JP2003520048A

JP2003520048A - 細胞単離方法

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Publication number: JP2003520048A
Application number: JP2001553385A
Authority: JP
Inventors: コルプス，トーン; ヒルデレフセト，ウン
Original assignee: ジェンポイントアーエス
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2003-07-02
Anticipated expiration: 2021-01-22
Also published as: CA2397067A1; JP4594577B2; ES2288925T3; AU2695901A; GB0001450D0; DE60129000D1; WO2001053525A3; AU785041B2; EP1252328B1; CN101560545B; CN1395620A; US20030153028A1; EP1865068A3; NO332049B1; CA2397067C; CN101560545A; WO2001053525A2; ATE365225T1; DK1252328T3; EP1865068A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、試料から細胞を単離する方法であって、前記細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより結合する方法に関し、とりわけ試料から微生物を単離する方法に関する。そのような方法における使用にとって好ましいリガンドには、炭水化物およびその誘導体が含まれる。試料から微生物を単離するためのキットも記載されており、該キットは、（ａ）微生物に非特異的に結合可能なリガンドが表面に固定された固体支持体と、（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための手段と、任意に、（ｃ）前記細胞を溶解するための手段と、さらに任意に、（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手段とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、試料中に存在する微生物の単離方法、とりわけ試料中に存在する細
菌の単離方法に関する。

【０００２】（背景技術）微生物の存在について試料を定性的および定量的に分析しようとする現在の手
法のほとんどは、特定の微生物、例えば病原体の同定に向けられている。食品お
よび臨床試料からのリステリア菌およびサルモネラ菌の菌株の免疫磁気分離が記
載されている（例えば、Skjerve et al. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 347
8-3481参照）。そのような手法は、当該微生物に特異的なリガンド、一般的には
抗体、の使用に依存している。免疫磁気分離は特異的なリガンドの使用に依存し
ているので、特定の微生物を同定するために探す状況においてのみ適用可能であ
って、存在するかもしれない微生物についての全般的な選別が求められる状況で
は適用できない。免疫磁気分離では、疑われていない微生物をピックアップする
のは容易ではないであろう。

【０００３】例えば、水試料のような環境試料を分析する場合、存在する種々の微生物種の
全体像または微生物の総濃度の推定を得ることが望ましい状況がある。上水道中
に存在し得る細菌の総量に関して制限が設けられることがあり、これは特定細菌
の存在についての問題とは独立している。例えば川または湖における微生物の広
範な種類の同定により、その水域の状態、栄養分レベル、農薬流出等のについて
の有益な情報がもたらされる

【０００４】もし試料から微生物を単離する一般的な方法が提供できれば、存在する特定微
生物の同定は次の段階において都合よく実行できる。核酸に基づく分析は、特定
微生物の識別に都合よく使用できるであろう。

【０００５】試料中に存在する微生物の総量の推定を得るため、またはさらなる分析用に微
生物を試料から単離するために現在用いられている方法は、濾過および／または
遠心分離ならびに寒天プレート上での培養を伴うかなり荒い分離手法に頼ってい
る。総細菌濃度の決定は、フローサイトメトリーまたは濾過および例えばペトリ
皿中の一般培地上での培養により実行し得る。これらの方法には数日を要するこ
とがあり、かなり複雑かつ不正確である。食品試料の分析に用いられる従来方法
に特有の問題が観察されている。これは食品試料が固形物（集塊および脂肪粒）
を多く含み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾
向があり、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に
利用できないからである。

【０００６】したがって、実行が迅速かつ便利で、多数の微生物種を試料から、好ましくは
一段階で、単離できる方法に対する需要がある。

【０００７】（発明の開示）本発明はこれらの要求に対処するものであり、したがって、本発明の１つの局
面によれば、試料からの微生物単離方法が提供され、この方法は、前記微生物を
固体支持体上に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより、結合す
る段階を含む。

【０００８】したがって、本発明は、固体支持体に付着させた非特異的リガンドと、微生物
表面に見られる前記リガンドとの結合パートナー（受容体）との間の相互作用の
利用により、広い微生物綱の捕獲を可能にする一般的単離方法を提供する。本発
明の本質が、固定されたリガンドと微生物との間の非特異的相互作用なので、本
明細書中で「微生物単離」に言及する時は、微生物の非種特異的および非属特異
的な方法による単離を意味することを意図している。換言すれば、固定されたリ
ガンドは、複数の属、少なくとも２種類の異なる属、好ましくは３種類以上、よ
り好ましくは５ないし７種類の異なる属、最も好ましくは少なくとも１０あるい
は１４種類以上の異なる属の微生物と結合することができる。

【０００９】このように本発明により、微生物、特に細菌を試料中の他の成分から単離する
一般的方法が提供される。この方法は、１つの細菌種を標的にするのではなく、
微生物集団全体についての情報を得るためまたは例えば種特異的プローブを用い
た核酸レベルでの種特異的情報が得られる第２の段階を容易にするために総分離
システムが達成されるという意味で「一般的」である。

【００１０】微生物は、それらが固体支持体に結合され、次いで試料の残部から、微生物を
結合させたまま固体支持体を取り去るか試料の残部を例えば流出により取り去る
ことによって分離し得るという点で「単離される」。固体支持体が磁気を帯びて
いる場合には、支持体／微生物複合体の操作は特に便利である。

【００１１】本発明の方法は、原生生物、藻類、原虫および菌類ならびにマイコプラズマ、
すべての細菌およびウイルスを含む、真核細胞に結合し得るすべての微生物を含
む多種多様な微生物の単離に用い得る。本発明の方法は、真核生物寄生生物、特
にヒト細胞（または他の宿主生物体）上に見られる複合多糖類に結合できるもの
の単離に用い得る。そのような真核生物寄生生物には、クリプトスポリジウム、
赤痢アメーバおよびマラリア原虫が含まれる。したがって、本明細書における「
微生物」への言及は、そのような寄生生物を含むものと解されるべきである。

【００１２】本発明の方法は、細菌の単離に特に適している。細菌の分類は複雑かつ絶え間
なく変わる科学であるが、「真の」細菌（真正細菌）は多数のパート（Bergey’
s Manual of Determinative Biology）、例えば光合成細菌、滑走細菌、有鞘細
菌およびグラム陽性球菌に分割し得る。個々のパートは次に、１つ以上の目に分
割され、その目内に科と属がある。１つ以上の属、科、または目あるいはパート
の細菌は、本発明の方法を用いて単離し得る。細菌の以下の科および属のいくつ
かまたはすべての細菌の試料から効果的な分離を本発明の方法を用いて達成でき
る。すなわち、アエロモナス、バシラス、カンピロバクター、シトロバクター、
クロストリジウム、エンテロバクター、エシェリキナ（病原菌および非病原菌）
、ハフニア、クレブシエラ、リステリア、プロテウス、サルモネラ、シェワネラ
、セラチア、シゲラ、ビブリオ、エルシニア、モルガンラ、フォトバクテリウム
、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、エンテロコッカ
ス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ラクトバシラス、ブロコスリックス
である。

【００１３】この方法は、細菌と他のタイプの微生物、例えば藻類、原虫、菌類またはウイ
ルスを同時に単離するために用い得る。

【００１４】特定の状況では、試料は限られた数のタイプの細菌のみを含み、この方法によ
り、いくつかの、あるいは１つか２つの細菌種のみが結合されて試料から単離さ
れる結果になることがある。それでもやはりそのような方法は特異的な方法では
ない。なぜならば、利用可能な細菌群がある程度限定されていても、固定された
リガンドは多種多様な細菌と結合し得るからである。

【００１５】任意の単離方法を実行するために特定の固体支持体−リガンド複合体を選択す
る必要がないという事実により、柔軟性およびコストの点で著しい利点がもたら
される。なぜならば、リガンドが付着した１つの固体支持体は、多種多様な単離
／分離方法において用い得るからである。したがって、特に有利なのは固体支持
体の一般的な結合能力である。

【００１６】好ましくは、本発明の方法の結果、試料中に存在する微生物（例えば細菌）が
、存在するすべての細菌細胞の割合および細菌のタイプの割合双方について、高
い割合で単離される。したがって、好ましくは試料中の微生物の少なくとも３０
％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは７０〜８０％の微生物が
固体支持体に結合されるであろう。当然ながら、結合される試料中の微生物の百
分率は、試料に添加される固体支持体の量と微生物に対するリガンドの比率に依
存する。上記の百分率については、混合物中に存在する固体支持体とリガンドと
が過剰にあるものと見なされる。

【００１７】別の見方をすると、存在する種々の（例えば細菌の）種の少なくとも２０％の
標本が好ましくは単離され、存在する種々の（例えば細菌の）種のより好ましく
は少なくとも３０〜４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の、特に少なく
とも６０〜７０％の、さらには少なくとも８０％の標本が固体支持体に結合され
る。

【００１８】「非特異的」リガンドとは、上で論じたように、１種類以上、好ましくは２〜
３種類以上、より好ましくは、５〜７種類以上、例えば１０〜１４種類以上の微
生物および／または細菌属と結合できるものである。リガンドと、微生物の表面
上にあって結合の原因であるその結合パートナーとの間に相互作用があるのであ
り、細胞が沈殿により固まる場合のように、細胞と固体支持体との間に一般的な
引力または会合が単にあるのではない。リガンドの非特異的特徴は、リガンドが
微生物表面の一部と無差別に結合または会合できるということではなく、リガン
ドの結合パートナーが微生物の特定のタイプまたは種に対して特異的ではないと
いうことを指す。したがって、リガンドは、汎用結合リガンドであると見なし得
る。

【００１９】適した結合パートナーは、種々の微生物中に、特に種々の細菌属中に比較的広
く見出されるので、かなり一般的、したがって非特異的な単離方法がもたらされ
る。したがって、リガンドは１つ以上の特異的な結合パートナーを有する一方で
、適した結合パートナーを有している多種多様な細菌すべてと結合できるという
意味で「非特異的」である。理論により拘束されることを望むのではないが、そ
れ自体が一般に種特異的である多種多様な結合パートナーは同じリガンドと結合
することができ、したがって種特異的でない分離方法がもたらされる。種特異的
レクチンは、炭水化物ベースのリガンドと共に非種特異的分離システムを提供す
ることができる。

【００２０】結合パートナーは一般に微生物表面のタンパク質であり、種ごとに変わり得る
。結合パートナーについてあまり多くは知られていないが、それにもかかわらず
本発明の方法で用いる適切なリガンドを本発明者らは同定することができた。

【００２１】リガンドは非タンパク質であり、したがって抗体および誘導体ならびにそれら
のフラグメントは排除される。本発明の方法の非特異的リガンドと対照的に、そ
のようなタンパク質リガンドは、例えば細胞上のタンパク質と非常に特異的な（
すなわち、属、特に種特異的な）相互作用が可能である。

【００２２】好ましいリガンドは炭水化物であり、単糖類、オリゴ糖類（二糖類および三糖
類を含む）および多糖類が含まれる。適切な単糖類としては、適宜ピラノースお
よびフラノースの形のヘキソースおよびペントース、ならびにアルドン酸および
ウラオン酸、デオキシ糖またはアミノ糖、硫酸化糖および糖アルコールのような
誘導体が含まれる。適切な単糖類の例としては、マンノース（例えばD−マンノ
ース）、ガラクトース（例えばＤ−ガラクトース）、グルコース（例えばＤ−グ
ルコース）、フルクトース、フコース（例えばＬ−フコース）、Ｎ−アセチル−
グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ラムノース、ガラクトサミン、
グルコサミン（例えばＤ−グルコサミン）、ガラクツロン酸、グルクロン酸、Ｎ
−アセチルノイラミン酸、メチルＤ−マンノピラノシド（マンノシド）、α−メ
チル−グルコシド、ガラクトシド、リボース、キシロース、アラビノース、サッ
カラート、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グリセリンおよびこれ
らモノマーの誘導体が含まれる。これらの中で、マンノース、ガラクトースおよ
びフコースが好ましい。

【００２３】特に好ましいのはオリゴ糖類および多糖類であり、これらは、単糖モノマーの
ポリマー、例えば上で論じた単糖モノマーを含むポリマーである。

【００２４】オリゴ糖類は、２〜１２個、好ましくは４〜８個の共有結合した単糖単位を含
み、これらは同じでも異なってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは
分岐状であり、例えば、２〜６単位のマルトース、スクロース、トレハロース、
セロビオースおよびサリシン、特にマルトースを有するオリゴマンノシルである
。オリゴ糖類の製造方法は、Pan et al. Infection and Immunity (1997), 4199
-4206に記載されている。

【００２５】多糖類は、１３個以上の共有結合した単糖単位を含み、これらは同じでも異な
ってもよく、直鎖状でも分岐状でもよく、好ましくは分岐状である。適切な多糖
類は、マンノース、ガラクトース、グルコース、フルクトースまたはウロン酸を
多く含み、例えばマンノースの直鎖ポリマーであって４番目のマンノースごとに
１つのガラクトース側鎖を有するものと考えられているガラクトマンナン多糖（
本明細書中ではＧＵＭまたはＧＵＭ１と呼ばれる）（シグマＧ−０７５３）であ
る。

【００２６】マンノースとガラクトースサブユニットとから構成されている多糖類は、リガ
ンドの好ましいタイプであり、さらなる例はグアーであり、これは１，６α結合
のほぼ１つ置きの単位にガラクトース側鎖を有するβ１，４結合されたマンノー
ス主鎖を有している。マンノースとガラクトースの比率は約１．８：１〜約２：
１であり、本明細書中説明される実験において用いたグアーはシグマ社製で、カ
タログ参照番号はＧ１４２９である。

【００２７】さらなる多糖類には、ガラクトース、ラムノース、arabionseおよびグルクロ
ン酸の側鎖ポリマーと考えられるアラビアゴム（シグマＧ９７５２）、およびガ
ラクトース、ラムノースおよびグルクロン酸の部分アセチル化ポリマーと考えら
れるカラヤゴム（シグマＧ０５０３）、ならびにマンノース単位で構成されたホ
モ多糖マンナンが含まれる。

【００２８】適切なリガンドである糖誘導体としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキスト
ラン硫酸およびカラギーナン（様々な形状）が含まれる。硫酸化糖は糖誘導体の
好ましい種類である。

【００２９】炭水化物のような微生物にとっての栄養分である分子をベースとしたリガンド
により、適切な分離手段がもたらされることを本発明者らは見出した。微生物の
捕獲を向上させるため、受容体／リガンドの相互作用を利用することはもとより
、培地中の栄養分の存在に対する細菌のプロアクティブな反応を利用する単離シ
ステムを提供することが本発明の方法の目的であった。本発明の方法による非特
異的なリガンドとして用い得る、微生物にとっての栄養分としては、ニコチン酸
、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよ
びコバミドなどのビタミン類、ならびにヘミン、ラクトフェリン、トランスフェ
リン、ヘモグロビンなどの鉄キレート分子／化合物およびアエロバクチン、フェ
リクロム（シグマＦ８０１４）、フェリエンテロケリン、エンテロバクチンおよ
びフェリキサニンンなどのシデロフォアが含まれる。

【００３０】細胞（例えば微生物）に非特異的に結合し得るリガンドが表面に固定された固
体支持体は、したがって、本発明のさらなる局面を構成する。「非特異的」とは
上で定義されている（すなわち、細胞タイプまたは種特異的ではなく、結合パー
トナーとの相互作用に依存する）通りであり、適切なリガンドは、本明細書中で
は本発明の方法に関して説明される。

【００３１】細菌ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）のフコース感受性およびマンノー
ス感受性の赤血球凝集の研究において、Ｌ−フコースおよびＤ−マンノースは、
アガロースビーズ（Sanchez et al. APMIS (1990) 98 353-357）に共有結合的に
結合されており、したがってこれらの固体支持体−リガンド複合体は本発明の範
囲には含まれない。この以前の研究は、１種類の細菌種のみを含む非常に特異的
な相互作用を調べるものであり、汎用的な細菌単離方法ではない。したがって、
本明細書中で定義される方法におけるこれらのビーズ−リガンド複合体の使用は
、本発明の局面を含む。

【００３２】固定化されたリガンドは好ましくは、オリゴ糖もしくは多糖、ビタミン（例え
ば微生物にとっての栄養分として必要なもの）または鉄キレート化合物でああり
、特に好ましくは多糖類である。特に好ましいリガンドの例は、本発明の方法に
関して前に論じた。

【００３３】本明細書中で論じたように汎用的な分離方法が提供されるが、本発明者らは、
特定の糖類を含むリガンドが、微生物の特定の非常に広い綱の分離に特に適して
いることを見出した。したがって、マンノース含有リガンド（リガンドはマンノ
ースモノマーまたはマンノース含有ポリマーとし得る）を用いると、例えば消化
管内に存在する細菌種は非常に効率的に単離され、肺を通って入る細菌は、リガ
ンドとして硫酸化糖類を用いることにより非常に効率的に単離され、さらに尿路
に感染する細菌は固定化グルコースに結合する（ここでも、モノマーとしてまた
はポリマー中に組み入れられた時）。消化管または肺から採取された試料から細
菌を分離する方法においてそのようなリガンドを使用することは、したがって、
本発明のさらなる好ましい局面を構成する。

【００３４】微生物が単離され得る試料としては、例えば湖、川、汚水処理施設およびその
他の水処理センターからの水試料または土質試料のような環境試料が含まれる。
これらの方法は、食品試料の分析ならびに細菌レベルの監視が要求される健康お
よび衛生用途一般、例えば食品が製造されているエリアにおいて特に有用である
。ミルク製品は例えば、リステリア菌について分析できる。固定化された抗体を
用いる従来の細菌単離手法は、おそらく固定化された抗体の疎水性のため、リス
テリア菌を単離するために非特異的リガンドを用いる本発明者らの方法よりもず
っと効率が悪いことが明らかになっている。試料が水試料である場合には、リガ
ンドは、当該微生物にとっての栄養分であるのが好ましい。

【００３５】食物試料は、必要であれば（固体試料であれば）最初にホモジナイズし、次に
適切な培地（例えばペプトン水）と混合し、３７℃で一晩インキュベートするこ
とにより分析できる。チーズ、アイスクリーム、卵、マーガリン、魚、エビ、チ
キン、牛肉、ポークリブ、小麦粉、ロールドオート、ボイルした米、コショウ、
トマトやブロッコリや豆などの野菜類、ピーナッツおよびマジパンなどの食品は
この方法で分析できる。本発明の方法は、食品試料の分析にとりわけ役立つもの
である。なぜならば、これらの食品試料は固形物（集塊および脂肪粒）を多く含
み、これらがフィルタを詰まらせさらに遠心分離後にペレットを作る傾向があり
、このペレットに細菌がパックされてしまい溶解または抗体との結合に利用でき
ないからである。

【００３６】本方法にしたがって微生物を単離できる試料は、人または動物の体から取られ
た臨床試料とし得る。適切な試料としては、全血および血液由来製品、尿、糞便
、脳脊髄液またはその他任意の体液、ならびに組織試料および例えば体腔の拭き
取りにより得られた試料が含まれる。

【００３７】試料には、他の細胞分離工程により得られた半純粋製剤のような比較的純粋ま
たは部分精製された出発物質も含まれ得る。

【００３８】本発明の固体支持体および方法は、試料からの真核細胞の非選択的単離に用い
得ることも見出された。この方法は、単離のために、ただ一つの細胞タイプが標
的とされるのではないという点で「非選択的」である。少なくとも２つ、好まし
くは３つ以上、４つ以上さらには６つ以上の異なるタイプの真核細胞がこれらの
方法により単離されるであろう。

【００３９】したがって、さらなる局面において、試料からの真核細胞の単離方法が本発明
によりもたらされ、この方法は、前記真核細胞を固体支持体に、該固体支持体上
に固定化された非特異的リガンドにより結合する段階を含む。分離し得る適切な
真核細胞は、多糖類に結合するレクチンをその表面に有しているものである。そ
のような方法は、血液または血液由来試料から、骨髄または白血球を含むどのよ
うな組織もしくは体液からでもすべてのタイプの白血球を捕獲することが望まし
い場合に、とりわけ有用である。この用途について、特に適したリガンドとして
は、カラギーナンおよびその誘導体、デキストラン硫酸のような硫酸化多糖類（
グリコサミノグリカン類）、ヘパリンおよびヘパラン硫酸が含まれる。

【００４０】発明のそのような方法により、少なくともＢ−細胞および単球、好ましくは全
タイプの白血球でなくとも大部分が、同じビーズに結合させることにより単離し
得る。赤血球は好ましくは捕獲されない。この方法は一般に、試料からのＤＮＡ
単離方法の準備段階である。従来技術の方法による血液からのＤＮＡ単離は、試
料の直接溶解とＤＮＡ捕獲により達成される。そのような手法では存在するすべ
ての細胞が溶解されるのに対して、本発明の方法では、白血球が結合されて当該
細胞の初期濃縮が可能になる。抗体ベースの分離システムでは、白血球の捕獲が
一般にできないであろう。同様に、他の細胞グループが真核生物試料から単離で
きる。

【００４１】したがって、本発明により、「細胞」が真核細胞または原核細胞とし得る細胞
単離方法がもたらされ、用語「細胞」は前に定義したすべての微生物を含む。

【００４２】本発明で用いる適切な固体支持体は、現在広く使用されているか、または固定
、分離等向けに提案されている公知の任意の支持体またはマトリクスとすること
ができる。これらは、粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜、ファイバー、毛管、
あるいはマイクロタイターストリップ、チューブ、プレートまたはウエル等の形
状を取ることができる

【００４３】支持体は、ガラス、シリカ、ラテックスまたはポリマー材料で作るのが好都合
である。細胞の、続いて核酸の結合用に大きい表面積を有する材料が好まれる。
一般にそのような支持体は表面が不規則であり、例えば粒子、ファイバー、ウェ
ブ、焼結物またはふるいなどの多孔性または粒子状である。粒状材料、例えばビ
ーズは、特にポリマー製ビーズは結合能力が大きいので一般に好まれる。

【００４４】本発明により用いられる粒状固体支持体は、球形ビーズを含むのが好都合であ
る。ビーズのサイズは決定的ではないけれども、例えば、直径が少なくとも１μ
ｍ、好ましくは少なくとも２μｍであり、最大直径がせいぜい１０μｍ、好まし
くはせいぜい６μｍとし得る。例えば、直径が２．８μｍおよび４．５μｍのビ
ーズがうまく働くことが示されている。

【００４５】本発明の方法での使用に適した非磁性ポリマービーズは、Ｄｙｎｏｐａｒｔ
ｉｃｌｅｓＡＳ（リレストローム市、ノルウェー）ならびにＱｉａｇｅｎ社、
Ｐａｒｍａｃｉａ社およびＳｅｒｏｔｅｃ社から入手可能である。

【００４６】しかしながら、操作および単離を助けるには、磁性ビーズが好ましい。本明細
書中で用いられる用語「磁性」は、磁場中に置かれた時に支持体が磁気モーメン
トを有することができ、したがってその磁場の作用下で移動可能であることを意
味する。言い換えれば、磁気粒子を含む支持体は磁気凝集により容易に除去でき
、これにより、細胞および核酸の結合段階に続く迅速、単純かつ効率的な粒子分
離方法がもたらされ、さらにこれは、細胞の分断または核酸の劣化を引き起こし
得るせん断力を発生させる遠心分離のような従来手法よりもはるかに過酷ではな
い方法である。

【００４７】したがって、本発明の方法を用いることにより、細胞が付着した磁性粒子を、
例えば永久磁石を使って磁場をかけることにより、適切な表面上へ取り去ること
ができる。通常は、試料混合物を収容している容器の側面に磁石を適用して容器
壁に粒子を凝集させ、試料の残部を流して捨てれば十分である。

【００４８】特に好ましいのは、たとえばＥＰ−Ａ−１０６８７３においてＳｉｎｔｅｆに
より記載されている超常磁性粒子である。なぜならば、反応の間に粒子が磁性凝
集および凝固することが回避でき、これにより均一な核酸抽出が保証されるから
である。ＤｙｎａｌＡＳ（オスロ市、ノルウェー）がダイナビーズ（DYNABEADS
）として販売している周知の磁性粒子が本発明での使用に適している。

【００４９】本発明で用いるために官能基被覆した粒子は、米国特許第４，３３６，１７３
号、同４，４５９，３７８号、および同４，６５４，２６７号によりビーズを改
質することにより調製できる。したがって、ビーズ、または他の支持体は、例え
ば正または負に帯電、親水性または疎水性の、種々のタイプの官能基化表面を有
するように調製できる。

【００５０】粒子は、好ましくは結合のための大きい表面積を提供し、したがって小さくか
つ平滑でなくなる傾向がある。固体支持体の表面は、（リガンド固定の前または
後）好ましくは疎水性ではない。

【００５１】発明の方法における固体支持体として用いるとりわけ好ましい粒子は、内部に
磁性コロイドが被包されたＰＶＡ（ポリビニルアルコール）ベースの球形ポリマ
ー粒子（ビーズ）である。これらのビーズは、ＣＡ２，２２７，６０８に記載さ
れるような、磁性コロイド含有ポリマー相を乳化剤含有植物油相中に懸濁させて
製造することができる。粒子は、サイズが１〜８μｍで変わり得、好ましくはＣ
ｈｅｍａｇｅｎＡＧ（ドイツ）から入手可能である。

【００５２】結合に適した条件を達成するため、適切なバッファ等を単離用媒質として使用
できる。適切な電荷、浸透圧等を有するバッファは、固体支持体との接触の前、
それと同時に、またはその後に、試料に添加するのが好都合である。ＰＢＳは適
切な細胞結合バッファである。

【００５３】リガンドを固体支持体へ付着させる方法は、技術的に公知である。一般には、
固体支持体は最初に活性化され、次にリガンドと反応させられ、リガンド自身は
、固体支持体への共有結合的付着用に若干改質しておくことができる。上記で論
じたＣｈｅｍａｇｅｎ社製の超常磁性ビーズのケースでは、ポリビニルアルコー
ルマトリクスは、８原子スペーサーを介したイソシアネート官能基の導入により
活性化できる。これらの活性化ビーズ（Ｍ−ＰＶＡＡｋ２ｘ）は次に、アミ
ノ官能基またはヒドロキシ官能基を含んでいる分子の直接カップリング用に用い
得る。典型的なカップリング反応は以下の通りである。

【００５４】Ｃｈｅｍａｇｅｎ社は、カップリングによる同社のビーズの改質に関連した特
許を有している。

【００５５】細胞結合を調べるため、および特定の微生物についての定性的または定量的な
情報が必要な場合には、さらなる同定段階を実施し得る。上記で説明した一般的
な細胞分離方法を種特異的検出方法と組み合わせることは、本発明の特に好まし
い実施形態である。

【００５６】結合された微生物の同一性は、その微生物の核酸の分析、または特定タイプの
微生物に特異的な標識抗体を用いる技術的に公知な他の手法により調べることが
できる。細胞を固体支持体に結合した後、微生物−ビーズ複合体からの核酸が、
例えばＰＣＲにより単離および分析できるのが好都合である。したがって、微生
物が前記固体支持体に結合した後、その後の分析用に核酸を微生物から放出する
細胞溶解段階が行われる。放出された核酸は溶液中で分析し得るが、これが固体
支持体に結合した後に分析するのがより好都合であり、この固体支持体は同じで
も異なってもよいが、好ましくは微生物自身が結合した固体支持体と同じである
。したがって、さらなる局面では、以下の段階を含む、微生物含有試料の分析方
法が本発明により提供される。（ａ）前記微生物を固体支持体へ、該固体支持体上に固定化された非特異的リガ
ンドにより結合する段階、（ｂ）前記固体支持体に結合された微生物を同定する段階。

【００５７】段階（ｂ）は、（ｃ）微生物を溶解し、さらに任意に（ｄ）前記溶解された微生物から放出された核酸を固体支持体に結合することに
より実行するのが好都合である。

【００５８】代わりの見方をすると、本発明により、試料中の細胞タイプまたは微生物の検
出方法が提供され、該方法は、上記に記載されるような段階（ａ）および（ｂ）
を含む。

【００５９】微生物を溶解し、こうして放出された核酸を結合しそして核酸を分析するのに
適した方法は、参照により本明細書に含まれるＷＯ９８／５１６９３に記載され
ている。したがって、本発明のさらなる局面は、細胞試料から核酸を単離する方
法であって、（ａ）前記試料中の細胞固体支持体へを、該固体支持体に固体された非特異的リ
ガンドにより結合する段階と、（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、さらに（ｃ）前記溶解された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階とを
含む。

【００６０】さらなる局面は、試料中の標的細胞の存在または不在を検出する方法であって
、該方法は、（ａ）前記試料中の細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的
リガンドにより結合する段階と、（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、（ｃ）前記溶された細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と、（ｄ）前記結合された核酸中の、前記標的細胞に特徴的な核酸の存在または不在
を検出する段階とを含む。好ましい細胞、リガンドおよび固体支持体は上記で論
じた通りのものである。

【００６１】核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの任意の自然発生物もしくは合成修飾物
とし得る。しかしながら好ましくは、核酸はＤＮＡであって、これは一重または
二重の撚糸状あるいは任意の形状、例えば直線状または環状とし得る。

【００６２】結合に続き、単離または支持体結合された微生物が溶解されてそれらの核酸を
放出する。細胞溶解方法は技術的に公知かつ文献中に広く記載されており、公知
方法のいずれも用い得る。種々の微生物について種々の方法がより適切であり得
るが、例えば、以下の方法のうちのいずれも用い得るであろう。すなわち、例え
ば適切なバッファ中のＳＤＳ、ＬｉＤＳまたはサルコシルを用いた洗浄溶解；塩
酸グアニジウム（ＧＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジウム（ＧＴＣ）、ヨウ化ナ
トリウム（ＮａＩ）、過塩素酸塩等のようなカオトロープ剤の利用；フレンチプ
レス、超音波処理、ガラスビーズやアルミナを用いるまたは液体窒素中での磨砕
のような機械的破砕；例えばリゾチーム、プロテイナーゼ、プロナーゼまたはセ
ルラーゼあるいは商業的に入手可能な任意のその他の溶解酵素を用いる酵素溶解
；バクテリオファージまたはウイルス感染による細胞溶解；凍結乾燥；浸透圧衝
撃；マイクロ波処理；例えば加熱もしくは煮沸、またはドライアイスないし液体
窒素中での凍結と、解凍による温度処理；アルカリ溶解である。上記で言及した
ように、そのような方法はすべて標準的な溶解手法であり、かつ技術的に公知で
あり、そのような方法または方法の組み合わせのいずれも用い得る。

【００６３】溶解は、本発明にしたがって、カオトロープ剤および／または洗浄剤を用いて
達成するのが好都合である。例えば、細菌細胞の場合、カオトロープ剤と洗浄剤
との組み合わせは特に効果的であることが見出されている。したがって、典型的
な適切な溶解剤としては、ＧＴＣまたはＧＨＣｌのようなカオトロープ剤とＳＤ
Ｓまたはサルコシルのような洗浄剤が含まれる。溶解剤は、単なる水溶液として
供給するか、バッファ溶液中に入れていわゆる「溶解バッファ」とすることもで
きる。任意の適切なバッファを用いることができ、例えばＴｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎ
ｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅおよびリン酸塩バッファが含まれる。代わりに、溶解剤を別
々に加えることができる。溶解剤の適切な濃度および量は、正確なシステム、ｃ
ａｌｌｓの性質等に応じて変わり、適切に決定し得るが、ＧＴＣ、ＧＨＣｌ、Ｎ
ａＩまたは過塩素酸塩のようなカオトロープ剤を２Ｍ〜７Ｍの濃度で、ＮａＯＨ
のようなアルカリ剤を０．１Ｍ〜１Ｍの濃度で、洗浄剤を０．１〜５０％（ｗ／
ｖ）例、えば０．５〜１５％の濃度で用い得る。したがって、適切な溶解バッフ
ァの代表的な例は、４ＭＧＴＣ、サルコシル１％（ｗ／ｖ）の水溶液である。

【００６４】単離された支持体結合微生物は、試料の残部から好都合に除去または分離でき
、その結果、細胞が濃縮または濃化される。したがって、細胞結合段階は、細胞
を当初試料よりも小さい体積に濃化または濃縮するのに役立つ。次に、所望の溶
解剤を含む適切な溶解バッファを加えるか、単離された分子を所望の溶解条件に
かけることにより、溶解は好都合に達成し得る。例えば、適切な溶解剤を含む溶
解バッファを単に加える場合、単離された細胞は、溶解バッファの存在下で、溶
解を可能にする適切な時間単にインキュベートすることができる。種々のインキ
ュベート条件は種々の溶解システムに適し、技術的に公知である。例えば、洗浄
剤および／または溶解バッファ含有カオトロープ剤については、インキュベーシ
ョンは室温またはより高い温度、例えば３７℃〜６５℃で起こり得る。同様に、
インキュベーション時間は、数分、例えば５〜１０分間から数時間、例えば１〜
２時間まで変わり得る。ＧＴＣ／サルコシル溶解バッファと細菌細胞との場合に
は、６５℃で１０〜２０分間のインキュベーションが適切であることが見出され
ているが、もちろん必要に応じて変え得る。例えばプロテイナーゼＫ等を用いる
酵素溶解の場合には、より長い処理時間、例えば一晩、が必要になることがある
。

【００６５】溶解に続いて、放出された核酸は、好ましくは溶解された微生物が結合される
固体支持体に共有結合的に結合されるのが好都合である。とはいえ、例えば、ビ
ーズの混合群には、あるものには微生物に結合するための非特異的リガンドが提
供され、他のものには核酸を結合するようにし得る。

【００６６】この核酸結合は、核酸を固体支持体と結合するための技術的に公知のどのよう
な方法ででも達成できる。核酸は支持体に、非特異的に、すなわち配列とは独立
して結合され得るのが好都合である。したがって、例えば放出された核酸は、例
えばアルコール、アルコール／塩の組合せ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
等の公知の核酸沈殿剤のいずれかを用いて、支持体上に沈殿させ得る。このよう
なビーズ上への核酸沈殿は、例えばＷＯ９１／１２０７９中に記載されている。
したがって、核酸の沈澱を引き起こすアルコール添加に続いて、溶液中の支持体
および放出された核酸に塩を添加し得る。代わりに、塩とアルコールとを一緒に
添加することも、塩を省くこともできる。細胞結合段階に関して上記で説明した
ように、任意の適切なアルコールまたは塩を用いることができ、適切な量または
濃度は容易に決定できる。

【００６７】代わりの非特異的な核酸結合手法には、ＤｙｎａｌＡＳのＷＯ９６／１８７
３１中に記載されるような洗浄剤の使用（いわゆる「DNA Direct」法）、および
ＡｋｚｏＮ．Ｖ．によりＥＰ−Ａ−０３８９０６３中に記載されているカオト
ロープ剤と、シリカ粒子のような核酸結合固相との利用が含まれる。

【００６８】支持体への核酸のイオン性結合は、帯電表面を有する固体支持体、例えばポリ
アミン被覆した支持体、を用いて達成できる。

【００６９】本発明の方法において用いられる支持体は、核酸の特定的または非特異的結合
を助ける官能基、例えば、ロイシンジッパーやヒストンなどのＤＮＡ結合タンパ
ク質あるいはインターカレーション色素（例えば、臭化エチジウムまたはＨｏｅ
ｃｈｓｔ４２９４５）、を有することもでき、これらは支持体上に被覆し得る。

【００７０】同様に、核酸の選択的捕獲を助けるため、支持体に結合パートナーを付与する
ことができる。例えば、補足的なＤＮＡないしＲＮＡ配列、またはＤＮＡ結合タ
ンパク質、ウイルス核酸に結合するウイルスタンパク質を用い得る。そのような
タンパク質の固体支持体への付着は、技術的に公知の手法を用いて達成できる。

【００７１】発明にしたがって核酸を沈殿させる好都合な方法は、沈澱剤、例えばアルコー
ルを、支持体と溶解細胞とを含んでいる混合物へ添加することである。したがっ
て、適切な容量のアルコール、例えば１００％または９６％エタノール、を混合
物に単に添加し、さらに放出された核酸が支持体に結合されるのに十分な時間イ
ンキュベートされる。この段階のためのインキュベーション条件は決定的ではな
く、室温で５〜１０分間のインキュベーションを単に含み得る。しかしながら、
選択によっては、時間の長さが変わり、温度が上昇し得る。

【００７２】必要ではないが、例えば核酸結合段階に続いて、１つ以上の洗浄段階を本発明
の単離方法に導入することが好都合なことがある。どのような従来の洗浄バッフ
ァまたは他の媒質でも用い得る。概して、イオン強度が低〜中程度のバッファは
、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０／１０ｍＭＮａＣｌ）で調製
できる。必要なら、例えばアルコールを含有する他の標準的な洗浄媒質も用いる
ことができ、例えば７０％エタノールでの洗浄である。

【００７３】磁性粒子を用いると、粒子を凝集させ、核酸結合媒質を除去し、洗浄媒質を添
加し、さらに粒子を必要な回数だけ再凝集させることにより、容易な洗浄段階が
可能になる。

【００７４】核酸単離プロセスおよび必要となることがある任意の洗浄段階に続き、核酸が
結合された支持体を、任意の適切な媒質、例えば水または低イオン強度バッファ
中に、例えば再懸濁または浸漬することができる。支持体および所望の任意の後
続処理の性質に応じ、支持体から核酸を放出させることが望ましいこともあれば
望ましくないこともある。

【００７５】磁性または非磁性ビーズのような粒子状固体支持体のケースでは、これは、多
くの場合において、支持体から核酸を溶出することなく、例えばＰＣＲまたは他
の増幅において直接用い得る。また、多くのＤＮＡ検出または同定方法について
は、溶出は必要ではない。なぜならば、ＤＮＡはビーズ表面とランダムに接触し
、水素結合またはイオン性もしくは他の力によって多くのポイントにおいて結合
され得るが、一般的にオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションおよび増
幅に利用可能な十分なＤＮＡの長さがあるからである。

【００７６】しかしながら、必要であれば、核酸の溶出は、公知の手段を用いて、例えば７
０〜９０℃まで５〜１０分間加熱し、それに続いて支持体を媒質から除去して核
酸を溶液中に残すことにより容易に達成し得る。そのような加熱は、ＰＣＲにお
いて、繰り返しプログラムに先立つＤＮＡ変性段階により自動的に得られる。

【００７７】もしＤＮＡからＲＮＡを除去する必要があれば、これは、ＤＮＡ単離段階の前
に、例えばＲＮＡａｓｅまたはＮａＯＨのようなアルカリを添加することによっ
てＲＮＡを破壊することにより達成し得る。

【００７８】本発明の利点は、実施が迅速かつ簡単であることであり、この方法の単純さに
より試料の高いスループットが可能になる。

【００７９】本発明は、支持体としてもし粒子、特に磁性粒子が用いられれば、有利に自動
化しやすい。

【００８０】上記で言及したように、本発明の方法は、核酸ベースの検出手順で使用するた
めの核酸を調製する最初の準備段階としてとりわけ有用である。

【００８１】上記で言及したように、有利に結合された核酸は、検出段階の実行前に支持体
から溶出または除去される必要が必要がない。ただし、必要であればこれを行う
ことができる。核酸が溶出されるかされないかも、核酸結合段階において用いら
れた特定の方法に依存する。したがって、特定の核酸結合手続は、他のものより
も緊密に核酸を結合する。例えば洗浄剤（例えば、ＤＮＡＤｉｒｅｃｔ）を用
いたＤＮＡ結合の場合には、溶出バッファまたは他の適切な媒体が導入されると
、核酸は固体支持体から溶出しようとする。アルコールまたはカオトロープのよ
うな沈澱剤によって結合された核酸は、より緊密に結合されたままで残ろうとし
、バッファ媒質中に置かれても溶出しようとせず、溶出には加熱を要することが
ある。

【００８２】したがって、特に支持体が粒子であれば、支持体結合核酸は、核酸ベースの検
出手続において、単に支持体を検出段階に適した媒質中に再懸濁するか、支持体
をこの媒質中に添加することによって直接用い得る。核酸が媒体中に溶出しても
、または上記で言及したようであっても、核酸が溶出する必要はない。硫酸化糖
類がリガンドとして用いられる場合は、溶出が好ましい。

【００８３】核酸を検出するための多数の種々の技術が公知で文献中に記載されており、こ
れらのいずれであっても本発明にしたがって使用し得る。最も単純には、核酸は
プローブへのハイブリダイゼーションにより検出でき、非常に多くのそのような
ハイブリダイゼーションプロトコルが記載されている（例えば、Sambrook et al
., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Har
bor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照）。最も一般的には、検出は、これ
について文献中に記載されている任意の方法を用いて、in situハイブリダイゼ
ーション段階および／またはin vitro増幅段階を伴うであろう。したがって、言
及したように、ＬＡＲ、３ＳＲおよびＱ−β−レプリカーゼシステムのような手
法が使い得る。しかしながら、ＲＣＲおよびその種々の改良、例えばネステッド
プライマーの使用は一般に選択される方法であろう（例えば、核酸増幅技術の総
説についての、Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology
, 4: 41-47参照）。

【００８４】他の検出方法は、シーケンシングアプローチ、例えば、Syvanen and Soderlun
d, 1990, Genomics, 8: 684-692に記載されているようなミニシーケンシグアプ
ローチに基づくことができる。

【００８５】ＰＣＲのような増幅手法において、ＤＮＡ二重鎖を溶かす最初の段階において
必要な加熱により、結合されたＤＮＡが支持体から放出されることがある。した
がって、ＰＣＲのようなその後の検出段階の場合は、支持体に結合された核酸は
反応混合物に直接添加することができ、核酸は検出プロセスの最初の段階におい
て溶出する。本発明にしたがって得られた単離された支持体結合核酸試料全体ま
たは一部を検出段階において用い得る。

【００８６】ＰＣＲやその他の検出段階の結果は、多くの方法により検出もしくは視覚化で
き、それらの方法は従来技術において記載されている。例えば、ＰＣＲやその他
の増幅産物は、電気泳動ゲル、例えば臭化エチジウム染色アガロースゲル上を、
公知の手法を用いて走らせることができる。代わりに、ＤＩＡＮＡシステムを用
いることができ、これはネステッドプライマー法の改良である。ＤＩＡＮＡ（De
tection of Immobilised Amplified Nucleic Acids：固定化された増幅核酸の検
出）システム（Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)参照）にお
いては、内側の第２のプライマーペアは、それぞれ、増幅されたＤＮＡの捕獲を
可能にする固定化手段と、ラベルすなわち認識を可能にするラベルの付着手段を
有している。これにより、バックグラウンド信号の減少と、増幅ＤＮＡの迅速か
つ容易な検出手段という二重の利点がもたらされる。リアルタイムＰＣＲ法は、
ＤＮＡ検出、例えば５’ヌクレアーゼＰＣＲまたは蛍光プローブを用いる手法に
おいて用い得る。

【００８７】多くの種々のシーケンシング手法、例えば標準シーケンシング、固相シーケン
シング、サイクリックシーケンシング、自動シーケンシングおよびミニシーケン
シグのいずれかを用いたシーケンシングにより、増幅核酸も検出でき、または結
果が確認される。

【００８８】本発明の方法を実行するために必要な様々な反応物質および構成要素は、キッ
トの形で供給するのが好都合である。そのようなキットは本発明のさらなる局面
である。

【００８９】最も単純には、本発明のこの局面により、（ａ）微生物に非特異的に結合できるリガンドをその表面に固定した固体支持体
と、（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための方法と、任意に（ｃ）前記細胞を溶解するための手段と、さらに任意に、（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手
段とを含む、微生物を試料から単離するキットが提供される。

【００９０】様々な手段（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、本発明の方法に関連して上記で記
載および論じられた通りのものとし得る。

【００９１】典型的なキットは、固体支持体、例えばＧＵＭ１のような多糖類で被覆した粒
子と、例えばＰＢＳのような結合バッファと、溶解バッファとを含み得る。

【００９２】さらなる任意の構成要素は、（ｅ）標的微生物に特有な核酸の存在または不在
を検出するための手段である。上記で論じたように、そのような手段には、ハイ
ブリダイゼーションおよび増幅に基づく検出手法において使用される適切なプロ
ーブまたはプライマーオリゴヌクレオチドが含まれる。

【００９３】任意に、そのようなキットには、バッファ、塩類、ポリマー、酵素等がさらに
含まれ得る。

【００９４】本発明のキットは、ＰＣＲ増幅用の細菌抽出およびＤＮＡ単離において大きな
実際的な有用性がある。このキットによる使用に適したプロトコルは以下の通り
で、磁性または磁化可能ビーズが固体支持体（ａ）として選択されたものと想定
する。 − 結合バッファ（ｂ）とビーズとを組み合わせ、一晩培養した培地からの試料
を添加し、例えばエッペンドルフ型チューブ内で混合する。 − 磁石の影響下に置き、細菌／ビーズ複合体をチューブ側面に移動させる。 − 上澄みをピペットで取って捨てる。 − 溶解バッファ（ｃ）を加え、エタノールでインキュベートする。 − 磁石を用いて上澄みからビーズを分離し、上澄みをピペットで取って捨てる
。 − ビーズを洗浄して上澄みを除去する。 − ビーズ／ＤＮＡ試料をＰＣＲ用に再懸濁する。

【００９５】本発明のさらなる局面によれば、試料からの細胞の全体的分離における、本明
細書中に記載される固体支持体の使用がもたらされる。この分離は「全体的」で
ある。なぜならば、これは細胞特異的な単離方法ではなく、むしろ試料中に存在
する細胞（例えば微生物）を他の構成要素から単離する一般的な方法だからであ
る。すでに、そのような方法は濾過または沈殿により達成されている。対照的に
、本明細書中に記載される固体支持体は、リガンド−レセプタ結合の利点を組み
合わせるために用いることができるが、種または細胞タイプ特異的なやり方では
ない。本明細書中に記載されるように、固体支持体に付着させられたリガンドは
、試料中の微生物のタイプ（例えば種々の細菌種）または真核細胞タイプの（大
半ではないが）かなりの割合と結合し、試料全体から全体的な分離を達成するこ
とができる。

【００９６】以下、本発明を非限定的な実施例において図面を参照しつつより詳細に説明す
る。

【００９７】（発明を実施するための最良の形態）実施例１炭水化物被覆粒子の製造と細胞結合特性の試験化合物は、Ｍ−ＰＶＡＯＣＮ−活性化ビーズ（Chemagen AG）上で結合させ
た。反応は以下の通りである。

【００９８】改質したビーズを、種々の菌液、すなわち純粋な未希釈菌液（ｏ．ｎ．）ある
いは水またはバッファ（ＰＢＳ）中で希釈した菌液と共にインキュベートした。
細胞結合を調べるため、ＤＮＡを細菌−ビーズ複合体から単離し、その後にＰＣ
Ｒを実施することにより分析した。参考文献：ＷＯ９８／５１６９３。このカッ
プリング反応は、Ｃｈｅｍａｇｅｎ社により実施され、その結果得られた改質ビ
ーズはｍ本明細書中で論じた本発明の単離方法において用いた。

【００９９】実施例２ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３０℃、無撹拌で一晩培養した
。ＰＢＳ（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ１０μｌを混合し（
１０ｍｇ／ｍｌ）、次に一晩培養した菌液１００μｌを添加し、ピペット操作に
より穏やかに混合した。チューブを室温で５分間放置した。上澄みを磁気選別機
を用いて除去し、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍ guaridineチオシア
ネート−１％サルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを開けたまま
で、６５℃で５分間インキュベートした。

【０１００】次に、９６％エタノール１００μｌを添加し、ふたを閉じたままでインキュベ
ーションを５分間継続した。上澄みを磁気選別機を用いて除去し、ビーズ−ＤＮ
Ａ試料を７０％エタノール１ｍｌで２回洗浄した。

【０１０１】ビーズ−ＤＮＡ試料を、Ｈ_２Ｏ４５μｌ中に再懸濁し、エタノールのすべての
痕跡を除去するため、ふたを開けたままで６５℃で１５分間インキュベートした
（代わりに、Ｈ_２Ｏ５μｌを加えてビーズを湿らせ、次にこのビーズを６５℃で
５分間インキュベートしてもよい）。精製物質２０μｌを１回の５０μｌＰＣＲ
で用いた。

【０１０２】単離された細菌を同定するため、種特異的またはグループ特異的プライマー（
ＸおよびＹ）を用いたＰＣＲ増幅を実施した。

【０１０３】下記の表１は種々の細菌についての適切なプライマーを示すものである。

【表１】ＰＣＲ増幅は５０μｌ容積で実施した：Ｈ_２Ｏ−１７．５μｌ；ｄＮＴＰ２ｍＭ
−５μｌ；１０ｘバッファＤｙｎａＺｙｍｅ−５μｌ；プライマーｘ（１０ｐｍ
ｏｌ／μｌ）−１μｌ；プライマーｙ１０ｐｍｏｌ／μｌ−１μｌ；酵素Ｄｙｎ
ａｚｙｍｅ２Ｕ／μｌ−０．５μｌ；テンプレート−２０μｌ。温度プログラム
：９４℃−４分間、次に、９６℃−１５秒間；５６℃−３０秒間；７２℃−１分
間のパラメーターで３５サイクル；続いて７２℃−７分間。

【０１０４】ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により視覚化した。

【０１０５】実施例３実施例２のプロトコルを、D−マンノースがカップリングされたＭ−ＰＶＡを
用いて実施した。

【０１０６】このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属
、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。

【０１０７】実施例４実施例２のプロトコルを、マルトースがカップリングされたＭ−ＰＶＡビーズ
を用いて実施した。

【０１０８】このビーズは、バシラス属、大腸菌（病原性および非病原性）、リステリア属
、サルモネラ属、エルシニア属と結合することが明らかになった。

【０１０９】実施例５実施例２のプロトコルを、ガラクトマンナン多糖類（ＧＵＭ１）がカップリン
グされたＭ−ＰＶＡビーズを用いて実施した。

【０１１０】このビーズは、とりわけアエロモナス属、バシラス属、カンピロバクター属、
シトロバクター属、クロストリジウム属、エンテロバクター属、大腸菌（病原性
および非病原性）、ハフニア属、クレブシエラ属、リステリア属、プロテウス属
、サルモネラ属、シェワネラ属、セラチア属、シゲラ属、ビブリオ属、エルシニ
ア属と結合することが明らかになった。

【０１１１】これらの実験の結果は、図３のゲル写真に見ることができる。以下のスキーム
計画にしたがって特定の細菌がビーズに結合することを表すＰＣＲ産物のバンド
が示してある。

【０１１２】レーン１、ＤＮＡマーカー（GeneRuler(登録商標)１００ｂｐＤＮＡラダー、F
ermentas社製）；レーン２−３、それぞれKlebsiella pneumoniasおよびK.oxytoca；レーン４−６、それぞれShigella flexneri、S.sonneiおよびS.boydii；レーン７−８および１２−１３、Vibrio cholerae（レーン７および１２）、V.
vulnificus（レーン８）、およびV. parahaemolyticus；レーン９、Hafnia alvei；レーン１０−１１、それぞれAeromonas sobriaおよびA. hydrophila；レーン１２−１３、Vibrio（上記参照）；レーン１４、Proteus vulgaris；レーン１５−１６、それぞれSalmonell enterica ssp typhimuriumおよびS. ent
erica ssp enteritidis；レーン１７−１８および４１−４４、Yersinia enterocolitica（レーン１７−
１８（血清型不明）、血清型Ｏ：９（レーン４２）、Ｏ：８（レーン４３）、お
よびＯ：３（レーン４４））、およびY. pseudotuberculosis（レーン４１）；
レーン１９、Escherichia coli；レーン２０−２１、それぞれListeria innocuaおよびL. monocytogenes；レーン２２−２３および３８−３９、Bacillus cereus（レーン２２）、B. subt
ilis（レーン２３）、およびB. simplex（レーン３８−３９）；レーン２４、Citrobacter freundii；レーン２５−２６、それぞれClostridium perfringensおよびC. sordelli；レーン２７−３０、Escherichia coli、病原性レーン３１−３７、Campylobacter jejuni（レーン３１）およびC. lari（レー
ン３２−３７）；レーン３８−３９、Bacillus（上記参照）；レーン４０、Brochothrix thermosphacta；レーン４１−４４、Yersinia（上記参照）；レーン４５−４７、それぞれEnterobacter sakazakii、E. aerogenes、およびE.
cloacae；レーン４８、Morganella morganii；レーン４９、Serratia marcescens；レーン５０−５２、Shewanella putrefaciens；レーン５３−５４、それぞれPhotobacterium phosphoreumおよびP. damsela；レーン５５、Streptococcus thermophilus；レーン５６、Lactococcus lactis；レーン５７、Staphylococcus warneri；レーン５８、Enterococcus faecalis；レーン５９−６０、Leuconostoc mesenteroides；レーン６１−６４、Pediococcus acidilactici（レーン６１−６２）およびP. d
amnosus（レーン６３−６４）；レーン６５−６９、Lactobacillus acidophilus（レーン６５、６８および６９
）、およびL. plantarum（レーン６６−６７）。

【０１１３】実施例６ E. coliを、実施例３、４、および５のビーズならびにダイナビーズＭ−２８
０（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）（未活性化）を用いて、一晩培養菌液から単離し
た。核酸を放出するための溶解後、約６００ｂｐのE. coli ＤＮＡシーケンスを
、プライマーＵ５９／Ｌ６７３を用いて増幅した（表１参照）。

【０１１４】結果を図１に示す。レーン２−５、１５μｌテンプレートを用い、レーン７−１０では、５μｌテン
プレートを用いた；レーン１および６、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；レーン２および７、マンノース被覆ビーズ；レーン３および８、マルトース被覆ビーズ；レーン４および９、ＧＵＭ１被覆ビーズ；レーン５および１０、活性化ダイナビーズＭ−２８０。

【０１１５】実施例７ B. cereus ATCC 14579を、一晩培養菌液（１００mlＴＳＢ、３０℃）２mlから
、実施例５のビーズと未被覆ビーズ（参照記号：ＵＮＣ）を用い、以下の希釈に
従って単離した。レーン１、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；レーン２、１００μｇＵＮＣ、未希釈菌液；レーン３、５０μｇＧＵＭ１、１０^１希釈菌液；レーン４、１００μｇＧＵＭ１、１０^１希釈菌液；レーン５、２００μｇＧＵＭ１、１０^１希釈菌液；レーン６、１００μｇＵＮＣ、１０^１希釈菌液；レーン７、５０μｇＧＵＭ１、１０^２希釈菌液；レーン８、１００μｇＧＵＭ１、１０^２希釈菌液；レーン９、２００μｇＧＵＭ１、１０^２希釈菌液；レーン１０、１００μｇＵＮＣ、１０^２希釈菌液；レーン１１、５０μｇＧＵＭ１、１０^３希釈菌液；レーン１２、１００μｇＧＵＭ１、１０^３希釈菌液；レーン１３、ＤＮＡマーカーφｘ１７４／ＨａｅＩＩＩ；レーン１４、２００μｇＧＵＭ１、１０^３希釈菌液；レーン１５、１００μｇＵＮＣ、１０^３希釈菌液；レーン１６、５０μｇＧＵＭ１、１０^４希釈菌液；レーン１７、１００μｇＧＵＭ１、１０^４希釈菌液；レーン１８、２００μｇＧＵＭ１、１０^４希釈菌液；レーン１９、１００μｇＵＮＣ、１０^４希釈菌液；レーン２０、５０μｇＧＵＭ１、１０^５希釈菌液；レーン２１、１００μｇＧＵＭ１、１０^５希釈菌液；レーン２２、２００μｇＧＵＭ１、１０^５希釈菌液；レーン２３、１００μｇＵＮＣ、１０^５希釈菌液；

【０１１６】核酸を放出するための溶解の後、約６００のｂｐのB. cereusシーケンスを、
プライマーＵ５５２／Ｌ１２５４を用いて増幅した（表１参照）。結果を図２に
示す。１０^１希釈の場合の結果はエラーとなるであろう。なぜならば、５０μｇ
のＧＵＭ１と２００μｇのＧＵＭ１は両方とも、細胞結合を示す、核酸検出につ
いてポジティブな結果を与えるからである。概して、未被覆ビーズの場合よりも
ＧＵＭ１の場合のほうが、結合が１００−１０００倍良好なことを結果が示して
いる。

【０１１７】実施例８他のビーズは、本発明の原理を説明するために使用し、特に適切なビーズタイ
プはダイナビーズＭ−２７０エポキシ、製品番号１４３．０２（ノルウェー国Ｄ
ｙｎａｌＡＳから入手可能）である。

【０１１８】ビーズの調製無菌濾過した０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌを乾燥
ビーズ３０ｍｇに加えて、１ｍｌ当たりビーズ約１０^９個の濃度とした。ビーズ
を約３０秒間渦攪拌することにより再懸濁し、次に低速チルト回転で１０分間イ
ンキュベートした。チューブを磁石上に４分間置き、上澄みをピペットで慎重に
取り除いた。

【０１１９】０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）２ｍｌをチューブに再度加
え、ビーズを渦攪拌により適切に混合した。チューブを磁石上に４分間置き、上
澄みを除去した。

【０１２０】洗浄したビーズを、０．１Mリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）６００
μｌ中に再懸濁して、リガンド溶液添加後に推奨ビーズ濃度と硫酸アンモニウム
濃度になるようにした。このビーズ溶液を被覆手順において用いた。

【０１２１】被覆手順リガンドをＰＢＳに溶解して１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、無菌濾過した。

【０１２２】Ｄｙａｎａｌ社の推奨に従い、リガンド６００μｌを、ビーズ溶液６００μｌ
と無菌濾過３Ｍ硫酸アンモニウム６００μｌと混合した。チューブを、室温で低
速回転により一晩インキュベートした。

【０１２３】インキュベーション後、チューブを磁石上に４分間置き、上澄みを除去した。
被覆ビーズを、２ｍｌＰＢＳで合計４回洗浄した。最後にビーズを３０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度になるようにＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁し、４℃で保管した。

【０１２４】実施例９ビーズ上の細菌の単離および特定細菌の同定のためのプロトコル細菌を、トリプトンソイブロス１００ｍｌ中で３７℃で一晩培養した。ＰＢＳ
（結合バッファ）８００μｌと本発明によるビーズ（１０ｍｌ／ｍｌ）２０μｌ
とを混合し、次に一晩培養菌液１００μｌを加え、ピペット操作により穏やかに
混合した。チューブを室温に５分間放置した。上澄みを磁気分離機により除去し
、ビーズ−細菌複合体を溶解バッファ（４Ｍグアニジンチオシアネート−１％サ
ルコシル）５０μｌ中に再懸濁した。試料を、ふたを閉じた状態で、８０℃で５
分間インキュベートした。

【０１２５】次に、９６％エタノール１５０μｌを加え、インキュベーションを５分間継続
した。磁気分離機により上澄みを除去し、ビーズ−ＤＮＡ試料を７０％エタノー
ル１ｍｌで２回洗浄した。

【０１２６】ビーズ−ＤＮＡ試料をＨ_２Ｏ３０μｌ中に再懸濁し、エタノールの痕跡をすべ
て除去するためにふたを開けたままで、８０℃で１０分間インキュベートした。
精製物質３０μｌ全部を１回の５０μｌＰＣＲにおいて用いた。

【０１２７】実施例１０実施例９のプロトコルを用いて細菌を単離し、この単離した細菌を同定するた
め、以下のプライマー用いたＰＣＲ増幅を実施した。

【０１２８】実験Ａ−Ｅ表１の通り。

【０１２９】実験ＦＵＰＰＥＲ：５’ TGCTTTACACATGCAAGTCG ３’ ＬＯＷＥＲ：５’ CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG ３’

【０１３０】以下の実験で用いたビーズは、ＤｙｎａｌＡＳ製ダイナビーズM−２７０また
はＣｈｅｍａｇｅｎＡＧ製Ｍ−ＰＶＡＯＣＮ−活性化ビーズである。

【０１３１】以下の実験Ａ−Ｇで用いた細菌は次の通りである。 Aeromonas hydrophila CCUG ２５９４２ Bacillus cereus ATCC １１７７８ Bacillus cereus NVH ００７５−９５ Campylobacter jejuni CCUG ２５９０３ Clostridium perfringens ATCC １３１２４ Escherichia coli ATCC ２５９２２ Escherichia coli CCUG ３８０８１ Helicobacter pylori CCUG ３８７７１ Listeria monocytogenes ATCC ３５１５２ Listeria monocytogenes CCUG １５５２７ Neisseria gonorrhoeae ATCC ４９２２６ Salmonell typhimurium ATCC １４０２８ Salmonella typhimurium CCUG ３１９６９ Shigella flexneri CCUG ３８９４７ Streptococcus pyogenes CCUG ３０９１７ Streptococcus pneumoniae CCUG ３３０６２ Vibrio cholerae CCUG ４２５３４ Yersinia enterocolitica Noma ref １０２、Y８４２

【０１３２】以下の実験においては、一般に増幅はＤＮＡ−ビーズ複合体に直接実行した。
しかしながら、増幅手法を用いる細菌種の同定は、上澄みに実行することができ
る。ヘパリン、デキストラン硫酸およびカラギーナンのような特定の結合リガン
ドについては、硫酸基がＰＣＲ反応を阻害することがあるので、これが好ましい
ことがある。以下の実験においては、特に指示されていなければ、カラギーナン
被覆が用いられる場合は、ビーズを８０℃でインキュベートしてすべてのＤＮＡ
をビーズから放出した後に、ＰＣＲを上澄みに対して実施する。

【０１３３】この実施例においては、「カラギーナン」は、イオタカラギーナン（シグマ、
Ｃ−３８８９）を意味する。ヘパリンおよびデキストラン硫酸はシグマ社から入
手し、カタログ参照番号はそれぞれＨ３１４９およびＤ６９２４である。

【０１３４】Ａ．ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたVibrio choleraeからのゲノ
ムＤＮＡの単離増幅の結果は図４のゲル写真に示してある。

【０１３５】ゲルの左上から読む：ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカー（弱）ウエル番号２＝V. choleraeの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝V. choleraeの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝V. choleraeの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝V. choleraeの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝V. choleraeの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝V. choleraeの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝V. choleraeの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝V. choleraeの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１０＝V. choleraeの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１１＝V. choleraeの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１２＝V. choleraeの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１３＝V. choleraeの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加

【０１３６】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝V. choleraeの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号３＝V. choleraeの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号４＝V. choleraeの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号５＝V. choleraeの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号６＝V. choleraeの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号７＝V. choleraeの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号８＝V. choleraeの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号９＝V. choleraeの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１０＝ネガティブコントロール

【０１３７】Ｂ．ゴム、マンノース、カラギーナンを用いたShigella flexaneriからのゲノム
ＤＮＡの単離増幅の結果は図５のゲル写真に示してある。

【０１３８】ゲルの左上から読む：ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. flexaneriの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. flexaneriの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. flexaneriの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. flexaneriの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. flexaneriの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. flexaneriの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. flexaneriの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. flexaneriの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１０＝S. flexaneriの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１１＝S. flexaneriの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１２＝S. flexaneriの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号１３＝S. flexaneriの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加

【０１３９】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. flexaneriの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. flexaneriの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. flexaneriの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. flexaneriの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. flexaneriの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. flexaneriの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. flexaneriの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. flexaneriの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加

【０１４０】Ｃ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたE. coliからのゲノム
ＤＮＡの単離増幅の結果は図６のゲル写真に示してある。

【０１４１】ゲル上には６本のラインがあり、すべてE. coliを示す。

【０１４２】ゲルの左上から読む：ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号９＝ネガティブコントロール

【０１４３】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎ２００μｇに添加

【０１４４】ライン３：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍａｇ
ｅｎ２００μｇに添加

【０１４５】ライン４：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加

【０１４６】ライン５：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加

【０１４７】ライン６：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加

【０１４８】Ｄ．カラギーナン、マンノース、ゴム、マンナンを用いたSalmonella typhimuri
umからのゲノムＤＮＡの単離増幅の結果は図７のゲル写真に示してある。

【０１４９】ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝ネガティブコントロール

【０１５０】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１５１】ライン３：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１５２】ライン４：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、マンナン被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加

【０１５３】ライン５：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、マンノース被覆
ダイナビーズ２００μｇに添加

【０１５４】ライン６：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. typhimuriumの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. typhimuriumの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. typhimuriumの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. typhimuriumの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. typhimuriumの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. typhimuriumの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. typhimuriumの１０^−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加 Salmonella typhimuriumからのＤＮＡ単離

【０１５５】Ｅ．グアー、ゴム、マンノースおよびカラギーナンを用いたCampylobacer jejun
iからのＤＮＡ単離増幅の結果は図８のゲル写真に示してある。

【０１５６】ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、グアー被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビー
ズ２００μｇに添加ウエル番号９＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビー
ズ２００μｇに添加ウエル番号１０＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号１１＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号１２＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号１３＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号１４＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１５＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１６＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１７＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１８＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号１９＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆ダ
イナビーズ２００μｇに添加ウエル番号２０＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２１＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２２＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２３＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２４＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２５＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、マンノース被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２６＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２７＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２８＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号２９＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３０＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３１＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３２＝C. jejuniの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３３＝C. jejuniの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３４＝C. jejuniの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３５＝C. jejuniの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３６＝C. jejuniの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３７＝C. jejuniの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１５７】Ｆ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたStreptococ
cus pyrogenesからのゲノムＤＮＡの単離増幅の結果は図９のゲル写真に示してある。

【０１５８】ライン１：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅｍ
ａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１５９】ライン２：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃｈ
ｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６０】ライン３：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被覆
Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６１】ライン４：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫酸
被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後ビーズの残部にＰＣＲを実施ウエル番号１０＝S. pyrogenesの１０^−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１１＝S. pyrogenesの１０^−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１２＝S. pyrogenesの１０^−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１３＝S. pyrogenesの１０^−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１４＝S. pyrogenesの１０^−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号１５＝S. pyrogenesの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６２】Ｇ．ゴム、ヘパリン、カラギーナンおよびデキストラン硫酸を用いたNeisseria
gonorrhoeaeからのゲノムＤＮＡ単離増幅の結果は図１０のゲル写真に示してある。

【０１６３】ライン１：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆Ｃｈｅ
ｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６４】ライン２：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０^−１希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０^−２希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０^−３希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０^−４希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０^−５希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、ヘパリン被覆Ｃ
ｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６５】ライン３：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０^−１希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０^−２希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０^−３希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０^−４希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０^−５希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、カラギーナン被
覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６６】ライン４：磁石を用いてビーズから分離した上澄みを９０℃で５分間インキュベーション
した後にＰＣＲを実施ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝N. gonorrhoeaeの１０^−１希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝N. gonorrhoeaeの１０^−２希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝N. gonorrhoeaeの１０^−３希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝N. gonorrhoeaeの１０^−４希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加水中に再懸濁した後にビーズの残部にＰＣＲを実行ウエル番号６＝N. gonorrhoeaeの１０^−５希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号９＝N. gonorrhoeaeの１０^−６希釈物１００μｌを、デキストラン硫
酸被覆Ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１６７】実施例１１実験は、Ｊ５５８Ｌと呼ばれるがんＢ−細胞ラインの純培養液について実施し
た。用いたプライマーは下記の通りである。ＵＰＰＥＲ：5’ CCCGCCCCTTGCCTCTC 3’ ＬＯＷＥＲ：5’ TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3’

【０１６８】増幅の結果は図１１のゲル写真に示してある。磁石を用いてビーズから分離し
た上澄みを９０℃で５分間インキュベーションした後にＰＣＲを実施。

【０１６９】ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０^−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０^−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０^−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０^−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ｃｈｅｍａｇｅｎビーズ２００μｇに添加

【０１７０】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０^−０希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０^−１希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０^−２希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０^−３希釈物１００μｌを、タイプＩカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加

【０１７１】ライン３：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０^−０希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナ
ン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０^−１希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナ
ン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０^−２希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナ
ン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０^−３希釈物１００μｌを、タイプＩＩカラギーナ
ン被覆ダイナビーズ２００μｇに添加

【０１７２】ライン３：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝Ｂ−細胞の１０^−０希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号３＝Ｂ−細胞の１０^−１希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝Ｂ−細胞の１０^−２希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝Ｂ−細胞の１０^−３希釈物１００μｌを、タイプＶカラギーナン
被覆ダイナビーズ２００μｇに添加

【０１７３】用いた種々のタイプのカラギーナンは以下の通り（シグマ社カタログ中の製品
番号を付す）：タイプＩカラギーナン − 大部分がカッパカラギーナン：Ｃ１０１３タイプＩＩカラギーナン − 大部分がイオタカラギーナン：Ｃ１１３８タイプＶカラギーナン − イオタカラギーナン：Ｃ−３８８９

【０１７４】実施例１２ＧＵＭ被覆ビーズからE. coliを実施例８のプロトコルに従って単離した。未
被覆ビーズを被覆ビーズと同じ被覆手順に通したが、糖は加えなかった。実施例
９の単離プロトコルに続いて下記の希釈を行った。

【０１７５】ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−１希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−２希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号６＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−３希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号９＝E. coliの１０^−４希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加

【０１７６】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号３＝E. coliの１０^−５希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号４＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号５＝E. coliの１０^−６希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号７＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、未被覆ダイナビーズ２
００μｇに添加ウエル番号８＝E. coliの１０^−７希釈物１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加

【０１７７】増幅の結果は図１２のゲル写真に示してある。

【０１７８】実施例１３種々の細菌種を、実施例８のプロトコルに従ってＧＵＭ被覆ビーズから単離し
た。実施例９の単離プロトコルに続き下記の操作を行い、増幅の結果は図１３の
ゲル写真に示してある。

【０１７９】ライン１：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝未希釈のShigella flexneri１００μｌを、ゴム被覆ダイナビー
ズ２００μｇに添加ウエル番号３＝未希釈のVibrio cholerae１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号４＝未希釈のAeromonas hydrophila１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝未希釈のStreptococcus pneumonia１００μｌを、ゴム被覆ダイ
ナビーズ２００μｇに添加ウエル番号６＝未希釈のStreptococcus pyogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝未希釈のSalmonella typhimurium１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝未希釈のYersinia enterocolitica１００μｌを、ゴム被覆ダイ
ナビーズ２００μｇに添加

【０１８０】ライン２：ウエル番号１＝ＨａｅＩＩＩマーカーウエル番号２＝未希釈のE. coli１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ２００μ
ｇに添加ウエル番号３＝未希釈のListeria monocytogenes１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号４＝未希釈のClostridium perfringens１００μｌを、ゴム被覆ダイ
ナビーズ２００μｇに添加ウエル番号５＝未希釈のBacillus cereus１００μｌを、ゴム被覆ダイナビーズ
２００μｇに添加ウエル番号６＝未希釈のCampylobacter jejuni１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加ウエル番号７＝未希釈のNeissseria gonorrhoeae１００μｌを、ゴム被覆ダイナ
ビーズ２００μｇに添加ウエル番号８＝未希釈のBordetella pertussis１００μｌを、ゴム被覆ダイナビ
ーズ２００μｇに添加

【０１８１】 bordetella用プライマーは、Nesseria用のものと同じであった（表１参照）。

【図面の簡単な説明】

【図１】マンノース、マルトースおよびＧＵＭ１で被覆したビーズと結合された細菌（
E. coli）の核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。

【図２】ＧＩＭ１被覆ビーズと、未被覆ビーズと結合された細菌（B. cereus）の核酸
からのＰＣＲ産物を示すゲルの写真である。

【図３】ＧＵＭ１被覆ビーズへの多様な細菌の結合を示す一連のゲル写真を示す。

【図４】種々の被覆ビーズに結合されたVibrio choleraeの核酸からのＰＣＲ産物を示
すゲルの写真である。

【図５】種々の被覆ビーズに結合されたShigella flexneri の核酸からのＰＣＲ産物を
示すゲルの写真である。

【図６】種々の被覆ビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物を示すゲルの
写真である。

【図７】種々の被覆ビーズに結合されたSalmonella typhimuriumの核酸からのＰＣＲ産
物を示すゲルの写真である。

【図８】種々の被覆ビーズに結合されたCampylobacter jejuniの核酸からのＰＣＲ産物
を示すゲルの写真である。

【図９】種々の被覆ビーズに結合されたSteptococcus pyogenesの核酸からのＰＣＲ産
物を示すゲルの写真である。

【図１０】種々の被覆ビーズに結合されたNeisseria gonorrheaeの核酸からのＰＣＲ産物
を示すゲルの写真である。

【図１１】種々の被覆ビーズに結合されたヒト白血球細胞の核酸からのＰＣＲ産物を示す
ゲルの写真である。

【図１２】被覆および未被覆ダイナビーズに結合されたE. coliの核酸からのＰＣＲ産物
を示すゲルの写真である。

【図１３】ＧＵＭ被覆ダイナビーズに結合された種々の細菌の核酸からのＰＣＲ産物を示
すゲルの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/569 Ｂ 33/569 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｒ 1:01 //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA28 BA13 BB01 BB12 CA25 CB03 CB04 CB21 CB30 DA12 DA13 DA14 DB22 FA36 FB02 FB15 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ06 QQ41 QR43 QR55 QR62 QR83 QS12 QS16 QS25 4B065 AA01X AA15X AA23X AA29X AA30X AA39X AA40X AA46X AA48X AA49X AA55X BD50 CA46 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料から細胞を単離する方法であって、前記細胞を固体支持
体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガンドにより結合する段階を含む
方法。
【請求項２】細胞は微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】微生物は細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】試料中に存在する種々の細菌種の少なくとも３０％の代表が
前記固体支持体に結合される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】試料中に存在する種々の細菌種の少なくとも６０％の代表が
前記固体支持体に結合される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】リガンドは栄養分である、前記請求項のいずれかに記載の方
法。
【請求項７】リガンドは、炭水化物または炭水化物誘導体を含む、前記請
求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】リガンドは、単糖類、オリゴ糖類、多糖類または硫酸化多糖
類から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】リガンドは、マンノース、ゴム、グアー、ヘパリン、ヘパラ
ン硫酸、カラギーン、デキストラン硫酸およびマンナンから成る群から選択され
る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】固体支持体は粒状である、前記請求項のいずれかに記載の
方法。
【請求項１１】固体支持体に結合された１種以上の細胞を同定する段階を
さらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】細胞は細胞タイプ特異的核酸プローブを用いて同定される
、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】結合された細胞が溶解されてその核酸を放出する、請求項
１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】放出された核酸は固体支持体に結合される、請求項１３に
記載の方法。
【請求項１５】試料中の微生物を検出する方法であって、（ａ）前記微生物を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的リガン
ドにより結合する段階と、（ｂ）前記固体支持体に結合された微生物を同定する段階とを含む方法。
【請求項１６】段階（ｂ）は、微生物の溶解を含む、請求項１５に記載の
方法。
【請求項１７】溶解された前記微生物から放出された核酸は、固体支持体
に結合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】細胞に非特異的に結合し得るリガンドがその表面に固定さ
れた固体支持体。
【請求項１９】リガンドは、炭水化物または炭水化物誘導体である、請求
項１８に記載の固体支持体。
【請求項２０】試料からの細胞の全体的単離用の、請求項１８または１９
に記載の固体支持体の使用。
【請求項２１】細胞は微生物である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】細胞試料から核酸を単離する方法であって、（ａ）前記試料中の細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的
リガンドにより結合する段階と、（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、（ｃ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階とを
含む方法。
【請求項２３】試料中における標的細胞の存在または不在を検出する方法
であって、（ａ）前記試料中の細胞を固体支持体に、該固体支持体上に固定された非特異的
リガンドにより結合する段階と、（ｂ）結合された細胞を溶解する段階と、（ｃ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合する段階と、
（ｄ）結合された前記核酸内での、前記標的細胞に特徴的な核酸の存在または不
在を検出する段階とを含む方法。
【請求項２４】核酸は、細胞と同じ固体支持体に結合される、請求項２２
または２３に記載の方法。
【請求項２５】細胞は微生物である、請求項２２〜２４のいずれかに記載
の方法。
【請求項２６】試料から微生物を単離するためのキットであって、（ａ）微生物に非特異的に結合可能なリガンドがその表面に固定された固体支持
体と、（ｂ）微生物を前記固体支持体に結合するための手段と、任意に（ｃ）前記細胞を溶解するための手段と、さらに任意に（ｄ）溶解された前記細胞から放出された核酸を固体支持体に結合するための手
段とを含むキット。