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JP2003518017A - シグナル伝達の調節 - Google Patents

シグナル伝達の調節

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JP2003518017A
JP2003518017A JP2001540107A JP2001540107A JP2003518017A JP 2003518017 A JP2003518017 A JP 2003518017A JP 2001540107 A JP2001540107 A JP 2001540107A JP 2001540107 A JP2001540107 A JP 2001540107A JP 2003518017 A JP2003518017 A JP 2003518017A
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retinoid
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polypeptide
cell
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Abstract

(57)【要約】 ポリペプチドが生物学的作用を有するシグナル伝達経路に機能的に含まれるとして特定される。企図されるポリペプチドはレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、または細胞レチノイン酸結合蛋白質とは異なるが、レチノイドまたはレチノイド代謝産物の結合によって生物学的作用が調節される。特に企図される方法において、レチノイドまたはレチノイド代謝産物を細胞または哺乳動物に生物学的作用を調節するのに有効な濃度で投与する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は１９９９年１１月２３日出願の米国仮出願第６０／１６７４３８号の
利益を主張し、この開示を参照として本明細書に取り入れる。
【０００２】 （発明の分野） 本発明の分野はシグナル伝達の調節である。
【０００３】 （発明の背景） 多くの生理的および病態生理的状態は、直接または間接的にその状態を妨げる
薬物を細胞、細胞培養物、または生物に提供することによって、影響を受け得る
。例えば、生理的および病態生理的状態を直接妨げる薬物には、酵素阻害剤（例
えば、ペニシリンは細菌のトランスペプチダーゼを阻害し、またはＭｅｖｉｎｏ
ｌｉｎ（商標）は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡレダク
ターゼを阻害する）またはアンチセンス核酸（例えば、アンチセンスＤＮＡはウ
イルス遺伝子の翻訳を阻害する）が含まれる。直接妨げる薬物はその標的に対し
て高度に特異的であることが多いが、その生物学的作用は個々の生化学的変換ま
たは過程に限定されることが多い。
【０００４】 複数の生化学反応または生理学的事象を調節するために、シグナル伝達経路を
調節する薬物を用いることができ、シグナル伝達経路を妨げる多くの組成物およ
び方法が当技術分野において知られている。例えば、シグナル伝達経路を妨げる
１つの方法において、シグナリング分子（例えば、サイトカインまたはインスリ
ン）を細胞または生物に加える。シグナリング分子を加えることは有益であるこ
とが多く、特にシグナリング分子を欠く系に外因性シグナリング分子を添加して
シグナリング分子の生理学的に正常なレベルを再構成する場合に有益である。し
かしながら、外因性シグナリング分子を加えることは、特に分子が不純物および
／または不均質性を伴う免疫原性ペプチドまたはペプチド調製物である場合には
、問題となることが多い。
【０００５】 あるいは、シグナリング分子の受容体を遮断することもできるし、さもなくば
他の方法で機能的に不活性とすることもできる。例えば、ベータ遮断薬は神経系
における天然シグナルアドレナリンのベータアドレナリン受容体への結合を阻害
する。受容体遮断薬は一般に、その標的受容体の強い阻害を示すが、受容体遮断
薬は、それらが標的受容体と同じファミリーに属する場合には特に、非標的受容
体も阻害する傾向がある（例えば、種々のベータ遮断薬は非標的ベータ−２受容
体を遮断する傾向がある）。
【０００６】 もう１つの例において、シグナリングカスケード内の因子は、シグナルが細胞
の標的区画に伝達されるのを阻害または防止することもできる。シグナリングカ
スケードにおける特に有望な因子は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体キナー
ゼであり、これはＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合に依存してその基質を特異
的にリン酸化するが、最近、ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤がＶＥＧＦキナーゼ関連経
路におけるシグナリングを効果的に阻害することが明らかにされた［Ｄｒｅｖｓ
Ｊ．他、「血管内皮成長因子受容体チロシンキナーゼであるＰＴＫ７８７／Ｚ
Ｋ２２２５８４の、マウス腎細胞癌モデルにおける原発性腫瘍、転移、血管密度
、および血流量の特異的阻害に対する作用（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＰＴＫ７８
７／ＺＫ ２２２５８４、ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ
ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ，ｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ
ｔｕｍｏｒ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ａｎｄ
ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａ
ｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｄｅｋ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０（１
７）：４８１９〜２４］。しかしながら、多くの他のシグナリング経路において
種々のキナーゼが存在するため、ＶＥＧＦキナーゼ以外のキナーゼとの比較的低
い交叉反応でも、過剰な非標的経路を破壊する可能性がある。
【０００７】 さらに他の例において、シグナリングカスケードの終点における因子および過
程が、シグナルが細胞内で調節または他の機能に翻訳されることを阻害または防
止することもできる。「終点阻害」の典型的な例は、シグナルに反応して生成さ
れる転写産物にハイブリダイズするか、あるいはシグナルによって活性化される
標的配列と三重らせんを形成する、アンチセンス核酸の使用である。
【０００８】 シグナル伝達経路を妨げる種々の方法が当技術分野において知られているが、
それらのすべて、またはほとんどが１つまたは複数の欠点を有している。したが
って、シグナル伝達経路を妨げる新規な方法を提供する必要がある。
【０００９】 （発明の概要） 本発明の目的は、系におけるシグナル伝達経路を細胞特異的に調節する組成物
および方法である。１つの工程において、シグナル伝達経路は、レチノイドまた
はレチノイド代謝産物を結合する細胞ポリペプチドを機能的に含むとして特定さ
れる；ここで、細胞ポリペプチドはレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、レチノイド
Ｘ受容体（ＲＸＲ）、視色素（ｖｉｓｉｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔ）、および細胞レ
チノイン酸結合蛋白質（ＣＲＡＢＰ）のいずれでもなく、かつ、レチノイドまた
はレチノイド代謝産物の結合によって、シグナル伝達経路によって調節される生
物学的作用が調節される。さらなる工程において、レチノイドまたはレチノイド
代謝産物を生物学的作用を調節するために有効な濃度で系（例えば、哺乳動物、
細胞、または組織培養物）に投与する。
【００１０】 本発明の１つの態様において、レチノイドは、シス配置を有し、９−シス−レ
チノイド、４−ヒドロキシフェニル−レチナミド、または４−ヒドロキシフェニ
ル−レチナミド類縁体であることが好ましい。さらに企図されるレチノイドおよ
びレチノイド代謝産物には、レチニルイノシチド、脂質複合レチノイド、イオウ
含有レチノイドの種々の立体異性体が含まれ、特に企図されるレチノイド代謝産
物には硫酸化レチノイドおよびＳ−アデノシルレチノイドが含まれる。
【００１１】 本発明の別の態様において、細胞ポリペプチドはイオンチャネルを含み、Ｋ+
、Ｃａ2+、Ｎａ+、またはＣｌ-特異性を有するイオンチャネルが好ましく、イオ
ンチャネルはスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）と機能的に協同作用することが特
に好ましい。イオンチャネルがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）ゲート（ｇａｔｅ
ｄ）カリウムチャネル複合体を含むことがさらに特に企図される。
【００１２】 本発明のさらなる態様において、企図される生物学的作用はレチノイドまたは
レチノイド代謝産物の結合によって増幅され、特に企図される生物学的作用には
細胞分裂、インスリン分泌、細胞増殖、および不整脈が含まれる。
【００１３】 本発明のさらなる態様において、企図されるレチノイドは複峰性作用（ｂｉｍ
ｏｄａｌ ｅｆｆｅｃｔ）を有し、第一の濃度でのレチノイドまたはレチノイド
代謝産物の投与は第一の生物学的作用を調節し、第二の濃度でのレチノイドまた
はレチノイド代謝産物の投与は第二の生物学的作用を調節する。
【００１４】 本発明の種々の目的、特徴、態様、および利点は、下記の本発明の好ましい実
施形態の詳細な説明および添付の図面より明らかになるであろう。
【００１５】 （詳細な説明） 一般に、レチノイドは、レチノイド酸受容体（ＲＡＲ）および／またはレチノ
イドＸ受容体（ＲＸＲ）への結合を介して種々のシグナル伝達経路において相互
作用すると考えられている［例えば、Ｖｉｔａｍｉｎｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎ
ｅｓ、４９、３２７〜３８２（１９９４）を参照されたい］。例えば、レチノイ
ドのＲＡＲおよび／またはＲＸＲへの結合がアポトーシスに関与するシグナル伝
達経路において示されている［例えば、Ｋａｓｔｎｅｒ，Ｐ．他、「遺伝子発現
の調節における核レチノイド酸受容体の役割；健康および疾患におけるビタミン
Ａ（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ａｃｉｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄ
ｉｅａｓｅ）」、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １
８９〜２３８（１９９４）を参照されたい］。さらに一般には、ＲＡＲおよび／
またはＲＸＲは、他のＲＡＲおよび／またはＲＸＲ分子または他の核転写活性化
因子との二量体としての核転写活性化因子として作用すると考えられている。
【００１６】 驚くことに、発明者らはレチノイドおよび／またはレチノイド代謝産物がＲＡ
Ｒおよび／またはＲＸＲ以外の細胞ポリペプチドにも結合すること、ならびにレ
チノイドおよび／またはレチノイド代謝産物のそのような細胞ポリペプチドへの
結合によって、そのような細胞ポリペプチドを機能的に含むシグナル伝達経路に
おいて生物学的作用を調節することを見いだした。
【００１７】 したがって、系における生物学的作用を制御するシグナル伝達経路を細胞特異
的に妨げる方法は、シグナル伝達経路がレチノイドまたはレチノイド代謝産物を
結合する細胞ポリペプチドを機能的に含むとして特定される１つの工程を含むこ
とができることが企図されるが、ここで、企図される細胞ポリペプチドはＲＡＲ
、ＲＸＲ、視色素、またはＣＲＡＢＰ以外のポリペプチドであり、かつ、レチノ
イドまたはレチノイド代謝産物のそのようなポリペプチドへの結合により生物学
的作用が調節されるものである。さらなる工程において、レチノイドまたはレチ
ノイド代謝産物は生物学的作用を調節するために有効な濃度で系に投与される。
本明細書において用いられる「細胞ポリペプチドへの結合」なる用語は、細胞ポ
リペプチドが１０-3／Ｍｏｌ未満の解離定数で結合した物質を保持することを意
味するが、レチノイドをレチノイド代謝産物に変換する酵素の触媒活性部位（ｃ
ａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）へのレチノイドの結合は
特に除外する。
【００１８】 本発明の１つの特定の態様において、発明者らは、９−シスレチノイン酸をマ
ウスにインビボ投与すると、心筋細胞の増殖が低下すること、特に心臓ニューロ
ンおよび心臓伝導細胞（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）における対応するミ
トコンドリアシグナル伝達経路でのシグナル増幅により心臓ニューロンおよび心
臓伝導細胞のアポトーシスが引き起こされること、を見いだした（下記の実験デ
ータを参照されたい）。
【００１９】 心臓ニューロンおよび心臓伝導細胞、ならびに心筋細胞は、有意な量のＲＸＲ
およびＲＡＲを含むことに、特に留意すべきである［例えば、Ｇｅｏｒｇｉａｄ
ｅｓ Ｐ、Ｂｒｉｃｋｅｌｌ ＰＭ、「ラット心臓細胞におけるレチノイドＸ受
容体−ガンマ遺伝子転写産物レベルの調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅ
ｔｉｎｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｒａｔ ｈｅａｒｔ ｃｅｌｌｓ）」；Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ １９９８；２２（６）：４５７〜６３、およびＫａｓｔｎ
ｅｒ他、「ビタミンＡ欠乏ならびにＲＸＲアルファ、ＲＸＲベータおよびＲＡＲ
アルファの突然変異は胎児心室心筋細胞の早期分化を引き起こす（Ｖｉｔａｍｉ
ｎ Ａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＲＸＲａ
ｌｐｈａ，ＲＸＲｂｅｔａ ａｎｄ ＲＡＲａｌｐｈａ ｌｅａｄ ｔｏ ｅａ
ｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｖｅｎ
ｔｒｉｃｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）」；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ １９９７ Ｄｅｃ；１２４（２３）：４７４９〜５８を参照されたい］。実
際のところであるならば、９−シスレチノイドまたはその代謝産物のＲＡＲおよ
び／またはＲＸＲへの結合がアポトーシスシグナル伝達経路においてシグナルの
増幅を引き起こす。当業者であれば心臓ニューロン、心臓伝導細胞、および心筋
細胞のすべてにおけるシグナル伝達経路の調節を期待するであろう。しかしなが
ら、アポトーシスは心臓ニューロンおよび心臓伝導細胞において細胞特異的に誘
導されたが、心筋細胞では誘導されなかった。したがって、アポトーシスシグナ
ル伝達経路の調節は、ＲＡＲおよび／またはＲＸＲ、ならびに／またはＲＸＲを
含む異質二量体複合体への９−シスレチノイドの結合によって仲介されるのでは
なく、９−シスレチノイドの別の結合標的への結合によって仲介されることが企
図される。
【００２０】 ９−シスレチノイドまたはその代謝産物の別の（非ＲＡＲ／非ＲＸＲ）結合標
的に関して、心臓ニューロン、心臓伝導細胞、および心筋細胞がミトコンドリア
ＡＴＰゲートＫ+チャネルを有することが既知であることが理解されるべきであ
る（例えば、Ｌｉｇｈｔ ＰＥ他、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ．４
４、３５６〜３６９、１９９９；Ｉｒｉｓａｗａ Ｈ他、「洞房結節における心
臓ペースメーキング（Ｃａｒｄｉａｃ ｐａｃｅ ｍａｋｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ
ｓｉｎｏ−ａｔｒｉａｌ ｎｏｄｅ）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３，１９
７〜２２７、１９９３；Ｇａｒｌｉｄ ＫＤ，ミトコンドリアにおけるカチオン
輸送−カリウムサイクル（Ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ ｍｉｔｏ
ｃｈｏｎｄｒｉａ−ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｙｃｌｅ）」、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２７５、１２３〜１２６、１９９６を参照
されたい）。さらに、ミトコンドリアＡＴＰゲートＫ+チャネルは、Ｋ+の流量を
増大させてその結果Ｃａ2+の流量を増大させることにより、アポトーシス過程に
関与していることが提唱されている。興味深いことに、ミトコンドリアＡＴＰゲ
ートＫ+チャネルは蛋白質複合体においてスルホニル尿素受容体（ＳＵＲ）によ
って調節されることが明らかにされており、ＳＵＲは心筋細胞において２型とし
て発現されたときと、心臓ニューロン心臓／伝導細胞において１型として発現さ
れたときとで、その基質に対して明らかに異なる結合親和性を有し（Ａｇｕｉｌ
ａｒ−Ｂｒｙａｎ Ｌ ａｎｄ Ｂｒｙａｎ Ｊ、「アデノシン三リン酸感受性
カリウムチャネルの分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｔ
ａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ）」、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖｉｅｗ ２０、１
０１〜１３５、１９９９）、心筋細胞における２型ＳＵＲは一般に種々の基質（
例えば、種々のスルホニル尿素系薬物）に対し、心臓ニューロン心臓／伝導細胞
における１型ＳＵＲよりも低い親和性を有することが知られている（Ｉｎａｇａ
ｋｉ Ｎ他、「スルホニル尿素受容体のファミリーはＡＴＰ感受性Ｋ+チャネル
の薬理学的性質を決定する（Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅ
ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＡＴＯ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋ + ｃｈａｎｎｅｌｓ）」、Ｎｅｕｒｏｎ １６（５）、１０１１〜１０１７、
１９９６）。心臓伝導細胞（すなわち、心臓伝導系を含む細胞）は１型ＳＵＲを
含み、心筋細胞は２型ＳＵＲを含むとの仮説も立てられている。種々の基質のＳ
ＵＲへの結合がＡＴＰゲートＫ+チャネルの活性を調節することも知られている
（Ｂａｕｋｒｏｗｉｔｚ Ｔ他、「ＫＡＴＰチャネルのＡＴＰ阻害の決定子とし
てのＰＩＰ２およびＰＩＰ（ＰＩＰ２ ａｎｄ ＰＩＰ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｎｔｓ ｆｏｒ ＡＴＰ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＫＡＴＰ ｃｈａ
ｎｎｅｌｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１１４１〜１１４４、１９９８；Ｆ
ａｎ Ｚ ａｎｄ Ｍａｋｉｅｌｓｋｉ ＪＣ、「アニオン性リン脂質はＡＴＰ
感受性カリウムチャネルを活性化する（Ａｎｉｏｎｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐ
ｉｄｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２、５３８８〜５３９
５、１９９７；Ｈｅｒｏｎ Ｌ他、「スルホニル尿素感受性ＫＡＴＰチャネルの
調節物質としての可能性があるヒトアルファエンドスルフィン：分子クローニン
グ、発現および生物学的性質（Ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ−ｅｎｄｏｓｕｌｆｉｎ
ｅ，ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒ
ｅａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＫＡＴＰ ｃｈａｎｎｅｌ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒ
ｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
９５、８３８７〜８３９１、１９９８；Ｈｏｌｅｍａｎｓ他、「フルオレセイン
誘導体のラット脳におけるグリベンクラミド結合部位との相互作用（Ｉｎｔｅｒ
ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉ
ｔｈ ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒａ
ｔ ｂｒａｉｎ）」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ．１８３、１８３〜
１８６、１９９５）。発明者らの知見（未発表データ）に基づくが、特定の仮説
または理論にしばられることを意図するものではなく、レチノイドおよびその代
謝産物がＳＵＲおよび／またはＳＵＲ−Ｋ+チャネル複合体に特異的に結合する
ことが企図され、そのような結合がＡＴＰゲートＫ+チャネルの活性を調節（例
えば、アップレギュレート）することがさらに企図される。
【００２１】 本発明のさらなる態様において、シグナル伝達経路に細胞特異的を妨げる別の
方法において、系はマウスに限定される必要はなく、適当な系にはインビボおよ
びインビトロの系が含まれることが企図される。例えば、適当なインビトロの系
には細胞および組織培養物が含まれ、この場合、細胞が生体試料（例えば、生検
）、二次細胞培養物、または解凍した細胞もしくは組織サンプル由来であっても
よい。特に企図される細胞は哺乳動物細胞であるが、哺乳動物以外の脊椎動物お
よび無脊椎動物も企図される。特に企図されるインビボの系には、哺乳動物（特
にヒト）、哺乳動物以外の脊椎動物、および無脊椎動物（例えば、酵母）が含ま
れる。
【００２２】 レチノイドに関して、知られているすべてのレチノイドは、本明細書に示され
る教示と併用することが適していることが企図され、具体例としてのレチノイド
がＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ（Ｍａｒｃｉａ Ｄａｗｓｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｈ．Ｏｋ
ａｍｕｒａ（編）、ＣＲＣ Ｐｒ；ＩＳＢＮ：０８４９３４７９７１）、Ｒｅｔ
ｉｎｏｉｄｓ：Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｄ Ｒｅｔｉｎｏｉｄ Ａｃｔ
ｉｏｎ（Ｈｅｉｎｚ Ｎａｕ（編）、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｓ．Ｂｌａｎｅｒ（編）
；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；ＩＳＢＮ：３５４０６５８９２０）、また
はＲｅｔｉｎｏｉｄｓ（Ｍａｒｉａ Ａ．Ｌｉｖｒｅａ、Ｌｅｓｔｅｒ Ｐａｃ
ｋｅｒ（編）；Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７８７５８７
）に記載されており、これらはすべて参照として本明細書に取り入れる。しかし
ながら、レチノイドは少なくとも１つのシス配置を含むことが好ましく、シス配
置は９−シス配置（例えば、９−シスレチノイン酸）であることが特に企図され
る。具体例としてのレチノイドを図２に示しているが、式中、Ｒ1〜Ｒ18はＨ、
ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリールか
ら独立に選択され、これらはすべて独立して、ハロゲン、官能基（例えば、ＣＨ
Ｏ、ＣＯＯＨ、ＮＯ2、ＮＯ、ＮＨ2、ＮＨ、ＳＯ2、ＳＯ、ＰＯ4 3-）、単糖、二
糖、および多糖を含む極性および／または親水性基、脂肪酸、脂質、ステロイド
などを含む非極性および／または疎水性基、ならびにアミノ酸および／またはア
ミノ酸誘導体をさらに含んでいてもよい。企図されるＲ1〜Ｒ18は、ペンディン
グを含むＲ1〜Ｒ18の種々の位置または骨格にあることができる、複素原子をさ
らに含んでいてもよい。企図されるレチノイドの立体異性体またはキラル異性体
が存在する場合、すべての化学的に妥当な配置（Ｒ、Ｓ、シス、およびトランス
の配置）が企図される。例えば、適当なレチノイドは示した９−シス配置に限定
される必要はないが、全トランス、９−シス−１１−シス−１３−トランス配置
なども含むことができる。しかしながら、本明細書において用いられるレチノイ
ド」なる用語は、「調節された細胞増殖および細胞死におけるレトロレチノイド
（Ｒｅｔｒｏ−Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｇ
ｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅａｔｈ）」、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ １９９６、１８４：５４９〜５５５に記載のレトロレチノイドは特に除外す
る。
【００２３】 さらなる企図される態様において、レチノイド類縁体が適当な代替レチノイド
として企図される。本明細書において用いられる「レチノイド類縁体」なる用語
は、Ｖｕｌｉｇｏｎｄａら（２０００年３月７日）の米国特許第６０３４２４２
号に概説されているとおり、慣用的にレチノイン酸誘導体によるものとされる活
性を示すいかなる分子をも意味し、前述の開示を参照として本明細書に取り入れ
る。特に企図されるレチノイド類縁体は、米国特許第６１１７８４５号に記載の
４−ヒドロキシフェニル−レチナミドまたは４−ヒドロキシフェニル−レチナミ
ド類縁体であり、この開示も参照として本明細書に取り入れる。さらなる企図さ
れるレチノイド類縁体は、ＲＸＲの二環式スペース配座的に制約された既知リガ
ンドを特に含み、ＬＧ１０６９などのＲＸＲアゴニスト、およびＢｅｎｏｉｔら
（「ＲＡＲ独立ＲＸＲシグナリングはｔ（１５；１７）白血病細胞の成熟を誘導
する（ＲＡＲ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＸＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄ
ｕｃｅｓ ｔ（１５；１７）ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏ
ｎ）」ＥＭＢＯ Ｊ（１９９９）１８（２４）、７０１１〜７０１８）によって
記載された化合物を特に含む。
【００２４】 レチノイドおよびレチノイド類縁体は１つまたは複数の生化学的（例えば、酵
素による）または熱力学的（例えば、熱異性化）変換において代謝され、レチノ
イド代謝産物またはレチノイド類縁体代謝産物を生成することもできることが特
に理解されるべきである。レチノイドおよび／またはレチノイド類縁体を代謝す
ることができる多くの代謝的変換があり、既知のすべての代謝的変換が企図され
る。例えば、代謝的変換は、極性、荷電、親油性または親水性基、イオウ、窒素
、または酸素含有基などを含む、化学的官能性または基の付加を含むことができ
る。さらなる企図される基には、スルフェート、チオール、およびアデノシルメ
チオニンが特に含まれるが、糖類（例えば、ヘキソースおよび／またはペントー
ス）および複素環式化合物（例えば、塩基）も含まれ、これらは糖および／また
はアルコールにさらに連結されていてもよい。したがって、レチノイド代謝産物
には硫酸化レチノイドおよびＳ−アデノシルレチノイド、ならびにレチノールイ
ノシチドの種々の立体異性体が含まれることが企図される。
【００２５】 レチノイドまたはレチノイド代謝産物が結合する細胞ポリペプチドはＳＵＲ−
ＡＴＰゲートＫ+チャネル複合体に限定される必要はなく、別のポリペプチドに
はカルシウムイオン、ナトリウムイオン、または塩素イオンに選択性を有するイ
オンチャネルが含まれることが、さらに理解されるべきである。イオンチャネル
がＳＵＲと機能的に協同作用する（ｃｏｏｐｅｒａｔｅ）ことが特に企図される
。別のさらなる企図されるポリペプチドは、調節膜貫通ペプチドのＭｉｎＫファ
ミリーの構成員と共に、内向き整流カリウムチャネルＨＥＲＧを含む複合体を含
む。本明細書において用いられる「イオンチャネルがＳＵＲと機能的に協同作用
する」なる用語は、イオンチャネルの活性がＳＵＲによって直接または間接的に
影響を受けることを意味する。本明細書において用いられる「直接影響を受ける
」なる用語は、ＳＵＲがイオンチャネルに物理的に結合し、レチノイドのＳＵＲ
および／またはＳＵＲ−イオンチャネル複合体への結合がイオンチャネルの活性
に影響をおよぼすことを意味する。本明細書において用いられる「間接的に影響
を受ける」なる用語は、ＳＵＲがイオンチャネルに物理的に結合しておらず、レ
チノイドまたはレチノイド代謝産物がＳＵＲに結合したときにイオンチャネルの
活性がＳＵＲとイオンチャネル複合体との間の少なくとも１つの中間分子によっ
て調節され得ることを意味する。さらなる企図される別の細胞ポリペプチドは、
細胞解毒のための膜輸送蛋白質を含み、ｍｇｍおよびＰｇＰのファミリーの構成
員を特に含む。
【００２６】 したがって、別の生物学的作用（すなわち、アポトーシス以外の生物学的作用
）は、イオンチャネルおよび／またはＳＵＲを含むシグナル伝達経路によって仲
介されるすべての生物学的作用を含むことが企図される。例えば、神経内分泌細
胞のインスリン分泌は少なくとも部分的にはＫ+イオンチャネルおよび／または
ＳＵＲの活性によって調節されることが知られている（例えば、Ｇｒｉｂｂｌｅ
Ｆ他、「スルホニル尿素の組織特異性（Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ
ｙ ｏｆ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ）」Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７、１４１２
〜１４１８、１９９８を参照されたい）。同様に、少なくとも部分的にはＫ+イ
オンチャネルおよび／またはＳＵＲの活性に関連している種々の神経内分泌障害
が企図される（例えば、Ｓｈｙｎｇ ＳＬ他、「小児期における持続性高インス
リン血性低血糖症に関連するスルホニル尿素受容体１における新規突然変異の機
能分析（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔ
ａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｙｐｅｒｉｎ
ｓｕｌｉｎｅｍｉｃ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ ｏｆ ｉｎｆａｎｃｙ）」、
Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７、１１４５〜１１５０、１９９８を参照されたい）。さ
らに企図される疾患には、病因論において塩素イオンチャネルの機能不全に関与
することが知られている嚢胞性線維症が含まれる。別の例において、企図される
生物学的作用には、細胞増殖、細胞分裂、および不整脈も含まれ、これらはすべ
てイオンチャネルおよび／またはＳＵＲを含むシグナル伝達経路によって調節さ
れることが企図される（Ｍａｌｈｉ Ｈ他、「１次ラット肝実質細胞およびヒト
肝細胞系統において、ＫＡＴＰチャネルは細胞分裂促進的に誘導された増殖を調
節する（ＫＡＴＰ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ
ａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｍａｒ
ｙ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃｅ
ｌｌ ｌｉｎｅｓ）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、２６０５０〜７、２
０００；Ｎｏｂｌｅ Ｄ、「心拍および心不整脈のイオンから見た基礎（Ｔｈｅ
ｉｏｎｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｒｔｂｅａｔ ａｎｄ ｏｆ
ｃａｒｄｉａｃ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）」：ＢＮ Ｓｉｎｇｈ、ＨＪＪ
Ｗｅｌｌｅｎｓ、Ｍ Ｈｉｒａｏｋａ（編）：「心不整脈の電気薬理学的制御（
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃａ
ｒｄｉａｃ Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ）」、Ｍｏｕｎｔ Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ、Ｆ
ｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌ．１９９４、ｐ．３〜２０、および以下の章）。さらなる
例において、レチノイド結合モチーフがＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）を含む場
合、レチノイドの投与は癌細胞における薬物耐性表現型の調節を含んでいてもよ
いことが企図される（例えば、ＰｇＰまたはｍｄｍにおけるＡＢＣとの相互作用
を介して）。生物学的作用の調節は生物学的作用の増幅または低減を含んでいて
もよいことがさらに理解されるべきである。
【００２７】 レチノイドはイオンチャネル以外の細胞ポリペプチドにも結合しうることがさ
らに企図され、適当な別のポリペプチドには、膜貫通蛋白質、膜関連蛋白質、細
胞質ゾル蛋白質、ミトコンドリア、小胞体、エンドソーム、および核を含む細胞
区画に関連するまたは該細胞区画内に位置する蛋白質が含まれる。例えば、特に
企図される別の細胞ポリペプチドには、ＰＩ3−キナーゼ、蛋白質キナーゼＢ、
ＰＩ4−キナーゼ、ＰＩ4,5−キナーゼ、およびリン酸イノシトール受容体アイソ
フォームなどのイノシチド結合ポリペプチドが含まれる。細胞外ＡＴＰ、ｂｃｌ
−ｘおよびｂｃｌ−２によって調節されるＰ2Ｘイオンチャネルも企図される。
ＩＴＰ／ＩＤＰおよびＧＴＰ／ＧＤＰ結合蛋白質が特に好ましく、全トランスレ
チノイドの結合よりもシスレチノイドの結合が特に好ましい。しかしながら、Ｒ
ＡＲ、ＲＸＲ、およびＣＲＡＢＰ−Ｉ、ＣＲＡＢＰ−ＩＩ、および視経路におけ
るレチノイドイソメラーゼは、適当な代替細胞蛋白質から特に除外される（Ｗａ
ｌｄ，Ｇ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １６２、２３０〜２３９（１９６８））。代替の
細胞ポリペプチドは、転写因子として単独または他の蛋白質との組み合わせで作
用する核ポリペプチドではないことを理解しなければならない。
【００２８】 したがって、レチノイドおよびレチノイド代謝産物の少なくとも１つを含むリ
ガンドを有し、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および細胞レチノイ
ン酸結合蛋白質以外のポリペプチドをさらに有する、リガンド−ポリペプチド複
合体が企図される；ここで、ポリペプチドはリガンドを１０-3／Ｍｏｌ未満の解
離定数で結合し、かつ、リガンドのポリペプチドへの結合によってシグナル伝達
経路における生物学的作用は調節される。
【００２９】 レチノイドまたはレチノイド代謝産物の投与に関して、典型的には特定の系に
よって特定の投与が決定されることが企図される。例えば、系が細胞または組織
培養物である場合、投与は典型的にはレチノイド含有溶液を細胞または組織培養
物と混合することを含む。他方、系がヒト、哺乳動物、または他の動物である場
合、適当な投与には経口もしくは非経口投与、注射、注入、局所または経皮適用
などが含まれる。同様に、投与の計画は主として特定の系および生物学的作用に
依存することになることが理解されるべきであり、したがって、計画はかなり変
動し得ることが企図される。例えば、いくつかの細胞培養物においては、１回の
投与で所望の生物学的作用の調節が得られる一方で、ヒトへの投与では所望の生
物学的作用の調節を得るためには複数回の投与を必要とし得る。
【００３０】 同様に、レチノイドまたはレチノイド代謝産物の用量はかなり変動し得るもの
であり、用量は一般に数マイクログラムから数グラムの範囲内にあることが企図
される。しかしながら、系におけるレチノイドの濃度は約１マイクロモルから約
１０マイクロモルの間であることが好ましい。本発明のさらなる企図される態様
において、企図されるレチノイドまたはレチノイド代謝産物の投与は、投与され
るレチノイドおよびレチノイド代謝産物の量に関して複峰性作用を有することが
理解されるべきである。数ある作用の中でも、発明者らは、適度の量（すなわち
、３〜１０ｍｇ／ｋｇ）の９−シスレチノイン酸をマウスに投与すると心筋細胞
、心臓ニューロン、および心臓伝導細胞の増殖低下を引き起こすが、高用量（す
なわち、２０ｍｇ／ｋｇ以上）の９−シスレチノイン酸を投与すると心筋細胞の
増殖低下、ならびに心臓ニューロンおよび心臓伝導細胞のアポトーシスを引き起
こすことを見いだした。したがって、レチノイドおよび／またはレチノイド代謝
産物は複峰性の活性を示すことが企図される。したがって、第一の濃度でのレチ
ノイドおよび／またはレチノイド代謝産物の投与は第一の生物学的作用を調節し
、第二の濃度でのレチノイドおよび／またはレチノイド代謝産物の投与は第二の
生物学的作用を調節することが企図される。特に企図される第一の生物学的作用
は心筋細胞の増殖低下を含み、特に企図される第二の生物学的作用は心臓ニュー
ロンおよび心臓伝導細胞におけるアポトーシス誘導を含む。
【００３１】 （実験データ） （動物実験） １週齢のＣＬ５７／ｂｌマウス同腹仔（体重約３ｇ）を５から１０匹の群に分
け、担体中全トランス−ＲＡ、担体中９−シス−レチノイン酸（ＲＡ）、または
担体（キャノーラ油、Ｓｉｇｍａ）で処置した。各治療群を１匹の授乳母マウス
に割り付けた。実験変数としての摂食頻度の制限を除外するため、１０匹を超え
る群は避けた。胃管栄養補給用のレチノイド調製物は、すべてのマウスが担体中
４０ｍｇ／ｋｇの全トランス−ＲＡ、担体中１２ｍｇ／ｋｇもしくは２０ｍｇ／
ｋｇの９−シス−ＲＡ、または担体単独を含む、最大１５０μｌの量を投与する
ように調合した。ＤＭＳＯまたはエタノール含量は０．１％に制限した。仔マウ
スに屈曲静脈カテーテルを接続したツベルクリンシリンジから胃管栄養補給した
。強い吸乳反射によって粘稠で臭いのある調合物の送達が促進された。母マウス
の縄張り保護行動に応じて、仔マウスの異常な臭いによる母の子殺し行動誘発を
防止するために、胃管栄養補給後、仔マウスを簡単にケージストレイで巻いた。
胃管栄養補給後２時間は、母親の子殺しを防止するため仔マウスを注意深くモニ
ターした。２４時間毎に体重を記録した。
【００３２】 取り込みの動力学のために、処置仔マウス対を１時間、２時間、４時間、８時
間、１６時間、２４時間、３６時間および７２時間後に断頭により屠殺した。解
剖顕微鏡下で臓器を摘出し、液体窒素中で凍結した。外科的解剖顕微鏡下で心臓
を摘出し、組織を心房、心室、および伝導系が豊富な部分（プルキンエ線維を伴
う心室中隔および洞結節を伴う大動脈と肺動脈（流出路）との間の心房領域を含
む組織調製物）に分けた。免疫組織検査のために、仔マウスを７２時間後に屠殺
し、心臓をＰＢＳ中で洗浄し、秤量し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で
固定した後、標準的クライオスタット法のためにＯＣＴに包埋した。仔マウスが
瀕死状態であれば（典型的には胃管栄養補給後３６から７２時間の間）、屠殺し
て共焦点顕微鏡検査またはＨＰＬＣのために心臓を摘出した。
【００３３】 （免疫組織検査） 共焦点顕微鏡検査のために、クライオスタット切片をまずＴＵＮＥＬプロトコ
ルに従ってアポトーシスＤＮＡ鎖切断について染色し（Ａｐｏｐｔａｇキット、
Ｏｎｃｏｒ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、次いで伝導細胞をウサギ抗コネキシ
ン３７抗体もしくはウサギ抗コネキシン４０抗体により対比染色するか、心筋細
胞をウサギ抗ミオシン抗体により対比染色した。コネキシンアイソフォーム４０
および４３の免疫検出は、げっ歯類における心臓伝導系の細胞を検出するための
有用な方法として確立されている（Ｇｏｕｒｄｉｅ他、「ギャップ結合における
コネキシン４０およびコネキシン４３の空間分布および相対量は心臓房室伝導系
の成分の機能的性質に相関する（Ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｇａｐ−ｊｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｎｅｘｉｎ４０ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３ ｃ
ｏｒｒｅｌａｔｅ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｄｉａｃ ａｔｒｉｏｖｅｎｔ
ｒｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ １０５（Ｐｔ４）９８５〜９９１、１９９３）。コネキシン４０
のシグナルは比較的弱いため、マウスモデルにおける伝導系のための同等なマー
カーとしてコネキシンアイソフォーム３７を用いることができる（Ｗｉｌｌｅｃ
ｋｅ Ｋ他、１９９１；Ｗｉｌｌｅｃｋｅ Ｋ、個人的情報）。ウサギ抗ニュー
ロン特異的エノラーゼをヨウ化プロピジウムと合わせることは報告されている方
法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）に従い、核のアポトーシス凝縮が進んだ心臓ニューロンを特定するた
めに用いた。免疫組織検査および画像解析の方法は，ＧｒａｕｐｎｅｒのＷＯ０
０／５３２３６号にさらに詳細に記載されている。
【００３４】 ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、全ＩＧＦ結合蛋白質群（ＩＧＦＢＰ１−５）、Ｉ
ＧＦ−Ｒ、ミトコンドリアＭｎ依存性スーパーオキシドジスムターゼＭｎ−ＳＯ
Ｄ、および細胞質Ｃｕ／Ｚｎ依存性スーパーオキシドジスムターゼＣｕ／Ｚｎ−
ＳＯＤに対する市販の最高純度の一次抗体を製造者が推奨する希釈率で用いて、
アポトーシスのメカニズムを調べた。心臓ミオシン、アクチン、コネキシン３７
、コネキシン４０、およびコネキシン４３抗血清を用いて、対比染色により細胞
表現型を特定した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ−３００ソフトウェアにより共焦点画像
を捕捉および処理して、定量分析を行った。簡単に言うと、各抗体／二次抗体の
組み合わせのために、チャネルバックグラウンドに相当する単位面積あたりのピ
クセル強度を求め、実験によるピクセル強度から差し引いた。高シグナル領域の
蛍光チャネルあたりのピクセル強度を単位面積あたりのピクセル強度に標準化し
、対照領域におけるピクセル強度も同様にした。組織の型およびレチノイド処置
条件ごとに少なくとも５つのほぼ同じサイズの独立した領域を解析した。９−シ
スレチノイド誘導による単位面積あたりの平均ピクセル強度を、９−シスレチノ
イド誘導非存在下での単位面積あたりの平均ピクセル強度の倍数として表した（
誘導倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）＋／−ｓ．ｅ．ｍ．）。
【００３５】 ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、全ＩＧＦ結合蛋白質群（ＩＧＦＢＰＩ−５）、Ｉ
ＧＦ−Ｒ、ミトコンドリアＭｎ依存性スーパーオキシドジスムターゼＭｎ−ＳＯ
Ｄ、および細胞質Ｃｕ／Ｚｎ依存性スーパーオキシドジスムターゼＣｕ／Ｚｎ−
ＳＯＤに対する市販の最高純度の一次抗体を製造者が推奨する希釈率で用いて、
アポトーシスのメカニズムを調べた。心臓ミオシン、アクチン、コネキシン３７
、コネキシン４０、およびコネキシン４３抗血清を用いて、対比染色により細胞
表現型を特定した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ−３００ソフトウェアにより共焦点画像
を捕捉および処理して、定量分析を行った。
【００３６】 一例として、２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ投与後、または担体投与後の周産
期マウスの心臓切片からの対の共焦点レーザー顕微鏡写真を図３Ａ〜３Ｄに示す
。アポトーシス事象を細胞表現型に相関付けるため、アポトーシス細胞を共焦点
顕微鏡の透過光モードで特定し、ＤＩＣ画像を記録し、一致する画像を蛍光モー
ドでスキャンして、正確なオーバーレイ画像を得た。
【００３７】 図３Ａは２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ処置後のマウス心臓の流出路領域にお
けるアポトーシス細胞の発生および分布を示している。図３Ｂはマウス伝導細胞
マーカーコネキシン３７によるアポトーシス細胞の染色を示す、対応する蛍光画
像である。図３Ｃは担体処置後のマウス心臓の流出路領域にアポトーシス細胞が
発生していないことを示している。図３Ｄは同じ切片でマウス伝導細胞マーカー
コネキシン３７により染色された細胞の存在を示す、対応する蛍光画像である。
【００３８】 周産期マウスの心臓切片の定量的共焦点分析のさらなる例を、図４Ａ〜４Ｄに
グラフ形式で示す。各抗体／二次抗体の組み合わせのために、チャネルバックグ
ラウンドに相当するピクセル強度（単位面積あたり）を求めた。このバックグラ
ウンドシグナルを、異なる実験条件下または対照条件下で観察された単位面積あ
たりのピクセル強度から差し引いた。同じ実験条件下、推定上等しい細胞環境の
異なる領域で、実質的に異なるレベルのマーカー発現が観察された場合には、そ
のようなシグナルを分類し、別々のバーで示した（例えば、図４ＢではＣｕ／Ｚ
ｎ−ＳＯＤレベル、および図４ＣではＩＧＦ−受容体レベル）。組織の型および
レチノイド処置条件ごとに少なくとも５つのほぼ同じサイズの独立した領域を解
析した。バックグラウンドを補正し、面積で標準化したピクセル強度の平均を求
め、相対ピクセル強度として表した。図４Ａにおいて、９−シスレチノイド誘導
による単位面積あたりの平均ピクセル強度を、９−シスレチノイド誘導非存在下
での単位面積あたりの平均ピクセル強度の倍数として表した（誘導倍数）。
【００３９】 図４Ａは、２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ投与後の心臓流出路における細胞ミ
トコンドリアでの免疫反応性Ｍｎ依存性スーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−
ＳＯＤ）のアップレギュレーションを、担体投与後の対応する対照シグナルの誘
導倍数として定量している。図４Ｂは、２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ投与後の
周産期マウスの心筋細胞および周産期マウスの心臓流出路細胞でのＣｕ／Ｚｎ依
存性スーパーオキシドジスムターゼの発現において、担体投与後の対応する対照
シグナルと比較して有意な変化はないことを示している。レチノイド処置または
Ｉ対照心臓のいずれにおいても、２つの顕著に異なるレベルのＣｕ／Ｚｎ−ＳＯ
Ｄ発現が認められる。図４Ｃは、２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ投与後の周産期
マウスの心室心筋細胞において、担体投与後の対応する対照シグナルと比較して
２つの異なるレベルのＩＧＦ−１受容体発現が認められることを示している。心
筋細胞の１つの区画は対照群と同等のレベルのＩＧＦＲを含み、もう１つの心筋
細胞区画は著しく高いレベルのＩＧＦＲを含む。図４Ｄは、２０ｍｇ／ｋｇの９
シス−ＲＡ投与後の周産期マウスの心筋細胞において、担体投与後の対応する対
照シグナルと比較してＩＧＦ結合蛋白質５の発現がわずかに増加していることを
示している。
【００４０】 （ＨＰＬＣ分析） レチノイド分析用に採取した組織を、２回の超音波処理によって分散させた。
異なるサンプル間の抽出効率の変動を修正するために、スラリーを既知の量の合
成レチノイドとともに点在させた（ｄｏｔｅｄ）。抽出工程は報告されている方
法に従った（例えば、Ｂｉｅｓａｌｓｋｉ ＨＫ、「ヒトにおけるビタミンＡお
よびレチノイドの毒性の比較評価（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅ
ｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎ
ｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎ ｍａｎ）」、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ５７、１
１７〜１６１、１９８９を参照されたい）。抽出溶媒を蒸発させた後、未精製の
レチノイド画分をＨＰＬＣ緩衝液に再懸濁し、ＲＰＣカラムに注入し、アイソク
ラチック勾配で極性を漸減させて溶出した。溶出の状況を記録し、システムソフ
トウェアで解析した。レチノイン酸アイソフォームの位置を特定し、組織１ｍｇ
あたりの個々のレチノイドの絶対量を計算することができた。
【００４１】 （結果） 驚くべき複峰性作用、すなわち非突然変異誘発量の９シス−ＲＡ胃管栄養補給
後の仔マウス突然死、および心臓の成長停止は、成長因子の投与中止と類似点を
有している。
【００４２】 高濃度の９シス−ＲＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）適用後、アポトーシスと、伝導細胞
マーカーと免疫反応性である細胞との間に強い相関性が認められた。免疫反応性
についての議論は心臓内の細胞の局所解剖によって裏付けられ、伝導細胞の表現
型と一致していた。
【００４３】 コネキシン３７染色（図３Ａ〜３Ｄ）およびコネキシン４０染色（示していな
い）の結果は一致していた。高用量全トランス−ＲＡ（４０ｍｇ／ｋｇ）、低濃
度９シス−ＲＡ（１０ｍｇ／ｋｇ未満）、または担体の適用後のいずれにおいて
も、アポトーシスと伝導細胞型との間に相関性は認められなかった。２０ｍｇ／
ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ未満のいずれでも９シス−ＲＡ処置後の心筋細胞にお
いて，ＴＵＮＥＬシグナルの共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は認め
られなかったが、心筋のサイズは低下した。低濃度の９シス−ＲＡ（１０ｍｇ／
ｋｇ未満）で見られた心筋成長阻害は、９シス−ＲＡ用量１０ｍｇ／ｋｇ付近で
完全な成長停止に近づいたが、これとは対照的にかなり高い用量（４０ｍｇ／ｋ
ｇ）のＲＡでは作用は限られていた（３０％未満の成長低下）。
【００４４】 心臓細胞型における、筋肉細胞の増殖調節で最も重要であることが知られてい
るＩＧＦ経路の詳細な共焦点分析は、上流ＩＧＦシグナリングの中断と心筋成長
阻害または伝導細胞の組織特異的アポトーシスのいずれとの間の関連性は示され
ないことを明らかにしている。ＩＧＦリガンドレベル、ＩＧＦ受容体レベル、お
よび調節結合蛋白質レベル（ＩＧＦＢＰ１〜５）を試験した。ＩＧＦ−１機能の
負の調節因子であることが知られているＩＧＦＢＰ５は、９シス−ＲＡ処置後の
心筋細胞においてわずかにアップレギュレートされる（図４Ｃ）が、この反応の
範囲では成長停止の全状態を説明しているとは考えられない。驚くことに、ＩＧ
Ｆ受容体のレベルは心筋細胞のある群では変化しておらず、心筋細胞の他の群で
は著しくアップレギュレートさえしていることが判明した（図４Ｄ）。
【００４５】 伝導細胞アポトーシスにおけるｆａｓ／ＴＮＦ−受容体経路の関与について、
証拠はまったく得られなかった。
【００４６】 重要な派生を伴うもう１つの知見は、２０ｍｇ／ｋｇの９シス−ＲＡ投与後に
おいて、心臓組織における反応性酸素種を代謝する経路が実質的に活性化される
ことである。第一に、内因性ペルオキシダーゼ活性を止めるのに典型的に用いら
れる濃度でのＨ2Ｏ2添加により、９シスＲＡ処置した組織切片では心筋細胞の大
きな面積から著しい量の気泡が放出されたが、全トランス−ＲＡまたは担体で処
置した動物由来の切片では気泡放出は見られなかった。この結果は、高レベルの
９シス−ＲＡ投与により内因性ペルオキシダーゼ活性が多いに増大したことを示
唆するもので、用いた方法では検出されない、内因性反応性酸素種の量の増大と
一致すると考えられる。放出されたガスの圧により、いくつかの組織切片の分離
が起こった。質的な判断により、放出されたガスの量は多すぎて、心筋細胞に比
べて量が非常に少ない伝導細胞において貯蔵することができなかったか、あるい
は該伝導細胞によって産生することはできなかった。第二に、心臓流出路のコネ
キシン陽性細胞においてＭｎＳＯＤ蛋白質シグナルの非常に高いアップレギュレ
ーションが検出された。すなわち、３．４倍のアップレギュレーションシグナル
が洞房結節周囲の心房領域に局在化し；１１倍のアップレギュレーションシグナ
ルが固有洞房結節の領域に局在化しているようである。したがって、アポトーシ
スは、蛋白質レベルでのＭｎＳＯＤのアップレギュレーションを介して反応性酸
素種の損傷作用に対抗するためのプログラムを開始している細胞で起こる。反対
に、高レベルの内因性ペルオキシダーゼ活性を有し、反応性酸素種に対して防御
する酵素レベルが高くない心筋細胞は良好に生存する。したがって、レチノイド
によるアポトーシスと反応性酸素を産生および除去する酵素経路とは、周産期心
臓組織におけるプログラムされた細胞死の実行と原因的に関連するものではない
、別の現象である。
【００４７】 血液／血漿、心室、心房および伝導細胞領域はすべて、同じ型のレチノイン酸
アイソフォームをほぼ同等の濃度で含む。胃管栄養補給により投与されたレチノ
イン酸アイソフォームの薬動力学的挙動は、試験したすべての心臓組織で実質的
に同じである。したがって、ＨＰＬＣデータは、心筋細胞への取り込みではなく
、伝導細胞へのレチノイドの高度に優先的な取り込みは、組織特異的アポトーシ
スの誘導の原因となりうるという仮説の誤りを明らかにしている。
【００４８】 心臓成長に対するＩＧＦシグナリングまたはレチノイドによる反応性酸素種の
発生などの周知のメカニズムおよび経路はどれも、９シス−ＲＡで観察された複
峰性作用を満足に説明するものではないことが、特に理解されるべきである。
【００４９】 したがって、企図される方法が、特にＳＵＲ１に結合するが、ＳＵＲ２には結
合しないレチノイドおよびレチノイド類縁体／その組成物（ＲＸＲアゴニスト活
性を持たないことが好ましい）を選択することによって、心臓への副作用が軽減
された抗糖尿病薬の開発および改良に役立つことが理解されるべきである。同様
に、ＳＵＲ２の機能を選択的に調節し、したがってチャネル選択的抗不整脈化合
物の新規組成物を作るために、レチノイドおよびレチノイド類縁体／その組成物
を用いることが企図される。もう１つの企図されるレチノイドおよびレチノイド
類縁体／その組成物の使用は、抗増殖療法に対して高度に薬剤耐性を示す腫瘍の
感受性を高めることを目的とする、細胞解毒のための輸送蛋白質の選択的調節で
ある。
【００５０】 したがって、シグナル伝達経路の細胞特異的調節の特定の実施形態および適用
を開示してきた。しかしながら、本発明の概念から逸脱することなく、すでに記
載したものの他にも多くの改変が可能であることが、当業者には明らかであると
思われる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の真意以外で制限され
ることはない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあた
り、すべての用語は脈絡に一致する最大限可能な様式で解釈されるべきである。
特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる用語は
、非限定的な形式で要素、成分、または工程に言及したものであることを意味し
、このことは、言及された要素、成分、または工程は特に言及されていない他の
要素、成分、または工程と共に存在、使用、または組み合わせてもよいことを示
している、と解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物の具体例を示す図である。
【図１Ｂ】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物の具体例を示す図である。
【図１Ｃ】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物の具体例を示す図である。
【図１Ｄ】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物の具体例を示す図である。
【図２】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物のさらなる具体例としての構造を示す図
である。
【図３Ａ】 ９−シス−レチノイン酸および対照投与後の、心臓伝導細胞におけるアポトー
シスの共局在化を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】 ９−シス−レチノイン酸および対照投与後の、心臓伝導細胞におけるアポトー
シスの共局在化を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図３Ｃ】 ９−シス−レチノイン酸および対照投与後の、心臓伝導細胞におけるアポトー
シスの共局在化を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図３Ｄ】 ９−シス−レチノイン酸および対照投与後の、心臓伝導細胞におけるアポトー
シスの共局在化を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図４Ａ】 ９−シス−レチノイン酸投与後の種々の酵素およびシグナル伝達マーカーの発
現レベルを、担体投与後の対応する対照シグナルと比較して示すグラフである。
【図４Ｂ】 ９−シス−レチノイン酸投与後の種々の酵素およびシグナル伝達マーカーの発
現レベルを、担体投与後の対応する対照シグナルと比較して示すグラフである。
【図４Ｃ】 ９−シス−レチノイン酸投与後の種々の酵素およびシグナル伝達マーカーの発
現レベルを、担体投与後の対応する対照シグナルと比較して示すグラフである。
【図４Ｄ】 ９−シス−レチノイン酸投与後の種々の酵素およびシグナル伝達マーカーの発
現レベルを、担体投与後の対応する対照シグナルと比較して示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/06 Ａ６１Ｐ 9/06 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｎ 5/02 5/02 5/00 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA90X CA60 4C206 AA01 AA02 DA12 GA03 GA31 JA02 JA66 MA01 MA04 MA72 MA75 NA14 ZA38 ZB26 ZC03 ZC35 ZC42 4H045 AA10 AA30 DA01 DA50 EA20 【要約の続き】

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 系において生物学的作用を制御するシグナル伝達経路を細胞
    特異的に妨げる方法であって、 前記シグナル伝達経路を、レチノイドおよびレチノイド代謝産物の少なくとも
    １つを結合する細胞ポリペプチドを機能的に含むとして同定することと、ここで
    、前記細胞ポリペプチドはレチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および細
    胞レチノイン酸結合蛋白質以外のポリペプチドであり、かつ、前記レチノイドお
    よびレチノイド代謝産物の少なくとも１つの結合によって前記生物学的作用が調
    節される、 前記レチノイドおよびレチノイド代謝産物の少なくとも１つを生物学的作用を
    調節するために有効な濃度で系に投与することと、 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記系が細胞培養物および組織培養物の少なくとも１つを含
    むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記系が哺乳動物であることを特徴とする、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記レチノイドおよびレチノイド代謝産物の少なくとも１つ
    がシス配置を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記レチノイドが９−シス−レチノイン酸であることを特徴
    とする、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記レチノイドが４−ヒドロキシフェニル−レチナミドまた
    は４−ヒドロキシフェニル−レチナミド類縁体であることを特徴とする、請求項
    １に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記レチノイド代謝産物がイオウ原子を含むことを特徴とす
    る、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記細胞ポリペプチドがイオンチャネルを含むことを特徴と
    する、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記イオンチャネルがカリウムイオン、カルシウムイオン、
    塩素イオン、およびナトリウムイオンからなる群より選択されるイオンに特異的
    であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記イオンチャネルがスルホニル尿素受容体およびＭｉｎ
    −Ｋチャネルファミリーの構成員の少なくとも１つと機能的に協同作用すること
    を特徴とする、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記イオンチャネルがアデノシン三リン酸ゲートカリウム
    チャネル複合体を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記細胞ポリペプチドが細胞解毒のための膜輸送蛋白質を
    含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記生物学的作用が細胞分裂を含むことを特徴とする、請
    求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記生物学的作用がインスリン分泌を含むことを特徴とす
    る、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記生物学的作用が細胞増殖を含むことを特徴とする、請
    求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記生物学的作用が不整脈を含むことを特徴とする、請求
    項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記生物学的作用が腫瘍細胞の薬剤耐性を含むことを特徴
    とする、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記投与工程が経口投与および非経口投与の少なくとも１
    つを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記生物学的作用の調節が前記生物学的作用の増幅を含む
    ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 第一の濃度での前記レチノイドまたはレチノイド代謝産物
    の少なくとも１つの投与は第一の生物学的作用を調節し、第二の濃度での前記レ
    チノイドまたはレチノイド代謝産物の少なくとも１つの投与は第二の生物学的作
    用を調節することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記第一の生物学的作用が第一の細胞の増殖低下を含み、
    前記第二の生物学的作用が第二の細胞のアポトーシス誘導を含むことを特徴とす
    る、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 レチノイドおよびレチノイド代謝産物の少なくとも１つを
    含むリガンドと、 レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、および細胞レチノイン酸結合蛋白
    質以外のポリペプチドと、ここで、前記ポリペプチドは前記リガンドを１０-3／
    Ｍｏｌ未満の解離定数で結合し、かつ、前記リガンドの前記ポリペプチドへの結
    合によってシグナル伝達経路における生物学的作用が調節される、 を含むことを特徴とするリガンド−ポリペプチド複合体。
  23. 【請求項２３】 前記リガンドが９−シスレチノイン酸を含み、前記ポリペ
    プチドがイオンチャネルを含むことを特徴とする、請求項２２に記載のリガンド
    −ポリペプチド複合体。
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