JP2003517015A

JP2003517015A - ヘリコバクターピロリ結合性新規物質およびその用途

Info

Publication number: JP2003517015A
Application number: JP2001544888A
Authority: JP
Inventors: カールソン，カール−アンデシュ; レオナードソン，イレネ; テネベリ，スサン; オングストロム，ヨーナス
Original assignee: アープラスシエンセインベステアーベー
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-05-20
Also published as: HUP0204243A3; CN100389773C; EP1237558A1; NO20022890L; NO20022890D0; AU2418801A; RU2002118703A; CN1411376A; EE200200312A; RU2283115C2; WO2001043751A1; US20040086514A1; SK8152002A3; PL356329A1; NZ520111A; SE9904581D0; CZ20021989A3; CA2392766A1; HUP0204243A2; IL150247A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃを包含してなるヘリコバクターピロリ結合性物質を開示し、この結合性物質を包含してなる医薬組成物および食品、ならびにヘリコバクターピロリの存在によって生じる病態の治療方法を開示する。更に、本発明の結合性物質を包含してなる、バクテリア性付着因子の同定剤、ヘリコバクターピロリによる感染の診断剤、ヘリコバクターピロリの型の同定剤、他のヘリコバクターピロリ結合性物質類を同定する際の指標剤およびヘリコバクターピロリの結合を阻害する阻害剤、並びに結合性物質をヘリコバクターピロリに対するワクチンの製造に用いる方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、新規なヘリコバクターピロリ結合性物質とその用途、例えば、ヘ
リコバクターピロリによって生じる病態の治療用医薬組成物や治療方法に関す
る。

【０００２】発明の背景微生物の付着は感染による発病の第一段階と考えられており、感染性病原体の
付着特異性と、宿主標的臓器の上皮細胞が発現する受容体の構造が、病原体の宿
主域と組織親和性の重要な決定因子である（文献１）。

【０００３】ヒト胃部の病原体であるヘリコバクターピロリは、慢性表在性胃炎の原因で
あり（文献２）、また、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃腺癌の発症とも関連付けられ
ている（文献３−７）。この微生物は非常に特異な宿主域と組織親和性を有して
いる、すなわち、定着にヒトの胃の上皮を必要とする（文献８）。ヒトの胃にお
いては、この細菌の大半は粘液層に観察されるが、表面の粘液細胞に選択的に結
合することも知られている（文献８、９）。

【０００４】従来、ヘリコバクターピロリのいくつかの異なる結合特異性が実証されてい
る。即ち、この細菌は、ホスファチジルエタノールアミンやガングリオテトラオ
シルセラミド（文献１０、１１）、Ｌｅ^b血液型決定因子（文献１２）、硫酸ヘ
パラン（文献１３）、ＧＭ３ガングリオシド（文献１４）、スルファチド（文献
１４、１５）、ラクトシルセラミド（文献１６）などの様々な化合物に結合する
ことが報告されている。ヒト赤血球、ヒト顆粒球およびヒト胎盤に存在するグリ
コスフィンゴリピドの大きな複合体（ポリグリコシドセラミド）に対する、ヘリ
コバクターピロリのシアル酸依存性の結合も報告されている（文献１７、１８
）。

【０００５】ヘリコバクターピロリは、消化管疾病に関連するほか、消化管以外の臓器の
多数の病気とも関連している（文献７４）。例えば、心臓病、特にアテローム性
動脈硬化（文献７５）、肝腺癌などの肝臓病（文献７６、７７）、皮膚病（文献
７８）、乳児突然死症候群（文献７９、米国特許第6、083、756号）などとの関連
が示唆されている。

【０００６】発明の概要本発明の主たる目的は、ヘリコバクターピロリによって引き起こされる病態
を治療するための新たな方法を提供することにある。

【０００７】本発明は、ヘリコバクターピロリ特異的受容体をヒトの胃上皮に発見したこ
とに基づく。多くの場合、この受容体は、ヒトの消化管にのみ存在する糖脂質で
あるラクトテトラオシルセラミドであり、本発明者らの研究において、最小結合
エピトープはＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはそれと非常に類似した構造であるＧ
ａｌβ３ＧａｌＮＡｃであることが判明した。

【０００８】従って、本発明は、該結合エピトープ、あるいはその類似体または誘導体を包
含してなるヘリコバクターピロリ結合性物質に関する。

【０００９】本発明の１つの目的は、ヘリコバクターピロリによって引き起こされる病態
の治療用医薬組成物を提供することにある。

【００１０】本発明の他の１つの目的は、ヘリコバクターピロリが存在することによって
生じる病態の治療用医薬組成物の製造のために、上記ヘリコバクターピロリ結
合性物質を用いる方法を提供することにある。

【００１１】本発明の更に他の１つの目的は、ヘリコバクターピロリが存在することによ
って生じる病態の治療方法を提供することにある。

【００１２】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質を含
んでなる、バクテリア性付着因子を同定するための同定剤を提供することにある
。

【００１３】本発明の更に他の１つの目的は、治療目的や非医療目的（例えばin vitroアッ
セイなど）でヘリコバクターピロリの結合を阻害するための、上記ヘリコバク
ターピロリ結合性物質を含んでなる阻害剤を提供することにある。

【００１４】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質を含
んでなる、ヘリコバクターピロリに結合する他の物質類を同定する際の指標剤
を提供することにある。

【００１５】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質を包
含してなる、食品および栄養添加物を提供することにある。

【００１６】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質また
は上記バクテリア性付着因子を、ヘリコバクターピロリに対するワクチンの製
造に用いる方法を提供することにある。

【００１７】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質を含
んでなる、ヘリコバクターピロリによる感染を診断するための診断剤を提供す
ることにある。

【００１８】本発明の更に他の１つの目的は、上記ヘリコバクターピロリ結合性物質を含
んでなる、ヘリコバクターピロリの型の同定剤を提供することにある。

【００１９】発明の詳細な説明上記のように、本発明は、特定のヘリコバクターピロリ結合性物質に関する
。本発明の完成に至る研究の過程において、多くの異なるヘリコバクターピロ
リ株に³⁵Ｓ−メチオニンを代謝的に取り込ませて標識し、薄層プレート上に分離
した複数の異なる天然のグリコスフィンゴリピドに結合するか否かを調べた。そ
の結果、２つの異なる結合特異性がオートラジオグラフィによって繰り返し検出
された。既に詳述されているように、ヘリコバクターピロリはラクトシルセラ
ミド、ガングリオトリアオシルセラミドおよびガングリオテトラオシルセラミド
に結合する（文献１６）。ヒト由来の材料に初めに検出された唯一の結合活性は
、ヒト胎便の非酸性画分のテトラグリコシルセラミド領域に含まれる化合物に対
するものだった。

【００２０】ヒトの胃上皮に存在するグリコスフィンゴリピドの組成は詳細に規定されてい
ない。しかし、ヒト消化管の粘膜細胞および粘膜下組織のグリコスフィンゴリピ
ドに関する最近の研究（文献５５）によると、胃底部および胃腔の粘膜にはスル
ファチドが豊富に存在することが報告されている。薄層プレートにおいて、ガラ
クトシルセラミド、ラクトシルセラミド、グロボトリアオシルセラミドおよびグ
ロボシドと同じ移動度を示すものが非酸性グリコスフィンゴリピドの大部分を占
めており、一方、ＧＭ３、ＧＭ１およびＧＤ３と同じ移動度を示すものがガング
リオシドの大部分を占めていた。ヘリコバクターピロリ結合性のラクトシルセ
ラミドが更にフィトスフィンゴシンおよびヒドロキシ脂肪酸に結合した化合物は
、ヒトの胃の上皮細胞に特徴的な化合物であることが明らかになった（文献１６
）。

【００２１】また、血液型Ｃａｄ活性型ガングリオシド（ＧａｌＮＡｃβ４（ＮｅｕＡｃα
３）Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）はヒトの胃底部
で同定された（文献５６）ものの、幽門には見出されていない（文献５７）こと
は、グリコスフィンゴリピドは異なる胃の部分で特徴的な発現をしていることを
示している。

【００２２】ヒトの胃組織の入手は限られているため、本発明者らは、初めにヒト胎便、即
ち、生れたばかりの子供が初めて排泄する無菌の便であり、主として発生途中の
消化管から押出された粘膜細胞からなるもの、に検出されるヘリコバクターピ
ロリ結合性グリコスフィンゴリピドの研究に集中した。単離した後、このヘリコ
バクターピロリ結合性グリコスフィンゴリピドを質量分析、プロトンＮＭＲス
ペクトル分析、およびＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ
（ラクトテトラオシルセラミド）のメチル化による分析に付した。ラクトテトラ
オシルセラミドの組織における分布は非常に限られている。最近まで、ラクトテ
トラオシルセラミドはヒトの胎便（文献４５）、ad modumビルロート手術ＩＩに
よる部分切除を受けたことのある個体の小腸（文献４６）、正常なヒトの胃粘膜
およびヒトの胃癌組織（文献５８）にのみ同定されていた。しかし、最後に挙げ
た文献に記載されている５例のうちの４例の「正常な」粘膜は、十二指腸または
胃の潰瘍の治療のための幽門洞切除によって得られたものである。モノクローナ
ル抗体Ｋ−２１を用いた免疫組織化学的研究は、非分泌型個体のヒト胃粘膜表面
（小窩表皮）におけるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ配列の選択的発現を明示し（文献
５９）、このデータは組織切片に対するヘリコバクターピロリ結合性の局在化
（文献８、９）と一致した。Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ配列に結合するポリクロー
ナル抗体を用いた免疫組織化学的研究によって、血液型がＯＬｅ（ａ−ｂ−）の
非分泌型個体のヒト空腸および回腸の刷子縁細胞におけるラクトテトラオシルセ
ラミドの存在が確認され、同様の結果が１個体ではあるが、血液型がＯＬｅ（ａ
＋ｂ＋）の非分泌型個体にも確認された（文献６０）。

【００２３】この研究で検討した６６株のヘリコバクターピロリ分離株のうち、５７株（
８６％）はラクトテトラオシルセラミド結合特異性を発現していたが、９株は発
現していなかった。ヘリコバクターピロリ分離株におけるラクトテトラオシル
セラミド結合性の高い普及率は、この消化系病原体に保存されている性質であり
、それ故に重要な毒性因子であると考えられることを示している。

【００２４】ラクトテトラオシルセラミド結合特異性の生物学的重要性は、ヒトの胃の標的
表皮細胞から単離した非酸性グリコスフィンゴリピドのテトラグリコシルセラミ
ド領域に対するヘリコバクターピロリの結合によって更に証明された。プロト
ンＮＭＲスペクトル法およびセラミドグリカナーゼによる加水分解で得られたパ
ーメチル化四糖類のガスクロマトグラフィ−質量分析法によると、結合活性画分
はラクトテトラオシルセラミドを包含することが判明した。結合活性を有するラ
クトテトラオシルセラミドは、分析した７個体のうちの１個体にしか存在しなか
った。この結果は、ヘリコバクターピロリによる感染とそれに関連した慢性胃
炎は非常に一般的であるものの、感染者のうちの少数のみが消化性潰瘍や胃腺癌
などの更に進んだ病態を発症する（文献７）ことを示唆している。推論であるが
、胃上皮細胞中のラクトテトラオシルセラミドの存在が、感染によってもたらさ
れる消化性潰瘍や胃癌などの深刻な病状の発症に必要なコファクターであると考
えられる。

【００２５】ヒト胎便から単離した結合活性を有するラクトテトラオシルセラミド画分は、
ヒドロキシセラミド種および非ヒドロキシセラミド種の両方を含んでいた。ラク
トシルセラミド結合特異性に関する報告（文献１６）と同様に、論理的には、結
合はヒドロキシセラミド種を有する分子種に限られる。しかし、スフィンゴシン
および１６：０と２４：０の非ヒドロキシ脂肪酸のみからなるセラミドを含む、
ウサギ胸腺から単離したラクトテトラオシルセラミド（B. Lanne et al.、これ
から出版される）は、ヒト胎便から単離したラクトテトラオシルセラミドと同様
に活性を示した（データは示さない）。従って、ラクトテトラオシルセラミドに
対する結合はセラミドの組成に依存しないことが判明した。

【００２６】 ¹²⁵Ｉで標識したバクテリアの表面タンパク質を用いて得た結合パターンは、³ ⁵ Ｓで標識したバクテリアの細胞のそれと同一であり、この結果は、表面タンパ
ク質調製物を炭水化物付着因子の単離および同定に使用できることを示唆してい
る。

【００２７】まとめると、ヒトの胃の粘膜細胞に対するヘリコバクターピロリの付着は複
数の因子からなるシステムであり、標的組織に存在する異なる受容体を複数のバ
クテリア性付着因子が認識して結合すると考えられる。この研究においては、別
の結合活性を有する化合物、即ち、薄層プレート上のグリコスフィンゴリピドへ
の結合によって検出したラクトテトラオシルセラミドを同定する。グリコスフィ
ンゴリピドの分布は限られており、今までヒトの消化管にしか見出されていない
。他のヒト組織では、ラクトテトラオシルセラミドはフコースまたはシアル酸で
置換されているので、使用したアッセイ条件下では結合性を示さなかった。

【００２８】このようなヘリコバクターピロリ結合性のグリコスフィンゴリピドの単離お
よびその構造の特徴づけ、ならびにヒト胃粘膜細胞におけるこの化合物の同定は
、最少結合エピトープ、即ちＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃの同定に繋がる。エピトー
プであるＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃは、構造も機能もＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに非
常に類似しているため、２つは実質的に交換可能である。

【００２９】したがって、本発明は下記式（１）：

【化４】

【００３０】（式中、Ｒ₁およびＲ₂は水素原子または水酸基であり、但し、Ｒ₂が水酸基の場合には
Ｒ₁は水素原子であり、Ｒ₂が水素原子の場合にはＲ₁は水酸基であり、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、好ましくはラクトシル基、ガラクト
シル基、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル基であるか、またはＯ−グリカンま
たはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部をなす残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、例えば、セ
ラミド脂質部分やＺへの結合（−Ｏ−）であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数であり、物質によってｍは数千または数百万以下の整数でも
よい。）で表される少なくとも１種の化合物、あるいはヘリコバクターピロリに対して
該化合物と同等またはそれよりも優れた結合能を有する該化合物の類似体または
誘導体を包含してなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質に関する。

【００３１】式（１）において、Ｒ₁が水酸基であり、Ｒ₂が水素原子の場合には、式（２）
の化合物が得られ、Ｒ₁が水素原子であり、Ｒ₂が水酸基の場合には、式（３）の
化合物が得られる。

【化５】

【化６】

【００３２】本発明は、式（１）、（２）および（３）のいずれかによって表される化合物
であって、−Ｏ−Ｘを−Ｓ−Ｘ、−Ｎ−Ｘまたは−Ｃ−Ｘで置換した化合物も包
含する。これは、上記の構造が置換可能であることは当業者には公知だからであ
る。

【００３３】更に本発明は、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ（式（１）のＲ₁が水酸基であり、Ｒ₂ が水素原子である化合物に対応）またはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃ（式（１）のＲ ₁ が水素原子であり、Ｒ₂が水酸基である化合物に対応）、あるいはヘリコバクタ
ーピロリに対してＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃと同
等またはそれらよりも優れた結合能を有するそれらの類似体または誘導体を包含
してなるか、またはこれらの物質から構成されてなるヘリコバクターピロリ結
合性物質にも関する。

【００３４】本発明によれば、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃそれ
自体を用いることができるが、天然または合成したそれらのいかなる類似体や誘
導体も、それらと同等またはそれらよりも優れた結合能を有する限り使用するこ
とができる。ラクトテトラオース、ラクトテトラオシルセラミド（Ｇａｌβ３Ｇ
ｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）またはガングリオテトラオシルセ
ラミド（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）のような、
結合部位であるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃを包含し
てなる物質、あるいはヘリコバクターピロリに対して該物質と同等またはそれ
らよりも優れた結合能を有する該物質の類似体または誘導体も使用することがで
きる。最小結合エピトープ、あるいはその類似体または誘導体は、該物質の非還
元末端に存在することが好ましい。

【００３５】ラクトテトラオースまたはガングリオテトラオースは、単独または多価の形態
で使用することが好ましい。

【００３６】本発明のヘリコバクターピロリ結合性物質は、１種以上の上記物質およびそ
れを担持している担体から構成されてなるものでも、このような担体を包含して
なるものでもよい。

【００３７】本発明のヘリコバクターピロリ結合性物質は、上記物質を１種以上包含して
なるミセルから構成されてなるものでも、このようなミセルを包含してなるもの
でもよい。このようなミセルの具体例としては、数分子のラクトテトラオースな
どを含有しているリポソームが挙げられる。

【００３８】本発明のヘリコバクターピロリ結合性物質は、多糖（ポリアセタミド鎖また
はその結合体など）や抗生物質、好ましくはヘリコバクターピロリに対して有
効な抗生物質、に結合していてもよい。

【００３９】したがって、本発明の結合性物質は、ルイスｂ［Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕ
ｃα４）ＧｌｃＮＡｃ］やＮｅｕＮＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ／ＧｌｃＮＡｃな
どの、種々の糖鎖配列および立体配座を有する公知のヘリコバクターピロリ結
合性エピトープを含有する糖鎖や複合糖質、あるいは糖化合物（Glycocompound
）の混合物の一部でもよい。複数の結合性物質を同時に用いることが治療に際し
て有益である。

【００４０】本発明の結合性物質は、抗生物質、好ましくはペニシリン系抗生物質、に結合
していてもよい。本発明の結合性物質は、抗生物質を標的であるヘリコバクター
ピロリに誘導する。このような結合体を用いると、ヘリコバクターピロリに対
する処置または治療に必要な抗生物質が少量となり、抗生物質の副作用が低減さ
れるので、ヘリコバクターピロリに対する処置において有利である。結合体の
抗生物質の部分は、ヘリコバクターピロリを殺菌または静菌するためのもので
あるが、結合体は、後述するような抗付着効果（antiadhesive effect）も有し
ている。

【００４１】ヘリコバクターピロリが数種のオリゴ糖配列に結合することは公知である。
特定の株によるいくつかの結合は、共生的な相互作用を示すものであって、癌や
重篤な病態をもたらすものではない。ガン型（cancer-type）の糖エピトープへ
の結合に関する現今のデータは、本発明の結合性物質が病原性の強い相互作用を
妨げることを示しており、この過程においては、他の受容体に結合している病原
性の低いヘリコバクターピロリ菌や株には関与しない。したがって、ヘリコバ
クターピロリと関連付けられる病気の予防のためには、完全にヘリコバクター
ピロリを取り除く必要はない。病原性の低いヘリコバクターピロリには、病原
性の高いヘリコバクターピロリ株の増加を予防するプロバイオティックな効果
があることも考えられる。

【００４２】ヘリコバクターピロリはその表層にＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ配列を有してお
り、少なくとも非フコシル化配列を有するいくつかの株は、本願に記載した結合
性を示す。本発明の結合性物質は、ヘリコバクターピロリ菌どうしの結合も妨
げることができ、結果として、例えば菌の定着を阻害することができる。

【００４３】本発明のヘリコバクターピロリ結合性物質は、例えば糖脂質、糖タンパク質
またはネオグリコプロテインである。結合性物質は、少なくとも２本のオリゴ糖
鎖を包含してなるオリゴマー分子でもよい。

【００４４】患者の消化管にヘリコバクターピロリが存在することによって生じる病気ま
たは病態の治療用に、本発明の結合性物質を抗付着のために用いることができる
。具体的には、ヘリコバクターピロリが患者の胃上皮の受容体に結合するのを
阻害するために使用できる。本発明の結合性物質または医薬組成物を投与すると
、ヘリコバクターピロリの結合に対して受容体と競合し、消化管に存在するヘ
リコバクターピロリの全部または一部が胃上皮の受容体のかわりに本発明の結
合性物質に結合する。次いで、本発明の結合性物質に結合したヘリコバクター
ピロリは腸を通過し、患者から排出され、結果として、患者の健康に対するヘリ
コバクターピロリの影響は減少する。好ましい結合性物質は、結合部位である
Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃを包含する溶解性の化合
物、例えばラクトテトラオース、ラクトテトラオシルセラミド、ガングリオテト
ラオースまたはガングリオテトラオシルセラミドの溶解性類似体が挙げられる。
本発明の結合性物質を適切な担体に担持して用いることが可能であり、屡々好ま
しい。担体を用いる場合には、１つの担体につき数分子の結合性物質を担持する
ことで、阻害効果を向上することができる。

【００４５】本発明によると、肝臓病、心臓病または乳児突然死症候群等のヘリコバクターピロリの存在することによって生じる他の病気を治療することもできる。

【００４６】本発明によると、本発明に記載の物質（必要な場合には担体に担持したもの）
を包含してなる、患者の消化管にヘリコバクターピロリが存在することによっ
て生じる病態の治療に適した医薬組成物を製造したり、結合性物質を上記の病態
の治療方法に使用することができる。本発明によって治療可能な病態としては、
慢性表在性胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍および胃腺癌などが挙げられる。

【００４７】本発明の医薬組成物は、当業者に公知の他の物質、例えば、不活性な賦形剤ま
たは薬学的に許容できる補助剤、担体、保存料等を包含していてもよい。

【００４８】さらに、本発明の結合性物質は、他の薬剤、例えばプロトンポンプ阻害剤また
は胃ｐＨ調節剤（オメプラゾール（omeprazole）、ランソプラゾール（lansopra
zole）、ラニチジン（ranitidin）等）を含む胃の病気を治癒するための医薬や
ヘリコバクターピロリに対する抗生物質と共に投与することができる。

【００４９】本発明の結合性物質または医薬組成物の投与方法は適当な方法でよいが、経口
投与が好ましい。

【００５０】本発明で用いる「治療」とは、病気または病態を治癒または緩和するための治
療と、病気または病態の発生を予防するための処置の両方を意味する。治療は、
短時間で行う場合もあれば、長期間にわたる場合もある。

【００５１】本発明で用いる「患者」とは、本発明に基づく治療を必要とするヒトまたはヒ
ト以外の哺乳類を意味する。

【００５２】さらに、本発明の結合性物質に結合する配列をスクリーニングして１種以上の
付着因子を同定するために、本発明の結合性物質を含んでなる同定剤を提供する
ことができる。該配列は、例えばタンパク質または炭水化物である。糖結合性タ
ンパク質としては、レクチンまたは糖結合性酵素が挙げられる。スクリーニング
は、例えばアフィニティクロマトグラフィ法またはアフィニティクロスリンキン
グ法により行なうことができる。

【００５３】さらに、ヒト組織に存在するＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３Ｇａｌ
ＮＡｃに特異的に結合する物質を用いて、ヘリコバクターピロリの結合を妨げ
ることができる。このような物質の例としては、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃに特異
的なモノクローナル抗体Ｋ−２１、上記構造に結合する他の抗体類やレクチン類
、あるいは３位にβ結合しているガラクトースを切断するβ−ガラクトシダーゼ
、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ、またはオリゴ糖鎖から末端Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡ
ｃを切り出すエンドグリコシダーゼなどの酵素が挙げられる。さらに、Ｇａｌβ
３ＧｌｃＮＡｃに結合する付着因子またはとりわけそれの結合部位を、ヘリコバ
クターピロリが受容体のＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃへ結合するのを阻害するため
に使用することができる。ヒトに使用する場合、上記のような結合性を示す物質
としては、人体に適応した抗体や、免疫原性がなく、且つ本発明の結合性物質か
ら末端単糖残基を切り出すことのできるヒト由来の組換えグリコシダーゼ等の、
このような用途に適した物質を使用する。しかしながら、消化管には、多数の天
然のレクチンおよびグリコシダーゼ（例えば食品由来のもの）に対する耐性が見
られる。

【００５４】さらに、本発明の結合性物質は、ヘリコバクターピロリ、すなわち上記の病
態、に対する予防接種に適切なワクチンを製造するための鋳型として用いること
ができる。

【００５５】さらに、本発明の結合性物質は、ヘリコバクターピロリによる感染によって
生じる病態の診断剤に用いることができる。

【００５６】さらに、本発明の結合性物質は、例えばin vitroアッセイ系のような、他のヘ
リコバクターピロリ結合性物質類の同定に使用するといった、非医療目的でヘ
リコバクターピロリの結合を阻害する阻害剤に用いることができる。

【００５７】さらに、本発明の結合性物質は、ヘリコバクターピロリに結合する他の物質
類を同定する際の指標剤に用いることができる。

【００５８】さらに、本発明の結合性物質を、ヘリコバクターピロリの型の同定剤にも用
いることができる。

【００５９】最後に、本発明の結合性物質は、ヒトおよび動物の食品または栄養組成物、具
体的には、食料、乳製品（牛乳、ヨーグルトなど）、飲料用組成物および乳児用
の食品等に用いることができる。本発明で用いる「栄養組成物」および「食品」
には、天然のヒト乳汁はふくまれない。本発明の結合性物質は、いわゆる機能性
食品または機能を付与した食品（functionalised food）の一部とすることが好
ましい。このような機能性食品は、ヘリコバクターピロリが標的細胞または組
織に結合するのを阻害または防止することで、ヒトまたは動物の健康にプラスの
効果を与える。本発明の結合性物質は、既に定義されている食品または機能性食
品組成物の一部となりうる。機能性食品は、アメリカ食品医薬品局のような食品
を監督する機関により認められた他の公知の食品成分を含有してもよい。本発明
の結合性物質は、栄養添加物、好ましくは機能性食品または機能性飲料を製造す
るための食品添加物または飲料添加物となる。食品または食品添加物は、乳牛や
その他の動物によってその乳汁中に自然に大量の結合性物質を生産させることで
製造することもできる。これは、適切なグリコシルトランスフェラーゼを動物の
乳汁中に過剰に発現させることで達成できる。家畜の特定の系統または種を選択
し、本発明の結合性物質を大量生産するように飼育することができる。本発明の
結合性物質、特に栄養組成物または栄養添加物としての結合性物質は、バクテリ
アや酵母のような微生物によって製造することもできる。

【００６０】本発明の結合性物質はを乳幼児用の食品または栄養組成物、特に乳児用の食品
の一部として添加することが特に有用である。本発明において「乳児用の食品」
とは、タンパク質を加水分解した食品、低体重乳児のための食品またはフォロー
アップ（follow-up）食品などの、乳児用の特別な食品を意味する。多くの乳児
は、天然のヒト乳汁に替わる特別な食品によって育てられている。このような食
品には、ヒト乳汁に含まれるラクトースに基づく特殊なオリゴ糖、とくにラクト
−Ｎ−テトラオースであるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃおよび
その誘導体のような糖鎖の延びたオリゴ糖は含まれていないことがある。乳児用
の食品は乾燥粉末でよく、水を加えてもとにもどすことで最終の食品の形態にし
、乳児または幼児にあたえる。本発明の好ましい実施態様においては、乳児用の
食品のラクト−Ｎ−テトラオース濃度は、天然のヒト乳汁中に存在するのと同じ
濃度、すなわち約０．０５〜５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１ｇ〜０．５ｇ／
Ｌとなるようにする。

【００６１】ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびパラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース（Ｇａ
ｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ）はヒト
乳汁に見出されており、したがって乳児用の食品の安全な添加物または成分であ
ると考えられる。ヘリコバクターピロリは乳児または幼児に対して特に高い感
染性を示すことから、後々感染によって生じる病気を考慮すると、感染を防ぐこ
とが適切である。ヘリコバクターピロリは乳児突然死症候群を引き起こすこと
も知られているが、バクテリアを根絶するための強力な抗生物質を使用すること
は、幼児または乳児にはとくに不適切である。

【００６２】本発明の結合性物質を含んでなる診断剤または同定剤においては、必要に応じ
て試験キットを構成するプローブや試験用棒などに結合性物質が含まれている。
このようなプローブまたは試験用棒がヘリコバクターピロリを含むサンプルと
接触すると、ヘリコバクターピロリはプローブまたは試験用棒に付着するので
、サンプルからヘリコバクターピロリを取り出して分析することができる。

【００６３】グリコスフィンゴリピドの命名法は、生化学の命名法に関するＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ委員会の推奨する方法に従う（CBN for Lipids: Eur. J. Biochem. (1977)
79, 1121; J. Biol. Chem. (1982) 257, 3347-3351 および J. Biol. Chem. (19
87) 257, 3347-3351）。

【００６４】本発明において、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＡお
よびＮｅｕＧｃはＤ型であり、ＦｕｃはＬ型であり、すべての糖残基はピラノー
ス環構造であるものとする。

【００６５】さらに、ラクトテトラオースであるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇ
ｌｃは、ラクト−Ｎ−テトラオースとも呼ばれている。

【００６６】脂肪酸と塩基の略記命名法においては、コロンの前の数字が分子の炭素鎖の長
さを示し、コロンの後の数字が分子の二重結合の合計を示す。２位に水酸基をも
つ脂肪酸は、例えばｈ１６：０のように略記の前に接頭辞ｈをつけて示す。長鎖
塩基に関しては、ｄがジヒドロキシ体を示し、ｔがトリヒドロキシ体を示してい
る。したがって、ｄ１８：１はスフィンゴシン（１，３−ジヒドロキシ−２−ア
ミノオクタデセン）を表し、ｔ１８：０はフィトスフィンゴシン（１，３，４−
トリヒドロキシ２−アミノオクタデセン）を表している。

【００６７】本願明細書の本文、実施例および請求項ではヘリコバクターピロリについて
のみ記述しているが、本発明の範囲にはヘリコバクターピロリに極めて類似し
た他のヘリコバクター属も含まれている。

【００６８】以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらになんら限定される
ものではない。

【００６９】以下の実施例において、［図面の説明］で詳細に説明した図面に参照する。実施例実施例においては、以下の略語を用いた。ＣＦＵ＝コロニー形成単位、Ｈｅｘ＝ヘキソース、ＨｅｘＮ＝Ｎ−アセチルヘキソサミン、及びＥＩ＝質量分析法。実施例において、ヘリコバクターピロリのグリコスフィンゴリピドへの結合
は、³⁵Ｓで標識したバクテリアによる薄層クロマトグラム上のグリコスフィンゴ
リピドへの結合によって調べた。２つの異なる結合特異性を屡々検出した。一つ
はヘリコバクターピロリのラクトシルセラミド、ガングリオトリアオシルセラ
ミド及びガングリオテトラオシルセラミドへの結合であり、もう１つはヒト胎便
由来の非酸性テトラグリコシルセラミドへの選択的な結合である。後者のヘリコ
バクターピロリ結合性グリコスフィンゴリピドを単離し、質量分析、プロトン
ＮＭＲスペクトル及び分解特性について検討し、このグリコスフィンゴリピドを
Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（ラクトテトラオシル
セラミド）と同定した。胃上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピド画分の
テトラグリコシルセラミド領域へのヘリコバクターピロリの結合は、ヒトのサ
ンプル７体のうちの１体に見られ、この画分にラクトテトラオシルセラミドが含
まれることは、プロトンＮＭＲスペクトル法及びセラミドグリカナーゼ処理によ
って得られたパーメチル化四糖類のガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分
析法によって確認した。ラクトテトラオシルセラミド結合特性の発現はヘリコバ
クターピロリ単離株６６株体のうち５７株（８６％）で検出された。

【００７０】材料と方法バクテリアの菌株、培養条件及び標識 − 使用したバクテリアとその入手先に
ついては、明細書の終わりに添付した表Ｉに記載した。大部分の実験においては
次の４株を用いた：基準株である１７８７５株（スウェーデン国、イェーテボ
リ大学カルチャーコレクション（Culture Collection, University of Goteborg
）（ＣＣＵＧ）より入手）、及び臨床単離株体である００２株、０３２株と３０
６株を併用した。

【００７１】菌株は、１５％（容積比）のグリセロールを含むトリプシン処理大豆液体培地
中で−８０℃で保存し、初期培養はＧＡＢ−ＣＡＭＰ寒天培地（文献１９）を用
い、高湿度（９８％）の微好気性条件（酸素５〜７％、二酸化炭素８〜１０％、
窒素８５％）で３７℃で４８〜７２時間行った。標識するためには、コロニーを
ＧＡＢ−ＣＡＭＰ寒天培地かブルセラ寒天培地に播種し、ｐＨ７．３のリン酸緩
衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した５０μＣｉの^［３５］Ｓ−メチオニン（英
国、Amersham社製）０．５ｍｌをプレート上に振り撒いた。３７℃の微好気性条
件下で１２〜３６時間インキュベートした後、細胞をかきとり、ＰＢＳで３回洗
浄し、さらにＰＢＳで１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌになるように懸濁した。

【００７２】他の方法としては、１０％の加熱により失活させた牛胎児血清（スウェーデン
国、Goteborgs Termometerfabrik社、Seralab）と５０μＣｉの^［３５］Ｓ−メ
チオニンを添加したたハムＦ１２培地（英国、Gibco BRL社製）にバクテリアを
播種した（１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ）。微好気性条件下、３７℃で２４時間、培
養ビンで振とう培養した。培養ビンから取り出した一部分について、ウレアーゼ
、オキシダーゼ及びカタラーゼのそれぞれの活性を試験し、位相差顕微鏡で検鏡
して球状体の含量が低いことを確認した。バクテリアの細胞を遠心分離で回収し
、ＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁
した。

【００７３】上記のいずれの方の標識方法によっても、ヘリコバクターピロリ１００体あ
たり約１ｃｐｍの比活性を有する懸濁液が得られた。

【００７４】バクテリア表面タンパク質の抽出 − 抽出過程に入る前に、ヘリコバクター
ピロリ株（表Ｉ中で＊のついているもの）を５％のウマ血液寒天培地上で、微好
気性条件下、３７℃で２〜３日間培養し、ヘリコバクターピロリを回収した後
にＰＢＳで１回洗浄した。ヘリコバクターピロリの粗抽出物は、ヘリコバクタ
ーピロリを１Ｍの塩化リチウムを含むＰＢＳ中で４５℃で２時間インキュベー
トすることで調製した（文献２０）。遠心分離を行なった後、得られた上清をＰ
ＢＳに対して一晩透析した。クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０染色試薬
（英国、リッチモンド、Bio-Rad社製）の酸性溶液を用いてこの抽出物のタンパ
ク質濃度を測定したところ、３００〜１５００μｇ／ｍｌであった。抽出物から
約１００μｇのタンパク質を含むサンプルをとりだし、イオドゲン（Iodogen）
法（文献２１）に従って^{［１２５］}Ｉで標識し、比活性が２〜５×１０^３ｃｐｍ
／μｇの標識タンパク質を得た。

【００７５】薄層クロマトグラフィ − 薄層クロマトグラフィはガラスまたはアルミニウム
にシリカゲル６０を塗布したＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムスタット、
Merck社製）を用い、クロロホルム／メタノール／水（６０：３５：８、容積比
）混合溶媒または０．０２％の塩化カルシウムを含むクロロホルム／メタノール
／水（６０：４０：９、容積比）混合溶媒を展開溶媒として行なった。化学検出
にはアニスアルデヒド（文献２２）あるいはレゾルシノール試薬（文献２３）を
用いた。

【００７６】クロマトグラム結合アッセイ − クロマトグラム結合アッセイは、文献２４の
記載にしたがって行った。グリコスフィンゴリピドの混合物（レーンあたり２０
〜８０μｇ）または純粋なグリコスフィンゴリピド（レーンあたり１〜４μｇ）
をアルミニウムにシリカゲル６０を塗布してあるＨＰＴＬＣプレート上で分離し
た。乾かしたクロマトグラムを０．５％（ｗ／ｖ）のポリイソブチルメタクリレ
ート（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、Aldrich Chem. Comp. Inc.製）を含
むジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（１：５、容積比）混合溶媒中に１分間浸漬
した。乾燥後、非特異的結合部位をブロックするためにクロマトグラムをコーテ
ィングした。はじめに異なるコーティング条件、例えば、１％のポリビニルピリ
リドン（polyvinylpyrrilidone）（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液（溶液１）、２％のゼ
ラチン（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液（溶液２）、２％の牛血清アルブミン（ｗ／ｖ）
のＰＢＳ溶液（溶液３）、２％の牛血清アルブミン（ｗ／ｖ）と０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳ溶液（溶液４）、または２％の牛血清アルブミ
ン（ｗ／ｖ）と０．２％デオキシコール酸（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳ溶液（溶液５
）のそれぞれについて試験した。溶液４を使用したときに最も安定した結果が得
られたので、溶液４を通常のコーティング液とした。コーティングは室温で２時
間行なった。その後、^３５Ｓで標識したバクテリア縣濁液（１×１０⁹ ＣＦＵ／
ｍｌ且つ１〜５×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈）または^１２５Ｉで標識したバクテリアの表面タンパク質溶液（約２×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌとな
るように溶液４で希釈）をクロマトグラム上に静かに振り撒き、室温で２時間イ
ンキュベートした。ＰＢＳで６回洗浄し、乾燥した後、ＸＡＲ−５Ｘ線フィル
ム（ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak社製）を用い、室温または
−７０℃で薄層プレートのオートラジオグラフィを３〜１２０時間行った。

【００７７】グリコスフィンゴリピドの調製対照となるグリコスフィンゴリピド − 明細書の終わりに添付した表IIに記載
した原料から標準的な方法（文献２５）で酸性および非酸性のグリコスフィンゴ
リピド画分を得た。すべてのグリコスフィンゴリピド画分をアセチル化し、珪酸
カラムを用いたクロマトグラフィを繰り返すことで個々のグリコスフィンゴリピ
ドを単離した。精製したグリコスフィンゴリピドの同定は、質量分析法（文献２
６）、プロトンＮＭＲスペクトル法（文献２７〜３０）及び分解特性に関する分
析（文献３１、３２）により行なった。

【００７８】Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＨ_２β３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（表IIのケース３）
は、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（表IIケース２）
を文献１６の記載にしたがって無水ヒドラジンで処理して得たものである。

【００７９】ヒトの胎便 − イェーテボリのサールグレンスカ大学病院（Sahlgrenska Univ
ersity Hospital）の産科で月満ちて生まれた新生児１７人の胎便を集めた。生
まれてから２４時間以内のごく最初の部分のみを回収し、凍結乾燥して−７０℃
で保存した。非酸性グリコスフィンゴリピドを文献２５の記載にしたがって貯蔵
材料（乾燥重量で２３．３ｇ）から単離した。具体的には、凍結乾燥した材料を
ソックスレー抽出機でクロロホルムとメタノールの混合溶媒（２：１および１：
９、容積比）を使って２段階で抽出した。抽出物は、穏やかな条件のアルカリ性
メタノール分解と透析に付し、珪酸カラム（セントルイス、Mallinckrodt Chem.
Work社製）で分離した。酸性及び非酸性糖脂質画分は、ＤＥＡＥセルロースカ
ラム（ＤＥ−２３、Whatman社製）によるクロマトグラフィより得た。非酸性糖
脂質からアルカリに安定なリン脂質を除去するために、この画分をアセチル化し
（文献２４）、２番目の珪酸カラムで分離し、その後、脱アセチル化と透析を行
なった。ＤＥＡＥセルロースカラムと珪酸カラムで最終的に精製したところ、２
６２ｍｇの非酸性グリコスフィンゴリピドを得た。

【００８０】ヘリコバクターピロリ結合性グリコスフィンゴリピドの単離を２段階の工程
で行なった。まず、２４０ｍｇの非酸性グリコスフィンゴリピド画分をシリカ（
YMC SH-044-10、粒子の直径１０μｍ；スウェーデン国、Kungsbacka、Skandinav
iaska Genetec社製）を充填した２．２×３０ｃｍのカラムを用いたＨＰＬＣで
分離した。このカラムをクロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４、容積
比）（溶液Ａ）で平衡化し、溶液Ａに対する溶液Ｂ（クロロホルム／メタノール
／水（４０：４０：１２、容積比））の直線状のグラジュエントを用い、２ｍｌ
／分の流速でグリコスフィンゴリピドを溶離した。具体的には、始めに２分間溶
液Ａをカラムに流し、次に溶液Ａ中に含まれる溶液Ｂの割合を５分間で０％から
５０％に上げ、次の１４０分間で５０％から８０％に上げ、さらに次の１０分間
で８０％から１００％に上げ、その後１００％に保って２３分間流した。２ｍｌ
の画分の一部を薄層クロマトグラフィで分析し、アニスアルデヒド染色で陽性だ
った画分については、さらにヘリコバクターピロリの結合をクロマトグラム結
合アッセイで調べた。ヘリコバクターピロリが結合した画分はチューブ７８〜
８８であり、これらの画分を集めたところ、１４．２ｍｇのヘリコバクターピ
ロリ結合性スフィンゴリピドを得た。

【００８１】このヘリコバクターピロリ結合性スフィンゴリピドをアセチル化し、さらにY
MC SH-044-10カラムを用いたＨＰＬＣで分離した。クロロホルムでカラムを平衡
化し、クロロホルムに対して溶液Ｃ（クロロホルム／メタノール（９５：５、容
積比））の直線状のグラジュエントを用い、２ｍｌ／分の流速でスフィンゴリピ
ドを溶離した。具体的には、クロロホルム中の溶液Ｃの割合を１０分間で０％か
ら２０％に上げ、次の７０分間で２０％から１００％に上げ、その後１００％に
保って１０分間流した。各１ｍｌの画分の一部について、脱アセチル化した後に
薄層クロマトグラフィに付し、アニスアルデヒド染色し、グリコスフィンゴリピ
ドを含有する画分については、ヘリコバクターピロリ結合活性を調べた。大部
分のヘリコバクターピロリ結合性グリコスフィンゴリピドはチューブ６２に存
在し、この画分（２．４ｍｇ）を構造決定に用いた。

【００８２】ヒトの胃上皮細胞 − 肥満症の治療としての選択的手術を受けた患者の胃基底
部から胃組織（１０×１０ｃｍの切片）を得た。この切片を０．９％塩化ナトリ
ウム（ｗ／ｖ）で洗浄し、胃粘膜細胞をやさしく掻き取り、−７０℃で保存した
。これを凍結乾燥し、そこから酸性及び非酸性グリコスフィンゴリピドを文献２
５の記載にしたがって単離した。２例においては、グリコスフィンゴリピドを非
粘膜性の残留物からも単離した。患者の血液型及びそれぞれの組織片から単離さ
れたグリコスフィンゴリピドの重量は、明細書の終わりに添付した表IIIに記載
した。

【００８３】表IIIのケース４の非酸性グリコスフィンゴリピド（２．９ｍｇ）をＨＰＬＣ
で分離した。具体的には、１．０×２５ｃｍシリカゲルカラム（粒子の直径：１
０μｍ）（Kromasil-Sil、Skandinaviska Genetec社製）を用い、１８０分かけ
てクロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４から４０：４０：１２、容積
比）のグラジュエントを流し、２ｍｌ／分の流速で画分を回収した。各画分の一
部を、アニスアルデヒドを染色試薬として用いる薄層クロマトグラフィに付した
。テトラグルコシルセラミドをチューブ１２〜１７に回収した。チューブ１２〜
１４は、更に薄層クロマトグラフィ上でトリグリコシルセラミド領域と同じ移動
度を示す化合物を含んでいた。これら３画分を集めたところ、０．２ｇの化合物
（画分４−Ｉと称する）を得た。チューブ１５〜１７からは別途０．５ｍｇのテ
トラグリコシルセラミド（画分４−ＩＩと称する）を得た。

【００８４】ケース５においては、１０ｍｇの非酸性グリコスフィンゴリピド画分を、上記
と同様のシステムを用い、クロロホルム／メタノール／水（６０：３５：８から
４０：４０：１２、容積比）のグラジュエントで溶離した。チューブ１１の画分
（画分５-Ｉと称する）はトリグルコシルセラミドとテトラグリコシルセラミド
（０．１ｍｇ）を含んでおり、一方、チューブ１２及び１３の画分には、テトラ
グルコシルセラミドしか含まれていなかった。チューブ１２及び１３に含まれる
テトラグルコシルセラミド（画分５-ＩＩと称する）は、合計で０．３ｍｇであ
った。

【００８５】電子イオン化質量分析 − 質量分析を行なう前に、文献３３の記載にしたがい
、ジメチルスルホキシド中の水酸化ナトリウム（固体）およびヨウ化メチルを用
いてグリコスフィンゴリピドをパーメチル化した。ヒトの胎便から単離したテト
ラグリコシルセラミドを、インビーム法（文献３４）を用いたVG ZAB 2F/I-IF質
量分析計（英国、マンチェスター、VG Analytical社製）で分析した。分析条件
は、データ処理したスペクトルの凡例に示した。ヒトの胃の粘膜細胞由来のテト
ラグリコシルセラミドをJEOL SX1024A質量分析計（日本国、東京、日本電子製）
で上記と同じ方法で分析した。分析条件は次の通りである。電子エネルギー：７
０ｅＶ、捕捉電流：３００μＡ、加速電圧：１０ｋＶ。温度は１５０℃で開始し
、１５℃／分で昇温した。

【００８６】分解特性の分析 − ヒト胎便由来のパーメチル化グリコスフィンゴリピドを加
水分解し、還元及びアセチル化し（文献３１、３２）、部分メチル化したアルジ
トール酢酸エステル及びヘキソサミニトール酢酸エステルをTrio−２四重極質量
分析計（Trio-2 quadrupole mass spectrometer）（英国、アールトリカム、VG
Masslab社製）を用いてガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析を行なっ
た。Hewlett Packard 5890Aガスクロマトグラフにオンカラム注入器および長さ
１５ｍ、内径０．２５ｍｍのフューズドシリカキャピラリーカラムであるＤＢ−
５（カナダ国、Ranco Cordova、J&W Scientific社製）（被覆の厚さは０．２５
μｍ）を備えた装置を用いた。サンプルをオンカラム法で７０℃（１分）で注入
し、オーブンの温度を７０℃から１７０℃へ５０℃／分で昇温し、さらに１７０
℃から２６０℃へは８℃／分で昇温した。質量分析法の分析条件は以下の通りで
ある。電子エネルギー：４０ｅＶ、捕捉電流：２００μＡ。サンプルに含まれる
成分は、対照物質とした、グリコスフィンゴリピドから得た部分メチル化アルジ
トールの酢酸エステルの保持時間および質量スペクトルと比較することで同定し
た。

【００８７】プロトンＮＭＲスペクトル法 − プロトンＮＭＲスペクトルをVarian VXR300
（カリフォルニア州、パロアルト、Varian社製）を用いて７．０５Ｔ（３００Ｍ
Ｈｚ）で測定し、さらにJEOL Alpha500（日本国、東京、日本電子製）を用いて
１１．７５Ｔ（５００ＭＨｚ）で測定した。データはオフラインでNMR1（ニュー
ヨーク州、シラキュース、NMRi社製）で処理した。重水素置換したグリコスフィ
ンゴリピド画分をジメチルスルホキシド−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ（９８：２、容積比）に溶
解し、スペクトルを３０℃で０．４Ｈｚのデジタル分解能で記録した。化学シフ
トはテトラメチルシランとの相対値で示した。

【００８８】溶解性オリゴ糖による阻害 − 溶解性オリゴ糖による結合阻害の可能性を調べ
るために、異なる濃度（０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ
／ｍｌ）のラクトテトラオース（ニューヨーク州、ウエストベリー、Accurate C
hem. & Sci. Corp.社製）またはラクトース（ニュージャージー州、フィリップ
スバーグ、J. T. Baker Chem. Co.社製）を含むＰＢＳ中で³⁵Ｓで標識したヘリ
コバクターピロリ００２株及び０３２株と共に室温で１時間インキュベートし
た。その後、分離したガングリオテトラオシルセラミド、ラクトテトラオシルセ
ラミド及び対照用のグリコスフィンゴリピドのクロマトグラムに対して、上記と
同様にクロマトグラム結合アッセイを行なった。

【００８９】分子モデリング − 表IIに記載した様々なグリコスフィンゴリピドについて、
シリコングラフィックス4D/3STGワークステーション上のDeriding-II force fie
ld（文献３５）でバイオグラフ分子モデリング用のプログラム（マサチューセッ
ツ、ウォルシャム、Molecular Simulations Inc.社製）で最小エネルギー立体配
座を計算した。電荷を電荷平衡法（文献３６）を使って生成し、クーロン相互作
用は距離依存電子誘導定数ε＝３．５ｒとした。さらに、特別水素結合項を用い
、その中でＤｈｂを−４ｋｃａｌ／ｍｏｌに設定した（文献３５）。

【００９０】ヒト胃上皮由来のテトラグリコシルセラミドのセラミドグリカナーゼ処理 −
Hanssonらの方法（文献３７）で酵素的加水分解を行なった。具体的には、ケー
ス４で得た画分４−ＩＩ、ケース５で得た画分５−ＩＩ、対照物質とするヒト赤
血球由来のグロボシド（文献３８）、対照物質とするヒト胎便由来のラクトテト
ラオシルセラミド及び対照物質とするラクトネオテトラオシルセラミド（ヒト赤
血球由来シアリルラクトネオテトラオシルセラミドをシアリダーゼ処理して得ら
れたもの、文献３９）のそれぞれを１００μｇづつ、１００μｌの０．０５Ｍ酢
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０、１２０μｇの塩素酸ナトリウムを含む）
に溶解し、短時間超音波処理した。その後、１ｍＵのヒル（Macrobdella decora ）由来のセラミドグリカナーゼ、（ドイツ国、マンハイム、Boehringer Mannhei
m社製）を加え、この混合液を３７℃で２４時間インキュベートした。最終的な
割合を８：４：３（容積比）となるようにクロロホルム／メタノール／水を添加
して反応を停止した。オリゴ糖を含む上層を、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ₁₈カートリッジ
（マサチューセッツ州、ミルフォード、Waters社製）を使用してセラミドと界面
活性剤から分離した。オリゴ糖を含む溶離液を窒素気流下および真空下で乾燥し
、文献３３の記載に従ってパーメチル化した。

【００９１】高温ガスクロマトグラフィ及びガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析
法によるパーメチル化オリゴ糖の分析 − 分析条件は文献４０の記載と実質的に
同じだった。０．０３μｍの厚みで架橋ＰＳ２６４（スイス国、Buchs、Fluka社
製）をコートしたフューズドシリカカラム（長さ１０ｍ、内径０．２５ｍｍ）を
用い、水素をキャリアーガスとしてHewlett-Packard 5890Aでキャピラリーガス
クロマトグラフィを行なった。パーメチル化オリゴ糖を酢酸エチルに溶解し、１
μｌのサンプルをオンカラム法で７０℃（１分）で注入した。温度は２段階で昇
温した、すなわち、７０℃から２００℃まで５０℃／分で昇温し、以後３５０℃
まで１０℃／分で昇温した。

【００９２】ガスクロマトグラフィ − 電子イオン化質量分析法は、Hewlett-Packard5890-
IIガスクロマトグラフをJEOL SX-102A質量分析計につないで行なった。クロマト
グラフィの条件は、キャピラリーカラムも含めてガスクロマトグラフィのそれと
同じにし、質量分析は次の条件で行った。インターフェイス温度：３５０℃、イ
オン源温度：３３０℃、電子エネルギー：７０ｅＶ、捕捉電流：３００μＡ、加
速電圧：１０ｋＶ、スキャン質量範囲：１００〜１６００、トータルサイクル時
間：１．４秒、分離度：１０００、及びイオン源領域内圧力：１０^-5Ｐａ。

【００９３】結果対照となるグリコスフィンゴリピド混合物への結合 − 詳細に特徴づけられて
いるグリコスフィンゴリピド類の混合物であり、多様な炭水化物配列を含む混合
物を薄層クロマトグラフィで分離した。

【００９４】結果を図１に示す。図１は³⁵Ｓで標識したヘリコバクターピロリあるいは¹²⁵ Ｉで標識したバクテリアの表面タンパク質の、薄層クロマトグラフィで分離した
グリコスフィンゴリピドへの結合を示す。図１Ａはアニスアルデヒド試薬で検出
したグリコスフィンゴリピドを示す。放射能標識したヘリコバクターピロリ１
７８７５株がグリコスフィンゴリピドに結合した後のオートラジオグラフィでは
、図１Ｂ及び図１Ｃに見られるように、いくつかの選択的なバンドしか視覚化さ
れなかった。放射能標識したバクテリア表面タンパク質を用いた場合にも、同様
の結合パターンが得られた（記載していない）。アルミニウムにシリカゲル６０
を塗布してあるＨＰＴＬＣプレート上で、クロロホルム／メタノール／水（６０
：３５：８、容積比）混合溶媒を展開溶媒としてグリコスフィンゴリピドを分離
し、結合アッセイを「材料と方法」の項で述べた方法で行なった。薄層クロマト
グラムを２％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでコートした際に
図１Ｂのオートラジオグラムを得、２％ＢＳＡのみを含むＰＢＳで薄層クロマト
グラムをコートした際に図１Ｃのオートラジオグラムを得た。各レーンは次のグ
リコスフィンゴリピドを含んでいる：血液型がＡのヒト赤血球由来の非酸性グリ
コスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン１）；イヌ小腸由来の非酸性グリコスフ
ィンゴリピド、４０μｇ（レーン２）；モルモット小腸由来の非酸性グリコスフ
ィンゴリピド、２０μｇ（レーン３）；マウス糞便由来の非酸性グリコスフィン
ゴリピド、２０μｇ（レーン４）；ブラックアンドホワイトラット（black-and-
white rat）小腸の上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（
レーン５）；ヒト胎便由来の非酸性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン
６）；血液型がＯのヒト赤血球由来の酸性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（
レーン７）；ウサギ胸腺由来の酸性グリコスフィンゴリピド、２０μｇ（レーン
８）；子牛脳由来のガングリオシド、４０μｇ（レーン９）；及びヒト副腎腫由
来の酸性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン１０）。オートラジオグラ
フィは１２時間行なった。

【００９５】レーン２（ラクトシルセラミド）、レーン３（ガングリオトリアオシルセラミ
ド）及びレーン４（ガングリオテトラオシルセラミド）の結合は、既に文献１６
に詳細に発表されている、ヘリコバクターピロリの「ラクトシルセラミド結合
特異性」及び「ガングリオ結合特異性」に対応するものであると判定した。

【００９６】さらに、テトラグリコシルセラミド領域と同じ移動度を示すヒト胎便由来の非
酸性グリコスフィンゴリピド画分中の成分に対するヘリコバクターピロリの選
択的結合を検出した（図１Ｂ、レーン６）。コーティングバッファーが界面活性
剤（Ｔｗｅｅｎ２０あるいはデオキシオキシコール酸）を含む場合にのみ、図１
に見られるように後者の結合活性を検出した。以後、溶液４（２％牛血清アルブ
ミン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を標準的なコーティング法に使
用した。ヒト胎便由来の結合活性を有するテトラグリコシルセラミドをＨＰＬＣ
で単離して、以下のように質量分析法、プロトンＮＭＲスペクトル法及び分解後
のガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析法によってその特性を調べた。

【００９７】ヒト胎便由来の、ヘリコバクターピロリ結合性グリコスフィンゴリピドの化
学構造 − 結合活性を有するテトラグリコシルセラミドを総量２４０ｍｇの非酸
性グリコスフィンゴリピドから単離した。この天然のグリコスフィンゴリピド混
合物のＨＰＬＣによって、１４．２ｍｇのテトラグリコシルセラミドを得た。こ
のテトラグリコシルセラミド画分は複合体混合物であり、ヘリコバクターピロ
リ結合性グリコスフィンゴリピドに加えて、少なくとも３つの他のグリコスフィ
ンゴリピドを含んでいた。テトラグリコシルセラミド画分をアセチル化し、さら
にＨＰＬＣで分離し、２．４ｍｇの結合活性を有するグリコスフィンゴリピドか
らなる純粋な画分を得た。薄層クロマトグラム上で放射能標識したヘリコバクタ
ーピロリの結合を観測することで、分取過程のそれぞれの段階をモニターした
。

【００９８】電子イオン化質量分析 − ヒト胎便由来の結合活性を有するパーメチル化グリ
コスフィンゴリピドの質量スペクトルを、ｄ１８：１−ｈ２４：０セラミドを有
する分子種を表す、説明のために簡略化した化学式とともに検討した。結果を図
２に示す。スペクトルの上に説明のための簡略化した式を示した。この式はスフ
ィンゴシンとヒドロキシ２４：０脂肪酸を有するセラミド種を表している。分析
条件は次の通りである。サンプル量：１６μｇ、電子エネルギー：４５ｅＶ、捕
捉電流：５００μＡ、加速電圧：８ｋＶ。温度は２５０℃から始めて、６℃／分
で昇温した。データ処理したスペクトルは３００℃で記録した。

【００９９】パーメチル化グリコスフィンゴリピドのスペクトルの大部分は、炭水化物配列
を与えるオキソニウムイオン及びセラミドの誘導開裂から生じるフラグメントイ
オンだった。他のフラグメントイオンの量はとても少なかったが、塩基のα開裂
によるインモニウムイオンが、フィトスフィンゴシンの場合には長鎖塩基のイオ
ンとして生じていた。

【０１００】長鎖塩基の一部が欠失することによって生じるインモニウムイオンに帰属する
ピークをｍ／ｚ１２９８と１３２６に検出した。これらのイオンは糖の数および
種類並びに脂肪酸組成に関する情報を提供し、この場合は、１つのＮ−アセチル
ヘキソサミンと３つのヘキソースがｈ２２：０とｈ２４：０の脂肪酸と組み合さ
れていることを示した。

【０１０１】ｍ／ｚ２１９と１８７（即ち２１９−３２）、４６４、６６８および８７２の
それぞれの炭水化物配列のイオンは、グリコスフィンゴリピドが、Ｈｅｘ−Ｈｅ
ｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘからなる炭水化物配列を有するテトラグリコシルセラミド
であることを示した。これは、炭水化物鎖全部と脂肪酸の一部からなるｍ／ｚ９
４５（即ち９４４＋１）のフラグメントイオンによって支持された。１型の鎖（
Ｈｅｘβ−３ＨｅｘＮ）の存在は、４−置換ＨｅｘＮの場合は著しく目立つｍ／
ｚ１８２のフラグメントイオン（文献４１，４２）が存在しないことによって示
された。ｍ／ｚ２６０の末端ＨｅｘＮイオンが見られないことから、ｍ／ｚ２２
８の強いフラグメントイオンは内部ＨｅｘＮに帰属する２次フラグメントである
。

【０１０２】分子量領域は弱かった。しかし、ｄ１８：１−２４：０、ｄ１８：１−ｈ２２
：０およびｄ１８：１−ｈ２４：０セラミドを有する分子種に対応する［Ｍ−Ｈ
］⁺イオンをそれぞれｍ／ｚ１５４８、１５５０と１５７８に検出した。分子イ
オンからの炭水化物鎖の末端部分の欠失も観察された（ｄ１８：１−ｈ２４：０
セラミドを有する分子種の式の下に説明がある）。ｍ／ｚ１３４２と１３７０の
それぞれのイオンはｔ１８：０長鎖塩基並びにｔ１８：０−ｈ２２：０セラミド
とｔ１８：０−ｈ２４：０セラミドのそれぞれに含まれる２つの水酸基間の開裂
によって生じたものと考えられる。

【０１０３】セラミドの組成に関する更なる情報が、ｍ／ｚ５４８〜７２２に見られる一連
のフラグメントイオンによって提供された。セラミドはｄ１８：１−１６：０か
らｔ１８：０−ｈ２４：０の範囲内の分子種の混合物であり、セラミドイオン、
インモニウムイオン、および分子イオンの相対強度をもとに判断した結果、主要
なセラミド種はｄ１８：１−２４：０、ｄ１８：１−ｈ２４：０、ｔ１８：０−
ｈ２２：０とｔ１８：０−ｈ２４：０であった。

【０１０４】従って、パーメチル化グリコスフィンゴリピドの質量分析によると、グリコス
フィンゴリピドの炭水化物鎖はＨｅｘ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ−Ｈｅｘであり、ｄ１
８：１の長鎖塩基とｔ１８：０の長鎖塩基が主に２２個と２４個の炭素原子から
なるヒドロキシ脂肪酸と非ヒドロキシ脂肪酸に組み合わさっていることが判明し
た。

【０１０５】分解特性に関する研究 − 炭水化物残基間の結合位置はパーメチル化テトラグ
リコシルセラミドの分解によって決定した。具体的には、サンプルを酸加水分解
に付し、次いで還元とアセチル化に付した。その結果として得られた部分的にメ
チル化されたアルジトール酢酸エステルをガスクロマトグラフィ−電子イオン化
質量分析法で分析した。このようにして得られた再構成イオンクロマトグラムに
は炭水化物のピークが４つ存在した（記載しない）。２，３，４，６テトラメチ
ル−ガラクチトールの酢酸エステルは末端ガラクトースの存在を示し、４，６ジ
メチル−２−Ｎメチル−アセタミド−グルシトール（３−置換Ｎ−アセチルグル
コサミン）の酢酸エステルは１型の鎖の存在を示した。残りの２つのピーク、即
ち２，４，６−トリメチル−ガラクチトールと２，３，６−トリメチルグルシト
ールのピークは、それぞれ３−置換ガラクトースおよび４−置換グルコースに帰
属すると判明した。

【０１０６】質量分析法のデータと上記データを組合せた結果、炭水化物鎖はＧａｌ１−３
ＧｌｃＮＡｃ１−３Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ１であると結論付けられた。

【０１０７】プロトンＮＭＲスペクトル法 − ヒト胎便由来のグリコスフィンゴリピドにつ
いて、３００ＭＨｚのプロトンＮＭＲスペクトル分析を行った。結果を図３に示
す。プローブ温度３０℃の条件で４，０００回スキャンした。５．０４ｐｐｍに
見られる大きな分散波形様のシグナルは測定装置のノイズである。また、４．９
３ｐｐｍに未同定の不純物が検出された。

【０１０８】プロトンＮＭＲスペクトルのアノメリック領域には、５つの大きな (3−ダブ
レット（Ｊ_1,2＝約８Ｈｚ）が存在した。グルコースのアノメリックプロトンシ
グナル（４．２０ｐｐｍ、Ｊ_1,2＝７．２Ｈｚ）は２つのシグナルに分れていた
。これはこのような場合に良く見られることで、セラミドの頭部にあたるグルー
プの差に基づくものである。４．２８ｐｐｍ（Ｊ_1,2＝７．２Ｈｚ）にはＧａｌ
(i4 基のアノメリックプロトンが検出され、これは３位の置換を意味する。内部
ＧｌｃＮＡｃβアノマーが４．７９ｐｐｍ（Ｊ_1,2＝８．０Ｈｚ）に検出され、
Ｎ−アセタミドメチルプロトンが１．８２ｐｐｍに共鳴しているのが検出された
。そして末端Ｇａｌ(3のシグナルが４．１５ｐｐｍ（Ｊ_1,2＝６．６Ｈｚ）に検
出され、これは１位と３位の結合を意味した。従って、アノメリックの化学シフ
トはラクトテトラオシルセラミドに関して出版されているデータ（文献４５）と
全て符合した。主な化合物のほかに、４．６７ｐｐｍと４．４７ｐｐｍのβ−ダ
ブレットが少量の不純物の存在を示し、これらは未分化のマウス白血病細胞につ
いて報告されているラクトガングリオテトラオシルセラミドのハイブリッド構造
（文献４４）に対応しているようだった。

【０１０９】すべてのデータを総合すると、ヒト胎便由来の、ヘリコバクターピロリ結合
性グリコスフィンゴリピドはＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１
Ｃｅｒ、即ち、既に上記の材料より単離されたことのあるラクトテトラオシルセ
ラミド（文献４５）であることが明らかとなった。本件で見出した主なセラミド
種（主にｄ１８：１−２４：０、ｄ１８：１−ｈ２４：０、ｔ１８：０−ｈ２２
：０、およびｔ１８：０−ｈ２４：０）は、ヒドロキシ脂質しか見出されていな
かった過去の報告とは異なっていた。

【０１１０】薄層クロマトグラムにおけるイソレセプターの比較 − ラクトテトラオシルセ
ラミドと関連した構造を有する種々の精製グリコスフィンゴリピドについて、ヘ
リコバクターピロリ結合活性をクロマトグラム結合アッセイで検討した。結果
を表IIおよび図４にまとめた。図４のレーンはそれぞれ以下の通りである：Ｇｌ
ｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（ラクトトリアオシルセラミド）、４
μｇ（レーン１）；Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（
ラクトテトラオシルセラミド）、４μｇ（レーン２）；Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３Ｇ
ｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（Ｈ５１型グリコスフィンゴリピ
ド）、４μｇ（レーン３）；Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌ
β４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（Ｌｅ^a−５グリコスフィンゴリピド）、４μｇ（レーン
４）；Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ
β１Ｃｅｒ（Ｌｅ^b−６グリコスフィンゴリピド）、４μｇ（レーン５）；Ｇａ
ｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（Ｘ−５グ
リコスフィンゴリピド）、４μｇ（レーン６）；Ｆｕｃα２Ｇａｌβ４（Ｆｕｃ
α３）ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（Ｙ−６グリコスフィンゴ
リピド）、４μｇ（レーン７）；およびＧａｌα３（Ｆｕｃα２）Ｇａｌβ３Ｇ
ｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（Ｂ−６１型グリコスフィンゴリ
ピド）、４μｇ（レーン８）。

【０１１１】図４Ａはアニスアルデヒドを用いた化学検出結果を示し、図４Ｂは³⁵Ｓで標識
したヘリコバクターピロリ０３２株の結合によって得られたオートラジオグラ
ムを示す。アルミニウムにシリカゲル６０を塗布してあるＨＰＴＬＣプレートと
、溶媒系としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（６０：３５：８、容積
比）を用いてグリコスフィンゴリピドを分離し、「材料と方法」の項で説明した
ように、２％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳをコーティングバッ
ファーとして用いた結合アッセイを行った。オートラジオグラフィは１２時間行
った。

【０１１２】結合活性を唯一示したグリコスフィンゴリピドはラクトテトラオシルセラミド
（レーン２）であり、その置換はいずれも結合活性を奪ってしまった。従って、
２位のα−フコースの付加（表IIのケース４）、末端ガラクトースの３位のα−
Ｎ−グリコリルノイラミン酸の付加（ケース１１）またはα−ガラクトースの付
加（ケース８）、あるいはＮ−アセチルグルコサミンの４位のα−フコースの付
加（ケース５）は許容されなかった。ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃ
ｅｒグリコスフィンゴリピド（ケース１）に対する結合はなく、Ｇａｌβ３Ｇｌ
ｃＮＡｃβ−部位の重要性を示した。末端から２つ目のＮ−グルコサミンの２位
に結合したアセトアミド基は実質的に相互作用に関与した。なぜならば、この置
換基の欠損（ケース３）は結合能を完全に失わせることになったからである。

【０１１３】薄層クロマトグラムにおける結合阻害 − ヘリコバクターピロリのグリコス
フィンゴリピドへの薄層プレート上での結合に対する溶解性オリゴ糖の阻害能は
、放射能標識したヘリコバクターピロリ１７８７５株を遊離ラクトテトラオー
ス（０．１ｍｇ／ｍｌ）またはラクトース（０．２ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液と
ともに室温で１時間インキュベートし、この懸濁液をクロマトグラム結合アッセ
イに付すことで測定した。結果を図５に示す。図５Ａはアニスアルデヒドで染色
した薄層クロマトグラムであり、図５Ｂはラクトースと共にインキュベートした
ヘリコバクターピロリの結合を示し、図５Ｃはラクトテトラオースと共にイン
キュベートしたヘリコバクターピロリの結合を示す。図５のレーンはそれぞれ
以下の通りである：Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（
ガングリオテトラオシルセラミド）、４μｇ（レーン１）；Ｇａｌβ３ＧｌｃＮ
Ａｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ（ラクトテトラオシルセラミド）、４μｇ
（レーン２）；およびＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ
（ネオラクトテトラオシルセラミド）、４μｇ（レーン３）。アルミニウムにシ
リカゲル６０を塗布してあるＨＰＴＬＣプレートと、クロロホルム／メタノール
／水混合溶媒（６０：３５：８、容積比）を展開溶媒として用いてグリコスフィ
ンゴリピドを分離し、「材料と方法」の項で説明したように、２％ＢＳＡと０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳをコーティングバッファーとして用いて結合ア
ッセイを行った。オートラジオグラフィは１２時間行った。

【０１１４】ラクトテトラオース（０．１ｍｇ／ｍｌ）とのインキュベーションによってヘ
リコバクターピロリとラクトテトラオシルセラミドとの結合は阻害され、一方
、ラクトースとのインキュベーションは結合に対して阻害効果はなかった。

【０１１５】ヒトの胃に由来するグリコスフィンゴリピドに対するヘリコバクターピロリの
結合ヒト胃壁全体から得た非酸性グリコスフィンゴリピド − バクテリアの標的組
織における、結合活性を有するグリコスフィンゴリピドの発現を検討するために
、ヒト胃壁全体より単離したグリコスフィンゴリピドに対するヘリコバクター
ピロリの結合を検討した。結果は、分離したグリコスフィンゴリピドをアニスア
ルデヒドで検出した薄層クロマトグラム（図６Ａ）および³⁵Ｓで標識したヘリコ
バクターピロリ００２株の結合によって得られたオートラジオグラム（図６Ｂ
）からなる図６に示した。図６のレーンはそれぞれ以下の通りである：ヒト胎便
由来のラクトテトラオシルセラミド、４μｇ（レーン１）；ヒト胎便由来の非酸
性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン２）；血液型がＡ（Ｒｈ＋）ｐの
個人より得られたヒト胃由来の非酸性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レー
ン３）；および血液型がＡ（Ｒｈ＋）Ｐの個人より得られたヒト胃由来の非酸性
グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン４）。アルミニウムにシリカゲル６
０を塗布してあるＨＰＴＬＣプレートと、溶媒系としてクロロホルム／メタノー
ル／水混合溶媒（６０：３５：８、容積比）を用いてグリコスフィンゴリピドを
分離し、「材料と方法」の項で説明したように、２％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含むＰＢＳをコーティングバッファーとして用いて結合アッセイを行っ
た。オートラジオグラフィは５時間行った。各バンドに含まれる炭水化物残基の
ナンバーを左端に記載した。

【０１１６】これらの非酸性画分のテトラグリコシルセラミド領域の大部分をグロボシドが
占めており（図６Ａのレーン４に例示されている）、グロボシドは、少なくとも
ヒトの小腸（文献４６）および結腸（文献４７）においては、非上皮性間質に由
来するものである。これらの画分に対するヘリコバクターピロリの結合は検出
されなかった（図６Ｂのレーン４に例示されている）。しかし、血液型がＡ（Ｒ
ｈ＋）ｐである個体の胃より得られた非酸性グリコスフィンゴリピド画分は、ラ
クトシルセラミドのグロボトリアオシルセラミドへの変換を司るガラクトシルト
ランスフェラーゼを欠損している（文献４９）ためにグロボシドを欠いており（
図６Ａ、レーン３）、ヘリコバクターピロリのテトラグリコシルセラミド領域
への結合が検出された（図６Ｂ，レーン３）。グリコスフィンゴリピドの単離に
用いた組織は、消化性潰瘍の外科手術の後に得たものであり、その量が限られて
いるために、結合活性を有するテトラグリコシルセラミドの化学的な特徴付けを
行うことはできなかった。

【０１１７】ヒトの胃の上皮細胞由来のグリコスフィンゴリピド − 次に本発明者らは、ヒ
トの胃の上皮細胞から単離したグリコスフィンゴリピドに対するヘリコバクターピロリの結合について検討した。非腫瘍性の幽門組織が通常の外科手術で切除
されることは稀なため、ヘリコバクターピロリが最も頻繁に発見される領域と
は組織学的に異なっているものの（文献５０と５１）、肥満症の手術の際に患者
より得られた胃底部からグリコスフィンゴリピドを単離した。

【０１１８】合計して７個体から粘膜をかき取り、そのうちの２個体からは更に非粘膜性の
残留物を得、それらからグリコスフィンゴリピドを単離した。材料の量が限られ
ているため、これらの画分の結合能はヘリコバクターピロリ００２株および０
３２株についてのみ試験した。

【０１１９】酸性グリコスフィンゴリピド画分に含まれる主な化合物は、薄層クロマトグラ
ムにおいてスルファチドやＧＭ３と同じ移動度を示した。ヘリコバクターピロ
リはこれらの主要な酸性グリコスフィンゴリピド類に結合しなかった（図示せず
）。非上皮性間質由来のグリコスフィンゴリピドに対してヘリコバクターピロ
リは結合しないことが判明した。

【０１２０】７ケースのヒトの胃の上皮細胞から分離した非酸性グリコスフィンゴリピド画
分のうちの５ケースにおいてヘリコバクターピロリの結合が認められ、その結
果を図７に示す。アニスアルデヒドを用いた化学検出の結果を図７Ａに示す。図
７Ｂに示すように、７個体のうちの１個体においては、ヘリコバクターピロリ
のテトラグリコシルセラミド領域への結合を検出した。図中のレーン１〜３は非
酸性グリコスフィンゴリピドを示し、それぞれ、対照となるイヌ小腸由来の非酸
性グリコスフィンゴリピド、４０μｇ（レーン１）；マウス糞便由来の非酸性グ
リコスフィンゴリピド、２０μｇ（レーン２）、ヒト胎便由来の非酸性グリコス
フィンゴリピド、４０μｇ（レーン３）である。一方、レーン４〜８は酸性グリ
コスフィンゴリピド（８０μｇ／レーン）を示し、５個体（表III中のケース１
〜５）のそれぞれのヒト胃上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピドである
。図７Ｂは、³⁵Ｓで標識したヘリコバクターピロリ０３２株の結合により得ら
れたオートラジオグラムである。グリコスフィンゴリピドを、アルミニウムにシ
リカゲル６０を塗布してあるＨＰＴＬＣプレート上で、クロロホルム／メタノー
ル／水（６０：３５：８、容積比）混合溶媒を展開溶媒として用いて分離した。
また、２％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳをコーティングバッ
ファーとして用い、「材料および方法」の項で説明したように結合アッセイを行
った。オートラジオグラフィは１２時間行った。各バンドに含まれる炭水化物残
基のナンバーを左端に記載した。

【０１２１】更に、既に報告されているように（文献１６）、１つのケースにおいては、ジ
グリコシルセラミド領域の移動度を示す結合活性を有する化合物を見出した。結
合活性を有するテトラグリコシルセラミドを含有する画分（ケース４）及び非結
合性の画分（ケース５）をＨＰＬＣで分離し、各々のケースから分離したテトラ
グリコシルセラミドをプロトンＮＭＲスペクトル法、電子イオン化質量分析法、
及びセラミドグリカナーゼで加水分解して得られたパーメチル化四糖類のガスク
ロマトグラフィ−電子イオン化質量分析法を用いてそれらの特性を分析した。結
果を図８に示す。図８Ａは表IIIのケース４及び５の胃上皮細胞から得られたテ
トラグリコシルセラミド含有画分の薄層クロマトグラムであり、図８ＢとＣは、
４−ＩＩ画分（図８Ｂ）及び５−ＩＩ画分（図８Ｃ）の５００ＭＨｚプロトンＮ
ＭＲスペクトルのアノメリック領域を示している。薄層クロマトグラムのレーン
は、ケース４の胃上皮由来の総非酸性グリコスフィンゴリピド、８０μｇ（レー
ン１）；ケース４の４−Ｉ画分、４μｇ（レーン２）；ケース４の４−ＩＩ画分
、４μｇ（レーン３）；ケース５の胃上皮由来の総非酸性グリコスフィンゴリピ
ド、８０μｇ（レーン４）；ケース５の５−Ｉ画分、４μｇ（レーン５）；ケー
ス５の５−ＩＩ画分、４μｇ（レーン６）である。ガラスにシリカゲル６０を塗
布してあるＨＰＴＬＣプレートとクロロホルム／メタノール／水（６０：３５：
８、容積比）混合溶媒を展開溶媒として用いてグリスフィンゴリピドを分離し、
アニサルデヒドで染色した。各バンドに含まれる炭水化物残基のナンバーを左端
に記載した。プロトンＮＭＲスペクトル法においては、０．５ｍｇ（４−ＩＩ画
分）または０．３ｍｇ（５−ＩＩ画分）のサンプルに対して、各々、プローブ温
度３０℃で４，０００回スキャンした。

【０１２２】ヒト胃上皮細胞から得たテトラグリコシルセラミド画分のプロトンＮＭＲスペ
クトル分析 − ケース４から分離した４−ＩＩ画分のプロトンＮＭＲスペクトル
（図８Ｂ）は、４．８１ｐｐｍ（Ｇａｌα）、４．５２ｐｐｍ（ＧａｌＮＡｃβ
）、４．２６ｐｐｍ（Ｇａｌβ）及び４．２０／４．１７ｐｐｍ（Ｇｌｃβ）に
現れるグロボシドのアノメリックシグナルによって特徴付けられる。しかしなが
ら、ＧａｌαのＨ１シグナルのふもとの小さなピークは、この画分中に他のグリ
コスフィンゴリピドもまた存在することを示した。このシグナルは、ラクトテト
ラオシルセラミドのＧａｃＮＡｃβのＨ１シグナルと一致し、グロボシドの共鳴
シグナル下に他のシグナルが隠れている可能性を示した。しかし、グロボトリア
オシルセラミドのＧａｌαのＨ１も、非常に近い化学シフトを有している。正確
なシフトは、温度や他の要素によって変化する。この点を解決するために、本発
明者らはラクトテトラオシルセラミド、グロボテトラオシルセラミド、及びグロ
ボトリアオシルセラミドの４００ＭＨｚにおける対照となるスペクトルを比較し
た。対照となるラクトテトラオシルセラミド及びグロボテトラオシルセラミドの
混合物も調製し、５００ＭＨｚで測定した。これらの比較は、４．７９ｐｐｍに
おけるシグナルが、ラクトテトラオシルセラミドのＮ−アセチルグルコサミンの
β−アノメリックプロトンに属することを明確に示した。このことは、ケース４
においてより早く溶離してくるテトラグリコシルセラミド含有画分（４−Ｉ画分
）を分析することによって更に確認された。このときは、ガラクトースの２つの
重複しないα−アノメリックシグナルが検出され、一方はグロボテトラオシルセ
ラミドの内側のＧａｌαのＨ１（４．８１ｐｐｍ）に対応し、他方はグロボテト
ラオシルセラミドの末端のＧａｌαのＨ１（４．７８ｐｐｍ）に対応することが
分かった（図示せず）。

【０１２３】ラクトテトラオシルセラミドの存在は、グロボトリアオシルセラミド及びグロ
ボテトラオシルセラミドのＮ−アセタミドガラクトースと比較したＮ−アセタミ
ドグルコース（文献５２）のメチルシグナルの違いをも生じる。ＧａｌＮＡｃの
メチルシグナルは１．８５ｐｐｍに現れ、ラクトテトラオシルセラミドのＧｌｃ
ＮＡｃのメチルシグナルは１．８２ｐｐｍに現れた。これは対照としているスペ
クトルと一致し、文献５３に報告された値とも極めて近いものである。メチルシ
グナルの強度から、４−ＩＩ画分は、およそ５％のラクトテトラオシルセラミド
を含有すると判断した。

【０１２４】ケース５においてより早く溶離してくるテトラグリコシルセラミド含有画分（
５−Ｉ画分）は、４．８１ｐｐｍ及び４．７８ｐｐｍにおけるα−アノメリック
シグナルによって各々証明されているように、グロボトリアオシルセラミド及び
グロボテトラオシルセラミドの両方を含有していた（図示せず）。図８Ｃに示す
、より遅く溶離してくるテトラグリコシルセラミド含有画分（５−ＩＩ画分）は
また、ラクトネオテトラオシルセラミドのＧｌｃＮＡｃβに対応する４．６５ｐ
ｐｍのβ−ダブレット（文献５３）も含有していた。このグリコスフィンゴリピ
ドのＮ−アセタミドグルコースは、１．８２ｐｐｍのメチルシグナルを有する。
これはラクトネオテトラオシルセラミドに関する先行データ（文献５２）とも符
合するものである。

【０１２５】ヒト胃上皮細胞から得たテトラグリコシルセラミド画分の電子イオン化質量分
析 − ケース４及びケース５からそれぞれ得られた４−ＩＩ画分及び５−ＩＩ画
分のパーメチル化誘導体の電子イオン化質量分析法により得られた質量スペクト
ル（図示せず）は非常に似ていた。双方のスペクトルにおいて、ｍ／ｚ２６０及
び２２８（即ち２６０−３２）におけるイオンは顕著であり、末端ＨｅｘＮを示
すものであった。一方、末端Ｈｅｘを示すｍ／ｚ２１９におけるイオンは見出さ
れなかった。ｍ／ｚ９４５におけるイオンが末端ＨｅｘＮ−Ｈｅｘの存在を示し
た。炭水化物鎖の全長及び脂肪酸の一部を含有するｍ／ｚ９４５（９４４＋１）
におけるフラグメントイオンは、ＨｅｘＮ−ＨｅｘＨｅｘ−Ｈｅｘなる炭水化物
配列を示していた。

【０１２６】セラミド部分のフラグメントイオン、イモニウムイオン及び分子イオンの相対
強度は、４−ＩＩ画分に含まれる主要なセラミド種が、ｄ１８：１−１６：０、
ｄ１８：１−ｈ２４：０及びｄ１８：１−ｈ２４：１であり、５−ＩＩ画分は主
として、ｄ１８：１−１６：０、ｄ１８：１−２２：０、ｄ１８：１−２４：０
、ｄ１８：１−２４：１及びｄ１８：１−ｈ２４：０のセラミド種を含有するこ
とを示した。

【０１２７】このように、電子イオン化質量分析法では２つのサンプルの主要な化合物であ
るグロボサイドのみが特定され、プロトンＮＭＲ分析によってその存在が示唆さ
れた、画分中の少量の化合物は電子イオン化質量分析法で識別することはできな
かった。しかし、後述するように、クロマトグラフィ法と質量分析法を併用して
分離能を上げることで、少量の化合物の同定が可能となった。

【０１２８】ヒト胃上皮細胞由来のパーメチル化四糖類の高温ガスクロマトグラフィ−電子
イオン化質量分析 − ケース４の４−ＩＩ画分およびケース５の５−ＩＩ画分を
セラミドグリカナーゼで加水分解し、遊離した四糖類をパーメチル化し、ガスク
ロマトグラフィおよびガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析によって分
析した。結果を図９および図１０にまとめた。それぞれのクロマトグラムのピー
クは、α配座異性体とβ配座異性体に分離している。

【０１２９】図９は、セラミドグリカナーゼで遊離したパーメチル化四糖類の再構成イオン
クロマトグラムである。ランＡは、対照となるグロボシド、ラクトテトラオシル
セラミドおよびラクトネオテトラオシルセラミドの混合物であり、ランＢは、表
IIIのケース４の胃上皮由来のテトラグリコシルオシルセラミドであり、ランＣ
は、表IIIのケース５の胃上皮由来のテトラグリコシルオシルセラミドである。
分析条件は「材料と方法」の項に記載した。対照となる混合物のオリゴ糖には印
をつけた。

【０１３０】図１０は、高温ガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析法で得た、対照
となるグリコスフィンゴリピド（図１０のＩおよびＩＩ）、表IIIのケース４の
胃上皮由来のテトラグリコシルオシルセラミド画分（図１０のＩＩＩ）および表
IIIのケース５の胃上皮由来のテトラグリコシルオシルセラミド画分（図１０の
ＩＶ）をそれぞれセラミドグリカナーゼで処理し、遊離したパーメチル化オリゴ
糖の質量スペクトルである。分析条件は「材料と方法」の項に記載した。ランＡ
〜Ｃという表記は、図１０に示すトータルイオンクロマトグラムの部分を指して
いる。対照となるスペクトルには、そこから読み取ることのできる化学式を記載
した。

【０１３１】ヘリコバクターピロリ結合性を示したケース４の胃上皮の四糖類は、図９の
ランＢが示すように、２本のピークに分離した。顕著なピークは、対照としたグ
ロボシド由来の糖と同じ保持時間で溶離したが、小さなピークは対照としたラク
トテトラオシルセラミド由来の糖と同じ保持時間で溶離した。

【０１３２】ヘリコバクターピロリ結合性を示さないケース５の胃上皮の四糖類も２本の
ピークに分離し（図９のランＣ）、最も顕著なピークは、対照としたグロボシド
由来の糖と同じ保持時間で溶離した。この場合には、小さい方のピークは対照と
したラクトネオテトラオシルセラミド由来の糖と同じ保持時間で溶離した。

【０１３３】ヘリコバクターピロリ結合性を示すケース４およびヘリコバクターピロリ結
合性を示さないケース５におけるテトラグリコシルセラミド画分の違いを更に実
証するために、パーメチル化オリゴ糖の質量スペクトルを測定した（図１０）。
両方のケースにおいて、最も顕著なピークのスペクトルは対照としたグロボシド
のスペクトルと一致した（データは示さない）。しかし、ヘリコバクターピロ
リ結合性を示すケース４（図１０のＩＩＩ）およびヘリコバクターピロリ結合
性を示さないケース５（図１０のＩＶ）において、少量しか含まれていない四糖
類のスペクトルにはいくつかの相違点があった。

【０１３４】両者のスペクトルにおいて、末端のＨｅｘ−ＨｅｘＮ−Ｈｅｘ炭化水素配列を
示すフラグメントイオンは、ｍ／ｚ１８７（２１９−３２）、２１９、４３２（
４６４−３２）、４６４および６６８にあった。しかしながら、ケース５の溶離
の遅いピークのスペクトルには、ｍ／ｚ１８２のフラグメントイオンが最も顕著
であったものの、このイオンはケース４の溶離の遅いピークのスペクトルには存
在しない。ｍ／ｚ１８２のフラグメントイオンは、２型炭水化物鎖であるＧａｌ
β４ＧｌｃＮＡｃβ（文献４１、４２）に特徴的なイオンであるが、現在では、
イオン源温度を２８０℃以上に設定したときにのみ観測されることが報告されて
いる（文献５４）。

【０１３５】ケース５の糖のスペクトルにおいても、対照とするラクトネオテトラオシルセ
ラミドのスペクトル（図１０のＩＩ）と同様に、ｍ／ｚ４３２（４６４−３２）
のフラグメントイオンが最も顕著だった。これは、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ鎖
からよりもＧａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ鎖（Ｃ２−Ｃ３からの可能性が最も高い）
からメタノールが取り除かれやすいことを示している。

【０１３６】ケース４の糖は、最も強いフラグメントイオンをｍ／ｚ２２８に示した。この
イオンは、対照としたラクトテトラオシルセラミドのスペクトルにおいても顕著
であった（図１０のＩ）。ｍ／ｚ２６０にイオンが存在しないので、これはおそ
らく内側のＧｌｃＮＡｃに由来するものである。

【０１３７】結果としては、ケース４および５のテトラグリコシルセラミド由来のパーメチ
ル化オリゴ糖のガスクロマトグラフィおよびガスクロマトグラフィ−電子イオン
化質量分析によって、これらの画分のプロトンＮＭＲスペクトル法の結果を確認
した。両画分に含まれる主要な化合物はグロボテトラオースと同定されたものの
、少量しか含まれない化合物は異なっていた。ヘリコバクターピロリ結合性を
示したケース４においては、少量しか含まれない化合物はラクトテトラオースで
あり、ヘリコバクターピロリ結合性を示さないケース５のそれはネオラクトテ
トラオースだった。

【０１３８】ヘリコバクターピロリ分離株におけるラクトテトラオシルセラミド結合性の
発現頻度 − 表Ｉに挙げた６６株のヘリコバクターピロリ分離株の薄層クロマ
トグラム上でグリコスフィンゴリピドへの結合性を分析することで、ラクトテト
ラオシルセラミド結合特性の発現頻度を評価した。結合アッセイのために、バク
テリアを保存培養物から培養し、クロマトグラム結合アッセイでヒト胎便由来の
ラクトテトラオシルセラミドに対するヘリコバクターピロリ株の結合を調べた
。結合した場合には、図１Ｂのレーン６と同様のパターンを示した。結合しなか
った株は、保存培養物から更に２回培養しなおし、クロマトグマム結合アッセイ
によりアッセイをしなおした。すなわち、３度続けてアッセイでラクトテトラオ
シルセラミドに結合しなかった株を非結合性であると判断した。この基準による
と、分析した６６株のうちの９株（表Ｉに示した１５株、６５株、１７６株、１
９８株、２３９株、２６９株、２７１株、２７２株およびＢＨ０００３３４株）
が非結合性であったが、残りの分離株である５７株（全体の８６％）はラクトテ
トラオシルセラミド結合能を発現していた。

【０１３９】考察赤血球および唾液を使った血清学的分類によると、ケース４の血液型はＡＬｅ
（ａ＋ｂ−）非分泌型個体であり、これはこの個体の胃粘膜にヘリコバクター
ピロリ結合性非置換ラクトテトラオシルセラミドが存在していることと一致した
。しかしながら、Ｌｅ^b決定基に対するモノクローナル抗体の結合実験によって
、かなりの量のＬｅ^b−６グリコスフィンゴリピドが、この個体から分離した非
酸性グリコスフィンゴリピド画分、さらには他の個体の胃検体由来の非酸性画分
に存在することが見出された（データは記載しない）。以上の知見は、ヒトの胃
粘膜におけるルイス血液型抗原の発現は赤血球や唾液におけるルイス抗原の発現
とは相関関係がないことを示しており、他のヒト組織、例えば尿路上皮組織（文
献６１、６２）および大腸（文献４７，６３）に関する従来の報告と同じである
。

【０１４０】非分泌型個体の十二指腸潰瘍の罹患率の増加（文献６４〜６６）を考慮すると
、この個体が非分泌型であったとの知見は興味深いものである。最近の研究（文
献６７）によると、非分泌型であることとヘリコバクターピロリに感染しやす
いことには関連がないとの報告がある。しかしながら、分泌型であるか否かは、
菌の定着によって生じる結果、すなわち、非分泌型個体に見られる消化性潰瘍罹
患率の増加は、個体の胃上皮細胞にヘリコバクターピロリ結合性ラクトテトラ
オシルセラミドが存在しているためであると考えられる。

【０１４１】本研究の実験条件においては、ヘリコバクターピロリはラクトテトラオシル
セラミドを認識し、その一方では、ヒトの胃上皮細胞から分離した酸性画分中の
スルファチドおよびＧＭ３ガングリオシドと仮に同定したグリコスフィンゴリピ
ドには結合しなかった。ヘリコバクターピロリのラクトテトラオシルセラミド
への結合は、バクテリアを寒天培地で培養した場合にも、液体培地で培養した場
合にも検出されたことから、培養条件の違いによる影響を受けなかった。さらに
、ヘリコバクターピロリのラクトテトラオシルセラミドへの結合は、ヘリコバ
クターピロリの培養時間が１２時間の時にも１２０時間の時にも検出された。

【０１４２】ヘリコバクターピロリのラクトテトラオシルセラミドへの結合は、Ｌｅ^b結合
性付着因子をコードしている遺伝子が不活性であるｂａｂＡｌＡ２変異体にも見
られた（データは記載しない、文献６８参照）。したがって、ヘリコバクター
ピロリのＬｅ^b決定基への結合とラクトテトラオシルセラミドへの結合は、２つ
の別個の結合特異性を示している。

【０１４３】Ｌｅ^b決定基（Ｆｕｃα２Ｇａｌβ３（Ｆｕｃα４）ＧｌｃＮＡｃβ）は、ラ
クトテトラオシルセラミドの末端部分である１型二糖単位を基本にしている。し
かしながら、ヘリコバクターピロリとＬｅ^b決定基との相互作用はフコースに依
存しており、末端ガラクトースの２位にα―フコースが存在することが最小必須
要件であり、この相互作用は、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位にα−フコース
を導入することで強くなる（文献９）。これに対してヘリコバクターピロリの
ラクトテトラオシルセラミドへの結合においては、置換した基本受容体配列につ
いて調べた全ての試験において相互作用が完全に失われたことから、置換してい
ない炭化水素鎖が必要である。

【０１４４】図１２は、ラクトテトラオシルセラミドの最小エネルギー分子モデルを示す（
表IIのケース２、図１２Ａ）。比較のためにＬｅ^b−６グリコスフィンゴリピド
（表IIのケース６、図１２Ｃ）および２種の他のヘリコバクターピロリ非結合
性物質、即ち、Ｌｅ^b−５グリコスフィンゴリピド（表IIのケース５、図１２Ｂ
）および脱フコース化Ｂ６１型グリコスフィンゴリピド（表IIのケース８、図
１２Ｄ）の最小エネルギー分子モデルも共に示す。上半部に示してある図は、対
応するモデルを上から見たものである。ＧｌｃβＣｅｒ結合は延伸した立体配座
をとっていることがわかる。図１２のＢからＤにおいては、ラクトテトラオシル
セラミドの基本構造を網掛けで示し、フコースのメチル基の炭素とＧｌｃＮＡｃ
のアセトアミド基の炭素を黒で示す。ラクトテトラオシルセラミドのヘリコバク
ターピロリ結合エピトープを構成している重要な部分の識別するために検討し
たラクトトリアオシルセラミド（ケース１）およびアセトアミド部分をアミンに
還元したラクトテトラオシルセラミド（ケース３）は、ラクトテトラオシルセラ
ミドの末端二糖のＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３がエピトープを構成していること
を示した。後者の構造（ケース３）がヘリコバクターピロリに結合しないとの
知見は、さらに次の可能性を示した：無傷のアセトアミド基がヘリコバクター
ピロリとの結合に必須であるか、または還元によって生じたアミンは、ラクトテ
トラオシルセラミド内のＧａｌβ４の２位水酸基と水素結合による相互作用にも
関与しないので、ラクトテトラオシルセラミドの立体配座が変化している。この
二つの効果が組み合あわされていることも考えられる。さらに、ラクトテトラオ
シルセラミドの末端ＧａｌにＧａｌα３（ケース８）またはＦｕｃα２（ケース
４）を結合して糖鎖を延伸した物質、あるいは末端から２番目のＧｌｃＮＡｃを
Ｆｕｃα４（ケース５）で置換した物質がヘリコバクターピロリと結合しない
との知見は、末端二糖であるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３の大部分が結合を司る
付着因子との相互作用に直接関与していることを示唆している。

【０１４５】シアル酸（ガングリオシド）を包含しているグリコスフィンゴリピドに対する
ヘリコバクターピロリの結合が報告されている（文献８０）。しかしながら、
シアル酸結合能のないヘリコバクターピロリ（例えばＣＣＵＧ１７８７５株）
や結合能がシアル酸に依存するヘリコバクターピロリ（例えばＣＣＵＧ１７８
７４株）はラクトテトラオシルセラミドを認識した（図１１を参照）。さらに、
ラクトテトラオシルセラミドの末端Ｇａｌをα３結合をなすシアル酸で置換した
ものは、表IIのケース１１に示すように、ヘリコバクターピロリとの結合性を
完全に失った。したがって、ヘリコバクターピロリのラクトテトラオシルセラ
ミドへの結合能は、ガングリオシドの認識とは関係ない。

【０１４６】図１２Ｃの構造を上から見た図（ページの左側の図）に示すように、Ｌｅ^b決
定基においては、２個のフコースによって覆われているＧｌｃＮＡｃβ３残基は
接近しがたい部分であり、末端から２番目にあるＧａｌβ３もある程度は接近し
がたい部分である。さらに、ヘリコバクターピロリのＬｅ^bへの結合は、構造同
等体であるＬｅ^yによって阻害される（文献９）ので、Ｌｅ^bのＧｌｃＮＡｃβ３
残基はヘリコバクターピロリのこの化合物への結合に必須ではない。Ｌｅ^b−６
およびＬｅ^y−６の末端四糖部分の最小エネルギー構造の比較によると、両者の
差異はＧｌｃＮＡｃβ３残基が約１８０度回転していることのみであり、Ｌｅ^b
構造のＧｌｃＮＡｃβ３残基のアセタミド部分（または残基全体である可能性が
高い）がヘリコバクターピロリの結合に必須でないものの、ラクトテトラオシ
ルセラミドにおいてはこの逆であることがわかる。さらに、ラクトテトラオシル
セラミドの末端Ｇａｌβ３の環平面とＬｅ^b構造の対応する平面のなす角度は、
フコース単位が２個結合したことによる混み合いのために４０度近い値であり、
上記２種の構造がヘリコバクターピロリに対する別個の受容体として扱わなけ
ればならない理由を示している。

【０１４７】図１１は、シアル酸結合性ヘリコバクターピロリであるＣＣＵＧ１７８７４
株（図１１Ｂ）およびシアル酸結合能のないヘリコバクターピロリであるＣＣ
ＵＧ１７８７５株（図１１Ｃ）による、ラクトテトラオシルセラミドの認識を図
示している。図１１Ａのクロマトグラムは、アニスアルデヒドで染色したもので
ある。レーン１はヒト赤血球由来のグロボシド（ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇ
ａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）、レーン２はヒト胎便由来のラクトテトラオシルセ
ラミド（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）、レーン３
はＧＭ３ガングリオシド（ＮｅｕＡｃα３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）、レー
ン４はヒト顆粒球由来のガングリオシドである。上記２株のヘリコバクターピ
ロリはラクトテトラオシルセラミド（レーン２）を認識し、シアル酸結合能をも
つＣＣＵＧ１７８７４株はヒト顆粒球由来のガングリオシド(レーン４)に結合し
た。

【０１４８】分子モデル実験 − ラクトテトラオシルセラミド構造とガングリオテトラオシルセラミド構造の交叉結合性ヘリコバクターピロリがラクトテトラオシルセラミドの末端二糖に特異的に
結合することが最近報告された。このことはガングリオテトラオシルセラミド結
合性エピトープを理解するための情報を提供する。ラクトテトラオシルセラミド
とガングリオテトラオシルセラミドの２種の間に見られる主な違いは２番目と３
番目の糖残基間の結合であり、ＧａｌＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ）の４位における差
異を無視すれば、末端は同じ二糖の配列である。ガングリオトリアオシルセラミ
ドの脱Ｎ−アシル化体およびガングリオテトラオシルセラミドの脱Ｎ−アシル化
体がヘリコバクターピロリに結合しないという知見と共に、ヘリコバクターピ
ロリへの親和性が前者のグリコスフィンゴリピドにくらべて後者のグリコスフィ
ンゴリピドにおいて劇的に増加するという知見（文献１６）は、ガングリオテト
ラオシルセラミドの末端二糖もまた結合エピトープを形成していることを強く示
している。ラクトテトラオシルセラミド体およびガングリオテトラオシルセラミ
ド体のすべてについて最小エネルギー状態と考えられる配座異性体を作成し、対
にして比較すると、少なくとも２対の配座異性体においては、それぞれの末端二
糖からなる結合エピトープが同一の形で表せることが判明した（図１３）。この
知見は、同一のバクテリア付着因子が２種のグリコスフィンゴリピドの結合に関
与していることを示唆している。さらに、Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ結合の立体配座の違
いは、薄層クロマトグラムアッセイ（図１）において、ヘリコバクターピロリ
は他の脂質や胆汁酸の塩（例えばＴｗｅｅｎ２０やデオキシコレート）を使用し
た時にのみラクトテトラオシルセラミドに結合するが、ガングリオテトラオシル
セラミドとの結合は、他の脂質や胆汁酸の塩の添加による影響をわずかしか受け
ないことによって支持されている。したがって、他の脂質または胆汁酸の塩が存
在しないときには、ラクトテトラオシルセラミドのＧｌｃβ１Ｃｅｒ結合の立体
配座は図１３とは異なり、ヘリコバクターピロリと結合する結合エピトープが
不正確に提示されている可能性が高い。最近、他の脂質がグリコスフィンゴリピ
ドの立体配座に与える同様の効果に関する概説が発表された（文献７３）。ラク
トテトラオースがヘリコバクターピロリとガングリオテトラオシルセラミドと
の結合を阻害する（図５）という上記の直接的な結果は、この考え方を確立する
ものである。

【０１４９】したがって、ガングリオテトラオシルセラミドのＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃβ４
エピトープに対するヘリコバクターピロリの結合能は、実際には内部Ｇａｌの
４位置換およびＧｌｃＮＡｃβ３残基の４位のアキシアル位に関して寛容性のあ
るラクトテトラオシルセラミド特異性と考えるべきである。

【０１５０】類似体の例四糖であるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（スウェーデン国、
Tullinge、Isosep社製）およびマルトヘプタオース（アメリカ国、セントルイス
、Sigma社製）を、シアノボロヒドリドを用いて４−ヘキサデシルアニリン（Ｈ
ＤＡと略す、スウェーデン国、ストックホルム、Aldrich社製）で還元的にアミ
ノ化した（Halina Miller-Podrazaがこれから発表する）。生成物を質量分析で
同定し、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ｒｅｄ）−ＨＤＡおよ
びマルトヘプタオース（ｒｅｄ）−ＨＤＡであることを確認した（「（ｒｅｄ）
−」とは、還元的アミノ化反応によって糖類の還元末端のグルコースおよびヘキ
サデシルアニリン（ＨＤＡ）のアミノ基が形成するアミンの結合した構造を意味
する）。上記のＴＬＣオーバーレイアッセイにおいて、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ
β３Ｇａｌβ４Ｇｌｃ（ｒｅｄ）−ＨＤＡは、ヘリコバクターピロリに対して
ラクトテトラオシルセラミドグリコスフィンゴリピドと同様に結合活性を示した
が、対照として用いたマルトヘプタオース（ｒｅｄ）−ＨＤＡ複合体は、完全に
不活性であった。これは、Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３配列の合成誘導体の１例
である。三糖であるＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌがヘリコバクターピロ
リ結合性の構造であることも示しており、（還元によって還元末端のＧｌｃのピ
ラノース環構造が破壊されるので）還元末端のグルコースは結合に必要ないこと
も示している。

【０１５１】

【表１】

【０１５２】

【表２】

【０１５３】

【表３】

【０１５４】参考文献 1. Beachey, E. H. (1981) J. Infect. Dis. 143, 325-345 2. Blaser, M. J. (1990) J. Infect. Dis. 161, 626-633 3. Blaser, M. J. (1992) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 4 (suppl 1), 17-
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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、薄層クロマトグラフィで分離したグリコスフィンゴリピドに対する³⁵ Ｓで標識したヘリコバクターピロリの結合を示す。図１(Ａ)は、アニスアルデ
ヒド試薬で検出したグリコスフィンゴリピドを示す。図１(Ｂ)および図１(Ｃ)は
、放射能標識したヘリコバクターピロリ１７８７５株が結合した後にオートラ
ジオグラフィで検出したグリコスフィンゴリピドを示す。レーン１はヒトの血液
型がＡの赤血球由来の非酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン２はイヌ小
腸由来のグリコスフィンゴリピドであり、レーン３はモルモット小腸由来の非酸
性グリコスフィンゴリピドであり、レーン４はマウス糞便由来の非酸性グリコス
フィンゴリピドであり、レーン５は、ブラックアンドホワイトラット（black-an
d-white rat）の小腸上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピドであり、レ
ーン６はヒト胎便由来の非酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン７はヒト
の血液型がＯの赤血球由来の酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン８はウ
サギ胸腺由来の酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン９は仔牛脳由来のガ
ングリオシドであり、レーン１０はヒト副腎腫由来の酸性グリコスフィンゴリピ
ドである。図１Ａの左に表示した数字は各バンドに含まれる炭化水素残基のナン
バーである。

【図２】図２は、ヒト胎便から単離したヘリコバクターピロリ結合性グリコスフィン
ゴリピドのパーメチル化体の質量スペクトルを示す。スペクトルの上には、スフ
ィンゴシンと２４：０のヒドロキシ脂肪酸からなるセラミド種の単純化した式を
示す。

【図３】図３は、ヒト胎便由来のグリコスフィンゴリピドのプロトンＮＭＲスペクトル
のアノメリック領域を示す。プローブ温度３０℃で、４０００回スキャンした。
５．０４ｐｐｍの大きな分散波形様のシグナルは測定装置のノイズであり、また
４．９３ｐｐｍに未同定の不純物が検出された。

【図４】図４は、薄層プレート上で分離した純粋なグリコスフィンゴリピドに対する
ヘリコバクターピロリの結合を示す。レーン１はラクトトリアオシルセラミド
であり、レーン２はラクトテトラオシルセラミドであり、レーン３はＨ５１型
グリコスフィンゴリピドであり、レーン４はＬｅ^a−５グリコスフィンゴリピド
であり、レーン５はＬｅ^b−６グリコスフィンゴリピドであり、レーン６はＸ−
５グリコスフィンゴリピドであり、レーン７はＹ−６グリコスフィンゴリピドで
あり、レーン８はＢ６１型グリコスフィンゴリピドである。図４Ａは、アニス
アルデヒドによる化学検出の結果であり、図４Ｂは、³⁵Ｓで標識したヘリコバク
ターピロリの結合よって得たオートラジオグラムである。

【図５】図５は、オリゴ糖類のラクトースおよびラクトテトラオースとヘリコバクター
ピロリをプレインキュベートすることによって得られる効果を示す。図５Ａは
、アニスアルデヒドで染色した薄層クロマトグラムであり、図５Ｂは、ラクトー
スとインキュベートしたヘリコバクターピロリの結合を示し、図５Ｃは、ラク
トテトラオースとインキュベートしたヘリコバクターピロリの結合を示す。レ
ーン１はガングリオテトラオシルセラミドであり、レーン２はラクトテトラオシ
ルセラミドであり、レーン３はネオラクトテトラオシルセラミドである。

【図６】図６は、分離したグリコテトラオシルセラミドをアニスアルデヒドで検出した
薄層クロマトグラム（図６Ａ）および³⁵Ｓで標識したヘリコバクターピロリ０
０２株との結合により得たオートラジオグラム（図６Ｂ）を示す。レーン１はヒ
ト胎便由来のラクトテトラオシルセラミドであり、レーン２はヒト胎便由来の非
酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン３は血液型がＡ（Ｒｈ＋）ｐの個体
のヒトの胃に由来する非酸性グリコスフィンゴリピドであり、レーン４は、血液
型がＡ（Ｒｈ＋）Ｐの個体のヒト胃に由来する非酸性グリコスフィンゴリピドで
ある。各バンドに含まれる糖質残基のナンバーを左側に表示する。

【図７】図７は、ヒト胃上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピドに対するヘリコ
バクターピロリの結合を示す。レーン１は対照としたイヌ小腸由来の非酸性グ
リコスフィンゴリピドであり、レーン２は対照としたマウス糞便由来の非酸性グ
リコスフィンゴリピドであり、レーン３は対照としたヒト胎便由来の非酸性グリ
コスフィンゴリピドであり、レーン４〜８は、５個体（表IIIのケース１〜５）
のヒト胃上皮細胞由来の非酸性グリコスフィンゴリピド（８０μｇ／レーン）で
ある。図７Ａは、アニスアルデヒドによる化学検出を示し、図７Ｂは、³⁵Ｓで標
識したヘリコバクターピロリによる結合で得たオートラジオグラムである。各
バンドに含まれる糖質残基のナンバーを左側に表示する。

【図８】図８は、表IIIのケース４および５の胃上皮細胞由来のテトラグリコシルセラ
ミド含有画分（図８Ａ）並びに、画分４−ＩＩ（図８Ｂ）および画分５−ＩＩ（
図８Ｃ）の５００ＭＨｚプロトンＮＭＲスペクトルのアノメリック領域の薄層ク
ロマトグラムである。レーン１はケース４の胃上皮由来の全非酸性グリコスフィ
ンゴリピドであり、レーン２はケース４の画分４−Ｉであり、レーン３はケース
４の画分４−ＩＩであり、レーン４はケース５の胃上皮由来の全非酸性グリコス
フィンゴリピドであり、レーン５はケース５の画分５−Ｉであり、レーン６はケ
ース５の画分５−ＩＩである。各バンドに含まれる糖質残基のナンバーを左側に
表示する。

【図９】図９は、セラミドグリカナーゼを用いて遊離したパーメチル化オリゴ糖の再構
成イオンクロマトグラムを示す。ランＡは、対照としたグロボシド、ラクトテト
ラオシルセラミドおよびラクトネオテトラオシルセラミドの混合物であり、ラン
Ｂは表IIIのケース４の胃上皮由来のテトラグリコシルセラミドであり、ランＣ
は表IIIのケース５の胃上皮由来のテトラグリコシルセラミドである。対照とし
て混合物（ランＡ）のオリゴ糖には印をつけた。

【図１０】図１０は、高温ガスクロマトグラフィ−電子イオン化質量分析によって得られ
た質量スペクトルであり、対照としたグリコスフィンゴリピドをセラミドグリカ
ナーゼで処理して遊離したパーメチル化オリゴ糖（ＩおよびＩＩ）、表IIIのケ
ース４の胃上皮由来のテトラグリコシルセラミド（ＩＩＩ）、および表IIIのケ
ース５の胃上皮由来のテトラグリコシルセラミド画分（ＩＶ）のそれぞれのスペ
クトルを示す。

【図１１】図１１は、シアル酸結合性ヘリコバクターピロリＣＣＵＦ１７８７４株（図
１１Ｂ）およびシアル酸結合能を有していないＣＣＵＧ１７８７５株（図１１Ｃ
）の両者によるラクトテトラオシルセラミドの認識を示す。

【図１２】図１２は、ヘリコバクターピロリ結合性ラクトテトラオシルセラミド（図１
２Ａ）、および非結合性Ｌｅ^a−５グリコスフィンゴリピド（図１２Ｂ）、Ｌｅ^b −６グリコスフィンゴリピド（図１２Ｃ）および脱フコース化Ｂ６１型グリコ
スフィンゴリピド（図１２Ｄ）の最小エネルギー配座異性体を示す。

【図１３】図１３は、ラクトテトラオシルセラミドおよびガングリオテトラオシルセラミ
ドの最小エネルギー配座異性体の分子モデルであり、末端二糖はＧｌｃβ１Ｃｅ
ｒ二面角だけが異なっているほかは、同一であることを示している。ラクトテト
ラオシルセラミドおよびガングリオテトラオシルセラミドのＧｌｃβ１Ｃｅｒ結
合の二面角（Φ、ΨおよびΘ）の異なる、考えられるすべての低エネルギー立体
配座の異性体を作成し、次いで各配座異性体を対にして比較した。その結果、２
種のグリコスフィンゴリピドにおいて、その末端二糖の立体配座が同じである２
対の配座異性体を見出した。第１の対においては、ラクトテトラオシルセラミド
（図１３Ａ）のＧｌｃβ１Ｃｅｒ二面角は、５１度、−１７９度および６７度で
あり、ガングリオテトラオシルセラミド（図１３Ｂ）の同じ角は、５１度、１８
０度および１７７度である。図１３Ａにおける立体配座は、Ｇｌｃの２位水酸基
と長鎖塩基の３位酸素原子の間の分子内水素結合により安定しているが、図１３
Ｂにおける立体配座は、延伸したものであると考えられる。第２の対においては
、ラクトテトラオシルセラミド（図１３Ｃ）のＧｌｃβ１Ｃｅｒ二面角は、１３
度、−９０度および−５９度であり、ガングリオテトラオシルセラミド（図１３
Ｄ）においては、５３度、−１７３度および−６４度である。ラクトテトラオシ
ルセラミドの場合には、Ｇｌｃの２位水酸基は脂肪酸の２位水酸基および長鎖塩
基のＮＨ基と水素結合を形成しているが、ガングリオテトラオシルセラミドは、
Ｇａｌβ１Ｃｅｒの結晶構造と同じＧｌｃβ１Ｃｅｒの立体配座をとっている。
ＧｌｃＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃのアセタミド基中のメチル基の炭素を黒で示した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年３月１４日（２００２．３．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子または水酸基であり、Ｒ₂は水素原子または水酸基であり、但し
、Ｒ₂が水酸基の場合にはＲ₁は水素原子であり、Ｒ₂が水素原子の場合にはＲ₁は
水酸基であり、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、但し、Ｒ₂が水酸基の場合にはＸは
ラクトース残基またはラクトシル基ではない、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物を包含してなる、ヘリコバクターピロリをe x vivoで結合するための結合剤。

【化２】（式中、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物を包含してなる、ヘリコバクターピロリをe x vivoで結合するための結合剤。

【化３】（式中、Ｘは、ラクトース残基またはラクトシル基以外の単糖残基であるか、あるいは
オリゴ糖残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物を包含してなる、ヘリコバクターピロリをe x vivoで結合するための結合剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 1/04 1/04 1/16 1/16 9/00 9/00 31/04 31/04 35/00 35/00 43/00 43/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者テネベリ，スサンスウェーデン国、エス−430 63 ヒンドス、アンデビケンペーエル 1639 (72)発明者オングストロム，ヨーナススウェーデン国、エス−416 57 イェーテボリ、デイェーエシュガタン 12 Ｆターム(参考） 4B018 LB07 LB08 MD31 ME09 ME11 4C084 AA17 BA44 CA62 DA41 NA14 ZA362 ZA662 ZA752 ZB262 ZB352 4C085 AA03 BA20 CC33 EE01 4C086 AA02 EA05 EA20 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA66 ZA68 ZA75 ZB26 ZB35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（１）：【化１】（式中、Ｒ₁は水素原子または水酸基であり、Ｒ₂は水素原子または水酸基であり、但し
、Ｒ₂が水酸基の場合にはＲ₁は水素原子であり、Ｒ₂が水素原子の場合にはＲ₁は
水酸基であり、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物、あるいはヘリコバクターピロリに対して
該化合物と同等またはそれよりも優れた結合能を有する該化合物の類似体または
誘導体を包含してなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項２】下記式（２）：【化２】（式中、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物、あるいはヘリコバクターピロリに対して
該化合物と同等またはそれよりも優れた結合能を有する該化合物の類似体または
誘導体を包含してなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項３】下記式（３）：【化３】（式中、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基であり、Ｙはスペーサーまたは末端結合基であるか、あるいは結合であり、Ｚはオリゴ価または多価の担体であるか、あるいは水素原子であり、ｎは０または１であり、ｍは１以上の整数である。）で表される少なくとも１種の化合物、あるいはヘリコバクターピロリに対して
該化合物と同等またはそれよりも優れた結合能を有する該化合物の類似体または
誘導体を包含してなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項４】Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導体
であってＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと同等またはそれよりも優れた結合能を有する
化合物を包含してなるヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項５】該Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導
体が、該ヘリコバクターピロリ結合性物質の非還元末端に存在することを特徴
とする、請求項４に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項６】Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導体
であってＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃと同等またはそれよりも優れた結合能を有する
化合物から構成されてなる請求項４に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質
。
【請求項７】Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導体
であってＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃと同等またはそれよりも優れた結合能を有する
化合物を包含してなるヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項８】該Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導
体が、該ヘリコバクターピロリ結合性物質の非還元末端に存在することを特徴
とする、請求項７に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項９】Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃ、あるいはその類似体または誘導体
であってＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃと同等またはそれよりも優れた結合能を有する
化合物から構成されてなる請求項７に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質
。
【請求項１０】ラクトテトラオースを包含してなる、請求項４または５に
記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１１】ラクトテトラオースから構成されてなる、請求項４または
５に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１２】ラクトテトラオシルセラミド（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ
３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）を包含してなる、請求項４または５に記載のヘ
リコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１３】ラクトテトラオシルセラミド（Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ
３Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）から構成されてなる、請求項４または５に記載
のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１４】ガングリオテトラオシルセラミド（Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡ
ｃβ４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）を包含してなる、請求項７または８に記載
のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１５】請求項１〜１４に記載の物質からなる群より選ばれる１種
以上の物質およびそれを担持している担体から構成されてなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１６】請求項１〜１５に記載の物質からなる群より選ばれる１種
以上の物質を包含してなるミセルから構成されてなる、ヘリコバクターピロリ
結合性物質。
【請求項１７】請求項１〜１６に記載の物質からなる群より選ばれる１種
以上の物質が多糖に結合してなる、ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１８】該多糖がポリラクトサミンまたはその結合体であることを
特徴とする、請求項１７に記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項１９】糖脂質であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれ
かに記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項２０】糖タンパク質またはネオグリコプロテインであることを特
徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のヘリコバクターピロリ結合性物
質。
【請求項２１】少なくとも２本のオリゴ糖鎖を包含してなるオリゴマー分
子であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項２２】少なくとも３本のオリゴ糖鎖を包含してなるオリゴマー分
子であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項２３】請求項１〜２２に記載の物質からなる群より選ばれる１種
以上の物質を、ヘリコバクターピロリに対する抗生物質に共有結合してなる、
ヘリコバクターピロリ結合性物質。
【請求項２４】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を包含してなる医
薬組成物。
【請求項２５】ヘリコバクターピロリの存在によって生じる病態の治療
用、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】患者の消化管にヘリコバクターピロリが存在することに
よって生じる病態の治療用、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】慢性表在性胃炎の治療用、請求項２４〜２６のいずれかに
記載の医薬組成物。
【請求項２８】十二指腸潰瘍の治療用、請求項２４〜２６のいずれかに記
載の医薬組成物。
【請求項２９】胃潰瘍の治療用、請求項２４〜２６のいずれかに記載の医
薬組成物。
【請求項３０】胃腺癌の治療用、請求項２４〜２６のいずれかに記載の医
薬組成物。
【請求項３１】ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ腫の治療用、請求
項２４〜２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３２】肝臓病の治療用、請求項２４または２５に記載の医薬組成
物。
【請求項３３】心臓病の治療用、請求項２４または２５に記載の医薬組成
物。
【請求項３４】乳児突然死症候群の治療用、請求項２４〜２６のいずれか
に記載の医薬組成物。
【請求項３５】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を、ヘリコバクタ
ーピロリの存在によって生じる病態の治療用医薬組成物の製造のために用いる
方法。
【請求項３６】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を、患者の消化管
にヘリコバクターピロリが存在することによって生じる病態の治療用医薬組成
物の製造のために用いる方法。
【請求項３７】該医薬組成物が、慢性表在性胃炎の治療用であることを特
徴とする、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】該医薬組成物が、十二指腸潰瘍の治療用であることを特徴
とする、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】該医薬組成物が、胃潰瘍の治療用であることを特徴とする
、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４０】該医薬組成物が、胃腺癌の治療用であることを特徴とする
、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４１】該医薬組成物が、ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ
腫の治療用であることを特徴とする、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４２】該医薬組成物が、肝臓病の治療用であることを特徴とする
、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】該医薬組成物が、心臓病の治療用であることを特徴とする
、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】該医薬組成物が、乳児突然死症候群の治療用であることを
特徴とする、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４５】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を含んでなる、ヘ
リコバクターピロリの結合を阻害するための阻害剤。
【請求項４６】非医療目的でヘリコバクターピロリの結合を阻害するこ
とを特徴とする、請求項４５に記載の阻害剤。
【請求項４７】アッセイ系で使用することを特徴とする、請求項４６に記
載の阻害剤。
【請求項４８】該アッセイ系をヘリコバクターピロリに結合する他の物
質類を同定する際に用いる、請求項４７に記載の阻害剤。
【請求項４９】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を含んでなる、ヘリ
コバクターピロリに結合する他の物質類を同定する際の指標剤。
【請求項５０】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を包含してなる食
品。
【請求項５１】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を包含してなる栄
養添加物。
【請求項５２】該物質がＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃで
あることを特徴とする、請求項５０に記載の食品または請求項５１に記載の栄養
添加物。
【請求項５３】乳児用の食品であることを特徴とする、請求項５２に記載
の食品。
【請求項５４】０．１ｇ〜０．５ｇ／リットルの濃度でＧａｌβ３Ｇｌｃ
ＮＡｃβ３Ｇａｌβ４Ｇｌｃを使用できるように、該Ｇａｌβ３ＧｌｃＮＡｃβ
３Ｇａｌβ４Ｇｌｃを包含することを特徴とする、請求項５３に記載の食品。
【請求項５５】該濃度が、０．０５ｇ〜５ｇ／リットルであることを特徴
とする、請求項５４に記載の食品。
【請求項５６】請求項５０〜５５のいずれかに記載の食品または栄養添加
物を含んでなる、ヘリコバクターピロリの結合を阻害するための阻害剤。
【請求項５７】患者にヘリコバクターピロリが存在することによって生
じる病態の治療方法であって、薬学的に有効な量の請求項１〜２３のいずれかに
記載の物質を該患者に投与することを包含してなる治療方法。
【請求項５８】該患者にヘリコバクターピロリが存在することによって
生じる病態の治療方法であって、請求項５０〜５５のいずれかに記載の食品を患
者に与えることを特徴とする治療方法。
【請求項５９】該病態が、患者の消化管にヘリコバクターピロリが存在
することによって生じる病態であることを特徴とする、請求項５７または５８に
記載の方法。
【請求項６０】慢性表在性胃炎を治療するための、請求項５７または５８
に記載の方法。
【請求項６１】十二指腸潰瘍を治療するための、請求項５７または５８に
記載の方法。
【請求項６２】胃潰瘍を治療するための、請求項５７または５８に記載の
方法。
【請求項６３】胃腺癌を治療するための、請求項５７または５８に記載の
方法。
【請求項６４】ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ腫を治療するため
の、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６５】肝臓病を治療するための、請求項５７または５８に記載の
方法。
【請求項６６】心臓病を治療するための、請求項５７または５８に記載の
方法。
【請求項６７】乳児突然死症候群を治療するための、請求項５７または５
８に記載の方法。
【請求項６８】請求項２、４〜６と１０〜１３のいずれかに記載の物質を
含んでなる、バクテリア性付着因子の同定剤。
【請求項６９】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質または請求項６８
に記載の同定剤によって同定したバクテリア性付着因子を、ヘリコバクターピ
ロリに対するワクチンの製造に用いる方法。
【請求項７０】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質または請求項６８
に記載の同定剤によって同定したバクテリア性付着因子を用いて製造される、ヘ
リコバクターピロリによる感染を予防するためのワクチン。
【請求項７１】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を含んでなる、ヘ
リコバクターピロリによる感染によって生じる病態の診断剤。
【請求項７２】請求項１〜２３のいずれかに記載の物質を含んでなる、ヘ
リコバクターピロリの型の同定剤。