JP2003514028A

JP2003514028A - ワクチンとしての抗体の新たな使用

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Publication number: JP2003514028A
Application number: JP2001537979A
Authority: JP
Inventors: ハンスロイブナー; ヘルムートエッケルト; ゴットフリートハイムラー
Original assignee: イジェネオンクレブス−イミュンセラピーフォーシュングス−アンドエントウィックラングス−アーゲー
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2003-04-15
Also published as: NZ518669A; ATA192799A; SK6542002A3; WO2001035989A2; ES2218272T3; NO20022333D0; HUP0204216A2; AT409086B; CN1390138A; WO2001035989A3; CA2391927A1; NO20022333L; AU2357201A; EE200200252A; BR0015597A; PL356770A1; TR200401267T4; IS6381A; DE50006526D1; DK1229936T3

Abstract

(57)【要約】癌疾患に対する個別の自己由来の予防的または治療的なワクチン接種のための組成物を産生するための、腫瘍関連抗原に対して向けられる抗体に結合し、かつ特異的なリガンド上での免疫親和性精製によって抗体を含む個体の体液から回収される、抗体の使用を記載する。免疫親和性精製のリガンドは、腫瘍関連抗原に対して向けられる抗体またはそれらの誘導体である。さらに、本発明は、免疫親和性精製によって得られた抗体、またはそれらによりインビトロでパルスされた樹状細胞を含む、薬学的組成物に関連する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、腫瘍関連抗原に対して向けられ、抗体を含む個体の体液から特異的
なリガンド上での免疫親和性精製によって回収される抗体に結合する抗体の、癌
疾患に対する個別の自己由来の予防的または治療的なワクチン接種のための組成
物を産生するための使用を記載する。免疫親和性精製のリガンドは、1つまたは
複数の腫瘍関連抗原に対して向けられる抗体またはそれらの誘導体である。さら
に、本発明は、免疫親和性精製によって得られる抗体、またはそれらによってイ
ンビトロでパルスされた（pulsed）樹状細胞を含む、薬学的組成物に関連する。

【０００２】ヒトの適応免疫系は2つの必須構成要素、すなわち、体液性免疫および細胞性
免疫からなる。適応免疫応答は、Bリンパ球およびTリンパ球のクローン選択に基
づき、原則として、任意の抗原を認識させ、免疫学的記憶を形成させる。ワクチ
ン接種の場合、一般に適応免疫系のこれらの特徴が利用される。

【０００３】全てのB細胞は特定の結合特異性を有する抗体を産生する。この抗体はまた、
それが産生されるB細胞の膜において、特異的受容体としても存在する。外部抗
原として認識される抗原に対する体液性免疫応答は、各々の抗原のエピトープに
結合できる抗体を産生するB細胞の選択的な活性化に基づく。B細胞の分化の過程
においては、DNA 再配列が抗体の多様性に関して非常に重要である。

【０００４】ヒト血清には、著しく多様化した特異性、アイソタイプおよびサブクラスをも
つ多数の抗体が存在する。血清中の全ての免疫グロブリンの総濃度は、15 mg/ml
〜20 mg/mlである；すなわち、約100 gの著しく多様化した特異性を有する免疫
グロブリンが血液中を永続的に循環している。異なる特異性をもつ全ての抗体の
正確な量を示すのは不可能である。理論上可能なレパートリーは約10¹¹である。
一般に、ある抗体は、親和性および結合力が異なるとはいえ、互いに類似した異
なる抗原に結合できる。

【０００５】免疫系は、これらの異なる特異性の分布および重要性に関し、内因性の制御機
構によって恒常性を維持しなければならない。必須の機構は、ニールス・ジャー
ン（Niels Jerne）によって約25年前に仮定された「イディオタイプ・ネットワー
ク」である（Jerne, Ann. Immunol. 125C(1974), 373〜389）：その結合特異性を
決定する抗体の全てのイディオタイプに対して向けられ、かつしたがって抗原認
識の意義の範囲内で第一抗体のイディオタイプに結合する、抗イディオタイプ抗
体が存在する。ジャーン（Jerne）は、リンパ球上のイディオタイプ特異的な受
容体間の相互作用が免疫系の調節を担うと提唱した。免疫応答の過程において、
免疫応答によって最初に誘導される抗体に対して向けられる抗イディオタイプ抗
体も形成されることが示されているため、これらの相互作用が実際に行われてい
るのは明らかである。全ての抗体に対する抗イディオタイプ抗体が存在するため
、リンパ球は抗体のイディオタイプに関して大抵寛容でない。

【０００６】免疫学的意義の範囲内で、いくつかの抗イディオタイプ抗体は1つの抗原の「内
部像（internal image）」を提示し得る。ゆえに、免疫化によって誘導される抗
体は名目上の抗原に部分的に結合できるため、そのような抗体は名目上の抗原の
代理として免疫化に使用されうる。非常に長い間、特に癌の免疫療法において、
このアプローチは使用されてきた。10年以上の間、モノクローナル抗イディオタ
イプ抗体を用いたワクチン接種による腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導する
ための、多くの前臨床計画および臨床計画が存在する（概要については以下を参
照：Bhattacharya-Chatterjee, Foon;「癌の抗イディオタイプ抗体ワクチン療法
（Anti-idiotype antibody vaccine therapies of cancer）」; Cancer Treat.
Res. 94(1998), 51〜68）。これらのモノクローナル抗イディオタイプ抗体のほ
とんどはマウス由来のものである。しかし、ヒトモノクローナル抗イディオタイ
プ抗体を用いた試験も存在する（例えば、Fagerbergら、PNAS 92(1995), 4773〜
4777）。

【０００７】 B細胞リンパ腫を患う患者の治療的な免疫化の試みは、特別な場合である。そ
のような疾患の場合、そのイディオタイプの特性をもつ特異的な免疫グロブリン
を産生し、かつまた該免疫グロブリンを細胞膜における受容体として有する、特
定のB細胞クローンが変性している。この抗体はモノクローナル抗体であり、か
つ個々のB細胞リンパ腫に関して腫瘍特異的な抗原と考えられる。細胞培養にお
いて産生され、適切な免疫原の形態でワクチンとして投与された場合、そのよう
な患者特異的な自己由来の抗体は、この抗体のイディオタイプに対する免疫応答
を誘導でき、該免疫応答はB細胞リンパ腫に影響を及ぼし得ることが示されてい
る（Reichardtら、Blood. 93(1999), 2411〜2419）。

【０００８】要約すると、以下のことが言える：腫瘍関連抗原を模倣するヒトモノクローナル抗イディオタイプ抗体は、ワクチ
ンとして、癌患者において免疫応答を誘導することができ、該免疫応答はことに
よると該腫瘍関連抗原に対して向けられる。ハイブリドーマ技術またはヒトB細
胞の不死化（immortalisation）により、そのようなヒトモノクローナル抗体は
、受動免疫療法のために（主にマウスの）抗腫瘍抗体を投与され、それらに対す
る免疫応答を確立した患者から得られた。その他の患者は、この方法によって産
生されたヒトモノクローナル抗イディオタイプ抗体により免疫化された。 B細胞リンパ腫によって産生され、ゆえに限定されたイディオタイプをもつヒ
ト抗体は、個別のワクチン接種として、患者特異的な方法で免疫応答を誘導する
ことができ、該免疫応答はことによるとB細胞リンパ腫に対して向けられる。そ
のような患者特異的な抗体は、ハイブリドーマ技術またはB細胞リンパ腫細胞の
不死化により、個々に得られなければならない。該抗体の使用は通常B細胞リン
パ腫の治療に限られる。

【０００９】ゆえに、ある種に由来するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を、その抗体
が由来する同種の個体を免疫化するためにも使用できることは公知であるが、細
胞を操作し培養することは任意の場合に必要である。したがって、このアプロー
チは時間がかかり、モノクローナル抗体のみに限定される。

【００１０】したがって、癌に対する防御と同様に、有効で広く適用可能な、かつ選択的に
腫瘍の個々の治療を可能にする、手段および方法を提供する必要が、依然として
あることは明らかである。

【００１１】ゆえに、本発明の基礎となる技術的課題は、癌の治療および癌に対する防御の
ために、異なる種類の腫瘍の基質（framework）内で個々に使用できる、効率の
よい手段および方法を提供することである。

【００１２】この技術的課題は、請求項において特徴付けられる態様を提供することにより
解決された。

【００１３】このように、本発明は同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗
原またはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとし
て使用され、免疫親和性精製によって抗体を含む体液から抗体が回収される点で
特徴付けられる、癌に対する治療的または予防的なワクチン接種のためのワクチ
ンとして適切な組成物を産生するための、抗体の使用に関連する。

【００１４】最先端の技術において説明された方法と比較して、本発明に従った使用は、本
発明の概念が広く有効に適用され、モノクローナル抗体に限定されないことを可
能にする、抗イディオタイプ抗体を産生するために細胞培養を使用しないという
、利点を有する。

【００１５】例えば、あらゆるヒトの血中に全体として多量に存在する抗体のプールは、可
能なあらゆる結合特異性をもつ抗体を含む。このようにこの抗体プールは、原則
として、例えば任意の腫瘍関連抗原（TAA）に対して向けられる（すでに公知の
または新規の）マウスモノクローナル抗体（Ab1）のイディオタイプに対する抗
体（Ab2）も含む。免疫学的ネットワークに従い、あらゆるヒトにおける同じ抗
体プールはまた、自己由来のAb2のイディオタイプに対して向けられる抗体、い
わゆるAb3抗体も一定量含む。ネットワーク理論によると、Ab3は外部のAb1によ
って限定される腫瘍関連抗原に結合できる。Ab2/Ab3の平衡をAb3寄りに移行する
と、免疫系が該抗原をもつ腫瘍細胞をよりよく認識しかつ攻撃できるという結果
になる。

【００１６】ここで、そのような免疫学的平衡の移行を、個々の自己由来のAb2分画を免疫
原ワクチンの形態で投与することにより達成できることが、本発明の基礎である
。そのような自己由来のワクチン接種により、Ab3を産生するB細胞は選択的に刺
激されることが可能である。そのようなワクチン接種のためには、適切なワクチ
ンアジュバントを使用する公知の方法に従って製剤化できる、少量のAb2分画の
みが必要である。

【００１７】本発明に従って使用される抗体はゆえに、抗体を含む体液由来のAb2抗体であ
り、かつ免疫親和性精製に使用される抗TAA抗体に対して向けられる、抗体であ
る。抗体を含む体液は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ、悪性滲出液等であ
る。体液は好ましくは血清である。体液は抗体を含む体液をもつ任意の動物由来
でありうる。好ましくは、これらは脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物で
あり、かつ最も好ましくは、体液はヒト起源のものである。

【００１８】自己由来の抗体を用いたワクチン接種により誘導される免疫応答は、これらの
抗体の結合領域、すなわちそれらのイディオタイプによって決定されるため、原
則としては、ワクチン接種を成功させるために、これらの抗体の断片または誘導
体がなおもそれぞれの元の抗体のイディオタイプを含んでいる限り、完全な抗体
の分画の代わりにこれらの断片または誘導体も使用できる。このように、「抗体」
という用語は、同じ結合特異性をもつ抗体の断片または誘導体も含む。限定はし
ないが例として、以下のものが挙げられる：例えば本質的に公知の生化学的方法
（例えば酵素による切断）に従って産生されうる、F(ab)'₂断片およびF(ab)'断
片。「誘導体」という用語は、例えばリポソームへ取りこむために親油性（lipoph
ilia）を増加させるため、遊離アミノ基において脂肪酸によってアミド化された
抗体のような、本質的に公知の化学的または生化学的方法に従って産生されうる
抗体誘導体を含む。特に、「誘導体」という用語は、例えば破傷風トキソイド、シ
ュードモナス外毒素、リピドAの誘導体、GM-CSF、IL-2のような免疫応答を増強
できる分子と抗体または抗体断片を化学的に結合することによって、または例え
ばGM-CSF、IL-2、IL-12、C3d等のような免疫応答を増強するポリペプチドと抗体
または抗体断片を化学的に結合することによって、産生されうる産物も含む。免
疫親和性精製による、抗体を含む体液からの、例えばヒト血清からの、抗体の精
製は、当業者に公知の方法を用いて実施できる（Clin.Chem. 45(1999), 593；J.
Chem. Technol. Biotechnol. 48(1990), 105）。TAA特異的な抗体または抗体混
合物を固相上に固定する。固相は、結合特性を本質的に失わずに抗体が結合でき
る、膜、ゲル、または同様の材料でありうる。Ab2はバッチにおいてまたは流動
法（flow-through method）において固定化抗体に結合できる。免疫親和性精製
は精製装置において自動的に、または手動法によって実施されうる。しかし、本
方法は固定化抗体を含む単純な装置によって、手動で、自動で、または半自動で
実施されうるとも考えられる。実施例1において記載される、免疫親和性クロマ
トグラフィーにおいては、通常使用される血清1 ml当たり3μg〜10μgの免疫グ
ロブリンが得られる。一般に、このようにして得られる抗体分画は、IgMおよびI
gGの両方からなる。したがって血液採取の許容できる量から、例えば血清約25 m
lをもたらす血液50 mlから、約0.08 mg〜0.25 mgのAb2を回収することが可能で
ある。この量は基本的にワクチン接種には十分である。より多量のAb2を回収す
ることが望まれる場合は、本質的に公知の血漿搬出のような技術を免疫親和性精
製と組合わせて使用できる。異なる特異性をもついくつかの抗体を使用する場合
は、これらの固定化抗体を同時に使用できる、または、別々の免疫親和性精製を
並行してもしくは連続して実施できる。

【００１９】本出願の枠組みにおいて、「腫瘍関連抗原」という用語は、好ましくは腫瘍細胞
によって提示される構造体であって、かつしたがってそれを非悪性の組織から区
別することを可能にする構造体である。好ましくは、そのような腫瘍関連抗原は
腫瘍細胞の細胞膜上または細胞膜内に局在する。しかし、そのような抗原が非変
性細胞上にも存在することは除外できない。腫瘍関連抗原は例えば、ポリペプチ
ド、特にグリコシル化タンパク質、またはポリペプチドのグリコシル化型であり
うる。腫瘍関連抗原を提示し得るその他の構造体は、例えば糖脂質である。これ
らは例えば、GM2などのようなガングリオシドを含む。さらに、腫瘍関連抗原は
癌細胞に特徴的でありうる、細胞膜の脂質の組成における変化により提示される
ことができる。

【００２０】異なる腫瘍関連抗原に対する著しく多様化した抗体は長年公知であるか、また
は本質的に公知の方法（例えばハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術
）を用いて産生できる。

【００２１】好ましい態様においては、免疫親和性精製によって得られる抗体は、自己由来
の個別のワクチンという意義において、その体液からそれらの抗体が回収された
個体に投与される。

【００２２】ゆえに、ある個体の体液、例えば血液からのAb2分画の回収が、その体液中に
存在する抗体の免疫親和性精製によって達成できることが、本発明のさらなる不
可欠な構成要素である。腫瘍関連抗原に対する1つ（または複数）の抗体が、リ
ガンドとして使用される。

【００２３】この文脈においては、個体は任意の動物、好ましくは脊椎動物、より好ましく
は哺乳動物および最も好ましくはヒトでありうる。

【００２４】別の好ましい態様においては、様々な腫瘍関連抗原に対して、および／または
、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の様々なエピトープに対して向けられるいくつ
かの抗体を、免疫親和性精製のために同時に使用できる。異なる腫瘍関連抗原に
対して、または異なるエピトープに対して向けられるいくつかの抗体、特にモノ
クローナル抗体が、体液中に存在するAb2の免疫親和性精製のために同時に使用
される場合は、選択された一連の腫瘍関連抗原に基づいた、異なるAb2からなる
分画が得られ、かつそれをワクチンとして同時に使用することにより、これら全
ての腫瘍関連抗原またはエピトープに対する免疫応答が誘発される。ゆえに、免
疫学的平衡は一連の（しばしば共発現された）腫瘍関連抗原またはエピトープの
認識に向かって、ある段階で移行される。腫瘍細胞がいくつかの抗原の発現を同
時に停止できる可能性は極端に低いため、そのような手順により、誘導される免
疫応答の有効性は自然と増加し、腫瘍の抗原陰性の変異体の形成（「腫瘍の回避
（escape）」）は本質的に減少する。

【００２５】原則として、前述の方法は、あらゆる公知のまたは新規に発見された腫瘍関連
抗原に基づくことができる。唯一の前提条件は、そのような抗原に対して向けら
れる1つまたは複数の抗体、好ましくはモノクローナル抗体が、免疫親和性精製
のリガンドとして利用可能なことである。原則としては、あらゆる可能な種類の
抗体、特にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が適しており、モノク
ローナル抗体がより好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の
混合物を使用することもまた可能である。さらに、例えばマウスモノクローナル
抗体およびその他の種（例えばラット）由来の抗体の両方を使用できる。その上
、腫瘍関連抗原に対するマウス-ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒトモノク
ローナル抗体を使用できる。免疫親和性精製に使用される抗体の特性は、それら
の結合領域、すなわちそれらのイディオタイプによって決定される。このように
、原則として、これらの抗体の断片もまた、これらの断片がそれぞれの元の抗体
のイディオタイプをなおも保持している限り、完全な抗体の代わりに、首尾よく
免疫親和性精製を行うために使用できる。限定はしないが、例として以下が含ま
れる：本質的に公知の生化学的方法（酵素による切断）に従って、または本質的
に公知の分子生物学的方法に従って、産生できるF(ab)'₂断片、F(ab)'断片およ
びFv断片。実際には各種類の抗体または断片の混合物を使用することも可能であ
る。

【００２６】腫瘍関連抗原の選択、およびゆえに、これらの抗原に対して向けられる免疫親
和性精製に使用される抗体の選択は、それに対してワクチン接種が実施される腫
瘍の指標の、抗原特性に依存する。

【００２７】既に公知であり、かつ様々な腫瘍、特に上皮腫瘍上にて頻繁に発現される、以
下の腫瘍関連抗原を例示的に挙げる。しかし、本明細書において記載される自己
由来のワクチン接種法の使用は、これらの抗原に全く限定されない：上皮細胞接着分子（Ep-CAM）癌胎児抗原（CEA）ルイスY炭水化物シアリルTn炭水化物グロボH炭水化物 GD2/GD3/GM2のようなガングリオシド前立腺特異抗原（PSA） CA125 CA19-9 CA15-3 TAG-72 EGF受容体ニューロン細胞接着分子（N-CAM） Her2/Neu受容体 D97 CD20 CD21

【００２８】挙げられたあらゆる（主にはいくつかの）抗原に対しては、Ab2を回収するた
めの、前述の免疫親和性精製のためのリガンドとして使用されるのに原則として
適しているモノクローナル抗体について、特に説明されている。

【００２９】腫瘍関連抗原については、例えばデヴィータ（DeVita）ら（編、「癌の生物学
的治療（Biological Therapy of Cancer）」、第2版、第3章：腫瘍抗原の生物学
（Biology of Tumour Antigens）、Lippincott社、ISBN 0-397-5144116-6(1995)
）においてさらに記載される。

【００３０】好ましい態様においては、腫瘍関連抗原は、上皮起源の癌細胞、神経内分泌細
胞起源の癌細胞または造血系の癌細胞上にしばしば発現または共発現される、膜
局在分子である。

【００３１】別の好ましい態様においては、本発明に従って産生される組成物は、その中に
含まれる抗体を多数投与することに適している。本明細書において説明される、
個体の体液から自己由来のワクチンを回収するための方法は、当然ながら1つの
みの適用には限定されない。

【００３２】最初のワクチン接種により誘発される、抗腫瘍効果に向かう免疫学的レパート
リーの移行は、その手順を繰り返すことによって増強でき、例えば免疫親和性精
製による最初の自己由来のワクチンの回収の数週間後に、体液、例えば血液を再
度採取でき、新しい自己由来のワクチンを調製および投与できる。このようにし
て、個々のワクチンにおける免疫学的平衡の対応する状態が常に考慮されること
が保証される。この過程は適切な間隔で（例えば最初は4週〜8週毎に、その後6
ヶ月毎に）何度も実施できる。

【００３３】本明細書において説明される、自己由来の抗体を用いたワクチン接種のための
新たな組成物および方法は、原則として治療および予防の両方の目的に適してい
る。癌患者に繰り返し行われる治療的ワクチン接種により、新たな転移の形成を
抑制でき、少なくとも疾患の散在（dissemination）を遅延できる。治療的な自
己由来のワクチン接種は、特に以下の疾患期において有用となり得る：例えば原発腫瘍の手術の成功後のような、疾患初期（アジュバント期）において
は、残りの散在性の腫瘍細胞は、本明細書に記載される自己由来のワクチン接種
によって破壊され、新たな転移の形成を妨げられる。その結果、そのような患者
では、再発のない寿命およびしたがって生存期間全体が、延長されうる。選択的
に、そのような自己由来のワクチン接種および適切な間隔で投与される追加抗原
注射（shot）によって、転移の形成から一生涯防御を達成することが可能である
。

【００３４】転移が既に形成されている場合、さらなる転移の進展および形成は、本明細書
において記載される組成物または自己由来のワクチン接種によって阻止されうる
。疾患の状態は安定化され、その結果、生活の質を維持でき、寿命は延長されう
る。

【００３５】本明細書に記載される自己由来のワクチン接種の戦略はまた、以前に診断また
は治療のために腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を投与され、それに対
して免疫応答を発達させた患者においても使用できる。結果として、この抗体が
リガンドとして使用される免疫親和性精製においては、それに対して向けられる
抗体（Ab2）は、非処置の個体の場合より多く得られる。これらのAb2を用いたワ
クチン接種は、ことによると本来既に形成されているAb3の形成を増強する。癌
患者に静脈内投与される、腫瘍関連抗原に対して向けられるマウス抗体（Ab1）
を用いた受動免疫療法による、Ab2の誘導を経た、潜在的な抗腫瘍特性をもつAb3
の内因性の誘導は、長年の間仮定され、かつ分析されてきた（例えば、Koprowsk
iら、PNAS 81(1984), 216〜19）。

【００３６】本明細書に記載される組成物および自己由来のワクチン接種は、原則として、
健康な個体における癌疾患の形成に対する防御を、予防法として増加させるため
にも使用できる。そのような手段は特に、危険度の高い群（これらは例えば、対
応する試験によってより多く検出できる、ある癌疾患を発症させる遺伝的素因を
有する個体を含む）の場合において意味をなす。

【００３７】対応するワクチンは個々の体液、例えば血清から産生されることが好ましいた
め、イディオタイプネットワークに関して各個体の免疫学的状態が考慮に入れら
れることは、本明細書に記載される個別の自己由来のワクチン接種の戦略におけ
る一般的な利点である。

【００３８】さらに、結果として、免疫化される個体は、外部抗原と接触せずに、免疫学的
平衡の調節を行うのに適した形態の内因性の成分のみによって処置される。

【００３９】本発明に従った好ましい態様において、免疫親和性精製によって得られた抗体
は、適切なワクチンアジュバントを用いて製剤化される。

【００４０】ワクチンに共通して言えるように、自己由来の抗体分画またはそれらの断片お
よび誘導体は、ワクチンアジュバントと共に製剤化できる。免疫応答はそのよう
なアジュバントにより増強される。そのようなアジュバントの例は、限定はしな
いが以下を含む：アルミニウムを含むアジュバント、特に水酸化アルミニウム（
例えばAlu-gel）、リポ多糖類の誘導体、カルメット-ゲラン杆菌（BCG）、QS-21
、リポソーム調製物、例えば破傷風トキソイドまたはインフルエンザウイルスの
成分のような、免疫系が既に強い免疫応答を発達させている付加的な抗原を選択
的にリポソーム調製物の中に有する製剤。

【００４１】免疫応答を増強するために、ワクチン調製物はまた、免疫応答の形成を支える
、対応する好ましくはヒトのサイトカインと共に、投与することもできる。特に
、限定的にではないが、顆粒球マクロファージ刺激因子（GM-CSF）が挙げられる
。このサイトカインは抗原処理（antigen-processing）細胞（例えば樹状細胞）
のを活性化により、有効な免疫応答を刺激する。

【００４２】選択的に、本質的に公知でかつ公表されている方法を使用することにより、自
己由来の抗体分画はエキソビボにて培養された自己由来の樹状細胞とインキュベ
ートすることもできる。このようにパルスされた樹状細胞は、続いてそれぞれの
個体に投与される。このようにして、特に有効な免疫応答を達成することが可能
である。

【００４３】本発明に従った使用の好ましい態様においては、組成物に含まれる抗体をアジ
ュバントと混合し、かつ次に好ましくは70℃から121℃の温度において熱処理に
供する。使用されるアジュバントは、好ましくはアルミニウムを含むアジュバン
トである。そのような熱処理はタンパク質抗原を変性させるが、アジュバントへ
の結合によって、タンパク質の免疫原部分が正しい形態で免疫系に提示され得る
ことは可能である。しかし、熱処理の利点を得るためにタンパク質を変性させる
必要は全くない。タンパク質の熱変性は温度のみに依存するのではなく、そのタ
ンパク質がこの温度に供される時間にも依存することが知られている。さらに、
タンパク質の変性の原因となる、例えばイオン強度、イオン組成、pH値、混合物
における活性表面の性質および量のような、その他の物理化学的パラメータが存
在する。抗体が変性されない、もしくは完全には変性されない、および／または
、例えばアジュバントの表面上のより少ない脱着のような他の効果を使用できる
ような条件が存在し得る。

【００４４】アジュバントを用いてワクチン製剤を産生する方法および、その後の熱処理の
さらなる利点は、製剤全体において感染性病原体が弱められる、または不活化さ
れ得るということである。この利点はワクチン製剤の産生および保管ならびに流
通のいずれにとっても重要である。このように、伝染性の疾患の公知のまたは未
知の病原体に関してより高い安全性が得られる。さらに、ワクチンの微生物保存
は熱によって実施されるため、対応する包装が使用される場合、防腐剤を用いず
に充填することが可能である。

【００４５】そのような製剤の別の利点は、加熱によって少なくとも部分的には、抗体の変
性を導き得るため、抗体の免疫原性が潜在的に増加させることである。この抗原
性の増加は、特にその個体自体のタンパク質と認識されるタンパク質の場合に、
免疫原性を増加できる。

【００４６】別の利点は、抗体アジュバント複合体が潜在的に、熱不活化によって付加的に
安定化されることであり、すなわちタンパク質抗原の脱着は、熱処理されていな
い抗原アジュバント製剤におけるほど迅速には起こらない。この利点により、個
々の免疫化の間により長い間隔を空けることも、ことによると可能になる。

【００４７】本発明に従って産生される組成物は、一般に公知の方法に従って、例えばワク
チンとして皮下注射または筋肉内注射により、投与できる。

【００４８】さらに本発明は、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原ま
たはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして使
用される、免疫親和性精製によって抗体を含む体液から回収された抗体を含む、
薬学的組成物に関連する。

【００４９】上記のように、そのような組成物は癌に対する治療的または予防的ワクチン接
種のためのワクチンとして適している。

【００５０】薬学的組成物の調製物、成分、製剤、投与の種類等の好ましい態様に関しては
、本発明に従った使用に関連して以前に説明されたものと同じ適用がなされる。

【００５１】最後に、しかしとりわけ本発明は、免疫親和性精製によって同一個体の抗体を
含む体液から回収された抗体と樹状細胞がインビボにおいてインキュベートされ
た、エキソビボで培養された個体の単離樹状細胞を含む、薬学的組成物にも関連
する。

【００５２】さらに、本発明はまた、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連
抗原またはそれらの断片を認識する抗体が、リガンドとして免疫親和性精製のた
めに使用され、抗体を含む体液から、好ましくは同一個体の体液から免疫親和性
精製によって得られた抗体を個体に投与する、癌に対する治療的または予防的な
ワクチン接種の方法にも関連する。

【００５３】さらに、本発明は癌に対する治療的または予防的ワクチン接種の方法に関連し
、ここでエキソビボにて培養され、かつ抗体を含む体液から免疫親和性精製によ
って得られた抗体と事前にインビトロでインキュベートされた、自己由来の単離
された樹状細胞を個体に投与し、ここで同じイディオタイプをもつ1つまたは複
数の腫瘍関連抗原またはそれらの断片を認識する抗体は、リガンドとして免疫親
和性精製のために使用される。

【００５４】本発明に従った使用に関連して以前に説明されたのと同じものが、好ましい態
様に適用される。

【００５５】本発明はまた、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原また
はそれらの断片を認識する抗体が、リガンドとして免疫親和性精製に使用され、
免疫親和性精製によって抗体を含む体液から抗体が回収される点で特徴付けられ
る、抗体調製物の産生方法にも関連する。

【００５６】本発明に従った使用に関連して以前に説明されたのと同じものが、腫瘍関連抗
原と同様に、リガンドとして使用される体液、抗体に適用される。

【００５７】免疫親和性精製は当業者に公知の方法に従って実施できる。この場合、また本
発明に従った使用に関連して以前に挙げられたのと同じものが適用される。

【００５８】本発明の方法の好ましい態様においては、異なる腫瘍関連抗原および／または
そのような抗原のエピトープに対して向けられるいくつかの抗体が、同時に親和
性精製に使用される。いくつかの抗体が親和性精製に使用されるアプローチにお
いては、それらは同時または別々のいずれかで使用でき、免疫親和性精製は並行
してまたは連続して実施できる、すなわち、異なるエピトープおよび／または抗
原特異性を要求に従って組合わせることができる。これらの要件は異なる個々の
腫瘍上の異なる抗原の発現から生じる。

【００５９】特に好ましい態様においては、免疫親和性精製においてモノクローナル抗体が
リガンドとして使用され、さらにより好ましい態様においては、血清が体液とし
て使用される。

【００６０】本発明の方法は好ましくは、癌に対する治療的または予防的ワクチン接種に適
した薬学的組成物の産生に使用される、抗体調製物を調製する方法である。

【００６１】さらに、本発明は本発明の前述の抗体調製物の調製方法が実施され、このよう
にして得られた抗体調製物が、続いて薬学的に許容される担体および／または適
切なワクチンアジュバントを用いて製剤化される、薬学的組成物の調製方法に関
連する。

【００６２】好ましい態様において、抗体調製物はアジュバントと、好ましくはアルミニウ
ムを含むアジュバントと混合され、次に好ましくは70℃から121℃の温度におい
て熱処理に供される。

【００６３】本発明に従った使用に関連して以前に挙げられたのと同じものが、そのような
薬学的製剤またはワクチン製剤の好ましい態様に適用される。

【００６４】本出願において引用される、あらゆる特許、刊行物またはデータバンク登録の
開示の内容は、それにより、その全体が参照として本出願の開示内容に組み入れ
られる。

【００６５】以下の材料は、本発明をより詳しく例示するが限定するものではない、下記の
実施例において使用された：マイクロタイタープレート： ELISAのためのイムノプレートF96マキシソープ（Immuno Plate F96 MaxiSorp）
（Nunc）細胞ELISAのための細胞培養クラスター（Coster; カタログ番号3598）細胞株： KATOIII：ヒト胃癌細胞株（ATCC HTB 103）連結（coupling）緩衝液： 0.1 M NaHCO₃ 0.5 M NaCl pH 8.0 精製緩衝液A：不完全PBS 0.2 M NaCl 精製緩衝液B： 0.1 M グリシン／HCl 0.2 M NaCl pH 2.9 培地A： RPMI 1640+2 g/l NaHCO₃ 100 U/ml ペニシリンG 100μg/ml 硫酸ストレプトマイシン 4 mMグルタミン 10％ウシ胎仔血清（熱不活化）結合緩衝液： 15 mM Na₂CO₃ 35 mM Na₂CO₃ 3 mM NaN₃ pH :9.6 不完全PBS（不完全PBSicient）（def）： 138 mM NaCl 1.5 mM KH₂PO₄ 2.7 mM KCl 6.5 mM Na₂HPO₄ pH :7.2 固定溶液：生理食塩水中の0.1％グルタルジアルデヒト洗浄緩衝液A：不完全PBS中の 2％ NaCl 0.2％トリトンX-100 洗浄緩衝液B：不完全PBS中の0.05％トゥイーン 20 ブロッキング緩衝液A：不完全PBS中の 5％ウシ胎仔血清（熱不活化）ブロッキング緩衝液B：不完全PBS中の 1％ウシ血清アルブミン 0.1％ NaN₃ 希釈緩衝液A：不完全PBS中の 2％ウシ胎仔血清（熱不活化）希釈緩衝液B：不完全PBS 染色緩衝液： 24.3 mM クエン酸 51.4 mM Na₂HPO₄ pH :5.0 基質： 40 mg ジヒドロ塩化o-フェニレンジアミン 100 ml 染色緩衝液 20μl H₂O₂（30％）停止溶液： 4 N H₂SO₄ 製剤緩衝液： 10％不完全PBS、pH=6.0 90％生理食塩水

【００６６】実施例1 TAA特異的な抗体を用いた免疫親和性カラムの調製 7.5 gのCH-セファロース 4B（Pharmacia）を20 mlの1 mM HCl中に15分間懸濁
した。その後ゲルを1lの1 mM HCl、続いて200 mlの連結緩衝液によって焼結ガラ
スのAG3フィルター上で洗浄した。100 mgのマウス抗体17-1A（Panorex, 保存溶
液 10 mg/ml；腫瘍関連抗原Ep-CAMに対して向けられる）を5 lの連結緩衝液に対
して透析し、連結緩衝液を用いて5 mg/mlにまで調整した。この溶液を密閉容器
内でゲル懸濁液と混合した。連結に適した懸濁液は、ゲル対緩衝液1：2の比率で
得られる。この懸濁液を4℃にて24時間回転させた。次に、過剰なリガンドを30
mlの連結緩衝液を用いて3回洗い流した。残りの反応基は1 Mのエタノールアミン
を用いた4℃における1時間のインキュベーションによってブロックした。その後
、ゲルを0.1 MのTris-HCl緩衝液と共に室温にて1時間回転させた。最後に、ゲル
をpH値を変化させながら3サイクルの緩衝液によって洗浄した。各サイクルは、0
.5 MのNaClを含むpH 4の0.1 Mの酢酸ナトリウム緩衝液、および続いて、0.5 Mの
NaClを含むpH 8の0.1 MのTris-HCl緩衝液からなる。ゲルを4℃にて保存した。

【００６７】実施例2 免疫親和性クロマトグラフィーによる、血清由来の抗体分画の免疫親和性精製 10 mlの末梢血をアカゲザルから採取し、そこから血清を回収した。全ての手
順は無菌条件下において行った。

【００６８】 FPLCシステム（Pharmacia）において免疫親和性精製を実施した。実施例1に従
って得られた1 mlのゲルをPharmaciaによるHR5/5カラムの中に充填した。5 mlの
血清を、精製緩衝液Aを用いて1：10に希釈した。この溶液をカラム上に1 ml/分
で注入し、次に検出器のUVが基線（280 nm）に再度到達するまで精製緩衝液Aで
洗浄した。結合した免疫グロブリンを精製緩衝液Bによって溶出し、脱着直後に
分画を1 MのNa₂HPO₄を用いて中和した。図1はこの精製のクロマトグラムを示す
（UV 280 nm）。

【００６９】このように精製された50μlの抗体分画をサイズ排除カラム（SEC, Zorbax 250
GF）で分析した。220 mMリン酸緩衝液、pH 7+10％のアセトニトリルを流出剤と
して使用した。この分析のクロマトグラムからわかるように（図2）、抗体分画
はIgMおよびIgGを約3：2の比率で含む。抗体分画の全量は約40μgであった（サ
イズ排除精製(SEC)により標準と比較して測定された）。このようにして得られ
た抗体分画をELISAにおいて、抗体17-1A（親和性精製のリガンドとして使用され
た）への結合に関して試験した：腫瘍関連抗原に対して向けられ、かつ親和性精
製のために使用された抗体の100μlアリコート（抗体17-1A；結合緩衝液に溶解
した10μg/mlの溶液）を、マイクロタイタープレートのウェル中で37℃にて1時
間インキュベートした。洗浄緩衝液Aによってプレートを6回洗浄した後、200μl
のブロッキング緩衝液Aを加え、37℃にて30分間インキュベートした。上記のよ
うにプレートを洗浄した後、同じ濃度で陰性対照として通常のヒト免疫グロブリ
ンと同様に試験される、親和性精製された抗体分画の100μlアリコートを、希釈
緩衝液A中の1：4から1：65,000の希釈溶液中で、37℃にて1時間インキュベート
した。上記のようにプレートを洗浄した後、100μlのペルオキシダーゼに連結さ
れたヤギ抗ヒトIg抗体（Zymed）を、希釈緩衝液Aに1：1,000の希釈度で加え、37
℃にて30分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液Aで4回、染色緩衝液で
2回洗浄した。100μlの特異的基質を加えることによって、抗体の結合を検出し
、50μlの停止溶液を加えることによって、約3分後に呈色反応を停止させた。49
0 nmの波長において吸光度（OD）を測定することによって評価を行った（参照測
定の波長は620 nmである）。

【００７０】図3において認められるように、親和性精製された抗体分画は抗体17-1Aに著し
く結合した一方、通常のヒト免疫グロブリンは実質上結合しない。

【００７１】実施例3 精製された抗体を用いたワクチンの製剤化親和性精製によって得られた抗体分画を、以下の指示に従い水酸化アルミニウ
ムをアジュバントとして用いて製剤化した： 1 mgの水酸化アルミニウム（水性懸濁液；Alhydrogel、Superfos）を、親和性ク
ロマトグラフィー後に得られた3 mlの抗体溶液（約40μgの抗体を含む）に加え
、「FILTRON」遠心分離バイアル（Microsep（商標）、10 KD分離）中で懸濁液を
4,000×gで30分間遠心分離した。続いて、1 mlの製剤緩衝液によって溶液を2回
懸濁し、4,000×gで30分間遠心分離した。懸濁液を製剤緩衝液で0.5 mlに満たし
、このようにして得られた懸濁液を無菌的手法で充填した。

【００７２】実施例4 免疫親和性精製した自己由来の抗体を用いたアカゲザルの免疫化実施例2および実施例3において説明されるようにその血清からワクチンを得た
個々のアカゲザルの背中に、このワクチンを用いて皮下にワクチン接種した。こ
の最初のワクチン接種の前に、血清の回収のために5 mlの血液を採取した（免疫
応答の評価のための開始値を決定するため）。その2週間後に、血清の回収のた
めに10 mlの血液を再度採取した。この血清4 mlを用いて、上記のように自己由
来のワクチンの回収を繰り返した。新たに得られたワクチンを再度、アカゲザル
の背中に皮下注射した。このワクチン接種の4週間後、血清の回収のために再度5 mlの血液を採取した（2回のワクチン接種の効果を判断するため）。

【００７３】このアカゲザルの前血清（pre-serum）および2回目のワクチン接種から4週間
後の免疫血清を、抗体がKATOIII細胞株上において結合しているか否かについて
、細胞ELISAにおいて分析した。このために、以下の段階を行った：マイクロタイタープレートのウェルに、培地A中で2×10⁶細胞／mlの濃度のKATOI
II細胞株の細胞懸濁液100μlを入れて、37℃にて一晩インキュベートした。上清
を吸い取った後、プレートをウェル当たり50μlの固定溶液と室温にて5分間イン
キュベートした。上清を吸い取った後、200μlのブロッキング緩衝液Bを各ウェ
ルに添加し、プレートを室温にて1時間インキュベートした。200μlの洗浄緩衝
液Bによってそれを2回洗浄した後、試験するサル血清の100μlアリコートを、希
釈緩衝液B中の1：4から1：56,000の希釈溶液中で、37℃にて1時間インキュベー
トした。100μlの氷冷洗浄緩衝液Bでプレートを2回洗浄した後、希釈緩衝液A中
の1：1,000の希釈溶液中の、ペルオキシダーゼに連結されたヤギ抗ヒトIg抗体（
Zymed）100μlを加え、37℃にて45分間インキュベートした。100μlの氷冷洗浄
緩衝液Bでプレートを3回洗浄した。100μlの特異的基質を添加することにより、
抗体の結合を検出し、50μlの停止溶液を添加することにより、約5分後に呈色反
応を停止させた。490 nmの波長における吸光度（OD）を測定することにより、評
価を行った（基準測定の波長は620 nmである）。

【００７４】図4からわかるように、自己由来の方法によりワクチン接種されたアカゲザル
の免疫血清において免疫グロブリンが存在し、これらの免疫グロブリンはKatoII
I腫瘍細胞上において結合できる一方、同じ動物の前血清においてはそのような
抗体はほとんど検出できない。

【００７５】上記の実験の結果により、腫瘍関連抗原に対して向けられるモノクローナル抗
体での免疫親和性精製によって得られた個別の自己由来の抗体分画を用いたワク
チン接種が、該腫瘍関連抗原を発現するヒト腫瘍細胞上で結合する体液性免疫応
答を誘発したことが、例示的に示され得る。

【００７６】実施例5： 2つの異なるTAA特異的抗体を用いた免疫親和性カラムの調製 EP-CAMに反応するモノクローナルマウス抗体およびルイスYに反応するモノク
ローナルマウス抗体の両方を、標準的な技術に従って、活性化されたCHセファロ
ース4B（Pharmacia Biotech、スウェーデン）に連結した： 7.5 gのCHセファロース4Bを20 mlの1 mM HClにおいて15分間懸濁し、浸漬した。
1 lの1 mM HClでゲルを洗浄し、次に焼結ガラスのAG3フィルター上で200 mlの連
結緩衝液で洗浄した。100 mgのマウス抗体（保存溶液 10 mg/ml）を、5 lの連結
緩衝液に対して透析し、連結緩衝液で5 mg/mlに調節した。この溶液をゲル懸濁
液と密閉容器内で混合した。連結に適した懸濁液は、ゲル対緩衝液の比率1：2で
得られる。この懸濁液を4℃にて24時間回転させた。その後、過剰なリガンドを3
0 mlの連結緩衝液で3回洗い流した。1 Mのエタノールアミンとの4℃における1時
間のインキュベーションにより、残りの反応基をブロックした。その後、ゲルを
0.1 MのTris-HCl緩衝液と室温にて1時間回転させた。最後に、pH値を変えながら
ゲルを緩衝液で3サイクル洗浄した。各サイクルは、0.5 M NaClを含むpH 4の0.1
M酢酸ナトリウム緩衝液、および続いて0.5 M NaClを含むpH 8の0.1 M Tris-HCl
緩衝液からなる。ゲルを4℃にて保存した。

【００７７】 2つの同一量の、2種類の親和基質を混合し、免疫親和性クロマトグラフィーの
カラムとして充填した（System Akta Pharmacia、スウェーデン）。

【００７８】実施例6： 2つの異なるTAA特異的抗体を用いて、同時に行った免疫親和性精製による、サル
の血清由来の抗体の精製約20 mlの血液をそれぞれ、免疫学的に未経験な（naive）アカゲザルから採取
した。実施例5に記載された免疫親和性クロマトグラフィーのカラムを用いて、9
mlの血清をそれぞれ精製した（System Akta Pharmacia、スウェーデン）。

【００７９】適用のための緩衝液：精製緩衝液A

【００８０】溶出緩衝液：精製緩衝液B

【００８１】溶出液を0.5 Mのリン酸水素ナトリウム溶液によって中和した。

【００８２】精製されたタンパク質が高濃度で存在するように、溶出液を分別した。

【００８３】 50μlの精製した抗体分画を、サイズ排除カラム（SEC, Zorbax 250 GF）上で
分析した。220 mMのリン酸緩衝液、pH7+10％アセトニトリルを流出剤として使用
した（流速：1.000 ml/分；波長214 nm）。この分析のクロマトグラムからわか
るように（図5）、抗体分画はIgM（保持時間 6.963分）およびIgG（保持時間 8.
745分）を約3：2の比率で含む。抗体分画の総量は約50μgであった（SECによっ
て標準と比較して測定された、図6）。

【００８４】実施例7：精製した抗体由来のワクチンの異なる製剤化ワクチンは遠心分離のための限外ろ過ユニット（Centricon 10；Amicon, USA
）において製剤化される。このために、1 mMのリン酸ナトリウム緩衝液、0.86％
のNaCl、pH 6.0（NBK）を用いて、遠心分離により限外ろ過ユニットを洗浄した
。

【００８５】その後、1 mlの緩衝液（NBK）をユニットに満たし、37μlのAlhydro gel2％（
Superfos Biosector、デンマーク）を加えた。

【００８６】実施例6の中和した溶出液を加えた後、Centriconの使用説明書に従って遠心分
離および洗浄（緩衝液5 mlを用いて）を行った。

【００８７】その後、ワクチンを再懸濁し、緩衝液で550μlまでに満たし、無菌的手法で充
填した。

【００８８】または、ワクチンは再懸濁後に緩衝液で545μlまでに満たし、5.5μlのチメロ
サール保存溶液（10 mg/ml, Sigma, USA）を加えた。

【００８９】ワクチン製剤の第3の変型は、無菌的手法でガラスバイアルに充填した後、オ
ートクレーブで熱変性させた（121℃；20分間）。

【図面の簡単な説明】

【図１】アカゲザルの血清由来の抗体分画の免疫親和性精製（固定化抗体
17-1Aによる）のクロマトグラムを示す。

【図２】免疫親和性精製によって精製された抗体分画のクロマトグラム（
サイズ排除クロマトグラフィー）を示す。

【図３】抗体17-1A上による親和性精製によって得られた血清抗体の結合
を示す：17-1A ELISA。

【図４】アカゲザルの自己由来のワクチン接種の結果を示す：血清IgのKa
toIII腫瘍細胞への結合（細胞ELISA）。

【図５】免疫親和性精製（混合ベッド抗EpCAM/抗ルイスY）によって精製
された抗体分画のクロマトグラム（サイズ排除クロマトグラフィー）を示す。

【図６】（サイズ排除クロマトグラフィーにより分離された）サイズ標準
のクロマトグラムを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１１月１９日（２００１．１１．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の詳細な説明

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【００１０】ロスマン（Losman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)、3421-3425
において、癌患者からのab2抗体の精製が記載されている。しかし、この患者はC EAに対するマウスモノクローナル抗体（NP-4）で事前に処置された。

【００１１】したがって、癌に対する防御と同様に、有効で広く適用可能な、かつ選択的に腫瘍の個々の治療を可能にする、手段および方法を提供する必要が、依然としてあることは明らかである。

【００１２】ゆえに、本発明の基礎となる技術的課題は、癌の治療および癌に対する防御のために、異なる種類の腫瘍の基質（framework）内で個々に使用できる、効率の
よい手段および方法を提供することである。

【００１３】この技術的課題は、請求項において特徴付けられる態様を提供することにより解決された。

【００１４】このように、本発明は同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗
原またはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして使用され、免疫親和性精製によって抗体を含む体液から抗体が回収される点で特徴付けられる、癌に対する治療的または予防的なワクチン接種のためのワクチンとして適切な組成物を産生するための、抗体の使用に関連する。

【００１５】最先端の技術において説明された方法と比較して、本発明に従った使用は、本発明の概念が広く有効に適用され、モノクローナル抗体に限定されないことを可能にする、抗イディオタイプ抗体を産生するために細胞培養を使用しないという、利点を有する。

【００１６】例えば、あらゆるヒトの血中に全体として多量に存在する抗体のプールは、可能なあらゆる結合特異性をもつ抗体を含む。このようにこの抗体プールは、原則として、例えば任意の腫瘍関連抗原（TAA）に対して向けられる（すでに公知の
または新規の）マウスモノクローナル抗体（Ab1）のイディオタイプに対する抗
体（Ab2）も含む。免疫学的ネットワークに従い、あらゆるヒトにおける同じ抗
体プールはまた、自己由来のAb2のイディオタイプに対して向けられる抗体、い
わゆるAb3抗体も一定量含む。ネットワーク理論によると、Ab3は外部のAb1によ
って限定される腫瘍関連抗原に結合できる。Ab2/Ab3の平衡をAb3寄りに移行すると、免疫系が該抗原をもつ腫瘍細胞をよりよく認識しかつ攻撃できるという結果になる。

【００１７】ここで、そのような免疫学的平衡の移行を、個々の自己由来のAb2分画を免疫
原ワクチンの形態で投与することにより達成できることが、本発明の基礎である。そのような自己由来のワクチン接種により、Ab3を産生するB細胞は選択的に刺激されることが可能である。そのようなワクチン接種のためには、適切なワクチンアジュバントを使用する公知の方法に従って製剤化できる、少量のAb2分画の
みが必要である。

【００１８】本発明に従って使用される抗体はゆえに、抗体を含む体液由来のAb2抗体であ
り、かつ免疫親和性精製に使用される抗TAA抗体に対して向けられる、抗体であ
る。抗体を含む体液は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ、悪性滲出液等である。体液は好ましくは血清である。体液は抗体を含む体液をもつ任意の動物由来でありうる。好ましくは、これらは脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物であり、かつ最も好ましくは、体液はヒト起源のものである。

【００１９】自己由来の抗体を用いたワクチン接種により誘導される免疫応答は、これらの抗体の結合領域、すなわちそれらのイディオタイプによって決定されるため、原則としては、ワクチン接種を成功させるために、これらの抗体の断片または誘導体がなおもそれぞれの元の抗体のイディオタイプを含んでいる限り、完全な抗体の分画の代わりにこれらの断片または誘導体も使用できる。このように、「抗体」という用語は、同じ結合特異性をもつ抗体の断片または誘導体も含む。限定はしないが例として、以下のものが挙げられる：例えば本質的に公知の生化学的方法（例えば酵素による切断）に従って産生されうる、F(ab)'₂断片およびF(ab)'断
片。「誘導体」という用語は、例えばリポソームへ取りこむために親油性（lipoph ilia）を増加させるため、遊離アミノ基において脂肪酸によってアミド化された抗体のような、本質的に公知の化学的または生化学的方法に従って産生されうる抗体誘導体を含む。特に、「誘導体」という用語は、例えば破傷風トキソイド、シュードモナス外毒素、リピドAの誘導体、GM-CSF、IL-2のような免疫応答を増強
できる分子と抗体または抗体断片を化学的に結合することによって、または例えばGM-CSF、IL-2、IL-12、C3d等のような免疫応答を増強するポリペプチドと抗体または抗体断片を化学的に結合することによって、産生されうる産物も含む。免疫親和性精製による、抗体を含む体液からの、例えばヒト血清からの、抗体の精製は、当業者に公知の方法を用いて実施できる（Clin.Chem. 45(1999), 593；J. Chem. Technol. Biotechnol. 48(1990), 105）。TAA特異的な抗体または抗体混合物を固相上に固定する。固相は、結合特性を本質的に失わずに抗体が結合できる、膜、ゲル、または同様の材料でありうる。Ab2はバッチにおいてまたは流動
法（flow-through method）において固定化抗体に結合できる。免疫親和性精製
は精製装置において自動的に、または手動法によって実施されうる。しかし、本方法は固定化抗体を含む単純な装置によって、手動で、自動で、または半自動で実施されうるとも考えられる。実施例1において記載される、免疫親和性クロマ
トグラフィーにおいては、通常使用される血清1 ml当たり3μg〜10μgの免疫グ
ロブリンが得られる。一般に、このようにして得られる抗体分画は、IgMおよびI gGの両方からなる。したがって血液採取の許容できる量から、例えば血清約25 m lをもたらす血液50 mlから、約0.08 mg〜0.25 mgのAb2を回収することが可能で
ある。この量は基本的にワクチン接種には十分である。より多量のAb2を回収す
ることが望まれる場合は、本質的に公知の血漿搬出のような技術を免疫親和性精製と組合わせて使用できる。異なる特異性をもついくつかの抗体を使用する場合は、これらの固定化抗体を同時に使用できる、または、別々の免疫親和性精製を並行してもしくは連続して実施できる。

【００２０】本出願の枠組みにおいて、「腫瘍関連抗原」という用語は、好ましくは腫瘍細胞によって提示される構造体であって、かつしたがってそれを非悪性の組織から区別することを可能にする構造体である。好ましくは、そのような腫瘍関連抗原は腫瘍細胞の細胞膜上または細胞膜内に局在する。しかし、そのような抗原が非変性細胞上にも存在することは除外できない。腫瘍関連抗原は例えば、ポリペプチド、特にグリコシル化タンパク質、またはポリペプチドのグリコシル化型でありうる。腫瘍関連抗原を提示し得るその他の構造体は、例えば糖脂質である。これらは例えば、GM2などのようなガングリオシドを含む。さらに、腫瘍関連抗原は
癌細胞に特徴的でありうる、細胞膜の脂質の組成における変化により提示されることができる。

【００２１】異なる腫瘍関連抗原に対する著しく多様化した抗体は長年公知であるか、または本質的に公知の方法（例えばハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術）を用いて産生できる。

【００２２】好ましい態様においては、免疫親和性精製によって得られる抗体は、自己由来の個別のワクチンという意義において、その体液からそれらの抗体が回収された個体に投与される。

【００２３】ゆえに、ある個体の体液、例えば血液からのAb2分画の回収が、その体液中に
存在する抗体の免疫親和性精製によって達成できることが、本発明のさらなる不可欠な構成要素である。腫瘍関連抗原に対する1つ（または複数）の抗体が、リ
ガンドとして使用される。

【００２４】この文脈においては、個体は任意の動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物および最も好ましくはヒトでありうる。

【００２５】別の好ましい態様においては、様々な腫瘍関連抗原に対して、および／または、1つまたは複数の腫瘍関連抗原の様々なエピトープに対して向けられるいくつ
かの抗体を、免疫親和性精製のために同時に使用できる。異なる腫瘍関連抗原に対して、または異なるエピトープに対して向けられるいくつかの抗体、特にモノクローナル抗体が、体液中に存在するAb2の免疫親和性精製のために同時に使用
される場合は、選択された一連の腫瘍関連抗原に基づいた、異なるAb2からなる
分画が得られ、かつそれをワクチンとして同時に使用することにより、これら全ての腫瘍関連抗原またはエピトープに対する免疫応答が誘発される。ゆえに、免疫学的平衡は一連の（しばしば共発現された）腫瘍関連抗原またはエピトープの認識に向かって、ある段階で移行される。腫瘍細胞がいくつかの抗原の発現を同時に停止できる可能性は極端に低いため、そのような手順により、誘導される免疫応答の有効性は自然と増加し、腫瘍の抗原陰性の変異体の形成（「腫瘍の回避
（escape）」）は本質的に減少する。

【００２６】原則として、前述の方法は、あらゆる公知のまたは新規に発見された腫瘍関連抗原に基づくことができる。唯一の前提条件は、そのような抗原に対して向けられる1つまたは複数の抗体、好ましくはモノクローナル抗体が、免疫親和性精製
のリガンドとして利用可能なことである。原則としては、あらゆる可能な種類の抗体、特にポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が適しており、モノクローナル抗体がより好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の混合物を使用することもまた可能である。さらに、例えばマウスモノクローナル抗体およびその他の種（例えばラット）由来の抗体の両方を使用できる。その上、腫瘍関連抗原に対するマウス-ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒトモノク
ローナル抗体を使用できる。免疫親和性精製に使用される抗体の特性は、それらの結合領域、すなわちそれらのイディオタイプによって決定される。このように、原則として、これらの抗体の断片もまた、これらの断片がそれぞれの元の抗体のイディオタイプをなおも保持している限り、完全な抗体の代わりに、首尾よく免疫親和性精製を行うために使用できる。限定はしないが、例として以下が含まれる：本質的に公知の生化学的方法（酵素による切断）に従って、または本質的に公知の分子生物学的方法に従って、産生できるF(ab)'₂断片、F(ab)'断片およ
びFv断片。実際には各種類の抗体または断片の混合物を使用することも可能である。

【００２７】腫瘍関連抗原の選択、およびゆえに、これらの抗原に対して向けられる免疫親和性精製に使用される抗体の選択は、それに対してワクチン接種が実施される腫瘍の指標の、抗原特性に依存する。

【００２８】既に公知であり、かつ様々な腫瘍、特に上皮腫瘍上にて頻繁に発現される、以下の腫瘍関連抗原を例示的に挙げる。しかし、本明細書において記載される自己由来のワクチン接種法の使用は、これらの抗原に全く限定されない：上皮細胞接着分子（Ep-CAM）癌胎児抗原（CEA）ルイスY炭水化物シアリルTn炭水化物グロボH炭水化物 GD2/GD3/GM2のようなガングリオシド前立腺特異抗原（PSA） CA125 CA19-9 CA15-3 TAG-72 EGF受容体ニューロン細胞接着分子（N-CAM） Her2/Neu受容体 D97 CD20 CD21

【００２９】挙げられたあらゆる（主にはいくつかの）抗原に対しては、Ab2を回収するた
めの、前述の免疫親和性精製のためのリガンドとして使用されるのに原則として適しているモノクローナル抗体について、特に説明されている。

【００３０】腫瘍関連抗原については、例えばデヴィータ（DeVita）ら（編、「癌の生物学
的治療（Biological Therapy of Cancer）」、第2版、第3章：腫瘍抗原の生物学
（Biology of Tumour Antigens）、Lippincott社、ISBN 0-397-5144116-6(1995) ）においてさらに記載される。

【００３１】好ましい態様においては、腫瘍関連抗原は、上皮起源の癌細胞、神経内分泌細胞起源の癌細胞または造血系の癌細胞上にしばしば発現または共発現される、膜局在分子である。

【００３２】別の好ましい態様においては、本発明に従って産生される組成物は、その中に含まれる抗体を多数投与することに適している。本明細書において説明される、個体の体液から自己由来のワクチンを回収するための方法は、当然ながら1つの
みの適用には限定されない。

【００３３】最初のワクチン接種により誘発される、抗腫瘍効果に向かう免疫学的レパートリーの移行は、その手順を繰り返すことによって増強でき、例えば免疫親和性精製による最初の自己由来のワクチンの回収の数週間後に、体液、例えば血液を再度採取でき、新しい自己由来のワクチンを調製および投与できる。このようにして、個々のワクチンにおける免疫学的平衡の対応する状態が常に考慮されることが保証される。この過程は適切な間隔で（例えば最初は4週〜8週毎に、その後6
ヶ月毎に）何度も実施できる。

【００３４】本明細書において説明される、自己由来の抗体を用いたワクチン接種のための新たな組成物および方法は、原則として治療および予防の両方の目的に適している。癌患者に繰り返し行われる治療的ワクチン接種により、新たな転移の形成を抑制でき、少なくとも疾患の散在（dissemination）を遅延できる。治療的な自
己由来のワクチン接種は、特に以下の疾患期において有用となり得る：例えば原発腫瘍の手術の成功後のような、疾患初期（アジュバント期）においては、残りの散在性の腫瘍細胞は、本明細書に記載される自己由来のワクチン接種によって破壊され、新たな転移の形成を妨げられる。その結果、そのような患者では、再発のない寿命およびしたがって生存期間全体が、延長されうる。選択的に、そのような自己由来のワクチン接種および適切な間隔で投与される追加抗原注射（shot）によって、転移の形成から一生涯防御を達成することが可能である。

【００３５】転移が既に形成されている場合、さらなる転移の進展および形成は、本明細書において記載される組成物または自己由来のワクチン接種によって阻止されうる。疾患の状態は安定化され、その結果、生活の質を維持でき、寿命は延長されうる。

【００３６】本明細書に記載される自己由来のワクチン接種の戦略はまた、以前に診断または治療のために腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体を投与され、それに対して免疫応答を発達させた患者においても使用できる。結果として、この抗体がリガンドとして使用される免疫親和性精製においては、それに対して向けられる抗体（Ab2）は、非処置の個体の場合より多く得られる。これらのAb2を用いたワクチン接種は、ことによると本来既に形成されているAb3の形成を増強する。癌
患者に静脈内投与される、腫瘍関連抗原に対して向けられるマウス抗体（Ab1）
を用いた受動免疫療法による、Ab2の誘導を経た、潜在的な抗腫瘍特性をもつAb3 の内因性の誘導は、長年の間仮定され、かつ分析されてきた（例えば、Koprowsk iら、PNAS 81(1984), 216〜19）。

【００３７】本明細書に記載される組成物および自己由来のワクチン接種は、原則として、健康な個体における癌疾患の形成に対する防御を、予防法として増加させるためにも使用できる。そのような手段は特に、危険度の高い群（これらは例えば、対応する試験によってより多く検出できる、ある癌疾患を発症させる遺伝的素因を有する個体を含む）の場合において意味をなす。

【００３８】対応するワクチンは個々の体液、例えば血清から産生されることが好ましいため、イディオタイプネットワークに関して各個体の免疫学的状態が考慮に入れられることは、本明細書に記載される個別の自己由来のワクチン接種の戦略における一般的な利点である。

【００３９】さらに、結果として、免疫化される個体は、外部抗原と接触せずに、免疫学的平衡の調節を行うのに適した形態の内因性の成分のみによって処置される。

【００４０】本発明に従った好ましい態様において、免疫親和性精製によって得られた抗体は、適切なワクチンアジュバントを用いて製剤化される。

【００４１】ワクチンに共通して言えるように、自己由来の抗体分画またはそれらの断片および誘導体は、ワクチンアジュバントと共に製剤化できる。免疫応答はそのようなアジュバントにより増強される。そのようなアジュバントの例は、限定はしないが以下を含む：アルミニウムを含むアジュバント、特に水酸化アルミニウム（例えばAlu-gel）、リポ多糖類の誘導体、カルメット-ゲラン杆菌（BCG）、QS-21 、リポソーム調製物、例えば破傷風トキソイドまたはインフルエンザウイルスの成分のような、免疫系が既に強い免疫応答を発達させている付加的な抗原を選択的にリポソーム調製物の中に有する製剤。

【００４２】免疫応答を増強するために、ワクチン調製物はまた、免疫応答の形成を支える、対応する好ましくはヒトのサイトカインと共に、投与することもできる。特に、限定的にではないが、顆粒球マクロファージ刺激因子（GM-CSF）が挙げられる。このサイトカインは抗原処理（antigen-processing）細胞（例えば樹状細胞）のを活性化により、有効な免疫応答を刺激する。

【００４３】選択的に、本質的に公知でかつ公表されている方法を使用することにより、自己由来の抗体分画はエキソビボにて培養された自己由来の樹状細胞とインキュベートすることもできる。このようにパルスされた樹状細胞は、続いてそれぞれの個体に投与される。このようにして、特に有効な免疫応答を達成することが可能である。

【００４４】本発明に従った使用の好ましい態様においては、組成物に含まれる抗体をアジュバントと混合し、かつ次に好ましくは70℃から121℃の温度において熱処理に
供する。使用されるアジュバントは、好ましくはアルミニウムを含むアジュバントである。そのような熱処理はタンパク質抗原を変性させるが、アジュバントへの結合によって、タンパク質の免疫原部分が正しい形態で免疫系に提示され得ることは可能である。しかし、熱処理の利点を得るためにタンパク質を変性させる必要は全くない。タンパク質の熱変性は温度のみに依存するのではなく、そのタンパク質がこの温度に供される時間にも依存することが知られている。さらに、タンパク質の変性の原因となる、例えばイオン強度、イオン組成、pH値、混合物における活性表面の性質および量のような、その他の物理化学的パラメータが存在する。抗体が変性されない、もしくは完全には変性されない、および／または、例えばアジュバントの表面上のより少ない脱着のような他の効果を使用できるような条件が存在し得る。

【００４５】アジュバントを用いてワクチン製剤を産生する方法および、その後の熱処理のさらなる利点は、製剤全体において感染性病原体が弱められる、または不活化され得るということである。この利点はワクチン製剤の産生および保管ならびに流通のいずれにとっても重要である。このように、伝染性の疾患の公知のまたは未知の病原体に関してより高い安全性が得られる。さらに、ワクチンの微生物保存は熱によって実施されるため、対応する包装が使用される場合、防腐剤を用いずに充填することが可能である。

【００４６】そのような製剤の別の利点は、加熱によって少なくとも部分的には、抗体の変性を導き得るため、抗体の免疫原性が潜在的に増加させることである。この抗原性の増加は、特にその個体自体のタンパク質と認識されるタンパク質の場合に、免疫原性を増加できる。

【００４７】別の利点は、抗体アジュバント複合体が潜在的に、熱不活化によって付加的に安定化されることであり、すなわちタンパク質抗原の脱着は、熱処理されていない抗原アジュバント製剤におけるほど迅速には起こらない。この利点により、個々の免疫化の間により長い間隔を空けることも、ことによると可能になる。

【００４８】本発明に従って産生される組成物は、一般に公知の方法に従って、例えばワクチンとして皮下注射または筋肉内注射により、投与できる。

【００４９】さらに本発明は、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原ま
たはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして使用される、免疫親和性精製によって抗体を含む体液から回収された抗体を含む、薬学的組成物に関連する。

【００５０】上記のように、そのような組成物は癌に対する治療的または予防的ワクチン接種のためのワクチンとして適している。

【００５１】薬学的組成物の調製物、成分、製剤、投与の種類等の好ましい態様に関しては、本発明に従った使用に関連して以前に説明されたものと同じ適用がなされる。

【００５２】最後に、しかしとりわけ本発明は、免疫親和性精製によって同一個体の抗体を含む体液から回収された抗体と樹状細胞がインビボにおいてインキュベートされた、エキソビボで培養された個体の単離樹状細胞を含む、薬学的組成物にも関連する。

【００５３】さらに、本発明はまた、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連
抗原またはそれらの断片を認識する抗体が、リガンドとして免疫親和性精製のために使用され、抗体を含む体液から、好ましくは同一個体の体液から免疫親和性精製によって得られた抗体を個体に投与する、癌に対する治療的または予防的なワクチン接種の方法にも関連する。

【００５４】さらに、本発明は癌に対する治療的または予防的ワクチン接種の方法に関連し、ここでエキソビボにて培養され、かつ抗体を含む体液から免疫親和性精製によって得られた抗体と事前にインビトロでインキュベートされた、自己由来の単離された樹状細胞を個体に投与し、ここで同じイディオタイプをもつ1つまたは複
数の腫瘍関連抗原またはそれらの断片を認識する抗体は、リガンドとして免疫親和性精製のために使用される。

【００５５】本発明に従った使用に関連して以前に説明されたのと同じものが、好ましい態様に適用される。

【００５６】本発明はまた、同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原また
はそれらの断片を認識する抗体が、リガンドとして免疫親和性精製に使用され、免疫親和性精製によって抗体を含む体液から抗体が回収される点で特徴付けられる、抗体調製物の産生方法にも関連する。

【００５７】本発明に従った使用に関連して以前に説明されたのと同じものが、腫瘍関連抗原と同様に、リガンドとして使用される体液、抗体に適用される。

【００５８】免疫親和性精製は当業者に公知の方法に従って実施できる。この場合、また本発明に従った使用に関連して以前に挙げられたのと同じものが適用される。

【００５９】本発明の方法の好ましい態様においては、異なる腫瘍関連抗原および／またはそのような抗原のエピトープに対して向けられるいくつかの抗体が、同時に親和性精製に使用される。いくつかの抗体が親和性精製に使用されるアプローチにおいては、それらは同時または別々のいずれかで使用でき、免疫親和性精製は並行してまたは連続して実施できる、すなわち、異なるエピトープおよび／または抗原特異性を要求に従って組合わせることができる。これらの要件は異なる個々の腫瘍上の異なる抗原の発現から生じる。

【００６０】特に好ましい態様においては、免疫親和性精製においてモノクローナル抗体がリガンドとして使用され、さらにより好ましい態様においては、血清が体液として使用される。

【００６１】本発明の方法は好ましくは、癌に対する治療的または予防的ワクチン接種に適した薬学的組成物の産生に使用される、抗体調製物を調製する方法である。

【００６２】さらに、本発明は本発明の前述の抗体調製物の調製方法が実施され、このようにして得られた抗体調製物が、続いて薬学的に許容される担体および／または適切なワクチンアジュバントを用いて製剤化される、薬学的組成物の調製方法に関連する。

【００６３】好ましい態様において、抗体調製物はアジュバントと、好ましくはアルミニウムを含むアジュバントと混合され、次に好ましくは70℃から121℃の温度におい
て熱処理に供される。

【００６４】本発明に従った使用に関連して以前に挙げられたのと同じものが、そのような薬学的製剤またはワクチン製剤の好ましい態様に適用される。

【００６５】本出願において引用される、あらゆる特許、刊行物またはデータバンク登録の開示の内容は、それにより、その全体が参照として本出願の開示内容に組み入れられる。

【００６６】以下の材料は、本発明をより詳しく例示するが限定するものではない、下記の実施例において使用された：マイクロタイタープレート： ELISAのためのイムノプレートF96マキシソープ（Immuno Plate F96 MaxiSorp）
（Nunc）細胞ELISAのための細胞培養クラスター（Coster; カタログ番号3598）細胞株： KATOIII：ヒト胃癌細胞株（ATCC HTB 103）連結（coupling）緩衝液： 0.1 M NaHCO₃ 0.5 M NaCl pH 8.0 精製緩衝液A：不完全PBS 0.2 M NaCl 精製緩衝液B： 0.1 M グリシン／HCl 0.2 M NaCl pH 2.9 培地A： RPMI 1640+2 g/l NaHCO₃ 100 U/ml ペニシリンG 100μg/ml 硫酸ストレプトマイシン 4 mMグルタミン 10％ウシ胎仔血清（熱不活化）結合緩衝液： 15 mM Na₂CO₃ 35 mM Na₂CO₃ 3 mM NaN₃ pH :9.6 不完全PBS（不完全PBSicient）（def）： 138 mM NaCl 1.5 mM KH₂PO₄ 2.7 mM KCl 6.5 mM Na₂HPO₄ pH :7.2 固定溶液：生理食塩水中の0.1％グルタルジアルデヒト洗浄緩衝液A：不完全PBS中の 2％ NaCl 0.2％トリトンX-100 洗浄緩衝液B：不完全PBS中の0.05％トゥイーン 20 ブロッキング緩衝液A：不完全PBS中の 5％ウシ胎仔血清（熱不活化）ブロッキング緩衝液B：不完全PBS中の 1％ウシ血清アルブミン 0.1％ NaN₃ 希釈緩衝液A：不完全PBS中の 2％ウシ胎仔血清（熱不活化）希釈緩衝液B：不完全PBS 染色緩衝液： 24.3 mM クエン酸 51.4 mM Na₂HPO₄ pH :5.0 基質： 40 mg ジヒドロ塩化o-フェニレンジアミン 100 ml 染色緩衝液 20μl H₂O₂（30％）停止溶液： 4 N H₂SO₄ 製剤緩衝液： 10％不完全PBS、pH=6.0 90％生理食塩水

【００６７】実施例1 TAA特異的な抗体を用いた免疫親和性カラムの調製 7.5 gのCH-セファロース 4B（Pharmacia）を20 mlの1 mM HCl中に15分間懸濁
した。その後ゲルを1lの1 mM HCl、続いて200 mlの連結緩衝液によって焼結ガラスのAG3フィルター上で洗浄した。100 mgのマウス抗体17-1A（Panorex, 保存溶
液 10 mg/ml；腫瘍関連抗原Ep-CAMに対して向けられる）を5 lの連結緩衝液に対して透析し、連結緩衝液を用いて5 mg/mlにまで調整した。この溶液を密閉容器
内でゲル懸濁液と混合した。連結に適した懸濁液は、ゲル対緩衝液1：2の比率で得られる。この懸濁液を4℃にて24時間回転させた。次に、過剰なリガンドを30 mlの連結緩衝液を用いて3回洗い流した。残りの反応基は1 Mのエタノールアミンを用いた4℃における1時間のインキュベーションによってブロックした。その後、ゲルを0.1 MのTris-HCl緩衝液と共に室温にて1時間回転させた。最後に、ゲルをpH値を変化させながら3サイクルの緩衝液によって洗浄した。各サイクルは、0 .5 MのNaClを含むpH 4の0.1 Mの酢酸ナトリウム緩衝液、および続いて、0.5 Mの NaClを含むpH 8の0.1 MのTris-HCl緩衝液からなる。ゲルを4℃にて保存した。

【００６８】実施例2 免疫親和性クロマトグラフィーによる、血清由来の抗体分画の免疫親和性精製
10 mlの末梢血をアカゲザルから採取し、そこから血清を回収した。全ての手
順は無菌条件下において行った。

【００６９】 FPLCシステム（Pharmacia）において免疫親和性精製を実施した。実施例1に従って得られた1 mlのゲルをPharmaciaによるHR5/5カラムの中に充填した。5 mlの血清を、精製緩衝液Aを用いて1：10に希釈した。この溶液をカラム上に1 ml/分
で注入し、次に検出器のUVが基線（280 nm）に再度到達するまで精製緩衝液Aで
洗浄した。結合した免疫グロブリンを精製緩衝液Bによって溶出し、脱着直後に
分画を1 MのNa₂HPO₄を用いて中和した。図1はこの精製のクロマトグラムを示す
（UV 280 nm）。

【００７０】このように精製された50μlの抗体分画をサイズ排除カラム（SEC, Zorbax 250 GF）で分析した。220 mMリン酸緩衝液、pH 7+10％のアセトニトリルを流出剤として使用した。この分析のクロマトグラムからわかるように（図2）、抗体分画
はIgMおよびIgGを約3：2の比率で含む。抗体分画の全量は約40μgであった（サ
イズ排除精製(SEC)により標準と比較して測定された）。このようにして得られ
た抗体分画をELISAにおいて、抗体17-1A（親和性精製のリガンドとして使用された）への結合に関して試験した：腫瘍関連抗原に対して向けられ、かつ親和性精製のために使用された抗体の100μlアリコート（抗体17-1A；結合緩衝液に溶解
した10μg/mlの溶液）を、マイクロタイタープレートのウェル中で37℃にて1時
間インキュベートした。洗浄緩衝液Aによってプレートを6回洗浄した後、200μl のブロッキング緩衝液Aを加え、37℃にて30分間インキュベートした。上記のよ
うにプレートを洗浄した後、同じ濃度で陰性対照として通常のヒト免疫グロブリンと同様に試験される、親和性精製された抗体分画の100μlアリコートを、希釈緩衝液A中の1：4から1：65,000の希釈溶液中で、37℃にて1時間インキュベート
した。上記のようにプレートを洗浄した後、100μlのペルオキシダーゼに連結されたヤギ抗ヒトIg抗体（Zymed）を、希釈緩衝液Aに1：1,000の希釈度で加え、37 ℃にて30分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液Aで4回、染色緩衝液で 2回洗浄した。100μlの特異的基質を加えることによって、抗体の結合を検出し
、50μlの停止溶液を加えることによって、約3分後に呈色反応を停止させた。49 0 nmの波長において吸光度（OD）を測定することによって評価を行った（参照測定の波長は620 nmである）。

【００７１】図3において認められるように、親和性精製された抗体分画は抗体17-1Aに著しく結合した一方、通常のヒト免疫グロブリンは実質上結合しない。

【００７２】実施例3 精製された抗体を用いたワクチンの製剤化親和性精製によって得られた抗体分画を、以下の指示に従い水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いて製剤化した： 1 mgの水酸化アルミニウム（水性懸濁液；Alhydrogel、Superfos）を、親和性クロマトグラフィー後に得られた3 mlの抗体溶液（約40μgの抗体を含む）に加え
、「FILTRON」遠心分離バイアル（Microsep（商標）、10 KD分離）中で懸濁液を 4,000×gで30分間遠心分離した。続いて、1 mlの製剤緩衝液によって溶液を2回
懸濁し、4,000×gで30分間遠心分離した。懸濁液を製剤緩衝液で0.5 mlに満たし、このようにして得られた懸濁液を無菌的手法で充填した。

【００７３】実施例4 免疫親和性精製した自己由来の抗体を用いたアカゲザルの免疫化実施例2および実施例3において説明されるようにその血清からワクチンを得た個々のアカゲザルの背中に、このワクチンを用いて皮下にワクチン接種した。この最初のワクチン接種の前に、血清の回収のために5 mlの血液を採取した（免疫応答の評価のための開始値を決定するため）。その2週間後に、血清の回収のた
めに10 mlの血液を再度採取した。この血清4 mlを用いて、上記のように自己由
来のワクチンの回収を繰り返した。新たに得られたワクチンを再度、アカゲザルの背中に皮下注射した。このワクチン接種の4週間後、血清の回収のために再度5 mlの血液を採取した（2回のワクチン接種の効果を判断するため）。

【００７４】このアカゲザルの前血清（pre-serum）および2回目のワクチン接種から4週間
後の免疫血清を、抗体がKATOIII細胞株上において結合しているか否かについて
、細胞ELISAにおいて分析した。このために、以下の段階を行った：マイクロタイタープレートのウェルに、培地A中で2×10⁶細胞／mlの濃度のKATOI II細胞株の細胞懸濁液100μlを入れて、37℃にて一晩インキュベートした。上清を吸い取った後、プレートをウェル当たり50μlの固定溶液と室温にて5分間インキュベートした。上清を吸い取った後、200μlのブロッキング緩衝液Bを各ウェ
ルに添加し、プレートを室温にて1時間インキュベートした。200μlの洗浄緩衝
液Bによってそれを2回洗浄した後、試験するサル血清の100μlアリコートを、希釈緩衝液B中の1：4から1：56,000の希釈溶液中で、37℃にて1時間インキュベー
トした。100μlの氷冷洗浄緩衝液Bでプレートを2回洗浄した後、希釈緩衝液A中
の1：1,000の希釈溶液中の、ペルオキシダーゼに連結されたヤギ抗ヒトIg抗体（ Zymed）100μlを加え、37℃にて45分間インキュベートした。100μlの氷冷洗浄
緩衝液Bでプレートを3回洗浄した。100μlの特異的基質を添加することにより、抗体の結合を検出し、50μlの停止溶液を添加することにより、約5分後に呈色反応を停止させた。490 nmの波長における吸光度（OD）を測定することにより、評価を行った（基準測定の波長は620 nmである）。

【００７５】図4からわかるように、自己由来の方法によりワクチン接種されたアカゲザル
の免疫血清において免疫グロブリンが存在し、これらの免疫グロブリンはKatoII I腫瘍細胞上において結合できる一方、同じ動物の前血清においてはそのような
抗体はほとんど検出できない。

【００７６】上記の実験の結果により、腫瘍関連抗原に対して向けられるモノクローナル抗体での免疫親和性精製によって得られた個別の自己由来の抗体分画を用いたワクチン接種が、該腫瘍関連抗原を発現するヒト腫瘍細胞上で結合する体液性免疫応答を誘発したことが、例示的に示され得る。

【００７７】実施例5： 2つの異なるTAA特異的抗体を用いた免疫親和性カラムの調製 EP-CAMに反応するモノクローナルマウス抗体およびルイスYに反応するモノク
ローナルマウス抗体の両方を、標準的な技術に従って、活性化されたCHセファロース4B（Pharmacia Biotech、スウェーデン）に連結した： 7.5 gのCHセファロース4Bを20 mlの1 mM HClにおいて15分間懸濁し、浸漬した。 1 lの1 mM HClでゲルを洗浄し、次に焼結ガラスのAG3フィルター上で200 mlの連結緩衝液で洗浄した。100 mgのマウス抗体（保存溶液 10 mg/ml）を、5 lの連結緩衝液に対して透析し、連結緩衝液で5 mg/mlに調節した。この溶液をゲル懸濁
液と密閉容器内で混合した。連結に適した懸濁液は、ゲル対緩衝液の比率1：2で得られる。この懸濁液を4℃にて24時間回転させた。その後、過剰なリガンドを3 0 mlの連結緩衝液で3回洗い流した。1 Mのエタノールアミンとの4℃における1時間のインキュベーションにより、残りの反応基をブロックした。その後、ゲルを 0.1 MのTris-HCl緩衝液と室温にて1時間回転させた。最後に、pH値を変えながらゲルを緩衝液で3サイクル洗浄した。各サイクルは、0.5 M NaClを含むpH 4の0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液、および続いて0.5 M NaClを含むpH 8の0.1 M Tris-HCl 緩衝液からなる。ゲルを4℃にて保存した。

【００７８】 2つの同一量の、2種類の親和基質を混合し、免疫親和性クロマトグラフィーのカラムとして充填した（System Akta Pharmacia、スウェーデン）。

【００７９】実施例6： 2つの異なるTAA特異的抗体を用いて、同時に行った免疫親和性精製による、サルの血清由来の抗体の精製約20 mlの血液をそれぞれ、免疫学的に未経験な（naive）アカゲザルから採取した。実施例5に記載された免疫親和性クロマトグラフィーのカラムを用いて、9 mlの血清をそれぞれ精製した（System Akta Pharmacia、スウェーデン）。

【００８０】適用のための緩衝液：精製緩衝液A

【００８１】溶出緩衝液：精製緩衝液B

【００８２】溶出液を0.5 Mのリン酸水素ナトリウム溶液によって中和した。

【００８３】精製されたタンパク質が高濃度で存在するように、溶出液を分別した。

【００８４】 50μlの精製した抗体分画を、サイズ排除カラム（SEC, Zorbax 250 GF）上で
分析した。220 mMのリン酸緩衝液、pH7+10％アセトニトリルを流出剤として使用した（流速：1.000 ml/分；波長214 nm）。この分析のクロマトグラムからわか
るように（図5）、抗体分画はIgM（保持時間 6.963分）およびIgG（保持時間 8. 745分）を約3：2の比率で含む。抗体分画の総量は約50μgであった（SECによっ
て標準と比較して測定された、図6）。

【００８５】実施例7：精製した抗体由来のワクチンの異なる製剤化ワクチンは遠心分離のための限外ろ過ユニット（Centricon 10；Amicon, USA
）において製剤化される。このために、1 mMのリン酸ナトリウム緩衝液、0.86％のNaCl、pH 6.0（NBK）を用いて、遠心分離により限外ろ過ユニットを洗浄した
。

【００８６】その後、1 mlの緩衝液（NBK）をユニットに満たし、37μlのAlhydro gel2％（ Superfos Biosector、デンマーク）を加えた。

【００８７】実施例6の中和した溶出液を加えた後、Centriconの使用説明書に従って遠心分離および洗浄（緩衝液5 mlを用いて）を行った。

【００８８】その後、ワクチンを再懸濁し、緩衝液で550μlまでに満たし、無菌的手法で充填した。

【００８９】または、ワクチンは再懸濁後に緩衝液で545μlまでに満たし、5.5μlのチメロサール保存溶液（10 mg/ml, Sigma, USA）を加えた。

【００９０】ワクチン製剤の第3の変型は、無菌的手法でガラスバイアルに充填した後、オ
ートクレーブで熱変性させた（121℃；20分間）。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 16/42 16/42 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ハイムラーゴットフリートオーストリア共和国ウィーンカロルドカッセ 29 Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AC20 BA30 CA24 CA45 4C085 AA03 AA04 AA14 BB01 CC03 CC13 DD86 EE06 FF13 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 EA22 EA28 EA51 FA71 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原ま
たはそれらの断片を認識する抗体が免疫親和性精製のためのリガンドとして使用
され、抗体を含む体液から免疫親和性精製によって抗体が回収される点で特徴付
けられる、癌に対する治療的または予防的なワクチン接種のためのワクチンとし
て適した薬学的組成物の産生のための抗体の使用。
【請求項２】自己由来の個別のワクチンという意義で、薬学的組成物がそ
の体液から抗体を得た個体へ投与されることが意図される、請求項1記載の使用
。
【請求項３】体液が血清である、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】個体がヒトである、請求項1から3のいずれか一項記載の使用
。
【請求項５】異なる腫瘍関連抗原に対して、および／またはそのような抗
原の異なるエピトープに対して向けられるいくつかの抗体が、免疫親和性精製の
ために同時に使用される、請求項1から4のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】免疫親和性精製のためのリガンドとして使用される抗体がモ
ノクローナル抗体である、請求項1から5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】薬学的組成物が繰り返し調製され、その後適切な間隔で繰り
返される個別のワクチンとして投与されることが意図される、請求項1から6のい
ずれか一項記載の使用。
【請求項８】腫瘍関連抗原が、上皮起源の癌細胞上または神経内分泌起源
の癌細胞上または造血系の癌細胞上でしばしば発現される、および／または共発
現される膜局在性（membrane-located）分子である、請求項1から7のいずれか一
項記載の使用。
【請求項９】免疫親和性精製により精製された抗体またはそれらの誘導体
が適切なワクチンアジュバントと共に製剤化される（formulated）、請求項1か
ら8のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】組成物が免疫応答を増強し、かつ抗体として同時に投与さ
れるタンパク質をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】タンパク質がヒトタンパク質である、請求項10記載の使用
。
【請求項１２】ヒトタンパク質が顆粒球マクロファージ刺激因子（GM-CSF
）である、請求項11記載の使用。
【請求項１３】組成物が免疫親和性精製によって精製された抗体の、皮下
注射または筋肉内注射によるワクチンとしての投与に適している、請求項1から1
2のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】組成物に含まれる抗体がアジュバントと混合され、かつ熱
処理に供される、請求項1から13のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】樹状細胞が、同じ個体の抗体を含む体液から免疫親和性精
製によって得られた抗体と事前にインビトロでインキュベートされ、同じイディ
オタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原またはそれらの断片を認識する抗
体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして使用される、癌に対する治療的ま
たは予防的なワクチン接種のためのワクチンとして適した薬学的組成物の産生の
ための、単離されエキソビボで培養された個体の樹状細胞の使用。
【請求項１６】同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原
またはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして
使用される、抗体を含む体液から免疫親和性精製によって得られた抗体を含む、
薬学的組成物。
【請求項１７】樹状細胞が、同じ個体の抗体を含む体液から免疫親和性精
製によって得られた抗体と事前にインビトロでインキュベートされ、同じイディ
オタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原またはそれらの断片を認識する抗
体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして使用される、単離されエキソビボ
で培養された個体の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】同じイディオタイプをもつ1つまたは複数の腫瘍関連抗原
またはそれらの断片を認識する抗体が、免疫親和性精製のためのリガンドとして
使用され、抗体を含む体液から免疫親和性精製によって抗体が回収される点で特
徴付けられる、抗体調製物の産生方法。
【請求項１９】異なる腫瘍関連抗原に対して、および／またはそのような
抗原のエピトープに対して向けられるいくつかの抗体が、親和性精製のために同
時に使用される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】親和性精製に使用される抗体がモノクローナル抗体である
、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】体液が血清である、請求項18から20のいずれか一項記載の
方法。
【請求項２２】抗体調製物が請求項18から21のいずれか一項記載の方法に
従って調製され、かつこのようにして得られた抗体調製物が薬学的に許容される
担体および／または適切なワクチンアジュバントと共に製剤化される点で特徴付
けられる、薬学的組成物の産生方法。
【請求項２３】抗体調製物がアジュバントと混合され、かつ熱処理に供さ
れる、請求項22記載の方法。