JP2003511021A - 微生物を検出するためのデバイスおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 活性化可能なシールによって分離された少なくとも２つのチャンバを含むデバイスであって、シールの活性化時に前記２つのチャンバは連通し、さらに、前記デバイスの少なくとも１つのチャンバは生物学的アッセイ試薬を含む、デバイスおよびこれを用いた方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、微生物の検出、より詳細には、自蔵式アッセイデバイスならびに食
物、臨床標本、および環境サンプルなどのさまざまなサンプルにおける微生物を
検出および計数するための使用方法に関する。

【０００２】 背景 微生物、特に細菌の検出は、食品および飲料産業を含むさまざまな産業におい
て重要である。例えば、病原性細菌を対象に食物および水をスクリーニングする
必要性は、消費者の安全性を確実にするのに非常に重要である。特定の科の細菌
のレベルを決定することは、貯蔵寿命ならびに食品の微生物受容性ならびに食品
の製造において使用される加工装置および生材料の衛生状態を確立するために一
般に使用されるアプローチである。微生物感染の診断はまた、原因生物の検出に
依存する。

【０００３】 細菌を検出するための既知の多くの方法が存在する。例えば、細菌に感染する
ウイルスであるバクテリオファージを用いてもよい。バクテリオファージの存在
、感染された細菌、またはその欠如を検出してもよい。これらの既知の方法には
、さまざまな欠点がある。例えば、試験しようとするサンプルまたは使用される
装置は、サンプルの操作中に汚染し得る。もう１つの問題は、関連する検出デバ
イスの使用の簡便さに関与する。遭遇するさらなるもう１つの問題は、微生物を
検出するのに掛かる時間である。さらなるもう１つの潜在的問題は、周囲環境の
特定の感染を防止するためのアッセイの成分（例えば、ファージまたはヘルパー
細菌など）の汚染に関与する。

【０００４】 概要 本発明は、微生物、特に細菌の検出のためのアッセイに関する問題の取り扱い
を最小限にすることを助けるデバイスおよび方法を提供する。デバイスおよび方
法は、使用するのに相対的に容易である。本発明の好適な実施態様では、方法お
よびデバイスは、相対的に迅速かつ正確な結果のためのファージの増幅を使用す
る。従って、本発明のデバイスおよび方法を使用して、相対的に迅速かつ正確な
結果を提供する自蔵式で使用に容易なユニットにおいて微生物の検出を行うこと
ができる。

【０００５】 １つの態様では、本発明は、活性化可能なシールによって分離された少なくと
も２つのチャンバを含むデバイスを提供し、ここで、シールの活性化時に前記２
つのチャンバは連通している。好ましくは、活性化は、シールを回転する（例え
ば、傾斜させる）か、シールを破砕するか、またはそうでなければシールをゲー
ト制御もしくは開放することによって生じ得る。デバイスの少なくとも１つのチ
ャンバは生化学的アッセイ試薬を含む。

【０００６】 もう１つの態様では、本発明は、活性化可能なシールによって分離された少な
くとも２つのチャンバを含むデバイスを提供し、ここで、少なくとも１つのチャ
ンバは、バクテリオファージ、抗ウイルス剤、または細菌ヘルパー細胞を含む生
物学的アッセイ試薬を含む。

【０００７】 もう１つの態様では、本発明は、第１のチャンバはバクテリオファージを含み
、第２のチャンバは抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を
含む、それぞれが回転可能なシールによって分離された少なくとも３つのチャン
バを含むデバイスを提供する。好ましくは、前記第２のチャンバは前記第１のチ
ャンバと前記第３のチャンバとの間に配置され、回転可能なシールによって相互
に分離される２つのサブチャンバに分離され、ここで、各サブチャンバは異なる
抗ウイルス剤を含む。

【０００８】 さらにもう１つの態様では、本発明は、微生物の存在または非存在を検出する
ための方法であって、活性化可能なシールによって相互に分離される少なくとも
２つのチャンバを含むデバイスを提供し、少なくとも１つのチャンバは生物学的
アッセイ試薬を含む工程、前記チャンバの少なくとも１つに、微生物を含むこと
が疑われるサンプルを添加する工程、１つ以上のチャンバ間のシールを活性化し
て、前記試薬と前記サンプルとの間の接触を可能にする工程、および前記サンプ
ル中の微生物の存在または非存在を検出する工程を含む、方法を提供する。

【０００９】 さらにもう１つの態様では、本発明は、細菌の存在または非存在を検出するた
めの方法であって、活性化可能なシールによって相互に分離される少なくとも３
つのチャンバを含むデバイスを提供し、第１のチャンバはバクテリオファージを
含み、第２のチャンバは抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細
胞を含み、前記第２のチャンバは前記第１のチャンバと前記第３のチャンバとの
間に配置される工程、バクテリオファージを含む前記第１のチャンバに標的細菌
を含むことが疑われるサンプルを添加する工程、前記バクテリオファージを前記
標的細菌に感染させる工程、前記第１のチャンバと前記第２のチャンバとの間の
シールを活性化して、抗ウイルス剤と細胞外バクテリオファージとの間の接触を
可能にする工程、前記第２のチャンバと前記第３のチャンバとの間のシールを活
性化して、細菌ヘルパー細胞と感染された標的細菌との間の接触を可能にする工
程、前記細菌ヘルパー細胞と前記感染された細菌とをインキュベートする工程、
および前記サンプル中の前記標的細菌の存在または非存在を検出する工程を含む
、方法を提供する。

【００１０】 好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、微生物（例えば、細菌、酵母、菌類、およびバクテリオファージな
どのウイルス）、特に細菌を検出するための方法ならびにデバイスを含む。好適
な実施態様では、本発明は、細菌を検出するためのファージの増幅の使用に関す
る。１つの態様では、該方法は、活性化可能なシール（即ち、漏れを防止するよ
うな２つのコンパートメントを分離するバルブなどのコンポーネント）によって
分離された少なくとも２つのチャンバを含むデバイスであって、ここで、シール
の活性化時に前記２つのチャンバは連通している、上記デバイスの使用を取り込
む。好ましくは、このデバイスはさまざまな形状の断面を有することができる管
の形態であるが、他の構築物（例えば、矩形もしくは円形管、平坦基板上のチャ
ンネル、またはマイクロ再生型構造）も想定される。このデバイスは、サンプル
の潜在的汚染を減少する。さらに、自蔵式であるため使用が簡便かつ容易である
。

【００１１】 本発明のデバイスおよび方法の好適な実施態様は、バクテリオファージと細菌
との間の相互作用を利用する。それらは、サンプル中の細菌またはバクテリオフ
ァージの試験および検出のために、細菌の抗細菌剤に対する感受性を決定するた
め、および／または殺ウイルス剤の有効性を決定するために使用することができ
る。定性試験および定量試験の両方を行うことができる。本発明のデバイスおよ
び方法を使用して、米国特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）に記載のよ
うな方法を実施することができる。

【００１２】 本発明の好適な方法は、バクテリオファージが細菌に感染する場合に生じる特
異的な認識／結合関係に基づく。バクテリオファージは自らの核酸を宿主細菌に
注入し、次いで、これは、産生される「ファージ」を複製するために使用され、
破壊時に宿主を開放し、次いで、さらなる細菌（例えば、ヘルパー細菌）に感染
する。一旦、ファージが細胞に特異的に感染し、自らの核酸を注入すると、ファ
ージは細胞外環境から保護される。従って、細菌に特異的に感染していないファ
ージを死滅させることができる。非結合ファージの除去または死滅は、さまざま
な方法によって達成することができる。これらには、例えば、殺ウイルス剤もし
くは熱の使用、またはファージの安定性に必須な化学物質の除去が含まれる。保
護され、複製および出現することが可能なバクテリオファージの数は直接検出さ
れるのに十分であり得る。あるいは、該数は、必要な時間（ファージの形成時間
が１時間未満であり、１０〜１０００子孫が産生されるため、これは短くあり得
る）だけ増殖している宿主に対してそれらを増加させることによって増幅させる
ことができる。上記は溶菌経路を示すファージについて説明しているが、当業者
であれば、本発明の方法およびデバイスにおいて溶原性ファージを用いることが
できることも認識するであろう。

【００１３】 ファージの検出は、多くの方法によって行うことができる。これらには、例え
ば、ファージのいくつかの成分に対する抗体を使用する、免疫学的方法、ファー
ジゲノムに対する核酸プローブを使用する方法、またはプラークアッセイによる
方法が挙げられる。あるいは、検出は、濁度変化、プラーク形成、および色、ル
ミネセンス、または蛍光の変化に関与し得る。１つの方法は、細菌がファージに
感染されるときに検出可能なシグナルを産生する能力を有するような遺伝子の改
変（容易に検出することができる表現型をコードする遺伝子）によって、細菌を
構築することができるという発見に基づいている。ファージは、シグナルの発生
を誘発し、従って、ファージの（即ち、ファージを保護した細菌の）存在を選択
的かつ容易に検出することができる。これらの細菌はレポーター細菌と呼ばれ、
米国特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）により詳細に記載されている。

【００１４】 好適な実施態様では、デバイスは、細菌（標的細菌）の検出に使用される。こ
れは、ファージを試験サンプルに添加して、試験サンプル中の標的細菌に感染さ
せ、抗ウイルス剤（または抗ウイルス剤の混合物）で細胞外バクテリオファージ
を死滅させ、抗ウイルス剤を（例えば、緩衝液で）中和し、バクテリオファージ
を増幅して、それによって、プラーク形成および細菌ヘルパー細胞の菌叢の助け
によりファージ感染された標的細菌からの検出を容易にすることによって行われ
る。このようなエンドポイントとしてのプラーク形成による細菌のファージ溶菌
サイクルを、以後「ファージ増幅アッセイ」（ＰＡＡ）と呼ぶ。そのようなアッ
セイで使用されるさまざまな試薬の相対量は当業者に公知であり、米国特許第５
，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）に開示されている。プラーク形成のアッセイ
結果は、典型的に約４時間〜約６時間内に容易に読み取ることができ、必要であ
れば２４時間で確認される。細菌を計数する従来の方法では、通常約２４時間〜
約４８時間の増殖が必要である。

【００１５】 標的細菌の検出に適切なバクテリオファージとしては、Ｃｏｌｉファージ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａファージ、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａ
ｃｔｅｒファージ、Ｂａｃｉｌｌｕｓファージ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓファ
ージ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓファージ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファー
ジ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍファージ、Ｓｈｉｇｅｌｌａファージ、Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓファージ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍファージ、お
よびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅファージが挙げられるが、これらに限定さ
れない。上記のファージは、典型的にアメリカンタイプカルチャーコレクション
から入手されるか、または自然から単離することができ、例えば、凍結乾燥され
たペレットの形で使用することができる。

【００１６】 本発明の方法およびデバイスでは、細胞外バクテリオファージを死滅させるた
めに適切な抗ウイルス剤が使用される。これらには、第一鉄塩、第一銅塩、葉抽
出物、ザクロ皮抽出物、および不飽和脂肪酸などの有機酸が挙げられるが、これ
らに限定されない。抗ウイルス剤の例は、国際公開ＷＯ９５／２２２５４および
米国特許第５，８４０，３０８号（Ｊａｓｓｉｍら）に開示されている。

【００１７】 バクテリオファージを増幅するために、好ましくは検出のための酵素を提供す
るために、適切な細菌ヘルパー細胞が使用される。そのような細菌ヘルパー細胞
は、標的細菌と同じであってもまたは異なるものであることができる。好ましく
は、それらは、それらが選択されたバクテリオファージに感染され得るように標
的細菌に緊密に関連するべきである。細菌ヘルパー細胞の例としては、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ
、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＶｉ
ｂｒｉｏ細菌、ならびにそれらの弱毒化バージョンが挙げられるが、これらに限
定されない。

【００１８】 そのようなファージ、抗ウイルス剤、および細菌ヘルパー細胞は、ここで使用
される生物学的アッセイ試薬である。本発明のデバイスおよび方法において使用
することができる他の生物学的アッセイ試薬としては、代謝調節因子、選択剤、
タンパク質、抗体、酵素基質、染料、色素、指示化学物質、栄養素またはそれら
の組み合わせが挙げられる。特定の検出可能な酵素を誘導するために代謝調節因
子を添加することができる。例としては、イソプロピルチオガラクトシドおよび
グルコースが挙げられるが、これらに限定されない。所望される細菌の増殖を選
択するために選択剤を添加することができる。例としては、胆汁酸ならびに特定
の染料および色素が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を添加し
て、抗ウイルス剤を中和することができる。例としては、ウシ血清アルブミンお
よび卵アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。抗体を使用して、フ
ァージ特異的タンパク質および内部タンパク質または他のペプチドを検出するこ
とができる。例としては、主要キャプシドタンパク質などの特異的タンパク質に
対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定
されない。酵素基質を使用して、色、ルミネセンス、または蛍光の生成によって
ヘルパー細胞から放出される酵素を検出することができる。例としては、米国特
許出願第０８／８４４，１４５号（Ｗｉｃｋｓら）に開示されたものが挙げられ
るが、これらに限定されない。栄養素を添加して、ヘルパー細菌細胞を含む細菌
の増殖を支持することができる。例としては、酵母抽出物、無機塩、微量元素、
および他の増殖培地またはそれらの成分が挙げられるが、これに限定されない。
染料および色素を添加して、プラークの可視化を援助することができる。例とし
ては、米国特許出願第０８／８４４，１４５号（Ｗｉｃｋｓら）に開示されたも
のが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ指示薬などの指示化学物質を添
加して、水素イオンを利用するかまたは生成する酵素反応の検出を援助すること
ができる。例としては、フェノールレッドおよびブロモチモールブルーなどのフ
スホンフタレインが挙げられるが、これらに限定されない。

【００１９】 このアッセイを実施するために使用されるデバイスは、ＰＰＡを行うための上
記で列挙した成分を含有するように特別に設計される。デバイスは多くの成分お
よび／またはコンパートメントを有することができ、該デバイスはこれらの材料
を分離し、所望であればアッセイを行うために混合することが可能である。本発
明に従って使用することができるデバイスの例は、米国特許第５，０６７，０５
１号（Ｌａｄｙｊｅｎｓｋｙ）、同第３，２９０，０１７号（Ｄａｖｉｅｓ）、
および同第５，５０８，８９３号（Ｎｏｗａｋ）に開示されている。

【００２０】 デバイスの成分は、シール（例えば、バルブ）を挿入することによって区画化
される。図１について述べると、デバイス１０は、シール１６によって分離され
た少なくとも２つのチャンバ１２および１４を含み、該シールは、シールの活性
化時に２つのチャンバ間の連通（好ましくは、流体連通）を可能にする。好まし
くは、活性化は、シールを回転する（例えば、傾斜させる）か、シールを破砕す
るか、またはそうでなければシールをゲート制御もしくは開放することによって
生じ得る。より好ましくは、シールの活性化は、シールが１片で残存するように
シールを回転する（例えば、圧力の適用時にシールは約９０度回転する）ことに
関与する。

【００２１】 デバイスの本体または壁は、さまざまな材料、特にデバイスのコンパートメン
ト内で試薬と有害な反応をしない有機高分子材料（例えば、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリブチレン、ポリ塩化ビニル、およびポリウレタン）から作製す
ることができる。デバイスは、好ましくは、透明、半透明、または不透明であり
得る可撓性材料から作製される。シールは、さまざまな材料、特にデバイスのコ
ンパートメント内で試薬と有害な反応をしない有機高分子材料（例えば、シリコ
ーン、ゴム、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル）から作製することができる。シー
ルは、膜、ディスク、バルブなどの形態であり得る。それらは、ディスクの本体
を形成する材料よりも剛性な材料から作製される。それらは、化学または機械的
技術を含むさまざまな技術（例えば、超音波圧接もしくは圧力定着）を使用して
、デバイスの本体の適切な場所に保持され得る。デバイスの本体は末端部を有し
ても、有していなくてもよく、また該末端部は密封またはキャップ付加されてい
ても、されていなくてもよい。そのような末端キャップは、デバイスの本体の一
部であるかまたは該本体からの分離物であり得る。例えば、該本体の材料と同じ
または異なる材料から作製されるキャップを使用することができる。

【００２２】 好適な実施態様では、デバイスは少なくとも３つのチャンバを含み、ここで、
少なくとも２つのチャンバは、活性化時に回転するシールによって分離される。
これらのチャンバの少なくとも１つは、微生物を検出するための１つ以上の生物
学的アッセイ試薬を含む。アッセイ試薬は液体物質であっても、また粉末のよう
な固体物質であってもよい。アッセイ試薬の例は上に記載されている。生物学的
アッセイ試薬のさまざまな組み合わせを本発明のデバイスにおいて使用すること
ができる。例えば、いずれか１つのチャンバにおいて、アッセイ試薬の混合物を
使用することができる。

【００２３】 引き続き図１について述べると、デバイスは、シール１６および２０によって
分離された少なくとも３つのチャンバ１２、１４、および１８を含み、該シール
は、隣接するチャンバ間の連通を可能にする。少なくとも１つの実施態様では、
成分は、個別のチャンバ中にバクテリオファージ、抗ウイルス溶液、および細菌
ヘルパー細胞を含む。具体的には、第１のチャンバ１２はバクテリオファージを
含み、第２のチャンバ１４は抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバ１８は細菌ヘ
ルパー細胞を含む。図１に示されるように、第２のチャンバ１４は、好ましくは
、第１のチャンバと第３のチャンバとの間に配置される。第２のチャンバ１４は
、２つのサブチャンバ２２および２４に分離することができ、各チャンバは異な
る抗ウイルス剤を含むことができ、シール２６によって相互に分離される。シー
ルを回転させることによって成分をともに混合することができ、２つ以上のチャ
ンバ内で成分を混合することが可能である。成分、例えば、抗ウイルス溶液の混
合は、本デバイス内で容易に行うことができる。抗ウイルス成分はウイルスを死
滅させるが、好ましくは、感染された標的細菌に害を及ぼさない。

【００２４】 微生物を検出する方法について本発明を行う場合、以下の工程が実施される。
上記のデバイスを提供する。好ましくは、デバイスは、活性化可能なシールによ
って相互に分離された少なくとも２つのチャンバを含み、ここで、少なくとも１
つのチャンバは生物学的アッセイ試薬を含む。より好ましくは、デバイスは、シ
ールによって相互に分離された少なくとも３つのチャンバを含み、ここで、第１
のチャンバはバクテリオファージを含み、第２のチャンバは抗ウイルス剤を含み
、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を含み、ここで、第２のチャンバは第１の
チャンバと第３のチャンバとの間に配置される。微生物、例えば、標的細菌細胞
を含むことが疑われるサンプルを第１のチャンバに添加する。必要であれば、時
間をおいて、サンプルが、第１のチャンバに存在する任意の生物学的圧制試薬と
相互反応するようにする。例えば、十分な時間をおいて、バクテリオファージを
標的細菌細胞に感染させる。あるいは、１つ以上のチャンバ間のシールを活性化
させて、試薬とサンプルとの間の接触を可能にする。さらに、試薬とサンプルと
の間の所望される連通のために、他のシールを順に活性化することもできる。例
えば、図１に示される好適なデバイスの第１のチャンバと第２のチャンバとの間
のシールを活性化して（例えば、回転させて）、抗ウイルス剤と細胞外バクテリ
オファージ（即ち、サンプル中の微生物に感染しなかったバクテリオファージ）
との間の接触を可能にする。続いて、第２のチャンバと第３のチャンバとの間の
シールを活性化して（例えば、回転させて）、細菌ヘルパー細胞と感染された標
的細菌細胞との間の接触を可能にする。必要であれば、細菌ヘルパー細胞および
感染された細菌細胞を、バクテリオファージを増幅させおよび／またはバクテリ
オファージ依存的シグナル（例えば、ルミネセンス）を発生させるのに十分な時
間だけインキュベートすることができる。

【００２５】 次いで、サンプル中の標的微生物の存在または非存在を検出することができる
。検出は、標準的な技術および器具を使用する濁度変化、プラーク形成、および
色、ルミネセンス、または蛍光形成に関与し得る。

【００２６】 細菌の検出について、ファージに基づく検出方法以外の方法を本発明に従って
使用することができる。例えば、インキュベーションおよび溶菌のために標的細
菌が誘導される第１のチャンバにおいて増殖培地などの生物学的アッセイ試薬な
らびに隣接する第２のチャンバにおいて指示染料などの第２の生物学的アッセイ
試薬を含むデバイスを使用して、コアグラーゼ陽性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓなどの細菌中の耐熱性ヌクレアーゼを検出することができる。もう１つの例と
して、インキュベーションのために標的細菌が誘導される第１のチャンバにおい
て増殖培地、隣接する第２のチャンバにおいてガラクトシダーゼ誘導剤、および
隣接する第３のチャンバにおいて検出のための酵素基質を含むデバイスを使用し
て、腸内細菌由来のガラクトシダーゼなどのタンパク質を検出することができる
。

【００２７】 細菌以外の微生物の検出のために、本発明のデバイスの使用についてさまざま
な公知の方法を適応することができる。例えば、酵母を含有することが疑わしい
サンプルを、酵母用増殖培地およびサンプル中の任意の細菌を死滅させるための
抗生物質を含む第１のチャンバを含有するデバイスに誘導し、次いでアルカリホ
スファターゼを検出するための基質を含有する第２のチャンバに誘導することに
よって、酵母を検出することができる。

【００２８】 実施例 以下の実施例は本発明の理解を助けるために提供されるものであって、本発明
の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。他に示さない限り、すべての
部および百分率は重量に基づく。

【００２９】 実施例１ ファージ増幅デバイス デバイスは、１２８ｍｍ長、外径６．３５ｍｍ、および管壁厚０．５ｍｍの円
筒形可撓性プラスチック（ポリプロピレン）管から構築した（図１を参照のこと
）。取り外し可能な中実プラスチックストッパーを使用して、デバイスの底部末
端および頂部末端の両方を塞いだ。１．９ｍｍの厚さおよび５．８５ｍｍの直径
を有する回転可能なシリコーンゴムディスク形状バルブによって、デバイスを４
つのチャンバに分離した。バルブは、最初は「閉鎖位置」（管壁に対して垂直で
隣接するチャンバを相互に密封している）にあったが、指をひねり、デバイスの
外面を操作することによって「開放位置」に対して約９０度回転させ得る。デバ
イスの４つのチャンバは、管の頂部のチャンバ１２（６１８ｍｍ^３）、チャンバ
１２に隣接するチャンバ２２（３０９ｍｍ^３）、チャンバ２２に隣接するチャン
バ２４（５３８ｍｍ^３）、および管の底部のチャンバ１８（１７４７ｍｍ^３）か
ら成った。バルブ２６はチャンバ２２および２４を分離し、バルブ１６はチャン
バ１２および２２を分離し、バルブ２０はチャンバ２４および１８を分離した。

【００３０】 実施例２ ファージ増幅デバイス 第２のデバイスは、１２８ｍｍ長、外径８．４ｍｍ、および管壁厚０．５ｍｍ
の円筒形可撓性プラスチック（ポリプロピレン）管から構築した（図１を参照の
こと）。取り外し可能な中実プラスチックストッパーを使用して、デバイスの底
部末端および頂部末端の両方を塞いだ。１．５ｍｍの厚さおよび７．９ｍｍの直
径を有する回転可能なＳＡＮＴＯＰＲＥＮＥ（登録商標）熱可塑性ゴムディスク
形状バルブによって、デバイスを４つのチャンバに分離した。バルブは、最初は
「閉鎖位置」（管壁に対して垂直で隣接するチャンバを相互に密封している）に
あったが、指をひねり、デバイスの外面を操作することによって「開放位置」に
対して約９０度回転させ得る。デバイスの４つのチャンバは、管の頂部のチャン
バ１２（１４７１ｍｍ^３）、チャンバ１２に隣接するチャンバ２２（５８８ｍｍ ^３ ）、チャンバ２２に隣接するチャンバ２４（６８６ｍｍ^３）、および管の底部
のチャンバ１８（２５４９ｍｍ^３）から成った。バルブ１６はチャンバ１２およ
び２２を分離し、バルブ２６はチャンバ２２および２４を分離し、バルブ２０は
チャンバ２４および１８を分離した。

【００３１】 実施例３ 細菌の検出および計数 サンプル中の細菌の検出および計数において使用するために、実施例１に記載
のファージ増幅のためのデバイス（ＰＡＤ）を構築した。しかし、構築中に、脱
イオン水中の硫酸第一鉄（製品番号２０７０−０１、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈ
ｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）の４．８ｍＭ溶液（０．５ｍｌ）をチャンバ２４
に添加し、抗ウイルス成分として作用させ、ザクロ皮抽出物（ＰＲＥ）の１３％
水溶液（０．２５ｍｌ）（国際公開ＷＯ ９５／２２，２５４（Ｓｔｅｗａｒｔ
ら）において記載のように調製した）をチャンバ２２に添加して、抗ウイルス成
分として作用させた。構築後、凍結乾燥されたＥ．ｃｏｌｉ，ＡＴＣＣ １３７
０６細菌のペレット（約１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）をチャンバ１８に添加して、
細菌「ヘルパー細胞」として作用させた。チャンバ１２は試験サンプルを収容す
るために空のままにし、すべてのバルブを最初は「閉鎖位置」に設定した。

【００３２】 １×１０^８ｃｆｕ／ｍｌを含有するＥ．ｃｏｌｉ，ＡＴＣＣ １３７０６の１
晩培養物をλ緩衝液（米国特許第５，４９８，５２５号（Ｒｅｅｓら）の実施例
４に記載のとおりに調製した）で１０倍段階希釈し、次いで、チャンバが約０．
１ｍｌの培養液を含有するように、該培養物をチャンバ１２に誘導した。このサ
ンプルに、１×１０^１１ｐｆｕ／ｍｌを含有するバクテリオファージ［φＸ １
７４（ＡＴＣＣ １３７０６−Ｂ１）］の栄養ブロス（製品番号４３１１４７９
，ＢＢＬ，Ｃｏｃｋｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）懸濁液の１０μｌを添加した。バク
テリオファージを、インキュベーター中３７℃で１０分間、細菌に吸着させた。
次いで、バルブ２６を開放し、チャンバ２２および２４の抗ウイルス成分を２３
℃で２分間混合させた。次いで、バルブを開放し、抗ウイルス溶液をチャンバ１
２の内容物と２３℃で５分間混合させることによって、非吸着バクテリオファー
ジを不活化した。次いで、バルブ２０を開放し、該溶液とチャンバ１８中の細菌
ペレットとを２３℃で５分間組み合わせることによって、得られた溶液を中和し
た。デバイス中の最終溶液を、４２℃で溶融状態に保持された２．５ｍｌの頂部
寒天（寒天重層法用標準栄養ブロス頂部寒天）を含有する滅菌スクリューキャッ
プ管（１６ｍｍ×１００ｍｍ）に移した。頂部寒天溶液を底部寒天プレート（標
準栄養寒天）上に注ぎ、３７℃で２４時間インキュベートした。６時間および２
４時間目のプラーク数を計数した。８つの系列希釈物（１０^−３〜１０^−１０）
の結果を表１に示す。

【００３３】 抗ウイルス成分によるバクテリオファージの死滅の有効性を実証するために、
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を最初のλ緩衝液サンプルに添加しなかったことを除いて、陰
性コントロールサンプル（Ｃ−１）を上記と同じ様式で作動させた。抗ウイルス
成分を利用しなかったことを除いて、陽性コントロールサンプル（Ｃ−２）を上
記（１０^−３希釈）と同じ様式で作動させた。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の各
段階希釈サンプルを標準ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）Ｅ．Ｃ．プレート（３
Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）上でプレート化し、製造者の指示
に従って（３７℃で２４時間）インキュベートした。コントロールサンプルおよ
びＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）プレートアッセイの結果も表１に示す。

【００３４】

【表１】 ¹ − pfu＝プラーク形成単位² − cfu＝コロニー形成単位³ − TNTC＝多数のため計数できず

【００３５】 表１のデータは、実施例１のデバイスを利用した結果（６時間および２４時間
目のｐｆｕの減少）は、標準ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）プレートアッセイ
から得られた結果（２４時間目のｃｆｕの減少）と極めて良好に相関することを
示す。ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）プレートアッセイに対するｃｆｕは、約
１２時間後までは認められなかったことに留意した。

【００３６】 実施例４ 細菌の検出および計数 実施例２に記載のファージ増幅のためのデバイス（ＰＡＤ）に、実施例３に記
載の試薬を充填し、次いで、実施例３に記載のＥ．ｃｏｌｉ細菌の検出および計
数のために利用した。ｐｆｕの数（「ＰＡＤ法」）およびｃｆｕの数（ＰＥＴＲ
ＩＦＩＬＭ（登録商標）プレート法）を計数した。８つの系列希釈物（１０^−３ 〜１０^−１０）の結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】 表２のデータは、実施例２のデバイスを利用した結果（６時間および２４時間
目のｐｆｕの減少）は、標準ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）プレートアッセイ
から得られた結果（２４時間目のｃｆｕの減少）と極めて良好に相関することを
示す。ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ（登録商標）プレートアッセイに対するｃｆｕは、約
１２時間後までは認められなかったことに留意した。

【００３９】 すべての特許、特許出願、および公開物のすべての開示内容は、あたかもそれ
ぞれが個別に組み入れられるように、本明細書において参考として援用される。
本発明のさまざまな改変および変更は、本発明の範囲および趣旨から逸脱するこ
となく当業者に明白であろう。本発明は、本明細書に記載の例示的実施態様およ
び実施例により過度に制限されることを意図しておらず、そのような実施例およ
び実施態様は、実施例のみによって示されると理解されるべきである。本発明の
範囲は、本明細書に記載の請求の範囲によってのみ制限されることが意図される
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のデバイスの好適な実施態様の略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゲイリー・イー・クレジカレック アメリカ合衆国55133−3427ミネソタ州セ ント・ポール、ポスト・オフィス・ボック ス33427 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA08 BB02 BB13 FA01 GB03

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 活性化可能なシールによって分離された少なくとも２つのチ
   ャンバを含むデバイスであって、前記シールの活性化時に前記２つのチャンバは
   連通し、少なくとも１つのチャンバは生物学的アッセイ試薬を含む、デバイス。
2. 【請求項２】 前記チャンバの少なくとも１つは液体物質を含む、請求項１
   に記載のデバイス。
3. 【請求項３】 前記シールの活性化時に前記２つのチャンバは流体連通して
   いる、請求項２に記載のデバイス。
4. 【請求項４】 前記チャンバの少なくとも１つは固体物質を含む、請求項１
   に記載のデバイス。
5. 【請求項５】 前記固体物質は粉末の形態である、請求項４に記載のデバイ
   ス。
6. 【請求項６】 前記生物学的アッセイ試薬は、バクテリオファージ、細菌ヘ
   ルパー細胞、代謝調節因子、選択剤、タンパク質、抗体、酵素基質、抗ウイルス
   剤、染料、指示化学物質、色素、栄養素、またはそれらの組み合わせを含む、請
   求項１に記載のデバイス。
7. 【請求項７】 前記チャンバの少なくとも２つは、活性化時に回転するシー
   ルによって分離される、請求項１に記載のデバイス。
8. 【請求項８】 第１のチャンバはバクテリオファージを含み、第２のチャン
   バは抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を含む、請求項７
   に記載のデバイス。
9. 【請求項９】 前記第２のチャンバは、前記第１のチャンバと前記第３のチ
   ャンバとの間に配置される、請求項８に記載のデバイス。
10. 【請求項１０】 前記シールの活性化は前記シールを回転させることを含む
    、請求項１に記載のデバイス。
11. 【請求項１１】 活性化可能なシールによって分離された少なくとも２つの
    チャンバを含むデバイスであって、少なくとも１つのチャンバは、バクテリオフ
    ァージ、抗ウイルス剤、および細菌ヘルパー細胞の群より選択される生物学的ア
    ッセイ試薬を含む、デバイス。
12. 【請求項１２】 前記生物学的アッセイ試薬は、バクテリオファージ、細菌
    ヘルパー細胞、代謝調節因子、選択剤、タンパク質、抗体、酵素基質、抗ウイル
    ス剤、染料、指示化学物質、色素、栄養素、またはそれらの組み合わせからなる
    群より選択される、請求項１１に記載のデバイス。
13. 【請求項１３】 前記シールは、活性化時に回転して、前記２つのチャンバ
    間の連通を可能にする、請求項１１に記載のデバイス。
14. 【請求項１４】 第１のチャンバはバクテリオファージを含み、第２のチャ
    ンバは抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を含む、少なく
    とも３つのチャンバを含む、請求項１１に記載のデバイス。
15. 【請求項１５】 前記第２のチャンバは、前記第１のチャンバと前記第３の
    チャンバとの間に配置される、請求項１４に記載のデバイス。
16. 【請求項１６】 前記第２のチャンバは、活性化可能なシールによって相互
    に分離される２つのサブチャンバに分離される、請求項１５に記載のデバイス。
17. 【請求項１７】 前記第２のチャンバの２つのサブチャンバは、それぞれ抗
    ウイルス剤を含む、請求項１６に記載のデバイス。
18. 【請求項１８】 前記チャンバの少なくとも１つは液体物質を含む、請求項
    １１に記載のデバイス。
19. 【請求項１９】 前記シールの活性化時に前記２つのチャンバは流体連通し
    ている、請求項１８に記載のデバイス。
20. 【請求項２０】 前記チャンバの少なくとも１つは固体物質を含む、請求項
    １１に記載のデバイス。
21. 【請求項２１】 第１のチャンバはバクテリオファージを含み、第２のチャ
    ンバは抗ウイルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を含む、それぞ
    れが回転可能なシールによって分離された少なくとも３つのチャンバを含むデバ
    イス。
22. 【請求項２２】 前記第２のチャンバは前記第１のチャンバと前記第３のチ
    ャンバとの間に配置され、回転可能なシールによって相互に分離される２つのサ
    ブチャンバに分離され、各サブチャンバは異なる抗ウイルス剤を含む、請求項２
    １に記載のデバイス。
23. 【請求項２３】 微生物の存在または非存在を検出するための方法であって
    、 活性化可能なシールによって相互に分離される少なくとも２つのチャンバを含
    むデバイスを提供し、少なくとも１つのチャンバは生物学的アッセイ試薬を含む
    工程、 前記チャンバの少なくとも１つに、前記微生物を含むことが疑われるサンプル
    を添加する工程、 １つ以上の前記チャンバ間の前記シールを活性化して、前記試薬と前記サンプ
    ルとの間の接触を可能にする工程、および 前記サンプル中の微生物の存在または非存在を検出する工程、 を含む、方法。
24. 【請求項２４】 細菌の存在または非存在を検出するための方法であって、 シールによって相互に分離される少なくとも３つのチャンバを含むデバイスを
    提供し、第１のチャンバはバクテリオファージを含み、第２のチャンバは抗ウイ
    ルス剤を含み、第３のチャンバは細菌ヘルパー細胞を含み、前記第２のチャンバ
    は前記第１のチャンバと前記第３のチャンバとの間に配置される工程、 バクテリオファージを含む前記第１のチャンバに標的細菌を含むことが疑われ
    るサンプルを添加する工程、 前記バクテリオファージを前記標的細菌に感染させる工程、 前記第１のチャンバと前記第２のチャンバとの間の前記シールを活性化して、
    前記抗ウイルス剤と細胞外バクテリオファージとの間の接触を可能にする工程、 前記第２のチャンバと前記第３のチャンバとの間の前記シールを活性化して、
    前記細菌ヘルパー細胞と前記感染された標的細菌との間の接触を可能にする工程
    、 前記細菌ヘルパー細胞と前記感染された細菌とをインキュベートする工程、お
    よび 前記サンプル中の前記標的細菌の存在または非存在を検出する工程、 を含む、方法。
25. 【請求項２５】 前記第２のチャンバは、シールによって相互に分離される
    ２つのサブチャンバに分離される、請求項２４に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記第２のチャンバの２つのサブチャンバは、それぞれ抗
    ウイルス剤を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記２つのサブチャンバ間のシールが活性化され、前記抗
    ウイルス剤と前記細胞外バクテリオファージとが接触する前に前記２つの抗ウイ
    ルス剤を混合することを可能にする、請求項２６に記載の方法。