JP2003510018A

JP2003510018A - マイコバクテリウム・ツベルクローシスｅｓａｔ−６遺伝子ファミリーベースの結核ワクチン及び診断法

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Publication number: JP2003510018A
Application number: JP2001509760A
Authority: JP
Inventors: アンデルセン，ペーター; スクジョ，リッケ
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 1999-07-13
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2003-03-18
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: AU2005201767B2; CA2378763A1; WO2001004151A3; AU779495B2; JP5010079B2; AU2005201767A1; WO2001004151A2; EP1200466A2; US7867502B1; AU5966400A; AU2008224343B2; AU2008224343A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、esat-6遺伝子のメンバーによってエンコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドフラグメントに関する。esat-6遺伝子ファミリーのメンバーは、小さなタンパク質をエンコードする遺伝子として定義され、そのような2つの遺伝子は、ゲノム上に互いに隣合って配置されており、少なくとも1つの遺伝子産物がRv3874、Rv3875又はRv0288のいずれかと少なくとも15%同一のアミノ酸配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野この発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tubercu
losis)由来の免疫学的に活性で、新規な幾つかのポリペプチドフラグメント、免
疫原性成分としてフラグメントを含むワクチン及び他の免疫組成物、及びポリペ
プチドの調製方法及び使用に関する。また、この発明は、この発明のポリペプチ
ドフラグメントの調製及びエム・ツベルクローシスでの感染診断に有用なエム・
ツベルクローシス由来の新規な核酸フラグメントに関する。

【０００２】発明の背景マイコバクテリウム・ツベルクローシスによって引き起こされるヒトの結核は
、WHOによれば年に約300万件の死亡の原因である深刻な全世界的な健康問題であ
る。新しいTB症例の世界的な発生率は最近10年間のあいだ徐々に低下していたが
、ここ数年間のこの傾向は、AIDSの出現及びエム・ツベルクローシスの多重薬剤
耐性株の発生により、著しく変化した。臨床上の使用に現在利用可能な唯一のワクチンはBCGで、このワクチンの効力
は依然として論議課題である。BCGは一般にTBの動物モデルに高レベルの後天的
耐性を誘発するが、発展途上国での幾つかのヒトの試験では、有意な保護を立証
できなかった。特に、BCGは合衆国での使用がFDAにより許可されていない。とい
うのは、BCGワクチン接種は、TB感染診断のためのツベルクリン皮膚試験の特異
性を損なうためである。

【０００３】このため、TBに対して新規かつ改良されたワクチンの開発が緊急の課題となっ
ており、WHOによって極めて高い優先性が示されている。保護マイコバクテリア
物質を明らかにするための多くの試みがなされており、1950〜1970年に数人の研
究者が実験的なワクチン接種後の耐性の増加を報告した。しかし、BCGの効能で
の特異的な長期間にわたる保護免疫応答の立証は、いまだなされていない。エム・ツベルクローシスに対する免疫は、3つの基本的な特徴によって特徴付
けられる; 1) 生細菌は、効果的に保護免疫応答を誘発する; 2) 特異的に感作さ
れたTリンパ球は、この保護を媒介する、及び3) 最も重要な媒介分子はインター
フェロンガンマ(IFN-γ)と思われる。エム・ツベルクローシスは、新しい結核(TB)ワクチンの形成を潜在的に示す幾
つかのタンパク質を保持し、ならびに分泌する。数年のあいだ、主な努力は、TB
に対する新しいワクチンの開発のため新しい保護抗原を同定することに向けられ
た。候補分子の研究は、最初は分裂細菌から放出されるタンパク質に焦点を絞っ
た。幾つかの分子が、このマイコバクテリアタンパク質画分から同定され、特徴
付けられた。培養ろ液由来のある低分子質量タンパク質、ESAT-6は、結核(TB)患
者由来のヒト末梢血液単核細胞(PBMC)の刺激に使用される際に特別な潜在性のIF
N-γインデューサーであることが見出された(Ravnら、 1999)。

【０００４】エム・ツベルクローシスゲノムの全シーケンシングにより、幾つかの重要な知
見がもたらされた。興味深い内容は、効力のあるT-細胞抗原ESAT-6は別の低質量
タンパク質(CFP10)とともに転写されるという知見であった。これらの2つのタン
パク質をエンコードする遺伝子は、言い換えれば、同じオペロンに位置するマイ
コバクテリアゲノム上で互いに隣合うことが見出され、同じプロモーターで制御
された。2つの遺伝子は、約40％の配列同一性を有する。アミノ酸レベルでは、
配列同一性は約15％であった。タンパク質は、大きさとpIがほぼ同じであった。

【０００５】推定上の幾つかのオープンリーディングフレーム(ORF)とともに、これらの2つ
の分子は、esat-6遺伝子ファミリーと称されるものを構成している(Coleら、199
8, Berthetら、1998)。このファミリーの遺伝子は全て、低質量タンパク質をエ
ンコードしており、これらはESAT-6 及びCFP10のようにオペロン様構造に位置し
ている。ファミリーは、最初にColeら(1998)により以下の言葉: 「おそらくはSe
c-独立の手法で分泌される、効力のあるT-細胞抗原ESAT-6は、多重遺伝子ファミ
リーのメンバーでエンコードされている。遺伝子の関連試験は、輸送体として作
用しうる大きなATP-加水分解性膜タンパク質をエンコードする遺伝子を含む幾つ
かの同じく組織化されたオペロンを示している」で記載され、その後、Berthet
ら(1998)によって、以下:「esat-6との弱い類似性を共有する幾つかの遺伝子は
、エム・ツベルクローシスのゲノムシーケンシング計画中に先に同定された。こ
れらの遺伝子は互いに35％未満の配列類似性を共有するが、それらは全て約100
アミノ酸の小さなポリペプチドを潜在的にコードしているので、esat-6遺伝子フ
ァミリーに分類された。これらの遺伝子は全てオペロン様構造に組織化され、PE
及びPPEファミリーの反復タンパク質をエンコードする遺伝子によって頻繁に先
行される」のように記載された。

【０００６】もっとも初期段階でのエム・ツベルクローシスの診断は、疾患の有効な治療に
重要である。エム・ツベルクローシス感染を決定付ける現在の診断アッセイは高
価で、大きな労働力を要する。世界の一部では、エム・ツベルクローシスに暴露
された大多数の患者は胸部x-線を受け、唾液試料から細菌をインビトロで培養す
る試みがなされている。診断アッセイとしてのX-線は無感覚で、極めて進行した
段階でしか感染を同定できない。エム・ツベルクローシスの培養は、診断ツール
としても理想的ではない。なぜなら、細菌は体外で不完全かつゆっくり成長し、
このため偽陰性の試験結果を生じ、結果を得るまでに数週間を要するからである
。世界の第三国で用いられる安価なアッセイは、標準的なツベルクリン皮膚試験
である。それはエム・ツベルクローシス感染個体をエム・ボビス(M. bovis)BCG
のワクチン接種個体と区別できず、そのためにエム・ツベルクローシスに関連し
た細菌株でのワクチン接種(BCGワクチン接種)を受けるか、又は子供時代に受け
た地域世界で使用できないため、感染の検出において少しも理想的ではない。

【０００７】発明の要約最も広い観点において、この発明は、esat-6遺伝子ファミリーのメンバーによ
ってエンコードされるアミノ酸配列からなるか、又はesat-6遺伝子ファミリーの
メンバーによってエンコードされるポリペプチドフラグメントと少なくとも70％
の配列同一性を有し、同時にesat-6遺伝子ファミリーのメンバーによってエンコ
ードされるポリペプチドフラグメントに免疫学的に等価なアミノ酸類似体からな
る、実質的に純粋なポリペプチドフラグメントに関する。esat-6遺伝子ファミリ
ーのメンバーは、小さなタンパク質をエンコードする遺伝子として定義され、2
つのかかる遺伝子はゲノム上で互いに隣合って配置され、遺伝子産物の少なくと
も1つはRv3874、Rv3875又はRv0288のいずれかと少なくとも15％のアミノ酸配列
同一性を有する。現在、以下の遺伝子がesat-6遺伝子ファミリーのメンバーであ
る: Rv0287、 Rv0288、 Rv1036c、 Rv1037c、 Rv1038c、 Rv1197、 Rv1198、 Rv
1792、 Rv1793、 Rv2346c、 Rv2347c、 Rv2348c 、Rv2653c、 Rv2654c、 Rv3019
c、 Rv3020c、 Rv3444c、 Rv3445c、 Rv3619c、 Rv3620c、 Rv3874、 Rv3875、
Rv3890c、 Rv3891c、 Rv3904c及び Rv3905c。これらのタンパク質は、マクロファージ食胞の細胞内環境に関連し得る重要な
マイコバクテリアの特異的な機能を有している。さらに、それらは、実施例1、3
a 及び 3bに記載するように、高い免疫学的効力を示す。したがって、それらは
、TBに対するワクチン又はTB用の診断調製物の有用な候補として提案される。こ
れらのタンパク質をエンコードする遺伝子は、TBに対するDNAワクチンの成分と
して提案される。

【０００８】発明の詳細な開示この明細書及び請求の範囲において、用語「ポリペプチドフラグメント」又は
その変形は、少なくとも2アミノ酸残基、多くて10アミノ酸残基の短いペプチド
、オリゴペプチド(11〜100アミノ酸残基)及びより長いペプチドを意味する。ポ
リペプチドフラグメントは、グリコシル化により、脂質化により、あるいは置換
基からなることにより化学的に修飾されていてもよい。この明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチドフラグメント」は、
自然に結合する他のポリペプチド物質を多くて5重量％含むポリペプチド調製物
を意味する(他のポリペプチド物質についてはより低い％、例えば多くて4％、多
くて3％、多くて2％、多くて1％及び多くて1/2％が好ましい)。実質的に純粋な
ポリペプチドは、少なくとも96％純粋、つまりポリペプチドが調製物中の全ポリ
ペプチド物質の少なくとも96重量％を構成することが好ましい。％は高い方が好
ましく、例えば少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも
99,25％、少なくとも99,5％及び少なくとも99,75％である。ポリペプチドフラグ
メントは「本質的に純粋な形態」、つまりポリペプチドフラグメントが自然に結
合するいずれかの他の抗原、つまり結核複合体に属する細菌由来のいずれかの他
の抗原を本質的に有しないことが好ましい。これは、後述する非マイコバクテリ
ア宿主細胞における組換え手段によりポリペプチドフラグメントを調製すること
によって、又は固相もしくは液相ペプチド合成の周知方法、例えばMerrifieldに
より記載される方法あるいはその変形でポリペプチドフラグメントを合成するこ
とによって、行うことができる。

【０００９】「結核複合体」はその通常の意味を有する。つまり、TBを引起こすマイコバク
テリア複合体には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウ
ム・ボビス、マイコバクテリウム・ボビスBCG及びマイコバクテリウム・アフリ
カヌム(Mycobacterium africanum)がある。用語「毒性マイコバクテリア」によれば、ヒトを含む哺乳動物で結核疾患を引
起こし得る細菌と理解される。毒性マイコバクテリアの例は、エム・ツベルクロ
ーシス、エム・アフリカヌム及びエム・ボビスである。用語「TB患者」によれば、毒性マイコバクテリアでの感染が培養又は顕微鏡学
的に明らかにされた個体、及び/又はTBと臨床的に診断された個体及び抗-TB化学
療法に感受性の個体と理解される。TBの培養、顕微鏡及び臨床的な診断は、当業
者に周知である。用語「PPD陽性個体」によれば、マントー試験が陽性の個体又はPPDが末梢血液
単核細胞(PBMC)もしくは血液全体からの少なくとも1,000pg/mlのINF-γの放出に
よって測定される回収反応(recall reaction)のインビトロでの増加を誘発する
個体と理解される。誘発は、約1.0〜2.5 x 10⁵PBMCからなる懸濁液に2.5〜5 μ
gのPPD/mlを加えて行われる。IFN-γの放出は、懸濁液にPPDを添加してから5日
後に回収される上清中のINF-γを、PPDを加えないINF-γの放出と比較した測定
によって評価される。

【００１０】用語「遅延型過敏反応」によれば、ポリペプチドの注射後又は皮膚への塗布後
に誘発されるT-細胞介在性炎症反応が理解される。この炎症反応は、ポリペプチ
ドの注射又は塗布から72〜96時間後に現れる。用語「IFN-γ」によれば、インターフェロン-ガンマが理解される。この明細書をとおして特記しない限り、用語「包含する」、又は「含む」もし
くは「からなる」のようなその変形は、記述した要素又は完全体又は要素もしく
は完全体の群の包括を意味するが、いずれかの他の要素又は完全体又は要素もし
くは完全体の群を排除するものではないものと理解されるであろう。

【００１１】用語「配列同一性」は、同じ長さの2つのアミノ酸配列間又は同じ長さの2つの
ヌクレオチド配列間のホモロジーの程度の定量的な測定を示す。比較される2つ
の配列が等しい長さではない場合、可能な限り最も良く適合するように配列を配
置しなければならない。配列同一性は、

【数１】 [N_difは、配置した際の2つの配列における非同一残基の全数であり、N_refは配列
の1つにおける残基数である]として算出できる。つまり、DNA配列AGTCAGTCは、
配列 AATCAATC (N_dif=2 及び N_ref=8)と75％の同一性を有するであろう。ギャッ
プは、非同一の特定残基として計測し、つまりDNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAG
TC (N_dif=2 及び N_ref=8)と75％の配列同一性を有するであろう。配列同一性は
、あるいは、BLASTプログラム、例えばBLASTPプログラム(Pearson W.R及びD.J.
Lipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448) (www.ncbi.nlm.nih.gov/ cgi-bin/BLAS
T)により算出することができる。発明の1つの観点において、アライメントは、h
ttp://www.ch.embnet.org/software/LALIGN form.html で入手可能なX. Huang
及びW. Millerら(Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)によって記載されるデ
フォルトパラメータで世界的なアラインアルゴリズムを用いて行われる。

【００１２】配列同一性について最も好ましい最少％は、少なくとも80％、例えば少なくと
も85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、
少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくと
も98％、少なくとも99％及び少なくとも99.5％である。ここに示されるエム・ツベルクローシス抗原は、ここに具体的に示される1以
上のDNA配列に実質的に相同のDNA配列でエンコードされる変異型を含む。ここで
用いられる配列同一性は、適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズし
得るDNA配列を意味する。適切で適度なストリンジェントな条件には、5X SSC、0
.5 % SDS、 1.0 mM EDTA (pH 8.0)溶液での予備洗浄; 50〜60℃で、5X SSC一晩
、又は交差種のホモロジーの場合には、45℃、0.5XSSCでのハイブリダイズ; 次
いで、0.1 % SDS 含有の2X、 0.5X 及び 0.2X SSCそれぞれでの 65℃で 20分の2
回の洗浄が含まれる。このようなハイブリダイズ化DNA配列も、ハイブリダイズ
化DNA配列によってエンコードされる免疫原性ポリペプチドをエンコードするヌ
クレオチド配列のように、コード縮重により、この発明の範囲内である。

【００１３】このように、各ポリペプチドフラグメントは、特定のアミノ酸及び核酸配列に
よって特徴づけることができる。このような配列には、かかる核酸及びポリペプ
チド配列が核酸配列における1以上のヌクレオチドの置換、挿入、付加及び/又は
欠失によって修飾され、組換えポリペプチドに1以上のアミノ酸残基の置換、挿
入、付加又は欠失を引起こす組換え法によって産生される類似体及び変異型が含
まれるものと理解されるであろう。用語ヌクレオチドを以下に用いる際、幾つかの目的には、それはDNA、RNA、PN
A 又は LNAとして同じく理解され得る。しかし、当業者が理解するように、明ら
かな制限が課される。PNA又はLNAは、DNAの代わりに用いることができる。 PNA
は、極めて動的なハイブリダイゼーションプロフィルを示すことが分かっている
(PNAはNielsen P Eら、1991, Science 254: 1497-1500に記載)。 LNA (Locked N
ucleic Acids)は、ビシクロヌクレオシドモノマーを含む、最近導入されたオリ
ゴヌクレオチド類似体である(Koshkinら、1998, 54, 3607-3630;Nielsen, N.K.
ら、J.Am.Chem.Soc 1998, 120, 5458-5463)。

【００１４】 esat-6遺伝子ファミリーは、以下の基準a)〜c)を満たす遺伝子からなる: a) 小さなタンパク質をコードする遺伝子; b) ゲノム上で互いに隣合って配置している少なくとも2つのかかる遺伝子; c) 基準b)の遺伝子産物の少なくとも1つは、Rv3874 (SEQ ID NO: 1)、Rv3875 (S
EQ ID NO: 2)又はRv0288 (SEQ ID NO: 3)のいずれかと少なくとも15％のアミノ
酸配列同一性を有する。 esat-6 ファミリーに関する共通特性の1つは、遺伝子のタンパク質生成物の大
きさが小さいことである。これに関し、小さいタンパク質は約80アミノ酸、例え
ば約90アミノ酸、約100アミノ酸、約110アミノ酸、約120アミノ酸、約130アミノ
酸、約140アミノ酸又は約150アミノ酸である。これらのタンパク質は重要なマイコバクテリアの特異的な機能を有しており、
その機能がマクロファージ食胞の細胞内環境に関連し、これらの分子の発現が細
胞内成長中の特定の感染段階で同時にアップレギュレートされ得ることを示唆し
ている。このアップレギュレーションは、このタンパク質ファミリーの高い抗原
性を説明できる可能性がある。基準c)のアミノ酸配列同一性は15 ％以上、例え
ば20％以上、例えば25％、30％以上又は35％以上ですらあることが好ましい。

【００１５】現在、以下の遺伝子が上記の基準a)〜c)を満たし、この結果esat-6遺伝子ファ
ミリーメンバーが同定されている(表1参照): Rv0287、 Rv0288 (TB10.4)、 Rv1036c、 Rv1037c、 Rv1038c、 Rv1197、 Rv1198
、 Rv1792、 Rv1793、 Rv2346c、 Rv2347c、 Rv2348c、 Rv2653c、 Rv2654c、 R
v3019c、 Rv3020c、 Rv3444c、 Rv3445c、 Rv3619c、 Rv3620c、 Rv3874 (CFP10
)、 Rv3875 (ESAT-6)、 Rv3890c、 Rv3891c、Rv3904c及び Rv3905c。実施例1に開示されるように、CFP10、 ESAT-6及び TB10.4 (以前はCFP7と命名
)は、精製組換え抗原をヒトTB患者由来PBMCの刺激に用いる際に、極めて良好な
IFN-γインデューサーである。このような(後述の基準 d) ii)に記載されるよう
な)作用は、このタンパク質がワクチン又は診断組成物の成分としてさらに開発
されるべきであるかどうかを決定する前の、重要な最初の試験である。興味深いことに、組み換え体Rv1793 及びこのタンパク質及びRv0287(ともにes
at-6遺伝子ファミリーのメンバーである)から誘導される合成ペプチドは、2人の
PPD-陽性ドナー由来のPBMCにおいてT-細胞増殖及びIFN-γ産生を刺激した (WO98
/53075 及びWO98/53076)。

【００１６】この発明の1つの具体例で、esat-6 ファミリーメンバーのタンパク質生成物は
、さらに基準 d)を満たすべきである: d) 少なくとも1つの後述する性質が、陽性であるべきである: i) それは、5 x 10⁴個の毒性マイコバクテリアで感染させてから28日後のマウ
スから回収したT-リンパ球からの少なくとも1,500 pg/mlのIFN-γの放出によっ
て測定される毒性マイコバクテリアでの一次感染中にインビトロの反応を誘発す
る。誘発は、脾臓から単離した約2 x 10⁵個の細胞からなる懸濁液にポリペプチ
ドを加えて行われる。ポリペプチドを加えた結果、濃度は20μg/懸濁液ml未満と
なり、 IFN-γの放出は、懸濁液にポリペプチドを加えてから3日後に回収した上
清中のIFN-γの測定により評価できる。 ii) それは、診断から0〜6ヶ月後のTB患者、又はPPD陽性個体から回収した末梢
血液単核細胞(PBMC)又は全血液から少なくとも500 pg/ml、好ましくは 1,000 pg
/mlのIFN-γの放出により測定される回収反応をインビトロで誘発する。誘発は
、約1.0〜2.5 x 10⁵個のPBMC又は全血液細胞からなる懸濁液に、ポリペプチドを
加えて行われる。ポリペプチドを加えた結果、濃度は20μg/懸濁液ml未満となり
、IFN-γの放出は、懸濁液にポリペプチドを加えてから5日後に回収した上清中
のIFN-γの測定により評価できる。

【００１７】 iii) それは、血清がPBSで1:20に希釈され、高くて20μg/mlの濃度でポリペプ
チドとインキュベートされる際に、ELISA技術又はウエスタンブロットによって
測定されるようなTB患者で特異的な抗体反応を誘発し、ELISAで少なくとも0.1の
OD又はウエスタンブロットで視覚確認できる反応を誘発する。 iv) それは、臨床的に又は半臨床的(subclinically)に毒性マイコバクテリア
感染した個体から回収した末梢血液単核細胞(PBMC)からの少なくとも500pg/mlの
IFN-γ放出によって測定される陽性のインビトロ反応を誘発する。誘発は、約1.
0〜2.5 x 10⁵個のPBMCからなる懸濁液に、ポリペプチドを加えて行われる。ポリ
ペプチドを加えた結果、濃度は20μg/懸濁液ml未満となり、IFN-γの放出は、懸
濁液にポリペプチドを加えてから5日後に回収した上清中のIFN-γの測定により
評価できる。毒性マイコバクテリアに感染していない個体では、このようなIFN-
γの放出を誘発しないことが好ましい。 v) それは、PPD陽性個体から生じるT細胞系からの少なくとも500pg/mlのIFN-
γの放出によって測定される陽性のインビトロ反応を誘発する。誘発は、1〜5 x
10⁵細胞/mlからなる懸濁液に、ポリペプチドを加えて行われる。ポリペプチド
を加えた結果、濃度は20μg/ml未満となり、IFN-γの放出は、懸濁液にポリペプ
チドを加えてから3〜5日後に回収した上清中のIFN-γの測定により評価できる。

【００１８】 vi) それは、PPD陽性個体から生じるT細胞系からの少なくとも5の刺激指数(SI
)のT-細胞増殖によって測定される陽性のインビトロ反応を誘発する(SI、抗原存
在下における分当たりの平均数/無抗原の分当たりの平均数として算出)。誘発は
、1〜5 x 10⁵細胞/mlからなる懸濁液に、ポリペプチドを加えて行われる。ポリ
ペプチドを加えた結果、濃度は20μg/ml未満となり、IFN-γの放出は、懸濁液に
ポリペプチドを加えてから3〜5日後に回収した上清中のIFN-γの測定により評価
できる。 vii) それは、臨床的に又は半臨床的に毒性マイコバクテリア感染した個体に
、高くて100μgのポリペプチドの皮膚内注射又は局所塗布パッチで測定される陽
性DTH反応を誘発する。陽性反応は、注射又は塗布から72〜96時間後に少なくと
も10mmの直径を有する。 viii) それは、臨床的に又は半臨床的に毒性マイコバクテリア感染した個体に
、高くて100μgのポリペプチドの皮膚内注射又は局所塗布パッチで測定される陽
性DTH反応を誘発する。陽性反応は、注射から72〜96時間後に少なくとも5mmの直
径を有する。毒性マイコバクテリアに明らかに感染した個体にかかる反応を誘発
しないことが好ましい。

【００１９】 i)に記載の性質は、再活性化した記憶T-リンパ球からのIFN-γの放出が2,000
pg/ml、例えば3,000 pg/mlの際にも、充足されるであろう。この発明の別の具体
例で、ポリペプチドの免疫学的な作用は、ポリペプチドを加えず、有意な増加は
免疫学的に有効なポリペプチドを示す同様のアッセイからのIFN-γの放出で記載
されるようなIFN-γ放出と比較して測定される。この発明の好ましい具体例で、
ポリペプチドを加えた結果、濃度は20μg/懸濁液ml未満、例えば15μg、10μg、
5μg、3μg、2μg又は1μgポリペプチド/懸濁液mlとなる。性質i)についてのマウス系統の1つの例は、動物モデルとしてのC57Bl/6jであ
る。当業者に公知であるように、種々の系統が、遺伝学的変化により同じポリペ
プチドに対する強度を変えて免疫応答と反応しうる。どのマウス系統がどのヒト
群で免疫原性反応性の最も良好な予想を生じるかは、現在知られていない。した
がって、他のマウス系統、例えばC3H/HeN、 CBA (好ましくは CBA/J)、 DBA (好
ましくは DBA/2J)、A/J、AKR/N、DBA/1J、FVB/N、SJL/N、129/SvJ、 C3H/HeJ-Lp
s又はBALBマウス (好ましくはBALB/cA、 BALB/cJ)を試験することが重要である
。現在、モルモットモデルやラットモデルのような別の動物モデルで行われる同
様の試験が臨床上、予想されることも考えられている。ヒトに対する臨床上の予
想を良好に得るためには、いずれかの家畜動物のモデル、例えばウシモデル、ブ
タモデル、シカモデル、又はいずれかの霊長類モデルが臨床上の予想を与え、こ
の結果動物モデルとして役立つと考えられる。

【００２０】さらに、結核疾患は、幾つかの異なる動物種、例えば牛、霊長類、モルモット
、アナグマ、オポッサム及びシカなどにも影響を及ぼしていることに留意すべき
である。上述のいずれかのモデルにおいて有効であることが分かっているポリペ
プチドは、たとえヒトに有効でなくても、動物の治療に重要である可能性がある
。毒性マイコバクテリアに感染してから28日以内のマウスから回収した再活性化
Tリンパ球からのIFN-γの放出を測定することが提案される。これは、免疫宿主
が保護免疫反応を高める際に、感染マクロファージの初期認識の原因となる特定
のT-細胞がIFN-γの産生をとおして強力な殺菌活性を刺激するとの事実に起因し
ている(Rook, G.A.W. 1990., Flesch, I.ら、1987)。しかし、他のサイトカイン
は、IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-βのように、ポリペプチド
に対する免疫応答をモニターする際に関連している可能性がある。通常、1以上
のサイトカインは例えばPCR技術又はELISAを利用して測定されるであろう。特定
のポリペプチドによって誘発されるこれらのサイトカインのいずれかの量の有意
な増加又は減少がポリペプチドの免疫効力の評価に使用できることは、当業者に
高く評価されるであろう。IFN-γをコードする遺伝子が崩壊しているマウスはマ
イコバクテリア感染を制御できず、広範囲な播種、チーズ様の壊死及び大きなア
ブセス(abcesse)を伴って極めて迅速に死ぬので、IFN-γ反応を誘発するポリペ
プチドの能力は、保護免疫と最も関連した相関現象であると現在は考えられてい
る(Flynnら、(1993) J.Exp.Med 178: 2249-2254, Cooperら、(1993) J.Exp.Med.
178:2243-2248)。記憶モデルにおける保護免疫の抗原標的に関する情報を得る
ための特定モデルはLefford (Leffordら(1973) Immunology 25:703) によって最
初に開発され、最近の数年に広範囲に使用されている(Orme ら、(1988). Infect
.Immun. 140:3589, P.Andersenら、(1995) J.Immunol.154: 3359)。

【００２１】 ii)に記載される性質も、PBMCからのIFN-γの放出が診断から6ヶ月以上、例え
ば診断から9ヶ月、1年、2年、5年又は10年経つTB患者又はPPD陽性個体から回収
したPBMCで測定される際には、満たされるであろう。 IFN-γ、ポリペプチド濃度及び他のサイトカインの有意な増加に関する性質 i
)についてのコメントは、性質ii)に等しく関連している。 iii)に記載される性質は、特にELISAが以下のように行われるならば、満たさ
れるであろう: 1〜10μg/ml濃度の興味あるポリペプチドを、96ウェルのポリス
チレンプレート(NUNC, Denmark)に被覆し、0.37 M NaCl及び0.5% Tween-20を含
有するリン酸緩衝液pH 7.3での洗浄工程の後、TB患者由来の血清又は血漿を、1%
Tween-20を有するPBSで1:10〜1:1000に希釈する。ポリペプチドに対する抗体結
合は、標識(例えばペルオキシダーゼ標識)した第二抗体を加えて測定し、その後
、製造者(DAKO, Denmark)によって記載されるように、OPD 及びH₂O₂を用いて反
応を可視化する。各ウェルのOD値は、適当なELISAリーダーを用いて測定する。好ましい具体例では、ウエスタンブロットは以下のように行われる: 1〜40μg
濃度のポリペプチドをSDS-PAGEに用い、電気泳動後、ポリペプチドを膜、例えば
ニトロセルロース又はPVDFに移す。その後、0.37 M NaCl 及び0.5% Tween-20を
含むリン酸緩衝液pH 7.3で膜を30分洗浄する。1人以上のTB患者から得た血清を
、0.37 M NaClを含むリン酸緩衝液pH 7.3で1:10〜1:1000に希釈する。その後、結合緩衝液で4回5分膜を洗浄し、ペルオキシダーゼ又はホスファター
ゼ標識した第二抗体でインキュベートする。次いで、製造者(DAKO, Denmark)に
よって推奨される染色方法を用いて反応を可視化する。

【００２２】ポリペプチドが毒性マイコバクテリウムに感染していない個体、つまりBCGワ
クチン接種を受けたか、又はマイコバクテリウム・アビウム(Mycobaterium aviu
m)に感染しているかもしくは非結核のマイコバクテリウムで感作された個体、又
は毒性マイコバクテリウムに感染していない個体、つまり毒性マイコバクテリウ
ムで進行中の感染が、陽性の培養物、顕微鏡上又は臨床上、全く明らかにされて
いない個体でかかるIFN-γ放出を誘発しない場合には、iv)に記載される性質も
特に満たされるであろう。IFN-γの有意な増加、ポリペプチド濃度及び他のサイ
トカインに関する性質i)についてのコメントは、性質iv)に等しく関連している
であろう。ポリペプチドが毒性マイコバクテリウムに感染していない個体、つまりBCGワ
クチン接種しているか、又はマイコバクテリウム・アビウムに感染もしくは非結
核のマイコバクテリウムに感作している個体でかかる反応を誘発しない場合には
、vii)に記載される性質が特に満たされるであろう。好ましい具体例において、
皮膚内に注射されるか、又は塗布されるポリペプチド量は90μg、例えば 80μg
、70μg、60μg、50μg、40μg又は30μgである。この発明の別の具体例で、陽
性反応の直径は少なくとも6 mm、例えば7 mm、8 mm、9 mm又は10 mmである。好
ましい具体例で、硬化又は紅斑又はその双方は、皮膚内注射、パッチ試験又は多
重穿刺によるポリペプチドの投与後に測定できる。反応直径は、48時間以上後、
例えば72又は96時間後に陽性であり得る。

【００２３】ポリペプチドが、毒性マイコバクテリアに感染していない、つまり毒性マイコ
バクテリウムで進行中の感染が、陽性の培養物又は顕微鏡上、全く明らかにされ
ていない個体でかかる反応を誘発しない場合には、viii)に記載の性質が特に満
たされるであろう。皮膚内に注射されるかもしくは塗布されるポリペプチド量及
び陽性反応の直径に関する性質vii)についてのコメントは、性質 viii)に等しく
関連している。この発明の1つの観点は、esat-6遺伝子ファミリーのメンバーによってエンコ
ードされるアミノ酸配列からなる実質的に純粋なポリペプチドフラグメントと少
なくとも70％の配列同一性を有し、同時に該ポリペプチドフラグメントに免疫学
的に等価であり、但しRv0287、 Rv0288、 Rv1037c、 Rv1038c、 Rv1197、 Rv119
8、 Rv1792、 Rv1793、 Rv2346c、 Rv2347c、 Rv3019c、 Rv3619c、 Rv3620c、
Rv3874及びRv3875からなる群からは選択されない、上記の実質的に純粋なポリペ
プチドフラグメントに関する。この明細書において、2つのポリペプチドフラグメントは、性質i)、性質ii)、
性質iii)、性質iv)、性質v)、性質vi)、性質vii)又は性質viii)を満たすならば
、免疫学的に等価である。

【００２４】

【表１】

【００２５】免疫診断及びワクチン調製の双方において、既知の免疫原性タンパク質又はポ
リペプチドのセグメントから抗原を調製することはしばしば可能かつ実際的なこ
とである。あるエピトープ領域は、完全な抗原性ポリペプチドによって産生され
るものと同様の反応を生じるのに用いることができる。免疫反応中に認識される関連T-細胞エピトープを同定するために、「ブルート
・フォース（brute force）」法を使用することもできる:T-細胞エピトープは直
線状であるので、SEQ ID NOs: 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27
、29又は 31を有するポリペプチドの欠失変異体は、組織的に構築される場合に
は、例えばこれらの欠失変異体をここに記載されるIFN-γアッセイに付すことに
よって、免疫認識に必須なポリペプチドの領域を示すであろう。別の方法は、SE
Q ID NOs: 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 又は31を有する
ポリペプチド由来のオリゴペプチド(好ましくは約20アミノ酸残基長の合成物)の
重複を利用する。これらの幾つかはIFN-γアッセイで陽性の反応を生ずるであろ
うが、他のものは生じないであろう。

【００２６】この発明の好ましい具体例で、この発明のポリペプチドフラグメントは、B-細
胞又はT-細胞のエピトープからなる。 T-細胞エピトープの最短長は少なくとも6アミノ酸であることが分かっている
が、このようなエピトープはより長いアミノ酸のストレッチからなることが普通
である。つまり、この発明のポリペプチドフラグメントは、少なくとも7アミノ
酸残基長、例えば少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも12、少
なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも20、少なくとも22、少な
くとも24及び少なくとも30のアミノ酸残基長を有することが好ましい。 1つの好ましい具体例で、この発明のポリペプチドフラグメントは、いずれの
シグナル配列も有しない;これは、ポリペプチドフラグメントが合成で調製され
る際に特に興味深いが、ポリペプチドフラグメントが組換えで調製される場合で
すら、それらが宿主細胞により周辺細胞質又は細胞外空間に輸送されないことが
通常容認される;ポリペプチドフラグメントは、宿主細胞の崩壊後に細胞質から
従来の方法(後述参照)で回収することができ、ポリペプチドフラグメントの再生
(refolding)が必要な際には、全体的な再生スキームを用いることができる(例え
ば、このような全体的な再生法が記載されるWO 94/18227の開示参照)。

【００２７】融合ポリペプチドを産生することにより、この発明のポリペプチドフラグメン
トの優れた特性が得られる。例えば、組換えによって産生された場合にポリペプ
チドの輸出を助ける融合パートナー、ポリペプチドの精製を助ける融合パートナ
ー及びこの発明のポリペプチドフラグメントの免疫原性を高める融合パートナー
が、興味ある可能性の全てである。従って、この発明はまた、上記の少なくとも
1個のポリペプチドフラグメントと少なくとも1個の融合パートナーとを含む融合
ポリペプチドに関する。免疫原性を高めるためには、融合パートナーは、例えば
、上記の(関連エピトープの多重発現を可能にする)別のポリペプチドフラグメン
ト、及び、ESAT-6、TB10.4、CFP10、FP17、CFP21、CFP25、CFP29、MPB59、MPT59
、MPB64及びMPT64又はこれらの抗原のいずれかの少なくとも1つのT-細胞エピト
ープのような結核複合体に属する細菌由来の別のポリペプチドからなる群から選
択することができる。融合パートナーとして役立ち得る免疫原性を高める他のポ
リペプチドは、T細胞エピトープ(例えばポリペプチドESAT-6、MPB64、MPT64又は
MPB59から誘導されたT細胞エピトープ)、又は、標的遺伝子産物の免疫原性を高
める免疫原性エピトープ、例えばIFN-γ、IL-2及びIL-12のようなリンホカイン
である。発現及び/又は精製を容易にするためには、融合パートナーは、例えば
、細菌の線毛タンパク質、例えば毛成分pilin及びpapA; タンパク質 A; ZZ-ペプ
チド (ZZ-融合体はスウェーデンの Pharmaciaにより市販);マルトース結合タン
パク質; グルタチオン S-トランスフェラーゼ; β-ガラクタトシダーゼ;又はポ
リ-ヒスチジンであってもよい。

【００２８】他の興味ある融合パートナーは、脂質化され、免疫原性ポリペプチドが免疫系
に適切な方法で提示されるようにするポリペプチドである。この作用は、例えば
、ポリペプチド中の脂質化された膜アンカーが、これを産生する細胞から単離さ
れているときに、自己-アジュバント作用を(天然に脂質化されている)ポリペプ
チドに付与するボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)OspA ポリ
ペプチドベースのワクチンから知られている。反対に、OspA ポリペプチドは、
脂質化アンカーなしに調製された場合には、免疫学的に比較的不活である。

【００２９】この発明の別の部分は、単離形態の核酸フラグメントに関する。この核酸フラ
グメントは、 1) esat-6 遺伝子ファミリーのメンバーである核酸配列からなり、及び/又
は 2) 少なくとも10ヌクレオチド長を有し、かつ、ストリンジェントなハイブ
リッド形成条件 (当該分野で定義される条件、すなわち、融点T_m下の5〜10℃、
Sambrookら、1989年、11.4〜11.49頁参照)下で、1)の核酸フラグメントと容易に
ハイブリッド形成し、及び/又は 3) 少なくとも10ヌクレオチド長を有し、かつストリンジェントなハイブリ
ッド形成条件 (当該技術分野で定義されている条件、すなわち、融点T_m 下の5〜
10℃、Sambrookら、1989年、11.45〜11.49頁参照)下で、 SEQ SEQ ID NO: 6 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 12 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 14 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 16 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 18 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 20 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 22 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 24 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 26 又はこれに相補的な配列、 SEQ ID NO: 28 又はこれに相補的な配列、又は SEQ ID NO: 30 又はこれに相補的な配列から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸フラグメントと容易にハイブリッ
ド形成する。

【００３０】核酸フラグメントは、DNAフラグメントであるのが好ましい。この発明による利点を確実にするためには、ハイブリッド形成研究又はアッセ
イに用いられる場合の好ましい核酸配列には、選択された配列の少なくとも10〜
40程度のヌクレオチドのストレッチに相補的な配列が含まれる。少なくとも10ヌ
クレオチド長の大きさは、フラグメントが、安定かつ選択的な二重らせん分子を
形成するのに十分な長さを確実に有するのを助ける。しかしながら、ハイブリッ
ドの安定性と選択性とを増し、それによって、得られる特異的なハイブリッド分
子の質と程度を向上させるためには、10塩基長より大きいストレッチにわたって
相補配列を有する分子が一般的には好ましい。

【００３１】従って、用語「サブ配列」は、この発明の核酸フラグメントに関係して用いら
れる場合、上記ハイブリッド形成パターンを示す少なくとも10ヌクレオチドの連
続ストレッチを示すことを意図する。通常、これは、SEQ ID NO: 6、12、14、16
、18、20、22、24、26、28 又は30を有するハイブリッド形成パートナーのサブ
配列と少なくとも70％の最小配列同一性を要するであろう。核酸フラグメントは
、10ヌクレオチドよりも長く、例えば少なくとも15、少なくとも20、少なくとも
25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも 40、少なくとも 45、少なくとも
50、少なくとも 55、少なくとも 60、少なくとも 65、少なくとも 70及び少な
くとも 80のヌクレオチド長であることが好ましく、また配列同一性は好ましく
は70%よりも高く、例えば少なくとも 75%、少なくとも 80%、少なくとも 85%、
少なくとも90%、少なくとも 92%、少なくとも 94%、少なくとも 96%及び少なく
とも 98%であるべきである。配列同一性は100%であることが、最も好ましい。こ
うしたフラグメントは、例えば米国特許第4,603,102号のPCR技術のような核酸再
生技術の適用による、化学的手段でフラグメントを直接合成することによって、
又は組換え産生用の組換えベクターに選択した配列を導入することによって、容
易に調製することができる。

【００３２】同一アミノ酸が種々のコドンによりエンコードされることがあり、特にコドン
の用途が、ヌクレオチド配列を発現する当該生物の好みに関係していることは周
知である。このように、この発明の核酸フラグメントの少なくとも1つのヌクレ
オチド又はコドンは他のものと交換され、発現した場合には、当該核酸フラグメ
ントによりエンコードされたポリペプチドに同一又は実質的に同一なポリペプチ
ドを生じる可能性がある。したがって、この発明では、1以上のヌクレオチドの
置換、挿入(イントロンを含む)、付加、欠失及び転移(rearrngement)のような
配列変異が可能である。これらの変異は、核酸フラグメント又はそのサブ配列に
よりエンコードされたポリペプチドに実質的な作用を及ぼさない。用語「置換」
は、全ヌクレオチド配列中の1以上のヌクレオチドの1以上の異なるヌクレオチド
での交換を意味することを意図する。「付加」は、全ヌクレオチド配列のいずか
の末端での1以上のヌクレオチドの追加を意味すると理解される。「挿入」は、
全ヌクレオチド配列内での1以上のヌクレオチドの導入を意味することを意図す
る。「欠失」は、1以上のヌクレオチドが、全ヌクレオチド配列から、配列のい
ずれかの末端において又はその内部の適当な点において、欠失されることを示す
ことを意図する。「転移」は、2以上のヌクレオチド残基が、互いに交換される
ことを意味することを意図する。

【００３３】修飾されるヌクレオチド配列は、上に説明したようにcDNA又はゲノム由来であ
ってもよいが、合成由来であってもよい。さらに、配列は、上に説明したように
cDNAとゲノムとの混合、cDNAと合成又はゲノムと合成との混合であってもよい。
配列は、例えば部位特異的突然変異誘発により修飾されて、所望のポリペプチド
をエンコードする所望の核酸フラグメントを生じてもよい。ポリペプチドをエン
コードする核酸の修飾に焦点を当てた以下の説明は、こうした可能性ならびに所
望の核酸フラグメントを得るために2以上のDNAフラグメントの連結反応により核
酸を構築する可能性及び上記原理の組合わせを包含するものと理解されるべきで
ある。ヌクレオチド配列をいずれかの適当な技術を用いて修飾し、この発明のポリペ
プチドをエンコードする核酸フラグメントを産生することができる。この発明のポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列の
修飾は、得られるポリペプチドの免疫学的機能を損なわないものであるべきであ
る。

【００３４】ここに開示される抗原の変異型を調製する好ましい方法は、部位特異的突然変
異誘発である。この技術は、基礎となる核酸の特異的突然変異誘発により抗原配
列から誘導される、個々のペプチド、又は生物学的機能が等しいタンパク質もし
くはペプチドの調製に有用である。さらに、この技術により、1以上のヌクレオ
チド変形配列を核酸に導入することによって、例えば、上記に考慮した項目の1
以上を導入して、配列変異体を容易に調製し、試験することができる。部位特異
的突然変異誘発は、所望の突然変異のヌクレオチド配列をエンコードする特異的
なオリゴヌクレオチド配列ならびに十分数の隣合ったヌクレオチドの使用により
突然変異体を産生でき、検討されている欠失結合の両側に安定な二重らせんを形
成するのに十分な大きさのプライマー配列と配列コンプレキシティーを生じる。
代表的には、変更される配列の結合の両側に約5〜10残基を持った約17〜25ヌク
レオチド長のプライマーが好ましい。一般的に、この発明による部位特異的突然変異誘発は、まず、この発明のポリ
ペプチドをエンコードする核酸配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得るこ
とによって行われる。所望の突然変異配列を持ったオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、一般的には合成によって、例えばCreaら(1978)の方法により調製される。
次いで、このプライマーを一本鎖ベクターとアニーリングし、大腸菌ポリメラー
ゼI クレノウフラグメントのようなDNA重合酵素に付し、突然変異を有する鎖の
合成を完了する。こうして、1方の鎖が本来の、突然変異していない配列をエン
コードし、第2の鎖が所望の突然変異を有するヘテロ二重らせんが形成される。
次いで、このヘテロ二重らせんベクターを用いて大腸菌細胞のような適当な細胞
を形質転換し、突然変異配列が配置されている組換えベクターを含むクローンを
選択する。

【００３５】この発明の選択された核酸フラグメントの配列変異体を、部位特異的突然変異
誘発を用いて調製することは、潜在的に有用な遺伝子種を産生する手段として提
供されるものであり、この発明の核酸フラグメントの配列変異体を得る方法は他
にもあるので、限定的であることを意味しない。例えば、所望の遺伝子をエンコ
ードする組換えベクターを突然変異誘発剤で処理して、ヒドロキシルアミンを用
いるプラスミドDNAの突然変異誘発用の配列変異体(例えば、Eichenlaub, 1979に
記載の方法を参照)を得ることができる。また、この発明は、上記核酸フラグメントを含む複製可能な発現ベクター、特
にこの発明のポリペプチドフラグメントをエンコードする核酸フラグメントから
なるベクターに関する。ベクターは、組換えDNA手順に好都合に付されるベクターであればいかなるベ
クターであってもよく、ベクターの選択は、大抵の場合、これが導入される宿主
細胞に依存している。従って、ベクターは、自律複製ベクター、即ち、その複製
が染色体複製から独立した、染色体外的なものとして存在するベクターであって
もよい。こうしたベクターの例は、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染
色体又はウィルスである。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに
、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、これが組み込まれた染色体と共に複製される
ベクターであってもよい。

【００３６】発現ベクターは、ここに開示されるいずれのDNAセグメントも含むように構築
されていてもよい。こうしたDNAは、毒性マイコバクテリア株に、又は試料中の
マイコバクテリア核酸検出用のハイブリッド形成プローブにすら特異的な抗原性
タンパク質をエンコードし得る。所望の抗原性タンパク質に応じて、長い又は短
いDNAセグメントを用いることができる。開示されているDNAにより発現又はエン
コードされるタンパク質のエピトープ領域が、比較的に短いDNAセグメントとし
て含まれていもよい。種々の発現ベクターが可能であり、これらの発現ベクター
には、例えば、異種遺伝子産物の同定に有用な遺伝子リポーター遺伝子産物をエ
ンコードするDNAセグメント及び/又は形質転換細胞の同定に有用であり得る抗生
物質耐性遺伝子のような耐性遺伝子が含まれる。

【００３７】この発明のベクターを用いて細胞を形質転換させ、この発明の核酸フラグメン
トを増殖させるか、又はこの発明のポリペプチドフラグメントを発現させること
ができる。従って、この発明は、この発明による少なくとも1個のこうしたベク
ターを有する形質転換細胞にも関する。かかる形質転換細胞(これもこの発明の
一部である)は、いずれかの好適な細菌宿主細胞又は他のいずれかの細胞型、例
えば単細胞真核生物、真菌又は酵母、又は多細胞生物、例えば動物もしくは植物
由来の細胞であってもよい。哺乳動物の細胞が用いられるのは、特にグリコシル
化が望ましい場合においてであるが、タンパク質のグリコシル化は原核生物では
稀な現象である。しかしながら、通常は、マイコバクテリウム、サルモネラ、シ
ュードモナス、バシラス及びエシェリキア属に属する細菌のような原核細胞が好
ましい。形質転換細胞は、大腸菌、枯草菌又はエム.ボビスBCG 細胞が好ましく
、特に形質転換細胞が、この発明によるポリペプチドを発現することが好ましい
。後者は、単に形質転換細胞を含む培養物からの回収によって、この発明のポリ
ペプチドを産生する可能性を拓くものである。この発明のこの部分の最も好まし
い実施態様においては、形質転換細胞は、Copenhagen BCG Laboratory(Statens
Seruminstitut、デンマーク)からのマイコバクテリウム・ボビス株Copenhagenで
あるマイコバクテリウム・ボビスBCG株: Danish 1331である。この発明の核酸フラグメントは、この発明のポリペプチドフラグメントの組み
換え体を産生することができる。しかし、天然源からの単離も、ペプチド合成の
ように、ポリペプチドフラグメントを提供する手段である。

【００３８】従って、この発明は、この発明のポリペプチドフラグメントの産生方法にも関
する。この方法は、上記核酸フラグメントを、宿主細胞中で複製可能なベクタ
ーに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し(形質転換細胞は、分
画ハイブリッド形成、融合レポーター遺伝子産物、抵抗マーカー、抗-抗原抗体
等の同定によるスクリーニングを含む種々の技術を用いて選択できる)、この宿
主細胞を、ポリペプチドの発現を行うのに十分な条件下、培養培地で培養し(当
然、細胞は状況に適した条件下で培養でき、DNAが所望される場合には複製条件
を用いる)、宿主細胞又は培養培地からポリペプチドを回収するか; 又は、結核複合体の全マイコバクテリアから、又はその溶解物又はフラクション、例
えば細胞壁含有フラクションから、ポリペプチドを単離するか、又は固相又は液相のペプチド合成によってポリペプチドを合成することからなる。形質転換細胞の成長に用いられる培地は、目的にかなった通常の培地であれば
いかなる培地であってもよい。好適なベクターは上記ベクターのいずれであって
もよく、好適な宿主細胞は上記細胞型のいずれであってもよい。ベクターを構築
し、それを宿主細胞に導入するのに用いられる方法は、組換えDNA分野における
こうした目的の場合に知られるいずれの方法であってもよい。以下に、可能性に
ついてより詳細に説明する:

【００３９】一般的には、当然、原核生物は、この発明の核酸配列の初期クローニング、及
びこの発明に有用なベクターの構築に好ましい。例えば、後述のより詳細な開示
に記載される特定の菌株に加えて、例として、大腸菌K12 株294 (ATCC No. 3144
6)、大腸菌B、及び大腸菌X 1776 (ATCC No. 31537)のような菌株が挙げられる。
これらの例は、当然、例示的なものであり限定的なものではない。原核生物は、発現にも好ましい。上記の菌株ならびに大腸菌W3110 (F-、λ-、
野生株、ATCC No. 273325)、枯草菌のような桿菌、又はサルモネラ・ティフィム
リムもしくはセラチア・マルセッセンスのような他の腸内細菌、及び種々のシ
ュードモナス種を用いてもよい。特に興味あるものは、成長の早いマイコバクテ
リア、例えばエム.スメグマチスである。というのは、これらの細菌は、結核複
合体のマイコバクテリアに高度に類似しており、従って、発現産物の翻訳後修飾
を行う必要性を低減する良好な可能性を有するためである。この発明の１つの局
面においては、この発明のポリペプチドをGRAS生物、例えばラクトコッカス(lac
tococcus)において産生するのが好ましい。

【００４０】一般的には、レプリコンを含み、かつ、宿主細胞に和合性を有する種由来の
制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関係して用いられる。ベ
クターは、通常は複製部位ならびに形質転換細胞に表現型選択を提供し得るマー
キング配列を有する。例えば、大腸菌は通常は、大腸菌種由来のプラスミド、pB
R322を用いて形質転換される(例えばBolivarら、1977, Gene 2: 95参照)。pBR32
2 プラスミドは、アンピシリンとテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含み、
従って、形質転換細胞を同定する容易な手段を提供する。また、pBR プラスミド
、又は他の微生物プラスミド、又はファージは、微生物により使用されうる発現
用のプロモーターを含むか、又は含むように修飾されなければならない。組換えDNA構築に最も一般的に用いられるこれらのプロモーターには、B-ラク
タマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーター系(Changら、1978; Itak
uraら、1977; Goeddelら、1979)、及びトリプトファン(trp)プロモーター系(Goe
ddelら、1979; EPO Appl. Publ. No. 0036776)が含まれる。これらは最も一般的
に用いられるプロモーターであるが、他の微生物プロモーターも発見され利用さ
れており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されているので、当業
者はそれらをプラスミドベクターと機能的に連結することができる(Siebwenlist
ら、1980)。原核生物由来の所定の遺伝子が、それらの自身のプロモーター配列
から大腸菌で効率的に発現され、人工的手段により別のプロモーターを付加する
必要性を排除するようにしてもよい。

【００４１】この発明によるポリペプチドの組換え産生後、例えば、この発明によるポリペ
プチドに実質的に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いるアフィニティー
クロマトグラフィー (又はクロマトグラフィーベースの他の通常の生化学的手順
)により、ポリペプチドの単離を行ってもよい。他の可能性は、Andersen ら. J.
Immunol. Methods 161: 29〜39に記載の同時電気溶出技術を用いることである
。この発明によると、翻訳後修飾には、ポリペプチドの脂質化、グリコシル化、
切断、又は伸長が含まれてもよい。ある局面においては、この発明により提供されるDNA 配列情報により、マイコ
バクテリアの遺伝子配列に特異的にハイブリッド形成することのできる比較的短
いDNA (又はRNA、PNA、又はLNA) 配列を調製することができる。これらの局面に
おいては、適当な長さの核酸プローブが、関連配列を考慮して調製される。こう
した核酸プローブがマイコバクテリアの遺伝子配列に特異的にハイブリッド形成
できることによって、核酸プローブは、種々の実施態様に特別な有用性をもたら
している。最も重要なことには、プローブは、所定の試料中の病原性生物の存在
を検出するために、種々の診断的アッセイで用いることができる。しかしながら
、変異体種プライマー、又は他の遺伝子構築物の調製に用いられるプライマーの
調製に配列情報を使用することをはじめとする、いかなる使用も想定される。

【００４２】この発明の核酸フラグメントは、この発明のポリペプチド合成及びハイブリッ
ド形成プローブ(直接的なハイブリッド形成アッセイ、又は例えばPCRもしくは他
の分子増幅法におけるプライマーとして有用)のための開始点として用いること
とは別に、抗原のインビボ発現に用いてもよい。即ち、核酸フラグメントをいわ
ゆるDNAワクチンに用いてもよい。最近の研究から、真核細胞において非複製的
なベクターでクローンされたDNAフラグメントは、例えば筋肉内注射又は経皮投
与 (いわゆる"遺伝子銃"法)により動物（ヒトを含む）に導入され得ることが明
らかにされている。DNAは、例えば筋肉細胞により吸収され、興味ある遺伝子が
、真核生物において機能しているプロモーター、例えばウィルス性プロモーター
により発現され、その後、遺伝子産物が免疫系を刺激する。これらの新しく発見
された方法は、引用によりここに組み込まれるUlmerら, 1993において検討され
ている。従って、この発明は、この発明による核酸フラグメントからなるワクチンにも
関し、このワクチンは、これを投与したヒトを含む動物により、抗原をインビボ
で発現する。発現される抗原の量は、ヒトを含む動物における結核複合体のマイ
コバクテリア感染に対する耐性を実質的に増大するのに有効である。

【００４３】こうした"DNA ワクチン"の効能は、発現産物をエンコードする遺伝子を、免疫
応答調節能を有するポリペプチドをエンコードするDNAフラグメントと共に投与
することにより高められる可能性がある。例えば、リンホカイン前駆体又はリン
ホカイン(例えばIFN-γ、IL-2又はIL-12)をエンコードする遺伝子は、2個の個々
のDNAフラグメントを投与するか、同一ベクターに含まれる両方のDNAフラグメン
トを投与することにより、免疫原性タンパク質をエンコードする遺伝子と共に投
与することができる。また、それぞれがここに開示されるポリペプチドの関連す
るエピトープをエンコードする多数のヌクレオチド配列からなるDNAフラグメン
トを投与し、それにより、これらのエピトープの幅広いスペクトルで免疫系の連
続的感作を行うこともあり得る。上記のとおり、この発明のポリペプチドフラグメントは、ワクチン成分、又は
免疫診断剤中成分の優れた候補である。従って、この発明の他の部分は、この発明によるポリペプチド又は融合ポリペ
プチドからなる免疫組成物に関する。こうした免疫組成物の最適な効能を確保す
るために、免疫組成物は、免疫学的及び医薬的に許容される担体、ビヒクル又は
アジュバントからなることが好ましい。

【００４４】適当な担体は、プラスチックのようなポリペプチドが疎水性非共有相互作用に
より結合しているポリマー、例えばポリスチレン、又は多糖、もしくはポリペプ
チドのようなポリペプチドが共有結合しているポリマー、例えばウシ血清アルブ
ミン、オバルブミン、又はキーホールリンペットヘモシアニンからなる群から選
択される。適当なビヒクルは、希釈液及び懸濁剤からなる群から選択される。ア
ジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド (DDA)、 Quil A
、ポリ I:C, フロイント不完全アジュバント、IFN-γ、IL-2、IL-12、モノホス
ホリルリピド A (MPL)、及びムラミルジペプチド(MDP)からなる群から選択され
ることが好ましい。この発明による好ましい免疫組成物は、それぞれ異なるポリペプチドフラグメ
ントがポリペプチドか又は上記融合ポリペプチドかである、少なくとも 2個の異
なるポリペプチドフラグメントからなる。免疫組成物は、2〜20個、例えば3〜20
個の異なるポリペプチドフラグメント又は融合ポリペプチドからなることが好ま
しい。こうした免疫組成物は、好ましくはワクチンの形態又は皮膚試験試薬の形態で
あってもよい。

【００４５】上記にしたがって、この発明はそれ故に、この発明による免疫組成物の産生方
法にも関する。この方法は、この発明によるポリペプチドを調製、合成又は単離
し、ポリペプチドをワクチン用媒体に可溶化又は分散し、任意に他のエム.ツベ
ルクローシス抗原及び/又は担体、ビヒクル及び/又はアジュバント物質を加える
ことからなる。活性成分としてペプチド配列を含むワクチンの調製は、全て引用によりここに
組み込まれる米国特許第 4,608,251号; 第 4,601,903号; 第4,599,231号及び第4
,599,230号により例示されているように、当該分野において一般的に十分に理解
されている。代表的には、こうしたワクチンは、液体溶液又は懸濁液のいずれか
として注射可能物質として製造され、注射に先立って液体に溶解又は懸濁するの
に適した固体の形態で製造されてもよい。調製品は、乳化されてもよい。活性な
免疫原性成分は大抵の場合、医薬的に許容されかつ活性成分と相溶性を有する賦
形剤と混合される。適当な賦形剤は例えば水、生理食塩水、デキストロース、グ
リセロール、エタノール等及びそれらの組合わせである。加えて、ワクチンは、
必要であれば、ワクチンの有効性を高める湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、又はア
ジュバントのような補助物質を少量含んでもよい。

【００４６】ワクチンは通常は、非経口で、注射によって、例えば経皮的に又は筋肉注射に
よって投与される。他の投与形態に適した追加の製剤には、坐薬、及び、場合に
よっては、経口製剤が含まれる。坐薬の場合には、通常の結合剤と担体が、例え
ばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドを含んでいてもよい。こうした
坐薬は、活性成分を0.5〜10%、好ましくは1〜2%の範囲で含有する混合物から調
製されてもよい。経口製剤には、こうした通常使用される賦形剤、例えば、医薬
グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。これらの組
成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤又は散剤の形態を
とり、10〜95％、好ましくは25〜70%の活性成分を含有する。タンパク質は、中性又は塩の形態としてワクチンに製剤化されてもよい。医薬
的に許容される塩には、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基と形成)が含まれる。
それらは、例えば塩酸又はリン酸のような無機酸、又は、酢酸、蓚酸、酒石酸、
マンデル酸等のような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基で形成さ
れる塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸
化鉄のような無機塩、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチル
アミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩から誘導され得る
。

【００４７】ワクチンは、用量製剤に適合するように、及び治療上効果的かつ免疫原性的に
なるような量で投与される。投与量は、例えば、免疫応答を高める個々の免疫系
の能力、及び所望の保護程度をはじめとする治療対象に依存する。適当な用量範
囲は、好ましくは約0.1〜1000μgの範囲、例えば約1〜300μgの範囲、特に約10
〜50 μgの範囲のワクチンにつき数百μgオーダーである。初期投与及びブース
ター注射に適当な生活規制も様々であるが、初期投与に次いで接種又は他の投与
を行うのが代表的である。適用方法は、実に様々である。通常のワクチン投与法は、いずれも使用可能で
ある。これらには、固形の生理的に許容される基体又は生理的に許容される分散
剤での経口投与、非経口的な、注射等による投与が含まれると考えられる。ワク
チンの用量は投与経路に依存し、ワクチンを投与される人の年齢、及びそれより
も度合いは低いがワクチンを投与する人の体格にしたがって変化するであろう。ワクチンのポリペプチドは、ワクチンにおいて十分に免疫原性なものもあるが
、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免疫応答が高められるものも
ある。

【００４８】ワクチンのアジュバント効果を得るための種々の方法には、リン酸緩衝生理食
塩水中0.05〜0.1％溶液として通常用いられる水酸化アルミニウム又はホスフェ
ート（alum）のような薬剤の使用、0.25％溶液として用いられる合成ポリマーと
糖(Carbopol)との混合、それぞれ、70〜101℃の温度範囲で 30秒〜2 分間の熱処
理によるワクチン中のタンパク質の凝集が含まれる。アルブミンに対するペプシ
ン処理(Fab)抗体を用いた再活性化による凝集、又はシー.パルブム(C. parvum)
のような細菌細胞又はエンドトキシン又はグラム-陰性細菌のリポポリサッカラ
イド成分との混合、マンニッドモノ-オレエート(Aracel A) のような生理的に許
容される油状ビヒクル中での乳化又はブロック代体として用いられるパーフルオ
ロカーボン(Fluosol-DA)の20％溶液を用いた乳化も、用いることができる。この
発明によれば、DDA (ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド)はアジュバ
ントの興味ある候補であるが、フロイント不完全アジュバントならびにQuilAが
可能性として興味深い。さらなる可能性は、モノホスホリルリピド A (MPL)及び
ムラミルジペプチド (MDP)である。アジュバント効果の獲得に関し非常に興味ある（従って好ましい）他の可能性
は、Gosselin ら, 1992 (引用によりここに組み込まれる)に記載の技術を用いる
ことである。手短に言えば、この発明の抗原のような関連抗原の提示は、単核細
胞/マクロファージのFcγリセプターに対する抗体（又は抗原結合抗体フラグメ
ント）に抗原を接合することにより、高めることができる。特に、抗原と抗Fcγ
RIとの接合により、ワクチン接種の目的のための免疫原性が高められることが示
されている。

【００４９】他の可能性としては、上記のアジュバントと組合わせられるリンホカイン(例
えばIFN-γ、IL-2 及びIL-12)のような免疫調節物質又は合成IFN-γインデュー
サー、例えばポリ I:Cの使用が含まれる。実施例 3bで説明したように、こうし
た抗原とアジュバントとの混合により、優れたワクチン製剤がもたらされると考
えられる。多くの場合、ワクチンの多回数の投与、通常は6回を越えないワクチン接種、
より通常は4回を越えないワクチン接種、好ましくは1回以上、通常は少なくとも
約3回のワクチン接種が必要であろう。ワクチン接種は、通常は2〜12週間の間隔
、より通常は3〜5週間の間隔を置く。所望の保護免疫レベルを維持するためには
、1〜5年、通常は3年の間隔の周期的ブースターが望ましい。免疫化の過程後に
は、ワクチンに用いられる1以上のポリペプチドメンバーと同時培養(co-culture
)、例えばESAT-6 又はST-CFと同時培養したPBMCのインビトロでの増殖アッセイ
、特に、感作リンパ球から放出されたIFN-γレベルの測定を行ってもよい。アッ
セイは、通常の標識、例えば放射性核種、酵素、螢光剤等を用いて行ってもよい
。これらの技術は周知であり、これらのタイプのアッセイの例示として種々の特
許、例えば、米国特許第3,791,932号; 第4,174,384号、及び第3,949,064号に見
ることができる。

【００５０】遺伝的な変異により、異なる個体は、同一ポリペプチドに対して強度の異なる
免疫応答に反応し得る。従って、この発明のワクチンは、免疫応答を高めるため
に幾つかの異なるポリペプチドからなってもよい。ワクチンは、2以上のポリペ
プチドからなってもよい。それらのポリペプチドは全て上記されるとおりである
か、全てではなく幾つかのペプチドが、エム.ツベルクローシス複合体に属する
細菌から誘導されもよい。後者の例においては、ポリペプチドについて上記した
基準を必ずしも満たさないポリペプチドが、それら自身の免疫原性により作用し
たり、あるいは単にアジュバントとして作用することができる。こうした興味あ
るポリペプチドの例は、ESAT-6、TB10.4及びMPT64であるが、マイコバクテリア
から単離され得る他のあらゆる物質が候補として可能である。ワクチンは、1〜20個、例えば2〜20個又は3〜20個の異なるポリペプチド、例
えば3〜10 個の異なるポリペプチドからなってもよい。この発明のポリペプチドとアジュバントとを混合する理由の1つは、細胞性免
疫応答を効果的に活性化するためである。しかしながら、この効果は、他の方法
で、例えば、ワクチン中の有効な抗原を非病原性微生物で発現させることにより
得ることができる。こうした微生物の周知の例は、マイコバクテリア・ボビスBC
Gである。

【００５１】従って、この発明の他の重要な局面は、現在入手可能な生BCGワクチンの改良
であって、上記ポリペプチドをエンコードするDNA配列の1以上のコピーが、微生
物がポリペプチドを発現し、分泌し得るように微生物ゲノムに導入されている微
生物を有効成分として含むことからなる、結核複合体に属するマイコバクテリア
によって引き起こされるTBに対する、ヒトを含む動物の免疫化用ワクチンである
。この明細書において、用語「ゲノム」は、微生物の染色体ならびに染色体外の
DNA又はRNA、例えばプラスミドを指す。しかしながら、この発明のDNA配列は、
非病原性微生物の染色体に導入されていることが好ましい。というのは、これに
より、導入された遺伝物質の損失が防止されるからである。非病原性微生物は、例えばマイコバクテリウム、サルモネラ、シュードモナス
及びエシェリキア属からなる群から選択される細菌が好ましい。非病原性微生物
は、マイコバクテリウム・ボビスBCG、例えばマイコバクテリウム・ボビス BCG
菌株: Danish 1331であることが特に好ましい。

【００５２】この発明によるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の1以上のコ
ピーをエム.ボビスBCG 株由来のマイコバクテリウムに組み込むことにより、BCG
菌株の免疫原性効果が高まるであろう。この発明のヌクレオチド配列の1以上の
コピーの組み込みにより、一層免疫応答が高まると考えられ、その結果、この発
明の一局面は、ポリペプチドをエンコードするDNA配列の少なくとも2コピー、例
えば少なくとも5コピーが、微生物のゲノムに組み込まれているワクチンである
。DNA 配列のコピーは、同一ポリペプチドをエンコードする同一物、同一又は相
同のポリペプチドをエンコードする同一のDNA配列の変異体であってもよく、あ
るいは別の具体例では、ポリペプチドの少なくとも1つがこの発明によるもので
ある異なるポリペプチドをエンコードする異なるDNA配列であってもよい。この発明の生ワクチンは、この発明による形質転換非病原性細胞を培養し、こ
れらの細胞をワクチン用媒体に移し、任意に担体、ビヒクル及び/又はアジュバ
ント物質を加えることにより調製することができる。

【００５３】また、この発明は、ヒトを含む動物に、この発明によるポリペプチド又は上記
皮膚試験試薬を皮内注射することからなる、マイコバクテリウム・ツベルクロー
シス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによ
って動物に引起こされるTBを診断する方法に関する。注射部位における陽性の皮
膚応答は動物がTBを有していることを示し、注射部位における陰性の皮膚応答は
動物がTBを有していないことを示す。陽性の応答は、少なくとも 5 mmの直径を
有する皮膚応答であるが、より大きい、例えば少なくとも 1 cm、1.5 cm及び少
なくとも 2 cm の直径を有する反応が好ましい。皮膚試験試薬に用いられる組成
物は、ワクチンについて上記したのと同じ方法で調製することができる。ワクチンの調製及び使用に関する上記の開示に伴い、この発明は、この発明の
ポリペプチド、又は上述のこの発明のワクチン組成物、又は上述の生ワクチンを
ヒトを含む動物に投与することからなる、結核複合体に属するマイコバクテリア
によって引き起こされたTBに対して動物を免疫感作する方法にも関する。好まし
い投与経路は、非経口(例えば静脈内及び動脈内)、腹膜内、筋肉内、皮下、皮内
、経口、頬、舌下、鼻、直腸又は経皮経路である。

【００５４】多数の可能な診断アッセイ及び方法が想定される: 毒性マイコバクテリアによる過去又は現在の感染についての診断が目的である
場合、患者由来の単核細胞(すなわちTリンパ球)からなる血液試料を、この発明
の１以上のポリペプチドの試料と接触させることができる。この接触はインビト
ロで行うことができ、陽性反応は、例えば、T細胞の増殖又はγ-インターフェロ
ンのようなサイトカインの細胞外相(例えば培養上清)への放出であってもよい。
適当なインビボ試験は、上記皮膚試験であろう。患者由来の血清試料をこの発明
のポリペプチドに接触させることも考えられ、血清試料中の抗体とポリペプチド
との結合に関する立証が、過去又は現在の感染を示す。従って、この発明は、結核複合体に属する細菌による動物又はヒトでの現在又
は過去の感作をインビトロで診断する方法にも関する。この方法は、動物又はヒ
ト由来の血液試料を提供し、動物由来の試料とこの発明のポリペプチドとを接触
させることからなり、血液試料中の単核細胞による少なくとも1個のサイトカイ
ンの細胞外相への有意な放出が、動物が感作していることを示す。用語「有意な
放出」は、サイトカインの放出が、TB診断のない患者由来の血液試料からのサイ
トカインの放出よりも(スチューデントの両側(two-tailed)T 検定のような適当
な統計分析により定義された95%の信頼区間で)著しく多いことを意味する。通常
は、有意な放出は、こうした試料から観察される放出の少なくとも2倍である。

【００５５】あるいは、感染の可能性がある器官の試料を、この発明のポリペプチドに対し
て生じる抗体に接触させてもよい。当該分野で周知の方法による試料と抗体との
反応の立証は、現在の感染を示す。また、当然に、患者由来の血清試料をこの発
明のポリペプチドフラグメントの少なくとも1つと接触させ、抗体と抗原との反
応を可視化する周知の方法を用いることにより、血清中の抗マイコバクテリア抗
体の存在を立証できる可能性がある。この発明の核酸フラグメントを動物に投与するか、又はこの発明の核酸フラグ
メントもしくはそれに相補的な核酸フラグメントとともに試料をインキュベート
し、インキュベーションから得られるハイブリダイズした核酸の存在を(当該分
野で周知であるハイブリダイゼーションアッセイを用いて)検出することからな
る、ヒトを含む動物、又は試料においてマイコバクテリアの核酸の存在を立証す
る方法も、この発明に含まれる。こうしたTB診断法には、上記ヌクレオチド配列
の少なくとも一部からなり、PCR技術の使用により核酸フラグメント（又は相補
的なフラグメント）とハイブリッド形成する被試験動物又はヒト由来の試料中で
ヌクレオチド配列の存在を検出する組成物の使用が含まれる。

【００５６】開示された抗原のうちのある抗原がエム.ボビスBCGには存在しないが毒性マイ
コバクテリアには存在するという事実は、それらが、興味ある薬剤標的であるこ
とを示している。抗原は、マイコバクテリウムによる感染を容易にするレセプタ
ー分子又は毒素を構成している可能性があり、こうした機能が阻害された場合に
は、マイコバクテリウムの感染力が低減されるであろう。この発明の抗原から特に適当な薬剤標的を決定するためには、この発明のポリ
ペプチドの少なくとも1つをエンコードする遺伝子と必要な制御配列をマイコバ
クテリアの無毒性株(例えばBCG)に導入し、どのポリペプチドが毒性に重要であ
るかを決定することができる。特定のタンパク質が毒性に重要である/毒性に寄
与するといったん同定されれば、抗マコバクテリア剤を合理的に設計して、重要
遺伝子の発現を阻害するか、又は重要遺伝子産物を攻撃することができる。例え
ば、抗体又はそのフラグメント、例えばFab及び(Fab')₂ フラグメントを、当該
分野で公知の方法によってこうした重要なポリペプチドに対して調製し、その後
、予防又は治療剤として用いることができる。あるいは、例えば遺伝子の内因性
プロモーターを含む組換え発現系を用いて、重要な遺伝子産物の発現を選択的に
抑制する能力に関して、又は標的の作用を直接妨げる能力に関して、小分子をス
クーニングすることができる。次いで、これらの小分子が、マイコバクテリアの
毒性を抑制する治療剤又は予防剤として用いられる。

【００５７】あるいは、毒性マイコバクテリウムを無毒性にする抗マイコバクテリア剤は、
制御配列を発現するように操作可能に連結し、毒性マイコバクテリウムを形質転
換するために用いることができる。こうした抗マイコバクテリア剤は、マイコバ
クテリウムにおける剤の転写又は翻訳によって特定のマイコバクテリウムの複製
を阻害する。このような「新たな無毒」マイコバクテリウムは、例えばBCGと比
較して毒性マイコバクテリウムに免疫学的に極めて類似しているので、ワクチン
の目的について上記修飾BCGの優れた代替物となろう。最後に、イムノアッセイにおいてこの発明のポリペプチドと特異的に反応する
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又は上記抗体の特異的な結合フラ
グメントも、この発明の一部である。こうしたポリクローナル抗体の産生では、
適当な動物がポリペプチドによって免疫感作されること、及びこれらの抗体が次
いで、好適にはイムノアフィニティークロマトグラフィーにより単離されること
が必要である。モノクローナルの産生は、この発明が、免疫感作及び陽性ハイブ
リドーマのスクリーニングの双方に十分量の抗原を提供するため、当該分野で周
知の方法により行うことができる。

【００５８】参考文献 Andersen, P.及び I, Heron. 1993. Journal of Immunological Methods 161 29
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【００５９】図面の説明図1 rTB7.3、rTB10.4及びrCFP10に対するヒトリンパ球の応答。2人のヒトTB患者(
○)、及びrTB7.3 (A)、rTB10.4 (B)及びrCFP10 (C)の濃度を増していった、2人
のBCGワクチン接種を受けた健康なヒトドナー(△) 由来のPBMCの刺激から得られ
たIFN-γ 応答。全てのIFN-γ 分析は、3つのウェルからプールした上清につい
て2回行い、平均として示した。複数のウェルにおける偏差は、常に、平均の10
％未満であった。 50 pg/ml より下のIFN-γレベルを、陰性として考えた。図2 異なるドナー群におけるエム.ツベルクローシスからの低質量抗原に対するIFN
-γ応答。7人の健康なワクチン接種を受けていないドナー、7人の健康な BCG ワ
クチンを受けたドナー及び17人の TB患者を、5μg/mlのST-CF又は組換え抗原で
刺激した。個々の抗原特異的応答は、デルタ値(抗原刺激したウェルにおけるIFN
-γ放出−非刺激ウェルにおけるIFN-γ放出)として示す。ST-CF: 短期間培養濾
液、rTB7.3: Rv3221cの組み換え型、rTB10.4: Rv0288の組換え型、rCFP10: CFP1
0の組換え型、rESAT-6: ESAT-6の組換え型。

【００６０】実施例実施例1 ヒトTB患者由来PBMC の刺激に対するCFP10, ESAT-6及びTB10.4 の効
果 ESAT-6 抗原を、高レベルの放出されたIFN-γとの強いT細胞応答により、培養
濾液の低分子量フラクションで同定した(Andersenら、1995)。この抗原は現在、
多くの研究により、良好な刺激性の抗原特性を有することが立証され、TB患者な
らびにTBに感染した異なる種の動物の高い％によって強く認められている。最近
、他の小さないくつかのタンパク質が種々のマイコバクテリア抽出物から同定さ
れ、それらの免疫学的な関連性について評価された。近年、ESAT-6と同じオペロ
ンでエンコードされる10 kDaの分子（CFP10）が同定された(Berthet, F.X.1998)
。 2つの新規な低量のエム.ツベルクローシスタンパク質：TB10.4及びTB7.3 (Rv3
221c と同一であり、ESAT-6 遺伝子ファミリーのメンバーではない)が同定され
た。TB10.4 は、ESAT-6ファミリーの新規なメンバーとして同定された。我々の
データは、今までに試験されたESAT-6 ファミリーの3つのメンバー(TB10.4、CFP
10及びESAT-6)が、全てエム.ツベルクローシスに対するヒトの免疫応答によって
強く認識された標的であることを立証している。

【００６１】 CFP10、TB7.3及びTB10.4をエンコードする遺伝子のクローニング CFP10 をエンコードする遺伝子を前記のようにクローンした(Berthet, F.X. 1
998)。TB7.3 (以前CFP7Aと呼ばれた) をST-CFから同定し、相当する遺伝子を(WO
98/44119)に記載のようにクローンした。 TB10.4 (以前CFP7と呼ばれた) をエンコードする遺伝子は、Mab PV-2でλgt11
エム.ツベルクローシスのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっ
て同定し、以前(WO98/44119)に記載されるようにクローンした。

【００６２】組換え型TB7.3、TB10.4及びCFP10の発現及び精製ヒスチジンタグ標識した組換え型タンパク質 (rTB7.3、rTB10.4及びrCFP10)は
、本質的には製造業者により記載されるように、8M の尿素の存在下、タロンカ
ラム(Clonetech, Palo Alto, Ca) を用いて金属アフィニティークロマトグラフ
ィーによって発現及び精製した。均質化のためのタンパク質の精製は、1mlのHit
rapカラム(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を用いて陰イオン交換クロマトグラフ
ィーによって行った。タンパク質の濃度は、BCA試験（Micro BCA Protein Assay
Reagent kit, Pierce, Oud-Beijerland,オランダs）によって測定した。カブト
ガニアメーバ様細胞溶解物/Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)-試験により測定
したこれらの調製物中のLPS含量は、常に0.05ng LPS/タンパク質μg未満であっ
た。

【００６３】低量のエム.ツベルクローシスタンパク質の免疫学的認識 PBMCは、デンマーク、コペンハーゲン大学病院、肺医学部(Department of Pul
monary Medicine, University Hospital of Copenhagen)で診断及び治療された1
7人のデンマーク人のTB患者、及びBCG ワクチン接種した7人ならびにエム.ツベ
ルクローシスへの暴露が知られてない、ワクチン接種していない健康な7人から
得た。血液試料を、結核の診断後0〜6ヶ月間、BCGワクチン接種後2ヶ月〜40年間
回収した。上清におけるPBMCの分離、培養及び IFN-γの測定は、Ravnらによって以前記
載されたように行った。3つの組換え型タンパク質(rTB7.3、rTB10.4及びrCFP10)
の容量応答の研究は、0.3〜10μg抗原/培養液mlを用いて行った。2人のデンマー
ク人のTB患者及びBCGワクチン接種した2人の健康なデンマーク人ドナーのリンパ
球培養物を3つの抗原で刺激した。TB7.3 で刺激後のリンパ球の応答は、一般に10
00pg/ml未満のIFN-γの放出を伴って低かった(図 1A)。IFN-γも、この抗原に対
する増殖応答（データは提示せず）も、ST-CF で見られる応答の20%以上に達し
なかった。他の２つの抗原に対して、高レベルのIFN-γが、抗原の濃度が増大す
るにつれて誘発された(図 1 B 及びC)。抗原の最適濃度は1.25〜10μg/ml で、
これらの濃度はml当たり1000〜4000pg の範囲でIFN-γの応答を生じた。抗原を13〜17 人のTB患者、4〜7人の BCGワクチン接種者及び7人の非ワクチン
接種のドナーで調査した (図2)。TB7.3 は認識されたが、患者とワクチン接種し
たドナーとの両者において低レベルであった。TB患者の約40 % (13人中5人) は
、バックグラウンド以上のかなりのレベルでこの分子を認識し、応答中央値は、
これらのドナーの場合、ST-CF の場合の同じドナーでの4024pg IFN-γ/mlに対し
、659pg IFN-γ/mlであった。

【００６４】 TB10.4 は、BCG ワクチン接種をしたドナー(71% の応答者、IFN-γの中央値=
1mlにつき3968pgに対し、 ST-CFの場合、同じドナーで1mlにつき5335pg)及びTB
患者 (88% の応答者、IFN-γの中央値 = 3298pg/mlに対し、ST-CFの場合、同じ
ドナーで4707pg/ml)の両者によってより高いレベルで認識された。TB患者では、
CFP10 は著しいIFN-γの放出(IFN-γの中央値 = 2135pg/mlに対し、ST-CF の場
合、同じドナーで4755pg/ml)を誘発した。 TB10.4、CFP10及びESAT-6に対する著しいT細胞応答と比較すると、TB7.3は、
非常に低い活性を有する、弱くではあるが認識された抗原であった。 ESAT-6に例えると、TB患者では、TB10.4は著しく高いレベルのIFN-γを誘発し
た(P = 0.0017, ウィルコキソン・サイン(Wilcoxon Signed)・ランク試験)のに
対し、CFP10 及びESAT-6に対するT 細胞の応答は類似していた(P = 0.121)。CFP1
0及びTB10.4の両方は、70％未満のTB患者により認識され、興味深いことに、こ
れら2つの効力のある免疫原性分子は、ESAT-6との共通点をいくつか有する：即
ち、それらは大きさとpI (10kDa と4.5)がほぼ同じで、ESAT-6に対するアミノ酸
配列同一性をそれぞれ15 % 及び21.9 %示し、上記で定義したようにesat-6遺伝
子ファミリーのメンバーである。表示されたデータは、ESAT-6 ファミリーのメンバーに対する宿主の免疫応答
に厳密に集束しており、このファミリーが将来的なTBのワクチン及び診断法に関
連し得る幾つかの分子を含むことを立証している。

【００６５】実施例2 ESAT-6 ファミリーから低量のタンパク質をエンコードする遺伝子
のクローニングタンパク質の大腸菌中での組換え型発現のため、Rv0287、Rv1036c、Rv1037c、
Rv2346c、Rv2348c、Rv2653c、Rv2654c、Rv3020c、Rv3444c、Rv3445c、Rv3890c、
Rv3891c、Rv3904c及びRv3905cをエンコードする遺伝子を、遺伝子特異的なプラ
イマーでのPCR 増幅によって、発現ベクターpMCT3 (6つの N-末端ヒスチジン残
基を含むことだけを除いては、pMCT6 (Harboe ら、1998)と同一)にクローンした
。タンパク質のクローニングのため、以下の遺伝子特異的なプライマーを使用し
た： Rv0287: PA0287: 5'- CTGAGATCTATGAGCCTTTTGGATGC- 3' (BglII) PB0287: 5'- CTAAGCTTGGATCCTCAGAACCCGGTATAGG - 3' (BamHI) Rv1036c: PA1036c: 5'- CTGAGATCTTTGATCCCCGGTCGGATGGTG (BglII) PB1036c: 5'- CTCCCATGGGTCAGGTGATCGAATCAGCCA (NcoI) Rv1037c: PA1037c: 5'- CTGAGATCTATGACCATCAACTATC - 3' (BglII) PB1037c: 5'- CTAAGCTTGGATCCTTAGGCCCAGCTGGAGCC - 3' (BamHI) Rv2346c: PA2346c: 5'- CTGAGATCTATGACCATCAACTATC - 3' (BglII) PB2346c: 5'- CTAAGCTTGGATCCTCAGGCCCAGCTGGAGCC - 3' (BamHI) Rv2348c: PA2348c: 5'- CTGAGATCTGTGCTTTTGCCTCTTGGTCCG (BglII) PB2348c: 5'- CCCAAGCTTCTAGCCGGCCGCCGGAGA (HindIII) Rv2653c: PA2653c: 5'- CTGAGATCTTTGACCCACAAGCGCACTAAA (BglII) PB2653c: 5'- CTCCCATGGTCACTGTTTCGCTGTCGGGTTC (NcoI) Rv2654c: PA2654c: 5'- CTGAGATCTATGAGCGGCCACGCGTTGGCT (BglII) PB2654c: 5'- CTCCCATGGTCACGGCGGATCACCCCGGTC (NcoI) Rv3020c: PA3020c: 5'- CTGAGATCTATGAGTTTGTTGGATGCCCAT (BglII) PB3020c: 5'- CTCCCATGGTTAAAACCCGGTGTAGCTGGA (NcoI) Rv3444c: PA3444c: 5'- CTGAGATCTATGAACGCAGACCCCGTG - 3' (BglII) PB3444c: 5'- CTAAGCTTGGATCCCTAGCGTGCCCAAGCTCC - 3' (BamHI) Rv3445c: PA3445c: 5'- CTGAGATCTATGGTTGAACCGGGAAGG - 3' (BglII) PB3445c: 5'- CTAAGCTTGGATCCCTATAGGTCGCCGCCGGC - 3' (BamHI) Rv3890c: PA3890c: 5'- CTGAGATCTATGTCAGATCAAATCACG - 3' (BglII) PB3890c: 5'- CTAAGCTTGGATCCTTAGAACAAGCCCGCG - 3' (BamHI) Rv3891c: PA3891c: 5'- CTGAGATCTATGGCAGACACAATTCAGG - 3' (BglII) PB3891c: 5'- CTAAGCTTCCCGGGTCAGGATCCGTGGCTAGC - 3' (SmaI) Rv3904c: PA3904c: 5'- CTGAGATCTATGGATCCGACCGTGTTGG - 3' (BglII) PB3904c: 5'- CTGCCATGGTCACGACCACATACCC - 3' (NcoI) Rv3905c: PA3905c: 5'- CTGAGATCTATGGGTGCCGACGACAC - 3' (BglII) PB3905c: 5'- CTAAGCTTGGATCCTCAGCCACCGCCCACC - 3' (BamHI)

【００６６】上記に挙げたプライマーは、各配列の後に示した制限部位をもたらす。制限部
位は、pMCT3にクローニングするために用いられる。ATGに代わる開始コドンが本
来の配列で用いられる場合、プライマーは、代わりにATGコドンを導入する。PCR
反応物は、400μMのdNTP混合物(Boehringer Mannheim)を有する1×PCR緩衝液＋
Mg (Boehringer Manheim) 中10 ngのエム.ツベルクローシスの染色体DNA、0.4 p
Mの各プライマー及び50 μlの反応容量中1.5 ユニットの Tag DNA ポリメラーゼ
(Boehringer Mannheim)を含有した。PTC-200サーマルサイクラー(M J Research,
Inc.)を用いて、反応物をはじめ94℃に5分間加熱し、92℃で1分間、52℃で1分間
及び72℃で2分間のプログラムを30サイクル行い、7分72℃で終了した。PCR産物を
pRC2.1クローニングベクターにクローンし、製造業者によって記載されるように
、ワン・ショット(One Shot)(登録商標)大腸菌細胞(Invitrogen, Leek, オラン
ダ)に形質転換した。プラスミドDNAを適当な制限酵素（プライマー配列を参照）
で消化し、pMCT3にクローンし、大腸菌XL-1 Blue細胞に形質転換した。正確な挿
入は、常に塩基配列決定によって確認した。DNA塩基配列決定法は、自動ゲル読
み取り装置(model 373A; Applied Biosystems)と組み合わせてサイクル塩基配列
決定システムを用いてStatens Serum Institutで行った。

【００６７】組換え型Rv0287、Rv1036c、Rv1037c、Rv2346c、Rv2348c、Rv2653c、Rv2654c、Rv
3020c、Rv3444c、Rv3445c、Rv3890c、Rv3891c、Rv3904c及びRv3905cの発現及び
精製組換え型タンパク質の発現及び金属アフィニティー精製は、本質的に製造業者
によって記載されるようにして行った。100μg/mlのアンピシリン及び12.5μg/ml
のテトラサイクリンを含むLB-培地に、組換え型pMCT3プラスミドを収容するXL1-
Blue 細胞の一晩培養液を接種した。培養物を、OD₆₀₀ の密度が0.5に達するまで
37℃で振盪した。その後、IPTG を1 mMの最終濃度まで添加し、培養物をさらに2
〜16時間インキュベートした。細胞を採収し、1×超音波処理緩衝液+ 8 Mの尿素
で再懸濁し、パルス間で30秒停止しながら5×30秒超音波処理した。遠心分離した
後、溶解物を10 mlのタロン樹脂 (Clontech, Palo Alto, USA)を含むカラムに加
えた。カラムを洗浄し、製造業者によって記載されるように溶離した。組換え型タンパク質を含むフラクションを貯留し、均質なタンパク質調製物を
得て、貯留したフラクションを多溶離技術(multielution technique) (Andersen
and Heron, 1993) 又はHitrapカラムで陰イオン交換(Pharmacia, Uppsala, Swe
den)のどちらか一方に付した。

【００６８】

【表２】

【００６９】

【表３】

【００７０】合成ペプチドの合成 3つの抗原(Rv3444c, Rv3890c及びRv3905c)は、ライデン大学 (Leiden Univers
ity) メディカルセンター(Albinusdreef 2, 2333 Leiden, オランダ)の感染症及
び免疫血液学/血液銀行C5-P部で、ABIMED ペプチドシンセサイザー (ABIMED, La
ngenfeld,ドイツ)で標準的な固相方法によって合成ペプチドとして合成した。ペプチドには以下のアミノ酸を含めた； Rv3444c p1: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 1-18 Rv3444c p2: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 11-28 Rv3444c p3: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 21-38 Rv3444c p4: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 31-48 Rv3444c p5: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 41-58 Rv3444c p6: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 51-68 Rv3444c p7: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 61-78 Rv3444c p8: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 71-88 Rv3444c p9: SEQ. ID. NO. 21: アミノ酸 81-100

【００７１】 Rv3890c p1: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸1-18 Rv3890c p2: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸11-28 Rv3890c p3: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 21-38 Rv3890c p4: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 31-48 Rv3890c p5: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 41-58 Rv3890c p6: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 51-68 Rv3890c p7: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 61-78 Rv3890c p8: SEQ. ID. NO. 25: アミノ酸 71-95

【００７２】 Rv3905c p1: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 1-18 Rv3905c p2: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 11-28 Rv3905c p3: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 21-38 Rv3905c p4: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 31-48 Rv3905c p5: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 41-58 Rv3905c p6: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 51-68 Rv3905c p7: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 61-78 Rv3905c p8: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 71-88 Rv3905c p9: SEQ. ID. NO. 31: アミノ酸 81-103

【００７３】実施例3A: T細胞系のインターフェロン-γの誘導精製した組換え型タンパク質を、IFN-γの放出として測定されるT細胞応答の
誘導能についてスクリーンした。スクリーニングは、PPD陽性ドナーから生じたT
細胞系のIFN-γの誘導の試験及び/又はTB患者、PPDが陽性ならびに陰性の健康な
ドナーから得られるPBMC調製物における応答の測定を伴った。ヒトのドナー: PBMC は、インビトロでPPDに対する応答が陽性の健康なドナーか
ら得た。 T細胞系の調製: 1 mlの総容量中5細菌/細胞の割合で、新たに単離された1〜5×1
0⁶ のPBMCを生存可能なエム.ツベルクローシスと1.5時間培養することによって
、T細胞系を調製した(ドナー1及び2)。洗浄後、細胞をHEPESで補足したRPMI 1640
培地（Gibco, Grand Island, N.Y）及び10％の熱不活化NHS中で培養した。ある
いは、1〜5 ×10⁶ の新たに単離されたPBMCを5 μg/mlの ST-CFと培養すること
によって、T細胞系統を調製した(ドナー3〜5)。37℃及び5% CO₂で7日培養した後
、T細胞をウェル当たり30-50 Uのr-IL-2 (組換え型インターロイキン 2) (Boehr
inger Mannheim)でおよそ7日間補足した。最後に、5 ×10⁵のオートロガス抗原提
示細胞/ml(ドナー1及び2)又は1×10⁶細胞/照射(2000 RAD)オートロガスPBMCのml
(ドナー3〜5) の存在下、5μg/mlのPPD及び/又はST-CF、組み換え型のRv2653c
、Rv3891c、Rv3904cならびにRv3444c、Rv3890c及びRv3905cのペプチド貯留(2〜9
ペプチド)で1-5×10⁵細胞/mlを刺激することによって、組換え抗原及び合成ペプ
チドに対する反応性について、T細胞系を試験した。抗原なし(No ag) 及びPHA
を陰性及び陽性の対照としてそれぞれ使用した。上清を培養の4日後採収し、IFN-
γの存在が分析されるまで-20℃で貯蔵した。異なるT細胞系で得られた応答を表４に示す。ここで、ドナー1及び2は、生存
可能なエム.ツベルクローシスにより駆動されるT細胞系に基づくのに対し、ドナ
ー3〜5は、ST-CFで刺激することによって生じる。

【００７４】

【表４】

【００７５】組換え型抗原Rv2653c、Rv3891c及びRv3904c ならびに抗原Rv3444c、Rv3890c及
びRv3905cをカバーするペプチドに関する表4に示す結果は、これらの抗原がPPD
陽性の個体から生じるT細胞系でIFN-γ産生を誘導できることを示す。

【００７６】実施例3B ヒトのTB患者又はBCGワクチン接種者におけるインターフェロン-γ
の誘導ヒトのドナー: PBMC は、エム.ツベルクローシスへの暴露が知られていないBCG
ワクチンを接種した健康なドナー及び培養又は顕微鏡検査法を用いてTBに感染し
たと判明した患者から得た。血液試料は、診断の0〜6ヶ月後TB患者から採取した
。リンパ球の調製及び細胞培養: PBMC をLymphoprep (Nycomed, Oslo, ノルウェー
)でヘパリン添加血液の勾配遠心分離によって新たに単離し、使用するまで液体
窒素で貯蔵した。1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Gibo BRL, Life Technol
ogies)、1% の非必須アミノ酸(FLOW, ICN Biomedicals, CA, USA)、及び地方の
血液銀行の正常なヒトのAB0 血清(NHS)10％で補足した完全RPMI 1640 培地(Gibc
o, Grand Island, N.Y.)で、細胞を再懸濁した。細胞の数及び生存能力を、ニグ
ロシン染色によって測定した。マイクロタイタープレート(Nunc, Roskilde, Denm
ark)に50 μl中1.25×10⁵ のPBMCとともに培養物を定着させ、ST-CF PDD、Rv028
7、Rv1036c、 Rv1037c、Rv2653c、Rv3445c、Rv3891c及びRv3904cで刺激した。抗
原なし(No ag)及び植物性赤血球凝集素(PHA)を、陰性ならびに陽性の対照として
それぞれ使用した。培養、貯留の5日後、サイトカインを検出するための上清を
採収し、使用するまで-80℃で貯蔵した。

【００７７】サイトカインの分析: インターフェロン-γ(IFN-γ) を、市販のモノクローナル
抗体ペア(Endogen)を用いて標準的なサンドウィッチELISA 技術で検出し、製造
業者の指示に従って使用した。組換え型IFN-γ(Endogen) を基準として用いた。全
てのデータは2つ(duplicate)のウェルの平均であり、ウェル間の偏差は平均の10
% を超過しなかった。50 pg/ml 未満のサイトカインのレベルは、陰性であると
考えた。42人の各ドナーの応答を、表5及び6に示す。表5に示すように、幾つかの組換えタンパク質で刺激した後、著しいIFN-γの
放出が認められる。6人のドナーに対して、Rv0287での刺激は高いIFN-γの応答
を生じる。Rv1037c、 Rv3891c及びRv3904cで刺激した場合、ドナーの40%〜60%は
IFN-γ応答の中央値を示すのに対し、この実験のRv3445c での刺激によっては、
限定された応答が得られるに過ぎない。

【００７８】

【表５】

【００７９】

【表６】

【００８０】

【表６（つづき１）】

【００８１】

【表６（つづき２）】

【００８２】組換え型抗原Rv1036c、 Rv2653c、Rv3891c及びRv3904c に関する表6に示す結
果は、これらの抗原が健康なPPD及び/又はST-CF陽性の個体及び/又はTb患者由来
のPBMCでIFN-γ産生を誘導できることを示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 rTB7.3、rTB10.4及びrCFP10に対するヒトリンパ球の応答。2人の
ヒトTB患者(○)、及びrTB7.3 (A)、rTB10.4 (B)及びrCFP10 (C)の濃度を増して
いった、2人のBCGワクチン接種を受けた健康なヒトドナー(△) 由来のPBMCの刺
激から得られたIFN-γ 応答。全てのIFN-γ 分析は、3つのウェルからプールし
た上清について2回行い、平均として示した。複数のウェルにおける偏差は、常
に、平均の10％未満であった。 50 pg/ml より下のIFN-γレベルを、陰性として
考えた。

【図２】異なるドナー群におけるエム.ツベルクローシスからの低質量抗
原に対するIFN-γ応答。7人の健康なワクチン接種を受けていないドナー、7人の
健康な BCG ワクチンを受けたドナー及び17人の TB患者を、5μg/mlのST-CF又は
組換え抗原で刺激した。個々の抗原特異的応答は、デルタ値(抗原刺激したウェ
ルにおけるIFN-γ放出−非刺激ウェルにおけるIFN-γ放出)として示す。ST-CF:
短期間培養濾液、rTB7.3: Rv3221cの組み換え型、rTB10.4: Rv0288の組換え型、
rCFP10: CFP10の組換え型、rESAT-6: ESAT-6の組換え型。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年８月７日（２００１．８．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｐ 31/06 ４Ｈ０４５Ａ６１Ｐ 11/00 Ｃ０７Ｋ 14/35 31/06 16/16 Ｃ０７Ｋ 14/35 19/00 16/16 Ｃ１２Ｎ 1/21 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｒ 1:32 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＣ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:32） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者スクジョ，リッケデンマーク、ディーケー−2640 ヘデハウゼン、エル．エー．リングスヴァンゲ 17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 BA50 CA04 CA07 DA05 EA04 GA01 GA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE11 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01X AA36Y AA90X AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA45 CA46 4C085 AA03 AA08 AA24 AA38 BA09 CC07 DD33 DD86 EE03 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA11 EA31 EA50 FA34 FA72 FA74 GA23 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 esat-6遺伝子ファミリーのメンバーによってエンコードされ
るアミノ酸配列からなるか、又はesat-6遺伝子ファミリーのメンバーによってエ
ンコードされるポリペプチドフラグメントと少なくとも70％の配列同一性を有し
、同時にesat-6遺伝子ファミリーのメンバーによってエンコードされるポリペプ
チドフラグメントに免疫学的に等価なアミノ酸類似体からなり、但しRv0287、 R
v0288、 Rv1037c、 Rv1038c、 Rv1197、 Rv1198、 Rv1792、 Rv1793、 Rv2346c
、 Rv2347c、 Rv3019c、 Rv3619c、 Rv3620c、 Rv3874及びRv3875からなる群か
らは選択されない、実質的に純粋なポリペプチドフラグメント。
【請求項２】 SEQ ID NOs: 7、13、15、17、19、21、23、25、27、29 又は
31に示すようなアミノ酸配列からなるか、又はSEQ ID NOs: 7、13、15、17、19
、21、23、25、27、29 及び31からなる群から選択されるポリペプチドフラグメ
ントと少なくとも70％の配列同一性を有し、同時にSEQ ID NOs: 7、13、15、17
、19、21、23、25、27、29 及び31からなる群から選択されるポリペプチドフラ
グメントに免疫学的に等価なアミノ酸配列類似体からなる実質的に純粋なポリペ
プチドフラグメント。
【請求項３】 SEQ ID NOs: 7、13、15、17、19、21、23、25、27、29 又は
31に示すアミノ酸配列のT-細胞エピトープからなるか、又はアミノ酸配列のT-細
胞エピトープと少なくとも70％の配列同一性を有し、同時に該ポリペプチドフラ
グメントに免疫学的に等価な実質的に純粋なポリペプチドフラグメント。
【請求項４】本質的に純粋な形態である前記請求項のいずれかによるポリ
ペプチドフラグメント。
【請求項５】少なくとも7アミノ酸残基、例えば少なくとも8、少なくとも
9、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18
、少なくとも20、少なくとも22、少なくとも24及び少なくとも30アミノ酸残基長
を有する前記請求項のいずれかによるポリペプチドフラグメント。
【請求項６】いずれのシグナル配列も有しない前記請求項のいずれかによ
るポリペプチドフラグメント。
【請求項７】配列同一性が少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少な
くとも 90％、少なくとも 91％、少なくとも92％、少なくとも 93％、少なくと
も 94％、少なくとも 95％、少なくとも 96％、少なくとも 97％、少なくとも 9
8％、少なくとも 99％及び少なくとも 99.5％である前記請求のいずれかによる
ポリペプチドフラグメント。
【請求項８】前記請求項のいずれかによる少なくとも 1つのポリペプチ
ドフラグメント及び少なくとも 1つの融合パートナーからなる融合ポリペプチド
。
【請求項９】融合パートナーが、請求項１〜７のいずれかに定義されるポ
リペプチドフラグメント、及び結核複合体に属する細菌由来の別のポリペプチド
フラグメント、例えばESAT-6又はその少なくとも1つのT-細胞エピトープ、TB10.
4又はその少なくとも1つのT-細胞エピトープ、及びMPT59又はその少なくとも1つ
のT-細胞エピトープからなる群から選択される請求項８による融合ポリペプチド
。
【請求項１０】融合パートナーが、DnaK、GroEL、ウレアーゼ、グルタミ
ンシンセターゼ、プロリンリッチ複合体、L-アラニンデヒドロゲナーゼ、ホスフ
ェート結合タンパク質、Ag 85複合体、HBHA (ヘパリン結合血球凝集素)、MPT51
、スーパーオキシドジスムターゼ、19 kDaリポプロテイン、α-クリスタリン、G
roES及びMPT59からなる群から選択される請求項８による融合ポリペプチドフラ
グメント。
【請求項１１】ポリペプチドの自己アジュバント作用を可能にするよう脂
質化される前記請求項のいずれかによるポリペプチド。
【請求項１２】医薬として用いるための前記請求項のいずれかによる実質
的に純粋なポリペプチド。
【請求項１３】動物においてマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マ
イコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって引起
こされる結核に対する診断又はワクチン接種用医薬組成物の製造における前記請
求項のいずれかによる実質的に純粋なポリペプチドの使用。
【請求項１４】請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドからなる免
疫組成物。
【請求項１５】さらに免疫学的かつ医薬的に許容される担体、ビヒクル又
はアジュバントからなる請求項１４による免疫組成物。
【請求項１６】担体が、ポリペプチドが疎水性の非共有相互作用により結
合するプラスチックのようなポリマー、例えばポリスチレン、ポリペプチドが共
有結合する多糖及びポリペプチドのようなポリマー、例えばウシ血清アルブミン
、オバルブミン又はキーホールリンペットヘモシアニンからなる群から選択され
；ビヒクルが希釈剤及び懸濁剤からなる群から選択され；かつアジュバントがジ
メチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、Quil A、ポリI:C、フロイン
トの不完全アジュバント、IFN-γ、IL-2、IL-12、モノホスホリルリピドA (MPL)
及びムラミルジペプチド(MDP)からなる群から選択される請求項１５による免疫
組成物。
【請求項１７】少なくとも 2つの異なるポリペプチドフラグメントからな
り、異なるポリペプチドフラグメントがそれぞれ請求項１〜１１のいずれかによ
るポリペプチドである請求項１４〜１６のいずれかによる免疫組成物。
【請求項１８】 3〜20個の異なるポリペプチドフラグメントからなり、異
なるポリペプチドフラグメントそれぞれが請求項１〜１１のいずれかである請
求項１７による免疫組成物。
【請求項１９】ワクチンの形態である請求項１４〜１８のいずれかによる
免疫組成物。
【請求項２０】皮膚試験試薬の形態である請求項１４〜１８のいずれかに
よる免疫組成物。
【請求項２１】請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドをエンコー
ドするDNA配列からなるDNAフラグメントの少なくとも 1つのコピーが、微生物が
ポリペプチドを発現し、任意に分泌し得るように微生物ゲノムに導入されている
非病原性微生物を有効成分として含むことからなる、結核複合体に属するマイコ
バクテリアによって引き起こされる結核に対する、ヒトを含む動物の免疫化用ワ
クチン。
【請求項２２】微生物が細菌である請求項２１によるワクチン。
【請求項２３】細菌が、マイコバクテリウム、サルモネラ、シュードモナ
ス及びエシェリキアの属からなる群から選択される請求項２２によるワクチン。
【請求項２４】微生物が、マイコバクテリウム・ボビスBCG、例えばマイ
コバクテリウム・ボビスBCG株: Danish 1331である請求項２３によるワクチン。
【請求項２５】請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドをエンコー
ドするDNAフラグメントの少なくとも 2つのコピーが、微生物のゲノム中に導入
される請求項２１〜２４のいずれかによるワクチン。
【請求項２６】コピー数が少なくとも5である請求項２５によるワクチン
。
【請求項２７】検出手段と任意に組み合わさった、請求項１〜１１のいず
れかによるポリペプチドからなる、ヒトを含む動物における結核診断用組成物。
【請求項２８】 1) esat-6遺伝子ファミリーメンバーである核酸配列から
なり、 2) 少なくとも 10ヌクレオチド長を有し、かつSEQ ID NOs: 6、12、14、16、18
、20、22、24、26、28又は30に開示されるヌクレオチド又はそれに対する相補配
列を有する核酸フラグメントと適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする単離形態の核酸フラグメント。
【請求項２９】 DNAフラグメントである請求項２８による核酸フラグメン
ト。
【請求項３０】医薬として用いるための請求項２８又は２９による核酸フ
ラグメント。
【請求項３１】マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリ
ウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボビスによって引起こされる結核
に対する診断又はワクチン接種用の医薬組成物の製造における請求項２８又は２
９による核酸フラグメントの使用。
【請求項３２】ワクチンを投与したヒトを含む動物によって抗原をインビ
ボで発現させ、発現される抗原の量が、ヒトを含む動物における結核複合体のマ
イコバクテリア感染に対する耐性を実質的に増大するのに有効な、請求項２８又
は２９による核酸フラグメントからなるワクチン。
【請求項３３】請求項２８〜２９による核酸フラグメントからなる複製可
能な発現ベクター。
【請求項３４】ウイルス、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド及
びミニ染色体からなる群から選択される請求項３３によるベクター。
【請求項３５】請求項３３又は３４による少なくとも 1つのベクターを有
する形質転換細胞。
【請求項３６】結核複合体に属する細菌、例えばエム.ツベルクローシス
ボビスBCG細胞である請求項３５による形質転換細胞。
【請求項３７】請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドを発現する
請求項３５又は３６による形質転換細胞。
【請求項３８】検出用手段と任意に組み合わさった、請求項２３又は２４
による核酸フラグメントからなる、ヒトを含む動物での結核の診断用組成物。
【請求項３９】請求項２８又は２９による核酸フラグメントを、宿主細胞
中で複製可能なベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入し
、宿主細胞を、ポリペプチドの発現を行うのに十分な条件下、培養培地で培養し
、かつ宿主細胞又は培養培地からポリペプチドを回収するか、又は、結核複合体の全マイコバクテリアから、又はその溶解物又はフラクション、例
えば細胞壁含有フラクションから、ポリペプチドを単離するか、又は固相又は液相のペプチド合成によってポリペプチドを合成することからなる
、請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドの産生方法。
【請求項４０】請求項１〜１１のいずれかによるポリペプチドを調製し、
合成又は単離し、かつワクチン用媒体にポリペプチドを可溶化又は分散し、任意
に他のエム.ツベルクローシス抗原及び/又は担体、ビヒクル及び/又はアジュバ
ント物質を加えるか、又は請求項３５〜３６のいずれかによる細胞を培養し、ワクチン用媒体に細胞を移
し、かつ担体、ビヒクル及び/又はアジュバント物質を任意に加えることからな
る、請求項１４〜２０のいずれかによる免疫組成物の産生方法。
【請求項４１】ヒトを含む動物に、請求項１〜１１のいずれかによるポリ
ペプチド又は請求項２０による免疫組成物を皮内注射することからなり、注射部
位での陽性の皮膚応答が動物が結核を有していることを示し、注射部位での陰性
の皮膚応答が動物が結核を有していないことを示す、マイコバクテリウム・ツベ
ルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌム又はマイコバクテリウム・ボ
ビスによって動物に引起こされる結核の診断方法。
【請求項４２】ヒトを含む動物に、請求項１〜１１のいずれかによるポリ
ペプチド、請求項１９による免疫組成物又は請求項２１〜２６のいずれかによる
ワクチンを投与することからなる、結核複合体に属するマイコバクテリアによっ
て引起こされる結核に対する動物の免疫化方法。
【請求項４３】ポリペプチド、免疫組成物又はワクチンが、非経口(例え
ば静脈内及び動脈内)、腹膜内、筋肉内、皮下、皮内、経口、頬、舌下、鼻、直
腸又は経皮経路によって投与される請求項４２による方法。
【請求項４４】動物又はヒト由来の血液試料を提供し、請求項１〜１１の
いずれか１つによるポリペプチドと動物由来の試料を接触させることからなり、
血液試料中の単核細胞による少なくとも１つのサイトカインの細胞外相への有
意な放出が、動物が感作されていることを示す、結核複合体に属する細菌での動
物又はヒトでの過去もしくは現在の感作を診断する方法。
【請求項４５】イムノアッセイで請求項１〜１のいずれかによるポリペプ
チドと特異的に反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、もしくは
該抗体の特異的な結合フラグメント。