JP2003510072A

JP2003510072A - 遺伝子発現を改変するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2003510072A
Application number: JP2001526924A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエル．フォドール，; ハグディースジェイ．ラムスーンダール，
Original assignee: アレクシオンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2003-03-18
Also published as: MXPA02003232A; EP1220928A2; AU7744800A; WO2001023541A2; WO2001023541A3; CA2385162A1

Abstract

(57)【要約】細胞における標的遺伝子の発現を、外因性ＤＮＡ配列をこの標的遺伝子に導入することにより調節することに有用な、新規な方法および組成物が開示される。本発明の組成物および方法は、哺乳動物を含むノックアウト動物の生産に有用である。本発明の細胞における真核生物遺伝子の発現を調節する方法は、細胞を核酸構築物でトランスフェクトする工程であって、この構築物は、第１の遺伝子配列に相同な第１の構築物配列、選択マーカーをコードする配列、および第２の遺伝子配列に相同な第２の構築物配列を含み、該第１および第２の遺伝子配列は、該真核生物遺伝子の１以上のイントロン領域の少なくとも一部を独立して含む、工程、およびこの選択マーカーを該哺乳動物遺伝子に組み込む工程を包含し、この選択マーカーの発現は、該細胞における該哺乳動物遺伝子の発現の調節を生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、組換え遺伝学および免疫学を含む生物学的科学に関する。
より詳細には、非ヒトノックアウト動物（好ましくは哺乳動物）が本明細書中に
記載され、その中で１つ以上の遺伝子の発現が変化される。異種移植片がまた本
明細書中で提供され、その中で、移植片のレシピエントによる拒絶を防止するた
め、または拒絶の可能性を減少させるために、１つ以上の遺伝子の発現が調節さ
れる。

【０００２】（背景）侵入する病原、毒素、および他の外来の物質に対する哺乳動物（ヒトを含む）
の免疫応答は、一緒に作用する多くの特定化した細胞に関わる。リンパ球は、免
疫系の特異性の原因である白血球の１つのクラスである。リンパ球の２つの重要
なクラスは、Ｔ細胞およびＢ細胞である。Ｔ細胞は胸腺で発生し、そして細胞媒
介免疫の原因である。多くの型の特定化したＴ細胞が存在し、例えば、ヘルパー
Ｔ細胞（これは、他の型の白血球の活性を増大する）、サプレッサーＴ細胞（こ
れは、他の白血球の活性を抑制する）、および細胞傷害性Ｔ細胞（これは、細胞
を殺傷する）である。Ｂ細胞は骨髄で発生し、そして抗体の産生および分泌によ
ってその効果を発揮する。

【０００３】協調的な免疫応答の秘訣は補体であり、これは、米国特許第５，６７９，３４
５号に記載されるように、多くの免疫学的に媒介される疾患（例えば、全身性狼
瘡、エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、慢性間接リウマチ、お
よび免疫−溶血性貧血）において観察される組織損傷の病原に関与する。補体は
また、移植された器官移植片の拒絶に関与する。補体は、拒絶から生じる炎症状
態または移植片における感染、虚血、および脈管の血栓症によって重ね合わされ
た（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄ）炎症状態に起因する、移植における組織損傷、
ならびに器官移植片を受けていない患者における同様な原因による炎症に起因す
る組織損傷の大部分の原因である。特に、細胞への補体の攻撃は、免疫媒介移植
片拒絶の急速な発症段階の中心であり（超急性拒絶）、ここで数時間内に補体の
活性化および引き続く組織の損傷が生じる。

【０００４】移植片拒絶は、多くの異なる機構を介して起こり得、拒絶の時間経過は特定の
機構の特性である。移植の数分または数時間内に起こる早期の拒絶（超急性拒絶
）は、移植手術の時点で存在する成分による補体活性化に関与する。活性化は、
移植片の「外来性」または非自己マーカーと反応性の予め形成された抗体による
古典的な経路を介してか、または、例えば、移植前の保存の間の器官への虚血性
損傷の結果としての、移植片における組織損傷に対する応答における代替経路を
介して起こり得る。急性の拒絶は、移植後数日から数週間起こり、そして移植を
成り立たせる外来性組織に対する宿主の感作によって生じる。一旦、宿主の免疫
系が移植された組織を外来性であると同定すると、免疫系の全ての手段はこの移
植片に対して整理され、これは特異的（抗体およびＴ細胞依存性の）応答ならび
に非特異的（食細胞および補体依存性の）応答の両方を含む。慢性拒絶は、通常
、移植片のレシピエントが免疫抑制される場合にのみ起きる。次いで、この移植
片は、究極的にはこの移植片の生存に影響する変化を組織が起こすのに十分長く
生存し得る。このような変化としては、過形成および組織肥大、ならびに血管腔
の狭小化を導き、そしてこの移植片組織の酸素の供給を強力に減じる内皮細胞の
損傷が挙げられる。

【０００５】ブタ組織の異種移植片拒絶は、血管に沿って並ぶブタ内皮細胞で発現される炭
水化物外来性抗原（例えば、Ｇａｌα（１，３）ガラクトース）を認識する天然
のヒト抗体によって誘発される。Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（２０）
：１２２１−１２２２（１９９９年８月２０日）。米国特許第５，８２１，１１
７号は、クローンされた変異体ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ配列（詳細には、野生型遺伝子のエキソン内の）を用いて、野生型のブ
タＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を分裂することに
よる、異種移植片拒絶の阻害を記載する。得られた変異体遺伝子は、患者の免疫
系による移植された異種移植片の拒絶が回避されるという予期された結果と一致
して、機能的ガラクトシルトランスフェラーゼをコードしない。

【０００６】このようないわゆる「ノックアウト」哺乳動物において、内因性遺伝子の発現
は、遺伝子操作を通して変化（代表的には、抑制）される。ノックアウト哺乳動
物の調製は、代表的には、標的遺伝子の発現を抑制するために、未分化の細胞型
（胚幹細胞と呼ばれる）に核酸構築物を導入することが必要とされる。この細胞
は、哺乳動物の胚に導入され、そして組み込まれる。この胚は、妊娠の期間にわ
たって養母に移植される。例えば、Ｐｆｅｆｆｅｒら（Ｃｅｌｌ，７３：４５７
−４６７［１９９３］）は、腫瘍壊死因子レセプターｐ５５をコードする遺伝子
が、相同組換えを用いる変異によって分裂されるマウスを記載する。このマウス
は、腫瘍壊死因子のシグナル伝達に対する減少した応答を示した。Ｆｕｎｇ−Ｌ
ｅｕｎｇら（Ｃｅｌｌ，６５：４４３−４４９［１９９１］；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１７４：１４２５−１４２９［１９９１］）は、ＣＤ８をコードする遺伝
子の発現を欠いたノックアウトマウスを記載する。これらのマウスは、種々の抗
原および特定のウイルス性病原（例えば、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）に対す
る細胞傷害性Ｔ細胞応答の減少したレベルを有することが見出された。

【０００７】しかし、以前の典型的な方法は、標的遺伝子のエキソン領域の操作を記載する
。従って、特に、異種移植片拒絶を克服するために、動物（哺乳動物を含む）に
おける遺伝子発現を調節するための新規かつ改良された方法の必要性がこの分野
に存在する。以下は、これらおよび他の重要な目的に焦点を当てる。

【０００８】（要旨）動物における特定の遺伝子の発現は、動物のゲノムＤＮＡに新しいＤＮＡ配列
（これは、調節されるべき遺伝子のＤＮＡ配列の少なくともいくつかの部分の分
裂を生じる）を導入することによって調節され得ることが発見された。本明細書
中に記載される方法は、動物（哺乳動物を含む）における遺伝子発現の変更のた
めの一般的有用性を有する。驚いたことに、以前の方法とは対照的に、新しいＤ
ＮＡ配列を標的ゲノムＤＮＡのイントロンに挿入することによって、遺伝子発現
が部分的または全体で抑制され得ることが見出された。

【０００９】「ノックアウト」動物を作製するための、本明細書中に記載される方法の多才
性は、以下の好ましい実施形態の一般的説明（実施例を含む）によって例証され
る。残りの議論は、大部分がＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー
ゼノックアウトブタの有用性に関するが、本明細書中に記載される方法の有用性
は、単にこのタンパク質には限定されないことが理解されるべきである。むしろ
、以下の議論は、単にその多才性および好ましい使用の例示のために提供される
。

【００１０】（好ましい実施形態の説明）本明細書において使用される技術用語および科学用語は、そうでないと本明細
書において定義しない場合当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細
書において記載されるものに類似または等価の任意の方法および材料が記載され
る方法の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイスおよ
び材料をここで記載する。本明細書において言及するすべての刊行物は、本明細
書において、細胞株、ベクターおよび方法論を記載および開示する目的のために
参考として援用される。これらは、本明細書に関連して使用され得る刊行物にお
いて報告されている。

【００１１】本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」
、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないと文脈が明示的に示さない限り、複
数の参照形態をも包含することが意図される。したがって、例えば、「１つの宿
主細胞」との言及は、そのような宿主細胞の複数を包含することが意図され、「
１つの抗体」との言及は、１つ以上の抗体および当業者に公知のその等価物に対
する参照形態を意図する、云々。添付の特許請求の範囲は、記載された特定の方
法論、プロトコル、細胞株、ベクター、および試薬に限定されないことが理解さ
れるべきである。これらは変動し得るものであることを当業者は理解する。また
、本明細書において使用される用語論は、特定の実施形態のみを記載する目的の
ためであり、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【００１２】用語「ノックアウト」とは、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の少
なくとも一部の発現の調節をいう。用語「ノックアウト構築物」とは、細胞にお
いて内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質を調節するように設計さ
れている核酸配列をいう。ノックアウト構築物として使用される核酸配列は、代
表的に、調節されるべき遺伝子（単数または複数（エキソン配列、イントロン配
列、および／またはプロモーター配列を含むがそれらに限定されない）のある部
分からのＤＮＡ、およびその細胞においてそのノックアウト構築物を破壊しそし
てそれについて選択するために使用される配列マーカーを含む。このノックアウ
ト構築物の核酸配列は、細胞に挿入され、そしてネイティブ遺伝しからのタンパ
ク質発現を妨害または中断するような位置においてその細胞のＤＮＡに組み込ま
れる。そのような挿入は、通常、相同組換え（すなわち、ノックアウト構築物の
領域が内因性ＤＮＡ配列とそのノックアウト構築物が細胞に導入されるときに互
いにハイブリダイズするほど相同であり、そしてそのノックアウト構築物がその
内因性ＤＮＡの対応位置へと組み込まれるように組み換えられる）によって生じ
る。

【００１３】ノックアウト構築物核酸配列は、調節されるべき遺伝子の１つ以上のエキソン
および／またはイントロンの全長配列または部分配列、調節されるべき遺伝子の
プロモーターの全長配列または部分配列、あるいはそれらの組み合わせを含み得
る。本発明の１つの実施形態において、ノックアウト構築物の核酸配列は、調節
されるべき遺伝子の第一の核酸配列領域に対して相同である第一の核酸配列領域
、および調節されるべき遺伝子の第二の核酸配列領域に対して相同である第二の
核酸配列領域を含む。ノックアウト構築物の方向は、第一の核酸配列が第二の核
酸配列の上流に位置するようであるべきであり、そしてその配列マーカーがその
中にあるべきである。

【００１４】適切な核酸配列領域は、ノックアウト構築物配列と目的の遺伝子との間に相同
性が存在するように選択されるべきである。好ましくは、ノックアウト構築物配
列は、標的配列に関して同質遺伝子配列である。ノックアウト構築物の核酸配列
領域は、それがその遺伝子に対して相同である場合、その遺伝子の任意の領域に
相関し得る。核酸配列は、それが、その核酸配列に対して少なくとも約９０％同
一であり、好ましくは少なくとも約９５％同一であり、またはもっとも好ましく
は、約１００％同一である場合に、「相同である」とみなされる。さらに、選択
マーカーに隣接する５’および３’の核酸配列は、そのノックアウト構築物がそ
の標的細胞のゲノムＤＮＡへと導入されるときにハイブダイゼーションについて
の相補性配列を提供するに十分大きくあるべきである。例えば、選択マーカーに
隣接する相同核酸配列は、長さが、少なくとも約５００ｂｐであるべきであり、
好ましくは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）であるべきであり、より好ましく
は、約２−４ｋｂであるべきであり、そしてもっとも好ましくは約３−４ｋｂで
あるべきである。好ましい実施形態において、構築物の選択マーカーに隣接する
相同核酸配列は双方とも、長さが少なくとも約５００ｂｐであるべきであり、好
ましくは、少なくとも約１ｋｂであるべきであり、より好ましくは約２−４ｋｂ
であるべきであり、そしてもっとも好ましくは約３−４ｋｂであるべきである。

【００１５】別の適切なＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡが不十分に大きい場合、ｃＤＮＡ配列を含
む。その構築物を作製するために使用される隣接核酸配列の各々は、好ましくは
、１つ以上のエキソンおよび／またはイントロンの領域、ならびに／あるいはプ
ロモーター領域に対して相同である。これらの配列の各々は、互いに異なるが、
同じエキソンおよび／またはイントロン内での領域に対して相同であり得る。あ
るいは、これらの配列は、その遺伝子の異なるエキソンおよび／またはイントロ
ン内での領域に対して相同であり得る。好ましくは、ノックアウト構築物の２つ
の隣接する核酸配列は、目的の遺伝子の同じかまたは異なるイントロンの２つの
配列領域に対して相同である。さらに、同質遺伝子ＤＮＡを使用して本発明のノ
ックアウト構築物を作製することが好ましい。したがって、ノックアウト構築物
を作製するために得られた核酸配列は、好ましくは、標的細胞として使用される
ものと同じ細胞株から得られる。

【００１６】本発明にしたがって、ノックアウト核酸配列の少なくとも１つの目的の遺伝子
への組み込みは、遺伝子産物の発現の調節を生じる。遺伝子の発現を「調節する
こと」とは、その遺伝子の発現を抑制すること、その遺伝子の発現を破壊するこ
と、その遺伝子の発現を消失させること、その遺伝子の発現を変化させること、
または野生型遺伝子の発現に比較してその遺伝子の発現を減少させることを包含
する。好ましくは、組み込まれたノックアウト構築物は、ネイティブタンパク質
機能に比較して減少したタンパク質機能を生じる。もっとも好ましくは、組み込
まれたノックアウト構築物は、非機能性タンパク質の生産を生じる。そのタンパ
ク質の完全な非機能性も絶対的な非機能性も要求されない。

【００１７】用語「遺伝子の破壊」および「遺伝子破壊」とは、その遺伝しの野生型または
天然に存在する配列に比較してその細胞においてその遺伝子の発現が調節される
ような、ある遺伝子のネイティブＤＮＡ配列の少なくとも１つの領域（通常１つ
以上のエキソンまたは１つ以上のイントロン）および／またはプロモーター領域
への核酸配列の挿入をいう。例として、核酸構築物は、破壊されるべき標的遺伝
子ＤＮＡ配列（プロモーターおよび／またはコード領域）に対して相補的なＤＮ
Ａ配列の間に挿入される、抗生物質耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むよ
うに調製され得る。ついでこの核酸構築物が細胞内へとトランスフェクトされる
とき、その構築物は、ゲノムＤＮＡに、相同組換えによりランダムにかまたは標
的遺伝子中に組み込まれる。トランスフェクタントの集団における薬物耐性細胞
についての選択は、相同遺伝子ノックアウトを得る確率を上昇させることが見出
されている。従って、細胞の多くの子孫がもはや遺伝子を発現しないか、または
減少したレベルでそれを発現する。なぜなら、今やそのＤＮＡは、抗生物質耐性
遺伝子によって破壊されるからである。

【００１８】いくつかの場合、例えば、本明細書において記載される方法を用いて、ヒトへ
の異種移植片について適切な細胞、組織または器官を生産する場合、機能的タン
パク質の生産を完全に除去することは必要でなくてもよい。むしろ、他の治療レ
ジメンとともに、患者の免疫応答および拒絶の確率を予防または減少するレベル
にのみまで機能的タンパク質の産生を減少させることで十分である。従って、例
えば、本明細書において記載される方法に従って行われるノックアウトは好まし
くは、それから正常にコードされるポリペプチドの生物学的活性を、変異させて
いない遺伝子に比較して少なくとも約７０％、好ましくは約８０％減少させ得る
。

【００１９】ノックアウト構築物は、培養物中に維持され得るそのゲノムＤＮＡにおける組
み込みのために適切な任意の標的細胞へと挿入され得る。適切な細胞としては以
下が挙げられるがそれらに限定されない：線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ト
ランスジェニック胚性線維芽細胞、胚性幹細胞、および始原生殖細胞。１つの実
施形態において、そのノックアウト構築物は、肺性幹細胞（ＥＳ細胞）へと挿入
され、そしてＥＳ細胞ゲノム配列へと組み込まれる。ついで、組み込まれたノッ
クアウト構築物を含むＥＳ細胞は、発生中のマウス胚へと注射され、そして組み
込まれる。別の実施携帯において、ノックアウト構築物は、核移入ドナー細胞へ
と挿入される。適切な核移入ドナーとしては、以下が挙げられる：線維芽細胞、
上皮細胞、および卵丘（ｃｕｍｕｌｏｕｓ）細胞。この実施形態において、ノッ
クアウト構築物は、核移入ドナー細胞へと挿入され、そしてそのノックアウト構
築物を含むそのドナー細胞は、除核卵母細胞と融合される。ついで、得られた融
合卵母細胞は、代理雌へと移入される。さらに、標的細胞を使用してノックアウ
ト哺乳動物を作製する場合、その標的細胞は、生成されるノックアウト哺乳動物
と同じ種に由来することが好ましい。従って、例えば、ブタ胚性幹細胞またはブ
タ線維芽細胞は、通常、ノックアウトブタの生成のために使用される。

【００２０】ノックアウト構築物の核酸配列は、任意の適切な方法を用いて宿主細胞のゲノ
ムＤＮＡへと組み込まれ得る。１つの好ましい実施形態において、組み込みは、
相同組換えのプロセスにより達成される。相同組換えは、以前に記載されており
、例えば、以下に記載される：Ｋｕｃｈｅｒｌｐａｔｉｅｔａｌ．（１９８
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．ＳｃｈＵＳＡ１１：３１５３−３１５７
；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉｅｔａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏ．５：７１４−７２０；Ｓｍｉｔｈｉｅｓｅｔａｌ．（１９８５）Ｎａ
ｔｕｒｅ３１７：２３０−２３４；Ｗａｋｅｅｔａｌ．（１９８５）Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．８：２０８０−２０８９；Ａｙａｒｅｓｅｔａｌ．
（１９８５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１１：３７５−３８８；Ａｙａｒｅｓｅ
ｔａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：１６５６−１６６２；
Ｓｏｎｇｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ８４：６８２０−６８２４；Ｔｈｏｍａｓｅｔａｌ．（１９８６）
Ｃｅｌｌ４４：４１９−４２８；ＴｈｏｍａｓａｎｄＣａｐｅｃｃｈｉ（１
９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３−５１２；Ｎａｎｄｉｅｔａｌ．（１９８
８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３８４５−３８４９
；およびＭａｎｓｏｕｒｅｔａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３６：３
４８−３５２（これらは、本明細書において参考として援用される）。さらに、
相同組換えを用いて特定の遺伝子変異を胚性幹細胞内に作製することおよび生殖
系列へこれらの変異を移入することの種々の局面が記載されている（Ｅｖａｎｓ
ａｎｄＫａｕｆｍａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９４：１５４−１４
６；Ｄｏｃｔｓｃｈｉｎａｎｅｔａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３３
０：５７６−５７８；ＴｈｏｍａｓａｎｄＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８７）Ｃ
ｅｌｌ５１：５０３−５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．（１９８９）
Ｃｅｌｌ５６：３１６）。相同組換えにおいて、２つのＤＮＡ分子の間のＤＮ
Ａフラグメントは、相同な核酸配列の部位において交叉（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）
の間に交換される。したがって、交叉は、その構築物（目的の遺伝子の第一の核
酸領域に相同である）の第一の核酸配列の５’領域内での相同性の部位において
ノックアウト構築物と真核生物遺伝子との間で生じる。第二の交叉事象は、目的
の遺伝子の第二の核酸領域と相同な構築物の３’領域において生じる。結果とし
て、ノックアウト構築物のこれらの２つの領域の間の配列情報は、宿主細胞のゲ
ノムＤＮＡにおける目的の遺伝子に挿入される。

【００２１】本明細書に記載される方法を使用して、１、２またはそれを超える遺伝子をノ
ックアウトした哺乳動物を産生し得る。そのような哺乳動物は、各々のノックア
ウト構築物を生成するために、本明細書において示される手順を繰り返すことに
よるか、または異なる単一の遺伝子がノックアウトされた２匹の哺乳動物を互い
に交配させること、および二重ノックアウト遺伝子型を有する哺乳動物について
スクリーニングすることによって生成され得る。

【００２２】用語「マーカー配列」または「選択マーカー」とは、目的の遺伝子の発現を調
節するノックアウト構築物の部分として、およびゲノムにそのノックアウト構築
物を組み込んだそれらの細胞を同定する手段として使用される核酸配列をいう。
選択マーカーは、これらの目的に資する任意の配列であり得る。例えば、選択マ
ーカーは、細胞において検出可能な特性を付与するタンパク質（例えば、抗生物
質耐性遺伝子）または標的細胞において代表的に見出されないアッセイ可能な酵
素をコードし得る。これらの選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞株を回
収するために使用される、検出可能および／またはアッセイ可能な任意の核酸配
列であり得る。当業者は、本発明において使用するための適切な選択マーカーを
決定し得る。例えば、適切な選択マーカーとしては、以下が挙げられるがそれら
に限定されない：βラクタマーゼ（アンピシリン耐性）、カナマイシン耐性、ゲ
ンタシン耐性、プロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ、ハイグロマイ
シン−β−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、およびトリプトファ
ンシンセターゼ。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）（Ｗ
ｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．（１９７７）Ｃｅｌｌ１１：２２３−３２）
またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ａｐｒｔ）（Ｌｏｗｙ，
Ｉ．ｅｔａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ２２：８１７−２３）の遺伝子（これ
らは、それぞれｔｋまたはａｐｒｔ細胞において使用され得る）は、選択マーカ
ーとして使用され得る。また、抗代謝物、抗生物質または除草剤耐性は、選択の
ための基礎として使用され得る；例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）（
これは、メトトレキサートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅ
ｔａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６
７−７０）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）（これは、アミ
ノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｏ
ｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ｅｔａｌ（Ｉ９８１）Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）。さらなる選択マーカー遺伝子が記載されてお
り、そして例えば、以下を包含する：トリプトファンシンセターゼ（ｔｒｐＢ）
（これは、細胞がトリプトファンのかわりにインドールを利用することを可能に
する）、またはヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）（これは、細胞が
ヒスジチンの代わりにヒスチジノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔ
ｍａｎ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（Ｉ９８８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、可視マーカ
ーの使用は、以下のようなマーカーを用いて人気を集めている：アントシアニン
、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびルシフェラーゼならびにその気質であ
るルシフェリン。これらは、形質転換体を同定するに広汎に使用されるのみなら
ず、特定のベクター系に対して帰属可能な一過性または安定なタンパク質発現の
量を定量するためにも使用される（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔａｌ．（１
９９５）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５．１２１−１３１）。本発明
において、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイ
シン耐性遺伝子またはプロマイシン耐性遺伝子）である。

【００２３】さらに、その選択マーカーがタンパク質をコードする場合、それはまた、その
発現を調節するプロモーターを含み得るか、または内因性のプロモーター（好ま
しくは、標的遺伝子プロモーター）からの発現を必要とする。従って、選択マー
カーは、その自分のプロモーターに作動可能に連結されてい得るか、またはプロ
モーターなしであり得る。選択マーカー遺伝子は、付属するその自分のプロモー
ターなしにノックアウト構築物中に挿入され得る。なぜなら、それは、抑制され
るべき遺伝子のプロモーターを用いて転写され得るからである。さらに、そのマ
ーカー遺伝子は、その遺伝子の３’末端に付着したポリＡシグナル配列を有し得
る。このシグナル配列は、遺伝子の転写を終結するように働き、そして３’末端
でアデニン残基の付加を伴う転写物をプロセシングしてｍＲＮＡを安定化させる
。

【００２４】１つの実施形態において、標的遺伝子（例えば、Ｇａｌα（１，３）ガラクト
シルトランスフェラーゼ）は、標的遺伝子のイントロン内への、操作されたエキ
ソンまたは活性遺伝子の挿入によって調節される。この実施形態において、その
標的遺伝子は、標的遺伝子のイントロン内に多重終止コドンを含む、インフレー
ムのプロモーターのない操作されたエキソン（例えば、抗生物質耐性遺伝子）の
挿入によって翻訳されることが妨害される。この「プロモータートラップ」戦略
を用いて、操作されたエキソンは、インフレームで、開始コドンを含むエキソン
の上流にスプライスされる。このことにより、目的の遺伝子の前に薬物耐性遺伝
子の発現が生じ、そして同時に、薬物耐性遺伝子の下流に多重の終止コドンの存
在に起因して標的遺伝子の発現が阻害される。本明細書に記載されるように、適
切な選択条件下で標的化された細胞の生存を付与する任意の遺伝子は、操作され
たエキソンとして使用され得る。

【００２５】「プロモータートラップ」戦略を用いて、標的遺伝子のイントロン配列と相同
性を有する配列を含む遺伝子標的化構築物が設計される（例えば、Ｇａｌα（１
，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン３配列）、ＡＧジヌ
クレオチドスプライスアクセプター部位を含む下流のイントロンスプライスアク
セプターシグナル配列（例えば、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のイントロン４スプライスアクセプターシグナル配列）、多重終止
コドンを含むように操作されたプロモーターなしの選択マーカーで操作されたエ
キソン（例えば、薬物耐性遺伝子）、すぐ下流のエキソンに対して操作されたエ
キソンをスプライスするためのＧＴジヌクレオチドスプライスドナー部位を含む
イントロンスプライスドナーシグナル配列（例えば、Ｇａｌα（１，３）ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン４スプライスドナー配列）、なら
びに標的遺伝子へのアニーリングを助けるための標的遺伝子のイントロン配列と
相同性を有するさらなる配列（例えば、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子のイントロン３配列相同性））。この方法を使用して、目的
の標的遺伝子内の任意のイントロンを標的化し得ることが理解される。

【００２６】別の実施形態において、「プロモータートラップ」戦略を使用して、インフレ
ームのプロモーターなしで操作されたエキソン（例えば、抗生物質耐性遺伝子）
に内因性エキソンを置き換えることによって標的遺伝子発現を調節し得る。操作
されたエキソンは、インフレームでスプライシングされ、そして薬物耐性遺伝子
の発現を生じ、そして同時に、全長標的遺伝子の発現を阻害する。

【００２７】この「プロモータートラップ」遺伝子標的構築物は、開始コドンの蒸留に標的
遺伝子３’イントロン配列と相同性を有する配列（例えば、Ｇａｌα（１，３）
ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子３’イントロン３配列）、ＡＧジヌクレ
オチドスプライスアクセプター部位を含む上流のイントロンスプライスアクセプ
ター配列（例えば、イントロン３スプライスアクセプター配列）、Ｋｏｚａｋコ
ンセンサス配列、例えばポリＡ終結配列を含む（操作されたエキソン）プロモー
ターなしの選択マーカー遺伝子、開始コドンの下流のイントロン領域からのＧＴ
ジヌクレオチドスプライスドナー部位、および下流のイントロンに対して５’配
列相同性を有する配列（例えば、５’イントロン４スプライスドナー配列）を含
むスプライスドナー配列、を含むように設計され得る。Ｇａｌα（１，３）ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子または目的の他の任意の遺伝子内の任意のエ
キソンを標的化するために使用され得ることが理解される。ブタＧａｌα（１，
３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を標的化するために有用な代表的な
構築物は、２０００年９月２８日に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、に受託番号＿＿で寄託され、そして
実施例２において本明細書において説明される。

【００２８】なお別の実施形態において、選択マーカーは、標的化された遺伝子に対して反
対の方向でノックアウト構築物中に挿入され得る。この実施形態において、強力
なプロモーターは、すべて反対の方向で選択マーカーとともに使用される。これ
は、逆方向での転写を駆動し、それゆえ、標的化された遺伝子の発現を調節する
。その標的遺伝子は、「衝突構築物」を用いて調節されて、エキソンの代わりに
活性遺伝子を、および隣接するイントロンの少なくとも一部（スプライスドナー
およびスプライスアクセプター部位を含む）を挿入する。挿入された遺伝子（例
えば、選択マーカー遺伝子）は、ホスホグリセレートキナーゼＩ（ＰＧＫ）遺伝
子プロモーターのような高度に活性なプロモーターの制御下にあり、その結果、
この遺伝子の転写は、内因性の遺伝子の転写の終結を生じる（Ｒｏｓａｒｉｏ
ｅｔａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５９２−１５９
６）。これらの選択マーカー遺伝子は、転写終結配列を含むようにさらに操作さ
れる。操作される遺伝子の挿入を行って、任意のイントロン内の任意のエキソン
をまたはその部分を置き換えて、機能的遺伝子産物の発現を調節する短縮転写物
を生じるようにさせ得る。その構築物が組み込まれた、トランスフェクトされた
細胞についての陽性選択は、選択マーカー遺伝子の発現を介して達成され得る。
本明細書において記載されるように、適切な選択条件下で標的化された細胞の生
存を付与する任意の選択マーカー遺伝子は強力なＰＧＫプロモーターによって駆
動され得ることが理解される。さらに、毒素遺伝子（例えば、リシンＡ毒素）は
、好ましくは、無作為組換え事象を排除するように挿入された衝突構築物へと操
作される。ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を標
的化するために有用な代表的な衝突構築物は、２０００年９月２８日にＡＴＣＣ
に受託番号＿＿で寄託され、本明細書において実施例３において説明される。

【００２９】細胞において組み込まれた選択マーカー核酸は、目的の遺伝子の発現を調節し
得る。選択マーカーの発現は、組み込まれた配列を含む細胞の選択を可能にする
。目的の遺伝子の発現の調節は、内因性遺伝子と同じ方向または逆の方向で操作
されたエキソンによって内因性遺伝子を破壊することによって達成される。

【００３０】用語「動物」は、本明細書において使用されるように、任意の多細胞真核生物
を包含することが意図され、好ましくはとりわけ、哺乳動物である。異種移植片
ドナーの文脈において用いられる場合、用語「哺乳動物」は好ましくは以下を包
含するがそれらに限定されない：ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ウサギ、ハ
ムスター、ラット、マウス、ウマ、ネコ、イヌなど。好ましくは、ヒトは、除か
れる。

【００３１】用語「子孫」とは、特定の哺乳動物（すなわち、そのゲノムＤＮＡに挿入され
たノックアウト構築物を含む哺乳動物）に由来するかそれから出自する任意のお
よび全ての未来の世代をいう。従って、任意の連続する世代の子孫は、本明細書
において包含され、その結果、その子孫であるＦ１、Ｆ２、Ｆ３世代などなどは
、未来永劫の世代はこの定義に含まれる。

【００３２】用語「免疫調節する」および「免疫調節」とは、特定の種についての任意の成
分の平均の活性に比較して、免疫系のその成分の活性のレベルにおける変化をい
う。従って、本明細書において使用されるように、免疫調節とは、活性における
増加または減少をいう。好ましくは、本発明に従って、選択マーカーの目的の遺
伝子への組み込みは、宿主細胞が患者に導入されるときに免疫応答の現象を生じ
る。免疫調節は、抗体反応性、補体活性、Ｂ細胞、任意のまたはすべての型のＴ
細胞、抗原提示細胞、および免疫機能に関与すると考えられる任意の他の細胞の
レベルをアッセイすることによって検出され得る。さらに、またはあるいは、免
疫調節は、免疫系において役割を有すると考えられる特定の遺伝子の発現レベル
、免疫系において役割を有する、サイトカイン（インターロイキンなど）または
他の分子のような特定の化合物のレベル、および／または免疫系の機能発揮に関
与する、特定の酵素、タンパク質などのレベルを評価することによって検出され
得る。

【００３３】ノックアウトされるべき標的遺伝子は、破壊されるべきＤＮＡにおける少なく
ともいくつかの配列情報がノックアウト構築物とスクリーニングプローブとの両
方の調製物において使用するに利用可能である場合、任意の遺伝子であり得る。
本明細書に記載される方法を用いるために標的遺伝子のゲノム配列全体が知られ
ることは必要ではない。

【００３４】ノックアウトされるべき標的遺伝子は、成熟および／または未熟なＴ細胞およ
び／またはＢ細胞において発現される遺伝子である。その標的遺伝子が標的の抗
原提示細胞、標的内皮細胞、標的神経細胞またはレシピエントの体液性免疫また
は細胞性免疫系によって攻撃され得る任意の標的細胞において発現されることが
さらに好ましい。この標的遺伝子は、さらに好ましくは、免疫系による炎症また
は免疫抑制応答の間の活性化経路において、直接または間接的のいずれかで、関
与し、そしてノックアウトされるときには致死性を生じない。本発明に従って、
標的遺伝子の発現は、本明細書に記載される方法に従って有利に変更されて、ヒ
トにおける使用のための異種移植片細胞、組織および器官を作製し、患者による
免疫応答および拒絶を減少または予防することができる。

【００３５】従って、本発明のノックアウト構築物の挿入によって調節され得るその相同組
換えおよび発現を受け得る場合、任意の遺伝子が使用され得る。適切な遺伝子と
しては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｂ７．３、Ｐセレクチン、
Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２またはＶＣＡＭ−１、ＣＤ２８、
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５４、主要適合性複合体クラスＩ、β−２−ミクロ
グロブリン、不変鎖（Ｉｉ）、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、およびＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子。このリストは、網羅的で
あることは意図しない。当業者は、調節されるべき適切な遺伝子を確認すること
ができる。好ましくは、遺伝子は、患者の免疫応答に相関付けられる。より好ま
しくは、標的遺伝子は、以下からなる群より選択されるブタ標的遺伝子である：
ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７．３、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−
１、ＩＣＡＭ−２またはＶＣＡＭ−Ｉ。現在好ましいブタ標的遺伝子は、Ｇａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子である。

【００３６】選択される遺伝子をノックアウトするために使用されるＤＮＡ配列は、以下に
記載されるような当該分野において周知の方法を用いて入手され得る：Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ
．Ｙ．（１９８９））。そのような方法としては、例えば、ゲノム配列の少なく
とも一部を入手するために、同じ遺伝子の少なくとも一部をコードするｃＤＮＡ
プローブでのゲノムライブラリーのスクリーニングが挙げられる。あるいは、ｃ
ＤＮＡ配列がノックアウト構築物において使用されるべき場合、そのｃＤＮＡは
、オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体（ライブラリーが発現ベクターへとク
ローニングされている場合）でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
によって入手され得る。プロモーター配列がノックアウト構築物において使用さ
れるべき場合、合成ＤＮＡプローブは、プロモーター配列を含むゲノムライブラ
リーをスクリーニングするように設計され得る。ノックアウト構築物において使
用されるべきＤＮＡを得るための別の方法は、ＤＮＡ合成機を用いて、ＤＮＡ配
列を合成的に製造することである。

【００３７】別の実施形態において、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ
遺伝子をコードするブタゲノムＤＮＡは、λファージクローンライブラリーから
単離される。ブタゲノムライブラリーは、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子のエキソン４に対応するｃＤＮＡを用いてスクリーニング
される。ファージがスクリーニングされ、そしてエキソン４配列を含む特有のク
ローンが標準的なライブラリースクリーニング方法を用いて単離される（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）。この手順を用いて得られるクローンは、インサー
ト１５−４０ｋｂ長を含む。これらのクローンは、ｐｇＧＴ、λ１、λ２、λ４
−１およびλ８−２と命名された。イントロン３からイントロン８までのブタＧ
ａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の全体にわたる、特有
の重複するヌクレオチド配列を含む以下の５つのベクターがＡＴＣＣに寄託され
ている：（１）１８．２７５ｋｂ λ−２ファージクローンの５’の最末端のイ
ントロン３内の１．６ｋｂ、（２）１８．２７５ｋｂのλ−２ファージクローン
のイントロン３からイントロン４にわたる６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメ
ント；（３）１８．２７５ｋｂλ−２ファージクローンの６．７ｋｂフラグメン
トの後の４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、（４）１８．２７５λ−２ファ
ージクローンの３’最末端部分での６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメ
ント、および（５）エキソン７からエキソン９までにわたるλ−２ファージクロ
ーンの１３ｋｂフラグメント。これらの５つのベクターは、ＡＴＣＣに２０００
年９月２９日にそれぞれ以下の受託番号＿＿で寄託された。種々のインサートの
サブクローンを用いて、図１に提供されるように、イントロン３からイントロン
８までの請求されるイントロン配列を生成した。これらの配列を用いて、ブタＧ
ａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の調節のための構築物
を標的化する設計において、配列相同性の領域を決定し得る。

【００３８】ノックアウト構築物をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、標的細胞を遺伝
子操作および挿入するために十分な量で生成される。増殖は、以下のような公知
の方法によって達成され得る：適切なベクターへとその配列を入れることおよび
細菌細胞またはそのベクターを迅速に増殖し得る他の細胞を形質転換すること、
ＰＣＲ増幅すること、またはＤＮＡ合成機によって合成することによる。

【００３９】ノックアウト構築物を生成するにおいて使用されるべきＤＮＡ配列は、位置を
切断するために選択される制限酵素で消化され、その結果、選択マーカー遺伝子
をコードするあらたなＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配列内の適切な位置に挿入され得
る。選択マーカー遺伝子挿入のために適切な位置は、ネイティブ遺伝子の発現を
調節するように働く位置である。この位置は、切断されるべき配列における制限
部位、および例えばイントロン配列、エキソン配列またはプロモーター配列が調
節されるべきかどうかのような種々の因子に依存する。別の言葉では、選択マー
カーのそのＤＮＡ配列への挿入の正確な位置は、プロモーター機能またはネイテ
ィブエキソンの合成の調節を生じる。例えば、ノックアウト構築物は、標的遺伝
子の単一のイントロン内で選択マーカー全体を挿入するように操作され得る。こ
のようにして、第一の核酸配列は、第二の核酸配列から上流の選択されたイント
ロンの領域を含み、その第二の核酸配列は、その第一の核酸配列の下流に位置す
る選択されたイントロンの領域を含むように選択される。選択マーカーは、第一
の核酸配列と第二の核酸配列との間に導入される。ついで、その構築物がその細
胞に導入される場合、その構築物核酸配列は標的遺伝子に組み込まれ、そして選
択マーカーが標的化されたイントロン内に全体が挿入される。

【００４０】同様に、構築物は、発現が調節されるという条件で、その遺伝子の任意の所望
かつ適切な領域内に選択マーカーを挿入するよう操作され得る。例えば、構築物
は、２つの隣接するイントロン間に選択マーカーを挿入し、これによって、その
標的遺伝子の内因性エキソンを完全に除去するように、標的遺伝子のイントロン
の少なくとも一部分および隣接するイントロンの少なくとも一部分を含む領域に
かかる（ｓｐａｎｏｖｅｒ）ように、標的遺伝子に対するプロモーターから隣
接するイントロンの少なくとも一部分を含む領域にかかるように、１より多い標
的遺伝子を含む領域かかるように、ならびにその組み合わせのために、操作され
得る。

【００４１】ゲノムＤＮＡ配列を適切な制限酵素で消化した後、当業者に周知の方法および
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載の方法を使用して、選択マーカー遺伝子を、そ
のゲノムＤＮＡ配列に連結する。連結されるＤＮＡフラグメントの末端は、適合
性でなければならず；これは、適合性の末端を生成する酵素での全てのフラグメ
ントの切断、または連結前でのその末端の平滑末端化のいずれかによって達成さ
れる。平滑末端化は、例えば、付着末端を充填するためのクレノウフラグメント
（ＤＮＡポリメラーゼＩ）の使用によって、当該分野で周知の方法を使用して行
われる。

【００４２】連結されたノックアウト構築物は、標的細胞に直接導入され得るか、または挿
入前の増幅のために適切なベクターにまず配置され得る。好ましいベクターは、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＧＥＭ７（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，
Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のような、細菌細胞において迅速に増幅されるベク
ターである。

【００４３】本発明の別の実施形態において、胚性幹（ＥＳ）細胞が、標的細胞として使用
される。これは、発生中の胚の生殖系列に組み込みそしてその生殖系列の部分と
なって、ノックアウト構築物の生殖系列伝播を生じる能力による。従って、この
能力を有すると考えられる任意のＥＳ細胞株が、本発明における使用に適切であ
る。例えば、ＥＳ細胞の作製に使用されている１つのマウス系統は、１２９Ｊ系
統である。これらの細胞を、当業者に周知の方法を使用して、ＤＮＡ挿入のため
に培養および調製する。これらの方法は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｔｅｒ
ａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌ
ｌｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８７））、Ｂｒ
ａｄｌｅｙら（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＤｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．
，２０：３５７−３７１（１９８６））、およびＨｏｇａｎら（Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）
）（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載される。

【００４４】標的細胞へのノックアウト構築物の挿入は、当該分野で周知の種々のトランス
フェクション方法を使用して達成され得る。例えば、適切なトランスフェクショ
ン方法としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェンクションおよび
リン酸カルシウム処理（Ｌｏｖｅｌｌ−Ｂａｄｇｅ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、前
出を参照のこと）が挙げられる。好ましいトランスフェクション方法は、エレク
トロポレーションである。細胞をエレクトロポレーションに供する場合に、標的
細胞およびノックアウト構築物ＤＮＡを、エレクトロポレーション装置を使用し
てそしてその使用のための製造業者のガイドラインに従って、電気パルスに曝す
。エレクトロポレーション後、細胞は、適切なインキュベーション条件下で回収
され得る。次いで、細胞を、このノックアウト構築物の存在についてスクリーニ
ングする。

【００４５】細胞に導入される各ノックアウト構築物ＤＮＡは、そのノックアウト構築物が
ベクターに挿入されている場合には、最初に直線化されなければならない。直線
化は、そのベクター配列内のみを切断しそしてノックアウト構築物配列内を切断
しないように選択された、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、そのＤＮＡ
を消化することによって達成される。

【００４６】ＤＮＡ配列の導入のために、このノックアウト構築物ＤＮＡは、その選択され
た挿入方法について適切な条件下で、標的細胞に添加される。１より多い構築物
が標的細胞に導入される場合、各構築物をコードするＤＮＡは、同時にまたは１
つずつ導入され得る。

【００４７】スクリーニングは、当該分野で公知の方法またはその組み合わせを使用して行
われ得る。選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、細胞を、さも
なければ致死濃度の抗生物質の存在下で培養する。生存する細胞は、おそらく、
このノックアウト構築物を組み込んでいる。選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性
遺伝子以外である場合、標的細胞のゲノムＤＮＡを、標準的な方法（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載の方法）を使用して、それらの細胞から抽出し得
る。次いで、このＤＮＡを、その選択マーカー配列にのみハイブリダイズするよ
う設計されたプローブ（単数または複数）を用いて、サザンブロット上でプロー
ブし得る。選択マーカー遺伝子が、活性を検出し得る酵素（例えば、β−ガラク
トシダーゼ）をコードする遺伝子である場合、適切な条件下で、その酵素基質を
細胞に添加し得、そして酵素活性についての適切なアッセイを行い得る。さらに
、ゲノムＤＮＡを、特定のサイズおよび配列のＤＮＡフラグメントを増幅するよ
うに特別に設計したプローブを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっ
て増幅し得る（すなわち、適切な位置にこのノックアウト構築物を含む細胞のみ
が、適切なサイズのＤＮＡフラグメントを生じる）。ＰＣＲは、相同組換えの存
在の検出において使用され得る（ＫｉｍおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、（１９８８）
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１６：８８８７−８９０３：Ｊｏｙｎｅｒ
ら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３３８：１５３−１５７）。その構築物内の配列
に相補的なプライマーおよびその構築物の外側かつ標的遺伝子座の配列に相補的
なプライマーを使用し得る。このようにして、相同組換えが生じた相補鎖に存在
するこの両方のプライマーを有するＤＮＡ二重鎖のみが得られ得る。プライマー
配列または予測されるサイズの配列の存在を実証することによって、相同組換え
の発生が支持される。

【００４８】標的遺伝子ノックアウト構築物の上流および／または下流に、二重交差（Ｄｏ
ｕｂｌｅｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）が生じたか否かを同定するための遺伝子を挿入
し得る。この目的のために、任意の適切なマーカーが、本明細書中に記載のよう
に使用され得る。好ましくは、二重交差を同定するために使用される選択マーカ
ーは、標的遺伝子ノックアウト構築物の組み込みを同定するために使用される選
択マーカーとは異なる。１つの好ましい実施形態において、単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ遺伝子が使用される。なぜなら、このチミジンキナーゼ遺伝
子の存在は、ヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビアまたはガンシクロビ
ア）を使用して、機能的ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む細胞に対するそれらの細胞傷
害性効果によって、検出され得るからである。これらのヌクレオシドアナログに
対する感受性の不在は、このチミジンキナーゼ遺伝子の不在を示し、そして従っ
て、相同組換えが生じた場合には、二重交差事象もまた生じている。

【００４９】ノックアウト構築物は、ランダムな挿入事象の発生に起因して、標的遺伝子ゲ
ノム中のいくつかの位置に組み込まれ得、そして各細胞ゲノムにおいて異なる位
置に組み込み得る。ランダムな複数の組み込み部位に対して、所望の挿入部位は
、ノックアウトされるＤＮＡ配列に相補的な位置にある。ノックアウト構築物を
取り込む標的化された細胞の約１〜５％未満が、実際に所望の位置にこのノック
アウト構築物を組み込むことが見い出されている。ノックアウト構築物の適切な
組み込みを有する細胞の同定を、本明細書中に記載する。

【００５０】本発明の１つの実施形態において、その適切な位置にノックアウト構築物を含
む適切にトランスフェクトされた標的細胞を、胚に挿入する。挿入は、当該分野
で公知の任意の適切な方法において達成され得る。好ましくは、細胞は、マイク
ロインジェンクションによって胚に導入される。最も好ましくは、細胞は、マウ
ス胚への注入のためのＥＳ細胞である。マイクロインジェンクションのために、
約１０〜３０個の細胞が、マイクロピペットに収集され、そして適切な発生段階
にある胚に注入され、このトランスフェクトされた細胞をこの発生中の胚に組み
込む。胚への注入のための適切な発生段階は、その発生中の胚の胚葉（ｇｅｒｍ
ｉｎａｌｌａｙｅｒ）の形成前であり、これは、当業者は容易に決定し得る。
好ましくは、胚は、初期胚盤胞段階にある。例えば、マウス胚は、約３．５日で
、このトランスフェクトされた細胞を導入され得る。胚は、当業者に公知の方法
（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、前出））によって、妊娠中
の雌の子宮を灌流することによって得られる。好ましくは、胚は、雄性である。

【００５１】標的遺伝子の適切な組み込みを有するトランスフェクトされた標的細胞を胚に
導入した後、この胚を、偽妊娠義母（ｆｏｓｔｅｒｍｏｔｈｅｒ）の子宮に移
植する。任意の義母が使用され得るが、義母の選択は、よく生育しそして再生す
る能力およびその子（ｙｏｕｎｇ）を保護（ｃａｒｅｆｏｒ）する能力に基づ
く。このような義母は、代表的には、同じ種の精管切除した雄と交配させること
によって作製され得る。偽妊娠義母の段階は、首尾よい移植に重要であり、これ
は種依存性である。マウスについては、この段階は、偽妊娠約２〜３日目である
。

【００５２】別の実施形態において、その適切な、トランスフェクトされた細胞は、核移入
ドナー細胞である。核移入ドナー細胞は、実質的に任意の体細胞型であり得、こ
れには、線維芽細胞、上皮細胞、卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓｃｅｌｌ）などが
挙げられる。核移入ドナー細胞を、インビトロで培養し、そして本明細書中に記
載の構築物および技術を使用して、相同組換えを介して標的化される。細胞を、
適切な培地で増殖し、適切に組み込まれたノックアウト構築物を含む細胞の選択
を可能にする。ＰＣＲもまた、正確に標的化された組み込みの確認のために行い
得る。この後、動物の未受精卵母細胞を、公知の方法を使用して除核する。次い
で、この除核した未受精卵母細胞を、この選択したノックアウト核移入ドナー細
胞に融合させる。融合は、電気刺激、化学的刺激、注入による挿入、または他の
公知の方法によって行われ得る。次いで、この融合した産物を培養し、生存性に
ついて評価し、そして代理レシピエント雌に移入する。参考および方法について
は、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：６４；Ｗ
ｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０；ＷＯ００／２５５７
８；ＷＯ９７／０７６６９；ＷＯ９９／３６５１０；ＷＯ００／４２１７４；Ｗ
Ｏ９９／５３７５１；ＷＯ９９／４５１００（これらは、参考として本明細書中
に援用される）を参照のこと。

【００５３】この義母または代理レシピエント雌から生まれる子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）
または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を、このノックアウト構築物を含むゲノムＤＮＡ
についてスクリーニングする（例えば、ＰＣＲによって）。この工程は、このト
ランスフェクトされた標的細胞が注入された胚を保持した義母の子孫を選択する
ために特に重要である。対して、除核された未受精卵母細胞と融合されたこのト
ランスフェクトされた標的細胞を保持した代理レシピエント雌の子孫は、代表的
に、そのゲノム内にノックアウト構築物が挿入されている。

【００５４】任意の適切な選択方法が使用され得る。例えば、毛色（ｃｏａｔｃｏｌｏｒ
）選択ストラテジーを使用する場合、子孫を、その子孫への標的化された遺伝子
の適切な組み込みを示す毛色についてスクリーニングし得る。他の方法としては
、本明細書中に記載されるように、子孫からＤＮＡを得て、そしてサザンブロッ
トおよび／またはＰＣＲを使用するこのノックアウト構築物の存在についてスク
リーニングすることが挙げられる。ノックアウト子孫を同定および特徴付ける他
の手段としては、ノーザンブロットおよびウエスタンブロットの使用が挙げられ
る。例えば、ノーザンブロットを使用して、ノックアウトされた遺伝子、マーカ
ー遺伝子または両方をコードする転写物の存在または非存在について、そのｍＲ
ＮＡをプローブし得る。さらに、ウエスタンブロットを使用して、これらの子孫
の種々の組織における、ノックアウトされた遺伝子の発現のレベルを評価する。
これは、このノックアウトされた遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体
またはマーカー遺伝子産物（この遺伝子が発現される場合）に対する抗体を用い
てこのウエスタンブロットをプローブすることによる。子孫由来の種々の細胞の
インサイチュ分析（例えば、細胞の固定および抗体での標識）および／または蛍
光活性化細胞分離（ＦＡＣＳ）分析を、このノックアウト構築物遺伝子産物の存
在または非存在を確認するための適切な抗体を使用して行い得る。

【００５５】次いで、組み込まれたノックアウト構築物をそのゲノム中に含むことを示す子
孫が、それらの生殖系列においてノックアウト構築物を保持し、このノックアウ
ト構築物についてヘテロ接合性のＦ１子孫を作製すると考えられる場合に、この
子孫を、外部交配（ｏｕｔ−ｃｒｏｓｓ）して複数の子孫を作製し得る。次いで
、Ｆ１を交配して、ホモ接合性の動物を作製する。

【００５６】次いで、ヘテロ接合体を、互いに交配し、ホモ接合性のノックアウト子孫を作
製する。ホモ接合体は、本明細書中に記載のような任意のスクリーニング方法に
よって同定され得る。例えば、ホモ接合体は、この交配の産物である宿主動物、
ならびに既知のヘテロ接合体である宿主動物および野生型宿主動物からの、等価
量のゲノムＤＮＡのサザンブロットによって同定され得る。サザンブロットをス
クリーニングするためのプローブは、本明細書中に示されるように設計され得る
。

【００５７】本明細書中に記載のノックアウト哺乳動物は、調節された遺伝子（単数または
複数）に依存して、種々の用途を有する。調節された標的化された遺伝子（単数
または複数）が、この免疫抑制または炎症に関与すると考えられるタンパク質を
コードする場合、ノックアウト哺乳動物を使用して、免疫調節に有用な薬物（す
なわち、これらの活性を増強または阻害する薬物）をスクリーニングするために
使用され得る。有用な薬物についてのスクリーニングは、ある範囲の投薬量にわ
たって候補薬物をノックアウト動物に投与する工程、および評価される免疫障害
に対するその薬物の免疫調節効果について種々の時点でアッセイする工程を包含
する。このようなアッセイは、例えば、Ｔ細胞レベルおよびＢ細胞レベルの増加
または減少、免疫グロブリン産生の増加または減少、化学メッセンジャー（例え
ば、サイトカイン（例えば、インターロイキンなど））のレベルの増加または減
少、および／または免疫応答に関与する特定の遺伝子の発現レベルの増加または
減少を確認する工程を包含し得る。

【００５８】例えば、化学療法を受けている患者は、しばしば、免疫抑制を受ける。このよ
うな個体の免疫系を活性化することが所望され、これは、このような効果を生じ
得る治療薬剤を患者に投与することによる。本明細書中に記載されるようなノッ
クアウト動物は、種々の化合物（単独または組み合わせで）をスクリーニングし
て、免疫応答の部分的または全体的な修復または活性化が生じるか否かを決定す
るために使用され得る。

【００５９】同様に、同じストラテジーを適用して、関節炎を有する多くの患者に観察され
る炎症応答の抑制に有用であるか、または慢性関節リウマチおよび狼瘡を有する
患者において観察される自己免疫現象の抑制に有用である化合物を見い出し得る
。さらに、哺乳動物は、免疫系の発生の評価および特定の遺伝子変異の効果の研
究に有用であり得る。

【００６０】好ましい実施形態では、本明細書中に記載されるノックアウト哺乳動物は、ヒ
ト患者への異種移植片に用いられる。異種移植片組織は、任意の哺乳動物（好ま
しくは、ブタ）由来であり得る。異種移植片組織は、例えば、腎臓、心臓、肺、
または肝臓を含む、器官の形態であり得る。異種移植片組織はまた、例えば、水
晶体、膵島細胞、皮膚、角膜などを含む、器官、細胞集団、および腺の部分の形
態であり得る。

【００６１】本発明の別の局面では、標的遺伝子は、ブタのＧａｌα（１，３）ガラクトシ
ルトランスフェラーゼである。Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ
ーゼは、ブタにおけるノックアウトについての魅力ある標的である。この酵素は
、糖質残基（Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ）の付加の原因である。Ｇａｌα（１，
３）Ｇａｌは、ブタ対ヒト異種移植片組織におけるヒトＩｇＭ抗体およびＩｇＧ
抗体により認識され、そして引き続いて超急性拒絶を導く。従って、ノックアウ
トブタ（これはＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠
く）は、移植片器官についての豊富な供給源としての潜在的役割を果たし得る。
Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼおよびその変異体をコード
する核酸配列が開示される。好ましくは、このヌクレオチド配列は、ブタＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする。ヌクレオチド配列
は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその混合物の形態であり得る。ヌクレオチド配列ま
たは単離された核酸は、複製するＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡベクター
（当業者に周知である）（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）に挿入
され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｅｓｓ，ＮＹ．第２版、１９８９）。

【００６２】Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチ
ド配列は、発現、転写および翻訳のためのプロモーター、エンハンサー、および
他の調節配列を含み得る。このような配列をコードするベクターは、さらなる遺
伝子および／または選択マーカー、ならびに細胞内のベクターの増殖および維持
に必要な要素の挿入のための制限酵素部位を含み得る。

【００６３】Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列を含
む標的化構築物およびその変異体は、これらが、本発明の方法に従って、野生型
Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活化するのに用
いられ得る場合に特に好ましい。変異体Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラン
スフェラーゼヌクレオチド配列は、野生型Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼに対して、ヌクレオチドの欠失、挿入、置換および付加を含むが
、これらに限定されない。その結果、得られた変異体は、機能的ガラクトシルト
ランスフェラーゼをコードしない。これらのヌクレオチド配列は、本発明のガラ
クトシルトランスフェラーゼの発現を調節する方法に利用され得る。この様式で
は、変異体配列は、標的細胞中の野生型ゲノム配列と組換えられ得る。

【００６４】最も好ましい実施形態では、ノックアウトブタが作製され、このブタにおいて
、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が非機能的タンパ
ク質を産生する。非機能的タンパク質を産生することにより、そうでなければ異
種移植片組織において発現されるＧａｌα（１，３）Ｇａｌエピトープに結合す
るヒト抗体は、結合せず、その結果、組織拒絶を生じる免疫応答を防ぐ。この実
施形態では、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ結合に対する
抗体の間の相互作用を調節し得る任意のノックアウト構築物が用いられ得る。

【００６５】（実施例）以下の実施例は、例示のみを目的とし、そして本明細書中の開示の範囲または
特許請求の範囲を制限することを意図しない。

【００６６】（実施例１）（イントロン３内の操作されたエキソンの形態の操作された活性遺伝子の挿入
によるＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活化）この実施例では、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼタンパ
ク質を、プロモーターを欠く操作されたエキソン（例えば、抗生物質耐性遺伝子
）のインフレームでの挿入によって、翻訳されるのを防ぐ。このプロモーターを
欠く操作されたエキソンは、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー
ゼ遺伝子のイントロン内に複数の停止コドンを含む。この「プロモーター−トラ
ップ」ストラテジーを用いて、操作されたエキソンを、Ｇａｌα（１，３）ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン４の上流にインフレームでスプラ
イスする。これは、薬物耐性遺伝子の発現を、目的の遺伝子の前に生じ、そして
薬物耐性遺伝子の下流の複数の停止コドンの存在に起因してトランスフェラーゼ
遺伝子の発現を同時に阻害する。本明細書中に記載されるように、適切な選択条
件下で標的化細胞の生存を与える任意の遺伝子を、以下を含むがこれらに限定さ
れない、操作されたエキソンとして用い得る：アンピシリン、カナマイシン、ジ
ェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（
ｐｈｏｓｐｈｏｐｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、プロマイシンＮ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ、ハイグロマイシンｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキ
ナーゼ、およびトリプトファンシンテターゼ。本実施例はネオマイシンを用いる
。

【００６７】遺伝子ターゲティング構築物を設計する。遺伝子ターゲティング構築物は、Ｇ
ａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子５’イントロン３配列
、イントロン４スプライスアクセプターシグナル配列、複数の停止コドンを含む
ように遺伝子操作したプロモーターを欠くネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子（操作されたエキソン）、エキソン４の下流に操作されたエキソンをス
プライシングするためのイントロン４スプライスドナー配列に対する相同性、お
よびブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に対するア
ニーリングを補助するためのさらなるイントロン３配列相同性を有する配列を含
む。本実施例は、イントロン３をターゲティングすることを記載するが、本方法
を用いて、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子または目
的の任意の他の遺伝子内の任意のイントロンを標的とし得る。Ｇａｌα（１，３
）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の中のイントロン（イントロン３内か
らイントロン８の末端）の配列表を、図１に提供する。ターゲティングベクター
および対応するヌクレオチド配列のスキーム図を、図２および図３に示す。

【００６８】遺伝子ターゲティング構築物を、５つの別個のＤＮＡフラグメント（以下の１
−５）を共に連結することにより生成して、当業者に周知の標準的な分子生物学
的技術を用いて最終遺伝子ターゲティング構築物を形成する。ＰＣＲ反応は、製
造者の指示書に従って、ＥＬＯＮＧＡＳＥＥｎｚｙｍｅＭｉｘ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いる。本実
施例では、５０μｌの最終反応容量（２μｌのＤＮＡテンプレート、１μｌのＥ
ＬＯＮＧＡＴＥＥｎｚｙｍｅＭｉｘ、６０ｍＭＴｒｉｓ−ＳＯ₄（ｐＨ９
．１）、１８ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．２ｍＭＭｇＳＯ₄、２００ｍＭｄ
ＮＴＰミックス、１０％ＤＭＳＯおよび２００ｍＭの各プライマーを有する）を
用いる。この反応を、標準的なＰＣＲサーモサイクラー（ＧｅｎＡｍｐＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ２４００；ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆ
ｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）の中で、９５℃にて１分間でホットスタートし、
引き続いて３０〜４０サイクル行う。

【００６９】１．図１および３（ヌクレオチド番号１０〜４０２０）に列挙したイントロ
ン３配列を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を、ゲノムフラグメントの
ロングレンジ（ｌｏｎｇｒａｎｇｅ）ＰＣＲのための標準的ＰＣＲ条件を用い
て生成する。用いたプライマーは、ＮｏｔＩ制限部位およびイントロン３配列１
０−２３を含む５’プライマー

【００７０】

【化１】；ならびにＳａｌＩ制限部位およびイントロン３配列３９９９-４０２０に相同
な配列を含む３’プライマー

【００７１】

【化２】を含み、ここで、下線を付した配列は、制限部位を示し、そして太字は外因性配
列に対する相同性を示す。さらなるグアニンヌクレオチドを、クローニングの間
に時折生じる１ｂｐ欠失に匹敵するように本実施例における全てのプローブの５
’末端に付加する。

【００７２】２．ＰＣＲ産物を、イントロン４、３’スプライス配列（ピリミジンリッチ
投げ縄構造（ｌａｒｉｏｔ））およびＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランス
フェラーゼントロン３ジヌクレオチドアクセプター配列）、ならびに１９６塩基
の５’隣接ａｇジヌクレオチド部位（図１および３中のヌクレオチド１１５２１
−１１７１６）を含むように生成する。用いたプライマーは、ＳａｌＩ制限部位
を含む５’プライマー

【００７３】

【化３】；ならびにＥｃｏＲＩ制限部位およびピリミジンリッチ投げ縄構造およびＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼジヌクレオチドアクセプター配列
に相同的な相補鎖を含む３’プライマー

【００７４】

【化４】を含み、ここで、下線を付した配列は、制限部位を示し、そして太字は外因性配
列に対する相同性を有する配列を示す。

【００７５】３．ネオマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号＃ＡＦ０８１９５７
；図４）を含むＰＣＲ産物を、ＡＴＧ開始コドンを含む、ＥｃｏＲＩ制限部位お
よびネオマイシン耐性遺伝子に対する相同性を含む、５’プライマー

【００７６】

【化５】；ならびにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および天然の停止コドン、続いて２つのさら
なる操作された停止コドンを含むネオマイシン遺伝子の３’コドン領域に対する
相補鎖配列を含む、３’プライマー

【００７７】

【化６】を用いて生成する。ここで、下線を付した配列は、制限部位を示し、そして太字
は外因性配列に対する相同性を有する配列を示す（図３および４を参照のこと）
。

【００７８】４．ＰＣＲ産物を、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子のイントロン４についての５’スプライシングドナー配列（これは、イント
ロン４を含む本願の配列の配列４９３８〜５１７３（図１および３）に対応する
）を含むように生成する。用いたプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および
Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼジヌクレオチドスプライス
部位を含む、イントロン４、配列４９３８〜４９６２と同一の配列を含む、５’
プライマー

【００７９】

【化７】、ならびにＰｓｔＩ部位およびヌクレオチド番号５１５２〜５１７３に対応する
イントロン４由来の相補鎖配列を含み、そして複数の停止コドンを含む、３’プ
ライマー

【００８０】

【化８】を含み；ここで、下線を付した配列は、制限部位を示し、そして太字は外因性配
列に対する相同性を有する配列を示す。

【００８１】５．イントロン３の１１５０ヌクレオチドを含むＰＣＲ産物は、本願の配列
のヌクレオチド４０２４〜４８２６（図１および３）に対応する。用いたプライ
マーは、ＰｓｔＩ部位および本願の配列の配列４０２４〜４０５０を含む、５’
プライマー

【００８２】

【化９】；ならびにＸｈｏＩ制限部位および本願の配列の４８０１〜４８２６に対する相
補鎖配列を含む、３’プライマー

【００８３】

【化１０】を含み；ここで、下線を付した配列は、制限部位を示し、そして太字は外因性配
列に対する相同性を有する配列を示す。

【００８４】各ＰＣＲフラグメント（工程１−５）を、それぞれ増幅する。単一のＰＣＲフ
ラグメントを、製造業者のライゲーション指示書に従って、ｐＣＲ２．１ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローン化する。
組換えプラスミドＤＮＡを、適切な細菌宿主（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に形質転換する。この細菌を培養し、そしてプラスミドＤ
ＮＡを単離する。正しい挿入物を有するプラスミドＤＮＡ（制限分析および配列
分析により決定される）を用いて、最終生成物を構築する。

【００８５】ＰＣＲフラグメント増幅の後、一連のライゲーションを行って、細菌プラスミ
ドｐＢＳＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）中の最終
構築物をクローン化する。

【００８６】ａ．イントロン４ＰＣＲ産物（工程４）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩフ
ラグメントおよびイントロン３（上記工程５）由来のＰｓｔＩ-ＸｈｏＩ３’相
同性フラグメントを、ｐＢＳＳＫ＋ベクターＤＮＡに連結し、次いでＨｉｎｄ
ＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いて消化する。３つのＤＮＡフラグメントを等モル比
で混合し、そして製造業者の推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の存在下でインキュベ
ートする。ライゲーションの後、組換えプラスミドＤＮＡを適切な細菌宿主（Ｄ
Ｈ１０Ｂ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）に形質転換する。細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離する。正
確な挿入物を有するプラスミドを（制限分析および配列分析により決定される）
を用いて、最終生成物を構築する。

【００８７】ｂ．得られたプラスミド（工程５ａ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ
を用いて消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ-ＥｃｏＲＩネオマイシン耐性遺伝子フ
ラグメント（工程３）（これはＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて予め消
化している）と連結する。得られた組換えプラスミドＤＮＡを、適切な細菌宿主
（ＤＨ１０Ｂ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ，ＭＤ）に形質転換する。細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離する
。正確な挿入物を有するプラスミドを（制限分析および配列分析により決定され
る）を用いて、最終生成物を構築する。

【００８８】ｃ．得られたプラスミド（工程５ｂ）を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用い
て消化し、そしてＳａｌＩ-ＥｃｏＲＩイントロン４−３’スプライシングフラ
グメント（工程２）（これはＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩを用いて予め消化し、そ
してこのイントロン３４ｋｂＮｏｔＩ−ｓａｌＩフラグメント（工程１）は、Ｎ
ｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて予め消化している）に連結する。３つのＤＮＡフ
ラグメントを、製造業者の推奨に従って、等モル比で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の存在下で
インキュベートする。ライゲーションの後、組換えプラスミドＤＮＡを適切な細
菌宿主（ＤＨ１０Ｂ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｇｅｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）に形質転換する。細菌を培養し、そして組換えプラスミドＤＮ
Ａを単離する。

【００８９】最終構築物を用いて、ブタ胚性線維芽細胞、トランスジェニックブタ線維芽細
胞、またはブタ胚性幹細胞、またはブタ始原生殖細胞をトランスフェクトする。
ネオマイシンに耐性である細胞クローンを、統合の部位を決定するために、ＰＣ
Ｒによりスクリーニングする。最終構築物に組み込まれないイントロン４の領域
に配置したプライマー（５４０７〜５４２７の相補鎖；ＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＡ
ＡＣＡＴＧＧＣＡＧＧ；図１および３を参照のこと）を、５’ネオマイシン遺伝
子プライマー（工程３）と組み合わせて用いる。標的化挿入物のみが、適切なサ
イズのＰＣＲフラグメントを生じる。全ての他の統合事象は、陰性の結果を生じ
る。

【００９０】次いで、標的化挿入物を有する細胞クローンを、核移植技術を用いてトランス
ジェニック動物を作製するため（または、幹細胞の場合）に用いて、発生中の未
分化胚芽細胞に注入して、そしてキメラ子孫を産生する。

【００９１】（実施例２）（エキソン４と操作されたエキソンの形態の活性遺伝子との置換によるＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活化）本実施例では、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク
質を、外因性エキソン（エキソン３）をインフレームでプロモーターを欠く操作
されたエキソン（抗生物質耐性遺伝子）と交換することにより、翻訳されるのを
防いだ。この操作されたエキソンは、遺伝子の３’末端に付着させたウシ成長ホ
ルモンポリＡ配列（これは、操作されたエキソンの転写を停止させる役目をする
）を含んでいた。操作されたエキソンを、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子（「プロモーター−トラップ」ストラテジー）により代表
的に用いられる外因性プロモーターの利点を利用するために、インフレームでス
プライスした。これは、薬物耐性遺伝子の発現を生じ、そして同時に、全長Ｇａ
ｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を阻害した。本明
細書中に記載されるように、適切な選択条件下で標的化細胞の生存を与える任意
の遺伝子を、以下を含むがこれらに限定されない、操作されたエキソンとして用
い得る：アンピシリン、カナマイシン、ジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）、
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐｏｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ）、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンｂ
−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、およびトリプトファンシンテ
ターゼ。本実施例は、プロマイシンを利用する。

【００９２】Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子３’イントロン３
配列、イントロン３スプライスシグナル配列（スプライスアクセプター配列）に
相同性を有する配列、コザックコンセンサス配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列
（ｂポリＡ）（操作されたエキソン）に結合した、プロモーターのないプロマイ
シンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、5’イントロン４スプライスシグ
ナル配列（スプライスドナー配列）および５’イントロン４配列相同性を有する
配列を含む遺伝子標的化構築物を設計した。Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子のエキソン４は、ＡＴＧ開始コドンおよびこのタンパク
質のＮ末端部分をコードする。この実施例はイントロン３および４を標的化する
ことについて記載するが、この方法が、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子または目的の任意の他の遺伝子内の任意のエキソンを標的化
するために使用され得ることが予測される。Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子のイントロンの配列表（イントロン３内からイントロン
８の末端まで）を、図１に提供する。

【００９３】遺伝子標的化構築物を、当業者に周知の標準的な分子生物学の技術を用いて、
２つの異なるＤＮＡフラグメントを一緒に結合させ、最終の遺伝子標的化構築物
を形成することにより生成した。第１のＤＮＡフラグメントを、３’スプライス
配列を含むイントロン３の３’末端（スプライシングの間投げ縄構造を形成する
際に使用されるピリミジンリッチな分岐部位およびＡＧジヌクレオチドスプライ
スアクセプター配列）から得た。第２のＤＮＡフラグメントを、ＡＴジヌクレオ
チドスプライスドナー配列を含むイントロン４の５’末端から得た。このフラグ
メントを、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（図５）に結合したプロモーターのない
プロマイシン遺伝子のコード配列と共にコザックコンセンサス配列をインフレー
ムで含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターに結合し、最終遺伝子構築物を形成し
た。標的化ベクターの概略図および対応するヌクレオチド配列を図６および図７
に示す。さらに、この構築物を、２０００年９月２８日にＡＴＣＣに寄託番号で寄託した。

【００９４】（１．第１ＤＮＡフラグメントの作製）第１のＤＮＡフラグメントは、図７に示されるイントロン３配列からなるポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物であり（ヌクレオチド番号２３５〜４８５１位
（ラムダファージクローンから単離された挿入物のヌクレオチドの１位に対して
）、そしてゲノムフラグメントの長い範囲のＰＣＲのために、Ｒａｎｄｏｌｆら
（１９９６）によって記載されたような標準的ＰＣＲ条件を用いて作製した。イ
ントロン３配列２３５〜２６０からなる５’プライマーは、５’−ＡＡＧＡＴＴ
ＡＴＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＧＴＧＴＣＡＧＧ−３’であった。３’逆方向プライ
マー配列は、イントロン３の最も３’末端で配列４８２７〜４８５１に相補性で
あり、かつＡＧスプライスアクセプター部位を含んでいて、そして５’−ＣＴＣ
ＣＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ−３’であった。

【００９５】４．６１６ｋｂのイントロン３配列を作製するためのＰＣＲ反応条件を、ＥＬ
ＯＮＧＡＳＥＥｎｚｙｍｅＭｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、製造者の条件に従って行った。本
実施例において、２μｌのＤＮＡテンプレート、１μｌのＥＬＯＮＧＡＳＥＥ
ｎｚｙｍｅＭｉｘ、６０ｍＭのＴｒｉｓＳＯ₄（ｐＨ９．１）、１８ｍＭの
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．２ｍＭのＭｇＳＯ₄、２００ｍＭのｄＮＴＰ混合物、１０
％のＤＭＳＯ、および２００ｎＭの各プライマーと共に、５０μｌの最終反応容
量を使用した。反応を、９５℃で１分間ホットスタートし、続いて標準的なＰＣ
Ｒ装置内で３０〜４０サイクル行った（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＴＳ
ｙｓｔｅｍｓ２４００：ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）。

【００９６】（２．ＰＣＲ２．１クローニングベクターの調製）ＰＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅ
ｇｏ、ＣＡ）のＮｏｔＩ部位を、第２のＮｏｔＩ部位にわたって最終構築物へと
されるのを防ぐために破壊した。ＮｏｔＩ部位は固有であり、そして最終プラス
ミド構築物を直鎖化するために使用した。ＰＣＲ２．１ベクターを、ＮｏｔＩで
消化し、そしてクレノウ酵素（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて、製造者の仕様書に
従って、オーバーハングをフィルインした。プラスミドを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用い
て、製造者の推奨に従って再び結合させた。プラスミドＤＮＡを、適切な細菌宿
主（Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）へ
形質転換した。この細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離し、そしてＮ
ｏｔＩ酵素と共にインキュベートして制限分析によってこの部位の喪失を確かめ
た。

【００９７】（３．ＰＣＲ２．１ベクターへの第１のＤＮＡフラグメントの挿入）ＰＣＲに続いて、４．６１６ｋｂのフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて、製造者の仕様書に従って、改変ＰＣＲ２．１ベクターへ結合させた。プラ
スミドＤＮＡを適切な細菌宿主（Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ
ａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）へ形質転換した。この細菌を培養し、そしてプラスミ
ドＤＮＡを単離した。最終産物を構築するために、制限分析および配列分析遺伝
子よって決定されるとおりに、適切な配向に正確な挿入物を有するプラスミドを
使用した。

【００９８】（４．第２のＤＮＡフラグメントの調製）ＧＴジヌクレオチド受容コンセンサススプライス配列を含むイントロン４相同
配列からなる２．０８４ｋｂｐのＰＣＲ産物を、上の工程１に記載されるような
標準的なＰＣＲ条件を用いて構築した。イントロン４の最も５’末端における配
列４９３８〜４９６１からなる５’プライマーは、５’−ＧＴＡＡＴＴＡＴＧＡ
ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧ−３’であった。３’プライマーは、６９９７〜
７０２１位においてイントロン４の相補鎖と相同であり、そして配列５’ＡＧＣ
ＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＴＡＡＧＴＡＣＧＴＴＧＣ−３’であった。

【００９９】（５．ＰＣＲ２．１ベクターへの第２のＤＮＡフラグメントの挿入）ＰＣＲに続いて、２．０８４ｋｂのフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＣＲ２．１ベクターへと、製造者の結合条件
を用いて、結合させた。結合後、組換えプラスミドＤＮＡを適切な細菌宿主（Ｔ
ｏｐ１０Ｆ’、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ））へと形
質転換した。この細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した。最終産物
を構築するために、制限分析および配列分析遺伝子よって決定されるとおりに、
正確な挿入およびプラスミド内の配向を有するプラスミドを使用した。

【０１００】（６．合成オリゴヌクレオチドリンカー配列の調製）コザックコンセンサス配列および関連した制限酵素部位を含む合成オリゴヌク
レオチドリンカーを、以下のプロモーターのないプロマイシン遺伝子のインフレ
ームクローニングのために調製した。

【０１０１】

【化１１】（７．遺伝子標的化構築物のアセンブリ）以下の連結を行い、細菌プラスミドｐＢＳＫＳ＋（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、
ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）において最終構築物を作製した。この最終構築物を、
図６に例示する。

【０１０２】ａ．コザックコンセンサス配列を含むオリゴヌクレオチドリンカー（工程６）
を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した後に、ＫＳ＋ベクターＤＮＡへ
結合した。結合は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の存在下で少なくとも３：１のモル比のリンカ
ー：ベクターを使用して、製造者の推奨に従って行った。結合後、組換えプラス
ミドを適切な細菌宿主（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，
ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）へと形質転換した。この細菌を培養し、そしてプラス
ミドＤＮＡを単離した。リンカー内の固有の制限部位（ＢｇｌＩＩまたはＨｐａ
Ｉ）を用いて、制限酵素分析を行って、成功した結合を確認した。次いで、最終
産物を構築するために、リンカーを含むこのプラスミドを使用した。

【０１０３】ｂ．次いで、得られた「マザー」プラスミド（工程７ａ）を、ＥｃｏＲＶおよ
びＳｐｅＩで消化し、標的化構築物の３’アームにおいてクローニングした。Ｐ
ＣＲ２．１ベクターにクローニングされた２．８０４ｋｂのＰＣＲフラグメント
（工程５）をＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によ
ってベクターＤＮＡから単離し、そして精製した。２．８０４ｋｂフラグメント
を、マザープラスミド（工程７ａ）のＥｃｏＲＶ部位とＳｐｅＩ部位との間に結
合させた。結合は、製造者の推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の存在下で、３：１の
モル比の挿入物：ベクターを用いて行った。結合後に、組換えプラスミドを適切
な細菌宿主（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ，ＬａＪｏｌ
ｌａ、ＣＡ）へと形質転換した。この細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを
単離した。次いで、最終産物を構築するために、制限分析および配列分析によっ
て決定されるように、正確な挿入を有するプラスミドを使用した。

【０１０４】ｃ．マザープラスミドにクローニングされた次のフラグメント（工程７ｂ）は
、ＴＧＡ停止コドンの後にその３’末端に付加されたウシ成長ホルモン遺伝子ポ
リＡシグナル配列を有する配列をコードするプロモーターのないプロマイシン遺
伝子を含むカセットであった（図５）。ＰＧＫプロマイシンｂポリＡプラスミド
（これは、形質転換した細胞のプロマイシン耐性に対するホジティブコントロー
ルとして使用される）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化した。プロマイ
シンｂポリＡフラグメントを、ＰＧＫプロモーターを含むベクターＤＮＡの残り
から０．７％アガロースゲル上の電気泳動によって単離し、そして精製した。マ
ザープラスミド（工程７ｂ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで消化した。Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩプロマイシンｂポリＡカセットを、マザープラスミドＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位に結合させた。結合は、製造者の推奨に従っ
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ、ＭＡ）の存在下で、３：１のモル比の挿入物：ベクターを用いて行っ
た。結合後に、組換えプラスミドを適切な細菌宿主（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ
’、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）へと形質転換した。この細
菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した。最終産物を構築するために、
制限分析および配列分析によって決定されるように、正確な挿入を有するプラス
ミドを使用した。

【０１０５】ｄ．最終クローニング工程は、構築物の５’アーム（これは、ＰＣＲ２．１ベ
クター（工程３）由来の４．６１６ｋｂのイントロン３挿入物である）を結合す
る工程を包含した。ＰＣＲ２．１ベクター（工程３）を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏ
Ｉで消化した。４．６１６ｋｂのＰＣＲフラグメントを、アガロースゲル電気泳
動によってベクターＤＮＡから分離し、そして精製した。４．６１６ｋｂのＫｐ
ｎ／ＸｈｏＩ挿入物を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化されたマザープラスミ
ド（工程７ｃ）に結合させた。結合は、製造者の推奨に従って、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の
存在下で、等モル比の挿入物：ベクターを用いて行った。結合後に、組換えプラ
スミドを適切な細菌宿主（ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ，
ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）へと形質転換した。この細菌を培養し、そしてプラス
ミドＤＮＡを、標準的な分子生物学の技術によって単離した。制限分析および配
列分析によって決定されるように、正確な挿入を有するプラスミドを、最終産物
として使用した。

【０１０６】ｅ．最終構築物を使用して、ブタ胚性繊維芽細胞、トランスジェニックブタ繊
維芽細胞、またはブタ胚性幹細胞、あるいはブタ始原生殖細胞をトランスフェク
トした。プロマイシンに対して耐性である細胞クローンをＰＣＲによってスクリ
ーニングし、当業者に周知の方法によって組込み部位を決定し得る。イントロン
４の領域に配置されたプライマー（これは、最終構築物に組み込まれない）は、
５’プロマイシン遺伝子プライマーと組み合わせて使用され得る。標的化された
挿入物のみが、適切なサイズのＰＣＲフラグメントを与える。他の組込み事象は
全てネガティブな結果を引き起こす。

【０１０７】次いで、標的化された挿入物を有する細胞クローンは、核移植技術を用いて、
トランスジェニック動物を作製するために、または幹細胞の場合は、発生中の胚
盤胞内に注入し、そしてキメラ子孫を生み出すために、使用し得る。

【０１０８】（実施例３）（エキソン４を逆配向活性遺伝子で置換することによるＧａｌα（１，３）ガ
ラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不活性化）この実施例において、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子を、「衝突構築物」を用いることによって機能的に不活性化し、エキソンお
よび少なくとも隣接するイントロン部分の代わりに、スプライスドナー部位およ
びスプライスアクセプター部位を含む活性遺伝子を挿入した。挿入された遺伝子
は、高度に活性なプロモーター（例えば、ホスホグリセレートキナーゼＩ（ＰＧ
Ｋ）遺伝子プロモーター）の制御下にあり、その結果、この遺伝子の転写は、内
因性遺伝子の転写の終結を引き起こす（Ｒｏｓａｒｉｏら、（１９９６）Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１５９２−１５９６）。Ｇａｌα（１，３）ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン４は、ＡＴＧ開始コドンおよびこの
タンパク質のＮ末端部分をコードする。従って、この挿入物は、エキソン４およ
び隣接するイントロン３および４の一部分を置換するために作製され、機能的酵
素をコードしない切断された転写物が生じる。この実施例は、イントロン３およ
び４を標的化することを記載するが、この方法は、Ｇａｌα（１，３）ガラクト
シルトランスフェラーゼ遺伝子または任意の他の目的遺伝子内で任意のイントロ
ンを標的化するために使用され得る。Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子のイントロンの配列表（イントロン３内からイントロン８の末
端まで）を、図１に提供する。

【０１０９】この実施例において、ウシ成長ホルモンポリＡ（ｂポリＡ）転写終結配列と共
にプロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するＰＧＫプロモーターを、挿入した。
この遺伝子は、標準的な相同組換え技術によって、挿入された遺伝子に隣接する
相同性のためにイントロン３および４配列を用いて、Ｇａｌα（１，３）ガラク
トシルトランスフェラーゼエキソン４、ならびに隣接するイントロン３および４
配列の１部分を置換した。エキソン３および４を分離するイントロン３は、長さ
が５ｋｂより大きくて、そして、少なくとも約４．６ｋｂの相同配列が遺伝子の
一方の末端に存在するように、構築物を作製した。エキソン４および５を分離す
るイントロン４は、長さが約６．８ｋｂであり、そして、少なくとも約２．２ｋ
ｂの相同配列が遺伝子の他方の末端に存在するように、構築物を作製した。構築
物が組み込まれたトランスフェクトされた細胞のポジティブ選択を、プロマイシ
ン耐性遺伝子の発現によって達成した。本明細書中に記載されるように、適切な
選択条件下で標的化された細胞を生存させる任意の選択マーカー遺伝子は、強力
なＰＧＫプロモーターによって駆動され得ることが理解される。さらに、トキシ
ン遺伝子を、挿入して、無作為組込み事象を除いた。

【０１１０】衝突構築物を、当業者に周知の標準的な分子生物学の技術を用いて作製した。
４．６１６ｋｂのイントロン３相同フラグメントおよび２．０８４ｋｂのイント
ロン４相同フラグメントを、ＰＣＲを用いて作製し、そして実施例２、上記の置
換標的化構築物のための工程１〜５に記載されるように、ＰＣＲ２．１クローニ
ングベクターへクローニングした。衝突構築物の作製は、まず、ｐＢＳＫＳ＋
ベクターに、衝突構築物の３’アームとして２．０８４ｋｂのイントロン４相同
フラグメント、続いてＧＴ遺伝子のコード配列に対して逆の配向でＰＧＫ−プロ
マイシン−ウシポリＡカセットを結合させる工程を包含する。４．６１６ｋｂの
イントロン３相同フラグメントを、５’アームとして、次にクローニングした。
これによって、相同側に、組換えのための標的化構築物を作製した。リシンＡト
キシン遺伝子も、相同領域の外プラスミドに付加し、この遺伝子は、無作為な組
換えが起こる割合の細胞を効果的に殺傷する。リシンＡトキシン遺伝子を、ＰＣ
Ｒ増殖し、そして公開された配列（図８）に基づいてクローニングした。最終構
築物の概略図を図９に示す。さらに、この衝突構築物を、２０００年９月２８日
にＡＴＣＣに寄託番号で寄託した。１．構築物の２．０８４ｋｂの３’アーム（イントロン４相同性フラグメント
）は、そのマルチプルクローニング部位（ｐＢＳＫＳ＋）内にＸｈｏＩ−Ｅｃ
ｏＲＩリンカーを含むように改変された（実施例２、工程６を参照のこと）ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクターへ連結される第１のフラグメントであ
った。このリンカーのベクターへの連結を、上記実施例２、工程７ａに記載し、
そしてこのベクターのＥｃｏＲＶおよびＳｐｅＩ部位への２．０８４ｋｂ３’
アームの連結を、上記実施例２、工程７ｂに記載する。２．次の工程は、ＰＧＫプロマイシンウシポリＡカセットのｐＢＳＫＳ＋ベ
クター（２．０８４ｋｂ３’アームを含む）への連結を包含する。このＰＧＫ
−ｐｕｒｏ−ｂＰＡカセットを、ＰＧＫプロモーターのすぐ５’にあるＥｃｏＲ
Ｉで消化した。このＥｃｏＲＩオーバーハングを、クレノウ酵素（Ｒｏｃｈｅ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）で製造業者の仕様を用いてフィルインすることにより平滑化した。次いで
、このＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｂＰＡカセットを、ウシポリＡ配列のすぐ３’にある
ＸｈｏＩでの消化によりベクターから遊離させた。この平滑化したＰＧＫ−ｐｕ
ｒｏ−ｂＰＡ−ＸｈｏＩカセットを、アガロースゲル電気泳動によりベクターＤ
ＮＡから分離し、そして精製した。このｐＢＳＫＳ＋ベクター（工程１）を、
ＨｐａＩおよびＸｈｏＩで消化し、そして平滑化したＰＧＫ−ｐｕｒｏ−ｂＰＡ
−ＸｈｏＩフラグメントを、ベクターのＨｐａＩとＸｈｏＩ部位との間に連結し
た。連結の後、この組換えプラスミドを、適切な細菌宿主（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換した。
この細菌を培養し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した。次いで、制限分析およ
び配列分析により決定されたように、正しい挿入物を有するプラスミドを、最終
産物として用いた。３．４．６１６ｋｂのイントロン３相同性フラグメントを、ｐＢＳＫＳ＋マ
ザープラスミドに連結し（工程２）、そして衝突構築物（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の５’アームを示した。このフラグメントをＰＣＲ２．１
クローニングベクターから単離すること、ならびにこのマザープラスミドのＫｐ
ｎＩおよびＸｈｏＩ部位への連結は、上記実施例２、工程７ｄに記載される。４．リシンＡ毒素遺伝子（図８）を、市販の哺乳動物発現ベクター（例えば、
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。次いで、この挿
入物を、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡ部位とともに切り出し、そし
て挿入物およびベクターの両方に対するクレノウフィルイン反応の後に、平滑末
端連結により組換えプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングした。５．連結の後に、この組換えプラスミドＤＮＡを用いて、適切な細菌細胞（Ｘ
ＬＩ−ｂｌｕｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を形質転換した。この細菌を培養し、
そしてプラスミドＤＮＡを単離した。この最終構築物ＤＮＡを、ＫｐｎＩ（構築
物配列の外側にあるプラスミドＭＣＳにおける独特の酵素部位）で直鎖状にした
。直鎖状にしたプラスミドを用いて、ブタ胚性繊維芽細胞、トランスジェニック
ブタ繊維芽細胞、ブタ胚性幹細胞、またはブタ始原生殖細胞をトランスフェクト
し得た。プロマイシンに耐性の細胞クローンを、ＰＣＲによりスクリーニングし
て、当業者に周知の方法により組み込みの部位を決定し得た。最終構築物へ組み
込まれなかったイントロン４の領域に位置したプライマーを、５’プロマイシン
遺伝子プライマーと組み合わせて用い得た。標的化された挿入物のみが、適切な
サイズのＰＣＲフラグメントを生じる。全ての他の組み込み事象は、ネガティブ
な結果を生じる。

【０１１１】次いで、標的化された挿入物を有する細胞クローンを、核移入技術を用いるこ
とによりトランスジェニック動物を生産するために使用し得るか、または幹細胞
の場合には、発生中の胚盤胞に注入し、そしてキメラ子孫を生産するために使用
し得る。（実施例４：Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をコー
ドするブタゲノムＤＮＡのλファージクローンライブラリーからの単離）この実施例において、ブタのゲノムライブラリーを、当業者に周知の分子生物
学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）を用いて、Ｇａｌα（１，３）
ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン４に対応するｃＤＮＡでスク
リーニングした。ブタゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌ
ｔｏ，ＣＡ）を得て、そしてブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のエキソン４に由来するＰＣＲフラグメントでスクリーニングした
。エキソン４を、ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って³²ＰｄＣＴＰで
標識した。約４百万のファージ形成単位をスクリーニングし、そしてサザンブロ
ッティングにより決定されたエキソン４配列を含む独特のクローンを単離した。
この手順により得たクローンは、１５〜４０ｋｂ長の挿入物を含んでいた。これ
らのクローンを、ｐｇＧＴ、λ１、λ２、λ４−１およびλ８−２と指定した。
独特の重複するヌクレオチド配列（イントロン３内〜イントロン８のブタＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子全体にまたがり得る）を含
む５つのベクターを、ＡＴＣＣに寄託した：（１）１８．２７５ｋｂのλ−２フ
ァージクローンの最も５’末端のイントロン３内の１．６ｋｂ挿入物、（２）１
８．２７５ｋｂのλ−２ファージクローンのイントロン３〜イントロン４にまた
がる６．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、（３）１８．２７５λ−２ファ
ージクローンの６．７ｋｂフラグメント２の後ろにある４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメント、（４）１８．２７５λ−２ファージクローンの最も３’側の部分
にある６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメント、および（５）エキソン
７〜エキソン９にまたがるλ−２ファージクローンの１３ｋｂフラグメント。こ
れらの５つのベクターを、２０００年９月２９日にＡＴＣＣに寄託し、それぞれ
、登録番号を得た。種々の挿入物のサブクローンを、当業
者に周知の分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと
）を用いて、図１に提供されるイントロン３内〜イントロン８までの本願イント
ロン配列を生成するために使用した。これらの配列を、ブタＧａｌα（１，３）
ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の調節のための標的化構築物を設計する
際に配列相同性の領域を決定するために用い得た。

【０１１２】本明細書中に提供された組成物および方法を詳細に記載してきたが、当業者は
、多くの変更および改変が行われ得、そしてこのような変更および改変が、本明
細書中に提供された組成物および方法の趣旨および範囲を逸脱することなく行わ
れ得ることを認識する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイ
ントロンのヌクレオチド配列（イントロン３内からイントロン８の終わりまで）
を示す。長音記号は、エキソン領域内のヌクレオチドを示す。従って、ヌクレオ
チド配列の番号付けは、λ−２ファージクローンから単離された挿入物のヌクレ
オチド位置１に関連して、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子全体における塩基の数を表す。

【図２】図２は、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不
活性化に使用される遺伝子ターゲティングベクターの略図を示す（実施例１を参
照のこと）。このベクターは、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子のイントロン３の５’領域に対して相同性を有する配列、複数の終止
コドン（操作されたエキソン）を含むように操作された、プロモーターのないネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、操作されたスプライスアクセプタ
ー部位、操作されたエキソンを下流エキソン４へスプライシングするためのイン
トロン４配列の５’領域、およびブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子へのアニーリングを助けるための、イントロン３の３’領域に
対して相同性を有する配列を含むように設計される。矢印は、ＰＣＲに使用され
るプライマーの位置を示す。

【図３】図３は、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不
活性化に使用される遺伝子ターゲティングベクターのヌクレオチド配列を示す（
実施例１を参照のこと）。このベクターは、（Ａ．）Ｇａｌα（１，３）ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン３の５’領域に対して相同性を有
する配列、（Ｂ．）イントロン４スプライスアクセプター配列、（Ｃ．）複数の
終止コドン（操作されたエキソン）を含むように操作された、プロモーターのな
いネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、（Ｄ．）イントロン４スプラ
イスドナーシグナル配列、および（Ｅ．）ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシル
トランスフェラーゼ遺伝子へのアニーリングを助けるための、３’イントロン３
配列を含むように設計される。下線を引かれた全ての配列は、プライマー配列に
おける制限部位に対応する。太字は、ＰＣＲに使用されるプライマー領域を示す
。通常の形式はＰＣＲフラグメント配列を示す。

【図４】図４は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン耐性遺
伝子）についてのヌクレオチド配列を示す。太字は、遺伝子の開始コドンおよび
終止コドンの位置を示す。下線を引かれた配列は、プライマー配列に対応する。
大文字で書かれたヌクレオチドは、この遺伝子のコード領域内である。

【図５】図５は、プロマイシン／ウシ成長ホルモンポリＡのヌクレオチド配列を示す。
下線を引かれた配列は、プロマイシン遺伝子の開始コドンに対応する。

【図６】図６は、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不
活性化に使用される遺伝子ターゲティングベクターの略図を示す（実施例２を参
照のこと）。このベクターは、３’イントロンスプライスアクセプター配列を含
むＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子３’イントロン３
配列に対して相同性を有する配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ウシ成長ホル
モンポリＡ配列（操作されたエキソン）を含むように操作された、プロモーター
のないプロマイシン遺伝子、および５’イントロンスプライスドナー配列を含む
、５’イントロン４配列相同性を有する配列を含むように設計される。矢印は、
ＰＣＲに使用されるプライマーの位置を示す。

【図７】図７は、図６に概略的に示される遺伝子ターゲティングベクターのヌクレオチ
ド配列を示す（実施例２を参照のこと）。下線を引かれた配列は、使用されるプ
ライマー配列に対応する。太字は、相同性について使用されたイントロン領域を
示す。イントロン３の３’末端およびイントロン４の５’末端のＡＧおよびＧＴ
スプライスコンセンサス配列は、大文字である。

【図８】図８は、リシンＡ毒素遺伝子のヌクレオチド配列を示す。大文字のヌクレオチ
ドは、この遺伝子のコード領域内である。

【図９】図９は、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の不
活性化に使用される衝突構築物の略図を示す（実施例３を参照のこと）。このベ
クターは、３’イントロンスプライスアクセプター配列を含むＧａｌα（１，３
）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子３’イントロン３配列に対して相同性
を有する配列、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下で
、ウシ成長ホルモンポリＡ配列を含むように操作された逆配向プロマイシン遺伝
子、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で５’イン
トロンスプライスドナー配列およびリシンＡ毒素遺伝子を含む５’イントロン４
配列相同性を有し、そして相同性の領域の外側に位置するＳＶ４０ポリＡ配列を
含む配列を含むように設計される。矢印は、ＰＣＲに使用されるプライマーの位
置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラムスーンダール，ハグディースジェイ．アメリカ合衆国ニューヨーク 13346，ハミルトン，マディソンストリート 46 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA04 DA02 DA06 EA04 FA10 FA18 GA11 HA01 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA44 CA46 4C081 AA01 AA12 AA14 AB01 AB11 AB31 BA12 CD34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞における真核生物遺伝子の発現を調節する方法であって
、該方法は、該細胞を核酸構築物でトランスフェクトする工程であって、該構築物は、第１
の遺伝子配列に相同な第１の構築物配列、選択マーカーをコードする配列、およ
び第２の遺伝子配列に相同な第２の構築物配列を含み、該第１および第２の遺伝
子配列は、該真核生物遺伝子の１以上のイントロン領域の少なくとも一部を独立
して含む、工程、ならびに該選択マーカーを該真核生物遺伝子に組み込む工程、を包含し、該選択マーカーの発現は、該細胞における該真核生物遺伝子の発現の調節を生
じる、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、前記第１の構築物配列およ
び前記第２の構築物配列が、各々、前記遺伝子のイントロン領域の少なくとも一
部に相同である、方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、前記選択マーカーをコード
する配列が、相同組換えにより前記真核生物遺伝子に組み込まれ、前記第１の構
築物配列が、前記第１の遺伝子配列と組み換わり、そして前記第２の構築物配列
が、前記第２の遺伝子配列と組み換わって、該遺伝子に該選択マーカーが挿入さ
れる、方法。
【請求項４】請求項１に記載の方法であって、前記細胞を、前記選択マー
カーの発現についてスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】請求項２に記載の方法であって、前記第１の構築物配列およ
び前記第２の構築物配列が、前記遺伝子の同じイントロン内の異なる領域に相同
である、方法。
【請求項６】請求項２に記載の方法であって、前記第１の構築物配列およ
び前記第２の構築物配列が、異なるイントロンの領域に相同である、方法。
【請求項７】請求項１に記載の方法であって、前記選択マーカー遺伝子が
、抗生物質耐性遺伝子である、方法。
【請求項８】請求項１に記載の方法であって、前記選択マーカーをコード
する配列が、発現された場合に、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ジェネ
ティシン耐性、ネオマイシン耐性、プロマイシン耐性、ハイグロマイシンｂ耐性
、チミジンキナーゼ活性、トリプトファンシンテターゼ活性、アデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ活性、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性、ならびにヒス
チジノールデヒドロゲナーゼ、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびル
シフェラーゼからなる群より選択される表現型を付与するヌクレオチド配列であ
る、方法。
【請求項９】請求項８に記載の方法であって、前記選択マーカーをコード
する配列が、ネオマイシン耐性またはプロマイシン耐性を付与する、方法。
【請求項１０】請求項１に記載の方法であって、前記真核生物遺伝子が、
Ｂ７．３、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、Ｖ
ＣＡＭ−１、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５４、主要組織適合性遺伝
子複合体クラスＩ、β−２マクログロブリン、インバリアント鎖、カスパーゼ−
１、カスパーゼ−３、およびＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の方法であって、前記真核生物遺伝子が
、Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする、方法。
【請求項１２】請求項１１に記載の方法であって、前記Ｇａｌα（１，３
）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ブタ遺伝子である、方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、前記第１の構築物配列
および前記第２の構築物配列が、前記ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子のイントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロ
ン６、イントロン７、イントロン８、およびイントロン９からなる群より選択さ
れるイントロンの相同な領域から独立して選択される、方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、前記イントロン４が、
図１のヌクレオチド４９３８〜１１７１６のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項１５】請求項１３に記載の方法であって、前記イントロン５が、
図１のヌクレオチド１１７５３〜１３７４８のヌクレオチド配列を有する、方法
。
【請求項１６】請求項１３に記載の方法であって、前記イントロン６が、
図１のヌクレオチド１３８１０〜１４３５８のヌクレオチド配列を有する、方法
。
【請求項１７】請求項１３に記載の方法であって、前記イントロン７が、
図１のヌクレオチド１４４６３〜２１６２７のヌクレオチド配列を有する、方法
。
【請求項１８】請求項１３に記載の方法であって、前記イントロン８が、
図１のヌクレオチド２１７６６〜２７０４８のヌクレオチド配列を有する、方法
。
【請求項１９】請求項１３に記載の方法であって、前記第１の構築物配列
および前記第２の構築物配列が、前記真核生物遺伝子の同じイントロン内の異な
る領域に相同である、方法。
【請求項２０】請求項１９に記載の方法であって、前記イントロンが、ブ
タＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン３で
ある、方法。
【請求項２１】請求項１３に記載の方法であって、前記第１の構築物配列
および前記第２の構築物配列が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランス
フェラーゼ遺伝子の異なるイントロンに相同である、方法。
【請求項２２】請求項２１に記載の方法であって、前記第１の構築物配列
が、前記第２の構築物配列の上流に存在する、方法。
【請求項２３】請求項２１に記載の方法であって、前記第１の構築物のイ
ントロン領域が、イントロン３領域に相同であり、そして前記第２の構築物のイ
ントロン領域が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼのイ
ントロン４領域に相同である、方法。
【請求項２４】請求項２に記載の方法であって、前記選択マーカーをコー
ドする配列が、プロモーターがない遺伝子である、方法。
【請求項２５】請求項２に記載の方法であって、前記選択マーカーをコー
ドする配列が、プロモーターをさらに含む、方法。
【請求項２６】請求項２５に記載の方法であって、前記プロモーターが、
ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、方法。
【請求項２７】請求項２に記載の方法であって、前記選択マーカーをコー
ドする配列が、前記真核生物遺伝子の配向に対して反対の配向で転写される、方
法。
【請求項２８】請求項２７に記載の方法であって、前記選択マーカーをコ
ードする配列が、プロモーター配列をさらに含む、方法。
【請求項２９】請求項１に記載の方法であって、前記細胞が、線維芽細胞
、上皮細胞、内皮細胞、トランスジェニック胚性線維芽細胞、胚性幹細胞、およ
び始原生殖細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】請求項２に記載の方法であって、前記細胞がブタ細胞であ
る、方法。
【請求項３１】請求項２に記載の方法であって、前記構築物が、ＡＧジヌ
クレオチドスプライスアクセプター部位をさらに含む、方法。
【請求項３２】請求項２に記載の方法であって、前記構築物が、ＧＴジヌ
クレオチドスプライスドナー部位をさらに含む、方法。
【請求項３３】第１の遺伝子に相同な第１の構築物配列、選択マーカーを
コードする配列、および第２の遺伝子配列に相同な第２の構築物配列を含む核酸
構築物であって、該第１および第２の遺伝子配列が、真核生物遺伝子の１以上の
イントロン領域の少なくとも一部を独立して含む、核酸構築物。
【請求項３４】請求項３３に記載の核酸構築物であって、ＡＧジヌクレオ
チドスプライスアクセプター部位をさらに含む、核酸構築物。
【請求項３５】請求項３３に記載の核酸構築物であって、ＧＴジヌクレオ
チドスプライスドナー部位をさらに含む、核酸構築物。
【請求項３６】請求項３３に記載の核酸構築物であって、コザックコンセ
ンサス配列をさらに含む、核酸構築物。
【請求項３７】請求項３３に記載の核酸構築物であって、前記選択マーカ
ーをコードする配列が、発現された場合に、アンピシリン耐性、カナマイシン耐
性、ジェネティシン耐性、ネオマイシン耐性、プロマイシン耐性、ハイグロマイ
シンｂ耐性、チミジンキナーゼ活性、トリプトファンシンテターゼ活性、アデニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性、な
らびにヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、アントシアニン、β−グルクロニダー
ゼおよびルシフェラーゼからなる群より選択される表現型を付与するヌクレオチ
ド配列である、核酸構築物。
【請求項３８】請求項３７に記載の核酸構築物であって、前記選択マーカ
ーをコードする配列が、プロマイシン耐性またはネオマイシン耐性を付与する、
核酸構築物。
【請求項３９】請求項３３に記載の核酸構築物であって、前記真核生物遺
伝子が、Ｂ７．３、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ
−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５４、主要組織適
合性遺伝子複合体クラスＩ、β−２マクログロブリン、インバリアント鎖、カス
パーゼ−１、カスパーゼ−３、およびＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランス
フェラーゼをコードする遺伝子から選択される、核酸構築物。
【請求項４０】請求項３９に記載の核酸構築物であって、前記真核生物遺
伝子が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼである、核酸
構築物。
【請求項４１】請求項４０に記載の核酸構築物であって、前記第１の構築
物配列および前記第２の構築物配列が、前記ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン３、イントロン４、イントロン５、イ
ントロン６、イントロン７、イントロン８、およびイントロン９からなる群より
選択されるイントロンの相同な領域から独立して選択される、核酸構築物。
【請求項４２】請求項４１に記載の核酸構築物であって、イントロン４が
、図１のヌクレオチド４９３８〜１１７１６のヌクレオチド配列を有し、イント
ロン５が、図１のヌクレオチド１１７５３〜１３７４８のヌクレオチド配列を有
し、イントロン６が、図１のヌクレオチド１３８１０〜１４３５８のヌクレオチ
ド配列を有し、イントロン７が、図１のヌクレオチド１４４６３〜２１６２７の
ヌクレオチド配列を有し、そしてイントロン８が、図１のヌクレオチド２１７６
６〜２７０４８のヌクレオチド配列を有する、核酸構築物。
【請求項４３】請求項４１に記載の方法であって、前記第１の構築物配列
および前記第２の構築物配列が、前記真核生物遺伝子の同じイントロン内の異な
る領域に相同である、核酸構築物。
【請求項４４】請求項４３に記載の核酸構築物であって、前記イントロン
が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロ
ン３である、核酸構築物。
【請求項４５】請求項４１に記載の核酸構築物であって、前記第１の構築
物配列および前記第２の構築物配列が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルト
ランスフェラーゼ遺伝子の異なるイントロンに相同である、核酸構築物。
【請求項４６】請求項４５に記載の核酸構築物であって、前記第１の構築
物配列が、ブタＧａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼのイントロ
ン３領域に相同であり、そして前記第２の構築物配列が、ブタＧａｌα（１，３
）ガラクトシルトランスフェラーゼのイントロン４領域に相同である、核酸構築
物。
【請求項４７】請求項３３に記載の核酸構築物でトランスフェクトした、
細胞。
【請求項４８】請求項４１に記載の核酸構築物でトランスフェクトした、
細胞。
【請求項４９】請求項４４に記載の核酸構築物でトランスフェクトした、
細胞。
【請求項５０】請求項４６に記載の核酸構築物でトランスフェクトした、
細胞。
【請求項５１】請求項３３に記載の核酸構築物で形質転換した、細菌細胞
。
【請求項５２】請求項４１に記載の核酸構築物で形質転換した、細菌細胞
。
【請求項５３】請求項４４に記載の核酸構築物で形質転換した、細菌細胞
。
【請求項５４】請求項４６に記載の核酸構築物で形質転換した、細菌細胞
。
【請求項５５】図１のヌクレオチド４９３８〜１１７１６を有するＧａｌ
α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン４のヌクレオ
チド配列。
【請求項５６】図１のヌクレオチド１１７５３〜１３７４８を有するＧａ
ｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン５のヌクレ
オチド配列。
【請求項５７】図１のヌクレオチド１３８１０〜１４３５８を有するＧａ
ｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン６のヌクレ
オチド配列。
【請求項５８】図１のヌクレオチド１４４６３〜２１６２７を有するＧａ
ｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン７のヌクレ
オチド配列。
【請求項５９】図１のヌクレオチド２１７６６〜２７０４８を有するＧａ
ｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のイントロン８のヌクレ
オチド配列。
【請求項６０】Ｇａｌα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝
子の少なくとも一部を含むブタゲノムライブラリー由来のλファージクローンで
あって、該λファージクローンが、ｐｇＧＴ、λ１、λ２、λ４−１およびλ８
−２からなる群より選択される、λファージクローン。
【請求項６１】トランスジェニック哺乳動物を生産する方法であって、該
方法は、請求項３３に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする
工程、該核酸構築物の核酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該
選択した細胞を胚に導入する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程
、および該受胎した宿主哺乳動物から子孫を生産する工程を包含する、方法。
【請求項６２】トランスジェニック哺乳動物を生産する方法であって、該
方法は、請求項４４に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする
工程、該核酸構築物の核酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該
選択した細胞を胚に導入する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程
、および該受胎した宿主哺乳動物から子孫を生産する工程を包含する、方法。
【請求項６３】トランスジェニック哺乳動物を生産する方法であって、該
方法は、請求項４６に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする
工程、該構築物の核酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該選択
した細胞を胚に導入する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程、お
よび該受胎した宿主哺乳動物から子孫を生産する工程を包含する、方法。
【請求項６４】請求項６１に記載の方法に従って生産した、トランスジェ
ニック哺乳動物。
【請求項６５】請求項６２に記載の方法に従って生産した、トランスジェ
ニック哺乳動物。
【請求項６６】請求項６３に記載の方法に従って生産した、トランスジェ
ニック哺乳動物。
【請求項６７】移植拒絶を低減する方法であって、該方法は、請求項３２
に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする工程、該構築物の核
酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該選択した細胞を胚に導入
する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程、該受胎した宿主哺乳動
物から子孫を生産する工程、該子孫から細胞、組織、または器官を採取する工程
、および該採取した細胞、組織、または器官を、これらが必要な患者に移植する
工程を包含する、方法。
【請求項６８】移植拒絶を低減する方法であって、該方法は、請求項４４
に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする工程、該構築物の核
酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該選択した細胞を胚に導入
する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程、該受胎した宿主哺乳動
物から子孫を生産する工程、該子孫から細胞、組織、または器官を採取する工程
、および該採取した細胞、組織、または器官を、これらが必要な患者に移植する
工程を包含する、方法。
【請求項６９】移植拒絶を低減する方法であって、該方法は、請求項４６
に記載の核酸構築物で核ドナー細胞をトランスフェクトする工程、該構築物の核
酸を含むトランスフェクトした細胞を選択する工程、該選択した細胞を胚に導入
する工程、該胚を適切な宿主哺乳動物に受胎させる工程、該受胎した宿主哺乳動
物から子孫を生産する工程、該子孫から細胞、組織、または器官を採取する工程
、および該採取した細胞、組織、または器官を、これらが必要な患者に移植する
工程を包含する、方法。
【請求項７０】請求項４３に記載の核酸構築物であって、前記真核生物細
胞に毒性である遺伝子をコードする核酸配列をさらに含む、核酸構築物。
【請求項７１】請求項７０に記載の核酸構築物であって、前記真核生物細
胞に毒性である遺伝子がリシンＡ毒素遺伝子である、核酸構築物。