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JP2003510050A - クラミジア抗原および対応するｄｎａ断片ならびにその使用 - Google Patents

クラミジア抗原および対応するｄｎａ断片ならびにその使用

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JP2003510050A
JP2003510050A JP2001525362A JP2001525362A JP2003510050A JP 2003510050 A JP2003510050 A JP 2003510050A JP 2001525362 A JP2001525362 A JP 2001525362A JP 2001525362 A JP2001525362 A JP 2001525362A JP 2003510050 A JP2003510050 A JP 2003510050A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、クラミジア、特に肺炎クラミジア株の感染によって引き起こされる疾病に対してヒトをはじめとする宿主の核酸（ＤＮＡを含む）感作法であって、肺炎クラミジア系統のＯＭＰ（外膜タンパク質）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターおよび宿主においてＯＭＰ（外膜タンパク質）を発現させるプロモターを用いる方法を提供する。本発明の範囲内で改変も可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野 本発明はヒトなどの哺乳類におけるクラミジア感染症の予防および治療に使用
できるクラミジア(Chlamydia)ＯＭＰ（外膜タンパク質(outer membrane protein
)）抗原および対応するＤＮＡ分子に関する。
【０００２】 背景技術 クラミジアは原核生物である。それらは、リポ多糖および大腸菌(E coli)で見
られるタンパク質と構造的および機能的に類似するいくつかの膜タンパク質を含
む三層の外膜をはじめ、グラム陰性菌との形態的および構造的類似性を示す。そ
れらは、代謝上不活性であるが感染力のある細胞外段階と、複製はするが感染力
のない細胞内段階からなる独自の二相性生活環を有する偏性細胞内寄生体である
。生活環の複製段階は感染した宿主細胞の細胞質からこの細菌を隔離する膜に結
合した封入体内で起こる。
【０００３】 肺炎クラミジア(C.pneumonia)は一般的なヒト病原体で、初めにオウム病クラ
ミジア(Chlamydia psittaci)のTWAR株として記載されていたが、その後は新種で
あると認識されている。肺炎クラミジアは他のクラミジア種（トラコーマクラミ
ジア(C. trachomatis)、Ｃ．ペコラム(C. pecorum)およびオウム病クラミジアと
は抗原的、遺伝的および形態的に異なっている。それはトラコーマクラミジアま
たはオウム病クラミジアといずれかとＤＮＡ配列において１０％以下の相同性し
か示さない。
【０００４】 Ｃ．ニューモニアはコミュニティ獲得性の肺炎の一般的な原因であり、肺炎球
菌(Streptococcus pneumoniae)および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoni ae )よりもわずかに低い頻度である(Grayston et al. (1995) Journal of nfecti
ous Diseases 168:1231; Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmolo
gy and Visual Science 36:1477)。それはまた気管支炎および副鼻腔炎をはじめ
とする上気道症状および疾患を引き起こす(Grayston et al. (1990) Journal of
Infectious Diseases 168:1231; Grayston et al (1990) Journal of Infectio
us Diseases 161:618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501;
Wang et al (1986) Chlamydial infectious, Cambridge University Press, Ca
mbridge, p.329)。大部分の成人集団（６０％を超える）は肺炎クラミジアに対
する抗体を持っており(Wang et al (1986) Chlamydial infection, Cambridge U
niversity Press, Cambridge, p.329)、これはまだ認識されていないか、または
無症候性である過去の感染を示している。
【０００５】 肺炎クラミジア感染は通常には急性呼吸器系疾患（すなわち、咳、咽頭炎、嗄
声、および発熱；聴診での異常な胸部音）として示される。ほとんどの患者では
咳が２〜６週間持続し、回復が遅い。このようなケースの約１０％で、上気道感
染の後に気管支炎または肺炎が起こる。さらに肺炎クラミジア流行の際には、次
ぎにこれらの肺炎患者の約半数、特に虚弱者や高齢者で肺炎球菌の同時感染が認
めれた。上記で示されたように、肺炎クラミジア感染が呼吸器系感染以外の疾患
にも関連するさらに多くの証拠がある。
【０００６】 この生物の貯蔵庫はおそらくヒトである。オウム病クラミジアとは対照的に、
鳥類または動物の貯蔵庫は知られていない。伝染については明らかには定義され
ていない。それは分泌物との直接的な接触、媒介物、または風媒拡散によると考
えられる。長い潜伏期間があり、それは何ヶ月も持続する。流行の分析に基づけ
ば、感染者はその生物の効率の悪い媒介者であるので、肺炎クラミジアはある集
団にゆっくり拡散すると考えられる（患者から患者の間隔は平均３０日）。肺炎
クラミジア罹病率は普遍的である。小児期に最初に感染した後、成人期に再感染
が起こる。肺炎クラミジアは、２〜３年持続する高い発病率（流行病）間隔を重
ね合わせると著しくは世界中の伝染病であると考えられる。トラコーマクラミジ
ア感染は肺炎クラミジアに対する交差免疫を付与しない。感染症は経口抗せ物質
テトラサイクリンまたはエリスロマイシン（２ｇ／ｄ、少なくとも１０〜１４日
間）で容易に治療される。最近開発された薬剤アジスロマイジンはクラミジア感
染症に対して単回投与として極めて有効である。
【０００７】 ほとんどの場合、肺炎クラミジア感染は軽いことが多く、合併症もなく、感染
症の９０％までは亜急性であるか、認識されない。工業国の小児の間では感染は
５才まではまれであると考えられていたが、最近の研究(E Normann et al, Chla
mydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Ac
ta Paediatrica, 1998, Vol 87, Iss 1, pp 23-27)では、この世代の子供の多く
は血清反応陰性であるにもかかわらず感染のＰＣＲ証拠を示し、２〜４才の１７
〜１９％有病率と見積もられることが報告されている。発展途上国では、幼児の
間の肺炎クラミジア抗体の血清有病率は上昇し、肺炎クラミジアは急性下気道疾
患、ならびに世界の熱帯地方の幼児よび小児の死亡率の重要な原因であり得ると
疑われる。
【０００８】 血清有病率の研究および地方の流行病の研究によれば、肺炎クラミジアの一次
感染は通常、５才から２０才の間で起こる。米国では例えば、肺炎クラミジアに
よって引き起こされる毎年の小児肺炎の３０,０００症例であると見積もられる
。感染は小児または若年（例えば、学生や徴兵）群の中で集団発生する。
【０００９】 肺炎クラミジアはコミュニティ獲得性の下気道感染症の１０〜２５％を起こす
（スェーデン、イタリア、フィンランドおよび米国から報告）。流行中、肺炎ク
ラミジアは感染は肺炎の症例の５０〜６０％にのぼると考えられる。このような
期間にはまた、さらに肺炎球菌による混合感染があることが報告されている。
【００１０】 成人期の再感染もよくあり、臨床徴候はより軽い傾向にある。集団血清有病率
の研究に基づけば、年齢とともに曝露が増す傾向にあり、これは特にヒトにおい
て明らかである。何人かの研究者が、持続性、無症候性の肺炎クラミジア感染状
態がよくあることであると推測している。
【００１１】 中年または高年者では、肺炎クラミジア感染は慢性気管支炎および副鼻腔炎へ
と進行する可能性がある。米国での研究は、６０才より若い人において肺炎クラ
ミジアによって引き起こされた発病率は年間１,０００人につき１症例であるが
、若年層では発病率は３倍に上昇していたことを明らかにした。肺炎クラミジア
感染は病床中にある患者を除いては入院につながることはまれである。
【００１２】 極めて重要なのは、アテローム性動脈硬化症と肺炎クラミジア感染との関連で
ある。従来の肺炎クラミジア感染と心臓発作、冠動脈疾患および頸動脈疾患との
関係を示すいくつかの疫学研究がある(Saikku et al. (1988) Lanet; ii:983; T
hom et al. (1992) JAMA 268:68; Linnanmaki et al. (1993), Circulation 87:
1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116:273; Melnick et
al (1993) American Journal of Medicine 95:499)。さらに、この微生物は冠動
脈、頸動脈、末梢動脈および大動脈のアテロームおよび脂肪索で検出されている
(Shor et al. (1992) South African. Medical Journal 82:158; Kuo et al. (1
993) Journal of Infectious Diseases 167:841; Kuo et al. (1993) Arteriosc
lerosis and Thrombosis 13:1500; Campbell et al (1995) Journal of Infecti
ous Diseases 172:585; Chiu et al. Circulation, 1997 (In Press))。種々の
肺炎クラミジアは冠動脈および頸動脈から回収されている(Ramirez et al (1996
)Annals of Internal Medicine 125:979; Jackson et al. Abst. K121, p272, 3
6ｔｈ ICAAC, 15-18 Sept. 1996, New Orleans)。さらに肺炎クラミジアはウサ
ギモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の変化を誘導することが示されている
(Fong et al (1997) Journal of Clinical Microbiolology 35:48)。考え併せる
とこれらの結果は、、クラミジア性のアテローム性動脈硬化症の疫学的重要性は
依然証明されてはいないが、肺炎クラミジアがヒトにおいてアテローム性動脈硬
化症を引き起こし得るという高い可能性があることを示している。
【００１３】 いくつかの最近の研究はまた、肺炎クラミジア感染と喘息との間の関連も示し
ている。感染は喘鳴性の喘息性気管支炎、成人発症喘息および成人における喘息
の急性再燃に結びつけられており、小規模研究では何人かで長期抗生物質治療が
効果的にゆっくりと疾病の重篤度を軽減することが示されている(Hahn DL, et a
l. Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asth
ma. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45-49; Hahn DL, et al.
Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptom
itic asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dec; 117(3): 513-517; Bjornsson E, e
t al. Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperres
ponsiveness. Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63-69; Hahn DL. Treatment
of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a befor-after trial.
J Fam Pract. 1995 Oct; 41(4): 345-351; Allegra L, et al. Acute exacerbat
ions of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Re
spir J. 1994 Dec; 7(12): 2165-2168; Hahn DL, et al. Association of Chlam
ydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezng, asthmatic bronchit
is, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 22 5-230)。
【００１４】 これらの結果に照らして、肺炎クラミジア感染に対する防御ワクチンが極めて
重要であると考えられる。いずれのヒトクラミジア感染にも有用なワクチンはま
だない。有効なワクチンは物理的または化学的に不活化したクラミジアを用いて
開発できると考えられる。しかしながらかかるワクチンは高い安全域がない。一
般に、安全なワクチンはその微生物の遺伝子操作のよって弱毒化するか、または
組換えによって作出される。従って、ヒトクラミジア感染に対する有効かつ安全
なワクチンを作出する主な障壁は、クラミジア、特に肺炎クラミジアに関する遺
伝情報が不十分であることであった。
【００１５】 肺炎クラミジアおよびオウム病クラミジアを用いた研究では、クラミジアに対
する安全かつ有効なワクチンが達成可能な目標であることを示している。例えば
、トラコーマクラミジアの肺感染から回復したマウスはその後の膣攻撃によって
誘導される不妊症から保護される(Pal et al. (1996) Infection and Immunity.
64:5341)。同様に、不活化したオウム病クラミジアで免疫化したヒツジはその
後のクラミジア誘発性の流産および死産から保護された(Jones et al. (1995) V
accine 13:715)。クラミジア感染症からの保護はＴｈ１免疫応答、特にＩＮＦｇ
（ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する）の誘導と関連づけられている(Igietsemes et al.
(1993) Immunology 5:317)。ＣＤ４＋細胞系統またはクローンの、ヌードマウ
スまたはＳＣＩＤマウスへの養子移入は攻撃または明らかな慢性疾患からの防御
を付与し(Igietseme et al (1993) Regional Immunology 5:317; Magee et al (
1993) Regional Immunology 5: 305)、またＣＤ４＋Ｔ細胞のin vivo涸渇は攻撃
後の疾病を悪化させた(Lander et al. (1991) Ynfection & Immunity 59:3774;
Magee et al (1995) Infection & Immunity 63:516)。しかしながら、粘膜表面
の十分高力価の中和抗体の存在も保護作用を発揮し得る(Cotter et al. (1995)
Infection and Immunity 63:4704)。
【００１６】 肺炎クラミジア種内の抗原のバリエーションは遺伝情報が不十分であるために
十分記載されていないが、バリエーションはトラコーマクラミジアに基づいて存
在しているものと予測される。トラコーマクラミジアの血清学的亜型は主要外膜
タンパク質（ＭＯＭＰ）における抗原バリエーションに基づいて定義されている
が、公表されている肺炎クラミジアＭＯＭＰ遺伝子配列はこの微生物のいくつか
の異なる単離物の間ではダリエーションを示していない(Campbell et al (1990)
Infection and Immunity 58:93; McCafferty et al (1995) Infection and Imm
unity 63:2387-9; Gaydos et al. Infection and Immunity. (1992) 60(12):531
9-5323)。７６ｋＤａの抗原をコードする遺伝子は肺炎クラミジアのただ単一株
からクローニングされたものであり、その配列は公開されている(Perez Melgosa
et al., Infect. Immun. 1994. 62:880)。９ｋＤａおよび６０ｋＤａのシステ
イン(cyteine)豊富な外膜タンパク質遺伝子を含むオペロンが記載されている(Wa
tson et al., Nucleic Acids Res (1990) 18:5299; Watson et al., Microbiolo
gy (1995) 141:2489)。肺炎クラミジアに対する免疫血清によって認識される多
くの抗原は総てのクラミジア間で保存されているが、９８ｋＤＡ、７６ｋＤａお
よび他のいくつかのタンパク質は肺炎クラミジア特異的である可能性がある(Per
ez Melgosa et al., Infect. Immun. 1994. 62:880; Melgosa et al., FEMS Mic
robiol Lett (1993) 112:119; Campbell et al., J Clin Microbiol (1994) 32:
583)。肺炎クラミジア血清型の数および相対頻度の評価、ならびに抗原の定義は
まだ可能ではない。肺炎クラミジアＣＷＬ−０２９株の全ゲノム配列はすでに知
られており(http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)、さらなる配列が入手
できるので、抗原バリエーションのよりよい理解が得られる。
【００１７】 肺炎クラミジアに対して血清を免疫化することによって認識される多くの抗原
は総てのクラミジアにわたって保存されているが、９８ｋＤａ、７６ｋＤａおよ
び５４ｋＤａタンパク質は肺炎クラミジア特異的であると思われる(Campos et a
l. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477; Ma
rrie (1993) Clinical Infectious Diseases, 18:501; Wiedmann-Al-Ahmad M, e
t al. Reactions of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antib
odies with an isolated, species-specific 54-kilodalton protein od Chlamy
dia pneumoniae, Clin Diagn Lab Immunil. 1997 Nov; 4(6): 700-704)。患者由
来の血清による単離物の免疫ブロッティングは、単離物間でブロッティングパタ
ーンにバリエーションがあることを示し、血清型肺炎クラミジアが存在し得るこ
と示している(Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1
231; Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medecine 125:979)。しかし
ながらこの結果は、患者の血清の免疫ブロットプロフィールが感染後経時的に変
化するので、患者の感染状態によって混乱しているかもしれない。血清型の数お
よび相対頻度の評価、ならびに抗原の定義は依然として可能ではない。
【００１８】 従って、クラミジア感染を予防および治療するのに用いられる治療する肺炎ク
ラミジアのポリヌクレオチド配列を同定および単離する必要性がある。
【００１９】
【発明の概要】
本発明は、クラミジア感染を予防、治療または診断する方法に使用できる、ク
ラミジアポリペプチドＯＭＰ（外膜タンパク質）(配列番号１)をコードする精製
および単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の一つの形態では、
ポリヌクレオチド分子は配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００２０】 本発明のもう一つの形態は単離されたＤＮＡ分子に対応するポリペプチドを提
供する。対応するコードペプチドのアミノ酸配列は配列番号２で示されている。
【００２１】 当業者ならば、クラミジアＯＭＰ（外膜タンパク質）タンパク質をコードする
ポリヌクレオチド配列を提供する限り、本発明はまたかかるポリペプチドに由来
する断片をコードするポリヌクレオチドを提供することが分かるであろう。さら
に、本発明は、本明細書に記載の非必須アミノ酸の付加、欠失または置換によっ
て生じるかかるペプチドおよびそれらに由来する断片の変異体および誘導体、な
らびにを提供するものと理解される。当業者ならば、本発明はクラミジアポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供される限り、さらにかかるポリ
ペプチドと特異的に結合する単一特異性抗体を提供することが容易に分かるであ
ろう。
【００２２】 本発明は広い応用を有し、発現カセット、ベクターおよび本発明のポリヌクレ
オチドで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む。従って、本発明は
さらに（ｉ）組換え宿主系において本発明のポリペプチドを製造する方法、なら
びに関連の発現カセット、ベクター、および形質転換またはトランスフェクト細
胞；（ii）希釈剤または担体と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチドを含有
するワクチン、またはポックスウイルス、ネズミチフス菌(Salmonella typhimur ium )またはコレラ菌(Viblerae cholerae)ベクターなどの生ワクチン（かかるワ
クチンおよびワクチンベクターは、例えばクラミジア感染を予防および治療する
のに有用である）、ならびに関連の医薬組成物および関連の治療および／または
予防方法；（iii）裸の形態もしくは送達ビヒクルと配合した本発明のＲＮＡま
たはＤＮＡ分子、本発明のポリペプチドもしくはポリペプチドの組合せ、または
単一特異性抗体、ならびに関連の医薬組成物の治療的および／または予防的使用
；（iv）ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、単一特異性抗体、または本発明のポリペプチ
ドの使用を含み得る、生物学的サンプルにおけるクラミジアの存在の診断方法；
および（ｖ）抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポ
リペプチドの精製方法を提供する。
【００２３】
【発明の具体的説明】
肺炎クラミジアゲノムからクラミジアＯＭＰ（外膜タンパク質）をコードする
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定されている。このタンパク質を
コードする遺伝子は発現プラスミドに挿入されているが、これはクラミジア感染
に対する免疫防御を与えることが分かっている。従ってこのＯＭＰ（外膜タンパ
ク質）および関連のポリペプチドを用いてクラミジア感染を予防および治療する
ことができる。
【００２４】 本発明の第一の態様によれば、クラミジアポリペプチドをコードする単離ポリ
ヌクレオチドが提供され、そのアミノ酸配列は配列番号２に示されている。
【００２５】 「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然に存在する環境から取り出された
ポリヌクレオチドと定義される。例えば生細菌のゲノム中、または遺伝子バンク
の一部として存在する天然ＤＮＡ分子は単離されないが、細菌ゲノムの残存部分
から同分子は分離される、例えばクローニング（増幅）の結果として単離される
。典型的には単離されたＤＮＡ分子は天然に存在するゲノムの５’または３’末
端にすぐ隣接するＤＮＡ領域（例えばコドン領域）から遊離している。かかる単
離ポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の一部であってよいが、かかるベク
ターまたは組成物がかかるポリヌクレオチドの自然環境の一部ではないというこ
とから「単離された」と定義される。
【００２６】 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡま
たは合成ＤＮＡ）のいずれか、またはその改変体、変異体、相同体もしくは断片
である。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれかであり、一本鎖であれば、コー
ド鎖または非コード（アンチセンス）鎖のいずれかである。配列番号１で示され
る本発明のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つが、(a)コード配列、(
b)(a)の転写により誘導されるリボヌクレオチド配列、または(c)遺伝子コードの
重複または縮重により同じポリペプチドをコードするコード配列である。「ポリ
ペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシ
ル化またはリン酸化）にかかわらず、いずれのアミノ酸鎖をも意味する。本願で
は両用語を相互に使用してもよい。
【００２７】 本発明の第一の態様によれば、配列番号２と相同なアミノ酸配列が提供される
。本明細書において使用される「相同アミノ酸配列」とは、臨界融解温度(Ｔｍ)
を超えない２５〜３５℃において、配列番号１の核酸配列のいずれの部分ともハ
イブリダイズする核酸配列によって総てまたは一部がコードされるいずれかのポ
リペプチドである。相同アミノ酸配列は配列番号２で示されるアミノ酸配列と１
つ以上の保存的アミノ酸置換に関して異なるものである。またかかる配列は血清
型変異体(下記)ならびに免疫原性などのポリペプチド本来の特徴を維持する、欠
失または挿入を含む配列も包含する。かかる配列は配列番号２と好ましくは少な
くとも７５％、さらに好ましくは８０％、および最も好ましくは９０％同一であ
る。
【００２８】 相同アミノ酸配列には配列番号２と同一または実質的に同一の配列が挙げられ
る。「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも９０
％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９７％、および最も好ましくは９９％
同一であり、かつ好ましくは参照配列と大部分の保存的アミノ酸置換に関して異
なる配列を意味する。
【００２９】 保存的アミノ酸置換は同種類のアミノ酸間の置換である。これらの種類には、
例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンのよう
な非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；リジン、アルギニン、およびヒスチジンの
ような塩基性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸、およびグルタミン酸のよ
うな酸性側鎖を有するアミノ酸；およびグリシン、アラニン、バリン、ロイシン
、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、
およびシステインのような非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。
【００３０】 相同性は、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnolo
gy Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705のSequence Analysis
Software Packageのような配列解析ソフトウェアを用いて求められる。アミノ酸
配列を同一性が最大となるように配列する。配列に人為的にギャップを挿入し適
当な配列を得てもよい。ひと度最適なアライメントが設定されれば、全位置数に
対し、両配列のアミノ酸が一致する位置を総て記録することにより相同性の程度
が確認される。
【００３１】 同様に相同ポリヌクレオチド配列も定義される。相同配列はコード配列配列番
号１と好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは６０％、および最も好ま
しくは８５％同一のものである。
【００３２】 本発明の第一の態様によれば、配列番号２と相同な配列を有するポリペプチド
には、天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに配列番号２のポリペプチド本
来の特徴を維持する変異体または天然には存在しないいずれの他の変異体も包含
される。
【００３３】 当技術分野では公知であるように、対立遺伝子変異体はポリペプチドの生物学
的機能を変更しない、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有すること
を特徴とするポリペプチドのもう一つの形態である。「生物学的機能」とは、た
とえその機能が細胞の増殖または生存に必要でなくとも、それが天然に存在する
細胞におけるポリペプチドの機能を意味する。例えばポーリンの生物学的機能は
細胞外媒質に存在する化合物を細胞へ侵入させることである。生物学的機能は抗
原性特性とは性質が異なる。ポリペプチドは１以上の生物学的機能を有し得る。
【００３４】 対立遺伝子変異体は本来極めて一般的なものである。例えば肺炎クラミジアな
どの細菌種は通常対立遺伝子の小さな変化に関し互いに異なる種々の株で表され
る。実際、異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドはそれぞれ
の株で同一でないアミノ酸配列（およびポリヌクレオチド配列）を有していても
よい。この変動にかかわらず、一般に多くの対立遺伝子変異体に対して向けられ
た免疫応答が実証されている。クラミジアＭＯＭＰ抗原の研究では、株間のＭＯ
ＭＰのアミノ酸配列の変化にかかわらず、雑種株抗体結合が起こるとともに感染
力の中和がなされ、免疫原として用いた際に、ＭＯＭＰがアミノ酸変化を許容す
ることが示される。
【００３５】 相同ポリペプチドまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドは、
常法により抽出されたゲノム細菌ＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅法
によって回収される。これにはコードドメインの５’および３’末端の上流およ
び下流に適合する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用が含まれる。好適な
プライマーは配列番号１で提供されるヌクレオチド配列情報により設計される。
その工程は次の通りである：１０〜４０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオ
チドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確実に
するのに十分な比率でＣおよびＧを含有する、すなわちＣおよびＧヌクレオチド
量が全ヌクレオチド含量の少なくとも４０％、好ましくは５０％である、プライ
マーを選択することが有利である。標準的なＰＣＲ反応は典型的には１００μＬ
につき０．５〜５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、各２０〜２００μＭのデオ
キシヌクレオチド（好ましくは同濃度）、全デオキシヌクレオチド濃度にわたっ
て０．５〜２．５ｍＭ、１０５〜１０６の標的分子、および約２０Ｐｍｏｌの各
プライマーを含む。ＰＣＲサイクル約２５〜５０回を行い、アニーリング温度を
プライマーの真のＴｍより１５〜５℃低い温度とする。よりストリンジェントな
アニーリング温度にすると誤ってアニーリングしたプライマーの識別が向上し、
プライマーの３’末端への誤ったヌクレオチドの組み込みが少なくなる。変性温
度は９５℃〜９７℃が典型であるが、Ｇ＋Ｃ豊富な標的の変性についてはより高
い温度が適当であろう。実施するサイクル数は最初の標的分子の濃度にもよるが
、典型的には特異的でないバックグラウンド産物が集積する傾向にあるので、４
０サイクルを超えない方がよい。
【００３６】 相同ポリペプチドまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを回
収する別法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーのハイブリダイゼーショ
ンスクリーニングによるものがある。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野
では十分に知られており、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons INc., 1994), Silhavy et al. (
Silhavy et al. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring harbor Laborat
ory Press, 1994)、およびDavis et al. (Davis et al. A Manual for Genetic
Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring harbor Laboratory
Press, 1980)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を至適化する重要
なパラメーターは、その温度を超えると２本の相補ＤＮＡ鎖が互いに分離する臨
界融解温度を得るのに用いる式で表される(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res.
(1977) 4:1539)。約６００個以上のヌクレオチドでなるポリヌクレオチドの場
合、この式は次の通りである： Ｔｍ＝81.5＋0.41x(%G+C)＋16.6log(陽イオン濃度)−0.63x(%ホルムアミト゛)−600／塩 基数。
【００３７】 好適なストリンジェント条件下では、ハイブリダイゼーション温度(Ｔｈ)は約
２０〜４０℃、２０〜２５℃、または好ましくは計算値Ｔｍを超えない３０〜４
０℃である。最適温度および塩条件が容易に求め得ることは当業者には明らかで
あろう。
【００３８】 本発明のポリヌクレオチドに関しては（ｉ）４２℃で４〜１６時間以内、６×
５０％ホルムアミド含有ＳＳＣにおける、または（ii）６５℃で４〜１６時間以
内、６×ＳＳＣ水溶液（１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム(pH7.0)）
における、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズインキュベーショ
ン双方の間にストリンジェント条件に達する。
【００３９】 典型的には、ハイブリダイゼーション実験は６０〜６８℃、例えば６５℃で行
われる。このような温度では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
は６×ＳＳＣ、好ましくは２×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣ、より好ましくは０．５
×ＳＳＣ、０．３×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣ（ホルムアミドの不在下）行う
ことができる。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウムを含む。
【００４０】 天然には存在しない有用な相同体およびその断片は、アミノ酸配列変化および
／または欠失を許容すると思われる抗原の領域を同定する公知の方法を用いて設
計される。例として、異なる種由来の相同ポリペプチドを比較し、保存された配
列を同定することを挙げる。さらに分岐した配列が最も配列変化を許容すると考
えられる。配列間の相同性は例えばAltschul et al., Nucleic Acids Res,;25:3
389-3402 (1997)のＢＬＡＳＴ相同性検索アルゴリズムを用いて解析すればよい
。あるいは、コンピューターによって支援される可能性のあるＴまたはＢ細胞エ
ピトープの解析に基づいて配列がＴおよび／またはＢ細胞とより高い反応性を有
するように改変する。さらにもう１つの別法では、in vitroにおいてポリペプチ
ド内のある特定のアミノ酸残基または配列を変異させ、次いでのその変異ポリペ
プチドを、以下に概略を記した方法によりクラミジア感染症を予防または治療す
る能力についてスクリーニングする。
【００４１】 当業者ならば、本発明のスクリーニングプロセスに従うことによって配列番号
２のある特定の相同体がクラミジア感染症の予防または治療に有用であるかを過
度な実験を行うことなく求められることが容易に理解されるであろう。
【００４２】 スクリーニング手順は、 動物、好ましくはマウスを試験相同体または断片により免疫化し、 免疫化した動物にクラミジアを接種し、さらに クラミジアに対する感染防御を付与するそれらの相同体または断片を選択する
工程を含んでなる。
【００４３】 「感染防御を付与する」とは、試験相同体または断片で免疫化していない対照
動物と比べた場合に、クラミジア感染症のいずれかの影響の重篤度の軽減される
ことを意味する。
【００４４】 本発明の第一の態様によれば、配列番号２の部分配列、配列番号２と相同なポ
リペプチド配列の部分配列、内部欠失により全長ポリペプチドから誘導されたポ
リペプチド、および融合タンパク質であるポリペプチド誘導体が提供される。
【００４５】 タンパク質に対する免疫応答を誘導するのに必要とされるものは総てタンパク
質の小さな（例えば８〜１０個のアミノ酸）免疫原性領域であるため、ワクチン
としてタンパク質免疫原の断片および変異体を使用することは免疫学の分野では
一般に認られた慣例である。クラミジア以外の病原体の表面に曝された抗原に対
応する種々の短い合成ペプチドがそれぞれの病原体、例えばネズミ乳癌ウイルス
の１１残基ペプチド(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4:1539)、セ
ムリキ森林ウイルスの１６残基ペプチド(Snijders et al., 1991. J.Gen.Virol.
72:557-565)、およびイヌパルボウイルス由来の１５残基各々の２つの重複ペプ
チド(Langeveld et al., Vaccine 12(15):1473-1480,1994)に対する有効なワク
チン抗原であることが分かっている。
【００４６】 従って本記載により、配列番号２の部分配列またはその相同アミノ酸配列が全
長配列固有のものであり、本発明により教示されることは当業者には容易に理解
されるであろう。かかるポリペプチド断片の長さは少なくとも１２個のアミノ酸
であることが好ましい。それらの長さが少なくとも２０個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも５０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも７５個のアミノ酸
、およびさらに好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸であることが有利であ
る。
【００４７】 配列番号２と相同な配列の部分配列をコードする３０〜６００個のヌクレオチ
ドからなるポリヌクレオチドは、以下に概略を記したパラメーターを用い、かつ
増幅される断片の５’および３’末端の上流および下流の配列に適合するプライ
マーを使用するＰＣＲ増幅法により回収される。かかる増幅物の鋳型ポリヌクレ
オチドは配列番号１と相同な全長ポリヌクレオチド、またはＤＮＡまたはＲＮＡ
ライブラリーなどのポリヌクレオチド混合物に含まれるポリヌクレオチドのいず
れかである。部分配列を回収する別法としては、上記の条件下においてＴｍの計
算式を用いてスクリーニングハイブリダイゼーションを行う。３０〜６００個の
ヌクレオチドからなる断片を回収する場合、計算値Ｔｍを減法（６００／塩基対
のポリヌクレオチドサイズ）により補正し、ストリンジェント条件をＴｍを超え
ない５〜１０℃であるハイブリダイゼーション温度で定義する。２０〜３０塩基
より短いオリゴヌクレオチドを得る場合、Ｔｍの計算式は次の通りである：Ｔｍ
＝４ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。例えば、５０％Ｃ＋Ｇの１８個のヌクレオチ
ド断片は約５４℃のＴｍを有するであろう。配列番号２の断片またはその相同配
列である短いペプチドは化学合成(E. Gross and H. J. Meinhofer, 4 The Pepti
des: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesi
s, John Wiley & Sons (1981)、およびM. Bodanzki, Principles of Peptide Sy
nthesis, Springer-Verlag (1984))により直接得られる。
【００４８】 有用なポリペプチド誘導体、例えばポリペプチド断片をアミノ酸配列のコンピ
ューター支援解析を用いて設計する。これにより表面に曝された有望な抗原性領
域が同定されよう(Hughs et al., 1992. Infect. Immun. 60(9):3497)。プログ
ラムＳＥＱＳＥＥ(Wishart DS, et al., “SEQSEE：タンパク質配列解析に適し
た総合プログラム” Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10 (2): 121-32)を使用す
る、産物の順応性および疎水性に基づく配列番号２にある６個のアミノ酸配列の
解析では、有用な免疫原性断片および変異体を選択する基準として使用してもよ
い、可能性あるＢおよびＴ細胞エピトープが明らかとなり得る。この解析では抗
体により認識されると考えられる外面特徴の適当な組合せを使用する。ＨＬＡ−
Ａ０２０１ ＭＨＣサブクラスの有望なＴ細胞エピトープがＮＩＨで開発された
アプローチとエミュレートする、アルゴリズムにより明らかにすることができる
(Parker KC, et al. "Peptide binding to MHC class I molecules: implicatio
ns for antigenic peptide prediction." Immunol Res 1995; 14 (1) 34-57)。
【００４９】 感染防御Ｔ細胞依存性免疫応答を誘導するエピトープは、ポリペプチドの長さ
の範囲全体に存在する。しかしながら、いくつかのエピトープはポリペプチドの
２次および３次構造によりマスクされる。かかるマスクされたエピトープを明ら
かにするため、大きな内部欠失を引き起こし、それによってもとのタンパク質構
造の大部分を取り除いてマスクされたエピトープを露出させる。かかる内部欠失
は時に株間の高変異性の免疫優性領域を取り去るという付加的な利点をもたらす
。
【００５０】 ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドおよび大きな内部欠失を有す
るおよびポリペプチドを常法により構築する(Ausubel et al., Current Protoco
lsin Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)。かかる方法には標準
ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、クローニングしたＤＮＡ分子の制限酵素処理、またはKunkel
et al.(Kunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448)の方法が挙
げられる。これらの方法の成分およびその使用説明書はStratageneなどの様々な
販売元から容易に入手可能である。ひと度欠失変異体を構築すれば、それらを上
記のようにクラミジア感染症を予防または治療する能力について調べる。
【００５１】 本明細書において使用される「融合ポリペプチド」は、他のいずれかのポリペ
プチドとＮまたはＣ末端で融合した本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘
導体を含有するものである（以後ペプチドテールと記す）。かかる融合ペプチド
を得る簡便な方法はポリヌクレオチド配列のインフレーム融合物、すなわちハイ
ブリッド遺伝子の翻訳による。融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝
子を発現ベクターに挿入し、それを用いて宿主細胞を形質転換またはでトランス
フェクトする。そうでなければ、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体をコー
ドするポリヌクレオチド配列を、ペプチドテールをコードするポリヌクレオチド
が既に存在する発現ベクターに挿入する。かかるベクターおよびその使用説明書
は商業的に入手可能である、例えばペプチドテールがマルトース結合タンパク質
である、New England BiolabsのｐＭａｌ−ｃ２またはｐＭａｌ−ｐ２系、Pharm
aciaのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ系、またはNovagenから入手可能
なＨｉｓ−Ｔａｇ系。これらおよび他の発現系により本発明のポリペプチドおよ
び誘導体のさらなる単離のための便宜な手段が提供される。
【００５２】 融合ポリペプチドの有利な例としては、本発明のポリペプチドまたは相同体も
しくは断片と、コレラ毒素または大腸菌(E. coli)易熱性毒素のいずれかのサブ
ユニットＢのようなアジュバント活性を有するポリペプチドとを融合したもので
ある。もう一つの有利な融合物はポリペプチド、相同体または断片と、強力なＴ
細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープとを融合したものである。かかるエピト
ープは当技術分野で公知のもの（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原、D. R. Millich et
al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepati
tis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 329
: 547-549)、または、可能性のあるＴまたはＢ細胞のコンピュータ補助分析に基
づく本発明のもう一つのポリペプチドにおいて同定されたものであってよい。本
発明のこの態様に従い、融合ポリペプチドは配列番号２、またはその相同体もし
くは断片由来のＴまたはＢ細胞エピトープを含んでなる（ここで、エピトープは
そのポリペプチドまたは相同体もしくは断片の多様な変異体から誘導され、各々
のエピトープはそのエピトープのポリペプチド内の位置および配列において他と
は異なっている）。かかる融合物は全ポリペプチド、相同体または断片に対する
ＴまたはＢ細胞応答を最適にするため、それはクラミジア感染症の予防および治
療に有効である。
【００５３】 融合を達成するために、本発明のポリペプチドと、アジュバント活性を有する
ポリペプチドのＮ、または好ましくはＣ末端、またはＴもしくはＢ細胞エピトー
プとを融合する。そうでなければ、本発明のポリペプチド断片をアジュバント活
性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入する。またＴまたはＢ細胞エピ
トープを本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に挿入してもよい。
【００５４】 第一の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは異種シグナルペプチドを含
有する、本発明のポリペプチドへと成熟するハイブリッド前駆体ポリペプチドも
コードする。「異種シグナルペプチド」とは、本発明のポリペプチドの天然に存
在する前駆体には見られないシグナルペプチドを意味する。
【００５５】 ＲＮＡ、ＤＮＡ、または改変体もしくはその組合せを包含する本発明のポリヌ
クレオチド分子は多方面に適用される。ＤＮＡ分子は例えば（ｉ）組換え宿主系
においてコードされたポリペプチドを生産するプロセスにおいて、（ii）クラミ
ジア感染症を予防および／または治療する方法および組成物においてさらに用い
られる、ポックスウイルスなどのワクチンベクターの構築において、（iii）裸
の形態で、または送達ビヒクルと配合したワクチン薬剤として（ＲＮＡ分子と同
様）、および（iv）本発明のポリヌクレオチドを過剰発現できる、またはそれを
無毒性、変異型で発現する弱毒クラミジア株の構築において用いられる。
【００５６】 従って、本発明の第二の態様は、（ｉ）発現に必要なエレメントの制御下、特
に適当なプロモーターの制御下に置かれた本発明のＤＮＡ分子を含有する発現カ
セット；（ii）本発明の発現カセットを含有する発現ベクター；（iii）本発明
の発現カセットおよび／またはベクターで形質転換またはトランスフェクトした
原核生物または真核生物細胞、ならびに（iv）本発明のＤＮＡ分子の発現を可能
にする条件下において、本発明の発現カセットおよび／またはベクターで形質転
換またはトランスフェクトした原核生物または真核生物細胞を培養し、細胞培養
物からコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含
む、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはポリペプ
チド誘導体を生産する方法を含む。
【００５７】 組換え発現系は原核生物および真核生物宿主から選択される。真核生物宿主に
は、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)）、哺乳類細胞（例えばＣＯＳＩ
、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＪＥＧ３細胞）、節足動物細胞（例えばスポドプテラ・
フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)（ＳＦ９）細胞）、および植物細胞が挙
げられる。好ましい発現系としては大腸菌のような原核生物宿主がある。当業者
には細菌および真核生物細胞は商業的供給者をはじめいくつかの異なる供給者、
例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)から入
手可能である。組換えタンパク質発現に用いる細胞の商業的供給者は細胞の使用
説明書も提供する。
【００５８】 発現系の選択は発現されるポリペプチドに望まれる特徴によって異なる。例え
ば、特定の脂質化形態(lipidated form)または他のいずれかの形で本発明のポリ
ヌクレオチドを生産するのが有用であると考えられる。
【００５９】 総てのベクターおよび発現制御配列ならびに宿主が本発明のポリヌクレオチド
を等しく十分に発現するとは考えられないことは当業者には容易に理解されるで
あろう。しかしながら、下記の指針により、過度な実験を行うことなく、かつ本
発明の範囲を逸脱することなく、ベクター、発現制御配列および宿主が選択でき
よう。
【００６０】 ベクターを選択する場合、そこに存在し、かつ可能な限り複製し得るベクター
と適合する宿主を選択する必要がある。ベクターコピー数、コピー数を調節する
能力、抗生物質耐性などの他のタンパク質の発現が考慮される。発現制御配列を
選択する場合、いくつかの変数が考慮される。重要な変数には配列の相対強度（
例えば、種々の条件下において発現を駆動する能力）、配列の機能を調節する能
力、発現されるポリヌクレオチドと制御配列間の適合性（例えば二次構造は効率
的な転写を妨げるヘアピン構造を回避すると考えられる）がある。宿主を選択す
る場合、所望のコンホメーションで産物を発現でき、スケールアップが容易で、
さらにそれが最終産物の精製を容易にすることが望むならば、選択されたベクタ
ーと適合し、発現産物のいずれかの起こりうる有毒作用に耐性であり、発現産物
を効率的に分泌できる単細胞宿主を選択する。
【００６１】 発現カセットの選択は発現されるポリペプチドに望まれる特徴だけでなく選択
される宿主系にもよっても異なる。典型的には発現カセットは選択された宿主系
において機能し得るものであり、かつ構成的または誘導性であり得るプロモータ
ー；リボソーム結合部位；要すれば開始コドン（ＡＴＧ）；シグナルペプチド、
例えば脂質化(lipidation)シグナルペプチドをコードする領域；本発明のＤＮＡ
分子；停止コドン；および所望により３’末端領域（翻訳および／または転写タ
ーミネーター）を含む。シグナルペプチドコード領域は本発明のポリヌクレオチ
ドに隣接し、適当なリーディングフレームに存在する。シグナルペプチドコード
領域は成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と相同または異種であり、発現
に用いられる宿主の分泌機構と適合する。本発明のＤＮＡ分子により単独または
シグナルペプチドとともに構成されるリーディングフレームは転写および翻訳が
宿主系において起こるようにプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターお
よびシグナルペプチドコード領域は広く知られており、当業者ならば入手可能で
ある。例えばアラビノースにより誘導可能であり（プロモーターａｒａＢ）かつ
大腸菌などのグラム陰性菌において機能し得る、ネズミチフス菌(Salmonella ty phimurium )（および誘導体）のプロモーター（米国特許第5,028,530号およびCag
non et al., (Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7):843)に記載）
；Ｔ７ポリメラーゼを発現する数多くの大腸菌株において機能し得る、ＲＮＡポ
リメラーゼをコードするバクテリオファージＴ７遺伝子のプロモーター（米国特
許第4,952,496号に記載）；ＯｓｐＡ脂質化シグナルペプチド；およびＲｌｐＢ
脂質化シグナルペプチド(Takase et al., J. Bact. (1987) 169:5692)が挙げら
れる。
【００６２】 典型的には発現カセットは選択された発現系で複製する能力が選択される発現
ベクターの一部である。発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクタ
ー）は、例えばPouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985,
Supp. 1987)に記載されるものから選択することができる。好適な発現ベクター
は商業的供給者から購入することができる。
【００６３】 宿主細胞を発現ベクターで形質転換／トランスフェクトする方法は当技術分野
では十分に公知であり、Ausubel et al., (Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, John Wily & Sons Inc., 1994)に記載されるように選択
した宿主系によって異なる。
【００６４】 発現の際、本発明の組換えポリペプチド（またはポリペプチド誘導体）は生産
され細胞内コンパートメントに留まり、細胞外媒質または原形質膜空間に分泌／
放出されるか、または細胞膜に埋め込まれる。ポリペプチドは組換え細胞培養物
の遠心分離後の細胞抽出物からまたは上清から実質的に精製された形で回収され
る。典型的には組換えポリペプチドは抗体に基づくアフィニティー精製により、
またはポリペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドとアフィニ
ティー結合小ドメインとの融合などの当業者によって容易に適合できる十分に公
知な他の方法により精製する。本発明のポリペプチドを免疫アフィニティーによ
り精製するのに有用な抗体は下記のようにして得られる。
【００６５】 本発明のポリヌクレオチドはまたワクチンとしても有用である。遺伝子送達ビ
ヒクル（生ワクチンベクター）としてウイルスまたは細菌宿主を用いるか、また
は遺伝子を遊離型で、例えばプラスミドに挿入して投与するかの２つの主要な経
路がある。本発明のポリヌクレオチドの治療または予防効力は下記のようにして
評価される。
【００６６】 従って、本発明の第三の態様によれば、（ｉ）発現に必要なエレメントの制御
下に置かれた本発明のＤＮＡ分子を含有するポックスウイルスなどのワクチンベ
クター；（ii）本発明のワクチンベクターとともに希釈剤または担体を含んでな
る材料の組成物；とりわけ（iii）治療または予防上有効な量の本発明のワクチ
ンベクターを含有する医薬組成物；（iv）哺乳類に免疫原性上有効な量の本発明
のワクチンベクターを投与してクラミジアに対する感染防御または治療免疫応答
を誘導することを含む、哺乳類（例えばヒト）のクラミジアに対する免疫応答を
誘導する方法；またこの方法は動物（例えばネコまたは鳥）のクラミジア感染症
を治療または予防する獣医学的適用に用いることができる；さらに詳しくは（ｖ
）感染した個体に予防または治療量の本発明のワクチンベクターを投与すること
を含む、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス(C. trachomatis)、Ｃ．プシタ
チ(C. psittaci)、肺炎クラミジア、Ｃ．ペコラム(C. pecorum)）感染症を予防
および／または治療する方法が提供される。さらに本発明の第三の態様によれば
、クラミジア感染症を予防および／または治療する医薬の製造における本発明の
ワクチンベクターの使用が含まれる。
【００６７】 本明細書において、ワクチンベクターは本発明の１つまたはいくつかのポリペ
プチドまたは誘導体を発現する。ワクチンベクターはさらに免疫応答を増大する
（アジュバント効果）インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキ
ン−１２（ＩＬ−１２）などのサイトカインを発現すると考えられる。発現され
る各成分が哺乳類細胞における発現に必要なエレメントの制御下に置かれている
ことは明らかである。
【００６８】 本発明の第三の態様によれば、組成物はそれぞれが本発明のポリペプチドまた
は誘導体を発現し得るいくつかのワクチンベクターを含んでなる。組成物はまた
付加的なクラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もし
くは誘導体；または必要に応じてＩＬ−２もしくはＩＬ−１２などのサイトカイ
ンと共に、または該サイトカインをを発現し得るワクチンベクターを含んでなっ
てもよい。
【００６９】 哺乳類における感染症を治療または予防する予防接種方法は、いずれかの一般
的な経路により、特に粘膜（例えば目、鼻腔内、口腔、胃、肺、腸、直腸、膣、
または尿管）表面にまたは非経口（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または
腹膜内）経路により投与される本発明のワクチンベクターの使用を含んでなる。
好ましい経路はワクチンベクターの選択による。１回の投与で治療を果たしても
よいし、または間隔をおいて反復してもよい。好適な用量は当業者に理解されて
いる、ワクチンベクター自体、投与経路または予防接種する哺乳類の条件（重量
、年齢など）といった種々のパラメーターによって異なる。
【００７０】 当技術分野で入手可能な生ワクチンベクターには、アデノウイルスおよびポッ
クスウイルスなどのウイルスベクター、ならびに細菌ベクター（例えば赤痢菌属
(Shigella)、サルモネラ菌(Salmonella)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、乳酸桿
菌(Lactobacillus)、カルメットーゲラン菌(Bacille bilie de Calmette-Guerin
)（ＢＣＧ）、および連鎖球菌(Streptococcus)）が挙げられる。
【００７１】 アデノウイルスベクター例、ならびに本発明のＤＮＡ分子を発現し得るアデノ
ウイルスベクターの構築方法が米国特許第4,920,209号に記載されている。ポッ
クスウイルスベクターにはワクシニアおよびカナリヤポックスウイルスがあり、
それぞれ米国特許第4,722,848号および米国特許第5,364,773号に記載されている
。例えばワクシニアウイルスベクターの記載はTartaglia et al., Virology (19
92) 188:217、カナリヤポックスの参照文献はTaylor etal. Vaccine (1995) 13:
539も参照。哺乳類細胞における発現に好適な条件下で本発明のポリヌクレオチ
ドをウイルスゲノムに挿入するために、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る
ポックスウイルスベクターをKieny et al., Nature (1984) 312:163に記載され
る相同組換えにより得る。一般に治療または予防に使用するワクチンウイルスベ
クターの用量はキログラム当たりのプラーク形成単位が、約１×１０４〜約１×
１０１１、有利には約１×１０７〜約１×１０１０、好ましくは約１×１０７〜
約１×１０９であってよい。好ましくは、ウイルスベクターを、例えば４週間お
きに３回で、非経口投与する。本発明のウイルスベクターを含有する組成物に化
学アジュバントを加えることを避け、それによってウイルスベクター自身に対す
る免疫応答を最小にすることが好ましい。
【００７２】 経口生ワクチンとして有用な無毒性コレラ菌変異株が知られている。Mekalano
s et al., Nature (1983) 306:551および米国特許第4,882,278号では、機能し得
るコレラ毒素が生産されないように欠失させた、２つのｃｔｘＡ対立遺伝子それ
ぞれの実在する量のコード配列を有する株が記載されている。WO92/11354では、
変異（この変異を単一株においてｃｔｘＡ変異と組み合わせてもよい）によりｉ
ｒｇＡ遺伝子座を不活性化した株が記載されている。WO94/01533では、機能し得
るｃｔｘＡおよびａｔｔＲＳ１ ＤＮＡ配列を欠いた欠失変異体が記載されてい
る。WO94/19482に記載されるように、これらの変異株を遺伝子操作して非対応抗
原を発現させる。本発明のＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドまたはポ
リペプチド誘導体を発現し得るコレラ菌株の有効なワクチン用量は、選択された
投与経路に適した用量中の生存細菌数、約１×１０５〜約１×１０９、好ましく
は約１×１０６〜約１×１０８を含有する。好ましい投与経路としてはあらゆる
粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれらのベクターは鼻腔内または経口投与
される。
【００７３】 非対応抗原の組換え発現用に遺伝子操作した、またはしない弱毒ネズミチフス
菌株、および経口ワクチンとしてのそれらの使用は、Nakayama et al. (Bio/Tec
hnology (1988) 6:693)およびWO92/11361に記載されている。好ましい投与経路
としてはあらゆる粘膜経路が挙げられ、最も好ましくはこれらのベクターは鼻腔
内または経口投与される。
【００７４】 本発明においてワクチンベクターとして用いられる他の細菌株は、High et al
., EMBO (1992) 11:1991およびSizemore et al., Science (1995) 270:299（フ
レクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)）; Medaglini et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA (1995) 92:6868（ストレプトコッカス・ゴルドニー(Streptococcus gordonii )）、Flynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31（Bac
ille Calmette Guerin）、WO88/06626、WO90/00594、WO91/13157、WO92/01796、
およびWO92/21376（カルメットーゲラン菌）に記載されている。
【００７５】 細菌ベクターでは本発明のポリヌクレオチドを細菌ゲノムに挿入するか、また
は遊離状態でプラスミドの一部として残す。
【００７６】 本発明のワクチン細菌ベクターを含んでなる組成物はアジュバントをさらに含
有してもよい。いくつかのアジュバントが当業者に公知である。好ましいアジュ
バントは以下に挙げるように選択される。
【００７７】 従って、本発明の第四の態様によれば、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドとと
もに希釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；（ii）治療または予防上有効
な量の本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬組成物；（iii）免疫原性上有
効な量の本発明のポリヌクレオチドを投与してクラミジアに対する感染防御免疫
応答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法
；さらに詳しくは（iv）感染した個体に予防または治療量の本発明のポリヌクレ
オチドを投与することにより、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プ
シタチ、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコラム）感染症を予防および／または治
療する方法が提供される。さらに本発明の第四の態様によれば、クラミジア感染
症を予防および／または治療する医薬の製造における本発明のポリヌクレオチド
の使用が含まれる。好ましい使用には哺乳類細胞における、特に哺乳類細胞にお
いて複製できず、かつ哺乳類ゲノムに実質的に組み込むことのできないプラスミ
ドにおける発現の条件下に置かれたＤＮＡ分子の使用が挙げられる。
【００７８】 本発明のポリヌクレオチドの使用には、治療または予防目的での哺乳類へのワ
クチンとしての投与が挙げられる。かかるポリヌクレオチドは哺乳類細胞におい
て複製できず、かつ哺乳類ゲノムに組み込むことのできないプラスミドの一部と
してＤＮＡの形で用いられる。典型的には、かかるＤＮＡ分子は哺乳類細胞の発
現に好適なプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは遍在して、または
組織特異的のいずれかで機能する。非組織特異的プロモーターの例としては、初
期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第4,168,062号に記
載される）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（Norton & Coffin, Molec.
Cell Biol. (1985) 5:281に記載される）が挙げられる。組織特異的プロモータ
ーの例としては、筋肉細胞における発現を駆動するデスミンプロモーター（Li e
t al., Gene (1989) 78:243、Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:6562お
よびLi & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403に記載される）である。プ
ロモーターの使用については当業者は十分に公知である。有用なベクターは多く
の公報、特にWO94/21797およびMartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7
: 1205で記載されている。
【００７９】 ワクチンとして用いられる本発明のポリヌクレオチドは対応するポリペプチド
の前駆体または成熟型のいずれかをコードする。前駆体型ではシグナルペプチド
は相同または異種のいずれかである。後者の場合、組織型プラスミノゲン因子（
ｔＰＡ）のリーダー配列などの真核生物リーダー配列が好ましい。
【００８０】 本明細書において、本発明の組成物は１つまたはいくつかのポリヌクレオチド
とともに所望によりウレアーゼサブユニットＡ、Ｂもしくはその両方などの別の
クラミジア抗原、またはその断片、誘導体、変異体もしくは類似体をコードする
少なくとも一つの付加的なポリヌクレオチドを含有する。また組成物は免疫応答
を増強するためにインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−
１２（ＩＬ−１２）などのサイトカインをコードする付加的なポリヌクレオチド
を含有してもよい。これらの付加的なポリヌクレオチドは発現に好適な制御下に
置かれている。同じ組成物に含まれる本発明のＤＮＡ分子および／または付加的
なＤＮＡ分子は同じプラスミドに存在することが有利である。
【００８１】 本発明のポリヌクレオチド治療薬の製造に分子生物学におけるポリヌクレオチ
ドの調製および精製標準手法を用いる。ワクチンとして用いるための本発明のポ
リヌクレオチドは以下に概略を記した種々の方法により処方される。
【００８２】 一つの方法ではポリヌクレオチドはいずれの送達ビヒクルも用いない裸の形態
で使用される。かかるポリヌクレオチドは単に滅菌生理食塩水または滅菌緩衝溶
液などの生理学上許容される溶液に、担体を用いてまたは用いずに希釈する。担
体が存在する場合には、担体が等張性、低張性、または弱高張性であることが好
ましく、スクロース溶液、例えば２０％スクロース含有溶液により得られるよう
な比較的低いイオン強度を有する。
【００８３】 別法では細胞の取り込みを助ける薬剤と結合したポリヌクレオチドを使用する
。かかる薬剤の例は（ｉ）ブピバカインなどの細胞透過性を改変する化学物質（
例えばWO94/16737参照）、（ii）ポリヌクレオチドをカプセル封入するリポソー
ム、または（iii）それ自身がポリヌクレオチドと結合する陽イオン脂質または
シリカ、金、もしくはタングステン微粒子である。
【００８４】 陰イオンおよび中性リポソームは当技術分野では十分に公知であり（例えばリ
ポソーム作製方法の詳細な説明に関する、Liposomes: A Practical Approach, R
pc New Ed, IRL press (1990)参照）、ポリヌクレオチドをはじめとする広範囲
の産物を送達するのに有用である。
【００８５】 陽イオン脂質もまた当技術分野では公知であり、遺伝子送達には常用されてい
る。かかる脂質には、ＤＯＴＭＡ(Ｎ−[１−(２，３−ジオレイルオキシ）プロ
ピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるリポ
フェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰ(１，２−ビス（オレイルオキシ)−３−(トリ
メチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウ
ムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）および
ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−(Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノメタン)−カルバモイ
ル）コレステロール）などのコレステロール誘導体が挙げられる。これらの陽イ
オン脂質の記載はEP187,702、WO90/11092、米国特許第5,283,185号、WO91/15501
、WO95/26356、および米国特許第5,527,928号に見出すことができる。遺伝子送
達用の陽イオン脂質は、例えばWO90/11092に記載されるようにＤＯＰＥ（ジオレ
イルホスファチジルエタノールアミン）のような中性脂質と結合させて用いるこ
とが好ましい。
【００８６】 陽イオンリポソームを含有する製剤は所望により他のトランスフェクション促
進化合物を含有してもよい。それらの多くはWO93/18759、WO93/19768、WO94/256
08、およびWO95/2397に記載されている。それらには核膜を通るＤＮＡの輸送を
促進するのに有用なスペルミン誘導体（例えばWO93/18759参照）およびＧＡＬＡ
、グラミシジンＳ、ならびに陽イオン胆汁酸塩などの膜透過性化合物（例えばWO
93/19768参照）が挙げられる。
【００８７】 金またはタングステン微粒子はWO91/00359、WO93/17706、およびTang et al.
(Nature (1992) 356:152)に記載されるように遺伝子送達に用いられる。米国特
許第4,945,050号、米国特許第5,015,580号、およびWO94/24263に記載されるもの
のように、微粒子で被覆したポリヌクレオチドを無針注入装置（「遺伝子銃」）
を用いて皮内または表皮内経路で注入する。
【００８８】 ワクチン受容者に用いるＤＮＡ量は、例えばＤＮＡ構築に用いるプロモーター
の強さ、発現遺伝子産物の免疫原性、投与をしようとする哺乳類の条件（例えば
哺乳類の体重、齢、および全身の健康状態）、投与様式、および剤型による。一
般に、治療または予防上有効な量、約１μｇ〜約１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ
〜約８００μｇ、およびさらに好ましくは約２５μｇ〜約２５０μｇをヒト成人
に投与してもよい。１回の投与で投与を果たしてもよいし、または間隔をおいて
反復してもよい。
【００８９】 投与経路はワクチン分野で用いるいずれの便宜な経路であってもよい。一般的
な指針として、本発明のポリヌクレオチドは粘膜表面、例えば目、鼻腔内、肺、
口腔、腸、直腸、膣、および尿管表面により；または非経口経路、例えば静脈内
、皮下、腹膜内、皮内、表皮内、または筋肉内経路により投与する。投与経路の
選択は選択される製剤による。ブピバカインと結合させて処方したポリヌクレオ
チドは筋肉投与が有利である。中性もしくは陰イオンリポソームまたはＤＯＴＭ
ＡまたはＤＣ−Ｃｈｏｌなどの陽イオン脂質を用いる場合、製剤は静脈内、鼻腔
内（エアゾル化）、筋肉内、皮内、および皮下経路により注入することが有利で
あろう。裸の形態のポリヌクレオチドは筋肉内、皮内、または皮下経路により投
与することが有利であろう。
【００９０】 必ずしも必要ではないが、かかる組成物はアジュバントを含有していてもよい
。もしそうであれば、アジュバント作用を示すために同時投与する必要のない浸
透性アジュバント、例えば米国特許第5,057,546号に記載されるＱＳ２１などが
好ましい。
【００９１】 本願で提供される配列情報により診断目的で用いる特異的なヌクレオチドプロ
ーブおよびプライマーの設計が可能になる。従って、本発明の第五の態様によれ
ば、配列番号１に示される配列の遺伝子コードの縮重で見られる、または縮重に
より誘導された配列を有するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供され
る。
【００９２】 本願において使用される「プローブ」とは、上記のように、ストリンジェント
条件下で、配列番号１を有する核酸分子と、または配列番号１と相同な配列と、
またはその相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズするＤＮＡ（好まし
くは一本鎖）またはＲＮＡ分子（または改変体もしくはその組合せ）をいう。一
般に、プローブは全長配列よりかなり短い。かかるプローブは約５〜約１００個
、好ましくは約１０〜約８０個のヌクレオチドを含有する。特にプローブは配列
番号１の一部と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好まし
くは９５％相同である、またはかかる配列と相補的である配列を有する。プロー
ブはイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルア
ミノ−５−デオキシウリジン、またはジアミノ−２，６−プリンなどの改変塩基
を含有してもよい。糖またはリン酸残基も改変または置換してもよい。例えばデ
オキシリボース残基をポリアミドで置き換えてもよく(Nielsen et al., Science
(1991) 254:1497)、リン酸残基をジホスフェート、アルキル、アリールホスホネ
ートおよびホスホロチオエートエステルなどのエステル基で置き換えてもよい。
さらにリボヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基をアルキル基のような官能基など
で改変してもよい。
【００９３】 本発明のプローブは捕捉または検出プローブとして診断試験に用いられる。便
宜にはかかる捕捉プローブは共有結合手段によりまたは受動的吸着により固相支
持体に直接的または間接的に固定する。検出プローブは放射性同位元素、ペルオ
キシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ならびに発色性、蛍光性、または発光
性基質を加水分解し得る酵素、発色性、蛍光性、または発光性化合物、ヌクレオ
チド塩基類似体、およびビオチンから選択される検出マーカーで標識する。
【００９４】 本発明のプローブをドットブロット法(Maniatis et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sp
ring Habor, New York)、サザンブロット法(Southern, J. Mol. Biol. (1975) 9
8:503)、ノーザンブロット法（ＲＮＡを標的として用いることを除いて、サザン
ブロットと同じ）、またはサンドイッチ手法(Dunn et al., Cell (1977) 12:23)
などのいずれの通常のハイブリダイゼーション手法にも用いてよい。後の手法で
は互いに少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有する特異的な捕捉プロ
ーブおよび／または特異的な検出プローブの使用が含まれる。
【００９５】 プライマーは増幅プロセス（例えばＰＣＲ）、伸長プロセス、または逆転写法
における酵素的ＤＮＡ重合を開始するのに用いる、通常約１０〜約４０個のヌク
レオチドのプローブである。ＰＣＲをはじめとする診断法に用いるプライマーを
当技術分野で公知な方法で標識する。
【００９６】 本明細書において記載されるように、本発明はまた（ｉ）生物学的材料におい
てクラミジアの存在を検出および／または同定する本発明のプローブを含んでな
る試薬；（ii）(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)該材料
からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出して変性させ、さらに(c)ストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーションが検出されるように本発
明のプローブ、例えば捕捉、検出プローブもしくはその両方に曝す、生物学的材
料においてクラミジアの存在を検出および／または同定する方法；および（iii
）(a)該生物学的材料からサンプルを採取または誘導し、(b)そこからＤＮＡを抽
出し、(c)抽出したＤＮＡに少なくとも１つ、および好ましくは２つの本発明の
プライマーを提供してポリメラーゼ鎖反応により増幅し、さらに(d)増幅したＤ
ＮＡ断片を生産する、生物学的材料においてクラミジアの存在を検出および／ま
たは同定する方法も包含する。
【００９７】 配列番号１ポリヌクレオチド配列、その相同体、および各々の部分配列の開示
によりそれらの対応するアミノ酸配列が使用可能になることは明らかである。従
って本発明の第六の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされ
るアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドまたはポリペプチド
誘導体が提供される。
【００９８】 本明細書において使用される「実質的に精製されたポリペプチド」はそれが天
然に存在する環境から選別されたポリヌクレオチド、および／またはそれが合成
される環境に存在する多数のポリヌクレオチドから遊離したポリペプチドと定義
される。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは細胞質ポリペプチドから遊
離したものである。本発明のポリペプチドが天然源、すなわちクラミジア株から
精製され得る、または組換え手段により生産され得ることは当業者には容易に理
解されよう。
【００９９】 本発明の第六の態様によれば、ポリペプチド、相同体または断片がクラミジア
に対する感染防御をすると考えられる標的動物において、その免疫原性を向上さ
せるために改変されたまたは処理されたポリペプチド、相同体または断片が提供
される。かかる改変または処理には：３−メチルヒスチジン、４−ヒドロキシプ
ロリン、５−ヒドロキシリジンなどのアミノ酸誘導体によるアミノ酸置換、アミ
ノ酸の遊離アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル側基の改変などのポリペプ
チド、相同体または断片の調整後に行われる改変または欠失が挙げられる。
【０１００】 特異的抗原性を有する本発明のポリヌクレオチドによりコードされる相同ポリ
ペプチドまたはポリペプチド誘導体の同定は、配列番号１のアミノ酸配列を有す
る参照ポリペプチドに対して作製した抗血清との交差反応性によるスクリーニン
グにより達成される。の手順は次の通りである：単一特異性高度免疫抗血清を、
精製参照ポリペプチド、融合ポリペプチド（例えばＭＢＰ、ＧＳＴ、またはＨｉ
ｓ−ｔａｇ系の発現産物、その使用に関する記載および説明についてはｐｃＤＮ
Ａ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ(+)Ａ、ＢおよびＣに関する、またＸｐｒｅｓｓ(商標
)系タンパク質精製に関するInvitrogen製品マニュアルに含まれている）、また
は抗原性であると推測される合成ペプチドに対して作製する。抗血清を融合ポリ
ペプチドに対して作製する場合、２つの異なる融合系を使用する。特異性抗原性
は以下のようにウエスタンブロット法(Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1979) 76:4350)、ドットブロット法、およびＥＬＩＳＡ法などのいくつか
の方法により求めることができる。
【０１０１】 ウエスタンブロットアッセイでは、スクリーニングする産物を精製調製物また
は大腸菌全抽出物のいずれかとして、Laemmli(Nature (1970) 227:680)により記
載されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法に付す。ニトロセルロース膜に移した後、
この材料を約１：５〜約１：５０００、好ましくは約１：１００〜約１：５００
の希釈範囲で、希釈した単一特異性高度免疫抗血清とともにさらにインキュベー
トする。その産物に対応する一つのバンドが上記の希釈範囲のいずれかで反応性
を呈すれば、特異的抗原性が示される。
【０１０２】 ＥＬＩＳＡ法では、スクリーニングする産物を被覆抗原として用いることが好
ましい。全細胞抽出物を用いてもよいが、精製調製物が好ましい。要するに、約
１０μｇタンパク質／ｍｌの調製物約１００μｌを９６−ウェルポリカーボネー
トＥＬＩＳＡプレートに分注する。このプレートを３７℃で２時間、次いで４℃
で一晩インキュベートする。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩
衝生理食塩水(ＰＢＳ)(ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファー)で洗浄する。ウェルを１
％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ２５０μｌで飽和させ、非特異的抗
体結合を妨げる。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ
／Ｔｗｅｅｎバッファーで洗浄する。抗血清は０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ／Ｔｗ
ｅｅｎバッファーで連続的に希釈する。各ウェルに希釈物１００μｌを加える。
プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、洗浄して標準法により評価する
。例えば、特異的抗体をウサギで生産した場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ
複合体をウェルに加える。インキュベーションを３７℃で９０分間で行い、プレ
ートを洗浄する。適当な基質により反応物を顕出させ、この反応物を比色定量（
分光光度計により測定された吸光度）により測定する。上記の試験条件下で、Ｏ
．Ｄ．値が非免疫対照血清より大きい場合に陽性反応を示す。
【０１０３】 ドットブロット法でも、全細胞抽出物を用いてもよいが、精製産物が好ましい
。要するに、約１００μｇ／ｍｌの産物の溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH
7.5)で連続的に２倍希釈する。各希釈物１００μｌを９６−ウェルドットブロッ
ト装置(Biorad)にセットしたニトロセルロース膜０．４５μｍに塗布する。系を
減圧してバッファーを除去する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH7.5)を加えてウ
ェルを洗浄し、膜を風乾する。膜をブロッキングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(pH7.5)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ脱脂乳）で飽和させ、約
１：５０〜約１：５０００、好ましくは約１：５００の抗血清希釈物とともにイ
ンキュベートする。反応物を標準手順により調べる。例えば、ウサギ抗体を用い
る場合、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ複合体をウェルに加える。インキュベー
ションを３７℃で９０分間で行い、ブロットを洗浄する。適当な基質により反応
物を顕出させて停止させる。この反応物を発色スポットの様子から、例えば比色
定量により視覚的に測定する。上記の試験条件下で、発色スポットが少なくとも
約１：５、好ましくは少なくとも約１：５００の希釈物と結合する場合に陽性反
応を示す。
【０１０４】 本発明のポリペプチドまたは誘導体の治療または予防効力は下記のように評価
できる。本発明の第七の態様によれば、（ｉ）本発明のポリペプチドとともに希
釈剤または担体を含んでなる材料の組成物；とりわけ（ii）治療または予防上有
効な量の本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物；（iii）免疫上有効な量
の本発明のポリペプチドを哺乳類に投与してクラミジアに対する感染防御免疫応
答を誘導することにより哺乳類のクラミジアに対する免疫応答を誘導する方法；
さらに詳しくは（iv）感染した個体に予防または治療量の本発明のポリペプチド
を投与することにより、クラミジア（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プシタチ
、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコラム）感染症を予防および／または治療する
方法が提供される。さらに本発明の第七の態様によれば、クラミジア感染症を予
防および／または治療する医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用が含
まれる。
【０１０５】 本明細書において、本発明の免疫原性組成物はワクチン分野で知られる便宜な
経路、特に粘膜（例えば目、鼻腔内、肺、口腔、胃、腸、直腸、膣、または尿管
）表面にまたは非経口（例えば皮下、皮内、筋肉内、静脈内、または腹膜内）経
路により投与する。投与経路の選択はポリペプチドと結合したアジュバントなど
のいくつかのパラメーターによる。粘膜アジュバントを用いる場合には鼻腔内ま
たは口腔経路が好ましい。脂質処方またはアルミニウム化合物を用いる場合には
非経口経路が好ましく、皮下または筋肉内経路が最も好ましい。この選択もまた
ワクチン薬剤の性質による。例えば、ＣＴＢまたはＬＴＢと融合した本発明のポ
リペプチドは粘膜表面に投与することが最もよい。
【０１０６】 本明細書において、本発明の組成物は１つまたはいくつかの本発明のポリペプ
チドまたは誘導体を含有する。所望により組成物は少なくとも一つの付加的なク
ラミジア抗原、またはそのサブユニット、断片、相同体、変異体もしくは誘導体
を含有してもよい。
【０１０７】 本発明の組成物における使用では、ポリペプチドまたはその誘導体をリポソー
ム、好ましくは中性または陰イオンリポソーム、ミクロスフェア、ＩＳＣＯＭＳ
、またはウイルス様粒子(ＶＬＰ)中にまたはそれとともに処方して、送達を促進
および／または免疫応答を増強する。当業者はこれらの化合物を容易に入手でき
る；例えばLiposomes: A Practical Approach,RCP New Ed, IRL press(1990)参
照。
【０１０８】 リポソームなど以外のアジュバントも用いられ、当技術分野では公知である。
アジュバントは抗原を局所デポジットに封鎖することにより、それを急速な分散
から守る、またはそれらは宿主を刺激して免疫系のマクロファージまたは他の成
分に対し化学走性である因子を分泌する物質を含有すると考えられる。一般的に
は当業者によって、例えば以下に記載されるもの（本発明の第１１の態様に基づ
くもの）から適当な選択がなされるであろう。
【０１０９】 当業者ならば容易に決定できるが、治療は１回の投与で果たしてもよいし、ま
たは必要に応じて間隔をおいて反復してもよい。例えば、開始用量の後、週単位
または１ヶ月単位の間隔をおいて３回の追加免疫抗原投与を続ける。好適な用量
は当業者には容易に決定できるが、受容者（例えば成人または小児）、個々のワ
クチン抗原、投与経路または頻度、アジュバントの有無またはタイプ、および所
望の効果（例えば感染防御および／または治療）を含む種々のパラメーターによ
って異なる。一般に、本発明のワクチン抗原を粘膜経路によって約１０μｇ〜約
５００ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ〜約２００ｍｇの量を投与する。投与が非経口
経路の場合、通常用量は約１ｍｇ、好ましくは約１００μｇの限度を超えない。
【０１１０】 ワクチン薬剤として用いる場合、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを多段階免疫化プロセスの要素として連続的に用いてもよい。例えば、まず哺
乳類にポックスウイルスなどの本発明のワクチンベクターを、例えば非経口経路
によりに注入し、次いでワクチンベクターによりコードされるポリペプチドで２
回、例えば粘膜経路により追加免疫抗原を加える。また別の例では本発明のポリ
ペプチドまたは誘導体と結合したリポソームを開始に用い、粘膜アジュバント（
例えばＬＴ）と組み合わせた本発明の可溶性ポリペプチドまたは誘導体を用いて
粘膜により追加免疫抗原刺激を行う。
【０１１１】 本発明の第七の態様によれば、本発明のポリペプチド誘導体はまた、例えば血
液サンプルにおいて抗クラミジア抗体の存在を検出する診断試薬として用いられ
る。かかるポリペプチドの長さは約５〜約８０個、好ましくは約１０〜約５０個
のアミノ酸である。診断方法により、それらを標識するまたは標識しないのいず
れかである。かかる試薬を含む診断方法を以下に記載する。
【０１１２】 公知の実験室手法を用い、本発明のＤＮＡ分子の発現においてポリペプチドま
たはポリペプチド誘導体を生産し精製する。以下に記載されるように、ポリペプ
チドまたはポリペプチド誘導体は精製を促進する融合テールを有した融合タンパ
ク質として生産される。融合産物を用いて小型哺乳類、例えばマウスまたはウサ
ギを免疫化し、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対する抗体（単一特異
性抗体）を作製する。よって本発明の第八の態様によれば、本発明のポリペプチ
ドまたはポリペプチド誘導体と結合する単一特異性抗体が提供される。
【０１１３】 「単一特異性抗体」とは特異な天然に存在するクラミジアポリペプチドと反応
し得る抗体を意味する。本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗
体のいずれかである。単一特異性抗体は組換え体、例えばキメラ（例えば、ヒト
不変部と結合したネズミ由来の可変部により構成された）、ヒト化型（動物、例
えばネズミ由来の超可変部とともにあるヒト免疫グロブリン不変主鎖）および／
または一本鎖であってよい。ポリクローナルおよび単一特異性抗体は双方とも免
疫グロブリン断片、例えばＦ(ａｂ)'２またはＦａｂフラグメントの形であって
もよい。本発明の抗体はいずれのイソ型のもの、例えばＩｇＧまたはＩｇＡであ
ってよいが、ポリクローナル抗体は単一イソ型またはイソ型の混合物ある。
【０１１４】 本発明のポリペプチド、相同体または断片に対する抗体はそのポリペプチド、
相同体または断片を含んでなる組成物による哺乳類の免疫化により産生される。
かかる抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野では十分に公知である
。例えば、"Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Eds. E. Harlow and D. Lane (1988)、およびD. E. Yelton et al., 1981. A
nn. Rev. Biochem. 50: 657-680参照。モノクローナル抗体についてはKohl and
Milstein (1975) Nature 256:495-497参照。
【０１１５】 本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体に対して作製される本発明の
抗体を標準免疫学的アッセイ法、例えばウエスタンブロット解析法、ドットブロ
ットアッセイ法、またはＥＬＩＳＡ法(例えばColigan et al., Current Protoco
ls in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照)を用い
て作製して同定する。抗体は生物学的サンプルなどのサンプルにおいてクラミジ
ア抗原の存在を検出する診断法に用いられる。また抗体は本発明のポリペプチド
またはポリペプチド誘導体を精製するアフィニティークロマトグラフィーにも用
いられる。以下でさらに考察するように、かかる抗体を予防および治療的受動的
免疫化方法に用いてもよい。
【０１１６】 よって本発明の第九の態様によれば、本発明の抗体、ポリペプチド、またはポ
リペプチド誘導体を含有する生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を検出
する試薬；および（ii）免疫複合体が形成されるように生物学的サンプルと本発
明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体とを接触させて、かかる複
合体を検出してサンプルまたはサンプルが誘導される生物体においてクラミジア
の存在を示すことにより、生物学的サンプルにおいてクラミジアの存在を検出す
る方法が提供される。
【０１１７】 いずれを用いるとしても免疫複合体がサンプルの成分と抗体、ポリペプチド、
またはポリペプチド誘導体とで形成されること、および結合していない材料がい
ずれも複合体の検出前に除去されることは当業者には容易に理解されるであろう
。ポリペプチド試薬がサンプル、例えば血液サンプルにおいて抗クラミジア抗体
の存在を検出するのに有用であり、本発明の抗体が胃抽出物または生検などのサ
ンプルをクラミジアポリペプチドの存在についてスクリーニングするのに有用で
あることは明らかである。
【０１１８】 診断適用では、試薬（すなわち本発明の抗体、ポリペプチド、またはポリペプ
チド誘導体）は遊離状態にあるか、またはチューブ、ビーズ、または当分野にお
いて用いられるいずれかの他の通常の支持体などの固相支持体に固定されている
かである。固定は直接的または間接的手段によりなし遂げられる。直接的手段と
しては受動的吸着（非共有結合）または支持体と試薬との共有結合が挙げられる
。「間接的手段」とは試薬と相互作用する抗試薬化合物が固相支持体に最初に付
着することを意味する。例えば、ポリペプチド試薬を用いる場合に、それが生物
学的サンプルにおいて抗体の認識に関係していないエピトープと結合するのであ
れば、それに結合する抗体が抗試薬として作用し得る。間接的手段にはまた、例
えばビタミンなどの分子がポリペプチド試薬に接合され、その対応する受容体が
固相に固定されるリガンド−受容体系も用いられる。これはビオチン−ストレプ
トアビジン系によって例示される。あるいは、ペプチドテールを化学的にまたは
遺伝子操作により試薬に加え、接合または融合された産物をペプチドテールの受
動的吸着または共有結合により固定する。
【０１１９】 使用説明書も含んでなるキットにかかる診断薬が含まれていてもよい。この試
薬はそれがその標的と結合した場合に試薬の検出がなされる検出手段によって標
識される。検出手段はフルオレセインイソシアネートまたはフルオレセインイソ
チオシアネートなどの蛍光剤、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくは
ルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素、または１２５Ｉ
または５１Ｃｒなどの放射性元素であってよい。
【０１２０】 従って本発明の第１０の態様によれば、生物学的サンプルについて本発明の単
一特異性抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含む、生
物学的サンプルから、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製す
る方法が提供される。
【０１２１】 本発明の精製法における使用に関し、抗体はポリクローナルまたは単一特異性
抗体のいずれか、および好ましくはＩｇＧ型である。精製ＩｇＧは常法により抗
血清から調製する(Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994)
John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.)。一般的なクロマトグラフィー支持
体、ならびに抗体を接合する標準方法については、例えばAntibodies: A Labora
tory Manual, D. Lane, E. Harlow, Eds. (1988)に記載されている。以下に概略
を記す。
【０１２２】 要するに、好ましくはバッファー溶液中の肺炎クラミジア抽出物などの生物学
的サンプルを、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体（すなわち抗原
）をクロマトグラフィー材に吸着させるように、好ましくは生物学的サンプルの
希釈に用いるバッファーで平衡化した材料に適用する。本発明の抗体と結合した
ゲルまたは樹脂などのクロマトグラフィー材はバッチ型またはカラムのいずれか
である。結合しない成分を洗い流し、次いで抗原をグリシンバッファー、または
カオトロピック剤、例えばグアニジンＨＣｌ、もしくは高塩濃度（例えば、３Ｍ
ＭｇＣｌ２）を含有するバッファーなどの好適な溶出バッファーで溶出する。
溶出画分を回収し、例えば２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより抗原
の存在を検出する。
【０１２３】 本発明の第１１の態様によれば、（ｉ）本発明の単一特異性抗体とともに希釈
剤または担体を含んでなる材料の組成物；（ii）治療または予防上有効な量の本
発明の単一特異性抗体を含んでなる医薬組成物；および（iii）感染した個体に
治療または予防量の本発明の単一特異性抗体を投与することにより、クラミジア
（例えばＣ．トラチョマチス、Ｃ．プシタチ、肺炎クラミジア、またはＣ．ペコ
ラム）感染症を治療または予防する方法が提供される。さらに本発明の第１１の
態様によれば、クラミジア感染症を治療または予防する医薬の製造における本発
明の単一特異性抗体の使用が含まれる。
【０１２４】 単一特異性抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか、好ましく
はＩｇＡイソ型のもの（優勢）である。受動的免疫化では抗体を重炭酸バッファ
ーの存在下で哺乳類の粘膜表面、例えば胃粘膜に、例えば経口または胃内投与す
ることが有利である。また全身投与は重炭酸バッファーを用いずに行われる。本
発明の単一特異性抗体を単一有効成分として、または異なるクラミジアポリペプ
チドに対して特異的な少なくとも一つの単一特異性抗体との混合物として投与す
る。用いる抗体量および特定の管理方法は当業者により容易に決定される。大部
分の目的には、例えば抗体約１００〜１,０００ｍｇを１週間毎日投与、または
抗体約１００〜１,０００ｍｇを２または３日間１日当たり３回投与が有効な管
理法である。
【０１２５】 治療または予防効力を当技術分野の常法を用いて、例えば粘膜免疫応答の誘導
または感染防御および／または治療的免疫の誘導を、例えば肺炎クラミジアマウ
スモデルを用いて測定することにより評価する。モデルの肺炎クラミジア株を別
のクラミジア株と置き換えてもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。
例えば、肺炎クラミジア由来のＤＮＡ分子およびポリペプチドの効果は、好まし
くはマウスモデルにおいて肺炎クラミジア株を用いて評価する。感染防御はクラ
ミジア感染症の程度を対照群のものと比較して求める。感染症が対照群に比べて
軽減されている場合に感染防御を示す。本発明のポリヌクレオチド、ワクチンベ
クター、ポリペプチドおよびその誘導体、ならびに抗体に対してかかる評価がな
される。
【０１２６】 上記のいずれのワクチン組成物においても有用なアジュバントは以下の通りで
ある。
【０１２７】 非経口投与用アジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、
およびヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が挙げられる。
標準プロトコールに従い、抗原をアルミニウム化合物で沈降させる、またはそれ
に吸着させる。ＲＩＢＩ(ImmunoChem, Hamilton, MT)などの他のアジュバントも
非経口投与に用いられる。
【０１２８】 粘膜投与用アジュバントには細菌毒、例えばコレラ毒(ＣＴ)、大腸菌易熱性毒
(ＬＴ)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒Ａおよび
百日咳毒（ＰＴ）、もしくはその組合せ、サブユニット、変性毒素、または天然
コレラ毒サブユニットＢ(ＣＴＢ)の精製製剤などのその変異体が挙げられる。こ
れらの毒素のいずれに対する断片、相同体、誘導体、および融合物もアジュバン
ト活性を保有している場合にはそれらもまた適当である。好ましくは弱毒化した
変異体を用いる。好適な変異体は、例えばWO95/17211（Arg-7-Lys CT変異体）、
WO96/06627（Arg-192-Gly LT変異体）、およびWO95/34323（Arg-9-LysおよびGlu
-129-Gly PT変異体）に記載される。本発明の方法および組成物において用いら
れるさらなるＬＴ変異体には、例えばSer-63-Lys、Ala-69Gly、Glu-110-Asp、お
よびGlu-112-Asp変異体が挙げられる。例えば大腸菌、サルモネラ・ミネソタ(Sa lmonella minnesota)、ネズミチフス菌、またはシゲラ・フレクスネリ(Shigella Flexneri)の細菌モノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬＡ)；サポニン、またはポリアク
チドグリコリド(ＰＬＧＡ)ミクロスフェアなどの他のアジュバントも粘膜投与に
用いられる。
【０１２９】 粘膜および非経口投与の双方に有用なアジュバントには、ポリホスファゼン（
ＷＯ９５／０２４１５）、ＤＣ−ｃｈｏｌ(３ｂ−(Ｎ−(Ｎ'，Ｎ'−ジメチルア
ミノメタン)−カルバモイル）コレステロール；米国特許第5,283,185号およびWO
96/14831)およびＱＳ−２１(WO88/09336)が挙げられる。
【０１３０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、または抗体
を含有する本発明の医薬組成物は常法で製造される。特に医薬上許容される希釈
剤または担体、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理食塩水とともに
処方される。一般に希釈剤または担体は投与形ならびに経路、および医薬上の標
準法に基づき選択される。好適な医薬上の担体または希釈剤、ならびに医薬製剤
における使用に医薬上必要不可欠なものは、Remington's Pharmaceutical Scien
ces、当分野における標準的な参照文献およびＵＳＰ／ＮＦに記載されている。
【０１３１】 本発明はまた、本発明のクラミジアポリペプチドおよび粘膜アジュバントと抗
生物質、制酸剤、スクラルファート、またはその組合せとを併用した経口投与に
よりクラミジア感染症を治療する方法も含む。ワクチン抗原およびアジュバント
とともに投与し得るかかる化合物の例としては、例えばマクロライド、テトラサ
イクリン、およびその誘導体（用い得る抗生物質の特異例として、アジトロマイ
シンもしくはドキシサイクリンまたはサイトカインもしくはステロイド類などの
免疫調節剤が挙げられる）などの抗生物質がある。さらにともに結合した１種を
超える上記成分を含有する化合物を用いる。本発明はまたこれらの方法を行うた
めの組成物、すなわち医薬上許容される担体または希釈剤中に本発明のクラミジ
ア抗原（または抗体）、アジュバント、および１種以上の上記の化合物を含有す
る組成物も含む。
【０１３２】 最近、６０ｋＤａのシステイン豊富な外膜タンパク質は、ヒトにおいて保存さ
れているエピトープ、ネズミαミオシン重鎖エピトープＭ７Ａ−αと交差反応す
る配列を含んでいることが示されている(Bachmaier et al., Science (1999) 28
3:1335)。この交差反応性は心血管疾患の発症の一因であることを示しているの
で、ワクチンとして使用される場合はそのタンパク質からこのエピトープおよび
ヒト抗原と交差反応するその他のエピトープのいずれもを除去するのが有効であ
り得る。従って、本発明のさらなる具体例は、例えばタンパク質をコードするポ
リヌクレオチドからエピトープをコードするヌクレオチドを欠失させるまたは置
換して、ワクチンとしてのタンパク質の有効性と安全性を向上させることでコー
ド配列を改変することを含む。ヒト抗原との望ましくない相同性または交差反応
性を持つことがわかっているいずれの防御抗原に対しても同様のアプローチが適
当であり得る。
【０１３３】 本発明の方法および組成物において用いられる上記化合物の量については当業
者ならば容易に求められる。治療／免疫化計画についても公知であり、当業者に
よって容易に計画される。例えば、非ワクチン成分を１〜１４日目に投与して、
ワクチン抗原＋アジュバントを７、１４、２１、および２８日目に投与すること
が可能である。
【０１３４】
【実施例】 上記の開示は一般に本発明を説明するものである。さらに完全な理解は以下の
具体的な例により得られる。これらの例は単に例示のために記載されるものであ
って、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況が提案されまたは便
宜となる限り、形態の変更および同等物との置換も考えられる。ここでは特定の
用語が用いられているが、かかる用語は説明を意図したものであって、限定しよ
うとするものではない。
【０１３５】例１： この例はＯＭＰ（外膜タンパク質）遺伝子を含むプラスミドベクターｐＣＡｍ
ｇｐ００２の調製を示すものである。 ＯＭＰ（外膜タンパク質）遺伝子を５’プライマー（5'ATAAGAATGCGGCCGCCACC
ATGGGACTATTCCATCTAACTCTC 3'）（配列番号３）および３’プライマー（5'GCGCC GGATCC CCTCCACAATTTTTATGAGTAAGCC 3'）（配列番号４）を用いるポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によって、肺炎クラミジア・ゲノムＤＮＡから増幅した。５’
プライマーはＮｏｔＩ制限部位、リボゾーム結合部位、開始コドン、およびＯＭ
Ｐ（外膜タンパク質）コード配列の５’末端配列を含む。３’プライマーはＯＭ
Ｐ（外膜タンパク質）のＣ末端配列をコードする配列およびＢａｍＨＩ制限部位
を含む。停止コドンを除き、さらなるヌクレオチドを挿入してヒスチジンタグと
のフレーム内融合物を得た。 増幅後、QIAquick(商標)ＰＣＲ精製キット(Qiagen) を用いてＰＣＲ断片を精
製し、その後ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＣＭＶプロモーターの制
御下で転写する例２に記載のｐＣＡ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ真核生物発現ベクター（図
３）へ挿入した。
【０１３６】例２： この例は真核生物発現ベクターｐＣＡ／Ｍｙｓ−Ｈｉｓの調製を示す。 プラスミドｐｃＤＮＡ３．１(-)Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ(Invitrogen)をＳｐｅＩお
よびＢａｍＨＩで制限処理してＣＭＶプロモーターを除去し、残りのベクター断
片を単離した。プラスミドＶＲ−１０１２(Vical)由来のＣＭＶプロモーターお
よびイントロンＡをＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ断片上に単離した。これらの断片を連
結してプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを作出した。ＯＭＰ（外膜タンパク質
）遺伝子を含んだＰＣＲ断片をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩで制限処理したものをＮｏ
ｔＩおよびＢａｍＨＩで制限処理したプラスミドｐＣＡ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと連結
してプラスミドｐＣＡｍｇｐ００２を作出した（図３）。
【０１３７】 得られたプラスミドｐＣＡｍｇｐ００２をエレクトロポレーションによって大
腸菌ＸＬ−１ブルー(Stratagene)へトランスフェクトし、これを５０μｇ／ｍｌ
のカルベニシリンを含むＬＢ培地で増殖させた。プラスミドはエンド・フリー・
プラスミド・ギガ・キット(商標)(Qiagen)大スケールＤＮＡ精製系によって単離
した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸光度で求め、ゲル電気泳動に付して臭化エチ
ジウム染色し、分子量標準と比較してプラスミドを確認した。遺伝子の５’およ
び３’末端はＬｉＣｏｒモデル４０００ＬＤＮＡシーケンサーおよびＩＲＤ−８
００標識プライマーを用いた配列決定によって確認した。
【０１３８】例３： この例は肺炎クラミジアの鼻腔攻撃に対する防御を達成するためのマウスの免
疫化を示す。 これまでに、マウスが肺炎クラミジアの種々の単離物による鼻腔内感染に感受
性があることが示されている(Yang et al., 1993)。ＡＲ−３９株(Grayston, 19
89)は、裸のＤＮＡとして送達されたクラミジア遺伝子産物の致死下の肺炎クラ
ミジアの肺感染に対する防御応答を誘起する能力を調べるための抗原投与感染モ
デルとしてＢａｌ／ｃマウスにおいて用いた。防御免疫は肺感染の加速化された
クリアランスと定義される。
【０１３９】 ７〜９週齢の雄Ｂａｌ／ｃマウス群（６〜１０匹／群）を例１および２に記載
の肺炎クラミジアＯＭＰ（外膜タンパク質）のコード配列を含むプラスミドＤＮ
Ａで筋肉内(i.m.)および鼻腔内(i.n.)感作させた。対照個体群には生理食塩水ま
たはクラミジア遺伝子の挿入物を欠いたプラスミドベクターを与えた。
【０１４０】 i.m.感作では、０、３および６週の３回、ＰＢＳ５０μｌ中ＤＮＡ１００μｇ
を左、右の四頭筋に交互に注射した。i.n.感作では、０、３および６週の３回、
ＤＮＡ５０μｇを含むＰＢＳ５０μｌを麻酔したマウスに吸入させた。８週目に
、致死下の肺炎クラミジア抗原投与の増殖を制限する能力を試験するために、免
疫化しマウスにＳＰＧバッファー１００μｌ中の肺炎クラミジアＡＲ３９株５×
１０５ＩＦＵを鼻腔内接種した。
【０１４１】 抗原投与後９日目にマウスから肺を摘出し、直ちにＳＰＧバッファー（７．５
％スクロース、５ｍＭグルタミン酸塩、１２．５ｍＭリン酸塩 ｐＨ７．５）中
で本発明ホモジネートした。このホモジネートはアッセイまで−７０℃で凍結保
存した。ホモジネート希釈物を感受性細胞の単層に接種することで感染性クラミ
ジアの存在に関してアッセイした。この接種物を３０００ｒｐｍで１時間細胞上
へ遠心分離した後、シクロヘキシミド１μｇ／ｍｌの存在下で３５℃にて３日間
インキュベートした。単層のインキュベーション後、ホルマリンおよびメタノー
ルで固定し、次ぎに肺炎クラミジアおよびペルオキシダーゼ基質として金属で増
強したＤＡＢを感染させたウサギからの回復期血清を用いてクラミジア封入体の
存在に対して免疫ペルオキシダーゼ染色した。
【０１４２】 図４および表１は、ｐＣＡｍｇｐ００２をi.n.およびi.m.感作させたマウスの
肺のクラミジア力価が９日目で６例中５例で４１，０００未満であり（平均２９
，７８３）、一方、生理食塩水を感作させた偽性の対照マウスの値の範囲は９日
目で１３，６００〜４５８，１００ＩＦＵ／肺（平均１０７，６４１）であった
。別のプラスミドＤＮＡ構築物のｐＣＡＢｋ９１７では防御できず、感作マウス
の肺の力価は生理食塩水を感作させた対照マウスで得られたものと同等であった
ので（平均８５，３５０ＩＦＵ／肺）、ＤＮＡの感作自体は認められた防御効果
の一因ではなかった。構築物ｐＣＡＢｋ９１７は、ＯＭＰ（外膜タンパク質）を
コードするヌクレオチド配列がオープンリーディングフレームをベースとする他
の仮性外膜タンパク質をコードする肺炎クラミジアヌクレオチド配列に置換され
ていること以外は、ｐＣＡｍｇｐ００２と同一である。
【０１４３】
【表１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 肺炎クラミジア由来のＯＭＰ（外膜タンパク質）遺伝子のヌクレオチド配列（
配列番号１）およびＯＭＰ（外膜タンパク質）の推定アミノ酸配列（配列番号２
）を示す。
【図２】 肺炎クラミジアＯＭＰ（外膜タンパク質）遺伝子の制限酵素解析を示す。
【図３】 プラスミドｐＣＡｍｇｐ００２の構成および構成要素を示す。
【図４】 ＤＮＡ感作後のｐＣＡｍｇｐ００２による肺炎クラミジア感染に対する防御を
示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月１９日（２００１．１０．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 11/00 ４Ｃ０８５ 48/00 31/00 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 11/00 Ｃ０７Ｋ 14/295 ４Ｈ０４５ 31/00 16/12 Ｃ０７Ｋ 14/295 19/00 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/569 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:01 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョー、ワング カナダ国オンタリオ州、トロント、アスペ ンウッド、ドライブ、51 (72)発明者 パメラ、ダン カナダ国オンタリオ州、ウッドブリッジ、 ローズバリー、レイン、97 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA40 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 BA31 CA04 CA07 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 GA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ06 QQ43 QQ79 QQ96 QR42 QR56 QR72 QR75 QX01 4B064 AF27 AG26 AG31 CA02 CA06 CA10 CA11 CA19 CA20 DA01 DA13 DA15 4B065 AA01Y AA26X AA57X AA72X AA90X AB01 CA23 CA24 CA25 CA45 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA44 CA03 CA53 NA14 ZA591 ZA592 ZB321 ZB322 4C085 AA03 AA13 AA14 BA45 BB33 CC07 CC32 EE01 EE05 EE06 FF13 4C087 AA02 BC83 NA14 ZA59 ZB32 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 BA41 BA54 CA11 DA75 DA86 EA20 EA52 FA73 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２、 （ｂ）(ａ)のポリペプチド由来の少なくとも１２個の連続するアミノ酸を含ん
    でなる免疫原性断片、および （ｃ）免疫原性を失わずに改変された(ａ)または(ｂ)のポリペプチドであって
    、対応する(ａ)または(ｂ)のポリペプチドとアミノ酸配列において少なくとも７
    ５％の同一性を有する、改変ポリペプチド のいずれかから選択されるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、核
    酸分子。
  2. 【請求項２】 （ａ）配列番号１、 （ｂ）配列番号１によってコードされるポリペプチドをコードする配列、 （ｃ）(ａ)および(ｂ)の核酸配列のいずれか１つに由来する少なくとも３８個
    の連続するヌクレオチドを含んでなる配列、および （ｄ）配列番号１によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列において
    少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列 のいずれかから選択される核酸配列を含んでなる、核酸分子。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の核酸分子に対してアンチセンスである核酸配列を含
    んでなる、核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドと、第二のポリ
    ペプチドとを含んでなる融合タンパク質を、コードする核酸配列を含んでなる、
    核酸分子。
  5. 【請求項５】 第二のポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項４に記載の核酸分
    子。
  6. 【請求項６】 第二のポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項４に記載の核酸分子
    。
  7. 【請求項７】 １種以上の発現制御配列に作動可能に連結された、請求項１〜６のいずれか一
    項に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 ワクチンベクターと、 （ｉ）配列番号１、 （ii）配列番号１によってコードされるポリペプチドをコードする核酸配列、 （iii）(ｉ)および(ii)の核酸配列のいずれか一つに由来する少なくとも３８
    個の連続するヌクレオチドを含んでなる、核酸配列、 （iv）配列番号１によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列において
    少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列、 （ｖ）配列が配列番号２で示されるポリペプチドをコードする、核酸配列、 （vi）配列番号２に由来する少なくとも１２個の連続するアミノ酸を含んでな
    る免疫原性断片をコードする核酸配列、および （vii）(ｉ)〜(ｖ)で定義されるポリペプチド、または免疫原性を失わずに改
    変された、(vi)で定義される免疫原性断片をコードする核酸配列であって、対応
    する(ｉ)〜(ｖ)のポリペプチドまたは対応する(vi)の断片とアミノ酸配列におい
    て少なくとも７５％の同一性を有する、改変ポリペプチドまたは断片 のいずれかから選択される少なくとも一つの第一の核酸と を含んでなる、ワクチンであって、 ここで、各々の第一の核酸は発現可能であり、 所望によりこの第一の核酸によって発現されるポリペプチドに対する免疫応答
    を増強する付加的なポリペプチドをコードし、かつそれを発現し得る第二の核酸
    を含んでなる、ワクチン。
  9. 【請求項９】 ワクチンベクターと、融合タンパク質をコードする少なくとも一つの第一の核
    酸配列とを含んでなるワクチンであって、 該融合タンパク質が、 （ａ）(i) 配列番号１によってコードされるポリペプチド、 (ii) 配列番号１に由来する少なくとも３８個の連続するヌクレオチド
    を含んでなる核酸配列によってコードされるポリペプチド、 (iii) 配列番号１によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列に
    おいて少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、 (iv) 配列が配列番号２で示されるポリペプチド、 (v)配列番号２に由来する少なくとも１２個の連続するアミノ酸を含ん
    でなる免疫原性断片、および (vi) (i)〜(iv)で定義されるポリペプチド、または免疫原性を失わずに
    改変された、(v)で定義される免疫原性断片であって、対応する(i)〜(iv)のポリ
    ペプチドまたは対応する(v)の断片とアミノ酸配列において少なくとも７５％の
    同一性を有する、改変ポリペプチドまたは断片 のいずれかから選択される第一のポリペプチドと、 （ｂ）第二のポリペプチドと を含んでなり、 ここで、各々の第一の核酸は発現可能であり、 所望によりこの第一のポリペプチドに対する免疫応答を増強する付加的なポリ
    ペプチドをコードし、かつそれを発現し得る第二の核酸を含んでなる、ワクチン
    。
  10. 【請求項１０】 第二のポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項９に記載のワクチ
    ン。
  11. 【請求項１１】 第二のポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項９に記載のワクチン
    。
  12. 【請求項１２】 各々の第一の核酸が１種以上の発現制御配列に作動可能に連結された、請求項
    ８〜１１のいずれか一項に記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 請求項１、２、および４〜７のいずれか一項に記載の少なくとも一つの第一の
    核酸と、ワクチンベクターとを含んでなるワクチンであって、 ここで、各々の第一の核酸はポリペプチドとして発現し、 所望によりこの第一の核酸によって発現されるポリペプチドに対する免疫応答
    を増強する付加的なポリペプチドをコードする第二の核酸を含んでなる、ワクチ
    ン。
  14. 【請求項１４】 第二の核酸が付加的なクラミジアポリペプチドをコードしている、請求項８〜
    １３のいずれか一項に記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸と、医薬上許容される担体とを含ん
    でなる、医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項８〜１４のいずれか一項に記載のワクチンと、医薬上許容される担体と
    を含んでなる、医薬組成物。
  17. 【請求項１７】 請求項７に記載の核酸分子で形質転換された、単細胞宿主。
  18. 【請求項１８】 ストリンジェント条件下で、配列番号１の核酸分子と、またはその核酸分子の
    相補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする５〜１００個のヌクレオチ
    ドからなる、単離された核酸プローブ。
  19. 【請求項１９】 ストリンジェント条件下で、配列番号１の核酸分子、またはその核酸分子の相
    補もしくはアンチセンス配列とハイブリダイズする１０〜４０個のヌクレオチド
    からなる、単離されたプライマー。
  20. 【請求項２０】 請求項１、２、および４〜７のいずれか一項に記載の核酸配列によってコード
    されている、ポリペプチド。
  21. 【請求項２１】 （ａ）配列番号２、 （ｂ）(ａ)のポリペプチドに由来する少なくとも１２個の連続するアミノ酸を
    含んでなる免疫原性断片、および （ｃ）免疫原性を失わずに改変された(ａ)または(ｂ)のポリペプチドであって
    、対応する(ａ)または(ｂ)のポリペプチドとアミノ酸配列において少なくとも７
    ５％の同一性を有する、改変ポリペプチド のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 請求項２０または２１のポリペプチドと、第二のポリペプチドとを含んでなる
    、融合タンパク質。
  23. 【請求項２３】 第二のポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項２２に記載の融合
    タンパク質。
  24. 【請求項２４】 第二のポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項２２に記載の融合タ
    ンパク質。
  25. 【請求項２５】 請求項２０または２１に記載のポリペプチド、または請求項２２〜２４のいず
    れか一項に記載の融合タンパク質を生産する方法であって、 請求項１７に記載の単細胞宿主を培養する工程を含んでなる、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２０または２１に記載のポリペプチド、または請求項２２〜２４のいず
    れか一項に記載の融合タンパク質に対する、抗体。
  27. 【請求項２７】 （ｉ）配列番号１によってコードされるポリペプチド、 （ii）配列番号１に由来する少なくとも３８個の連続するヌクレオチドを含ん
    でなる核酸配列によってコードされるポリペプチド、 （iii）配列番号１によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列におい
    て少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、 （iv）その配列が配列番号２で示されるポリペプチド、 （ｖ）配列番号２に由来する少なくとも１２個の連続するアミノ酸を含んでな
    る免疫原性断片、および （vi）(ｉ)〜(iv)で定義されるポリペプチド、または免疫原性を失わずに改変
    された、(ｖ)で定義される免疫原性断片であって、対応する(ｉ)〜(iv)のポリペ
    プチドまたは対応する(ｖ)の断片とアミノ酸配列において少なくとも７５％の同
    一性を有する、改変ポリペプチドまたは断片 のいずれかから選択される少なくとも一つ第一のポリペプチドを含んでなるワク
    チンであって、 所望によりこの第一のポリペプチドに対する免疫応答を増強する付加的なポリ
    ペプチドを含んでなる、ワクチン。
  28. 【請求項２８】 少なくとも一つの融合タンパク質を含んでなるワクチンであって、 該融合タンパク質が、 （ａ）(i) 配列番号１によってコードされるポリペプチド、 (ii) 配列番号１に由来する少なくとも３８個の連続するヌクレオチド
    を含んでなる核酸配列によってコードされるポリペプチド、 (iii) 配列番号１によってコードされるポリペプチドとアミノ酸配列に
    おいて少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、 (iv) 配列が配列番号２で示されるポリペプチド、 (v) 配列番号２に由来する少なくとも１２個の連続するアミノ酸を含ん
    でなる免疫原性断片、および (vi) (i)〜(iv)で定義されるポリペプチド、または免疫原性を失わずに
    改変された、(v)で定義される免疫原性断片であって、対応する(i)〜(iv)のポリ
    ペプチドまたは対応する(v)の断片とアミノ酸配列において少なくとも７５％の
    同一性を有する、改変ポリペプチドまたは断片 のいずれかから選択される第一のポリペプチドと、 （ｂ）第二のポリペプチドと を含んでなり、 所望によりこの第一のポリペプチドに対する免疫応答を増強する付加的なポリ
    ペプチドを含んでなる、ワクチン。
  29. 【請求項２９】 第二のポリペプチドが異種シグナルペプチドである、請求項２８に記載のワク
    チン。
  30. 【請求項３０】 第二のポリペプチドがアジュバント活性を有する、請求項２８に記載のワクチ
    ン。
  31. 【請求項３１】 請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の少なくとも一つの第一のポリペプチ
    ドと、所望によりこの第一のポリペプチドに対する免疫応答を増強する付加的な
    ポリペプチドとを含んでなる、ワクチン。
  32. 【請求項３２】 付加的なポリペプチドがクラミジアポリペプチドを含んでなる、請求項２７〜
    ３１のいずれか一項に記載のワクチン。
  33. 【請求項３３】 請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチドと、医薬上許容される
    担体とを含んでなる、医薬組成物。
  34. 【請求項３４】 請求項２７〜３２のいずれか一項に記載のワクチンと、医薬上許容される担体
    とを含んでなる、医薬組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項２６に記載の抗体と、医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成
    物。
  36. 【請求項３６】 （ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸、 （ｂ）請求項８〜１４および２７〜３２のいずれか一項に記載のワクチン、 （ｃ）請求項１５、１６および３３〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物
    、 （ｄ）請求項２０もしくは２１に記載のポリペプチド、または請求項２２〜２
    ４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または （ｅ）請求項２６に記載の抗体 を用いて、クラミジア感染症を予防または治療する方法。
  37. 【請求項３７】 （ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸、 （ｂ）請求項２０もしくは２１に記載のポリペプチド、または請求項２２〜２
    ４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および （ｃ）請求項２６に記載の抗体 のいずれか１つから選択される成分を用いて、試験される哺乳類の体液をアッセ
    イする工程を含んでなる、クラミジア感染症の検出方法。
  38. 【請求項３８】 使用説明書と、 （ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸、 （ｂ）請求項２０もしくは２１に記載のポリペプチド、または請求項２２〜２
    ４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および （ｃ）請求項２６に記載の抗体 のいずれか１つから選択される成分と を含んでなる、診断キット。
  39. 【請求項３９】 予めポリペプチドで免疫化した哺乳類におけるクラミジア感染を予防またはそ
    の重篤度を軽減するのに有効な免疫応答を誘導する、請求項２０または２１に記
    載のポリペプチド、または請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパ
    ク質を同定する方法であって、 （ａ）マウスをそのポリペプチドまたは融合タンパク質で免疫化し、さらに （ｂ）免疫化したマウスにクラミジアを接種し、 ここで、免疫化されていない対照マウスに比べて、免疫化したマウスで、クラミ
    ジア感染の感受性が予防されたまたはその重篤度が軽減したポリペプチドまたは
    融合タンパク質を同定することを含んでなる、方法。
  40. 【請求項４０】 図３で示される、発現プラスミドｐＣＡｍｇ００２。
  41. 【請求項４１】 配列番号３または４の、核酸分子。
  42. 【請求項４２】 クラミジア由来の約６２ｋＤａの、単離された外膜タンパク質。
  43. 【請求項４３】 肺炎クラミジア由来の約６２ｋＤａの、単離された外膜タンパク質。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007511227A (ja) * 2003-11-21 2007-05-10 サノフィ パストゥール リミテッド クラミジア感染に対する免疫

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2340283A1 (en) 1998-08-20 2000-03-02 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding pomp91a protein of chlamydia
US6686339B1 (en) 1998-08-20 2004-02-03 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia
EP1105490A1 (en) 1998-08-20 2001-06-13 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia
US6649370B1 (en) 1998-10-28 2003-11-18 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6607730B1 (en) 1998-11-02 2003-08-19 Aventis Pasteur Limited/Aventis Pasteur Limitee Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
CA2353107A1 (en) 1998-12-01 2000-06-08 Andrew D. Murdin Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
NZ512730A (en) * 1998-12-04 2003-12-19 Univ Manitoba A immunization procedure against chlamydia infection using an attenuated bacteria comprsing a plasmid with a major outer membrane protein (MOMP) from chlamydial
EP2277893A3 (en) 1998-12-08 2011-03-30 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
US7297341B1 (en) 1998-12-23 2007-11-20 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
WO2000039157A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US6808713B1 (en) 1998-12-28 2004-10-26 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
GB9902555D0 (en) 1999-02-05 1999-03-24 Neutec Pharma Plc Medicament
MXPA01009256A (es) 1999-03-12 2003-07-14 Aventis Pasteur Antigenos de chlamydia y fragmentos de acido desoxirribonucleico correspondientes y usos de los mismos.
AU780444B2 (en) 1999-05-03 2005-03-24 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
NZ517952A (en) 1999-09-20 2004-01-30 Aventis Pasteur Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6632663B1 (en) 1999-09-22 2003-10-14 Aventis Pasteur Limited DNA immunization against chlamydia infection
WO2001046224A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
CA2407114A1 (en) 2000-04-21 2001-11-01 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6919187B2 (en) * 2000-04-21 2005-07-19 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
AU2001258105A1 (en) 2000-05-08 2001-11-20 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
WO2002002606A2 (en) 2000-07-03 2002-01-10 Chiron S.P.A. Immunisation against chlamydia pneumoniae
ES2733084T3 (es) 2009-03-06 2019-11-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antígenos de Chlamydia

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998058953A2 (en) * 1997-06-23 1998-12-30 Svend Birkelund Surface exposed proteins from chlamydia pneumoniae
WO1999027105A2 (en) * 1997-11-21 1999-06-03 Genset Chlamydia pneumoniae genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE312920T1 (de) 1996-07-12 2005-12-15 Dna immunisierung gegen chlamydia infektion
US6579854B1 (en) * 1996-08-14 2003-06-17 Vanderbilt University Diagnosis and management of infection caused by chlamydia
ES2352082T3 (es) * 1997-11-21 2011-02-15 Merck Serono Biodevelopment Polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección polipéptido de la membrana externa de chlamydia pneumoniae, fragmentos del mismo y sus usos, en particular para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de una infección.
EP1032676A2 (en) 1997-11-28 2000-09-06 Genset $i(CHLAMYDIA TRACHOMATIS) GENOMIC SEQUENCE AND POLYPEPTIDES, FRAGMENTS THEREOF AND USES THEREOF, IN PARTICULAR FOR THE DIAGNOSIS, PREVENTION AND TREATMENT OF INFECTION
US6541011B2 (en) * 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
EP1105490A1 (en) * 1998-08-20 2001-06-13 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia
US6693087B1 (en) * 1998-08-20 2004-02-17 Aventis Pasteur Limited Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia
EP1129202A2 (en) 1998-10-28 2001-09-05 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigenes and corresponding dna fragments and uses thereof
US6822071B1 (en) * 1998-11-12 2004-11-23 The Regents Of The University Of California Polypeptides from Chlamydia pneumoniae and their use in the diagnosis, prevention and treatment of disease
AU1722300A (en) 1998-11-12 2000-05-29 Regents Of The University Of California, The Chlamydia pneumoniae genome sequence
CA2353107A1 (en) * 1998-12-01 2000-06-08 Andrew D. Murdin Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US20020061848A1 (en) 2000-07-20 2002-05-23 Ajay Bhatia Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
EP2277893A3 (en) 1998-12-08 2011-03-30 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US6565856B1 (en) 1998-12-08 2003-05-20 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
US6808713B1 (en) * 1998-12-28 2004-10-26 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
GB9902555D0 (en) 1999-02-05 1999-03-24 Neutec Pharma Plc Medicament
AU780444B2 (en) 1999-05-03 2005-03-24 Sanofi Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
NZ517952A (en) 1999-09-20 2004-01-30 Aventis Pasteur Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US6632663B1 (en) 1999-09-22 2003-10-14 Aventis Pasteur Limited DNA immunization against chlamydia infection
WO2001046225A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
WO2001046224A2 (en) 1999-12-22 2001-06-28 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
US20020132994A1 (en) * 2000-04-04 2002-09-19 Murdin Andrew D. Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US20030100706A1 (en) * 2000-04-04 2003-05-29 Murdin Andrew D. Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US20020071831A1 (en) * 2000-04-04 2002-06-13 Murdin Andrew D. Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US20020082402A1 (en) * 2000-04-04 2002-06-27 Murdin Andrew D. Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
US20020094965A1 (en) * 2000-04-04 2002-07-18 Murdin Andrew D. Chlamydia antigens and corresponding DNA fragments and uses thereof
CA2407114A1 (en) 2000-04-21 2001-11-01 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
US20040254130A1 (en) * 2000-05-08 2004-12-16 Murdin Andrew D Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
AU2001258105A1 (en) 2000-05-08 2001-11-20 Aventis Pasteur Limited Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof
WO2002002606A2 (en) 2000-07-03 2002-01-10 Chiron S.P.A. Immunisation against chlamydia pneumoniae

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998058953A2 (en) * 1997-06-23 1998-12-30 Svend Birkelund Surface exposed proteins from chlamydia pneumoniae
WO1999027105A2 (en) * 1997-11-21 1999-06-03 Genset Chlamydia pneumoniae genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6010045793, ＫＡＬＭＡＮ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．, "Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｎｄ Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ", ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ, 199904, Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．４, ｐ．３８５−３８９ *
JPN6010045795, Ｄａｔａｂａｓｅ ＵｎｉＰｒｏｔ［ｏｎｌｉｎｅ］， Ａｃｃｅｓｓｉｎ Ｎｏ Ｑ９Ｚ９Ｇ０＿ＣＨＬＰＮ， ＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９Ｚ９Ｇ０．ｔｘｔ？ｖｅｒｓｉ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007511227A (ja) * 2003-11-21 2007-05-10 サノフィ パストゥール リミテッド クラミジア感染に対する免疫

Also Published As

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