JP2003509010A - ペプチドのスクリーニング方法 - Google Patents
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-
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Abstract
(57)【要約】
抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列のスクリーニング方法であって、以下の：（ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基をもつペプチドを発現するように、誘導性プロモーターに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラスミドを結合させ、（ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対して感受性である宿主細胞を形質転換させ、（ｃ）生きた細胞を選択するように上記の形質転換された宿主細胞をスクリーニングし、（ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、上記生きた細胞を培養し、（ｅ）細胞増殖における上記誘導物質の作用に従って細胞を選択し、そして上記選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を回収するステップを含む上記方法に関する。ＤＮＡシャッフリングを、ヌクレオチド・プールの作製方法として重要視する。
Description
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためにヌクレオ
チド配列プールをスクリーニングする方法に関する。
チド配列プールをスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
発明の背景
さまざまな生理活性ペプチド、例えば抗菌酵素、抗腫瘍ペプチド、及び抗菌ペ
プチドは、標的細胞を死滅させる又はその増殖を阻害することが知られている。
それらペプチドのための改良されたスクリーニング方法は、新規生理活性ペプチ
ドの開発のために望ましいものである。
プチドは、標的細胞を死滅させる又はその増殖を阻害することが知られている。
それらペプチドのための改良されたスクリーニング方法は、新規生理活性ペプチ
ドの開発のために望ましいものである。
【０００３】
発明の要約
本発明の目的は、標的細胞を死滅させうる又はその増殖を阻害しうる生理活性
ペプチドをコードする新しい又は改良された現存の遺伝子を同定するための方法
を提供することである。本発明は、上記ペプチドのための自殺発現系（ｓｕｉｃ
ｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＥＳ）を開発した。前記Ｓ
ＥＳの原理は、細胞中でペプチドをコードするライブラリーを産生し、個々のペ
プチドの発現を誘導し、そして前記ペプチド合成の結果としてのそれらの宿主細
胞の死滅させる又は増殖阻害する能力によってペプチド・コード配列を選択／同
定することにある。ペプチド誘導、選択、プラスミド増幅、及び突然変異誘発の
連続する過程は、改良された生理活性を有するペプチドの同定に使用されうる。
しかしながら保護されていない又は足場となるペプチドが、上記方法において、
前記細胞内での消化から前記活性ペプチドを保護するために必要とされる。上記
ペプチドは、例えば本発明中に記載された活性ペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を同定するためではなく、回収、そして前記ペプチドの精製のために必要
とされるであろう。
ペプチドをコードする新しい又は改良された現存の遺伝子を同定するための方法
を提供することである。本発明は、上記ペプチドのための自殺発現系（ｓｕｉｃ
ｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＥＳ）を開発した。前記Ｓ
ＥＳの原理は、細胞中でペプチドをコードするライブラリーを産生し、個々のペ
プチドの発現を誘導し、そして前記ペプチド合成の結果としてのそれらの宿主細
胞の死滅させる又は増殖阻害する能力によってペプチド・コード配列を選択／同
定することにある。ペプチド誘導、選択、プラスミド増幅、及び突然変異誘発の
連続する過程は、改良された生理活性を有するペプチドの同定に使用されうる。
しかしながら保護されていない又は足場となるペプチドが、上記方法において、
前記細胞内での消化から前記活性ペプチドを保護するために必要とされる。上記
ペプチドは、例えば本発明中に記載された活性ペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を同定するためではなく、回収、そして前記ペプチドの精製のために必要
とされるであろう。
【０００４】
したがって、本発明は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するた
めのヌクレオチド配列プールのシークエンス方法であって、以下の： ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基を
もつ酵素又は成熟ペプチドであるペプチドを発現するように、誘導性プロモータ
ーに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラスミドを
結合させ、 ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対し感受性の宿主細胞を形
質転換させ、 ｃ）生きた細胞を選択するように上記の形質転換された宿主細胞をスクリーニ
ングし、 ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、上
記の生きた細胞を培養し、 ｅ）細胞増殖に対する上記誘導物質の効果に従って細胞を選択し、そして ｆ）上記の選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を
回収する、 ことを含む上記方法を提供する。本自殺発現系（ＳＥＳ）の原理は、微生物中の
ペプチド・ライブラリーを作製し、前記個々のペプチドの発現を誘導し、そして
突然のペプチド合成の結果としてそれらが死滅させられる又は激しく増殖阻害さ
れるかどうかによって細胞を選択／同定することにある。
めのヌクレオチド配列プールのシークエンス方法であって、以下の： ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基を
もつ酵素又は成熟ペプチドであるペプチドを発現するように、誘導性プロモータ
ーに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラスミドを
結合させ、 ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対し感受性の宿主細胞を形
質転換させ、 ｃ）生きた細胞を選択するように上記の形質転換された宿主細胞をスクリーニ
ングし、 ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、上
記の生きた細胞を培養し、 ｅ）細胞増殖に対する上記誘導物質の効果に従って細胞を選択し、そして ｆ）上記の選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を
回収する、 ことを含む上記方法を提供する。本自殺発現系（ＳＥＳ）の原理は、微生物中の
ペプチド・ライブラリーを作製し、前記個々のペプチドの発現を誘導し、そして
突然のペプチド合成の結果としてそれらが死滅させられる又は激しく増殖阻害さ
れるかどうかによって細胞を選択／同定することにある。
【０００５】
抗菌活性をコードする新しい遺伝子の同定のために、推定上、抗菌活性を宿す
遺伝子のライブラリーを、関連するプラスミド中にクローニングし、合成を誘導
し、増殖阻害された又は死滅させられた細菌を確認し、そして対応する遺伝子を
シークエンスし、そして分析した。
遺伝子のライブラリーを、関連するプラスミド中にクローニングし、合成を誘導
し、増殖阻害された又は死滅させられた細菌を確認し、そして対応する遺伝子を
シークエンスし、そして分析した。
【０００６】
高められた生理活性を有するペプチドの変異体の同定のために、既存のペプチ
ドの突然変異体ライブラリーを、作製し、そして標的生物中に導入する。（より
少量の誘導物質を徐々に用いる）ペプチド誘導、選択、プラスミド増幅、及びシ
ャッフリング／突然変異誘発の連続する過程は、向上した生理活性を有するペプ
チドの確認を可能にするであろう。
ドの突然変異体ライブラリーを、作製し、そして標的生物中に導入する。（より
少量の誘導物質を徐々に用いる）ペプチド誘導、選択、プラスミド増幅、及びシ
ャッフリング／突然変異誘発の連続する過程は、向上した生理活性を有するペプ
チドの確認を可能にするであろう。
【０００７】
発明の詳細な説明
ペプチド
本発明の方法は、それらの生理活性すなわち標的細胞を死滅させる又はその増
殖を阻害するそれらの能力によりペプチドをスクリーニングするために用いられ
うる。したがって、前記ペプチドは、本来の細胞標的と相互作用／結合／失活さ
せるペプチド化合物でありうる。着目のペプチドは、抗菌酵素又は（１００未満
のアミノ酸残基）短かいペプチド、例えば抗菌ペプチド（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＭＰ）又は抗腫瘍ペプチドでありうる。
殖を阻害するそれらの能力によりペプチドをスクリーニングするために用いられ
うる。したがって、前記ペプチドは、本来の細胞標的と相互作用／結合／失活さ
せるペプチド化合物でありうる。着目のペプチドは、抗菌酵素又は（１００未満
のアミノ酸残基）短かいペプチド、例えば抗菌ペプチド（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＭＰ）又は抗腫瘍ペプチドでありうる。
【０００８】
前記抗菌酵素は、例えばムラミダーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、リパーゼ
、ホスホリパーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ
又はラッカーゼでありうる。あるいは、従来の抗生物質、例えばポリケチド又は
ペニシリンを合成する酵素のコンソーシアムを利用しうる。
、ホスホリパーゼ、キチナーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ
又はラッカーゼでありうる。あるいは、従来の抗生物質、例えばポリケチド又は
ペニシリンを合成する酵素のコンソーシアムを利用しうる。
【０００９】
前記抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、膜活性型抗菌ペプチド又は細胞内標的に作用
／相互作用する、例えば細胞ＤＮＡに結合する抗菌ペプチドでありうる。前記Ａ
ＭＰは、一般的に１００未満のアミノ酸残基、典型的には２０〜８０残基から成
る、比較的短かいペプチドである。前記抗菌ペプチドは、殺菌及び／又は殺真菌
作用をもち、さらに抗ウイルス又は抗腫瘍作用ももちうる。それは、一般的に正
常哺乳類細胞に対してわずかな細胞毒性をもつ。
／相互作用する、例えば細胞ＤＮＡに結合する抗菌ペプチドでありうる。前記Ａ
ＭＰは、一般的に１００未満のアミノ酸残基、典型的には２０〜８０残基から成
る、比較的短かいペプチドである。前記抗菌ペプチドは、殺菌及び／又は殺真菌
作用をもち、さらに抗ウイルス又は抗腫瘍作用ももちうる。それは、一般的に正
常哺乳類細胞に対してわずかな細胞毒性をもつ。
【００１０】
前記抗菌ペプチドは、一般的に高い陽イオン性及び疎水性である。それは、典
型的にはいくつかのアルギニン及びリジンを含み、そして単独のグルタミン酸又
はアスパラギン酸を含みえない。それは、一般的に大部分の疎水性残基を含む。
前記ペプチドは、一般的に高い正電荷をもつ１の表面と他の疎水性表面をもつ両
親媒性構造をもつ。
型的にはいくつかのアルギニン及びリジンを含み、そして単独のグルタミン酸又
はアスパラギン酸を含みえない。それは、一般的に大部分の疎水性残基を含む。
前記ペプチドは、一般的に高い正電荷をもつ１の表面と他の疎水性表面をもつ両
親媒性構造をもつ。
【００１１】
前記生理活性ペプチド及びそれをコードするヌクレオチド配列は、植物、無脊
椎動物、昆虫、両生類及び哺乳類、又は微生物、例えば細菌及び菌類から提供さ
れうる。
椎動物、昆虫、両生類及び哺乳類、又は微生物、例えば細菌及び菌類から提供さ
れうる。
【００１２】
前記抗菌ペプチドは、通常膜に平行した方向で、例えば、膜への非特異的な結
合を通して、標的微生物の細胞膜上に対し作用して、二重膜の一面とだけ相互作
用する。
合を通して、標的微生物の細胞膜上に対し作用して、二重膜の一面とだけ相互作
用する。
【００１３】
前記抗菌ペプチドは、典型的には５つの大分類：αヘリカル、（デフェンシン
（defensin）様）シスチン−リッチ、β−シート、通常のアミノ酸から成り独特
の組成をもつペプチド、及びまれな修飾アミノ酸を含むペプチドの１つに属する
構造をもつ。
（defensin）様）シスチン−リッチ、β−シート、通常のアミノ酸から成り独特
の組成をもつペプチド、及びまれな修飾アミノ酸を含むペプチドの１つに属する
構造をもつ。
【００１４】
アルファ−ヘリカル・ペプチドの例は、マゲイニン（Ｍａｇａｉｎｉｎ）１及
び２；セクロピン（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ａ，Ｂ、及びＰ１；ＣＡＰ１８；アンド
ロピン（Ａｎｄｒｏｐｉｎ）；クラバニン（Ｃｌａｖａｎｉｎ）Ａ及びＡＫ；ス
チエリン（Ｓｔｙｅｌｉｎ）Ｄ及びＣ；並びにブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）II
である。シスチン−リッチ・ペプチドの例は、α−デフェンシン（Ｄｅｆｅｎｓ
ｉｎ）ＨＮＰ−１（ヒト好中球ペプチド）、ＨＮＰ−２、及びＨＮＰ−３；β−
デフェンシン−１２；ドロソマイシン（Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）；γ１−プロチ
オニン（Ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）；並びに昆虫デフェンシンＡである。β−シ
ート・ペプチドの例は、ラクトフェリシン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ）Ｂ；
タチプレシン（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）Ｉ；及びプロテグリン（Ｐｒｏｔｅｇ
ｒｉｎ）ＰＧ１〜５である。独特な構造をもつペプチドの例は、インドリシジン
（Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）；ＰＲ−３９；バクテニシン（Ｂａｃｔｅｎｉｃｉ
ｎ）Ｂａｃ５及びＢａｃ７；並びにヒスタチン（Ｈｉｓｔａｔｉｎ）５である。
独特なアミノ酸をもつペプチドの例は、ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）；グラミシジン
（Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）Ａ；及びアラメチシン（Ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）で
ある。
び２；セクロピン（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ａ，Ｂ、及びＰ１；ＣＡＰ１８；アンド
ロピン（Ａｎｄｒｏｐｉｎ）；クラバニン（Ｃｌａｖａｎｉｎ）Ａ及びＡＫ；ス
チエリン（Ｓｔｙｅｌｉｎ）Ｄ及びＣ；並びにブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）II
である。シスチン−リッチ・ペプチドの例は、α−デフェンシン（Ｄｅｆｅｎｓ
ｉｎ）ＨＮＰ−１（ヒト好中球ペプチド）、ＨＮＰ−２、及びＨＮＰ−３；β−
デフェンシン−１２；ドロソマイシン（Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）；γ１−プロチ
オニン（Ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｉｎ）；並びに昆虫デフェンシンＡである。β−シ
ート・ペプチドの例は、ラクトフェリシン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ）Ｂ；
タチプレシン（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）Ｉ；及びプロテグリン（Ｐｒｏｔｅｇ
ｒｉｎ）ＰＧ１〜５である。独特な構造をもつペプチドの例は、インドリシジン
（Ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）；ＰＲ−３９；バクテニシン（Ｂａｃｔｅｎｉｃｉ
ｎ）Ｂａｃ５及びＢａｃ７；並びにヒスタチン（Ｈｉｓｔａｔｉｎ）５である。
独特なアミノ酸をもつペプチドの例は、ナイシン（Ｎｉｓｉｎ）；グラミシジン
（Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）Ａ；及びアラメチシン（Ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）で
ある。
【００１５】
その他の例は、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇ ｉｇａｎｔｅｕｓ
）からの抗真菌ペプチドである。
【００１６】
好ましい態様において前記発現ペプチドは、いかなる保護性の足場タンパク質
をもたない。
をもたない。
【００１７】
ヌクレオチド配列プール
抗生物質又は抗菌作用物質のような抗菌ペプチドの市販の実用品は、それらの
効能、種特異性、及び固有の条件下での実行能力に依存する。一般的に、これら
の条件は、その条件のもとで上記ペプチドがもともと進化したところの条件とは
かなり異なる。大部分の抗菌ペプチドは、例えば同時に存在する広範囲の異なる
微生物を標的とするために、生理的塩類の範囲の中で働くために、ヒト免疫系を
回避するために又は哺乳類循環系の除去能力に対抗するために進化させられるこ
とはなかった。
効能、種特異性、及び固有の条件下での実行能力に依存する。一般的に、これら
の条件は、その条件のもとで上記ペプチドがもともと進化したところの条件とは
かなり異なる。大部分の抗菌ペプチドは、例えば同時に存在する広範囲の異なる
微生物を標的とするために、生理的塩類の範囲の中で働くために、ヒト免疫系を
回避するために又は哺乳類循環系の除去能力に対抗するために進化させられるこ
とはなかった。
【００１８】
与えられた抗菌ペプチドのために、このジレンマは、前記ペプチドの知識に基
づいた論理的な改変によるか又は前記ペプチドのさらなる進化を誘導し、親配列
の無作為な変異体を生み出し、そしてその後の要求された特性の組合わせが見い
出される突然変異体を選択するかのいずれかにより原理上解決されうる。指示さ
れた進化、すなわち強力な高処理アッセイと組合わされた、特有の望ましい特徴
を備える突然変異タンパク質及びペプチドを生み出すように配列スペースの広大
な領域を調査する反復プロセスは、天然又は改変遺伝子にコードされた抗菌ペプ
チドの大量のライブラリーが要求された特徴をもつ主要な候補物の同定のために
産生され、そして評価されることを可能にする。これらのアプローチは、現在、
活性に基づいた新しいタンパク質を生み出すために前例のない速さで学術機関に
も産業にも等しく幅広く採用されている。
づいた論理的な改変によるか又は前記ペプチドのさらなる進化を誘導し、親配列
の無作為な変異体を生み出し、そしてその後の要求された特性の組合わせが見い
出される突然変異体を選択するかのいずれかにより原理上解決されうる。指示さ
れた進化、すなわち強力な高処理アッセイと組合わされた、特有の望ましい特徴
を備える突然変異タンパク質及びペプチドを生み出すように配列スペースの広大
な領域を調査する反復プロセスは、天然又は改変遺伝子にコードされた抗菌ペプ
チドの大量のライブラリーが要求された特徴をもつ主要な候補物の同定のために
産生され、そして評価されることを可能にする。これらのアプローチは、現在、
活性に基づいた新しいタンパク質を生み出すために前例のない速さで学術機関に
も産業にも等しく幅広く採用されている。
【００１９】
前記生理活性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、上述の源生物の中の
１からの染色体ＤＮＡから得ることができ、及び／又は化学的に合成されること
ができる。前記ヌクレオチド配列は、上記ソース生物由来のｃＤＮＡであること
もできる。
１からの染色体ＤＮＡから得ることができ、及び／又は化学的に合成されること
ができる。前記ヌクレオチド配列は、上記ソース生物由来のｃＤＮＡであること
もできる。
【００２０】
本発明のシークエンス方法は、向上した生理活性を有するペプチドの開発に使
用されうる。したがって、生理活性ペプチドをコードする既知の遺伝子から出発
するとき、ＤＮＡプールは、例えば突然変異ライブラリー作製のための無作為突
然変異誘発により、遺伝子シャッフリングにより、又は変性遺伝子の合成により
得ることができる。
用されうる。したがって、生理活性ペプチドをコードする既知の遺伝子から出発
するとき、ＤＮＡプールは、例えば突然変異ライブラリー作製のための無作為突
然変異誘発により、遺伝子シャッフリングにより、又は変性遺伝子の合成により
得ることができる。
【００２１】
シャッフルされる配列は、異なる生物からの関連の配列（いわゆる、“ファミ
リー・シャッフリング”）でありえ又はそれらは、親配列及びそれらの変異体を
含みうる。
リー・シャッフリング”）でありえ又はそれらは、親配列及びそれらの変異体を
含みうる。
【００２２】
本発明の好ましい態様において無作為突然変異誘発は、例えば、Stemmer (Ste
mmer, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747-10751; Stemmer, 1994.
Nature 370: 389-391)及びCrameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology
15: 436-438に記載されたインビトロにおける相同性ＤＮＡのシャッフリングに
より達成される（これらの全てを援用する）。
mmer, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10747-10751; Stemmer, 1994.
Nature 370: 389-391)及びCrameri, A., et al., 1997. Nature Biotechnology
15: 436-438に記載されたインビトロにおける相同性ＤＮＡのシャッフリングに
より達成される（これらの全てを援用する）。
【００２３】
前記方法は、インビトロにおけるＰＣＲ技術を用いることによる相同性ＤＮＡ
配列シャッフリングに関する。シャッフルしたＤＮＡ配列を含む活性組換え遺伝
子は、前記発現タンパク質の向上した作用に基づいたＤＮＡライブラリーから選
ばれる。
配列シャッフリングに関する。シャッフルしたＤＮＡ配列を含む活性組換え遺伝
子は、前記発現タンパク質の向上した作用に基づいたＤＮＡライブラリーから選
ばれる。
【００２４】
先の方法は、相同性ＤＮＡ配列のシャッフリング方法に関して本明細書に援用
されるＷＯ９５／２２６２５にも記載される。前記方法の１つの重要なステップ
は、前記相同性鋳型二重鎖ポリヌクレオチドを要求されるサイズの無作為断片に
切断することであり、その後に上記断片を全長遺伝子に相同的に再会合させる。
されるＷＯ９５／２２６２５にも記載される。前記方法の１つの重要なステップ
は、前記相同性鋳型二重鎖ポリヌクレオチドを要求されるサイズの無作為断片に
切断することであり、その後に上記断片を全長遺伝子に相同的に再会合させる。
【００２５】
他の好ましい態様において無作為突然変異誘発は、組換えられた相同性ポリヌ
クレオチドのライブラリーがインビトロＤＮＡ合成の間に誘発された鋳型シフト
によりいくつかの異なる入力鋳型ＤＮＡ及びプライマーから構築されるＤＮＡシ
ャッフリングの方法を記載し、ＷＯ９８／４１６５３（本明細書に援用される）
に記載される方法により達成される。この点で特に、同じくＷＯ９８／４１６５
３に記載される、ＤＮＡ合成の間に誘発した鋳型シフトを通してのこのインビト
ロ組換えの特別なバーションは、好ましい。ここで短かい（＞５ヌクレオチド）
ランダムＤＮＡプライマーは、併合される突然変異ＤＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成
の無作為な開始に利用される。
クレオチドのライブラリーがインビトロＤＮＡ合成の間に誘発された鋳型シフト
によりいくつかの異なる入力鋳型ＤＮＡ及びプライマーから構築されるＤＮＡシ
ャッフリングの方法を記載し、ＷＯ９８／４１６５３（本明細書に援用される）
に記載される方法により達成される。この点で特に、同じくＷＯ９８／４１６５
３に記載される、ＤＮＡ合成の間に誘発した鋳型シフトを通してのこのインビト
ロ組換えの特別なバーションは、好ましい。ここで短かい（＞５ヌクレオチド）
ランダムＤＮＡプライマーは、併合される突然変異ＤＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成
の無作為な開始に利用される。
【００２６】
前記小さなサイズの抗菌ペプチドをコードする前記遺伝子のために、配列多様
性の作製及び併合するそれぞれの上記方法を用いる場合、特別な注意が企図され
る。大部分のシャッフリング方法は、十分な数の同一塩基対（２０〜１００塩基
対）が組換えられる変異に隣接することに依存するため、短かい遺伝子における
変異は、先に記載した方法により併合することは技術的に難かしい。
性の作製及び併合するそれぞれの上記方法を用いる場合、特別な注意が企図され
る。大部分のシャッフリング方法は、十分な数の同一塩基対（２０〜１００塩基
対）が組換えられる変異に隣接することに依存するため、短かい遺伝子における
変異は、先に記載した方法により併合することは技術的に難かしい。
【００２７】
したがって、誘導される進化の他の形態が、短かい遺伝子に適用される。約５
０未満のアミノ酸与えられたペプチドの変異体の併合を含む好ましい態様におい
て、全ての前記要求される変異体を宿す１つの縮重ＤＮＡプライマーが、合成さ
れるであろう。この縮重プライマー中の与えられた位置において、野生型ヌクレ
オチドに加えて変異ヌクレオチドがともに存在するはずである。野生型から変異
ヌクレオチドへの変異の頻度は、企図される至適な状態に調節されうる；法則及
び考慮すべきことは、本技術分野で知られる。全ての要求される突然変異体を１
つのプライマー中に含むことにより、前記要求された配列を、完全にサンプリン
グすることができた。この方法は、それらが最初の遺伝子配列にどれだけ類似し
ているかにかかわらず全ての要求される突然変異体のサンプリング及び併合を可
能にする。
０未満のアミノ酸与えられたペプチドの変異体の併合を含む好ましい態様におい
て、全ての前記要求される変異体を宿す１つの縮重ＤＮＡプライマーが、合成さ
れるであろう。この縮重プライマー中の与えられた位置において、野生型ヌクレ
オチドに加えて変異ヌクレオチドがともに存在するはずである。野生型から変異
ヌクレオチドへの変異の頻度は、企図される至適な状態に調節されうる；法則及
び考慮すべきことは、本技術分野で知られる。全ての要求される突然変異体を１
つのプライマー中に含むことにより、前記要求された配列を、完全にサンプリン
グすることができた。この方法は、それらが最初の遺伝子配列にどれだけ類似し
ているかにかかわらず全ての要求される突然変異体のサンプリング及び併合を可
能にする。
【００２８】
約５０を超えるアミノ酸をもつペプチドが使用される場合、２つ以上の独立、
及び縮重プライマーが使用されるであろう。これは、約１８０〜２００未満のヌ
クレオチドＤＮＡプライマーだけが常に合成されうるという、ＤＮＡプライマー
合成のときに経験した制約によるものである。
及び縮重プライマーが使用されるであろう。これは、約１８０〜２００未満のヌ
クレオチドＤＮＡプライマーだけが常に合成されうるという、ＤＮＡプライマー
合成のときに経験した制約によるものである。
【００２９】
約５０を超えるアミノ酸からなるペプチドが使用される他の態様において、併
合される前記配列多様性（前記個々の変異体）を、２０〜３０塩基対の長さの短
かいオリゴヌクレオチド中に個別に宿しうる。このアプローチにおいて、特異的
なオリゴＤＮＡは、前記ライブラリーに含まれるであろうそれぞれの突然変異に
使用される。前記突然変異は、アニーリングを最適化するために優先的に前記短
かいオリゴＤＮＡの中央に位置するべきである。この増幅の主力として野生型ペ
プチド遺伝子を用いるＰＣＲ反応において、いくつかの又は多くのこれら短かい
オリゴＤＮＡをスパイキングすることは、前記要求される突然変異体の併合を可
能にするであろう。併合される前記個々のオリゴＤＮＡの量を変えることにより
、野生型に対する個々の変異体の要求される割合が作り出されうる。前記配列の
両端約１０塩基対がミスマッチであることが要求されるので、この方法は、すぐ
近くに隣接する突然変異体と効率的に併合できない。
合される前記配列多様性（前記個々の変異体）を、２０〜３０塩基対の長さの短
かいオリゴヌクレオチド中に個別に宿しうる。このアプローチにおいて、特異的
なオリゴＤＮＡは、前記ライブラリーに含まれるであろうそれぞれの突然変異に
使用される。前記突然変異は、アニーリングを最適化するために優先的に前記短
かいオリゴＤＮＡの中央に位置するべきである。この増幅の主力として野生型ペ
プチド遺伝子を用いるＰＣＲ反応において、いくつかの又は多くのこれら短かい
オリゴＤＮＡをスパイキングすることは、前記要求される突然変異体の併合を可
能にするであろう。併合される前記個々のオリゴＤＮＡの量を変えることにより
、野生型に対する個々の変異体の要求される割合が作り出されうる。前記配列の
両端約１０塩基対がミスマッチであることが要求されるので、この方法は、すぐ
近くに隣接する突然変異体と効率的に併合できない。
【００３０】
前記自殺発現系は、存在し、そしてすでに特徴づけされたペプチドの向上した
変異体の確認にとどまらない。与えられた宿主細胞の増殖に作用するペプチドを
コードする新しい遺伝子をも確認しうる。ｃＤＮＡ又は無作為に発現させた全染
色体ＤＮＡ断片のライブラリーは、前記自殺発現系の中で出発物質として使用さ
れ、そしてクローニングされうる。
変異体の確認にとどまらない。与えられた宿主細胞の増殖に作用するペプチドを
コードする新しい遺伝子をも確認しうる。ｃＤＮＡ又は無作為に発現させた全染
色体ＤＮＡ断片のライブラリーは、前記自殺発現系の中で出発物質として使用さ
れ、そしてクローニングされうる。
【００３１】
宿主細胞
前記宿主細胞は、ペプチド、酵素又は着目の二次代謝産物に対し感受性でなく
てはならない。
てはならない。
【００３２】
したがって、抗菌ペプチド又は抗菌酵素に関するスクリーニングの場合、前記
宿主細胞は、細菌、例えばエッシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．ズブ
チリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）であ
ることができ又は真菌細胞、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）といった糸状菌又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又は
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）といった酵母であることができる。前記抗菌ペプ
チドをそれに対し用いることが意図されているところの標的微生物に関係した宿
主細胞を使用することは、好ましい。
宿主細胞は、細菌、例えばエッシェリシア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．ズブ
チリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）といったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）であ
ることができ又は真菌細胞、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）といった糸状菌又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又は
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）といった酵母であることができる。前記抗菌ペプ
チドをそれに対し用いることが意図されているところの標的微生物に関係した宿
主細胞を使用することは、好ましい。
【００３３】
抗腫瘍ペプチドに関するスクリーニングの場合、前記宿主細胞は、好ましくは
哺乳類細胞、特に腫瘍細胞である。
哺乳類細胞、特に腫瘍細胞である。
【００３４】
前記宿主細胞は、好ましくはそれらを代謝又は分解することなく、前記誘導物
質を膜を横切って輸送できることが望ましい。これは、誘導物質レベルが前記細
胞の内側で一定であり、そして時間の経過により減少しないので発現試験として
有利である。これは、「無償性（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ）」誘導物質を選ぶか又
は前記誘導物質の代謝に必要な１つ以上の遺伝子の欠失により達成されうる。
質を膜を横切って輸送できることが望ましい。これは、誘導物質レベルが前記細
胞の内側で一定であり、そして時間の経過により減少しないので発現試験として
有利である。これは、「無償性（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ）」誘導物質を選ぶか又
は前記誘導物質の代謝に必要な１つ以上の遺伝子の欠失により達成されうる。
【００３５】
前記宿主細胞は、前記抗菌ペプチドを発現できるようにするために選ばれなく
てはならない。したがって、真菌細胞は、ジスルフィド架橋をもつペプチド、例
えば先に触れたシスチン・リッチなペプチドに好ましい。
てはならない。したがって、真菌細胞は、ジスルフィド架橋をもつペプチド、例
えば先に触れたシスチン・リッチなペプチドに好ましい。
【００３６】
プラスミド
前記プラスミドは、前記宿主生物中で複製可能であり、そして前記誘導性プロ
モーターの調節下で前記生理活性ペプチド（及び場合によりシグナル・ペプチド
）を発現できなくてはならない。それは一般に選択可能なマーカー、例えば抗生
物質マーカーを含むであろう。多くの前記プラスミドは、本技術分野で知られて
いる。
モーターの調節下で前記生理活性ペプチド（及び場合によりシグナル・ペプチド
）を発現できなくてはならない。それは一般に選択可能なマーカー、例えば抗生
物質マーカーを含むであろう。多くの前記プラスミドは、本技術分野で知られて
いる。
【００３７】
ライゲーション
場合によりシグナル・ペプチドに連結された着目のペプチドを発現するように
、誘導性プロモーターに作用可能な状態で連結された前記ヌクレオチド配列プー
ルと、プラスミドを結合させる。前記着目の短かいペプチド又は酵素は、いかな
る伸長（前記付加的なシグナル・ペプチド以外）なしに又は例えば１〜５アミノ
酸の短かい伸長をともなって発現されうる。融合タンパク質の形態における発現
は、好ましくないし必要でもない。
、誘導性プロモーターに作用可能な状態で連結された前記ヌクレオチド配列プー
ルと、プラスミドを結合させる。前記着目の短かいペプチド又は酵素は、いかな
る伸長（前記付加的なシグナル・ペプチド以外）なしに又は例えば１〜５アミノ
酸の短かい伸長をともなって発現されうる。融合タンパク質の形態における発現
は、好ましくないし必要でもない。
【００３８】
誘導性プロモーター及び誘動（発）物質
本発明に従って使用されるプラスミドは、前記ペプチドをコードする挿入され
たヌクレオチド配列の発現を調節する誘導性プロモーターを含まなくてはならな
い。それが前記コードされた生理活性ペプチドの合成の完全な停止を可能にする
ことは、前記ＳＥＳの適用に有利である。さらに、ペプチドは微生物の細胞質中
で本来不安定で、そして容易に分解されるため、前記コードされた生理活性ペプ
チドの誘導は、有意でなくてはならない。本実施例の中で使用される誘導性プロ
モーターは、２つのタンパク質により正と負の両方に調節される。誘導物質の存
在下において、前記プロモーターからの発現は、開始され、誘導物質の不存在の
間も前記プロモーターからのひじょうに低いレベルの発現が起こる。非誘導レベ
ルは、二次代謝産物の存在中における増殖によりなおいっそう抑えられる。前記
２つの調節物質の活性を変えることにより、タンパク質の発現レベルは、潜在的
毒性又は本来の遺伝子について至適な発現に操作されうる。
たヌクレオチド配列の発現を調節する誘導性プロモーターを含まなくてはならな
い。それが前記コードされた生理活性ペプチドの合成の完全な停止を可能にする
ことは、前記ＳＥＳの適用に有利である。さらに、ペプチドは微生物の細胞質中
で本来不安定で、そして容易に分解されるため、前記コードされた生理活性ペプ
チドの誘導は、有意でなくてはならない。本実施例の中で使用される誘導性プロ
モーターは、２つのタンパク質により正と負の両方に調節される。誘導物質の存
在下において、前記プロモーターからの発現は、開始され、誘導物質の不存在の
間も前記プロモーターからのひじょうに低いレベルの発現が起こる。非誘導レベ
ルは、二次代謝産物の存在中における増殖によりなおいっそう抑えられる。前記
２つの調節物質の活性を変えることにより、タンパク質の発現レベルは、潜在的
毒性又は本来の遺伝子について至適な発現に操作されうる。
【００３９】
前記プロモーターは、ラクトース誘導物質の存在により調節されるか又は合成
非消化性ラクトース誘導体ＩＰＴＧにより調節される、Taguchi S., Nakagawa K
., Maeno M. and Momose H.; "In Vivo Monitoring System for Structure-Func
tion Relationship Analysis of the antibacterial peptide Apidaecin"; Appl
ied and Environmental Microbiology, 1994, pp.3566-3572、の中に記載される
Ｌａｃプロモーターでありうる。他の誘導性プロモーターは、本技術分野で知ら
れる、例えばトリプトファンにより誘導されるｔｒｐプロモーター又はガラクト
ースにより誘導されるＥ．ｃｏｌｉのｇａｌプロモーター、Ｓ．セレビシエのｇ
ａｌｌプロモーター、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
のＡＯＸ１プロモーター、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｐＭＴ（メ
タロチオネイン）プロモーター、哺乳類の発現に関するＭＭＴＶ ＬＴＲ，ｐＶ
ｇＲＸＲ又はｐＩＮＤプロモーターである。前記細胞内で代謝又は消化されない
誘導物質を使用することは、前記誘導物質濃度が前記スクリーニング工程を通し
て一定に保たれうるという利点を与える。しかしながら、前記Ｌａｃプロモータ
ーの欠点は、前記誘導物質の不存在によりそれを完全に停止できないことである
。前記プロモーターは、本実施例において用いたｐＢＡＤプロモーターでもある
（以下を参照のこと）。このプロモーターは、とりわけ分解性アラビノース誘導
物質により誘導される。しかしながら先に言及した一定レベルの誘導物質をもつ
利点を達成するために、アラビノースを消化する宿主細胞の能力を、前記宿主細
胞染色体から好適な遺伝子（遺伝子型の記載は、本実施例中に見い出されうる）
を欠失することにより除くことができた。しかしながら好適なプロモーターの選
択に関する重要な配慮は、前記対応している誘導物質が前記プロモーターへの接
近をもたらすために前記細胞膜を透過することが可能であることが望ましいとい
ったことである。
非消化性ラクトース誘導体ＩＰＴＧにより調節される、Taguchi S., Nakagawa K
., Maeno M. and Momose H.; "In Vivo Monitoring System for Structure-Func
tion Relationship Analysis of the antibacterial peptide Apidaecin"; Appl
ied and Environmental Microbiology, 1994, pp.3566-3572、の中に記載される
Ｌａｃプロモーターでありうる。他の誘導性プロモーターは、本技術分野で知ら
れる、例えばトリプトファンにより誘導されるｔｒｐプロモーター又はガラクト
ースにより誘導されるＥ．ｃｏｌｉのｇａｌプロモーター、Ｓ．セレビシエのｇ
ａｌｌプロモーター、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
のＡＯＸ１プロモーター、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｐＭＴ（メ
タロチオネイン）プロモーター、哺乳類の発現に関するＭＭＴＶ ＬＴＲ，ｐＶ
ｇＲＸＲ又はｐＩＮＤプロモーターである。前記細胞内で代謝又は消化されない
誘導物質を使用することは、前記誘導物質濃度が前記スクリーニング工程を通し
て一定に保たれうるという利点を与える。しかしながら、前記Ｌａｃプロモータ
ーの欠点は、前記誘導物質の不存在によりそれを完全に停止できないことである
。前記プロモーターは、本実施例において用いたｐＢＡＤプロモーターでもある
（以下を参照のこと）。このプロモーターは、とりわけ分解性アラビノース誘導
物質により誘導される。しかしながら先に言及した一定レベルの誘導物質をもつ
利点を達成するために、アラビノースを消化する宿主細胞の能力を、前記宿主細
胞染色体から好適な遺伝子（遺伝子型の記載は、本実施例中に見い出されうる）
を欠失することにより除くことができた。しかしながら好適なプロモーターの選
択に関する重要な配慮は、前記対応している誘導物質が前記プロモーターへの接
近をもたらすために前記細胞膜を透過することが可能であることが望ましいとい
ったことである。
【００４０】
前記ｐＢＡＤプロモーターは、ＡｒａＣ及びｃＡＭＰ−ＣＲＰの２つのタンパ
ク質により正及び負の両方に調節される。アラビノースの存在下において、前記
プロモーターからの発現が、開始され、しかし一方では、アラビノースの不存在
の間にも、ひじょうに低いレベルの発現が前記プロモーターから起こっている。
ク質により正及び負の両方に調節される。アラビノースの存在下において、前記
プロモーターからの発現が、開始され、しかし一方では、アラビノースの不存在
の間にも、ひじょうに低いレベルの発現が前記プロモーターから起こっている。
【００４１】
非誘導レベルは、グルコース存在中における増殖によりなおいっそう抑えられ
る。ｐＢＡＤのプロモーター領域へのｃＡＭＰ−ＣＲＰの結合が同様に減少する
、ｃＡＭＰレベルの低下にグルコースが働く。ｃＡＭＰレベルが下げられるとき
、転写活性は減らされる。着目のペプチドが前記宿主に対し過度に増殖阻害性又
は毒性である場合、これは理想的である。要するに、前記２つの調節物質の活性
を変えることにより、タンパク質の発現レベルは、潜在的毒性又は本来の遺伝子
の発現を最適化するために操作されうる。
る。ｐＢＡＤのプロモーター領域へのｃＡＭＰ−ＣＲＰの結合が同様に減少する
、ｃＡＭＰレベルの低下にグルコースが働く。ｃＡＭＰレベルが下げられるとき
、転写活性は減らされる。着目のペプチドが前記宿主に対し過度に増殖阻害性又
は毒性である場合、これは理想的である。要するに、前記２つの調節物質の活性
を変えることにより、タンパク質の発現レベルは、潜在的毒性又は本来の遺伝子
の発現を最適化するために操作されうる。
【００４２】
シグナル・ペプチド
シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、前記生理活性ペプチドが上記
シグナル・ペプチドを結合したものとともに発現されるように、場合によりプラ
スミドの前記誘導性プロモーターの下流、かつ、上記生理活性ペプチドをコード
する配列の上流に挿入されうる。与えられた宿主細胞に関して好適なシグナル・
ペプチドは、本技術分野の原則に従って選ばれうる。
シグナル・ペプチドを結合したものとともに発現されるように、場合によりプラ
スミドの前記誘導性プロモーターの下流、かつ、上記生理活性ペプチドをコード
する配列の上流に挿入されうる。与えられた宿主細胞に関して好適なシグナル・
ペプチドは、本技術分野の原則に従って選ばれうる。
【００４３】
一般的に、着目のペプチドは、まず最初に前記標的細胞を外側から攻撃又は浸
透するので、多くの場合前記ＳＥＳの成功には当該ペプチドが前記細胞の外へ搬
出されることが求められる。一般的に、生理活性ペプチドは、細胞膜を通り抜け
て、例えばグラム陰性原核生物の場合には細胞周辺腔に分泌され、そしてそこか
らその細胞標的、例えば細胞膜、膜成分若しくは細胞周辺腔との相互作用が又は
外側の細胞膜を通り抜けてさらに拡散することが可能になる。
透するので、多くの場合前記ＳＥＳの成功には当該ペプチドが前記細胞の外へ搬
出されることが求められる。一般的に、生理活性ペプチドは、細胞膜を通り抜け
て、例えばグラム陰性原核生物の場合には細胞周辺腔に分泌され、そしてそこか
らその細胞標的、例えば細胞膜、膜成分若しくは細胞周辺腔との相互作用が又は
外側の細胞膜を通り抜けてさらに拡散することが可能になる。
【００４４】
着目のペプチドが細胞内に発現されそして保持されるときにその作用を発揮し
うる場合、例えば前記細胞のＤＮＡに結合するペプチド又は膜透過能力に依存し
ないペプチド又は細胞内標的をもつペプチドの場合、シグナル・ペプチドは省か
れうる。１つの例は、前記文献において相互作用すること及び核酸を隔離するこ
とが示唆される、プロリン−アルギニン・リッチ・ペプチド・ファミリーである
Ｂａｃ５，Ｂａｃ７、及びＰＲ３９である。
うる場合、例えば前記細胞のＤＮＡに結合するペプチド又は膜透過能力に依存し
ないペプチド又は細胞内標的をもつペプチドの場合、シグナル・ペプチドは省か
れうる。１つの例は、前記文献において相互作用すること及び核酸を隔離するこ
とが示唆される、プロリン−アルギニン・リッチ・ペプチド・ファミリーである
Ｂａｃ５，Ｂａｃ７、及びＰＲ３９である。
【００４５】
スクリーニング工程
上述のように、本発明は、標的微生物の細胞膜、細胞壁又はＤＮＡに作用する
抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためにヌクレオチド配列
プールをスクリーニングする方法であって、以下の： （ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基
をもつ酵素又は突然変異ペプチドであるペプチドを発現するように、誘導性プロ
モーターに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラス
ミドを結合させ、 （ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対して感受性である宿主
細胞を形質転換させ、 （ｃ）生きた細胞を選択するように上記の形質転換された宿主細胞をスクリー
ニングし、 （ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、
上記の生きた細胞を培養し、 （ｅ）細胞増殖に対する上記誘導物質の効果に従って細胞を選択し、そして （ｆ）上記の選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列
を回収する、 ステップを含む上記方法に関する。
抗菌ペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためにヌクレオチド配列
プールをスクリーニングする方法であって、以下の： （ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基
をもつ酵素又は突然変異ペプチドであるペプチドを発現するように、誘導性プロ
モーターに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラス
ミドを結合させ、 （ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対して感受性である宿主
細胞を形質転換させ、 （ｃ）生きた細胞を選択するように上記の形質転換された宿主細胞をスクリー
ニングし、 （ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、
上記の生きた細胞を培養し、 （ｅ）細胞増殖に対する上記誘導物質の効果に従って細胞を選択し、そして （ｆ）上記の選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列
を回収する、 ステップを含む上記方法に関する。
【００４６】
前記スクリーニング工程のステップ（ａ）に先立って特定の準備ステップを必
要とする。宿主には、殺菌する及び／又は増殖阻害するペプチドが発見されるこ
とが求められ、そしてその宿主に適合した好適なプラスミドが選択されることが
望ましい。ヌクレオチド配列、例えば既知の抗菌ペプチドをコードする既知の配
列の突然変異により提供されたヌクレオチド配列プールは、先に記載されたよう
に慣例の方法により準備されることが望ましい。
要とする。宿主には、殺菌する及び／又は増殖阻害するペプチドが発見されるこ
とが求められ、そしてその宿主に適合した好適なプラスミドが選択されることが
望ましい。ヌクレオチド配列、例えば既知の抗菌ペプチドをコードする既知の配
列の突然変異により提供されたヌクレオチド配列プールは、先に記載されたよう
に慣例の方法により準備されることが望ましい。
【００４７】
ステップ（ａ）において前記ライブラリーは、慣例の方法により好適なプラス
ミドに連結され、そして前記宿主細胞培養の中に形質転換される（ステップ（ｂ
））。
ミドに連結され、そして前記宿主細胞培養の中に形質転換される（ステップ（ｂ
））。
【００４８】
ステップ（ｃ）は、前記形質転換工程のために、その間に死滅させられた及び
／又は増殖阻害されるようになった細胞から生細胞を分離する、最初のスクリー
ニング又は選択ステップである。このステップは、重要なステップである、なぜ
ならスクリーニング・ステップの最終的な目的は、抗菌ペプチドを産生する挿入
ヌクレオチド配列の誘導された発現により死滅させられた及び／又は増殖阻害さ
れた細胞を識別することであるからである。前記抗菌ペプチドによらずに前記ス
クリーニング工程などの前に死滅及び／又は阻害が起きた細胞は、それらが前記
生細胞から分離されなかった場合、前記スクリーニングにおいて誤った活性応答
を生じるであろう。ステップ（ｄ）において誘導物質が、前記挿入プラスミド中
に包含された、前記ライブラリーからのヌクレオチド配列の発現を誘導するため
に培養された前記生細胞に導入される。前記ペプチドは、転写により産生される
ため、前記宿主細胞は、上記ペプチドが上記宿主に対して抗菌作用を有するとき
死滅させられるか及び／又は増殖阻害されるであろう。好ましい態様において死
滅させられた及び／又は増殖阻害された宿主細胞が選択される。死滅させられた
及び／又は増殖阻害された宿主細胞の選択により、抗菌活性を有するペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む細胞が単離されうる。段階的な応答を達成し
、そして異なる抗菌作用又は効果を固定するために、もう１レベル高い誘発物質
濃度が平行して使用されうる。ステップ（ｅ）において死滅させられる及び／又
は増殖阻害されるようになる宿主細胞は、選択されそして上記宿主細胞の形質転
換の形で挿入されたプラスミド・ヌクレオチド配列から発現されるペプチドによ
り影響をうけない宿主細胞から分離される。それは、例えば低濃度の誘導物質に
より影響されるペプチドの誘導された発現により強く影響をうける細胞のみを選
択するか又はスクリーニング及び／又はヌクレオチド配列プール若しくはライブ
ラリーに関する存在する知識の意図される範囲に依存して、全ての影響された細
胞を選択しうる。
／又は増殖阻害されるようになった細胞から生細胞を分離する、最初のスクリー
ニング又は選択ステップである。このステップは、重要なステップである、なぜ
ならスクリーニング・ステップの最終的な目的は、抗菌ペプチドを産生する挿入
ヌクレオチド配列の誘導された発現により死滅させられた及び／又は増殖阻害さ
れた細胞を識別することであるからである。前記抗菌ペプチドによらずに前記ス
クリーニング工程などの前に死滅及び／又は阻害が起きた細胞は、それらが前記
生細胞から分離されなかった場合、前記スクリーニングにおいて誤った活性応答
を生じるであろう。ステップ（ｄ）において誘導物質が、前記挿入プラスミド中
に包含された、前記ライブラリーからのヌクレオチド配列の発現を誘導するため
に培養された前記生細胞に導入される。前記ペプチドは、転写により産生される
ため、前記宿主細胞は、上記ペプチドが上記宿主に対して抗菌作用を有するとき
死滅させられるか及び／又は増殖阻害されるであろう。好ましい態様において死
滅させられた及び／又は増殖阻害された宿主細胞が選択される。死滅させられた
及び／又は増殖阻害された宿主細胞の選択により、抗菌活性を有するペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む細胞が単離されうる。段階的な応答を達成し
、そして異なる抗菌作用又は効果を固定するために、もう１レベル高い誘発物質
濃度が平行して使用されうる。ステップ（ｅ）において死滅させられる及び／又
は増殖阻害されるようになる宿主細胞は、選択されそして上記宿主細胞の形質転
換の形で挿入されたプラスミド・ヌクレオチド配列から発現されるペプチドによ
り影響をうけない宿主細胞から分離される。それは、例えば低濃度の誘導物質に
より影響されるペプチドの誘導された発現により強く影響をうける細胞のみを選
択するか又はスクリーニング及び／又はヌクレオチド配列プール若しくはライブ
ラリーに関する存在する知識の意図される範囲に依存して、全ての影響された細
胞を選択しうる。
【００４９】
細胞を選択する規準は、それぞれに選ばれうる、例えば最大誘導物質濃度は、
この誘導物質濃度より低い誘導物質の存在により影響をうける細胞のみを選択す
るために定められ、さらに／又は形質転換した宿主細胞のレプリカに対する誘導
物質の段階的に低下する濃度を用いた減少したレベルの転写誘導は、上昇した生
理活性を有するペプチドの単離を可能にするであろう（図４）。
この誘導物質濃度より低い誘導物質の存在により影響をうける細胞のみを選択す
るために定められ、さらに／又は形質転換した宿主細胞のレプリカに対する誘導
物質の段階的に低下する濃度を用いた減少したレベルの転写誘導は、上昇した生
理活性を有するペプチドの単離を可能にするであろう（図４）。
【００５０】
前記挿入されたヌクレオチド配列は、生理活性ペプチドをコードしているとし
て同定された前記選択された宿主細胞から慣例の方法により回収されうる。前記
ヌクレオチド配列は、慣例の方法、例えばＰＣＲ増幅により増幅されうる。ここ
から確認され、そして増幅されたヌクレオチド配列は、産生宿主中に挿入され、
そして確認されたものと一致するペプチドは、ペプチドが上記宿主細胞により後
に搬出されうるより大きなポリペプチドへの融合を通して発現される既知の方法
に従って大量に産生されうる。上記ポリペプチドは、着目のペプチドを前記細胞
内での消化及び前記宿主細胞酵素によるその不活性から保護し、並びに／又は上
記宿主細胞が発現されたペプチド及び前記ペプチドが上記ポリペプチドの中に組
込まれなかった場合に起こるであろう作用により強い影響を受けることなく増殖
及び上記ペプチドの発現を続けられるように上記宿主細胞内において上記ペプチ
ドの作用を下げる機能をもつ。前記ペプチドをコードする確認された、そして増
幅されたヌクレオチド配列は、先に記載されたように、例えば無作為突然変異誘
発により、遺伝子シャッフリングにより又は縮重遺伝子の合成によっても突然変
異されうる。これらの新しく突然変異させたヌクレオチド配列は、次に改良され
た作用を有する新規ペプチドをコードするヌクレオチド配列を確認するために、
ステップ（ａ）から（ｆ）に従って、例えば後のスクリーニングにおいて誘発物
質濃度を低くすることにより再びスクリーニングされうる。
て同定された前記選択された宿主細胞から慣例の方法により回収されうる。前記
ヌクレオチド配列は、慣例の方法、例えばＰＣＲ増幅により増幅されうる。ここ
から確認され、そして増幅されたヌクレオチド配列は、産生宿主中に挿入され、
そして確認されたものと一致するペプチドは、ペプチドが上記宿主細胞により後
に搬出されうるより大きなポリペプチドへの融合を通して発現される既知の方法
に従って大量に産生されうる。上記ポリペプチドは、着目のペプチドを前記細胞
内での消化及び前記宿主細胞酵素によるその不活性から保護し、並びに／又は上
記宿主細胞が発現されたペプチド及び前記ペプチドが上記ポリペプチドの中に組
込まれなかった場合に起こるであろう作用により強い影響を受けることなく増殖
及び上記ペプチドの発現を続けられるように上記宿主細胞内において上記ペプチ
ドの作用を下げる機能をもつ。前記ペプチドをコードする確認された、そして増
幅されたヌクレオチド配列は、先に記載されたように、例えば無作為突然変異誘
発により、遺伝子シャッフリングにより又は縮重遺伝子の合成によっても突然変
異されうる。これらの新しく突然変異させたヌクレオチド配列は、次に改良され
た作用を有する新規ペプチドをコードするヌクレオチド配列を確認するために、
ステップ（ａ）から（ｆ）に従って、例えば後のスクリーニングにおいて誘発物
質濃度を低くすることにより再びスクリーニングされうる。
【００５１】
前記スクリーニング又は分離工程は、特定の態様において、前記形質転換宿主
細胞を栄養培地及び場合により抗生物質を含むプレート上にストリークするため
に慣例のプレート・アッセイの利用により実施される。前記形質転換プラスミド
が上記抗生物質に対し抵抗するための遺伝子を含む場合、非形質転換宿主細胞は
、上記培地上で死滅し、一方形質転換した宿主細胞は生き残るであろう。次に前
もって決定された時間前記プレートをインキュベートし、形質転換宿主細胞のコ
ロニー形成を可能にし、そしてこれらのプレートから細胞サンプルを発現及び挿
入プラスミドの中に含まれるペプチドの産生を誘導する誘導物質をさらに含む他
のプレートに移し取る。形質転換宿主細胞がこの環境において増殖しつづけ、そ
して正常なコロニーを形成する場合、発現された及び産生されたペプチドは前記
宿主細胞を死滅させない及び／又は阻害しないことが推定されうる。一方前記宿
主細胞が全くコロニーを形成しない又は正常な増殖に比べコロニーが減少した場
合、誘導されたペプチドが上記宿主細胞に対して抗菌作用を有することは、明ら
かである。慣例のアガロース・プレートのためのスクリーニング戦略の記述は、
図２に与えられる。しかしながら、プレート・アッセイは、時間の浪費と長い手
順を含む、そしてさらに好ましい態様において前記スクリーニング又は分離工程
は、本技術分野で述べられるマイクロタイター・アッセイにおいて実施される。
この種のアッセイにおいて前記液体宿主細胞培養は、マイクロタイター・プレー
トの各ウェルに異なる挿入ヌクレオチド配列を含む単独又はほんの数個の細胞が
配置されるか又はそうでなければ、調べられた１つだけ又は数個のヌクレオチド
配列が各ウェルに含まれることが保証されている（例えば同じ挿入ヌクレオチド
配列を含む多数の宿主細胞である）。各ウェルの宿主細胞は、栄養培地の添加に
より培養されうる、そして上記マイクロタイター・プレートの複写又は複製が、
付加的なテスト・プレートへの副次標本の移動により準備されうる。誘導物質を
含む培地を、次に各ウェルに添加し、そして培養中の各ウェルの前記宿主細胞培
養の増殖を、例えば各ウェルの前記細胞の懸濁液を透過した光回折の計測により
観察する。宿主細胞の増殖が前記発現したペプチドの影響を受けなかった場合、
このウェル中の細胞数は、正常に増加し、そしてそのウェルを透過して計測され
る上記細胞懸濁液の光回折は、増加するであろう。しかしながら、前記宿主細胞
の増殖が前記発現されたペプチドの影響を受けた場合、このウェルの細胞数は、
正常の増殖に比べて減少し、そして上記細胞の懸濁液の光回折における変化も小
さくなるであろう。マイクロタイター・プレートについてのスクリーニング戦略
の記述は、図３に与えられている。第３の、そして最も好ましい態様として、前
記スクリーニング又は分離工程は、例えば、Gant V.A., Warnes G., Phillips I
. and Savidge G.F.; "The application of flow cytometry to the study of b
acterial responses to antibiotics"; J. Med. Microbiol.; 1993; 39; pp.147
-154に記載の蛍光支援型細胞分取（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓｉｓｔｅ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｏｎｇ）（ＦＡＣＳ）装置を利用することにより実施
されうる。この種の装置は、例えば上記装置の製造業者により本技術分野で広く
説明されている。このアプローチの使用のために、各細胞の増殖の指標である生
死判別プローブ（例えば蛍光又は比色プローブ）が、前記宿主細胞内に組込まれ
る。好適には、前記誘導物質及び生死判別プローブを、指数関数的に増殖してい
る宿主細胞の液体培養に添加し、そして死滅させられた又は増殖阻害されている
微生物を識別及び回収する。
細胞を栄養培地及び場合により抗生物質を含むプレート上にストリークするため
に慣例のプレート・アッセイの利用により実施される。前記形質転換プラスミド
が上記抗生物質に対し抵抗するための遺伝子を含む場合、非形質転換宿主細胞は
、上記培地上で死滅し、一方形質転換した宿主細胞は生き残るであろう。次に前
もって決定された時間前記プレートをインキュベートし、形質転換宿主細胞のコ
ロニー形成を可能にし、そしてこれらのプレートから細胞サンプルを発現及び挿
入プラスミドの中に含まれるペプチドの産生を誘導する誘導物質をさらに含む他
のプレートに移し取る。形質転換宿主細胞がこの環境において増殖しつづけ、そ
して正常なコロニーを形成する場合、発現された及び産生されたペプチドは前記
宿主細胞を死滅させない及び／又は阻害しないことが推定されうる。一方前記宿
主細胞が全くコロニーを形成しない又は正常な増殖に比べコロニーが減少した場
合、誘導されたペプチドが上記宿主細胞に対して抗菌作用を有することは、明ら
かである。慣例のアガロース・プレートのためのスクリーニング戦略の記述は、
図２に与えられる。しかしながら、プレート・アッセイは、時間の浪費と長い手
順を含む、そしてさらに好ましい態様において前記スクリーニング又は分離工程
は、本技術分野で述べられるマイクロタイター・アッセイにおいて実施される。
この種のアッセイにおいて前記液体宿主細胞培養は、マイクロタイター・プレー
トの各ウェルに異なる挿入ヌクレオチド配列を含む単独又はほんの数個の細胞が
配置されるか又はそうでなければ、調べられた１つだけ又は数個のヌクレオチド
配列が各ウェルに含まれることが保証されている（例えば同じ挿入ヌクレオチド
配列を含む多数の宿主細胞である）。各ウェルの宿主細胞は、栄養培地の添加に
より培養されうる、そして上記マイクロタイター・プレートの複写又は複製が、
付加的なテスト・プレートへの副次標本の移動により準備されうる。誘導物質を
含む培地を、次に各ウェルに添加し、そして培養中の各ウェルの前記宿主細胞培
養の増殖を、例えば各ウェルの前記細胞の懸濁液を透過した光回折の計測により
観察する。宿主細胞の増殖が前記発現したペプチドの影響を受けなかった場合、
このウェル中の細胞数は、正常に増加し、そしてそのウェルを透過して計測され
る上記細胞懸濁液の光回折は、増加するであろう。しかしながら、前記宿主細胞
の増殖が前記発現されたペプチドの影響を受けた場合、このウェルの細胞数は、
正常の増殖に比べて減少し、そして上記細胞の懸濁液の光回折における変化も小
さくなるであろう。マイクロタイター・プレートについてのスクリーニング戦略
の記述は、図３に与えられている。第３の、そして最も好ましい態様として、前
記スクリーニング又は分離工程は、例えば、Gant V.A., Warnes G., Phillips I
. and Savidge G.F.; "The application of flow cytometry to the study of b
acterial responses to antibiotics"; J. Med. Microbiol.; 1993; 39; pp.147
-154に記載の蛍光支援型細胞分取（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓｉｓｔｅ
ｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｏｎｇ）（ＦＡＣＳ）装置を利用することにより実施
されうる。この種の装置は、例えば上記装置の製造業者により本技術分野で広く
説明されている。このアプローチの使用のために、各細胞の増殖の指標である生
死判別プローブ（例えば蛍光又は比色プローブ）が、前記宿主細胞内に組込まれ
る。好適には、前記誘導物質及び生死判別プローブを、指数関数的に増殖してい
る宿主細胞の液体培養に添加し、そして死滅させられた又は増殖阻害されている
微生物を識別及び回収する。
【００５２】
前記組込んだプローブを保持することで、その細胞を前記プローブに好適な波
長の励起光に晒すことによってその細胞内の蛍光を計測することにより細胞の生
死を、観察しうる、例えば前記プローブの蛍光が計測される場合、その細胞は生
きており又はその逆も同じことである。ＦＡＣＳ装置により、要求された特徴を
示す細胞が、かなりの速度及び精度において選択されることができ、蛍光測定が
、高感度である事実によっても手助けされうる。本発明の方法において、ＦＡＣ
Ｓ装置は、前記スクリーニング又は生細胞及び形質転換宿主細胞を選択する選択
ステップ（ｃ）並びに／又は死滅させられた及び／若しくは阻害された細胞を前
記ペプチドの発現誘導の後に選択する選択ステップ（ｅ）に利用されうるか、あ
るいは上記のプレート及び／又はマイクロタイター・プレート技術と併合されう
る。この目的のために多くの好適な蛍光プローブが、例えばモレキュラー・プロ
ーブ社、ユージーン、オレゴン、米国から市販されている。前記プローブの使用
において、それは、例えば膜構造を傷つけるか若しくは劣化するかどうか、膜透
過能力を低下若しくはなくすかどうか、又は特定のプローブが細胞内標的（例え
ばＤＮＡ）と相互作用することを許すかどうか検討される。前記プローブの例は
、それに制限されることなく、死滅及び／若しくは損傷細胞を透過し、そしてそ
の細胞の核酸を蛍光発光させることが意図される（例えばＳＹＴＯＸ（商標）緑
色核酸染色）又は生細胞を透過し、そして蛍光発光させることが意図される（例
えばＳＹＴＯ（商標）生細胞核酸染色）プローブであるところのモレキュラー・
プローブ社のＳＹＴＯ（Ｘ）（商標）核酸染色を含む。前記プローブの使用手順
は、その製造業者から入手できる。（膜透過能力に対して感受性のものが利用さ
れうる）蛍光性レドックス・プローブも、Rodriguez, G.G., Phipps D., Ishigu
ro K. and Ridgway H.F.; "Use of a Fluorescent Redox Probe for Direct Vis
ualization of Actively Respiring Bacteria", Applied and Environmental Mi
crobiology, 1992, pp.1801-1808に記載の塩化５−クアノ−２，３−ジトルイー
ルテトラゾリウム・プローブを利用するか、又はJepras R.I., Paul F.E., Pear
son S.C. and Wilkinson M.J.; "Rapid Assessment of Antibiotic Effects on
Escherichia coli by bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid) trimethine Oxonol a
nd Flow cytometry"; Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 1997; pp.2001
-2005に記載のモレキュラー・プローブ社から入手できるＤｉＢＡＣ4(３）プロ
ーブを利用する。
長の励起光に晒すことによってその細胞内の蛍光を計測することにより細胞の生
死を、観察しうる、例えば前記プローブの蛍光が計測される場合、その細胞は生
きており又はその逆も同じことである。ＦＡＣＳ装置により、要求された特徴を
示す細胞が、かなりの速度及び精度において選択されることができ、蛍光測定が
、高感度である事実によっても手助けされうる。本発明の方法において、ＦＡＣ
Ｓ装置は、前記スクリーニング又は生細胞及び形質転換宿主細胞を選択する選択
ステップ（ｃ）並びに／又は死滅させられた及び／若しくは阻害された細胞を前
記ペプチドの発現誘導の後に選択する選択ステップ（ｅ）に利用されうるか、あ
るいは上記のプレート及び／又はマイクロタイター・プレート技術と併合されう
る。この目的のために多くの好適な蛍光プローブが、例えばモレキュラー・プロ
ーブ社、ユージーン、オレゴン、米国から市販されている。前記プローブの使用
において、それは、例えば膜構造を傷つけるか若しくは劣化するかどうか、膜透
過能力を低下若しくはなくすかどうか、又は特定のプローブが細胞内標的（例え
ばＤＮＡ）と相互作用することを許すかどうか検討される。前記プローブの例は
、それに制限されることなく、死滅及び／若しくは損傷細胞を透過し、そしてそ
の細胞の核酸を蛍光発光させることが意図される（例えばＳＹＴＯＸ（商標）緑
色核酸染色）又は生細胞を透過し、そして蛍光発光させることが意図される（例
えばＳＹＴＯ（商標）生細胞核酸染色）プローブであるところのモレキュラー・
プローブ社のＳＹＴＯ（Ｘ）（商標）核酸染色を含む。前記プローブの使用手順
は、その製造業者から入手できる。（膜透過能力に対して感受性のものが利用さ
れうる）蛍光性レドックス・プローブも、Rodriguez, G.G., Phipps D., Ishigu
ro K. and Ridgway H.F.; "Use of a Fluorescent Redox Probe for Direct Vis
ualization of Actively Respiring Bacteria", Applied and Environmental Mi
crobiology, 1992, pp.1801-1808に記載の塩化５−クアノ−２，３−ジトルイー
ルテトラゾリウム・プローブを利用するか、又はJepras R.I., Paul F.E., Pear
son S.C. and Wilkinson M.J.; "Rapid Assessment of Antibiotic Effects on
Escherichia coli by bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid) trimethine Oxonol a
nd Flow cytometry"; Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 1997; pp.2001
-2005に記載のモレキュラー・プローブ社から入手できるＤｉＢＡＣ4(３）プロ
ーブを利用する。
【００５３】
ＦＡＣＳ装置又は慣例の冷光装置は、Virta M, Akerman K.E.O., Saviranta P
., Oker-Blom C. and Karp M.T.; "Real time measurement of cell permeabili
zation with low-molecular-weight membranolytic agents", Journal of Antim
icrobial Chemotherapy; 1995; 36; pp. 303-315に記載の技術により、生物発光
での使用に適用させることもできる。そのうえ、比色計は、比色計測を意図した
非蛍光細胞分取装置に利用されることがより好適ではあるが、例えばRoslev P.
and King G.M.; "Application of a Tetrazolium Salt with Water-Soluble For
mazan as an Indicator of viability in Respiring Bacteria"; Applied and E
nvironmental Microbiology, 1993, pp. 2891-2896; に記載のとおり応用されう
る。ＦＡＣＳに関するスクリーニング戦略の記述は、図１に与えられている。
., Oker-Blom C. and Karp M.T.; "Real time measurement of cell permeabili
zation with low-molecular-weight membranolytic agents", Journal of Antim
icrobial Chemotherapy; 1995; 36; pp. 303-315に記載の技術により、生物発光
での使用に適用させることもできる。そのうえ、比色計は、比色計測を意図した
非蛍光細胞分取装置に利用されることがより好適ではあるが、例えばRoslev P.
and King G.M.; "Application of a Tetrazolium Salt with Water-Soluble For
mazan as an Indicator of viability in Respiring Bacteria"; Applied and E
nvironmental Microbiology, 1993, pp. 2891-2896; に記載のとおり応用されう
る。ＦＡＣＳに関するスクリーニング戦略の記述は、図１に与えられている。
【００５４】
細胞内生理活性ペプチドのスクリーニングに対して本発明の方法を応用すると
き、特に真核生物細胞、例えば哺乳類細胞において、代替の好ましいスクリーニ
ング又は選択戦略が利用されうる。前記挿入ヌクレオチド配列の誘導された発現
において、それが宿主細胞に対して生理活性である場合、得られるペプチドは、
前記細胞膜を引き裂き及び／又は劣化し、そして死滅させられた細胞及び／又は
影響を受けた細胞は、遠心分離器にかけるか又はろ過するかにより影響を受けな
かった細胞から分離される。遠心分離器にかける場合、前記影響を受けなかった
生きた細胞は、沈殿し、一方影響を受けた細胞からの核酸物質は、上清中に分離
されうる。この分離は、前記影響を受けなかった生きた細胞をろ過して取り除く
ことによってもなされうる。この分離ステップから先に記載のとおり増幅及び突
然変異が行われうる。
き、特に真核生物細胞、例えば哺乳類細胞において、代替の好ましいスクリーニ
ング又は選択戦略が利用されうる。前記挿入ヌクレオチド配列の誘導された発現
において、それが宿主細胞に対して生理活性である場合、得られるペプチドは、
前記細胞膜を引き裂き及び／又は劣化し、そして死滅させられた細胞及び／又は
影響を受けた細胞は、遠心分離器にかけるか又はろ過するかにより影響を受けな
かった細胞から分離される。遠心分離器にかける場合、前記影響を受けなかった
生きた細胞は、沈殿し、一方影響を受けた細胞からの核酸物質は、上清中に分離
されうる。この分離は、前記影響を受けなかった生きた細胞をろ過して取り除く
ことによってもなされうる。この分離ステップから先に記載のとおり増幅及び突
然変異が行われうる。
【００５５】
一旦、最適なペプチドが同定されれば、そこに上記ペプチドの塩濃度に対する
感受性、イオン強度、pH及び／若しくは特に前記ペプチドに対する正常哺乳類細
胞の感受性が、前記ペプチドの意図される用途に依存して試験されるところの他
の試験が行われうる。
感受性、イオン強度、pH及び／若しくは特に前記ペプチドに対する正常哺乳類細
胞の感受性が、前記ペプチドの意図される用途に依存して試験されるところの他
の試験が行われうる。
【００５６】
抗菌ペプチドの使用
本発明の方法によって発見された抗菌ペプチドは、多くの分野の用途に利用さ
れうる。好適な分野の１つは、化学系防腐剤の代替として例えば食物／飼料、塗
料配合物、洗剤配合物、化粧品又は他の個人向けケア製品の防腐である。前記ペ
プチドは、例えばその材料を上記ペプチドを含む被覆物によりコートすることで
保存性メディカル・デバイス、例えば人工関節インプラント、静脈内用チューブ
などに使用されうる。前記ペプチドは、例えば洗浄産業におけるバイオフィルム
の処理のための消毒剤として、対象の表面の微生物を消毒及び／又は殺菌及び／
又は阻害するために積極的に応用されうる。好ましい用途の１つは、ヒト及び／
若しくは動物の体又は皮膚若しくは粘膜表面における微生物感染及び／又は腫瘍
を治療するためのペプチド製剤である。本発明のスクリーニング方法の使用は、
微生物を殺菌及び／又は阻害しうるが、しかし正常な哺乳類及び／又は真核生物
細胞に対しマイナスの作用をわずかにもつか又は全くもたない、きわめて生理的
に活性なペプチドを発見するために万能の手段であるということが企図される。
前記ペプチドは、経口投与のために、静脈内又は皮下注射のために又は軟膏とし
て処方されうる。
れうる。好適な分野の１つは、化学系防腐剤の代替として例えば食物／飼料、塗
料配合物、洗剤配合物、化粧品又は他の個人向けケア製品の防腐である。前記ペ
プチドは、例えばその材料を上記ペプチドを含む被覆物によりコートすることで
保存性メディカル・デバイス、例えば人工関節インプラント、静脈内用チューブ
などに使用されうる。前記ペプチドは、例えば洗浄産業におけるバイオフィルム
の処理のための消毒剤として、対象の表面の微生物を消毒及び／又は殺菌及び／
又は阻害するために積極的に応用されうる。好ましい用途の１つは、ヒト及び／
若しくは動物の体又は皮膚若しくは粘膜表面における微生物感染及び／又は腫瘍
を治療するためのペプチド製剤である。本発明のスクリーニング方法の使用は、
微生物を殺菌及び／又は阻害しうるが、しかし正常な哺乳類及び／又は真核生物
細胞に対しマイナスの作用をわずかにもつか又は全くもたない、きわめて生理的
に活性なペプチドを発見するために万能の手段であるということが企図される。
前記ペプチドは、経口投与のために、静脈内又は皮下注射のために又は軟膏とし
て処方されうる。
【００５７】
実施例
実施例１：さまざまな抗菌ペプチドの発現によるＥ．ｃｏｌｉの増殖阻害
モデルＡＭＰ、すなわちＣＡＰ１８、ＰＲ３９、アンドロピン、Ｂａｃ５、Ｂ
ａｃ７、クラバニンＡ、クラバニンＡＫ（クラバニンＡ変異体）、スチエリンＤ
、及びスチエリンＣ遺伝子を、標準的ＰＣＲ反応においてオリゴＤＮＡを用いて
合成し、そして向上した生理活性をもつＡＭＰを確認するその能力を評価するた
めに本ＳＥＳにおいてクローニングした。
ａｃ７、クラバニンＡ、クラバニンＡＫ（クラバニンＡ変異体）、スチエリンＤ
、及びスチエリンＣ遺伝子を、標準的ＰＣＲ反応においてオリゴＤＮＡを用いて
合成し、そして向上した生理活性をもつＡＭＰを確認するその能力を評価するた
めに本ＳＥＳにおいてクローニングした。
【００５８】
プラスミド
２つの実験系列を作製した：ｐＨＨ系列（プラスミドｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡを
使用）は、ペプチドが細胞膜と相互作用することが許される場所から、Ｅ．ｃｏ ｌｉ の細胞周辺腔へ前記ＡＭＰの搬出を可能にした。ｐＨＨＡ系列（プラスミド
ｐＨＨＡを使用）において、前記ペプチドはシグナル配列を欠き、そしてそれに
対応して生じるものは、細胞質中に保持された。
使用）は、ペプチドが細胞膜と相互作用することが許される場所から、Ｅ．ｃｏ ｌｉ の細胞周辺腔へ前記ＡＭＰの搬出を可能にした。ｐＨＨＡ系列（プラスミド
ｐＨＨＡを使用）において、前記ペプチドはシグナル配列を欠き、そしてそれに
対応して生じるものは、細胞質中に保持された。
【００５９】
利用した親プラスミドの１つであるｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡは、インビトロゲン
社から市販されている。それは、厳密に調節されたＥ．ｃｏｌｉにおける組換え
タンパク質の発現を意図したｐＵＣ由来の発現ベクターである。このプラスミド
は、増殖培地中に誘導物質が不存在の状態で前記組換えペプチドの発現がないも
のとして、Ｅ．ｃｏｌｉに対して毒性をもつペプチド及びタンパク質のクローニ
ングを可能にする。しかしながら、転写及びそれをもとにしたペプチド合成は、
広く誘導されうる。
社から市販されている。それは、厳密に調節されたＥ．ｃｏｌｉにおける組換え
タンパク質の発現を意図したｐＵＣ由来の発現ベクターである。このプラスミド
は、増殖培地中に誘導物質が不存在の状態で前記組換えペプチドの発現がないも
のとして、Ｅ．ｃｏｌｉに対して毒性をもつペプチド及びタンパク質のクローニ
ングを可能にする。しかしながら、転写及びそれをもとにしたペプチド合成は、
広く誘導されうる。
【００６０】
選択
全てのＡＭＰは最初に外側から標的生物を攻撃又は透過するので、前記ＳＥＳ
の成功は、多くの場合において当該ＡＭＰが前記細胞の外に搬出されることが要
求される。この系において、前記ＡＭＰは、その細胞標的、例えば細胞膜、膜若
しくは細胞周辺腔中の成分と相互作用することを許す場所又は外側の膜を通過し
てさらなる拡散を許す場所から細胞周辺腔へ分泌された。
の成功は、多くの場合において当該ＡＭＰが前記細胞の外に搬出されることが要
求される。この系において、前記ＡＭＰは、その細胞標的、例えば細胞膜、膜若
しくは細胞周辺腔中の成分と相互作用することを許す場所又は外側の膜を通過し
てさらなる拡散を許す場所から細胞周辺腔へ分泌された。
【００６１】
ｐＨＨ系列において、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ内のｇｅｎｅＩＩＩシグナル配列
を、当該ペプチド／タンパク質の分泌を実現するために誘導性プロモーターの前
に配置した。ＧｅｎｅＩＩＩは、ｐＩＩＩをコードする、線維状ファージfdから
のわずかなキャプシド・タンパク質の１つである。ｐＩＩＩは、１８アミノ酸の
Ｎ末端シグナル配列により合成され、そして膜の中へ挿入するために細菌の分泌
系を必要とする。前記シグナル配列は、内側の膜を通過後取り除かれ、こうして
本来のペプチドが残る。ＮｃｏＩ制限部位は、前記シグナル配列の分割部位にじ
かに続く。
を、当該ペプチド／タンパク質の分泌を実現するために誘導性プロモーターの前
に配置した。ＧｅｎｅＩＩＩは、ｐＩＩＩをコードする、線維状ファージfdから
のわずかなキャプシド・タンパク質の１つである。ｐＩＩＩは、１８アミノ酸の
Ｎ末端シグナル配列により合成され、そして膜の中へ挿入するために細菌の分泌
系を必要とする。前記シグナル配列は、内側の膜を通過後取り除かれ、こうして
本来のペプチドが残る。ＮｃｏＩ制限部位は、前記シグナル配列の分割部位にじ
かに続く。
【００６２】
もう一方の親プラスミド系列、ｐＨＨＡにおいて、ペプチドは、シグナル配列
をもたずに合成され、そしてそれに対応して生じるものは、細胞質中に保持され
た。前記ｐＨＨＡプラスミドは、前記ｇｅｎｅＩＩＩが欠失した点だけがｐＢＡ
Ｄ／ｇＩＩＩＡと異なる。この欠失は、転写開始部位にオーバーラップする付加
的なＮｃｏＩ部位の導入により生み出された。したがって、前記シグナル配列を
、ＮｃｏＩによる制限処理により除き、そしてそのプラスミドを、再連結してｐ
ＨＨＡを作り出した。
をもたずに合成され、そしてそれに対応して生じるものは、細胞質中に保持され
た。前記ｐＨＨＡプラスミドは、前記ｇｅｎｅＩＩＩが欠失した点だけがｐＢＡ
Ｄ／ｇＩＩＩＡと異なる。この欠失は、転写開始部位にオーバーラップする付加
的なＮｃｏＩ部位の導入により生み出された。したがって、前記シグナル配列を
、ＮｃｏＩによる制限処理により除き、そしてそのプラスミドを、再連結してｐ
ＨＨＡを作り出した。
【００６３】
再プラスミド系（ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ及びｐＨＨＡ）において、前記ＡＭＰ
遺伝子を、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片として導入する。
遺伝子を、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断片として導入する。
【００６４】
誘導性プロモーターの調節
利用した誘導性プロモーターであるｐＢＡＤは、２つのタンパク質、ＡｒａＣ
及びｃＡＭＰ−ＣＲＰにより正と負の両方に調節される。アラビノースの存在下
において、前記プロモーターからの発現が開始され、一方アラビノースの不存在
下において、前記プロモーターからひじょうに低いレベルの発現が起こる。非誘
導レベルは、グルコースの存在下における増殖によりなおいっそう抑えられる。
グルコースは、ｐＢＡＤのプロモーター領域への前記ｃＡＭＰ−ＣＲＰの結合を
減少させるｃＡＭＰレベルの低下に作用する。ｃＡＭＰレベルを下げることで、
転写活性を低下させる。着目のペプチドが、宿主細胞に対しひじょうに増殖阻害
性又は毒性である場合、これが理想的である。要するに、前記２つの調節物質の
活性を変えることにより、タンパク質発現レベルを、潜在的な毒性又は本来の遺
伝子の発現に関して至適に操作しうる。
及びｃＡＭＰ−ＣＲＰにより正と負の両方に調節される。アラビノースの存在下
において、前記プロモーターからの発現が開始され、一方アラビノースの不存在
下において、前記プロモーターからひじょうに低いレベルの発現が起こる。非誘
導レベルは、グルコースの存在下における増殖によりなおいっそう抑えられる。
グルコースは、ｐＢＡＤのプロモーター領域への前記ｃＡＭＰ−ＣＲＰの結合を
減少させるｃＡＭＰレベルの低下に作用する。ｃＡＭＰレベルを下げることで、
転写活性を低下させる。着目のペプチドが、宿主細胞に対しひじょうに増殖阻害
性又は毒性である場合、これが理想的である。要するに、前記２つの調節物質の
活性を変えることにより、タンパク質発現レベルを、潜在的な毒性又は本来の遺
伝子の発現に関して至適に操作しうる。
【００６５】
Ｃ末端のｍｙｃエピトープ及び６ｘ Ｈｉｓタグ
先に触れたさまざまなＡＭＰの遺伝子を、読み枠内のｍｙｃエピトープ及び６
ｘ Ｈｉｓタグの前にクローニングした。ＴＡＧ終止コドンは、前記ＡＭＰ遺伝
子と前記２つのエピトープをコードする配列を隔てた。これは、正常なＥ．ｃｏ ｌｉ において、転写の誘導によりＡＭＰだけが合成されることを意味する。前記
ＴＡＧ終止コドンにおける翻訳の終了は、融合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉに対し
て無毒である場合、ＡＭＰ／ｍｙｃ／６ｘ Ｈｉｓ融合タンパク質の合成を可能
にすることを、さまざまな菌株において抑制しうる。この融合タンパク質は、ニ
ッケル（Ｎｉ2+）樹脂の親和性を用いて容易に精製され、そして抗Ｍｙｃ又は抗
６ｘ Ｈｉｓ抗体を用いて容易に検出される。精製の次に、臭化シアン分解が、
都合よく位置したメチオニンにおける分解により前記ＡＭＰから前記２つのタグ
を分離する。この系は、選択したペプチドの前記抗菌活性の慣例のアッセイを用
いる、確認を可能にする容易で、都合のよい精製を可能にする。
ｘ Ｈｉｓタグの前にクローニングした。ＴＡＧ終止コドンは、前記ＡＭＰ遺伝
子と前記２つのエピトープをコードする配列を隔てた。これは、正常なＥ．ｃｏ ｌｉ において、転写の誘導によりＡＭＰだけが合成されることを意味する。前記
ＴＡＧ終止コドンにおける翻訳の終了は、融合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉに対し
て無毒である場合、ＡＭＰ／ｍｙｃ／６ｘ Ｈｉｓ融合タンパク質の合成を可能
にすることを、さまざまな菌株において抑制しうる。この融合タンパク質は、ニ
ッケル（Ｎｉ2+）樹脂の親和性を用いて容易に精製され、そして抗Ｍｙｃ又は抗
６ｘ Ｈｉｓ抗体を用いて容易に検出される。精製の次に、臭化シアン分解が、
都合よく位置したメチオニンにおける分解により前記ＡＭＰから前記２つのタグ
を分離する。この系は、選択したペプチドの前記抗菌活性の慣例のアッセイを用
いる、確認を可能にする容易で、都合のよい精製を可能にする。
【００６６】
宿主生物
利用される菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０である（インビトロゲン社から
市販）。それは、ａｒａＢＡＤＣ- 及びａｒａＥＦＧＨ+ である。
市販）。それは、ａｒａＢＡＤＣ- 及びａｒａＥＦＧＨ+ である。
【００６７】
ＡＭＰ遺伝子
以下のモデルＡＭＰ、すなわちＣＡＰ１８，ＰＲ３９、アンドロピン、Ｂａｃ
５，Ｂａｃ７、クラバニンＡ、クラバニンＡＫ（クラバニンＡ変異体）、スチエ
リンＤ、及びスチエリンＣの活性断片を、以下に示されるオリゴＤＮＡを用いた
標準的ＰＣＲ反応により合成した。前記ＰＣＲ増幅したＡＭＰ遺伝子を、Ｎｃｏ Ｉ及びＸｂａＩにより制限処理し、そしてｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ及びｐＨＨＡ内
の対応するクローニング・サイトに連結した。これらの連結反応混合物を、化学
的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０中に形質転換し、そしてそれぞれのク
ローンを分析した。前記ＡＭＰ遺伝子を、最終的にＤＮＡシークエンスにより確
認した。
５，Ｂａｃ７、クラバニンＡ、クラバニンＡＫ（クラバニンＡ変異体）、スチエ
リンＤ、及びスチエリンＣの活性断片を、以下に示されるオリゴＤＮＡを用いた
標準的ＰＣＲ反応により合成した。前記ＰＣＲ増幅したＡＭＰ遺伝子を、Ｎｃｏ Ｉ及びＸｂａＩにより制限処理し、そしてｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ及びｐＨＨＡ内
の対応するクローニング・サイトに連結した。これらの連結反応混合物を、化学
的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０中に形質転換し、そしてそれぞれのク
ローンを分析した。前記ＡＭＰ遺伝子を、最終的にＤＮＡシークエンスにより確
認した。
【００６８】
前記ＡＭＰ遺伝子の合成に用いたプライマー
【００６９】
【化１】
【００７０】
【化２】
【００７１】
【化３】
【００７２】
前記ＡＭＰ遺伝子に相当するアミノ酸配列を以下に示す。
【００７３】
小文字のアミノ酸は、天然のＡＭＰには存在せず、最も近いクローニング・サ
イト（ＣＣＡＴＧＧ，ＡＴＧはメチオニンをコードする）としてＮｃｏＩを利用
するクローニング戦略の結果として生み出された。前記遺伝子の天然コドン使用
方法を、維持した。
イト（ＣＣＡＴＧＧ，ＡＴＧはメチオニンをコードする）としてＮｃｏＩを利用
するクローニング戦略の結果として生み出された。前記遺伝子の天然コドン使用
方法を、維持した。
【００７４】
【化４】
【００７５】
【化５】
【００７６】
さまざまなＡＭＰの発現によるＥ．ｃｏｌｉの増殖阻害
以下の実験は、内因性ＡＭＰ発現の誘導により、Ｅ．ｃｏｌｉが液体培地中で
増殖を阻害されるかどうかを評価するために行った。
増殖を阻害されるかどうかを評価するために行った。
【００７７】
１日目、前記それぞれのＡＭＰをコードしているプラスミドを宿す細胞を、Ｌ
Ｂ＋１００γアンピシリン中に播種し、そして強く振とうしながら３７℃にて非
誘導条件下、育てた。これらの一晩中の培養を、２日目に、異なる量のアラビノ
ース（０％、０．００１％、０．０１％、及び０．１％）の存在する、新しい前
もって温めたＬＢブロス＋１００γアンピシリン中に１００倍希釈した。これら
の新たに希釈した培養１００μｌを、マイクロタイター・プレートに移し、そし
て振とうしながら３７℃にてインキュベートした。前記培養の増殖をＥＬＩＳＡ
リーダーを用いてＯＤ450 において一定の間隔で計測した。対応する増殖曲線を
、図５〜１４に示す。
Ｂ＋１００γアンピシリン中に播種し、そして強く振とうしながら３７℃にて非
誘導条件下、育てた。これらの一晩中の培養を、２日目に、異なる量のアラビノ
ース（０％、０．００１％、０．０１％、及び０．１％）の存在する、新しい前
もって温めたＬＢブロス＋１００γアンピシリン中に１００倍希釈した。これら
の新たに希釈した培養１００μｌを、マイクロタイター・プレートに移し、そし
て振とうしながら３７℃にてインキュベートした。前記培養の増殖をＥＬＩＳＡ
リーダーを用いてＯＤ450 において一定の間隔で計測した。対応する増殖曲線を
、図５〜１４に示す。
【００７８】
ペプチドを細胞周辺腔へ分泌するところの（前記親プラスミドｐＢＡＤ／ｇＩ
ＩＩＡを用いた）前記ｐＨＨ系列において、アンドロピンを除く全てのＡＭＰの
発現は、細菌の増殖を有意に阻害した。類似した遺伝子型（ａｒａＢＡＤＣ- 及
びａｒａＥＦＧＨ+)を有するＥ．ｃｏｌｉの他の菌株を利用した場合、類似した
結果を得た（データ不掲載）。アンドロピンは、折りたたみ、そして抗菌活性を
発揮するために十分な塩濃度を必要とすることが報告されており；より弱い阻害
がみられたということの説明となりうる観察である。非増殖阻害は、前記ｐＩＩ
Ｉシグナル配列に融合した前記Ｍｙｃ／ＨＩＳ６対照ペプチドの３８個のアミノ
酸を発現する前記ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ対照プラスミドを保有する菌株において
明らかである。このことから推して、前記ｐＩＩＩシグナル配列に融合したペプ
チドの発現自体はＥ．ｃｏｌｉの増殖を有意に阻害するものでないことが判断さ
れうる。前記結果を図５ｂ〜１４ｂに示す。
ＩＩＡを用いた）前記ｐＨＨ系列において、アンドロピンを除く全てのＡＭＰの
発現は、細菌の増殖を有意に阻害した。類似した遺伝子型（ａｒａＢＡＤＣ- 及
びａｒａＥＦＧＨ+)を有するＥ．ｃｏｌｉの他の菌株を利用した場合、類似した
結果を得た（データ不掲載）。アンドロピンは、折りたたみ、そして抗菌活性を
発揮するために十分な塩濃度を必要とすることが報告されており；より弱い阻害
がみられたということの説明となりうる観察である。非増殖阻害は、前記ｐＩＩ
Ｉシグナル配列に融合した前記Ｍｙｃ／ＨＩＳ６対照ペプチドの３８個のアミノ
酸を発現する前記ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩＡ対照プラスミドを保有する菌株において
明らかである。このことから推して、前記ｐＩＩＩシグナル配列に融合したペプ
チドの発現自体はＥ．ｃｏｌｉの増殖を有意に阻害するものでないことが判断さ
れうる。前記結果を図５ｂ〜１４ｂに示す。
【００７９】
ペプチドが細胞質に保持されるところの前記ｐＨＨＡ系列において、増殖阻害
の異なるパターンが観察された。この状況において前記ＡＭＰのたった１つのサ
ブセットだけが、増殖阻害を発揮した。この違いは、たぶん前記ＡＭＰの作用様
式の違いを反映している。膜透過能に依存しないペプチド又は細胞内標的をもつ
ペプチド（例えばプロリン−アルギニン・リッチ・ペプチド・ファミリーである
Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、及びＰＲ３９は、核酸と相互作用し、そして失活させるこ
とが文献において示唆されている）が、前記細胞内に発現され、そして保持され
た場合にその生存能力に作用することが予想される。その結果を図５ａ〜１４ａ
に示す。
の異なるパターンが観察された。この状況において前記ＡＭＰのたった１つのサ
ブセットだけが、増殖阻害を発揮した。この違いは、たぶん前記ＡＭＰの作用様
式の違いを反映している。膜透過能に依存しないペプチド又は細胞内標的をもつ
ペプチド（例えばプロリン−アルギニン・リッチ・ペプチド・ファミリーである
Ｂａｃ５、Ｂａｃ７、及びＰＲ３９は、核酸と相互作用し、そして失活させるこ
とが文献において示唆されている）が、前記細胞内に発現され、そして保持され
た場合にその生存能力に作用することが予想される。その結果を図５ａ〜１４ａ
に示す。
【００８０】
さまざまなＡＭＰの発現による固体培地上におけるＥ．ｃｏｌｉの増殖阻害
以下の実験を、内因性ＡＭＰ発現の誘導によりＥ．ｃｏｌｉが固体培地上にお
いて増殖阻害されるかどうか評価するために行った。
いて増殖阻害されるかどうか評価するために行った。
【００８１】
１日目、ＡＭＰをコードするプラスミドを宿す細胞を、ＬＢ＋１００γアンピ
シリン中に播種し、そして強く振とうしながら３７℃にて非誘発条件下、育てた
。これらの一晩中の培養を、２日目に新しい、前もって温めたＬＢブロス＋１０
０γアンピシリン中に１００倍希釈し、そして１００γアンピシリン及び異なる
量のアラビノース（０％、０．００１％、０．０１％、及び０．１％）を含むＬ
Ｂアガロース・プレート上に３μｌスポットした。これらのアガロース・プレー
トを、次に３７℃にて一晩中インキュベートした。細菌クローンの増殖を、その
次の日に記録した。増殖の阻害を、存在するアラビノースの量との相互関係を証
明するために観察した。阻害パターンは、液体培地中での増殖のときに観察され
た結果を反映した。
シリン中に播種し、そして強く振とうしながら３７℃にて非誘発条件下、育てた
。これらの一晩中の培養を、２日目に新しい、前もって温めたＬＢブロス＋１０
０γアンピシリン中に１００倍希釈し、そして１００γアンピシリン及び異なる
量のアラビノース（０％、０．００１％、０．０１％、及び０．１％）を含むＬ
Ｂアガロース・プレート上に３μｌスポットした。これらのアガロース・プレー
トを、次に３７℃にて一晩中インキュベートした。細菌クローンの増殖を、その
次の日に記録した。増殖の阻害を、存在するアラビノースの量との相互関係を証
明するために観察した。阻害パターンは、液体培地中での増殖のときに観察され
た結果を反映した。
【００８２】
変異ライブラリー
前記自殺発現系が異なる抗菌活性を示すペプチド変異体の間で識別が可能であ
るかどうか検討するために、前記９つのＡＭＰ遺伝子の突然変異ライブラリーを
、ＰＣＲ及び０．５mM塩化マンガンを用いて作製した。例証を目的として、突然
変異スチエリンＣクローンの無作為摘出クローンを選択し、そして誘導物質依存
性の増殖阻害について分析した。突然変異ＡＭＰは、生理活性を変更したように
見えるものによって同定されてきた（図１５）。前記突然変異体のサブセットを
、シークエンスし、そして変更された生理活性を示す全てのクローンが、当該ｗ ｔ （野生型）と異っていることを確認した。
るかどうか検討するために、前記９つのＡＭＰ遺伝子の突然変異ライブラリーを
、ＰＣＲ及び０．５mM塩化マンガンを用いて作製した。例証を目的として、突然
変異スチエリンＣクローンの無作為摘出クローンを選択し、そして誘導物質依存
性の増殖阻害について分析した。突然変異ＡＭＰは、生理活性を変更したように
見えるものによって同定されてきた（図１５）。前記突然変異体のサブセットを
、シークエンスし、そして変更された生理活性を示す全てのクローンが、当該ｗ ｔ （野生型）と異っていることを確認した。
【図１】
図１は、改変された抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）の同定のための蛍光支援型細胞
分取（ＦＡＣＳ）装置を用いたＳＥＳ系における方法のステップの流れを表した
図表を示し、ここで、Ａは、細菌宿主細胞中の突然変異抗菌ペプチド（ＡＭＰ）
のライブラリーであり；Ｂは、ＦＡＣＳを介した死滅細菌の除去であり；Ｃは、
転写誘導であり；Ｄは、ＦＡＣＳを介した生育できない細菌の選択でありそして
Ｅは、ＰＣＲ増幅、増幅遺伝子のシャッフリング、クローニング、及び形質転換
である。以下の記号を用いた：。
分取（ＦＡＣＳ）装置を用いたＳＥＳ系における方法のステップの流れを表した
図表を示し、ここで、Ａは、細菌宿主細胞中の突然変異抗菌ペプチド（ＡＭＰ）
のライブラリーであり；Ｂは、ＦＡＣＳを介した死滅細菌の除去であり；Ｃは、
転写誘導であり；Ｄは、ＦＡＣＳを介した生育できない細菌の選択でありそして
Ｅは、ＰＣＲ増幅、増幅遺伝子のシャッフリング、クローニング、及び形質転換
である。以下の記号を用いた：。
【表１】
【図２】
図２は、固形培地を用いた慣習のアガロース・プレートによる改変されたＡＭ
Ｐの同定のためのスクリーニングの方策の流れを表した図表を示し、ここで、Ａ
は、アガロース・プレートへの細菌クローンの分配であり；Ｂは、レプリカ・プ
レートの作製であり；Ｃは、転写の誘導（発）でありそしてＤは、コロニーの特
徴づけ、例えば特性、ＡＭＰ配列、死滅した又は阻害された細胞のコロニー、Ｐ
ＣＲ増幅、遺伝子シャッフリング及びクローニングを含む。
Ｐの同定のためのスクリーニングの方策の流れを表した図表を示し、ここで、Ａ
は、アガロース・プレートへの細菌クローンの分配であり；Ｂは、レプリカ・プ
レートの作製であり；Ｃは、転写の誘導（発）でありそしてＤは、コロニーの特
徴づけ、例えば特性、ＡＭＰ配列、死滅した又は阻害された細胞のコロニー、Ｐ
ＣＲ増幅、遺伝子シャッフリング及びクローニングを含む。
【図３】
図３は、液体培地を用いたマイクロタイター・プレートによる改変されたＡＭ
Ｐの同定のためのスクリーニングの方策の流れを表した図表を示し、ここでＡは
、マイクロタイター・ウェルへの細菌クローンの分配であり；Ｂは、レプリカ・
プレートの作製であり；Ｃは、転写誘導（発）でありそしてＤは、コロニーの特
徴づけ、例えば特性、ＡＭＰ配列、死滅した又は阻害された細胞のコロニーの同
定、ＰＣＲ増幅、遺伝子シャッフリング及びクローニングを含む。
Ｐの同定のためのスクリーニングの方策の流れを表した図表を示し、ここでＡは
、マイクロタイター・ウェルへの細菌クローンの分配であり；Ｂは、レプリカ・
プレートの作製であり；Ｃは、転写誘導（発）でありそしてＤは、コロニーの特
徴づけ、例えば特性、ＡＭＰ配列、死滅した又は阻害された細胞のコロニーの同
定、ＰＣＲ増幅、遺伝子シャッフリング及びクローニングを含む。
【図４】
図４は、ＡＭＰをコードするＤＮＡにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉにおけ
る作用を示し、ここで前記ＡＭＰの発現は、アラビノース誘導物質により誘導し
うる。垂直方向において誘導物質のレベルを示す。異なるＡＭＰ′ｓを試験し、
ここで１は、アンドロピンであり；２は、Ｂａｃ７であり；３は、Ｂａｃ５であ
り；４は、スチエリンＤであり；５は、スチエリンＣであり；６は、ＰＲ３９で
あり；７は、ＣｌａｖＡであり；８は、ＣｌａｖＡＫであり；９は、ＣＡＰ１８
でありそして１０は、ｐＢＡＤである。異ったＥ．ｃｏｌｉコロニーにおける前
記作用は、視覚的に確認しうる。
る作用を示し、ここで前記ＡＭＰの発現は、アラビノース誘導物質により誘導し
うる。垂直方向において誘導物質のレベルを示す。異なるＡＭＰ′ｓを試験し、
ここで１は、アンドロピンであり；２は、Ｂａｃ７であり；３は、Ｂａｃ５であ
り；４は、スチエリンＤであり；５は、スチエリンＣであり；６は、ＰＲ３９で
あり；７は、ＣｌａｖＡであり；８は、ＣｌａｖＡＫであり；９は、ＣＡＰ１８
でありそして１０は、ｐＢＡＤである。異ったＥ．ｃｏｌｉコロニーにおける前
記作用は、視覚的に確認しうる。
【図５】
Ａ：アンドロピン（ＰＨＨＡ１０００−アンドロピン）の発現が誘導されるＥ ．ｃｏｌｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここ
で上記アンドロピンは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：アンドロピン（ＰＨＨ１０００−アンドロピン）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記アンドロピンは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
で上記アンドロピンは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：アンドロピン（ＰＨＨ１０００−アンドロピン）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記アンドロピンは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図６】
Ａ：Ｂａｃ７（ＰＨＨＡ１１００−Ｂａｃ７）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌ ｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂ
ａｃ７は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：Ｂａｃ７（ＰＨＨ１１００−Ｂａｃ７）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂａ
ｃ７は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
ａｃ７は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：Ｂａｃ７（ＰＨＨ１１００−Ｂａｃ７）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂａ
ｃ７は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図７】
Ａ：Ｂａｃ５（ＰＨＨＡ１２００−Ｂａｃ５）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌ ｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂ
ａｃ５は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：Ｂａｃ５（ＰＨＨ１２００−Ｂａｃ５）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂａ
ｃ５は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
ａｃ５は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：Ｂａｃ５（ＰＨＨ１２００−Ｂａｃ５）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｂａ
ｃ５は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図８】
Ａ：スチエリンＤ（ＰＨＨＡ１３００−スチエリンＤ）の発現が誘導されるＥ ．ｃｏｌｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここ
で上記スチエリンＤは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：スチエリンＤ（ＰＨＨ１３００−スチエリンＤ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記スチエリンＤは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
で上記スチエリンＤは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：スチエリンＤ（ＰＨＨ１３００−スチエリンＤ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記スチエリンＤは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図９】
Ａ：スチエリンＣ（ＰＨＨＡ１４００−スチエリンＣ）の発現が誘導されるＥ ．ｃｏｌｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここ
で上記スチエリンＣは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：スチエリンＣ（ＰＨＨ１４００−スチエリンＣ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記スチエリンＣは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
で上記スチエリンＣは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：スチエリンＣ（ＰＨＨ１４００−スチエリンＣ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記スチエリンＣは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１０】
Ａ：ＰＲ３９（ＰＨＨＡ１５００−ＰＲ３９）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌ ｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｐ
Ｒ３９は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：ＰＲ３９（ＰＨＨ１５００−ＰＲ３９）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記ＰＲ
３９は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
Ｒ３９は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計
測により観察した。誘導物質のレベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：ＰＲ３９（ＰＨＨ１５００−ＰＲ３９）の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記ＰＲ
３９は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１１】
Ａ：クラバニンＡ（ＰＨＨＡ１６００−クラバニンＡ）の発現が誘導されるＥ ．ｃｏｌｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここ
で上記クラバニンＡは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：クラバニンＡ（ＰＨＨ１６００−クラバニンＡ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記クラバニンＡは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
で上記クラバニンＡは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０
nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：クラバニンＡ（ＰＨＨ１６００−クラバニンＡ）の発現が誘導されるＥ． ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで
上記クラバニンＡは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmで
のＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１２】
Ａ：クラバニンＡＫ（ＰＨＨＡ１７００−クラバニンＡＫ）の発現が誘導され
るＥ．ｃｏｌｉのアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、
ここで上記クラバニンＡＫは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の
４５０nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられ
る。 Ｂ：クラバニンＡＫ（ＰＨＨ１７００−クラバニンＡＫ）の発現が誘導される Ｅ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、こ
こで上記クラバニンＡＫは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５
０nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
るＥ．ｃｏｌｉのアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、
ここで上記クラバニンＡＫは、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の
４５０nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられ
る。 Ｂ：クラバニンＡＫ（ＰＨＨ１７００−クラバニンＡＫ）の発現が誘導される Ｅ．ｃｏｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、こ
こで上記クラバニンＡＫは、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５
０nmでのＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１３】
Ａ：ＣＡＰ１８（ＰＨＨＡ１８００−ＣＡＰ１８）の発現が誘導されるＥ．ｃ ｏｌｉ
のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上
記ＣＡＰ１８は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでの
ＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：ＣＡＰ１８（ＰＨＨ１８００−ＣＡＰ１８）の発現が誘導されるＥ．ｃｏ ｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記
ＣＡＰ１８は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ
計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
記ＣＡＰ１８は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでの
ＯＤ計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：ＣＡＰ１８（ＰＨＨ１８００−ＣＡＰ１８）の発現が誘導されるＥ．ｃｏ ｌｉ のアラビノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記
ＣＡＰ１８は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ
計測により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１４】
Ａ：対照ペプチドＭｙｃ／ＨＩＳ６の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉのアラビ
ノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｍｙｃ／ＨＩ
Ｓ６は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測
により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：対照ペプチドＭｙｃ／ＨＩＳ６の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉのアラビ
ノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｍｙｃ／ＨＩ
Ｓ６は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
ノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｍｙｃ／ＨＩ
Ｓ６は、細胞質内に保持されている。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測
により観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。 Ｂ：対照ペプチドＭｙｃ／ＨＩＳ６の発現が誘導されるＥ．ｃｏｌｉのアラビ
ノース誘導物質の異なるレベルでの増殖曲線であって、ここで上記Ｍｙｃ／ＨＩ
Ｓ６は、細胞周辺腔に分泌される。増殖を細胞懸濁液の４５０nmでのＯＤ計測に
より観察した。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与えられる。
【図１５】
無作為に採取された突然変異体からのスチエリンＣ変異体の発現が誘導される Ｅ．ｃｏｌｉ
の増殖曲線である。スチエリンＣ変異体の無作為に採取されたクロ
ーンは＃１〜＃１０まで番号を付けられる。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与え
られる。
ーンは＃１〜＃１０まで番号を付けられる。誘導物質レベルは、％ｗ／ｗで与え
られる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月９日（２００１．７．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ Ａ６１Ｋ 37/02
35/00 37/48
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ
Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ
，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Claims (18)
- 【請求項１】 ペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するためのヌ
クレオチド配列プールのシークエンス方法であって、以下の： ａ）場合によりシグナル・ペプチドに連結された１００未満のアミノ酸残基を
もつ酵素又は成熟ペプチドであるペプチドを発現するように、誘導性プロモータ
ーに作用可能な状態で連結された上記ヌクレオチド配列プールと、プラスミドを
結合させ、 ｂ）上記結合したプラスミドにより上記ペプチドに対し感受性の宿主細胞を形
質転換させ、 ｃ）生きた細胞を選択するように、上記の形質転換された宿主細胞をスクリー
ニングし、 ｄ）上記ヌクレオチド配列の発現を誘導するように、誘導物質の存在下で、上
記の生きた細胞を培養し、 ｅ）細胞増殖に対する上記誘導物質の効果に従って細胞を選択し、そして ｆ）上記の選択された細胞から上記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を
回収する、 ことを含む上記方法。 - 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列プールを、無作為突然変異誘発により
、遺伝子シャッフリングにより、又は縮重遺伝子の合成により作製する、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ペプチドが酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
- 【請求項４】 前記ペプチドが１００未満のアミノ酸残基から成る短かいペ
プチド、好ましくは抗菌性ペプチド又は抗腫瘍性ペプチドである、請求項１又は
２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記ペプチドが、細菌に対し活性な抗菌性ペプチド又は抗菌
性酵素であり、かつ、前記宿主細胞が、細菌細胞（特にエッシェリシア・コリ（ Ｅ．ｃｏｌｉ ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））、糸状菌（特にアスペル
ギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））又は酵母細胞（特にカンジダ属（Ｃａｎ ｄｉｄａ ）又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））である、
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記ペプチドが、抗腫瘍性ペプチドであり、かつ、前記宿主
細胞が、哺乳類の細胞、特に腫瘍細胞である、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ペプチドが、１００未満のアミノ酸残基の短かいペプチ
ドであり、かつ、前記結合が、伸長なしに又はＮ末端の１〜５アミノ酸の伸長を
もって前記ペプチドを、そして場合によりシグナル・ペプチドを発現するための
ものである、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 ステップｃ）及びｅ）の選択を、アガロース・プレートを用
いて行なう、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 ステップｃ）及びｅ）の選択を、マイクロタイター・ウェル
内で行なう、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 ステップｃ）及びｅ）の選択を、ＦＡＣＳ装置を用いて行
なう、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 ステップｃ）及びｅ）の選択を、遠心分離又はろ過により
行なう、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 人体又は動物体の治療のための製剤の発見及び製造のため
の請求項１〜１１のいずれかに記載の方法の使用。 - 【請求項１３】 前記遺伝子シャッフリングが、相同的な鋳型二本鎖ポリヌ
クレオチドを無作為断片に切断し、続いて上記断片を全長遺伝子に相同的に再会
合させることを含み相同的なＤＮＡのインビトロ・シャッフリングを含む、請求
項２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記遺伝子シャッフリングが、インビトロＤＮＡ合成の間
に誘導された鋳型シフトにより入力ＤＮＡ鋳型とランダムＤＮＡプライマーから
構築される再結合した相同性ポリヌクレオチドのライブラリーの形成を含む、請
求項２に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記ランダムＤＮＡプライマーが、併合されるべき前記突
然変異ＤＮＡ鋳型の上でＤＮＡ合成を無作為に開始させるために利用される、請
求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記遺伝子シャッフリングが、併合されるべき前記変異を
宿している３０未満の塩基対をもつプライマーの使用を含む、請求項２に記載の
方法。 - 【請求項１７】 前記遺伝子シャッフリングが、遺伝子全体をコードする１
以上の縮重ＤＮＡプライマーの合成を含む、請求項２に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記遺伝子配列の多様性が、出発物質としてｃＤＮＡのラ
イブラリー又は無作為に作製された全ゲノムＤＮＡ断片のライブラリーを含む、
請求項１に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| IL (1) | IL146743A0 (ja) |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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