[go: up one dir, main page]

JP2003508080A - 生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法 - Google Patents

生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法

Info

Publication number
JP2003508080A
JP2003508080A JP2001521773A JP2001521773A JP2003508080A JP 2003508080 A JP2003508080 A JP 2003508080A JP 2001521773 A JP2001521773 A JP 2001521773A JP 2001521773 A JP2001521773 A JP 2001521773A JP 2003508080 A JP2003508080 A JP 2003508080A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protease
gly
group
βala
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001521773A
Other languages
English (en)
Inventor
コモリヤ，アキラ
エス． パッカード，ビバリー
Original Assignee
オンコイミューニン，インコーポレイティド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/394,019 external-priority patent/US6936687B1/en
Application filed by オンコイミューニン，インコーポレイティド filed Critical オンコイミューニン，インコーポレイティド
Publication of JP2003508080A publication Critical patent/JP2003508080A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、螢光が特定のプロテアーゼの存在下で上昇する新規試薬を提供する。その試薬は、特徴的に折たたまれたペプチド主鎖を含んで成り、ここで前記主鎖の個々の端が螢光団に接合されている。折たたまれたペプチドが、プロテアーゼによる消化により切断される場合、螢光団は可視波長で高い強度の螢光シグナルを供給する。それらのプロテアーゼインジケーターは、生物学的サンプル、特に凍結された組織断片におけるプロテアーゼ活性の検出のために特に適切である。なぜならば、可視波長におけるそれらの高い螢光シグナルのためである。本発明はまた、現場凍結された断片におけるプロテアーゼ活性を検出するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、螢光レベルを活性プロテアーゼの存在下で高める新規種類の螢光発
生組成物に関する。それらの螢光発生プロテアーゼインジケーターは典型的には
可視波長で螢光を発し、そしてその故に、生物学的サンプル中のプロテアーゼ活
性の検出及び位置決定のためにひじょうに有用である。
【０００２】 発明の背景 プロテアーゼは、ペプチド結合を触媒的に加水分解する多くの種類のタンパク
質分解酵素を意味する。プロテアーゼの主なグループは、メタロプロテアーゼ、
セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼ
を包含する。プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼは、多くの生理学的過程、
たとえば血液凝固、受精、炎症、ホルモン生成、免疫応答及び繊維素溶解に関連
している。
【０００３】 多くの病状は、特定のプロテアーゼ及びそれらのインヒビターの活性の変更に
より引き起こされ、そしてその変更により特徴づけられ得る。たとえば、気腫、
関節炎、血栓症、癌転移及びいくつかの形の血友病は、セリンプロテアーゼ活性
の調節の欠陥に起因する（たとえば、Textbook of Biochemistry with Clinical
Correlations, John Wiley and Sons, Inc. N. Y. (1993) を参照のこと）。ウ
イルス感染の場合、感染された細胞中にウイルスプロテアーゼの存在が同定され
ている。このようなウイルスプロテアーゼには、例えばAIDSに関連するHIV プロ
テアーゼ及びＣ型肝炎に関連するNS３プロテアーゼが包含される。これらのウイ
ルスプロテアーゼはウイルスのライフサイクルにおいて重要な役割を演ずる。
【０００４】 プロテアーゼは癌転移に関連すると考えられて来た。プロテアーゼウロキナー
ゼの高められた合成は、多くの癌における転移能力の上昇と関連付けれて来た。
ウロキナーゼは、細胞外空間に遍在するプラスミノーゲンからのプラスミンを活
性化し、そしてその活性化は転移する腫瘍細胞が侵入する細胞外マトリックスに
おけるタンパク質の分解を引き起こすことができる。プラスミンはまた、コラゲ
ナーゼを活性化することができ、従って、毛細管及びリンパ系を取り囲む基礎膜
におけるコラーゲンの分解を促進し、それにより、標的組織中への腫瘍細胞の侵
入を可能にする（Dano、など、Adv. Cancer. Res., 44 : 139 (1985)) 。
【０００５】 特定のプロテアーゼの活性の変化の明確な測定は、根底にある病状の処置及び
管理において臨床的に有意義である。しかしながら、プロテアーゼは容易にはア
ッセイすることができない。典型的なアプローチは、プロテアーゼと結合する抗
体を用いるELISA 、又は種々のラベルされた基質を用いるRIA を包含する。それ
らの天然の基質によるアッセイは、実施するのに困難であり、且つ高価である。
現在入手できる合成基質によるアッセイは、高価で、低感受であり、且つ非選択
性である。さらに、多くの“インジケーター”基質は、プロテアーゼの自己破壊
を一部もたらす多量のプロテアーゼを必要とする。
【０００６】 プロテアーゼ検出への最近のアプローチは、Ｐ１’位置（切断できるペプチド
結合のカルボキシル側のアミノ酸位置）に位置する離れた色原体又は螢光発生体
の切断誘発される分光学的変化に依存する（たとえば、アメリカ特許第 4,557,8
62号及び第 4,648,893号を参照のこと）。しかしながら、多くのプロテアーゼは
、プロテアーゼの認識のために切断されやすい結合のいづれかの側に２又は３個
のアミノ酸残基を必要とし（特定のプロテアーゼは６個以下のアミノ酸残基を必
要とするであろう）、そして従って、それらのアプローチはプロテアーゼ特異性
を欠いている。
【０００７】 しかしながら、最近、螢光発生インジケーター組成物が開発されており、ここ
では“ドナー”螢光団は、HIV プロテアーゼのための結合部位であるペプチド（
７個のアミノ酸）及びそのペプチドに螢光団及び発色団を連結するリンカーを含
む短い橋により“レセプター”発色団に連結されている（Wangなど、Tetra. Len
s. 45 : 6493〜6496 (1990))。ドナー螢光団のシグナルは、共鳴エネルギートラ
ンスファー(RET) を包含すると思われる工程を通してレセプター螢光団により消
光される。ペプチドの切断は、螢光団及び発色団の分離、すなわち前記消光の除
去をもたらし、そして続くシグナルがドナー螢光団から測定された。
【０００８】 ドナーとレセプターとの間の橋の設計は、アッセイの感度を制限する比較的無
能な消光を導びいた。さらに、発色団及び/又は蛍光団（fluorophore）は、紫外
線範囲において強く光を吸収する分子を典型的には含む生物学的サンプルにおい
て検出のための感度を減じる紫外線範囲での光を吸収した。 切断される場合、高いシグナルレベル、及び損なわれていない場合、非常に近
いシグナルレベルを示し、高度のプロテアーゼ特異性を示し、そして可視範囲に
おいて独占的に作動し、それによりそれらを生物学的サンプルへの使用のために
適切な螢光発生プロテアーゼインジケーターが所望される。本発明の組成物は、
それらの及び他の利点を提供する。
【０００９】 発明の要約 本発明は、特定のプロテアーゼの存在下で、その螢光を高める新規の試薬を提
供する。それらの螢光発生プロテアーゼインジケーターは、それらがプロテアー
ゼにより消化される場合、可視波長で高い強度の螢光シグナルを供給する。可視
波長におけるそれらの高い螢光シグナルのために、それらのプロテアーゼインジ
ケーターは、生物学的サンプル、特に凍結された組織断片及び培養された又は新
しく単離された細胞におけるプロテアーゼ活性の検出のために特に適切である。
測定は組織サンプル、細胞などのためには螢光顕微鏡を用いて、そして細胞懸濁
サンプルのためにはフローサイトメーター又は顕微鏡を用いて行うことができる
。
【００１０】 本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼの活性の検出
のために適切な組成物である。それらの組成物は、下記一般式：
【化２】
【００１１】 [式中、Ｐは２〜約15個、好ましくは２個〜約12個、好ましくは２個〜約10個
、好ましくは２個〜約８個、２個〜約６個、又は２個〜約４個のアミノ酸から成
る、プロテアーゼのためのプロテアーゼ結合部位を含んで成るペプチドであり；
Ｆ1 及びＦ2 は螢光団であり；Ｓ1 及びＳ2 は長さ１〜約50個の範囲のアミノ酸
のペプチドスペーサーであり；ｉ及びｒは独立して０又は１であり；そしてＣ1
及びＣ2 は長さ１〜約８個より好ましくは１〜約６個の範囲のアミノ酸のペプチ
ドを含んで成るコンホメーション決定領域である〕を有する。
【００１２】 コンホメーション決定領域はそれぞれ、組成物中に曲げ（ベンド；bend) を導
入し、あるいはペプチド主鎖の自由度を制限し、それにより約 100Å以下の分離
を伴って螢光団を並置する。スペーサー（Ｓ1 及びＳ2 ）のいづれかが存在する
場合、それらは末端アミノ酸のα炭素原子に結合されるペプチドによりプロテア
ーゼ結合部位に連結される。従って、ｎが１である場合、Ｓ1 はＣ1 の末端αア
ミノ基を通して、ペプチド結合によりＣ1 に連結され、そしてｋが１である場合
、Ｓ2 はＣ2 の末端αカルボキシル基を通してペプチド結合によりＣ2 に連結さ
れる。
【００１３】 プロテアーゼ結合部位を含んで成るアミノ酸残基は、従来、特定のプロテアー
ゼにより加水分解されるペプチド結合に対して番号付けされている。従って、切
断されたペプチド結合のアミノ側上の第１のアミノ酸残基はＰ1 と命名され、そ
して切断されるペプチド結合のカルボキシル側上の第１のアミノ酸残基はＰ1'と
命名される。残基の番号付けは、加水分解されたペプチド結合からの距離が離れ
るほど高まって行く。従って、４のアミノ酸プロテアーゼ結合領域は、 P2-P1-P1'-P2' と命名されたアミノ酸を含み、そしてプロテアーゼはＰ1 とＰ1'との間の結合
領域を切断する。
【００１４】 特に好ましい態様において、本発明の螢光源組成物は、本明細書に記載する式
（II）及び式（Ｖ）の組成物である。本発明の好ましい螢光団インジケーターは
、決定領域を有し、そして場合によっては本明細書に記載するようにスペーサー
を有する。最も好ましい態様において、組成物は単一種の螢光団を有する。これ
らの「ホモラベル」(homolabel) された組成物のために好ましい螢光団には、Ｈ
−型ダイマーを形成する螢光団が含まれる。特に好ましい螢光団は約300nmと800
nmとの間、更に好ましくは約310nmと750nmとの間、最も好ましくは約 315nmと約
700nmの間の励起波長を有する。
【００１５】 もう一つの態様において、本発明はプロテアーゼの活性を検出する方法を提供
する。この方法は、プロテアーゼを、本明細書に記載する１又は複数のプロテア
ーゼインジケーターと接触せしめることを含む。特に好ましい態様において、「
接触」は組織切片において、あるいは組織、血液、尿、唾液又は他の生物流体、
リンパ、生検体を含むがこれらに限定されない生物学的サンプルから成る群から
選択された材料、培養物、又は細胞懸濁液においてである。検出方法には、螢光
顕微鏡法、螢光マイクロプレートリーダー、フローサイトメトリー、フルオロメ
トリー、吸光分光法から成る群から選択される方法が含まれる。
【００１６】 好ましい組成物において、Ｆ1 が５−及び／又は６−カルボキシテトラメチル
ローダミンであることができ、そしてＦ2 はローダミンＸアセタミドであること
ができる。これらの組成物は、膜又はリポゾームのごとき固体支持体又は液体に
接合させてもよい。
【００１７】 もう１つの態様においては、上記組成物の何れかが、サンプル中のプロテアー
ゼ活性を検出するための方法に使用され得る。サンプルは、たとえば研究又は産
業において使用される“貯蔵(stock)”プロテアーゼのサンプルであり得、又は
それは生物学的サンプルでもあり得る。従って、本発明は、サンプルと上記組成
物のいづれかとを接触せしめ、そして次に、螢光の上昇がプロテアーゼ活性を示
す螢光発生組成物の螢光の変化を検出することによってサンプル中のプロテアー
ゼ活性を検出するための方法を提供する。前記サンプルは好ましくは、生物学的
流体、たとえば唾液又は血液を包含する生物学的サンプル、組織サンプル、たと
えば生検又は断片、及び生検としての又は培養物における細胞サンプルである。
特に好ましいものは、組織断片、培養された細胞、培養された組織及び同様のも
のである。
【００１８】 さらに他の態様において、本発明は、細胞に分子を結合するための方法を提供
する。この方法は、少なくとも２個の螢光団分子及び疎水性基が結合した分子を
用意し；そして該細胞を該分子に接触せしめ、これにより分子を細胞に入れるこ
とを含んで成る。１つの態様において、この方法は、少なくとも２個の大きく平
らな疎水性の螢光団及び疎水性基が結合された分子を用意することを含む。好ま
しい分子には、ポリペプチド、核酸、脂質、オリゴサッカライドが含まれる。適
当な螢光団及び疎水性基を本明細書に記載する。好ましい細胞には哺乳類細胞が
含まれる。
【００１９】 本発明の更に他の態様において、本発明はプロテアーゼ（又はヌクレア-ゼ、
リパーゼなど）を調節する能力について被験物質をスクリーニングするための方
法を提供する。この方法は、プロテアーゼ又はプロテアーゼを含有する細胞を被
験物質と接触せしめ、前記プロテアーゼを本明細書に記載する蛍光源インディケ
ーターと接触せしめ、そして前記蛍光源組成物により生成されるシグナル又はシ
グナルの不存在を検出することを含み、ここで、プロテアーゼ又は細胞が低濃度
の前記被験物質と接触される対照（例えば、負対照）と比較して、被験物質と接
触したプロテアーゼ又は細胞により生成されるシグナルの相違が、被験物質がプ
ロテアーゼの活性を調節することを示す。好ましい態様において、対照は被験物
質の不存在である。
【００２０】 典型的には、対照に比べて、被験物質と接触したプロテアーゼ又は細胞により
生成されるシグナルの増加が、被験化合物による前記プロテアーゼの活性の増加
を示し、対照と比べて、被験物質と接触したプロテアーゼ又は細胞により生成さ
れるシグナル（例えば、蛍光）の減少が、被験物質によるプロテアーゼの活性の
低下を示す。ある種の態様においては、被験物質を除去した後に、プロテアーゼ
が蛍光源組成物と接触される。この方法は、前記プロテアーゼを調節する被験物
質のリストを含んで成るデータベースに前記プロテアーゼの活性を調節する被験
物質を入れることを可能にする。種々の態様において、検出は細胞内シグナルの
検出（例えば、顕微鏡、フローサイトメトリーなどによる）を含む。ある種の特
に好ましい態様において、検出は全体細胞（whole cells）の高スループット（
high throughput）を含む。
【００２１】 定義 用語“プロテアーゼ結合部位”とは、特異的に認識され、そしてプロテアーゼ
により切断されるアミノ酸配列を意味する。プロテアーゼ結合部位は、プロテア
ーゼにより加水分解されるペプチド結合を含み、そしてこのペプチド結合により
連結されるアミノ酸残基は、その切断部位を形成すると言われる。それらのアミ
ノ酸は、それぞれ、加水分解された結合のアミノ及びカルボキシル側上の残基の
ためにＰ1 及びＰ1'を示す。
【００２２】 螢光団は、特徴的な波長で光を吸収し、そして次に最とも典型的には、特徴的
な異なった波長で光を再発光する分子である。螢光団は、当業者に良く知られて
おり、そしてローダミン及びローダミン誘導体、フルオレセイン及びフルオレセ
イン誘導体、クマリン、及びランタニドイオンシリーズとのキレート化剤を包含
するが、但しこれらだけには限定されない。螢光団は、光を吸収するが、しかし
特徴的には、光を再発光しない発色団とは区別される。
【００２３】 “ペプチド”及び“ポリペプチド”は、α炭素原子が、１つのアミノ酸のα炭
素カルボニル基と他のアミノ酸のアミノ基との間での縮合反応により形成される
ペプチド結合を通して連結されるアミノ酸の鎖である。鎖の一端での末端アミノ
酸（アミノ末端）は、遊離アミノ基を有し、そして鎖の他端での末端アミノ酸（
カルボキシル末端）は、遊離カルボキシル基を有する。本明細書で用いられる場
合、用語“アミノ末端”（Ｎ−末端として略語化される）は、ペプチドの末端で
のアミノ酸上の遊離α−アミノ基、又はペプチド内の何れか他の位置でのアミノ
酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与する場合、イミノ基）を意味する。同様
に、用語“カルボキシ末端”は、ペプチドのカルボキシ末端上の遊離カルボキシ
ル基又はペプチド内のいづれか他の位置でのアミノ酸のカルボキシル基を意味す
る。ペプチドはまた、本質的に、任意のポリアミノ酸、例えばペプチド擬似体、
たとえばアミド結合に対してエーテル結合により連結されるアミノ酸をも包含す
るが、これらに限定されない。
【００２４】 本明細書に記載されるポリペプチドは、左側でアミノ末端及び右側でカルボキ
シル末端により書かれる。本発明のペプチド成分を含んで成るアミノ酸は、プロ
テアーゼ切断部位に対して番号付けされ、そして番号はその切断部位からカルボ
キシル及びアミノ方向に距離と共に連続的に多くなる。カルボキシル部位上の残
基は、Ｐ1'におけるような“ ’”により、又はそれらが位置する領域を示す文
字及び下付き文字により示される。その“ ’”は、残基が切断部位のカルボキ
シル側上に位置することを示す。
【００２５】 用語“残基”又は“アミノ酸”とは、本明細書で使用される場合、ペプチド中
に組込まれたアミノ酸を意味する。アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であり、
そして特にことわらない限り、天然に存在するアミノ酸と類似する態様で機能す
ることができる、天然のアミノ酸の既知の類似体を包含することができる。 用語“ドメイン”又は“領域”とは、ポリペプチドの特徴的な領域を意味する
。ドメインは、特定の構造特徴、たとえばβ回転、αヘリックス、又はβプリー
ツシートにより、特徴的な構成アミノ酸（たとえば優先的な疎水性又は親水性ア
ミノ酸、又は反復アミノ酸配列）により、又は折りたたまれた立体ポリペプチド
の特定領域におけるその局在化により特徴づけられ得る。本明細書で使用される
場合、領域又はドメインは、一連の連続したアミノ酸から成る。
【００２６】 用語“プロテアーゼ活性”又は“プロテアーゼの活性”とは、プロテアーゼに
よるペプチドの切断を意味する。プロテアーゼ活性は、多くの小さなペプチドフ
ラグメントへの１又は複数のペプチドの“消化”を包含する。特定のプロテアー
ゼのプロテアーゼ活性は、特定のプロテアーゼにより特異的に認識される特定の
ペプチド結合部位での加水分解をもたらすことができる。その特定のプロテアー
ゼは、特定の末端アミノ酸残基を担持するペプチドフラグメントの生成により特
徴づけられ得る。
【００２７】 用語“被験物質”は、本明細書に記載される１又は複数のアッセイにおいてス
クリーニングされるべき物質を意味する。この物質は本質的にいかなる化学化合
物であってもよい。こらは単一の単離された化合物として存在することが出来、
又は化学的（例えば、組み合わせ）ライブラリーの構成員であることが出来る。
特定の好ましい態様において、被験物質は小有機分子であろう。 用語“小有機分子”は、医薬において一般に使用される有機分子に匹敵するサ
イズの分子を意味する。この用語は生物学的巨大分子（例えば、タンパク質、核
酸など）を含まない。好ましい小有機分子は、約5000Daまで、より好ましくは20
00Daまで、そして最も好ましくは約1000Daまでの範囲に亘る。
【００２８】 用語“データベース”は、情報を記録または再生するための手段を意味する。
データベースはペーパーシステム、カードシステム、機械的システム、電気的シ
ステム、光学システム、磁気システムを含むがこれらに限定されない任意の便利
な媒体を含むことができる。好ましいデータベースは電子的（例えば、コンピュ
ータに基ずく）を含む。データベースの貯蔵及び操作における使用のためのコン
ピュータ系は当業者によく知られているが、“パーソナルコンピュータシステム
”、メインフレームシステム、特殊なハードウエアに貯蔵された１又は複数のイ
ンターネット又はイントラネット上の分布した腺を含むがこれらに限定されない
。
【００２９】 用語“生物学的試料”は、本明細書中で用いられるように、生物の成分（例え
ば、細胞又は組織）から及び/又はインビトロ細胞若しくは組織培養から得られ
る試料を意味する。試料は、いかなる生物組織若しくは液の試料（例えば血液、
血漿、リンパ、脊椎液、尿、唾液など）の試料である。生物学的試料はまた、器
官、又は組織の切片、例えば組織学的目的のために取られる凍結された切片を含
む。 本明細書において言及される幾つかのアミノ酸は、次のような短縮表示により
記載される：
【００３０】
【表１】
【００３１】 本明細書において使用する他の略号には、Fmoc（９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル）基を示す「Fm」、Ｎ（α）−アセチル基を示す「Ac」、「daa 」（「
ｄ」がaaのｄ異性体を示す）、及びベンゾキシカルボニル基を示す「Ｚ」が含ま
れる。
【００３２】 具体的な説明 プロテアーゼ活性の螢光発生インジケーター 本発明は、サンプル中のプロテアーゼ活性を検出するために有用な新規螢光発
生分子を提供する。本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは一般的に、
特定のプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列を有するペ
プチドにより“レセプター”分子に連結される螢光団（ドナー）を包含する。ド
ナー螢光団は典型的には、異なった（より長い）波長で再発光する特定の波長で
の入射放射線により励起される。ドナー螢光団がレセプター分子に接近して維持
される場合、レセプターは螢光団により再発光される光を吸収し、それにより、
ドナー分子の螢光シグナルを消光せしめ、あるいは仮定のドナー及びアクセプタ
ーが複合体を形成し、この複合体は入射光を吸収しそして複合体が破壊されるま
で照射エネルギーを放出しない。
【００３３】 この後者の態様においては、二つの蛍光団が異なっていても又は同じであって
も消光が起こる。従って、例１に示されるような２種の異なった螢光団による二
重ラベルされたペプチドの他に、同じ螢光団により二重ラベルされたペプチドも
また、プロテアーゼインジケーターとしても使用され得る（たとえば例６を参照
のこと）。２つの蛍光団又は発色団を連結する主鎖（例えばペプチド）の切断は
、２つの分子の分離、消光効果の開放及び螢光の上昇又はスペクトル特性の変化
をもたらす。
【００３４】 １つの基本的な用途において、本発明の螢光発生分子は、実験又は産業使用の
ための試薬（たとえば緩衝溶液中で）として製造される精製されたプロテアーゼ
の活性をアッセイするために使用され得る。多くの他の酵素のように、プロテア
ーゼは、特にそれらがそれらの活性形として貯蔵される場合、時間の経過と共に
活性を失なう。さらに、多くのプロテアーゼは、使用する前、酵素の活性形を生
成するために、特定のペプチド結合の加水分解によりそれ自体活性化されるべき
不活性前駆体形（たとえばチモーゲン）で天然において存在する。活性化の程度
は多種であり、そしてプロテアーゼは時間の経過と共に活性を失なうので、プロ
テアーゼが活性であることを認識し、そしてしばしば、特定の用途においては、
特定のプロテアーゼを用いる前、その活性を定量化することがしばしば所望され
る。
【００３５】 プロテアーゼ活性を認識し、そして定量化するためのこれまでのアプローチは
、プロテアーゼのアリコートとその基質とを混合し、一定の期間、消化せしめ、
そして次に、その消化されたタンパク質の量を、最とも典型的にはHPLCにより測
定することを包含する。このアプローチは、時間の浪費であり、高価な試薬を用
い、多くの段階を必要とし、そして相当量の労力を必要とする。対照的に、本発
明の螢光発生試薬は、単一段階工程における数分でのプロテアーゼ活性の急速な
決定を可能にする。試験されるべきプロテアーゼのアリコートは単純に、本発明
の螢光発生試薬に添加され、又はその試薬と接触せしめられ、そして続く螢光の
変化がモニターされる（たとえば、螢光計又は螢光マイクロプレートリーダーを
用いて）。
【００３６】 “試薬”溶液におけるプロテアーゼ活性を決定する他に、本発明の螢光発生組
成物は生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性を検出するためにも使用され
得る。用語“生物学的サンプル”とは、本明細書で使用される場合、生物から又
は生物の成分（たとえば細胞）から得られたサンプルを意味する。サンプルはい
づれかの生物学的組織又は流体のものであり得る。ときおり、サンプルは、患者
に由来するサンプルである“臨床学的サンプル”であり得る。そのようなサンプ
ルは、唾液、血液、血液細胞（たとえば白血球細胞）、組織又は細い針の生検サ
ンプル、尿、腹水、及び胸水、又はそれらからの細胞を包含するが、但しそれら
だけには限定されない。生物学的サンプルはまた、組織の断片、たとえば組織学
的な目的のために採取される凍結断片も包含する。
【００３７】 これまで記載されて来た螢光発生プロテアーゼインジケーターは典型的には、
紫外線範囲での光を吸収する（たとえば、Wang、など. 、前記）。従って、それ
らは、紫外線範囲において吸収する構成成分（たとえばタンパク質）を典型的に
は含む生物学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性の敏感な検出のためには不適
切である。対照的に、好ましい態様において、本発明の螢光インジケーターは、
可視範囲（400nm 〜約 750nm）において吸収し、そして発光する。従って、それ
らのシグナルは、螢光団の活性化、すなわち光の吸収により容易に消光されない
し、又はバックグラウンド分子により妨害もされず；従って、それらは生物学的
サンプルにおいて容易に検出される。
【００３８】 さらに、しばしば螢光団及び消光発色団を用いるこれまでの螢光発生プロテア
ーゼインジケーターとは異なって、本発明のインジケーターは、２種の螢光団（
すなわち、ドナー及びレセプターとしての螢光団）、蛍光団及び発色団、又は本
発明のペプチド主鎖の１つにより連結される場合、基底状態のダイマーを効果的
に形成する同じ２つの螢光団を使用することができる。これまで記載された発色
団／螢光団の組合せよりも一層高い消出の程度を示す螢光団の対が選択され得る
。
【００３９】 事実、これまでの組成物は、対合する発色団により得られる消出の低い程度の
ために、比較的低い効能の螢光団に制限されて来た（Wangなど、前記）。対照的
に、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、高い効能の螢光団を用い
、そして消光がペプチド基質の切断により開放される場合、強いシグナルを提供
しながら、高い程度の消光を達成することができる。高いシグナルは、ひじょう
に低いレベルのプロテアーゼ活性の検出を可能にする。従って、本発明の螢光発
生プロテアーゼインジケーターは、プロテアーゼ活性の現場検出のために特に適
切である。
【００４０】 本発明の好ましい螢光発生プロテアーゼインジケーターは、下記一般式：
【化３】
【００４１】 〔式中、Ｐはプロテアーゼ結合部位を含むペプチドであり、Ｆ1 及びＦ2 は螢
光団であり、Ｃ1 及びＣ2 はコンホメーション決定領域であり、そしてＳ1 及び
Ｓ2 は任意のペプチドスペーサーであり、Ｆ1 はドナー螢光団又は発色団であり
、そしてＦ2 はアクセプター螢光団又は発色団であり、又は逆に、Ｆ2 はドナー
螢光団又は発色団であり、そしてＦ1 はアクセプター螢光団又は発色団であり、
あるいはＦ1 及びＦ2 は同一（蛍光団又は発色団）であり得る〕を有する。プロ
テアーゼ結合部位は、そのプロテアーゼ活性をインジケーターが示すように企画
されているプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列（ペプ
チド）を提供する。プロテアーゼ結合部位は、典型的には、２アミノ酸〜約12ア
ミノ酸、２〜約10、２〜約８、２〜約６、又は２〜約４アミノ酸の長さの範囲の
ペプチドである。
【００４２】 好ましいコンホメーション決定領域は、分子中に曲げ（bend) を導入するか、
又はペプチド主鎖の自由度を制限するアミノ酸配列である。２つのコンホメーシ
ョン決定領域の組合された効果は、それぞれＣ1 及びＣ2 のアミノ末端及びカル
ボキシ末端に結合された螢光団を並置することである。従って、螢光団は好まし
くは、約 100Å以下の距離でお互いに隣接して位置する。螢光団（Ｆ1 及びＦ2
）は典型的には、それらはリンカーに結合され得るけれども、コンホメーション
決定領域に直接的に接合される。存在する場合、任意のスペーサー（Ｓ1 及びＳ 2 ）が、固体支持体に組成物を、又は生物学的サンプルの成分（たとえば細胞膜
）に組成物を連結するために使用される。スぺーサーはまた、追加のまたは他の
官能性を提供することができる。例えば、スペーサーは、HPLCによるペプチドの
容易な検出のため、光学シグナルを提供するようにアミノ酸GYを含むことが出来
る。
【００４３】 実質的にコンホメーション決定領域は、組成物のプロテアーゼ特異性を高める
。コンホメーション決定領域を含んで成るアミノ酸配列は、典型的には、お互い
との及び結合された螢光団との立体的妨害により、酵素にほとんど近づくことが
できない。これに対して、プロテアーゼ結合部位は、螢光団又はコンホメーショ
ン決定領域のいづれかにより比較的妨げられず、そしてそのため、プロテアーゼ
に容易に接近することができる。
【００４４】 II．プロテアーゼ結合部位 好ましい態様において、プロテアーゼ結合部位及びコンホメーション決定領域
は、連続したアミノ酸配列（ペプチド）を形成する。プロテアーゼ結合部位は、
特定のプロテアーゼにより認識され、そして切断されるアミノ酸配列である。種
々のプロテアーゼが特定のアミノ酸に隣接するペプチド結合を切断することは良
く知られている。従って、たとえば、トリプシンは、塩基性アミノ酸、たとえば
アルギニン及びリジンに続くペプチド結合を切断し、そしてキモトリプシンは、
大きな疎水性アミノ酸残基、たとえばトリプトファン、フェニルアラニン、チロ
シン及びロイシンに続くペプチド結合を切断する。セリンプロテアーゼは、小さ
な疎水性残基、たとえばアラニンに続くペプチド結合を切断する。
【００４５】 しかしながら、特定のプロテアーゼは、正しい隣接したアミノ酸を有するタン
パク質におけるあらゆる結合を切断しないであろう。むしろ、プロテアーゼは、
個々の特定のプロテアーゼのための認識ドメインとして作用する特定のアミノ酸
配列に対して特異的である。特定の理論により結びつけられないが、折りたたま
れた球状タンパク質における多くの他の可能性ある部位よりも特定の切断部位の
ための特定のプロテアーゼの選択はその可能性ある切断部位のアミノ酸配列及び
また、それらのコンホメーション及びコンホメーション柔軟性により主として決
定され得ると思われる。
【００４６】 従って、たとえば、制限されたタンパク質分解生成物、たとえばスブチリシン
と呼ばれるプロテアーゼを用いて一本鎖の折りたたまれたタンパク質リボヌクレ
アーゼ−Ａからリボヌクレアーゼ−Ｓ（２種のポリペプチド鎖から成る非共有複
合体）を得る。同様に、トリプシン消化により一本鎖スタフィロコーカス（Stap
hylococcus)ヌクレアーゼから二本鎖非共有複合体、すなわちスタフィロコーカ
スヌクレアーゼ−Ｔを得る。他の基質よりも１つの基質に対する特定のプロテア
ーゼの選択のもう１つの例は、ヒト線維芽細胞型コラゲナーゼである。このプロ
テアーゼは、両タイプＩ及びタイプIII 可溶性コラーゲン基質が同じコラゲナー
ゼ感受性Gly-Ile 又はGly-Leu 結合をたとえ含んでいたとしても、タイプIII 可
溶性コラーゲンよりもタイプＩの方を好む（たとえば、Brikedal-Hansen など.,
(1993) Crit. Rev. in Oral Biology and Medicine 4 : 197-250を参照のこと）
。
【００４７】 認識ドメインを含み、そしてそれ故に、プロテアーゼにより認識され、そして
切断され得るいづれかのアミノ酸配列が、本発明の螢光発生プロテアーゼインジ
ケーター組成物の“プロテアーゼ結合部位”のために適切である。既知のプロテ
アーゼ基質配列及びプロテアーゼのペプチドインヒビターは、それらが切断され
、又はそれらが阻害する特定のプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列を有
する。従って、既知の基質及びインヒビター配列は、プロテアーゼ認識領域への
使用のために適切な基本的配列を提供する。本発明の組成物におけるプロテアー
ゼ結合ドメインとして使用するために適切な多くのプロテアーゼ基質及びインヒ
ビター配列は表２に示されている。当業者は、これが完全な列挙ではなく、そし
て他のプロテアーゼ基質又はインヒビター配列が使用され得ることを認識するで
あろう。
【００４８】 プロテアーゼ結合部位を含むアミノ酸残基は、従来、特定のプロテアーゼによ
り加水分解されるペプチド結合に対して番号付けされている。従って、切断され
たペプチド結合のアミノ側上の第１のアミノ酸残基は、Ｐ1 として命名され、そ
して切断されたペプチド結合のカルボキシル側上の第１のアミノ酸残基はＰ1'と
して命名される。残基の番号は、加水分解されたペプチド結合から離れた距離ほ
ど多くなる。従って、４つのアミノ酸プロテアーゼ結合領域は、 P2-P1-P1'-P2' と称するアミノ酸を含み、そしてプロテアーゼは、Ｐ1 とＰ1'との間の結合領
域を切断する。
【００４９】 好ましい態様において、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのプロ
テアーゼ結合領域は、切断部位に対して対称であるように選択される。従って、
たとえば、結合領域がIle-Pro-Met-Ser-Ile(たとえばα−１抗−トリプシン）で
あり、そして切断がMet とSer との間で生じる場合、この配列に基づく４つのア
ミノ酸残基結合領域は、
【００５０】
【化４】
【００５１】 である。より長い配列から選択される結合ドメインの他の例は、表２に提供さ
れている。プロテアーゼ結合ドメイン内に存在しない残るアミノ又はカルボキシ
ル残基は、下記に説明されるように一定の制限を受けやすいコンホメーション決
定領域の一部として残存することができる。従って、本発明の例においては、ア
ミノ末端Ile はB05449(2)、Ｃ1 コンホメーション決定領域中に組込まれ得る。 種々のアミノ酸置換が、結合特異性を高め、反応性側鎖を排除し、又は分子の
コンホメーションエントロピーを減じる（自由度を低める）ために、プロテアー
ゼ結合ドメインを含んで成るアミノ酸に行なわれ得る。従って、たとえば、酸化
できる硫黄を担持するメチオニン(Met) 残基をノルロイシンにより置換すること
が時々所望される。従って、与えられる例においては、好ましいプロテアーゼ結
合領域は、次の配列：
【００５２】
【化５】 を有するであろう。
【００５３】 コンホメーション決定領域 コンホメーション決定領域（Ｃ1 及びＣ2 ）は、本発明の螢光発生プロテアー
ゼインジケーター分子のペプチド主鎖を固定し、そしてその中に曲げを導入する
、プロテアーゼ切断領域のいづれかの端でのペプチド領域である。２種のコンホ
メーション決定領域及び比較的直線状のプロテアーゼ切断領域の組合せは、“Ｕ
”形状の基部（中央）で切断部位を有する、おおよそＵ−形状の分子を生成する
。用語Ｕ−形状とは、もちろん、おおよそであり、すなわち螢光団が近接した並
置（たとえば約 100Å以下）下で比較的固定して保持されることを意味する。
【００５４】 １つの態様において、アミノ酸、たとえばプロリン(Pro）及びα−アミノ酪酸
(Aib) の両者が、ペプチド分子中に曲げを導入し、そしてペプチド主鎖の固定性
を高めるために選択される。Ｃ1 及びＣ2 ドメインは、Ｕ形状の“アーム”が固
定され、そして結合された螢光団が約 100Å以下の距離、分離してお互い隣接し
て位置するように選択される。ペプチド主鎖の必要な剛性及び螢光団の配置を維
持するためには、コンホメーション決定領域は、好ましくは４個の長さ又はそれ
以下の長さのアミノ酸であり、又は他方では、約18個以上の長さのアミノ酸であ
り、そして安定したαヘリックスコンホメーション又はβ−プリーツシートを形
成する。
【００５５】 Ａ）テトラペプチド結合部位組成物 好ましい態様において、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのペプ
チド主鎖は、トリペプチドＣ1 領域、テトラペプチドＰ領域及び単一アミノ酸又
はジペプチドＣ2 領域を含むであろう。
【００５６】 それらの化合物は、下記式：
【化６】
【００５７】 〔式中、Ｙは、
【化７】 のいづれかである〕
【００５８】 により表わされ得る。それらの式において、ペプチド結合領域は−Ｐ2 −Ｐ1
−Ｐ1'−Ｐ2'−として示され、そしてコンホメーション決定領域Ｃ1 及びＣ2 の
アミノ酸残基はそれぞれ−Ｃ1 5−Ｃ1 4−Ｃ1 3−及び−Ｃ2 3−Ｃ2 4−として示され
る。Ｃ2 領域は、アミノ酸か又はジペプチドのいづれかであり得る。Ｃ2 領域が
ジペプチドであろうと又はアミノ酸であろうと、Ｆ2 螢光団及びＳ2 スペーサー
は、存在する場合、Ｃ2 のカルボキシル末端残基に常に結合される。スペーサー
がＣ2 領域に存在する場合、それはαカルボキシル基にペプチド結合によりＣ2
のカルボキシル末端残基を結合される。
【００５９】 上記で示されたように、コンホメーション決定領域は典型的には、分子中に曲
げを導入し、そしてその剛性を高めるアミノ酸残基、たとえばプロリン(Pro) を
含む。しかしながら、プロテアーゼ結合領域（Ｐ）の末端残基がそれら自体、曲
げを創造する残基、たとえばプロリンである場合、その末端に結合されるＣ領域
においてＰに接近した位置で曲げを創造する残基を配置することは必要でないこ
とを当業者は理解するであろう。従って、コンホメーション決定領域は、上記の
ようにプロテアーゼ結合領域をまず決定し、コンホメーション決定領域に存在す
る“残りの”残基を決定し、そして必要なら、次のガイドラインに従ってそれら
の残基を変性することによって企画される：
【００６０】 １．Ｐ2'部位がPro でない場合、Ｃ2 はジペプチド（式III ）Pro-Cys, Aib-C
ys, Pro-Lys 、又はAib-Lys であり、そして逆に、Ｐ2'部位がPro である場合、
Ｃ2 は単一のアミノ酸残基（式IV）Cys 又はLys である。 ２．Ｐ2 部位がPro でない場合、Ｃ1 はAsp-C1 4-Pro, Asp-C1 4-Aib, Asp-Aib-
Pro, Asp-Pro-C1 3, Asp-Aib-C1 3, Asp-Pro-Aib又はAsp-Aib-Aib から成るトリペ
プチドであり、そしてＰ2 部位がPro 残基である場合、基Ｃ1 はAsp-C1 4-C1 3 又
はAsp-C1 4-Aib から成るトリペプチドである。 ３．Ｐ3 (C1 3) 残基がPro である場合、Ｃ1 はAsp-C1 4-Pro 又はAsp-Aib-Pro
から成るトリペプチドである。
【００６１】 ４．Ｐ4 (C1 4) 残基がPro である場合、Ｃ1 はAsp-Pro-C1 3 又はAsp-Pro-Aib
から成るトリペプチドである。 ５．Ｐ2 及びC1 3 が両者ともプロリンでない場合、Ｃ1 はAsp-Pro-C1 3, Asp-A
ib-C1 3, Asp-C1 4-Pro, Asp-C1 4-Aib, Asp-Pro-Aib 又はAsp-Aib-Pro から成るト
リペプチドである。 上記のように、いづれかのメチオニン(Met）がノルロイシン(Nle) により置換
され得る。Ｃ1 、及びＣ2 から成る多くの適切なペプチド主鎖が第２表に提供さ
れる。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
【表４】
【００６５】 Ｂ）他の結合部位を有するインジケーター もう１つの好ましい態様においては、結合部位（Ｐ）は、２〜約12個の長さの
アミノ酸の範囲である。幾分大きなコンホメーション決定領域がインジケーター
分子の自由度の程度を十分に制限することができ、すなわちその螢光団が結合〔
認識〕ドメイン（Ｐ）のアミノ酸配列にかかわりなく、適切に消光されることが
本発明の発見であった。１つの好ましい態様において、それらの組成物は、下記
【００６６】 式Ｖ：
【化８】
【００６７】 で表わされる化合物を含む。この式において、Ｐは、プロテアーゼ結合部位を
含んで成るペプチドであり、そして２〜約12個のアミノ酸から成り、Ｆ1 及びＦ 2 は螢光団であり、ここでＦ1 は組成物（スペーサーを除く）のアミノ末端アミ
ノ酸に結合され、そしてＦ2 はカルボキシル末端アミノ酸に結合される。Ｓ1 及
びＳ2 は、存在するなら、１〜約50個の長さのアミノ酸の範囲のペプチドスペー
サーであり、そしてＳ1 は、存在するなら、アミノ末端アミノ酸に結合され、そ
してＳ2 は、存在するなら、カルボキシル末端アミノ酸に結合される。下付き文
字ｉ，ｊ，ｋ，ｍ，ｎ，ｏ，ｐ，ｑ及びｒは独立して０又は１である。
【００６８】 特に好ましい態様においては、aa1 及びaa10は、リシン、オルニチン及びシス
テインから成る群から独立して選択され；aa2, aa3,aa8 及びaa9 は、Asp 、Glu
、Lys 、オルニチン、Arg 、シトルリン、ホモシトルリン、Ser 、ホモセリン
、Thr 、及びTyr から成るアミノ酸又はジペプチドから成る群から独立して選択
され；aa5, aa4, aa6 及びaa7 はプロリン、３，４−デヒドロプロリン、ヒドロ
キシプロリン、α−アミノイソ酪酸及びＮ−メチルアラニンから成る群から独立
して選択され；
【００６９】 ＸはGly,βAla,γAbu, Gly-Gly, Ahx,βAla-Gly,βAla-βAla,γAbu-Gly,βAl
a-γAbu, Gly-Gly-Gly, γAbu-γAbu, Ahx-Gly, βAla-Gly-Gly,Ahx-βAla,βAl
a-βAla-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, Ahx-γAbu,βAla-βAla-βAla,γAbu-βAla-Gl
y,γAbu-γAbu-Gly, Ahx-Ahx, γAbu-γAbu-βAla 、及びAhx-Ahx-Gly から成る
群から選択され；ＹはGly,βAla,γAbu, Gly-Gly, Ahx,Gly-βAla,βAla-βAla,
Gly-γAbu,γAbu-βAla, Gly-Gly-Gly,γAbu-γAbu, Gly-Ahx, Gly-Gly-βAla,
βAla-Ahx,Gly-βAla-βAla, Gly-Gly-Gly-Gly, γAbu-Ahx,βAla-βAla-βAla,
Gly-βAla-γAbu,Gly-γAbu-γAbu, Ahx-Ahx, βAla-γAbu-γAbu 、及びGly-Ah
x-Ahx から成る群から選択される。
【００７０】 ｉが１である場合、Ｓ1 は、aa1 の末端αアミノ基を通してペプチド結合によ
りaa1 に結合され；そしてγが１である場合、Ｓ2 は、aa10の末端αカルボキシ
ル基を通してペプチド結合によりaa10に結合される。それらのアミノ酸の１又は
複数のアミノ酸が不在である場合、螢光団は残る末端アミノ酸に結合される。 そのような特に好ましい組成物のアミノ酸主鎖は、第３表及び第４表に列挙さ
れる。
【００７１】
【表５】
【００７２】
【表６】
【００７３】
【表７】
【００７４】
【表８】
【００７５】
【表９】
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
【表１２】
【００７９】
【表１３】
【００８０】
【表１４】
【００８１】
【表１５】
【００８２】
【表１６】
【００８３】 IV．螢光団 入射光線により励起された螢光団は光を吸収し、そして次に、異なった（長い
）波長で光を再発光する。しかしながら、“レセプター”として知られる第２種
類の分子の存在下で、いわゆるドナー螢光団により発光された光は、レセプター
により吸収され、それにより、ドナーの螢光シグナルを消光する。従って、螢光
団／発色団に対立するものとして、２種の螢光団の使用は、ドナーの発光スペク
トルとレセプターの励起スペクトルとの間でのオーバーラップの明確な評価を可
能にする。これは、消光の最適化を可能にするペプチド主鎖の設計を促進する。
これは、低濃度のプロテアーゼ活性の検出を促進する高い効率のドナー／レセプ
ター対をもたらす。従って、螢光団／発色団の組合せが適切であるけれども、好
ましい態様においては、本発明の螢光発生プロテアーゼインヒビターは２種の螢
光団を含むであろう。
【００８４】 “ドナー”及び“レセプター”分子は典型的には、レセプター分子の吸収スペ
クトルが、ドナー分子の発光スペクトルと、できるだけ広くオーバーラップする
ように、調和した対として選択される。さらに、ドナー及びレセプター螢光団は
好ましくは、ドナー分子の吸収及び発光スペクトルが可視範囲 (400nm 〜約 700
nm) に存在するように選択される。それにより、螢光団は、生物学的サンプルに
おいて検出できるシグナルを提供し、従って、生物学的流体、組織ホモジネート
、組織断片及び同様のものにおけるプロテアーゼ活性の検出を促進する。多くの
螢光団の発光スペクトル、吸収スペクトル及び化学組成は、当業者に良く知られ
ている（たとえば、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,
R. P. Hauglond, ed.を参照のこと、これは引用により本明細書に組込まれる）
。
【００８５】 好ましい螢光団対は、ローダミン誘導体を包含する。従って、たとえば５−カ
ルボキシテトラメチルローダミン又は５−及び／又は６−カルボキシテトラメチ
ルローダミン（９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス−（ジメ
チルアミノ）キサンチリウムクロライド（５−TMR)及び９−（２，６−ジカルボ
キシフェニル）−３，６−ビス−（ジメチルアミノ）キサンチリウムクロライド
（６−TMR)）のスクシンイミジルエステル、（Molecular Probes,
【００８６】 Eugene, Oregon, USA から入手できるC211及びＣ1171）（式VI）は、特に好ま
しいドナー分子であり：
【化９】
【００８７】 そしてローダミンＸアセトアミド（Molecular ProbesからのR492）（式VII ）
【化１０】
【００８８】 又は５−及び／又は６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（９−（２，５−ジカル
ボキシフェニル）−２，７−ジメチル−３，６−ビス−（エチルアミノ）キサン
テン（５−DER)及び９−（２，６−ジカルボキシフェニル）−２，７−ジメチル
−３，６−ビス−（エチルアミノ）キサンテン（６−DER)）、のスクシンイミジ
ルエステル、Ｃ1309として得られる混合異性体（Molecular ProbesからのＣ1309
）は特に好ましいレセプター分子である。
【００８９】 それらの螢光団は、このドナー／レセプター対の両メンバーの励起及び発光が
可視波長に存在し、分子が高い励起係数を有し、そして分子が溶液において高い
螢光収率を有するので、特に好ましい。励起係数は発光団による特定波長での光
吸収の測定であり、そして従って、シグナルを消光するその能力に関連し、とこ
ろが螢光収率は再発光された光に対する吸収された光の割合であり、そして螢光
団の効率の測定値であり、そして従って、プロテアーゼインジケーターの感度に
影響を及ぼす。
【００９０】 他の好ましい螢光団には、９−（２−カルボキシフェニル）−２，７−ジメチ
ル−３，６−ビス（エチルアミノ）キサンチリウム、９−（２−カルボキシフェ
ニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウム、及び９−（２−カル
ボキシフェニル）−キサンチリウムが含まれるが、これらに限定されない。 もちろん、最とも好ましいものではないが、紫外線範囲下で吸収し、そして発
光する螢光団もまた、本発明のプロテアーゼインジケーターに使用され得る。螢
光団の１つの特に好ましい紫外線吸収対は、ドナー分子として下記７−ヒドロキ
シ−４−メチルクマリン−３−酢酸（式VIII）：
【００９１】
【化１１】
【００９２】 及びレセプター分子として下記７−ジエチルアミノ−３−（（４’−ヨードア
セチル）アミノ）フェニル）−４−メチルクマリン（式IX）：
【００９３】
【化１２】
【００９４】 である。それらの及び他の螢光団は、多くの製造業者、たとえばMolecular Pr
obes（Eugene, Oregon, USA)から市販されている。 調和された吸収及び発光スペクトルを有する螢光団が本発明の実施下で必要と
されないことは驚くべき発見である。事実、単一種の螢光団は、Ｆ1 及びＦ2 に
より支配される位置における本発明のポリペプチド主鎖に連結される場合、それ
自体、消光することができる。さらに、この消光は、ペプチド主鎖が切断される
場合、十分に開放される。
【００９５】 特定の理論に基づくものではないが、消光は、２種の螢光団の電子軌道が相互
作用し、可逆的消光をもたらす、基底状態ダイマーの形成により達成されると思
われる。それは、基底状態ダイマーを効果的に形成するために螢光団を十分に接
近せしめる、本発明のペプチド主鎖の限定されたコンホメーションエントロピー
である。
【００９６】 Ｈ−タイプダイマーからの特に好ましい分子。螢光分子によるＨ−タイプダイ
マーの形成は、Packard など. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 1164
0-11645 により記載される。このＨ−タイプダイマーは、吸収スペクトルにおけ
る励起バンド及び螢光消光により特徴づけられる（たとえば、Valdes-Aguilera
など. (1989) Acc. Chem. Res., 22 : 171-177及びPackard など. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 11640-11645 を参照のこと）。 従って、好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼインジケーターは、
単一種の螢光団のみ、より好ましくは、Ｈ−タイプダイマーを形成できる螢光団
を包含する。
【００９７】 NorFesは、セリンプロテアーゼエラスターゼのための認識配列及び切断部位を
含むウンデカペプチドである。NorFesがアミノ酸配列の反対の部位上で種々の螢
光団により二重にラベルされる場合、螢光は、分子内グラウンド状態ダイマーの
形成のために消光された。それらのダイマーのスペクトル特徴は、励起理論によ
り予測できた。
【００９８】 温度の上昇につれてダイマー／モノマー比の低下は、染料分子間の分子間引力
を示した。テトラメチルローダミンから構成されるホモダイマーの破壊の活性化
の自由エネルギーは少なくとも 1.7Kcal／モルであり、そしてジエチルローダミ
ンの場合、 2.4Kcal／モルであった。励起ダイマーを形成する螢光団の分子間引
力のために、結合するアミノ酸配列は本明細書に記載される最適配列からはずれ
る。従って、励起−形成螢光団が使用される場合、アミノ酸置換が本明細書に記
載される“主鎖”において行なわれ得、そして活性はまだ維持され得る。
【００９９】 特に好ましい励起−形成螢光団は、カルボキシテトラメチルローダミン、カル
ボキシローダミン−Ｘ、カルボキシローダミン110、ジエチルアミノクマリン及
びカルボシアニン染料を包含するが、これらに限定されない。この態様において
は、単一の螢光団のみが使用されるので、発光又は吸収スペクトルを適合する必
要はない。従って、広範囲の種類の螢光団が効果的に使用され得る。さらに、単
一の螢光団の使用は合成化学をひじょうに単純化する。
【０１００】 本発明のホモ−二重ラベルされたインジケーター（単一種の螢光団によりラベ
ルされたインジケーター）はまた、螢光測定の他に、吸光測定による酵素活性の
検出を可能にする。吸収スペクトルにおける青色−シフトされた励起バンド（又
は青色−シフトされた吸収最大値）はＨ−ダイマー形成を示し、そして螢光消化
が後者と同時に生じるので、吸収スペクトルの測定は正しい設定における診断手
段として十分であり得る。二重にラベルされたプロテアーゼインジケーターが特
定のプロテアーゼにより切断される場合、Ｈ−タイプのダイマーが破壊される。
次に、Ｈ−タイプのダイマーに関連する青色−シフトされた吸収最大値が失なわ
れる。従って、青色−シフトされた励起バンドでの吸収強度を測定する場合、Ｈ
−タイプのダイマーが破壊されるにつれて、吸収強度の低下が予測され、ところ
が、モノマー最大ピークでの吸収強度は上昇することが予測される。
【０１０１】 ある高スループットスクリーニング系における使用のために好ましいのは、ロ
ーダミン、又はシアニン色素、例えばシアニン及びシアニン類似体と共に製剤化
される本発明のインジケーターである。特に好ましい態様はカルボシアニン色素
、更に好ましくはジアルキル化カルボシアニン色素、例えば例６に記載するもの
を用いる。適当なシアニン色素にはN-エチル-N'-[5-(N"-サクシンイミジルオキ
シカルボニル)ペンチル]インドカルボシアニンクロライド、及びN-エチル-N'-[5
-(N"-サクシンイミジルオキシカルボニル)ペンチル]-3,3,3',3-テトラメチル-2,
2-インドジカルボシアニンクロライドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】 Ｖ．螢光発生プロテアーゼインジケーターの調製 本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、まず、ペプチド主鎖、すな
わちプロテアーゼ切断部位（Ｐ）、２種のコンホメーション決定領域（Ｃ1 及び
Ｃ2 ）、及び存在するなら、スペーサー（Ｓ1 及びＳ2 ）を合成することによっ
て好ましくは調製される。次に、螢光団がペプチドに化学的に接合される。螢光
団は好ましくは、ペプチドに直接的に接合されるが、しかしながら、それらはま
た、リンカーを通してもペプチドに結合される。最後に、螢光発生プロテアーゼ
インジケーターが固体支持体に結合される場合、次に、それは直接的に又はリン
カーを通して、スペーサー（Ｓ1 又はＳ2 ）を経て固体支持体に化学的に接合さ
れる。
【０１０３】 Ａ）ペプチド主鎖の調製 配列のＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列における残る
アミノ酸を連続的に付加する固相ペプチド合成は、本発明の化合物のペプチド主
鎖を調製するための好ましい方法である。固相合成のための技法は、次の文献に
記載されており：Barany and Merrifield, Solid−Phase Peptide Synthesis :
pp. ３〜284, The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology, Vol.２：Specia
l Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al,J. Am. Chem.
Soc. 85, 2149〜2156 (1963) 、及びGross and Meienhofer, eds. Academic Pre
ss, N. Y., 1980及びStewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,２nd ed.
Pierce Chem. Co., Rockford,III .(1984) ; これらは引用により本明細書に組
込まれる。固相合成は、FMOC又はTBOC化学を用いて市販のペプチド合成機により
最とも容易に達成される。螢光助剤プロテアーゼインジケーターのペプチド成分
の化学合成は、例１及び２に詳細に記載されている。
【０１０４】 特に好ましい態様においては、ペプチド合成は、Fmoc合成化学を用いて実施さ
れる。Asp, Ser, Thr 及びTyr の側鎖が好ましくは、ｔ−ブチルチオを用いて保
護され、そしてCys 残基の側鎖はS-トリチル及びS-t-ブチルチオにより保護され
、そしてLys 残基が好ましくは、リシン残基のためのｔ−Boc, Fmoc 及び4-メチ
ルトリチルを用いて保護される。適切に保護されたアミノ酸試薬は市販されてい
る。複数の保護基の使用は、選択的なブロック解除及びいづれか特定の所望する
側鎖への螢光団の結合を可能にする。
【０１０５】 従って、たとえば、t-Boc 保護解除は、ジクロロメタン中、TFA を用いて達成
され、Fmoc保護解除はDMF 又はＮ−メチルピロリドン中、20％(v/v)ピペリジン
を用いて達成され、そして4-メチルトリチル保護解除は水中、１〜５％(v/v)TFA
、又はDCM 中、１％ TFA又は５％トリイソプロピルシランを用いて達成される
。S-t-ブチルチオ保護解除は水性メルカプトエタノール（10％）を用いて達成さ
れ、ｔ−ブチル及びｔ−boc 、及びS-トリチル保護解除は、TFA : フェノール：
水：チオアニソール：エタンジチオール（85:5:5:2.5:2.5)を用いて達成され、
そしてｔ−ブチル及びｔ−Boc 保護解除はTFA : フェノール：水（95:5:5）を用
いて達成される。詳細な合成、保護解除、及び螢光団結合法は、例１及び２に提
供される。
【０１０６】 他方、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターのペプチド成分は、組換
えDNA 技法を用いても合成され得る。手短に言及すれば、所望するアミノ酸配列
をコードするDNA 分子が、Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22 : 1859
〜1862 (1981) により記載される固相ホスホラミジット法、Matleucci 、など.
、J. Am. Chem. Soc., 103 : 3185 (1981)（両者は引用により本明細書中に組込
まれる）を包含する当業者に知られている種々の方法、又は当業者に知られてい
る他の方法により化学的に合成される。好ましくは、DNA は、標準方法を用いて
の市販のDNA 合成機に基づいて標準のβ−シアノエチルホスホラミジットを用い
て合成され得る。
【０１０７】 オリゴヌクレオチドは、必要なら、当業者に良く知られている技法により精製
され得る。典型的な精製法は、ゲル電気泳動、アニオン交換クロマトグラフィー
（たとえばMono-Qカラム、 Pharmacia−LKB, Piscataway, New Jersey, USA) 又
は逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を包含するが、但しこれらだけに
は限定されない。タンパク質及びペプチド精製の方法は、当業者に良く知られて
いる。標準方法のレビューのためには、Methods in Enzymology, Volume 182 :
Guide to Protein Purification, M. Deutscher, ed. (1990), 619〜626 ページ
（これは、引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【０１０８】 オリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチドによるアニーリング、又は
DNA ポリメラーゼによる重合により二本鎖DNA に転換され得る。次に、DNA がプ
ロモーターの制御下でベクター中に挿入され、そして宿主細胞を形質転換するた
めに使用され、その結果、細胞がコードされたペプチド配列を発現する。ペプチ
ドのクローニング及び発現の方法は当業者に良く知られている。たとえば、Samb
rook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(２nd Ed., Vols. １
−３, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Methods in Enzymology, Vol.
152 : Guids to Molecular Cloning Technigues (Berger and Kimmel (eds.),
San Diego : Academic Press, Inc. (1987))、又はCurrent Protocols in Molec
ular Biology, (Ausubel, et al. (eds.), Greens Publishing and Wiley−Inte
rscience, New York (1987) （これらは、引用により本明細書に組込まれる）を
参照のこと。
【０１０９】 Ｂ）ペプチド主鎖への螢光団の連鎖 螢光団は、当業者に良く知られている多くの手段のいずれかによりペプチド主
鎖に連結される。好ましい態様においては、螢光団は、螢光団上の反応部位から
ペプチド上の反応基、たとえば末端アミノ又はカルボキシル基に、又はアミノ酸
側鎖上の反応性基、たとえばアミノ、ヒドロキシル、又はカルボキシル成分に直
接的に連結される。多くの螢光団は通常、適切な反応部位を含む。他方、螢光団
は、他の分子への連鎖のために反応性部位を付与するよう誘導体化され得る。第
２分子への結合のために官能基により誘導体化された螢光団は、種々の製造業者
から入手できる。誘導体化は、螢光団自体上の基の単純な置換によることができ
、又はリンカーへの接合によることができる。種々のリンカーが当業者に良く知
られており、そして下記に論ぜられる。
【０１１０】 上記のように、好ましい態様においては、螢光団は、プロテアーゼインジケー
ターのペプチド主鎖に直接連結される。従って、たとえば、５’−カルボキシテ
トラメチルローダミン（Ｃ2211）螢光団は、式Ｖに示されるようにアミノ酸のα
アミノ基を通してアスパラギン酸に連結され得る。ローダミンＸアセトアミド（
R492）のヨードアセトアミド基は、式VIに示されるように、システインのスルフ
ヒドリル基との反応により連結され得る。そのような連結を実施する手段は、当
業者に良く知られており、そして１つのそのような連結の詳細が例１に提供され
る。
【０１１１】 当業者は、ペプチドスペーサー（Ｓ1 又はＳ2 ）が存在する場合（下記で論ぜ
られるように）、螢光団は好ましくは、スペーサー自体がそれぞれＣ1 又はＣ2
の末端アミノ及びカルボキシル基とペプチド連鎖を形成するにつれて、Ｃ1 又は
Ｃ2 の末端アミノ酸の側鎖上の反応性基を通してコンホメーション決定領域に連
結されることを理解するであろう。
【０１１２】 Ｃ）スペーサーペプチドの選択及び固体支持体への連鎖 本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターは、溶液で得られ、又は固体支
持体に連結され得る。“固体支持体”とは、本発明の螢光発生プロテアーゼイン
ジケーターを用いてのプロテアーゼ活性についてのアッセイのために使用される
溶液に存在するいづれの成分にも溶解せず又はその成分と反応せず、そして螢光
発生分子の結合のための官能基を提供するいづれかの固体材料を意味する。
【０１１３】 固体支持材料は当業者に良く知られており、そしてシリカ、調節された多孔性
ガラス(CPG) 、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、カルボキシル変性テ
フロン（登録商標）、デキストラン、誘導体化された多糖類、たとえばアミノ、 カルボキシル又はスルフヒドリル基を担持する寒天、種々のプラスチック、たと えばポリエチレン、アクリル樹脂、及び同様のものを包含するが、但しこれらだ けには限定されない。“半固体”支持体、たとえば細胞及びリポソームに見出さ れるような脂質膜もまた使用される。当業者は、固体支持体が、リンカーの結合 又はペプチドの直接的な結合のための反応性部位を供給するために官能基（たと えばヒドロキシル、アミン、カルボキシル、エステル、及びスルフヒドリル）に より誘導体化され得ることを理解するであろう。
【０１１４】 螢光助剤プロテアーゼインジケーターは、螢光団を通して、又はインジケータ
ーを含むペプチド結合を通して、直接的に固体支持体に連結され得る。ペプチド
主鎖を通しての連鎖が、最とも好ましい。 ペプチド主鎖を通して固体支持体に連結することが所望される場合、そのペプ
チド主鎖は、追加のペプチドスペーサー（式ＩにおいてＳ1 又はＳ2 と命名され
ている）を含むことができる。そのスペーサーは、ペプチド主鎖のアミノ又はカ
ルボキシル末端で存在し、そして約１〜約50個のアミノ酸、より好ましくは１〜
約20個及び最とも好ましくは１〜約10個のアミノ酸の長さのものであり得る。特
に好ましいスペーサーは、Asp-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys, Lys-Glu
-Asp-Gly-Gly-Asp-Lys, Asp-Gly-Ser-Gly-Glu-Asp-Glu-Lys 、及び Lys-Glu-Asp
-Glu-Gly-Ser-Gly-Asp-Lysを包含する。
【０１１５】 ペプチドスペーサーのアミノ酸組成は、スペーサーが支持体から分子の活性成
分を分離するように作用し、それにより所望しない相互作用を妨げる場合、臨界
ではない。しかしながら、スペーサーのアミノ酸組成は、リンカー又は固体支持
体自体が容易に結合される側鎖を有するアミノ酸（たとえばシステイン又はリシ
ン）を供給するよう選択され得る。他方、リンカー又は固体支持体自体は、Ｓ1
のアミノ末端又はＳ2 のカルボキシル末端に結合され得る。
【０１１６】 好ましい態様においては、ペプチドスペーサーは実際、リンカーにより固体支
持体に連結される。用語“リンカー”とは、本明細書で用いられる場合、他の分
子にペプチドを連結するために使用され得る分子（たとえば、固体支持体、螢光
団、等）を意味する。リンカーは、ペプチドと共有結合を形成することができる
第１反応部位及び固体支持体上の反応性基と共有結合を形成することができる第
２反応部位を供給するホモ二官能性分子である。ペプチド（スペーサー）との共
有結合は、末端カルボキシル又はアミノ基のいづれかを通してであり、又はアミ
ノ酸側鎖上の反応性基による（たとえばシステインへのジスルフィド結合を通し
て）。
【０１１７】 適切なリンカーは、当業者に良く知られており、そして直鎖又は枝分れ鎖の炭
素リンカー、複素環式炭素リンカー又はペプチドリンカーを包含するが、但しこ
れらだけには限定されない。上記のように、リンカーは、それらの末端カルボキ
シル又はアミノ基を通して、又はそれらの反応性側鎖基を通してカルボキシル及
びアミノ末端アミノ酸に連結され得る。
【０１１８】 特に好ましいリンカーは、アミノ基、カルボキシル基、又はスルフヒドリルに
対して共有結合を形成することができる。アミノ結合リンカーは、反応性基、た
とえばカルボキシル基、イソシアネート、イソチオシアネート、エステル、ハロ
アルキル、及び同様のものを包含する。カルボキシル−結合リンカーは、反応性
基、たとえば種々のアミン、ヒドロキシル及び同様のものを形成することができ
る。最後に、スルフヒドリル−／結合リンカーは、反応性基、たとえばスルフヒ
ドリル基、アクリレート、イソチアシネート、イソシアネート及び同様のものを
包含する。
【０１１９】 特に好ましいリンカーは、固体支持体上に見出されるスルフヒドリル基により
アミノ基（たとえばペプチドにおけるリシン残基上に見出されるアミノ基）を連
結するために、又は固体支持体上に見出されるアミノ基によりスルフヒドリル基
（たとえば、ペプチドのシステイン残基上に見出される）を連結するためにスル
ホMBO(ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステ
ル）を包含する。他の特に好ましいリンカーは、EDC(１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミド）及びビス−（スルホスクシンイミジ
ルスベレート）を包含する。他の適切なリンカーは、当業者に良く知られている
。
【０１２０】 本発明の螢光発生化合物は、ドナー螢光団が、分子の切断の後、固体支持体上
に保持されるように、又はドナー螢光団が、切断の後、溶液中に入るように、Ｓ 1 又はＳ2 スペーサーのいづれかを通して固体支持体に連結され得る。前者の場
合、次に支持体がプロテアーゼ活性を検出するために螢光についてアッセイされ
、そして後者の場合、溶液がプロテアーゼ活性を検出するために螢光についてア
ッセイされる。
【０１２１】 VI．プロテアーゼ活性の検出 本発明はまた、種々の情況においてプロテアーゼ活性を検出するために螢光発
生プロテアーゼインジケーターを用いるための方法も提供する。従って、１つの
態様においては、本発明は、実験又は産業目的のために使用されるプロテアーゼ
の原液のプロテアーゼ活性を確証し、又は定量化するために螢光発生インジケー
ターを用いる方法を提供する。使用する前、プロテアーゼ原液のプロテアーゼ活
性の確証は一般的に、プロテアーゼはしばしば、時間の経過と共に活性を失ない
（たとえば、自己加水分解を通して）又はチモーゲン前駆体から活性化される場
合、種々の程度の活性化を示すので推薦される。
【０１２２】 原液のプロテアーゼ活性についてのアッセイは、本発明の螢光発生プロテアー
ゼインジケーターに一定量の原液を添加し、そして螢光の続く上昇を測定するこ
とを単に必要とする。原液及び螢光発生インジケーターはまた結合され得、そし
てプロテアーゼの活性を最適化する“消化緩衝液”においてアッセイされ得る。
プロテアーゼ活性をアッセイするのに適切な緩衝液は当業者に良く知られている
。一般的に、そのpHが特定のプロテアーゼの最適pHに対応する緩衝液が選択され
るであろう。
【０１２３】 たとえば、エラスターゼ活性をアッセイするのに特に適切な緩衝液は、50mMの
リン酸ナトリウム、１mMのEDTA（pH8.9)から成る。その測定は、螢光計、及び螢
光団のための“励起”光源を提供し、そして次に、特定の波長で発光される光を
測定する装置により最とも容易に行なわれる。プロテアーゼを欠く対照のインジ
ケーター溶液との比較は、プロテアーゼ活性の測定を提供する。その活性レベル
は、既知の活性のプロテアーゼ溶液により生成される螢光の変化速度が決定され
る、プロテアーゼ／インジケーターの組合せのための標準曲線を生成することに
よって正確に定量化され得る。
【０１２４】 螢光発生化合物の検出は好ましくは、螢光計を用いて達成されるけれども、検
出は当業者に良く知られている種々の他の方法により達成され得る。従って、た
とえば、本発明の螢光団は可視波長を発光するので、検出は光源による励起に応
答しての螢光の可視検査により単純に行なわれ得る。検出はまた、ディジタイザ
ー又は他の像獲得システムに連結されたビデオカメラを用いて、像分析システム
により行なわれ得る。検出はまた、螢光顕微鏡下でフィルターを通しての可視化
により行なわれ得る。その顕微鏡は、オペレーターにより可視化されるシグナル
を提供する。しかしながら、シグナルは写真フィルム上に又はビデオ分析システ
ムを用いて記録され得る。シグナルはまた、像分析システム又は単なる光度計の
いづれかを用いて即時に単純に定量化され得る。
【０１２５】 従って、たとえば、サンプルのプロテアーゼ活性についての基本的アッセイは
、緩衝液にサンプルを懸濁し、又は溶解し（アッセイされる特定のプロテアーゼ
の最適pHで）、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターの１つを緩衝液に
添加し、そして分光光度計を用いて螢光の得られる変化をモニターすることを包
含するであろう。分光光度計は、ドナー螢光団の励起波長でドナー螢光団を励起
し、そしてドナー螢光団の発光波長でその得られる螢光を検出するよう設定され
るであろう。
【０１２６】 もう１つの態様において、本発明のプロテアーゼ活性インジケーターは、生物
学的サンプルにおけるプロテアーゼ活性の検出のために使用され得る。従って、
好ましい態様においては、本発明は、単離された生物学的サンプル、たとえば唾
液、血液、血液細胞、腫瘍生検及び同様のもの、又は培養物中の細胞又は組織、
又はその断片が包埋されておらず、そして固定されていない断片におけるプロテ
アーゼ活性を検出するための方法を提供する。シグナルは、螢光顕微鏡、螢光マ
イクロプレートリーダー、螢光計、又はフローサイトメーターを用いて定量する
ことができる。
【０１２７】 Ａ）単離された生物学的サンプルのエキソビボアッセイ １の態様において、本発明は単離された生物学的サンプルにおけるプロテアー
ゼ活性の検出方法を提供する。これは、本発明の螢光助剤プロテアーゼインジケ
ーターとサンプルとを単純に接触せしめ、そしてインジケーターの螢光の変化を
時間と共にモニターすることによって決定され得る。サンプルは、上記のように
“消化緩衝液”に懸濁され得る。サンプルはまた、分析の前、たとえば遠心分離
により細胞残骸を除去され得る。
【０１２８】 螢光助剤プロテアーゼインジケーターが固体支持体に結合される場合、アッセ
イは、サンプル溶液にインジケーターを担持する固体支持体を接触せしめること
を包含する。インジケーターがドナー螢光団を担持する分子側により固体支持体
に連結される場合、そのインジケーターの消化に起因する支持体の螢光が上記手
段のいづれかにより時間の経過と共にモニターされるであろう。逆に言えば、レ
セプター分子螢光団が固体支持体に結合される場合、試験溶液が固体支持体上に
通され、そして次に、試験溶液のその得られる発光（切断された螢光団による）
が測定される。ドナー及びアクセプター対は個体支持体及び液体両者において、
同じ蛍光団により置換されうる。この後者のアプローチは、高い処理量の自動ア
ッセイのために特に適切である。
【０１２９】 Ｂ）組織学的断片の現場アッセイ もう１つの態様においては、本発明は組織学的断片における現場プロテアーゼ
活性を検出するための方法を提供する。組織におけるプロテアーゼ活性を検出す
るこの方法は従来技術の方法（たとえば、特異的染色、抗体ラベル、等）よりも
実質的な利点を提供する。なぜならば、単純なラベリングアプローチとは異なっ
て、プロテアーゼインジケーターを用いての現場アッセイは、プロテアーゼの単
純な存在又は不在よりもむしろ実際の活性を示すからである。プロテアーゼは、
しばしば、プロテアーゼラベルを結合することができるそれらの不活性前駆体（
チモーゲン）形で組織に存在する。従って、従来のラベリングアプローチは、組
織のプロテアーゼ活性と共に生理学的状態に関しての情報を提供しない。
【０１３０】 現場アッセイ法は一般的に、組織断片（好ましくは凍結された断片）を供給し
、その断片と本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターの１つとを接触せし
め、そして得られる螢光を可視化することを含んで成る。可視化は好ましくは、
螢光顕微鏡を用いて行なわれる。その螢光顕微鏡は“ドナー”螢光団の螢光を誘
発するために“励起”光源を供給する。顕微鏡は典型的には、得られる螢光の検
出を最適化するためにフィルターを備え付けられている。従って、たとえば、例
１に記載される螢光助剤プロテアーゼインジケーターに関して、Nikon 顕微鏡の
ための典型的なフィルターキューブは、励起フィルター（λ＝550 ±12nm）、二
色ミラー（λ＝580nm)及び干渉−発光フィルター（λ＝580 ±10nm）を含むであ
ろう。上記のように、顕微鏡は、カメラ、光測計又は像獲得システムを備え付け
られ得る。
【０１３１】 断片は好ましくは、固定化又は包埋がサンプル中のプロテアーゼ活性を破壊す
るので凍結断片として切断される。 螢光発生インジケーターは、多くの手段で断片に導入され得る。たとえば、螢
光助剤プロテアーゼインジケーターは、組織断片に適用される、上記のような緩
衝溶液に供給され得る。他方、螢光発生プロテアーゼインジケーターは、半固体
媒体、たとえば組織サンプル上に広げられるゲル又は寒天として供給され得る。
ゲルは、プロテアーゼ活性に応答してシグナルを提供しながら、サンプル中の湿
気の保持を助ける。
【０１３２】 螢光発生プロテアーゼインジケーターはまた、ウェスターンブロットの開発に
類似する方法に使用され得るポリマー、たとえばプラスチックフィルムに接合さ
れて供給され得る。プラスチックフィルムはスライド上の組織サンプル上に配置
され、そして切断されたインジケーター分子に起因する螢光が顕微鏡下でサンプ
ル組織に見られる。 典型的には、組織サンプルは、内因性プロテアーゼが螢光発生プロテアーゼイ
ンジケーターを切断する時間インキュベートされるべきである。インキュベーシ
ョン時間は、37℃までの温度（37℃も含む）で約10〜60分の範囲であろう。
【０１３３】 Ｃ）組織及び生検サンプルに由来する培養物及び細胞懸濁液における細胞の現 場アッセイ さらにもう１つの態様において、本発明は、組織、生検サンプル、又は生物学
的流体（たとえば唾液、血液、尿、リンパ、血漿、等）に由来する培養物、細胞
懸濁液又は付着細胞層における細胞の現場プロテアーゼ活性の検出方法を提供す
る。 好ましい態様において、培養された細胞は、チャンバースライド上で又は懸濁
液において増殖され、そして次に、細胞遠心分離により組織学スライドに移され
る。同様に、細胞懸濁液は、標準の方法に従って調製され、そして組織学スライ
ドに移される。
【０１３４】 一つの好ましい態様において、スライドがリン酸緩衝溶液により洗浄され、そ
して螢光源プロテアーゼインジケーターを含む、半固体ポリマー又は溶液により
被覆される。スライドが、37℃で、プロテアーゼインジケーターを内因性プロテ
アーゼが切断するのに必要な時間インキュベートされる。次に、スライドが上記
のように適切なフィルターを備えた螢光顕微鏡下で試験される。 他の好ましい態様において、細胞が37℃でプロテアーゼインジケーターと共に
インキュベートされ、次に、緩衝液により洗浄され、そしてガラス細管に移され
、そして螢光顕微鏡下で試験される。流動細胞計測計が細胞内酵素活性を定量化
するために使用される場合、螢光原インジケーターと共に細胞が、37℃でのイン
キュベーションの後、緩衝液により単純に希釈され、そして分析される。
【０１３５】 VII. プロテアーゼ活性のモジュレーションのスクリーニング ある好ましい態様において、本発明は、プロテアーゼ活性のモジュレーション
をスクリーニングする方法を提供する。プロテアーゼ活性のモジュレーターは、
プロテアーゼの活性を増加させ、減少させるか、または排除するか、あるいは特
定部位（例えば、特に細胞または細胞中の位置）におけるプロテアーゼの利用可
能性を増加させ、減少させるか、または排除する因子（例えば、化合物）である
。プロテアーゼ活性のモジュレーターは、プロテアーゼに対して直接的に作用す
るか、あるいは、間接的に、例えば、主題のプロテアーゼを活性化する酵素の利
用可能性または活性を変更することによって、作用することができる。
【０１３６】 好ましい態様において、これらの方法は、基本的には、「主題の」プロテアー
ゼまたは主題のプロテアーゼを含有する細胞を1またはそれ以上の被験因子と接
触させることを含む。また、プロテアーゼまたは細胞を本発明の1またはそれ以
上のインジケーター化合物と接触させる。被験因子をより低い濃度で使用するか
、あるいは被験因子を使用しない対照と比較した、被験因子の存在下にインジケ
ーター化合物が生成するシグナルの差は、被験因子がプロテアーゼ活性をモジュ
レートすることを示す。
【０１３７】 典型的には、本発明のアッセイは、被験因子を存在させるか、または被験因子
を前もって適用したとき見られる活性と、（通常陰性の）対照の活性との間に差
が存在する場合、好ましくは差が統計的に有意である（例えば、80％より大きい
、好ましくは約90％より大きい、より好ましくは約98％より大きい、最も好まし
くは約99％より大きい）場合、陽性としてスコアが付けられる。最も好ましい「
陽性の」アッセイは、少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ま
しくは少なくとも2倍、最も好ましくは4倍またはさらに10倍の陰性対照との差を
示す。
【０１３８】 これらのアッセイは、in vitroにおいて適当な緩衝系中で問題の1またはそれ
以上のプロテアーゼおよび本発明の1またはそれ以上の化合物を使用して実施す
ることができる。被験因子を緩衝系に添加し、インジケーターのシグナルの変化
を検出することができる。さらに、または選択的に、「試験」アッセイを被験因
子を欠如する（陰性対照）同一緩衝系のアッセイと単に比較することができる。 これらのアッセイは、in vivoにおいて培養する細胞、培養する組織、または
生物中の細胞／組織中で実施することができる。本発明の1またはそれ以上の細
胞透過性インジケーターを被検体細胞の中に導入する。細胞、組織、または生物
を1またはそれ以上の被験因子と接触させ、そして1またはそれ以上の被験因子に
より発生したインジケーターシグナルの変化を本明細書に記載するように検出す
る。
【０１３９】 A） 被験因子 事実上任意の被験因子を本発明の方法に従いスクリーニングすることができる
。このような因子は、核酸、タンパク質、糖、多糖、糖タンパク質、脂質、およ
び小さい有機分子を包含するが、これらに限定されない。小さい有機分子という
用語は、典型的な、薬学上一般に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を
意味する。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸、およびそ
の他）を排除する。好ましい小さい有機分子は、約5000Daまで、より好ましくは
2000Daまで、最も好ましくは約1000Daまでのサイズの範囲である。
【０１４０】 普通に、有効な性質を有する新しい化学的実在物は、いくつかの所望の性質ま
たは活性を有する化合物（「先導化合物」と呼ぶ）を同定し、先導化合物の変異
型をつくり、これらの変異型化合物の性質および活性を評価することによって発
生される。しかしながら、現在の傾向は薬剤発見のすべての面についての時間目
盛を短縮することである。高い処理量のスクリーニング（HTS）法は、大きい数
を急速にかつ効率よく試験することができるために、普通の先導化合物同定法の
代わりに使用されている。
【０１４１】 1つの好ましい態様において、高い処理量のスクリーニング法は多数の潜在的
治療用化合物（候補の化合物）を含有するライブラリーを準備することを含む。
次いで、このような「組合わせの化学的ライブラリー」を、本明細書に記載する
ように、1またはそれ以上のアッセイにおいて同定して、所望の特徴的活性を表
示するライブラリーのメンバー（特に化学種またはサブクラス）を同定する。こ
うして同定された化合物は普通の「先導化合物」として働くことができるか、あ
るいはそれら自体潜在的または実際の治療剤として使用することができる。
【０１４２】 組合わせの化学的ライブラリーは、多数の化学的（構築ブロック）、例えば、
試薬を組合わせることによって、化学的合成または生物学的合成により発生した
多様な化合物の集合物である。例えば、線形組合わせの化学的ライブラリー、例
えば、所定の化合物長さについてすべての可能な方法でアミノ酸と呼ぶ1組の化
学的構築ブロック（すなわち、ポリペプチド中の多数のアミノ酸）を組合わせる
ことによって、ポリペプチド（例えば、ムテイン）ライブラリーは形成される。
このような化学的構築ブロックの組合わせ混合を通して、数百万の化合物を合成
することができる。例えば、100の互換性化学的構築ブロックを系統的に組合わ
せ混合すると、1×108のテトラマー化合物または1×1010のペンタマー化合物が
理論的に合成されるということを、1人の解説者が観測した（Gallop他（1994）3
7（9）：1233−1250）。
【０１４３】 組合わせの化学的ライブラリーの調製は当業者によく知られている。このよう
な組合わせの化学的ライブラリーはペプチドライブラリーを包含するが、これら
に限定されない（例えば、下記の文献を参照のこと：米国特許第5,010,175号、F
urka（1991）Int. J. Pept. Prot. Res. 37：487−493、Houghton他（1991
）Nature 354：84−88）。ペプチド合成は本発明とともに使用するために考え
られかつ意図される唯一のアプローチでは決してない。また、化学的に多様なラ
イブラリーを発生させる他の化学的方法を使用することができる。このような化
学的方法は下記のものを包含するが、これらに限定されない：
【０１４４】 ペプチド（PCT公開No.WO 91／19735、1991年12月26日）、コード化ペプチド
（PCT公開No.WO 93／20242、1993年10月14日）、ランダムバイオ−オリゴマー
（PCT公開No.WO 92／00091、1992年1月9日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5
,288,514号）、ダイバーソマー（diversomers）、例えば、ヒダントイン、ベン
ゾジアゼピンおよびジペプチド（Hbbs他（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 90：6909−6913）、ビニロガス（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara他（
1992）J. Amer. Chem. Soc. 114：6568）、ベータ−D−グルコーススカホー
ディングを有する非ペプチドのペプチドミメティックス（peptidomimetics）（H
irschmann他（1992）J. Amer. Chem. Soc. 114：9217−9218）、小化合物ラ
イブラリーの類似する有機合成法（Chen他（1994）J. Amer. Chem. Soc. 11
6：2661）、オリゴカルバメート（Cho他（1993）Science 261：1303）、および
／またはペプチジルホスホネート（Campbell他（1994）J. Org. Chem. 59：6
58）。
【０１４５】 一般に、下記の文献を参照のこと：Gordon他（1994）J. Med. Chem. 37：1
385、核酸ライブラリー（例えば、Stratagene，Corp. 参照）、ペプチド核酸ラ
イブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例え
ば、Vaughn他（1996）Nature Biotechnology、14（3）：309−314）、およびPC
T／US 96／10287）、炭水化物ライブラリー（例えば、下記の文献を参照のこと
：Liang他（1996）Science、274：1520−1522、および米国特許第5,593,853号）
、および小有機分子のライブラリー（例えば、下記の文献を参照のこと：ベンゾ
ジアゼピン、Baum（1993）C & EN、Jan 18、p. 33、イソペノイド、米国特
許第5,569,588号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974
号、ピロリジン、米国特許第5,525,735号および米国特許第5,519,134号、モルホ
リノ化合物、米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514
号、およびその他）。
【０１４６】 組合わせライブラリーを調製する装置は商業的に入手可能である（例えば、下
記を参照のこと：357 MPS、390 MPS、Advanced Chem. Tech.、ケンタッキー
州ルイスヴィレ、Symphony、Rainin、マサチュセッツ州ウォバーン、433A、Appl
ied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州、9090 Plus、Milli
pore、マサチュセッツ州ベッドフォード）。
【０１４７】 また、多数のよく知られているロボットシステムが溶液相化学のために開発さ
れてきている。これらのシステムは下記のものを包含するが、これらに限定され
ない：自動化ワークステーション、例えば、自動化合成装置（Takeda Chemical
Industries，LTD、日本国大阪）およびロボットアームを使用する多数のロボ
ットシステム（Zymate II、Zymark Corporation、マサチュセッツ州ホプキン
トン；Orca、Hewlett−Packerd、カリフォルニア州パロアルト）これらは化学者
が実行するマニュアル合成操作を模倣する、VentureTMプラットフォーム、開始
から終了まで576〜9,600の同時反応を実験することができる超高処理量合成装置
（Advanced Chem. Tech.，Inc.、ケンタッキー州ルイスヴィレ参照）。
【０１４８】 前述の装置のいずれも本発明とともに使用するために適当である。これらの装
置が本明細書に記載するように作動できるように、これらの装置（使用する場合
）の特質およびそれらに対する変更の実行は当業者にとって明らかとなるであろ
う。さらに、多数の組合わせライブラリーはそれら自体商業的に入手可能である
（例えば、下記を参照のこと：ComGenex、ニュージャージイ州プリンセトン、As
inex、モスクワ、Ru、Tripos，Inc.、ミゾリー州セントルイス、ChemStar，Ltd
、モスクワ、RU、3D Pharmaceuticals、ペンシルベニア州エクストン、Martek
Biosciences、マリイランド州コロンビア、およびその他）。
【０１４９】 B） 高い処理量のスクリーニング 本明細書に記載する任意のプロテアーゼ活性のアッセイおよび／またはプロテ
アーゼ活性または他の切断活性のモジュレーターまたは他の切断活性（例えば、
グリコシラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、リパーゼ活性、およびその他）のモジ
ュレーターは高い処理量のスクリーニングが可能である。好ましいアッセイは、
被検化合物の存在に応答する本発明のインジケーターが生成するシグナルの変更
を検出する。
【０１５０】 これらのアッセイは、必ずしも一度に単一の被験因子をスクリーニングする必
要がない。反対に、高い処理量のスクリーニングを促進するために、少なくとも
2つ、好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、最も好ましくは少
なくとも20の被検化合物を使用して単一アッセイを実施することができる。アッ
セイが陽性である場合、活性を有する被験因子が同定されるまで、引き続くアッ
セイを被験因子のサブセットを使用して実施することができる。
【０１５１】 光学的シグナル（例えば、蛍光、変更されたスペクトル、およびその他）につ
いて高い処理量のアッセイ、種々のリポーター遺伝子産物について高い処理量の
アッセイは当業者によく知られている。例えば、フローサイトメーターおよび多
ウェル蛍光光度計が商業的に入手可能である。 実施例17において、本発明のアッセイのために蛍光、均質、多重、生細胞およ
びビーズをベースとするスクリーニングアッセイにおける、PE Biosystems FN
ATTM System 8100、自動化、マクロ−コンフォーカル高い処理量のスクリーニ
ング（HTS）システムの使用を例示する。
【０１５２】 VIII．他のインジケーター組成物 上記で説明されたように、主鎖の反対側（たとえばペプチド切断部位）上に共
有結合される螢光分子が自己−相互作用（たとえば、ダイマーの形成を通して）
により消光できることが、本発明の発見であった。従って、１つの態様において
は、インジケーター分子が適合されたドナー−受容体対よりもむしろ単一の螢光
団を用いて製造され得る。また、上記で説明されたように、特に好ましい螢光団
は、Ｈ−タイプのダイマーを形成するもの（たとえば、カルボキシローダミン11
0、カルボキシテトラメチルローダミン、カルボキシローダミン−Ｘ、ジエチル
アミノクマリン、及びカルボシアニン染料）である。
【０１５３】 好ましい態様において、本発明に従い組合わせ決定領域（CDRs）を使用して、
蛍光体の単一種で二重に標識化したペプチドインジケーターを製作するが、この
ような二重に標識化した蛍光体系の使用は組合わせ決定領域を含んでなるペプチ
ド基質に限定されない。反対に、本明細書に記載するホモ−二重標識化インジケ
ーター系は、蛍光体の「二量体」の形成（相互クェンチング）を可能とするバッ
クボーンを提供する事実上任意のペプチドバックボーンとともに使用可能である
。こうして、本明細書に記載する方法によれば、蛍光共鳴エネルギー移動系（FR
ET）（アクセプター／ドナー）系を使用する、従来既知のペプチドバックボーン
のインジケーターをその代わりに単一蛍光体を使用して設計することができる。
【０１５４】 しかしながら、単一種標識化インジケーターの使用は、ペプチドをベースとす
る組成物に制限されない。反対に、「ホモ−二重標識化」インジケーター分子は
、下記のものを包含するが、これらに限定されない種々のバックボーンを利用す
ることができる：核酸バックボーン、オリゴ糖バックボーン、脂質バックボーン
、およびその他。たとえば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、オリゴヌ
クレオチド、糖、ポリサッカリド、プロテオグリカン、脂質、糖脂質及びリポポ
リサッカリドに螢光団を結合するための接合方法は、Hermanson, (1995) Biocon
jugate Techniques, Academic Press New York, N. Y., Kay M. など., (1995)
Biochemistry, 34 : 293-300、及びStubbs, など., (1996) Biochemistry 35 :
937-947 により記載される。
【０１５５】 Ａ）核酸インジケーター ホモ−二重ラベルされた核酸主鎖は、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は
エンドヌクレアーゼ活性のための効果的なインジケーターを提供する。この態様
においては、核酸主鎖が、３’及び５’末端で（直接的な結合を通して、又はリ
ンカー（たとえば、ペプチド）を通して間接的に）自己−消光性（たとえばＨ−
タイプダイマー形成性）螢光団によりラベルされる。核酸主鎖は、自己−相補的
領域を含み、そしてそれにより、自己−消光が生じるよう螢光団を接近せしめる
ヘアピン又は他の自己−ハイブリダイズされたコンホメーションを形成するよう
選択される。
【０１５６】 このようにして形成されたインジケーター（プローブ）が相補的標的核酸にハ
イブリダイズされる場合、自己−ハイブリダイゼーションが排除され、螢光団が
分離され、そして分子により生成される螢光シグナルが上昇する。他方では、螢
光ラベルされた核酸主鎖は、ヌクレアーゼ活性（たとえば制限エンドヌクレアー
ゼ又はリボザイム活性）についてアッセイするために使用され得る。核酸主鎖が
ヌクレアーゼにより（たとえば、主鎖における標的部位の制限エンドヌクレアー
ゼ認識により）切断される場合、螢光団は再び分離され、螢光シグナルが高めら
れる。適切な核酸主鎖を選択する方法は、Tyagi and Kramerなど. (1996) Natur
e Biotechnology, 14 : 303-308 により記載される。
【０１５７】 ホモ−二重ラベルされた螢光DNA プローブは、種々の情況下で、標的DNA 配列
の検出、局在化又は定量化のために使用され得る。従って、たとえば、本発明の
核酸インジケーターは、核酸増幅（たとえばPCR)反応における増幅生成物の急速
な検出のために使用され得る。ここで、増幅生成物の領域に対して相補的な主鎖
を有するインジケーターが選択される。増幅生成物が生成されるにつれて、イン
ジケーターは、生成物にハイブリダイズし、そしてPCR 溶液の螢光シグナル活性
が上昇する。核酸インジケーターは、他の種々の情況下で、ハイブリダイゼーシ
ョン又はヌクレアーゼ活性インジケーターとして使用され得る。
【０１５８】 たとえば、現場ハイブリダイゼーション（たとえばFISH）において、ゲノムDN
A のマッピングは、染色体内の特定の領域を標的化するために螢光プローブを用
いて達成され得る（たとえば、Meyne (1993) Chromosome mapping by fluoresce
nt in situ hybridization, pp 263-268 In : Methods in Nonradioactive Dete
ction G.C. Howard, ed., Appleton & Lange, Norwalk, Connecticut ; Morriso
n (1992) Deiection of energy transfer and fluorescence quenching, pp. 31
1-352 In : Nonisotopic DNA Probes Techniques L.J. Kricka, ed. Academic P
ress, New York ; and Varani (1995) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2
4 :379-404 を参照のこと）。
【０１５９】 もう１つの態様において、自己−消光螢光団は、２種の分子の相互作用（たと
えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、リガンド−受容体、等）を
アッセイするために使用され得る。この態様において、１つの螢光団が１つの分
子（たとえばタンパク質）に結合され、そして第２の螢光団が第２の分子（たと
えば、第２の核酸又は核酸結合タンパク質）に結合される。２種の分子が結合す
る場合、螢光団は並置され、そしてお互い消化する（たとえば、Ｈ−タイプのダ
イマーの形成を通して）。２種の分子の相互作用を測定するためへのドナー−受
容体共鳴エネルギートランスファーシステムの使用は、Bannwarth など., Helve
tica Chimica Acta. (1991) 74 : 1991-1999, Bannwarth など. (1991), Helvet
ica ChimicaActa. 74 : 2000-2007、及びBannwarth など. 、ヨーロッパ特許出
願D439036A2 により記載される。
【０１６０】 Ｂ）オリゴ糖インジケーター ホモ−二重ラベルされたオリゴ糖主鎖インジケーターは、グリコシダーゼ活性
の検出及びレシチン結合タンパク質の同定を可能にする。螢光団は、オリゴ糖又
は糖ペプチド主鎖に直接的に接合され、又はリンカー（たとえば、ペプチド）を
通して結合され得る。オリゴ糖及び／又は糖ペプチドは、化学的に合成され、組
換え的に発現され、又は天然源、たとえばフェチュイン及び他の糖タンパク質か
ら親の糖タンパク質のタンパク質分解断片化により単離され得る。
【０１６１】 オリゴヌクレオチドに関する場合におけるように、オリゴ糖特異的構造が、特
定のグリコシダーゼ、すなわち２種の糖分子間の結合を加水分解する酵素の検出
のために選択され得る。 特定のオリゴ糖又はレシチンがそのレシチン結合タンパク質を見出すために選
択される場合、高められた螢光性が、２種の染料を分離することによって、又は
２種の染料の相対的配向をゆがめることによって、Ｈ−タイプのダイマーを破壊
する複合体化現象を示す。それらの効果は、ホモ−二重ラベルされたプローブか
らの高められた螢光性をもたらす。
【０１６２】 Ｃ）脂質インジケーター 脂質、糖脂質又はリポ多糖が自己−消光（たとえばＨ−タイプのダイマーを形
成する）螢光団によりラベルされ、そしてリポソーム又は他の脂質（たとえば生
物学的）膜に付加される場合、螢光性の低下がＨ−タイプのダイマー形成を示し
、そしてそのような螢光強度の程度は、Ｈ−タイプのダイマー形成の量の徴候で
あろう。脂質膜の相対的な流動性のために、自己−消光性螢光団は、安定したＨ
−タイプのダイマーと相互作用することができる（たとえば、約６〜約10Åの空
間に近づく）。
【０１６３】 膜活性剤、たとえば膜の流体力学又は試験化合物への透過性のいずれかに影響
を及ぼす剤が添加される場合、その観察される螢光強度の変化は、膜流動性又は
透過性を変性する試験化合物の能力を示す。従って、そのようなラベルされた脂
質は、薬物スクリーニング、及び液体−薬物供給ビークルの開発において有用で
ある。 同様に、本発明の脂質−基材のプローブは、脂質／タンパク質相 互作用の程度を同様に調べるために使用され得る。
【０１６４】 IX．ポリペプチドの細胞摂取 ポリペプチドへの疎水性保護基の結合が、細胞によるそのポリペプチドの摂取
を高めることはまた、本発明の発見であった。その効果は、ポリペプチドがまた
、螢光団、より好ましくは２種の螢光団を担持する場合、最とも明白である（例
９を参照のこと）。しかしながら、ある好ましい態様において、蛍光団は疎水性
基として二重になることができる。好ましい疎水性基は次のものを包含するが、
但しそれらだけには限定されない：
【０１６５】 Fmoc、9-フルオレンアセチル基(Fa）、1-フルオレンカルボキシル基、9-フル
オレンカルボキシル基、および9-フルオレン-1-カルボキシル基、ベンジルオキ
シカルボニル、キサンチル(Xan）、トリチル(Trt）、４−メチルトリチル(Mtt)
、４−メトキシトリチル(Mmt) 、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベン
ゼンスルホニル(Mtr) 、メシチレン−２−スルホニル(Mts) 、４，４’−ジメト
キシベンズヒドリル(Mbh) 、トシル(Tos) 、２，２，５，７，８−ペンタメチル
クロマン−６−スルホニル(Pmc) 、４−メチルベンジル(MeBzl) 、４−メトキシ
ベンジル (MeOBzl) 、ベンジルオキシ（BzlO) 、ベンジル(Bzl) 、ベンゾイル（
Bz）、
【０１６６】 ３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Npys) 、１−（４，４−ジメチル−
２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル(Dde) 、２，６−ジクロロベンジ
ル（２，６−DiCl−Bzl)、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Cl−Ｚ）
、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Br−Ｚ）、ベンジルオキシメチル
(Bom) 、ｔ−ブトキシカルボニル(Boc) 、シクロヘキシルオキシ（cHxO) 、ｔ−
ブトキシメチル(Bum)、ｔ−ブトキシ（tBUO) 、ｔ−ブチル(tBu) 、アセチル（A
c) 、及びトリフルオロアセチル(TFA) 。 疎水性基は、本質的に任意の位置において対象分子（例えば、インジケーター
又は阻害剤）とカップリングすることが出来る。
【０１６７】 好ましい態様において、疎水性基は、同種の結合パートナー（例えばプロテア
ーゼ）による対象分子の認識/結合を妨害しないような位置にカップリングされ
る。対象分子がポリペプチドである特に好ましい態様において、疎水性基は末端
に結合される。疎水性基は対象分子に直接カップリングすることが出来、又はリ
ンカーをかいしてカップリングされる。疎水性基のカップリングのために適当な
リンカーは当業界においてよく知られている。
【０１６８】 従って、本発明は、細胞中に分子（たとえば、ポリペプチド、オリゴヌクレオ
チド、オリゴ糖、脂質、等）を供給するための方法を提供する。前記方法は、少
なくとも２種の螢光団分子及び疎水性基、より好ましくはFmoc基を結合している
、供給されるべき分子（たとえばポリペプチド）を供給し、そして次に、前記分
子と細胞とを接触せしめることを包含する。
【０１６９】 ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖又は脂質が診断最終点のために又は
治療目的のためにインビボで供給される予定である場合、低められた毒性を有す
るか又はまったく毒性を有さない螢光団及び疎水性基が好ましいことが理解され
るであろう。 従って、好ましい態様においては、螢光団は、生物学的活性をほとんど又はま
ったく有さない非毒性分子により置換され得る。好ましい分子は、供給される予
定である分子の２つの末端を連結するリンカーとして作用する融合された環化合
物である。特に好ましい融合された環化合物は、励起ダイマーの空間を近づける
。
【０１７０】 最とも好ましい融合された環化合物は、ステロイド類を包含するが、但しそれ
らだけには限定されない。Ｈ−タイプのダイマー形成のために知られている、比
較的平らで且つ疎水性の螢光団は、たとえばステロイド分子に見出される同様に
疎水性で且つ構造的に硬質で及び／又は平らな融合された環化合物、すなわち完
全なステロイド分子よりも小さなステロイド誘導体により置換され得、ここで２
〜３個の融合された６員環分子は通常の架橋剤を通して架橋され、本明細書に記
載されるFmoc及び他の疎水性基に相当するサイズ及び全体的な疎水性が提供され
得る。安全な代謝経路がそれらの小さな構成単位から成る大きな分子のために存
在するので、そのようなハイブリッド分子の毒性は低いことが予測される。好ま
しい態様においては、疎水性分子は、約17×12Åのサイズである。
【０１７１】 ペプチドがインビボで供給される予定である場合、低められた毒性か又は非毒
性の螢光団が好ましい。多くの螢光団の毒性は当業者に良く知られている（たと
えば、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6
th Ed., Molecular Probes, Eugene, OR.(1996)を参照のこと）。さらに、毒性
（たとえばLD50) は、当業者に良く知られている標準の方法に従って容易に決定
され得る。最とも好ましい態様においては、融合された環化合物は、融合された
ステロイド、たとえばLattなど. (1965) J. Am. Chom. Soc., 87 : 995-1003 に
示される構造体ＸＩ及びＸIIであり、ここで−OR及び−OR2 は細胞中に輸送する
ことが所望される、ペプチド、核酸又は他分子の末端のための結合の活性化され
た点として作用することができる。
【０１７２】 上記に示されるように、ほとんどのいづれかの分子の細胞摂取は、疎水性基及
び螢光団又はステロイド架橋剤の結合により増強されるであろう。従って、適切
な分子は、実質的に、細胞中に導入することが所望されるいづれかの分子を包含
する。特に好ましい分子は、ポリペプチド（たとえば、本発明のプロテアーゼイ
ンヒビター）、及び核酸（たとえば、オリゴヌクレオチドHIV インヒビター（た
とえば、Jing (1997) Biochem., 36 : 12498-12505を参照のこと）、リボザイム
、ペプチド核酸、及び同様のもの）を包含するが、但しそれらだけには限定され
ない。
【０１７３】 Ｘ．活性検出キット 本発明はまた、サンプル中のプロテアーゼ活性の検出のためのキットを提供す
る。キットは本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターを含む１又は複数の
容器を含んで成る。インジケーターは、溶液に供給され、又は固体支持体に結合
され得る。従って、キットは、インジケーター溶液又はインジケーター“計量棒
”、吸取紙、培養培地及び同様のものを含むことができる。キットはまた、自動
プロテアーゼ活性検出器への使用のためのインジケーターカートリッジ（ここで
は、螢光発生インジケーターが“レセプター”螢光団側により固体支持体に結合
されている）も含むことができる。
【０１７４】 キットはさらに、方法を教授し、そしてキットの成分の使用を記載する取扱説
明書を含むことができる。さらに、キットはまた、他の試薬、緩衝液、種々の濃
度のプロテアーゼインヒビター、原液プロテアーゼ（標準曲線、等の生成のため
の）、培養培地、使い捨てキュベット及び同様のものを、本発明の螢光発生プロ
テアーゼインジケーターを用いてのプロテアーゼ活性の検出を助けるために包含
する。 さらに又は他方では、キットが、本明細書に記載されるいずれか他のインジケ
ーター（たとえば、核酸基材のインジケーター、オリゴ糖インジケーター、脂質
インジケーター、等）を含んで成ることが理解されるであろう。この場合、キッ
トは、特定のインジケーター主鎖が基質又は結合剤である、特定の活性／化合物
／相互作用の検出を促進するであろう。
【０１７５】 ＸＩ．プロテアーゼインヒビター プロテアーゼインジケーターがまた、プロテアーゼインヒビターとしても作用
できることは、本発明の発見でもあった。プロテアーゼインヒビター及びプロテ
アーゼ基質は、いくつかの基本的性質、たとえばプロテアーゼの触媒性基質結合
部位に結合する能力及びプロテアーゼと比較的安定した複合体を形成する能力を
共有する。従って、多くの通常の基質又はそれらのフラグメントは、より高い濃
度で競争基質阻害を示す。その阻害は、インヒビターがプロテアーゼの同じ基質
結合部位に結合し、それにより、それはプロテアーゼの触媒ドメインへの結合に
おいて生来の基質と競争するので、競争性である。
【０１７６】 本発明は、プロテアーゼインヒビター企画のための３種の新規アプローチを提
供する。第１のアプローチにおいては、通常の基質は、それがプロテアーゼに十
分に結合するが、しかし低められた（遅いか又は存在しない）加水分解速度を有
するように再企画される。遅い加水分解速度は、プロテアーゼ認識ドメイン中に
変更された（異なった）コンホメーション及び／又はコンホメーション柔軟性を
導入することによって達成される。基質（たとえば生来の）がプロテアーゼの基
質結合部位に結合した後、Ｐ1 とＰ1'との間のペプチド結合のコンホメーション
が、所定のプロテアーゼのペプチド結合加水分解反応の転移コンホメーションに
ゆがめられる。
【０１７７】 このペプチド結合及び隣接するペプチド結合が、それらがゆがめられないよう
に変更される場合、加水分解速度は、切断部位ペプチド結合が所望する転移コン
ホメーションに容易にゆがめられる基質に比較して、低められるであろう。この
アプローチは例16に示されており、ここでその例は、プロテアーゼ認識、アミノ
酸配列を変えないで、基質の加水分解速度をいかにして変えることができるかを
示している。
【０１７８】 第２のアプローチにおいては、インヒビターが、切断部位ペプチド結合をゆが
めることを困難にする決定的なＰ1 又はＰ1'残基を置換することによって生成さ
れる。通常、Ｐ1 及びＰ1'のアミノ酸側鎖は、プロテアーゼ触媒ドメインの側鎖
と特異的に相互作用する。それらの特異的相互作用は、加水分解反応の転移コン
ホメーションへのペプチド結合ゆがみの調整を促進する。従って、たとえば、CP
P32 プロテアーゼ基質におけるアスパラギン酸残基の決定的Ｐ1 残基が荷電され
ていないアスパラギンにより置換される場合、基質とプロテアーゼとの間の通常
の相互作用は、変性された基質がプロテアーゼの基質結合部位に結合する場合で
さえ、起こらない。
【０１７９】 再び、これは、より遅いか又はゼロの加水分解速度を導く。インヒビターの企
画におけるＰ1 残基置換効果の例は、DEVNペプチドの性質により示されている（
たとえば、図５及び例12を参照のこと）。基質DEVNがインヒビターである生物学
的コンホメーションは、例13に示されている。ペプチドDEVNがプロテアーゼに結
合する追加の証拠が例15に与えられている。 Ｐ1'残基は、荷電されたアミノ酸側鎖、又は表３に示されるような構造的に硬
質の残基（たとえばプロリン）、すなわち DVVCC SMS（通常の基質）及びDVVCC PdMS（インヒビター）のＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼ基質NS3 NS5A／5Bのため
の基質配列を、導入するために変更され得る。下線の残基は、Ｐ1 残基である。
【０１８０】 第３のアプローチにおいては、基質のＰ1 及びＰ1'残基間のアミド結合が、非
加水分解性化学結合、たとえばＰ1 及びＰ1'残基のための同じアミノ酸側鎖を維
持する、エーテル、チオエーテル、メチレン結合、又はアルキレン(C=C)又はエ
ーテル結合(C-O-C(=O))（但し、それらだけには限定されない）に変更され得る
。また、アミド結合は、レトロインバーソ（retroinverso）結合、又は他の偽似
アミノ酸結合、たとえばCH2 基によりカルボニル基を置換するCH2-NH又はC(=O)-
Sにより置換され得る。
【０１８１】 例 本発明は次の例により例示される。それらの例は例示目的のためであって、本
発明を制限するものではない。 例１ プロテアーゼ活性の検出のための螢光発生分子の合成 ペプチド合成及び誘導体化をPCT公開pct/us98/03000(wo98/37226)に記載され
ている方法によりおこなった（この記載を引用により、本明細書に組み入れる）
。
【０１８２】 例２.螢光発生プロテアーゼインジケーターは、消化される場合、強いシグナ
ルを供給する 本発明の螢光発生プロテアーゼインジケーターがプロテアーゼにより容易に消
化されることを示すために、切断の程度を、プロテアーゼの存在下でインジケー
ター切断生成物の出現についてアッセイすることによって決定した。
【０１８３】 式 F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2（ここでＦ1 はαアミノ基を
通してアスパラギン酸に連結されるドナー螢光団（５’−カルボキシテトラメチ
ルローダミン（Ｃ2211））であり、そしてＦ2 はシステインのスルフヒドリル基
を通して連結されるレセプター螢光団（ローダミンＸアセトアミド（R492））で
ある）を有するプロテアーゼインジケーター約１μｇを、50mMのリン酸ナトリウ
ム、１mMのEDTA（pH8.9)から成る緩衝液に溶解した。この溶液に、１単位のエラ
スターゼを添加した。その溶液を、エラスターゼの添加の前及び添加の約30分後
にHPLCにより分析した。消化は37℃で行なわれた。HPLCにより分離された成分を
、５−TMR 螢光団及びR492螢光団の両者の検出を可能にする 550nmの波長で及び
R492螢光団の検出を可能にする 580nmの波長でモニターした。
【０１８４】 結果は、プロテアーゼエラスターゼの添加の前及び添加の後の螢光発生プロテ
アーゼインジケーター溶液のHPLCプロフィールを示す図１に示される。図１（ａ
）は、損なわれていない螢光発生プロテアーゼインヒビターを表わす単一のピー
クを示す、エラスターゼの添加の前のHPLCを示す。エラスターゼの添加後（図1(
b)及び1(c))、螢光発生プロテアーゼインジケーターの完全な消化を示す後期溶
離の単一のピーク（図1(a))の痕跡は存在しなかった。さらに、図1(b)及び1(c)
における２つの優先的なピークは、消化が単一の部位で主に生じたことを示唆す
る。ペプチド配列内の他の部位での低い程の消化を示すいくつかの小さなピーク
が存在するが、しかしながら、わずか２つの消化ピークの著しい優先は、それら
の第２部位がエラスターゼに容易に接近できなかったことを示す。
【０１８５】 エラスターゼプロテアーゼの添加後の螢光発生プロテアーゼインジケーターの
発光スペクトルの変化を、励起及び発光側の両者上で４nmで設定されたスリット
幅を伴ってSLM スペクトロ螢光計モデル 48000を用いてモニターした。すべての
測定は、37℃で実施された。 図２におけるスペクトルは、エラスターゼの添加の前（ａ）及び添加の後（ｂ
）での螢光発生プロテアーゼインジケーターの発光を示し、そしてエラスターゼ
の添加の後、インジケータードナー螢光団の発光強度の時間依存性上昇を図３に
プロットする。
【０１８６】 螢光発生プロテアーゼインヒビターは、エラスターゼプロテアーゼによる処理
の後、 589nmでの螢光の10倍以上の上昇を示し（図2(a)が図2(b)に比較された）
、そして螢光の５倍以上の上昇がプロテアーゼへの暴露の始めの1000秒以内で生
じた。処理されたインジケーターと処理されていないインジケーターとの間の強
さの変化は、それらが特定のスリット幅を通して統合されるシグナルを表わすの
で、ある程度、使用されるスリット幅の機能である。従って、より広いスリット
幅（たとえば８又は16nmのスリット）が使用される場合、さらに高いシグナルが
消化に応答して提供されるであろう。
【０１８７】 例３. 螢光シグナルは、分子内エネルギーの消光解除によるものであった プロテアーゼ処理の後に観察される螢光の上昇が分子内エネルギーの消光解除
によるものであることを示すために、螢光発生プロテアーゼインジケーターのエ
ラスターゼ消化により生成されるシグナルを、F1(5-TMR)又はＦ2(R492) のいづ
れかに結合される同じペプチド主鎖のエラスターゼ処理により生成されるシグナ
ルに比較した。等濃度の二重螢光団分子及び２種の単一螢光団分子への１単位の
エラスターゼの添加の後のドナー螢光団の螢光強度の変化を調べた。
【０１８８】 その結果は図４に示される。二重螢光団分子は、初期において、ほぼ完全な消
光を示し、続いて、エラスターゼの添加の約30分後、一定値に達する、エラスタ
ーゼの添加の後での螢光の劇的な上昇を示した（図4(a))。対照的に、２種の単
一螢光団分子は、実質的に初期消光を示さず、そしてエラスターゼの添加後、螢
光の有意な変化も示さなかった。実際、その螢光レベルは、十分に消化された二
重螢光団インジケーター分子の螢光レベルに相当した（図4(b))。 それらの結果は、螢光発生プロテアーゼインジケーターの螢光強度の上昇が、
ドナー螢光団からレセプター螢光団に分子内で移行される共鳴エネルギーの中断
によるものであり、そして螢光団とペプチド主鎖との間の相互作用ではないこと
を示唆する。これは、大きなペプチド又は疎水性ペプチドへの結合に基づいて、
多くの疎水性螢光団の螢光が消光されるので、有意である。
【０１８９】 例４.プロテアーゼの特異性はインヂケーターコンホーメーションの関数であ
る 特定の理論に基づくものではないが、本発明の螢光発生プロテアーゼインジケ
ーターは、それらの折たたまれた構造により、より特定にはそれらの比較的剛性
のＵ−形状コンホメーションにより、高い程度のプロテアーゼ特異性を達成する
と思われる。その分子から得られる消光の程度は、２種の螢光団の平均隔離距離
に影響を及ぼす。従って、プロテアーゼインジケーターが比較的折たたまれてい
ないか又は柔軟な状態で存在する場合、折たたまれていない状態（変性）を引き
起こす傾向がある条件は、プロテアーゼの不在下で分子の螢光に対する効果をほ
とんど又はまったく有さないことが予測された。逆に言えば、分子が比較的剛性
である場合、螢光団の平均隔離距離の上昇が予測され、それにより消光効果が低
められることが予測されるので、変性条件は、螢光シグナルを高めることを予測
されるであろう。
【０１９０】 従って、プロテアーゼの不存在下での螢光源性プロテアーゼインディケーター
の螢光に対する変性条件の効果が決定された。第１に、添加されたチャオトロー
プ剤濃度（２Ｍ又は８Ｍの尿素）の関数としての、例１のインディケーターの螢
光の変化が測定された。螢光源性プロテアーゼインディケーターがチャオトロー
プ剤により変性された場合、螢光強度は時間と共に増加し、分子の変性（アンフ
ォルディング）により平らになった。
【０１９１】 それらのデータは、螢光発生プロテアーゼインジケーターが通常、エネルギー
最少化問題解決法に基づくモデルにより予測されるように、コンホメーション決
定領域により創造される安定した折たたまれたコンホメーションで存在すること
を示す。プラトーの螢光レベルは、十分に変性されたペプチド主鎖によりまだ連
結されている螢光団の残る消光を示す。延長された（変性された）ペプチドの消
化は、螢光団がお互いさらに遠くの方に移動することができるので、螢光の２倍
以上の上昇をもたらす。
【０１９２】 例５．１つの螢光団により二重ラベルされたペプチドの消光及び開放 １つの螢光団により二重ラベルされた本発明のペプチド主鎖が、螢光消光をま
だ達成し、従って共鳴エネルギー移行の他に、他の機構を通しての消光を示すこ
とは、本発明の驚くべき発見である。 基底状態の二量体化及び衝突性(collisional) 消光が全体の観察される消光に
寄与することを評価するために、表11に列挙される一連の二重ラベルされたペプ
チドを合成した。
【０１９３】 個々の色素により単独でラベルされたNorFesペプチドと共に色素の吸収スペク
トルを比較する他に、切断の前及び後で取られた発光スペクトルが、共鳴エネル
ギー移行(RET) 以外の手段により、消光の％及び螢光シグナル消光の存在を決定
するために比較された。 螢光団は、アスパラギン酸残基(D)のα−アミノ基を通してアミノ末端に及び
リシン(K)のε−アミノ基に連結された。ラベリングは、6-TMR 又はDER に連結
されるスクシンイミジル基の置換により行なわれた。NorFES−KGY と称するペプ
チドの構造は次の通りである：
【０１９４】
【化１３】
【０１９５】 吸光分光計から決定されるように、フルオレセイン−NorFES−フルオレセイン
を除く、すべての二重ラベルされたペプチドは、いわゆる基底状態のダイマーの
存在を示した。これは、より短い波長への吸光最大値の移行、及び酵素消化され
た、二重ラベルされたサンプルについてのスペクトルに比較される場合、吸収ス
ペクトルの形状の変化により示された。エラスターゼによる切断に基づいて、基
底状態のダイマーを破壊し、そしてその得られるスペクトルは同濃度のそれぞれ
の単独でラベルされたペプチドを含む溶液と同じであった。
【０１９６】 特定の理論に基づくものではないが、本発明に従って企画され、そして合成さ
れた化合物に観察される基底状態のダイマー形成は、ペプチド主鎖のＵ形状コン
ホメーションが螢光団をきわめて接近した状態にし、従って、基底状態二量体化
を通して逆消光をもたらす２種の螢光団の電子軌道のオーバーラップを可能にす
ることを示すと思われる。本発明のポリペプチドが、これまで観察されるよりも
有意に低い色素濃度で基底状態のダイマーの形成を可能にしたことは驚くべき発
見であった。
【０１９７】 たとえば、溶液における遊離フルオロセイン色素の基底状態二量体化は、0.74
M以上の高い濃度でのみ観察され、溶液における遊離エオシン色素の基底状態二
量体化は、 2.8×10-2M以上の高い濃度でのみ観察され（Forster and Konig, Ze
itschrift fur Electrochemie, 61 : 344 (1957) を参照のこと）、そして溶液
におけるローダミンＢ色素の基底状態二量体化は、６×10-4Ｍ以上の濃度でのみ
観察された（Arbeloa and Ojeda, Chemical Physics Letters, 87 : 556 (1982)
を参照のこと）。対照的に、本発明においては、その効果は、 4.0×10-7Mで又
は報告された値よりも約 100倍低い濃度で観察された。
【０１９８】 本発明に従って合成された化合物についての基底状態ダイマーの観察は、第11
表に列挙されるそれらの化合物と同じ螢光団を有する二重ラベルされたペプチド
についての有意なレベルの螢光消光を予測した。実際、この予測は確証された。
すなわち、6-TMR-NorFES-KGY-6-TMR、すなわちホモ二重ラベルされたペプチドと
6-TMR-NorFES-KGY-6-TMRとの比較は、消光の程度がヘテロ−対ホモ−においてわ
ずかに高いことを示す（94％対90％）。しかしながら、フルオロセイン誘導体は
わずか55％の消光を示した。％螢光消光（％Q）についての記号Ｉo 及びＩc は
、損なわれていないラベルされたペプチド及び酵素消化されたラベルされたペプ
チド溶液についての螢光強度を言及する。
【０１９９】
【表１７】
【０２００】 基質配列は１つのアミノ酸残基により拡張され、そして螢光団は、観察される
消光の量の主な心配を伴わないでリシン残基の側鎖上にエピシロンアミノ基を通
して結合され得た。特に、この付加(K-NorFES-KGYと称するペプチド）は、ヘテ
ロ−及びホモ−二重ラベルされたペプチドの両者について、切断率のわずかな上
昇及び％消光のひじょうにわずかな上昇をもたらした（Ｋ−NorFES−KGY ペプチ
ドにおいては、N-末端ラベリングは、α−アミノ末端よりもむしろリシンのエプ
シロンアミノ基を通してであった）。
【０２０１】 エラスターゼによるそれらの基質の切断率をまた、シグナルが最大値の 1／2
である、プロテアーゼの添加後の時間を記録することによって測定した（表11を
参照のこと）。３種のホモ−二重ラベルされたペプチド、すなわち６−TMR ；DE
R の２種の分子及びフルオレセイン（F1）によりラベルされたNorFES−KGY の比
較は、次のような切断率の順序を示す：F1-NorFES-KGY-F1＞6-TMR-NorFES-KGY-6
-TMR＞DER-NorFES-KGY-DER。
【０２０２】 例６．色素−色素二量体が長いペプチド中に形成される さらに、本発明者は、（ホモ二重ラベルされた）PAI-2,CS-1（31個の残基の長
さのペプチド）及び染料−染料ダイマー形成を可能にしない２種のDEVD様ペプチ
ドを合成し、そして誘導体化した。CS-1ペプチドは、有意に長いペプチドにおい
て、染料−染料ダイマー構造が形成され得ることを示す。このペプチドは、推定
上の切断部位Ile-Leu 結合のアミノ末端側に４個のプロリン残基を含むことを注
目すること。また、カルボキシルドメインに１つのプロリンが存在する。CS−１
ペプチドからの結果は、２種の染料（螢光団）間に潜在的に大きな配列を維持す
る。生産性Ｈ−タイプダイマーの形成を可能にしない、２種のDEVE−様ペプチド
のアミノ酸配列は、F1-DEVDGIDPK[F1]GY（配列番号:2）及びF1-PDEVDGIDPK[F1]G
Y（配列番号:3）である。
【０２０３】 例７．流動細胞計測及び螢光顕微鏡分析により試験された基質の細胞摂取 第12表に列挙される化合物を、細胞摂取のために合成し、そしてアッセイした
。基質の細胞インターナリゼーションを、Jurkat細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病系
）、HL−60細胞（ヒトプロ骨髄球白血病系）、ヒトリンパ球系、A1.1細胞（ネズ
ミＴ−細胞系）及びネズミ一次胸腺細胞を用いて試験した。生存細胞による基質
摂取の決定に使用される方法は、例６（HPLC方法に関する）、例２（螢光顕微鏡
分析に関する）、及び例３（流動細胞計測分析に関する）に提供される。基質の
細胞摂取に関するそれらの分析の要約は、この例に提供されている。
【０２０４】
【表１８】
【０２０５】 第12表に列挙されるデータは、(1)２種の螢光団のみの存在が、構造体2,5,7及
び９により示されるように、細胞摂取のために最適ではなく；(2)αアミノ基で
の9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc) 基の付加、及びわずか１種の螢光
団の結合は微々たる細胞摂取をもたらさず（たとえば、化合物３）；そして(3)
螢光団及び少なくとも１種のFmoc基は、基質の効果的な細胞摂取を可能にする（
構造体1,4,6,8,10,11及び12）ことを示す。
【０２０６】 ２つの同一の螢光団及び少なくとも１つの追加の疎水性基、たとえばFmoc基に
よりラベルされた本発明のプロテアーゼ基質を用いての他の実験は、この範例に
適合する。低い疎水性の基及び小さなベンジルオキシカルボニル基によるFmoc基
の置換は、低レベルの細胞摂取をもたらしたが、しかし疎水性基、たとえばDEVD
ペプチド化合物構造体５を有さない化合物よりも有意に良好であった。
【０２０７】 それらのデータは、Fmocがベンジルオキシカルボニル、Ｚ、又は次の他の疎水
性基により置換され得ることを示す：キサンチル(Xan) 、トリチル(Trt) 、４−
メチルトリチル(Mtt) 、４−メトキシトリチル(Mmt) 、４−メトキシ−２，３，
６−トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr) 、メシチレン−２−スルホニル(Mts)
、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル(Mbh) 、トシル(Tos) 、２，２，５，７
，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル(Pmc) 、４−メチルベンジル(MeB
zl) 、４−メトキシベンジル (MeOBzl) 、ベンジルオキシ（BzlO) 、ベンジル(B
zl) 、ベンゾイル（Bz）、
【０２０８】 ３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Npys) 、１−（４，４−ジメチル−
２，６−ジアキソシクロヘキシリデン）エチル(Dde) 、２，６−ジクロロベンジ
ル（２，６−DiCl−Bzl)、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Cl−Ｚ）
、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Br−Ｚ）、ベンジルオキシメチル
(Bom) 、ｔ−ブトキシカルボニル(Boc) 、シクロヘキシルオキシ（cHxO) 、ｔ−
ブトキシメチル(Bam) 、ｔ−ブトキシ（tBtO) 、ｔ−ブチル(tBu) 、アセチル（
Ac) 及びトリフルオロアセチル(TFA) 。
【０２０９】 化合物５上の酸基DEVDペプチドがエタノールによりエステル化される場合、こ
の修飾されたペプチドは、生存細胞によるいづれの増強された細胞摂取も示さな
かった。従って、Fmoc基の重要性、及び２種の螢光団形成Ｈ−タイプダイマーが
、この負の例により示される。
【０２１０】 例８．エステラーゼ又はアポプロトシス−関連プロテアーゼ基質と共にインキ ュベートされた細胞の螢光顕微鏡分析 エラスターゼ基質、Fm-K[F1]DAIPNIuSIPK[F1]GY(ここで、F1はカルボキシテト
ラメチルローダミンであり、FmはFmocであり、Ｋ〔F1〕はリシン（Ｋ）のエプシ
ロンアミノ基を通して共有結合されるF1であり、そしてFm−Ｋはアミノ末端リシ
ン残基のαアミノ基で共有結合されるFmoc基である）を、HL−60細胞と共に使用
した。細胞を、10nM〜10μＭの範囲の種々の濃度のエラスターゼ基質と共に10〜
60分間インキュベートした。
【０２１１】 次に、細胞を、５％血清を含むRPMI 1640 培地又はリン酸緩衝溶液により５倍
に希釈した。サンプルを遠心分離し、そして１mlの洗浄溶液によりもう１度、洗
浄した。遠心分離及び洗浄溶液の除去の後、細胞ペレットを約25μｌの培地によ
りやわらかくし、そしてそれらの細胞をガラス細管に移した。次に、細管をガラ
ス顕微鏡スライド上に配置し、そして標準のローダミンフィルターを用いて、螢
光顕微鏡下で試験した。 アポプトシス−関連プロテアーゼ活性の決定に関しては、例８に列挙される10
μＭの濃度の化合物（化合物構造体２〜13）を、細胞と共に30分〜３時間インキ
ュベートした。次に、細胞を同様にして２度、洗浄した。ガラス細管を用いて、
前記洗浄された細胞を移し、そして螢光顕微鏡下で試験した。
【０２１２】 例９．アポプトシス−関連プロテアーゼ基質と共にインキュベートされる細胞 の流動細胞計測分析 流動細胞計測分析に使用される基質の濃度は、４〜10％のウシ胎児血清を含む
RPMI 1640 培地において10μＭであった。選択された基質とのインキュベーショ
ンの間、細胞密度は、50,000細胞／ml〜4,000,000 細胞／mlの範囲であった。イ
ンキュベーション時間は、37℃で30分〜３時間であり、そしてインキュベーショ
ン体積は50μｌ〜２mlであった。基質と共に30〜60分間、インキュベートした後
、細胞懸濁液を、氷冷却されたハンクス緩衝溶液（HBSS）により10倍に希釈し、
そして次に、ナイロン布シートを通して濾過した。この濾過された細胞懸濁液を
、488nm の励起源を用いて、流動細胞計測分析にゆだねた。Becton Dickenson,
Inc.の流動細胞計測分析FacSort を、この流動細胞計測分析に使用した。典型的
には、サンプル当たり10,000〜30,000個の現象が集められた。
【０２１３】 基質インキュベーションを伴わない対照細胞及び最大の予測される螢光シグナ
ルを有するサンプルを用いて、計器検出器のパラメーターを設定した。たとえば
、基質化合物＃11 Fm-CGD2D : Fm-K[F1]DBJGDEVDGIDGJPK[F1]GY（配列番号：４
）(ここでF1はカルボキシテトラメチルローダミンであり；FmはFmocであり、Ｋ
〔F1〕は、リシン（Ｋ）のエプシロンアミノ基を通して共有結合されるF1であり
、NIu はノルロイシンであり、Ｂはアミノイソ酪酸であり、そしてＪはエプシロ
ン−アミノカプロン酸である）と共にJurkat細胞を15分間インキュベートした後
、基質の細胞摂取を示す約10個のチャネルの上昇が測定された。基質＃11は完全
には消光されなかったことを注目すること。
【０２１４】 従って、少量のバックグラウンド螢光が損なわれていない基質から予測される
。１μｇ／mlの抗−Fas 抗体、CH11クローンにより１〜６時間、活性化された細
胞からのシグナルは、ピークチャネル数の上昇を示した。螢光強度の10倍ほどの
上昇が観察された。細胞が、アポプトシス誘発剤、たとえば抗−Fas 抗体及び50
μＭでのCPP32 プロテアーゼインヒビターZVAD−フルオロメチルケトンと共に同
時インキュベートされる場合、この観察される螢光強度の上昇は排除された。こ
れは、化合物11からのシグナルがZVAD−FMK により阻害できるCPP32 プロテアー
ゼ活性のためであったことを示した。従って、流動細胞計測分析により決定され
るような個々の細胞における観察される螢光強度が、細胞内CPP32 プロテアーゼ
活性の直接的な測定として作用した。
【０２１５】 例10．アポプトシス−関連のプロテアーゼ基質の細胞溶解物加水分解に対する それらの効果により示される競争基質インヒビター ６時間の抗−Fas −刺激されたJurkat細胞溶解物におけるCPP32 プロテアーゼ活性のレベルを、50μＭの基質濃度のプロテアーゼ基質DEVD−AF
C(ここで、AFC はアミノフルオロメチルクマリンである）を用いて37℃で試験し
た。使用される緩衝液は50mMのHEPES (Ph7.5, 10％ｗ／ｖスクロース、 0.1％ｗ
／ｖ CHAPS) であった。螢光濃度の変化を、SLM 48000 スペクトルフルオロメー
ターによりモニターした。DEVD−AFC の加水分解速度は、反応混合物に存在する
、DEVD，DEVN及びICE 基質（第12表における化合物５，７、及び９）の濃度に依
存することが見出された。
【０２１６】 DEVD，DEVN及びICE の濃度が25μＭに上昇するにつれて、DEVD−AFC 加水分解
の速度は低められた。従って、DEVD，DEVN及びICE 基質は、それらの加水分解速
度がDEVD−AFC 基質の加水分解速度よりも遅いので、標的プロテアーゼ、たとえ
ばCPP32 の基質結合部位に結合し、そして競争インヒビターとして作用する。荷
電されていない保存性残基Asn により突然変異誘発されたそのＰ1 残基を有する
基質対照ペプチドが、プロテアーゼ基質結合部位に結合する能力、及び酵素阻害
を示す能力をまだ保持していることを見出すことは驚くべきことである。
【０２１７】 例11．基質は完全な細胞におけるアポプトシス刺激を遅延し、そして阻害する Jurkat細胞を、５％ CO2雰囲気下で、37℃で、10％ウシ胎児血清含有RPMI 160
培地において増殖する。血清含有率が４％に低下する場合、Jurkat細胞増殖速度
は遅くなったのみならず、また、有意な数の細胞が36時間以内に死亡した。使用
される細胞密度は、約 400,000個の細胞／mlであった。36時間後、対照ウェルは
約50％の死亡細胞（トリパンブルー陽性細胞）を含むが、ところが、0.1 又は 1
.0μｌの濃度の化合物＃11（表12）“Fm-CGD2D”、又はFm-K[F1]DBJGDEVDGIDGJP
K[F1]GY（配列番号：６）を含むウェルはわずか10％又は８％の非生存細胞を示
した。従って、効果的な細胞摂取を示す化合物＃11は、それらのJurkat細胞にお
いてアポプトシスを遅延せしめ、ここでそれはCPP32 プロテアーゼインヒビター
として又はCPP32 活性化プロテアーゼインヒビターとして作用した。
【０２１８】 例12．細胞からの損なわれていない及び切断された基質フラグメントの単離 抗−Fas 抗体（37℃で２時間、1μg/ml）によりアポプトシスに誘発されたJur
kat細胞を、10μＭの基質化合物＃10 Fm-G2D2D と共にインキュベートした。こ
の基質と共に１時間インキュベートした後、細胞を、４％血清含有RPMI 1640 培
地（あらゆる 100μｌのインキュベーション培地のために１mlの洗浄溶液）によ
り洗浄した。細胞を３度洗浄し、次にTriton X-100を含む細胞溶解緩衝液により
溶解した。次に、細胞溶解物を、Ｃ4 逆相クロマトグラフィーカラム、及び 0.0
75％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリル溶離剤システムを用いて分析
した。分析は、損なわれていない基質よりも早く溶出する２つの主要な新規ピー
クと共に、損なわれていない基質の存在を示した。２つの回収された主要ピーク
は、ローダミン吸収スペクトルを示し；従って、それらは基質のプロテアーゼ分
解に基づいて生成される２つの主要基質フラグメントに対応する。
【０２１９】 例13．標的酵素含有溶液と共に混合される場合のDEVN基質からの螢光シグナル DEVN (10μＭ）、すなわち表12の化合物である基質対照ペプチドは、アポプト
シス−活性化されたJurkat細胞溶解物によるプロテアーゼ消化に対して耐性であ
ることが見出された。集中的な消化時間は、螢光強度のさらなる上昇をもたらさ
なかった。この反応混合物のHPLC逆相分析は、完全に切断されていない基質の存
在を確かめた。荷電されていないアミノ酸Asn によるＰ1 残基Asp の置換は、プ
ロテアーゼ非基質へのプロテアーゼ基質の転換をもたらした。
【０２２０】 この対照ペプチドは、例12に記載されるような実験において競争性基質阻害を
示した。さらに、細胞溶解物の添加の後、時間の関数としてモニターする螢光強
度は、始め、螢光強度の有意な上昇を示したが、しかし15分後、この初期強度レ
ベルは安定化した。細胞溶解物に存在するプロテアーゼによる基質切断が存在し
なかったことを考慮すると、この初期螢光強度の最良な説明は、プロテアーゼに
結合するDEVN基質及びコンホメーション変化を受ける基質による。基質の主鎖を
包含するこのコンホメーション変化はまた、平均距離及び相対的配向に関してお
互いに対しての２つの共有結合される螢光色素分子のコンホメーションにも影響
を及ぼす。
【０２２１】 基質構造体におけるそれらの２種の螢光団の螢光消光の程度は、それらの双極
子に関してのそれらの距離及び特定の配向に対して敏感であることが見出された
。従って、螢光報告分子のそれらの２つの観点に影響を及ぼすいづれかのコンホ
メーション変化が、螢光消光に影響を及ぼすことが予測される。従って、プロテ
アーゼの基質結合部位に結合する基質により誘発されるコンホメーション変化は
、観察される初期螢光強度の変化、すなわちその螢光強度の上昇において影響さ
れた。基質は切断され得ないので、初期螢光強度の上昇は安定に達する。新規種
類の読取り、たとえば基質とその標的結合分子との間の会合の程度としての、基
質切断よりもむしろ基質のコンホメーション変化のために、この観察される螢光
強度の上昇を利用することができる。
【０２２２】 例14．種々のコンホメーション決定ドメイン(CDR) アミノ酸配列によりプロテ アーゼ認識ドメインの柔軟性を変更することによって誘発される加水分解速度の 変動 いづれかの所定のプロテアーゼのための生理学的に適切な基質のプロテアーゼ
切断部位を、２つの場合に分類することができる。１つは、セリンプロテアーゼ
インヒビター、たとえば好中球エラスターゼインヒビター、又はα−１−抗トリ
プシンであり、ここでエラスターゼ認識配列は残るインヒビター分子によりかな
り正確に保存される。
【０２２３】 エラスターゼによる切断に基づいて、このプロテアーゼ反応性部位及びその新
しく形成された末端残基は、反応性及び切断されたインヒビター構造体の高い分
離結晶構造分析により明らかなように、有意なコンホメーション変化を受ける。
第２種類のプロテアーゼ切断部位においては、その切断配列は、コンホメーショ
ンが十分に定義されていないか又は有意な量の柔軟性が存在するドメインにおい
て、遊離線状ペプチドにおいてと同じほど存在する。いくらかの程度の定義され
たコンホメーション、又は２種の可能性ある基質間の最大に利用できる主鎖柔軟
性差異が、他の基質よりも１つの基質のための与えられたプロテアーゼの選択を
もたらすと言われる。
【０２２４】 化合物４（Fm-DEVD)、10（Fm-G2D2D) 及び11（Fm-CGD2D) は、種々の量の強制
されたコンホメーション空間又は柔軟性を、与えられた基質中に、同じプロテア
ーゼ認識ドメインにより、しかし異なったコンホメーション決定ドメイン又は領
域(CDR) により、そのCDRのベント形成機能を保持しながら、いかにして導入で
きるかを示す。この例は、CDR のコンホメーション柔軟性又は剛性を変えること
によって中心のプロテアーゼ認識ドメインの相対的剛性又は柔軟性をいかにして
変えることができるかを示す。
【０２２５】 Fm-DEVD の親化合物は次の組成を有する：Fmoc-K[F1]DBDEVDGIDPK[F1]GY（配
列番号：７）。太字の下線の文字は、７個のアミノ酸残基から成るプロテアーゼ
認識配列である。化合物＃10は、このプロテアーゼ認識配列の両端で２種のグリ
シン延長部を含む。中心のプロテアーゼ認識ドメインは、アミノ末端でのグリシ
ン残基が生来の配列の一部分であるので、８個の長さの残基GDEVDGID（配列番号
：８）である。他のアミノ酸、たとえばアラニンよりも本来、より柔軟である２
つのグリシン残基は、低いコンホメーション強制、又は逆に、化合物４（表12）
よりも高い柔軟性を提供し、そしてそれにより、Aib 又はPro 残基と組合される
場合、より一層の屈曲を可能にする。
【０２２６】 グリシンに存在するメチレン基の他に、５つのメチレン基と共に両末端でアミ
ノカプロン酸の追加の挿入は、強制されたコンホメーションのさらなる緩和、及
び従って、プロテアーゼ認識ドメインGDEVDGIDのためのより高い柔軟性を提供す
る。この柔軟性の進行は、CPP32 はエラスターゼよりもより柔軟なプロテアーゼ
認識ドメインを認識するので、CPP32 プロテアーゼによる高められた加水分解速
度をもたらした。この言及に関する支持は、その生理学的基質のプロフォームで
のCPP32 プロテアーゼ切断部位、すなわちポリ(ADP−リボース）ポリメラーゼ、
PARPが２種の十分に折りたたまれたドメイン間に位置することである。
【０２２７】 従って、そのようなプロテアーゼ切断部位は確実には保持され得ず、又はその
コンホメーションは残る分子よりもほとんど定義されていないことを予測される
。従って、基質にそれらの構造特徴を供給するためには、柔軟な残基、たとえば
グリシン、エプシロンアミノカプロン酸、βアラニン、及びアミノ酪酸の導入は
、基質の中心プロテアーゼ認識ドメインの主鎖柔軟性を調節することに重要な役
割を演じることが予測される。コンホメーション決定ドメインのためのそれらの
追加の好ましい残基はまた、必要とされるベンド−誘発性影響を付与することが
予測される。
【０２２８】 それらの３種の基質についての観察された、変更された加水分解速度は、プロ
テアーゼ認識ドメインの柔軟性の調節における成功に向いている。これは、空間
を通してお互いと相互作用する２種の螢光団のための適切な配向を維持しながら
、タンパク質分解速度における観察される差異において表わされる。柔軟性を調
節するための手段を提供することにおける、及び適切に密接した空間においての
アミノ及びカルボキシル末端の配向を可能にすることにおけるこのコンホメーシ
ョン決定ドメインの重要性は、それらの化合物（４，10及び11）により例示され
る。
【０２２９】 それらの例は、Lys-Asp-Aib-Gly 又はLys-Asp-Aib-Ahx-Gly を含んで成るテト
ラペプチド及びペンタペプチドを提供し、ここでAhxはエピシロンアミノカプロ
ン酸（すなわち、NH2-(CH2)5-COOH)である。螢光団はロイシン残基のエピシロン
アミノ基に結合される。カルボキシル末端CDR ドメインは、トリペプチドGly-Pr
o-Lys 及びテトラペプチドGly-Ahx-Pro-Lys として定義される。加水分解速度は
、化合物４（Fm-DEVD : Fm-K[F1]DBDEVDGIDPK[F1]GY])（配列番号:9）と10（Fm-
G2D2D : Fm-K[F1]DBGDEVDGIDGPK[F1]GY）（配列番号:9）との間で３倍、早めら
れた。
【０２３０】 図５に示されるように、加水分解速度は、さらに、アミノカプロン酸(Ahx) 付
加物、すなわち化合物11（Fm-CGD2D : Fm-K[F1]DB Ahx GDEVDGIDG Ahx PK[F1]GY
（配列番号：10)）により、上記グリシン残基挿入よりも約３倍、早められた。
従って、全体的に少なくとも９倍の基質加水分解速度の上昇が達成された（表12
における化合物４及び11）。
【０２３１】 例15．プロテアーゼ基質において分子内Ｈ−タイプのダイマーを形成する螢光 団の構造特徴 本発明のホモ−二重ラベルされた螢光原組成物への使用のための種々の可能性
ある螢光団の、Ｈ−ダイマー形成と構造元素との間の最強の相互関係は、順に、
非局在化電荷、対称性、及び転移双極子の大きさである。疎水性は、このタイプ
の二量体化において主要決定基であることが観察されなかった。 本明細書に記載される実験においては、新規種類のプロ螢光プロテアーゼ基質
が企画され、そして合成された。それらの新規螢光原インジケーターは、励起モ
デルと適合するスペクトル性質を有し；より特定には、ローダミンにより二重ラ
ベルされたそれらのポリペプチドのスペクトルは、青色−シフトされた吸収ピー
ク及び螢光消光を示し、ここで両インジケーターはＨ−ダイマー形成のものであ
る。
【０２３２】 たとえば、NoreFes 、すなわちセリンプロテアーゼエラスターゼにより切断さ
れるウンデカペプチドは、分子内Ｈ−タイプのダイマー形成を示す色素の構造元
素を同定するために、その切断部位の反対側上で６種の螢光団によりホモ−二重
ラベルされた。酵素切断の前及び後で得られるそれらの６種の基質の吸収及び螢
光スペクトルは、非局在化された電荷、続く対称性の存在、及び最とも低いエネ
ルギーの電子転移双極子の大きさがダイマー形成において重要な要因であること
を示唆する。驚くべきことには、疎水性相互作用がこの研究において使用される
螢光団において重要である証拠は存在しなかった。 この研究において使用される６種の螢光団は、ローダミン−Ｘ、テトラメチル
ローダミン、フルオレセイン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン及
びピレンであった。
【０２３３】 それらの２種のローダミン（ローダミン−Ｘ、テトラメチルローダミン）のキ
サンテン成分は同じ電荷及び対称構造を有するが、それらの間での区別できる特
徴は、テトラメチルローダミンの高い転移双極子の大きさ及び低い疎水性である
。損なわれていないテトラメチルローダミン−誘導体化された基質のスペクトル
は、２種の二重ラベルされた損なわれていないペプチドの吸収スペクトルとそれ
ぞれ切断されたペプチド溶液のスペクトルとを比較する場合、ローダミン−Ｘの
電荷よりもより顕著な電荷を示すことが注目される。
【０２３４】 上記に示されるように、＋１の電荷がキサンテン構造体の個々にわたって局在
化された２種のローダミン誘導体に比較して、フルオレセインの３種の接合され
た環成分はpH９で荷電されていなかった。ペプチドの分解による色素（フルオレ
セイン）の分離の後、吸収スペクトルのいづれかの有意な形状変化の欠失は、Ｈ
−ダイマー形成における電荷のための役割を示す。この誘導体に関して観察され
る、ほとんど目立たないが、しかし、それにもかかわらず、測定可能な消光は、
２種のローダミンのいづれかが、フルオレセインに関するダイマー形成のための
解離定数がローダミンのための解離定数よりも４の大きさの程度低い、溶液にお
けるキサンテンの前記研究と一致する相互作用と比較して、２種のフルオレセイ
ン間の低いが、しかし測定可能な程度の相互作用に向ける。
【０２３５】 次に、色素対称の影響を、２種のクマリン、すなわちジエチルアミノクマリン
及びヒドロキシクマリンを用いて試験した。この種類の分子は、対称元素を含ま
ない。ジエチルアミノクマリンは、ローダミンに類似して、その２つの接合され
た環上に非局在化された陽性電荷を担持し、そしてヒドロキシクマリンは、フル
オレセインに類似して、pH９で中性である。ジエチルアミノクマリン−ラベルさ
れたNorFesのスペクトルは、11nmの青色シフトを示し、そしてヒドロキシクマリ
ン−ラベルされたNorFesのスペクトルはわずかに青色の層を示す。切断されたペ
プチド溶液に対する損なわれていないペプチドのそれぞれの消光度、76％及び28
％は、非局在化された電荷の重要性と一致する。ジエチルアミノクマリン−誘導
体化されたペプチドのあまり顕著でないスペクトルとキサンテンのスペクトルと
の比較は、Ｈ−ダイマー形成において重要な要素としての対称性の役割を支持す
る。
【０２３６】 最後に、疎水性の役割を、ピレン、すなわち炭素及び水素のみを含むＳ2 対称
を有する螢光団を用いて研究した。スペクトル変化は、吸収又は螢光モデルのい
づれにも観察されず、そして転移双極子の大きさは極端に小さい。それらの結果
は、Ｈ−ダイマー形成における疎水性のための有力な役割に対する証拠を提供す
る。
【０２３７】 要約すると、Ｈ−ダイマー形成と構造元素との間の最とも強い相互関係は、順
に、非局在化された電荷、対称性、及び転移双極子の大きさである。疎水性は、
このタイプの二量体化においては主要決定因子であることが観察されなかった。 上記例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。本発明の他の変
法は当業者に容易に明らかになるであろう。本明細書に引用されるすべての出版
物、特許及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。
【０２３８】 実施例16 高い処理量のスクリーニング 本発明のインジケーターが約650nm〜約720nmの範囲の波長を放射する蛍光分子
を使用するとき、それらは蛍光、均質、多重、生細胞およびビーズをベースとす
るスクリーニングアッセイのための、Perkin Elmer Applied Biosystems FM
ATTM System 8100自動化、マクロ−コンフォーカウ高い処理量のスクリーニン
グ（HTS）システムにおいて使用するためによく適する。
【０２３９】 96ウェルの平底プレートにおいて、細胞を3〜10×103細胞／ウェルの密度でプ
レートした。細胞の1集団をアポトーシス誘導因子、例えば、スタウロスポリン
と約1μMの濃度において約3〜4時間インキュベートし、そして第2集団をベヒク
ル、例えば、DMSOと等しい時間インキュベートした。インキュベーション期間後
、2つのIC5蛍光体を含んでなるPhiPhiLux（OncoImmunin，Inc.）細胞透過性蛍光
発生基質を約2μMの最後濃度で添加した。インキュベーションを1時間実施した
。プレートをFMATTM8100計装の中に入れ、各ウェル中の蛍光細胞の数を計数した
。
【０２４０】 好ましい態様において、バックグラウンドレベルに対して所望のシグナルが得
られるまで、光電子増倍管上の増加を下方に同調する（検出器感度を減少させる
）ことによって、このシステムを単に「そのまま」使用した。 特に本発明のインジケーターを使用する細胞内プロテアーゼ活性を検出するた
めに、この計装の実用性を増強するためのFMATTM8100の他の変更を行った。1つ
の変更において、放射側にニュートラルデンシティのフィルターの導入して、蛍
光インジケーターにより提供される全放射シグナルを減少できるように、機械を
変更した。これにより、感度を減少させないで、検出器を作動させることができ
る。連続的に可変のフィルターステップドフィルター（例えば、フィルターホイ
ール）は適度のシグナル減少の選択を可能とする。
【０２４１】 光学的切片厚さの選択を可能とするために、FMATTMにおいて固定ピンホールよ
りむしろ可変ピンホールを準備することができる。現在の計装は固定した100μm
の光学的切片を利用する。好ましい厚さの範囲は0.1μM〜100μmであり、そして
本発明のインジケーターとともに使用するためには、約10〜20μmの光学的切片
厚さが最も好ましい。 明るいフィールドおよび／または相の縮小画像捕捉のオプションを導入すると
、プロテアーゼインジケーターシグナルおよび細胞の画像の切り替えが可能とな
る。これにより、フィールド内の全細胞数の測定が促進される。
【０２４２】 FMATの倍率設定を増加すると、低い解像度の全細胞画像よりむしろ細胞下の局
在化画像の捕捉が可能となる。これにより、特定の細胞下オルガネラまたはドメ
インに対するプロテアーゼ活性の定位が促進される。 現存するヘリウム−ネオンレーザーと一緒に紫外線レーザー励起オプションを
導入すると、現存する核染色素、例えば、Hearchst色素を使用して核を計数する
ことができ、これにより細胞の計数が促進される。
【０２４３】 FMAT 8100に添付されている画像解析ソフトウェアを変更することもできる。
例えば、種々の測定したパラメーター、例えば、特定特徴的形状、輝度、サイズ
、特定標識の存在、およびその他を適用することによって、1またはそれ以上の
下位集団にグループを形成できるように、ソフトウェアを変更することができる
。これにより、例えば、1またはそれ以上の生理学的パラメーターまたはマーカ
ーと酵素活性を相関させることができる。 実時間捕捉画像の解析のソフトウェアを変更すると、細胞数または細胞下特徴
の数の計数することができ、これにより装置をそのデータ獲得プロトコルに対し
て正規化することができる。
【０２４４】 上記実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきでは
ない。本発明の他の変形は当業者にとって容易に明らかであり、添付された特許
請求の範囲に包含される。本明細書において引用したすべての刊行物、特許、お
よび特許出願は引用することによって本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図1Aは、D-NorFES-Aプロテアーゼ阻害剤（F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-P
ro-Cys-F2)（式中、Ｆ1 はドナー（Ｄ）螢光団（５’−カルボキシテトラメチル
ローダミン（Ｃ2211）であり、そしてＦ2 はアクセプター（Ａ）螢光団（ローダ
ミンＸアセタミド（R492) である）の、エステラーゼ添加前及び後でのHPLC分析
を示す。図１Ａ：エラスターゼ添加前のHPLCであって、無傷のインジケーター分
子を示す後溶出ピークを示す。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、D-NorFES-Aプロテアーゼ阻害剤（F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile
-Pro-Cys-F2)（式中、Ｆ1 はドナー（Ｄ）螢光団（５’−カルボキシテトラメチ
ルローダミン（Ｃ2211）であり、そしてＦ2 はアクセプター（Ａ）螢光団（ロー
ダミンＸアセタミド（R492) である）の、エステラーゼ添加前及び後でのHPLC分
析を示す。図１Ｂは、エラスターゼ添加後のHPLCであって、両螢光団が吸光する
550nmでの検出を示す。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、D-NorFES-Aプロテアーゼ阻害剤（F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile
-Pro-Cys-F2)（式中、Ｆ1 はドナー（Ｄ）螢光団（５’−カルボキシテトラメチ
ルローダミン（Ｃ2211）であり、そしてＦ2 はアクセプター（Ａ）螢光団（ロー
ダミンＸアセタミド（R492) である）の、エステラーゼ添加前及び後でのHPLC分
析を示す。図１Ｃはエラスターゼ添加後のHPLCであって、Ｆ2 が最大吸収する 5
80nmでの検出を示す。
【図２Ａ】 図２Ａは、エラスターゼ添加の前のD-NorFES-A- 螢光源プロテアーゼインジケ
ーターの発光スペクトルを示す。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、エラスターゼ添加の後のD-NorFES-A- 螢光源プロテアーゼインジケ
ーターの発光スペクトルを示す。
【図３】 図３は、エラスターゼ１ユニットの添加後の時間の関数としての、図１の螢光
源プロテアーゼインディケーターの経時的増加を示す。
【図４Ａ】 図４Ａは、エラスターゼ１ユニットの添加後の時間の関数としての、ドナー螢
光団の螢光強度を示す。図１の螢光源プロテアーゼインディケーター。D-NorFES
-Aは、F1-Asp-Ala-Ile-Pro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2 プロテアーゼインディケー
ター（式中、Ｆ1 はドナー螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（
Ｃ2211）であり、そしてＦ2 はアクセプター螢光団（ローダミンＸアセタミド（
R492) である）である。D-NorFES及びA-NorFESのそれぞれは、同じペプチド主鎖
を有するが、しかし２つの螢光団の内１方のみを提供する分子を示す。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、エラスターゼ１ユニットの添加後の時間の関数としての、ドナー螢
光団の螢光強度を示す。図４Ｂ：２種類の螢光団のいずれか一方により標識され
た図１の螢光源プロテアーゼのペプチド主鎖。D-NorFES-Aは、F1-Asp-Ala-Ile-P
ro-Nle-Ser-Ile-Pro-Cys-F2 プロテアーゼインディケーター（式中、Ｆ1 はドナ
ー螢光団（５’−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｃ2211）であり、そして
Ｆ2 はアクセプター螢光団（ローダミンＸアセタミド（R492) である）である。
D-NorFES及びA-NorFESのそれぞれは、同じペプチド主鎖を有するが、しかし２つ
の螢光団の内１方のみを提供する分子を示す。
【図５】 図５は、DEVD, DEVN及びICE 基質の螢光を示す。１μＭの基質DEVD（例８の化
合物２）、DEVN（例８の化合物３）及びICE(例８の化合物５）を含有する測定緩
衝液50mM HEPES緩衝剤、pH7.5 、10％（ｗ／ｖ）シュークロース及び 0.1％（ｗ
／ｖ）（HAPS） 100μｌに、10μｌのジャーカット細胞の細胞溶解物を添加し、
そして37℃にて16時間インキュベートした。このジャーカット細胞の溶解物は、
抗Fas 抗体により１μｇ／mlの濃度で６時間刺激された細胞から調製した。基質
溶液のみの螢光強度を、図５において、ｔ＝０として標示した水平線として示し
、そして細胞溶解物と基質溶液との混合物の16時間後の螢光強度を垂直線で示し
、そしてｔ＝16時間消化として標示する。10μｌの細胞溶解物を50μＭ ZVAD-FM
K(ベンゾキシカルボニル−バラニル−アラニル−アスパルチル−フルオロメチル
ケトン）と共に37℃にて30分間プレインキュベートし、次に基質溶液に加えた。
この混合物の16時間後の螢光強度を、ZVAD-FMK（阻害物質）として標示した棒に
より示す。最後に、プレインキュベートした細胞溶解物を、ヨードアセトアミド
（スルヒドリル基のためのアルキル化剤）及びPMSF（セリンプロテアーゼを阻害
するため）と共に、基質溶液に加えた。37℃にて16時間後の螢光強度を、ヨード
アセトアミド／PMSFとして標示した棒により示す。DEVN基質は負対照基質（Ｐ1
，Asp 残基がAsn により置換されている）である。CPP32 プロテアーゼは、Ｐ1
残基がアスパラギン酸残基であることを必要とする。DEVN基質のグラフの４本の
棒（図５）が示すところによれば、活性化された細胞溶解物はDEVD基質を消化す
る他のいかなるプロテアーゼも含有しない。なぜなら、16時間消化の強度は基質
のみと同じだからである。DEVD基質の棒グラフが示すところによれば、活性化さ
れた細胞溶解物はCPP32 プロテアーゼを含有し、そしてこのプロテアーゼ活性は
既知のCPP32 プロテアーゼ阻害剤であるZVAD-FMKにより阻害される。DEVD基質の
消化への他のプロテアーゼの寄与は、ZVAD-FMK棒とヨードアセタミド／PMSF棒の
強度の間の差により示される通り、非常に小さい。
【図６】 図６．本発明の方法において使用するための好ましいジアルキル化カルボシア
ニン色素。Ｘ及びＹは(CH3)2C、NH、O、Sなどから成る群から独立に選択される
。好ましくは、Ｎは０より大きくそして20未満であり、より好ましくはＮは０よ
り大きくそして10未満であり、そして最も好ましくはＮは０より大きくそして約
５未満である。或る態様においては、Ｎは１又は２である。R1及びR2は独立して
アルキル基から選択される。R3〜R10は独立してＨ、アルキル、Oアルキル、アル
ハライド、アルキル化アミン、アミンなどから成る群から選択される。Ｚは任意
のカウンテリオン(counterion)である。IC5において、R1はエチルであり、そし
てR2は5-(N-カルボニルペンチル）である。R3〜R10はＨである。Ｘ及びＹは3,3,
3',3'-テトラメチルである（例えば、Dojindo LaboratoriesからのIC5-OSuを参
考のこと）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パッカード，ビバリー エス． アメリカ合衆国，メリーランド 20852， ロックビル，パイン ヘブン テラス 10605 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ02 QQ03 QQ08 QQ20 QQ36 QR41 QR48 QR66 QS11 QS24 QS36 QX01 QX02

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式： 【化１】 [式中、PはDEVDGIN（配列番号11）、（d-O）DEVDGIN（配列番号12）、DEVDGID
    （配列番号13）、LVEIDNG（配列番号14）、GIETESGV（配列番号15）、TGRT（配
    列番号16）、VMTGRT（配列番号17）、SEVKLDAEF（配列番号18）、S（d-E）VK（d
    -L）DAE（d-F）（配列番号19）、EDVVCCS（配列番号20）、EEVEGIN（配列番号21
    ）、D（d-F）VDGIN、（d-D）EV（d-D）GIN、LVEIENG（配列番号22）、GIETDSG（
    配列番号23）、GIETESG（配列番号24）、LEHDGIN（配列番号25）、LETDGIN（配
    列番号26）、WEHDGIN（配列番号27）、YVHDG（配列番号28）、YVHDGIN（配列番
    号29）、YVHDA（配列番号30）、TGRTG（配列番号31）、S（d-E）VK（d-L）DAE（
    d-F）（配列番号32）、IEPDS（配列番号33）、PLGIAGI（配列番号34）、IETDSGV
    （配列番号35）、SEVNLDAEF（配列番号36）、YVHDAPV（配列番号37）およびSQNY
    PIVQ（配列番号38）から成る群から選択されるペプチドであり； F1およびF2は蛍光体であり、F1はアミノ末端のアミノ酸に結合されており、そ
    してF2はカルボキシル末端のアミノ酸に結合されており； S1およびS2は、存在するとき、1〜約50アミノ酸長さ範囲のペプチドスペーサ
    ーであり、S1は、存在するとき、アミノ末端のアミノ酸に結合されており、そし
    てS2は、存在するとき、カルボキシル末端のアミノ酸に結合されており； i、j、k、l、m、n、o、p、q、およびrは独立して0または1であり； aa1およびaa10は独立してリシン、オルニチンおよびシステインから成る群よ
    り独立して選択され； aa2、aa3、aa8、およびaa9はアミノ酸またはAsp、Glu、Lys、オルニチン、Arg
    、シツルチン、ホモシツルチン、Ser、ホモセリン、Thr、およびTyrから成るジ
    ペプチドから成る群より独立して選択され； aa5、aa4、aa6、およびaa7はプロリン、3，4−デヒドロプロリン、ヒドロキシ
    プロリン、アルファアミノイソ酪酸およびN−メチルアラニンから成る群より独
    立して選択され； XはGly、βAla、γAbu、Gly−Gly、Ahx、C7、βAla−Gly、βAla−βAla、γA
    bu−Gly、βAla−γAbu、Gly−Gly−Gly、γAbu−γAbu、Ahx−Gly、βAla−Gly
    −Gly、Ahx−βAla、βAla−βAla−Gly、Gly−Gly−Gly−Gly、Ahx−γAbu、β
    Ala−βAla−βAla、γAbu−βAla−Gly、γAbu−γAbu−Gly、Ahx−Ahx、γAbu
    −γAbu−βAla、およびAhx−Ahx−Glyから成る群から選択され； YはGly、βAla、γAbu、Gly−Gly、Ahx、C7、Gly−βAla、βAla−βAla、Gly
    −γAbu、γAbu−βAla、Gly−Gly−Gly、γAbu−γAbu、Gly−Ahx、Gly−Gly−
    βAla、βAla−Ahx、Gly−βAla−βAla、Gly−Gly−Gly−Gly、γAbu−Ahx、β
    Ala−βAla−βAla、Gly−βAla−γAbu、Ahx−Ahx、βAla−γAbu−γAbu、お
    よびGly−Ahx−Ahxから成る群から選択され；そして iが1であるとき、S1はaa1の末端アルファアミノ基を通すペプチド結合によりa
    a1に結合しており、そしてrが1であるとき、S2はaa10の末端アルファカルボキシ
    ル基を通すペプチド結合によりaa10に結合している] を有する、プロテアーゼ活性を検出するフルオロジェニック組成物。
  2. 【請求項２】 カルボキシル末端アミノおよびカルボン酸基がアミドで置換
    されている、請求項1に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 rが0であり、そしてaa10がC−末端のアミド基または遊離カ
    ルボン酸基である、請求項1に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 アミノ酸配列がFa−KDPJGDEVDGINGJPKGY、Fm−KDPJGDEVDGIN
    GJPkアミド、Fm−KDPJG（d-O）DEVDGINGJPKGY、Fm−KDPJGDEVDGINGPKGY、Fm−KD
    PGDEVDGINGJPKGY、Fm−KDPJGDEVDGIDGJPkアミド、Fm−KDPJGLVEINDNGJPKGY、Fm
    −KDPJGIETESGVGJPKGY、Fm−KDPJTGRTGPKGY、Fm−DPTGRTGPKGY、Fm−KDPVMTGRTG
    JPKGY、Fm−KDPTGRTGJPKGY、Fm−KDPJGTGRTGJPKGY、Fm−KDPJGTGRTGPKGY、Fm−K
    DPGTGRTGPKGY、Fm-KDPJGSEVKLGAEFGJPKGY、Fm−KDPJGS（d-E）VK（d-L）DAE（d-
    F）GC5PKDDY、Fa−KDPJGEDVVCCSGJPKGY、KDPJGEEVEGINGJPKGY、KDPJGD（d-F）VD
    GINGJPKGY、KDPJG（d-D）EV（d-D）GINGJPKGY、KDPJGLVEIENGJPKGY、KDPJGIETDS
    GJPKGY、KDPJGIETESGJPKGY、KDPJGLEHDGINGJPKGY、KDPJGLETDGNINGJPKGY、KDPJG
    WEHDGINGJPKGY、KDPJGYVHDGJPKGY、KDPJGYVHDGINGJPKGY、KDPJGYVGHDAPKGY、KDP
    JTGRTGJPKGY、KDPC3TGRTGPKGY、KDPC7TGRTGPKGY、KDPC5GS（d-E）VK（d-L）DAE
    （d-F）GJPKGY、KDPJGIEPDSGJPKGY、KDPJGPLGIAGIGJPKGY、およびKDPJGSQNYPIVQ
    GJPKGYから成る群から選択される、請求項1に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 F1およびF2が同一蛍光体である、請求項1に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 F1およびF2が約315〜約700nmの励起波長を有する、請求項5
    に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 F1分子がaa1アミノ酸のα−アミノ基を通して、またはaa1ア
    ミノ酸の側鎖アミノ基を通して、またはaa1アミノ酸の側鎖スルフヒドリル基を
    通して結合されている、請求項1に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 F2分子がaa10アミノ酸の側鎖アミノ基を通して、またはaa10
    アミノ酸のカルボキシル基を通して、またはaa10アミノ酸の側鎖スルフヒドリル
    基を通して結合されている、請求項1に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 前記蛍光体がローダミンX、9−（2，5−（または2，6）−ジ
    カルボキシフェニル）−3，6−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウムハライド
    または他のアニオン（TMR）、9−（2，5）−ジカルボキシフェニル）−2，7−ジ
    メチル−3，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウムハライドまたは他のアニオ
    ン（Rh6G）、9−（2，6）−ジカルボキシフェニル）−2，7−ジメチル−3，6−
    ビス（エチルアミノ）キサンチリウムハライドまたは他のアニオン、9−（2，5
    −（または2，6）−ジカルボキシフェニル）−3，6−ビスアミノ−キサンチリウ
    ムハライドまたは他のアニオン（Rh110）、9−（2，5（または2，6）−ジカルボ
    キシフェニル）−3−アミノ−6−ヒドロキシ−キサンチリウムハライドまたは他
    のアニオン（Blue Rh）、カルボキシテトラメチルローダミン、カルボキシロー
    ダミン−X、ジエチルアミノクマリン、9−（2，5−ジカルボキシフェニル）−3
    ，6−ビス−（ジメチルアミノ）キサンチリウムクロライド（5−TMR）、9−（2
    ，6−ジカルボキシフェニル）−3，6−ビス−（ジメチルアミノ）キサンチリウ
    ムクロライド（6−TMR）、9−（2−カルボキシフェニル）−2，7−ジメチル−3
    ，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウム、9−（2−カルボキシフェニル）−3
    ，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウム、および9−（2−カルボキシフェニ
    ル）−キサンチリウムから成る群から選択される、請求項1に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記組成物が疎水性基を有する、請求項1に記載の組成物
    。
  11. 【請求項１１】 前記組成物が疎水性基を有する、請求項4に記載の組成物
    。
  12. 【請求項１２】 前記疎水性基がFmoc、9−フルオレンアセチル、1−フルオ
    レンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、および9−フルオレン−1−カ
    ルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Xan）、トリチル（Trt）
    、4−メチルトリチル（Mtt）、4−メトキシトリチル（Mmt）、4−メトキシ−2，
    3，6−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Mtr）、メシチレン−2−スルホニル（
    Mts）、4，4−ジメトキシベンズヒドリル（Mbh）、トシル（Tos）、2，2，5，7
    ，8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル（Pmc）、4−メチルベンジル（MeBz
    l）、4−メトキシベンジル（MeOBzl）、ベンジルオキシ（MzlO）、ベンジル（Bz
    l）、3−ニトロ−2−ピリジンスルホニル（Npys）、1−（4，4−ジメチル−2，6
    −ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Dde）、2，6−ジクロロベンジル（2，
    6−DiCl−Bzl）、2−クロロベンジルオキシカルボニル（2−Cl−Z）、2−ブロモ
    ベンジルオキシカルボニル（2−Br−Z）、ベンジルオキシメチル（Bom）、t−ブ
    トキシカルボニル（Boc）、シクロヘキシルオキシ（cHxO）、t−ブトキシメチル
    （Bum）、t−ブトキシ（tBuO）、アセチル（Ac）、およびトリフルオロアセチル
    （TFA）から成る群から選択される、請求項11に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記疎水性基がFmocである、請求項12に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 前記疎水性基がFaである、請求項12に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 前記疎水性基が分子のアミノ末端に結合されている、請求
    項12に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 プロテアーゼを請求項1に記載の組成物と接触されること
    から成る、プロテアーゼ活性を検出する方法。
  17. 【請求項１７】 前記接触を組織学的切片である、請求項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記接触を細胞培養物中で実施する、請求項16に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 前記接触が播種したまたは培養した接着細胞である、請求
    項16に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記接触を組織、血液、尿、唾液、リンパ、バイオプシー
    から成る群から選択される生物学的試料に由来する細胞懸濁液中で実施する、請
    求項16に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 蛍光顕微鏡検査、蛍光マイクロプレートリーダー、フロー
    サイトメトリー、フルオロメトリー、吸収分光法から成る群から選択される方法
    により、検出を実施する、請求項16に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 疎水性基または少なくとも1つの融合環構造に結合した請
    求項1に記載の分子を準備し、そして 細胞を前記分子と接触させ、これにより前記分子は細胞の中に入る、 ことを含んでなる、細胞の中に分子を送り出す方法。
  23. 【請求項２３】 前記疎水性基がFmoc、9−フルオレンアセチル、1−フルオ
    レンカルボン酸基、9−フルオレンカルボン酸基、および9−フルオレン−1−カ
    ルボン酸基、ベンジルオキシカルボニル、キサンチル（Xan）、トリチル（Trt）
    、4−メチルトリチル（Mtt）、4−メトキシトリチル（Mmt）、4−メトキシ−2，
    3，6−トリメチル−ベンゼンスルホニル（Mtr）、メシチレン−2−スルホニル（
    Mts）、4，4−ジメトキシベンズヒドリル（Mbh）、トシル（Tos）、2，2，5，7
    ，8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル（Pmc）、4−メチルベンジル（MeBz
    l）、4−メトキシベンジル（MeOBzl）、ベンジルオキシ（MzlO）、ベンジル（Bz
    l）、3−ニトロ−2−ピリジンスルホニル（Npys）、1−（4，4−ジメチル−2，6
    −ジアキソシクロヘキシリデン）エチル（Dde）、2，6−ジクロロベンジル（2，
    6−DiCl−Bzl）、2−クロロベンジルオキシカルボニル（2−Cl−Z）、2−ブロモ
    ベンジルオキシカルボニル（2−Br−Z）、ベンジルオキシメチル（Bom）、t−ブ
    トキシカルボニル（Boc）、シクロヘキシルオキシ（cHxO）、t−ブトキシメチル
    （Bum）、t−ブトキシ（tBuO）、アセチル（Ac）、およびトリフルオロアセチル
    （TFA）から成る群から選択される、請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記蛍光体がローダミンX、9−（2，5−（または2，6）−
    ジカルボキシフェニル）−3，6−ビス（ジメチルアミノ）キサンチリウムハライ
    ドまたは他のアニオン（TMR）、9−（2，5）−ジカルボキシフェニル）−2，7−
    ジメチル−3，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウムハライドまたは他のアニ
    オン（Rh6G）、9−（2，6）−ジカルボキシフェニル）−2，7−ジメチル−3，6
    −ビス（エチルアミノ）キサンチリウムハライドまたは他のアニオン、9−（2，
    5−（または2，6）−ジカルボキシフェニル）−3，6−ビスアミノ−キサンチリ
    ウムハライドまたは他のアニオン（Rh110）、9−（2，5（または2，6）−ジカル
    ボキシフェニル）−3−アミノ−6−ヒドロキシ−キサンチリウムハライドまたは
    他のアニオン（Blue Rh）、カルボキシテトラメチルローダミン、カルボキシロ
    ーダミン−X、ジエチルアミノクマリン、9−（2，5−ジカルボキシフェニル）−
    3，6−ビス−（ジメチルアミノ）キサンチリウムクロライド（5−TMR）、9−（2
    ，6−ジカルボキシフェニル）−3，6−ビス−（ジメチルアミノ）キサンチリウ
    ムクロライド（6−TMR）、9−（2−カルボキシフェニル）−2，7−ジメチル−3
    ，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウム、9−（2−カルボキシフェニル）−3
    ，6−ビス（エチルアミノ）キサンチリウム、および9−（2−カルボキシフェニ
    ル）−キサンチリウムから成る群から選択される、請求項22に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記蛍光体がカルボキシテトラメチルローダミン、カルボ
    キシローダミン−Xおよびジエチルアミノクマリンから成る群から選択される、
    請求項22に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項22に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 プロテアーゼまたはプロテアーゼを含んでなる細胞を被験
    因子と接触させ、 前記プロテアーゼを請求項1〜15のいずれか一項に記載のフルオロジェニック
    組成物と接触させ、そして 前記フルオロジェニック組成物が生成するシグナルまたはシグナルの欠如を検
    出し、ここでプロテアーゼまたは細胞をより低い濃度の前記被験因子と接触させ
    る対照と比較した、前記被験因子と接触したプロテアーゼまたは細胞が生成する
    シグナルの差は、前記被験因子が前記プロテアーゼ活性をモジュレートすること
    を示す、 ことを含んでなる、プロテアーゼ活性をモジュレートする能力について被験因
    子をスクリーニングする方法。
  28. 【請求項２８】 より低い濃度の前記被験因子が前記被験因子の非存在であ
    る、請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 対照と比較して、前記被験因子と接触したプロテアーゼま
    たは細胞が生成するシグナルの増加が、前記被験因子が前記プロテアーゼ活性を
    増加させることを示す、請求項27に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 対照と比較して、前記被験因子と接触したプロテアーゼま
    たは細胞が生成するシグナルの減少が、前記被験因子が前記プロテアーゼ活性を
    減少させることを示す、請求項27に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 対照と比較して、前記被験因子と接触したプロテアーゼま
    たは細胞が生成するシグナルの増加が、前記被験因子が前記プロテアーゼ活性を
    増加させることを示す、請求項27に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記プロテアーゼを前記被験因子の存在下にフルオロジェ
    ニック組成物と接触させる、請求項27に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 被験因子の除去後、前記プロテアーゼをフルオロジェニッ
    ク組成物と接触させる、請求項27に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記プロテアーゼ活性をモジュレートする被験因子のリス
    トを含んでなるデータベースの中に、前記プロテアーゼ活性をモジュレートする
    被験因子を入れることをさらに含む、請求項27に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記検出が細胞内シグナルの検出を含んでなる、請求項27
    に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記検出が顕微鏡検査を含んでなる、請求項27に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】 前記検出がフローサイトメトリーを含んでなる、請求項27
    に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記検出が全細胞の高い処理量のスクリーニングを含んで
    なる、請求項27に記載の方法。
JP2001521773A 1999-09-10 2000-09-11 生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法 Pending JP2003508080A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/394,019 1999-09-10
US09/394,019 US6936687B1 (en) 1997-02-20 1999-09-10 Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
PCT/US2000/024882 WO2001018238A1 (en) 1999-09-10 2000-09-11 Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003508080A true JP2003508080A (ja) 2003-03-04

Family

ID=23557207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001521773A Pending JP2003508080A (ja) 1999-09-10 2000-09-11 生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1214445A4 (ja)
JP (1) JP2003508080A (ja)
AU (1) AU7368800A (ja)
CA (1) CA2384021A1 (ja)
WO (1) WO2001018238A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015502365A (ja) * 2011-12-12 2015-01-22 オンコイミューニン，インコーポレイティド オリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達
WO2023032995A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2024181455A1 (ja) 2023-02-27 2024-09-06 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2024181454A1 (ja) 2023-02-27 2024-09-06 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6893868B2 (en) 1997-02-20 2005-05-17 Onco Immunin, Inc. Homo-doubly labeled compositions for the detection of enzyme activity in biological samples
US6037137A (en) 1997-02-20 2000-03-14 Oncoimmunin, Inc. Fluorogenic peptides for the detection of protease activity
US7312302B2 (en) 1997-02-20 2007-12-25 Oncolmmunin, Inc. Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
US6951761B2 (en) 2001-08-31 2005-10-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Measurements of multiple molecules using a CryoArray
GB0200479D0 (en) * 2002-01-09 2002-02-27 Medical Res Council Fluorogenic protease substrates
US7927871B2 (en) 2002-01-29 2011-04-19 Oncoimmunin, Inc. Visualization and quantitation of cellular cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic protease substrates and caspase activity indicator markers
GB0311948D0 (en) * 2003-05-23 2003-06-25 Stockport Innovation Ltd Light emitting probes
EP2248821B8 (en) * 2008-02-22 2015-03-18 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Substrate for assaying beta-glucan and/or endotoxin and assay method

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723288A (en) * 1994-05-06 1998-03-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of fluorescent detection of nucleic acids and cytoskeleton elements using bis-dicationic aryl furans, and kits useful therefor
US5804395A (en) * 1995-12-01 1998-09-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Fluorescence polarization assays of enzymes and substrates therefore
US6037137A (en) * 1997-02-20 2000-03-14 Oncoimmunin, Inc. Fluorogenic peptides for the detection of protease activity
DE69920473T2 (de) * 1998-07-21 2006-02-23 Cytovia, Inc., San Diego Neue fluoreszenzfarbstoffe und ihre anwendung in fluoreszenznachweisverfahren ganzer zellen für kaspasen, peptidasen, proteasen und andere enzyme sowie deren verwendung

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015502365A (ja) * 2011-12-12 2015-01-22 オンコイミューニン，インコーポレイティド オリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達
JP2019073548A (ja) * 2011-12-12 2019-05-16 オンコイミューニン，インコーポレイティド オリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達
WO2023032995A1 (ja) 2021-08-31 2023-03-09 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2024181455A1 (ja) 2023-02-27 2024-09-06 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
WO2024181454A1 (ja) 2023-02-27 2024-09-06 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
EP4674861A1 (en) 2023-02-27 2026-01-07 FUJIFILM Corporation Compound, and labeled biomaterial using same
EP4674860A1 (en) 2023-02-27 2026-01-07 FUJIFILM Corporation Compound and labeled biomaterial using same

Also Published As

Publication number Publication date
EP1214445A4 (en) 2007-01-24
AU7368800A (en) 2001-04-10
CA2384021A1 (en) 2001-03-15
WO2001018238A1 (en) 2001-03-15
EP1214445A1 (en) 2002-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7541143B2 (en) Homo-doubly labeled compositions for the detection of enzyme activity in biological samples
JP4298796B2 (ja) 生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法
EP0873417B1 (en) Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof
US20030166028A1 (en) Peptide biosensors for anthrax protease
Mittoo et al. Synthesis and evaluation of fluorescent probes for the detection of calpain activity
US7312302B2 (en) Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
JP2003508080A (ja) 生物学的サンプル中のプロテアーゼの検出のための組成物及びその使用方法
WO2003099780A2 (en) Luminogenic protease substrates
CN106632689B (zh) 多肽探针、包含该探针的试剂盒及其应用
US20040024178A1 (en) Bacterial signal peptidase inhibitors and uses thereof
AU2006200291A1 (en) Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof
US6955891B2 (en) Reagents for assaying Bacillus anthracis lethal factor protease
CA2433880A1 (en) Water-soluble, fluorescent, & electrophoretically mobile peptidic substrates for enzymatic reactions and methods for their use in high-troughput screening_assays

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070911

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080729

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081028

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081105

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090324