JP2003506018A - 匂いレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なＧタンパク質共役レセプターと新規な匂いレセプターのファミリー及び関連した核酸、リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストを同定するために有用である一般的な発現クローニング法を含む匂いレセプターに関連する方法と組成物を提供する。これらの組成物は、開示されたレセプターの機能を、嗅覚系を介して媒介される生殖型／性的及び非性的社会的挙動、生殖型生理及び嗅覚系調節摂食挙動、回遊挙動及び受胎、移植、発情及び月経のような事象を変調するアゴニスト、アンタゴニスト又はリガンドとそれらを接触させるか発現を変調することによって変調する、関連レセプターのスクリーニングなどの広範囲の用途を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明者：ジョン・エンガイ、デイビッド・ジェイ・スペカ，デイビッド・エム・
リン、イユード・ワイ・イザコフ、アンドリュー・エイチ・ディットマン及びジ
ンホン・ファンで、全員がカリフォルニア州バークレーの住所である。

【０００２】 この研究は国立難聴等意思疎通障害研究所（ＮＩＤＣＤ）と海軍研究事務所と
国立科学財団の助成金によって支援された。

【０００３】 （関連出願とのクロスリファレンス） この出願は１９９９年７月２０日に出願された匂いレセプターなる名称の、米
国特許第６０／１４４７６６号に基づいて米国特許法第１２０条の優先権を主張
する。

【０００４】 （序） （発明の分野） 本発明の分野は匂いレセプターである。

【０００５】 （発明の背景） 脊椎動物の嗅覚系による多くの環境刺激の認識と識別は鼻の嗅覚上皮内の嗅覚
ニューロンの活性化によりなされる（Shepherd, 1994; Buch, 1996により概説）
。嗅覚プロセスにおける最初の過程は匂いレセプターと匂い物質のリガンドの相
互作用のレベルにある。匂いレセプターをコードすると思われる非常に多数のフ
ァミリーが最初にラットにおいて同定された（Buck及びAxel, 1991）。これらの
レセプターはＧタンパク質共役レセプターのスーパーファミリーに特徴的な７つ
の膜貫通ドメイントポロジーを示すと予想されている。異なる脊椎動物種のレセ
プターレパートリーのサイズは極めて大きく、１００及び１０００の個々の遺伝
子を含むと推定される（Buck, 1996）。これらの知見から、嗅覚識別における最
初の過程が、それぞれがほんの少数の構造的に関連した匂い物質に結合可能な非
常に多数の特異的レセプターからのシグナルの統合により達成されることが示唆
される。このモデルと一致して、一つのラット匂いレセプターが７から１０の炭
素のｎ-脂肪族アルデヒド類により活性化されうることが示されている（Zhao等,
1997;またKrautwurst等, 1998; Malnic等, 1999を参照）。無脊椎動物では、線
虫のｏｄｒ−１０遺伝子は匂い物質ジアセチルに応答するように鋭敏に調整され
ているＧタンパク質共役レセプターをコードしている（Sengupta等, 1996; Zhan
g等, 1997）。

【０００６】 ＢｕｃｋとＡｘｅｌ（１９９１）によって最初に記載されたレセプター遺伝子
ファミリーには関連していない他の嗅覚Ｇタンパク質共役レセプターが哺乳動物
の鋤鼻器（ＶＮＯ）において同定されている（Dulac及びAxel, 1995; Herrada及
びDulac, 1997; Matsunami及びBuck, 1997; Ryba及びTirindelli, 1997）。ＶＮ
Ｏは、非揮発性のフェロモン及び非フェロモンキューを受け取る高等脊椎動物の
末梢嗅覚系の特殊化器である（Halpern, 1987）。ＶＮＯレセプターは二つの無
関連の遺伝子ファミリーによりコードされており；ＶＮＲファミリーのメンバー
はＧタンパク質のαユニットＧａｉ２のその発現により定義されるＶＮＯニュー
ロンの亜集団に局在化する一方（Dulac及びAxel, 1995; Berghard及びBuck, 199
6; Jia及びHalpern, 1996）；Ｖ２ＲファミリーのメンバーはＧａｏ発現細胞の
別の亜集団に広く発現される（Herrada及びDulac, 1997; Matsunami及びBuck, 1
997; Ryba及びTirindelli, 1997）。興味深いことには、Ｖ２Ｒレセプターはカ
ルシウム感知レセプター（CaSR; Hebert及びBrown, 1995）及び代謝型グルタミ
ン酸レセプター（mGluR; Tanabe等, 1992）ファミリーに構造的に関連している
。ＶＮＯレセプターの両方のクラスはフェロモンレセプターを含むことが提案さ
れている一方、これらのオーファンレセプターの実際の機能はそのリガンド結合
又はリガンド活性化特性の直接の証明を待っている。

【０００７】 嗅覚レセプターのためのリガンドを同定するためのアプローチとして、我々は
、モデル系としてキンギョを使用する発現クローニング法を探求した。サカナは
陸生脊椎動物よりも小範囲の匂い物質に応答すると考えられており、よってより
少ない匂いレセプターレパートリーを保有していると思われる（Ngai等, 1993b
）。更に、サカナが認識する匂い物質は水溶性であり、アミノ酸（供餌キュー）
、胆汁酸（おそらくは移動の役割を持つ非再生社会的キュー）及び性ステロイド
及びプロスタグランジン（性フェロモンキュー）を含む（Hara, 1994; Sorensen
及びCaprio, 1998により概説）。電気生理学的研究により特異的リガンドに対す
るサカナの嗅覚系の感度が定義されており、例えばピコモル（性ステロイドに対
して）からナノモル（アミノ酸に対して）範囲で検知閾値を示している（Hara,
1994）。よって、インヴィボでの匂い物質誘起経路の確定した性質はサカナの匂
いレセプターの分子的及び生化学的特徴付けのための優れた出発点を提供する。

【０００８】 以下の実施例では、我々は塩基性アミノ酸を認識するように優先的に調整され
たキンギョ匂いレセプターをコードするｃＤＮＡの発現クローニングを記述する
。このｃＤＮＡは、ＣａＳＲ、ｍＧｌｕＲ及びＶＮＯレセプターのＶ２Ｒクラス
を含むレセプターファミリーと有意な類似性を持つＧタンパク質共役レセプター
をコードする。縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、キンギョの嗅覚上
皮に発現さえる他の関連配列を明らかにする。また我々の結果は、これらのレセ
プターが匂いレセプターのファミリーを含んでいることを示す。更に、キンギョ
のアミノ酸レセプターの匂い物質調整特性の特徴付けにより嗅覚系における分子
認識及び情報コーディングのモデルを考えるための重要な分子パラメータを提供
する。 この発明の側面はSpeca等（Neuron 1999 Jul;23(3):487-98）によって発表さ
れている。

【０００９】 （発明の概要） 本発明は、新規なＧタンパク質共役レセプターと新規なファミリーの匂いレセ
プターと、関連した核酸、リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストを同定する
ために有用である一般的な発現クローニング法を含む匂いレセプターに関連する
方法と組成物を提供する。これらの組成物は、嗅覚系を介して媒介される生殖型
／性的及び非性的社会的挙動、生殖型生理及び嗅覚系調節摂食挙動、回遊挙動及
び受胎、移植、発情及び月経のような事象を変調するアゴニスト、アンタゴニス
ト又はリガンドとそれらを接触させるかその発現を変調することによって、開示
されたレセプターの機能を変調することにより、関連レセプターのスクリーニン
グなどの広範囲の用途を提供する。

【００１０】 （発明の特定の実施態様の説明） 次の特定の実施態様と実施例の説明は例示のために提供されるもので限定のた
めではない。キンギョのＲ５．２４を特に対象とし、これについてしばしば実証
されるが、断片の限定及びアッセイの利用を含む次の説明はまた他の開示された
ＣａＳＲ様ポリペプチド及びポリヌクレオチドに当てはまる。 主題のドメインは、Ｒ５．２４媒介嗅覚、リガンドシグナル伝達又は伝達阻害
活性及び／又はＲ５．２４特異的結合標的-結合又は結合阻害活性のようなＲ５
．２４ドメイン特異的活性又は機能を提供する。Ｒ５．２４特異的活性又は機能
は、簡便なインヴィトロ細胞ベース又はインヴィボアッセイ、例えばインヴィト
ロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ、動物中（例えば遺伝子療法、トランスジェ
ニック動物等々）等々により測定されうる。特異的結合標的は、リガンド、アゴ
ニスト又はアンタゴニスト、Ｒ５．２４調節タンパク質又は他の制御因子でＲ５
．２４活性又はその局在化を変調するもの；あるいは非天然結合標的、例えば抗
体のような特異的免疫タンパク質、又はＲ５．２４特異的薬剤、例えば以下に記
載されるようなスクリーニングアッセイで同定されるものでありうる。Ｒ５．２
４結合特異性は、結合平衡定数により（通常は少なくとも約１０^７Ｍ^−１、好ま
しくは少なくとも約１０^８Ｍ^−１、より好ましくは少なくとも約１０^９Ｍ^−１）
、異種宿主（例えば齧歯類又はウサギ）中にＲ５．２４特異的抗体を誘発するた
めにＲ５．２４発現細胞において負の変異体として機能する主題のポリペプチド
の能力によりアッセイできる。

【００１１】 例示的な適したＲ５．２４ポリペプチド（ａ）配列番号：０２、又はその機能
的欠失変異体又はここに開示されたＲ５．２４配列に対して約６０−７０％、好
ましくは約７０−８０％、より好ましくは約８０−９０％、最も好ましくは約９
５−９９％類似の配列がデフォルト設定を使用するベストフィット分析法によっ
て決定され及び／又は（ｂ）天然Ｒ５．２４コード配列（例えば配列番号：０１
）又はそれに特異的にハイブリダイズする少なくとも３６、好ましくは少なくと
も７２、より好ましくは少なくとも１４４、最も好ましくは少なくとも２８８ヌ
クレオチド長のその断片を含む核酸によりコードされる。好適な欠失変異体はこ
こに記載されるＲ５．２４結合又は活性化アッセイにおいて容易にスクリーニン
グされる。好適なＲ５．２４ドメイン／欠失変異体／断片は配列番号：０２の少
なくとも８、好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも３２、最も
好ましくは少なくとも６４の連続残基を含み、Ｒ５．２４特異的活性、例えば特
に担体タンパク質と結合されたときのＲ５．２４特異的抗原性及び／又は免疫原
性を提供する。主題のドメインは特に担体タンパク質と結合されたときにＲ５．
２４特異的抗原及び／又は免疫原を提供する。例えば、Ｒ５．２４特異的ドメイ
ンに相当するペプチドはキーホールリンペット抗原（ＫＬＨ）に共有結合的に結
合され、コンジュゲートは完全フロイントアジュバント中で乳化される。実験用
ウサギを常法により免疫し採血した。Ｒ５．２４特異的抗体の有無を固定化Ｒ５
．２４ポリペプチドを使用する固相免疫吸着アッセイによって検査する。Ｒ５．
２４特異的抗原性及び／又は免疫原性ペプチドは、関連した配列ヒトＣａＳＲ、
フグＣａ０２．１、マウスＶ２Ｒ２及びラットｍＧｌｕＲ１とのアラインメント
において分かるように、広がった配列領域、好ましくは広がった細胞外又は細胞
質ゾル領域を包含する。

【００１２】 好適な天然Ｒ５．２４コード配列断片はそのようなＲ５．２４ドメインをコー
ドするのに十分な長さである。特定の実施態様では、Ｒ５．２４断片は種特異的
断片を含み；そのような断片はアラインメントから容易に識別される。そのよう
なＲ５．２４−１免疫原性及び／又は抗原性ペプチドの例を表１に示す。

【００１３】 一実施態様では、Ｒ５．２４ポリペプチドは、配列番号：０１を含む核酸又は
好ましくはストリンジェントな条件下で、全長ＤＮＡ鎖とハイブリダイズする断
片によってコードされている。そのような核酸は配列番号：０１の少なくとも３
６、好ましくは少なくとも７２、より好ましくは少なくとも１４４、最も好まし
くは少なくとも２８８のヌクレオチドを含む。特異的なハイブリダイゼーション
の実証にはストリンジェントな条件が必要で、例えば３０％ホルムアミドを５ｘ
ＳＳＰＥ（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＮａＰＯ_４、ｐＨ７．７、０．０
０１Ｍ ＥＤＴＡ）緩衝液に含む緩衝液中で４２℃にてハイブリダイズさせ、０
．２ｘＳＳＰＥ（条件Ｉ）で４２℃の温度にて洗浄して結合したままに残し；好
ましくは５０％ホルムアミドを５ｘＳＳＰＥ緩衝液に含む緩衝液中で４２℃の温
度にてハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＰＥ（条件ＩＩ）で４２℃にて洗浄し
て結合したままに残す。配列番号：０１のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする例示的
な核酸を表２に示す。

【００１４】 多くのニューロン細胞、形質転換細胞、感染（例えばウイルス）細胞等々を含
む広範囲の細胞型が、開示された方法による調節下でＲ５．２４ポリペプチドを
発現する。Ｒ５．２４の結合又は活性化の確認はここに開示されたような結合ア
ッセイ又は細胞機能アッセイにより容易に実施される。従って、主題の方法の適
応は広範な細胞型及び機能等々を包含する。標的細胞は培養中又はインサイツ、
すなわち天然宿主中に存在しうる。 他の側面では、本発明はＲ５．２４−リガンド相互作用を変調する薬剤のスク
リーニング法を提供する。これらの方法は一般にはＲ５．２４発現細胞、Ｒ５．
２４リガンド及び候補薬剤の混合物を生成し、Ｒ５．２４−リガンド相互作用へ
の薬剤の効果を決定することを含む。該方法はリード化合物に対する化学ライブ
ラリーの自動化されたコスト効率の良好な高スループットのスクリーニング法に
受け入れられる。同定された試薬は動物及びヒトでの治験に対して製薬工業での
用途が見いだされる；医薬開発のために、例えば試薬を誘導体化し、インヴィト
ロ及びインヴィボアッセイで再スクリーニングし、活性を至適化し毒性を最小に
できる。

【００１５】 開示されたＲ５．２４ポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系に対
して至適化されたＲ５．２４ポリペプチドコード核酸を逆翻訳するために使用さ
れるか（Holler等(1993) Gene 136, 323-328; Martin等(1995) Gene 154, 150-1
66）、又は天然Ｒ５．２４コード核酸配列の単離に使用される縮重オリゴヌクレ
オチドプライマー及びプローブを産生するために使用される（「ＧＣＧ」ソフト
ウェア, Genetics Computer Group, Inc, Madison WI）。Ｒ５．２４コード核酸
はＲ５．２４発現ベクターに使用され、例えば発現及びスクリーニング等々のた
めに組換え宿主細胞中に導入される。 本発明はまた配列番号：０１の断片を含むＲ５．２４ｃＤＮＡ特異的配列を有
し、それへの特異的なハイブリダイゼーションを行うのに十分な核酸ハイブリダ
イゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーを提供する。このようなプライ
マー又はプローブは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましく
は少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも９６のヌクレオチド長である。特
異的ハイブリダイゼーションの実証には一般にストリンジェントな条件が必要で
、例えば３０％ホルムアミドを５ｘＳＳＰＥ（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、０．０１
Ｍ ＮａＰＯ_４、ｐＨ７．７、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）緩衝液に含む緩衝液中で
４２℃にてハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＰＥで４２℃の温度にて洗浄して
結合したままに残し；好ましくは５０％ホルムアミドを５ｘＳＳＰＥ緩衝液に含
む緩衝液中で４２℃の温度にてハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＰＥで４２℃
にて洗浄して結合したままに残す。Ｒ５．２４核酸はまたＢＬＡＳＴＸ（Altshu
l等 (1990) Basic Local Alignment Search Tool, J Mol Biol 215, 403-410）
のようなアラインメントアルゴリズムを使用して識別することができる。また、
本発明はデフォルト設定でベストフィット解析によって決定して、配列番号：０
１と、約６０−７０％、好ましくは約７０−８０％、より好ましくは約８０−９
０％、より好ましくは約９０−９５％、最も好ましくは約９５−９９％類似の配
列を有する核酸を提供する。

【００１６】 主題の核酸は合成／非天然配列であり、及び／又は組換え体であり、これは、
それらが天然の染色体に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した天然配
列又は非天然配列を含んでいることを意味する。開示された脊椎動物Ｒ５．２４
核酸、又はその断片のヌクレオチド配列を含む主題の組換え核酸は、そのような
配列又は断片を、天然染色体に結合しているもの以外の配列が直ぐに隣りにある
（すなわち連続する）か、天然染色体に結合しているもの以外の配列が直ぐに隣
にあるか末端にある１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満、より好ましくは５０
０ｂｐ未満の天然フランキング領域が隣りにある状態で含んでいる。核酸は通常
はＲＮＡ又はＤＮＡであるが、変更された安定性等を提供するには他の塩基又は
ヌクレオチド類似体を含む核酸を用いることがしばしば有利である。 主題の核酸は、翻訳可能な転写産物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣ
Ｒプライマー、診断用核酸等々としての使用；Ｒ５．２４遺伝子と遺伝子転写産
物を検出する際の使用及び更なるＲ５．２４ホモログ及び構造類似体をコードす
る核酸を検出又は増幅する際の使用を含む広い範囲の応用が見いだされる。

【００１７】 実施例 脊椎動物の匂いレセプターを同定する手段として、Ｇタンパク質に共役するレ
セプターを発現クローニングするための一般的な方法を開発した。関係するレセ
プターｍＲＮＡが、インジェクトしたＲＮＡの量の０．１％程度と少ない場合で
も、この技術の感度と自由度により、同定されるべき複数のＧタンパク質経路の
活性化が可能になる。従って、この系は、特異的なアゴニストが利用可能である
ならば、如何なるＧタンパク質共役レセプターであってもそれに相当するｃＤＮ
Ａの機能的な同定を促進する。この発現クローニングによるアプローチを使用す
ることにより、我々は、キンギョの嗅覚上皮組織からアミノ酸匂い物質により活
性化されるレセプターをコードするｃＤＮＡを単離した。このレセプター、レセ
プター５．２４の性質決定により、これがアルギニン及びリジンにより優先的に
活性化され、これらの化合物と高い親和性（Ｋｄ＝〜１００ｎＭ）で相互作用す
ることが明らかとなる。他のアミノ酸は、レセプター５．２４と低い親和性で結
合する；結合特異性に影響を与える変数には、バックボーンの長さ同様に、側鎖
の末端機能部分の構造及び／又は電荷が含まれるようである。当該レセプターは
、立体特異性を示し、末梢嗅覚系において見いだされるアミノ酸神経伝達物質に
は結合することはないようである。このクローン化されたレセプターについて測
定された親和性は、アルギニン（約１ｎＭ）に対するインヴィボでのキンギョ嗅
覚系の閾値感度によく一致する。しかしながら、クローン化されたキンギョレセ
プターは、リガンドに対して５０から１００倍低い親和性を示す（例えば、Caga
n及びZeiger, 1978を参照のこと）単離されたサカナ嗅覚繊毛において性質決定
された塩基性アミノ酸結合部位とは異なるようである。

【００１８】 アミノ酸匂い物質の刺激は、サカナではホスホリパーゼ仲介経路により伝達さ
れることが示唆されていた（Huque及びBruch, 1986；Restrepo等, 1993）。これ
らの観察と一致して、我々の結果により、クローニングされたキンギョアミノ酸
レセプターの匂い物質による活性化は、哺乳類細胞と同様にアフリカツメガエル
の卵母細胞において、促進されたＰＩの代謝を引き起こす。これらのＧタンパク
質のサブユニットが 前述の異種性細胞系の両方に存在するにもかかわらず、Ｇ
αs-様経路との共役は観察されないが、このことは、キンギョアミノ酸匂いレセ
プターと全ての嗅覚ＣａＳＲレセプターが、インヴィボにおけるＰＩの代謝回転
を促進することを示す。興味深いことに、これらのレセプターは、形態学的にＶ
ＮＯの感覚神経に類似する、微繊毛神経細胞（Cao等, 1998も参照のこと）で発
現される。サカナ嗅覚微繊毛神経細胞と同様にＶＮＯとの両者は、哺乳類の微繊
毛性嗅覚神経細胞における匂い物質により誘起されるｃＡＭＰの上昇を膜電位の
変化へと変換するのに必要な（Brunet等, 1996）サイクリックヌクレオチドゲー
トチャンネル（cyclic nuclotide-gated channel）のαサブユニット（Berghard
等, 1996）を発現していないようである。

【００１９】 レセプター５．２４は、以前同定された、ＣａＳＲ、ｍＧｌｕＲ、及びＶ２Ｒ
ファミリーを含む、Ｇタンパク質レセプターと配列相同性を有する（Nakanishi
等, 1990；Herbert及びBrown, 1995；Herrada及びDulac, 1997；Matsunami及びB
uck, 1997；Ryba及びTirindelli, 1997）。また、更なるＣａＳＲ様レセプター
は、キンギョ嗅覚上皮組織において発現されている。我々の結果は、レセプター
５．２４は嗅覚感覚神経細胞により発現されるレセプターの多重遺伝子ファミリ
ーのメンバーであることを示すもので、当該レセプターに関する我々の生化学的
性質決定の結果と併せて、嗅覚ＣａＳＲ様レセプターファミリーは実際に匂いレ
セプターであるという直接の証拠を提供するものである。 哺乳類のＶ２Ｒレセプターは、ＶＮＯにおける発現の基づく、フェロモンレセ
プターのファミリーを構成することが提唱されていた（Herrada及びDulac, 1997
；Matsunami及びBuck, 1997；Ryba及びTirindelli, 1997）。しかしながら、Ｖ
ＮＯ--陸生の脊椎動物における嗅覚装置の特定化--非フェロモン的な手がかりと
同様にフェロモン的な手がかりの両方を感受することに留意すべきである（Halp
ern, 1987）。哺乳類Ｖ２Ｒレセプターのリガンド特異性が未だ示されていない
が、我々のデータは、少なくともキンギョレセプターファミリー、レセプター５
．２４、がアミノ酸刺激の特異的なサブセットを認識する匂いレセプターである
ことを、明確に示している。アミノ酸匂い物質はフェロモンではないので、哺乳
類Ｖ２Ｒレセプターを含む嗅覚ＣａＳＲ様レセプターのファミリーは、実際には
、フェロモン及び非フェロモンである匂い物質を含む広範にわたる様々な刺激を
受容するように機能しているようである。我々は、レセプター５．２４に関連す
るレセプターが、他のアミノ酸匂い物質を検出するために、サカナに用いられる
ことを開示する。

【００２０】 単離されたサケ嗅覚神経細胞からの電気生理学的記録により、細胞の〜６０％
は０．０１−１０μＭのＬ-セリンに感受性があることが示された（Nevitt及びD
ittman, 1999）。同様に、ナマズの嗅覚上皮組織からの単一記録により、嗅覚神
経細胞の〜４０％が１００μＭのＬ-アルギニンに応答することが示された（Kan
g及びCaprio, 1995）。また、〜５の細胞の活性を各記録部位で検出したキンギ
ョ嗅覚上皮組織からの複ユニット記録により、嗅覚神経細胞の大部分がアルギニ
ン（自発的活性を伴う２８の部位のうち２５が、１００μＭ Ｌ-アルギニンに応
答した）に応答したが、フェロモン（例えば、６５の部位のうち２５しか０．１
μＭ １５-ケトプロスタグランジンＦ２ａに応答しなかった）にはほとんど感受
性を示さなかったことが示唆されている。従って、レセプター５．２４ｍＲＮＡ
の広範にわたる発現は、サカナ嗅覚神経細胞の大部分がアミノ酸匂いレセプター
を発現することを、これとは独立に示唆する電気生理学的な記録と一致する。 以下に示す特定に実施態様及び実施例の説明は、例示的なものであって限定の
ために提供されるものではない。これら説明と本明細書を通じて、特に禁止され
他の意味に注記されていない限り、「ａ」及び「ａｎ」という用語は一又は複数
を意味し、「又は」は及び／又はを意味し、ポリヌクレオチド配列は、ここで記
載される置換可能な主鎖（バックボーン）と同時に反対鎖にまで拡張して理解さ
れるものである。

【００２１】 匂いレセプターの発現クローニングのための一般的方法。 我々は、キンギョ
の嗅覚系を、この種におけるフェロモン性及び非フェロモン性の両方の刺激への
応答に関し、生理的及び行動的な広範に及ぶ特徴付け（Sorensen及びCaprio, 19
98；Sorensen等, 1998）が行われていることにより、利用することにした。我々
のアプローチは、複数のＧタンパク質により仲介される経路のレセプター活性の
検出を可能にするように計画された。これに対して、過去の研究では、哺乳類嗅
覚神経細胞において匂い物質により誘起される興奮性シグナルが、細胞内の二次
的メッセンジャーであるｃＡＭＰにより特異的に仲介されること（Brunet等, 19
96）、インヴィトロにおける生化学的な研究により、ホスファチジルイノシトー
ル（ＰＩ）の代謝回転が、二次的メッセンジャーであるジアシルグリセロール及
びイノシトール１,４,５-トリホスフェート（ＩＰ３）を結果的に産生すること
から、サカナにおいて嗅覚シグナル伝達を仲介すること（Huque及びBruch, 1996
；Restrpo等, 1993）が証明されている。従って、サカナの匂いレセプターの発
現クローニングのためには、複数のシグナル伝達経路の活性化を検出できる系を
利用するのが賢明のようであった。

【００２２】 アフリカツメガエルの卵母細胞は、ＩＰ３が仲介する内在的な貯蔵分からのＣ
ａ２＋の放出、それに続くＣａ２＋依存的Ｃｌ−チャンネルの活性化を通じてＰ
Ｉ代謝回転の亢進を検出することができるため、Ｇタンパク質と共役するある種
のレセプターを発現クローニングするための強力な方法を提供する（Masu等, 19
87）。しかし、この細胞は、通常は、Ｇａｓ（従って、アデニリルシクラーゼ）
の活性化に対する電気生理学的応答を示さない。従って、Ｇタンパク質依存的経
路に関し、強力な出力を提供するように卵母細胞を設計した（Lim等, 1995）。
本方法は、候補となるレセプター（Lim等, 1995）を伴う、Ｇａｏｌｆ（嗅覚繊
毛に非常に多く存在するＧａｓ様アイソフォーム；Jones及びReed, 1989）、及
びＧタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャンネル（ＧＩＲＫｓ）の異所的な
発現に基づく。カリウム電流は、活性化されたＧａｓ様又はＧａｉサブユニット
からの解離に続く、フリーのＧタンパク質βγサブユニットによるＧＩＲＫチャ
ンネルの開閉に応答して観察することができる（Reuveny等, 1994；Lim等, 1995
）。対象のレセプターをコードするｃＤＮＡがｃＤＮＡのプールの中のほんの一
部にしか含まれないような、発現クローニングに対して、この系が敏感に反応す
るかどうか判定するために、ドーパミンＤ１レセプターをコードするＲＮＡを、
インジェクションに先立ち１０００倍に希釈した量のレセプターＲＮＡをＧａｏ
ｌｆ及びＧＩＲＫのＲＮＡと共に卵母細胞にインジェクトした。我々は典型的に
はレセプター発現卵母細胞に強いアゴニスト依存性電流を誘発できた。これらの
コントロールにより、単一のレセプターｃＤＮＡを含む〜１０００ｃＤＮＡクロ
ーンのプールが、我々のアッセイ系において発現され活性化された場合、依然と
して検出可能なシグナルを出すことができることが示された。従って、Ｇａｏｌ
ｆ及びＧＩＲＫを発現する卵母細胞は、その下流で共役する経路が不明瞭である
ようなＧタンパク質共役レセプターの発現クローニングの手段を提供する。

【００２３】 キンギョ匂いレセプターをコードするｃＤＮＡの発現クローニングによる同定
。 ＲＮＡはキンギョ嗅覚ｃＤＮＡクローンのプールから合成され（プールあた
り９００の異なるクローンを含む）、Ｇａｏｌｆ及びＧＩＲＫをコードする合成
ＲＮＡと共にアフリカツメガエル卵母細胞へインジェクトされた。その後、卵母
細胞は、アミノ酸、胆汁酸、又は性フェロモンを含む匂い物質のカクテルに曝し
その応答性に関しスクリーニングされた。匂い物質は、インヴィボにおける生理
的な応答の最大量の半量を誘発するのに必要な量の１００から１０００倍高い濃
度（Caprio, 1978；Sorensen等, 1987；Sorensen等, 1988；Michel及びLubomudr
ov, 1995；実験方法を参照のこと）でテストされた；ここに示される濃度は、Ｇ
ＩＲＫ及びＧタンパク質のＲＮＡのみインジェクトされた卵母細胞において、活
性を誘発しなかった。一のプール、プール１９由来のＲＮＡをインジェクトされ
た卵母細胞は、アミノ酸に対する強力な応答を示したが、胆汁酸又は性フェロモ
ンに対しては応答しなかった。アミノ酸に対する応答は、二相性であって、内向
性の基底Ｋ＋流以上の振動性の内向き電流に始まり、続いて基底レベル以下の内
向き電流へと減少した。このような二相性の効果は、Ｇａｑ仲介のホスホリパー
ゼＣ（ＩＰ３による最初の内向き電流の原因である）とプロテインキナーゼＣ（
ＧＩＲＫチャンネルサブユニットのリン酸化を通じてＫ＋流の抑制に至らしめる
）の活性化により誘起されると考えられる（Sharon等, 1997）。実際に、Ｇａｏ
ｌｆ及びＧＩＲＫなしでも、アミノ酸に応答する振動性の内向き電流は、プール
１９のＲＮＡを発現する卵母細胞において観察され、このことは、このプールに
含まれるレセプターが、ホスホリパーゼが仲介する経路と相互作用することを示
すものである。

【００２４】 シブセレクション（同胞選択）によるプール１９の反復性の細分化により、レ
セプター５．２４と命名された、レセプターをコードする単一クローンを単離す
ることができた。レセプター５．２４は、塩基性Ｌ-アミノ酸に最もよく応答し
、アルギニンとリジンによる活性化において、ほぼ同量の誘起電流を示し、中性
脂肪族Ｌ-アミノ酸（例えば、メチオニン、イソロイシン、スレオニン、セリン
、アラニン）にはより少なく応答し、酸性及び芳香族Ｌ-アミノ酸（例えば、グ
ルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファ
ン、ヒスチジン）にはほとんど応答しないことを示している；このレセプターは
Ｄ-アミノ酸では活性化されない（以降、別段、言明しない場合、ここで言及す
る全てのアミノ酸はＬ-アイソマーである）。

【００２５】 クローン化されたキンギョ匂いレセプターに対する放射標識されたＬ-アルギ
ニンの高親和性結合。 塩基性アミノ酸に対するクローン化されたキンギョのア
ミノ酸レセプターの親和性を決定するために、我々は、哺乳類細胞において発現
されたレセプターに対する放射標識されたリガンド結合による、リガンド-レセ
プター相互作用の性質決定を行った。ヒト胎児の腎臓(ＨＥＫ)２９３細胞に、レ
セプター５．２４のｃＤＮＡの挿入物を有する発現プラスミドを形質移入した。
レセプター５．２４発現細胞から調製された膜は、１ｍＭ ^３Ｈ-アルギニンの濃
度で飽和する結合を示し、リガンドの結合の程度は、コントロールの細胞から調
製された膜に比べ、有意に高い。複数回の実験による特異的結合活性の更なる解
析により、解離定数（Ｋｄ）が１２１±３３ｎＭアルギニン（平均値±標準誤差
、ｎ＝４；範囲：５２−２０７ｎＭ）であるような単一の結合サイト（ヒル定数
＝０．９５±０．０７[平均値±標準誤差]、ｎ＝４）を有するレセプターである
ことが示される。次に、我々は、ＨＥＫ２９３細胞において、どのような二次的
メッセンジャーの経路がレセプター５．２４と共役しているか決めることにした
。コントロールの細胞又はレセプター５．２４を発現する細胞は、様々な濃度の
アルギニンに暴露され、ＩＰ３及びｃＡＭＰの蓄積に関しアッセイした。アルギ
ニンは、レセプター５．２４を発現する細胞において、濃度依存的にＩＰ３の特
異的な増加を誘発する。これに対し、β-アドレナリン作動性レセプター（宿主
細胞株により内在的に発現された）が、ｃＡＭＰの蓄積の増加に至らしめる場合
でも、０．１ｍＭ又は１０ｍＭのアルギニンは、これらの細胞においてｃＡＭＰ
の検出可能な変化を引き起こさない。これらの結果は、アフリカツメガエル卵母
細胞の場合と同様に、レセプター５．２４がＨＥＫ２９３細胞中で好んでPI代謝
回転を促進することを示す。

【００２６】 クローン化されたキンギョアミノ酸匂いレセプターと相互作用する化合物の構
造-活性間における性質。 嗅覚情報をコード化するために匂いレセプターがど
のように使用されるか理解するには、個々のレセプタータイプの匂い物質特性を
性質決定することが必要である。従って我々は構造的に関連したリガンドに対す
るレセプター５．２４の相対的特異性を決定することとした。このレセプターは
高い親和性でアルギニンに結合するので、レセプター５．２４と結合する他の化
合物を、^３Ｈ-アルギニンを用いた置換アッセイにより、スクリーニングした。
これらのアッセイは、化合物がアゴニストとして、部分アゴニストとして、又は
アンタゴニストとして働くかどうかという点に関し情報を与えないが、にも拘わ
らずレセプターの分子特異性への洞察を可能ならしめる。手短に述べると、レセ
プター５．２４を発現するＨＥＫ２９３細胞から調製された膜への^３Ｈ-アルギ
ニンの結合が、競合リガンドの様々な濃度での存在下又は非存在下においてアッ
セイされた。アフリカツメガエル卵母細胞におけるレセプター５．２４の活性化
プロファイルと一致して、アルギニンとリジンは同様の濃度依存性で^３Ｈ-アル
ギニンの結合を置換し、それぞれ、〜０．３3及び〜０．５ｍＭの半抑制濃度（
ＩＣ５０）を示した（８０及び９０ｎＭのＫｉ'ｓ又は阻害定数に一致する；表
３を参照のこと）。グルタミン酸塩は、アフリカツメガエル卵母細胞で発現され
たレセプター５．２４を活性化させないようで、標識されていないアルギニン又
はリジンに比べほど８０倍程度効率悪く（ＩＣ５０＝〜２０ｍＭ；Ｋｉ＝６．７
ｍＭ）^３Ｈ-アルギニンを置換する。興味深いことに、アルギニンの脱炭酸類似
体であるアグマチンは、^３Ｈ-アルギニンをかなり不十分にしか置換しない（Ｋ
ｉ＞１ｍＭ；後述及び表４を参照のこと）。

【００２７】

【００２８】

【００２９】 我々は、２０の天然由来のアミノ酸と、アミノ酸類似体及び神経伝達物質につ
いて比較結合研究を行った（表３及び表４）。多くの傾向がこのアッセイより明
らかである。最初に、レセプター５．２４は、明らかに塩基性のＲ基側鎖グルー
プを含むアミノ酸を認識する；テストした２０アミノ酸の中でアルギニンとリジ
ンは最も高い親和性を示す。さらに、〜１０から１００倍低い親和性がアルギニ
ン及びリジンの誘導体に対して観察され、アミノ酸神経伝達物質であるγ-アミ
ノ酪酸（GABA）、カルノシン、又はタウリン（Ｋｉ＞１ｍＭ）など、末梢嗅覚系
（Nicoll, 1971；Collins, 1974；Margolis, 1974）において存在するもの対し
ては、特異的相互作用は検出されなかった。第二に、側鎖の末端機能部位は、特
異性を決定することにおいて、重要な変数である。塩基性側鎖をアミド（グルタ
ミン、アスパラギン）を含んだＲの基、硫黄を含んだ基（システイン又はメチオ
ニン）、又はカルバミル（シトルリン）部分で置換すると、親和性は〜４から〜
２５倍減少する結果となる。側鎖に末端アミド又は硫黄を含有する基を含むアミ
ノ酸は、一般に、これらの構造を欠く脂肪酸側鎖を持つものよりも、より高い親
和性を示す。酸性側鎖（グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩）での置換の結果、
親和性において大幅な減少（〜８０から〜３００倍）を示す。環状（プロリン）
又は芳香族（トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン）側鎖
を含むアミノ酸は、一般に、レセプター５．２４と低い親和性で結合する。第三
に、特異性は、一部にはＲ基の炭素骨格長さに基づいており、リジン（Ｋｉ＝０
．０９ｍＭ）対オルニチン（Ｋｉ＝１．０ｍＭ；リジンの骨格より１炭素分短い
）、及びアルギニン（Ｋｉ＝０．０８ｍＭ）対ホモアルギニン（Ｋｉ＝１．６ｍ
Ｍ；アルギニンの骨格より１炭素分長い）により示される通りである。炭素鎖の
長さに基づく当該レセプターのチューニングは、７-, ８-, ９-,及び１０-炭素
ｎ-脂肪族アルデヒドに関して幾分幅広な応答プロファイルを示すクローン化さ
れたラットの匂いレセプターにおいて観察されるものより（Zhao等, 1997）、さ
らに鋭いもののようである。最後に、アグマチン及びカダベリン（それぞれ、ア
ルギニン及びリジンの脱炭素類似体）は、基本的にレセプター５．２４とは結合
しないので（Ｋｉ'ｓ＞１ｍＭ、又はアルギニン又はリジンのＫｄより１０００
０倍大きな値）、α-カルボン酸部分は、レセプターの結合に重要である。しか
しながら、カルボキシメチルアルギニン類似体、Ｌ-ＮＡＭＥは当該レセプター
と中程度の親和性（Ｋｉ＝１．０ｍＭ）で結合するので、カルボン酸との相互作
用は、おそらく、その負の電荷に依存するものではない。

【００３０】 キンギョのアミノ酸匂いレセプターはＣａＳＲ様レセプターに属する。 キンギ
ョのレセプター５．２４のｃＤＮＡの配列から、５６６アミノ酸のＮ末端細胞外
ドメインにより先行される７の膜貫通領域を持つタンパク質が予想される。レセ
プター５．２４は、ＣａＳＲ（Herbert及びBrown, 1995）、ｍＧｌｕＲレセプタ
ーファミリー（Tanabe等, 1992）、鼻骨のＶ２Ｒレセプターファミリー（Herrad
a及びDulac, 1997；Matsunami及びBuck, 1997；Ryba及びTirindelli, 1997）、
フグ（Nito等, 1998）及びキンギョ（Cao等, 1998）において見いだされた嗅覚
ＣａＳＲ-及びＶ２Ｒ関連レセプター、及びマウス（Hoon等, 1999）に見いださ
れた二つの推定上の味覚レセプターを含む以前に同定されたＧタンパク質共役レ
セプターと顕著な類似性を示す。レセプター５．２４は、これらのレセプターと
２５から３３％のアミノ酸配列における同一性を有し、ヒトとフグのＣａＳＲ配
列といくらか高い類似性を示す。ＣａＳＲ及びｍＧｌｕＲ配列とのこのような弱
い相同性にも拘わらず、レセプター５．２４は、カルシウム又はグルタミン酸塩
により活性化されない。 ｍＧｌｕＲのＮ末端細胞外領域は、グルタミン酸塩の結合に関し必要であり（
O'Hara等, 1993；Takahashi等, 1993）、イオンチャンネル型のグルタミン酸塩
レセプターと同様に、代謝調節型のレセプターのこの領域は、バクテリアの周辺
質アミノ酸結合タンパク質と顕著な配列類似性を示す（Nakanishi等, 1990；O'H
ara等, 1993）。バクテリアのタンパク質 の構造に基づくｍＧｌｕＲ1のＮ末端
ドメインに関する分子モデル化により、セリン１６５とスレオニン１８８は、ア
ミノ酸リガンドのα-アミノ及びα-カルボキシ部分の協調により、グルタミン酸
塩と相互作用することが示唆される；ｍＧｌｕＲ１におけるこれらの位置の保存
的な突然変異の結果、アゴニストに対する結合が著しく減少する（O'Hara等, 19
93）。興味深いことに、対応する２残基は、レセプター５．２４において保存さ
れ（セリン１５２及びスレオニン１７５）されているが、ＣａＳＲ又は全てのＶ
２Ｒ配列において保存されていない。キンギョのレセプターにおけるこれらの残
基は、おそらくアミノ酸匂い物質との高親和性結合と協調するのに役立つ。

【００３１】 キンギョアミノ酸匂いレセプター関連嗅覚ＣａＳＲ様レセプターファミリー。
他の研究者による最近の研究により、レセプター５．２４と類似性を示し、キン
ギョの嗅覚上皮組織において特異的に発現されるＣａＳＲ様レセプターファミリ
ーのメンバーが同定された（Cao等, 1998）。この遺伝子ファミリーにおける更
なるレセプター配列を同定するために、我々は、レセプター５．２４、ＣａＳＲ
、ｍＧｌｕＲ、及びＶ２ＲのＮ末端領域配列間における保存されたモチーフに基
づく縮重プライマーを用いてキンギョの嗅覚ｃＤＮＡに対してＰＣＲを行った。
その結果得られたＰＣＲ産物のサブクローニング及びＤＮＡの配列決定により、
５つの異なるサブファミリーに分類することができる多数のＣａＳＲ様配列（配
列番号：３−６）が明らかにされた。Ｎ末端ドメインの当該領域の範囲内で、キ
ンギョＣａＳＲ様嗅覚レセプターサブファミリーは、２０から４３％の間のアミ
ノ酸同一性を示す。レセプター５．２４は、これまで同定されたレセプターグル
ープのメンバーの中で、最も相違するものであり、この領域において他の配列と
２０から２７％の類似性を示す。レセプター５．２４の全長ｃＤＮＡによりゲノ
ムＤＮＡブロットにおいて、１−２のバンドが検出され、この遺伝子は、キンギ
ョゲノム中で単一コピーとして存在することが示唆された。 さらに、全長ＣａＳＲ様配列は、前述の技術を用いてｃＤＮＡライブラリーか
ら容易に単離される。例えば、全長の、天然ＣａＳＲ様タンパク質の配列、配列
番号：７−８、１０及び１２は全長のキンギョｃＤＮＡによりコードされている
。配列番号１０及び１２に関する天然のコード化配列は、各々、配列番号：９及
び１１として示されている。さらに、異種性ＣａＳＲ様配列は、これらの技術を
用いて容易に単離される。例えば、機能的に、また構造的にキンギョ５．２４と
類似することが示されているゼブラフィッシュのタンパク質（約７０％のアミノ
酸同一性）は、配列番号：１４として示される（天然のコード配列は配列番号：
１３として示される）。

【００３２】 キンギョ嗅覚ＣａＳＲ様レセプターの発現パターン。 ＲＮＡブロットによる
レセプター５．２４の発現解析により、このタンパク質をコードするｍＲＮＡは
、嗅覚上皮組織において発現されるが、脳、腎臓、肝臓、筋肉、卵巣、腸、又は
精巣において発現されないことが明らかになった。また、レセプター５．２４プ
ローブは、高い緊縮性の条件下にて、胴体、エラ、唇、舌、及び口蓋組織の皮膚
においてｍＲＮＡを検出する。レセプター５．３及びレセプター３．１３に対す
るプローブによる同様のＲＮＡブロットにより、これらの遺伝子は、嗅覚上皮組
織において排他的に発現されることが示される。 嗅覚上皮組織におけるキンギョ嗅覚ＣａＳＲ様配列の発現パターンを検出する
ために、ＲＮＡによるインサツハイブリダイゼーションを実施した。我々は、レ
セプター５．２４のＮ末端細胞外領域に相当する^３５Ｓ標識アンチセンスＲＮＡ
プローブを用いて組織切片をプローブ化した。この領域は、このクラスのレセプ
ターにおいてもっとも多様化した領域であり、従って、一連の実験において用い
たハイブリダイゼーションの緊縮性の条件下では、レセプター５．２４にのみア
ニールすることが予想される。嗅覚感覚神経細胞を含む嗅覚感覚上皮組織領域の
先端及び内側の部位において、レセプター５．２４のｍＲＮＡが広く発現されて
いることが見いだされた。ジゴキシゲニン標識プローブを使用するインサイツハ
イブリダイゼーションにより、レセプター５．２４は感覚上皮組織の神経層にお
ける細胞の大分部において発現されていることが実証される。これらの観察は、
サカナのおよそ半分の嗅覚神経細胞はアミノ酸刺激に応答することができる（Kn
ag及びCaprio, 1995；Nebitt及びDittman, 1999）との電気生理学的な記録と一
致する。レセプター５．３に対するプローブを用いたインサイツハイブリダイゼ
ーションにより、このｍＲＮＡもまた、細胞の多くに局在することが示される。
レセプター５．２４とレセプター５．３の発現の広範にわたる局在化パターンに
対し、他のＣａＳＲ様レセプターは、点状の局在パターンで嗅覚上皮組織にて発
現される。レセプター３．１３、レセプター９、及びレセプター１０に対するプ
ローブのサブファミリーメンバーは、細胞の少ないサブセット（各約１〜５％）
とハイブリダイズ化する。

【００３３】 我々は、インサイツハイブリダイゼーションによるレセプター５．２４に関す
るシグナル強度は、他のレセプターに対する強度より一貫して弱かったことに気
づいた。キンギョ嗅覚ｃＤＮＡライブラリーの嗅覚ＣａＳＲ様配列によるスクリ
ーニングにより、これらのＲＮＡがおよそ同レベル（各配列は〜１０００００ク
ローン中１[レセプター５．２４及び５．３]から〜６０００００クローン中１[
レセプター１０．８]の間で示される）で発現されていることが明らかにされた
ため、これらの現象は、レセプター５．２４のｍＲＮＡの特性であり、その発現
レベルが低いことによるものではないようである。 キンギョのＣａＳＲ様レセプターを発現する細胞は、嗅覚のサイクリックヌク
レオチドゲートイオンチャンネルを発現する嗅覚神経細胞（Goulding等, 1992；
後述を参照のこと）、又は元々Ｂｕｃｋ及びＡｘｅｌ(1991)により記載されたフ
ァミリーに属する匂いレセプターに関し、我々が典型的に観察するものより、尖
端部に局在する。サカナの嗅覚上皮組織は、２つの主要なクラスの感覚細胞、繊
毛性及び微繊毛性の神経細胞を含むが、これらは、尖端ー基底部軸に沿って分離
される（Ymamoto, 1982）。微繊毛細胞は、上皮組織の上部層である尖端部に留
まり、細胞体が内部に存在する繊毛神経細胞から区別される。以前のインサイツ
ハイブリダイゼーションにより、Ｂｕｃｋ及びＡｘｅｌ(1991)により記載された
レセプタークラス、サイクリックヌクレオチドゲートイオンチャンネルは、サカ
ナの内部配置性の繊毛嗅覚神経細胞において発現されることが示された（Gouldi
ng等, 1992；Ngai等, 1993a；Ngai等, 1993b）。従って、キンギョのＣａＳＲ様
レセプターは、おそらく微繊毛嗅覚神経細胞において発現される（Cao等, 1998
も参照のこと）。

【００３４】 非嗅覚組織におけるレセプター５．２４ｍＲＮＡ発現の局在。 外部上皮組織
におけるレセプター５．２４のｍＲＮＡの発現により、嗅覚系以外において当該
レセプターは化学受容性機能を果たすか否かに関し疑問が生じる。これらの上皮
には、味蕾及び単生の化学受容細胞が含まれる；キンギョの顔面神経の記録は、
アルギニンがこの種において有効な味覚刺激ではないことを示しているが、これ
らの系は共に、サカナにおけるアミノ酸刺激に対し感受性がある（Sorensen及び
Caprio, 1998）。従って、我々は、レセプター５．２４が実際にこれらの化学受
容系において発現されるか否かを決定するために、さらなるインサイツハイブリ
ダイゼーションを行った。模範的なデータには、ジゴキシゲニン標識のレセプタ
ー５．２４プローブでハイブリダイズ化される代表的な鰓耙の組織切片を示した
。鰓耙は、鰓弓と結合する非呼吸器構造で、味蕾と単性の化学受容細胞を含む上
皮によりカバーされている。これらの組織切片と同様に、レセプタープローブと
ハイブリダイズ化されるの多くの他の組織切片を調べることにより、この配列は
、上皮組織を覆って広く発現されるが、明らかに味蕾から排除されることが示さ
れる。さらに、レセプター５．２４を発現する上皮細胞は、かなり多いため単性
の化学感受性細胞により、個々独立にカウントできないが、上皮組織中では、比
較的希薄で分散している（「単性」という用語はこのためである；Sorensen及び
Caprio, 1998）。従って、これらの結果は、非嗅覚的化学受容性伝達系における
レセプター５．２４の役割（塩基性アミノ酸を認識するために同調される匂いレ
セプターとしての）を論駁する。

【００３５】 実験方法：発現クローニング。 ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オスのキンギョの成体
の嗅覚ロゼット（olfactory rosettes）から調製した。ｃＤＮＡは、オリゴ(ｄ
Ｔ)プライマーを用いて合成され、二重鎖ＤＮＡは、５'側のＳａｌＩ及び３'側
のＮｏｔＩ酵素部位を介して決められた方向でｐＳＰＯＲＴ−１プラスミドへ連
結された（Life Technologies, Inc.）。連結反応物は、エレクトロポレーショ
ンにより大腸菌に導入された。プラスミドＤＮＡは、９００−１０００クローン
のプールから調製され、ＮｏｔＩで直線化し、精製し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼによるインヴィトロ転写の鋳型として用いられた。Ｇタンパク質及びＧＩＲＫ
サブユニットをコードするcＲＮＡの生産には、Ｇａｏｌｆ（Jones及びReed, 19
89）及びＧＩＲＫサブユニットであるＫｉｒ３．１（Reuveny等, 1994）及びＫ
ｉｒ３．４（Ashford等, 1994）のｃＤＮＡが、Ｐｆｕポリメラーゼを用いてＰ
ＣＲにより増幅され、ＲＮＡ発現ベクターであるｐＧＥＭＨＥ（Liman等, 1992
）にサブクローン化された。インヴィトロでの転写の後、cＲＮＡはＬｉＣｌ中
に沈殿させ、水に懸濁させた。 卵母細胞は、麻酔をしたゼノパスラエビスから除去し、コラゲナーゼで処理し
た。各ｃＤＮＡライブラリーのプールから得られた４０ｎｇのcＲＮＡ（〜４０
ｐｇ ｃＲＮＡ/クローン）が、Ｇａｏｌｆ及びＧＩＲＫのサブユニットＫｉｒ３
．１及びＫｉｒ３．４（各〜３０ｐｇ）をコードするcＲＮＡと共に、卵母細胞
にインジェクトされた。第一次スクリーニングが終了するまでに、およそ３０プ
ールがアッセイされた。インジェクトされた卵母細胞は、電気生理学的記録に先
立ち、１７℃で８０時間以インキュベートされた。記録は、二本の電極によるボ
ルテージクランピングにより、Axoclamp-2A 増幅器（Axon Instruments）又はDa
gan CA-1増幅器（Dagan Corp）を用いて行われた。データの取得と解析は、ｐＣ
ＬＡＭＰソフトウェアー（Axon Instruments）を用いて実施された。膜電位は、
−８０ｍＶに保持された。ＧＩＲＫに関する試行において、アゴニストを作用さ
せる前に基底流が安定化されるまで（〜４５秒間）、卵母細胞はまずＮａ-ＭＢ
ＳＨ（88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, pH7.5, 0.82 mM M
gSO₄[7H₂O], 0.33 mM Ca[NO₃]2[4H₂O], 0.41 mM CaCl₂[2H₂O]）で 灌流し、次い
で濃い濃度のＫ^＋（88 mM KCl, 1 mM NaCl）を含むK-MBSHに切り換えた。Ｇａｏ
ｌｆ及び／又はＧＩＲＫの不存在下でレセプター５．２４をインジェクトした卵
母細胞での記録はＮａ-ＭＢＳＨ中で実施した。卵母細胞は、８チャンネルバル
ブ（Hamilton）によりベイジング液を切り換えることにより、異なるアゴニスト
を含む溶液に曝した。 ＤＮＡ配列は、Pharmacia AlfExpress シークエンサーにより行われた。シー
クエンスは、MacVector ソフトウェアーを用いて解析された。

【００３６】 哺乳類細胞培養とＤＮＡ形質移入。 細胞の形質移入に対しては、レセプター
５．２４ｃＤＮＡ挿入物は、二つの発現ベクターにサブクローニングされた：Ｃ
ＭＶＩは、ヒトサイトメガロウィルス（CMV）即時性初期プロモーター-エンハン
サーに発現を作動させるために、ＣＭＶのイントロンＡの配列を加えたもので、
608RX-2.2Lは、ｃＤＮＡ挿入物の後に内在性リボソーム認識部位（IRES）強化緑
色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）コード化配列を持つことを除き、CMVIと類似する
；また、608RX-2.2Lはピューロマイシン耐性遺伝子を含む。一過性のアッセイに
おいては、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞が、ＣＭＶＩ-レ
セプター５．２４又はＣＭＶＩコントロールプラスミドでリポフェクタミン（Li
fe Technologies）を用いて形質移入され、膜調製のために４８時間後に回収さ
れた。安定細胞株については、２９３-ＴＳＡ細胞が、608RX-2.2L−レセプター
５．２４プラスミド又はコントロール608RX-2.2Lプラスミドで形質移入され、ピ
ューロマイシンで選択された。高レベルのＥＧＦＰ蛍光発光を示すコロニーが選
択され、増殖され、³Ｈ-Ｌ-アルギニンの結合に関しスクリーニングされた（以
下を参照）。レセプター５．２４で形質移入された５つの異なる安定細胞株にお
いて、レセプター密度（Rt）は、０．５から６．０ｐｍｏｌのＬ-アルギニン結
合部位／ｍｇ膜タンパク質の間でバラツキがあった。４つの異なる608RX-2.2L形
質移入コントロール細胞株において、ＥＧＦＰの発現は、レセプター５．２４形
質移入細胞と同等であったが、L-アルギニンの結合は、非形質移入細胞と区別で
きなかった（Rt=0.01-0.03 pmol/mg）。競合結合アッセイ及びシグナル伝達の研
究は、安定細胞株５．２４-２０（Rt=2.0 pmol/mg）及びベクターのみ（Rt=0.03
pmol/mg）で形質移入された安定なコントロール細胞株（2.2-9）を用いて行わ
れた。

【００３７】 膜の調製とリガンド結合アッセイ。 リガンド結合アッセイのための膜は、リ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により、コンフルエントな細胞を３回洗浄し、Ｐ
ＢＳベースの酵素非含解離溶液で剥がし、氷で冷やした５．０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
、ｐＨ７．４、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．５
ｍＭ ＰＭＳＦに細胞を再懸濁して調製した。以後、全ての操作は氷上にて行っ
た。３０分のインキュベーション後、細胞懸濁液をホモジナイズし、１００００
０ｘｇで３０分間遠心した。細胞膜沈殿は、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ,
ｐＨ７．４、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．０μｇ／ｍ
ｌロイペプチン、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）中にて再懸濁、遠心により２回洗浄し
、結合緩衝液に再懸濁後、−８０℃で凍結させた。 飽和結合アッセイは、２０−２５μｇの膜タンパク質を用い、最終容量１００
μｌの結合緩衝液中で、[２,３-^３Ｈ]Ｌ-アルギニン（特異的活性＝４０Ｃｉ／
ｍｍｏｌ；Dupon NEN）の濃度を増加させて行われた。非特的な結合は、５００
μＭの非標識L-アルギニンの存在下にて測定された。競合アッセイは、５００ｎ
Ｍ [２,３-³Ｈ]Ｌ-アルギニンと共に競合リガンドの濃度を増加させて行った。
全てのインキュベーションは、４℃にて６０分間行い、０．１％の氷冷ポリエチ
レンイミンで前処理したワットマンＧＦ／Ｃフィルターで素早くろ過して、反応
を止めた。フィルターは、４．０ｍｌの氷で冷やした２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐ
Ｈ７．４で３回洗浄し、保持された放射活性をシンチレーションカウントにより
測定した。全ての実験は、３回行われ、少なくとも２回は繰り返された。データ
は、Originソフトウェアーを用いて非直線カーブの至適化（Microcal）により解
析した。^３Ｈ-Ｌアルギニンの結合の５０％阻害（ＩＣ５０）を引き起こすコン
ペティターの濃度は、非直線カーブの至適化により決定された；阻害定数は、式
Ｋｉ＝(ＩＣ５０)／(１+[³Ｈ-アルギニン]／Ｋｄ）に従って計算した。

【００３８】 ＩＰ３及びｃＡＭＰの測定。 ＩＰ３及びｃＡＭＰの測定に対しては、細胞株
５．２４−２０及び２．２−９（負のコントロール）を２４ウェルのプレートに
３．５ｘ１０^５細胞／ウェルの集密度で蒔き、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で
一晩インキュベートした。反応の終結に先立って全ての続きの操作を５％ＣＯ_２ 中で３７℃にて実施した。匂い物質の暴露に先立ち、コンフルエントな細胞をＰ
ＢＳで二回洗浄し、遊離のアミノ酸を除去し、アミノ酸を含まない培地（０．１
％のＢＳＡを含むアールのバランス塩溶液）中で３時間インキュベートし、レセ
プター又は下流のシグナル伝達経路の潜在的な脱感作からの回収を可能にする。
ＩＰ３アッセイに対しては、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１０ｍＭのＬｉＣｌを
含むＰＢＳ中で１５分間プレインキュベートし、ついで４００μｌのＰＢＳ／１
０ｍＭのＬｉＣｌ中で３０分間、匂い物質に暴露した。ＩＰ３レベルをラジオレ
セプター競合アッセイ（Dupont NEN）によって決定した。ｃＡＭＰの測定に対し
ては、３時間のアミノ酸を含まないプレインキュベーションの後に細胞をＰＢＳ
で一回洗浄し、０．５ｍＭのＩＢＭＸを含むＰＢＳ中で１５分プレインキュベー
トし、４００μｌのＰＢＳ／０．５ｍＭのＩＢＭＸ中で３０分間、匂い物質にさ
らした。ｃＡＭＰレベルをラジオイムノアッセイ（DuPont NEN）によって決定し
た。

【００３９】 ＰＣＲ。 ＰＣＲを実施して更なるＣａＳＲ様匂いレセプターｃＤＮＡを同定
した。３つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、レセプター５．２４、ｍＧ
ｌｕＲ（Duvoisin等, 1995）、ヒトＣａＳＲ（Garrett等, 1995）、及び哺乳動
物Ｖ２Ｒ２（Herrada及びDulac, 1997; Matsunami及びBuck, 1997; Ryba及びTir
indelli, 1997）配列のアラインメントに基づいてデザインされた： プライマーＡ：レセプター５．２４のアミノ酸２１１−２１５に対応； プライマーＢ：レセプター５．２４のアミノ酸５１８−５１４に対応； プライマーＣ：レセプター５．２４のアミノ酸７５５−７５１に対応。 ネスト化ＰＣＲはおよそ２００００のクローンを含むプラスミドライブラリー
プールで実施された。各ライブラリーのプールからのＤＮＡをプライマーＣを持
つ５'Ｔ７プライマーを使用して一次ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。一次Ｐ
ＣＲ反応物を１％アガロースゲル上で分離し、１−４ｋｂの範囲の産物を切除し
、溶出し、プライマーＡ及びプライマーＢを使用する二次ＰＣＲ反応のための鋳
型として使用した。二次ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、〜１
ｋｂの断片をＴＡプラスミドベクター（Invitrogen）中にサブクローニングし、
配列決定した。

【００４０】 ＲＮＡブロット分析とインサイツハイブリダイゼーション。 キンギョ組織中
のレセプター５．２４ｍＲＮＡの分布を、高ストリンジェント下でプローブとし
て３２Ｐ標識アンチセンスＲＮＡを使用してＲＮＡブロット分析によって決定し
た（Ambion）。分析した各キンギョ組織の０．５マイクログラムのポリ(A)に富
ませたＲＮＡを変性条件下で電気泳動し、ナイロン膜にブロッティングし、レセ
プター５．２４のアミノ酸３８９−６００に対応する６００ｎｔのＲＮＡプロー
ブでプロービングした。全長レセプター５．２４ｃＤＮＡはジェノミックＤＮＡ
ブロットの単一の遺伝子を認識するようであり、この領域をコードする配列はこ
のクラスのレセプターの最も分岐した部分を含むので、このプローブがストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下でレセプター５．２４ＲＮＡに完全に
特異的である可能性が高い。コントロールとして、続いて膜をキンギョのｂ-ア
クチンＲＮＡプローブにハイブリダイズした。 ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションは、本質的に記載されているように
して（Barth等, 1996; Barth等, 1997）、成体のキンギョ嗅覚ロゼットからの２
０ｍｍ厚の新鮮凍結組織切片で実施した。スライドを３５Ｓ標識（１０７ｃｐｍ
／ｍｌ）又はジゴキシゲニン標識（１ｍｇ／ｍｌ）プローブで最短１６時間の間
、６０−６５℃にてハイブリダイズし、６５℃にて０．２ｘＳＳＣで洗浄した。
３５Ｓプローブでハイブリダイズさせたスライドを更に２０ｍｇ／ｍｌのＲＮａ
ｓｅＡで処理し、６５℃にて０．２ｘＳＳＣ中で再洗浄し、脱水し、コダックＮ
ＴＢ−２エマルションに浸漬し、１４−２８日の間４℃に暴露し、発達させ、ト
ルイジンブルーで対比染色した。ジゴキシゲニン標識プローブをアルカリホスフ
ァターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体とＮＢＴ／ＢＣＩＰ中での色素発色で可視化
した。 レセプター５．２４の局在化に対しては、全長レセプターの最初の６００のア
ミノ酸に対応する〜１．８ｋｂのＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサ
ブクローニングし、３５Ｓ及びジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブのインヴィト
ロでの転写に対して使用した。レセプター３．１３及び５．３に対するジゴキシ
ゲニン標識プローブを、これらのレセプターのＮ末端ドメインから撚りだしたク
ローン化〜１ｋｂＰＣＲ挿入断片から合成した。Ｂｕｃｋ及びＡｘｅｌ（1991）
によって最初に同定されたレセプターファミリーのメンバーを同定するために、
縮重逆転写ＰＣＲを、過去に記載されているようにして（Barth等, 1996）キン
ギョの嗅覚ＲＮＡで実施した。Ｄ１／１１３−６と命名したこのクラスのレセプ
ターからの一つのキンギョのクローンを用いてジゴキシゲニン標識ＲＮＡプロー
ブを合成した。嗅覚環状ヌクレオチドゲートチャンネルを発現する細胞を、〜２
．５ｋｂの全長ゼブラフィッシュｃＤＮＡから合成したジゴキシゲニン標識プロ
ーブで局在化した（Barth等, 1996を参照）。

【００４１】 参考文献： Abe, K.,等(1993). J.Biol.Chem. 268,12,033-12,039. Ashford, M.L., Bond, C.T., Blair, T.A.,及びAdelman, J.P. (1994). Nature
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【００４２】 この明細書で引用した全ての出版物及び特許出願は、あたかも各々の出版物又
は特許出願が特に及び個々に参考として取り入れられると示されているように、
ここに出典明示して取り入れるものとする。前記の発明は、理解を明瞭にする目
的で例示及び実施例によって幾分詳細に説明したが、当業者には、本発明の教示
に照らして、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく、それ
にある種の変更及び修飾が可能であることは容易に明らかになるであろう。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 45/00 33/566 Ａ６１Ｐ 15/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １１１ 5/00 Ａ (72)発明者 スペカ，デイビッド，ジェー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720 −3200，バークレー，ユニバーシティ オ ブ カリフォルニア，バークレイ，ライフ サイエンシズ アディション 265，デ パートメント オブ モレキュラー アン ド セル バイオロジー (72)発明者 リン，デイビッド，エム． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720 −3200，バークレー，ユニバーシティ オ ブ カリフォルニア，バークレイ，ライフ サイエンシズ アディション 265，デ パートメント オブ モレキュラー アン ド セル バイオロジー (72)発明者 イザコフ，イユード，ワイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720 −3200，バークレー，ユニバーシティ オ ブ カリフォルニア，バークレイ，ライフ サイエンシズ アディション 265，デ パートメント オブ モレキュラー アン ド セル バイオロジー (72)発明者 ディットマン，アンドリュー，エイチ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720 −3200，バークレー，ユニバーシティ オ ブ カリフォルニア，バークレイ，ライフ サイエンシズ アディション 265，デ パートメント オブ モレキュラー アン ド セル バイオロジー (72)発明者 ファン，ジンホン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94720 −3200，バークレー，ユニバーシティ オ ブ カリフォルニア，バークレイ，ライフ サイエンシズ アディション 265，デ パートメント オブ モレキュラー アン ド セル バイオロジー Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 4B024 AA01 AA20 BA63 CA04 CA06 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B063 QA18 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG20 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA90Y AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA17 BA44 CA62 NA14 ZA812 ZC412 4H045 AA10 BA10 CA40 CA52 DA50 EA21 EA28 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：０２、残基１−１０；配列番号：０２、残基２９
   −４１、配列番号：０２、残基７５−８７；配列番号：０２、残基９２−１０９
   ；配列番号：０２、残基１３２−１４１；配列番号：０２、残基１９２−２０５
   、配列番号：０２、残基２５８−２６９；配列番号：０２、残基２９５−３１１
   、配列番号：０２、残基３１６−３３０；配列番号：０２、残基３７３−３８２
   、配列番号：０２、残基４０３−４２２；配列番号：０２、残基４３６−４４２
   、配列番号：０２、残基４７４−４８５；配列番号：０２、残基５０２−５１６
   、配列番号：０２、残基５６１−５７６；配列番号：０２、残基５９５−６１６
   、配列番号：０２、残基６４０−６５６；配列番号：０２、残基６８３−６９７
   、配列番号：０２、残基７１７−７３２；配列番号：０２、残基７６８−７７７
   、配列番号：０２、残基７９８−８１３；配列番号：０２、残基８２９−８４３
   、配列番号：０２、残基８４４−８７７；及び配列番号：０２、残基８５２−８
   ７５からなる群から選択される配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号：０２の少なくとも１６の連続残基を含んでなる請
   求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号：０２、残基１−５６６を含んでなる請求項１に記
   載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号：０２−０６からなる群から選択される配列を含ん
   でなるポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号：０２を含んでなる請求項１に記載のポリペプチド
   。
6. 【請求項６】 配列番号：０７、０８、１０、１２及び１４からなる群から
   選択される配列の少なくとも１６の連続残基を含んでなるポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列が配列番号：１４である請求項６に記載のポリペプチド
   。
8. 【請求項８】 配列番号：１４を含んでなる請求項６に記載のポリペプチド
   。
9. 【請求項９】 配列番号：０１のストランドの少なくとも３６の連続ヌクレ
   オチドを含んでなる単離された又は組換え体ポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 配列番号：０１、ヌクレオチド１−４７；配列番号：０１
    、ヌクレオチド５８−９９；配列番号：０１、ヌクレオチド９５−１３８；配列
    番号：０１、ヌクレオチド１８１−２２０；配列番号：０１、ヌクレオチド２６
    １−２９９；配列番号：０１、ヌクレオチド２７４−３１５、配列番号：０１、
    ヌクレオチド３５１−３８９；配列番号：０１、ヌクレオチド４５０−５９３、
    配列番号：０１、ヌクレオチド５２４−５４６；配列番号：０１、ヌクレオチド
    ５６１−６０８；配列番号：０１、ヌクレオチド６８９−７２７、配列番号：０
    １、ヌクレオチド７０８−７３７；配列番号：０１、ヌクレオチド７３８−８０
    １、配列番号：０１、ヌクレオチド８０５−８５４；配列番号：０１、ヌクレオ
    チド８５５−９０７、配列番号：０１、ヌクレオチド９１０−９５３；配列番号
    ：０１、ヌクレオチド１００７−１０５９、配列番号：０１、ヌクレオチド１１
    ４７−１１６３；配列番号：０１、ヌクレオチド１２５８−１２７９、配列番号
    ：０１、ヌクレオチド１３７５−１３８９；配列番号：０１、ヌクレオチド１５
    ８１−１５９５、配列番号：０１、ヌクレオチド１６２１−１６３９；配列番号
    ：０１、ヌクレオチド１７４４−１７５５；及び配列番号：０１、ヌクレオチド
    １９５１−１９６９からなる群から選択される配列を含んでなる請求項９に記載
    のポリヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 配列番号：０１のストランドの少なくとも７２の連続ヌク
    レオチドを含んでなる請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 配列番号：０９、１１及び１３からなる群から選択される
    配列のストランドの少なくとも３６の連続ヌクレオチドを含んでなる単離された
    又は組換え体ポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 配列が配列番号：１３である請求項１２に記載のポリヌク
    レオチド。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のポリペプチドをコードする組換え体ポリ
    ヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 請求項６に記載のポリペプチドをコードする組換え体ポリ
    ヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含んでなる細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１４に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞又は細胞
    性抽出物中に導入し、上記ポリヌクレオチドが転写産物として発現され該転写産
    物が上記ポリペプチドを含んでなる翻訳産物として発現される条件下で上記宿主
    細胞又は抽出物をインキュベートし、上記翻訳産物を単離する工程を含んでなる
    、Ｒ５．２４ポリペプチドを製造する方法。
18. 【請求項１８】 結合標的へのＲ５．２４ポリペプチドの相互作用を変調す
    る薬剤をスクリーニングする方法において、 請求項１に記載の単離されたポリペプチドと、該ポリペプチドの結合標的と、
    候補薬剤とを含む混合物を、上記薬剤が存在しなければ上記ポリペプチドが基準
    親和性でもって上記結合標的に特異的に結合する条件下で、インキュベートし； 上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合親和性を検出して薬剤バイアス
    親和性を測定する工程を含んでなり、薬剤バイアス親和性と基準親和性の間の差
    が、上記薬剤が上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合を変調することを
    示す方法。
19. 【請求項１９】 ポリペプチドが細胞膜に導入され、結合親和性が、膜を貫
    通するポリペプチドによるリガンド結合媒介シグナル伝達を測定することにより
    検出される請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｇタンパク質共役レセプターをスクリーニングする方法に
    おいて、Ｇα_ｏｌｆとＧｓから選択される少なくとも一つのＧタンパク質と少な
    くとも一つのＧタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャンネルを、候補レセプ
    ターと共に、共発現させることによって、複数のシグナル伝達経路の活性化を検
    出する発現系を使用して発現クローニングし、アゴニスト依存性電流を生じるク
    ローンを同定する工程を含んでなり、レセプターが匂いレセプターで、Ｇタンパ
    ク質がＧα_ｏｌｆである方法。