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JP2003504011A - ハイスループットアッセイシステム - Google Patents

ハイスループットアッセイシステム

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JP2003504011A
JP2003504011A JP2001505351A JP2001505351A JP2003504011A JP 2003504011 A JP2003504011 A JP 2003504011A JP 2001505351 A JP2001505351 A JP 2001505351A JP 2001505351 A JP2001505351 A JP 2001505351A JP 2003504011 A JP2003504011 A JP 2003504011A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しアレイを用いる多種の、ハイスループット、生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。本発明の組合せには、多数の試験領域、少なくとも２つ、そして、好ましい実施態様では、少なくとも２０の実質的に同一の試験領域を含む表面であり、各試験領域には包括的アンカー分子のアレイが含まれる。そのアンカーは、二官能性リンカー分子に結合し、それぞれに、少なくとも１つのアンカーに特異的な部分および目的の標的に特異的なプローブである部分が含まれる。作成したプローブのアレイを用い、プローブと特異的に相互作用する１つまたはそれ以上の標的分子の存在を分析するか、または活性を試験する。本発明のある実施態様では、試験領域(ウェルであり得る)を、より小さい小区域(へこみ、またはくぼみ)に更に再分割する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９８年１２月２２日付け出願の米国出願番号０９/２１８,１６
６の一部係属出願であり、その開示は引用により本文書に加える。本出願は、１
９９７年１２月１９日付け先の出願６０/０６８,２９１および１９９８年７月２
日付け米国出願番号０９/１０９,０７６の優先権を主張するものである。それら
の開示はその全体を何れも引用によりこの文書に加える。
【０００２】 本発明の背景技術 本発明は、例えば、組成物、装置および方法に関係し、プローブの繰り返しア
レイを用いる多種の生物学的または化学的アッセイの同時実施に有用である。多
数の領域には、それぞれ遺伝的アンカー分子のアレイが含まれる。アンカーは二
官能性リンカー分子を伴い、それぞれ少なくとも１つのアンカーに特異的な部分
および目的の標的に特異的なプローブである部分を含む。生成したプローブのア
レイを用い、プローブに特異的に相互作用する１つまたはそれ以上の標的分子の
存在を分析する。本発明は、分子相互作用の性質により識別し得る多種分野に関
連し、それには医薬探索、分子生物学、生物化学、生理学および医学診断技術が
含まれるが、これらに限らない。
【０００３】 表面または“チップ”上に配置する多数の分子プローブを、多種の生物学的お
よび化学的アッセイに使用する。アッセイを行い、目的の標的分子が任意のプロ
ーブと相互作用するかどうか測定する。選択した試験条件下プローブを標的分子
にさらした後、検出装置により、標的分子が、所定のプローブと相互作用するか
どうか決定する。
【０００４】 これらシステムは、様々なスクリーニング法に有用であり、プローブまたは標
的分子の何れかについての情報を得ることができる。例えば、それらを用い、他
のものに混じる目的のレセプターに結合するペプチドまたは可能性ある薬物をス
クリーニングする；多くの他のものに混じる、例えば、遺伝的変異、固体群の中
の突然変異体(allelic variant in a population)、または特定の病原体もしく
は病原株の存在する、サンプルをスクリーニングする；遺伝子発現の研究をする
ため、例えば、特定の生理状態、発生段階または疾病状態などに発現が関連する
mＲＮＡ群を同定し得る。
【０００５】 本発明の要旨 本発明は、多種の生物学的または化学的アッセイを同時に行う組成物、装置お
よび方法を提供し、多数のサンプルをハイスループット分析し得、そのサンプル
には、例えば、診断アッセイにおいてスクリーニングされる多数の患者サンプル
、または薬物探索の方法において試験される多数の可能性ある薬物もしくは治療
薬がある。サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せを提供
する。この組合せには、多数の空間的に分離された領域を含む表面が含まれ、そ
の領域は試験領域と名付けられ、少なくとも２つの実質的に同一のウェルであり
得る。各表面には、少なくとも、２つ、好ましくは２０またはそれ以上含まれ、
例えば、少なくとも約２５、５０、９６、８６４または１５３６などであり、実
質的に同一な領域である。各試験領域は、１つまたはそれ以上の標的を含む(ま
たは部分的に含む)サンプルを導入する空間であると定義され、生物学的または
化学的アレイを含む。(“標的を含むサンプル”または“サンプル中の標的を検
出する”という語句は、標的を含まないかまたは検出されないサンプルまたは測
定(検出の試み)を除外することを意味するものではない。通常の意味において、
本発明は、標的がサンプル中に含まれるかどうかを、それが検出されるかされな
いかにかかわらず測定するアレイを含む。)このアレイは、包括的アンカーを含
み、それぞれが、アンカーに特異的な第１の部分および少なくとも１つの標的に
特異的なプローブを含む第２の部分を有する二官能性リンカー分子に結合する。
本発明の組合せは、１つまたはそれ以上の標的を含むサンプルとの接触にあり、
所望により、ディテクター分子と反応し、次いで、試験領域中における標的分子
とプローブとの間の反応を検出する検出装置により応答指令信号が送られ、それ
によりアッセイの結果を得る。
【０００６】 本発明は、特にハイスループット生物学的アッセイに有用な方法および組成物
を提供する。特に好ましい実施態様では、本発明を用い、ハイスループットな薬
物探索のスクリーニングができる。例えば、ハイスループットアッセイは、１度
に多くの(例えば１００)９６ウェルマイクロプレートに実施することができる。
プレートの各ウェルには、例えば３６種の試験物が含まれ、その中で、約３６の
アンカーおよびリンカーの対のアレイを用いることにより実施される。すなわち
、プレートあたり９６ウェルを有する１００プレートであり、ウェルあたり３６
の試験物をそれぞれ有し、合計３４５,０００試験物となり得る；例えば、９,６
００種の薬物候補のそれぞれに、３６種のパラメーターまたはアッセイを同時に
試験し得る。ハイスループットアッセイにより、１度で１パラメーターのみを試
験するアッセイよりも多くの各薬物候補についての情報が提供される。例えば、
単一の最初のハイスループットスクリーニングアッセイが可能であり、薬物候補
が選択的であるか、特異的であるか、および/または非毒性であるかどうか決定
する。非ハイスループット方法は、広範囲の追加アッセイを必要とし、目的の各
薬物候補のパラメーターを試験する。幾つかの型のハイスループットスクリーニ
ングアッセイを実施例１５-１７に記載する。多様な生物学的アッセイを同時に
実施する能力および１度に多くのアッセイを行う能力(すなわち、超ハイスルー
プットにおいて)は、本発明の重要な２つの利点である。
【０００７】 ある実施態様では、例えば、アミノ酸または修飾オリゴヌクレオチドのような
一級アミンの結合を誘導した表面を有するポリスチレンで作成した９６ウェルＤ
ＮＡ Ｂindプレート(Ｃorning Ｃostar)を用い、３６種のオリゴヌクレオチドの
回収物をアンカーとしての役割をする各プレートの各ウェルの表面上にスポット
し得る。アンカーを誘導ポリスチレンに共有結合し、同じ３６のアンカーをすべ
てのスクリーニングアッセイ使用し得る。任意の特定のアッセイの場合、所定の
一群のリンカーを用い、３６種ぐらいの目的の標的またはアッセイ型に特異的な
各ウェルの表面にプログラムし得、種々の試験サンプルを各プレート中の各９６
のウェルに適用し得る。同じ一群のアンカーを複数時間用い、目的の他の標的お
よびアッセイのウェルの表面に再度プログラムするか、または同じ一群のリンカ
ーを複数時間、再度使用し得る。この順応性および再利用性により、更に本発明
の利点が示される。
【０００８】 本発明のある態様は、サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な
組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも２つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、そ
れら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも８種のオリゴヌクレオチドアンカーを含み、それぞれが結合するの
が、 c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第１の部分、および当該標的に特異的
なプローブを含む第２の部分を有する二官能性リンカー、 を含む組合せである。
【０００９】 本発明の他の対応は、サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な
組合せであって、それには、当該サンプルの添加前に、 a)少なくとも２つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、そ
れら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも８種のアンカー、それぞれが結合するのが、 c)アンカーに特異的な第１の部分、および当該標的に特異的なプローブを含む第
２の部分を有する二官能性リンカー、 を含む組合せである。
【００１０】 本発明の他の実施態様は、少なくとも１つの標的を検出する方法であり、それ
には、当該標的が当該組合せと効率よく結合する条件下、上記のような当該組合
せと共に標的を含むサンプルと接触することを含む。他の態様は、ＲＮＡ発現パ
ターンを決定する方法であって、それには、上記の組合せと共に少なくとも２つ
のＲＮＡ分子を標的として含むサンプルをインキュベーションすることを含む(
少なくとも１つの組合せのプローブが、ＲＮＡ標的によるプローブへの特異的な
ハイブリダイゼーションが効率的となる条件下、少なくとも１つのＲＮＡ標的に
特異的となる(すなわち、選択的)核酸(例えばオリゴヌクレオチド)である)。他
の態様は、ＲＮＡ発現パターンを修飾する試薬(または条件)を同定する方法であ
って、それは、上記ＲＮＡ発現パターンを決定する方法であり、更に、当該試薬
(または条件)の存在下作成するＲＮＡ発現パターンを多種の一群の条件下作成す
るＲＮＡ発現パターンに比較することを含む。
【００１１】 実施例の方法により、図１および２は、本発明の組合せおよびmＲＮＡ標的の
検出にそれを使用する方法を示す。図２に示す本発明の表面は、１５の同一試験
領域を含む；本発明の特に好ましい実施態様では、これら各試験領域はマイクロ
タイタープレート中のウェルである。各試験領域は、６種のアンカーを含み、こ
こでは番号１-６で示す。図１で概要を示しているのは、当該アンカーの１つ、
アンカー１であり、本発明の最も好ましい態様では、オリゴヌクレオチドである
。アンカー１に、２つの部分を含むリンカー分子、リンカー１を結合させる。第
１の部分はアンカーに特異的であり、この図中ではアンカーに特異的に結合し得
るオリゴヌクレオチドである。第２の部分は、目的の標的、ここでは標的mＲＮ
Ａ１、に特異的なプローブであり、この図中では当該標的にハイブリダイズし得
るオリゴヌクレオチドである。この図中では示していないが、残りの５つのアン
カーはそれぞれ、自身のリンカーとアンカー特異的部分を介してハイブリダイズ
し得る；各リンカーは、例えばmＲＮＡ１と異なる(またはmＲＮＡ１と同一の)m
ＲＮＡに特異的なプローブ部分を含み得る。この示した組合せを用い、１５種ぐ
らいのサンプルをmＲＮＡ１の存在のため同時(または、アレイ中の他の５つのプ
ローブにより特定(プログラム)されるmＲＮＡ標的の場合、同時に)にアッセイし
得る。アッセイを行うため、この例において、１５の独立したセルラインの１つ
sayのＲＮＡ抽出物となり得る各サンプルを、少量の体積で１つの領域、ウェル
に加え、プローブおよび標的のハイブリダイゼーションが効率的となる条件下イ
ンキュベーションする。mＲＮＡ１がサンプル中に存在するかどうか決定するた
め、パターンを認識し得、および/またはシグナルの存在のため各領域内の特定
位置に応答指令信号を送り得る検出装置を用いる。セルラインを、mＲＮＡがイ
ンビボでタグで標識される条件下インキュベーションするならば、そして、mＲ
ＮＡ１がサンプル中に存在するならば、ディテクターは、アンカー/プローブ複
合体１により決まる位置でタグをつけたmＲＮＡから放射するシグナルを検出す
る。他に、領域(ウェル)に添加する前または後に、mＲＮＡを直接インビトロで
標識し得る。他に、図１に示したように、プローブにハイブリダイズさせる前ま
たは後に、例えば、プローブにより認識される以外の配列に相補的であるタグを
つけた“ディテクター”オリゴヌクレオチド(標的−特異的レポーターオリゴヌ
クレオチド)と共にＲＮＡをインキュベーションすることにより、mＲＮＡに間接
的にタグをつけることができる。図示した例では、１５のサンプルを同時に分析
し得る。少なくとも２０またはそれ以上、例えば１５３６ぐらいか、それ以上の
サンプルが本発明により同時に分析され得るため、それは超ハイスループットア
ッセイシステムであるといえる。
【００１２】 本明細書中で使用するとき、“標的”とは、存在、活性および/または量が望
ましくは決定され、所定のプローブに親和性を有する物質について言及する。標
的は、人工的か、または自然に生ずる物質であり得る。また、それらは、不変化
の状態か、または他の種類との集合体として用い得る。標的を、共有結合的か、
または非共有結合的に、結合膜に、直接かまたは特定結合物質を介して結合し得
る。本発明で用い得る標的の例には、レセプター(小胞、脂質、細胞膜または様
々な他のレセプターにおける)、リガンド、レセプターに特異的なアゴニストま
たはアンタゴニスト、抗原決定基に特異的に反応するポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体および抗血清(ウイルス、細胞または他の物質のような)、薬剤、
核酸またはポリヌクレオチド(mＲＮＡ、tＲＮＡ、rＲＮＡ、オリゴヌクレオチド
、ＤＮＡ、ウイルス性ＲＮＡまたはＤＮＡ、ＥＳＴ、cＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡから誘導するＰＣＲ増幅産物、ならびに変異、変異体またはそれらの修飾)
、タンパク質(神経伝達物質の切断に応答するようなもの、プロテイナーゼ、キ
ナーゼなどの酵素を含む)、酵素の基質、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポ
リサッカライド、細胞(細胞表面抗原を含み得る)、細胞膜、オルガネラなど、な
らびに複合、共有結合架橋などの型で存在する分子または他の物質を含むが、こ
れらに限らない。本明細書中で使用するとき、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核
酸およびオリゴヌクレオチドは取り換えることができる。標的はまた抗-プロー
ブとして言及し得る。
【００１３】 本明細書中で使用するときは、“プローブ”は、物質であり、例えば、特定の
標的により特異的に認識され得る分子である。可能性あるプローブ/標的または
標的/プローブ結合パートナーの型には、レセプター/リガンド、リガンド/アン
チリガンド、ＤＮＡ/ＤＮＡ、ＤＮＡ/ＲＮＡ、ＰＮＡ(ペプチド核酸)/核酸を含
む核酸(ポリヌクレオチド)相互作用、酵素、他の触媒、または基質、小分子また
はエフェクター分子を含む他の物質などを含むが、これらに限らない。本発明が
目的とするプローブの例は、有機または無機物質または金属を含むポリマー、キ
レート化剤、または金属、プラスチック、細胞膜レセプターのアゴニストおよび
アンタゴニスト、トキシンおよびベナム(venom)、ウイルス性エピトープ、ホル
モン(例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど)、ホルモンレセプター、脂
質(リン脂質を含む)、ペプチド、酵素(プロテーゼまたはキナーゼのような)、酵
素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖、核酸(オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、ＰＮＡもしくは修飾もしくは置換核酸を含む)、オリゴサッカロイド、タ
ンパク質、酵素、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖抗体もしく
はそのフラグメントと特異的に相互作用する他の化合物を含むが、これらに限ら
ない。プローブポリマーは、直線状か、環状であり得る。プローブは、特異活性
または特異結合の何れかの効力により、リン酸化および非リン酸化タンパク質を
識別し得る。レクチンのようなプローブはグリコシル化タンパク質を識別し得る
。本明細書中で使用するとき、核酸、ポリヌクレオチド、ポリ核酸およびオリゴ
ヌクレオチドという語は置き換えることができる。“プローブ”として上記した
任意の物質はまた“標的” 働きをし得、その逆もあり得る。
【００１４】 任意の互換性のある表面を本発明のと共に用い得る。表面(通常固体)は任意の
多種の有機または無機物質またはそれらの組合せであり、ポロプロピレンまたは
ポリスチレン、セラミック、シリコン、例えばガラス顕微鏡スライドまたはガラ
スカバースリップの厚さを有する(融合)シリカ、石英またはガラス、フィルター
ペーパーのような紙、ジアゾ化セルロース、ニトロセルロースフィルター、ナイ
ロン膜、またはポリアクリルアミドゲルまたは他のタイプのパッド、例えば、任
意の種々の慣用の方法により湿潤ゲルの乾燥により製造した、フィルムを含む非
常に多孔性の固体であるエアロゲルから成る、例えば、エアロゲルパッドまたは
エアロベッドが単に例として含まれる。光に透明である基体は、アッセイを実施
する方法に光学的検出が含まれる際に、有用となる。好ましい態様では、表面は
、マルチウェルのプラスチック表面であり、例えば、組織培養ディッシュ、例え
ば２４-、９６-、２５６-、３８４-、８６４-または１５３６-ウェルプレート(
例えば、Ｃorning Ｃostar ＤＮＡ Ｂind plateのような修飾プレート)である。
アンカーは、例えば表面と直接結合し得るか、または１つの型の表面、例えばガ
ラスと結合し得、次いで、例えば、二次表面、例えばマイクロタイターディッシ
ュ中のプラスチック“ウェル”内の表面と接触して位置する。表面の形は重要で
はない。例えば、四角、矩形もしくは丸形のような平坦表面、曲線表面、または
ビーズ、粒子、繊維、沈殿、チューブ、球のような３次元表面であり得る。
【００１５】 表面は、空間的に分離され、アドレサブル(addressable)または同定可能な領
域を含む。各領域は、一群のアンカーを含む。どのように領域が分離されるか、
それらはどのような物理的性質であるか、そして、どのように相互に相対的に方
向付けられるかは、重要ではない。ある実施態様では、領域は、液体の通過を妨
げる任意の物理的バリアーにより相互に分離され得る。例えば、好ましい実施態
様では、領域は、マルチウェル(例えば、組織培養)ディッシュのウェルとなり得
、例えば、２４-、９６-、２５６-、３８４-、８６４-または１５３６-ウェルプ
レートである。他に、ガラス表面のような表面をエッチングすると、例えば、８
６４または１５３６の分離された浅いウェルとなり得る。他に、表面は、仕切り
またはウェルのない領域を含み得、例えば、平坦表面であり、例えば、プラスチ
ック、ガラスまたは紙の切片であり、そして、個々の領域は、分離領域を形作る
構造(例えばプラスチックまたはガラス片)を覆うことにより更に決定され得る。
所望により、表面は、個々の領域が形作られる前に、アンカーまたはリンカーと
結合するアンカーの１つまたはそれ以上のアレイを既に含み得る。他の実施態様
では、各領域の内のアンカーのアレイは相互に分離され得、それは、アンカーの
ない表面上のブランクスペース(blank space)によるか、または小滴の分散を防
止するワックスまたはシリコンのような化学的境界(chemical boundary)による
。
【００１６】 また他の実施態様では、領域は、チューブまたは液体調節チャンネルとして決
定され得、例えば、Ｂeattie et al (１９９５) Ｃlin. Ｃhem. ４, ７００-７
０６に開示するようなフロースルーアッセイとして設計され得る。チューブは任
意のサイズ、例えば、毛管または広い内径のチューブであり得る；液体の流れを
可能にし得る；または部分的にまたは完全にゲル、例えば、アガロースまたはポ
リアクリルアミドで充たされ、それを通って化合物が、例えば、電気泳動により
輸送(通過、流動、ポンプ輸送)され得る；ゲルはアンカーの結合に関して活性化
されており、異なるアンカーが連続して通過し、ゲル内のアンカーの直線的アレ
イの形成を可能にする；そしてリンカー、標的などが連続して通過する。表面内
または表面上などの領域もまたそれ自身の表面の修飾により決まり得る。例えば
、プラスチック表面はまた、修飾または誘導プラスチックで作成した部分を含み
、それは、例えば、特定の型のポリマーを加える部位としての働きをし得る(例
えば、ＰＥＧをポリスチレン表面に結合し得、次いで、カルボキシルまたはアミ
ノ基で、二重結合、アルデヒドなどを誘導する。)。他に、プラスチック表面は
突出(protrusion or bump)のようなモールドした構造を含み得、それは、アンカ
ーの添加のためのプラットフォームとしての役割をし得る。他の実施態様におい
て、領域はゲルパッド、例えばポリアクリルアミドゲルパッドまたは絵アロパッ
ドであり得、それらは、例えば、ガラスのような表面上に臨まれるパターンで配
置され、または例えば、ガラスと石英プレートのような二つの表面の間にサンド
イッチされ得る。アンカー、リンカー等はこのようなパッドの表面上に固定化で
き、またはそれらの中に包埋され得る。ゲルパッドの種々の他の配置が、当業者
には明らかであり、通常の、慣用法により製造できる。試験領域の相対的な方向
付けは、任意の多様な型となり、それらには、四角または矩形または他の表面内
の平行または垂直なアレイを含むがこれらに限らず、それらは、丸または他の表
面、または直線状アレイなどのアレイに容易に拡張される。
【００１７】 本発明の空間的に分離された領域は、マルチプルコピー(multiple copy)内に
存在する。すなわち、少なくとも２つ、好ましく少なくとも２０、または少なく
とも約２４、５０、９６、２５６、３８４、８６４、１５３６、２０２５、また
はそれ以上などであり、実質的にそれらは同一であり、空間的に分離(分断され
た)領域である。繰り返し領域の数の増加により、ますます、より高いスループ
ットのアッセイをし得る。本明細書中で使用するとき、実質的に同一の領域とは
、同一または実質的に同一のアンカーのアレイおよび/またはアンカー/リンカー
複合体を含む領域について言及する。本明細書中で使用するとき、実質的に同一
とは、本発明に従い標的を分析する前後関係において、アレイまたは領域が、他
のアレイまたは領域と本質的に同一の機能として働くことを意味する。機能に実
質的に影響しない相違、すなわち、標的の検出可能性は、小ヌクレオチド不完全
性(脱落/挿入/置換)またはオリゴ不完全性(弱い表面結合)などの系に沿い、それ
らは、アッセイの正確性において、標的決定結果に重要な影響を与えない。
【００１８】 もちろん、当業者ならば、表面上のすべての領域が相互に実質的に同一である
必要はないことを認識し得る。例えば、２種の一群のアレイが平行に試験され得
るならば、単一表面上の一群のアレイを両方含むことが利点となり得る。例えば
、２種の一群のアレイを、互い違いにストリッピングしたパターンに配置し、そ
れらの間での比較を促進し得る。他の実施態様では、従事者は、表面上の他の領
域と識別し得る方法で検出し得る１つまたはそれ以上の領域を含み、それによっ
て、“登録領域”として使用し得ることを希望する。例えば、登録領域は、オリ
ゴヌクレオチドまたはペプチドを含み、それにより、表面上の領域の位置に配置
される“開始点”としてスキャンニング検出装置が認識し得る蛍光分子の明瞭な
パターンが示される。
【００１９】 試験領域の大きさおよび物理的空間は制限されない。典型的な領域は、面積が
約１ないし約７００mm２、好ましくは１ないし４０mm２であり、そして約０.５
ないし約５mm離れており、含まれる面積に応じて通常選択され得る。好ましい実
施態様では、領域は約５mm離れている。例えば、各領域は、矩形グリッドを有し
、それは、例えば、８列および６段からなり、直径約１００マイクロメーターで
あるアンカーの粗い環状スポットで５００マイクロメーター離れている；その領
域は、面積２０平方ミリメーターである。より大きな領域およびより小さな領域
ならびに空間が含まれる。
【００２０】 領域はまた、領域内の幾つかまたはすべてのアンカーは、例えば、へこみ(ind
entation)および小さなくぼみ(dimple)によって、隣接するアンカーから物理的
に分離されるように、更に再分割される。例えば、多くの領域内の再分割(小区
域)は、約１０ないし約１００またはそれ以上もしくはそれ未満の範囲となり得
る。ある実施態様では、１５３６-ウェルディッシュのウェルである領域を、よ
り小さいウェルに更に再分割し、例えば、約４ないし約９００、好ましくは約１
６ないし約３６ウェルとし、それにより、ウェル内のウェルにアレイに形成し得
る。図４参照。そのくぼんだ表面により、各設計した空間(位置)に単一のアンカ
ー(またはアンカーの群)を物理的に位置させるのに必要な強度が弱くなり、そし
て、アンカーを含む領域の大きさが、より均一となり、それにより、ブローブへ
結合する標的の検出が促進される。
【００２１】 本明細書中で使用するとき、“アンカー”という語は、任意の存在物または物
質について言及し、例えば、その分子(またはその物質と実質的に同一の“グル
ープ”(図７参照))は、表面と結合するか(例えば、表面において固定化されるか
、または共有結合的もしくは非共有結合的の何れかで結合する)、またはその表
面の部分であり(例えば、プラスチック表面の誘導部分)、そして、本明細書に記
載のようにリンカーまたは他の物質と特異的に相互作用するか、もしくは結合し
得る。本明細書中で使用する場合、アンカーおよびリンカーが特定の方法で分子
会合を介して組合される際、“アンカー/リンカー複合体”が存在する。リンカ
ーとの相互作用は、ある共有結合のように不可逆的か、または核酸ハイブリダイ
ゼーションのように可逆的であり得る。好ましい実施態様では、アンカーは核酸
であり、それは、任意の長さ(例えば、オリゴヌクレオチド)または型(例えば、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡもしくはＤＮＡ分子のＰＣＲ産物)となり得る。
核酸は、修飾または置換され得る(例えば、イノシンのような天然には生じない
ヌクレオチド；スルファメート、スルファミド、ホスホチオネート、メチルホス
ホネート、カルバメートなどのような様々な既知連結を介する結合；またはＤＮ
Ａストレプトアビジン結合のような半合成分子を含む)。一本鎖核酸が好ましい
。アンカーはまたペプチドまたはタンパク質である。例えば、ポリクローナルま
たはモノクローナル抗体分子またはそのフラグメント、または一本鎖抗体または
そのフラグメントであり得、それらは、抗原または抗-抗体分子であるリンカー
の部分に特異的に結合する；表面では、アンカーはペプチドであり得、そして、
それれに結合するリンカー部分は抗体などである。他の実施態様では、アンカー
はレクチン(カブトガニ、ピーナッツ、ヤエナリ、Ｐhaseolus、小麦麦芽などの
ような生物由来のコンカナバリンＡまたは凝集素)であり、特定の炭水化物に特
異的である。他の実施態様では、アンカーは、修飾または誘導プラスチックポリ
マーのような有機分子であり得、それらは、例えば、オリゴヌクレオチドの特定
の固体相化学合成の段階としての働きをし得る。この場合、誘導プラスチックは
、製造過程の組合せのプラスチック表面に完全に形成される、分離した、誘導さ
れた位置のアレイとして分配され得る。他の実施態様では、アンカーは、金属イ
オン、例えば、Ｎi、Ｚn、Ｃa、Ｍgなどと特定のタンパク質もしくはキレート剤
との間で特異的または選択的な結合に有利となり得る。例えば、アンカーはポリ
ヒスチジンであり得、リンカーのアンカー特異的部分はニッケルであり得、それ
は、ニッケルキレート化剤を介して標的特異的プローブに結合する。他に、キレ
ート化剤は、アンカーおよびポリヒスチジンプローブ関連部分であり得る。他に
、アンカーは無機物質であり得る。例えば、カルシウムおよびマグネシウムのよ
うな金属であり得、リンカーのアンカー特異的部分は、それぞれ、ＥＤＴＡまた
はＥＧＴＡのような選択的キレート化剤であり、それは標的特異的プローブに結
合する。当業者ならば、広範囲の他の型の分子もまた、プローブおよび標的に関
連して考察される一般的な型のようなアンカーとしての働きをし得る。
【００２２】 試験領域中のアンカーの数は、少なくとも２つ、好ましくは約８から約９００
の間(それよりも多い場合および少ない場合を含む)、より好ましくは約８から約
３００の間、そして最も好ましくは約３０から約１００の間(例えば約６４)であ
り得る。幾つかの好ましい実施態様では、９６試験領域(例えば、ウェル)を有す
る表面の場合約１６、３６、４５または１００のアンカー/試験領域または３８
４試験領域(例えば、ウェル)を有する表面の場合、約９、１６または２５のアン
カー/試験領域がある。最も好ましい実施態様では、試験領域中の各アンカーは
、アレイ中、他の何れのアンカーとも異なる特異性を有する。しかし、２つまた
はそれ以上のアンカーは同じ特異性を有し、すべてのアンカーは同一となり得る
。本発明の組合せが非常に多くの試験領域を含み(例えば、約８６４、１５３６
またはそれ以上)、そのため多数の試験サンプルが同時に処理され得る、ある実
施態様では、限られた数(例えば、約２、４、６または９)のパラメーターのみに
関し当該サンプルを試験することが目的とされる。換言すれば、非常に多数の領
域を含む組合せの場合、領域あたり約２ないし９アンカーのみを有することが利
点となる。
【００２３】 試験領域内または試験領域上のアンカーの物理的空間および相対的方向付けは
限定されない。典型的に、アンカー同士の距離は、約０.００３ないし約５mmま
たはそれ未満、好ましくは約０.０３と約１との間である。より長いおよびより
短いアンカー空間(および面積)が含まれる。アンカーが、相互および領域の境界
に相対的な任意の方向付けで配置され得る。例えば、それらは、四角、矩形、六
辺形または他のアレイ、または放射線または同心円の中心から放射するアンカー
を有する環状アレイのような二次元的方向付けで配置され得る。アンカーはまた
、一次元の直線アレイで配置され得る。例えば、オリゴヌクレオチドはＤＮＡま
たはＲＮＡ配列に従って特異的位置にハイブリダイズし得、超分子アレイを形成
し得るか、またはフロースルーゲルにおける直線配置である。他に、アンカーは
“バーコード”様型となり得る(図６参照)。例えば、アンカーは相互に平行なロ
ングラインとなり得る。各ロングラインの間またはその幅の距離は、調節された
方法で変化し得、バーコードのような単なる認識パターンが生じ、例えば、第１
のおよび３番目のラインは残りの広さの２倍となり得、ラインは取り除かれるな
どされ得る。エクストラエンプティーラインは、１つの試験領域をはっきりと区
別する最後のラインの後に位置され得、バーコードパターンは連続的な試験領域
で繰り返され得る。
【００２４】 アンカーのパターンは、分離したアッセイウェル(試験領域)または分離アッセ
イ小滴の位置を明確に登録する必要はない。“アッセイ位置”という語は、アッ
セイサンプルが適用されるアッセイ表面の位置の言及に使用される(これらは、
アッセイサンプルの分離した小滴の位置により、または例えばマルチウェルプレ
ート上の個々のアッセイウェルを決める壁または仕切りの位置により決められる
)。アンカーパターン自体(例えばオリゴヌクレオチドアンカーの“バーコード”
様パターン)を用い、各分離アンカーがパターン認識により正確に決められ、ち
ょうど各バーコードのラインが残りのラインに相対する位置により認識される。
このため、第１のアンカーは、各アッセイ位置の１つの端または１つの角を必要
としない。第１のアンカーは、アッセイ位置に相対する位置よりもむしろパター
ン認識により発見される。各アッセイ位置(例えば、小滴の面積またはウェルの
面積)で使用される面積が、アンカーの繰り返しパターンの少なくとも１つの全
体の単位を含むのに十分広い限り、次の各アッセイ点は、パターンラインがアッ
セイ位置の面積内にあるところはどこでも(バーコード)パターンにより特定され
るすべての標的のアッセイ位置のサンプルを試験する。
【００２５】 アンカーは、各試験領域内の明確または固定されたパターンで配置される必要
はない。例えば、各アンカーは、粒子、ビーズなどに結合し得、それらは試験領
域内のランダムな位置と仮定される。各アンカーの位置は、例えば検出可能なタ
グの使用により決定され得る。例えば、各型のアンカーに特異的なリンカー分子
は、種々の蛍光、ルミネセンスなど、タグで標識され得、特定リンカー/アンカ
ー対を含む粒子の位置は、リンカーから放射するシグナル、例えば、励起または
放射スペクトルの性質により同定され得る。当業者ならば、種々の結合したタグ
であって、それぞれ認識し得るスペクトルを有する一群のリンカーを調製し得る
。他に、アンカーは直接標識され得る。例えば、各型のアンカーをタグで標識し
得、そのタグは様々なスペクトルを有する蛍光を他の型のアンカーにおいて発す
る。他に、粒子、ビーズなどは、大きさまたは形について相互に異なっている。
本明細書中で記載する任意の標識および検出方法を用い得る。例えば、蛍光は、
ＣＣＤを基にするイメージングシステムにより、スキャンニング蛍光顕微鏡また
はＦluorescence Ａctivated Ｃell Ｓorter(ＦＡＣＳ)により測定され得る。
【００２６】 アンカーは、リンカー分子のある部分-アンカー特異的部分-と特異的に相互作
用するか、または結合し得る。“相互作用”または“結合”という語は、本明細
書中では、２つの物質または化合物(例えば、アンカーおよびリンカーのアンカ
ー特異的部分、プローブおよびその標的、または標的および標的特異的レポータ
ー)が相互に結合し(例えば、結合(attached, bound)、ハイブリダイズ、結合(jo
ined)、アニール、共有結合(covalently linked)、または他の結合)、十分に目
的のアッセイを行い得ることを意味する。“特異的”または“特異的に”という
語は、本明細書では、２つの化合物(例えば、アンカーおよびリンカーのアンカ
ー特異的領域、プローブおよびその標的、または標的および標的特異的レポータ
ー)が相互に選択的に結合し、任意の保護技術のない場合、当該成分に結合する
ことを目的としない他の成分には通常結合しない。特異的相互作用を達成する必
要のあるパラメーターを、例えば当分野の通常の技術を用い、通常決定すること
ができる。
【００２７】 例えば、核酸の場合、当業者ならば、他の物質または分子(例えば、他のオリ
ゴヌクレオチドリンカー)への非特異的ハイブリダイゼーションを最小化する一
方、選択したストリンジェンシー条件下、他の核酸にハイブリダイズさせ得る核
酸(例えば、オリゴヌクレオチドアンカー)の特徴(長さ、塩基組成物および相補
性の程度のような)を実験的に決定することができる。典型的に、アンカーのＤ
ＮＡまたは他のアミノ酸配列、リンカーの部分、ディテクターオリゴヌクレオチ
ドは、その結合対と十分相補性があり、選択したストリンジェントハイブリダイ
ゼーション条件下ハイブリダイズでき、Ｔmは室温よりも約１０から２０℃高く
なり得る(例えば約３７℃)。通常、オリゴヌクレオチドアンカーは、長さ約８な
いし約５０ヌクレオチド範囲となり得、好ましくは１５、２０、２５または３０
ヌクレオチドとなり得る。本明細書中で使用するとき、“高いストリンジェント
ハイブリダイゼーション条件”とは、核酸同士で少なくとも９５％、好ましくは
約９７％から１００％のヌクレオチド相補性(同一性)があるときにハイブリダイ
ゼーションが生じる任意の条件を意味する。しかし、望ましい目的に応じて、ハ
イブリダイゼーション条件は選択され得、低い相補性、例えば、約９０％、８５
％、７５％、５０％などを必要とする。変わり得るハイブリダイゼーション反応
パラメーターでは、塩濃度、緩衝液、pＨ、温度、インキュベーション時間、ホ
ルムアミドのような変性剤の量および型などがある(例えば、Ｓambrook et al.
(１９８９) Ｍolecular Ｃloning: Ａ Ｌaboratory Ｍanual (２d ed.) Ｖols.
１-３, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress, Ｎew Ｙork; Ｈames et al.(１９８５)
. Ｎucleic Ａcids Ｈybridaization, ＩＬ Ｐress; Ｄavis et al. (１９８６)
, Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology, Ｅlsevir Ｓciences Ｐublishing
, Ｉnc., Ｎew Ｙork)。例えば、核酸(例えば、リンカーオリゴヌクレオチド)を
、試験領域(例えば、マルチウェルプレートのウェル-好ましい実施態様では、９
６または３８４またはそれ以上のウェルプレート)に、体積約０.１ないし約１０
０またはそれ以上のμl(好ましい実施態様では、約１ないし約５０μl、最も好
ましくは約４０μl)で、例えば６ＸＳＳＰＥ-Ｔ(０.９ Ｍ ＮaＣl、６０mＭ Ｎa
Ｈ２ＰＯ４、６mＭ ＥＤＴＡおよび０.０５% ＴritonＸ-１００)のような緩衝液
中、濃度約０.０１ないし約５μＭ(好ましい実施態様では約０.１μＭ)で、加え
ることができ、約１０分ないし少なくとも３時間(好ましい実施態様では、少な
くとも約１５分間)、温度約４℃ないし約３７℃(好ましい実施態様では、おおよ
そ室温)の範囲で結合対(例えば、表面上のオリゴヌクレオチドアンカー)にハイ
ブリダイズすることができる。条件を選択し、ハイスループットとすることがで
きる。本発明の１つの実施態様では、反応条件はおおよそ生理条件である。
【００２８】 例えば、アンカーまたはリンカーの部分としての働きをし得る他の型の物質ま
たは分子(例えば、ポリペプチド、レクチンなど)の設計、および結合対との特異
的相互作用に必要な反応条件は当分野には通常であり、一般的である(例えば、
Ｎiemeyer et al (１９９４) Ｎucleic Ａcids Ｒes. ２２, ５５３０-５５３９
; Ｆodor et al (１９９６)米国特許番号５,５１０,２７０; Ｐirrung et al (
１９９２)、米国特許番号５,１４３,８５４に記載の通り)。インキュベーション
パラメーターには、緩衝液、塩濃度、pＨ、温度、インキュベーション時間、担
体および/または試薬または非特異的相互作用を減少する条件がある。例えば、
アンカーとして抗体を含む試験領域(例えば、マルチウェルプレートのウェル-好
ましい実施態様では９６または３８４またはそれより多いウェルプレート)に、
抗-抗体(例えば、抗原または抗体特異的二次抗体)を、体積約０.１ないし約１０
０またはそれよりも多いμl(好ましい実施態様では、約１ないし約５０μl、最
も好ましくは約４０μl)で、例えば、６ＸＳＳＰＥ-Ｔ、ＰＢＳまたは生理食塩
水のような緩衝液中、濃度約１０pＭないし約１０nＭ(好ましい実施態様では、
約１nＭ)で加えることができ、表面上のアンカーと共に、約１０分ないし少なく
とも約３時間(好ましい実施態様では、少なくとも１５分間)、温度約４℃ないし
４５℃の範囲(好ましい実施態様では、約４℃)でインキュベーションし得る。ペ
プチドアンカーの場合、約５ないし約２０の長さのアミノ酸が好ましい。
【００２９】 本発明の幾つかの実施態様では、アレイ中の各アンカーは、選択した反応条件
下、アレイ中の他のアンカーと実質的に同程度に、相当するリンカーのアンカー
特異的部分と相互作用し得る。これにより確実となるのは、アンカーによるリン
カーおよびそのプローブの実質的に均一のアレイに対する特異性である。
【００３０】 試験領域内のアンカーは、“包括的な”群であり得、１つまたはそれ以上の様
々なリンカーと相互作用し得る各アンカーであり、それぞれ、異なる“プローブ
”部分以外のアンカーに特異的な部分がある；そのため、包括的アンカーの単一
のアレイを用い、様々な一群のプローブをプログラムまたは決定する。アンカー
のその包括的アッセイの順応性を図１および２に引用して示す。図２は１５の試
験領域を含む表面を示し、それぞれ、６種のアンカーのアレイを含み、実施例中
ではオリゴヌクレオチドである。図１は、これらアンカーの１つ(オリゴヌクレ
オチド)、アンカー１を概略し、それらは、アンカー１に特異的である１つの部
分および標的mＲＮＡ１に特異的な第２の部分を含む、リンカー１と接触する。
他に、あるものは、例えば、リンカー２と置換され、リンカー１のように、アン
カー１に特異的な部分を含むが、標的mＲＮＡ１の代わりに標的mＲＮＡ２に特異
的な第２の部分を含む。そのため、アンカー１を用い、２つまたはそれ以上の種
々の標的mＲＮＡの何れか用のプローブを明記(またはプログラム、または定義、
または決定)し得る。オリゴヌクレオチドまたはペプチドのハイレゾリューショ
ンパターン(アレイ)を作成し、結びつける方法は、高価であり、時間がかかり、
および/または物理的に困難となり得る。アンカーの前形成アレイを用い、多種
のプローブアレイをプログラムする能力は、本発明の１つの利点である。
【００３１】 図２に示す包括的アンカーにより、オリゴヌクレオチドプローブのパターンが
決定されるけれども、同一アンカーアレイもまた使用され、他のタンパク質、例
えば、レセプタータンパク質(図３参照)のアレイをプログラムし得る。明らかに
、多くの入れ替えが可能であり、アンカー/リンカー相互作用の型の所定の範囲
、例えば、タンパク質/抗体の組合せのような“サンドイッチ”または“ピギー
バック”プローブの多数の複合層が得られる。そのため、この発明のアンカーの
表面自身、新規な利点を提供する。
【００３２】 本発明のある実施態様では、アンカーは、可逆的にリンカーと相互作用し得る
；そのため、包括的一群のアンカーは再利用され、種々の一群のプローブをプロ
グラムし得る。例えば、オリゴヌクレオチドアンカーは、例えば、２つのオリゴ
ヌクレオチドが解離する過熱段階により、リンカーのオリゴヌクレオチド部分か
ら分離され得、次いで、二次リンカーと再結合する。高価であり、時間がかかり
、および/または作成に物理的困難を有する、アンカーアレイを再利用する能力
は、本発明の他の利点である。
【００３３】 アンカーが、リンカーと相互作用する必要はない。例えば、アンカーは、蛍光
色素のような検出可能な分子と結合し得(直接的または間接的)、それによって、
例えば、試験表面およびディテクターとの間の登録の目的で、グリッド内のスポ
ットを位置付け得る。他に、アンカーを既知量の検出分子で標識し得る。例えば
、較正の目的で内部定量マーカーとして用いるためである。
【００３４】 本明細書中で使用する“リンカー”という語は、選択した(設計した)アンカー
またはアンカーのサブセット(“アンカー-特異的”)に特異的である第１の部分(
成分または部分)および目的の標的(“標的-特異的”)に特異的なプローブである
第２の部分を含む二官能性物質として言及する。リンカーの２つの部分は、共有
結合的または非共有結合的連結を介して結合し得、中間体に直接または中間体を
介して結合し得る。
【００３５】 リンカーのアンカー特異的部分の化学的性質は、もちろん、アンカーまたは相
互作用するアンカーの機能である。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドなら
ば、相互作用するリンカーの部分は、例えば、オリゴヌクレオチドに特異的に結
合するペプチドであり、選択したストリンジェント条件下で効率的および特異的
にハイブリダイズし得る。核酸は、例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ＰＮＡ、ＰＣＲ産物、または置換もしくは修飾核酸(例えば、イノシンのよ
うな天然には生じないヌクレオチド；スルファメート、スルファミド、ホスホチ
オネート、メチルホスホネート、カルバメートなどのような様々な既知連結を介
する結合；またはＤＮＡストレプトアビジン結合のような半合成分子を含む)で
あり得る。一本鎖成分が好ましい。オリゴヌクレオチドアンカーに特異的なリン
カー部分は、長さ約８ないし５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは約１５、２０
、２５または３０ヌクレオチドである。アンカーが抗体ならば、相互作用するリ
ンカーの部分は、例えば、抗-抗体、抗原、またはアンカーと特異的に相互作用
し得る分子の１つの小フラグメントであり得る。上記他のタイプのアンカーと特
異的に相互作用し、そして、アンカー-特異的なリンカー部分としての働きをす
る物質または分子もまた、当分野に既知であり、通常の方法を用い設計し得る(
例えば上記参照)。
【００３６】 標的-特異的なリンカーの部分の化学的性質は、もちろん、プローブであり、
相互作用する標的の機能である。例えば、標的が、特にmＲＮＡならば、標的-特
異的なリンカーの部分は、例えば、標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチド
であるが、選択したハイブリダイゼーション条件下、ＲＮＡまたはＤＮＡを阻害
する。当業者ならば、当分野に既知の方法を用い、標的に所望によりハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドの特徴を実験的に決定し、非側異的な阻害ＤＮＡま
たはＲＮＡへのハイブリダイズを最小とする(例えば、上記参照)。通常、非標的
ＲＮＡの過剰のバックグラウンドに存在する標的mＲＮＡの識別に使用するオリ
ゴヌクレオチドプローブの長さは、約８ないし約５０ヌクレオチドの範囲、好ま
しくは約１８、２０、２２または２５ヌクレオチドである。拮抗標的のあまりな
い生化学的アッセイで使用するオリゴヌクレオチドプローブはより短くなり得る
。当分野に既知の方法(例えば、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ)を用い、
オリゴヌクレオチドプローブの配列を、既知の遺伝的データベースにおいて可能
性のある阻害配列と相互に関係せず、類似しないように、選択し得る。オリゴヌ
クレオチドプローブによるＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションが可能な
ハイブリダイゼーション条件の選択が、当分野に認識される方法を用い、決定す
ることができる(例えば、上記参照)。例えば、標的ＲＮＡ[例えば、マルチウェ
ルマイクロタイタープレート(例えば、９６または３８４またはそれ以上のウェ
ル)のウェルのような任意の容器において、組織または増殖細胞から抽出した全
ＲＮＡまたはmＲＮＡ(および所望により目的の試薬で処理した)]を、６ＸＳＳＰ
Ｅ-Ｔまたは他の緩衝液中、オリゴヌクレオチドプローブアレイを含む試験領域
に添加し得(上記参照)、所望により、非特異的結合(例えば、破砕したニシンま
たはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、約０.５mg/ml)を減少させる試薬を含
み、約１０分ないし少なくとも１８時間(好ましい実施態様では、約３時間)の範
囲の時間、経験的に決めた温度でインキュベーションする。ハイブリダイゼーシ
ョンするストリンジェンシーは、アンカー-特異的なリンカー部分にアンカーを
結合させるのに用いるストリンジェンシーと同一か、またはそれよりも弱い。他
の型のプローブの設計および使用はまた、例えば、上記考察したように当分野に
通常である。
【００３７】 アンカー-特異的および標的-特異的なリンカーの部分を、任意の様々の共有的
または非共有的結合により、結合(join, attach, link)し得、その性質は本発明
の本質ではない。２つの部分を直接、または中間分子を介して連結し得る。リン
カーの両方の部分がオリゴヌクレオチドである、ある実施態様では、ホスホジエ
ステル結合のように共有結合し得、単一の、同一線上の核酸を形成する。アンカ
ー-特異的な部分がオリゴヌクレオチドであり、標的-特異的な部分がレセプター
、例えばレセプタータンパク質である他の実施態様では、２つの部分はビオチン
およびストレプトアビジン分子の相互作用を介して結合し得、その例を図３に示
す。多種のその連結は既知である(例えば、Ｎiemeyer et al (１９９４). ＮＡ
Ｒ ２２, ５５３０-５５３９)。他に、２つの部分が直接結合し得、例えばオリ
ゴヌクレオチドがアミド化され、次いでアミド結合を介してペプチドまたはタン
パク質に直接結合(例えば架橋)するか、またはアミド結合または脂質結合を介し
て膜成分に結合し得る。その共有結合または非共有結合を形成する方法は通常で
あり、当業者により容易に最適化される。
【００３８】 ２つの物質が結合(例えば、２つの核酸、２つのタンパク質、タンパク質プラ
ス核酸または他のもののインキュベーションにより)し、複合体(例えばアンカー
/リンカー複合体のような)を形成した後、生成した複合体を所望により処理(例
えば、洗浄)し、特異的相互作用未処理物を残すが、非特異的結合物質を取り除
くように実験的に決定した条件を用い、非結合物質(例えば、リンカー)を取り除
く。例えば、反応混合物を、１回ないし約１０回またはそれ以上、複合体(例え
ば、アンカー/リンカー複合体)の達成に使用する条件と同じか、それより幾らか
高ストリンジェンシーである条件下で洗浄し得る。
【００３９】 本発明の組合せは、通常の技術を用い通常通り製造され得る。
【００４０】 本発明に使用し得る幾つかの表面は、商業上の提供者より容易に利用できる。
好ましい実施態様では、表面は、Ｃorning Ｃosterにより販売されている修飾プ
レートのような９６-、３８４-または１５３６-ウェルマイクロタイタープレー
トである。他に、表面はウェルを含み、次いで、へこみまたは“くぼみ”を含み
、アルミニウムまたはスチールのようなミクロ機械加工物質により形成され、モ
ールドを調製し、次いで、プラスチックまたは同様の物質をモールドにミクロ注
入し、図４に示すような構造を形成する。他に、図４に示すような構造には、ガ
ラス、プラスチック、セラミックなどが含まれ、例えば、図５に示されるような
３つの切片からアセンブリされ得る；ウェル仕切り(図５a)と呼ぶ第１の部分は
サンプルウェル間の分離を形成する；サブディバイダー(subdivider)(図５b)と
呼ぶ第２の部分は各試験ウェル内に再分割またはくぼみを形成する；そして、基
盤(図５c)と呼ぶ３つ目の部分はプレートの基盤および試験ウェルの下側表面を
形成する。例えば、仕切りは、金属、例えばシリコンの切片であり、それを通る
穴があり、それぞれの穴は、３つの切片が結合するとき試験ウェルの壁を形成す
る。サブディバイダーは、例えば、薄い金属片、例えば、シリコンであり、スク
リーンまたは良好な網の形をしている。基盤は、金属、例えばガラスの平坦切片
であり、例えば、生物化学アッセイに用いる典型的なマイクロプレートの下側部
分の形となる。基盤の上側表面は、図５cに示すように平坦であるか、またはサ
ブディバイダー型で配置されるへこみを形成し得、各サンプルウェル内に完全な
再分割、またはウェルを提供する。３つの切片は標準的な方法、例えばシリコン
ウェハーのアセンブリを用いる方法により結合され得る。
【００４１】 オリゴヌクレオチドアンカー、リンカー部分、またはディテクターは、通常の
技術、例えば、商業上のオリゴヌクレオチド合成機により、および/または合成
されるサブフラグメントに連結することにより、合成され得る。本発明のある実
施態様では、オリゴヌクレオチドアンカーのような実施する核酸アンカーの位置
を定め得、それは、試験領域の表面上または表面内であり、ホトリトグラフまた
はシルクスクリーン化学結合、インクジェット技術による配置、キャピラリー、
スクリーンまたは液体チャンネルチップ、電極アレイを用いる電気化学的パター
ニング、ピンまたはクウィルとの接触、またはフィルターの加熱またはＵＶ照射
後の変性を含む、任意の様々な通常の技術による(例えば、Ｒava et al (１９９
６) 米国特許番号５,５４５,５３１;Ｆodor et al (１９９６) 米国特許番号５,
５１０,２７０;Ｚanzucchi et al (１９９７) 米国特許番号５,６４３,７３８;
Ｂrennan (１９９５) 米国特許番号５,４７４,７９６;ＰＣＴ ＷＯ ９２/１００
９２; ＰＣＴ ＷＯ ９０/１５０７０参照)。アンカーを試験領域の表面の上部に
置くか、または例えば、表面から幾つかのアンカーを突き出す形態の表面内には
め込まれたポリアクリルアミドゲルパッドの場合であり、リンカーとの相互作用
が可能となる。好ましい実施態様では、実施したオリゴヌクレオチドアンカーは
、遊離アミノ基を有する５'末端で誘導される；５０mＭ リン酸緩衝液 pＨ８.５
および１mＭ ＥＤＴＡのような緩衝液中、経験的に決定された濃度で溶解する；
そして、Ｐixus nanojet dispenser(Ｃartesian Ｔechnologies)で、約１０.４
ナノリッターの小滴で、上側表面が新しい乾燥ＤＮＡ Ｂind plate(Ｃorning Ｃ
ostar)である試験ウェル内の特定位置に分配する。オリゴヌクレオチド結合およ
び蒸発の相対的な速さに応じて、調製の際にウェルの湿度を調整する必要がある
。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドアンカーは、試験領域の表面上に、例
えば、伸張するオリゴヌクレオチド鎖の光活性化脱保護のような通常の方法を用
い、直接合成され得るか、または、ナノジェットディスペンサーを用い、不活性
化化合物のナノリッター小滴のパターン化した分配により、合成され得る。例え
ば、単一ヌクレオチドを受けるすべての伸張配列の脱保護が行われ得、次いで、
ヌクレオチドを表面に加える。
【００４２】 ペプチド、タンパク質、レクチン、キレート化実施態様、プラスチックおよび
他の型のアンカーまたはリンカー部分もまた通常通り作成され得、アンカーは、
適当に利用できる技術(例えば、Ｆondor et al (１９９６) 米国特許番号５,５
１０,２７０;Ｐirrung et al (１９９２)米国特許番号５,１４３,８５４;Ｚanzu
cchi et al (１９９７)米国特許番号５,６４３,７３８;Ｌowe et al (１９８５)
米国特許番号４,５６２,１５７;Ｎiemeyer et al (１９９４) ＮＡＲ ２２, ５
５３０-５５３９参照)を用い、表面上または表面内に位置が定められ得る。
【００４３】 本発明の幾つかの実施態様では、開示の組合せを、様々なスクリーニング法に
用い、および/またはレベル、活性またはプローブもしくは標的分子構造につい
ての情報を得る。そのアッセイはＭulti Ａrray Ｐlate Ｓcreen(ＭＡＰＳ)法ま
たはアッセイと名付けられ、その表面は、アッセイに使用するアンカーまたはア
ンカープラスアッセイのアレイを含み、ＭＡＰＳまたはＭＡＰＳプレートと名付
けられる。
【００４４】 反応混合物、アッセイ、またはスクリーニング方法の内容は、任意の順序で集
められる。例えば、アンカー、リンカーおよび標的は連続して集められる；また
は、レポーターの存在または非存在下、標的およびリンカーを溶液中に集合させ
、次いで、アンカーと接触させる。本発明のある実施態様は、少なくとも１つの
標的を検出する方法に関係し、 a)当該標的を含むサンプルを、当該標的と当該リンカーとの間の第１のハイブリ
ダイゼーション産物を効率的に得る条件下、オリゴヌクレオチドアンカーに特異
的な第１の部分および当該標的に特異的なプローブを含む第２の部分を含む二官
能性リンカーと接触させること、 b)当該第１のハイブリダイゼーション産物と当該組合せ[当該組合せには、当該
第１のハイブリダイゼーション産物の添加前に、 １)少なくとも２つは実質的に同一な多数の空間的に分離された領域を含む表
面、それぞれの領域に含まれるのが、 ２)少なくとも８種のオリゴヌクレオチドアンカー が含まれる]との間の第２のハイブリダイゼーション産物を効率的に得る条件下
、当該第１のハイブリダイゼ−ション産物を組合せと接触させること、 c)当該第１のハイブリダイゼーション産物または当該第２のハイブリダイゼーシ
ョン産物を標識したディテクタープローブと接触させること、 d)当該検出プローブを検出すること を含む。
【００４５】 以下に記載するアッセイまたは方法のそれぞれを、ハイスループット法で実施
でき、それは、多数のサンプル(例えば、およそ約８６４、１０３６、１５３６
、２０２５またはそれ以上であり、組合せの領域数に依存する)を各プレートま
たは表面上で素早く同時にアッセイする。更に、多くのプレートまたは表面を同
時に処理し得る。例えば、薬物探索の方法では、それぞれは薬物候補(例えば、
様々な小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の物質のような多くのコ
ンビナトリ化学ライブラリー)を含む多くのサンプルを添加し得、既述のように
組合せの領域を分離するか、または生物学的または生化学的サンプルに加え、次
いで、組合せの領域に分けて加え、そして、領域内に位置するプローブアレイと
共にインキュベーションする；ならびにアッセイを各サンプルで行い得る。最近
の高密度マイクロプレートの出現と連続的な発達と共に、デンサーマイクロプレ
ート、ロボット、改善ディスペンサー、精巧な検出システムおよびデータ処理ソ
フトウェアから作成しデータを回収する、レーザー技術のようなＤＮＡスポッテ
ィングツールおよびその方法を用い、１日あたり数千または数万またはそれ以上
の化合物をスクリーニングまたは分析する。
【００４６】 例えば、プローブがオリゴヌクレオチドである実施態様では、アッセイは、遺
伝的変異または欠損の存在する、多数のサンプルの診断核酸またはポリヌクレオ
チドスクリーン(screen)(例えば、結合または他のアッセイ)(例えば、嚢胞性繊
維症のような疾患に付随する多形または特異的変異、例えばＩitia et al (１９
９２) Ｍolecular and Ｃellular Ｐrobes ６, ５０５-５１２)；病原体(細菌、
ウイルスおよび原生動物であり、それらの宿主は動物であり、ヒトまたは植物を
含む)、または特定の生理学的状態または疾患を診断するmＲＮＡ転写パターンで
あり得る。ＥＳＴの部分を含む核酸プローブ(全長コピーを含む)を用い、ＥＳＴ
が誘導される細胞により生じさせる転写パターン(または他のもの)を評価し得る
。核酸プローブはまた、ペプチド、タンパク質、または特定の核酸配列に特異的
に結合するタンパク質ドメインを検出し得る(およびその逆)。
【００４７】 他の実施態様では、本発明の組合せを用い、例えばタンパク質、核酸、小分子
などのような生化学的反応をモニターし得る。例えば、抗原および抗体；レセプ
ター(精製レセプターまたは細胞膜に結合するレセプターのような)およびそれら
のリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト；または酵素(プロテアーゼまた
はキナーゼのような)およびそれらの基質の相互作用の効率または特異性、また
は産物に変換する基質量の増加または減少；ならびに他のものである。その生化
学アッセイを用い、またはスクリーニングアッセイに基づき、プローブまたは標
的の特性解析する。例えば、特定のプロテアーゼの存在するサンプルをスクリー
ニングするため(例えば、血液凝固中に含まれるプロテアーゼＸaおよびＶＩＩa
のようなプロテアーゼ)、サンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブ
は、目的の各プロテアーゼに特異的な蛍光発生物質である。標的プロテアーゼが
基質に結合し、切断するならば、その基質は、通常、切断および２つのエネルギ
ー転位対間の分離の結果として蛍光を発生し、シグナルを検出し得る。他の例で
は、特定のキナーゼの存在するサンプルをスクリーニングするため(例えば、Ｓr
c、チロシンキナーゼ、ＺＡＰ７０)、目的の１つまたはそれ以上のキナーゼを含
むサンプルを組合せにおいてアッセイし、そのプローブは目的の１つのキナーゼ
により選択的にリン酸化し得るペプチドである。当分野において認識される、通
常に決定し得る条件を用い、サンプルを基質のアレイと共に、適当な緩衝液中、
および必要な補因子と共に、実験的に決定された時間、インキュベーションし得
る(幾つかのアッセイでは、例えば、目的のキナーゼの活性を調節する因子の生
化学的研究の場合、各キナーゼの濃度を、各基質が同様の割合でリン酸化される
ように調整し得る)。キナーゼおよび望ましくない反応成分を(所望により)取り
除くための実験的に決定した条件下、各反応を処理(例えば、洗浄)した後、リン
酸化基質は、例えば、蛍光標識抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体(例
えば、約１０nＭ濃度、またはそれ以上、またはそれ未満)のような検出可能試薬
と共にインキュベーションすることにより検出し得、そのシグナルを検出し得る
。他の例では、結合アッセイを行い得る。例えば、ＧＲＢ２ ＳＨ２またはＺＡ
Ｐ７０ ＳＨ２のようなＳＨ２ドメインを、適当なリン酸化ペプチドのプローブ
アレイ上でアッセイし得る；または血清を、免疫欠損の特定レセプターのプロー
ブアレイ上でスクリーニングし得る。また、酵素連結アッセイをアレイ型で実施
し得る。本発明の組合せもまた用い得、野生型対照物よりも活性が高いかまたは
低い変異酵素を検出し得るか、または除草剤または農薬を含む様々な試薬をスク
リーニングし得る。
【００４８】 もちろん、ＭＡＰＳアッセイを用い、サンプル中の活性標的の量を定量(測定
、量の測定)する。ただし、プローブは十分に占有されず、すなわち、利用可能
なプローブ部位の約９０％以上が標的と結合(または反応またはハイブリダイズ)
しない。これら条件下、より多い標的の保有により、より多いプローブの結合を
保有する結果となるため、標的を定量し得る。他方で、約９０％以上の利用可能
なプローブ部位が結合する条件下、より多い標的の保有の存在により、プローブ
に結合する標的の量は実質的には増加しない。任意の前記の型の標的をこの方法
により定量し得る。例えば、実施例６はオリゴヌクレオチド標的の定量について
記載する。更に、標的が過剰に存在する場合(例えば、それが多量に存在し、Ｍ
ＡＰＳプローブアレイ中の利用可能なプローブの量が飽和となる場合)、結合混
合物に標識していない標的を既知量加えることにより、その多量の標的を定量す
るため、反応の“感度がシフト”し得る。
【００４９】 他の実施態様では、本発明の組合せを用い、標的および所定のプローブの相互
作用を修飾する試薬をスクリーニングし得る。プローブ、標的または標的プラス
プローブにより形成される複合体の何れかと直接または間接的に相互作用するこ
とにより、試薬が標的/プローブ相互作用を修飾し得る。修飾により、様々な型
が形成され、プローブに対する標的の結合親和性の増加もしくは減少、標的およ
びプローブが結合する割合の増加もしくは減少、標的に対するプローブの結合の
拮抗的または非拮抗的阻害、またはある場合にはプローブ/標的相互作用を増加
もしくは減少するプローブもしくは標的の活性の増加もしくは減少が含まれるが
、これらに限らない。その試薬は人工または自然に生ずる物質であり得る。また
、その試薬を、不変化の状態で、または他の種類との集合体として用い得る；お
よびそれらを、結合要素(binding member)と共有結合的にまたは非共有結合的に
、直接かまたは特定の結合物質を介して結合し得る。例えば、可能性ある“血液
シンナー”、または血液凝固の原因となるプロテーゼの１つのカスケードと相互
に作用する試薬を同定するために、目的のプロテアーゼのカクテルを、多量の候
補試薬で試験し得、次いで、上記のように活性を試験し得る。本発明により用い
られ得る試薬の他の例は非常に多様であり、除草剤および農薬を含む。実施例１
６および１７は、特定のキナーゼを選択的に阻害する試薬、またはＳＨ２ドメイ
ンとリン酸化ペプチドの間の相互作用の選択的阻害剤のためのハイスループット
アッセイについて記載する。
【００５０】 他の態様において、本発明の組合わせは、遺伝子発現のパターンを調節できる
試薬のスクリーニングに使用できる。オリゴヌクレオチドのアレイは、例えば、
その一連の遺伝子からの発現のパターンが特定の生理学的状態または発育段階、
または疾病状態と相関しているmＲＮＡ種の同定に使用できる(“相関”遺伝子、
ＲＮＡ、または発現パターン)。“相関的”または“相関”なる用語は、ＲＮＡ
の合成パターンが、細胞の生理学的状態に関連するが、所定のＲＮＡの発現が必
ずしも特定の生理学的状態を担うか、それをもたらさないことを意味する。例え
ば、mＲＮＡの小サブセットは、特定の疾病状態のモデルとして働く細胞の発現
、アップコンバート／ダウンコンバートにより同定される；病理学的表現型を示
さない、この正常細胞と比較して変えられた発現のパターンは、これらの疾病状
態の指標として働くことができる(“指標”遺伝子、ＲＮＡ、または発現パター
ン)。“相関的”および“指標”は交換可能に使用できる。例えば、ホルボール
ミリステートのような腫瘍促進剤で処理した細胞は、腫瘍生育の初期段階に見ら
れるものを模倣した遺伝子発現のパターンを発現し得る。癌の他のモデルにおい
て、マウスインスリノーマ細胞(例えば、細胞系ＴＧＰ６１)は、アデノウイルス
に感染したとき、例えば、c-ＪunおよびＭＩＰ-２の発現の増加を示すが、一方
ＧＡＰＤＨおよびＬ３２のようなハウスキーピング遺伝子の発現は実質的に影響
されないままである。
【００５１】 疾病モデルの細胞と接触した後、直接的または間接的に、そしてインビボまた
はインビトロ(例えば、組織培養において)で、指標発現パターンを変える試薬は
、疾病に罹患している生物(例えば、ヒトまたは他の動物種、または植物)の治療
薬または薬として作用し得る。薬剤は、また、核酸と接触させて、直接、例えば
、インビトロ(試験管)発現系で発現パターンを調節できる。本明細書で使用する
限り、“調節”なる用語は測定可能な反応に関与する分子などの量および／また
は活性の増加または減少をもたらすことを意味する。本発明の組合わせは、この
ような薬剤のスクリーニングに使用できる。例えば、一連の細胞(例えば、疾病
モデル由来)を、一連の薬剤と(例えば、約１０分から約４８時間またはそれ以上
の時間)接触させ、慣用的な、当分野で既知の方法(例えば、商品として入手可能
なキット)を使用して、全ＲＮＡまたはmＲＮＡ抽出物を製造できる。ＲＮＡの量
の増幅が望ましい場合、ＲＴ−ＰＣＲ増幅のような標準法(例えば、Ｉnnis et a
l.編, (１９９６) ＰＣＲ Ｐrotocols: Ａ Ｇuide to Ｍethods in Ａmplificat
ion, Ａcademic Ｐress, Ｎew Ｙork参照)を使用できる。抽出物(またはこれら
の増幅産物)を、適当な指標ＲＮＡのプローブを含む多くの実質的に同一のアレ
イと接触(例えば、それとインキュベート)させ、指標発現パターンの変化に関連
するこれらの薬剤を同定できる。実施例１５は疾病状態と相関する遺伝子の発現
を変え得る化合物のスクリーニングのためのハイスループットアッセイを記載す
る。
【００５２】 同様に、特定の生理学的状態または発育段階に関連する薬剤が同定できる。こ
のような薬剤は、人工または天然に存在する物質であり、胚発育または生理学的
反応の調節に関連する物質、または農薬または除草剤のような農業で重要な物質
のような環境因子を含む。また、このような薬剤はその非変化状態でまたは他の
種との凝集で用いることができる；そして、それらを結合メンバーに、直接また
は特異的結合物質を介して、共有結合的にまたは非共有結合的に結合できる。
【００５３】 本発明の他の態様は a)多分離領域を含み、少なくともその二つが実質的に同一であり、各々の領域が
少なくとも８個の異なるアンカー(オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載
の他のタイプ)を含むものである表面、そして b)該アンカーの少なくとも一部に特異的な第１部分および該標的の少なくとも一
つに特異的なプローブを含む第２部分を有する、少なくとも一つの２官能性リン
カー分子を含む容器 を含む、サンプル中の少なくとも一つの標的の検出に有用なキットである。
【００５４】 一つの態様において、上記a)のような表面および該アンカーの少なくとも一部
に特異的な第１部分および該標的の少なくとも一つに特異的なプローブを含む第
２部分を有する２官能性リンカー分子を結合するために一連の指示書が提供され
る。指示書は、例えば(しかしこれに限定されない)、表面上の各々のアンカーの
記載、いくつのアンカーがあるか、そしてそれらが表面のどこに位置するか、お
よび特異的にリンカーをアンカーに結合(会合、結合等)させるプロトコールを含
むことができる。例えば、アンカーがオリゴヌクレオチドである場合、指示書は
各アンカーの配列を含むことができ、そこから、実施者がアンカーと特異的に相
互作用(例えば、ハイブリダイズ)するリンカーの相補的アンカー特異的分子を設
計できる；アンカーがペプチドである場合、指示書は、例えば、ペプチドと億位
的に作用する抗体に関する情報を伝達できる。指示書は、アンカーおよびリンカ
ーが会合するプロトコール、例えば、インキュベーション温度および時間、非会
合分子の除去(例えば、洗浄)のための条件および試薬等のハイブリダイゼーショ
ン(または他のタイプの会合)の条件および試薬を含み得る。更に、指示書は、本
明細書に記載の任意のタイプのコントロールリンカーの構築および使用における
情報、および組合わせで行う定量、標準化、“微調整”または較正アッセイの方
法における情報を含むことができる。指示書は、本明細書に記載のパラメーター
、条件または態様を包含でき、その全て当業者により慣用的に、慣用法で行うこ
とができる。
【００５５】 本明細書の他の箇所で述べたように、アンカーの所定のアレイを含む本発明の
表面に広範な型のリンカーを付着せしめて、広範なプローブアレイのいずれかを
プログラミングできる。さらに、本発明の表面から所定の組のリンカーを離脱せ
しめ、表面に他の組のリンカーを付着せしめて、所定の表面を何回も再利用する
ことが可能となる。この柔軟性および再利用性は本発明の別の利点である。
【００５６】 他の態様において、本発明の組合わせを用いて、ＥＳＴ(発現配列タグ)を位置
付けできる。すなわち、ＭＡＰＳアッセイを用いて、ＥＳＴ群のどれが同じ遺伝
子の異なる(または部分的に重なる)部分からつくられたか、またはどれが非反復
かを(これらが存在すれば)決定できる。図１８、１９、２０、２１は、このよう
なアッセイを示す。この例において、アッセイで１６のＥＳＴのどれが共通遺伝
子に“結合”しているかを(これが存在すれば)決定する。アッセイの第１工程(
参照、図１８)ではアレイが集合され、位置付けしようとする各ＥＳＴが、その
対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブにより提示される。位置
付けしようとするＥＳＴの数に等しい(または多い)数のアレイが表面の単離領域
(例えば、ウェル)に分散している。表示例において、組合わせの表面は１６のウ
ェルを含み、各ウェルが１６種のＥＳＴ特異的オリゴヌクレオチド、番号１-１
６、を含有する。ＥＳＴに“対応する”(ＥＳＴ“特異的”な)オリゴヌクレオチ
ドとは、１つのＥＳＴに十分に相補的であって、選択されたストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件で、そのＥＳＴに特異的にハイブリダイズし、他の
非関連ＥＳＴとはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドである。この型のＥ
ＳＴ対応オリゴヌクレオチドが特異的に(最適の条件下で)結合できるのは、ＥＳ
Ｔを本来生成した遺伝子から合成されたcＤＮＡのコード鎖または非コード鎖、
またはＥＳＴを本来生成した遺伝子から合成されたmＲＮＡである。オリゴヌク
レオチドの設計で考慮されるべき要因および特異的ハイブリダイゼーションをな
すための最適化ハイブリダイゼーションパラメーターについては、本明細書の別
の箇所で述べる。
【００５７】 アレイを集合するために、リンカー分子を調製する。各リンカー分子は、一般
的アレイの１アンカーに特異的な部分に加えて、位置付けしようとするＥＳＴの
１つに対応するオリゴヌクレオチドプローブ含有の部分を含む。リンカーのアン
カーへの付着については、本明細書の他の箇所で述べる。次の工程において、核
酸混合物(例えば、mＲＮＡ、または１本鎖または変性cＤＮＡ)を含有するサンプ
ルのアリコートをプローブアレイを含む各領域(ウェル)に加える。核酸混合物は
、１以上のオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含有し得る。次いで、
混合物を通常の最適条件でインキュベートすると、核酸が相補的なプローブに結
合する。いくつかのＥＳＴ特異的プローブが１本鎖核酸の異なる部分に相補的で
ある場合、核酸は、これらのプローブの１つが位置するアレイの各位置に結合す
る。
【００５８】 次の工程において、別個のディテクターオリゴヌクレオチド(表示例ではディ
テクター＃１-１６)を各領域(ウェル)に加える(参照、図１９)。ディテクターオ
リゴヌクレオチドの設計は、位置付けしようとする各ＥＳＴについて行う。各Ｅ
ＳＴ特異的ディテクターがＥＳＴの異なる(少なくとも部分的には非重複の)部分
に対応するのは、プローブオリゴヌクレオチドが対応するのよりも大きいので、
プローブとディテクターの各オリゴヌクレオチドは互いに干渉しない。例えば、
図２１に表すＥＳＴは、図１８-２０のＥＳＴ１、２および６に対応する。図２
１に表示するように、ＥＳＴ＃１および２の両者は遺伝子Ｘから得られ(両者に
“結合”している)、一方、ＥＳＴ＃６は別の非関連遺伝子から得られた。mＲＮ
Ａ混合物含有のサンプルのアリコートが遺伝子Ｘからつくられた混合物を含み、
それを図１８-２０に示すプローブアレイとインキュベートしたとき、遺伝子Ｘm
ＲＮＡは、最適条件において、プローブ１および２を持つ位置でハイブリダイズ
するが、プローブ６を持つ位置ではハイブリダイズしない。(もちろん、各mＲＮ
Ａは、そのハイブリダイズできるプローブの量以上の分子過剰で加えねはならな
い)。ディテクターオリゴヌクレオチド１を領域(ウェル)１に加えた場合、この
オリゴヌクレオチドは、プローブアレイの位置１および２で結合した遺伝子Ｘm
ＲＮＡとハイブリダイズするが、位置６のものとはしない。同様に、ディテクタ
ーオリゴヌクレオチド２を別のウェル、例えばウェル＃２に加えると、このオリ
ゴヌクレオチドは位置１および２で結合するが、位置６ではしない。このように
して、どのＥＳＴが結合するのか、すなわち同じ遺伝子の部分をコードするのか
、どのＥＳＴが非反復であるのか、を決定できる。
【００５９】 図２０に示す仮定的例において、最初の３つのＥＳＴは同じ遺伝子の部分をコ
ードし、最後の５つのＥＳＴは他の遺伝子の部分をコードし、残りのＥＳＴは結
合されないようである。ハイブリダイゼーション条件、最適洗浄工程、検出方法
などについては、ＭＡＰＳアッセイに関する本明細書の他の箇所で述べる。ＭＡ
ＰＳアッセイにより得た結合データを確認するためには、ＰＣＲ反応を行い、セ
ンスおよびアンチセンスプライマーとして対のＥＳＴ特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いる。各対の結合ＥＳＴがＰＣＲ産物を産生する。この対的ＰＣＲ
試験によって、結合ＭＡＰＳアッセイを用いずに直接的に結合を調べることがで
きる。しかし、多数の反応を必要とするかも知れないし、また、各ＥＳＴプライ
マーをセンスおよびアンチ両方の鎖として合成しなければならないかも知れない
。表示例では、１８０の反応を必要とするであろう。
【００６０】 １つの態様において、本発明は、複数のＥＳＴのどれが所定の核酸に相補的で
あるかを決定する方法であって、下記の事項を含む。 a)オリゴヌクレオチドプローブ(この少なくとも１つは該ＥＳＴの各々に対応
する)の固定化アレイを、該所定の核酸を含有し得る試験サンプルとインキュベ
ートし、該オリゴヌクレオチドプローブと該核酸とのハイブリダイゼーション産
物を得る、 b)該ハイブリダイゼーション産物をディテクターオリゴヌクレオチド(該オリ
ゴヌクレオチドの１つが対応するＥＳＴに対応するが、ＥＳＴの異なる部分に対
して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的である)とインキュベートし、 c)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレ
オチドにより標識されたかを検出する。
【００６１】 なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 １)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一
の領域をもつ表面を含み、各領域が、 ２)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アン
カーが、 ３)アンカーに特異的な第１部分、および少なくとも１つの該ＥＳＴに対応す
るオリゴヌクレオチドプローブを含む第２部分を有する２官能的リンカーと結合
している。
【００６２】 他の態様において、本発明は上記のような方法に関し、ただ、１以上の該ＥＳ
Ｔが該核酸に相補的であり得、かつ該ＥＳＴの各々が２の異なるオリゴヌクレオ
チド配列を含み、その第１は該ＥＳＴに対応するオリゴヌクレオチドプローブで
あり、その第２は概ＥＳＴに対応するディテクターオリゴヌクレオチドであり、
下記事項を含む。
【００６３】 a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも１つの領域に接触せしめ
、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも１つは該Ｅ
ＳＴの各々に対応する)のアレイを含み、 b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を
、該核酸部分に相補的な該ＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブに結合せしめ
、 c)１以上の該ＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該核酸分子を
含む概領域を、該アレイの所定の１つのオリゴヌクレオチドプローブが対応する
ＥＳＴに対応するディテクターオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、
それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定のオリゴヌクレオチド
プローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチドプローブに結合してい
る核酸分子に結合せしめ、 d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイ
のどのＥＳＴ対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌクレオチド
ＥＳＴ対応プローブに結合する核酸の部分に相補的であるかを検出し、それによ
ってどのＥＳＴが該所定の核酸に相補的かを同定する。
【００６４】 なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 １)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一
の領域をもつ表面を含み、各領域が、 ２)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、異なるアンカーを含み、各アン
カーが、 ３)アンカーに特異的な第１部分、および少なくとも１つの該ＥＳＴに対応す
るオリゴヌクレオチドプローブを含む第２部分を有する２官能的リンカーと結合
している。
【００６５】 ＥＳＴ位置付けアッセイの成分は、いかなる順序でも集合せしめ得る。例えば
、アンカー、リンカーおよびＥＳＴを順次集合せしめ得る。あるいは、リンカー
およびＥＳＴをレポーターの存在または不存在で溶液中で集合せしめ、次いでア
ンカーに加える。
【００６６】 別の態様において、本発明は、複数のどのＥＳＴが所定の核酸に相補的かを決
定する方法に関し、下記の事項を含む。 a)２官能的オリゴヌクレオチドリンカー分子の総合体(その各々が、少なくと
も１つの該ＥＳＴに対応するプローブである第１部分、およびアンカーオリゴヌ
クレオチドに特異的な第２部分を含む)を、該所定の核酸を含有し得る試験サン
プルとインキュベートして、該オリゴヌクレオチドと該核酸との第１ハイブリダ
イゼーション産物を得、 b)該第１ハイブリダイゼーション産物をアンカーオリゴヌクレオチド(各アン
カーオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの該リンカー分子のアンカー特異的部
分に対応している)の固定化アレイとインキュベートして、該アンカー、該オリ
ゴヌクレオチドプローブおよび該核酸を含む第２ハイブリダイゼーション産物を
形成し、 c)該第１または該第２のいずれかのハイブリダイゼーション産物をディテクタ
ーオリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドの１つが対応するＥＳＴに対応す
るが、ＥＳＴの異なる部分に対して該オリゴヌクレオチドプローブよりも特異的
である)とインキュベートし、 d)該アレイのどのオリゴヌクレオチドプローブが該ディテクターオリゴヌクレ
オチドにより標識されたかを検出する。
【００６７】 なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 １)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、空間的に分離され実質的に同一
の領域をもつ表面を含み、各領域が、 ２)調べようとするＥＳＴの数に等しい数の、異なるアンカーを含む。
【００６８】 勿論、ＥＳＴを位置付けするための上記方法は、試験配列(例えば、ポリヌク
レオチド)を目的の任意の核酸中へ位置付けするのに使用できる。例えば、１以
上のクローン化ＤＮＡフラグメントまたはcＤＮＡが同じゲノムＤＮＡに位置付
けされるかを調べることができる。このような方法が役立ち得るのは、例えば、
長い複雑な遺伝子の構造的解明おいてである。同様に、１以上の継ぎ合わせた配
列またはコード配列が同じゲノムＤＮＡに位置付けされるかを調べることができ
る。このような検査をなし得るのは、例えば、診断試験においてであって、分化
スプライシングパターンを特徴とする正常状態と疾患状態とを識別する。位置付
け方法の他の多くの適用については、当業者に明かであろう。
【００６９】 他の態様において、本発明は、複数のポリヌクレオチドのどれが所定の核酸に
相補的てあるかを決定する方法に関し、 なお、１以上の該ポリヌクレオチドが該核酸に相補的であり得、かつ該ポリヌ
クレオチドの各々が２の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、その第１は該ポ
リヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチドプローブであり、その第２は該ポ
リヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドであり、下記事項を
含む。 a)該核酸分子を含むサンプルを組合わせの少なくとも１つの領域に接触せしめ
、なお、該領域はオリゴヌクレオチドプローブ(そのうち少なくとも１つは該ポ
リヌクレオチドの各々に対応する)のアレイを含み、 b)該サンプルを該領域とともにインキュベートし、それによって該核酸分子を
、該核酸部分に相補的な該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに
結合せしめ、 c)１以上の該ポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブに結合した該
核酸分子を含む該領域を、該アレイの所定の１つのオリゴヌクレオチドプローブ
が対応するポリヌクレオチドに対応するディテクターオリゴヌクレオチドととも
にインキュベートし、それによってディテクターオリゴヌクレオチドを、該所定
のオリゴヌクレオチドプローブまたは該核酸に相補的な他のオリゴヌクレオチド
プローブに結合している核酸分子に結合せしめ、 d)該ディテクターオリゴヌクレオチドの存在を検出し、それによって該アレイ
のどのポリヌクレオチド対応オリゴヌクレオチドプローブが、該所定のオリゴヌ
クレオチドポリヌクレオチド対応プローブに結合する核酸の部分に相補的である
かを検出し、それによってどのポリヌクレオチドが該所定の核酸に相補的かを同
定する。
【００７０】 なお、オリゴヌクレオチドプローブの該アレイは組合わせの領域上に固定化さ
れている。該組合わせは下記を含む。 １)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、空間的に分離され実
質的に同一の領域をもつ表面を含み、各領域が、 ２)調べようとするポリヌクレオチドの数に等しい数の、異なるアンカーを含
み、各アンカーが、 ３)アンカーに特異的な第１部分、および少なくとも１つの該ポリヌクレオチ
ドに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含む第２部分を有する２官能的リン
カーと結合している。
【００７１】 本発明の別の態様において、ＥＳＴなどのポリヌクレオチドを位置付けする上
記方法は、１以上の工程間でサンプルの非結合部分を離脱せしめることをさらに
含む。 本発明の別の具体的態様において、目的の１以上のＲＮＡ標的(例えば、mＲＮ
Ａや他の型のＲＮＡ)を逆転写酵素によってcＤＮＡに変え、このcＤＮＡをプロ
ーブアレイにハイブリダイズする。この型のアッセイは図８に模式的に示した。
ＲＮＡ抽出物(または精製mＲＮＡ)を本明細書で述べるように細胞または組織か
ら調製する。次いで、逆転写酵素および目的のＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオ
チドプライマーをＲＮＡサンプルに加え、技術分野で認識の条件および手法(日
常的に決定および最適化できる)を用いて、cＤＮＡの第１鎖をつくる。用語“特
異的”プライマーは、目的のmＲＮＡに十分相補的であって、それに選択したス
トリジェントなハイブリダイゼーション条件で結合し、逆転写酵素で認識される
が、望ましくない核酸と結合しないものを意味する(特異的ハイブリダイゼーシ
ョンが達成される適当な反応条件については、上記の記述を参照)。残りのＲＮ
Ａ-特異的プライマーにより認識されなかったmＲＮＡ、および／またはＲＮＡ抽
出物中の他の型の汚染性ＲＮＡ、例えばtＲＮＡまたはrＲＮＡ-は、種々のリボ
ヌクレアーゼのいずれかにより、またはアルカリ処理などの化学的方法により除
去でき、１本鎖cＤＮＡが残り、これをＭＡＰＳプローブアレイと接触せしめる
。この方法で逆転写酵素を用いると、ＲＮＡを多量に取り扱う必要を最低にする
。ＲＮＡはヌクレアーゼによる変性に感受性であり、したがって扱いが難しい。
さらに、特異的逆転写酵素プライマーにより生じた追加の特異性がアッセイに対
する追加層の特異性をもたらす。
【００７２】 選択的に、上記のcＤＮＡをプローブアレイとのハイブリダイゼーションの前
に増幅して、シグナルの長さを増すことができる。上記のオリゴヌクレオチド逆
転写プライマーは、その５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼ(例えば、Ｔ７、Ｔ３
またはＳＰ２ポリメラーゼなど)の開始部位を特定する配列(約２２-２７ヌクレ
オチド長であり得る)を含み得る。図８に示す例においては、Ｔ７プロモーター
配列が逆転写酵素プライマーに加えられている。ポリメラーゼ認識部位はcＤＮ
Ａ中に組込まれて、適当なＲＮＡポリメラーゼによる多領域の転写(インビトロ
転写またはＩＶＴ)についての認識部位として働き得る。選択的に、このように
つくられたmＲＮＡを、ＰＣＲおよび適当なプライマーを用いて、増幅でき、ま
たはcＤＮＡ自体を増幅できる。転写およびＰＣＲの技法は、日常的に行われて
おり、既知である。
【００７３】 ＰＣＲの柔軟性は、本発明の方法における多くの変法を可能にする。一つの実
施態様において、標的の増幅に使用する１個または両方のＰＣＲプライマーは、
得られるＰＣＲ産物が、特異的または非特異的に、固体支持体に結合するのを可
能にする。このような化学修飾は、例えば、コースターＤＮＡ結合プレート(例
えば、Ｎ−オキシスクシンイミドエステルで修飾された、またはＰierce, Ｒock
ford, ＩＬのＰeacti-Ｂindプレートのようなマレイン酸無水物被覆プレート)の
ような表面に結合をさせる５'アミド化を含む。化学修飾を含むオリゴヌクレオ
チドを産生させる方法は、当分野で通常であり、慣用である。このような修飾プ
ライマーを含むＰＣＲ生産物は、固体支持体、例えば、マイクロタイターウェル
の内壁、ビーズ(例えば、非磁気または磁気ビーズ)を含む任意の支持体、または
本明細書に記載の任意のタイプの表面に結合できる。もちろん、ＰＣＲプライマ
ーはまたＰＣＲ反応を会しする前に支持体に結合できる。ＰＣＲの数回のサイク
ルを、洗浄無しで、しかし過剰の結合プライマーでででき、得られたＰＣＲ産物
は支持体に結合したままである。増幅標的配列の支持体への結合は、標的の、ア
ンカーおよび／またはリンカーを含む表面に接触(例えば、ハイブリダイズ)する
前、または接触したの後に促進でき、次いでそのような表面から遊離される。他
の実施態様において、標的の増幅に使用した１個または両方のＰＣＲプライマー
は、１個以上の制限酵素部位を含み得、目的の標的配列の末端またはフランキン
グの隣に制限部位を挿入することを可能にする。制限部位はＰＣＲにより、それ
がアンカーおよび／またはリンカーを含む表面に接触(例えば、ハイブリダイズ)
する前または後に増幅した標的に添加できる。この方法で挿入した制限部位は、
例えば、標的配列にフランキングなクローニング部位を提供することにより、増
幅した標的のクローニングを促進する。例えば、１個以上の制限部位を、ＰＣＲ
プライマーにおいて標的特異的配列と支持体への結合をさせる化学修飾の間に置
くことがでる。標的を、修飾ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅させ、そし
て化学修飾を介して支持体に結合させた後、洗浄し、次いで標的配列に隣接した
制限部位を開裂させ、それにより洗浄標的を遊離できる。例えば、図２３参照。
【００７４】 もちろん、制限酵素部位以外の開裂可能部位、例えば、特異的プロテアーゼに
より開裂できるペプチド、または物理的、化学的または他の手段により開裂およ
び／または放出される他の要素を上記の方法に使用できる。 他の実施態様において、標的の増幅に使用した１個または両方のＰＣＲプライ
マーは、例えば、標的特異的レポーターまたは検出リンカーに特異的な配列(標
的に存在する必要なない)を含み得る。
【００７５】 もちろん、上記のプライマー修飾を、任意の望ましい組合わせにおいて共に使
用でき、アッセイの任意の段階で増幅した生産物に添加できる。実施例２１およ
び２２は、上記のプライマー修飾の幾つかが増幅標的に取り込まれたプロトコー
ルを証明する。
【００７６】 上記の方法においてmＲＮＡを逆転写酵素でcＤＮＡに転換し、および／または
ＰＣＲにより増幅し、ＭＡＰＳプレート上のアッセイにかけるが、この方法は、
上記のＲＮＡに基づくすべてのアッセイについての標準ＭＡＰＳアッセイ法の代
わりに用いることができる。
【００７７】 本発明の他の具体的態様において、目的の１以上の核酸標的を特異的ポリヌク
レオチド保護フラグメントにハイブリダイズし、ヌクレアーゼ保護処置を行う。
目的の標的にハイブリダイズした保護フラグメントをＭＡＰＳプレートでアッセ
イした。目的の標的がＲＮＡであり、保護フラグメントがＤＮＡであると、ヌク
レアーゼ保護／ＭＡＰＳアッセイ(ＮＰＡ-ＭＡＰＳ)がＲＮＡを多量に取り扱う
必要を最低にできる。ＲＮＡはヌクレアーゼによる変性に感受性であり、したが
って扱いが難しい。このようなＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイにおいて、プローブア
レイ中のプローブは、目的の核酸標的と同じ鎖数のオリゴヌクレオチドであり、
標準ＭＡＰＳアッセイなどにおいて、むしろ核酸標的に相補的である。ＮＰＡ-
ＭＡＰＳアッセイの１例を図９に模式的に示す。
【００７８】 ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイにおいて、目的の標的は、すべての核酸、例えば、
ゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡ、m
ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、修飾核酸、合成核酸などであ
り得る。本発明の好ましい具体的態様において、このアッセイが用いられるのは
、組織または細胞のＲＮＡ抽出物中に存在する１以上のmＲＮＡ標的である。目
的の標的を含有するサンプルは、選択されたストリジエント条件(特異的ハイブ
リダイゼーションを達成するのに適当な反応条件については上記参照)で１以上
の特異的保護フラグメントと最初にハイブリダイズせしめる。保護フラグメント
は、ポリヌクレオチドであって、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ(ＰＣＲ産物を含む)、
ＰＮＡ、修飾または置換の核酸であり得て、目的の核酸標的部分に特異的である
。“特異的”保護フラグメントとは、その意図する結合相手と十分に相補的であ
り、選択されたストリジエント条件でそれと結合するが、他の意図していない核
酸とは結合しないポリヌクレオチドを意味する。保護フラグメントは、長さが少
なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは５０から約１００、または完全長のcＤ
ＮＡと同じであり得る。
【００７９】 好ましい具体的態様において、保護フラグメントは１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレ
オチドである。１００以上の標的に特異的である保護フラグメントが１回のハイ
ブリダイゼーション反応に含まれることがある。ハイブリダイゼーション後にサ
ンプルを１以上のヌクレアーゼのカクテルで処理し、実質的にすべての核酸を破
壊する。ただし、目的の核酸にハイブリダイズした保護フラグメント、および(
選択的に)ハイブリダイズし、ヌクレアーゼ保護処理の間にヌクレアーゼ消化か
ら保護された核酸標的部分(二本鎖ハイブリッド中にある)は、別であって破壊さ
れない。例えば、もしサンプルが細胞抽出物を含むと、望まない核酸、例えば、
ゲノムＤＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡ、mＲＮＡなどの目的のもの以外は、この工程
で実質的に破壊される。多様なヌクレアーゼのいずれをも用いることができ、例
えば、膵臓ＲＮＡse、ヤエナリヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮＡseＡ、
リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩなどを含むが、ハイブリダイ
ズされた複合体およびサンプル中の望ましくない核酸の性質に依存する。ＲＮＡ
seＨは、ＤＮＡ保護フラグメントに結合した残留ＲＮＡを消化するのに特異的に
有用である。これらの酵素についての反応条件は、既存の技術でよく知られてお
り、経験的に最適化できる。また、化学的処理もでき、例えば、ＲＮＡのアルカ
リ加水分解である。
【００８０】 必要に応じて、サンプルを周知技術でさらに処理して、不ハイブリダイズ材料
を除去するか、および／または残りの酵素を不活化または除去することができる
(例えば、フェノール抽出、沈降、カラム濾過など)。ハイブリダイゼーション過
程は、ヌクレアーゼ消化および(選択的に)化学的変性が続き、ヌクレアーゼ保護
法と呼ばれる。様々なヌクレアーゼ保護法が報告されている(参照、例えば、Ｌe
e et al (１９８７), Ｍeth. Ｅnzymol. １５２, ６３３-６４８. Ｚinn et al
(１９８３), Ｃell ３４, ８６５-８７９)。ヌクレアーゼ保護処理をしたサンプ
ルは、選択的なヌクレアーゼを不活性化処理をした後、ＭＡＰＳプローブアレイ
と接触せしめ、ＭＡＰＳアッセイの通常の工程を行う。結合保護フラグメントを
標識標的特異的レポーターとのハイブリダイゼーションで、標準的ＭＡＰＳアッ
セイについて本明細書に記載のように検出でき、または保護フラグメント自体を
検出可能な分子で共有結合的または非共有結合的に標識できる。
【００８１】 好ましい具体的態様において、保護フラグメントは、標的特異的レポーターと
のハイブリダイゼーションなどで標識するよりも、直接的に標識する。例えば、
レポーターは保護フラグメントにリガンド-抗リガンド相互反応によって結合す
る。例えば、ストレプトアビジン酵素複合体をビオチン化保護オリゴヌクレオチ
ドに加える。他の実施例において、保護フラグメントを化学的に修飾し(例えば
、ホースラディシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)または蛍光染料の直接結合による
)、この化学的修飾を、保護フラグメントの核酸部分で、またはそれなしで検出
する(例えば、酵素的または化学的処理などによる修飾の開裂後)。上記方法のい
ずれにおいても、保護フラグメントは、対応リンカー分子とハイブリダイズする
前または後に、標識できる。
【００８２】 ヌクレアーゼ保護過程が適切に働くこと、すなわち非ハイブリダイズ核酸が望
むように消化されることを制御するために、１以上の保護フラグメントを設計し
て、過程が適切に作動すればヌクレアーゼにより開裂されるオーバーハング(非
ハイブリダイズ)セグメントを含有せしめる。オーバーハングフラグメントの有
無を相補的標識検出プローブとのハイブリダイゼーションで検出でき、または保
護フラグメントのオーバーハング部分自体を検出可能な分子で共有結合的または
非共有結合的に標識できる。この制御は、サンプルをプローブアッセイと接触せ
しめる前、あるいはＭＡＰＳアッセイ自体の一部として行うことができる。かか
る制御アッセイの例は実施例１５に記載する。勿論、異なる標識を容易に識別で
きるので(例えば、異なる吸収スペクトルの蛍光)、いくつかの異なる標識オリゴ
ヌクレオチドを単一のアッセイに含め得る。さらに、ゲル電気泳動による解析の
ような標準ヌクレアーゼ保護アッセイを、保護フラグメントが期待どおりに進め
られているかを調べるために、アッセイ中に使用できる。
【００８３】 標的の検出後、検出プローブ(例えば、ＨＲＰ−標識)シグナルを除去(例えば
、変性、消滅、停止、抑制、遮断)でき、プレートを洗浄して、次段階を干渉す
る可能性がある残った試薬、薬剤または緩衝液(例えば、変性剤)を除去し、次い
で異なる検出プローブ(例えば、またＨＲＰ−標識)でオーバーハングを検出でき
る。
【００８４】 ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイを用いて、サンプル中の標的量を定量できる。もし
、保護フラグメントが標的に対し非常に分子過剰で加えられ、ハイブリダイゼー
ション反応が完了すると、ヌクレアーゼ保護工程後に残る保護フラグメントの量
はサンプル中にどれほどの標的が存在していたかを示す。このような定量反応の
１例を実施例１２および１３に記載する。 ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイを用いて、標準ＭＡＰＳアッセイを利用する上記の
方法のいずれも行い得る。
【００８５】 好ましい具体的態様において、ポリヌクレオチド保護フラグメントをＭＡＰＳ
プレート上よりも質量分析計で測定する。最も好ましい具体的態様において、ポ
リヌクレオチドのいずれもハイブリダイゼーションまたはヌクレアーゼ消化工程
中に固相表面に結合(付着)される。ハイブリダイゼーション後、保護フラグメン
トを残してハイブリダイズ標的をヌクレアーゼまたは化学処理などにより減成し
、直接比率で、どれほどのフラグメントが標的にハイブリダイズしていたかがわ
かる。あるいは、標的の(１本鎖)ハイブリダイズ部分、またはハイブリダイズ標
的および保護標的から形成された表面を残すように処理し、さらに分析する。分
析すべきサンプルをハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ混合物の残りか
ら分離し(例えば、エタノール沈降、または吸収またはアフィニティクロマトグ
ラフィ-など)、溶出または固定化し、高い情報量のためにループ注入により質量
分析計に入れる。好ましい具体的態様において、分析しようとするサンプル(例
えば、タンパク質フラグメント)を、よく知られた既知技術で、表面に吸着し、
レーザー照射により解析する。最も高感度のためには、フーリエ変換質量分析法
(ＦＴＭＳ)(または他の類似の高度な技法)用いることができ、フェムトモル以下
の各保護フラグメントを検出できる。
【００８６】 一つ(またはそれ以上)のサンプルで検出する保護フラグメントは、使用するマ
ススペクトロメーターに関して独得なシグナルを与えるように設計できる。一つ
の態様において、保護フラグメントは各々ハイブリダイゼーションおよびヌクレ
アーゼ処理後に独得な分子量を有し、特徴的イオン化および分裂パターンがその
濃度の測定に十分である。より感受性を得るためにまたは複合体混合物の分析を
助けるために、保護フラグメントを、明確な独得なシグナルを与えるために化学
部分で修飾(例えば、誘導体化)できる。例えば、各保護フラグメントは、鎖のハ
イブリダイズ部分に沿った１個またはそれ以上の位置でアミド結合を介してオリ
ゴヌクレオチド鎖に結合した異なる天然または非天然アミノ酸で誘導体化できる
。適当なエネルギーのマススペクトロメーターで、分裂はアミド結合で起き、ア
ミノ酸の特徴的割合を放出する。中程度のサイズ(おおまかに８０から２００分
子量)の化学部分を質量分析的タグとして使用するこの種の試みは、このサイズ
の分子が一般に検出が容易であるため、望ましい。他の例において、化学修飾は
、例えば、アミノ酸のような他の分子を例えば誘導体化できるようなテトラアル
キルアンモニウム基のような、定義された質量分析的シグナルを有する有機分子
である。他の例において、陽性または陰性イオンシグナルが多くの試薬との反応
により促進される。例えば、陽性イオン検出を促進するために、ピリリウム塩(
例えば、２,４-ジチエニル、６-エチルピリリウムテトラフルオロボレートまた
は多くの他のもの)とアミンを反応させ、ピリジウム塩を形成できる；多くの他
の促進剤が他の陽性荷電官能基の形成に使用できる(例えば、Ｑuirke et al. (
１９９４) Ａnalytical Ｃhemistry ６６, １３０２-１３１５参照)。同様に、
多くの当分野で既知の試薬と反応させ、陰性イオン促進種を形成できる。化学修
飾は、もちろん、核酸からの開裂後に、または核酸との会合中に検出できる。各
保護フラグメントを別々の方法で同定できるようにすることにより、多数の異な
る標的(例えば、２、６、１０、１６またはそれ以上の異なる標的)を１回のアッ
セイでアッセイ(例えばスクリーニング)可能にする。多くのこのようなアッセイ
が、速くそして容易に行うことができる。このようなアッセイまたは一連のアッ
セイは、したがって、本明細書で定義のハイスループットで行うことができる。
【００８７】 オリゴヌクレオチドがその質量により直接検出されるか、または独得な分子タ
グを使用するかどうかに関係なく、検出する各分子のシグナルは既知の濃度の純
粋調製物において十分特徴付けされる。これは、定量する(測定する、定量する)
ためのシグナルの正確性を可能にする。マススペクトロメトリーにより検出する
分子に関し、強度およびプロフィールは正確に予期できない。分子がイオン化す
る傾向、分子内の全ての化学結合の分裂への感受性、各断片が複合荷電されてい
るか、一荷電かの程度は、全て予期するには複雑すぎる。しかし、固定されたエ
ネルギーおよびサンプル取扱い特性の装置では、シグナルの強度およびプロフィ
ールは非常に再現性である。これゆえ、各プローブにおいて、シグナルは純粋な
標準により特徴付けでき、実験的シグナルは、正確に量が判断される。
【００８８】 一つの態様において、本発明は目的の１個またはそれ以上の核酸を検出する方
法に関し、目的の核酸を含むサンプルを１個またはそれ以上の保護フラグメント
のヌクレアーゼ保護に付し、ハイブリダイズした二本鎖分子、または保護された
核酸または保護フラグメントをマススペクトロメトリーで検出することを含む。
【００８９】 マススペクトロメトリーによる核酸の分析法は当分野で既知である。例えば、
Ａlper et al. (１９９８), Ｓcience ２７９, ２０４４-２０４５およびＫoste
r, Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６０５,７９８号参照。 種々の上記のハイスループットアッセイに加えて、多くの他のものが当業者に
明白である。
【００９０】 マルチプローブアッセイを使用する利点は、各プローブアレイにおいて、実際
の実験プローブと同じ反応条件下に付す、多くの“コントロール”プローブを包
含できる能力である。例えば、アレイの各領域は、ポジティブおよび／またはネ
ガティブコントロールを含むことができる。“ポジティブコントロールプローブ
”なる用語は、本明細書で、例えば、実質的に標的と相互作用するか、または定
量的にもしくは定性的に既知の方法で相互作用し、それにより、プローブ／標的
相互作用の(内部)標準として働くことが既知のコントロールプローブを意味する
ために使用する。“ネガティブコントロールプローブ”なる用語は、本明細書で
、実質的に標的と相互作用しないことが既知のコントロールプローブを意味する
ために使用する。このようなプローブは、例えば、ハイブリダイゼージョン特異
性を統制できる。用いることができるこのタイプのコントロールの例として、オ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを、疾病の一連の相関遺伝子の発現を調節す
る薬剤のスクリーニングに使用するアッセイが考慮される。各サンプルの融解細
胞の数、mＲＮＡの回収、またはハイブリダイゼージョン効率の可変性の内部標
準化コントロールとして、プローブアレイは、１個またはそれ以上の基底レベル
または、その発現が試験する薬剤により調節されることが予期されない構造遺伝
子(例えば、アクチン、チューブリンその他)またはＤＮＡ結合タンパク質(例え
ば、転写調節因子その他)のような構造的ハウスキーピング遺伝子に特異的なプ
ローブを含むことができる。更に、その試験した薬剤が、細胞死または毒性のよ
うな望ましくない副作用をもたらすかを測定するために、プローブアレイはアポ
トーシス(計画細胞死)プロセスの一部として誘導されることが既知の遺伝子に特
異的な、または細胞外傷(例えば、ヒートショックタンパク質)または細胞毒性(
例えば、p４５０遺伝子)の条件下に誘導されるプローブを含むことができる。
【００９１】 他のコントロールプローブは、アッセイの感受性の“微調整”のためにアレイ
に包含されることができる。例えば、特定の疾病状態に関連するmＲＮＡの産生
を調節する薬剤のためのアッセイを考慮する。分析で、ある組の相関的mＲＮＡ
の一つ(mＲＮＡ-Ａと言う)が、そのシグナルが他のmＲＮＡを圧倒するように他
のものに比べて多量に産生されることが示される場合、リンカーは、シグナルの
強度を同等にするためにアッセイを“微調整”できる。mＲＮＡ-Ａ標的のために
設計したアンカー特異的オリゴヌクレオチド配列を含むが、プローブ特異的配列
を欠く“遮断リンカー”は、標的特異的リンカーのプールの希釈のために添加で
き、従ってmＲＮＡに対する活性の感受性を減少させる。遮断および非遮断リン
カーの適当な比率は、当業者により、日常的な慣用法により決定できる。
【００９２】 活性要素を不活性要素で希釈することによる、特定の標的のアッセイの“微調
整”は、またアッセイの別の段階で行うことができる。例えば、標識、標的特異
的レポーターを、“不活性”標的特異的レポーター、例えば、同じ標的特異的部
分(例えば、オリゴヌクレオチド配列)であるが、シグナル伝達物体なし、または
シグナル伝達物体の不活性化または不活性形のもので希釈することにより検出の
レベルで行うことができる。本明細書で使用する“シグナル伝達物体(signaling
entity)”なる用語は、標識、タグ分子または検出可能なシグナルを放出する、
またはそのようなシグナルを産生できる物質、例えば、蛍光分子、発光酵素、ま
たは本明細書に記載の種々のシグナル伝達物質である。特に好ましい実施態様に
おいて、“微調整”は、標的含有複合体を検出リンカー(検出リンカーは、下記
、例えば、複合体サンドイッチタイプ検出法に関するセクション、実施例２３お
よび図２４において記載)に接触させる段階を含む。検出リンカーのセットは、
例えば、アッセイにおける各個々の標的の感受性の微調整のために設計できる。
例えば、特定の標的がサンプル中に非常に高レベルで存在することが知られてい
る場合、標的のための検出リンカーを経験的に測定可能な量の“遮断検出リンカ
ー”は、標的特異的部分(例えば、オリゴヌクレオチド配列)を含むが、レポータ
ー試薬に特異的な部分はないか、または標的特異的部分と、不活性レポーター試
薬に予め結合したレポーター試薬特異的部分を含む。即ち、レポーター試薬に特
異的な部分を含む変わりに、その部分は無くてもよく、またはレポーター試薬と
の相互作用(例えば、ハイブリダイズ)が防止(例えば、遮断)されている。このよ
うな微調整は、ある場合、本明細書で、シグナル“弱化”と呼ぶ。
【００９３】 本発明のアッセイで試験するサンプルは、上記の標的または他のものを含み得
る。アッセイする液体サンプルは、試験領域のサイズに適当な用量であり得、約
１００ナノリットルから約１００マイクロリットルの範囲である。好ましい態様
において、約１マイクロリットルの液滴を１５３６ウェルマイクロタイター皿の
各ウェルに適用する。サンプルを、ハイスループット分析に適した種々の方法に
より、例えば、ピペット輸送、インクジェットベースの分散または反復ピンツー
ルにより、プローブアレイと接触させて置くことができる。サンプルをプローブ
と標的の結合または他の適当な相互作用を達成するための有効な条件下(例えば
、塩濃度、pＨ、温度、インキュベーション時間等、上記参照)でインキュベート
する。これらの条件は、慣用的に決定できる。インキュベーション後、サンプル
を所望により処理し(例えば、洗浄)、経験的に特異的相互作用をそのままにする
が、非特異的結合物質を除去する条件を使用して非結合標的を除去する。例えば
、サンプルを約１回から１０回またはそれ以上、プローブ／標的結合の達成に使
用したのと同じまたはいくぶんよりストリンジェントな条件下で洗浄する。
【００９４】 標的ＲＮＡ、例えば、mＲＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは全
ＲＮＡを含むサンプルを種々の方法で調製できる。例えば、mＲＮＡを抽出する
インビトロ細胞培養をマイクロタイタープレートの個々のウェル中のような表面
の領域に置く。所望により、これらの細胞は、所望の細胞密度が達成された後に
、刺激剤または治療剤の可能性のある薬剤のような目的の薬剤で処理でき、それ
は種々の手段で、例えば、複製ピンツール(Ｂeckmanから入手可能な９６または
３８４ピンツールのような)で、ピペット輸送により、またはインクジェット分
散により細胞に添加でき、細胞と適当な時間、例えば、アッセイに依存して１５
分から４８時間の間細胞とインキュベートする。インビトロまたはインビボ源由
来の組織または細胞から抽出された全ＲＮＡ、mＲＮＡ等を慣用の、当分野で既
知の方法(例えば、商品として入手可能なキット)を使用して調製できる。
【００９５】 所望により、目的のＲＮＡと特異的プローブとのハイブリダイゼーションにお
いて競合する核酸(目的のＲＮＡと少なくとも部分的な配列相同性を共有する、
例えば、ゲノムＤＮＡ、rＲＮＡ、tＲＮＡまたはmＲＮＡ)を、ハイブリダイゼー
ションに付す前に、少なくとも部分的に、サンプルをヌクレアーゼ保護(ＮＰ)法
により処理することによりＲＮＡサンプルから除去できる。目的のＲＮＡに少な
くとも一部相補的であり、その配列が部分的にまたは完全に目的のＲＮＡに特異
的なプローブと重ね合わさる核酸(例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡであり
得る“保護フラグメント”)を過剰にサンプルに入れ、保護フラグメントが目的
のＲＮＡに特異的にハイブリダイズする(適当な反応条件の上記参照)、選択した
ストリンジェントなハイブリダイゼージョン条件下にインキュベートする。この
段階で、サンプル内の任意のまたは全ての目的のＲＮＡに特異的な保護フラグメ
ントを添加できる(例えば、１００倍またはそれ以上)。ハイブリダイゼーション
後、サンプルを１個またはそれ以上のヌクレアーゼのカクテルで処理し、保護フ
ラグメントに相補的な目的の各ＲＮＡの部分または保護フラグメントと保護ＲＮ
Ａの間に形成された二本鎖以外、全ての核酸を実質的に破壊する。次ぎの段階で
、保護フラグメントを、二本鎖を変性し、保護フラグメントを減衰させ、保護Ｒ
ＮＡを実質的にそのままにする適当な酵素での消化によりこのような二本鎖から
除去できる。例えば、膵臓ＲＮＡse、ヤエナリヌクレアーゼ、ＲＮＡse Ｈ、Ｓ
１ヌクレアーゼ(高いまたは低い塩のいずれかの消化条件下で)、ＲＮＡse Ａ、
リボヌクレアーゼＴ１、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ
、ＲＮＡse ＣＬ３、ＲＮＡse ＰhyＭ、Ｒnase Ｕ２等を含む種々のヌクレアー
ゼが、サンプルに存在するハイブリダイズした複合体の性質および望ましくない
核酸の性質に依存して、上記消化段階に使用できる。これらの酵素の反応条件は
、当分野で既知であり、経験的に最適化できる。要求に応じて、サンプルを当分
野で既知の方法で処理し、非ハイブリダイズ物質を除去するおよび／または残り
の酵素を不活性化または除去する(例えば、フェノール抽出、沈殿、カラム濾過
等)。処置サンプルを次いでプローブアレイと接触させて置く。特異的ハイブリ
ダイゼーションおよび続くヌクレアーゼ保護が適当に起こるように制御するため
に、標識保護フラグメントを反応混合物に入れることができる。ヌクレアーゼ保
護法が適当に働くように、即ち、非ハイブリダイズ核酸が望ましく消化されるよ
うに制御するために、１個またはそれ以上の保護フラグメントを、アッセイが適
当に働いた場合にヌクレアーゼにより開裂されるべきオーバーハンギング(非ハ
イブリダイズ)セグメントを含むように設計できる。オーバーハンギングフラグ
メントの存在または非存在は、相補的、標識プローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより決定でき、または保護フラグメントのオーバーハンギング部分それ自体
を検出可能な分子で標識できる。
【００９６】 本発明の方法に関して、標的を当分野で既知の種々の方法でおよび／または本
明細書に記載の方法(例えば、ヌクレアーゼ保護フラグメント検出に関して)で標
識(タグ付け)できる。例えば、化学ルミネッセント分子、または化学ルミネッセ
ント分子の産生を触媒する酵素、またはフルオレッセインまたはcy５のような蛍
光分子、またはキレート化ランタニド金属の一つのような時間分割蛍光分子、ま
たは放射活性化合物のような、検出用シグナルを提供する化学基と、標的分子を
直接的または間接的に結合できる。あるいは、標的をそれらがプローブと反応し
た後に、１個またはそれ以上の標的特異的レポーターで標識できる(例えば、図
１に示す抗体、オリゴヌクレオチドまたはプローブおよび標的に関連して上記の
一般的タイプの分子)。
【００９７】 一つのタイプの蛍光分子は、“アップコンバート蛍光団(phosphore)"であり得
、即ち、長波長(例えば、ＩＲ)を吸収し、励起し、次いで短波長(例えば、可視
光)を放出する蛍光である。アップコンバートした蛍光団が、分析する典型的な
サンプルに存在する干渉する可能性のある殆どの物質よりも長い波長を吸収する
ため、アップコンバートした蛍光団は、低い波長を吸収する蛍光団と比較して、
サンプルにおける物質によりもたらされる干渉を減少できる。殆どのアップコン
バートした蛍光団の狭い放出スペクトルはまた多数の異なるアップコンバートし
た蛍光団の同時の検出を可能にする。アップコンバートした蛍光団は既知であり
、当分野で慣用であり、例えば、特に酸硫化物塩の形の、イッテルビウム(Ｙb)
、エルビウム(Ｅr)、ツリウム(Ｔm)およびプラセオジム(Ｐr)のような、例えば
、希土類金属イオンを含む。８０以上程多くの個々の検出可能な蛍光団が記載さ
れている。(例えば、Ｂiological Ａgent Ｄetection and Ｉdentification, Ａ
pril ２７-３０, １９９９, ＤＡＲＰＡ, Ｂiological Ｗarfare Ｄefense, Ｄe
fense Ｓciences Ｏffice参照)。蛍光団は、所望により、例えば、マイクロスフ
ェアまたはラテックスビーズの表面に結合できる。他の蛍光標識と同様に、アッ
プコンバート蛍光団は、十分に密接したリンカー、標的またはレポーター上の標
識へのエネルギー伝達(またはそれによる調節)により検出可能である。更に、本
明細書で記載の他のシグナル伝達物質のように、アップコンバート蛍光団は、標
的の量の定量に使用でき、本明細書に記載の種々の方法、例えば、ヌクレアーゼ
保護フラグメントの検出に使用できる。
【００９８】 もちろん、アップコンバート蛍光団はまた表面上に任意の他の形態で分布して
いる標的、例えば、直接表面に結合した、表面上の異なるオリゴヌクレオチドの
アレイに直接結合した、または表面上に実質的に均質に、または任意の秩序のパ
ターンで分布した二官能性リンカーを介してアンカー(異なるまたは実質的に同
一の)に結合した、標的(ヌクレアーゼ保護フラグメントを含む)の検出にも使用
できる。任意の表面を、例えば、フロースルーシステム、または例えば、ビーズ
のような固体表面に使用できる。本発明の任意のアッセイに使用するビーズは、
例えば、任意の物質から成る、磁気および／または非磁気の任意のタイプであり
得る；そして一つのアッセイで使用するビーズは、サイズおよび／または形が実
質的に同じまたは異なり得る。
【００９９】 種々の多くの複合サンドイッチタイプ検出法も用いることができる。例えば、
標的を、標的に特異的な第１部分および共通(即ち、同じ)レポーター試薬、例え
ば、標識ポリヌクレオチド、抗体等により認識され得る第２部分を含む二官能性
分子とハイブリダイズできる。二官能性分子は、所望の数の共通レポーターを各
アッセイで使用できるように設計できる。
【０１００】 本発明の任意の方法に関して、種々の複合体サンドイッチタイプ検出法を標識
(タグ)標的に用いることができる。例えば、標的を、例えば、標的に特異的な第
１部分および“レポーター試薬”に特異的な第２部分を含む二官能性(または多
官能性)分子(“検出リンカー”)と相互作用、例えば、ハイブリダイズできる。
“特異的”なる用語は、本明細書で使用する限り、例えば、プローブと標的の相
互作用に関する。“レポーター試薬”なる用語は、本明細書で使用する限り、標
的ポリヌクレオチド抗体、またはプローブと標的に関連して本明細書で記載する
一般的なタイプの任意の分子を意味する。検出リンカーのこれらの二つの部分は
、例えば、プローブと標的に関連して上記の方法に関する各結合パターンで認識
（相互作用または関連)できる。検出リンカーはまた他の配列、例えば、標的に
特異的であるが、対応するアンカー結合リンカーの標的特異的部分とは異なる(
非重複である)配列を含み得る。検出リンカーに存在する任意の配列が、検出プ
ローブまたはレポーター試薬として働き得る。好ましい実施態様において、検出
リンカーはポリヌクレオチドである。
【０１０１】 検出リンカーは、任意の数の共通レポーター試薬がアッセイで使用できるよう
に設計できる。例えば、１組の検出リンカーを、各検出リンカーが異なる標的に
特異的であるが、レポーター試薬の同じ(共通)の、または一つの限定された数の
ための結合部位を含むように設計できる。限定された数(例えば、一つ)のレポー
ター試薬をシングルアッセイにおける種々の標的の標識に使用する能力は、費用
の減少および低いバックグラウンドの利点を提供する。もちろん、検出リンカー
／レポーター試薬組合わせを、例えば、アップコンバートした蛍光団により検出
できる標的配置のタイプに関して上記のような、任意の形態で、表面に分布した
標的の検出に使用できる。
【０１０２】 最も好ましい態様において、検出リンカーは、ヌクレアーゼによりコントロー
ル“オーバーハング”配列から、ヌクレアーゼ保護法(例えば、実施例１５に記
載のような)の間に開裂されている保護フラグメントが、優勢に標識されるよう
な方法で、保護ヌクレアーゼ保護フラグメントを検出するために設計できる。こ
のタイプの検出法は、図２４に模式的に記載する。本実施態様において、検出リ
ンカーは、標的に特異的な第１部分および、好ましい実施態様においては、アッ
セイの開始時に実質的に全てのヌクレアーゼ保護フラグメントに存在する共通コ
ントロールオーバーハング配列に特異的な第２部分を含む。望ましいように、コ
ントロールオーバーハング配列が、ヌクレアーゼ保護反応の間にヌクレアーゼ保
護フラグメントから開裂されている場合、検出リンカーの標的特異的部分はフラ
グメントの開裂保護フラグメントとハイブリダイズするが、検出リンカーのコン
トロールオーバーハング特異的部分は非結合であり、更なるハイブリダイゼーシ
ョンに利用可能なままである。他方で、コントロールオーバーハング特異的配列
が、例えば、ヌクレアーゼ保護法の間の不完全なヌクレアーゼ消化のために保護
フラグメントから開裂しない場合、検出リンカーの標的特異的およびコントロー
ルオーバーハング特異的部分の両方が更なるハイブリダイゼーションに利用可能
ではない。好ましい実施態様において、ヌクレアーゼ保護フラグメントと結合し
た検出リンカーを含む複合体は、シグナル伝達物質(例えば、螢光色素、ハプテ
ン、酵素または記載のような、任意の検出可能なシグナルまたはシグナル産生物
質を担持する他の分子)および検出リンカーのコントロールオーバーハング特異
的部分に特異的な部分(例えば、オリゴヌクレオチド)を含む、レポーター試薬に
更なる段階においてハイブリダイズする。レポーター試薬は、ヌクレアーゼ保護
フラグメントのコントロールオーバーハング配列が開裂しているフック剛体に優
勢に結合し、標識する(すなわち、検出リンカーのコントロールオーバーハング
部分がレポーター試薬の更なるハイブリダイゼーションに利用可能である)。
【０１０３】 多くの他のサンドイッチ検出法の変法が、当業者には明らかである。
【０１０４】 標的を、結合または他の安定な相互作用を達成するのに有効な条件下で標的特
異的レポーターとインキュベートできる方法は、慣用的に決定できる(上記参照)
。例えば、蛍光オリゴヌクレオチドレポーター(６×ＳＳＰＥ-Ｔのようなまたは
他の緩衝液中、約１０nＭから約１μＭまたはそれ以上の濃度、好ましくは約３
０nＭ)を、約１５分から２時間の間またはそれ以上(好ましくは約３０から６０
分)、約１５℃から約４５℃の間の温度(好ましくは室温)で、結合標的とインキ
ュベートできる。インキュベーション後、サンプルを所望により処理し(例えば
、洗浄)、経験的に特異的相互作用をそのままにするが、非特異的結合物質を除
去する条件を使用して非結合標的特異的レポーターを除去する。例えば、サンプ
ルを約１から１０回またはそれ以上、標的／レポーター結合の達成に使用したの
と同じまたはいくぶんよりストリンジェントな条件下で洗浄する。
【０１０５】 標的特異的レポーターでのタグ付けは、例えば、標的特異的オリゴヌクレオチ
ドレポーターが、プローブオリゴヌクレオチドよりも標的核酸の配列の異なる部
分を標的とする場合、または、プローブとレポーター抗体が標的抗原の別のエピ
トープを認識する場合、最初のハイブリダイゼーションの反応に特異的な更なる
層を提供できる。更に、標的特異的レポーターでのタグ付けは、反応の感受性の
“チューニング”を可能にできる。例えば、相関的発現パターンの一部である標
的mＲＮＡが非常に低いレベルで発現する場合、そのシグナルのレベルは、各々
特異的に標的mＲＮＡの異なる部分にハイブリダイズする数個の(例えば、約２個
から約５個またはそれ以上)標的特異的オリゴヌクレオチドレポーターに結合標
的をハイブリダイズすることにより増強(シグナル増幅)できる。
【０１０６】 二つのタイプのラベルを個々に検出する能力は、ＭＡＰＳアッセイにおける更
なるタイプのコントロールを可能にする。特定のアンカー位置(図７は３つの典
型的なアンカー位置を示し、各々多くの実質的に同一のアンカー(Ａ、Ｂまたは
Ｃ)を有する)のために設計したリンカーのいくつか(例えば、約１０から約１０
０％)は、一端に結合した標識(例えば、蛍石)を有し得る。例えば、ローダミン
またはＣy５蛍石はリンカーの５'末端に結合できる。このような修飾リンカーは
“コントロールリンカー”と名付ける。リンカーおよびコントロールリンカーの
混合物がアンカーと会合し、標的を含むサンプルを得られるプローブアレイとイ
ンキュベートした後、異なる蛍石(例えば、フルオレッセインまたは化学ルミネ
ッセントのような他の検出標識)を担持する標的特異的レポーターを使用できる(
または標的を直接蛍石または他の検出標識で標識できる)；そして二つのシグナ
ルの比率を決定できる。コントロールリンカーの存在は、試験領域内および間の
官能的(例えば、リンカーと相互作用できる)アンカーの数の計測を可能にし(即
ち、シグナル標準化の目的で、標的に結合するアレイの各位置の能力を試験する
)、結合標的の量の定量の基本として働き、アンカー位置の局在化を助けおよび
／または例えば、サンプルが、標的の不存在下によりシグナルがない場合、ポジ
ティブコントロールを提供する。本発明の一つの態様において、二つの異なる標
識(例えば、フルオロフォア)をまた使用して、標的分子の二つの異なる集団を検
出する；しかし、シグナルの空間的分離による標的の存在の認識の能力は、異な
る標的分子の標識の一つのタイプの使用を可能にする。
【０１０７】 標識を独立して検出する能力(例えば、フルオレッセインとローダミンのよう
な、例えば、識別可能な波長で放出される蛍光レベル、または異なるアップコン
バートした蛍光団)は、本発明の方法の付加的な柔軟性を可能にする。例えば、
２個以上の標的の各々を、直接または間接的に、それ自体の読字の検出可能な標
識で標識できる。これは、例えば、表面上に局在する標的の位置の道程、または
局在するビーズのサイズによる標的の動態に加えて(またはその代わりに)、標識
(例えば、放出の色)に特異的な性質に基づいた標的の検出を可能にする。本発明
の他の態様において、標的の多様性は、独立して領域内の一つの場所で独立して
検出できる。例えば、２個以上(例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上)の
標的を、アンカーの一つの(実質的に同一の)グループにより定義される場所で検
出できる。即ち、一連のリンカーを使用でき、その各々は、同じアンカーに特異
的なアンカー特異的部分と異なる標的に関する標的特異的レポーター部分を有す
る。例えば、４つのこのようなリンカーのセットを使用した場合、全４つは一つ
の場所でアンカーのグループのメンバーに結合でき、４つの異なる標的がその場
所に結合することを可能にする。ｋの各々の標的を異なる、識別可能な標識で標
識(直接または間接的)した場合、研究者は、４つの標的の各々の独立した位置で
の存在の検出ができる。したがって、例えば、１領域内の５つのアンカー(アン
カーのグループ)のアレイを、２０個ほど多い異なる穂兪的の検出のために、上
記のシナリオにおいて使用できる。このようなアッセイは、実施例２４および図
２５に説明する。同様に、例えば、８０個ほど多い複数の標的を、一つのタイプ
のアンカーが、任意の定義した形態で、例えば、ビーズまたはフロースルー装置
のような固体表面に、一つの場所ではないが、均等に分布しているとき、独立し
て検出できる；そしてビーズサイズまたは散乱のような他の態様を使用し、標的
同一性または標的のグループに関する情報を提供できる。
【０１０８】 本発明の他の実施態様において、目的の標的に特異的な“アンカー”は、リン
カーと結合していないがむしろ、直接標的と結合している；標的は、次ぎに、所
望により標的特異的レポーターと相互作用できる。標識されていても非標識でも
、標的は種々の方法で検出でき、当分野で日常的であり慣用的である(例えば、
Ｆodor et al (１９９６) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,５１０,２７０; Ｐirrung et
al (１９９２) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,１４３,８５４; Ｋoster (１９９７) Ｕ.
Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６０５,７９８; Ｈollis et al (１９９７) Ｕ.Ｓ. Ｐat.
Ｎo. ５,６５３,９３９; Ｈeller (１９９６) Ｕ.Ｓ. Ｐat, Ｎo. ５,５６５,３
２２; Ｅggers et al. (１９９７) Ｕ.Ｓ. Ｐat. Ｎo. ５,６７０,３２２; Ｌip
shutz et al (１９９５), ＢioＴechniques １９, ４４２-４４７; Ｓouthern (
１９９６) Ｔrends in Ｇenetics １２, １１０-１１５参照)。検出法は、酵素
ベースの検出、比色法、ＳＰＡ、オートラジオグラフィー、マススペクトロメト
リー、電気的方法、吸光度または発光の検出(化学ルミネッセンスまたは電気ル
ミネッセンスを含む)、および、例えば、タグとして使用した微小粒子由来の光
分散形の検出を含む。また、蛍光標識は、例えば、電荷結合素子(ＣＣＤ)または
蛍光顕微鏡(例えば、走査または共焦点蛍光顕微鏡)での結像により、または走査
システムとＣＣＤアレイまたは光電子増倍管の結合により、またはアレイベース
の検出法(例えば、各１０ミクロン部の試験領域の表面電位を検出でき、または
解像が十分高いとき、表面プラスモン共鳴を使用できる)の使用により検出でき
る。あるいは、アレイはリンカー、標的またはレポーター上の標識へのエネルギ
ー移動(またはそれによる修飾)により検出できる標識(例えば、フルオレッセイ
ンおよびローダミンのような、エネルギー移動プローブの一つの対)を含むこと
ができる。とりわけ、蛍光ベースの検出システムのホストは、蛍光強度、蛍光偏
光法(ＦＰ)、時間分割蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動および均質徐放性蛍光(Ｈ
ＴＲＦ)である。反復バーコード様パターンの分析は、パターン認識により達成
できる(各特異的標識標的の、他のスポットまたは線に対するその位置による適
当なスポットまたは線の発見)、標識の強度の定量に従う。１または２次元アレ
イのバーコード認識装置および分析のソフトウェアは、慣用的に製造されおよび
／または商品として入手可能である(例えば、Ｒava et al. (１９９６) Ｕ.Ｓ.
Ｐatent Ｎo. ５,５４５,５３１参照)。
【０１０９】 本明細書に記載の表面または領域の製造、本明細書に記載のアンカー、リンカ
ー、プローブおよび検出プローブのような物質の合成または精製または結合もし
くは会合、および本明細書に記載のような標識またはタグ付け物質の検出および
分析を含む本発明のアレイの製造および使用法は、既知であり、慣用法である。
上記に記載の引用文献に加えて、例えば、Ａffymax, Ａffymetrix, Ｎanogen,
Ｐrotogene, Ｓpectragen, ＭilliporeおよびＢeckman(これらから、本発明に有
用な製品が入手可能である)に譲渡された特許；上記のものを含む分子生物学お
よびタンパク質科学の標準テキスト；およびＣozette et al (１９９１) Ｕ.Ｓ.
Ｐat. ５,０６３,０８１；Ｓouthern (１９９６), Ｃurrent Ｏpinion in Ｂio
technology １, ８５-８８；Ｃhee et al (１９９６) Ｓcience ２７４, ６１０
-６１４；およびＦodor et al (１９９３) Ｎature ３６４, ５５５-５５６参照
。
【０１１０】 図面の説明 図１はリンカー１がアンカー１に特異的な部分および標的mＲＮＡ１に特異的
な他の部分(プローブ)を含み、標的検出プローブ１が、リンカーの標的特異的部
分の配列と異なる標的mＲＮＡ１の配列に特異的である、オリゴヌクレオチドの
設計スキームを図解する。
【０１１１】 図２は１５個の試験領域を含み、各々６アンカーオリゴヌクレオチドのアレイ
を含む、表面を図解する。 図３は、リンカーのアンカー特異的部分がプローブ部分(レセプタータンパク
質)にビオチンおよびストレプトアビジン分子を介して結合し、レセプターに特
異的なリガンドが蛍光標識分子で標識されている、レセプター結合アッセイのリ
ンカーの設計を図解する。Ｂ：ビオチン。ＳＡ：ストレプトアビジン。Ｒec：レ
セプタータンパク質。リガンド：レセプターのための天然または合成リガンド。 ＊ ：リガンドに結合する蛍光標識分子。
【０１１２】 図４は２１個の試験領域を含み、その各々が更に１６個の小領域に分割(へこ
み、くぼみ)されている表面を図解する。 図５a、５bおよび５cは図４に記載のような表面が凝集できる３片を図説する
。図５aはウェルセパレーターを示す；図５bはサブディバイダーを示す；そして
図５cは基盤を示す。 図６は各々“バーコード”様形であるプローブ(またはアンカー)の直線アレイ
を含む、二つの試験領域を示す。
【０１１３】 図７は各々で多コピー(“グループ”)で存在する３アンカー(Ａ、ＢおよびＣ)
を含む試験領域を模式的に示す。アンカーの各グループの位置は、“位置”と名
付ける。 図８は特異的逆転写酵素により産生されるcＤＮＡがＭＡＰＳプレート上でア
ッセイさせるアッセイを図説する。
【０１１４】 図９はヌクレアーゼ保護法を使用するアッセイを図説する(ＮＰＡ-ＭＡＰＳア
ッセイ)。サンプルＲＮＡを細胞または組織から調製し、薄波状線として示す。
ＲＮＡサンプルにポリヌクレオチド保護フラグメントのグループを添加し、太い
、濃いそして薄い線で描く。保護フラグメントの濃い部分は特異的ＲＮＡ標的に
相補的であり、これらの標的にハイブリダイズするセグメントを示す。薄い部分
はオーバーハンギング部分を示す；配列は相補的配列と接触するが、標的と相補
的ではない。保護フラグメントを過剰に添加する。全ての利用可能な標的の保護
フラグメントへのハイブリダイズに続いて、サンプルをヌクレアーゼの適当なカ
クテルおよび化学処理で処理し、望ましくない非ハイブリダイズＲＮＡおよび非
ハイブリダイズポリヌクレオチドを破壊する。例えば、Ｓ１ヌクレアーゼは、存
在する一本鎖ＤＮＡを破壊できる。これ故、過剰の保護フラグメントを結合保護
フラグメントのオーバーハンギング非ハイブリダイズ部分として加水分解する。
ＲＮＡはリボヌクレアーゼＨを含むリボヌクレアーゼの添加によりまたは塩基中
でサンプルを加熱することにより破壊できる。残りは、各ＲＮＡ標的がサンプル
にどの程度存在するかを反映する開裂保護フラグメントの収集物である。残りの
保護フラグメントwＭＡＰＳハイブリダイゼーションアッセイで測定する。
【０１１５】 図１０はＭＡＰＳアッセイにおけるハイブリダイゼーション特異性を図説する
。 図１１はアンカーのリンカーへの結合動態を図説する。 図１２は二つのオリゴヌクレオチド標的のＭＡＰＳアッセイを図説する。 図１３は感受性シフトの定量を図説する。 図１４は４つのリンカー／アンカー組合わせの融点温度決定を図説する。 図１５はＮＰＡ-ＭＡＰＳによるmＲＮＡアッセイを図説する。 図１６はＮＰＡ-ＭＡＰでの希釈曲線を図説する。
【０１１６】 図１７はホスホチロシン残基を含むペプチドの検出のためのアッセイを図説す
る。 図１８はマップＥＳＴのアッセイの第１段階を図説する：ＭＡＰＳプレートの
一般的アンカーのアレイにマップするＥＳＴの各々に対応する凝集リンカーの凝
集。１６ウェルのマイクロプレートの各表面に１６個の異なるオリゴヌクレオチ
ドプローブを含むリンカーが結合し、４×４マトリックスに配置する。第１位置
はオリゴ１を有し、これは第１ＥＳＴ配列の部分に相補的であり、試験する１６
ＥＳＴのためにこのようにする。 ＥＳＴを得た遺伝子から産生されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを全１６ウェルに添
加し、適当な条件下でハイブリダイズさせた。それ故、１６ＥＳＴ配列の一つを
含むcＤＮＡまたはmＲＮＡが、相補的プローブが置かれる位置に凝集する。
【０１１７】 図１９はマップＥＳＴの続く段階を図説する：ＭＡＰＳプレートへのディテク
ターオリゴヌクレオチドの添加。プレートの各ウェルに、マップするＥＳＴの一
つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。各ディテクターオリゴ
ヌクレオチドは検出に使用する分子、例えば、検出の方法が蛍光イメージングで
ある場合、フルオレッセインに結合したオリゴヌクレオチドである。各ディテク
ターオリゴヌクレオチドはＥＳＴの一つに相補的であるが、ＥＳＴ特異的プロー
ブが異なり、一つのＥＳＴに相補的なプローブおよびディテクターオリゴヌクレ
オチドが同時に両方結合できる。 洗浄後、単一ディテクターオリゴヌクレオチドを、図に番号付けするように各
ウェルに添加する。即ち、第１ＥＳＴに相補的な配列を有するディテクターオリ
ゴヌクレオチドを第１ウェルになどである。
【０１１８】 図２０aおよびbは図１８および１９に示すマップＥＳＴのアッセイの結果を示
す。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なス
トリンジェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの１６ウェ
ルをＣＣＤベースの蛍光イメージャーで結像する。図２０aは様式化した結果を
示す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するＥＳＴ特異
的プローブにより抑制されたmＲＮＡまたはcＤＮＡを標識すべきであることは予
期される。例えば、プローブ５はその位置で第５ＥＳＴ配列を含むcＤＮＡまた
はmＲＮＡを凝集し、第５ディテクターヌクレオチドがまた同じ位置でcＤＮＡま
たはmＲＮＡをハイブリダイズしなければならない。これは、各検出オリゴヌク
レオチドが適合プローブを標識する、これらの様式化データで当て嵌まる。加え
て、最初の３つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の３個により固
定されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並
んでいることを示す。同様に、最後の５個のＥＳＴは結合しているように見える
。これらのデーターからの結合を図２０bにグラフ的に示す。
【０１１９】 図２１は図１８-２０に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチドおよ
びＥＳＴ番号１、２および６の関係を図説する。 図２２はハイスループットアッセイを図説する。 図２３は増幅標的の製造法を説明する。 図２４は、検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイを説明する。 図２５は、複数の粉の使用を説明する。
【０１２０】 (実施例) 実施例１ ハイブリダイゼーション特異性(図１０) 一般的ＭＡＰＳプレートをインクジェットディスペンサーであるＰixusシステ
ム(Ｃartesian Ｔechnologies, Ｉnc., Ｉrvine, ＣＡ)を使用して製造し、マイ
クロタイタープレートの各ウェル内にＤＮＡの同一グリッドを形成した。全ての
オリゴヌクレオチドはＢiosourse Ｉnternational (Ｃamarillo, ＣＡ)から購入
した。このプレートに、７個の異なるオリゴヌクレオチドアンカーを、キーとし
て示す(図の左側)各ウェル内に分配した。各オリゴヌクレオチドを、５００mＭ
リン酸ナトリウムpＨ８.５および１mＭ ＥＤＴＡを含む２μＭ溶液から、ＤＮＡ
Ｂindプレート(Ｃorning Ｃorstar)に１０ナノリットル滴から２個のスポット
で分配し、乾燥させた。結合後、ウェルを５０mＭ Ｔris pＨ８で遮断し、次い
で、表面に共有結合しないオリゴヌクレオチドを５×ＳＳＰ緩衝液中の０.１％
ＳＤＳで洗い流した。
【０１２１】 洗浄プレートに蛍光標識したリンカーオリゴヌクレオチドを添加し、６×ＳＳ
ＰＥ中、０.１％Ｔriton Ｘ-１００と室温で３０分ハイブリダイズさせた。これ
は、リンカーの結合の好ましいプロトコールである。リンカーオリゴヌクレオチ
ドは合成中にcy５誘導体化され、特異的固定オリゴヌクレオチドに２５塩基対セ
グメントで相補的であった。７個のアンカーおよびリンカーの配列は下記の通り
である(全て３'から５'で示す)：
【表１】 ＊アンカーを、５'末端でアミドを有するＣ１２スペーサーで合成した。＊＊ リンカーを５'末端に結合したＣy５で合成した。＊＊＊ ディテクターオリゴヌクレオチドを５'末端に結合したビオチンで合成し
た。
【０１２２】 各ウェルにリンカーまたはリンカー混合物(図に示すような)を大量に添加した
。(“全て”と記したウェルに全７個のリンカーの混合物を添加した。)インキュ
ベーションおよび５×ＳＳＰで３回の洗浄の後、図面の右側に示す蛍光画像をＴ
undraイメージャー(ＩＲＩ, Ｓt. Ｃatherines, Ｏntrario)で撮った。見られる
ように、リンカーは、それらの相補的アンカーと特異的に会合することにより、
表面に自己凝集する。 この方法を８個の異なるアンカーおよびそれらと実質的に優先的に会合するリ
ンカーを各ウェルに分配する以外、繰り返す。方法全部を、２４、９６、３８４
、８６４または１５３６ウェルプレートの各ウェルで、３６、６４などの異なる
アンカーで繰り返す。
【０１２３】 実施例２ 結合動態(図１１参照) Ｃy５誘導体化リンカー番号１のその相補的結合アンカーへのハイブリダイゼ
ーションの速度を、異なる濃度のリンカーに関して示す。一般的ＭＡＰＳプレー
トを、アンカー１がウェル当り４スポットで結合している以外、図１のように調
製する。インキュベーションを、室温で０.１％Ｔween-２０含有５×ＳＳＰと室
温で行い、ウェルを３回５×ＳＳＰで洗浄し、結合蛍光を測定した。プレートの
蛍光画像をＴundraで撮り、背景を引いて各ウェル内の各スポットでの結合強度
をＴundraソフトウェアで計算した。プロットしたのは、二つのデュプリケート
ウェルの４点の結合強度の平均と標準分散である。
【０１２４】 実施例３ 蛍光リンカー 一般的ＭＡＰＳプレートを、ウェルあたり１スポット(上の二つの列)、ウェル
当り４スポット(次ぎの４列)またはウェル当り１６スポット(下の２列)にスポッ
トした一つの固定オリゴヌクレオチドを含むように、上記の方法に従って製造す
る。各ウェルに、相補的、蛍光標識リンカーを実施例１に記載の好ましいプロト
コールで結合する。洗浄に続いて、プレートの蛍光画像をＴundraで撮る。各ス
ポットでの蛍光の量は、どの程度官能的リンカーが標的へのハイブリダイズに利
用可能であるかを報告する。反復スポットで検出したシグナルの量は非常に再現
性である。
【０１２５】 実施例４ 結合曲線 実施例３のように調製したプレートに、異なる濃度の標的オリゴヌクレオチド
を添加する。会合しているリンカーは標的の部分に相補的な２５量体配列を含む
。標的を、全量３０または１００マイクロリットルの０.０５％ＳＤＳ含有５×
ＳＳＣ中に添加し、プレートを覆い、５０℃で一晩インキュベートする。標的の
結合リンカーへのハイブリダイゼーションに続き、標的を化学ルミネッセンスを
使用した好ましいプロトコールにより可視化する。標的の別々の部分に相補的な
(リンカーに相補的な部分と同じではない)２５量体配列を含むビオチニル化ディ
テクターオリゴヌクレオチドを３０nＭで添加する。ビオチニル化ディテクター
は、過剰の非結合標的を洗い流した後３０分添加できるか、または一晩のハイブ
リダイゼージョンの長さの標的と一緒に添加できる。ディテクターの添加に続い
て、表面を２回５×ＳＳＣ、１回０.１％Ｔween-２０および１％ＰＥＧ含有１×
ＳＳＰ(ＳＳＰＴＰ)で洗浄し、２５０μg／mlのストレプトアビジンに接合した
ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ：ＳＡ、Ｐierce, Ｒockford, Ｉ
Ｉlから)の１：５０,０００希釈を、ＳＳＰＴＰ中５時間室温で添加する。ウェ
ルを４回ＳＳＰＴＰで洗浄し、１回洗浄し、次いでＳuper Ｓignal Ｕltra試薬(
Ｐierce)とインキュベートする。数分後、蛍光の画像をＴundraイメージャーで
集め、例えば、画像を５分ＣＣＤアレイ内に蓄積できる。低レベルの標的を、標
的の濃度が〜５×１０-１３Ｍほど少なくてもあるウェルでは可視化できる；シ
グナルの量は、一般に〜１０-１０Ｍの濃度の標的で飽和される。反復スポット
で検出されるシグナルの量は、非常に再現性である。 実施例５ 二つのオリゴヌクレオチドのアッセイ(図１２参照) 上記の好ましいプロトコールを使用した二つの異なる標的オリゴヌクレオチド
のＭＡＰＳＤアッセイを証明する結合曲線を示す。一般的ＭＡＰＳプレートを、
各々４回各ウェル内にスポットされた４つの異なる固定オリゴヌクレオチドで調
製する。第２および第４のアンカーに関して、相補的リンカーオリゴヌクレオチ
ドは、記載のように自己凝集した。二つの標的を４０マイクロリットル中に示す
濃度で、記載のように各ウェルに添加し、５０℃で一晩インキュベートする。各
標的の結合量は、記載のように、ＨＲＰ：ＳＡおよび化学ルミネッセンス結像後
に、各標的に特異的なビオチニル化検出オリゴヌクレオチドの結合により可視化
された。下部パネルにおいて、イメージの強度を定量する。Ｔundra Ｉmagaerパ
ッケージの一部であるソフトウェアを使用して上部パネルに示す矢印の間の線に
沿って画像の強度をスキャンした。標的の最低濃度である１.１pＭで、スキャン
したイメージは十分に定義されたガウスピークを各スポットで示し、一方、標的
の０濃度では、最も左のサンプルで検出可能な背景ピークはなかった。
【０１２６】 実施例６ 感受性変化(図１３参照) ＭＡＰＳハイブリダイゼーションアッセイは、一連のオリゴヌクレオチドの濃
度の測定に、それらを表面に結合させ、それらを標識することにより使用できる
。これは、中程度のまたは低い濃度であるこれらのオリゴヌクレオチドで十分に
働く。二つのサンプルを、一つのサンプルがよりオリゴヌクレオチドを含み、よ
り結合する場合、区別できる。他方、標的オリゴヌクレオチドの濃度が表面を飽
和している場合(即ち、全ての結合部位を占領するのに十分高い場合)、そして濃
度が上がってもより結合できない場合、量は測定できない。しかし、標的の結合
曲線は、非標識競合リガンドの添加により変化できる。
【０１２７】 結合データは、４つの異なるオリゴヌクレオチド標的に関して得られ、その全
てがおおまかに３nＭで表面を飽和している(即ち、最大結合に到達)。非標識競
合標的を全てのウェルに添加することにより、標的オリゴヌクレオチドの結合は
移動し、低い濃度で結合は少なく、飽和が起こるレベルが上に移動する。競合オ
リゴヌクレオチドを、例えば標的１および３に添加できるが、２および４にはで
きない。アッセイの感受性のこの変化は、標的１および３のみにである。この方
法で、予期されるオリゴヌクレオチドの相対的量が既知であるなら、大きく異な
る濃度のオリゴヌクレオチド標的を一つのアッセイで十分測定できる。 データは一つのオリゴヌクレオチド標的への結合に関して上記に例示のように
定量できる。図１３は、高い濃度のこの標的のアッセイに使用する結合曲線のア
ッセイシフトにおける競合オリゴヌクレオチドの包含を定量的に示す。
【０１２８】 実施例７ ４つのプローブの融点(図１４参照) ＭＡＰＳアッセイでアンカーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズす
る４つの異なる蛍光標識リンカーオリゴヌクレオチドの量を、温度の上昇にした
がってプロットする。４つのオリゴヌクレオチドは最初に５０℃で１時間、３０
０nＭ中でハイブリダイズさせた。次いで、ウェルをプローブなしのＳＳＣで洗
浄し、結合した量を上記のように蛍光(５０℃点)で測定する。次いで、表面を５
５℃で３０分インキュベートし、結合した蛍光を測定するなど、全ての示した温
度で行う。
【０１２９】 実施例８ 検出法 二つの検出法を直接比較する。各々ウェル当り４スポットで、４つのオリゴヌ
クレオチドアンカーが結合したＭＡＰＳプレートに、二つのオリゴヌクレオチド
を各ウェルに添加し、両方とも共有結合したcy５部分を含むか、両方ともビオチ
ン基を含む。落射蛍光測定を、記載のように可視化および蛍光リンカーの測定に
関して行う。化学ルミネッセンス測定をＭＡＳＰアッセイに記載のように、ＨＲ
Ｐ：ＳＡの続く添加および化学ルミネッセンス基質を使用して行う。産生したシ
グナルは大まかに同じ強度である。しかし、各ウェルを離す壁があるマイクロプ
レートの外形、および液体の泡または流体のミニスカス(miniscus)のために、落
射蛍光画像の反射がデータ解析に影響し得る。
【０１３０】 実施例９ 化学ルミネッセンス産物 ホースラディッシュペルオキシダーゼの化学ルミネッセンス基質として利用可
能な二つの生産物を、ＭＡＰＳアッセイの検出法で比較できる。ＭＡＰＳプレー
トを実施例８のように調製し、ビオチニル化リンカーオリゴヌクレオチドとイン
キュベートする。次いで、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファター
ゼ(ＡlkＰhos:ＳＡ)またはＨＲＰ：ＳＡのいずれかを添加し、続いて、洗浄し、
ＡlkＰhos:ＳＡのプレートにはＣＤＰ-Ｓtar(Ｔropix)またはＨＲＰ:ＳＡのウェ
ルにはＥＬＣ-Ｐlusを添加する。ＳＡ誘導酵素および基質での標識は、ウェスタ
ンブロットの標識における使用に関して製造者が指示する通りである。これらの
二つ(および他の利用可能な基質)は、両方ともＭＡＰＳプレートへのオリゴヌク
レオチドハイブリダイゼージョンの評価に使用できる。
【０１３１】 実施例１０ ０.６mmでの解析 ＭＡＰＳアッセイの現在のシステムの解析は、各々ウェルあたり４回、０.６m
mのピッチ(中心から中心の空間)でスポットしたＭＡＰＳプレートをウェル当り
４つの異なるオリゴヌクレオチドアンカーで調製して試験する。次いで、cy５誘
導体化リンカーまたはビオチニル化リンカーをハイブリダイズし、検出し、上記
のようにスキャンする。落射蛍光測定に関して、解析は高い(そしてピッチは減
少できるようである)。化学ルミネッセンス検出法に関して、隣のスポットと完
全に離れておらず、この空間で、まだ個々のピークはコンピューターデコンヴォ
ルーションにより明白に解析し得る。
【０１３２】 実施例１１ 試験ヌクレアーゼ保護プロトコール ヌクレアーゼ保護プロトコールのハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ
処理の最適条件の試験のアッセイにおいて、Ａmbion(Ａustin, Ｔexas)のＮucle
ase Ｐrotection Ａssay Ｋitを使用して条件、緩衝液および酵素を提供する。
８個のサンプルを３つの緩衝液の一つに調製する。Ｈyb Ｂuff １は１００％Ｈy
bridization Ｂuffer(Ａmbion)；Ｈyb Ｂuff ２は７５％Ｈybridization Ｂuffe
rおよび２５％Ｈybridization Ｄilution Ｂuffer(Ａmbion)およびＨyb Ｂuff
３は各々５０％である。試験mＲＮＡに相補的な６０残基を含む７０量体オリゴ
ヌクレオチドを合成し(Ｂiosource Ｉnternational, Ｃamarillo, ＣＡ)、Ａmbi
onによりソラレン-ビオチンの標識について示されるプロトコールにしたがって
、ソラレン-フルオレッセイン(Ｓchleicher and Ｓchuell, Ｋeene, ＮＨ)で標
識する。簡単に、保護フラグメントを２０μlのＴＥ緩衝液(１０mＭ Ｔris、１m
Ｍ ＥＤＴＡ、pＨ８)中５０μg／mlに希釈し、１０分間沸騰させ、急速に氷水で
冷やす。ＤＭＦ中の４μlの１３０μg／mlソラレン-フルオレッセインを添加し
、サンプルを４５分、４０℃で手に持てる波長のＵＶ源で照射する。遊離ソラレ
ンフルオレッセインを飽和ブタノールでの抽出により除去する。使用したmＲＮ
Ａは、アンチセンスプラスミド(ＡmbionのpＴＲＩ-ＧＡＰＤＦ-Ｍouseアンチセ
ンスＣontrol Ｔemplate)から、Ｔ７プロモーターおよびＭaxiＳcriptキット(Ａ
mbion)を使用して製造したＧＡＰＤＨアンチセンスmＲＮＡである。短保護フラ
グメントは、別々に合成し、同様に標識した６０量体相補的部分である。保護フ
ラグメントの配列は下記の通りである：
【表２】
【０１３３】 ハイブリダイゼーションを、保護フラグメントを２０nＭでＧＡＰＤＨ mＲＮ
Ａを６０nＭで１０μlの最終容量に２時間、２２℃または３７℃で混合すること
により行う。ハイブリダイゼーションに続いてヌクレアーゼの混合物２００μl
を、製造者(Ａmbion Ｎuclease Ｐrotection Ｋit, ヌクレアーゼ混合物の１:２
００希釈)の指示にしたがって添加し、再び同じ温度で３０分インキュベートす
る。加水分解をＨybridization Ｉnhibition Ｂuffer (Ａmbion)で停止させ、オ
リゴヌクレオチドをペレット化し、エタノールで洗浄する。１０μlの１×Ｇel
Ｌoading Ｂuffer (Ａmbion)を添加し、オリゴヌクレオチドを１５％ＴＢＥ-尿
素ゲルで分離する。ゲルを３０分、流出緩衝液で渦を巻かせ、プラスチックプレ
ート上におき、励起および放出波長の選択のためのフルオレッセインフィルター
を使用してＴundraで結像させる。画像をＣＣＤアレイに２分蓄積する。最良の
条件は、Ｈyb Ｂuff ２で３７℃またはＨyb Ｂuff ３で２２℃でインキュベー
トしたサンプルである。これらのサンプルにおいて、検出可能な完全長保護フラ
グメントは残っておらず、あきらかに短保護フラグメントと同じサイズの有意な
量の完全長保護フラグメントの部分が見られる。
【０１３４】 実施例１２ ＮＰＡ-ＭＡＰＳによるmＲＮＡアッセイ(図１５参照) 完全ＮＰＡ-ＭＡＰＳプロトコールを、実施例１１に記載のものと同じハイブ
リダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理の条件で使用した。１０個のサンプル
をアッセイで流した。全て、同じ量の７０量体オリゴヌクレオチド保護フラグメ
ントおよび異なる量のＧＡＰＤＡ mＲＮＡを含んだ。０.０８mg／ml Ｙeast Ｒ
ＮＡ(Ａmbion)含有５０％Ｈybridization Ｂufferおよび５０％Ｄilution Ｂuff
erの１０μlの中のハイブリダイゼーションサンプルを９０℃で６分加熱し、７
０℃で５分加熱して短く遠心し、１９℃に冷やして１９時間インキュベーション
した。２００μlのヌクレアーゼ混合物を次いで各サンプルに３０分、１９℃で
添加した。各サンプルを、ＭＡＰＳアッセイのために６０μlに等分した。２μl
の１０Ｎ ＮaＯＨおよび２μlの０.５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、サンプルを９０℃
に１５分、３７℃に１５分加熱し、２０分室温で放置した。次いで、サンプルを
２μlの１０Ｍ ＨＣlで中和し、２Ｍ ＨＥＰＥＳ pＨ７.５および２００nＭの保
護フラグメントに特異的なビオチニル化ディテクターオリゴヌクレオチドを含む
１２μlの２０×ＳＳＣを、１μlの１０％ＳＤＳと共に添加した。サンプルを混
合し、８０℃で５分加熱し、各サンプルの２個の３５μl量をＭＡＰＳプレート
の二つのウェルにピペット輸送した(各サンプルを二つにわけ、ＭＡＰＳプレー
トでデュプリケートで流す)。プレートは標準ＭＡＰＳプロトコールのために調
製されており、保護フラグメントに特異的な自己凝集ＣＹ５誘導体化リンカーが
既に結合している。ＭＡＰＳプレートを覆い、５０℃で一晩インキュベートし、
発光の検出を記載のように行った。最後のサンプルにおいて、保護フラグメント
単独ではＭＡＰＳでどのように検出されるかの可視化のコントロールとして、ヌ
クレアーゼをアッセイ中に添加しない。図の下部において、ウェルの上の列の強
度スキャン(イメージャーの分析として)を示す。サンプルに存在するＧＡＰＤＨ
mＲＮＡの量(即ち、ＭＡＰＳプレートに等分した後の各デュプリケートにおけ
る量)を図に列記する。
【０１３５】 ＭＡＰＳプレートに使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである：
【表３】 ＊アンカーを５'末端でＣ１２スペーサーにより合成した。＊＊ リンカーを５'末端に結合したＣy５で合成した。＊＊＊ ディテクターオリゴヌクレオチドを５'末端に結合したビオチンで合成し
た。
【０１３６】 実施例１３ 希釈曲線、ＮＰＡ-ＭＡＰＳ(図１６参照) 実施例１２に記載のおよび図１５に示すデータを定量し、希釈曲線としてプロ
ットした。二つのデュプリケートウェルの全８スポットの平均および標準分散を
mＲＮＡの各濃度に対してプロットした。結合曲線は、式： フラクション結合＝最大結合＊１／(１＋ＩＣ５０／Ｌ) 〔式中、最大結合は飽和時の最大結合、フラクション結合はリガンド濃度Ｌで結
合する量、およびＩＣ５０はフラクション結合が最大結合の半分であるリガンド
の濃度〕 に入れた。曲線は図上に点で示し、図で標識するように、ＩＣ５０＝４.２フェ
ムトモルの値で最も適合した。
【０１３７】 実施例１４ 全マウス肝臓ＲＮＡ抽出物におけるＧＡＰＤＨ mＲＮＡのＮＰＡ-
ＭＡＰＳアッセイ 全マウスＲＮＡ抽出物を、ＮＰＡ-ＭＡＰＳアッセイでＧＡＰＤＨ mＲＮＡに
ついてアッセイし、希釈曲線を作る。マウス肝臓由来の全ＲＮＡは、Ｑuiagenキ
ットを使用して調製する。ＲＮＡを０.５mＭ Ｍg-アセテート含有７０％ＥtＯＨ
に沈殿させ、１０μlの０.８nＭ保護フラグメント含有０.０５％ＳＤＳ含有５×
ＳＳＣ中に再懸濁した。添加した保護フラグメントはオリゴヌクレオチド７０塩
基長であり、その６０塩基がマウスＧＡＰＤＨに相補的である。マウスＧＡＰＤ
Ｈ mＲＮＡに相補的なフラグメントを使用する(“保護フラグメント”)か、これ
らの配列の相補物をネガティブコントロールとして使用する(“アンチセンスフ
ラグメント”)。
【０１３８】 保護フラグメント含有ＲＮＡサンプルを９０℃で５分加熱し、ハイブリダイゼ
ーションを、サンプルを７０℃にし、それらをゆっくり一晩で室温に冷却するこ
とにより行う。１：１０希釈のＳ１ヌクレアーゼ(Ｐromega)を、３０分、１９℃
で３０μlの１×Ｓ１ Ｎuclease Ｂuffer(Ｐromega)に添加し、１.６μlの１０
Ｎ ＮaＯＨおよび２.７μlの０.５Ｍ ＥＤＴＡで停止させる。サンプルを９０℃
で１５分、次いで３７℃で１５分加熱し、変性させてＲＮＡを破壊し、１.６μl
の１０Ｍ ＨＣlで中和し、ＭＡＰＳプレート上で一晩、２００mＭ ＨＥＰＥＳ p
Ｈ７.５添加５×ＳＳＣと一晩インキュベートし、それに３０nＭビオチニル化検
出オリゴヌクレオチドを添加する。洗浄およびＳＡ-ＨＲＰでの可視化を記載の
ように行う。シグナルの量は、マウスＲＮＡの量の減少(サンプルは５００、１
７０、５０、５または０.５μgのマウスＲＮＡを含む)と並行して減少する。二
つのコントロールサンプルは、Ｓ１ヌクレアーゼが添加されていないものを含む
。シグナルは、相補的保護フラグメントにのみ見られる。
【０１３９】 使用したオリゴヌクレオチド：
【表４】 ＊アンカーを、５'末端でアミドを有するＣ１２スペーサーで合成した。＊＊ リンカーを５'末端に結合したＣy５で合成した。＊＊＊ プローブを５'末端に結合したビオチンで合成した。
【０１４０】 実施例１５ コントロールを含むヌクレアーゼ保護ＭＡＰＳアッセイ mＲＮＡはマウス肝臓から抽出され、ヌクレアーゼ保護は、ＧＡＤＰＨ特異的
保護フラグメントがマウスＧＡＰＤＨに相補的な６０ヌクレオチドを含み、標的
に相補的ではないフラグメントの３'で１５“オーバーハンギング”ヌクレオチ
ドが続く以外、本質的に実施例１４に記載のように行う。ハイブリダイゼーショ
ンおよびヌクレアーゼ消化後、残りの保護フラグメントを、二つの異なるオリゴ
ヌクレオチド検出フラグメントを固定化保護フラグメントの検出に使用する以外
、本質的に実施例１４に示すようにＭＡＰＳプレートとハイブリダイズさせる。
一つの検出フラグメントは保護フラグメントのＧＡＰＤＨ特異的部分に相補的で
あり、他方、コントロールは保護フラグメントの１５塩基オーバーハング部分に
相補的である。各検出フラグメントは異なる複製サンプル(即ち、異なるウェル)
で使用し、両方の検出フラグメントが同じ検出分子で標識できるようにする。本
実施例においては、両フラグメントをＨＲＰで標識する。ヌクレアーゼの添加な
しに、両方の検出フラグメントのからのシグナルが見られる；一方、ヌクレアー
ゼ消化が行われたときは、ＧＡＰＤＨ配列に対応するシグナルのみが検出できる
。ＧＡＰＤＨ特異的シグナルの量は、保護フラグメントを存在するＧＡＰＤＨ m
ＲＮＡの量に対し対して過剰に添加したため、ヌクレアーゼ消化の不存在下で見
られるものに相対して減少する。これは、ＧＡＰＤＨ mＲＮＡの量が保護ハイブ
リダイゼーションを限定し、形成された二本鎖の量(したがって、ヌクレアーゼ
から保護された保護フラグメントの量)がmＲＮＡを反映するするようにする。m
ＲＮＡが反応混合物に含まれないとき、ヌクレアーゼを検出したときシグナルは
検出できない。上記の発見は、アッセイのハイブリダイゼーションおよび消化段
階が所望により起こっていることを証明する。
【０１４１】 種々の標的に対応する保護フラグメントがアッセイに包含される場合、各保護
フラグメントは同じオーバーハング部分の１５塩基を含むことができる。これは
、全てのサンプルの残りのオーバーハングのテストに使用するためのフラグメン
トの検出を可能にする。
【０１４２】 実施例１６ 疾病状態と相関する遺伝子の発現を変え得る化合物のスクリーニン
グの転写アッセイ ヒト腫瘍由来の細胞系を使用する。正常細胞よりも高いレベルで３０遺伝子が
発現されることが判明している。(即ち、これらの３０遺伝子は正常細胞でより
も使用されおり、mＲＮＡを造り、続いて遺伝子が指示するタンパク質を製造す
る。転写アッセイは、各遺伝子のmＲＮＡがどの程度存在するかにより、どの程
度遺伝子が使用されているかを測定する。)ＭＡＰＳプレートでのヌクレアーゼ
保護アッセイ(ＮＰＡ-ＭＡＰＳ)を使用して、８８００個の化学化合物を試験し
て、化合物存在下での細胞の成長が、５個の正常(構造的、“ハウスキーピング
”)遺伝子の発現に影響することなく３０個の相関的遺伝子のいくつかの発現を
減少できるかを見るために試験する。効果を有する化合物は、この種の腫瘍の処
置の医薬の開発に将来的に有用であるかも知れない。
【０１４３】 約１０,０００から１００,０００細胞を、１００個の９６ウェルポリスチレン
プレートの各ウェルに添加し、それらが各ウェルの表面を覆うまで２日間生育さ
せる。各プレートの８ウェルに関して、細胞を添加なしで生育させる。残りの各
プレートの８８ウェルに、異なる量の化学化合物を添加し、その効果単独を試験
できるようにする。同時に１００プレートを使用することにより、８８００個の
化合物が同時に試験またはスクリーニングできる。細胞を２４時間、化合物の存
在下で生育させ、次いで細胞をアッセイのために回収する。各プレートの細胞を
９６ウェルプレートのサンプル中のＲＮＡの調製に関する指示にしたがって(例
えば、Ｑuiagen ＲＮeasy ９６キットにしたがって)処理する。ＲＮＡを調製し
た後、３０個の相関的遺伝子および６個の正常“ハウスキーピング”遺伝子を含
む３６個の異なるmＲＮＡ種の量をＮＰＡ-ＭＡＰＳ試験により定量する。各々目
的の遺伝子の一つに対応する３６ＤＮＡオリゴヌクレオチド保護フラグメントを
各ウェルに添加し、その標的mＲＮＡ配列に、選択したストリンジェントな条件
下でハイブリダイズさせる。次いで、Ｓ１ヌクレアーゼを添加して過剰の非ハイ
ブリダイズＤＮＡを破壊させ、サンプルを化学的に処理して同様にＲＮＡを破壊
する。左は、どの程度のmＲＮＡが各サンプルの処理細胞に含まれているかに比
例する、各３６遺伝子のオリゴヌクレオチド保護フラグメントである。
【０１４４】 各々３６個の異なるアンカーオリゴヌクレオチドの複数のアレイを各ウェルに
含む１００個の９６ウェルプレートを各ウェルに３６個の異なるリンカーオリゴ
ヌクレオチドを添加することにより調製する。リンカーは各ウェルに表面に自己
凝集し、一般的プレートを３６個のオリゴヌクレオチド保護フラグメントの各々
に特異的なプローブを含むＭＡＰＳプレートに変える。各リンカーは３６個のア
ンカーの一つに特異的な部分および３６個の保護オリゴヌクレオチドのセグメン
トの一つに特異的な部分を含む。１００個のサンプルプレートの各ウェルからの
オリゴヌクレオチドサンプルを１００個のＭＡＰＳプレートの対応するウェルに
添加する。選択したストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション後、
結合した化学ルミネッセント酵素を有する各標的のための検出オリゴヌクレオチ
ドを添加し、各ウェルの各特異的スポットが、サンプル中にどの程度mＲＮＡが
存在するかに依存して照らされる。６個のハウスキーピング遺伝子への作用無し
に相関的遺伝子の量が減少したウェルは、興味深い。これらのサンプルの細胞に
添加した化合物は、抗腫瘍剤の開発の出発点の可能性がある。
【０１４５】 実施例１７ 誘導および構造的遺伝子発現 ＲＮＡを、本質的に実施例１４に記載のように、アデノウイルスに感染してい
ない(“コントロール”)または感染１時間後(“感染”)のマウスの肝臓から調製
した。肝臓ＲＮＡの６０μgを各サンプルに使用し、サンプルをデュプリケート
で調製した。各アッセイウェルはデュプリケート位置を３組含み、上記の３つの
遺伝子に対応する。各位置はアンカーを含み、３つの遺伝子の一つの対応する保
護フラグメントに相補的なプローブを含むリンカーに結合する。ヌクレアーゼ保
護ＭＡＰＳアッセイを、本質的に図１２に記載のように行い、記載のように画像
を集めてスキャンした。３個のmＲＮＡ標的の各々に関してデュプリケートのウ
ェルの回収した生データおよびスキャンした強度を示す。スキャン線上の数は、
統合強度値および各条件の標準偏差(n＝４)である。変化が予期されないハウス
キーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨは、統計的に有意ではない１.３倍の僅かな増加
を感染サンプルで示した。ＭＩＰ-２およびc-junの転写は各々４および６倍に増
加した。これらの発見は、二つの遺伝子、ＭＩＰ-２およびc-junが、コントロー
ルの構造的発現遺伝子ＧＡＰＤＨと比較して、アデノウイルス感染に反応して促
進された反応を示すことを証明する。
【０１４６】 実施例１８ チロシンまたはセリンキナーゼを選択的に阻害する化合物のスクリ
ーニングの酵素アッセイ キナーゼはタンパク質にリン酸を結合させる酵素である。多くは正常および新
生物形成的細胞生育を刺激することが示されている。これ故、特異的キナーゼ(
しかし、全てのキナーゼではない)を阻害する化合物は、どのキナーゼが病因に
関与するかの試験に使用でき、そしてもしそうなら医薬開発の出発点として働く
。例えば、細胞生育の刺激または炎症性反応の調節に関与する５個のチロシンキ
ナーゼはsrc、lck、fyn、Ｚap７０およびyesである。各キナーゼは、チロシンを
含む短いペプチドとして、基質が部分的に同定される。キナーゼ種のいくつかは
重複し、異なるキナーゼがあるペプチドを、同等に、しかし、他のものが優性に
リン酸化し得る。５個のキナーゼに関して、３６個のペプチド基質は、特異的お
よび重複特性を示すものを選択する。
【０１４７】 １００個の９６ウェルプレートを使用する；各ウェルは３６個の一般的オリゴ
ヌクレオチドアンカーを含む。３６個のリンカーを調製し、一般的オリゴヌクレ
オチドアレイ(アンカーのみ)からペプチド基質を含むアレイに変換する。３６個
のペプチド基質を合成し、各々アミド結合を介して、例えば、５'アミノ基を含
むオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合させる。オリゴヌクレオチドは、アン
カーに特異的にハイブリダイズする配列を含む。ペプチド／オリゴリンカーは、
それらをＭＡＰＳプレートの全てのウェルに添加することにより表面に自己凝集
させる。
【０１４８】 スクリーニングのために、適当な濃度(基質のリン酸化の速度ができるだけ平
衡している)の５個のキナーゼを各ウェルに、８８００個の異なる試験する化合
物と共に添加する。化合物を、単離酵素を直接阻害する能力に関して試験する。
各アレイ化ペプチドのリン酸化の量を、チロシンがリン酸化されたペプチドのみ
に結合する標識抗体の添加により検出する。ホスホチロシンスポットのいくつか
で減少を示すが、全てのスポットではないウェルが興味深い。これらのウェルに
添加した化合物は、更に、試験したキナーゼのいくつかの選択的阻害剤の可能性
について試験できる。
【０１４９】 アッセイのスキームを図１７の上部パネルに示す。２５個の塩基対オリゴヌク
レオチドがアンカーの一つに相補的なキメラリンカー分子をチロシンホスホキナ
ーゼ酵素のペプチド基質に架橋する。キメラオリゴペプチド基質はオリゴヌクレ
オチドアンカーのアレイに自己凝集し、キナーゼ酵素をキメラのペプチド部分の
リン酸化に使用し、酵素反応を進行させた後、ペプチドのリン酸化の量を抗ホス
ホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体により、結合検出蛍光または酵素で検出す
る。
【０１５０】 アッセイの結果を下部パネルに示す。同一２官能性架橋剤であるＤＳＳ(Ｐier
ce)を使用して、オリゴヌクレオチドリンカーの５'アミノ基をリン酸化チロシン
で合成したペプチドのＮ末端に結合させた。一文字標記のペプチドの配列はＴＳ
ＥＰＱpＹＱＰＧＥＮＬ(配列番号３２)であり、pＹはホスホチロシンを意味する
。キメラは直接使用したか、または最初に６０分pＨ１４にし、チロシンのホス
フェート基を部分的に加水分解させて使用した。リン酸化または部分的脱リン酸
化キメラ分子はＭＡＰＳプレート内の相補的アンカー分子に、示す濃度で１時間
自己凝集する。洗浄およびウェルをＳＳＰＴＰ中の０.３％ＢＳＡで遮断後、Ｈ
ＲＰに架橋した抗ホスホチロシン抗体(Ｕpstate Ｂiotechnology, Ｌake Ｐlaci
d, ＮＹからの抗体４Ｇ１０)をＳＳＰＴＰ中１：３０００希釈で１時間添加し、
結合した抗体の量を化学ルミネッセンス基質であるＳuper Ｓignal Ｂlazeで検
出した。示す画像は１分、ＣＣＤアレイに蓄積させた。予期されるように、オリ
ゴペプチドに結合したリン酸の量に差異が見られた。この差異は、一連のキナー
ゼが、阻害剤の可能性のある異なる薬剤で処理したときにどのように作用するか
を測定するアッセイの基本である。
【０１５１】 実施例１９ ＳＨ２ドメインとリン酸化ペプチドの間の相互作用の選択的阻害剤
の検出のための結合アッセイ ＳＨ２ドメインはある成長調節タンパク質で結合サブユニットとして働く。ド
メインはリン酸化ホスホチロシン含有タンパク質またはペプチドに不完全な特異
性で結合する。即ち、あるホスホチロシンペプチドは１個または数個のＳＨ２タ
ンパク質に特異的に結合するが、他方は多くのＳＨ２タンパク質に広く結合する
。
【０１５２】 このアッセイに関して、リンカーはオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合す
るリン酸化ペプチドである。ペプチド部分は、選択ＳＨ２タンパク質の基に結合
する能力に関して選択する。リンカーは、一般的ＭＡＰＳプレートをＳＨ２タン
パク質の基に特異的なリガンドを有するプレートに変える。リガンドを担持する
１００個の９６ウェルＭＡＰＳプレートを造る。タンパク質を単離し、例えば、
cy５蛍光分子で標識する。
【０１５３】 ＳＨ２ドメイン／ホスホペプチド相互作用のスクリーニングのために、標識Ｓ
Ｈ２タンパク質の基を１００個の９６ウェルＭＡＰＳプレートの各ウェルに添加
し、各ウェルに異なる試験化合物を添加する。これゆえ、各化合物の個々のＳＨ
２タンパク質とそのホスホペプチドリガンドへの相互作用の効果が、試験される
。アッセイは、各表面結合ペプチドリンカーに付随した結合ＳＨ２タンパク質の
蛍光の測定のためである。減少した蛍光をあるスポットで示すが、全てのスポッ
トでは示さないウェルについて、添加した化合物を更にＳＨ２ドッキングの推定
選択的阻害剤として試験できる。
【０１５４】 実施例２０ ハイスループットスクリーニング(図２２参照) 一つの実験における９６ウェルからのシグナルの検出を証明するハイスループ
ットＭＡＰＳプレートを示す。同じオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーシ
ョンを８０ウェルの１６個の複製で測定した。示されるように、１２８０個のハ
イブリダイゼーションアッセイの再現性は非常に高かった。最も左および最も右
のカラムは、異なる濃度のオリゴヌクレオチドのシグナルの標準化のためのコン
トロールとして働く。
【０１５５】 同じ形態で、１６個の異なるオリゴヌクレオチドを各ウェルで試験でき、試験
をプレートの８０個の異なるウェルで繰り返す。もちろん、もっと多い数の異な
るオリゴヌクレオチドまたは他のプローブ(例えば、１００ヌクレオチドプロー
ブ)も各ウェルで試験でき、多くのプレートを同時に試験できる(例えば、９６ウ
ェルマイクロタイタープレート、１００プレート)。各サンプルに関して行うこ
とができるアッセイの多い数(例えば、後者の場合、約１００個の異なるアッセ
イ)および同時にアッセイできるサンプルの多い数(例えば、後者の場合、約９６
×１００または９６００の異なるサンプル)は超ハイスループットを提供する。
【０１５６】 実施例２１ 増幅した標的の調製(図２３参照) ＰＣＲプライマー(Ｐrimer Ｏne)を、プライマーオリゴヌクレオチドの５'末
端に導入された化学修飾を介して、固体支持体(例えば、ビーズまたは反応容器)
に結合せる。プライマーは、５'から３'で、化学修飾、制限酵素部位、および目
的の標的に相補的な配列(例えば、目的のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー)を含む。標
的を、結合したＰrimer Ｏneプラス、５'から３'で、ディテクターオリゴヌクレ
オチドに特異的な配列およびＰrimer Ｏneの標的と異なる部分に相補的な配列を
含むＰrimer ＴwoをＰＣＲプライマーとして使用したＰＣＲにより増幅する。Ｐ
ＣＲ増幅に続いて、増幅した標的ＤＮＡを洗浄して過剰の反応物質を除去し、Ｐ
rimer Ｏneの制限部位に特異的な制限酵素での開裂により、固体支持体から放出
させる。熱および／または化学法を使用して、制限酵素を不活性化し、二本鎖Ｄ
ＮＡ産物を変性する。放出された、一本鎖ＤＮＡ標的分し、次いで、アンカーお
よび／またはリンカーを含む表面と接触させ得、標的をＰrimer Ｔwoのディテク
ター特異的配列に相補的なディテクターオリゴヌクレオチドを使用して検出でき
る。
【０１５７】 実施例２２ 増幅した標的の調製 ＰＣＲプライマー(Ｐrimer Ｏne)を、プライマーオリゴヌクレオチドの５'末
端に導入された化学修飾を介して、固体支持体(例えば、ビーズまたは反応容器)
に結合せる。プライマーは、５'から３'で、化学修飾、プロテアーゼにより開裂
できるペプチド配列、および目的の標的に相補的な配列(例えば、目的のｍＲＮ
ＡのｃＤＮＡコピー)を含む。ペプチドの代わりに、特異的に開裂できる他の要
素も使用できる。例えば、実施例２１に記載のようなＰＣＲ増幅に続いて、まだ
固体支持体に結合しているＰＣＲ産物を変性し、(所望により)洗浄し、支持体に
結合した一本鎖分子の後ろにする。洗浄し、結合した分子を、次いで、(例えば
、適当なプロテアーゼでの処理により)放出させ、アンカーおよび／またはリン
カーを含む表面と接触させる。あるいは、変性に続いて放出された増幅標的の鎖
を、アンカーおよび／またはリンカーを含む表面と接触できる。いずれの場合も
、増幅した標的の一つの鎖のみ、リンカーと接触(例えばハイブリダイズ)し、増
幅した彪お的の逆の鎖からのハイブリダイゼーションとの強行が排除され、バッ
クグラウンドが減少する。リンカーは、増幅した標的配列のいずれか、または両
方に特異的に設計できる。
【０１５８】 実施例２３ 検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイ(図２４参照) 目的のｍＲＮＡを含むサンプルを、ｍＲＮＡに相補てきではない、標的特異的
部分およびコントロールオーバーハング部分を含むオリゴヌクレオチドを保護フ
ラグメントとして使用したヌクレアーゼ保護法に付す。ヌクレアーゼ消化に続き
、コントロールオーバーハング部分を、図の肥大部分に説明にように、望ましい
ように、開裂できる；またはオーバーハングは、図の右部分に説明するように、
消化されないようにできる。得られるヌクレアーゼ保護フラグメントを、標的特
異的部分およびコントロールオーバーハング部分を含む検出リンカーとハイブリ
ダイズさせる。図の左部分に示すアッセイにおいて、検出リンカーのコントロー
ルオーバーハング部分は、ハイブリダイズしないままである；対照的に、図の右
部分に示すアッセイにおいて、検出リンカーのオーバーハング部分は、保護フラ
グメントの残りのコントロールオーバーハング配列とハイブリダイズする。アッ
セイの次段階において、検出と相互作用できる部分を含むレポーター試薬を複合
体と相互作用させる。図の左部分に示すアッセイにおいて、レポーター試薬は検
出リンカーのハイブリダイゼーションに利用可能なままであるコントロールオー
バーハング特異的部分とハイブリダイズし、複合体がレポーター試薬のシグナル
伝達物質のために検出できる。対照的に、図の右部分に示すアッセイにおいて、
レポーター試薬は相補的配列がハイブリダイズエーションのために利用可能でな
いため、複合体と結合できず、シグナルは複合体に結合しない。
【０１５９】 本発明の多くのアッセイにおいて、レポーター医薬は検出リンカーに存在する
任意の配列と相互作用でき、コントロールオーバーハングに特異的な配列に限定
されない。
【０１６０】 実施例２４ 多重螢石(fluors)(図２５参照) ５つの場所、Ａ−Ｅを含む領域を図２５に示す。各場所は異なるグループの実
質的に同一のアンカー、アンカーＡ−Ｅを含む。場所Ａのアンカーに、４つの異
なるタイプのリンカーをハイブリダイズし、その各々はアンカーＡに特異的な部
分を含む。しかし、アンカーの各々は：標的１、２、３または４に対する異なる
標的特異的部分を含む。したがって、標的のアンカー／リンカー複合体へのハイ
ブリダイゼーション後、標的１、２、３または４は全て場所Ａで局在化するよう
にできる。同様に、４つの異なるタイプのリンカーが場所Ｂにハイブリダイズで
きる。各リンカーは、アンカーＢに特異的な部分を含むが、標的特異的部分は標
的５、６、７または８に特異的である。同様の形態で、標的９−１２は場所Ｃと
、標的１３−１６は場所Ｄとおよび標的１７−２０は場所Ｅと関連する。これら
の標的のいずれかを直接的または間接的に、例えば、アップコンタート可能な蛍
光団のような異なる、独立した検出可能な螢石で標的する場合、５つの独立した
場所での全２０個の標的を独立して検出できる。
【０１６１】 実施例２５ ハイスループット形態のアッセイ 本実施例において、本発明の転写アッセイを使用して遺伝子発現パターンにお
ける変化を、ハイスループットスクリーニングに容易な形態で検出し、定量する
。アッセイにおける全段階はロボットを利用して行う。慣用の洗浄段階は明確に
記載されていない。
【０１６２】 ＴＨＰ−１ヒト単球を９８ウェルＶ底マイクロタイタープレートで、５０,０
００または１５０,０００細胞／ウェルで生育させる。細胞は未処理であるか、
フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート(ＰＭＡ)で４８時間分化させ
。続いてリポポリサッカライド(ＬＰＳ)で４時間かっせいかする。処理に続き、
細胞をグアニジウムイソチオシアネート(guanidium isothyocyanate)で処理し、
必要になるまで凍結させる。ｍＲＮＡを、ビオチンポリ−ｄＴが結合したストレ
プトアビジン常磁性粒子を使用して得る。あるいは、全ＲＮＡをtri試薬(Ｓigma
Ｃhemical Ｃo., Ｓt. Ｌouis, ＭＯ)での抽出により得る。ｍＲＮＡまたは全
ＲＮＡのいずれかを含むサンプルを、ＤＮＡ保護フラグメントとして、各々が５
'から３'で、目的の１３個の標的の一つの特異的な２５量体(ＧＡＰＤＨ、ＩＬ
−１、ＴＮＦ−α、カテプシンＧ、cox-２、シクリン−２、ビメンチン、ＬＤ７
８-β、ＨＭＧ−１７、オステオポンチン、β−トロンボグロビン、アンギオテ
ンシンまたはアクチン)；１０量体スペーサー；共通オリゴヌクレオチドディテ
クタープローブに特異的な２５量体；および１５量体共通オーバーハング配列を
含むオリゴヌクレオチドの１３個の６０量体一本鎖の混合物を使用したヌクレア
ーゼ保護法に付す。ｍＲＮＡはそれにより、アッセイにおいて標的として働く化
学量論量の“対応するＤＮＡ保護フラグメント”に変換する。これらの対応する
ＤＮＡ保護フラグメントをコントロールオーバーハング配列とインキュベートす
るコントロール実験は、ヌクレアーゼ消化が望まれるように行われた場合に予測
されるように、実質的に目的のｍＲＮＡ標的に特異的な配列のみが対応する保護
フラグメントに存在することを示す。
【０１６３】 表面は本発明の方法により調製する。９６ウェルＤＮＡ Ｂind Ｐlateの各ウ
ェルにおいて、１６個の異なる２５量体オリゴヌクレオチドアンカーのアレイを
置く。一つのアンカー種はアレイの４つのうち３つのアレイのコーナーに使用し
、１３の異なるアンカー種を使用し、１個はそれぞれにアレイにおける残りの位
置で使用した。アンカーを次いで、定義された直交パターンにおいて、各々５'
から３'で、目的の１３個の標的の一つに対応する２５量体、１０量体スペーサ
ーおよびアンカーの一つに特異的な２５量体を含む６０量体オリゴヌクレオチド
リンカーとハイブリダイズする。したがって、複数反復１６スポットアレイのい
ずれかで、１３個の標的特異的リンカーの各々はアレイの異なる位置(場所)に局
在化する。このような直交アレイの説明に関して図１８参照。内部標準化コント
ロールとして働く構造的に発現されるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ
に対応するリンカーが、各アレイ内の３つの場所に示される。コントロール実験
は、実験に使用したリンカー、ならびに保護フラグメントおよびディテクターオ
リゴヌクレオチドが、望ましい特性を示すことを示す。
【０１６４】 上記のように調製した対応する保護フラグメントの混合物を含むサンプルを、
アンカー／リンカーアレイにハイブリダイズする。未処理または誘導したクラス
ターのいずれか由来のサンプルを使用する。次いでハイブリダイズした保護フラ
グメントの各場所での存在および量を、標識ディテクターオリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションにより検出する。各場所でのシグナルの量を標準化す
るために、本明細書に記載のように、ディテクターオリゴヌクレオチドを適当な
量の遮断されたオリゴマーで希釈する。各場所でのシグナルの量を処理し、コン
トロールＧＡＰＤＨシグナルに対して標準化する。得られたデータは、違う日に
行った８回繰り返したサンプルで、ならびに３つの異なる実験で調製したサンプ
ルで再現性がある。一つの実験における１３個の転写物の相対的な発生量を下記
の表に示す。
【表５】
【０１６５】 実施例２６ 複数アレイプレートデータの定量のためのコンピューターアルゴリ
ズム 好ましいアルゴリズムは、ＭＡＰＳプレートの全スポットの位置を発見し、各
データポイントに関するシグナルの振幅の適合度概算を自動的に計算する。好ま
しくは、アルゴリズムはコンピュータープログラムにより実行される。
【０１６６】 １ − 試験する最初のウェルを含むイメージの各ピクセル(画素)の強度値を含
むイメージデータの小部分、４０×４０ボックスを選択する。 ２ − １６の未知数を使用した各ピクセル位置で予測される強度を計算する関
数を定義する。未知数は： 各１３個の異なるマイクロアレイスポットの振幅(即ち、ＤＮＡアレイの各位置
で、実際のシグナルがどのくらい明るいか)。各ウェル内の４×４(＝１６)スポ
ットに関して、１６スポットの幾つかがある標的に関して２重であるため、１３
個ある。 この特定のウェル内のスポットの４×４アレイの正確な位置を定義するｘオフ
セットおよびｙオフセット。 ウェル内の図のバックグラウンド強度。
【０１６７】 各ピクセル位置の関数は、ピクセルと各スポットの間の距離を計算し、一定の
距離に関するインパルス反応関数によりスポット振幅を増幅することにより、そ
のピクセルで観察される強度とする寄与と合う。インパルス反応関数に使用する
画像は、適当な(一定)半径のＧaussian およびＬorentzianの合計により定義す
る。
【０１６８】 ３ − パラメーターの値を素早く推測することにより現在のウェルへの適合を
開始する。これを行うために、スポットがあると予測される図の１６個の領域に
関して平均イメージ強度を計算する。これらの１６の平均ｋらオフセットを引き
、一定計数により差異を測る。結果を再整理し、１６スポットを１３振幅と適合
させる。バックグラウンドおよびオフセットに関して、任意の小さな数を使用す
る。
【０１６９】 ４ − 適合した値(１６の未知数に関して)を、曲線適合により適合させる。特
に、１６の未知数を４０×４０＝１６００等式に適合させるため(もちろん全て
の式が直線的に独立しているが)、適合関数を直線化するため、Ｍarquadt法の非
直線最小２乗アルゴリズムを使用する。
【０１７０】 ５ − 現在のウェルに関して適合させたｘ、ｙオフセットを使用して、グリッ
ドがマイクロプレートの次ぎのウェルに関してである改善された関連で概算する
。９ミリメートルオフセットが次ぎの隣接ウェルに関して比例すると予測される
(ピクセルの数における距離を、イメージングシステムの倍率計数により変換し
て)。ウェルの間の距離はプレートのサイズに対して小さいため、位置の局所概
算の使用が最も正確である。
【０１７１】 ６ − 位置の改善された概算で、ピクセルの３０×３０ボックスに移動した、
隣のウェルのイメージの小さいボックスを定義する。これは適合法をより速くす
る。 段階２に戻り、各ウェルに関して繰り返す。
【０１７２】 前記から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認でき、その精神および範
囲から逸脱することなく、本発明を種々の使用および条件に適応するように変化
および修飾できる。 更に努力することなく、当業者は、前記を使用して、本発明をその完全な範囲
で利用できると考えられる。前記は好ましい具体的態様を記載し、したがって、
単に説明的であり、如何なる方法でも明細書の残りの記載を限定しない。 上記および図面で引用した全ての出願、特許および刊行物は、本明細書に引用
して包含させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 リンカー１がアンカー１に特異的な部分および標的mＲＮＡ１に特
異的な他の部分(プローブ)を含み、標的検出プローブ１が、リンカーの標的特異
的部分の配列と異なる標的mＲＮＡ１の配列に特異的である、オリゴヌクレオチ
ドの設計スキームを図解する。
【図２】 １５個の試験領域を含み、各々６アンカーオリゴヌクレオチドのア
レイを含む、表面を図解する。
【図３】 リンカーのアンカー特異的部分がプローブ部分(レセプタータンパ
ク質)にビオチンおよびストレプトアビジン分子を介して結合し、レセプターに
特異的なリガンドが蛍光標識分子で標識されている、レセプター結合アッセイの
リンカーの設計を図解する。Ｂ：ビオチン。ＳＡ：ストレプトアビジン。Ｒec：
レセプタータンパク質。リガンド：レセプターのための天然または合成リガンド
。＊：リガンドに結合する蛍光標識分子。
【図４】 ２１個の試験領域を含み、その各々が更に１６個の小領域に分割(
へこみ、くぼみ)されている表面を図解する。
【図５a】 ウェルセパレーターを示す。
【図５b】 サブディバイダーを示す。
【図５c】 基盤を示す。
【図６】 各々“バーコード”様形であるプローブ(またはアンカー)の直線ア
レイを含む、二つの試験領域を示す。
【図７】 各々で多コピー(“グループ”)で存在する３アンカー(Ａ、Ｂおよ
びＣ)を含む試験領域を模式的に示す。アンカーの各グループの位置は、“位置
”と名付ける。
【図８】 特異的逆転写酵素により産生されるcＤＮＡがＭＡＰＳプレート上
でアッセイさせるアッセイを図説する。
【図９】 ヌクレアーゼ保護法を使用するアッセイを図説する(ＮＰＡ-ＭＡＰ
Ｓアッセイ)。サンプルＲＮＡを細胞または組織から調製し、薄波状線として示
す。ＲＮＡサンプルにポリヌクレオチド保護フラグメントのグループを添加し、
太い、濃いそして薄い線で描く。保護フラグメントの濃い部分は特異的ＲＮＡ標
的に相補的であり、これらの標的にハイブリダイズするセグメントを示す。薄い
部分はオーバーハンギング部分を示す；配列は相補的配列と接触するが、標的と
相補的ではない。保護フラグメントを過剰に添加する。全ての利用可能な標的の
保護フラグメントへのハイブリダイズに続いて、サンプルをヌクレアーゼの適当
なカクテルおよび化学処理で処理し、望ましくない非ハイブリダイズＲＮＡおよ
び非ハイブリダイズポリヌクレオチドを破壊する。例えば、Ｓ１ヌクレアーゼは
、存在する一本鎖ＤＮＡを破壊できる。これ故、過剰の保護フラグメントを結合
保護フラグメントのオーバーハンギング非ハイブリダイズ部分として加水分解す
る。ＲＮＡはリボヌクレアーゼＨを含むリボヌクレアーゼの添加によりまたは塩
基中でサンプルを加熱することにより破壊できる。残りは、各ＲＮＡ標的がサン
プルにどの程度存在するかを反映する開裂保護フラグメントの収集物である。残
りの保護フラグメントwＭＡＰＳハイブリダイゼーションアッセイで測定する。
【図１０】 ＭＡＰＳアッセイにおけるハイブリダイゼーション特異性を図説
する。
【図１１】 アンカーのリンカーへの結合動態を図説する。
【図１２】 二つのオリゴヌクレオチド標的のＭＡＰＳアッセイを図説する。
【図１３】 感受性シフトの定量を図説する。
【図１４】 ４つのリンカー／アンカー組合わせの融点温度決定を図説する。
【図１５】 ＮＰＡ-ＭＡＰＳによるmＲＮＡアッセイを図説する。
【図１６】 ＮＰＡ-ＭＡＰでの希釈曲線を図説する。
【図１７】 ホスホチロシン残基を含むペプチドの検出のためのアッセイを図
説する。
【図１８】 マップＥＳＴのアッセイの第１段階を図説する：ＭＡＰＳプレー
トの一般的アンカーのアレイにマップするＥＳＴの各々に対応する凝集リンカー
の凝集。１６ウェルのマイクロプレートの各表面に１６個の異なるオリゴヌクレ
オチドプローブを含むリンカーが結合し、４×４マトリックスに配置する。第１
位置はオリゴ１を有し、これは第１ＥＳＴ配列の部分に相補的であり、試験する
１６ＥＳＴのためにこのようにする。 ＥＳＴを得た遺伝子から産生されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを全１６ウェルに添
加し、適当な条件下でハイブリダイズさせた。それ故、１６ＥＳＴ配列の一つを
含むcＤＮＡまたはmＲＮＡが、相補的プローブが置かれる位置に凝集する。
【図１９】 マップＥＳＴの続く段階を図説する：ＭＡＰＳプレートへのディ
テクターオリゴヌクレオチドの添加。プレートの各ウェルに、マップするＥＳＴ
の一つに対応するディテクターオリゴヌクレオチドを入れる。各ディテクターオ
リゴヌクレオチドは検出に使用する分子、例えば、検出の方法が蛍光イメージン
グである場合、フルオレッセインに結合したオリゴヌクレオチドである。各ディ
テクターオリゴヌクレオチドはＥＳＴの一つに相補的であるが、ＥＳＴ特異的プ
ローブが異なり、一つのＥＳＴに相補的なプローブおよびディテクターオリゴヌ
クレオチドが同時に両方結合できる。 洗浄後、単一ディテクターオリゴヌクレオチドを、図に番号付けするように各
ウェルに添加する。即ち、第１ＥＳＴに相補的な配列を有するディテクターオリ
ゴヌクレオチドを第１ウェルになどである。
【図２０a】 図１８および１９に示すマップＥＳＴのアッセイの結果を示す
。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なスト
リンジェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの１６ウェル
をＣＣＤベースの蛍光イメージャーで結像する。図２０aは様式化した結果を示
す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するＥＳＴ特異的
プローブにより抑制されたmＲＮＡまたはcＤＮＡを標識すべきであることは予期
される。例えば、プローブ５はその位置で第５ＥＳＴ配列を含むcＤＮＡまたはm
ＲＮＡを凝集し、第５ディテクターヌクレオチドがまた同じ位置でcＤＮＡまた
はmＲＮＡをハイブリダイズしなければならない。これは、各検出オリゴヌクレ
オチドが適合プローブを標識する、これらの様式化データで当て嵌まる。加えて
、最初の３つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の３個により固定
されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並ん
でいることを示す。同様に、最後の５個のＥＳＴは結合しているように見える。
これらのデーターからの結合を図２０bにグラフ的に示す。
【図２０b】 図１８および１９に示すマップＥＳＴのアッセイの結果を示す
。ディテクターオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび適当なスト
リンジェンシーの条件下のでの洗浄後、例えば、マイクロプレートの１６ウェル
をＣＣＤベースの蛍光イメージャーで結像する。図２０aは様式化した結果を示
す。各ＥＳＴ特異的ディテクターオリゴヌクレオチドは、対応するＥＳＴ特異的
プローブにより抑制されたmＲＮＡまたはcＤＮＡを標識すべきであることは予期
される。例えば、プローブ５はその位置で第５ＥＳＴ配列を含むcＤＮＡまたはm
ＲＮＡを凝集し、第５ディテクターヌクレオチドがまた同じ位置でcＤＮＡまた
はmＲＮＡをハイブリダイズしなければならない。これは、各検出オリゴヌクレ
オチドが適合プローブを標識する、これらの様式化データで当て嵌まる。加えて
、最初の３つのディテクターオリゴヌクレオチドは、各々最初の３個により固定
されたcＤＮＡまたはmＲＮＡを標識を標識し、これらの配列が同じ遺伝子に並ん
でいることを示す。同様に、最後の５個のＥＳＴは結合しているように見える。
これらのデーターからの結合を図２０bにグラフ的に示す。
【図２１】 図１８-２０に示すプローブ、ディテクターオリゴヌクレオチド
およびＥＳＴ番号１、２および６の関係を図説する。
【図２２】 ハイスループットアッセイを図説する。
【図２３】 増幅標的の製造法を説明する。
【図２４】 検出リンカーとレポーター試薬でのアッセイを説明する。
【図２５】 複数の粉の使用を説明する。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２８日（２００１．１２．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ １０３ Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ // Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スティーブン・フェルダー アメリカ合衆国85718アリゾナ州ツーソン、 ノース・カシードラル・ロック・プレイス 7064番 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 CB01 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 4B024 AA11 AA20 CA09 CA10 HA13 4B029 AA07 AA23 CC13 4B063 QA01 QA18 QR08 QR56 QR62 QR63 QS25 QS32 QX02

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプルの添加前に、 a)少なくとも２つの実質的に同一な空間的に分離された領域を複数含む表面、そ
    れら各領域に含まれるのが、 b)少なくとも８種のオリゴヌクレオチドアンカー、それぞれが結合するのが、 c)オリゴヌクレオチドアンカーに特異的な第１の部分、および当該標的に特異的
    なプローブを含む第２の部分を有する二官能性リンカー、 を含む、サンプル中の１つまたはそれ以上の標的の検出に有用な組合せ。
  2. 【請求項２】 当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件下、
    当該標的を含むサンプルを請求項１の組合せに接触させることを含む、少なくと
    も１つの標的検出する方法。
  3. 【請求項３】 a)当該標的による当該組合せへの結合を効率的とする条件下
    、当該標的を含むサンプルを請求項１の組合せと接触させること、 b)当該組合せおよび任意の結合標的を標識検出プローブと接触させること、 c)当該検出プローブを検出すること を含む、少なくとも１つの標的を検出する方法。
  4. 【請求項４】 当該標的が保護フラグメントである、請求項２に記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 該標的をサンプルを該組み合わせと接触させる前にＰＣＲに
    より増幅させる、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 該標的を、いずれかまたは両方がプライマーを固体表面に結
    合させる化学修飾を含む二つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより増幅さ
    せる、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 該標的を、いずれかまたは両方が１個以上の制限酵素部位を
    含む二つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより増幅させる、請求項５に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 該標的を、プロテアーゼにより開裂できる１個以上のペプチ
    ド配列を含む二つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより増幅させる、請求
    項５に記載の方法。
  9. 【請求項９】 該標的を、いずれかまたは両方が該検出プローブに特異的な
    配列を二つのＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより増幅させる、請求項５に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該標識検出プローブがアップコンバートした蛍光団である
    、請求項３に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該組合わせおよび任意の結合標的が、いずれかが異なるア
    ップコンバートした蛍光団を含む標識プローブである、少なくとも二つの異なる
    標識検出プローブと接触させる、請求項３に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 更に、 a)当該組合せおよび任意の結合標的を標識検出プローブと接触させること、およ
    び b)当該検出プローブを検出すること を含む、請求項４に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該組合わせおよび任意の結合標的を、いずれかが異なるア
    ップコンバートされた蛍光団を含む標識プローブである少なくとも二つの標識検
    出プローブと接触させる、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 更に、 a)該組合わせおよび任意の結合標的を、該標的に特異的な部分および、検出リン
    カーと相互作用し、シグナル伝達物体を含むレポーター試薬に特異的な部分を含
    む検出リンカーと接触させること、 b)該検出リンカーと該レポーター試薬を接触させること、および c)該シグナル物体を検出すること を含む、請求項２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該標的がヌクレアーゼ保護フラグメントである、請求項１
    ４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 a)標的を含み得るサンプルと請求項１に記載の組合わせを
    、該標的が該組合わせに結合するのに有効な条件下で接触させること、 b)該組合わせおよび任意の結合標的と、いずれかが該標的の一つに特異的な部分
    および共通レポーター試薬に特異的な部分を含む少なくとも二つの検出リンカー
    と接触させること、 c)該検出リンカーと、該検出リンカーと相互作用し、シグナル伝達物体を含む該
    共通レポーター試薬を接触させること、および d)該シグナル物体を検出すること を含む、少なくとも二つの標的を検出する方法。
  17. 【請求項１７】 該標的がヌクレアーゼ保護フラグメントである、請求項１
    ６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該シグナル伝達物体がアップコンバートした蛍光団を含む
    、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 更に、 a)ＲＮＡ抽出物を、各々が該ＲＮＡに特異的ではない共通３'オーバーハンギン
    グ配列を含む２個以上の保護フラグメントと、該保護フラグメントが該抽出物に
    おける目的のＲＮＡとハイブリダイゼーションするのに有効な条件下でインキュ
    ベートさせること、 b)該インキュベートした抽出物を、該保護フラグメントの保護以外の核酸全てを
    実質的に消化するのに有効な１個以上のヌクレアーゼでの処理に付すこと、 c)目的の該ＲＮＡとハイブリダイズしている該保護フラグメント以外の実質的に
    全ての核酸物質を除去し、標的として、保護フラグメントを含むサンプルを提供
    すること、 d)該組合わせおよび該結合保護フラグメントを、各々が該標的の一つの特異的な
    部分および該共通３'オーバーハンギング配列に特異的な部分を含む少なくとも
    二つの検出リンカーと接触させること、 e)該検出リンカーと、該共通レポーター試薬に特異的であり、シグナル伝達物体
    を含むレポーター試薬と接触させること、および f)シグナル伝達物体を検出すること を含む、少なくとも二つの標的を検出するための、請求項２に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該シグナル伝達物質が、アップコンバートした蛍光団を含
    む、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 １個以上の該検出リンカーを遮断した検出リンカーで希釈
    する、請求項１９に記載の方法。
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