JP2003504061A

JP2003504061A - プラスミド配列の転写の間における異常型ｒｎａの形成を防止するための方法および組成物

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Publication number: JP2003504061A
Application number: JP2001509517A
Authority: JP
Inventors: シー・サティシュチャンドラン; キャサリン・ジェイ・パチャック
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-06-27
Publication date: 2003-02-04
Also published as: IL147026A0; CN1360631A; WO2001004313A1; EP1194556A1; MXPA01013462A; BR0012325A; KR20020030780A; AU5893700A; AU783681B2; CA2378653A1

Abstract

(57)【要約】一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、部分二本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ分子を包含するポリヌクレオチド分子は、宿主細胞にトランスフェクトさせた場合にこれらの分子からの望ましくないポリヌクレオチド種の産生を抑制するターミネーター配列および／または他の修飾を含有する。これらの分子は、トランスフェクトされた宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の転写効率を増強し、かつ望ましくない転写物が産生される可能性を減少させる方法に有用である。さらに、本発明の方法は、宿主細胞または宿主中に存在するある種のポリヌクレオチドの発現が消滅したりダウンレギュレーションされたりすることを回避するのに有用である。これらの組成物および方法は、治療、ワクチン、診断および研究の分野で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、望ましくないポリ核酸配列の発現を減少させることにより、宿主細
胞におけるポリ核酸配列の発現効率を増強するのに有用な方法およびポリヌクレ
オチド組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、新規な組成物およびかかる
組成物の使用により異常型ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の発現を防止する方法に関す
る。

【０００２】（背景技術）ポリヌクレオチド組成物は、医薬用途について、主として哺乳動物の疾患の治
療または予防ならびに当該分野における研究について報告されている。具体的に
は、病原体の細胞外および細胞内感染、例えば、ウイルス、細菌、真菌の感染な
どの治療にポリヌクレオチド組成物を用いる周辺には、現在のところ、多くの活
性が存在する。一例として、哺乳動物の免疫系を利用することにより病原体と戦
う薬剤をインビボで哺乳動物細胞に送達するＤＮＡワクチンが報告されている。
かくして、このようなワクチンは、例えば、ウイルスのタンパクまたはポリペプ
チドを発現し、かつ感染性病原体の攻撃により体液性または細胞性の免疫応答を
誘発するように設計される。一方、遺伝子治療ベクターは、哺乳動物において発
現されないか、不適切に発現されるか、あるいは発現されているタンパクを哺乳
動物細胞に送達するように一般的に設計されたポリヌクレオチド組成物である。
このようなベクターは、抗原性であると認識されるようなポリヌクレオチド配列
または望ましくない細胞免疫応答を喚起するようなポリヌクレオチド配列に対す
る種特異的な免疫応答を与えなければならないことが多い。ポリヌクレオチド組
成物のさらに他の治療用途は、罹患した哺乳動物の患者に対して欠損または発現
不足のタンパクを送達することである。さらに、ポリヌクレオチドは、それ自体
がインビボ試薬として、診断／造影プロトコルに、遺伝子治療の試薬として、ア
ンチセンスプロトコルに、ワクチンへの応用に、さもなければ、遺伝的欠陥、感
染症、癌および自己免疫疾患などの様々な疾患を治療または予防するのに用いら
れる医薬品として有用である。また、ポリヌクレオチドは、生物学的な研究の分
析や、医学、診断、スクリーニングおよび汚染検出の分析などの分析用インビト
ロ試薬としても有用である。

【０００３】当該分野で公知の幾多の問題は、多数のポリヌクレオチド組成物が有用な医薬
品として広く受け入れられるようになることを妨げている。かくして、医学界は
哺乳動物の疾患を治療するためのＤＮＡワクチンや治療法をほとんど受け入れて
いない。

【０００４】ポリヌクレオチド組成物に媒介される現象は、植物、線虫およびショウジョウ
バエにおいて観察されており、転写後遺伝子サイレンシングおよび転写サイレン
シングと呼ばれている。この現象は、植物、線虫またはショウジョウバエが、調
節要素（例えば、プロモーター）またはその細胞内ですでに発現されている本来
の遺伝子あるいはそれらの一部に対して何らかの相同性を有するポリヌクレオチ
ド配列を発現するウイルス、ウイロイド、プラスミドまたはＲＮＡにトランスフ
ェクトまたは感染すると、内在性の調節要素および／または遺伝子と外来配列と
の両方の発現が永久に阻害されることになる。このサイレンシング効果は、遺伝
子特異的であることが示された。例えば、エル・ティモンズ(L. Timmons)および
エイ・ファイヤー(A. Fire)、ネイチャー(Nature),395:354(1998年10月29日)；
エイ・ファイヤー(A. Fire)ら、ネイチャー(Nature),391:806-810(1998年2月19
日)；アール・ヨルゲンセン(R. Jorgensen)ら、サイエンス(Science),279:1486-
1487(1998年3月6日)；ジェイ・アール・ケナーデル(J.R. Kennerdell)およびア
ール・ダブリュー・カーシュー(R.W. Carthew)、セル(Cell),95:1017-1026(1998
年12月)；エル・ミスクィッタ(L. Misquitta)およびビー・エム・パターソン(B.
M. Paterson)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),96:1451-
1456(1999年2月)；エム・ケイ・モントゴメリー(M.K. Montgomery)ら、プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー
・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),95:15502-15507(1998年12月)を参
照。全長のプロ-α１コラーゲン遺伝子をコードするＤＮＡプラスミドは、齧歯
類の繊維芽組織細胞系に一過的にトランスフェクトされ、本来のコラーゲン遺伝
子と一過的に発現された遺伝子とに対する「サイレンシング」効果が観察された
［バーラミアン(Bahramian)およびザルブル(Zarbl)、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),19(1):274-283(1999年1月)］。

【０００５】ポリヌクレオチド分子の使用に関するさらに別の問題は、意図された遺伝子含
有転写物ではない異常型ＲＮＡまたはＤＮＡの形成である。異常型ＲＮＡまたは
ＤＮＡの形成は、トランスフェクトされたプラスミドまたはポリ核酸分子の使用
に際して発生し、標的遺伝子の発現効率を減少させると考えられている。異常型
すなわち正常でないＲＮＡの形成は、上記サイレンシング効果の１つの原因であ
り得る。

【０００６】転写を終結させるように機能する当該分野で入手可能かつ公知の配列は多く存
在する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼIIの転写中断部位は、特にこの部位が一過
的発現系の強いポリアデニル化シグナルのすぐ下流に位置する場合には、転写の
終結に関係している［ピー・エンリケ-ハリス(P. Enriquez-Harris)ら、エンボ
・ジャーナル(EMBO J.),9(7):1833-1842(1991)；ジー・ダブリュー・ハットフィ
ールド(G.W. Hatfield)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mo
l. Cell. Biol.),3(10):1687-1693(1983)］。

【０００７】しかし、今日まで、医薬、ワクチン、遺伝子治療および診断に関する分野でポ
リヌクレオチド発現の効率を増大させる用途に終結機構を利用する有効かつ機能
的な組成物または方法を創作する提案はなされていない。当該分野には、異常型
ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の形成を阻害し、宿主細胞における選択的ポリヌクレオ
チド配列の発現を増大させるポリヌクレオチド組成物およびそれを用いる方法の
必要性が存在する。

【０００８】（発明の開示）ある態様では、本発明は、第１コード鎖と第２転写鋳型鎖とからなる二本鎖ポ
リヌクレオチド（好ましくはデオキシリボ核酸）分子を提供する。この第１鎖は
、（ｉ）５'から３'方向に、プロモーター、選択的ポリヌクレオチド配列（その
発現は該プロモーターにより制御される）およびポリアデニル化部位からなる少
なくとも１個の発現カセット配列と、（ii）少なくとも１個の第１鎖ターミネー
ター配列とを有する。この発現カセットの選択的ポリヌクレオチド配列は、細胞
内で発現されて生物学的機能を行うことが望まれるいかなるポリヌクレオチド配
列であってもよい。第１鎖ターミネーター配列は、好ましくはプロモーターの５
'側に、ポリアデニル化部位の３'側に、発現カセット配列の外側にあって第１鎖
上に、または、発現カセット配列の選択的ポリヌクレオチド配列内に存在する。
第１鎖ターミネーターは、発現カセット配列に相補的な第２鎖上の配列からの転
写を妨害することがなく、しかも発現されるべきポリヌクレオチド配列の機能に
影響を与えない位置に存在する。第２鎖は第１鎖に相補的である。第１鎖ターミ
ネーター配列に相補的な第２鎖配列の位置は、第１鎖発現カセットに相補的な第
２鎖配列からの転写を妨害しない。さらに、第２鎖は、第２鎖から開始される転
写を終結させる少なくとも１個の第２鎖ターミネーター配列を有する。第２鎖タ
ーミネーター配列は、好ましくは第１鎖の発現カセットに相補的な配列の外側に
あって第２鎖上、かつ発現カセット配列に相補的な配列からの転写を妨害するこ
とがなく、しかもポリヌクレオチド配列の発現された場合の生物学的機能を損な
わない位置に存在する。

【０００９】別の態様では、本発明は、上記二本鎖ポリヌクレオチド分子と、細胞にポリヌ
クレオチド（例えば、ＤＮＡ）を取り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤と
、適当な医薬上許容される担体とからなる医薬組成物を提供する。このような組
成物は、細胞内への病原体（例えば、ウイルス）の感染を治療するのに有用であ
る。他のこのような組成物は、ある種の癌を治療するのに有用である。他のこの
ような組成物は、ある種の細胞外病原体を処理するのに有用である。

【００１０】さらに別の態様では、本発明は、上記二本鎖ポリヌクレオチド分子の第１鎖ま
たは第２鎖から選択される一本鎖ポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１１】さらに別の態様では、本発明は、上記一本鎖ポリヌクレオチド分子と、細胞に
ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を取り込ませるのを容易にする自由選択の
薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる医薬組成物を提供する。

【００１２】さらに別の態様では、本発明は、宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配
列の発現効率を増強する方法であって、宿主細胞を、上記二本鎖ＤＮＡ分子また
はその一本鎖でトランスフェクトし、それにより宿主細胞内でポリヌクレオチド
分子から転写される異常型ポリヌクレチド配列の形成を阻害する工程からなる方
法を提供する。

【００１３】別の態様では、本発明は、二本鎖または部分二本鎖領域の形成を防止するよう
に修飾された、５'末端および３'末端を有するリボ核酸の配列からなる一本鎖Ｒ
ＮＡ分子を提供する。ある具体例では、この分子は５'キャップを有する。別の
具体例では、この分子はキャップを有しない。別の具体例では、この分子は３'
ポリＡ尾部を有する。さらに別の具体例では、この分子はポリＡ尾部を有しない
。

【００１４】さらに別の態様では、本発明は、上記一本鎖ＲＮＡ分子と、細胞にＲＮＡを取
り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤と、適当な医薬上許容される担体とか
らなる医薬組成物を提供する。

【００１５】別の態様では、本発明は、宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の発
現効率を増強する方法であって、宿主細胞を、上記一本鎖ＲＮＡ分子でトランス
フェクトし、それにより宿主細胞における異常型ＲＮＡ分子の形成を阻害する工
程からなる方法を提供する。

【００１６】さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物の患者を治療する方法であって、上
記ポリヌクレオチド分子のいずれかと、細胞にＤＮＡまたはＲＮＡを取り込ませ
るのを容易にする自由選択の薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる有
効量の医薬組成物を投与することからなる方法を提供する。

【００１７】さらに別の態様では、本発明は、宿主細胞に存在するポリヌクレオチドに相同
な選択的ポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド分子でトランスフェ
クトされた宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の意図しない不活化(shuttin
g off)またはダウンレギュレーション(down regulation)を防止する方法であっ
て、上記ポリヌクレオチド分子と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを
容易にする自由選択の薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる有効量の
医薬組成物を投与することからなる方法を提供する。

【００１８】ある具体例では、ポリヌクレオチド組成物または分子は、酵素的合成法または
化学的合成法によりインビトロで作成される。別の具体例では、これらの組成物
または分子は、単離された組換え体培養物（例えば、細菌細胞）中で生成され、
下記の方法に用いられる。別の具体例では、この組成物は、宿主細胞に送達され
た後、インビボでポリヌクレオチド分子を生成する。

【００１９】本発明のさらに別の態様は、診断や他の研究分析に用いるためにインビトロで
、あるいは治療または他の医薬用途で宿主患者に戻すためにエクスビボで、宿主
細胞または組織における望ましくないポリヌクレオチド発現を減少または阻害す
る試薬など、研究方法に用いるための組成物および分子を提供する。

【００２０】本発明の他の態様は、その好ましい具体例に関する以下の詳細な説明において
さらに説明する。

【００２１】本発明は、無脊椎動物および脊椎動物種、特に哺乳動物種を苦しめる疾患およ
び障害の治療、予防、研究および診断用の新規なポリヌクレオチド組成物および
方法を提供する。ここで、目的は選択的ポリヌクレオチド配列の発現効率を増強
し、かつ望ましくない異常型ポリヌクレオチド種の形成を減少または阻害するこ
とである。また、これらの組成物および方法は、宿主細胞に本来存在するか、あ
るいはそこに挿入れているある種のポリヌクレオチド配列の意図しない不活化ま
たはダウンレギュレーションを防止するものである。ここで用いるように、「宿
主細胞」または「宿主」という用語は、脊椎動物または無脊椎動物の細胞または
それらの細胞からなる生命体を意味するものである。かくして、本発明は、哺乳
動物、好ましくはヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコおよびウマ）、動物園の動物
、飼育動物および実験動物だけでなく、他の脊椎動物（例えば、鳥類および魚類
）、ならびにそれらの細胞に有効なものである。また、本発明は、特に真核生物
細胞、原核生物細胞、他の無脊椎動物細胞に有効である。また、本発明の組成物
および方法は、植物細胞およびおそらく他の生物にも有用である。

【００２２】これらの組成物および方法は、インビトロ、エクスビボおよびインビボのいず
れでも有用性を有する。例えば、本発明が特にインビトロで有用な細胞としては
、幹細胞、安定な細胞系および初代細胞が挙げられる。本発明が特にエクスビボ
で有用な細胞としては、幹細胞および初代細胞が挙げられる。上記の細胞タイプ
は、いずれも本発明の方法および組成物のインビボでの応用に用いてもよい。さ
らに、これらの組成物および方法は、細胞の分子機構を利用して、治療、ワクチ
ン、診断または研究の目的を達成することを可能にする。

【００２３】Ｉ．本発明のＤＮＡ分子本発明の目的を達成するのに有用なポリヌクレオチド分子のある具体例は、以
下で詳しく説明する第１「コード」鎖と相補的な「転写鋳型」第２鎖とから形成
された二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡである。ここで用いるように、また、特に
断らない限り、「相補的」という用語は、二本鎖ＤＮＡに言及する際におけるそ
の伝統的な意味を有する。例えば、第１鎖におけるすべてのプリン、すなわちア
デニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)に対して、第２鎖は、対応する位置に、ピリミジ
ン、すなわち第１鎖のすべてのＡと水素結合するチミジン(Ｔ)またはウリジン(
Ｕ)か、あるいは第１鎖のすべてのＧと水素結合するシトシン(Ｃ)を有する。

【００２４】この二本鎖または部分二本鎖分子は、ＤＮＡベクター、ＤＮＡプラスミド、ま
たは、細胞内で発現させるためにポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように
設計されたいかなる二本鎖ＤＮＡ構築物であってもよい。この二本鎖分子は、あ
る具体例では線状であり、別の具体例では、この二本鎖分子は環状である。本発
明のＤＮＡ分子は、本発明に従って細胞内でＲＮＡ分子に転写されることができ
る配列をＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌIIまたはＲＮＡｐｏｌIIIの制御下に含
有する二本鎖プラスミドまたはベクターであり得る。好ましくは、プロモーター
がＲＮＡｐｏｌIIプロモーターである場合、ＲＮＡ分子をコードする配列は、ナ
ンセンスｍＲＮＡ監視分解機構により核内での分解を回避するために約３００個
より多いヌクレオチドからなるオープンリーディングフレームを有する。このよ
うなプラスミドまたはベクターとしては、細菌、ウイルスまたはファージ由来の
配列が挙げられる。このようなベクターとしては、染色体、エピソームおよびウ
イルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エ
ピソーム、酵母染色体要素、およびウイルス由来のベクター、その組合せ由来の
ベクター、例えば、プラスミドとバクテリオファージの遺伝要素、コスミドおよ
びファージミド由来のものが挙げられる。かくして、ある例示的なベクターは二
本鎖ＤＮＡファージベクターである。別の例示的なベクターは二本鎖ＤＮＡウイ
ルスベクターである。

【００２５】本発明のＤＮＡ分子のさらに別の具体例は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の第１
鎖または第２鎖の一方からなる一本鎖ＤＮＡ配列である。これらの鎖は、以下で
詳しく説明する。また、一本鎖ＤＮＡ分子は合成してもよく、一本鎖が以下で詳
しく説明する第１コード鎖の情報（例えば、第２相補鎖上に存在する任意のター
ミネーターの相補体を形成する配列）をすべてコードするように設計される。あ
るいは、また、第１鎖ＤＮＡ分子は、非コード鎖または転写鋳型第２鎖として合
成してもよい。この第２鎖は、一本鎖が以下で詳しく説明する第１（コード）鎖
の相補的な情報（例えば、第１鎖の一部を形成するターミネーター配列の相補体
だけでなく、この非コード鎖上に存在するターミネーター配列を形成する配列）
をすべてコードするように設計される。一本鎖分子は、ＤＮＡベクター、環状一
本鎖ＤＮＡ（例えば、バクテリオファージＭ１３から単離されたもの）、または
、細胞内で発現させるためにポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように設計
されたいかなる一本鎖ＤＮＡ構築物であってもよい。二本鎖分子について上述し
たように、一本鎖プラスミドまたはベクターとしては、細菌、ウイルスまたはフ
ァージ由来の配列を挙げることができる。かくして、ある例示的な分子は一本鎖
ＤＮＡファージベクターである。別の例示的な分子は一本鎖ＤＮＡウイルスベク
ターである。この一本鎖分子は、ある具体例では線状であり、別の具体例では、
この一本鎖分子は環状である。

【００２６】これらのＤＮＡ分子は、構築物からの望ましくない配列の発現を減少させなが
ら、選択的ポリヌクレオチド配列をインビボ、エクスビボおよびインビトロで効
率的な方法で発現させるのに採用することができる。

【００２７】Ａ．第１鎖本発明の二本鎖、部分二本鎖または一本鎖分子は、少なくとも１個の発現カセ
ット配列を有する第１鎖（センス鎖またはコード鎖ともいう）を有する。第１鎖
がビシストロニック(bicistronic)であれば、２個以上の発現カセット配列を含
有する。便宜的に、このような発現カセットは、宿主細胞内でその転写を可能に
するように調節成分に作動可能なように連結された選択的ポリヌクレオチド配列
を有する。ここで用いるように、「作動可能なように連結された」配列には、選
択的ポリヌクレオチド配列と隣接する発現制御配列と、このポリヌクレオチド配
列を制御するためにトランスに作用するか、あるいはある距離を置いて作用する
発現制御配列との両方が含まれる。かくして、発現カセットは、少なくとも、５
'から３'方向に、プロモーター、選択的ポリヌクレオチド配列、およびポリアデ
ニル化（ポリＡ）部位を含有する。

【００２８】他の発現制御配列としては、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエン
ハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの
効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；
翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザック(Kozak)コンセンサス配列）；タ
ンパクの安定性を増強する配列；必要な場合、コードされた産物の分泌を増強す
る配列が挙げられる。望ましくは、ＤＮＡ構築物の第１鎖は、さらに核局在化シ
グナルを付与される。核局在化シグナルは、転写が起こった場合に、選択的ポリ
ヌクレオチド配列をこの分子でトランスフェクトされた細胞の核に向かわせる。
適当な核局在化シグナルは、当業者に公知であり、本発明を限定するものではな
い［例えば、ディー・エイ・ディーン(D.A. Dean)、エクスペリメンタル・セル
・リサーチ(Exp. Cell Res.),230(2):293-302(1997年2月1日)］。

【００２９】本発明の目的では、本発明での使用に適したプロモーターは、当該分野で公知
の構成的な、誘発可能な、および／または、組織特異的なプロモーターから選択
される。本発明のある具体例では、発現カセットに用いられるプロモーターは、
望ましくは弱いプロモーター、例えば、選択された宿主細胞において徐々に開始
するプロモーター；一例として、アデノ随伴ウイルスＩＴＲのある状況下におけ
る弱いプロモーターである。有用な構成的プロモーターの例としては、レトロウ
イルスラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)ＬＴＲプロモーター（所望により、ＲＳＶエ
ンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター（所望により
、ＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、ボウシャルト(Boshart)ら、セル(Cell
),41:521-530(1985)を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プ
ロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(ＰＧＫ)
プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［インビトロジェン(Invitrogen)］
が挙げられるが、これらに限定されない。誘発可能なプロモーターは、外部から
供給された化合物により調節される。例えば、亜鉛誘発可能なヒツジメタロチオ
ニン(ＭＴ)プロモーター、デキサメタゾン(Ｄｅｘ)誘発可能なマウス乳癌ウイル
ス(ＭＭＴＶ)プロモーター、Ｔ^７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許出願第
WO98/10088号］；エクジソン昆虫プロモーター［ノー(No)ら、プロシーディング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・
エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),93:3346-3351(1996)］；テトラサイクリン
抑制系［ゴッセン(Gossen)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA),89:5547-5551(1992)］；テトラサイクリン誘発可能な系［ゴッセン(Gosse
n)ら、サイエンス(Science),268:1766-1769(1995)、またハーベイ(Harvey)ら、
カレント・オピニオン・オブ・ケミカル・バイオロジー(Curr. Opin. Chem. Bio
l.),2:512-518(1998)を参照］；ＲＵ４８６誘発可能な系［ワン(Wang)ら、ナシ
ョナル・バイオテクノロジー(Nat. Biotech.),15:239-243(1997)およびワン(Wan
g)ら、ジーン・テラピー(Gene Ther.),4:432-441(1997)］およびラパマイシン誘
発可能な系［マガリ(Magari)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション(J. Clin. Invest.),100:2865-2872(1997)］が挙げられる。

【００３０】発現カセットの任意成分は、従来から採用され遺伝子工学の分野で用いられる
プロモーターおよび調節配列の中から容易に選択される。例えば、サムブルック
(Sambrook)ら、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(
Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、コールド・スプリング・ハーバー
(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)およびこの分
野における他のテキストを参照。発現カセット成分の選択は、本発明を限定する
ものではない。

【００３１】同様に、選択的ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド、タンパク、または他
の目的産物をコードするか、あるいは目的の生物学的機能を行い、治療用、予防
用、遺伝子治療用、あるいは、研究または診断用として、細胞内で優先的にかつ
効率的にインビトロ、エクスビボまたはインビボ発現されることが望まれるいか
なるポリヌクレオチド配列であってもよい。このような選択的ポリヌクレオチド
配列の宿主は、治療または予防する状態に依存して、当業者が選択しうる。ポリ
ヌクレオチド配列の選択は、得られた分子が供される用途に依存する。例えば、
ある種の選択的ポリヌクレオチド配列は、発現により検出可能なシグナルを生成
するレポーター遺伝子を含む。このようなレポーター配列としては、β-ラクタ
マーゼ、β-ガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)、アルカリホスファターゼ、チミジン
キナーゼ、緑蛍光タンパク(ＧＦＰ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ(ＣＡＴ)、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４
、ＣＤ８）、インフルエンザヘマグルチニンタンパクなど当該分野で公知のもの
（それらに対する高親和性抗体が存在するか、あるいは従来法で生成させること
ができる）をコードするＤＮＡ配列、および、特にヘマグルチニンまたはＭｙｃ
由来の抗原標識領域に適当に融合した膜結合タンパクからなる融合タンパクをコ
ードするＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【００３２】これらの配列は、それらの発現を誘導する調節要素に随伴する場合、酵素分析
法、Ｘ線撮影法、比色定量分析法、蛍光または他の分光分析法、蛍光活性化細胞
分離分析法、免疫学的分析法（例えば、酵素結合免疫球吸着測定法(ＥＬＩＳＡ)
、放射免疫測定法(ＲＩＡ)および免疫組織染色法）などの従来法により検出可能
なシグナルを与える。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、ヘル
パーウイルスの存在は、β-ガラクトシダーゼ活性の分析により検出される。選
択的ポリヌクレオチドがルシフェラーゼである場合、ヘルパーウイルスは、照度
計の光発生により測定すればよい。

【００３３】しかし、望ましくは、選択的ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク、ペプチ
ド、アンチセンス核酸（例えば、ＲＮＡ）、酵素、または触媒ＲＮＡなどの生物
学および医学に有用な産物をコードする非マーカー配列である。選択的ポリヌク
レオチドは、遺伝子の欠陥を補正または改善するのに用いてもよい。遺伝子の欠
陥としては、正常な遺伝子が正常なレベルより少なく発現される欠陥や、機能的
な遺伝子産物が発現されない欠陥が挙げられる。好ましいタイプの選択的ポリヌ
クレオチド配列は、宿主細胞内で発現される治療タンパクまたはポリペプチドを
コードする。さらに、本発明は、例えば、マルチサブユニットタンパクにより生
じる遺伝子の欠陥を補正または改善するために、多数の選択的ポリヌクレオチド
を用いることを包含する。いくつかの場合には、あるタンパクの各サブユニット
をコードするために、あるいは異なるペプチドまたはタンパクをコードするため
に、異なる選択的ポリヌクレオチドを用いてもよい。これは、タンパクサブユニ
ットをコードするＤＮＡの寸法が大きい場合、例えば、免疫グロブリン、血小板
由来増殖因子、またはジストロフィンタンパクの場合には、望ましい。細胞がマ
ルチサブユニットタンパクを産生するためには、異なるサブユニットの各々を含
有する組換えウイルスを細胞に感染させる。あるいは、あるタンパクの異なるサ
ブユニットは、同じ選択的ポリヌクレオチドにコードされていてもよい。この場
合、単一の選択的ポリヌクレオチドはサブユニットの各々をコードするＤＮＡを
含むが、各サブユニットのＤＮＡは内在性リボザイム(ribozyme)認識部位(ＩＲ
ＥＳ)で分離されている。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡの寸
法が小さい場合、例えば、サブユニットおよびＩＲＥＳをコードするＤＮＡの全
長が５ｋｂより小さい場合には、望ましい。しかし、選択的ポリヌクレオチドは
、研究に望ましいいかなる産物をコードしていてもよい。選択的ポリヌクレオチ
ド配列の選択は、本発明を限定するものではない。

【００３４】選択的ポリヌクレオチドによりコードされる他の有用な産物としては、ホルモ
ン、増殖因子および分化因子、例えば、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン
(ＧＨ)、副甲状腺ホルモン(ＰＴＨ)、成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)、卵胞刺激
ホルモン(ＦＳＨ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)、ヒト絨毛膜刺激ホルモン(ｈＣＧ)
、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、アンギオポイエチン、アンギオスタチン、顆粒
球コロニー刺激因子(ＧＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、結合組織増殖因子
(ＣＴＧＦ)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)、酸性繊維芽細胞増殖因子(
ａＦＧＦ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、形質転換増殖因子α(ＴＧＦα)、血小
板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、インスリン増殖因子ＩおよびII(ＩＧＦ-ＩおよびＩ
ＧＦ-II)、形質転換増殖因子βスーパーファミリー（例えば、ＴＧＦβ、アクチ
ビン、インヒビン、または骨形態形成タンパク(ＢＭＰ)ＢＭＰ-１〜１５のいず
れか）のいずれか１つ、増殖因子のヘレグリン／ノイレグリン／ＡＲＩＡ／ノイ
(neu)分化因子(ＮＤＦ)ファミリー、神経増殖因子(ＮＧＦ)、脳由来神経向性因
子(ＢＤＮＦ)、ニューロトロフィンＮＴ-３およびＮＴ-４／５、毛様体神経栄養
因子(ＣＮＴＦ)、グリア細胞系由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、ニュールツリン、
アグリン；セマホリン／コラプシン、ネトリン-１およびネトリン-２からなるフ
ァミリーのいずれか１つ、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、エフリン、ノジン、ソニッ
ク・ヘッジホッグ(sonic hedgehog)およびチロシンヒドロキシラーゼが挙げられ
るが、これらに限定されない。

【００３５】他の有用な選択的ポリヌクレオチド産物としては、免疫系を調節するタンパク
、例えば、サイトカインおよびリンホカイン（例えば、トロンボポイエチン(Ｔ
ＰＯ)、インターロイキン(ＩＬ)ＩＬ-１〜ＩＬ-１７）、単球化学誘引タンパク
、白血病阻害因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド
、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆ
ｌｋ-２／ｆｌｋ-３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫系に
より産生される遺伝子産物も本発明に有用である。これらには、免疫グロブリン
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、人体に
適応した抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容
体、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣ分子、ならびに遺伝子操作された免疫グロ
ブリンおよびＭＨＣ分子が挙げられるが、これらに限定されない。有用な遺伝子
産物として、補体調節タンパク、膜共同因子タンパク(ＭＣＰ)、腐敗加速因子(
ＤＡＦ)、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９などの補体調節タンパクも挙げられる
。

【００３６】さらに他の有用な選択的ポリヌクレオチドは、ホルモン、増殖因子、サイトカ
イン、リンホカイン、調節タンパクおよび免疫系タンパクに対する受容体のいず
れか１つなどの産物を産生しうる。選択的ポリヌクレオチドは、コレステロール
調節に対する受容体（例えば、低密度リポタンパク(ＬＤＬ)受容体、高密度リポ
タンパク(ＨＤＬ)受容体、超低密度リポタンパク(ＶＬＤＬ)受容体、およびスカ
ベンジャー受容体）であり得る。また、本発明に有用な選択的ポリヌクレオチド
配列は、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、グ
ルココルチコイド受容体およびエストロゲン受容体）、ビタミンＤ受容体および
他の核受容体などの産物をコードする。さらに、有用なポリヌクレオチド配列と
しては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子(ＳＲＦ)、ＡＰ-１、
ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤおよびミオゲニンなどの転写因子、ＥＴＳ-ボックス
含有タンパク、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、
ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ-４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ-ボ
ックス結合タンパク、インターフェロン調節因子(ＩＲＦ-１)、ウィルムス腫瘍
タンパク、ＥＴＳ-結合タンパク、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ-ボックス結合タンパク（
例えば、ＧＡＴＡ-３）、および、翼部のあるヘリックスタンパク(winged helix
protein)の双頭ファミリー(fork head family)をコードする配列が挙げられる
。

【００３７】発現カセットの選択的ポリヌクレオチド配列によりコードされていてもよい他
の有用な産物としては、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカル
バミラーゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、アルギノスクシネートリアー
ゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートハイドロラーゼ、フェニルアラニ
ンヒドロキシラーゼ、α-１アンチトリプシン、グルコース-６-ホスファターゼ
、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンβ-
シンターゼ、有枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-ｃ
ｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニル
ＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β-グルコ
シダーゼ、ピルベートカルボキシレート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼ
キナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ-タンパク、Ｔ-タンパク、嚢胞性繊
維症経膜調節因子(ＣＦＴＲ)配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列が挙げら
れる。

【００３８】さらに他の有用なポリヌクレオチドにコードされる産物としては、天然に存在
しないポリペプチド（例えば、挿入、欠失またはアミノ酸置換を含む天然に存在
しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチド）、例えば
、単鎖の遺伝子操作された免疫グロブリン、アンチセンス分子および触媒核酸（
例えば、リボザイム）が挙げられる。さらに他の適当なポリヌクレオチド配列は
、当業者が容易に選択しうる。ポリヌクレオチドの選択は、本発明を限定するも
のであるとは認められない。以下の実施例に示すように、例示的な選択的ポリヌ
クレオチド配列はネズミのインターロイキン-１２をコードする配列である。

【００３９】第１鎖の一部として、少なくとも１個、望ましくは少なくとも２個、そして好
ましくは３個またはそれ以上の転写ターミネーター配列が存在する。転写ターミ
ネーターは、転写がＤＮＡ鋳型（「第２」）鎖上の発現カセット内で中断される
ことなく進行し、かつ発現カセット内のポリヌクレオチド配列の生物学的機能が
発現により悪影響を受けない限り、発現カセット配列内を含めて、ＤＮＡコード
（すなわち、非転写）鎖上のどこにでも存在することができる。本質的には、転
写が第２「鋳型」鎖の１個またはそれ以上の発現カセット相補領域から起こるこ
とができ、かつ発現されたタンパクまたはペプチドがその生物学的機能を保持し
ている限り、転写ターミネーターを挿入するために、いかなる修飾を第１鎖に行
ってもよい。好ましい転写ターミネーターは、鋳型鎖の転写を妨害する２次構造
を生成しない。これらのターミネーター配列の機能は、ＤＮＡ分子からなるこれ
らの鎖が宿主細胞内にある場合に、望ましくない転写が第１鎖から、およびまた
相補的な第２転写鋳型鎖から生じることを防止することである。重要なのは、こ
れらの第１鎖転写ターミネーターが、第２鋳型鎖からの、またはビシストロニッ
ク分子の第１鎖から転写されることが意図される発現カセットからの必要な転写
を妨害または中断できないことである。例えば、これらのターミネーター配列の
機能は、宿主細胞に存在するポリヌクレオチド配列に相同であれば、宿主細胞内
でその正常な転写を不活化またはダウンレギュレーションするであろう望ましく
ない転写物の形成を防止する。さらに、これらのターミネーターの機能は、プロ
モーターの物理的な吸蔵を防止し、それにより選択的ポリヌクレオチドの発現効
率を増大させる。第１鎖がビシストロニックである（すなわち、２個またはそれ
以上の発現カセットを含むか、各鎖が１個の発現カセットを含む）場合、ターミ
ネーター配列の同一性および位置に同じ制約を課する。

【００４０】各第１鎖に用いられるターミネーター配列の数に依存して、各ターミネーター
配列は、同一または異なるターミネーター配列でればよい。ある具体例では、タ
ーミネーター配列は、細菌ターミネーター、例えば、５ＳリボソームＲＮＡター
ミネーター、ｒｒｎＢでありうる。別の具体例では、ターミネーター配列は、細
菌ターミネーター、例えば、トリプトファンオペロンターミネーター、ｔｒｐＡ
でありうる。別の具体例では、ターミネーター配列は、バクテリオファージター
ミネーター、例えば、λ５ＳＲＮＡターミネーターまたはバクテリオファージ
Ｐ１ヘッドタンパクターミネーターでありうる。ポリＡ部位の３'側に位置する
採用しうるさらに別の望ましいターミネーター配列は、ＲＮＡｐｏｌIIの真核
生物転写中断部位、例えば、ピー・エンリケ-ハリス(P. Enriquez-Harris)ら、
エンボ・ジャーナル(EMBO J.),10(7):1833-1842(1991)に記載されている部位で
ある。α-グロビンターミネーターは、ＲＮＡｐｏｌIIのターミネーターの一例
であり、この分子の第１鎖におけるターミネーター配列として採用してもよい。
さらに、ヒストンｍＲＮＡプロセッシングシグナル、例えば、エヌ・コドチョイ
(N. Chodchoy)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell.
Biol.),11(1):497-509(1991年1月)は、第１鎖の有用なテーミネーター配列であ
る。同様に、哺乳動物のガストリン遺伝子のターミネーター、すなわちガストリ
ンターミネーターも有用である。別の有用なターミネーター配列は、上記のよう
に、リボザイム開裂部位およびそれに続く転写中断部位ターミネーター配列を提
供するポリ核酸配列である。第１鎖に用いるための他のターミネーター配列とし
ては、リボ核酸開裂部位およびその３'側に続く転写中断部位ターミネーター配
列が挙げられる。ρ依存性ターミネーター［例えば、シー・イー・ボグデン(C.E
. Bogden)ら、モレキュラー・セル(Mol. Cell),3:487-493(1999年4月)］および
ρ非依存性ターミネーター［例えば、アイ・グサロフ(I. Gusarov)およびイー・
ナドラー(E. Nudler)ら、モレキュラー・セル(Mol. Cell),3:495-504(1999年4月
)］は、いずれもこの目的で第１鎖に採用しうる配列である。

【００４１】さらに、エム・ニルソン(M. Nilsson)ら、サイエンス(Science),265:2085-208
8(1994)に記載されている、いわゆる「パドロックプローブ(padlock probe)」は
、二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡ分子の有用なターミネーターである。パドロッ
クは、パドロックの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドと第１鎖上の少な
くとも１０個の連続したヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションにより、
本発明のポリヌクレオチド分子に捩れて連結した環状一本鎖ポリヌクレオチド配
列である。図１Ｃおよび図１Ｄを参照。

【００４２】ＤＮＡ分子のこの第１鎖において、上記ターミネーター配列の少なくとも１個
は、好ましくはプロモーターの５'側に存在する。望ましくは、この第１鎖ター
ミネーター配列は、プロモーターの５'側に１〜５０個のヌクレオチドだけ離れ
て存在する。別の望ましい具体例では、この第１鎖ターミネーター配列は、プロ
モーターの５'側に２０〜４０個のヌクレオチドだけ離れて存在する。別の望ま
しい具体例では、この第１鎖ターミネーター配列は、プロモーターの５'側に１
０〜３０個のヌクレオチドだけ離れて存在する。ある具体例では、それゆえ、パ
ドロックターミネーター（または任意の他の適当なターミネーターあるいはリボ
ヌクレオリティック(ribonucleolytic)部位または触媒部位の補体）は、第１鎖
の５'非翻訳領域内に存在しうる。

【００４３】さらに別の具体例では、第１鎖ターミネーター配列は、上記リストから独立し
て選択され、発現カセットの外側にあってポリＡ部位の３'側に存在する。この
第１鎖ターミネーター配列は、望ましくは発現カセットのポリＡ部位から３'側
に少なくとも１００〜１５０個のヌクレオチドだけ離れて存在するか、あるいは
そのポリＡ配列の末端の直後に存在する。かくして、別の具体例では、パドロッ
クターミネーター（または任意の他の適当なターミネーターあるいはリボヌクレ
オリティック部位または触媒部位の補体）は、第１鎖の３'非翻訳領域内に存在
しうる。

【００４４】さらに、別の具体例では、５'および３'ターミネーター配列の両方が採用され
、第１鎖上の発現カセットに隣接している。

【００４５】ＤＮＡ分子の第１鎖のさらに別の具体例では、発現カセットに隣接する５'お
よび３'ターミネーター配列に加えて、さらに自由選択の配列が発現カセットの
外側にあって第１鎖上に存在する。本発明のさらに別の具体例では、少なくとも
１個のＲＮＡ不安定配列［例えば、エイ・エム・クラトーラ(A.M. Curatola)ら
、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15(11):
6331-6340(1995年11月)；エイ・エム・ズエビアガ(A.M. Zubiaga)ら、モレキュ
ラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15(4):2219-2230(1
995年4月)］は、第１鎖上にあって、好ましくは発現カッセット配列の外側に存
在する。好ましくは、ＲＮＡ不安定配列の補体は、３'隣接ターミネーター配列
の３'側に、または５'隣接ターミネーター配列の５'側に存在する。図１Ａ〜１
Ｄは、好ましい具体例のうちのいくつかの概略図を示す。

【００４６】さらに別の具体例では、パドロックターミネーター（または任意の他の適当な
ターミネーターあるいはリボヌクレオリティック部位または触媒部位の補体）は
、発現カセット内に、より詳しくは選択的ポリヌクレオチド配列のコード配列内
に存在する。例えば、図１Ｄにおいて、パドロックターミネーターは、ポリヌク
レオチド配列のコード配列に存在する。この位置にある場合、ターミネーター配
列は、発現カセットに相補的な第２鎖の部分からの転写を妨害せず、かつ発現さ
れるべきタンパクの生物学的機能に影響を与えない。言い換えれば、第１鎖にお
けるターミネーター配列の存在は、第２鎖からの転写を防止または妨害すること
ができないので、選択的ポリヌクレオチド配列は、第１鎖ターミネーター配列の
位置に関係なく、常に正しく転写され発現され、その生物学的機能を保持する。
この位置では、コード領域内にあるターミネーター配列は、第２鎖からの転写を
妨害せず、かつ発現されたタンパクの生物学的機能に影響を与えないことを条件
として、上記したパドロックプローブを含めて、上記ターミネーターのいずれか
でありうる。

【００４７】さらに代わりまたは別の具体例として、第１鎖はＡＴＧ（開始コドン）または
コザック(Kozak)領域の導入をもたらすいかなる修飾も回避する。このような修
飾は、単独または組み合わせて、理論的には、アンチセンスＲＮＡの望ましくな
い転写を防止する。しかし、可能な場合には、二本鎖ＲＮＡの形成に対する付加
された確実性は、コード鎖内の１個またはそれ以上の部位に、ＲＮＡ不安定配列
の補体を付加することにより達成すればよい。この鎖から思いがけずに形成され
たいかなる望ましくないアンチセンスＲＮＡも、ＲＮＡの分解を促進する不安定
配列を含有し、センスＲＮＡとハイブリダイズするのに利用されない。

【００４８】ある望ましい修飾として、ＤＮＡ分子からなる第１鎖は、この鎖上のどこかに
存在する長さが７個より多い連続したヌクレオチドからなるいかなる逆方向相補
反復配列も欠いている。一例として、第１鎖が、例えば、配列ＡＴＧＣＴＴＡを
含有する場合、第１鎖上の他の場所には、逆方向相補配列ＴＡＡＧＣＡＴが存在
しない。この逆方向相補反復配列の欠落は、哺乳動物の宿主細胞にとっては通常
の体温である３７℃で同じ鎖上の配列の望ましくない内部での塩基対の形成を回
避する。これは、ＤＮＡ分子が宿主細胞内でＲＮＡに転写される場合または第１
鎖が一本鎖ＤＮＡ分子である場合に、特に重要である。さらに別の代わりの具体
例として、ＤＮＡ分子からなる第１鎖は、この鎖上のどこかに存在する長さが４
個より多い連続したヌクレオチドからなるいかなる逆方向相補反復配列も欠いて
いる。この逆方向相補反復配列の欠落は、ある無脊椎動物種の宿主細胞のより低
い体温で同じ鎖上の配列の望ましくない内部での塩基対の形成を回避する。

【００４９】本発明のＤＮＡ分子からなる第１鎖の別の具体例として、第１鎖の「ゆらぎ」
ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列を変更し、この配列におけるいかなる逆方向
相補反復部分も防止または排除するために、操作することができる。このような
ゆらぎヌクレオチドは、一般的には、大抵のコドンの第３塩基の位置にあるが、
第１または第２の位置に存在することができる。このような反復部分を排除する
この方法は、安定な２本鎖領域を形成するか、あるいは逆方向相補反復部分また
は宿主のポリヌクレオチド配列に対する相同性を示す異常型ＲＮＡ構造にＤＮＡ
が転写されるのを回避することを可能にする。あるいは、本発明のＤＮＡ分子か
らなる第１鎖の具体例は、選択的ポリヌクレオチド配列からなる第１鎖のその部
分の実質的にすべてのコドンにおけるゆらぎヌクレオチドを変更することを包含
する。この場合、分子内の選択的ポリヌクレオチド配列は宿主細胞内にすでに存
在するポリヌクレオチド配列と相同的すぎる可能性がある。コードされるアミノ
酸を変化させることなく、コドンを変化させるような塩基だけを変更することに
より、選択的ポリヌクレオチド配列は、かくして同じアミノ酸配列をコードする
が、宿主細胞または宿主生物内にある望ましいポリヌクレオチド配列と実質的に
非相同であるヌクレオチド配列を提供する。「ゆらぎ」コドン内におけるこの非
相補性領域は、宿主細胞内のＤＮＡ分子からなる転写物が、トランスフェクトさ
れた宿主細胞に本来存在するか、あるいは必須の相同なポリヌクレオチド配列を
望まずにまたは意図せずに不活化またはダウンレギュレーションすることを防止
する。図２Ａおよび図２Ｂを参照。「実質的にすべての」ゆらぎ塩基とは、選択
的ポリヌクレオチドと宿主細胞内のいかなるポリヌクレオチドとの間の相同性を
も破壊することにより、宿主細胞内のポリヌクレオチド配列の不活化を防止する
のに十分ゆらいでいるコドンを意味する。

【００５０】ＤＮＡが組換えにより製造される場合には、ゆらぎ塩基は公知の突然変異技術
で変更すればよい。ＤＮＡが合成される場合には、ゆらぎコドン塩基は、意図さ
れる宿主細胞または生物における本来の配列と適合するのを回避するように故意
に作成する。ゆらぎ塩基は、上記の異常型ＲＮＡ構造が回避されることを条件と
して、選択された宿主細胞内での発現用コドンを最適化するのに好ましいコドン
を挿入するように選択すればよい。例えば、好ましいコドンの選択を教示してい
る米国特許第5,786,464号を参照。

【００５１】ここで用いるように、また当該分野で公知であるように、「相同性」または「
相同な」という用語は、２個のポリペプチド配列間または２個のポリヌクレオチ
ド配列間の配列関連度を意味し、このような配列の２つの長さ間の適合の同一性
により決定される。同一性と相同性とは、いずれも従来技術の方法［例えば、コ
ンピューテショナル・モレキュラー・バイオロジー(COMPUTATIONAL MOLECULAR B
IOLOGY)、レスク, エイ・エム(Lesk, A.M.)編、オックスフォード・ユニバーシ
ティ・プレス(Oxford University Press)、ニューヨーク、(1988)；バイコンピ
ューティング：インフォーマティクス・アンド・ゲノム・プロジェクツ(BIOCOMP
UTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS)、スミス, ディー・ダブリュー(Smit
h, D.W.)編、アカデミック・プレス(Academic Press)、ニューヨーク、(1993)；
コンピューター・アナリシス・オブ・シークエンス・データ(COMPUTER ANALYSIS
OF SEQUENCE DATA)、パートＩ、グリフィン, エイ・エム(Griffin, A.M.)およ
びグリフィン, エイチ・ジー(Griffin, H.G.)編、フマナ・プレス(Humana Press
)、ニュージャージー、(1994)；シークエンス・アナリシス・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー(SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY)、フォン・ハイニ
ェ, ジー(von Heinje, G.)、アカデミック・プレス(Academic Press)、(1987)；
およびシークエンス・アナリシス・プライマー(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER)、グ
リブスコフ, エム(Gribskov, M.)およびデヴェル・ジェイ(Devereux, J.)編、エ
ム・ストックトン・プレス(M Stockton Press)、ニューヨーク、(1991)を参照］
で容易に算出することができる。２個の配列間の同一性または相同性を決定する
のに通常採用される方法としては、ガイド・トゥ・ヒュージ・コンピューターズ
(GUIDE TO HUGE COMPUTERS)、マーチン・ジェイ・ビショップ(Martin J. Bishop
)編、アカデミック・プレス(Academic Press)、サン・ディエゴ、1994年、なら
びに、エイチ・カリロ(H. Carillo)およびディー・リプトン(D. Lipton)、サイ
アム・ジャーナル・オブ・アプライド・マシマティックス(SIAM J. Applied Mat
h.),48:1073(1988)に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されな
い。同一性または相同性を決定する好ましい方法は、調べた２個の配列間に最大
の適合を与えるように設計される。２個の配列間の同一性および相同性を決定す
る好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ
のアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ［ジェイ・デヴェル(J. Devereux)ら、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),12(1):387(1984)］、関連するＭ
ＡＣＶＥＣＴＯＲプログラム(オックスフォード(Oxford))およびＦＡＳＴＡ(ピ
アソン(Pearson))プログラムが挙げられるが、これらに限定されない。このよう
なコンピュータープログラムの使用は、本発明に用いるのに望ましい適当なＤＮ
ＡおよびＲＮＡ分子の設計を可能にする。特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子に必要
なアルゴリズムおよび／または相同性の程度は、当業者が選択しうる。必要な相
同性の選択、プログラムのデフォルト値の選択、および相同性を算出するのに採
用されるプログラムの選択は、この明細書の教示内容および科学文献の知識を与
えられれば、当該分野の技術範囲内である。

【００５２】Ｂ．第２鎖本発明の二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡ分子または本発明の代わりの一本鎖Ｄ
ＮＡ分子は、好ましくは第２「転写鋳型」鎖からなる。第２鎖は、細菌で産生さ
れるプラスミドの第１鎖に対して、通常１００％相補的であるが、このことは、
例えば、これらの鎖の少なくとも一方が合成的に製造され、実質的に相同な鎖と
組み合わされている場合のように、本質的ではない。Ｔ_ｍが適当な条件下で両方
の鎖を共に存続させるほど十分に高いような２つの鎖の間に十分な相同性が存在
すれば、第１鎖と非相同の領域が第２鎖上に存在してもよい。

【００５３】第２鎖は、第２鎖上で開始されたいかなる転写をも終結させる少なくとも１個
の第２鎖ターミネーター配列を有する。第２鎖ターミネーター配列は、第２鎖上
にあって発現カセット配列に相補的でない第２鎖の配列中に存在する。好ましく
は、ＤＮＡ分子からなる第２鎖は、１個より多くの第２鎖ターミネーター配列を
含有する。より好ましくは、第２鎖は、発現カセットに相補的な配列の外側にあ
って第２鎖のヌクレオチド１００個毎に２個のターミネーター配列から１個のタ
ーミネーターまで含有する。別の好ましい具体例は、第１鎖の発現カセットに相
補的でない領域にあって第２鎖のヌクレオチド５００個毎に１個のターミネータ
ー配列を含有する。１個より多くの第２鎖ターミネーター配列を用いる場合、多
数のターミネーター配列が、上記のように、発現カセットに相補的でない第２鎖
の領域に点在していればよい。

【００５４】別の具体例では、シストロンまたは発現カセット内を含めて、目的の遺伝子ま
たはポリヌクレオチド内でさえ、第１センス鎖上の１個またはそれ以上の位置に
ターミネーター配列を含むことが望ましい場合には、第２アンチセンスＤＮＡ鎖
は、ある程度の非相補性を有していてもよく、これはｍＲＮＡに転写されるのに
必要である。さらに別の具体例は、第１鎖上のコード領域に相補的な領域の外側
に１個またはそれ以上の転写ターミネーターまたはＲＮＡ不安定配列を含有する
第２鎖である。第２アンチセンス鎖の変化は、通常、このような変化がそれにも
かかわらず機能的なポリペプチドを与え、かつ転写に悪影響を及ぼさない限りに
おいてのみ行うことができる。ｃｉｓターミネーターまたは不安定配列がプラス
ミドのセンス鎖内にコードされていればよいが、第２のアンチセンスまたは転写
鎖上のヌクレオチドは、得られたアミノ酸配列を変化させず、かつ悪影響を及ぼ
さない保存的またはナンセンス突然変異または他の突然変異だけを含んでいなけ
ればならない。このような具体例では、いかなる発現タンパクの機能も悪影響を
受けてはならない。

【００５５】第２鎖上の各ターミネーター配列は同一であっても、各々が異なるターミネー
ター配列であってもよい。これらのターミネーター配列は、上記の配列を第１鎖
ターミネーター配列として含んでいる。ある具体例では、ターミネーター配列は
、細菌ターミネーター、例えば、ｒｒｎＢまたはｔｒｐＡでありうる。別の具体
例では、ターミネーター配列は、バクテリオファージターミネーター、例えば、
λ５ＳＲＮＡターミネーターまたはバクテリオファージＰ１ヘッドタンパクタ
ーミネーターでありうる。さらに別の望ましい採用しうるターミネーター配列は
、リボザイム開裂部位またはリボヌクレオチド開裂部位と、その３'側に続く真
核生物転写中断部位、例えば、ＲＮＡｐｏｌIIの転写中断部位またはα-グロビ
ンターミネーターとを与えるポリ核酸配列である。さらに、ヒストンｍＲＮＡプ
ロセッシングシグナルは、第２鎖に有用なターミネーター配列である。同様に、
哺乳動物ガストリン遺伝子のターミネーター、すなわちガストリンターミネータ
ーも有用である。ρ依存性ターミネーターおよびρ非依存性ターミネーターの両
方も、この目的で第２鎖に採用しうる配列である。さらに、上記のパドロックタ
ーミネーター配列は、二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡ分子の一部である場合には
、第２鎖の有用なターミネーターである。

【００５６】本発明の第２鎖のある具体例では、ターミネーター配列は、発現カセットに相
補的でない第２鎖の領域に存在し、第１鎖ポリＡ部位に対して、すぐ３'側に位
置する（図１Ｂを参照）。本発明の別の具体例では、第２鎖ターミネーター配列
は、発現カセット配列に相補的でない第２鎖の領域内にあってポリＡ部位から２
００個未満のヌクレオチドだけ離れて存在する（図１Ｃを参照）。第２鎖の代わ
りの具体例は、第１鎖プロモーター配列に対して、５'側に存在するターミネー
ター配列を含有する（図１Ａ〜図１Ｃを参照）。好ましい具体例は、第１鎖の発
現カセットに相補的でない第２鎖の領域中に点在する多数のターミネーター配列
を含有する（図１Ｂおよび図１Ｃを参照）。

【００５７】ＤＮＡ分子の第２鎖の別の具体例は、発現カセット配列に相補的でない第２鎖
配列の領域上に存在する少なくとも１個のＲＮＡ不安定配列をさらに含有する第
２鎖を包含する。好ましくは、第２鎖のそのような領域内に１個より多くの不安
定配列が存在する。さらに、第１鎖と同様に、第２鎖は、好ましくは、哺乳動物
細胞または哺乳動物に用いる場合には７個より多くのヌクレオチドからなるいか
なる相補逆方向反復配列をも含有せず、また、無脊椎動物細胞または生物に用い
る場合には４個より多くのヌクレオチドからなるいかなる相補逆方向反復配列を
も含有しない。

【００５８】本発明のＤＮＡ分子からなる第２鎖の別の具体例として、第２鎖の「ゆらぎ」
ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列を変更し、かつ配列内のいかなる逆方向相補
反復部分も防止または排除するように操作することができる。このような反復部
分を排除するこの方法は、ＤＮＡが二本鎖領域を形成するＲＮＡに転写されるの
を回避することを可能にする。あるいは、本発明のＤＮＡ分子からなる第２鎖の
具体例は、選択的ポリヌクレオチド配列に相補的な第２鎖のその部分の実質的に
すべてのコドンにおけるゆらぎヌクレオチドを変更することを包含する。この場
合、分子内の選択的ポリヌクレオチド配列は宿主細胞内にすでに存在するポリヌ
クレオチド配列と相同的すぎる可能性がある。コードされるアミノ酸を変化させ
ることなく、コドンを変化させるような塩基だけを変更することにより、選択的
ポリヌクレオチド配列は、かくして同じアミノ酸配列をコードするが、宿主細胞
または宿主生物内にある望ましいポリヌクレオチド配列と実質的に非相同である
ヌクレオチド配列を提供する。「ゆらぎ」コドン内におけるこの非相補性領域は
、宿主細胞内のＤＮＡ分子からなる転写物が、トランスフェクトされた宿主細胞
に本来存在するか、あるいは必須の相同なポリヌクレオチド配列を望まずにまた
は意図せずに不活化またはダウンレギュレーションすることを防止する。図２Ａ
および図２Ｂを参照。「実質的にすべての」ゆらぎ塩基とは、選択的ポリヌクレ
オチドと宿主細胞内のいかなるポリヌクレオチドとの間の相同性をも破壊するこ
とにより、宿主細胞内のポリヌクレオチド配列の不活化を防止するのに十分ゆら
いでいるコドンを意味する。ＤＮＡが組換えにより製造される場合には、ゆらぎ
塩基は公知の突然変異技術で変更すればよい。ＤＮＡが合成される場合には、ゆ
らぎコドン塩基は、意図される宿主細胞または生物における本来の配列と適合す
るのを回避するように故意に作成する。

【００５９】本発明のＤＮＡ分子は、上記のような第１鎖および第２鎖からなる二本鎖であ
ろうと部分二本鎖であろうと、また、上記の第１鎖または第２鎖のいずれかから
形成された一本鎖であろうと、細胞内で転写されるヌクレオチド配列が、いかな
る有意な二本鎖を形成する能力をも欠いている一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチ
センス鎖となることを可能にする。このＤＮＡ分子は、所望により、塩基対を形
成していないポリヌクレオチド配列で分離されたセンスポリヌクレオチド配列お
よびアンチセンスポリヌクレオチド配列の両方からなる一本鎖ＲＮＡ配列を提供
することができる。

【００６０】本発明のこれらＤＮＡ分子は、以下で詳しく説明する方法で調製し、用いれば
よい。

【００６１】 II．本発明のＲＮＡ分子本発明による別の組成物は、宿主細胞内で安定な二本鎖ＲＮＡまたは部分二本
鎖ＲＮＡ分子の形成を防止するように設計される５'末端と３'末端とを有するリ
ボ核酸の配列からなる実質的に一本鎖のＲＮＡ分子である。所望により、この分
子は５'ＡＴＧコドンを含有することができる。このＲＮＡが翻訳されることを
意図しない場合、例えば、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの触媒ＲＮ
Ａ分子に、５'ＡＴＧは必要でない。所望により、コザック(Kozak)配列などの調
節領域が５'ＡＴＧコドンの前方にある。この一本鎖ＲＮＡ分子は線状分子であ
ってもよい。あるいは、この一本鎖ＲＮＡ分子は環状であってもよい。

【００６２】この一本鎖ＲＮＡ分子は、宿主細胞内で翻訳された場合に選択された生物学的
機能を有する選択的ポリヌクレオチド配列を有する。選択的ポリヌクレオチド配
列は、コード配列、すなわち、それは翻訳されてタンパクまたはその機能断片を
発現する。あるいは、選択的ポリヌクレオチドは非コード的であってもよいが、
調節機能または他の生物学的機能を有していてもよい。生物学的機能を有する選
択的ポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ分子の第１鎖について上に記載した配列か
ら選択すればよい。

【００６３】この一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、長さが約１００〜１０,０００ポ
リヌクレオチドである。現在のところ、この配列は、最も望ましくは長さが少な
くとも２００ポリヌクレオチドであるが、ある具体例では、長さが２００〜８０
００ポリヌクレオチドの範囲に及ぶことができる。別の具体例では、ＲＮＡ分子
は、長さが７５００ポリヌクレオチド未満であることができる。さらに別の具体
例では、このＲＮＡ分子は、約５０００ポリヌクレオチド未満の配列長を有する
ことができる。さらに別の具体例では、このＲＮＡ分子は、約２０００ポリヌク
レオチド未満の配列長を有することができる。さらに別の具体例では、このＲＮ
Ａ分子は、約１０００ポリヌクレオチド未満の配列長を有することができる。さ
らに別の具体例では、このＲＮＡ分子は、約７５０ポリヌクレオチド未満の配列
長を有することができる。

【００６４】ある具体例では、この一本鎖ＲＮＡ分子は、３'末端に小さいヘアピン配列、
すなわちわずか５個のヌクレオチドからなる２本鎖の配列を有していてもよい。
他の具体例では、もともとこのＲＮＡ分子の一部として存在していたかもしれな
いいかなるヘアピン配列もこの分子から削除される。

【００６５】本発明のＲＮＡ分子のある具体例として、このＲＮＡ配列は、この鎖上のどこ
かに存在する長さが７個より多い連続したヌクレオチドからなるいかなる逆方向
相補反復配列も欠いている。一例として、第１鎖が、例えば、配列ＡＵＧＣＵＵ
Ａを含有する場合、ＲＮＡ鎖上の他の場所には、逆方向相補配列ＵＡＡＧＣＡＵ
が存在しない。この逆方向相補反復配列の欠落は、哺乳動物の宿主細胞にとって
は通常の体温である３７℃で同じ鎖上の配列の望ましくない内部での塩基対の形
成を回避する。さらに別の代わりの具体例として、一本鎖ＲＮＡ分子は、この鎖
上のどこかに存在する長さが４個より多い連続したヌクレオチドからなるいかな
る逆方向相補反復配列も欠いている。この逆方向相補反復配列の欠落は、ある無
脊椎動物種の宿主細胞のより低い体温で同じ鎖上の配列の望ましくない内部での
塩基対の形成を回避する。

【００６６】本発明の一本鎖ＲＮＡ分子の別の具体例として、この鎖の「ゆらぎ」ヌクレオ
チドは、ヌクレオチド配列を変更し、この配列におけるいかなる逆方向相補反復
部分も防止または排除するために、操作することができる。このような反復部分
を排除するこの方法は、異常型二本鎖ＲＮＡ領域の形成を防止する。あるいは、
本発明のＲＮＡ分子の具体例は、選択的ポリヌクレオチド配列に翻訳される鎖の
その部分の実質的にすべてのコドンにおけるゆらぎヌクレオチドを変更すること
を包含する。この場合、分子内の選択的ポリヌクレオチド配列は宿主細胞内にす
でに存在するポリヌクレオチド配列と相同的すぎる可能性がある。コードされる
アミノ酸を変化させることなく、コドンを変化させるような塩基だけを変更する
ことにより、選択的ポリヌクレオチド配列は、かくして同じアミノ酸配列をコー
ドするが、宿主細胞または宿主生物内にある望ましいポリヌクレオチド配列と実
質的に非相同であるヌクレオチド配列を提供する。「ゆらぎ」コドン内における
この非相補性領域は、トランスフェクトされた宿主細胞に本来存在するか、ある
いは必須の相同なポリヌクレオチド配列を望まずにまたは意図せずに不活化また
はダウンレギュレーションすることを防止する。「実質的にすべての」ゆらぎ塩
基とは、選択的ポリヌクレオチドと宿主細胞内のいかなるポリヌクレオチドとの
間の相同性をも破壊することにより、宿主細胞内のポリヌクレオチド配列の不活
化を防止するのに十分ゆらいでいるコドンを意味する。ＲＮＡが組換えにより製
造される場合には、ゆらぎ塩基は公知の突然変異技術で変更すればよい。ＲＮＡ
が合成される場合には、ゆらぎコドン塩基は、意図される宿主細胞または生物に
おける本来の配列と適合するのを回避するように故意に作成する。

【００６７】別の具体例では、一本鎖ＲＮＡ分子が意図された宿主細胞における遺伝子の染
色体コピーを有する場合、この一本鎖ＲＮＡは染色体コピーと区別できるように
調製される。この分子は選択的ポリヌクレオチド配列に隣接するいかなる異種配
列も含有しない。前者は配列はリボ核酸配列が本来の配列と同一である。この分
子は、細胞に染色体遺伝子を不活化させうる異種隣接配列を有する異常型産生部
分二本鎖ＲＮＡを回避するように設計される。

【００６８】本発明のさらに別の具体例では、一本鎖ＲＮＡ分子は、この分子の５'末端に
キャップを有する。別の具体例では、この一本鎖ＲＮＡ分子は、この配列の５'
末端にキャップを有しない。

【００６９】本発明のさらに別の具体例では、一本鎖ＲＮＡ分子は、この分子の３'末端に
ポリＡ配列を有する。別の具体例では、一本鎖ＲＮＡ分子は、この配列の３'末
端にポリＡ配列を有しない。

【００７０】さらに別の具体例では、一本鎖ＲＮＡ分子は、３'ヒドロキシ基に、ヘアピン
部分（二本鎖領域）の伸張を阻害する鎖ターミネーターとして機能する修飾が付
加されている。このような化学的部分としては、ジデオキシヌクレオチド(ｄｄ
ＮＴＰ)、３'アミノヌクレオチドトリホスフェート、３'メチルヌクレオチドト
リホスフェート、および３'ホスホリルチオエートヌクレオチドトリホスフェー
トが挙げられるが、これらに限定されない。他の鎖ターミネーターは、当業者が
容易に選択しうる。

【００７１】本発明の一本鎖ＲＮＡ分子のさらに他の具体例は、３'末端に、鎖の伸張を防
止するようにも機能するトポロジカルな結び目または輪縄を与えるＲＮＡ配列を
包含する。これらの構造物は、スミス(Smith)およびニコノヴィッチ(Nikonowicz
)、バイオケミストリー(Biochem.),37:13486-13498(1998)に従って調製すること
ができる。

【００７２】本発明の一本鎖ＲＮＡ分子のさらに他の具体例は、２個またはそれ以上の上記
修飾を含有するＲＮＡ配列を包含する。例えば、本発明のＲＮＡ分子は、５'キ
ャップおよびポリＡ尾部を有するか、あるいは、５'キャップおよび逆方向反復
部分を有しないが、ポリＡ尾部を有しうる。さらに別の具体例は、逆方向反復部
分を有さず、３'末端に鎖ターミネーターを有し、ポリＡ尾部を有しない。当業
者は、上記修飾の他のものを組み合わせて、本発明のＲＮＡ分子を調製すればよ
い。

【００７３】宿主細胞に本来存在するか、さもなければ宿主細胞または生物に必須である相
同なポリヌクレオチド配列の思いがけない不活化またはダウンレギュレーション
を防止するために、二本鎖または部分二本鎖であるＲＮＡ分子を回避することが
望ましい。本発明のこれらＲＮＡ分子は、以下で詳しく説明する方法および組成
物で調製し、用いればよい。

【００７４】 III．ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の調製上記のＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、当該分野で公知の教示内容を用いて、設計
し製造すればよい。これらの分子は、いずれも上記のように修飾して、選択され
た配列の発現を増強し、かつ望ましくない異常型ポリヌクレオチド種の転写を防
止し、それにより宿主細胞または宿主生物のポリヌクレオチド配列の意図しない
不活化を回避すればよい。

【００７５】これらのポリヌクレオチド分子は、上で引用したサムブルック(Sambrook)また
はプロメガ・プロトコルズ・アンド・アプリケーションズ・ガイド(Promega Pro
tocols and Applications Guide)、(第３版、1996)、ドイル(Doyle)編、ISBN第1
-882274-57-1に記載されているものなどの従来の手法により設計すればよい。例
えば、これらの分子は、酵素的な合成法または化学的な合成法でインビトロで製
造すればよい。

【００７６】ある具体例では、ＲＮＡ分子は、上で引用したような教科書に記載されている
従来法に従って、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いて、従来の酵素的な合成法でインビトロで製造される。例え
ば、ある具体例では、本発明のＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、Ｔ７プロモーターを
含有するプラスミドおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する別のプラスミド
でトランスフェクトされた宿主細胞内で調製すればよい。

【００７７】別の具体例では、これらの分子は、化学的な合成法でインビトロで製造すれば
よい［例えば、キュー・シュー(Q. Xu)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(
Nucl. Acids Res.),24(18):3643-4(1996年9月)；エヌ・ナリシュキン(N. Narysh
kin)ら、バイオオーガニッシェカイア・キマイア(Bioorg. Khim.),22(9):691-8(
1996年9月)；ジェイ・エイ・グラスビー(J.A. Grasby)ら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),21(19):4444-50(1993年9月)；シー・チャイ
クス(C. Chaix)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),17(
18):7381-93(1989)；エス・エイチ・チャウ(S.H. Chou)ら、バイオケミストリー
(Biochem.),28(6):2422-35(1989年3月)；オー・オダイ(O. Odai)ら、ヌクレイッ
ク・アシッズ・シンポジウム・シリーズ(Nucl. Acids Symp. Ser.),21:105-6(19
89)；エヌ・エイ・ナリシュキン(N.A. Naryshkin)ら、バイオオーガニッシェカ
イア・キマイア(Bioorg. Khim.),22(9):691-8(1996年9月)；エス・サン(S. Sun)
ら、アール・エヌ・エイ(RNA),3(11):1352-1363(1997年11月)；エックス・チャ
ン(X. Zhang)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),25(20
):3980-3(1997年10月)；エス・エム・グラバズノフ(S.M. Gravaznov)ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),26(18):4160-7(1998年9月)；
エム・カドクラ(M. Kadokura)ら、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム・シ
リーズ(Nucl. Acids Symp. Ser.),37:77-8(1997)；エイ・デーヴィソン(A. Davi
son)ら、バイオメディカル・ペプチズ・プロテインズ・アンド・アシッズ(Biome
d. Pept. Proteins. Nucl. Acids),2(1):1-6(1996)；およびエイ・ブイ・ムドラ
コフスカイア(A.V. Mudrakovskaia)ら、バイオオーガニッシェカイア・キマイア
(Bioorg. Khim.),17(6):819-22(1991年6月)を参照］。

【００７８】あるいは、これらの分子は、宿主細胞の培養物中で組換え手段により製造し、
それから単離すればよい。本発明に有用なＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、組換え体
微生物（例えば、細菌および酵母）中または組換え宿主細胞（例えば、哺乳動物
細胞）中で製造し、従来の手法により、その培養物から単離することができる。
例えば、これらの手法を詳述する実験マニュアルの代表例である上で引用したサ
ムブルック(Sambrook)に記載されている手法および米国特許第5,824,538号、第5
,877,159号および第5,643,771号（出典を示すことにより、明細書の一部をなす
）に記載されている手法を参照。

【００７９】環状ＲＮＡ分子は、エス・ワン(S. Wang)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl. Acids Res.),22(12):2326-33(1994年6月)；ワイ・マツモト(Y. Mats
umoto)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),87(19)7628-3
2(1990年10月)；プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),91(8)3
117-21(1994年4月)；エム・ツァグリス(M. Tsagris)ら、ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),19(7):1605-12(1991年4月)；エス・ブラウン(
S. Braun)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids Res.),24(21):4
152-7(1996年11月)；ゼッド・パスマン(Z. Pasman)ら、アール・エヌ・エイ(RNA
),2(6):603-10(1996年6月)；ピー・ジー・ザフィロポウロス(P.G. Zaphiropoulo
s)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ユー・エス・エイ(Proc. Natl. Acad. Sci., USA),93(13)6536-41(1996
年6月)；ディー・ボードリー(D. Beaudry)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ(Nucl. Acids Res.),23(15):3064-6(1995年8月)（すべて出典を示すことによ
り、明細書の一部をなす）に記載されている手法に従って調製することができる
。

【００８０】上記の文献は、ここに提供された教示内容が与えられれば、下記の特定の具体
例のいずれかを製造するのに必要な手法を当業者に提供する。

【００８１】インビトロで調製または合成されるこのようなＤＮＡおよび／ＲＮＡ分子は、
ポリヌクレオチド分子として、宿主細胞または宿主生物に直接送達してもよい。
あるいは、望ましいＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、本発明の必要とされるＤＮＡま
たはＲＮＡ分子に必要な配列を含有するように設計された生きている、弱毒され
たまたは殺された不活化組換え細菌中で宿主細胞に与えてもよい。かかる組換え
細菌細胞、真菌細胞などは、米国特許第5,824,538号、第5,877,159号および第65
,643,771号（出典を示すことにより、明細書の一部をなす）に記載されているよ
うな従来の手法を用いることにより調製することができる。これらの送達物を調
製するのに有用な微生物としては、上で引用した文献に掲載されているもの、例
えば、エセリキア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・スブチリス(Bacillus
subtilis)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、ならびに
シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィ
ロコッカス(Staphylococcus)およびシゲラ(Shigella)の様々な種が挙げられるが
、これらに限定されない。

【００８２】ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、生きている、弱毒されたまたは殺された不活化ウ
イルス、特に上記の必要とされるＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列を有
する組換えウイルスにより、宿主細胞または宿主中で形成すればよい。このよう
なウイルスは、遺伝子治療用などに遺伝子を細胞に送達するのに現在用いられて
いる組換えウイルスと同様に設計すればよい。ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を宿主細
胞にインビボで与えるように操作すればよい有用なウイルスまたはウイルス配列
としては、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロ
ウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイル
ス、パポーベウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイ
ルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、正鎖および負鎖ＲＮＡウイルス、
ウイロイドおよびウイルソイド、またはその一部が挙げられるが、これらに限定
されない。これらの様々なウイルスは、本発明の教示内容と共に、特にエム・デ
ィ・ニコラ(M. Di Nicola)ら、キャンサー・ジーン・テラピー(Cancer Gene The
r.),5(6):350-6(1998)に記載されているような従来の手法を適用することにより
設計すればよい。

【００８３】また、宿主細胞中における望ましい上記ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形成は、上
記のような合成ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子または組換えウイルスにトランスフ
ェクトまたはインビトロで感染しているドナー細胞であって、生きている、弱毒
されたまたは殺された不活化ドナー細胞内で行ってもよい。次いで、これらのド
ナー細胞は、以下で詳しく説明するように、宿主に投与すればよい。これらのド
ナー細胞は、望ましくは、送達することが意図されている宿主としての宿主種の
細胞であり、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３、
ＢＨＫ細胞系およびＣＯＳ-７細胞などの哺乳動物細胞が哺乳動物用の有用な宿
主細胞である。このようなドナー細胞は、例えば、エメリッチ(Emerich)ら、ジ
ャーナル・オブ・ニューロサイエンス(J. Neurosci),16:5168-81(1996)に記載さ
れているものと同様の手法を用いて作成することができる。さらにより好ましい
ことは、ドナー細胞は、治療すべき特定の宿主から採取し、ディー・ビー・コー
ン(D.B. Kohn)ら、ネイチャー・メディスン(Nature Med.),4(7):775-80(1998)に
記載れているものなどの選択移入法(adoptive transfer techniques)に類似した
エクスビボでの操作によりドナー細胞に作成すればよい。

【００８４】最後に、本発明の分子は、上記のような、あるいは、組換え細菌、細胞および
ウイルスとして、またはその中にある合成ＲＮＡ分子または合成ＤＮＡ送達分子
の混合物に作成することもできる。この混合物の組成は、当業者が容易に選択し
うる。

【００８５】 IV．本発明の医薬（治療または予防）、診断または研究用の組成物および方法本発明の組成物は、宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の発現効率
を増強するためのインビトロまたは組織培養法に有用であるか、あるいは同じ方
法（回収工程を除く）が選択的ポリヌクレオチドをインビボまたはエクスビボで
効率的に発現するのに採用されている場合には、同様に有用である。この方法の
ある具体例は、宿主細胞を上記の二本鎖または部分二本鎖ＤＮＡ分子またはＲＮ
Ａ分子でトランスフェクトし、それにより宿主細胞内でポリヌクレオチド分子か
ら転写または翻訳される異常型ポリヌクレオチド種の形成を阻害する工程を包含
する。宿主細胞が試験管または組織培養中であるこの方法の具体例では、この方
法は、ポリヌクレオチド産物によりコードされる最大量の産物を宿主細胞から発
現させ回収することを可能にする。例えば、宿主細胞は従来法により溶解し、産
物を採取すればよく、あるいは、産物が分泌される場合には、従来の手法により
培地から採取すればよい。

【００８６】宿主が生きている哺乳動物の場合、この方法は、上記のポリヌクレオチド分子
と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤と、
適当な医薬上許容される担体からなる有効量の医薬組成物を哺乳動物患者に投与
することを包含する。医薬用である本発明の組成物は、望ましくは、医薬送達用
の付加的な自由選択の成分と共に、医薬上許容される担体中にＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子あるいはその混合物を含有する。この医薬組成物の特定の処方は、活性な
薬剤の形態に依存する。

【００８７】適当な医薬上許容される担体は、本発明のポリヌクレオチド組成物の投与を容
易にするが、生理学的に不活性および／または無害である。担体は、当業者が選
択しうる。このような担体としては、滅菌食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキスト
ロース、滅菌水、グリセロール、エタノール、ラクトース、スクロース、リン酸
カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油
、ゴマ油および水、ならびにその組合せが挙げられるが、これらに限定されない
。さらに、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセロールまたはジステア
リン酸グリセロールなどの時間を遅らせる物質を、あるいはワックスと共に含み
うる。さらに、緩徐放出性のポリマー製剤を用いることができる。この製剤は、
投与の形態に適しているべきでもある。投与の形態による適当な担体の選択は、
当業者が日常的に行っている。

【００８８】本発明のこのような分子は、ＤＮＡを細胞に導入する公知の手法により、ポリ
ヌクレオチドとして細胞内に導入すればよい。これらの分子は、ファージおよび
ウイルスベクターの場合、感染および形質導入の公知の手法により、パッケージ
化または被包されたＤＮＡまたはＲＮＡウイルスとして細胞内に導入してもよく
、その方が好ましい。ウイルスベクターは、複製能を有していても複製能を欠い
ていてもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、完全化宿主細胞内で
だけ生じる。

【００８９】組成物が、上記のように、ポリヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡ分子、プラ
スミド、ウイルスベクターまたは組換えウイルス、あるいは、ポリヌクレオチド
または様々なポリヌクレオチドの多数のコピーなどを含有する場合、この組成物
は、望ましくは、担体だけを用いて、「裸の」ポリヌクレオチドとして製剤しう
る。あるいは、このような組成物は、望ましくは、自由選択のポリヌクレオチド
促進剤または「協同剤(co-agent)」、例えば、局所麻酔薬、ペプチド、カチオン
性脂質などの脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリジンなどのポリカチオン
、デンドリマー(dendrimer)などの有枝３次元ポリカチオン、炭水化物、カチオ
ン性の両親媒性化合物、洗浄剤、ベンジルアンモニウム界面活性剤、あるいは細
胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする他の化合物を含有する。こ
のような促進剤または協同剤の非限定的な例は、米国特許第5,593,972号、第5,7
03,055号、第5,739,118号、第5,837,533号および国際特許出願第WO96/10038号(1
996年4月4日公開)および国際特許出願第WO94/16737号(1994年8月8日公開)（各々
出典を示すことにより、明細書の一部をなす）に記載されている。

【００９０】用いられる促進剤が局所麻酔薬、好ましくはブピバカインである場合、ポリヌ
クレオチド組成物の全重量に基づいて約０.１重量％〜約１.０重量％の量が好ま
しい。また、小胞複合体での送達に関する国際特許出願第PCT/US98/08799号およ
び約０.００１〜０.０３重量％の量で投与される協同剤としてのベンジルアンモ
ニウム界面活性剤の配合を教示する国際特許出願第PCT/US98/22841号（これらの
教示内容は、出典を示すことにより、明細書の一部をなす）を参照。

【００９１】組成物がポリヌクレオチド以外、例えば、上記のトランスフェクトされたドナ
ー細胞または細菌である場合、組成物は他の付加的な薬剤、例えば、米国特許第
5,824,538号、第5,643,771号、第5,877,159号（出典を示すことにより、明細書
の一部をなす）に記載されているものを含有していてもよい。

【００９２】組成物のいずれに存在していてもよいさらに別の成分は、アジュバント、防腐
剤、化学安定剤、または他の抗原性タンパクである。典型的には、安定剤、アジ
ュバントおよび防腐剤は、目的のヒトまたは動物での効力について最良の製剤を
決定するように最適化される。適当な具体例である防腐剤としては、クロロブタ
ノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パ
ラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノー
ルが挙げられる。用いてもよい適当な安定化成分としては、例えば、カザミノ酸
、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ-Ｚアミン、カリウム二リン酸
、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および粉乳が挙げられる。従来の
アジュバントは、白血球を誘引するか、あるいは免疫応答を増強するのに用いら
れる。このようなアジュバントとしては、特に、リビ(Ribi)、鉱油および水、水
酸化アルミニウム、アンフィジェン(Amphigen)、エイブリジン(Avridine)、Ｌ１
２１／スクアレン、Ｄ-ラクチド-ポリラクチド／グリコシド、プルロニック・プ
リオイス(pluronic plyois)、ムラミルジペプチド、死んだボルデテラ属菌、お
よびサポニン（例えば、クイル・エイ(Quil A)）が挙げられる。

【００９３】さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症剤
として機能し、かつ本発明の組成物と共に投与してもよい他の薬剤としては、α
-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、コ
ロニー刺激因子（例えば、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、
上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ-１、ＩＬ-
２、ＩＬ-４、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＩＬ-１０およびＩＬ-１２）などの増殖因子
、サイトカインおよびリンホカインが挙げられる。さらに、繊維芽増殖因子、界
面活性剤（例えば、免疫刺激複合体(ＩＳＣＯＭＳ)）、フロイント(Freund)不完
全アジュバント、ＬＰＳ類似体（例えば、モノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)）、ム
ラミルペプチド、キノン類似体および小胞複合体（スクアレンおよびヒアルロン
酸）も本発明の組成物と共に投与してもよい。

【００９４】また、医薬組成物は、組成物の選択された投与形態に適した他の添加剤を含有
していてもよい。かくして、これらの組成物は、従来のいかなる投与経路による
投与にも適した添加剤を含有することができる。投与経路としては、非経口投与
、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所
投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、膣内投与などが挙げられるが、これ
らに限定されない。このような経路は、すべてこれらの投与に適しており、用い
る薬剤、患者および治療状態、ならびに類似の因子に依存して、主治医が選択す
ればよい。

【００９５】また、本発明の組成物は、粉剤、液剤または懸濁剤の剤形を開発するための他
の医薬上許容される賦形剤（例えば、鼻腔内または肺内への投与用のもの）と共
に用いることができる凍結乾燥したポリヌクレオチドを含有していてもよい。例
えば、レミントン：ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファーマシ
ィ(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)、第2巻、第19版(1995)
、例えば、第95章のエアロゾル；および国際特許出願第PCT/US99/05547号（これ
らの教示内容は、出典を示すことにより、明細書の一部をなす）を参照。これら
組成物の投与経路は、必要なら、組み合わせるか、あるいは調整すればよい。

【００９６】いくつかの好ましい具体例では、本発明の医薬組成物は、例えば、液剤、粉剤
、エアロゾル剤、錠剤、カプセル剤、腸溶性コーティングを施した錠剤またはカ
プセル剤、あるいは坐剤の形態で、哺乳動物患者への投与用として調製される。

【００９７】本発明の組成物は、医薬組成物として用いる場合には、約１ｎｇ〜約２０ｍｇ
のポリヌクレオチド分子、例えば、合成ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、プラスミ
ド、ウイルスベクター、組換えウイルス、およびその混合物を含有することがで
きる。いくつかの好ましい具体例では、組成物は約１０ｎｇ〜約１０ｍｇのポリ
ヌクレオチド配列を含有する。他の具体例では、医薬組成物は約０.１〜約５０
０μｇのポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの好ましい具体例では、組
成物は約１〜約３５０μｇのポリヌクレオチド配列を含有する。さらに他の好ま
しい具体例では、医薬組成物は約２５〜約２５０μｇのポリヌクレオチド配列を
含有する。いくつかの好ましい具体例では、ワクチンおよび治療薬は約１００μ
ｇのポリヌクレオチド配列を含有する。

【００９８】ＤＮＡまたはＲＮＡ分子がドナー細胞または細菌で送達される本発明の組成物
は、約１〜約１０^７細胞／服用量の範囲内の用量で送達することができる。同様
に、送達薬剤が生きている組換えウイルスである場合、適当なベクターに基づく
組成物は、服用量あたり１×１０^２〜１×１０^１２ｐｆｕを含有する。

【００９９】上記の用量範囲は単なる指針に過ぎない。一般的には、医薬組成物は、それが
設計された目的の疾患、障害または感染を治療または防止するのに有効な量で投
与される。採用された投与単位における医薬組成物の量は、本発明の組成物に対
するインビトロでの細胞の応答および実験動物の応答に基づいて、経験的に決定
される。至適な用量は、各治療の様相および適応度に対して標準的な方法で決定
されるものと認められる。かくして、これら組成物の服用量、投与時期、投与経
路、および再投与の必要性は、治療している症状、その重篤度、合併症状、なら
びに、哺乳動物患者の年齢および身体的状態などの因子、他の活性化合物の採用
などを考慮して、当業者が決定すればよい。

【０１００】本発明のさらに別の具体例は、宿主細胞に本来存在するポリヌクレオチド配列
に相同なポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド分子でトランスフェ
クトされた宿主細胞において必須または望ましいポリヌクレオチド配列の意図し
ないまたは望ましくない不活化またはダウンレギュレーションを防止するための
本発明のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の使用である。この方法は、上記のポリヌクレ
オチド分子、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする自由選択の
薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる有効量の医薬組成物を投与する
工程からなる。

【０１０１】上記の分子内における選択的ポリヌクレオチド配列の同一性に依存して、上記
の組成物、医薬組成物、用量および投与形態は、脊椎動物（特に哺乳動物、さら
に鳥類および他の家禽類、魚類）ならびに無脊椎動物を苦しめる様々な障害（例
えば、異種病原性生物、細胞外または細胞内病原体のいずれかによる感染）の治
療に特に望ましい。さらに、本発明の組成物は、宿主が病原体に感染するのを防
止したり、癌を治療するのに有用である。さらに、これらの組成物は、宿主が欠
損するポリヌクレオチドタンパクまたは機能を効率的に発現させることにより、
遺伝的障害または遺伝子障害の治療に有用である。

【０１０２】当業者は、この開示内容を与えられれば、本発明による治療用または予防用の
組成物を製造することができる目的のウイルス科および属、または病原体（原核
生物および真核原生動物の病原体を含む）ならびに多細胞寄生体を容易に選択す
ることができる。例えば、一般的な免疫学の教科書および米国特許第5,593,972
号（出典を示すことにより、明細書の一部をなす）におけるこのような病原体の
表を参照。当業者は、上記の障害を容易に選択することができ、かつ疾患の治療
または予防に用いるのに適当な選択的ポリヌクレオチド配列を容易に設計するこ
ともできる。

【０１０３】Ｖ．本発明の他の方法上記の組成物、および宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の発現を
増強し、それにより異常型配列の産生または転写を減少させるためにこれらの組
成物を用いる一般的な方法は、このような効率的な発現が必須である様々な研究
およびインビトロでの応用に適用することもできる。これらの組成物および方法
は、植物細胞および昆虫細胞を操作するのに応用してもよく、同様に、宿主はす
でに上で述べた他の生物の中でも特に植物および昆虫であってもよい。

【０１０４】同様に、この方法の応用は、選択的ポリヌクレオチド産物を効率的に産生する
哺乳動物、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物および他の起源の細胞系を製造するた
めに用いることができる。これらの分子は、用いた安定な細胞系がある種のポリ
ヌクレオチドにコードされた産物を製造する効率を上昇させるために採用しても
よい。このような操作された細胞は、動物の医薬用、動物のワクチン用、ならび
に農場における様々な用途の組換えタンパクを製造するのに採用してもよい。こ
のような細胞は、薬物または他の有用な化合物の従来の試験分析、あるいは薬物
のスクリーニングおよび開発用の分析などに採用してもよい。さらに他の用途は
、この教示内容を与えられれば、当業者に自明であると思われる。

【０１０５】以下の実施例は、本発明の組成物を調製する方法、ならびに、選択的ポリヌク
レオチド配列の転写効率およびそれゆえ発現効率を上昇させ、かつ異常型（意図
されない）ポリヌクレオチド配列の発現を減少または阻害するために本発明の組
成物を使用する方法を例示する。これら組成物の様々な選択的ポリヌクレオチド
、ならびにＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子に関する他の選択がこの明細書によ
り教示されているように容易になしうることは、当業者に理解されている。これ
らの実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。

【０１０６】実施例１：マウスインターロイキン１２(ｍＩＬ１２)を選択的ポリヌクレオチ
ドとして用いたコード鎖上にターミネーター配列を含有するＤＮＡプラスミドＤＮＡプラスミド構築物からのネズミＩＬ１２ｐ４０の発現に関する実験は
、文献に報告されている。免疫応答がなければ（マウスにおいて非抗原性）、血
清中におけるＩＬ１２ｐ４０タンパクの発現は、８日目にピークとなり、５０
日目までに基本（内生）レベルに減少する。

【０１０７】以下の実施例では、プラスミド配列は、異常型ＲＮＡの形成を防止するターミ
ネーター配列の挿入により修飾される。ｍＩＬ１２発現ベクターのクローニング
部位は、ヌクレオチド番号４７００（ポリＡ部位の下流）にＨｐａＩおよびヌク
レオチド番号２５６８（ＣＭＶプロモーター／エンハンサー／ＲＳＶエンハンサ
ーモジュールの上流）にＳｐｈＩ部位として、図６に示されている。ｍＩＬ１２
をコードするプラスミド（図６）は、伸張の終結を引き起こす配列（要素）を含
有するように修飾されている。以下に示すターミネーター配列は、プロモーター
クローニング部位にあるヒトＣＭＶプロモーターの上流かつＳＶ４０ポリアデニ
ル化配列の約１５０塩基下流に配置される。ターミネーターをプロモーターの上
流に用いる場合には、ある種の終結配列はポリＡ部位と関連させた場合にだけ効
率的に働くので、ポリアデニル化配列もターミネーター配列の１５０塩基対上流
にクローニングされる。

【０１０８】プラスミドに挿入されるターミネーター配列としては、以下のものが挙げられ
る：ρ依存性およびρ非依存性である細菌ポリメラーゼターミネーターは、各々
、ｔｒｐＡ（ジーンバンク受託番号E02304）およびｒｍＢＴ１Ｔ２（アマシャム
-ファルマシア・バイオテック(Amersham-Pharmacia Biotech)カタログ番号27-49
25-01、ブロシウス, ジェイ(Brosius, J.)、ジーン(Gene),27:151(1984)、ジー
ンバンク受託番号U13859）である。これらの配列は、ファルマシア・バイオテッ
ク(Pharmacia Biotech)から入手可能な既存のベクターから単離されるか、ある
いはこれらの配列は容易に合成される（ジーンバンク受託番号E02304）。ヒスト
ンターミネーター［ジーンバンク受託番号Z46261、ヌクレオチド750-765、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),497-509(1991
年1月)］およびグロビンターミネーター［ジーンバンク受託番号U89937、ヌクレ
オチド4517-4565］二本鎖ＤＮＡが合成される。３３塩基対ｔｒｐＡ二本鎖ＤＮ
Ａ配列は合成され（ジーンバンク受託番号E02304）、ｒｍＢＴ１Ｔ２ターミネー
ター断片を含む１１３９塩基対ＰｖｕII断片はｐＫＫ２３２-８ベクター(アマシ
ャム-ファルマシア・バイオテック(Amersham-Pharmacia Biotech))から単離され
る。これらのヌクレオチド断片は、ｍＩＬ１２ベクター内の制限部位のいずれか
またはＳｐｈＩおよびＨｐａＩ部位の両方にクローニングされる（図６）。

【０１０９】これらのプラスミド構築物の各々を精製する。試験プラスミドの各々の１００
μｇをマウスの後足の筋肉組織に注射する。２組の対照マウス群も用いる：一方
の対照マウス群は同量の出発プラスミドを注射し、他方の群はｐ４０ｃＤＮＡ配
列を含有しない基幹プラスミドを注射する。

【０１１０】ｍＩＬ１２／ｐ４０鎖の発現は、クウォンティカイン(Quantikine)Ｍ-ＩＬ-１
２ｐ４０ＥＬＩＳＡ分析法（ジーンザイム(Genzyme)）を用いることにより、接
種されたマウスの血清中で分析する。ターミネーターを含有するプラスミドは、
対照プラスミドより血清中におけるＩＬ１２ｐ４０のレベルが高くなるのに対し
、発現カセットの両側にターミネーターを含有するプラスミドは、ＩＬ１２ｐ４
０を最大限に発現すると期待される。コード鎖上にターミネーター配列を含有す
るプラスミドは、従来技術のプラスミドに比べて、ＩＬ-１２の発現が増え、か
つＩＬ-１２の発現寿命が延びると予想される。

【０１１１】実施例２：非コード鎖上のターミネーター配列実施例１に記載したように、ｍＩＬ１２をコードするプラスミド（図６）を、
同様に、非コード鎖上における伸張の終結を引き起こす配列（要素）を含有する
ように修飾する。これらの要素は、非コード鎖上にあって、ＳｐｈＩクローニン
グ部位にあるＣＭＶプロモーターの上流かつＨｐａＩクローニング部位にあるＳ
Ｖ４０ポリアデニル化配列に対して約１５０塩基下流の位置に配置される。

【０１１２】実施例１に記載したのと同じターミネーター配列のヌクレオチド断片を非コー
ド鎖上のｍＩＬ１２ベクター中の制限部位のいずれか、あるいはＳｐｈＩおよび
ＨｐａＩ部位の両方にクローニングする。これらの構築物の各々を精製する。プ
ラスミドの各々の１００μｇをマウスの後足の筋肉組織に注射する。ｍＩＬ１２
／ｐ４０鎖の発現は、実施例１に記載したＥＬＩＳＡにより接種したマウスの血
清中で分析する。この実施例では、２組の対照マウス群を用いる：一方の対照マ
ウス群は同量の出発プラスミドを注射し、他方の群はｐ４０ｃＤＮＡ配列を含有
しない基幹プラスミドを注射する。

【０１１３】非コード鎖上にいずれか１個のターミネーターを含有するプラスミドは、対照
プラスミドより血清中におけるＩＬ１２ｐ４０のレベルが高くなると期待される
のに対し、非コード鎖上の発現カセットの両側にターミネーターを含有するプラ
スミドはＩＬ１２ｐ４０を最大限に発現すると期待される。非コード鎖上にター
ミネーターを含有するプラスミド構築物は、対照と比較した場合に、従来技術の
プラスミドよりＩＬ１２の発現が増え、かつ期間が長くなる。

【０１１４】実施例３：コード鎖および非コード鎖上のターミネーター配列ｍＩＬ１２をコードする実施例１および２のプラスミド（図６）を、さらに、
二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖および非コード鎖の両方の上に伸張の終結を引き起
こす配列（要素）を含有するように修飾する。このような２個の要素はプロモー
タークローニング部位（ＳｐｈＩ部位）にあるＣＭＶプロモーターの上流に配置
され、かつ２個の要素はＳＶ４０ポリアデニル化配列（ＨｐａＩ部位）の約１５
０塩基下流の位置に配置されることにより、一方の要素はコード鎖上で有効であ
り、他方の要素は非コード鎖上で有効である。クローニング部位およびターミネ
ーター配列は、実施例１で採用したものと同様である。

【０１１５】実施例１および２のプラスミドを、さらに、コード領域内を含めてシストロン
内のセンス鎖またはコード鎖上の１個またはそれ以上の部位に、ニルソン(Nilss
on)ら、サイエンス(Science),265:2085-2088(1994)に記載されているようなパド
ロックターミネーターを加えることにより修飾する。例えば、パドロックターミ
ネーターは、ＩＬ-１２コード鎖内の１個、２個またはそれ以上の部位に付加さ
れる。付加的な自由選択のパドロックは、５'または３'非翻訳領域のいずれかの
アンチセンス鎖内に付加してもよい。

【０１１６】これらのヌクレオチド断片を、ｍＩＬ１２ベクターにおける制限部位のいずれ
か、あるいはＳｐｈＩおよびＨｐａＩ部位の両方にクローニングする（図６）。
これらの構築物の各々を精製する。

【０１１７】発現カセットの両側にあって両方の鎖上にターミネーターを有するプラスミド
の各々の１００μｇをマウスの後足の筋肉組織に注射する。ｍＩＬ１２／ｐ４０
鎖の発現は、上記にように、標準的なＥＬＩＳＡにより接種したマウスの血清中
で分析する。２組の対照マウス群を用いる：一方の対照マウス群は、コード鎖上
の発現カセットの両側にターミネーターを含有する同量のプラスミドを注射する
。他方の群は、非コード鎖上の発現カセットの両側にターミネーターを含有する
同量のプラスミドを基幹プラスミドと共に注射する。

【０１１８】コード鎖および非コード鎖の両方にターミネーターを含有する構築物は、最大
両のＩＬ１２を対照プラスミドより長期間にわたって発現すると予想される。

【０１１９】実施例４：ＲＮＡ不安定配列の使用ＲＮＡ不安定配列ＵＵＡＵＵＵＡＵＵ［エイ・エム・クラトーラ(A.M. Curato
la)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15
(11):6331-6340(1995年4月)；エイ・エム・ズビアガ(A.M. Zubiaga)ら、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.),15(4):2219-2230
(1995年4月)］を二本鎖ＤＮＡとして合成し、図６および実施例１のプラスミド
のコード鎖または非コード鎖あるいは両方の鎖内にあって、ポリＡ部位の下流に
あるＨｐａＩ部位、および／または、プロモーターの上流にあるＳｐｈＩ部位に
クローニングする。これらの不安定配列を含有するＲＮＡ分子は急速の分解する
。

【０１２０】これらの構築物の各々を精製する。プラスミドの各々の１００μｇをマウスの
後足の筋肉組織に注射する。ｍＩＬ１２／ｐ４０鎖の発現は、上記のように、Ｅ
ＬＩＳＡにより接種したマウスの血清中で分析する。２組の対照マウス群を用い
る：一方の対照マウス群は同量の出発プラスミド（ＲＮＡ不安定配列を有しない
）を注射し、他方の群はｐ４０ｃＤＮＡ配列を含有しない基幹プラスミドを注射
する。

【０１２１】不安定配列を含有するプラスミドは、対照プラスミドより血清中におけるＩＬ
１２ｐ４０のレベルが高くなるのに対し、多数のＲＮＡ不安定配列を含有するプ
ラスミドほど、多くのＩＬ１２ｐ４０を発現すると期待される。

【０１２２】実施例５：修飾構築物からの異常型ＲＮＡ合成の非存在ＳＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶプロモーターを、上記実施例１〜４に記載
したのと同様のターミネーターまたは不安定配列を含有するプラスミド内ならび
にターミネーターおよびＲＮＡ不安定配列を含有しない対照プラスミド内の発現
カセットの外側に逆向きに配置する。これらのプラスミドを用いて、ヒト横紋筋
肉腫(ＲＤ)細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Ty
pe Culture Collection)から入手可能なヒト細胞系）をトランスフェクトする。

【０１２３】トランスフェクトされた細胞由来のＲＮＡを分析する。例えば、図７の概略図
における領域Ａの配列内、すなわち２個のターミネーター●^１と●^２との間にあ
る配列内に由来する配列を用いて、ノーザンブロットを調べる。電気泳動させた
後、リボヌクレアーゼＡ分解したＲＮＡのノーザンブロット分析は、領域Ａ配列
内に由来するプローブを用いて行う。リボヌクレアーゼＡは一本鎖ＲＮＡを分解
するが、二本鎖ＲＮＡを分解しないはずである。

【０１２４】異常型ＲＮＡ抑制要素（ターミネーターおよびＲＮＡ不安定配列）を含有する
プラスミドでトランスフェクトした細胞のＲＮＡ調製物中に、領域Ａ由来のＲＮ
Ａは全く検出されないか、あるいは非常に減少した量しか検出されない。対照プ
ラスミドでトランスフェクトされた細胞のＲＮＡ調製物のノーザンブロットには
、領域Ａ由来のＲＮＡが検出される。さらに、異常型ＲＮＡ抑制要素を含有しな
い対照プラスミドの場合だけ、リボヌクレアーゼ分解の後に、二本鎖ＲＮＡが検
出される。

【０１２５】上記の刊行物は、すべて出典を示すことにより、明細書の一部をなす。本発明
の数多くの修正および変更は上記の明細書に包含され、当業者に自明であると期
待される。本発明の組成物および方法に対するこのような修正および変更は、こ
こに添付した特許請求の範囲に包含されると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、５'ターミネーター配列(Ｔ^１)、プロモーター(Ｐ)、
選択的ポリヌクレオチド配列(ＰＮ)、ポリアデニル化配列(ｐＡ)、３'ターミネ
ーター配列(Ｔ^２)を有する第１「センス」鎖と、第２鎖ターミネーター配列（Ｔ ^３）を有する第２相補鎖とを含有する本発明の二本鎖ＤＮＡ分子の説明図である
。この場合、第２鎖ターミネーター配列はセンス鎖上のポリＡ配列に対して３'
側にある位置に存在する。この第１鎖または第２鎖のいずれを本発明の一本鎖Ｄ
ＮＡ分子に利用してもよい。図１Ｂは、２個の５'ターミネーター配列(Ｔ^１およびＴ^２)、プロモーター(Ｐ
)、選択的ポリヌクレオチド配列(ＰＮ)、ポリアデニル化配列(ｐＡ)、３'ターミ
ネーター配列(Ｔ^３)およびＲＮＡ不安定配列(ＲＩＳ)を有する第１「センス」鎖
と、第１鎖上の発現カセット領域に相補的でない領域に点在させた多数の第２鎖
ターミネーター配列（Ｔ^４〜Ｔ^８）を有する第２相補鎖とを含有する本発明の別
の二本鎖ＤＮＡ分子の説明図である。この場合、ターミネーターＴ^４およびＴ^５はセンス鎖上のポリＡ配列に対して下流側にある位置に存在し、ターミネーター
Ｔ^６〜Ｔ^８はセンス鎖上のプロモーター(Ｐ)に対して上流側にある位置に存在す
る。この第１鎖または第２鎖のいずれを本発明の一本鎖ＤＮＡ分子に利用しても
よい。図１Ｃは、パドロックターミネーター(ＰＴ)、プロモーター(Ｐ)の５'側に存
在する別のターミネーター(Ｔ^２)、選択的ポリヌクレオチド配列(ＰＮ)、ポリア
デニル化配列(ｐＡ)、３'ターミネーター配列(Ｔ^３)を有する第１「センス」鎖
と、第１鎖上の発現カセット領域に相補的でない領域に点在させた多数の第２鎖
ターミネーター配列（Ｔ^４〜Ｔ^６）を有する第２相補鎖とを含有する本発明の別
の二本鎖ＤＮＡ分子の説明図である。この場合、ターミネーターＴ^４およびＴ^５はセンス鎖上のポリＡ配列に対して下流側にある位置に存在し、ターミネーター
Ｔ^６はセンス鎖上のプロモーター(Ｐ)に対して上流側にある位置に存在する。こ
の第１鎖または第２鎖のいずれを本発明の一本鎖ＤＮＡ分子に利用してもよい。第１Ｄは、パドロックターミネーター(ＰＴ)が選択的ポリヌクレオチド(ＰＮ)
配列内のセンス鎖上に位置すること以外は、図１Ｃに示したように位置する多数
のターミネーターを有する本発明の別の二本鎖ＤＮＡ分子の説明図である。

【図２】図２Ａは、塩基対を形成し、それ自身の上に折り重なって、二本
鎖または部分二本鎖ＲＮＡとなり得る、配列Ａの逆方向相補反復部分（配列Ｂ）
を含有するインビトロで作成されたＲＮＡ分子を例示する概略図である。この概
略図において、コドンＧＣＣはＡｌａをコードし、ＡＡＧはＬｙｓをコードし、
ＣＵＵおよびＵＵＧはいずれもＬｅｕをコードし、ＧＧＣおよびＧＧＡはいずれ
もＧｌｙをコードする。図２Ｂは、ゆらぎ塩基（すなわち、変更された場合に、コドンを変化させるが
、コードされたアミノ酸は変化させないようなコドン内のヌクレオチド）を変更
して逆方向相補反復部分を除去することを例示する概略図である。この概略図に
おいて、コドンＧＣＣはＡｌａをコードし、ＡＡＧはＬｙｓをコードし、ＣＵＵ
およびＵＵＧはいずれもＬｅｕをコードし、ＧＧＣおよびＧＧＡはいずれもＧｌ
ｙをコードする。一方の相補逆方向反復配列にゆらぎを与えることにより、塩基
対の形成は不完全であり、安定な二本鎖分子を形成させない。

【図３】図３Ａは、小さいヘアピン部分を有するＲＮＡ分子と、内在性Ｒ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用の結果とを例示する概略図である。図３Ｂは、３'鎖ターミネーター(＊)で修飾された同じ分子に対する効果を例
示する概略図である。内在性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるヘアピン部
分の伸張は不可能である。

【図４】図４Ａは、ＤＮＡ二本鎖プラスミドを例示する概略図である。図４Ｂは、ターミネーター配列が存在しない場合に、図４Ａのプラスミドから
いかにして転写物が形成されるかを例示する概略図である。異常型ＲＮＡ鎖は、
プラスミドの両鎖から誘導される。各矢印は転写の方向を示す。これらの転写物
の中には、他の転写物と塩基対を形成して二本鎖ＲＮＡを形成することができる
ものが存在する。図４Ｃは、両鎖にターミネーターを有する二本鎖ＤＮＡプラスミドから生成す
る転写物を例示する概略図である。コード鎖上のターミネーターは＊で表す。非
コード鎖上のターミネーターは○で表す。矢印は転写の方向を示す。

【図５】図５は、プラスミドの第１（コード）鎖の伸張領域の概略図であ
る。コード鎖上のターミネーターは＊で表す。転写物は依然としてプラスミドＤ
ＮＡ上の様々な隠れた部位から開始することができるが、プラスミドの至る所に
ターミネーターが存在することにより、開始された転写物はターミネーターを過
ぎて伸張することが防止され、かくしてＤＮＡ二本鎖プラスミドから異常型ＲＮ
Ａの形成が防止される。

【図６】図６は、実施例１〜４で採用したプラスミドを例示する。このプ
ラスミドは、呼吸器合胞体ウイルスエンハンサー(ＲＳＶｅｎｈ)およびヒトサイ
トメガロウイルスプロモーター(ＨＣＭＶ)を含有する発現カセットと、ネズミＩ
Ｌ-１２ｐ４０選択的ポリヌクレオチド配列と、ＳＶ４０ポリアデニル化(ポリ
Ａ)部位とを有する。また、このプラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子(Ｋａｎ ^Ｒ )と、複製の始点(ｏｒｉ)とを含有する。制限エンドヌクレアーゼ酵素制限部
位は、それら各々のヌクレオチド位置番号に共に示されている。このプラスミド
は、各鎖の長さが４７０９塩基である。

【図７】図７は、実施例５に用いた二本鎖プラスミドである。このプラス
ミドは、２つのプロモーター：第１鎖からある方向に転写を向かわせるサルサイ
トメガロウイルス(ＳＣＭＶ)プロモーターと、第２鎖から反対方向に転写を向か
わせるＨＣＭＶプロモーターとを含有する。矢印は転写の方向を示す。ターミネ
ーターおよびＲＮＡ不安定配列は●で表され、第２鎖のターミネーターは●^１で
表され、第１鎖のターミネーターは●^２で表される。領域Ａは、図示のように、
●^１と●^２との間に存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA11 DA02 EA04 FA02 FA07 FA18 GA11 HA17 HA19 4B065 AA90X AA99Y AB01 BA02 CA24 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１コード鎖と第２転写鋳型鎖とからなる二本鎖ポリヌクレ
オチド分子であって、（ａ）該第１コード鎖は、（ｉ）５'から３'方向に、プロモーター、選択的ポリヌクレオチド配列（そ
の発現は該プロモーターにより制御される）およびポリアデニル化部位からなる
発現カセット配列と、（ii）少なくとも１個の第１鎖ターミネーター配列と、を有し；（ｂ）該第２鎖は該第１鎖に相補的であり、第１鎖ターミネーター配列に相補
的な該第２鎖配列の部分は該第１鎖発現カセットに相補的な第２鎖配列からの転
写を妨害せず、また、該第２鎖は該第１鎖発現カセットに相補的な第２鎖配列の
外側にあって該第２鎖上に開始された転写を終結させる少なくとも１個の第２鎖
ターミネーター配列を有する、二本鎖ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】前記第１鎖ターミネーター配列が、前記プロモーターの５'
側に存在するターミネーター配列、前記ポリアデニル化部位の３'側に存在する
ターミネーター配列、前記発現カセット配列の外側にあって該第１鎖上に存在す
るターミネーター配列、および、該発現カセット配列の選択的ポリヌクレオチド
配列内に存在するターミネーター配列からなる群から選択される請求項１記載の
ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】前記第２鎖ターミネーター配列が前記発現カセット配列に相
補的でない配列中にあって前記第２鎖上に存在する請求項１記載のポリヌクレオ
チド分子。
【請求項４】前記第１鎖がさらにリボヌクレオリティック部位に相補的な
配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項５】前記第１鎖がさらに触媒部位に相補的な配列を有する請求項
１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項６】前記リボヌクレオリティック部位がＲＮＡ不安定配列である
請求項４記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項７】前記不安定配列が、第２ターミネーター配列の３'側、第１
ターミネーター配列の５'側またはコード配列内にあって、前記第１鎖上に存在
する請求項６記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項８】前記第１鎖ターミネーター配列が、前記プロモーターの５'
側に１〜５０個のヌクレオチドだけ離れて存在する請求項２記載のポリヌクレオ
チド分子。
【請求項９】前記第１鎖ターミネーター配列が、前記ポリアデニル化部位
から３'側に約１００個のヌクレオチドだけ離れて該第１鎖上に存在する請求項
２記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】前記第１鎖ターミネーター配列が、前記ポリＡ部位から３
'側に約１５０個のヌクレオチドだけ離れて該第１鎖上に存在する請求項９記載
のポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】該第１鎖が少なくとも２個のターミネーターを含有する請
求項２記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】前記第１鎖ターミネーター配列が該第１鎖上の望ましくな
い転写を減少させる請求項２記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】第１鎖が７個より多いヌクレオチドからなる逆方向相補反
復配列を有しない請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】前記第１鎖ターミネーター配列が、細菌ターミネーター、
バクテリオファージターミネーター、ポリＡ部位とそれに続く真核生物ＲＮＡ転
写中断部位、ポリＡ部位とそれに続くα-グロビンターミネーター、ヒストンプ
ロセッシングシグナル、リボザイム開裂部位とそれに続く該転写中断部位を与え
るポリ核酸配列、リボ核酸開裂部位とそれに続く該転写中断部位、ρ依存性ター
ミネーター、ρ非依存性ターミネーター、および環状の一本鎖パドロックポリヌ
クレオチド配列（ただし、該パドロックの少なくとも１０個の連続したヌクレオ
チドと該第１鎖上の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドとの間のハイブリ
ダイゼーションにより該ポリヌクレオチド分子に捩れて連結している）からなる
群から独立して選択される請求項１１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】第２鎖が２個以上のターミネーター配列を有する請求項１
記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】さらに、前記第１鎖の発現カセット配列に相補的な配列の
外側の位置にあって第２鎖配列上に存在する少なくとも１個のＲＮＡ不安定配列
を有する請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】前記第２鎖が７個より多いヌクレオチドからなる逆方向相
補反復配列を有しない請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】前記第２鎖が４個より多いヌクレオチドからなる逆方向相
補反復配列を有しない請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１９】前記第２鎖ターミネーター配列が前記第１鎖ポリＡ部位の
３'側に存在する請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】前記第２鎖ターミネーター配列が、前記第１鎖発現カセッ
ト配列に相補的である配列の外側の第２配列中にあって、ポリＡ部位から２００
個未満のヌクレオチドだけ離れて存在する請求項１記載のポリヌクレオチド分子
。
【請求項２１】前記第２鎖ターミネーター配列が前記第１鎖プロモーター
の５'側に存在する請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】前記第２鎖ターミネーター配列が、細菌ターミネーター、
バクテリオファージターミネーター、リボザイムまたはリボ核酸開裂部位とそれ
に続くα-グロビンターミネーターからなる配列、ヒストンプロセッシングシグ
ナル、リボ核酸開裂部位またはリボザイム開裂部位とそれに続く真核生物ＲＮＡ
転写中断部位からなる配列、ρ依存性ターミネーター、ρ非依存性ターミネータ
ー、および環状の一本鎖パドロックポリヌクレオチド配列（ただし、該パドロッ
クの少なくとも１０個の連続したヌクレオチドと該第２鎖上の少なくとも１０個
の連続したヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションにより該ポリヌクレオ
チド分子に捩れて連結している）からなる群から独立して選択される請求項１記
載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２３】ポリヌクレオチドベクターである請求項１記載のポリヌク
レオチド分子。
【請求項２４】さらに、該分子でトランスフェクトした細胞の核にポリヌ
クレオチドを局在化させる配列を有する請求項２３記載のポリヌクレオチド分子
。
【請求項２５】ゆらぎヌクレオチドが変更されて逆方向相補反復部分の発
生が防止される請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２６】前記第１鎖配列および前記第２鎖配列が線状分子を形成す
る請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】前記第１鎖配列および前記第２鎖配列が環状分子を形成す
る請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２８】前記選択的ポリヌクレオチド配列がタンパクをコードする
請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２９】前記選択的ポリヌクレオチド配列が生物学的活性を有する
請求項１記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３０】前記プロモーターが弱いプロモーターである請求項１記載
のポリヌクレオチド分子。
【請求項３１】選択的ポリヌクレオチド配列からなる配列の部分における
実質的にすべてのコドンのゆらぎ塩基が修飾されて同じアミノ酸配列をコードす
るが、宿主細胞に存在するポリヌクレオチド配列に実質的に非相同のヌクレオチ
ド配列を与える二本鎖ポリヌクレオチド分子。
【請求項３２】請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
分子と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤
と、適当な医薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
【請求項３３】請求項１〜３２のいずれか１項に記載の二本鎖ポリヌクレ
オチド分子の第１鎖または第２鎖から選択される一本鎖ポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】前記ターミネーター配列が、細菌ターミネーター、バクテ
リオファージターミネーター、リボザイム開裂部位またはリボ核酸開裂部位とそ
れに続く真核生物ＲＮＡ転写中断部位またはα-グロビンターミネーターからな
る配列、ヒストンプロセッシングシグナル、ρ依存性ターミネーターおよびρ非
依存性ターミネーターからなる群から独立して選択される請求項３３記載のポリ
ヌクレオチド配列。
【請求項３５】請求項３３〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ド分子と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする自由選択の薬
剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
【請求項３６】５'末端、宿主細胞内で翻訳された場合に選択的な生物学
的機能を有するリボヌクレオチド配列、および、３'末端からなり、二本鎖また
は部分二本鎖ＲＮＡ分子を安定に形成することができない実質的に一本鎖のＲＮ
Ａ分子。
【請求項３７】ゆらぎヌクレオチドが変更されて逆方向相補反復部分の発
生が防止される請求項３６記載の分子。
【請求項３８】３'末端におけるヘアピン部分の伸張を防止するように修
飾された請求項３６記載の分子。
【請求項３９】長さが７個より多くのヌクレオチドからなる逆方向相補反
復配列を有しない請求項３６記載の分子。
【請求項４０】長さが４個より多くのヌクレオチドからなる逆方向相補反
復配列を有しない請求項３６記載の分子。
【請求項４１】該分子の５'末端にキャップを有する請求項３６記載の分
子。
【請求項４２】前記修飾が前記配列の３'末端に鎖ターミネーターを結合
させることからなる請求項３８記載の分子。
【請求項４３】前記配列中に位置し、５'コドンの５'側に存在するコザッ
ク配列を有する請求項３６記載の分子。
【請求項４４】ポリＡ尾部を有する請求項３６記載の分子。
【請求項４５】ポリＡ尾部を有しない請求項３６記載の分子。
【請求項４６】選択的ポリヌクレオチド配列からなる分子配列の部分にお
ける実質的にすべてのコドンのゆらぎ塩基が修飾されて同じアミノ酸配列をコー
ドするが、宿主細胞に存在するポリヌクレオチド配列に実質的に非相同のヌクレ
オチド配列を与える実質的に一本鎖のＲＮＡ分子。
【請求項４７】請求項３６〜４５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
ド分子と、細胞にＲＮＡを取り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤と、適当
な医薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
【請求項４８】宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の発現効率
を増強させる方法であって、該宿主細胞を第１コード鎖と第２転写鋳型鎖とから
なる二本鎖ポリヌクレオチド分子でトランスフェクトし、それにより該宿主細胞
中の該ポリヌクレオチド分子から転写される異常型ポリヌクレチド配列の形成を
阻害する工程からなる方法であって、（ａ）該第１コード鎖は、（ｉ）５'から３'方向に、プロモーター、選択的ポリヌクレオチド配列（そ
の発現は該プロモーターにより制御される）およびポリアデニル化部位からなる
発現カセット配列と、（ii）少なくとも１個の第１鎖ターミネーター配列と、を有し；（ｂ）該第２鎖は該第１鎖に相補的であり、第１鎖ターミネーター配列に相補
的な該第２鎖配列の部分は該第１鎖発現カセットに相補的な第２鎖配列からの転
写を妨害せず、また、該第２鎖は該第１鎖発現カセットに相補的な第２鎖配列の
外側にあって該第２鎖上に開始された転写を終結させる少なくとも１個の第２鎖
ターミネーター配列を有する、方法。
【請求項４９】前記第１鎖ターミネーター配列が、前記プロモーターの５
'側に存在するターミネーター配列、前記ポリアデニル化部位の３'側に存在する
ターミネーター配列、前記発現カセット配列の外側にあって該第１鎖上に存在す
るターミネーター配列、および、前記発現カセット配列の選択的ポリヌクレオチ
ド配列内に存在するターミネーター配列からなる群から選択される請求項４８記
載の方法。
【請求項５０】前記第２鎖ターミネーター配列が前記第１鎖発現カセット
配列に相補的でない配列中にあって前記第２鎖上に存在する請求項４８記載の方
法。
【請求項５１】宿主患者を治療する方法であって、請求項１〜３１のいず
れか１項記載のポリヌクレオチド分子と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませ
るのを容易にする自由選択の薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる有
効量の医薬組成物を投与することからなる方法。
【請求項５２】宿主細胞における選択的ポリヌクレオチド配列の発現効率
を増強する方法であって、該宿主細胞を、５'末端、宿主細胞内で翻訳された場
合に選択的な生物学的機能を有するリボヌクレオチド配列、および、３'末端か
らなり、二本鎖または部分二本鎖ＲＮＡ分子を安定に形成することができない実
質的に一本鎖のＲＮＡ分子でトランスフェクトする工程からなる方法。
【請求項５３】宿主患者を治療する方法であって、請求項３６〜４５のい
ずれか１項記載のポリヌクレオチド分子と、細胞にＲＮＡを取り込ませるのを容
易にする自由選択の薬剤と、適当な医薬上許容される担体とからなる有効量の医
薬組成物を投与することからなる方法。
【請求項５４】宿主細胞内に存在するポリヌクレオチド配列の思いがけな
い不活化またはダウンレギュレーションを防止する方法（ただし、該宿主細胞は
該ポリヌクレオチド配列に相同なポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオ
チド分子でトランスフェクトされている）であって、請求項１〜３１および３６〜４５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド分子
と、細胞にポリヌクレオチドを取り込ませるのを容易にする自由選択の薬剤と、
適当な医薬上許容される担体とからなる有効量の医薬組成物を投与する工程から
なる方法。