JP2003501050A

JP2003501050A - 天然型ＰｒＰＳＣを特異的に認識する核酸分子、製造及び使用

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Publication number: JP2003501050A
Application number: JP2001500811A
Authority: JP
Inventors: ヴァイスシュテファン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-01
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2003-01-14
Also published as: EP1100958A2; WO2000073501A2; DE50012021D1; US7371833B1; EP1100958B1; DE19925073A1; DE19925073C2; ATE315105T1; WO2000073501A3; CA2339131A1; AU5527700A

Abstract

(57)【要約】核酸分子を単離するための方法であり、その核酸分子は天然型PrP ^SCとの特異的相互作用、及び天然型PrP ^C と天然型PrP ^SCとの区別が可能であり、その方法は−核酸のプールを精製したPrP ^SC調製物（PPPs）とインキュベートし、−得られた蛋白質／核酸分子複合体を選抜及び単離し、そして−特異的な核酸分子を任意に増幅し、そしてインキュベーション及び単離の過程を任意に繰り返す、という過程を用い、それにより得られた核酸分子、及び伝染性海綿状脳症の診断及び治療のためのそれの使用が述べられている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、核酸分子及びそれらの誘導体の分野に係り、それらの核酸分子及び
誘導体はプリオン蛋白質と相互作用することが可能であり、プリオン蛋白質は非
常に多様な形態の伝染性海綿状脳症（TSE ）の発生に関与している。特に本発明
は、 PrP^C とPrP ^SCのアイソフォームの間を特異的に区別する事が可能な核酸分
子の、選抜及び単離のための方法、この方法により得ることができる核酸分子、
及びこれらの核酸分子を含む薬剤組成物及び診断組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】

プリオンは、伝染性海綿状脳症（TSE ）の原因であると推定されており、伝染
性海綿状脳症（TSE ）には例えばヒツジ、ネズミ及びハムスターのスクレイピー
、ウシ伝染性海綿状脳症（BSE ）、伝染性海綿状ミンク脳症（TME ）、ヒトにお
けるクルー、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ症候群（GSS ）、ク
ロイツフェルト・ヤコブ病（CJD ）及び致死性家族性不眠症（FFI ）があり、プ
リオンは、完全にでないにしろ主として、遍在する細胞プリオン蛋白質である P
rP^C の異常なアイソフォームのPrP ^SCにより構成されている（概観のため、Lasm
ezas and Weiss,1999; Rieger et al.,1999; Prusiner et al.,1998; Weissmann
and Aguzzi,1997）。

【０００３】 WO 97/15685 及びその中で引用された参考文献は、 PrP^C とPrP ^SCのアイソフ
ォームのうち、 PrP^SCのみが処理されて、プロテイナーゼ Kに対して耐性である
PrP27-30アイソフォームになることが可能であることを、開示している。 PrP^SC は、二次構造の点で、即ちα−ヘリックスとβープリーティドシート（pleated
sheet ）の比率において、 PrP^C と異なっている。シリアンゴールデンハムスタ
ーの場合、 PrP^C とPrP ^SCとを比較すると、PrP27-30はアミノ末端において67個
のアミノ酸が切り取られている事もまた、知られている。

【０００４】 WO 97/15685 の中で、この性質は、プリオン蛋白質と関連した病気の診断の為
に用いられている。WO 97/15685 の教示によると、GST と融合した PrP^C が試験
において、特定の核酸配列を同定して選抜するために用いられており、その核酸
配列は細胞中のアイソフォームである PrP^C とPrP ^SCの間で［sic ］を区別でき
る事を意図している。 PrP^C と組み換え（rec ） PrP^C 27-30 は、上述した様に
、シリアンゴールデンハムスターに由来する PrP^C であり、アミノ末端において
67個のアミノ酸が切り取られており、 PrP^C と組み換え（rec ） PrP27-30 はグ
ルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST ）融合物として、選抜された核酸分子の
結合活性を試験する目的で用いられた。

【０００５】 WO 97/15685 の中で述べられた、特異的な核酸分子の同定及び単離のための方
法は、この関連において下記の： −グルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST ）と融合した PrP ^Cを、異なった配
列より成る核酸分子のプールとインキュベートする工程と、 −GST と融合した、 PrP ^Cと結合可能な核酸分子を選抜及び単離する工程と、 −単離された核酸分子を任意に増幅し、インキュベーション工程及び選抜工程を
任意に繰り返し、そして −単離された核酸分子の、 PrP^C 及びPrP ^SCのアイソフォーム又は PrP27-30 又
はその断片またはその誘導体に対する結合特異性を測定する工程、より成る。

【０００６】その選抜中に見出された核酸分子が、rec PrP 27-30 と結合しないという事実
は、しかしながら、その核酸分子がPrP 分子のアミノ末端領域へ結合する事を示
すにすぎない。

【０００７】それどころか、WO 97/15685 の中で述べられた工程によっては、天然型PrP ^SC のみに特異的に結合する核酸分子を得ることは不可能である事が明らかとなった
。更に、WO 97/15685 の中で検出されたPrP C に特異的な核酸分子は、伝染性海
綿状脳症（TSE ）を直接的に診断することに用いる事はできない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】

そのために本発明の目的は、天然の状態のPrP ^SCに特異的に結合し、PrP ^SCを
PrP^C から区別できる核酸分子を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

従って本発明の最初の視点は、核酸分子の選抜及び単離の方法に関し、その核
酸分子は天然型PrP ^SCと特異的に相互作用する事、及び天然型PrP ^C と天然型Pr
P ^SCを区別する事が可能であり、本方法は −異なった配列を有する核酸のプールを、精製したPrP ^SC調製物（PPPs）とイン
キュベートする工程、 −得られた蛋白質／核酸分子複合体を選抜及び単離する工程、そして −単離された核酸分子を任意に増幅し、そしてインキュベーション、単離及び増
幅の工程を任意に繰り返す工程、より成る。上記の方法は、得られた核酸分子を、それ自体は既知の方法により同定する工
程も、好ましくは含む。

【００１０】「核酸のプール」という用語は、異なった配列より成る核酸分子の任意の混合
物を意味し、好ましくは、非常に複雑であり高度に宿重（degenerate）した核酸
のプールを意味する。このプールは、関連技術分野において知られたRNA プール
M111.1であることが、特に好ましい（Famulok, 1994 ）。他の好ましい態様にお
いては、このプールはDNA/RNA 分子を修飾してそれらの安定性を増加させた、無
作為化（ランダム化）されたDNA/RNA プールである。

【００１１】「精製PrP ^SC調製物（PPPs）」という用語により、下記の記載に従って、プロ
テイナーゼ K（PK）を使用せずに、特別な処理方法により得られたPrP ^SC調製物
を意味する。

【００１２】これに関連して、PrP ^SCは臨床段階の伝染性海綿状脳症に罹っている動物の組
織からペレットの形で単離され、単離はTSE 及び脳ホモジネートの実施例につい
て記載した、実験の項で述べた方法により行われる。

【００１３】本発明によれば、核酸分子として一本鎖又は二本鎖核酸分子、例えばRNA 、修
飾されたRNA 、一本鎖DNA 又は二本鎖DNA 、を使用することが可能である。

【００１４】「天然型PrP ^C 」という用語は、本発明によれば、プリオン蛋白質の遍在する
細胞内アイソフォーム、及びその断片及び誘導体を含み、それらが由来する生物
には関わりがない。

【００１５】「天然型PrP ^SC」という用語は、プリオン蛋白質の、伝染性海綿状脳症に関連
している異常なアイソフォーム、及びその天然由来の誘導体を含み、それらが由
来する生物には関わりがない。

【００１６】「天然型」という用語により、変性条件を生物分子の構造（conformation）を
破壊する条件であるとみなす場合に、最も広範な形態において、非変性条件下の
存在型を意味するものである。

【００１７】「誘導体」という用語は、PrP ^C とPrP ^SCプリオン蛋白質のアイソフォームの
化学的に修飾された形態、及びそれらの蛋白質の変異体を、その用語の最も一般
的な形態において含むものであり、即ち天然由来のプリオン蛋白質アイソフォー
ムと、アミノ酸配列の１つの位置又はそれ以上の位置において異なっている蛋白
質、及び天然由来のプリオン蛋白質アイソフォームと比較して欠損部及び／又は
挿入部を有する蛋白質を含む。これらのタイプの変異体は、組み換えDNA 技術に
より作製することができ、又は天然由来の変異体でもよい。誘導体という用語は
、修飾されたアミノ酸を含む蛋白質、又はグリコシル化、リン酸化又は類似の修
飾により修飾された蛋白質もまた含む。

【００１８】精製PrP ^SC調製物（PPPs）は、本発明において、天然型PrP ^SCと相互作用する
ことが可能でかつ天然型PrP ^C と天然型PrP ^SCとを区別することが可能な核酸分
子を単離するためのプローブ又は標的として用いられ、精製PrP ^SC調製物は、主
として凝集した形態のPrP ^SCである感染性の画分に相当し、例えばスクレイピー
に感染したハムスターの脳から、プロテイナーゼK による処理をせずに、ペレッ
トの形態で単離する事が可能である。

【００１９】

【発明の実施の形態】

本発明の方法により、天然型の遍在するPrP ^C と天然型の異常なPrP ^SCアイソ
フォームを区別できる核酸分子を単離でき、PrP ^SCは上記の伝染性海綿状脳症（
TSE ）と関連しており、伝染性海綿状脳症（TSE ）には、例えばヒツジ、ネズミ
及びハムスターのスクレイピー、ウシのウシ伝染性海綿状脳症（BSE ）、ミンク
の伝染性海綿状ミンク脳症（TME ）、ヒトにおけるクルー、ゲルストマン・シュ
トロイスラー・シャインカ症候群（GSS ）、新しい変種（nvCJD ）を含むクロイ
ツフェルト・ヤコブ病（CJD ）、及び致死性家族性不眠症（FFI ）、ラバ、シカ
及びオオジカにおける慢性消耗病（CWD ）及びネコ伝染性海綿状脳症（FSE ）が
ある。

【００２０】核酸プールとPPPsとのインキュベーションは、種々の方法で行うことができる
。

【００２１】好ましい態様においては、ペレットの形態のPPPsは、適当な懸濁剤、例えば結
合緩衝液、の中で集め、核酸プールの中でインキュベートしてコロイド溶液を形
成する。

【００２２】 PPPsは、しかしながら、基質の上、例えばゲル又は樹脂の上、に固定すること
がまた可能である。この場合における固定化は、関連技術分野の当業者にそれ自
体は既知の方法により行なわれる。例えば、共有結合によりPPPsを基質と結合す
る事が、又は特異的な相互作用により基質に結合させる事が可能であり、その様
な特異的な相互作用は、基質上に存在するグループと、基質上のグループを特異
的に認識するPPPsの蛋白質中のドメインとの間に生じる。そのようなドメインを
、関連技術分野の当業者にそれ自体は既知の方法、例えば、組み換えDNA 技術の
枠組みの範囲内で、PPP 前駆体分子と融合させる事が可能である。

【００２３】本発明の方法の好適な態様の枠組みの範囲内で、予備選抜を行って非特異的に
結合する核酸分子を除去する事が可能である。これは、例えば「偽PPPs」を用い
て行うことが可能であり、偽PPPsはスクレイピー感染していない脳のホモジネー
トより得られる。本発明によれば、この予備選抜は、PPPsとのインキュベーショ
ンで上記で述べられた方法により、コロイド溶液中又は基質上に固定化された形
の「偽PPPs」を用いて行うことが可能である。

【００２４】得られた蛋白質／核酸複合体を、関連技術において知られた方法により、単離
することができる。例えば、固定化されたPPPsの場合には、結合していない核酸
分子を、インキュベーションの後に、適切な緩衝液により洗い流すことが可能で
ある。その後、結合した核酸分子を、例えば8M尿素を用いて溶出することが可能
であり、続いてフェノールにより抽出及び沈殿を行う事により、更に精製するこ
とができる。コロイド溶液中でPPPsとのインキュベーションを行う場合には、生
成した複合体を超遠心によりペレットの形で得る事が可能であり、そのペレット
より核酸分子を抽出することができる。あるいは、核酸分子をPPPsとインキュベ
ートした後に、生成した複合体を濾過する事もできる。

【００２５】本発明の更なる可能性は、適切である場合には、得られた核酸分子を増幅する
ことであり、その増幅は例えばインビトロ転写、逆転写又はPCR 又はこれらの技
術の組み合せにより行われ、そして得られた生成物をその後インキュベーション
及び単離（＝選抜）過程にもう一度かけることである。インキュベーション、単
離及び増幅の工程をこの様に繰り返す事により、核酸分子の結合特異性を濃縮す
ることができる。

【００２６】そこで、例えば、増幅の結果、第一サイクルにおいて、PPPsと反応させたRNA
プールの中における核酸生成物の濃度は0.01％未満、第二サイクルにおいては５
％、そして第三サイクルにおいては30％以上にできる。（即ち、第一サイクルに
おいて、RNA プールの中の0.01％未満の核酸分子がPPPsと特異的に結合し、第二
サイクルにおいて５％が結合し、そして第三サイクルにおいて30％以上が結合す
る）。

【００２７】本発明の好適な態様において、選抜及び単離により得られた核酸分子は、それ
自体は当業者に知られている方法により同定される。

【００２８】本発明の更なる視点は、上記の方法により取得可能であり、また天然型PrP ^SC に特異的に結合して天然型PrP ^C と天然型PrP ^SCとを区別する事が可能な核酸分
子に関する。この関連で、本発明においては、核酸分子という用語は、天然型Pr
P ^SCに特異的に結合し、かつ天然型PrP ^C と天然型PrP ^SCとを区別する事が可能
な、アンチセンスRNA 、一本鎖及び二本鎖DNA を意味する。

【００２９】好適な態様において、核酸分子は下記のヌクレオチド配列を、RNA レベルで含
む。

【化３】

【００３０】更に好適な態様において、核酸分子は下記のヌクレオチド配列をRNA レベルに
おいて含む。

【化４】

【００３１】本発明の更なる態様において、核酸分子を１つの位置又はそれ以上の位置にお
いて更に修飾して安定性を増加させ、及び／又はそれらの生化学的及び／又は生
物理学的性質を改変する。本発明の範囲は、この関連で、特に以下の操作を含む
。

【００３２】Ａ．本発明の核酸分子の、インビトロ／インビボにおける安定性、及び／又はそ
れらのヌクレアーゼに対する耐性を増加させるために： −リン酸骨格を、フォスフォロチオエート骨格により、完全に又は部分的に置換
し； −核酸ループを、非核酸スペーサーグループ（例えばヘキサエチレングリコール
）により、完全に又は部分的に置換し； −ヌクレオチドを、 2'-アミノプロピル- 、又は 2'-アミノ- 又は 2'-O-アルキ
ル- 又は 2'-フルオロリボヌクレオチドにより、完全に又は部分的に置換し； −５位のピリミジン塩基を、1-ペンテニルラジカルにより置換し； −修飾されたヌクレオチドによりキャッピングし（例えば、フォスフォロチオエ
ート又は反転した3'-3' ヌクレオチド）； −架橋ジスルフィド結合の助けによる安定化し； −キラル対照物を封入し； −脂肪族の添加、及び脂肪族により誘導体化されたアプタマーを、リポゾーム中
へ導入し； −例えばポリエチレングリコールの様なバイオポリマー担体へカップリングし；
−核酸分子を被包化する。

【００３３】Ｂ．核酸分子の親和性及び／又は活性を改善するために： −RNA を修飾して、放射照射により架橋が可能なアプタマーを、例えば5-ヨード
ウリジントリフォスフェイトを導入する事により作製し； −標的分子の他の領域を認識し、又それ自体反応に関与する、小さな有機リガン
ドヘ、RNA をカップリングする。

【００３４】Ｃ．診断試験の検出性を改善するために： −蛍光運搬体（fluorophore ）によりラベルし； −ジゴキシゲニンによりラベルし； −ビオチンでラベルする。

【００３５】上記で本発明において好ましいとして述べられ、上記に示された化学式を有す
る核酸分子は、ステム／ループ構造を形成する事が可能であり、プロテイナーゼ
K で処理していない天然型のPrP ^SCと特異的に反応するが、PrP27-30、プロテイ
ナーゼK 消化により得られる安定型のPrP ^SCと、天然型の真正PrP ^C とは反応し
ない核酸分子である。プリオン調製物は、例えばハムスター、マウス、ウシ又は
ヒトからも得ることができる。天然型PrP ^SCと特異的に結合する核酸分子は、RN
A アプタマーとして、文献においてもしばしば言及されている（例えば、WO97/1
5685及びその中で示されている参考文献、及びTuerk and Gold,1990 を参照）。

【００３６】しかしながら、本発明のアプタマーは、例えば、ハムスター、ウシ（PrP BSE
）、ヒト（PrP CJD ）及びネズミ由来の変性したPrP ^C 及びPrP ^SCと反応し、そ
れは天然型PrP ^SCだけを特異的に認識する事を示している。

【００３７】本発明のRNA アプタマーが、プリオン蛋白質PrP ^SCに特異的に結合し、PrP ^C
及びプロテイナーゼK 消化により生じる安定なPrP27-30に結合しないという証拠
は、例えば、感染していないハムスター及びクレイスピーの最終段階に罹ってい
るハムスターに由来する脳ホモジネートを、プロテイナーゼK 有り及び無しにお
いて、ノザンーウエスタンブロット解析を行うことにより、提供される。天然の
条件下では、例えば、第三サイクルの後に選抜されたRNA アプタマーは、PrP ^SC に特異的に結合するが（図１ａ）、PrP ^C とPrP27-30には結合しない。

【００３８】それとは対照的に、ポリクローナル抗体JB007 は、PrP ^C 、PrP ^SC及びPrP27-
30を認識し（図１ｂ）、それはRNA アプタマーがPrP ^SCに特異的に結合する事を
示している。変性条件下では、本発明のアプタマーはPrP ^C 及びPrP ^SCを認識し
たが（図１ｃ）、PrP27-30とは反応しなかった。モノクローナル抗体3F4 は、Pr
P ^C 、PrP ^SC及びPrP27-30を認識した（図１ｄ）。

【００３９】本発明のもう一つの好適な態様は、本発明の方法により得る事ができる核酸分
子のアンチセンスRNA に関する。この関連において、「アンチセンスRNA 」とい
う用語は、関連分野で通常知られている意味を有する（Kumar and Carmichael,
1998, Gerhart et al. 1998 及びVanhee-Brossollet and Vaquer, 1998）。

【００４０】本発明の更なる視点は、例えば核酸分子や抗体の様な巨大分子が、天然の条件
下でPrP ^SCと選択的に結合する能力を調べる方法に関し、その方法は下記の： −組織サンプルを超音波破砕して、組織サンプルの清澄な溶液を調製し、 −その清澄な溶液を、ネイティブなポリアクリルアミド電気泳動（好ましくはPA
A グラジエントを用いて（通常は3.5 から12％PAA 、好ましくは4 から12％PAA
、そして、特に好ましくは6 から12％PAA ））で分離し、単一の蛋白質バンドを
得て、続いて電気ブロッティングをし、そして −続いて、好ましくは、ノース−ウエスタンブロッティングの手法により天然型
PrP ^SCと選択的に結合する核酸を検出すること、又はウエスタンブロッティング
の手法により抗体（例えば、JB 007、SAF 32、15B3）を用いて天然型PrP ^SCを検
出すること、のいずれかの手段を用いて天然型PrP ^SCを検出し、 −あるいは、その清澄な溶液を、ネイティブアガロースゲル電気泳動により（好
ましくはアガロースグラジエントを用いて）分離を行う、という工程より成る。

【００４１】本発明の更なる視点は、上記により定義した本発明の核酸分子の、伝染性海綿
状脳症（TSE ）を診断するための使用に関する。本発明により確立された様に、例えばノース−ウエスタンブロッティング又は
ドットブロットの技術により、本発明の核酸分子は、例えばハムスター、ネズミ
、ヒト及びウシの天然型PrP ^SC/CJD/BSEを、選択的に認識する事ができる。それとは対照的に、recPrP-Iアプタマー（Weiss et al.,1997 中のRNA アプタ
マーモチーフI （Ap I）に対応）及びPrP 抗体は、天然型のPrP ^C とPrP ^SCの両
者を認識する事が可能である。変性条件下では、しかしながら、本発明の核酸分
子及びrecPrP-Iアプタマーは、PrP ^C とハムスター、ネズミ、ヒト及びウシPrP ^SC/CJD/BSE の両者と反応し、それはPrP ^SC/CJD/BSEは天然状態においてのみ、特
異的に認識される事を示す。

【００４２】本発明の更なる視点は、本発明の核酸分子を含む診断組成物に関する。この型
の組成物は、この型の組成物中において用いられると関連技術分野において知ら
れている従来の賦形剤を、更に含むことができる。本発明の診断組成物は、種々
の動物種及びヒトにおいて、プリオン病を検出する為の診断試験を行う目的に適
している。そこで、本発明の診断組成物を、上記で述べた伝染性海綿状脳症を診
断する為の方法において使用する事ができる。その様な方法は、例えば、検査す
る対象である種の生体より得られたサンプルを、本発明の核酸とインキュベーシ
ョンし、そしてその後に核酸分子と天然型PrP ^SCとの相互作用の測定する事を含
んでもよい。これとの関連において、天然材料をプロテイナーゼK で予備消化を
行う必要がない、特異的であり簡単な方法に、本発明の核酸を用いる事が可能で
ある。核酸分子と天然型PrP ^SCとの相互作用の測定は、この場合には、例えばリ
ガンドが結合した放射活性を測定する事により行う事ができ、バイオセンサーの
助けを借りた、又は適切に採用した酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ELOA
）の技術を使用した蛍光測定法を行うことによる、蛍光測定法の手段により行う
事もできる。本発明によると、サンプル中における天然型PrP ^SCの量を定量的に
測定することもまた可能であり、その手段として、放射活性、蛍光異方性、又は
ELOA試験を用いたデンシトメーターによる測定がある。

【００４３】好ましい態様として、検討する対象であるサンプルは、広く多様な器官や組織
に由来する事が可能であり、例えばフォルマリン中で固定された又は冷凍した形
態でもよく、例えば脳、扁桃腺、腸、硬膜、リンパ節、神経、脾臓、胎盤、胃、
眼、脊髄又はパイエル腺に由来してもよい。サンプルは体液でもよく、好ましく
は血液、脳脊髄液、乳又は精子でもよい。

【００４４】脳がサンプルとして使用されるときには、診断は通常は死後に行われる。しか
し、生きている生物での生検という形態で、診断して検討を行う事もまた可能で
ある。上述の体液及び器官のサンプルの検討を、生きている生物で行う事も、同
様に可能である。

【００４５】本発明の更なる視点は、本発明の核酸を含む薬剤組成物に関する。この型の組
成物は更に、薬学的に許容される担体及び関連技術分野で既知の他の賦形剤を含
むことができる。特に適切な賦形剤は、本発明の核酸分子の半減期をインビボで
増加させる賦形剤、又は本発明の核酸分子の特異的な結合を改善させる賦形剤で
ある。

【００４６】その様な賦形剤の具体例は、本発明の核酸分子の安定性の増加及び／又は生化
学的及び／又は生物理学的性質の改変に関連して、上記において述べた物質であ
る。本発明の核酸分子を、関連技術分野の熟練した研究者に知られた方法によっ
て従来の材料の中に被包化する事、又リポソーム中に封入する事もまた可能であ
る。

【００４７】これらの本発明の薬剤組成物は、上記の伝染性海綿状脳症の治療に適している
。そこで、例えば、感染した細胞中でのPrP ^SCの生成を、本発明の薬剤組成物を
経口的に又は非経口的に（例えば静脈注射）投与する事により抑制する事ができ
る。

【００４８】そこで、本発明により、例えばクレイスピーに感染した神経芽腫細胞［ScN2a
(MHM-2) ］を、RNA 転写プラスミドpCIneo（mock：偽）、pCIneo PPP-I及びpCIn
eo recPrP-I によりトランスフェクトした。この形質転換した細胞型は、キメラ
のマウス／ハムスター／マウスPrP コンストラクトを含有し、そのために、内在
的に発現したマウスPrP と遺伝子を改変して発現したハムスターPrP とを、特異
的な抗体を用いて区別することができ、その様な抗体としては、ハムスターPrP
は認識するが、マウスPrP は認識しない3F4 の様な抗体がある。トランスフェク
トの48時間後にこれらの細胞の蛋白調製物をウエスタンブロット解析を行うと、
プロテイナーゼK （pK）の処理の後、pCIneo PPP-Iでトランスフェクトされた細
胞は、 PPP-Iアプタマー（112mer：配列番号２）を生成するが、PrP ^SCを生成し
ないことが判った（図２ａ、レーン２）。それと対照的に、 recPrP-I （RNA ア
プタマーモチーフＩ（Ap I）Weiss et al.,1997 を参照）アプタマーは、PrP ^SC の生成に関して何の影響も及ぼさず（図７ａ、レーン３）、それはpCIneoベクタ
ーによりトランスフェクトされた偽（mock）コントロールと同様であった（図７
ａ、レーン１）。

【００４９】 pCIneo（図７ｂ、mock、レーン１）、pCIneo PPP-I（図７ｂ、レーン２）及び
pCIneo recPrP-I （図７ｂ、レーン３）によりトランスフェクトされた神経芽腫
細胞［ScN2a (MHM-2) ］中における、 PPP-I RNAと recPrP-I RNA のレベルを解
析するために、蛋白調製物の作製と同時に全RNA を精製した。RNA プライマーＩ
によりこのRNA を逆転写し、PCR プライマーＩPCR とプライマーIIによりcDNAを
を増幅した後に、アガロースゲル電気泳動で解析したところ、pCIneo PPP-IとpC
Ineo recPrP-I でトランスフェクトされた細胞では、同じレベルの PPP-I RNA（
112mer：配列番号２）（図７ｂ、レーン２）と recPrP-I RNA （図７ｂ、レーン
３）を生成する事が示されたが、一方pCIneo（mock）でトランスフェクトされた
細胞では、 PPP-I RNAと recPrP-I RNA のレベルは示されなかった（図７ｂ、レ
ーン１）。

【００５０】これらのデータは、ScN2a 細胞中における PPP-I RNAの転写は、PrP SCレベル
とPrP ^C レベル（データを示さず）を検出限界以下に低下する事を示している。
この効果は、 recPrP-I RNA と比較しての PPP-I RNAの転写レベルの増加に加え
て、PrP ^SC/PrP ^C発現を抑制する PPP-I RNAの性質にも寄与する事ができる。

【００５１】これらのデータは、 PPP-Iアプタマーは天然型PrP ^SCの、インビボにおける形
成過程に大きく関与していることを示唆しており、その過程には天然型PrP ^SCと
の特異的な相互作用、おそらくは早期のPrP 合成中間物との相互作用もまた介し
ている。そのアプタマーは、PrP ^C の代謝にもまた関与しているかもしれない。
これは、TSE を処理する手段としての、本発明のアプタマーの有用性の原因であ
る。

【００５２】 PPI-I アプタマーは、PrP ^SC分子を「捕獲」することが明らかに可能であるた
めに、RNA の誘因物（decoy ）又はPPI-I の誘因物と言うこともできる。DNA の
誘因物はbunnkenn中に、例えばKing et al.,1998に記載されている。

【００５３】本発明の核酸配列が、PrP ^C とPrP ^SCの両者と変性条件下における相互作用す
ること、及びPrP27-30と相互作用しないことは、PrP ^SCのアミノ末端部分（AA23
/25 から90-101）におけるエピトープで、認識が起こることを示しており、PrP2
7-30は、種に依存するが、PrP ^SCと比較してアミノ末端において、67個から76個
のアミノ酸が欠損している。ヒト、ウシ、ハムスター及びマウス（ここではデー
タを示さず）の４種が、そのアプタマーにより認識されるという発見は、本発明
の核酸分子により認識されるPrP 中の認識部位は、異なった哺乳類中において高
度に保存されている、という推定を支持している。

【００５４】図面の説明略語のリスト１．Ab 3F4＝モノクローナル抗体 3F4 ２．Ab 15B3 ＝モノクローナル抗体 15B3 ３．Ab JB007＝ポリクローナル抗体 JB007 ４．Ab SAF32＝モノクローナル抗体 SAF32 ５．Ap Ctr1-I ＝コントロールアプタマー（112-mer ：配列番号４）６．Ap PPP-I＝ PPP-Iアプタマー（112-mer ：配列番号２）７．Ap recPrP-I ＝RNA アプタマーモチーフ-I（Ap I）（Weiss et al.,1997 を
参照）８．BSE ＝BSE を有するウシ由来の脳ホモジネート９．CJD ＝散発性CJD に罹っている患者由来の脳ホモジネート 10．Sc＝スクレイピーを有するハムスター由来の脳ホモジネート 11．Mr(b) ＝塩基の分子量標準 12．Mr(K) ＝kDa の分子量標準 13．N ＝ハムスター（図１、３、４、５）、又はヒト及びウシ（図６）由来の正
常な脳ホモジネート 14．PK＝プロテイナーゼ K 15．-pK ＝プロテイナーゼ Kを添加しない消化 16．+pK ＝プロテイナーゼ Kを添加した消化 17．プールRNA ＝無作為化したRNA プール（Famulok:1994） 18．PPP ＝精製したPrP ^SC調製物 19．PrP27-30＝プロテイナーゼ耐性プリオン蛋白質

【００５５】図１は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハムスター
由来の脳ホモジネートの、PPP アプタマー（第三サイクルの後）及びPrP 特異的
抗体による、天然及び変性条件下における、ノース−ウエスタン及びウエスタン
ブロット解析を示す。pKの非存在下（レーン１）及び存在下（レーン２）におけ
る非感染ハムスター由来の脳ホモジネート、及びpKの非存在下（レーン３）及び
存在下（レーン４）におけるスクレイピーに罹っているハムスター由来の脳ホモ
ジネートは、６−12％（ａ，ｂ）のネイティブPAA グラジエントゲル上、及び変
性SDS-12％PAA ゲル上（ｃ，ｄ）で分画され、ブロットされ、そして放射ラベル
したPPP アプタマー（第三サイクルの後）（ａ，ｃ）及びJB007 抗体（ｂ）及び
3F4 抗体（ｄ）を用いて現した。JB007 抗体がPPP アプタマーと同じ蛋白質を認
識したという事実（図１ａ，ｂ、レーン３参照）は、PPP アプタマーは天然型Pr
P ^SC蛋白質を特異的に認識できる事を示している。

【００５６】図２ａは、73-merアプタマー PPP-Iより構築された、ステムーループ構造の二
次元モデルを示す（配列番号１）。

【００５７】図２ｂは、5'及び3'末端において固定された領域を有する112-mer アプタマー
PPP-I より構築された、ステムーループ構造の二次元モデルを示す（配列番号２
）。

【００５８】図３は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハムスター
由来の脳ホモジネートの、PPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２）、recPrP
-Iアプタマー（Weiss et al.,1997 の、RNA アプタマーモチーフI （ApI ）参照
）、コントロールアプタマーCtr1-I（112-mer 、配列番号４）、プールRNA 及び
SAF32 抗体による、天然条件下における、ノース−ウエスタン及びウエスタンブ
ロット解析を示す。pKの非存在下（レーン１）及び存在下（レーン２）における
非感染ハムスター由来の脳ホモジネート、及びpKの非存在下（レーン３）及び存
在下（レーン４）におけるスクレイピーに罹っているハムスター由来の脳ホモジ
ネートは、４−12％（ａ，ｂ）のネイティブPAA グラジエントゲル上で分画され
、ブロットされ、そして放射ラベルしたPPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号
２）（ａ）、recPrP-Iアプタマー（６）（ｂ）、コントロールアプタマーCtr1-I
（112-mer 、配列番号４）（ｃ）、放射ラベルされたプールRNA （ｄ）及びSAF3
2 抗体（ｅ）を用いて現した。PPP-I アプタマーを用いた場合にのみ、pK処理を
しない、スクレイピーに罹っているハムスター由来の脳ホモジネートに由来する
天然型PrP ^SCへの、選択的な結合が見出されることが明らかとなった（ａ、レー
ン３）。

【００５９】図４は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハムスター
由来の脳ホモジネートの、放射標識したPPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号
２）、recPrP-Iアプタマー（Weiss et al.,1997 参照）、コントロールアプタマ
ーCtr1-I（112-mer 、配列番号４）及び3F4 抗体による、変性条件下における、
ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析を示す。pKの非存在下（レーン
１）及び存在下（レーン２）における非感染ハムスター由来の脳ホモジネート、
及びpKの非存在下（レーン３）及び存在下（レーン４）におけるスクレイピーに
罹っているハムスター由来の脳ホモジネートは、SDS-12％のPAA ゲル上で分画さ
れ、ブロットされ、そして放射ラベルしたPPP-I アプタマー（112-mer 、配列番
号２）（ａ）、recPrP-Iアプタマー（ｂ）、コントロールアプタマーCtr1-I（11
2-mer 、配列番号４）（ｃ）及び3F4 抗体（ｄ）を用いて現した。変性条件下で
は、PPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２）及びrecPrP-Iアプタマー（112-
mer 、配列番号４）を用いた場合にのみ、健康なハムスター及びスクレイピーに
罹っているハムスターに由来する脳ホモジネートに由来するPrP ^C とPrP ^SCへの
同等の良い結合が見出されることが明らかとなった。（ａ、ｂ、レーン３）。

【００６０】図５は、PPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２）と15B3抗体（Korth et a
l.,1997 ）の、天然条件下及び変性条件下において、PrP ^C 、PrP ^SC及びPrP27-
30へ結合する能力に関する比較であり、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロ
ット解析を用いた。pKの非存在下（レーン１）及び存在下（レーン２）における
非感染ハムスター由来の脳ホモジネート、及びpKの非存在下（レーン３）及び存
在下（レーン４）におけるスクレイピーに罹っているハムスター由来の脳ホモジ
ネートは、3.5-12％のネイティブPAA グラジエントゲル上（ａ、ｂ）、又はSDS-
12％のPAA ゲル上（ｃ、ｄ）で分画され、そして放射ラベルしたPPP-I アプタマ
ー（112-mer 、配列番号２）（ａ、ｃ）及び15B3抗体（ｂ、ｄ）を用いて現され
た。天然条件下では、PPP-I アプタマーは、スクレイピーに罹っているハムスタ
ーの脳ホモジネートに由来するPrP ^SCへ、選択的に結合することが明らかとなり
（ａ、レーン３）、一方、15B3抗体は天然型PrP ^C （ｂ、レーン１）、PrP ^SC（
ｂ、レーン３）及びPrP27-30（ｂ、レーン４）を認識する。15B3抗体は、述べら
れている（Korth et al.,1997 ）様に、PrP ^C 、PrP ^SCもPrP27-30も、いずれも
変性条件下では認識しないが（ｄ、レーン１−４）、一方、PPP-I アプタマーは
変性条件下でPrP ^C （ｃ、レーン１）及びPrP ^SC（ｃ、レーン３）を認識する。

【００６１】図６は、ヒト、CJD 患者、雌牛、BSE に罹っているウシ由来の脳ホモジネート
の、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析を示す。pKの非存在下（レ
ーン１）及び存在下（レーン２）におけるヒト由来の脳ホモジネート、及びpKの
非存在下（レーン３）及び存在下（レーン４）におけるCJD 患者由来の脳ホモジ
ネートは、4-12％のネイティブPAA グラジエントゲル上（ａ、ｂ）で分画され、
ブロットされ、そして放射ラベルしたPPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２
）（ａ）、recPrP-Iアプタマー（ｃ）（Weiss et al.,1997 ）及びSAF32 抗体（
ｅ）を用いて現された。pKの非存在下（レーン１）及び存在下（レーン２）にお
ける雌牛由来の脳ホモジネート、及びpKの非存在下（レーン３）及び存在下（レ
ーン４）におけるBSE に罹っているウシ由来の脳ホモジネートは、4-12％のネイ
ティブPAA グラジエントゲル上で分画され、ブロットされ、そして放射ラベルし
たPPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２）（ｂ）、recPrP-Iアプタマー（ｄ
）及びSAF32 抗体（ｆ）を用いて現された。PPP-I アプタマーは、CJD 患者及び
BSE に罹っているウシの脳ホモジネート由来する、天然型PrP^CJD/BSE へ、選択
的に結合することが明らかとなった（ａ、ｂ、レーン３）。

【００６２】図７は、スクレイピーに感染した神経芽腫細胞［ScN2a (MHM-2) ］に由来する
蛋白質及びRNA 調製物の、ウエスタンブロット及びRT-PCR解析を示し、その神経
芽腫細胞はPPP-I アプタマー及びrecPrP-Iアプタマーをコードするプラスミドで
トランスフェクトされている。（ａ）pCIneo（mock、レーン１）、pCIneo PPP-I
（レーン２）及びpCIneo recPPP-I （レーン３）でトランスフェクトされた、ス
クレイピーに感染した神経芽腫細胞由来の蛋白質調製物は、pKで処理を行った後
に、SDS-12％のPAA ゲル上で解析され、ニトロセルロースフィルター上にブロッ
トされ、そしてPrP 特異的な3F4 抗体を用いて現された。（ｂ）（ａ）において
述べられた様にトランスフェクトされた［ScN2a (MHM-2) ］細胞から、RNA を抽
出し、そしてPCR プライマーＩ及びIIを用いたRT-PCRにかけられた。得られたDN
A は、2.5 ％アガロースゲル上で解析された。PPP-I アプタマーの存在下におい
ては、PrP ^SCの合成は既に起こらなかったが（ａ、ｂ、レーン２）、一方、recP
rP-Iアプタマーの存在は、PrP ^SCの合成に影響しなかった（ａ、ｂ、レーン３）
。

【００６３】本発明を、図を参照にして、実施例に基づき、以降において詳しく説明するが
、その実施例は、何ら限定的な効果を有するものではない。

【００６４】

【実施例】

【実施例１】 PrP ^SC特異的なPPP-I アプタマーの作製材料 PPPsの調製 PPPsは、例えばハムスターの様なゲッシ類の脳より作製され、それらのゲッシ
類は、脳室内にスクレイピーを接種され、臨床的に終末段階にあり、接種は既知
の方法（Lasmezas et al.,1997）又は下記に述べられた方法により行われ、プロ
テイナーゼK による消化は行なわなかった。”偽”PPPsは、感染していないハム
スターの脳より、同様の方法で作製されたが、どの場合においてもプロテイナー
ゼK による消化は行なわなかった。

【００６５】インビトロの選抜の前に、PPPs及び”偽”PPPsを、8mM Na₂HPO₄; 0.87mM KH₂P
O₄; 136mM NaCl; 112.6mM KCl; 2mM DTT; 2mM MgCl₂ を含む、300 μl の結合緩
衝液（Weiss et al.,1997 ）で一度洗浄した。

【００６６】脳ホモジネートの調製脳ホモジネートは、感染していないハムスター、スクレイピー株263Kを脳質に
接種されたハムスター、感染していないマウス、スクレイピー株C506 M3 を接種
されたマウス、感染していないウシ、BSE に罹っているウシ（M.Dawson, CVL, G
B 由来）、神経学的でない疾患により死亡した人、及び散発性CJD に罹っている
患者より調製された。

【００６７】脳材料をホモゲナイズして、５％等張グルコース溶液中で、20％（w/v ）の溶
液へ調製した。引き続き、20％ NaCl を200 μl と、20％サルコシル、２％ S
B3-14 及びpH7.4 の2mM トリス緩衝液を含む新たに調製した溶液200 μl を、20
0 μl の等張グルコース溶液中の20％脳ホモジネートへ添加した。37℃で１時間
インキュベーションした後に、その混合液を、10％ NaCl 、20％スクロース、0.
1 ％ SB3-14 及びpH7.4 の10mMトリス緩衝液より成る、スクロースのクッション
（緩衝）上に置き、室温で２時間30,000 gで遠心分離を行った。上清は廃棄し、
ペレットは更に使用するために、例えば結合緩衝液中に、再懸濁した。

【００６８】 RNA プールM111.1 RNA プールM111.1（無作為化配列: 74核酸、：塩基順列 3.56 × 1044 ；プー
ル複雑性 1.03 × 10¹⁵ （Famulok, 1994 ））は、組み換えハムスターPrP ^C に
対しての、インビトロでの選抜方法として述べられており（Weiss et al.,1997
）、それを使用した。

【００６９】抗体 3F4 抗体は、Senetek PLC より得た。ポリクローナル抗体JB007 は、既知の方
法により作製された（Demaimay et al.,1997参照）。SAF 32抗体は、Service de
Neurovirologie （CEA, Fontenay-aux-Roses 、フランス）及びService de Pha
rmacologie et Immunologie （CEA, Saclay 、フランス）において作製された。
それは、プリオン蛋白質のAA 53-98領域を認識した。モノクローナル抗体15B3は
、ブルーノオエッチ、ズリッチ（Bruno Oesch,Zurich）よりもたらされ、モノ
クローナル抗体15B3はKorth et al.,1997 の中で述べられている。

【００７０】 PPPsに対する、インビトロ選抜セファデックスＧ50カラム上で精製された、183 μg の放射ラベルした［5'-
γ-32P-ATP］RNA 111.1 （Weiss et al.,1997 ）を、最初の予備選抜サイクル中
で、”偽PPPs”（燐酸結合緩衝液中に回収された）とインキュベートし、その偽
PPPsは、120UのRNasin（Roche Diagnostics ）の存在下で、40mgの非感染ハムス
ター脳より単離された（Weiss et al.,1997 ）。オーバーヘッドシェーカー中で
１時間、37℃でインキュベーションし、15,000 rpm/minで10分間遠心分離した後
、上清を、スクレイピーに罹っているハムスターに由来する脳40mgより調製した
PPPsと、インキュベートした。超遠心（70,000 g、30分）及び洗浄の過程の後に
、8Mの尿素によりPPP ペレットからRNA を溶出し、そしてそのRNA をフェノール
抽出及びエタノール沈殿により精製した。RNA がPPPsと結合するパーセンテージ
は、エタノール沈殿後のRNA ペレットの放射活性（dpm ）を測定し、選抜サイク
ルの前の全量（dpm ）RNA で割ることにより決定された。その後、下記のPCR プ
ライマーＩと共に50％のRNA が逆転写反応にかけられて、そしてそれによって得
られたcDNAの50％が、PCR プライマーＩ及び下記のPCR プライマーIIにより増幅
された。

【００７１】 PCR プライマーＩ

【化５】 PCR プライマーII

【化６】

【００７２】増幅されたcDNAの50％をその後、T7RNA ポリメラーゼを用いて、［α-³²P-UTP
］の存在下で、インビトロで転写した。それによって得られたRNA を、既知の方
法（Weiss et al.,1997 ）により精製した。これは、15％変性PAA ゲル上で分画
し、ゲルから主要バンドを切り出し、続いて溶出及び沈殿を行うことにより、な
された。個々の放射ラベル化したRNA の40μg を、選抜の第２及び第３サイクル
及び増幅にかけた。３つの選抜サイクルの後、RNA を、cDNAレベルにおいてEcoR
I とBamHI によりpGEM3-Zf(-) 中へクローン化し、結果として25クローンを得た
。これらのクローンの中で２つを、pGEM3-Zf(-) PPP-I 及びpGEM3-Zf(-) Ctrl-I
と称した。cDNAレベルにおける個々のRNA の配列を、ジデオキシシークエンシン
グにより決定した。

【００７３】 PPP-I （112-mer : 配列番号２）RNA とCtrl-I（112-mer : 配列番号４）の R
NAを作製するために、PCR プライマーＩとIIによりcDNAを増幅し、そして増幅さ
れたcDNAを、T7-RNAポリメラーゼにより転写した。［5'- γ-³²P-ATP］により放
射ラベルしたRNA は、既知の方法（Weiss et al.,1997 ）により精製された。

【００７４】

【実施例２】スクレイピーに感染した神経芽腫細胞［ScN2a (MHM-2) ］中のPrP の作製にお
ける、PPP-I アプタマーの影響 PPP-I アプタマーとrecPrP-Iアプタマー（＝pGEM3-Zf(-)-Ap1 、Weiss et al.
,1997 ）をコードするcDNAを、pGEM3-Zf(-) PPP-I 及びpGEM3-Zf(-)-rec PrP-I
プラスミドから、EcoRI （5'）とXbaI（3'）により切り出して、pCIneo（Pharmi
ngen）中にサブクローン化した。それにより得られたプラスミド、pCIneo PPP-I
（1999年３月２９日に寄託された、pCIneo SAF-Iに対応、DSM 12753）及びpCIne
o recPPP-I 、の正しい配列は、ジデオキシシークエンシングにより確認された
。スクレイピーに感染した神経芽腫細胞（Scott et al.,1992 ；MHM-2 （マウス
／ハムスター／マウスのキメラ）コンストラクトを含むScN2A ；この［ScN2a (M
HM-2) ］細胞株は、S.B.Prusiner教授より提供された）（80-100％コンフルエン
トに細胞を培養した）を、pCIneo、pCIneo PPP-I及びpCIneo recPrP-I により、
リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時
間後に、細胞を回収し、溶解して20ng/ μl のプロテイナーゼK （Roche Diagno
stics ）と、37℃で30分間インキュベートした。

【００７５】反応を、1M ペファブロック（Pefabloc）により停止して、蛋白質を５倍量の
メタノールを用いて -70℃で１時間沈殿した。その後蛋白質を14,000 rpmで20分
間遠心分離（Eppendorf bench centrifuge）してペレットとし、続いて35μl の
２回蒸留した水に再懸濁した。その後、35μl のSDS サンプル緩衝液を添加した
。続いて全蛋白質を、ウエスタンブロッティングにより解析し、3F4 抗体により
現した。

【００７６】 (MHM-2) コンストラクトを含む、このScN2A 細胞株の利点は、ハムスターPrP
は認識するがマウスPrP は認識しない3F4 抗体を使用できる点にあり、そのため
に遺伝子改変により発現したハムスターPrP と、内在性のマウスPrP を区別する
事ができる。

【００７７】 pCIneo（偽（mock）、レーン１）、pCIneo PPP-I（レーン２）及び pCIneo re
cPrP-I（レーン３）によりトランスフェクトされた細胞の、PrP ^SC合成レベルの
解析を行うのと同時に、細胞の全RNA をpeqGOLD RNA PureTMキット（PeqLab、ド
イツ）により抽出した。このDNA と蛋白質を含まないのRNA の調製に続いて、RN
A をPCR プライマ−Ｉにより逆転写し、そしてPCR プライマ−Ｉ及びIIを用いて
cDNAを増幅した。得られたDNA の容量で５％を、1X TBEと１μg/mlのエチジウム
ブロマイドを含む、2.5 ％アガロースゲルで解析した。

【００７８】

【実施例３】ウエスタン及びノース−ウエスタンブロット解析 50μg/mlのpKで処理した、又は処理しなかった脳ホモジネート（グルコース溶
液中20％）を、超音波破砕して清澄化した後、SDS-12％のPAA の変性ゲル又はネ
イティブのポリアグリルアミドゲル上にのせた。清澄化の為に、20％強度の脳ホ
モジネート（等張グルコース溶液中）を、2xの希釈緩衝液中で1:1 に希釈した（
1xの希釈緩衝液＝1x PBS，0.5% DOC, 0.5% NP40, 200μM ペファブロック（Pefa
block ）及び1mM PMSF）。脳ホモジネートを、その後ブランソンベッカーソニフ
ァイヤー中、40パルス、強度５、時間サイクル30％）で超音波破砕した。遠心分
離（エッペンドルフベンチ遠心機中、15,000min ^-1で７分間）の結果、上清１が
得られ、そしてペレットを上記の1x希釈緩衝液中に再懸濁し、そして40パルス、
強度６、時間サイクル40％で超音波破砕した。上記の遠心分離の後、上清１と２
を混合し、結果として清澄な脳ホモジネート（５％グルコース）となった。この
材料を、TBE で緩衝したPAA グラジエントゲル上にのせ、そのグラジエントは、
通常は3.5 から12、好ましくは４から12、そして特に好ましくは６から12％PAA
である。ニトロセルロース上に電気ブロッティングした後、蛋白質バンドを検出
し、検出は放射ラベルしたRNA 分子とのインキュベーションして続いてオートラ
ジオグラフィーを行う事により、又はPrP 特異的な抗体（二次抗体：各々の場合
、POD-結合抗マウスIgG 又は抗ウサギIgG ）とインキュベーションをして引き続
いて化学ルミネセンスを行う事により行った。

【００７９】

【実施例４】 RNA 二次構造のモデル PPP-I アプタマー、73-mer ;配列番号１、112-mer ; 配列番号２、の二次構造
のモデルは、ソフトウェアプログラムMacDNASIS Pro VI.0（図２ａ、２ｂ参照）
により作製した。

【００８０】 PPP-I （配列番号１及び２）及びコントロールアプタマーCtr1-I（配列番号３
及び４）の配列を、下記の配列表の中で示す。

【００８１】文献リスト１．Demainay R. et al., Late Treatment with Polene Antibiotics can prolo
ng the Survival of scrapie-affected Animals. J.Virol. 71 (1997), 9685-96
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Oligonucleotide Aptamers. Biochemistry, 37 (1998), 16489-16493. ６．Kumar M., Carmichael G. G.: Antisense RNA: Function and Fate of Dupl
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early onset of varient Creutzfeld-Jakob disease. Curr. Opin. Neurobiol.
7, 695-700 (1997)

【００８２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハ
ムスター由来の脳ホモジネートの、PPP アプタマー及びPrP 特異的抗体による、
天然及び変性条件下における、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析
を示す。

【図２】図２ａは、73-merアプタマー PPP-Iより構築された、ステムーループ
構造の二次元モデルを示す（配列番号１）。図２ｂは、5'及び3'末端において固定された領域を有する112-mer アプタマー
PPP-I より構築された、ステムーループ構造の二次元モデルを示す（配列番号２
）。

【図３】図３は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハ
ムスター由来の脳ホモジネートの、PPP-I アプタマー、recPrP-Iアプタマー、コ
ントロールアプタマーCtr1-I、プールRNA 及びSAF32 抗体による、天然条件下に
おける、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析を示す。

【図４】図４は、感染していないハムスター及びスクレイピーに罹っているハ
ムスター由来の脳ホモジネートの、放射標識したPPP-I アプタマー（112-mer 、
配列番号２）、recPrP-Iアプタマー、コントロールアプタマーCtr1-I（112-mer
、配列番号４）及び3F4 抗体による、変性条件下における、ノース−ウエスタン
及びウエスタンブロット解析を示す。

【図５】図５は、PPP-I アプタマー（112-mer 、配列番号２）と15B3抗体の、
天然条件下及び変性条件下において、PrP ^C 、PrP ^SC及びPrP27-30へ結合する能
力に関する比較であり、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析を用い
た。

【図６】図６は、ヒト、CJD 患者、雌牛、BSE に罹っているウシ由来の脳ホモ
ジネートの、ノース−ウエスタン及びウエスタンブロット解析を示す。

【図７】図７は、スクレイピーに感染した神経芽腫細胞［ScN2a (MHM-2) ］に
由来する蛋白質及びRNA 調製物の、ウエスタンブロット及びRT-PCR解析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/569 Ｚ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR48 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AF27 CA21 CC24 DA01 DA13 4C086 AA01 AA02 EA16 ZA01 ZC54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然型PrP ^SCとの特異的な相互作用が可能である核酸分子の単離
のため、及び天然型PrP ^C と天然型PrP ^SCとの区別のための方法であり、 −核酸のプールを精製PrP ^SC調製物（PPPs）とインキュベートする工程、 −得られた蛋白質／核酸分子複合体を選抜及び単離する工程、そして −特異的な核酸分子を任意に増幅し、そしてインキュベーション及び単離の過程
を任意に繰り返す工程、より成る方法。
【請求項２】得られた核酸分子を、それ自体は既知の方法による同定する工程
を更に含んでいる、請求項１記載の方法。
【請求項３】精製PrP ^SC調製物（PPPs）とのインキュベーションに先立ち、非
特異的に結合する核酸分子を除去するための予備選抜を行う、請求項１又は２記
載の方法。
【請求項４】予備選抜を、スクレイピーに感染していない脳ホモジネートによ
り行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】予備選抜を、スクレイピーに感染していない脳ホモジネートより
得られた偽PPPsにより行う、請求項４記載の方法。
【請求項６】前記核酸がRNA である、前記のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項７】前記プールが無作為化されたRNA プールである、前記のいずれか
の請求項記載の方法。
【請求項８】前記RNA プールが、Famulok (J.Am.Chem.Soc. 116 (1994), 1
698-1706)により述べられたRNA プールである、前記のいずれかの請求項記載の
方法。
【請求項９】前記核酸がDNA である、請求項１から請求項５のいずれかの請求
項記載の方法。
【請求項１０】前記核酸が一本鎖DNA である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】前記プールが無作為化されたDNA プールである、請求項９又は
請求項10記載の方法。
【請求項１２】前記核酸がアンチセンスRNA である、請求項１から請求項５の
いずれかの請求項記載の方法。
【請求項１３】前記プールが無作為化されたRNA/DNA プールであり、前記RNA/
DNA プールの中において前記RNA/DNA 分子が修飾されており、それによりそれら
の安定性が増加した、前記のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１４】 PPPsが融合蛋白質の部分である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】請求項１から請求項14のいずれかの請求項の中で示した方法に
より取得可能な、核酸分子。
【請求項１６】 pCIneo-PPP-I（pCIneo-SAF-Iの名前で、１９９９年３月２４日
に寄託された、DSM 12753）より取得可能な核酸分子。
【請求項１７】 RNA である、請求項15又は16記載の核酸分子。
【請求項１８】 DNA である、請求項15又は16記載の核酸分子。
【請求項１９】下記の配列より成る、請求項15から請求項17のいずれかの請求
項記載の核酸分子。【化１】
【請求項２０】下記の配列より成る、請求項15から請求項17のいずれかの請求
項記載の核酸分子。【化２】
【請求項２１】請求項15から請求項20のいずれかの請求項記載の核酸分子の、
アンチセンスRNA 。
【請求項２２】核酸分子であり、１つ又はそれ以上の位置において修飾され、
安定性を増加し及び／又は生物理学的及び／又は生化学的性質を改変した、請求
項15から請求項20のいずれかの請求項記載の核酸分子。
【請求項２３】天然型PrP ^SCに特異的な、請求項15から22のいずれかの請求項
記載の核酸分子の、伝染性海綿状脳症を検出するための手段として使用する方法
。
【請求項２４】薬剤組成物であり、当該薬剤組成物は、請求項15から請求項22
のいずれかの請求項記載の核酸分子、及び適切な場合には、薬学的に許容される
担体及び／又は賦形剤を含み、動物及びヒトにおける伝染性海綿状脳症を治療す
るための手段である、薬剤組成物。
【請求項２５】請求項15から請求項22のいずれかの請求項記載の核酸分子を含
む、伝染性海綿状脳症を検出するための、診断組成物。
【請求項２６】検出が体液中で行なわれる、請求項25記載の診断組成物。
【請求項２７】前記体液が血液、脳脊髄液、乳、精液又は唾液である、請求項
25記載の診断組成物。
【請求項２８】核酸とは異なる無機又は有機化合物であり、請求項15から請求
項22のいずれかの請求項記載の核酸分子の、三次元構造の情報に基づいた構造を
有する、無機又は有機化合物。
【請求項２９】脂質、蛋白質又は炭水化物である、請求項28記載の無機又は有
機化合物。
【請求項３０】巨大分子がPrP ^SCに選択的に結合する能力を、天然条件下で調
べる方法であって、 −組織サンプルを超音波破砕し、前記組織サンプルの清澄な溶液を作製うる工程
、 −前記清澄な溶液を、ネイティブゲル電気泳動により分離し、単一な蛋白質バン
ドを得、続いて電気ブロッティングを行う工程、そして −続いて天然型PrP ^SCを検出する工程、より成る方法。
【請求項３１】前記清澄な溶液の分離が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より行われる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】前記清澄な溶液の分離が、PAA グラジエントを用いたポリアク
リルアミドゲル電気泳動により行われる、請求項30記載の方法。
【請求項３３】前記清澄な溶液の分離が、アガロースゲル電気泳動により行わ
れる、請求項30記載の方法。
【請求項３４】前記清澄な溶液の分離が、アガロースグラジエントを用いたア
ガロースゲル電気泳動により行われる、請求項30記載の方法。
【請求項３５】前記検出が、抗体を用いたウエスタンブロッティングにより行
われる、請求項30から請求項34記載の方法。
【請求項３６】前記検出が、抗体断片を用いたウエスタンブロッティングによ
り行われる、請求項30から請求項34記載の方法。
【請求項３７】前記検出が、核酸を用いたノース−ウエスタンブロッティング
により行われる、請求項30から請求項34記載の方法。
【請求項３８】前記核酸がRNA である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】前記核酸が請求項19中のRNA 分子である、請求項37記載の方法
。
【請求項４０】前記核酸が請求項20中のRNA 分子である、請求項37記載の方法
。
【請求項４１】前記核酸がDNA である、請求項37記載の方法。
【請求項４２】前記核酸が一本鎖である、請求項37記載の方法。