JP2003289874A - 共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用 - Google Patents
共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用Info
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 カルボニル化合物の立体選択的不斉還元反応
を触媒する酵素として有用な共役ポリケトン還元酵素を
コードする遺伝子に関する情報を提供し、さらに当該酵
素の製造方法を提供する。また、本酵素を用いた光学活
性アルコールの製造方法を提供する。 【解決手段】 キャンディダ・パラプシロシス由来の共
役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１をコードする遺伝子お
よび共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２をコードする遺
伝子。及び、これら共役ポリケトン還元酵素遺伝子を含
む形質転換体を用いた光学活性１−ハロ−３−アミノ−
４−フェニル−２−ブタノール誘導体の製造方法。
を触媒する酵素として有用な共役ポリケトン還元酵素を
コードする遺伝子に関する情報を提供し、さらに当該酵
素の製造方法を提供する。また、本酵素を用いた光学活
性アルコールの製造方法を提供する。 【解決手段】 キャンディダ・パラプシロシス由来の共
役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１をコードする遺伝子お
よび共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２をコードする遺
伝子。及び、これら共役ポリケトン還元酵素遺伝子を含
む形質転換体を用いた光学活性１−ハロ−３−アミノ−
４−フェニル−２−ブタノール誘導体の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、共役ポリケトン還
元酵素をコードする遺伝子、この遺伝子を含有する組換
えベクターＤＮＡ、組換えベクターＤＮＡによる形質転
換体、並びにこの形質転換体を用いた共役ポリケトン還
元酵素の製造方法、さらには本酵素を用いた光学活性ア
ルコール類の製法に関するものである。
元酵素をコードする遺伝子、この遺伝子を含有する組換
えベクターＤＮＡ、組換えベクターＤＮＡによる形質転
換体、並びにこの形質転換体を用いた共役ポリケトン還
元酵素の製造方法、さらには本酵素を用いた光学活性ア
ルコール類の製法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】各種の光学活性アルコール類は、医薬
品、農薬等の原料として有用な化合物である。酵素や微
生物を用いたカルボニル化合物の立体選択的還元反応に
よる光学活性なアルコール類の製造方法は、効率的かつ
工業的な方法として注目されている。こうした立体選択
的還元反応を触媒する酵素として、共役ポリケトン還元
酵素が知られている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ、９９０巻、１７５頁、１９８９年）。本
酵素は、広い基質特異性と高い立体選択性を有している
ため、光学活性アルコール製造のための優れた触媒とな
ることが期待される。
品、農薬等の原料として有用な化合物である。酵素や微
生物を用いたカルボニル化合物の立体選択的還元反応に
よる光学活性なアルコール類の製造方法は、効率的かつ
工業的な方法として注目されている。こうした立体選択
的還元反応を触媒する酵素として、共役ポリケトン還元
酵素が知られている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ、９９０巻、１７５頁、１９８９年）。本
酵素は、広い基質特異性と高い立体選択性を有している
ため、光学活性アルコール製造のための優れた触媒とな
ることが期待される。
【０００３】共役ポリケトン還元酵素の生産能を有する
微生物としては、例えば、キャンディダ・パラプシロシ
ス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦ
Ｏ０７０８株が知られているが、上記微生物は少なくと
も２種類の共役ポリケトン還元酵素を生産することが知
られている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、６５巻、２７８５頁、２００１年）。
数種類の還元酵素を生産する微生物の菌体をカルボニル
不斉還元反応の触媒として利用する場合、カルボニル化
合物に対する基質特異性や立体選択性の差異により、製
品品質の低下等の不具合が懸念される。しかしながら必
要とされる還元酵素活性のみを当該微生物から単離する
ことは、非常に煩雑な操作を必要とし工業的に実施する
のは困難である。そこで、必要とされる酵素活性のみを
遺伝子工学技術を用いて大量生産することが望ましい。
しかしながら、共役ポリケトン還元酵素を遺伝子工学
的に生産するための遺伝子操作情報は知られていない。
微生物としては、例えば、キャンディダ・パラプシロシ
ス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦ
Ｏ０７０８株が知られているが、上記微生物は少なくと
も２種類の共役ポリケトン還元酵素を生産することが知
られている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．、６５巻、２７８５頁、２００１年）。
数種類の還元酵素を生産する微生物の菌体をカルボニル
不斉還元反応の触媒として利用する場合、カルボニル化
合物に対する基質特異性や立体選択性の差異により、製
品品質の低下等の不具合が懸念される。しかしながら必
要とされる還元酵素活性のみを当該微生物から単離する
ことは、非常に煩雑な操作を必要とし工業的に実施する
のは困難である。そこで、必要とされる酵素活性のみを
遺伝子工学技術を用いて大量生産することが望ましい。
しかしながら、共役ポリケトン還元酵素を遺伝子工学
的に生産するための遺伝子操作情報は知られていない。
【０００４】一方、光学活性１−ハロ−３−アミノ−４
−フェニル−２−ブタノール誘導体は、医薬品等の合成
原料として有用な化合物である。本化合物は、分子内に
２つの不斉炭素を有する化合物であり、１つの不斉炭素
の光学活性を化学合成的に創製し、もう一方の不斉炭素
の光学活性を、カルボニル基の還元反応により創製し得
ることが知られている。この還元反応を生物的に行なう
方法が知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、７６巻、１２７５頁、１９９９年および特開平
９−２８５号公報）。前者では、（１Ｓ，２Ｒ）の立体
配置を有するスレオ体が、後者では、スレオ体およびエ
リスロ体が得られることが開示されている。また、後者
では、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ０５８５の菌体が
エリスロ体を与えることも開示されている。しかし、い
ずれの場合も目的物の蓄積量はわずかで工業的製法とは
なり難い。
−フェニル−２−ブタノール誘導体は、医薬品等の合成
原料として有用な化合物である。本化合物は、分子内に
２つの不斉炭素を有する化合物であり、１つの不斉炭素
の光学活性を化学合成的に創製し、もう一方の不斉炭素
の光学活性を、カルボニル基の還元反応により創製し得
ることが知られている。この還元反応を生物的に行なう
方法が知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．、７６巻、１２７５頁、１９９９年および特開平
９−２８５号公報）。前者では、（１Ｓ，２Ｒ）の立体
配置を有するスレオ体が、後者では、スレオ体およびエ
リスロ体が得られることが開示されている。また、後者
では、キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ０５８５の菌体が
エリスロ体を与えることも開示されている。しかし、い
ずれの場合も目的物の蓄積量はわずかで工業的製法とは
なり難い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、共役ポリケ
トン還元酵素の遺伝子工学的生産、および本酵素による
光学活性アルコール類の効率的生産を目的として、共役
ポリケトン還元酵素をコードする遺伝子に関する遺伝子
操作材料と、この材料を用いた共役ポリケトン還元酵素
の製造方法、さらには、光学活性アルコール類の製造方
法を提供することにある。
トン還元酵素の遺伝子工学的生産、および本酵素による
光学活性アルコール類の効率的生産を目的として、共役
ポリケトン還元酵素をコードする遺伝子に関する遺伝子
操作材料と、この材料を用いた共役ポリケトン還元酵素
の製造方法、さらには、光学活性アルコール類の製造方
法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、キャンデ
ィダ・パラプシロシスが生産する２つの共役ポリケトン
還元酵素をコードする遺伝子の単離および遺伝子の構造
を決定することに成功し、さらに、当該遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡを得、これを大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に導入し、当該
形質転換体を培養することにより、効率よくポリケトン
還元酵素を生産することに成功した。さらに、当該組換
え酵素は、光学活性な１−ハロ−３−アミノ−４−フェ
ニル−２−ブタノン誘導体の還元反応をも触媒し、光学
活性な１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタ
ノール誘導体の生産を可能ならしめることも見い出し
た。
ィダ・パラプシロシスが生産する２つの共役ポリケトン
還元酵素をコードする遺伝子の単離および遺伝子の構造
を決定することに成功し、さらに、当該遺伝子をベクタ
ーＤＮＡに挿入した組換えＤＮＡを得、これを大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に導入し、当該
形質転換体を培養することにより、効率よくポリケトン
還元酵素を生産することに成功した。さらに、当該組換
え酵素は、光学活性な１−ハロ−３−アミノ−４−フェ
ニル−２−ブタノン誘導体の還元反応をも触媒し、光学
活性な１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタ
ノール誘導体の生産を可能ならしめることも見い出し
た。
【０００７】即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）
のＤＮＡ： （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
のＤＮＡ： （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００８】また、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）
のＤＮＡ： （ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
のＤＮＡ： （ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】また、本発明は、上記のいずれかのＤＮＡ
を含む組換えベクターでもある。
を含む組換えベクターでもある。
【００１０】また、本発明は、上記の組換えベクターを
含む形質転換体でもあり、また、該形質転換体を培地中
で培養し、培養物から共役ポリケトン還元酵素を採取す
ることを特徴とする共役ポリケトン還元酵素の製造方法
でもある。
含む形質転換体でもあり、また、該形質転換体を培地中
で培養し、培養物から共役ポリケトン還元酵素を採取す
ることを特徴とする共役ポリケトン還元酵素の製造方法
でもある。
【００１１】さらに、本発明は、一般式（１）：
【００１２】
【化３】
【００１３】（式中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。
Ｒ1、Ｒ2は、独立して水素原子、保護されていてもよい
ヒドロキシル基、アルコキシル基、アルキル基、ニトロ
基、保護されていてもよいアミノ基、または、シアノ基
を表す。Ｐ1、Ｐ2は独立して水素原子もしくはアミノ基
の保護基を表すか、または、Ｐ1、Ｐ2が一緒になってフ
タロイル基を表す。ただし、Ｐ1およびＰ2が同時に水素
原子である場合は除く。）で示される（１Ｓ，２Ｓ）−
１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール
誘導体の製法であって、一般式（２）：
Ｒ1、Ｒ2は、独立して水素原子、保護されていてもよい
ヒドロキシル基、アルコキシル基、アルキル基、ニトロ
基、保護されていてもよいアミノ基、または、シアノ基
を表す。Ｐ1、Ｐ2は独立して水素原子もしくはアミノ基
の保護基を表すか、または、Ｐ1、Ｐ2が一緒になってフ
タロイル基を表す。ただし、Ｐ1およびＰ2が同時に水素
原子である場合は除く。）で示される（１Ｓ，２Ｓ）−
１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール
誘導体の製法であって、一般式（２）：
【００１４】
【化４】
【００１５】（式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2、Ｐ1、Ｐ2は上記に
同じ。）で示される１−ハロ−３−アミノ−４−フェニ
ル−２−ブタノン誘導体と、共役ポリケトン還元酵素あ
るいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいは
その処理物とを反応させることを特徴とする（１Ｓ，２
Ｓ）−１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタ
ノール誘導体の製法でもある。
同じ。）で示される１−ハロ−３−アミノ−４−フェニ
ル−２−ブタノン誘導体と、共役ポリケトン還元酵素あ
るいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいは
その処理物とを反応させることを特徴とする（１Ｓ，２
Ｓ）−１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタ
ノール誘導体の製法でもある。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明はキャンディダ・パラプシ
ロシスが生産する２種類の共役ポリケトン還元酵素（Ｃ
ＰＲＣ１およびＣＰＲＣ２）をコードする遺伝子の単離
とその遺伝子のＤＮＡ塩基配列の解明に関する。
ロシスが生産する２種類の共役ポリケトン還元酵素（Ｃ
ＰＲＣ１およびＣＰＲＣ２）をコードする遺伝子の単離
とその遺伝子のＤＮＡ塩基配列の解明に関する。
【００１７】本発明における共役ポリケトン還元酵素活
性とは、イサチン、ケトパントイルラクトンのような共
役ポリケトンに作用する還元酵素活性を意味する。当該
活性の有無は、例えば、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に基質ケトパントイルラクトン０．４ｍＭ、Ｎ
ＡＤＰＨ０．３２ｍＭ、及び、酵素溶液０．０５ｍｌを
含む２．５ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、
波長３４０ｎｍの吸光度の減少の有無によって確認する
ことができる。
性とは、イサチン、ケトパントイルラクトンのような共
役ポリケトンに作用する還元酵素活性を意味する。当該
活性の有無は、例えば、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に基質ケトパントイルラクトン０．４ｍＭ、Ｎ
ＡＤＰＨ０．３２ｍＭ、及び、酵素溶液０．０５ｍｌを
含む２．５ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、
波長３４０ｎｍの吸光度の減少の有無によって確認する
ことができる。
【００１８】次に、本発明における共役ポリケトン還元
酵素をコードする遺伝子を取得する方法の例を記載する
が、本発明はこれに限定されない。
酵素をコードする遺伝子を取得する方法の例を記載する
が、本発明はこれに限定されない。
【００１９】まず、精製した酵素を適当なエンドペプチ
ダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断
片を精製後、プロテインシークエンサーにより部分アミ
ノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミ
ノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成す
る。
ダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断
片を精製後、プロテインシークエンサーにより部分アミ
ノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミ
ノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成す
る。
【００２０】次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、
通常のＤＮＡ単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅ
ｌｌ、１８巻、１２６１頁、１９７９年）により、該微
生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳
型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行
い、該酵素をコードするＤＮＡの一部を増幅（コア配
列）し、塩基配列決定を行う。塩基配列決定はジデオキ
シ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得
る。例えば、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
等を用いて行われ得る。
通常のＤＮＡ単離法、例えばＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｃｅ
ｌｌ、１８巻、１２６１頁、１９７９年）により、該微
生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳
型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行
い、該酵素をコードするＤＮＡの一部を増幅（コア配
列）し、塩基配列決定を行う。塩基配列決定はジデオキ
シ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得
る。例えば、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
等を用いて行われ得る。
【００２１】コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかに
するために、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中に
その認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成
したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させるこ
とにより逆ＰＣＲ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１６巻、８１８６頁、１９８８年）用の鋳型ＤＮ
Ａを調製する。
するために、該微生物の染色体ＤＮＡを、コア配列中に
その認識配列が存在しない制限酵素により消化し、生成
したＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより自己環化させるこ
とにより逆ＰＣＲ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１６巻、８１８６頁、１９８８年）用の鋳型ＤＮ
Ａを調製する。
【００２２】次に、コア配列をもとに、コア配列の外側
に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成
し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こ
うして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることに
より、目的酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を決定でき
る。
に向かうＤＮＡ合成の開始点となるプライマーを合成
し、逆ＰＣＲによりコア配列の周辺領域を増幅する。こ
うして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることに
より、目的酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を決定でき
る。
【００２３】本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１に
示すアミノ酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（Ｃ
ＰＲＣ１）をコードするＤＮＡ、又は、配列番号３に示
すアミノ酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（ＣＰ
ＲＣ２）をコードするＤＮＡである。これらＤＮＡは、
配列表の配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列から
なるＤＮＡであっても良いし、これら塩配列において１
もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され
た塩基配列からなり、かつ、共役ポリケトン還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良
い。または、配列表の配列番号１または配列番号３で示
すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり
かつ共役ポリケトン還元酵素活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡであっても良い。
示すアミノ酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（Ｃ
ＰＲＣ１）をコードするＤＮＡ、又は、配列番号３に示
すアミノ酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（ＣＰ
ＲＣ２）をコードするＤＮＡである。これらＤＮＡは、
配列表の配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列から
なるＤＮＡであっても良いし、これら塩配列において１
もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加され
た塩基配列からなり、かつ、共役ポリケトン還元酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良
い。または、配列表の配列番号１または配列番号３で示
すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり
かつ共役ポリケトン還元酵素活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡであっても良い。
【００２４】本発明の酵素のＤＮＡを宿主微生物内に導
入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させる
ために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主
微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいず
れもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとして
は、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、
コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株
との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用
され得る。
入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させる
ために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主
微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいず
れもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとして
は、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、
コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株
との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用
され得る。
【００２５】このようなベクターは、作動可能に連結さ
れたプロモーター（Ｔ７プロモーター、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆ
Ｂプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモー
ター等）の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能
に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に
用いられ得る。例えば、ｐＥＴ２１ａ等が好適に用いら
れ得る。
れたプロモーター（Ｔ７プロモーター、ｌａｃＵＶ５プ
ロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆ
Ｂプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモー
ター等）の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能
に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に
用いられ得る。例えば、ｐＥＴ２１ａ等が好適に用いら
れ得る。
【００２６】本明細書で用いる用語「制御因子」は、機
能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例え
ばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボック
ス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例え
ばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボック
ス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００２７】本明細書で用いる用語「作動可能に連結」
は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調
節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレ
メントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されるこ
とをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて
変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調
節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレ
メントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されるこ
とをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて
変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００２８】本発明のＤＮＡを有するベクターを導入す
る宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、
動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。
本発明のＤＮＡは常法により宿主細胞に導入し得る。宿
主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウ
ム法により、本発明のＤＮＡを導入することができる。
宿主とする大腸菌としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９
株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株等が挙げられ、好ましくは、大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株である。次に、共役ポリケトン還
元酵素を生産する形質転換体、ならびに本酵素および／
またはこの形質転換体を用いる光学活性アルコールの製
造方法について述べる。共役ポリケトン還元酵素の基質
としては、以下の一般式（２）：
る宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、
動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。
本発明のＤＮＡは常法により宿主細胞に導入し得る。宿
主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウ
ム法により、本発明のＤＮＡを導入することができる。
宿主とする大腸菌としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９
株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株等が挙げられ、好ましくは、大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株である。次に、共役ポリケトン還
元酵素を生産する形質転換体、ならびに本酵素および／
またはこの形質転換体を用いる光学活性アルコールの製
造方法について述べる。共役ポリケトン還元酵素の基質
としては、以下の一般式（２）：
【００２９】
【化５】
【００３０】（式中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。
Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水素原子、保護されていてもよ
いヒドロキシル基、アルコキシル基、アルキル基、ニト
ロ基、保護されていてもよいアミノ基、または、シアノ
基を表す。Ｐ1、Ｐ2は独立して、水素原子もしくはアミ
ノ基の保護基を表すか、または、Ｐ1、Ｐ2が一緒になっ
てフタロイル基を表す。ただし、Ｐ1およびＰ2が同時に
水素原子である場合は除く。）で表される光学活性１−
ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン誘導体
が用いられ得る。このうち、置換基Ｘ、Ｒ1、Ｒ2、
Ｐ1、Ｐ2の組合せとしては、例えば、次のようなものを
挙げることができる。
Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水素原子、保護されていてもよ
いヒドロキシル基、アルコキシル基、アルキル基、ニト
ロ基、保護されていてもよいアミノ基、または、シアノ
基を表す。Ｐ1、Ｐ2は独立して、水素原子もしくはアミ
ノ基の保護基を表すか、または、Ｐ1、Ｐ2が一緒になっ
てフタロイル基を表す。ただし、Ｐ1およびＰ2が同時に
水素原子である場合は除く。）で表される光学活性１−
ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン誘導体
が用いられ得る。このうち、置換基Ｘ、Ｒ1、Ｒ2、
Ｐ1、Ｐ2の組合せとしては、例えば、次のようなものを
挙げることができる。
【００３１】Ｘとしては、例えば、塩素原子、臭素原子
または、フッ素原子等を挙げることができる。なかでも
塩素原子が好ましい。Ｒ1、Ｒ2としては、水素原子、メ
チル基、ヒドロキシル基、メトキシル基、アミノ基等を
挙げることができる。
または、フッ素原子等を挙げることができる。なかでも
塩素原子が好ましい。Ｒ1、Ｒ2としては、水素原子、メ
チル基、ヒドロキシル基、メトキシル基、アミノ基等を
挙げることができる。
【００３２】Ｐ1、Ｐ2としては、水素原子またはアミノ
基の保護基等を挙げることができる。上記アミノ基の保
護基としては特に限定されず、通常アミノ基の保護基に
用いられる保護基等を挙げることができ、例えば、Ｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉ
ｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９９０年の３０９頁から３８４頁
に記載されているようなメトキシカルボニル基、ｔ−ブ
トキシカルボニル基、ベンジロキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル
基、ベンジル基、ジベンジル基、フタロイル基、トシル
基、ベンゾイル基等を挙げることができる。なかでも、
メトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベ
ンジロキシカルボニル基、フタロイル基等が好適に用い
られ、さらに好ましくはメトキシカルボニル基、ｔ−ブ
トキシカルボニル基である。
基の保護基等を挙げることができる。上記アミノ基の保
護基としては特に限定されず、通常アミノ基の保護基に
用いられる保護基等を挙げることができ、例えば、Ｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉ
ｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９９０年の３０９頁から３８４頁
に記載されているようなメトキシカルボニル基、ｔ−ブ
トキシカルボニル基、ベンジロキシカルボニル基、エト
キシカルボニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル
基、ベンジル基、ジベンジル基、フタロイル基、トシル
基、ベンゾイル基等を挙げることができる。なかでも、
メトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベ
ンジロキシカルボニル基、フタロイル基等が好適に用い
られ、さらに好ましくはメトキシカルボニル基、ｔ−ブ
トキシカルボニル基である。
【００３３】上記光学活性１−ハロ−３−アミノ−４−
フェニル−２−ブタノン誘導体は、特開昭６２−１２６
１５８号公報、特開平２−４２０４８号公報に開示され
た方法により調製することができる。
フェニル−２−ブタノン誘導体は、特開昭６２−１２６
１５８号公報、特開平２−４２０４８号公報に開示され
た方法により調製することができる。
【００３４】１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２
−ブタノン誘導体の還元には、本発明のＤＮＡを有する
形質転換体を好ましく用いることができる。このような
形質転換体としては、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共役
ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１の遺伝子（配列表の配列
番号２）を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ
１）や、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共役ポリケトン還
元酵素ＣＰＲＣ２の遺伝子（配列表の配列番号４）を導
入したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）等が挙げ
られる。中でも、配列表の配列番号３で示されるアミノ
酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（ＣＰＲＣ２）
の生産能を有する形質転換体が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）がより好ましい。
−ブタノン誘導体の還元には、本発明のＤＮＡを有する
形質転換体を好ましく用いることができる。このような
形質転換体としては、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共役
ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１の遺伝子（配列表の配列
番号２）を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ
１）や、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共役ポリケトン還
元酵素ＣＰＲＣ２の遺伝子（配列表の配列番号４）を導
入したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）等が挙げ
られる。中でも、配列表の配列番号３で示されるアミノ
酸配列からなる共役ポリケトン還元酵素（ＣＰＲＣ２）
の生産能を有する形質転換体が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）がより好ましい。
【００３５】なお、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ｐＥＴＣ１）は受託番号ＦＥＲＭＰ−１８７６３とし
て、また、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）は受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６４として、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され
ている。
（ｐＥＴＣ１）は受託番号ＦＥＲＭＰ−１８７６３とし
て、また、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）は受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６４として、独立行政法人
産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され
ている。
【００３６】還元反応の方法としては、適当な溶媒中に
基質１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノ
ン誘導体、補酵素ＮＡＤＰＨ、及び該形質転換体の培養
物またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌し
て反応させる。反応はバッチ式あるいは連続方式で行わ
れ得る。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗
酵素液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、
あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味す
る。更にこれら培養物またはその処理物は、酵素自体あ
るいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得
る。
基質１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノ
ン誘導体、補酵素ＮＡＤＰＨ、及び該形質転換体の培養
物またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌し
て反応させる。反応はバッチ式あるいは連続方式で行わ
れ得る。ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗
酵素液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、
あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味す
る。更にこれら培養物またはその処理物は、酵素自体あ
るいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得
る。
【００３７】反応時の温度は通常１０〜６０℃、好まし
くは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜
９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素
源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定す
ればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０
％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３
０％（Ｗ／Ｖ）である。反応時間は基質濃度、酵素源の
量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、
２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定す
ることが好ましい。
くは、２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは２．５〜
９、好ましくは、５〜９の範囲である。反応液中の酵素
源の量はこれらの基質を還元する能力に応じ適宜決定す
ればよい。また、反応液中の基質濃度は０．０１〜５０
％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３
０％（Ｗ／Ｖ）である。反応時間は基質濃度、酵素源の
量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、
２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定す
ることが好ましい。
【００３８】還元反応を促進させるために、還元反応に
必要とされている補酵素ＮＡＤＰＨを添加することによ
り、反応を促進させることもできる。この場合、具体的
には、反応液に直接これらを添加する。
必要とされている補酵素ＮＡＤＰＨを添加することによ
り、反応を促進させることもできる。この場合、具体的
には、反応液に直接これらを添加する。
【００３９】さらに、還元反応を促進させるために、Ｎ
ＡＤＰをそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元す
るための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得
られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素と
してグルコース脱水素酵素、還元するための基質として
グルコースを共存させるかまたは、還元型へ還元する酵
素としてギ酸脱水素酵素、還元するための基質としてギ
酸を共存させる。
ＡＤＰをそれぞれの還元型へ還元する酵素、及び還元す
るための基質を共存させて反応を行うと優れた結果が得
られるので好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素と
してグルコース脱水素酵素、還元するための基質として
グルコースを共存させるかまたは、還元型へ還元する酵
素としてギ酸脱水素酵素、還元するための基質としてギ
酸を共存させる。
【００４０】また更に、トリトン（ナカライテスク社
製）、スパン（関東化学社製）、ツイーン（ナカライテ
スク社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも
効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成
物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的
で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、
トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液
に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的
で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロ
フラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶
媒を添加することもできる。
製）、スパン（関東化学社製）、ツイーン（ナカライテ
スク社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも
効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成
物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的
で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、
トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液
に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的
で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロ
フラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶
媒を添加することもできる。
【００４１】上記の方法で得られる光学活性１−ハロ−
３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール誘導体の採
取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは
菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメ
チルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、晶
析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等によ
り精製すれば高純度の光学活性１−ハロ−３−アミノ−
４−フェニル−２−ブタノール誘導体を容易に得ること
ができる。
３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール誘導体の採
取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは
菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメ
チルエーテル、ヘキサン等の溶剤で抽出し、脱水後、晶
析あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等によ
り精製すれば高純度の光学活性１−ハロ−３−アミノ−
４−フェニル−２−ブタノール誘導体を容易に得ること
ができる。
【００４２】
【実施例】以下に実施例を挙げて本願発明をより詳細に
説明するが、本願発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本願発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００４３】以下の実施例において、ポリケトン還元酵
素活性の測定は、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に基質ケトパントイルラクトン０．４ｍＭ、ＮＡＤ
ＰＨ０．３２ｍＭ及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む２．
５ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、波長３４
０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。こ
れを還元活性測定の標準反応条件とした。この反応条件
において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ
に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
素活性の測定は、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に基質ケトパントイルラクトン０．４ｍＭ、ＮＡＤ
ＰＨ０．３２ｍＭ及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む２．
５ｍｌの反応液中、３０℃、３分間反応させ、波長３４
０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。こ
れを還元活性測定の標準反応条件とした。この反応条件
において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ
に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【００４４】なお、以下の実施例において用いた組換え
ＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に
記載されている。 １）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ出版、１９８９年。 ２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９８７年。
ＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に
記載されている。 １）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ出版、１９８９年。 ２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９８７年。
【００４５】実施例１ 酵素の精製
キャンディダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａ
ｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ７０８の菌体を破砕後、
遠心分離によって得られた無細胞抽出液を得た。これを
硫酸アンモニウム沈殿により分画し、４０−６０％飽和
画分で生じた沈殿を緩衝液に溶解後、透析した。これを
ＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０カラム（アマシャム・ファル
マシア・バイオテク社製）に供し、塩化カリウム（０−
１Ｍ）にて溶出した。活性画分を集め、塩化ナトリウム
を４Ｍとなるように加えて、Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＨＲ１０／１０カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製）に供して塩化ナトリウム（４−
０Ｍ）で溶出した。先に溶出した活性画分をＣＰＲＣ
１，後から溶出した活性画分をＣＰＲＣ２とした。それ
ぞれをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラム（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）によりゲル
ろ過した。活性画分を透析後、ＭｏｎｏＱＨＲ５／５カ
ラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に
供し、塩化カリウム（０−０．６Ｍ）により溶出し、活
性画分を精製酵素とした。
ｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ７０８の菌体を破砕後、
遠心分離によって得られた無細胞抽出液を得た。これを
硫酸アンモニウム沈殿により分画し、４０−６０％飽和
画分で生じた沈殿を緩衝液に溶解後、透析した。これを
ＭｏｎｏＱＨＲ１０／１０カラム（アマシャム・ファル
マシア・バイオテク社製）に供し、塩化カリウム（０−
１Ｍ）にて溶出した。活性画分を集め、塩化ナトリウム
を４Ｍとなるように加えて、Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＨＲ１０／１０カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製）に供して塩化ナトリウム（４−
０Ｍ）で溶出した。先に溶出した活性画分をＣＰＲＣ
１，後から溶出した活性画分をＣＰＲＣ２とした。それ
ぞれをＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラム（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）によりゲル
ろ過した。活性画分を透析後、ＭｏｎｏＱＨＲ５／５カ
ラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に
供し、塩化カリウム（０−０．６Ｍ）により溶出し、活
性画分を精製酵素とした。
【００４６】実施例２ ＣＰＲＣ１をコードする遺伝子
のクローニング （染色体ＤＮＡの取得）キャンディダ・パラプシロシス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ
７０８の菌体から、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ（Ｃｅｌｌ、１８
巻、１２６１頁、１９７９年）に記載の方法に従って染
色体ＤＮＡを抽出した。 （ＣＰＲＣ１をコードする遺伝子のＰＣＲ法によるクロ
ーニング）キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０
８より精製したＣＰＲＣ１を８Ｍ尿素存在下で変性させ
た後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダー
ゼ（和光純薬工業社製）で消化し、得られたペプチド断
片の配列をエドマン法により決定した。このアミノ酸配
列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマ
ー２種（プライマー１：５’ＣＡＹＡＴＨＧＡＹＧＧＩ
ＧＣＩＧＡＲＡＴＨＴＡＹＧＧ ３’、プライマー２：
５’ＴＡＹＴＣＩＡＣＤＡＴＩＣＣＩＧＧＮＧＴＹＴＧ
ＲＴＣＹＴＧ ３’）を合成した。プライマー２種（プ
ライマー１及びプライマー２）各２５０ｐｍｏｌ、染色
体ＤＮＡ２３００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、Ｅｘ
Ｔａｑ（宝酒造社製）１．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩
衝液５０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）
を３５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル
電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。 （ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニン
グ）増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列
を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を
含めて４４３塩基からなっていた。その配列は、図１に
示したＤＮＡ配列において、下線を引いたＤＮＡ配列部
分である。以後この配列を「コア配列」と記す。 （逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列５’ＴＣＡＴＡ
ＡＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＧ ３’（プラ
イマー３）及び３’側に近い部分の配列５’ＴＧＧＴＧ
ＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＧＡＧ ３’（プ
ライマー４）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まず
キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより消化し、消化物をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環
物５００ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプラ
イマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、
ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ
用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、
アニーリング（４８℃、１分）、伸長反応（７４℃、４
分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロース
ゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
のクローニング （染色体ＤＮＡの取得）キャンディダ・パラプシロシス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＩＦＯ
７０８の菌体から、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ（Ｃｅｌｌ、１８
巻、１２６１頁、１９７９年）に記載の方法に従って染
色体ＤＮＡを抽出した。 （ＣＰＲＣ１をコードする遺伝子のＰＣＲ法によるクロ
ーニング）キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０
８より精製したＣＰＲＣ１を８Ｍ尿素存在下で変性させ
た後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダー
ゼ（和光純薬工業社製）で消化し、得られたペプチド断
片の配列をエドマン法により決定した。このアミノ酸配
列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマ
ー２種（プライマー１：５’ＣＡＹＡＴＨＧＡＹＧＧＩ
ＧＣＩＧＡＲＡＴＨＴＡＹＧＧ ３’、プライマー２：
５’ＴＡＹＴＣＩＡＣＤＡＴＩＣＣＩＧＧＮＧＴＹＴＧ
ＲＴＣＹＴＧ ３’）を合成した。プライマー２種（プ
ライマー１及びプライマー２）各２５０ｐｍｏｌ、染色
体ＤＮＡ２３００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、Ｅｘ
Ｔａｑ（宝酒造社製）１．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩
衝液５０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）
を３５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル
電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。 （ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニン
グ）増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列
を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を
含めて４４３塩基からなっていた。その配列は、図１に
示したＤＮＡ配列において、下線を引いたＤＮＡ配列部
分である。以後この配列を「コア配列」と記す。 （逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列５’ＴＣＡＴＡ
ＡＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＡＴＴＧ ３’（プラ
イマー３）及び３’側に近い部分の配列５’ＴＧＧＴＧ
ＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＴＧＡＧ ３’（プ
ライマー４）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まず
キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより消化し、消化物をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環
物５００ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプラ
イマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、
ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ
用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、
アニーリング（４８℃、１分）、伸長反応（７４℃、４
分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロース
ゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００４７】増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏ
ｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その
塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、
ＣＰＲＣ１をコードするＤＮＡの全塩基配列を決定し
た。全塩基配列及び該ＤＮＡがコードする推定アミノ酸
配列を図１にまとめた。キャンディダ・パラプシロシス
ＩＦＯ０７０８由来の共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ
１のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示した。ま
た、本酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列表の
配列番号２に示した。
ｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その
塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、
ＣＰＲＣ１をコードするＤＮＡの全塩基配列を決定し
た。全塩基配列及び該ＤＮＡがコードする推定アミノ酸
配列を図１にまとめた。キャンディダ・パラプシロシス
ＩＦＯ０７０８由来の共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ
１のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示した。ま
た、本酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列表の
配列番号２に示した。
【００４８】実施例３ ＣＰＲＣ１遺伝子を含む組換え
ベクターの作製 大腸菌においてＣＰＲＣ１を発現させるために、形質転
換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＣＰＲＣ
１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＸｈｏ
Ｉ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得
した。実施例２で決定した塩基配列に基づき、ＣＰＲＣ
１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
したプライマー５（５’ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴ
ＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴ ３’）と、ＣＰＲ
Ｃ１の構造遺伝子の終始コドンの６塩基下流にＸｈｏＩ
部位を付加したプライマー６（５’ＴＡＴＣＴＣＧＡＧ
ＧＴＡＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＡ ３’）
とを合成した。
ベクターの作製 大腸菌においてＣＰＲＣ１を発現させるために、形質転
換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＣＰＲＣ
１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＸｈｏ
Ｉ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得
した。実施例２で決定した塩基配列に基づき、ＣＰＲＣ
１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
したプライマー５（５’ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴ
ＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴ ３’）と、ＣＰＲ
Ｃ１の構造遺伝子の終始コドンの６塩基下流にＸｈｏＩ
部位を付加したプライマー６（５’ＴＡＴＣＴＣＧＡＧ
ＧＴＡＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＴＡＣＴＴＧＧＡ ３’）
とを合成した。
【００４９】上記のプライマー２種（プライマー５及び
プライマー６）各１００ｐｍｏｌ、キャンディダ・パラ
プシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮＡ２３００ｎｇ、
ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）
２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製
し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、
１分）、伸長反応（７４℃、２分）を３０サイクル行
い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増
幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＸｈ
ｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社製）のＴ７プロモーターの下流のＮｄｅＩ、Ｘｈｏ
Ｉ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＥＴＣ
１を得た。ｐＥＴＣ１の作製法及び構造を図２に示す。
プライマー６）各１００ｐｍｏｌ、キャンディダ・パラ
プシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮＡ２３００ｎｇ、
ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）
２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製
し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０℃、
１分）、伸長反応（７４℃、２分）を３０サイクル行
い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増
幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＸｈ
ｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社製）のＴ７プロモーターの下流のＮｄｅＩ、Ｘｈｏ
Ｉ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＥＴＣ
１を得た。ｐＥＴＣ１の作製法及び構造を図２に示す。
【００５０】実施例４ 組換え大腸菌の作製
実施例３で得た組換えベクターｐＥＴＣ１を用いて大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転
換し、各々から組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）を
得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴＣ１）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６
３として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センターに寄託されている。
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転
換し、各々から組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）を
得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴＣ１）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６
３として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センターに寄託されている。
【００５１】実施例５ 組換え大腸菌におけるＣＰＲＣ
１の発現 実施例４で得た組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）
を、２ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／
ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、Ｎ
ａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で１４時間培
養し、集菌後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液のＣＰＲＣ１活性を前記の方法で測定
した。ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸
菌ＢＬ２１（ｐＥＴ２１ａ）では活性が認められなかっ
たのに対し、大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）では、比活
性が２１．４ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
１の発現 実施例４で得た組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）
を、２ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／
ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、Ｎ
ａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で１４時間培
養し、集菌後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。
この無細胞抽出液のＣＰＲＣ１活性を前記の方法で測定
した。ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸
菌ＢＬ２１（ｐＥＴ２１ａ）では活性が認められなかっ
たのに対し、大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ１）では、比活
性が２１．４ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００５２】実施例６ ＣＰＲＣ２をコードする遺伝子
のクローニング （染色体ＤＮＡの取得）実施例２と同様に、キャンディ
ダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の菌体から染色体ＤＮ
Ａを抽出した。 （ＣＰＲＣ２遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）キ
ャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０８より精製し
たＣＰＲＣ２を８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロ
モバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬
工業社製）で消化し、得られたペプチド断片の配列をエ
ドマン法により決定した。このアミノ酸配列から予想さ
れるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマー２種（プラ
イマー７：５’ＧＡＹＧＴＩＣＣＮＭＧＩＧＡＲＧＡＹ
ＡＴＨＴＧＧＧＴ ３’、プライマー８：５’ＴＡＩＣ
ＣＲＴＧＮＧＴＹＴＧＹＴＣＩＧＴＩＧＴＲＡＡＲＡＡ
３’）を合成した。上記のプライマー２種（プライマ
ー７及びプライマー８）各２５０ｐｍｏｌ、染色体ＤＮ
Ａ２３００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ
（宝酒造社製）１．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５
０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリン
グ（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）を３５
サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳
動により増幅ＤＮＡを確認した。 （ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニン
グ）増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列
を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を
含めて１８２塩基からなっていた。その配列は、図３に
示したＤＮＡ配列において、下線を引いたＤＮＡ配列部
分である。以後この配列を「コア配列」と記す。 （逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列５’ＣＣＡＡＣ
ＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧ ３’（プライ
マー９）及び３’側に近い部分の配列５’ＴＧＡＴＡＡ
ＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧ ３’（プライ
マー１０）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずキ
ャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮ
Ａを制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより消化し、消化物をＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物
５００ｎｇ、上記のプライマー２種（プライマー９及び
プライマー１０）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍ
ｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む Ｅｘ
Ｔａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９６℃、１
分）、アニーリング（５７℃、１分）、伸長反応（７４
℃、４分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガ
ロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。増幅
ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定し
た。この結果とコア配列の結果より、ＣＰＲＣ２をコー
ドするＤＮＡの全塩基配列を決定した。全塩基配列及び
該ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列を図３にまとめ
た。キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０８由来
の共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２のアミノ酸配列
を、配列表の配列番号３に示した。また、本酵素をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を、配列表の配列番号４に示し
た。
のクローニング （染色体ＤＮＡの取得）実施例２と同様に、キャンディ
ダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の菌体から染色体ＤＮ
Ａを抽出した。 （ＣＰＲＣ２遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）キ
ャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０８より精製し
たＣＰＲＣ２を８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロ
モバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬
工業社製）で消化し、得られたペプチド断片の配列をエ
ドマン法により決定した。このアミノ酸配列から予想さ
れるＤＮＡ配列を考慮し、ＰＣＲプライマー２種（プラ
イマー７：５’ＧＡＹＧＴＩＣＣＮＭＧＩＧＡＲＧＡＹ
ＡＴＨＴＧＧＧＴ ３’、プライマー８：５’ＴＡＩＣ
ＣＲＴＧＮＧＴＹＴＧＹＴＣＩＧＴＩＧＴＲＡＡＲＡＡ
３’）を合成した。上記のプライマー２種（プライマ
ー７及びプライマー８）各２５０ｐｍｏｌ、染色体ＤＮ
Ａ２３００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ
（宝酒造社製）１．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５
０μｌを調製し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリン
グ（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）を３５
サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳
動により増幅ＤＮＡを確認した。 （ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニン
グ）増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列
を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を
含めて１８２塩基からなっていた。その配列は、図３に
示したＤＮＡ配列において、下線を引いたＤＮＡ配列部
分である。以後この配列を「コア配列」と記す。 （逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列５’ＣＣＡＡＣ
ＣＴＧＧＡＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＧ ３’（プライ
マー９）及び３’側に近い部分の配列５’ＴＧＡＴＡＡ
ＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧ ３’（プライ
マー１０）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずキ
ャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮ
Ａを制限酵素ＨｉｎｃＩＩにより消化し、消化物をＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物
５００ｎｇ、上記のプライマー２種（プライマー９及び
プライマー１０）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍ
ｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む Ｅｘ
Ｔａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９６℃、１
分）、アニーリング（５７℃、１分）、伸長反応（７４
℃、４分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガ
ロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。増幅
ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定し
た。この結果とコア配列の結果より、ＣＰＲＣ２をコー
ドするＤＮＡの全塩基配列を決定した。全塩基配列及び
該ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配列を図３にまとめ
た。キャンディダ・パラプシロシスＩＦＯ０７０８由来
の共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２のアミノ酸配列
を、配列表の配列番号３に示した。また、本酵素をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を、配列表の配列番号４に示し
た。
【００５３】実施例７ ＣＰＲＣ２遺伝子を含む組換え
ベクターの作製 大腸菌においてＣＰＲＣ２を発現させるために、形質転
換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＣＰＲＣ
２の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＸｈｏ
Ｉ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得
した。実施例６で決定した塩基配列に基づき、ＣＰＲＣ
２の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
したプライマー１１（５’ＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣ
ＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡ ３’）と、ＣＰＲ
Ｃ２の構造遺伝子の終始コドンの５塩基下流にＸｈｏＩ
部位を付加したプライマー１２（５’ＴＴＴＣＴＣＧＡ
ＧＴＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴ
３’）とを合成した。プライマー２種（プライマー１１
及びプライマー１２）各１００ｐｍｏｌ、キャンディダ
・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮＡ２３００
ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社
製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調
製し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０
℃、１分）、伸長反応（７４℃、２分）を３０サイクル
行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により
増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＸ
ｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ社製）のＴ７プロモーターの下流のＮｄｅＩ、Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＥＴ
Ｃ２を得た。ｐＥＴＣ２の作製法及び構造を図４に示
す。
ベクターの作製 大腸菌においてＣＰＲＣ２を発現させるために、形質転
換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＣＰＲＣ
２の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＸｈｏ
Ｉ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得
した。実施例６で決定した塩基配列に基づき、ＣＰＲＣ
２の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加
したプライマー１１（５’ＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣ
ＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡ ３’）と、ＣＰＲ
Ｃ２の構造遺伝子の終始コドンの５塩基下流にＸｈｏＩ
部位を付加したプライマー１２（５’ＴＴＴＣＴＣＧＡ
ＧＴＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴ
３’）とを合成した。プライマー２種（プライマー１１
及びプライマー１２）各１００ｐｍｏｌ、キャンディダ
・パラプシロシスＩＦＯ７０８の染色体ＤＮＡ２３００
ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社
製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調
製し、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６０
℃、１分）、伸長反応（７４℃、２分）を３０サイクル
行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により
増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩ及びＸ
ｈｏＩで消化し、プラスミドｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ社製）のＴ７プロモーターの下流のＮｄｅＩ、Ｘｈ
ｏＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＥＴ
Ｃ２を得た。ｐＥＴＣ２の作製法及び構造を図４に示
す。
【００５４】実施例８ 組換え大腸菌の作製
実施例７で得た組換えベクターｐＥＴＣ２を用いて大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転
換し、各々から組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）を
得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴＣ２）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６
４として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センターに寄託されている。
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転
換し、各々から組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）を
得た。こうして得られた形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴＣ２）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６
４として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センターに寄託されている。
【００５５】実施例９ 組換え大腸菌におけるＣＰＲＣ
２の発現 実施例８で得た組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）を
２ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、
バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ
０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で１４時間培養し、
集菌後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸
濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細
胞抽出液のＣＰＲＣ２活性を前記の方法で測定した。ベ
クタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴ２１ａ）では活性が認められなかったのに対
し、大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）では、比活性が４．
２６ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
２の発現 実施例８で得た組換え大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）を
２ＹＴ培地（バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、
バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ
０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で１４時間培養し、
集菌後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸
濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細
胞抽出液のＣＰＲＣ２活性を前記の方法で測定した。ベ
クタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌ＢＬ２
１（ｐＥＴ２１ａ）では活性が認められなかったのに対
し、大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）では、比活性が４．
２６ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００５６】実施例１０ 光学活性１−クロロ−３−ア
ミノ−４−フェニル−２−ブタノールの合成 ０．６ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰ、０．２ｍｇ／ｍｌのグル
コース脱水素酵素（天野エンザイム社製）、５％（ｗ／
ｖ）のグルコース、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、２ｍＭの１−クロロ−３−アミノ−４−フェニル
−２−ブタノン（エタノール溶液）を含む反応液０．５
ｍｌに、実施例９記載の大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）
の凍結乾燥品２．５ｍｇを加えて２８℃で、１時間反応
させた。反応液にアセトニトリル０．５ｍｌを加えて遠
心分離し、その上清をＨＰＬＣ分析した（カラム：ＹＭ
Ｃ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３０３、ワイエムシィ
社製、カラム温度：４０℃、移動相：水／アセトニトリ
ル＝５５／４５（ｖ／ｖ）、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、
検出：２１０ｎｍ、溶出時間：（２Ｓ，３Ｓ）−１−ク
ロロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール、１
０分、（２Ｓ，３Ｒ）−１−クロロ−３−アミノ−４−
フェニル−２−ブタノール、１２．５分、１−クロロ−
３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン、１８分）。
その結果、ジアステレオマー過剰率９９％以上の（２
Ｓ，３Ｒ）−１−クロロ−３−アミノ−４−フェニル−
２−ブタノールが収率６６％で生成していた。
ミノ−４−フェニル−２−ブタノールの合成 ０．６ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰ、０．２ｍｇ／ｍｌのグル
コース脱水素酵素（天野エンザイム社製）、５％（ｗ／
ｖ）のグルコース、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、２ｍＭの１−クロロ−３−アミノ−４−フェニル
−２−ブタノン（エタノール溶液）を含む反応液０．５
ｍｌに、実施例９記載の大腸菌ＢＬ２１（ｐＥＴＣ２）
の凍結乾燥品２．５ｍｇを加えて２８℃で、１時間反応
させた。反応液にアセトニトリル０．５ｍｌを加えて遠
心分離し、その上清をＨＰＬＣ分析した（カラム：ＹＭ
Ｃ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３０３、ワイエムシィ
社製、カラム温度：４０℃、移動相：水／アセトニトリ
ル＝５５／４５（ｖ／ｖ）、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎ、
検出：２１０ｎｍ、溶出時間：（２Ｓ，３Ｓ）−１−ク
ロロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール、１
０分、（２Ｓ，３Ｒ）−１−クロロ−３−アミノ−４−
フェニル−２−ブタノール、１２．５分、１−クロロ−
３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン、１８分）。
その結果、ジアステレオマー過剰率９９％以上の（２
Ｓ，３Ｒ）−１−クロロ−３−アミノ−４−フェニル−
２−ブタノールが収率６６％で生成していた。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、広い基質特異性と高い立
体選択性を有する共役ポリケトン還元酵素を簡便かつ大
量に製造することが可能となる。また、光学活性１−ハ
ロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール等の光
学活性アルコールの工業的な製造方法が可能となる。
体選択性を有する共役ポリケトン還元酵素を簡便かつ大
量に製造することが可能となる。また、光学活性１−ハ
ロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール等の光
学活性アルコールの工業的な製造方法が可能となる。
【図１】 共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ配列とその推定アミノ酸配列。
する遺伝子を含むＤＮＡ配列とその推定アミノ酸配列。
【図２】 共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ１をコード
する遺伝子の発現ベクターの作製方法とその構造。
する遺伝子の発現ベクターの作製方法とその構造。
【図３】 共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ配列とその推定アミノ酸配列。
する遺伝子を含むＤＮＡ配列とその推定アミノ酸配列。
【図４】 共役ポリケトン還元酵素ＣＰＲＣ２をコード
する遺伝子の発現ベクターの作製方法とその構造。
する遺伝子の発現ベクターの作製方法とその構造。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 鐘淵化学工業株式会社
<120> 共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用
<130> TKS-4729
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> Candida parapsilosis
<400> 1
Met Ser Leu Ala Gly Lys Glu Phe Lys Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile
1 5 10 15
Pro Ala Val Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Arg Gly His
20 25 30
Asn Asp Leu Asp Lys Gln Leu Ile Gly Thr Leu Glu Leu Ala Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Phe Arg His Ile Asp Gly Ala Glu Ile Tyr Gly Thr Asn Lys
50 55 60
Glu Ile Gly Ile Ala Leu Lys Asn Val Gly Leu Asn Arg Lys Asp Val
65 70 75 80
Phe Ile Thr Asp Lys Tyr Asn Ser Gly Asn His Thr Tyr Asp Gly Lys
85 90 95
His Ser Lys His Gln Asn Pro Tyr Asn Ala Leu Lys Ala Asp Leu Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Leu Glu Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Phe Pro Tyr
115 120 125
Ile Ser Glu Lys Ser His Gly Phe Asp Leu Val Glu Ala Trp Arg Tyr
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Lys Asn Glu Gly Leu Ala Arg Asn Ile Gly Val Ser
145 150 155 160
Asn Phe Thr Ile Glu Asn Leu Lys Ser Ile Leu Asp Ala Asn Thr Asp
165 170 175
Ser Ile Pro Val Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Ala Tyr Leu Gln Asp
180 185 190
Gln Thr Pro Gly Ile Val Glu Tyr Ser Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ile
195 200 205
Glu Ala Tyr Gly Pro Leu Gly Pro Ile Thr Gln Gly Arg Pro Gly Pro
210 215 220
Leu Asp Lys Val Leu Ser Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Lys Arg Asn Glu
225 230 235 240
Gly Gln Ile Leu Leu Arg Trp Val Leu Gln Arg Gly Ile Leu Pro Ile
245 250 255
Thr Thr Thr Ser Lys Glu Glu Arg Ile Asn Asp Val Leu Glu Ile Phe
260 265 270
Asp Phe Glu Leu Asp Lys Glu Asp Glu Asp Gln Ile Thr Lys Val Gly
275 280 285
Lys Glu Lys Thr Leu Arg Gln Phe Ser Lys Glu Tyr Ser Lys Tyr Asp
290 295 300
<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> Candida parapsilosis
<400> 2
atg tca ctt gct gga aaa gaa ttt aaa tta tcc aac gga aac aaa atc 48
Met Ser Leu Ala Gly Lys Glu Phe Lys Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile
1 5 10 15
cca gct gtt gca ttt gga act gga act aaa tac ttt aag cgc ggc cac 96
Pro Ala Val Ala Phe Gly Thr Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Arg Gly His
20 25 30
aac gat ctc gac aag caa ttg att ggt act ttg gaa ctt gct ttg aga 144
Asn Asp Leu Asp Lys Gln Leu Ile Gly Thr Leu Glu Leu Ala Leu Arg
35 40 45
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Ser Gly Phe Arg His Ile Asp Gly Ala Glu Ile Tyr Gly Thr Asn Lys
50 55 60
gaa att gga atc gct tta aaa aac gtt ggt tta aac aga aaa gat gtc 240
Glu Ile Gly Ile Ala Leu Lys Asn Val Gly Leu Asn Arg Lys Asp Val
65 70 75 80
ttc atc act gac aaa tac aat tcg ggt aac cat act tat gac gga aaa 288
Phe Ile Thr Asp Lys Tyr Asn Ser Gly Asn His Thr Tyr Asp Gly Lys
85 90 95
cac tcg aaa cac caa aac cca tac aat gca tta aag gct gat ttg gaa 336
His Ser Lys His Gln Asn Pro Tyr Asn Ala Leu Lys Ala Asp Leu Glu
100 105 110
gat ttg gga ttg gag tat gtc gat tta tac ttg atc cat ttc cca tac 384
Asp Leu Gly Leu Glu Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Phe Pro Tyr
115 120 125
att tct gaa aaa tct cac ggg ttc gac ttg gtt gaa gct tgg agg tat 432
Ile Ser Glu Lys Ser His Gly Phe Asp Leu Val Glu Ala Trp Arg Tyr
130 135 140
ttg gaa aga gcc aag aac gaa ggt tta gct cgc aat att ggt gtt tcc 480
Leu Glu Arg Ala Lys Asn Glu Gly Leu Ala Arg Asn Ile Gly Val Ser
145 150 155 160
aat ttc act att gag aat ttg aaa tct atc ttg gat gcc aac acc gat 528
Asn Phe Thr Ile Glu Asn Leu Lys Ser Ile Leu Asp Ala Asn Thr Asp
165 170 175
tcg atc cca gtg gtt aat caa att gaa ttt agt gct tac ttg caa gac 576
Ser Ile Pro Val Val Asn Gln Ile Glu Phe Ser Ala Tyr Leu Gln Asp
180 185 190
caa act cca gga att gtt gaa tat tca cag caa caa gga att ctt att 624
Gln Thr Pro Gly Ile Val Glu Tyr Ser Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ile
195 200 205
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Glu Ala Tyr Gly Pro Leu Gly Pro Ile Thr Gln Gly Arg Pro Gly Pro
210 215 220
ttg gat aag gtt ttg tca aaa ttg tca gaa aag tac aag aga aat gaa 720
Leu Asp Lys Val Leu Ser Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Lys Arg Asn Glu
225 230 235 240
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Gly Gln Ile Leu Leu Arg Trp Val Leu Gln Arg Gly Ile Leu Pro Ile
245 250 255
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Thr Thr Thr Ser Lys Glu Glu Arg Ile Asn Asp Val Leu Glu Ile Phe
260 265 270
gat ttc gag ttg gat aaa gaa gat gag gat cag atc act aaa gtc gga 864
Asp Phe Glu Leu Asp Lys Glu Asp Glu Asp Gln Ile Thr Lys Val Gly
275 280 285
aag gaa aaa act ctt aga caa ttt tcg aaa gag tat tcc aag tat gat 912
Lys Glu Lys Thr Leu Arg Gln Phe Ser Lys Glu Tyr Ser Lys Tyr Asp
290 295 300
tga 915
<210> 3
<211> 307
<212> PRT
<213> Candida parapsilosis
<400> 3
Met Thr Gln Ser Asn Leu Leu Pro Lys Thr Phe Arg Thr Lys Ser Gly
1 5 10 15
Lys Glu Ile Ser Ile Ala Leu Gly Thr Gly Thr Lys Trp Lys Gln Ala
20 25 30
Gln Thr Ile Asn Asp Val Ser Thr Glu Leu Val Asp Asn Ile Leu Leu
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Gly Leu Lys Leu Gly Phe Arg His Ile Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Asn
50 55 60
Thr Gln Lys Glu Val Gly Glu Ala Leu Lys Arg Thr Asp Val Pro Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ile Trp Val Thr Thr Lys Tyr Ser Pro Gly Trp Gly Ser Ile
85 90 95
Lys Ala Tyr Ser Lys Ser Pro Ser Asp Ser Ile Asp Lys Ala Leu Ala
100 105 110
Gln Leu Gly Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Ser Pro Phe
115 120 125
Phe Thr Thr Glu Gln Thr His Gly Tyr Thr Leu Glu Gln Ala Trp Glu
130 135 140
Ala Leu Val Glu Ala Lys Lys Ala Gly Lys Val Arg Glu Ile Gly Ile
145 150 155 160
Ser Asn Ala Ala Ile Pro His Leu Glu Lys Leu Phe Ala Ala Ser Pro
165 170 175
Ser Pro Glu Tyr Tyr Pro Val Val Asn Gln Ile Glu Phe His Pro Phe
180 185 190
Leu Gln Asn Gln Ser Lys Asn Ile Val Arg Phe Cys Gln Glu His Gly
195 200 205
Ile Leu Val Glu Ala Phe Ser Pro Leu Ala Pro Leu Ala Arg Val Glu
210 215 220
Thr Asn Ala Leu Ala Glu Thr Leu Lys Arg Leu Ala Glu Lys Tyr Lys
225 230 235 240
Lys Thr Glu Ala Gln Val Leu Leu Arg Tyr Thr Leu Gln Arg Gly Ile
245 250 255
Leu Pro Val Thr Thr Ser Ser Lys Glu Ser Arg Leu Lys Glu Ser Leu
260 265 270
Asn Leu Phe Asp Phe Glu Leu Thr Asp Glu Glu Val Asn Glu Ile Asn
275 280 285
Lys Ile Gly Asp Ala Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Phe His Glu Gln Phe
290 295 300
Lys Asp Leu
305
<210> 4
<211> 924
<212> DNA
<213> Candida parapsilosis
<400> 4
atg act caa agt aac tta cta cca aaa aca ttt cgt acc aaa tct ggg 48
Met Thr Gln Ser Asn Leu Leu Pro Lys Thr Phe Arg Thr Lys Ser Gly
1 5 10 15
aag gag ata tca att gca ctt gga aca ggg acc aaa tgg aaa caa gcc 96
Lys Glu Ile Ser Ile Ala Leu Gly Thr Gly Thr Lys Trp Lys Gln Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Gln Leu Gly Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Ser Pro Phe
115 120 125
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130 135 140
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Ile Leu Val Glu Ala Phe Ser Pro Leu Ala Pro Leu Ala Arg Val Glu
210 215 220
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225 230 235 240
aag acc gaa gct caa gtt tta ttg agg tat act ttg caa aga ggt att 768
Lys Thr Glu Ala Gln Val Leu Leu Arg Tyr Thr Leu Gln Arg Gly Ile
245 250 255
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Leu Pro Val Thr Thr Ser Ser Lys Glu Ser Arg Leu Lys Glu Ser Leu
260 265 270
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Asn Leu Phe Asp Phe Glu Leu Thr Asp Glu Glu Val Asn Glu Ile Asn
275 280 285
aag att ggc gat gct aat ccc tat aga gct ttc ttc cat gag caa ttt 912
Lys Ile Gly Asp Ala Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Phe His Glu Gln Phe
290 295 300
aaa gat ttg tag 924
Lys Asp Leu
305
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 13/00 5/00 Ａ
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA02 DA06
4B050 CC03 DD04 FF01 FF04 FF05
FF11 FF12 LL05
4B064 AE01 CA19 CB18 CC24 CD12
DA01
4B065 AA26X AA73Y AB01 CA28
CA44
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ （ｂ）配列番号２で示される塩基配列において１もしく
は数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩
基配列からなり、かつ、共役ポリケトン還元酵素活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡを含有する
組換えベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
質転換体。 - 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
養し、培養物から共役ポリケトン還元酵素を採取するこ
とを特徴とする共役ポリケトン還元酵素の製造方法。 - 【請求項６】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするＤＮＡ （ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加
されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケトン還元酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項７】 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ： （ａ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ （ｂ）配列番号４で示される塩基配列において１もしく
は数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩
基配列からなり、かつ、共役ポリケトン還元酵素活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項６又は７記載のＤＮＡを含有する
組換えベクター。 - 【請求項９】 請求項８記載の組換えベクターを含む形
質転換体。 - 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換体を培地中で
培養し、培養物から共役ポリケトン還元酵素を採取する
ことを特徴とする共役ポリケトン還元酵素の製造方法。 - 【請求項１１】 一般式（１）： 【化１】 （式中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。Ｒ1、Ｒ2は、独立
して水素原子、保護されていてもよいヒドロキシル基、
アルコキシル基、アルキル基、ニトロ基、保護されてい
てもよいアミノ基、または、シアノ基を表す。Ｐ1、Ｐ2
は独立して水素原子もしくはアミノ基の保護基を表す
か、または、Ｐ1、Ｐ2が一緒になってフタロイル基を表
す。ただし、Ｐ1およびＰ2が同時に水素原子である場合
は除く。）で示される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−３−
アミノ−４−フェニル−２−ブタノール誘導体の製法で
あって、一般式（２）： 【化２】 （式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2、Ｐ1、Ｐ2は上記に同じ。）で示
される１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタ
ノン誘導体と、共役ポリケトン還元酵素あるいは該酵素
の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物と
を反応させることを特徴とする（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハ
ロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール誘導体
の製法。 - 【請求項１２】 前記共役ポリケトン還元酵素が、
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質、又は、（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配
列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加されたアミノ酸配列からなりかつ共役ポリケト
ン還元酵素活性を有するタンパク質である請求項１１記
載の方法。 - 【請求項１３】 前記微生物が請求項９記載の形質転換
体である請求項１１記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｘが塩素原子、Ｒ1、Ｒ2が水素原子、
Ｐ1がｔ−ブトキシカルボニル基、Ｐ2が水素原子である
請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002101734A JP2003289874A (ja) | 2002-04-03 | 2002-04-03 | 共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002101734A JP2003289874A (ja) | 2002-04-03 | 2002-04-03 | 共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003289874A true JP2003289874A (ja) | 2003-10-14 |
Family
ID=29241945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002101734A Pending JP2003289874A (ja) | 2002-04-03 | 2002-04-03 | 共役ポリケトン還元酵素遺伝子とその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003289874A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010539910A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | イーエーペー・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | 中間体のエナンチオ選択的酵素的還元方法 |
-
2002
- 2002-04-03 JP JP2002101734A patent/JP2003289874A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010539910A (ja) * | 2007-09-27 | 2010-12-24 | イーエーペー・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | 中間体のエナンチオ選択的酵素的還元方法 |
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