JP2003135060A

JP2003135060A - ウシインターロイキン−１βの製造方法

Info

Publication number: JP2003135060A
Application number: JP2001333932A
Authority: JP
Inventors: Makoto Mizukami; 誠水上; Yasuaki Murahashi; 保昭村橋; Shogo Ebisu; 省吾恵比須; Yuichi Yokomizo; 祐一横溝; Yasuyuki Mori; 康行森; Shigeki Inumaru; 茂樹犬丸; Takao Tsuji; 孝雄辻
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Fujita Health University; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Fujita Health University; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2003-05-13

Abstract

(57)【要約】【解決手段】成熟型ウシインターロイキン−１β（bo
vine Interleukin: bIL-1β）のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドにより形質転換されたブレビバチルス・チョーシネン
シス（Brevibacillus choshinensis）を培養することに
より、ウシインターロイキン−１βを培養物中に生成、
蓄積せしめ、これを採取すること、を特徴とするウシイ
ンターロイキン−１βの製造方法。【効果】高純度のウシインターロイキン−１β（ウシ
ＩＬ−１β）の大量生産が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ウシインターロイ
キン−１β（bovine Interleukin-1β:bIL-1β）（以
下、「ウシＩＬ−１β」ということもある）を遺伝子組
換え技術により効率的に大量製造する方法に関するもの
であり、更に詳細には、成熟型ウシＩＬ−１βのアミノ
酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡを組み込んだプラス
ミドにより形質転換されたブレビバチルス・チョーシネ
ンシス（Brevibacillus choshinensis）を培養し、培養
物中に生成したウシＩＬ−１βを採取することを特徴と
するウシＩＬ−１βの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−１（Interleukin-1:
IL-1）はサイトカインの一種で、古くからその存在が知
られており、内因性発熱物質、リンパ球活性化因子、肝
細胞刺激因子などの呼称で報告されてきたが、これらの
生理活性物質は何れもインターロイキン−１（ＩＬ−
１）なる称呼に統一された（Cellular Immunol., 48, 4
33(1979)）。その後ＩＬ−１の前駆体をコードする異な
る２種の遺伝子の存在が報告され(Nature, 315, 641 (1
985)）、この２種の遺伝子の塩基配列から推定される１
５９個のアミノ酸からなる１Ｌ−１αと１５３個のアミ
ノ酸からなるＩＬ−１βの存在が明らかにされた。

【０００３】ＩＬ−１の応用開発としては、抗癌剤、再
生不良性貧血、骨髄異形成症候群などへの臨床開発や抗
癌剤による副作用の防御、ワクチンのアジュバントなど
が検討されている。最近、ＩＬ−１が牛、羊、山羊など
の家畜の乳房炎などの病気の予防及び治療に効果のある
ことが分かり、従来の抗生物質治療とともに補助的治療
としての利用が検討され、効率的な生産方法の開発が求
められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＩＬ−
１βが家畜の乳房炎の予防及び治療に効果があることが
明らかになった。畜産産業に重要な位置を占める牛のＩ
Ｌ−１βについても研究が進められ、ウシＩＬ−１βが
乳牛の乳房炎の治療に有効なことが確認された。

【０００５】このウシＩＬ−１βは、２６６アミノ酸残
基の膜結合前駆体として生合成される。ウシＩＬ−１β
前駆体のＮ末端から１１３残基は分泌シグナルペプチド
であり、その１１３残基が切断された１５３アミノ酸残
基が成熟型ウシＩＬ−１βとして細胞外に分泌される。
ウシＩＬ−１βの前駆体及び成熟型ウシＩＬ−１βのア
ミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ０９４２８な
どに示されている。また成熟型ウシＩＬ−１βのアミノ
酸配列を配列番号１（図１、図２）に示した。このウシ
ＩＬ−１βを牛の治療に使用するに当たって大量のウシ
ＩＬ−１βが必要とされるが、生体には極微量しか存在
せず、入手の手段が実質的になかった。本発明は、ウシ
ＩＬ−１βの大量製造法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、ウシＩＬ−１βは
生体内には極微量しか存在しないことから、生体から抽
出する方法は少なくとも工業的には採算がとれる方法で
はない点に鑑み、各方面から検討した結果、遺伝子組換
え技術による効率的大量生産に着目した。

【０００７】そして本発明者らは、鋭意研究の結果、ウ
シＩＬ−１βをコードする遺伝子のクローニングに成功
し、該遺伝子を含有する発現プラスミドの作成にも成功
し、該遺伝子を効率的に発現することのできる宿主菌を
各方面から広くスクリーニングした。そして、ブレビバ
チルス・チョーシネンシスに着目した。

【０００８】ブレビバチルス・チョーシネンシス（Brev
ibacillus choshinensis）（従来は、バチルス・ブレビ
ス（Bacillus brevis）。Shida O.ら，Int. J. Syst. B
acteriol., 46, 939-946(1996）において分類学的位置
の変更があった。）に属する菌株には、タンパク質を菌
体外に分泌生産し、培養液中にタンパク質分解酵素を生
産しない菌株が多く、遺伝子組換えの宿主菌として様々
なタンパク質の生産に利用されている。例えば、高木ら
はブレビバチルス・チョーシネンシスに属する菌株のひ
とつであるブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３
１（ＦＥＲＭＢＰ−６８６３）（本菌株はバチルス・ブ
レビスＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）と同一菌
株である。）を宿主菌としてサイトカインの１種である
ｈ−ＥＧＦの大量生産技術を確立し、ｈ−ＥＧＦを培養
液中に約３ｇ／ｌ分泌生産させることに成功している
（BIO INDUSTRY, 8, 275(1991)）。

【０００９】本発明者らは、このブレビバチルス・チョ
ーシネンシスＨＰＤ３１の変異株であるブレビバチルス
・チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ
−６６２３）を用い、成熟型ウシＩＬ−１βのアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドにより形質転換を行ったところ、形質転
換体が得られることを確認し、そして更にこの形質転換
体を培養することにより、発現プラスミドベクターに組
込まれた目的ＤＮＡを発現せしめ、ウシＩＬ−１βを菌
体外に大量に分泌生産することにはじめて成功し、これ
らの有用新知見を基に更に研究を行い、ここにウシＩＬ
−１βを大量生産する方法を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、成熟型ウシＩＬ−１
βのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
断片を組み込んだプラスミドにより形質転換されたブレ
ビバチルス・チョーシネンシスを培養することにより、
ウシＩＬ−１βを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを
採取すること、を特徴とするウシＩＬ−１βの製造方法
に関するものである。以下、本発明について詳述する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の製造方法により製造され
るタンパク質のアミノ酸配列は、ウシＩＬ−１β活性を
有するものであれば、特に限定されないが、好ましく
は、成熟型ウシＩＬ−１βのもの（配列番号１）であ
る。また、本発明において成熟型ウシＩＬ−１βをコー
ドする塩基配列を有するＤＮＡとしては、配列番号１
（図１、図２）に示すウシＩＬ−１βのアミノ酸配列を
コードする塩基配列を有するＤＮＡならばいずれでもよ
いが、たとえば配列番号６（図１、図２）に示す塩基配
列を有するＤＮＡを用いることができる。なお、図１、
図２において、成熟型ウシＩＬ−１βのアミノ酸配列
（１５３アミノ酸）を下段に示し、塩基配列（４６２ｂ
ｐ）を上段に示す。

【００１２】このウシＩＬ−１βをコードする塩基配列
を有するＤＮＡ断片を宿主菌に導入し保持させるベクタ
ーは、宿主菌内で複製可能なプラスミドなら如何なるも
のでもよい。例えば、ブレビバチルス・チョーシネンシ
スで複製可能なｐＵＢ１１０、ｐＮＵ２００（鵜高重
三、日本農芸化学会誌、61, 669(1987)）、ｐＨＹ７０
０（S. Ebisu et al., Biosci. Biotech. Biochem., 5
6, 812〜813(1992)）、ｐＮＨ３００（Shiga, Yら、App
l. Environ. Microbiol., 58, 525-531(1992)）、ｐＨ
Ｔ１１０（特許第２７２７３９１号）やこれらの派生体
などのプラスミドを挙げることができる。特に好ましい
例としてｐＮＨ３００の派生体であるｐＮＨ３２６（Ka
jino, T.ら、Appl. Environ. Microbiol., 66, 638-642
(2000)）を挙げることができる。ｐＮＨ３２６は、ｐＮ
Ｈ３００のＨＷＰプロモーター領域の分泌シグナル配列
をＲ２Ｌ６型の改変分泌シグナル配列（特開平７−１７
０９８４号）に置き換え、マルチクローニングサイトの
下流にｐＨＴ９２６（Ebisu, S.ら、Appl. Environ. Mi
crobiol., 61, 3154-3157 (1995)）の転写ターミネータ
ー配列をコードするＤＮＡを挿入することにより構築さ
れたプラスミドベクターである。これらのプラスミドを
構築する方法としては、公知の方法が適宜用いられ、例
えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマ
ニュアル第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Molecular Cloning 2nd ed.,A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）に記
載の方法などが例示される。

【００１３】本発明において宿主菌として用いる細菌は
ブレビバチルス・チョーシネンシスであるが、特にブレ
ビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６８６３）やその変異株であるブレビバチルス・
チョーシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ−
６６２３）などが好適に使用できる。

【００１４】宿主菌であるブレビバチルス・チョーシネ
ンシスを形質転換する方法は、エレクトロポレーション
法、プロトプラスト法、ＰＥＧ法その他公知の方法で良
く、例えば、Takahashiらの方法（Takahashi et al.,
J. Bacteriol., 156, 1130 (1983)）またはTakagiらの
方法（H. Takagi et al., Agric. Biol. Chem., 53, 30
99-3100 (1989)）などが例示される。

【００１５】形質転換されたブレビバチルス・チョーシ
ネンシスの培養に用いる培地は、形質転換体が生育して
ウシＩＬ−１βを生産しうるものであれば如何なるもの
でもよい。

【００１６】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いられる。また窒
素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、尿素、
硫酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられる。
その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カ
リウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの無機
塩が必要に応じて培地に加えられる。栄養要求性を示す
菌はその生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸などが挙げられる。

【００１７】また、培養に際して必要があれば、培養の
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリン、ネオマイシンなどを加える。更に必要に
より、消泡剤、例えば大豆油、ラード油、各種界面活性
剤などを加えてもよい。培地の初発ｐＨは５．０〜９．
０、さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度
は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７
℃であり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好
ましくは２４〜９６時間である。

【００１８】本発明においては、形質転換体を前記の条
件で培養することによって、培養物中にウシＩＬ−１β
が生成、蓄積される。このようにして得られたウシＩＬ
−１βは公知の方法により、例えばＵＦ膜、ＭＦ膜など
を用いた膜処理、硫安分画法、クロマトグラフィーなど
（蛋白質・核酸の基礎実験法、南江堂（１９８５））で
精製することができる。

【００１９】ウシＩＬ−１βの回収、精製は、上記のよ
うに既知の蛋白質精製方法を適宜利用して実施すればよ
く、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈澱、限外濾過、
イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およ
びアフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、等電点
電気泳動などの方法を１種又は２種以上組合せて実施す
ることができる。

【００２０】具体的には、例えば次のようにしてもよ
い。先ず、培養物を遠心分離またはＭＦ膜で処理するこ
とによって菌体を除いた後、上澄液またはろ過液に硫安
を加え、更にその上澄液をＵＦ膜で濾過することにより
ウシＩＬ−１βを回収し、更に精製する為に分画分子量
の異なるＵＦ膜で分画することにより精製を行うことも
出来る。分画画分を更にイオン交換樹脂等により分画精
製し、必要があれば凍結乾燥すればよい。このようにし
て得られたウシＩＬ−１βの生理活性については、既知
の方法であるＭＴＴ法（T. Mosmann, J. Immunol. Met
h., 65, 55-63 (1983))で測定することができる。

【００２１】本発明により、ブレビバチルス・チョーシ
ネンシスを宿主菌とすることが可能となり、ウシＩＬ−
１βを大量に、しかも菌体外に生産することがはじめて
可能となった。特に本発明においては、ウシＩＬ−１β
を遺伝子組換え技術によって大量に生産することを可能
にしただけでなく、ウシＩＬ−１βは菌体外に分泌生産
されるため、回収、精製工程がきわめて簡単化され、且
つコンタミネーションの危険性も低く、きわめて効率的
にしかも純度の高いウシＩＬ−１βを大量に生産するこ
とができる。

【００２２】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに
限定されるものではない。

【００２３】

【実施例１】形質転換体の調製（１）ウシのＩＬ−１β遺伝子のクローン化ウシの末梢血液からフィコールコンレイ比重遠心法（新
生化学実験講座１２−Ｉ，東京化学同人，日本生化学会
編，ｐ３〜６）により単核球（ＰＢＭＣｓ）を分離し、
ｉｎｖｉｔｒｏで４時間、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ
（リポポリサッカライド）で刺激した。このＰＢＭＣｓ
からｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によ
りｃＤＮＡを得た。

【００２４】ここで得たウシｃＤＮＡをテンプレートに
して、ＰＣＲ法で配列番号２（図３）および配列番号３
（図４）のプライマーを合成して、分泌シグナル部分を
含むウシＩＬ−１β前駆体をコードするＤＮＡ（約８０
１ｂｐ）を増幅した。増幅ＰＣＲ産物は、TA cloning法
（Invitrogen社製 TA Cloning Kit）を用いてプラスミ
ドpCR II（Invitrogen社製）に連結した。この連結ＤＮ
Ａを用いて、E.coli INVαF’(Invitrogen社製)を形質
転換し、ＬＢ寒天培地（１．０％ Tryptone,０．５％ Y
east Extract，１．０％ NaCl，ｐＨ７．０，１．５％
Agar）に塗布して、アンピシリン耐性株を選択した。選
択株よりプラスミドを抽出して、ウシＩＬ−１β前駆体
をコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＣＲＩＩｂ
ＩＬ−１βを得た。

【００２５】更に、Steven R. Leongらの報告（Nucleic
Acids Res., 16, 9054 (1988））に従い、２種類のプ
ライマーＤＮＡ（ＢＩＬ−１−Ｎ：配列番号４（図
５）、ＩＬ−１−Ｃ：配列番号５（図６）を合成した。
先に得たプラスミドｐＣＲＩＩｂＩＬ−１βをテンプ
レートにし、上記により合成した２種類のプライマーＢ
ＩＬ−１−Ｎ、ＩＬ−１−Ｃを用いてＰＣＲ法で増幅し
た。

【００２６】ＰＣＲは、配列番号４のプライマーＢＩＬ
−１−Ｎと配列番号５のプライマーＩＬ−１−Ｃを各々
１００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位、ｄＮ
ＴＰ２００μＭ、ｐＣＲＩＩｂＩＬ−１β鋳型ＤＮＡ
１ｎｇ、１００μｌＴａｑ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭＭｇ²⁺、５０ｍＭ塩化カ
リウム、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）を混合
し、９６℃で３０秒保持した後、ＤＮＡの熱変性（９４
℃、６０秒）、プライマーのアニーリング（５４℃、６
０秒）、プライマーの伸長（７０℃、６０秒）を２５サ
イクルさせることによって行った。

【００２７】増幅させたＤＮＡ断片を、ＮｃｏＩとＢａ
ｍＨＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動
に供し、成熟型ウシＩＬ−１βをコードする塩基配列
（４６２ｂｐ：終止コドンＴＡＡを含む）を含む４８２
ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

【００２８】（２）ウシＩＬ−１β分泌発現ベクターｐ
ＮＨ３２６ｂＩＬ−１βの構築ｐＮＨ３２６（Kajino, T.ら、Appl. Environ., Microb
iol., 66, 638〜642(2000)）をＮｃｏＩとＢａｍＨＩ
で処理した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し
て４．０ｋｂの断片を回収し、先に得た成熟型ウシＩＬ
−１βをコードする塩基配列を含む４８２ｂｐのＤＮＡ
断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結Ｄ
ＮＡを用いてブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ
３１−Ｓ５（ＦＥＲＭＢＰ−６８６３）を形質転換
し、ネオマイシン５０ｍｇ／ｍｌ含有ＴＭ（ＴＭＮｍ）
寒天培地に塗布して、ネオマイシン耐性を持つ株を選択
した。選択株よりプラスミドを抽出して成熟型ウシＩＬ
−１βをコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＮＨ
３２６ｂＩＬ−１βを得た。

【００２９】また、ここで得た株をブレビバチルス・チ
ョーシネンシスHPD31-S5/pNH326bIL-1β（Brevibacillu
s choshinensis HPD31-S5/pNH326bIL-1β)と命名し、独
立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
にＦＥＲＭＰ−１８２４１として国内寄託した。

【００３０】

【実施例２】形質転換体の培養及びウシＩＬ−１βの精
製（１）ブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ３１−
Ｓ５／ｐＮＨ３２６ｂＩＬ−１βの培養得られた形質転換体ブレビバチルス・チョーシネンシス
ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３２６ｂＩＬ−１βを３０Ｌ
ジャーファーメンターを用いてＡＦＮｍ液体培地にて３
０℃で２日間振とう培養を行い、その培養上清をＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびヒトＩＬ−１βモノクローナル抗体を
用いたウエスタンブロット法により解析を行った。解析
の結果、ウシＩＬ−１β相当の分子量の位置に染色バン
ドを示し、その濃さよりウシＩＬ−１βが２００ｍｇ／
Ｌ培地中に生産されている事が確認された。Ｂ．ｃｈｏ
ｓｈｉｎｅｎｓｉｓＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＨ３２６
ｂＩＬ−１βによるウシＩＬ−１βの分泌生産のパター
ンを図面代用写真に示す（図７）。図中、ＣＢＢｓｔ
ａｉｎはクマシーブリリアントブルー染色像を示し、
Ｗ．Ｂ．はウエスタンブロッティング像を示す。

【００３１】（２）ウシＩＬ−１βの精製（１）で得たブレビバチルス・チョーシネンシスＨＰＤ
３１−Ｓ５／ｐＮＨ３２６ｂＩＬ−１βの培養液１８Ｌ
をポアサイズ０．４５μｍのペリコンカセット膜（ミリ
ポア社）を用いて除菌し、約１８ＬのウシＩＬ−１β培
養上清液を得た。次に、ウシＩＬ−１β培養上清液に１
０％飽和になるように硫安を１０００ｇ加え、よく溶解
させ、３時間以上静置した。硫安を加えたウシＩＬ−１
β培養上清液をポアサイズ０．４５μｍのペリコンカセ
ット膜を用いて濾過し、ウシＩＬ−１βを濃縮液側に回
収した。

【００３２】回収した濃縮したウシＩＬ−１βを１０，
０００分画のペリコンカセット膜を用いて純水にて透析
し、ウシＩＬ−１βを濃縮液側に回収した。さらにこの
回収液を凍結乾燥した。凍結乾燥サンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、Ｌｏｗｒｙ法（O.H.Lowry et al., J.Biol. Ch
em., 193, 265-275(1951)）を用いて解析した結果、精
製ウシＩＬ−１βの純度は約５０％で、培養液からの回
収率は６０％であった。

【００３３】

【実施例３】ウシＩＬ−１βの活性測定実施例２で得たウシＩＬ−１βについてマウス細胞由来
のＤ１０．Ｇ４．１細胞を用い、ＭＴＴ法（T. Mosman
n, J. Immunol, Meth., 65, 55-63(1983)）でその活性
を測定した。液体窒素（−１９６℃）保存中のマウス細
胞由来のＤ１０．Ｇ４．１細胞を３７℃で速やかに溶解
し、ＲＰＭＩ１６４０培地（血清なし）５０ｍｌ中に冷
凍保存細胞を良く懸濁する。細胞懸濁液を遠心し（４
℃、１，０００r.p.m.、１０分）上清を除いた後、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地（２０％血清入り）に再懸濁後、シャ
ーレに移し、３７℃、ＣＯ₂インキュベーターで２〜３
日間培養する。更に、Ｄ１０．Ｇ４．１細胞をＲＰＭＩ
１６４０培地（１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含む）中
で継代培養する。培養終了後セルスクレーパーを用いて
Ｄ１０．Ｇ４．１細胞を細胞をつぶさないように注意し
ながら、培養用シャーレから剥ぎとる。得られた細胞懸
濁液は血球計算板をもちいて、細胞数を測定した後、９
６穴シャーレに１穴あたり１００μｌ／ｗｅｌｌの濃度
になるように細胞を分配する。ｂＩＬ−１βを二倍希釈
法により５００ｎｇ／ｍｌ〜０．０６ｎｇ／ｍｌになる
ようにし、９６穴シャーレに各々１００μｌずつ分配す
る。３７℃、５％ＣＯ₂を含むインキュベーター内で１
８時間培養を行った後、核ウエルに２５μｌずつのＭＴ
Ｔ溶液（ＭＴＴ；3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-d
iphenyltetrazolium bromideを５ｍｇ／ｍｌＰＢＳに溶
解）を加える。２時間、３７℃、５％ＣＯ₂を含むイン
キュベーター内で培養した後、培養液を１００μｌ吸い
取り、溶出溶液（１２．５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、５０％
ＤＭＦ（N,N-dimethylfolmamide）、２．５％酢酸（８
０％濃度）、２．５％１Ｎ塩酸ｐＨ４．７）を１００μ
ｌ／ｗｅｌｌ添加した。３７℃で一晩抽出した後、良く
撹拌し、吸光度を測定した（Ｏ．Ｄ．at ５７０ｎ
ｍ）。その結果、組換体ウシＩＬ−１βは、ウシより得
た天然型ＩＬ−１βと同一の活性を示すことが確認でき
た。

【００３４】

【発明の効果】本発明によって、高純度のウシＩＬ−１
βを効率的に大量生産することがはじめて可能となり、
得られた組換えウシＩＬ−１βは家畜の乳房炎の予防及
び／又は治療に有効に利用することができる。

【００３５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 National Agricultural Research Organization； Higeta Shoyu Co., Ltd.,; and Fujita Gakuen 〈120〉 Producing Method of Bovine Interleukin-1β 〈130〉 6443 〈141〉 2001-10-31 〈160〉 6 〈210〉 1 〈211〉 153 〈212〉 PRT 〈213〉 Bovine gene 〈400〉 1 Ala Pro Val Gln Ser Ile Lys Cys Lys Leu Gln Asp Arg Glu Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Val Leu Ala Ser Pro Cys Val Leu Lys Ala Leu His Leu Leu 20 25 30 Ser Gln Glu Met Asn Arg Glu Val Val Phe Cys Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Arg Asp Asn Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Ile Lys Asp 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Lys Lys Gly Asp Thr Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Glu Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Asn Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Tyr Lys Thr Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ile Glu 115 120 125 Glu Arg Pro Val Phe Leu Gly His Phe Arg Ala Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Arg Met Glu Thr Leu Ser Pro 145 150 〈210〉 2 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 2 atggcaaccg tacctgaacc catc 24 〈210〉 3 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 3 ttagggagag agggtttcca ttct 24 〈210〉 4 〈211〉 38 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 4 aaaccatggc tttcgctgca cccgttcagt caataaag 38 〈210〉 5 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈400〉 5 aaaggatcct tagggagaga gggtttccat 30 〈210〉 6 〈211〉 462 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial sequence 〈400〉 6 gcacccgttc agtcaataaa gtgcaaactc caggacagag agcaaaaatc cctggtgctg 60 gctagcccat gtgtgctgaa ggctctccac ctcctctcac aggaaatgaa ccgagaagtg 120 gtgttctgca tgagctttgt gcaaggagag gaaagagaca acaagattcc tgtggccttg 180 ggtatcaagg acaagaatct atacctgtct tgtgtgaaaa aaggtgatac gcccaccctg 240 cagctggagg aagtagaccc caaagtctac cccaagagga atatggaaaa gcgctttgtc 300 ttctacaaga cagaaatcaa gaatacagtt gaatttgagt ctgtcctgta ccctaactgg 360 tacatcagca cttctcaaat cgaagaaagg cccgtcttcc tgggacattt tcgagctggc 420 caggatataa ctgacttcag aatggaaacc ctctctccct aa 462

【図面の簡単な説明】

【図１】成熟型ウシＩＬ−１βのアミノ酸配列（下段）
及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（上段）を示
す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】プライマー（配列番号２）を示す。

【図４】プライマー（配列番号３）を示す。

【図５】プライマーＢＩＬ−１−Ｎを示す。

【図６】プライマーＩＬ−１を示す。

【図７】形質転換体（２）と非形質転換体（コントロー
ル）（１）の培養物のクマシーブリリアントブルー染色
像及びウエスタンブロッティング像を示す図面代用写真
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者水上誠茨城県鹿島郡波崎町7293−９ (72)発明者村橋保昭千葉県木更津市東太田４−６−９サンセールかずさＰｏ３Ｂ−106 (72)発明者恵比須省吾千葉県銚子市清水町2798−１ (72)発明者横溝祐一茨城県つくば市並木４丁目11 919−103 (72)発明者森康行茨城県つくば市要１−２ (72)発明者犬丸茂樹茨城県つくば市並木四丁目10−１ (72)発明者辻孝雄愛知県豊明市沓掛町田楽ヶ窪１−98 学校法人藤田保健衛生大学・医学部内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA11 BA26 CA04 CA20 DA05 EA04 HA03 4B064 AG04 CA02 CA19 CC01 CC03 CC06 CC24 CD30 CE03 CE04 CE06 CE14 CE17 DA01 DA11 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウシインターロイキン−１β（bovine I
nterleukin-1β:bIL-1β）活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を
組み込んだプラスミドにより形質転換されたブレビバチ
ルス・チョーシネンシス（Brevibacillus choshinensi
s）を培養することにより、ウシインターロイキン−１
βを培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取するこ
と、を特徴とするウシインターロイキン−１βの製造方
法。
【請求項２】ウシインターロイキン−１β活性を有す
るタンパク質のアミノ酸配列が配列番号１に示す成熟型
ウシインターロイキン−１βのものであること、を特徴
とする請求項１に記載のウシインターロイキン−１βの
製造方法。
【請求項３】ウシインターロイキン−１β活性を有す
るタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基
配列が配列番号６の塩基配列で示されるものであるこ
と、を特徴とする請求項１又は２に記載のウシインター
ロイキン−１βの製造方法。