JP2003159088A - 組換えトロンビンレセプターおよびそれに関連した薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】循環系の制御に関連した物質を提供すること。
より詳細には、トロンビンレセプターの生産に有用な組
換え物質、診断手段としてのレセプターの使用、および
トロンビンレセプター活性化およびレセプターに関連し
た診断組成物を刺激またはブロックする治療剤を提供す
ること。 【解決手段】５７位および／または９９位および／また
は２０５位が野生型トロンビンｂ鎖と異なる、組換え的
に生産される変異トロンビン。組換え宿主に形質転換さ
れるとき、該宿主において上記のトロンビンを生産し得
る発現系を含有するＤＮＡ分子であって、該発現系が該
宿主において作動可能な異質の調節配列に作動可能に連
結された上記のトロンビンをコードするＤＮＡ配列を含
有する、ＤＮＡ分子。上記の発現系で形質転換される、
組換え宿主細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、循環系の制御に関
連した物質に関し、特に、トロンビンおよびその細胞レ
セプターによって仲介される活性に関する。より詳細に
は、本発明は、トロンビンレセプターの生産に有用な組
換え物質、診断手段としてのレセプターの使用、および
トロンビンレセプター活性化およびレセプターに関連し
た診断組成物を刺激またはブロックする治療剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】トロンビンは、循環系の状態を制御する
強力な因子である。トロンビンが、フィブリノーゲンか
ら、たいていの凝血の必要欠くべからざるフィブリンヘ
の変換を触媒することによって、血液凝固の形成を補助
することは明白である。さらに、トロンビンは、血液中
および血管内壁中の細胞に直接作用し、特に血小板を活
性化して凝血を形成することが公知である。トロンビン
で誘導された血小板活性化は、心筋梗塞、ならびにある
形態の不安定な狭心症および脳卒中を引き起こすプロセ
スである、動脈血栓形成に特に重要である。さらに、ト
ロンビンは炎症および他の細胞活性を促進する。トロン
ビンは、単球に対して走化性であり、リンパ疎に対して
細胞分裂促進性であり、内皮細胞に、好中球粘着性タン
パク質ＧＭＰ−１４０をその表面に発現させ、これらの
細胞の増殖を阻害する。トロンビンは、血小板由来の増
殖因子を内皮から誘導し、そして間葉細胞の分裂促進因
子である。

【０００３】トロンビンは、細胞を直接活性化すること
ができるので、少なくとも１つのトロンビンレセプター
が存在すると想定される。しかし、従来の結合研究で
は、トロンビンレセプターの存在を検出することが可能
ではなかった。なぜなら、トロンビンは、トロンビンに
対する細胞応答を直接仲介しない、細胞上に存在する多
数の物質を結合し得、バックグラウンドレベルの結合が
かなり高いからである。

【０００４】同定されているトロンビン結合性タンパク
質は、トランスダクション分子として機能しないようで
ある（Ｇｒｏｎｋｅ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ
ｅｍ（１９８７）２６２：３０３０−３０３６；０ｋａ
ｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８
７）２５３：３４３５）。生理学的に不活性な改変され
たトロンビンは、トロンビン自身と同様に血小板に結合
するようである。従って、従来の結合研究で同定される
結合部位は、機能的トロンビンレセプターと関連し得な
い。また、トロンビンはプロテアーゼであるため、その
レセプターがトロンビンとの相互作用によってタンパク
質分解で開裂されるなら、レセプターのトロンビンヘの
強力な結合能力は低下し得る。上記の要素はすべて、ト
ロンビンレセプターを発見しようとする従来の結合研究
が、最終的には非生産的であり得ることを示唆してい
る。

【０００５】トロンビンレセプターが存在し得ることが
想定されている一方、トロンビンによるタンパク質分解
による開裂がそのレセプター活性化に関与しているか否
かは、これまでに行われた研究からでも明白でない。ト
ロンビンが、トロンビンを共有結合によって改変し、ト
ロンビンをタンパク賃分解によって不活性にする試薬で
処理されると、血小板を刺激するトロンビンの能力は破
壊される（Ｂｅｒｎｄｔ，Ｍ．Ｃ．ら、「Ｐｌａｔｅｌ
ｅｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ」（１９８１）Ｅｌｓｅｖｉｏｒ／Ｎｏｒｔｈ
ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，ｐ
ｐ．４３−７４：Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７５）１４：１３０８−１３１
４：Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，ＤＮＡ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ
ｃｈｅｍ（１９７４）２４９：２６４６−２６５１；Ｐ
ｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｄｉａ
ｔｈ Ｈａｅｍｏｒｒｈ（１９７４）３２：２０７−２
１５；Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｅ．Ｆ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃ
ｈｅｍ（１９７７）２５２：７１１８−７１２３；Ｇｒ
ｅｃｏ，Ｎ．Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９９０）７５：１
９８３−１９９０）。上記の報告に記載の改変された形
態のトロンビンは、活性部位を占めるかさばった(bulk
y)または荷電した部身および基質に結合するトロンビン
表面の辺縁の付加領域をまた含む（Ｂｏｄｅ，Ｗ．ら、
Ｅｍｂｏ Ｊ（１９８９）８：３４６７−３４７５）。
事実、化学的に改変されたトロンビンの中には、トロン
ビンで誘導された血小板活性化をブロックするものがあ
り、血小板活性化をブロックする１つの改変されたタン
パク質分解性でないトロンビンである、D−フェニルア
ラニル−L−プロリル−L−アルギニルクロロメチルケト
ン(PPACK)トロンビンは、基質に結合しない.従って、プ
ロテアーゼ活性の欠乏が、血小板を活性化しないことの
原因であるとは結論できない。

【０００６】本願に記載の研究中に、２つのグループ
は、トロンビン応答性細胞系から調製されるメッセンジ
ャーRNAが、アフリカツメガエル卵母細胞に微量注入さ
れると、卵母細胞にトロンビン応答性を供与すると報告
している。mRNAは、ハムスターの肺の線維芽細胞系ＣＣ
Ｌ３９（Ｖａｎ Ｏｂｂｅｒｇｈｅｎ−Ｓｃｈｉｌｌｉ
ｎｇ，Ｅ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）
２６２：３３０−３３４）またはヒト臍静脈内皮細胞
（Ｐｉｐｉｌｉ−Ｓｙｎｅｔｏｓ，Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９９
Ｏ）１７１：９１３−９１９）から調製された。

【０００７】本明細書に記載のように、トロンビンレセ
プターを同定し特徴づけると、循環系における血栓症を
制御し得るシステムおよび物質の設計が可能になる。さ
らに、この研究によって、循環状態を評価するための新
しい診断試薬が提供される。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、哺乳類にお
ける循環系の制御に有用な方法および物質を提供する。
トロンビンによって活性化される細胞の表面に関連する
トロンビンレセプターの単離、組換え生産および特徴づ
けにより、これらの機能が有効に制御される。

【０００９】従って、１つの局面では、本発明は、トロ
ンビンレセプターの生産に関連する組換え物質に関す
る。これらには、例えば、培養されることにより、その
表面上にトロンビンレセプターを示すことが可能なトラ
ンスフェクトされた細胞が含まれ、そしてそれ故物質と
天然のトロンビンレセプターとの相互作用をアッセイす
るシステムを提供する。これらの細胞またはレセプター
の関連部分を有するペプチドは、試料中のトロンビンの
レベルを決定する診断薬、およびインビボにおいてトロ
ンビン活性に影響を与える候補物質をスクリーニングす
る手段として使用され得る。

【００１０】他の局面において、本発明は、活性化形態
のレセプタータンパク質の細胞外部分を模倣するトロン
ビンレセプターアゴニストに関する。これらのアゴニス
トは、例えば、血有病者の内出血部位に局部付与するこ
とによって、血小板凝血形成を促進するのに有用であ
る。アゴニストはまた、線維芽細胞増殖を刺激するトロ
ンビンの能力を模倣するため、創傷治癒の促進に有用で
あり得る。

【００１１】さらに他の局面において、本発明は、トロ
ンビンレセプターのアンタゴニストに関する。これらの
アンタゴニストは、レセプターの活性化に必要な重要な
特敏を欠く、改変された形態のトロンビンレセプターア
ゴニストペプチドを含む。これらのアンタゴニストは、
レセプターに結合するが、レセプターを活性化せず、ト
ロンビンによるレセプター活性化を防止する。

【００１２】トロンビンの作用を拮抗する本発明の第２
グループの化合物は、事実、トロンビン阻害剤である。
このグループは、通常にはレセプターの開裂およびトロ
ンビン結合領域を示すであろうレセプターの模倣を含
み、非開裂性ペプチドおよびトロンビンに対する結合が
向上したペプチドを含む。これらのペプチドは、トロン
ビンに直接結合し、レセプターに結合し得るトロンビン
のレベルを低下させ得る。従って、これらのペプチド
は、トロンビンで誘導された血小板凝固、フィブリノー
ゲン凝血および細胞増殖などのトロンビン仲介事象を減
少または防止する。

【００１３】アンタゴニストとして作用する第３グルー
プの化合物は、トロンビンレセプターのアニオン領域
に、それと入れ替わる代替アニオン領域を提供すること
によって、レセプターへのトロンビンの結合をブロック
する。これらのアンタゴニストは、レセプターのトロン
ビン結合部分に含まれるアニオン領域の模倣である。こ
れらのアンタゴニストはまた、トロンビンに結合し、ト
ロンビンと無傷のレセプターとの相互作用を防止する。

【００１４】逆に、トロンビンリガンドに存在するカチ
オン領域を模倣する代替カチオン傾城は、レセプターの
結合領域を占有するアンタゴニストに含まれ、トロンビ
ンの結合を防止し得る。

【００１５】第５グループのアンタゴニストは、レセプ
タータンパク質の特異的領域を結合するように設計され
る抗体を含み得る。一般に、これらのアンタゴニスト
は、トロンビンレセプターの任意の所望の領域に対して
高い特異性を有するモノクローナル抗体調製物である。
本発明の抗体はまた、レセプタータンパク質の免疫アッ
セイ、例えば、組換えシステムにおいて遺伝子が首尾よ
く発現していることを評価するのに有用である。

【００１６】第６グループのアンタゴニストは、改変さ
れた形態の、タンパク質分解活性を欠くトロンビンを含
む。

【００１７】他の局面では、本発明は、組換えトロンビ
ンレセプターを用いてアゴニストとアンタゴニストとを
スクリーニングするアッセイシステムに関する。あるシ
ステムは、アゴニストペプチドを用いて、アゴニストの
効力を阻害するアンタゴニストをスクリーニングする。

【００１８】本発明の他の局面は、血栓症の尺度として
活性化されたときにトロンビンレセプターから開裂され
たペプチドを、血液または尿などの液体中で検出するこ
とによる、循環系疾患の診断に関する。本発明に含まれ
る他の診断方法は、活性化レセプターに特異的な抗体を
用いて、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）のこれらの標的
を位置付け、イメージ化することによる、活性化形態の
レセプターの明視化および体内の凝血の検出である。

【００１９】本発明の他の局面は、本発明の化合物を含
む薬物組成物に関する。トロンビンレセプターの活性化
に対してアンタゴニストとして作用する本発明の化合物
は、抗血栓症剤として有用であり、様々な臨床兆候にお
いて役立つ。臨床兆候には、血管形成における突然の閉
鎖の治療、血管形成における再狭窄の治療、不安定な狭
心症の治療、心筋梗塞の治療、および特定の形態の血栓
または血小坂塞栓溶解性（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｙ
ｔｉｃ）発作の治療が含まれる。本発明の化合物は、単
独で用いられるか、またはウロキナーゼおよびｔＰＡな
どの他の治療薬と組み合わせて用いられ得る。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明は、組換え宿主に
形質転換されたとき、宿主の細胞表面でトロンビンレセ
プターを生産し得る発現系を含むＤＮＡ分子を提供し、
ここで上記発現系は、宿主中で作動可能な異種の調節配
列に作動可能に連結されたヒトトロンビンレセプターを
コードするＤＮＡ配列を含み得る。

【００２１】本発明はまた、上記の発現系で形質転換さ
れた組換え宿主細胞を提供する。

【００２２】本発明は、細胞表面でヒトトロンビンレセ
プターを発現する細胞を生産する方法を提供し、この方
法は、上記トロンビンレセプターをコードするＤＮＡが
発現する条件下で上記細胞を培養する工程を包含し得
る。

【００２３】本発明はまた、候補物質のトロンビンアゴ
ニスト活性を測定する方法を提供し、この方法は、以下
の工程を包含し得る：トロンビンレセプターをコードす
るＤＮＡを発現する条件下で培養された上記細胞を上記
物質の存在下および非存在下でインキュベートする工
程、および上記物質の存在下で上記細胞上で生産された
トロンビンレセプターの活性化の存在、非存在または量
を、上記物質の非存在下と比較して検出する工程。

【００２４】本発明は、トロンビンアンタゴニストとし
て作用する候補物質の能力を評価する方法を提供し、こ
の方法は、以下の工程を包含し得る：トロンビンまたは
トロンビンアゴニストの存在下、および上記候補物質の
存在下および非存在下で、トロンビンレセプターをコー
ドするＤＮＡを発現する条件下で培養された上記細胞を
インキュベートする工程、および上記候補物質の存在下
および非存在下で上記細胞の表面上でトロンビンレセプ
ターの活性化を測定する工程であって、これによって上
記候補物質の存在下の上記活性の減少が上記候補物質の
アンタゴニスト活性を示す工程；またはトロンビン、ト
ロンビンアゴニストまたは既知のトロンビンアンタゴニ
ストの存在下、および上記候補物質の存在下および非存
在下で、トロンビンレセプターをコードするＤＮＡを発
現する条件下で培養された上記細胞をインキュベートす
る工程、および上記トロンビン、トロンビンアゴニスト
または既知のトロンビンアンタゴニストの上記細胞の表
面への結合を、上記候補物質の存在下および非存在下で
測定する工程であって、これによって上記候補物質の存
在下の上記活性の減少が上記候補物質のアンタゴニスト
活性を示す、工程。

【００２５】本発明はさらに、ヒトトロンビンレセプタ
ー夕ンパク質またはその部分と特異的に免疫反応性の抗
体組成物を提供しうる。

【００２６】１つの実施形態において、上記部分は、ト
ロンビン−結合部分であるか、または前記部分がトロン
ビンプロテアーゼ標的部分であるか、あるいは上記抗体
が、活性化されたトロンビンもしくはレセプターと特異
的に免疫反応性であるか、またはトロンビンレセプター
の少なくとも一種の細胞外ループと特異的に免疫反応性
であるか、またはトロンビンレセプターの開裂された活
性化ペプチドと特異的に反応性であり得る。

【００２７】本発明はなお、活性化されたトロンビンレ
セプターをインシトゥに局在化する方法を提供し得る：
活性化されたトロンビンレセプターを持つ被験体に、上
記活性化されたレセプターに特異的な抗体が、上記活性
化されたレセプターに結合するのに有効な量を投与する
工程、および上記抗体の位置を検出する工程を包含し得
る。

【００２８】本発明は、哺乳類の被験体における血栓症
の診断方法を提供し、以下の工程を包含し得る：上記被
験体の生物学的流体の試料をトロンビンレセプターの開
裂された活性化ペプチドの存在、非存在または量を測定
する検出系と接触させる工程；および上記開裂されたペ
プチドの存在、非存在または量を検出する工程。

【００２９】本発明はさらに、トロンビンレセプターを
活性化し得るペプチドであって、以下の式で表されるペ
プチドを提供し得る： ＡＡ_ｘ−ＡＡ_ｙ−（ＡＡ_ｉ）_ｎ−Ｚ （１） ここで、ＡＡ_ｘは、小さなアミノ酸またはトレオニンで
あり、そしてＡＡ_ｙは、中性／非極性／芳香族アミノ酸
残基または中性／非極性／大きな／環状部分を含む非芳
香族アミノ酸であり；ここで、ＡＡは、アミノ酸残基を
表し、そして添え字ｉは、式（１）のＡＡ_ｙ残基の下流
（Ｎ→Ｃ）の指示するアミノ酸残基の位置を表示する整
数であり、そしてｎは２〜１２の整数であり；ただし、
ｎ＝２のとき、Ｚは式ＮＲ’Ｒ’であり、ここで少なく
とも一種のＲ’は少なくとも一種の極性置換基を含むア
ルキル（１−６Ｃ）であり；ＡＡ_１は、Ｌ−立体配置で
遊離のα−アミノ基を持つ中性または塩基性アミノ酸で
あり；ＡＡ_２は、Ｌ−立体配置で中性または塩基性アミ
ノ酸であり；ＡＡ_３−ＡＡ_１２は、Ｌ−アミノ酸残基で
あり；そしてＺは非干渉性の置換基である。

【００３０】１つの実施形態において、ＡＡ_ｘは、ｓｅ
ｒ，ａｌａ，ｇｌｙまたはｔｈｒであるか、あるいはＡ
Ａ_１およびＡＡ_２が中性／非極性／大きなアミノ酸であ
るか、あるいはＡＡ_３およびＡＡａが存在し、そしてそ
れぞれ独立してＡｒｇ，Ｌｙｓ，ＨａｒまたはＡｌａで
あるか、あるいはＺがＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’を含有
し、ここで各Ｒ’が独立してＨであるかまたは１−６Ｃ
の直鎖または分枝した鎖のアルキルであって、各Ｒ’
が、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、および−ＮＲ’ＣＮＲ’
ＮＲ’Ｒ’からなる群から選択される一種またはそれ以
上の置換基で任意に置換され得る、ここでＲ’がＨであ
るかまたは１−６Ｃの直鎖または分枝した鎖のアルキル
であり得る。

【００３１】別の実施形態において、上記のペプチド
は、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ；ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ
Ｋ；ＳＦＬＬＲＮＰＮ；ＳＦＬＬＲＮＰ；ＳＦＬＬＲ
Ｎ；ＳＦＬＬＲ；ＧＦＬＬＲ；ＴＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；
Ｓ（ｐＣｌＰｈｅ）ＬＬＲ；Ｓ（Ｔｈｉ）ＬＬＲ；ＳＦ
ＦＬＲ；ＳＦＦＬＲＮ；ＳＦ（Ｐｈｇ）ＬＲ；ＳＦＬ
（Ｎａｌ）ＲＮ；ＳＦＬ（Ｃｈａ）Ｒ；ＳＦ（Ｃｈａ）
（Ｃｈａ）ＲＮ；ＳＦ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＬＲＮＰＮ
ＤＫ；ＳＦＬＬＫＮ；ＳＦＬＬ（Ｈａｒ）Ｎ；ＳＦＬＬ
ＫＮ；ＳＦＦ（Ｃｈａ）ＡＮ；ＳＦ（Ｃｈａ）（Ｃｈ
ａ）ＲＫおよびそれらのアミデート型からなる群から選
択され得る。

【００３２】本発明は、インビボでトロンビンの作用を
阻害し得るペプチドであって、以下の式で表される、ペ
プチドを提供しうる： Ｘ−ＡＡ_ｙ−（ＡＡ_ｉ）_ｎ−Ｚ （２） ここで、Ｘはｓｅｒ，ａｌａ，ｔｈｒ，ｃｙｓまたはｇ
ｌｙ以外のアミノ酸残基であるかまたは脱アミノ化また
はアシル化アミノ酸であり、ここで、ＡＡ_ｙは中性、非
極性、環状部分を含む大きなアミノ酸部分であり、そし
てここで、ＡＡはアミノ酸残基を表しそして添え字ｉ
は、式（２）のＡＡ_ｙ残基の下流（Ｎ→Ｃ）の指示する
アミノ酸残基の位置を表示する整数であり、そしてｎは
４〜１２の整数であり；そしてここで、ＡＡ_１およびＡ
Ａ_２はそれぞれ独立して中性または塩基性Ｌ−アミノ酸
残基であり、ＡＡ_ｉは遊離のα−アミノ基を有し；ＡＡ
_３は、塩基性または中性アミノ酸残基であり；ＡＡ
_４は、塩基性または非芳香族中性アミノ酸であり；そし
てＺは、非干渉性の置換基である。

【００３３】１つの実施形態において、上記ペプチド
は、ＸがＭｖｌ，Ｍｐｒ，Ｍｂａ，またはＳＭｅＭｐｒ
であるか、またはＡＡ_ｙが芳香族であるか、あるいはＡ
Ａ_１およびＡＡ_２がそれぞれ独立してＬｅｕ，Ｖａｌ，
Ｉｌｅ，Ｃｈａ，ＮａｌまたはＴｉｃであるか、あるい
はＡＡ_３、およびＡＡ_８が存在するときそれぞれ独立し
てＡｒｇ，Ｌｙｓ，ＯｒｎまたはＨａｒであるか、ある
いはＡＡ_４およびＡＡ_６が存在するときそれぞれ独立し
てＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｏｒｎま
たはＨａｒであるか、あるいはＡＡ_７およびＡＡ_１０が
存在するときそれぞれ独立してＡｓｐ，Ｇｌｕ，β−Ａ
ｓｐまたはβ−Ｇｌｕであるか、あるいはＡＡ_１２が存
在するときはＰｈｅであり、そしてＡＡ_９が存在すると
きはＴｙｒであり、あるいはＺがＯＨまたはそのエステ
ルまたは塩、またはＮＲ’Ｒ’を包含し、ここで各Ｒ’
が独立してＨまたは１−６Ｃの直鎖または分岐した鎖の
アルキルであり、各Ｒ’が−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、お
よび−ＮＲ’ＣＮＲ’ＮＲ’Ｒ’からなる群から選択さ
れる一種またはそれ以上の置換基で任意に置換され得、
ここで各Ｒ’がＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖または
分岐した鎖のアルキルであり、またはＺが１−５個のア
ミノ酸残基のペプチド伸長部を含有し得る。

【００３４】なお別の実施形態において、上記ペプチド
は、ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ；ＸＦＬＬＲＮＰＮ
ＤＫＹＥＰ；ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ；ＸＦＬＬＲＮ
ＰＮＤＫＹ；ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；ＸＦＬＬＲＮＰＮ
Ｄ；ＸＦＬＬＲＮＰＮ；ＸＦＬＬＲＮＰ；ＸＦＬＬＲ
Ｎ；ＸＦＬＬＲ；ＸＦＬＬ；ＸＦＬ；Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）
（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）
ＲＮＰＮＤＫＹ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮ
ＤＫＹＥ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫ
Ｙ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ
（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）
（Ｃｈａ）ＲＮ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＡＰＮ
ＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＧＰＮＤＫ，Ｘ−
Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈ
ａ）（Ｃｈａ）ＲＮＡＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈ
ａ）ＲＮＰＡＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰ
ＮＤＡ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫＰＮＥＫ，お
よびＸ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫＰＮＤＡ；および
そのアミデート化またはアシル化型からなる群から選択
され得る。

【００３５】本発明は、以下の式： J-AA_y-(AA_i)_n-AA₉-AA₁₀-AA_ll-AA₁₂-AA_l3-Z （３） を有するペプチドであるトロンビンインヒビターを提供
しうる；ここで、Ｊは２−５個のアミノ酸残基のペプチ
ド伸長部またはそのアシル化または脱アミノ型であり；
ＡＡ_ｙは、環状部分を含む中性の非極性の大きなアミノ
酸であり；ｎは８であり；ＡＡは、アミノ酸残基であ
り、そして添え字ｉはＡＡ_ｙからの下流の位置を示す整
数であり；ＡＡ_１およびＡＡ_２は、それぞれ独立して中
性または塩基性のＬ−アミノ酸残基であり；ＡＡ_３およ
びＡＡ_８は、それぞれ独立して中性または塩基性のアミ
ノ酸残基であり；ＡＡ_４およびＡＡ_６は、それぞれ独立
して塩基性または中性非芳香族のアミノ酸であり；ＡＡ
_５およびＡＡ_１１は、それぞれ独立してプロリン残基ま
たは小さなアミノ酸であり；ＡＡ_７およびＡＡ_１０は、
それぞれ独立して酸性アミノ酸残基であり；ＡＡ_９およ
びＡＡ_１２は、それぞれ独立して中性／芳香族アミノ酸
残基であり； ＡＡ_１３は、芳香族アミノ酸残基または
小さな非極性のアミノ酸残基であり；そしてＺは非干渉
性の置換基である。

【００３６】１つの実施形態において、上記Ｊで表され
るペプチド伸長部がそのＣ−末端部で配列ＰＲＰを包含
するか、またはＪがペプチド結合を介して酸性アミノ酸
残基に結合した大きな／非芳香族／非極性／中性アミノ
酸残基を包含するＮ−末端配列を含むか、またはＡＡ_７
およびＡＡ_１０がそれぞれ独立してＡｓｐ，Ｇｌｕ，β
−Ａｓｐもしくはβ−Ｇｌｕであるか、またはＡＡ_１２
がＰｈｅでありそしてＡＡ_９がＴｙｒであるか、または
ＡＡ_１３がＴｒｐであるか、またはＺがＯＨもしくはそ
のエステルもしくはその塩、もしくはＮＲ’Ｒ’を包含
し、ここで各Ｒ’が独立してＨであるかまたは１−６Ｃ
の直鎖もしくは分岐した鎖のアルキルであり、各Ｒ’が
−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、および−ＮＲ’ＣＮＲ’Ｎ
Ｒ’Ｒ’からなる群から選択される一種またはそれ以上
の置換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ’がＨである
かまたは１−６Ｃの直鎖もしくは分岐した鎖のアルキル
であり得る。

【００３７】本発明はなお、インビボでトロンビンの作
用を阻害し得るペプチドであって、以下の式： B-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-Z （４） で表されるペプチドを提供し得る；ここで、ＢおよびＺ
は非干渉性の置換基であり、そしてＡＡ_９、ＡＡ_１２お
よびＡＡ_１３はそれぞれ独立して中性／芳香族または小
さいアミノ酸残基であり、ＡＡ_１０は、酸性アミノ酸残
基であり、そしてＡＡ_１１はプロリンまたは小さいアミ
ノ酸残基である。

【００３８】１つの実施形態において、本発明のペプチ
ドは、ＢがＨまたはアシルであるか、あるいはＢが１−
４個のアミノ酸のペプチド伸長部を包含するか、あるい
はＺがＯＨまたはそのエステルまたは塩、またはＮＲ’
Ｒ’を包含し、ここで各Ｒ’が独立してＨであるかまた
は１−６Ｃの直鎖もしくは分岐した鎖のアルキルであ
り、各Ｒ’が−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、および−ＮＲ’
ＣＮＲ’ＮＲ’Ｒ’からなる群から選択される一種また
はそれ以上の置換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ’
がＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖もしくは分岐した鎖
のアルキルであるか、あるいはＡＡ_１３がＰｈｅ，Ｔｒ
ｐもしくはＡｌａであるか、あるいはＺが配列ＥＤＥ
Ｅ，ＱＤＱＱ，ＥＤＥＱ，ＱＤＥＱ，ＱＤＥＥ，ＥＤＱ
Ｅ，ＥＤＱＱまたはＱＤＱＥを含む、ペプチドであり得
る。

【００３９】本発明は、インビボでトロンビンの作用を
阻害し得るペプチドであって、以下の式： B-AA_a-AA_b-AA_c-AA_d-AA_e-Z （５） で表されるペプチドを提供し得る；ここで、ＡＡ_ａおよ
びＡＡ_ｅはそれぞれ独立して疎水性アミノ酸または塩基
性アミノ酸であり、そしてＡＡ_ｂ、ＡＡ_ｃおよびＡＡ_ｄ
のそれぞれは独立して塩基性アミノ酸または大きな／極
性／非芳香族アミノ酸であり、そしてＢおよびＺは非干
渉性の置換基である。

【００４０】１つの実施形態において、本発明のペプチ
ドは、ＢがアシルまたはＨであるか、あるいはＺがＯＨ
またはそのエステルまたは塩、またはＮＲ’Ｒ’を包含
し、ここで各Ｒ’が独立してＨであるかまたは１−６Ｃ
の直鎖もしくたは分岐した鎖のアルキルであり、各Ｒ’
が−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、および−ＮＲ’ＣＮＲ’Ｎ
Ｒ’Ｒ’からなる群から選択される一種またはそれ以上
の置換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ’がＨである
かまたは１−６Ｃの直鎖もしくは分岐した鎖のアルキル
であるか、あるいはＡＡ_ａおよびＡＡ_ｅがそれぞれ独立
してＰｈｅ，ＴｒｐおよびＡｌａから選択されるか、あ
るいはＡＡ_ｂ−ＡＡ_ｄがそれぞれ独立してＡｒｇ，Ｌｙ
ｓおよびＧｌｎからなる群から選択されるか、あるいは
ＡＡ_ａ−ＡＡ_ｅが配列ＷＫＫＫＫ，ＫＫＫＫＷ，ＱＫＱ
ＱＷ，またはＷＱＫＱＱを有するペプチドでありうる。

【００４１】本発明は、５７位および／または９９位お
よび／または２０５位が野生型トロンビンｂ鎖と異な
る、組換え的に生産される変異トロンビンを提供し得
る。

【００４２】本発明はまた、組換え宿主に形質転換され
るとき、上記宿主において上記トロンビンを生産し得る
発現系を含有するＤＮＡ分子を提供し、上記発現系が上
記宿主において作動可能な異質の調節配列に作動可能に
連結された上記トロンビンをコードするＤＮＡ配列を含
有する。

【００４３】本発明は、上記発現系で形質転換される、
組換え宿主細胞もまた提供する。

【００４４】本発明はさらに、５７位および／または９
９位および／または２０５位が野生型トロンビンｂ鎖と
異なる、組換え的に生産される変異トロンビンを生産す
る方法を提供し、この方法は、発現に好適な条件下で上
記細胞を培養する工程、および上記培養からトロンビン
を回収する工程を包含し得る。

【００４５】本発明は、創傷治療に有用な薬剤組成物を
提供し、上記ペプチドの有効量を、少なくとも１種の薬
学的に受容可能な賦形剤との混合物で含有し得る。

【００４６】本発明はなお、望まれないトロンビン活性
により仲介される状態の治療に有用な薬剤組成物を提供
し、上記ペプチドまたは上記抗体組成物を、少なくとも
１種の薬学的に受容可能な賦形剤との混合物で合有し得
る。

【００４７】

【発明の実施の形態】本発明によって解明されるトロン
ビンレセプターの特徴は、図１および２に要約される。
図１は、レセプターをコードするクローンの完全なＤＮ
Ａ配列を、その推定アミノ酸配列と共に示す。全アミノ
酸配列は、４２５個のアミノ酸を含み、これらのアミノ
酸は、約４００個のアミノ酸からなる成熟レセプタータ
ンパク質を提供する２４個または２６のアミノ酸シグナ
ル配列を含む。

【００４８】図１に示される配列の疎水性/親水性プロ
ットは、成熟レセプターが７トランスメンブレンドメイ
ンレセプターファミリーのメンバーであり、アスパラギ
ンに連結したグリコシル化のためのいくつかのコンセン
サス部位を含む比較的長い(約７５個のアミノ酸)細胞外
のアミノ酸伸長部位を有することを示す。第１の細胞外
ループにおけるシステイン１７５と、第２の細胞外ルー
プにおけるシステイン２５４とを連結するジスルフィド
結合は、ロドプシンおよびβ−２アドレナリンレセプタ
ーと類似し得る。インシトゥレセプターの提案されたモ
デルは、図２に示される。

【００４９】再び図１を参照すると、トロンビンで触媒
された開裂部位は、４１位および４２位においてＡｒｇ
−Ｓｅｒ連結によって示される。この部位における開裂
によって、成熟ペプチドの１位から開裂部位へ伸長する
「活性化ペプチド」として示されるレセプターのペプチ
ド断片が遊離する。レセプターの正確なプロセッシング
部位は知られていない。従って、成熟タンパク質のN末
端は、あまり明白でない。しかし、成熟タンパク質N末
端は、恐らく２８位のアルギニン残基である。従って、
「活性化ペプチド」は、配列ＲＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤ
ＰＲを有し得る。Ｎ末端の正確な位置は、本発明の化合
物の設計にはあまり重要ではない。この「活性化ペプチ
ド」は、腎臓で大まかに濾過され、尿中に濃縮され得、
トロンビンによる血小板活性化の指標として使用され得
る。

【００５０】トロンビンによって開裂されるアミノ酸配
列、すなわち、開裂部位は、伸長した結合ポケットに含
まれるトロンビンの活性部位／「オキシアニオン孔」領
域に結合する。このオキンアニオン孔は、疎水性結合、
水素結合および電荷相互作用によって大きな基質と結合
する。代表的には、開裂される配列は、活性部位のアミ
ノ酸と相互作用し、一方、この開裂部位に対してカルボ
キシル側にある配列は、さらに伸長した「アニオン結合
外部部位」と相互作用する。トロンビンレセプターは、
図1に示されるように、５２−６０位のアニオン配列Ｙ
ＥＰＦＷＥＤＥＥを含む。この領域は、４１位と４２位
との間の開裂部位に対してすぐカルボキシル側にある。
この配列ＹＥＰＦＷＥＤＥＥ(芳香族/疎水性残基および
アニオン残基）の位置および組成は、この配列がトロン
ビンのアニオン結合外部部位を介してトロンビンがレセ
プターに結合するのを仲介する領域を含むことを強力に
示唆している。この仮定は、レセプターのこの領域の少
なくとも一部を示すペプチドがトロンビンを結合し、そ
の作用を阻害することを示すことによって、以下のよう
に確認される。この見解はまた、レセプターのこの部分
に結合するポリカチオン性物質が、トロンビン結合およ
びレセプター活性化をブロックし得ることを予想してい
る。

【００５１】活性化ペプチドの放出により、レセプター
タンパク質が再度折りたたまれて、レセプターを活性化
する。このことは、図２に図式的に示される。図２はま
た、活性化ペプチドの遊離および再折りたたみによって
生じるコンホメーション変化が、レセプターの細胞内コ
ンホメーションを変化させることも示している。この仮
定は、トロンビンレセプターが、活性化によって形成さ
れる新しいアミノ末端を模倣するペプチドによって活性
化され得ることを見いだすことによって確認される。従
って、活性化レセプター上の新しいアミノ末端であるN
末端の模倣は、そのアゴニストとして振舞う。レセプタ
ー活性化に対する、レセプター中に新たに形成されたア
ミノ末端の最初の２つのアミノ酸の重要性もまた、以下
のように確認された。アミノ末端セリンの位置とフェニ
ルアラニンの位置とを交換すると、上記のアゴニストペ
プチドのアゴニスト活性が完全に失われる。この情報に
基づいて、そしてトリプシノーゲンのトリプシンヘの活
性化に存在するメカニズムとの類似性によって、トロン
ビンがレセプターを開裂するときに新たに露出されるセ
リン上の正に帯電したアミノ基が、レセプター活性化に
おいて重要な役割を果たすようである。トロンビンレセ
プターを結合するが、α−アミノ基を欠失するように改
変されたアゴニストペプチド配列に基づくペプチドは、
トロンビンレセプターのアンタゴニストとして機能し得
る。従って、特異的な活性化相互作用能力を欠失するア
ゴニストペプチドの改変体は、トロンビンレセプターア
ンタゴニストとしての役割を果たす。

【００５２】（本発明の化合物）本発明のペプチド化合
物の記載に用いる命名法は一般的な習慣に従い、ペプチ
ドのＮ末端のアミノ基を各アミノ酸残基の左側に置き、
カルボキシル基を右側に置いた。本発明の選択された特
別な実施態様を表す式において、アミノ基およびカルボ
キシ末端基が多くの場合、特に示されないにもかかわら
ず、特に条件を指定しない限り生理的なpH値を示す形態
であることが理解される。従って、必ずしも条件指定お
よび表示されないが、生理的ｐＨのN末端Ｈ^＋ _２および
Ｃ末端0^-が特定の実施例または一般式のいずれにも存在
することが理解される。アミノ酸残基の側鎖上の遊離の
官能基もまた、アミド化、アシル化または他の置換によ
って改変され得、例えばこの化合物の活性に影響するこ
となくこれらの溶解性を変更し得る。

【００５３】示されたペプチドにおいて、それぞれの遺
伝子にコードされた残基は、適切に、次の慣用表に従っ
て、アミノ酸の種の名称に対応する単一の文字で表記さ
れる：

【００５４】

【表６】 遺伝子的にコードされないアミノ酸は、下記の議論に示
すように省略される。

【００５５】本願に示す特定のペプチドにおいて、Ｄ型
が特に上付短剣符(†)で表される他は、光学異性体を有
するアミノ酸残基のＬ型を意図する。

【００５６】本発明の化合物は、指定するクラスのアミ
ノ酸残基によって部分的に定義されるペプチドである。
アミノ酸残基は、一般に、次のような４つの主要なサプ
クラスに下位分類され得る：酸性：残基は生理的囲でH
イオンを失うことによる負の荷電を有し、そしてペプチ
ドが生理的pHで水性媒体中に存在するとき、その残基は
水性溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドの
コンホメーション中の表面の位置を求める。

【００５７】塩基性：残基は生理的ｐＨでＨイオンに会
合することによる正の荷電を有し、そしてペプチドが生
理的ｐＨで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性
溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドのコン
ホメーション中の表面の位置を求める。

【００５８】中性／非極性：残基は生理的ｐＨで荷電せ
ず、そしてペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在す
るとき、その残基は水性溶液によって反発され、残基が
含まれるペプチドのコンホメーション中の内部の位置を
求める。これらの残基はまた、本明細書では「疎水性
（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）」と表記される。

【００５９】中性／極性：残基は生理的ｐＨで荷電せ
ず、しかしペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在す
るとき、その残基は水性溶液によって誘引され、残基が
含まれるペプチドのコンホメーション中の外部の位置を
求める。

【００６０】それぞれの残基分子の統計的な収集におい
て、ある分子は荷電し、またある分子は荷電せず、そし
て水性媒体による吸引または反発がより大きいかまたは
より小さい範囲で存在することが、当然理解される。
「荷電した（ｃｈａｒｇｅｄ）」の定義に適合するため
には、生理的なｐＨでそれぞれの分子の有意な百分率
(少なくとも約２５％)が荷電される。極性または非極性
として分類するために必要な、誘引または反発の程度は
任意であり、従って、本発明によって特に想定されるア
ミノ酸は、１つまたはその他の分類に分類され得る。特
に指名しないほとんどのアミノ酸は、公知の性質に基づ
いて分類され得る。

【００６１】アミノ酸残基はさらに、環状または非環
状、および芳香族または非芳香族などの、残基の側鎖置
換基に関する自明な分類、ならびに小または大などとし
て下位分類され得る。残基がカルボキシル炭素を含めて
合計４個以下の炭素原子を含有するとき、小さいと考え
られる。小残基は、当然、常に非芳香族である。

【００６２】天然に存在するタンパク質アミノ酸に関し
て、前記体系に従う下位分類は次の通りである： 酸性：アスパラギン酸およびグルタミン酸； 塩基性／非環状：アルギニン、リジン； 塩基性／環状：ヒスチジン； 中性／極性／小：グリシン、セリン、システイン； 中性／非極性／小：アラニン； 中性／非極性／大／非芳香族：スレオニン、アスパラギ
ン、グルタミン； 中性／極性／大／芳香族：チロシン； 中性／非極性／大／非芳香族：バリン、イソロイシン、
ロイシン、メチオニン； 中性／非極性／大／芳香族：フェニルアラニン、および
トリプトファン。

【００６３】遺伝子にコードされた二級アミノ酸である
プロリンは、技術的には中性/非極性/大/環状および非
芳香族の群に入るが、ペプチド鎖の二次構造における公
知の作用による特別な例であり、従って、この定義の群
には含まれない。

【００６４】遺伝コードによってコードされないある種
の共通に見い出されるアミノ酸としては、例えば、ベー
タ−アラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）、または３−アミノ
プロピオン酸、４−アミノ酪酸などの他のオメガ−アミ
ノ酸、アルファ−アミンイソ酪酸（ａｍｉｎｉｓｏｂｕ
ｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａ
ｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、
ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシ
ン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅ
Ｉｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロ
ヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌ
ｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）２−ナフチルアラニン
（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキ
ノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニル
アラニン（Ｔｈｉ）；ならびにメチオニンスルフオキシ
ド（ＭＳＯ）を含む。これらはまた、便宜上特別なカテ
ゴリーに分類される。

【００６５】上記の定義に基づき、Ｓａｒおよびｂｅｔ
ａ−ＡｌａおよびＡｉｂは中性／非極性／小；ｔ−Ｂｕ
Ａ、ｔ−ＢｕＧ、Ｎ−ＭｅＩｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍｖｌおよ
びＣｈａは中性／非極性／大／非芳香族；Ｏｒｎは塩基
性／非環状；Ｃｙａは酸性；Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、
およびＭＳＯは中性／極性／大／非芳香族；そしてＰｈ
ｇ、Ｎａｌ、ＴｈｉおよびＴｉｃは中性／非極性／大／
芳香族である。

【００６６】種々のオメガ−アミノ酸が、大きさに従っ
て、中性/非極性/小（ｂｅｔａ−Ａｌａ、すなわち、３
−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大（そ
の他すべて）として分類される。

【００６７】遺伝子中にコードされた他のアミノ酸置換
基はまた、本発明の範囲のペプチド化合物に含まれ得、
そしてそれらの構造に従ってこの一般的な体系の範囲に
分類され得る。

【００６８】本発明のすべての化合物が、アミノ酸がＣ
末端を形成するとき、薬学的に許容可能な塩またはエス
テルの形態であり得る。塩は、例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、
Ｃａ ^＋２、Ｍｇ^＋２などであり得；エステルは一般に１
−６Ｃのアルコールのエステルである。

【００６９】（Ａ．アゴニスト）本発明のアゴニスト
は、次式の一連のベプテドを含む： ＡＡ_ｘ−ＡＡ_ｙ−（ＡＡ_ｉ）_ｎ−Ｚ （１） ここで、ＡＡ_ｘは、小アミノ酸またはスレオニン、好ま
しくはｓｅｒ、ａｌａ、ｇｌｙおよびｔｈｒから選択さ
れ、そしてＡＡ_ｙは、中性／非極性／芳香族アミノ酸残
基であるか、または中性／非極性／大／非芳香族アミノ
酸であり、環状部分（好ましくは、中性／非極性／芳香
族アミノ酸残基）を含む；ここで、ＡＡは、アミノ酸残
基を意味し、そして下付き文字ｉは整数であり、式
（１）のＡＡ_ｙ残基の下流（Ｎ→Ｃ）側の該当するアミ
ノ酸残基の位置を示し、そしてｎは２〜１２の整数であ
る。ただし、ｎ＝２であるとき、Ｚは式ＮＲ’Ｒ’のア
ミド化されたＣ末端を含み、少なくとも１つのＲ’が少
なくとも１つの極性置換基を含むアルキルであるという
条件で；そして一般に、Ｚは干渉しない置換基である。

【００７０】ＡＡ_１およびＡＡ_２は、従って、式１の化
合物の中に存在しなければならず；ＡＡ_３〜ＡＡ_１２は
任意である。ＡＡ_１およびＡＡ_２は、比較的正確に定義
されるが；ＡＡ_３〜ＡＡ_１２は、一般に、Ｌ−アミノ酸
残基である。ＡＡ_１の位置はまた、比較的許容性があ
る；従って、ＡＡ_１は、Ｌ配置中に遊離のα−アミノ基
を有する中性または塩基性アミノ酸であり；ＡＡ２は中
性または塩基性Ｌ−アミノ酸であり；ＡＡ_３〜ＡＡ_１２
は、好ましくはＡＡ_３が塩基性または中性アミノ酸残基
である、Ｌ−アミノ酸残基であり；ＡＡ_４およびＡＡ_６
は、それぞれ独立に中性／極性／大／非芳香族アミノ酸
であるか、またはＡＡ_４は塩基性アミノ酸であり得；Ａ
Ａ_５およびＡＡ_１１は、それぞれ独立に、プロリンまた
は小アミノ酸残基であり；ＡＡ_７およびＡＡ_１０は、そ
れぞれ独立に酸性アミノ酸残基であり；ＡＡ_８は塩基性
アミノ酸残基であり；そしてＡＡ_９およびＡＡ_１２は、
それぞれ独立に中性／芳香族アミノ酸残基である。

【００７１】式１のペプチドは、後続のアミノ酸配列に
よってＣ末端（しかしＮ末端ではない）で伸長されて
（Ｚに含まれるものとして示す）、非干渉置換基を含有
し得る。

【００７２】式１の化合物のＣ末端において、カルボキ
シル基は未誘導体化型またはアミド化型であり得；未誘
導体化型ではカルボキシルは遊離酸または塩、好ましく
は薬学的に許容可能な塩であり得る。

【００７３】Ｃ末端がアミド化される場合は、Ｃ末端で
カルボニル炭素と共有結合しているアミド基のチッ素原
子は、ＮＲ’Ｒ’であり、それぞれのＲ’が独立に水素
であるか、または１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキル
である。そのようなアルキルは、メチル、エチル、イソ
ペンチル、ｎ−ヘキシルなどのような１−６Ｃの直鎖ま
たは分枝鎖の飽和ハイドロカルピル（ｈｙｄｒｏｃａｒ
ｂｙ１）残基である。そのようなアミド基の典型は：特
に−ＮＨ_２、一ＮＨＣＨ_３、−Ｎ（ＣＨ_３）_２、−ＮＨ
ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＮＨＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２、および
−ＮＨＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３である。さら
に、いずれか一方または両方のＲ’は次に、例えば、そ
れぞれのＲ’は、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、ハロ、−Ｎ
Ｒ’ＣＮＲ’ＮＲ’Ｒ’などの、１つまたはそれ以上の
置換基で任意に置換され得る。ここでＲ’はそれぞれ独
立に上記定義の通りである。従って、Ｚは−ＯＨ(もし
くはエステルもしくは塩の形態)、または−ＮＲ’ Ｒ’
であり得、Ｒ’は上記定義の通りである。

【００７４】ＡＡ_ｘ−ＡＡ_ｙの好ましい実施態様として
は、ＧＦ、ＡＦ、ＳＦ、ＴＦ、Ｇ（ｐＣｌＰｈｅ）、Ａ
（ｐＣｌＰｈｅ）、Ｓ（ｐＣＩＰｈｅ）、Ｔ（ｐＣｌＰ
ｈｅ）、ＧＴｈｉ、ＡＴｈｉ、ＳＴｈｉ、およびＴＴｈ
ｉを含む。ＡＡ_１およびＡＡ _２の好ましい実施態様は大
きい非極性アミノ酸である。この他の式(１)の化合物の
残基としての好ましい実施態様は、ＡＡ_１およびＡＡ_２
がそれぞれ独立にＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｃｈａ、Ｐ
ｈｅ、２−ＮａｌもしくはＴｉｃ；またはＡＡ _３がＡｒ
ｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＨａｒもしくはＡｌａである、実
施態様である。他のアミノ酸としては、ＡＡ_４およびＡ
Ａ_６がそれぞれ独立にＧｌｎ、ＡｓｎもしくはＬｙｓで
あり；またはＡＡ_７およびＡＡ_１０がそれぞれ独立にＡ
ｓｐもしくはＧｌｕであり；ＡＡ_８がＡｒｇもしくはＬ
ｙｓであり；またはＡＡ_１２はＰｈｅでありそしてＡＡ
_９がＴｙｒであり；またはＺがＯＨ、もしくはＮＲ’
Ｒ’であり、Ｒ’は上記定義の通りである；またはＺが
さらに下記に定義するＡＡ_{１ ３}−ＡＡ_１７のいくつかも
しくはすべてを含む、実施態様が好ましい。特に好まし
くは、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ；ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ
Ｋ；ＳＦＬＬＲＮＰＮ；ＳＦＬＬＲＮＰ；ＳＦＬＬＲ
Ｎ；ＳＦＬＬＲ；ＧＦＬＬＲ；ＴＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；
Ｓ（ｐＣｌＰｈｅ）ＬＬＲ；Ｓ（Ｔｈｉ）ＬＬＲ；ＳＦ
ＦＬＲ；ＳＦＦＬＲＮ；ＳＦ（Ｐｈｇ）ＬＲ；ＳＦＬ
（Ｎａｌ）ＲＮ；ＳＦＬ（Ｃｈａ）Ｒ；ＳＦ（Ｃｈａ）
（Ｃｈａ）ＲＮ；ＳＦ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫ；ＳＦ
（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＬＲＮＰＮＤＫ；ＳＦＬＬＫＮ；
ＳＦＬＬ（Ｈａｒ）Ｎ；ＳＦＬＬＫＮ；ＳＦＦ（Ｃｈ
ａ）ＡＮ；およびそれらのアミド化型からなる群より選
択される、式（１）の化合物である。

【００７５】（Ｂ．アンタゴニスト）トロンビンレセプ
ターによって仲介される血小板活性化および他の細胞活
性を干渉する本発明の化合物は以下のものを含む： １）Ｎ末端セリン残基を欠如する改変されたアゴニスト
ペプチドを表すトロンビンレセプターに対するアンタゴ
ニスト； ２）循環しているトロンビンに対する誘引物として挙動
する、トロンビンレセプターの細胞外部分の、開裂不能
および／または強化結合型を表すトロンビンインヒビタ
ー。

【００７６】３）ＹＥＰＦＷＥＤＥＥのアニオン性−結
合外部部位領域の少なくとも一部分を模倣し、そしてや
はり循環しているトロンビンに対する誘引物として挙動
する、アニオン性および疎水性／アニオン性ペプチド。

【００７７】４）トロンビンそれ自身のアニオン性−結
合外部部位領域を模倣し、そしてトロンビンと競合して
レセプターに結合する、カチオン性または伸長したカチ
オン性ペプチド。

【００７８】５）トロンビンレセプターの種々の重要な
位置と免疫反応性の抗体であり；そして ６）レセプターに対して天然のトロンビンと競合する、
タンパク質分解活性を欠如するトロンビン変異体。

【００７９】（トロンビンレセプターアンタゴニスト）
前記第１グループ―改変されたアンタゴニスト−は以下
の式で表され得る。

【００８０】 Ｘ−ＡＡ_ｙ−（ＡＡ_ｉ）_ｎ−Ｚ （２） ここで、ＸはＳｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＣｙｓまたはＧ
ｌｙ以外のアミノ酸残基であるかまたは脱アミノまたは
Ｎ−アシル化アミノ酸であり；ＡＡ_ｙは環状部分、好ま
しくは芳香族を含んでいる、中性で非極性の大きなアミ
ノ酸残基であり；ＡＡはアミノ酸残基を表し、下付き文
字ｉは整数で、（２）式のＡＡ_ｙ残基の下流（Ｎ→Ｃ）
側の該当するアミノ酸の位置を表し、ｎは４〜１２の整
数であり、そして；ＡＡ_１およびＡＡ_２は、それぞれ独
立に、中性または塩基性であるＬ−アミノ酸残基であ
り、ＡＡ_ｉは遊離のα−アミノ基を有し；ＡＡ_３および
ＡＡ_８は、それぞれ独立に、塩基性または中性アミノ酸
残基であり；ＡＡ_４およびＡＡ_６は、それぞれ独立に、
塩基性または非芳香族アミノ酸類であり；ＡＡ_５および
ＡＡ_１１は、それぞれ独立に、プロリン残基または小さ
いアミノ酸類であり；ＡＡ_７およびＡＡ_１０は、それぞ
れ独立に、中性／芳香族アミノ酸残基であり、そして；
Ｚは、非干渉性の置換基である。

【００８１】好ましいＸの実施態様は、３−メルカプト
プロピオン酸(Ｍｐ−ｒ)、3−メルカプト吉草酸（Ｍｖ
ｌ）、２−メルカプト安息香酸（Ｍｂａ）およびS−メ
チル−３−メルカプトプロピオン酸（ＳＭｅＭｐｒ）の
残基を包含する。

【００８２】この抗トロンビン活性化合物のグループの
好ましい実施態様は、ＡＡ_１およびＡＡ_２が、それぞれ
独立に、Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｃｈａ，２
−ＮａｌまたはＴｉｃであり；あるいはＡＡ_３およびＡ
Ａ_８が、それぞれ独立に、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｏｒｎまた
はＨａｒであり、あるいはＡＡ_４およびＡＡ_６が、それ
ぞれ独立に、Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｏｒｎ，Ｈａｒ，Ｇｌ
ｙ，ＧｌｎまたはＡｓｎであり；あるいはＡＡ_７および
ＡＡ_１０が、それぞれ独立に、Ａｓｐ，Ｇｌｕ，β−Ａ
ｓｐまたはβ−Ｇｌｕであり；あるいははＡＡ_１２がＰ
ｈｅおよびＡＡ_９がＴｙｒであり；あるいはＺがＯＨ
（またはエステルもしくは塩の形態）、ＮＨ _２またはＮ
Ｒ’Ｒ’でそれぞれの各Ｒ’は独立にＨまたは上記のよ
うに任意に置換された１−６Ｃの直鎖または分岐鎖のア
ルキルを包含する。

【００８３】特に好ましい実施態様はＸがＭｐｒ、Ｓ−
Ｍｅ ＭｐｒまたはＭｂａであり、ＡＡ_ｙがＰｈｅであ
り、ＡＡ_１がＣｈａであり、ＡＡ_２がＣｈａであるよう
なペプチド類である。

【００８４】特に好ましい実施態様は、遺伝子によって
コードされているＡＡ_１−ＡＡ_１２であるか、あるいは
ＡＡ_１−ＡＡ_２がそれぞれ独立にChaであり得る。この
クラスのアンタゴニストペプチドの中で特に好ましいの
は、

【００８５】

【化１】 の中から選ばれ、特にＸがＭｐｒであるようなものであ
る。

【００８６】特に好ましいのは、

【００８７】

【化２】 である。

【００８８】（トロンビン阻宝剤）グループ２)のトロ
ンビン阻害剤は、レセプターと競合してトロンビンと結
合する化合物で、非開裂性および／または高い結合特性
を示すものである。これらの化合物は以下の式で表され
る： J-AA_y-(AA_i)_n-AA₉-AA₁₀-AA_ll-AA₁₂-AA_l3-Z （３） ここで、Ｊは２−５個のアミノ酸残基のペプチド伸長ま
たはそのアシル化されたもしくは脱アミノ化されたもの
ある。

【００８９】上記式（３）の化合物中、ＡＡ_ｙは、中性
で非極性の大きなアミノ酸残基であり、環状部分好まし
くは芳香族を含んでおり、かつｎは８である。

【００９０】上記中、ＡＡは、アミノ酸残基を表し、そ
して下付き文字ｉはＡＡ_ｙから下流方向に数えた位置を
表す。上記中、ＡＡ_１およびＡＡ_２は、それぞれ独立
に、中性または塩基性アミノ酸残基であり；ＡＡ_３およ
びＡＡ_８は、それぞれ独立に、中性または塩基性のアミ
ノ酸残基であり；ＡＡ_４およびＡＡ_６は、それぞれ独立
に、塩基性または中性の、非芳香族アミノ酸類であり；
ＡＡ_５およびＡＡ_１１は、それぞれ独立に、プロリン残
基または小さいアミノ酸であり；ＡＡ_７およびＡＡ_１０
は、それぞれ独立に、酸性アミノ酸残基であり；ＡＡ_９
およびＡＡ_１２は、それぞれ独立に、中性／芳香族アミ
ノ酸残基であり； ＡＡ_１３は、芳香族または小さく非
極性のアミノ酸残基であり、そして；Ｚは非干渉性の置
換基である。

【００９１】上記グループ２）のトロンビン阻害剤ペプ
チドはトロンビンレセプターの細胞外鎖を模倣している
が、タンパク質分解部位を欠き、および/またはトロン
ビンに対する結合性が高いが、その特に好ましい実施態
様は、下流にアニオン性アミノ酸残基を含有し、Ｊが４
−５個のアミノ酸残基のペプチド伸長であるものであ
る。特に好ましいのは、ＡＡ_ｙのすぐ上流の残基がｐｒ
ｏ−ａｒｇ−ｐｒｏ（ＰＲＰ）という配列を有し、その
配列が、大きく/非芳香族/非極性/中性アミノ酸残基が
ペプチド結合を介して下流の酸性アミノ酸残基と結合し
ジペプチド配列類から選ばれる残基のあとにつづくもの
である。このジペプチド配列の特に好ましい実施態様
は、ｉｌｅ−ａｓｐ、ｖａｌ−ａｓｐ、ｉｌｅ−ｇｌｕ
およびｌｅｕ−ａｓｐであり、特に、Ｊによって表され
る前記ペプチド伸長がＬＤＰＲＰ、ＬＥＰＲＰ、ＩＤＰ
ＲＰ、ＩＥＰＲＰ、ＶＤＰＲＰおよびＶＥＰＲＰから選
ばれるようなものである。

【００９２】さらに、ペプチド伸長がすぐ上流の配列ｐ
ｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏを含有するとき、上流に更に追加
される好ましい伸長はＤアミノ酸である。特に好ましい
のは、大きく／非極性／中性／芳香族であるＤアミノ
酸、特にトリプトファンまたはフェニルアラニンであ
り、そして特にフェニルアラニンである。

【００９３】Ｚは好ましくはOH(またはエステルもしく
は塩の形態)またはＮＲ’Ｒ’で、Ｒ’は上記のように
定義され、ＡＡ_１３から下流のレセプター配列を模倣し
ているペプチド伸長に任意に続き得るものである。

【００９４】式３）の化合物で特に好ましいものは、

【００９５】

【化３】 ならびにそのアミド化またはアシル化したものから選ば
れる。

【００９６】また好ましいものは、

【００９７】

【化４】 およびそのアミデート化およびアシル化したものから選
ばれる。

【００９８】（アニオン外部部位結合アンタゴニスト）
レセプターの結合領域ＹＥＰＦＷを模倣したペプチドを
表すアンタゴニストは、そのグループ３のアニオン伸長
(ＥＤＥＥ)を任意に含有しうるが、以下の式で表され
る。

【００９９】 B-AA₉-AA₁₀-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-Z （４） ここで、ＡＡ_９、ＡＡ_１２およびＡＡ_１３は、それぞれ
独立に、中性の芳香族アミノ酸残基または小さいアミノ
酸残基であり、ＡＡ_１０は、酸性アミノ酸残基であり、
ＡＡ_１１はプロリンまたは小さいアミノ酸残基である。
ＢおよびＺは非干渉置換基、典型的にはペプチド伸長で
あるが、一般的には非干渉有機ラジカルも含有し得る。
ＢまたはＨはアシルでもあり得る（該ペプチド伸長が存
在すればそれを含む）；ＺはＯＨ（もしくはそのエステ
ルもしくは塩の形態）またはＮＲ’Ｒ’（該ペプチド伸
長が存在すればそれも含む）でもあり得、上記したもの
である。

【０１００】式（４）で示される化合物の好ましい形態
は、ＡＡ_９、ＡＡ１２およびＡＡ_{１ ３}のそれぞれがｐｈ
ｅ，ｔｒｐまたはａｌａ、あｍたはｔｙｒであり；およ
びＡＡ_１０が、ｇｌｕ、ａｓｐ、β−ｇｌｕまたはβ−
ａｓｐである化合物である。

【０１０１】特に好ましい実施態様は、ＡＡ_９・ＡＡ
_１３が、ＹＥＰＦＷ、ＦＥＰＦＷ、ＹＤＰＦＷ、ＹＥＰ
ＹＷ、ＹＥＰＦＹ、ＹＥＰＷＹまたはＷＥＰＦＷであ
る。Ｚがペプチド配列ＥＤＥＥ，ＱＤＱＱ，ＥＤＥＱ，
ＱＤＥＱ，ＱＤＥＥ，ＥＤＱＥ，ＥＤＱＱまたはＱＤＱ
Ｅを含むこともあり得る。

【０１０２】Ｂの好ましい実施態様は、ＢがＨまたは１
−４個のアミノ酸のペプチド伸長もしくはそのアクリル
化された形態を含む。

【０１０３】これらのアンタゴニストはトロンビンに対
して誘引物として作用し、それゆえトロンビンの有効濃
度を低下させる。

【０１０４】（アニオン結合外部部位模倣）トロンビン
のアニオン結合外部部位(グループ４)を模倣したカチオ
ンペプチドは、以下の式で表される。

【０１０５】 B-AA_a-AA_b-AA_c-AA_d-AA_e-Z （５） ここで、ＢおよびＺは上記で定義されたとおりであり、
ＡＡ_ａおよびＡＡ_ｅは、それぞれ独立に、疎水性アミノ
酸または塩基性アミノ酸であり、かつＡＡ_ｂ、ＡＡ_ｃお
よびＡＡ_ｄは、それぞれは独立に、塩基性アミノ酸であ
る。

【０１０６】式（５）で表される化合物の好ましい化合
物はＢがアクリルまたはＨを含み；またはＺがＯＨ（ま
たはエステルもしくは塩）またはＮＲ’Ｒ’を含み、そ
れぞれのＲ’は上記で定義されたものである；またはＡ
Ａ_ａおよびＡＡ_ｅが、それぞれ独立に、ａｒｇ、ｌｙｓ
およびｇｌｎからなる群から選択される化合物、特に、
ＡＡ_ａ−ＡＡ_ｅがＷＫＫＫＫ，ＫＫＫＫＷ，ＱＫＱＱ
Ｗ，またはＷＱＫＱＱ配列を有する化合物である。

【０１０７】ＢおよびＺで表される非干渉置換基は更に
ペプチド伸長であり得、該ペプチド伸長は、トロンビン
アニオン結合外部部位の結合パターンと矛盾しない。該
ペプチド伸長が、トロンビンが基質と結合するこの能力
を模倣する場合、これらのアンタゴニストは、トロンビ
ンレセプタープロテインの関連領域、特に図１で示され
る位置５２−６０のＹＥＰＦＷＥＤＥＥ領域、に結合す
る能力によって作用する。

【０１０８】（抗体）トロンビンレセプターの重要部分
に対して免疫反応性の抗体であるアンタゴニスト(グル
ープ５)は、適切な哺乳類被験体に免疫処置を施すこと
によって得られる。この免疫処置は、抗体によって標的
されるように意図されたトロンビンレセプターの部分を
抗原領域として含有するペプチドを用いて行われる。重
要な領域としては、タンパク質分解性の開裂の領域、Ｙ
ＥＰＦＷＥＤＥＥボックスでの結合部位、活性化に重要
な細胞外セグメントのセグメント(これは開裂部位を含
む)、および細胞外ループを形成する配列の部分、特
に、活性化されたレセプターの細胞外領域のＮ末端と相
互作用を起こす領域が挙げられる。本発明のアゴニスト
ペプチドは、この場合の免疫原として用いられ得る。

【０１０９】従って、所望の抗体を調製する免疫原とし
て用いるための適切なペプチドとしては、ＹＥＰＦＷＥ
ＤＥＥ領域のC末端における２８位から６８位までの細
胞外領域の成熟配列の部分を表すペプチドが包含され
る。この領域は以下の配列：ＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰ
ＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧ
ＬＴＥＹを有し、そして配列ＬＤＰＲＳＦＬＬ(この配
列は開裂部位を含む)およびＹＥＰＦＷＥＤＥＥ(この配
列は結合部位を含む)を含むペプチドは特に有用であ
る。免疫原として有用である他の領域としては、アミノ
酸の１６１−１７６位；２４０−２６５位；および３３
６−３４６位を表すセグメントが挙げられる。配列ＹＹ
ＦＳＧＳＤＷＱＦＧＳＥＬＣＲ、ＫＥＱＴＩＱＶＰＧＬ
ＮＩＴＴＣＨＤＶＬＮＥＴＬＬＥＧ、およびＨＹＳＦＬ
ＳＨＴＳＴＴのこれらのペプチドは、それぞれ、提案さ
れた細胞外ループを表す。

【０１１０】これらの抗体は、ペプチド牲ハプテンを用
いた適切な免疫処置のプロトコルに従って、適切な哺乳
類宿主に免疫処置を施すことによって調製される。ペプ
チド性ハプテンは、十分な長さである場合は単独で、ま
たは免疫原性を増強することが所望されもしくは必要と
される場合は適切な担体に結合されて用いられる。ＢＳ
Ａ、ＫＬＨ、または他の担体タンパク質のような担体を
有する免疫原性結合体を調製するための方法は、当該技
術分野において公知である。場合によっては、例えばカ
ルボジイミド試薬を用いた、直接的な結合が有効であり
得る。他の場合では、結合試薬、例えば、イリノイ州、
ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．によって供給される結合試薬が、ハプテンヘの接近
を可能とするために望まれ得る。ハプテンのペプチド
は、Ｃｙｓ残基を用いてアミノ末端またはカルボキシ末
端を伸長するか、またはシステイン残基を散在させるこ
とによって、例えば、担体への結合を容易にし得る。免
疫原の投与は、一般的には、当該技術分野において一般
的に知られているように、適切な時間にわたって注射
し、そして適切なアジュバントを用いて行われる。免疫
処理の期間中、抗体の力価は、抗体形成が十升かどうか
を決定するために利用される。

【０１１１】この方法で生産されるポリクローナル抗血
清は、ある種の適用には、十分満足できるものであり得
るが、薬学的な組成物としては、モノクローナルの調製
物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌
する不朽化された細胞系は、一般的に知られているよう
に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準法、あ
るいはリンパ球または脾臓細胞の不朽化をもたらす改変
法を用いて調製され得る。所望の抗体を分泌する不朽化
された細胞系は、イムノアッセイによってスクリーニン
グされる。この方法では、抗原はペプチド性ハプテンで
あるか、または組換え宿主細胞上に現れたトロンビンレ
セプターそれ自身である。所望の抗体を分泌する適切な
不朽化された細胞の培養物が同定されると、これらの細
胞は、インビトロで、または腹水内での生産によって培
養され得る。

【０１１２】次いで、所望のモノクローナル抗体は、培
養上清液から、または腹水上清液から回収される。モノ
クローナルのフラグメントまたはポリクローナル抗血清
のフラグメントは、免疫学的に重要な部分を含有するな
らば完全な抗体と同様にアンタゴニストとして用いられ
得る。免疫学的に反応性であるフラグメント、例えば、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’の使用、Ｆ(ａｂ’)_２の使用は、特に
治療上の情況において、しばしぱ好ましい。なぜなら、
これらのフラグメントは、一般的に、全免疫グロブリン
より免疫原性が少ないからである。

【０１１３】これらの抗体またはフラグメントはまた、
最新の技街を用いて、組換え法によって生産され得る。
レセプターの所望の領域に特異的に結合する領域はま
た、複数種の起源のキメラの情況において、生産され得
る。

【０１１４】（非開裂性トロンビン）前記に加えて、ア
ンタゴニストは、レセプターに対して天然のトロンビン
と競合する、タンパク質分解活性が欠如しているトロン
ビン変異体(グループ６)を含む。上記のように、トロン
ビンのタンパク質分解性の開裂部位における関連部位と
しては、Ｂ鎖の２０５位のセリン残基、５７位のヒスチ
ジン残基、および９９位のアスパラギン酸残基が包含さ
れることが知られている。トロンビン分子のタンパク質
分解性を不活性にするこれらの残基の置換体を含有する
トロンビンの変異体は、標準的な部位特異的変異誘発法
を用いて調製される。この変異遺伝子を用い、組換え法
を用いて改変トロンビンが製造される。関連する置換体
は、天然の残基を前に有する位置番号、次いで置換され
た残基によって示される。従って、アラニンで置換され
た２０５位のセリンを有するトロンビンは、Ｓ２０５Ａ
と示される。

【０１１５】（好適な実施態様）本発明のアゴニストお
よびグループ（１）〜（４）のアンタゴニストの両方で
は、アミノ酸配列のある種の好適な実施態様は、ペプチ
ドにおけるアミノ酸が遺伝子によってコードされたもの
である。１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ酸残
基が遺伝学的にコードされていないアミノ酸で置換され
ているものも含まれる。

【０１１６】さらに詳しくは、これらの好適な実施態様
では、ＡＡ_１およびＡＡ_２の好適な実施態様は、ｌｅ
ｕ、ｖａｌ、またはｉｌｅであり；特にｌｅｕが好まし
い。ＡＡ_３およびＡＡ_８の好適な実施態様は、ａｒｇま
たはｌｙｓであり；特に、ＡＡ _３がａｒｇであり、そし
てＡＡ_８がｌｙｓである実施態様が好ましい。ＡＡ_４お
よびＡＡ_６の好適な実施態様は、ｇｌｎまたはａｓｎで
あり；特に、ａｓｎが好ましい。ＡＡ_７およびＡＡ_１０
の好適な実施態様は、ａｓｐまたはｇｌｕであり；特
に、ＡＡ_７がａｓｐであり、そしてＡＡ_１０がｇｌｕで
ある実施態様が好ましい。ＡＡ_１２の好適な実施態様は
フェニルアラニンであり、そしてＡＡ_９の好適な実施態
様はチロシンである。

【０１１７】好ましいアシル基は、式ＲＣＯ−であり、
ここでＲは1〜6個の炭素を有する直鎖または分枝鎖のア
ルキルを表す。アセチルが、特に好ましい。

【０１１８】本発明の全てのペプチドでは、１個または
それ以上のアミド結合(−ＣＯ−ＮＨ−)は、同配体(例
えば、−ＣＨ_２ＮＨ−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＣＨ_２Ｃ
Ｈ_２、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス型およびトランス型）、−
ＣＯＣＨ_２−、−ＣＨ（ＯＨ〕ＣＨ_２−、および−ＣＨ
_２ＳＯ−)である他の結合と任意に置換され得る。この
置換は、当該技術分野において公知の方法によって行わ
れ得る。以下の参考文献では、これらの他の結合部分を
含むペプチドアナログの調製について述べられている：
Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９
８３年３月）、第１巻、第３号、「ペプチド骨格の改
変」（総説）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、「アミノ酸
ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学」、Ｂ．
Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、
ニューヨーク、２６７頁、（１９８３）（総説）；Ｍｏ
ｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃ
ｉ（１９８０）、４６３−４６８頁（総説）；Ｈｕｄｓ
ｏｎ，Ｄ．，ら、Ｉｎｔ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ
（１９７９）１４：１７７−１８５（−ＣＨ_２ＮＨ−、
−ＣＨ_２ＣＨ_２−）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ら、
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ（１９８６）３８：１２４３−１２４
９（−ＣＨ_２−Ｓ）；Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．、Ｊ Ｃｈｅ
ｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ（１９８
２）３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シス型およびト
ランス型）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．，ら、Ｊ Ｍ
ｅｄ Ｃｈｅｍ（１９８０）２３：１３９２−１３９８
（−ＣＯＣＨ_２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，
Ｃ．，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９８
２）２３：２５３３（−ＣＯＣＨ_２−）；Ｓｚｅｌｋ
ｅ，Ｍ．，ら、ヨーロッパ出願ＥＰ４５６６５（１９８
２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（Ｏ
Ｈ〕ＣＨ_２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．，ら、Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ（１９８３）２４：４
４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ_２−）；およびＨ
ｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ（１９８２）３
１：１８９−１９９（−ＣＨ_２−Ｓ−）。

【０１１９】（ペプチド性アゴニストおよびアンタゴニ
ストの調製）本発明のペプチド性アゴニストおよびアン
タゴニストは、当該技術分野で公知のように、標準的な
固相(または液相)ペプチド合成方法を用いて調製され得
る。さらに、これらのペプチドをコードするDNAは、市
販のオリゴヌクレオチド合成器械を用いて合成され得、
かつ標準的な組換え生産システムを用いて組換え的に生
産され得る。遺伝子でコードされていないアミノ酸が含
まれるべき場合は、固相ペプチド合成を用いた生産が必
要とされる。

【０１２０】（トロンビンレセプターの組換え生産）本
発明は、組換え細胞の表面に現れるトロンビンレセプタ
ーを生産させるための組換え物質を提供する。これらの
組換え法を用いたレセプターの生産は、有用な診断用試
薬を提供する。この試薬は、生物学的サンプル中のトロ
ンビンのレベルを測定するために、またはさらに重要な
こととしては、トロンビン活性に影響する候補物貰をス
クリーニングする試薬として用いられる。

【０１２１】この組換え生産では、トロンビンレセプタ
ーをコードするＤＮＡ配列(図１に示されている)、また
はその縮重アナログは、以下に示されるような天然配列
の読み出しによって調製されるか、または公知の天然配
列の実質的な部分をプローブとして用いることによって
調製される。あるいはそれらは標準的な方法を用いて新
たに合成され得る。このＤＮＡは、所望の形質転換され
た宿主に適切な発現ベクターに結合され、そして適合性
の細胞に形賓転換される。これらの細胞は、トロンビン
レセプターをコードする遺伝子の発現に好ましい条件下
で培養され、そして表面にレセプターが現れた細胞が採
取される。

【０１２２】（診断およびスクリーニング用の手段とし
ての組換えトロンビンレセプターの使用）トロンビンレ
セプターをコードする組換えＤＮＡの利用により、宿主
細胞表面でのレセプターの発現が可能となる。従って、
レセプターに結合するアゴニストまたはアンタゴニスト
の候補の能力を評価するための手段として有用な細胞が
提供される。

【０１２３】容易に行われるアッセイの１つのタイプで
は、標識されたトロンビン、トロンビンのアゴニストま
たは公知の結合アンタゴニストのいずれかとの、アンタ
ゴニストの候補の競合が、レセプターヘの結合に関して
試験され得る。レセプターに結合する公知の標識された
物質は、もちろん、合成ペプチドであり得る。種々の濃
度の候補体は、一定の濃度の標識されたトロンビン、ト
ロンビンのアゴニストまたはアンタゴニストと共に供給
され、そしてレセプターヘの標識物質の結合の阻害が、
公知の方法を用いて評価され得る。

【０１２４】さらに幾分か複雑なアプローチでは、トロ
ンビンにより誘導される応答への候補体化合物の効果
が、下記のように、トロンビンレセプターを組換え的に
発現させる細胞中で、測定され得る。これらの細胞への
トロンビンの効果に関するアッセイ系としては、カルシ
ウムの可動化および電圧固定(これらは、以下でさらに
詳細に述べられている)が挙げられる。他の適切なエン
ドポイントとしては、トロンビンにより誘導されるホス
ホイノシトールのターンオーバーおよびアデニルシクラ
ーゼの阻害が挙げられる。これらのアッセイは、アンタ
ゴニストの候補の、単にトロンビンに結合する能力では
なく、レセプターの活性への効果の評価を司能にする。

【０１２５】（心臓血管の疾患の診断）１つの実施態様
においては、組換えトロンビンレセプタータンパク質の
利用により、レセプターの活性化された形態に免疫特異
的である抗体を生産することができる。次いでこの抗体
は、インビボで活性化されたレセプターの診断用の造影
に用いられ得る。これらの抗体は、組換え的に生産され
たレセプターの活性化された形態に対して、または以下
の実施例２に記載されている「新しいアミノ末端」ペプ
チドを表すペプチドに対して生産される。生じた抗体、
または免疫特異的なそのフラグメント、例えば、Ｆａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’_２フラグメントは、次いで、公
知の方法によって検出される標識物質に結合される。こ
れらの標識物質としては、テクネチウム^９９およびイン
ジウム^１１１または当該技術分野において公知の他の放
射活性標識物質を包含する放射性標識物質が挙げられ
る。インビボで注射されると、これらの抗体は、活性化
されたレセプターの部位へと向かう。従って、血栓症に
かかった問題の領域の位置づけを可能にする。

【０１２６】診断の他の実施態様においては、体液中に
おける活性化ペプチドの存在を検出および測定すること
が可能となる。抗体は上記のような活性化ペプチドに対
して製造され、そして標準的なＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ
アッセイに用いられて、過剰量の活性化ペプチドを、例
えば、尿中で検出し得る。

【０１２７】（アンタゴニストの利用および投与）本発
明のアンタゴニストは、血管形成の情況における急激な
閉塞または再狭窄の治療；不安定なアンギナの治療；お
よび心筋梗塞の治療において、治療学的に有用である。
アンタゴニストとして作用する本発明のペプチドは、当
該技術分野において公知の全身投与のための通常の処方
によって投与される。典型的なこのような処方は、例え
ば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ.,イーストン、ペンシルバニア州、最新版中
に見い出され得る。

【０１２８】ペプチドの全身投与の好ましい形態として
は、注射、典型的には静脈注射が挙げられる。他の注射
の経路、例えば、皮下注尉、筋肉内注射、または腹腔内
注射もまた用いられ得る。さらに最近では、ペプチドの
全身投与の他の手段が工夫されている。このような手段
としては、胆汁の塩またはフシジン酸のような浸透剤、
または他の界面活性剤を用いた経粘膜投与および経皮投
与が挙げられる。さらに、腸剤またはカプセル化剤とし
て適切に処方されれば、経口投与もまた可能であり得
る。

【０１２９】必要とされる投与量の範囲は、アンタゴニ
ストの選択、投与経路、処方物の性質、患者の疾患の性
質、および診察する医師の判断に依存する。しかし、適
切な投与量の範囲は、被験体１ｋｇあたり０．１−１０
０μｇの範囲である。しかし、入手可能なアンタゴニス
トの多様性および種々の投与経路の効果の違いによっ
て、必要とされる投与量の広範囲の変更が予期され得
る。例えば、経口投与は静脈注射による投与より多くの
投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量
のレベルにおける変化は、当該技術分野においてよく知
られている最適化のための標準的な経験的慣用法を用い
て調整され得る。

【０１３０】本発明のアゴニストは、創傷の治療におい
て、および線維芽細胞の増殖が有用である他の情況にお
いて有用である。これらの化合物は、一般的に、軟膏、
ペースト、ゲルなどの形態で局所的および/または限局
的に投与される。

【０１３１】（アッセイ系）種々のアッセイ系が、トロ
ンビンとそのレセプターとの相互作用、およびその相互
作用への種々の候補アゴニストおよびアンタゴニストの
影響を測定するために用いられ得る。血小板凝集におけ
るトロンビンレセプターおよびトロンビンの役割は、血
小板凝集法によって直接的に測定され得、またはフィブ
リンを含む血液凝固への効果が指標として用いられ得
る。さらに、血小板によるATPの取り込みが、測定され
得る。トロンビンレセプターの活性化の測定法として有
用なものには他に、トロンビンレセプターを発現するこ
とが公知の細胞におけるカルシウムの可動化または電圧
固定アッセイを利用するアッセイがある。これらの後者
のアッセイは、トロンビンレセプターを発現する組換え
細胞において、特に有用である。

【０１３２】（血小板凝集）:このアッセイでは、Ｂａ
ｅｎｚｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｍｏｌ
(１９７４)３１：１４９−１５５の方法、またはＣｈａ
ｒｏ，Ｉ．Ｆ．，ら、J Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１
９７７）６３：８６６−８７３に記載の方法によって、
洗浄されたヒト血小板を調製する。凝集を誘導するため
に、約１−２０ｎＭのトロンビンまたはＥＣ_５０の代わ
りのアゴニストを用いて、コントロール反応における凝
集を刺激する。その結果は、発光血小板凝集法（ｌｕｍ
ｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ）で観察する。凝集を刺激
するために、トロンビンの代わりに、種々の濃度の候補
アゴニストを用いることもできる。凝集を妨げる能力を
評価するためには、候補のインヒビターをトロンビンと
共に反応混合物に加える。

【０１３３】２ｍＭのマグネシウムおよび１ｍＭのカル
シウムを有するTyrode改変緩衝液（ｐＨ７．４）中に、
１０^８血小板／ｍｌの濃度で、洗浄された血小板を懸濁
させる。トロンビンまたは試験化合物を、６００ｍＭの
ＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＥＡ（ｐＨ６．０）、０．５％
のＰＥＧ６０００緩衝液中に少容量(約２０μｌ)で加
え、そして血小板懸濁液と共に３７℃で１５分間インキ
ュベートする。

【０１３４】血小板の活性化／ＡＴＰの分泌：４８０μ
ｌの懸濁液中の上記のように調製された血小板を、最終
濃度約１０ｎＭを得るのに十分な量のトロンビンを含有
する、２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水に加える。あ
るいは、代わりのアゴニストがそのＥＣ_５０の量で加え
られる。約２０μｌのＣｈｒｏｍｏｌｕｍｅ（登録商
標）（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ペンシルバニア州）を加える。凝
集を測定すると共に、ATPの分泌を評価する。これらの
結果は、ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ ｄｕａｌ ｃｈａｎｎｅ
ｌ ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏ
ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)での発光および光透
過率の変化を独立して測定することによって定量化され
る。血小板のATPの分泌を、発光信号として、発光凝集
計中で測定する。トロンビンと相互作用を起こすことが
推定される候補アンタゴニストは、血小板に加える前
に、室温で５分間、２０μｌのＰＢＳ中でトロンビンと
共に予めインキュベートする。予め行われるインキュベ
ーションは、レセプターと直接相互作用を引き起こすア
ゴニストまたはアンタゴニストを試験するためには必要
ではない。

【０１３５】マイクロタイタープレートを用いた血小板
凝集アッセイ：９６ウェルのマイクロタイタープレート
中での、洗浄された血小板を用いて測定されるトロンビ
ン仲介またはアゴニスト仲介血小板凝集を、Ｆｒａｔａ
ｎｔｏｎｉ、Ｊ．Ｃ．ら、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔ
ｈｏｌ（１９９０）９４：６１３−６１７に記載の方法
で行った。ハイブリドーマの上清液、精製されたモノク
ローナル抗体（ＭｏＡｂ)、またはペプチド牲アンタゴ
ニストの、トロンビンレセプターをブロックする能力
を、種々の濃度の抗体またはアンタゴニストを用いて、
このアッセイによって評価した。

【０１３６】フィブリノーゲン凝固アッセイ：１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１
０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５％のＰＥＧ６０００を含む
合計容量３００μｌの溶液中で、３７℃で、フィブリノ
ーゲンの最終濃度３．３ｍｇ／ｍｌで、フィブリノーゲ
ン凝固反応を行う。標準的なＦｉｂｒｏｓｙｓｔｅｍ
（登録商標）ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｒ（Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，スプリングフィー
ルド、ニュージャージー州）によって測定すると、５ｎ
Ｍのトロンビンによって、約１０秒間の凝固時間が得ら
れる。

【０１３７】上記のように、フィブラント（ｆｉｂｒａ
ｎｔ）の形成を刺激するためには、トロンビンの代わり
に候補アゴニストを用い；血餅形成を妨げる能力を試験
するためには、アンタゴニストまたはインヒビターをト
ロンビンと共に加える。

【０１３８】カルシウムの可動化：トロンビンレセプタ
ーをコードするｃＲＮＡを発現する卵母細胞による、ア
ゴニストにより誘導される^４５Ｃａ放出の増加を、刊行
物に記載された方法（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．
（１９８８）８５：４９３９−４０４３）によって評価
した。簡単にいうと、５０μＣｉの^４５ＣａＣｌ_２を含
有するカルシウムを含有しないＭＢＳＨ（１０−４０ｍ
Ｃｉ／ｍｇ Ｃａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ)３００μｌ中で
３０個の卵母細胞のグループをＲＴで４時間インキュベ
ートすることによって、細胞内のカルシウムプールを標
識する。標識された卵母細胞を洗浄し、次いで、抗生物
質を含まないＭＢＳＨ ＩＩ中で９０分間インキュベー
トする。５個の卵母細胞のグループを選択し、それを、
抗生物質を含まない０．５ｍｌ／ウェルのＭＢＳＨ Ｉ
Ｉを含有する２４ウェルの組織培養プレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ３０４７）中で各ウェルにおく。この培地は、１０
分ごとに除去して新鮮な培地と取り替える。採取した培
地をシンチレーションカウンティングによって分析し
て、それぞれ１０分間のインキュベーションの間に卵母
細胞によって放出された^４５Ｃａを測定する。単位時間
あたりの^４５Ｃａ放出が安定したベースラインを示すま
で、１０分間のインキュベーションを継続する。さらに
２回分の１０分間の採取物を得、次いでアゴニストを含
む試験培地を加え、そしてアゴニストにより誘導される
^４５Ｃａの放出を測定する。

【０１３９】電圧固定：１個の電極による電圧固定法を
用いたこと以外は、本質的に、以前Ｊｕｌｉｕｓ，
Ｄ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８)２４１：５５８
−５６３に記載された方法で、トロンビンレセプターを
コードするｃＲＮＡを発現する電圧固定された卵母細胞
において、アゴニストにより誘導される内部方向への塩
化物電流を測定する。

【０１４０】以下の実施例は例示を意図するものであ
り、本発明を限定するものではない。

【０１４１】

【実施例】（実施例Ｉ：トロンビンレセプターをコード
するｃＤＮＡの調製）要約すれぱ、ヒト細胞系ＨＥＬ
（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｔ．ら，Ｊ Ｃｌ
ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９８７）７９：８５９−８６
６）およびＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．
Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ（１９８８）７２：１９６８−１９
７７）をホルボール１２−ミリステート１３−アセテー
ト（ＰＭＡ）で刺激し、その後アフリカツメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内へのマイクロインジェクショ
ンのためにｍＲＮＡを単離した。次に、これらのｍＲＮ
Ａ試料で注入された卵母細胞を、それらの卵を検出する
ために細胞性カルシウムの可動性に対してアッセイし
た。それらの卵は、それらの表面のＲＮＡによりコード
されるトロンビンレセプターを発現していた。ｍＲＮＡ
のサイズによる選択をした後、４０ｋｂのｍＲＮＡ画分
をｃＤＮＡライブラリーの調製に使用した。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ内でクローン化されたプラスミドＤＮＡをインビトロ
系においてキャップ化ｃＲＮＡへ変換し、キャップ化ｃ
ＲＮＡを卵母細胞内に注入することにより、ライブラリ
ーをアッセイした。陽性クローン内の挿入部分を図１に
示されるｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を得るために
シークエンスした。

【０１４２】更に詳細には、アフリカツメガエル卵母細
胞を雌のアフリカツメガエル(Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ
ｖｉｓ)から集め、公知の方法を用いて処理する(Ｃｏｌ
ｅｍａｎ，Ａ．，Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ，およびＨｉｇｇ
ｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，編，Ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２
７１−３０２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９８
８）８５：４９３９−４９４３)。卵胞細胞を除去する
ために、卵母細胞を、カルシウムを含まない改変型Ｂａ
ｒｔｈ溶液（ＭＢＳＨ）中１ｍｇ／ｍｌのシグマ社製Ｉ
Ｉ型コラゲナーゼを用いて室温で４時間インキュベート
し、次いで、洗浄し、ＭＢＳＨ ＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン、１ｍｇ／ｍｌフィコール、１００
Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｌ/ｍｌストレプトマイ
シン、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する
ＭＢＳＨ)中で１８℃で一晩中インキュベートした。

【０１４３】Ｄｕｍｏｎｔ段階 Ｖの卵母細胞を選択
し、50ｍｌのｍＲＮＡでマイクロインジェクトして試験
した（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０中１μｇ／μ
ｌ）;分泌型アルカリ性ホスファターゼをコードするｃ
ＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ（Ｓ．Ｕｄｅｎｆｒｉｅ
ｎｄ博士により寛大に供与された）５ｎｇを、健全な卵
母細胞の選択に対する内部標準として、すべてのｍＲＮ
ＡあるいはｃＲＮＡ試料と共に同時注入した（Ｔａｔ
ｅ，Ｓ．Ｓ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ（１９９０）４：２２
７−２３１）。マイクロインジェクトされた卵母細胞を
９６ウェル培養プレートの個々のウェルにおいてＭＢＳ
Ｈ ＩＩ中で１８℃で４８時間培養した；次いで、卵母
細胞−調整培地を上記（Ｔａｔｅら，（上述））のアル
カリ性ホスファターゼ活性に対してアッセイし、「最高
に発現する」卵母細胞を機能性アッセイに対して選択し
た。

【０１４４】細胞質性ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡを標
準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によりＨＥＬ細胞およびＤａｍｉ細
胞から調製した。Ｓｕｍｉｋａｗａ，Ｋ．ら，Ｎｕｃｌ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８２）１０：５８０９−５
８２２に記載のように、１０−３０％ショ糖密度勾配を
厳密にかけて遠心分離によりサイズごとにポリＡ＋ＲＮ
Ａを分画した。各勾配画分の一定分量をグリオキサール
ゲル電気旅動によりサイズに対して分析した。各画分の
残渣を２回エタノール沈澱させ、ＲＮＡは１０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ，ｐＨ７．Ｏ中に１μｇ／μｌで溶解した。各
面分の一定分量を上記の卵母細胞系においてトロンビン
レセプター活性に対してアッセイした。

【０１４５】サイズで選択されたｃＤＮＡライブラリー
をトロンビンレセプター活性の強い４ｋｂ ｍＲＮＡ画
分からＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅ
ｎｅ（１９８３）２５：２６３−２５９）を用いて合成
した。ＢｓｔＸＩアダプター（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅ
ｅｄ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
（１９８７）８４：８５７３−８５７７）に連結後、約
３．５ｋｂあるいはより大きなｃＤＮＡを、クローニン
グベクターｐＦＲＯＧ内に連結する前に、アクリルアミ
ドゲル電気泳動により選択した。ｐＦＲＯＧベクター
を、ＮｏｔＩ部位の隣りにまれなカッターのＭｌｕＩの
制限部位を挿入するリンカーを加えることにより、ｐＣ
ＤＭ６ＸＬ(Ｃ．Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｙｏｓｔ，ＵＣＳＦ
により寛大に供与されたｐＨ４Ｍ誘導ベクター（Ａｒｕ
ｆｆｏおよびＳｅｅｄ（上述））から誘導した。ｐＦＲ
ＯＧは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの転
写制御下でｃＤＮＡを配置し、アフリカツメガエルのグ
ロビンの５’非翻訳領域を含有し、続いてｃＤＮＡ挿入
部によりコードされた情報を有するハイブリッドｍＲＮ
Ａの合成を指示した。

【０１４６】Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１株をエレクト
ロポレーションによりcＤＮＡライブラリーを用いて形
質転換し、１プール当り２０，ＯＯＯクローンを有する
５０個のプールをプレートした。モデルクローン、すな
わちｐＦＲＯＧ内のセロトニン１ｃレセプターcＤＮＡ
を運搬するＭＣ１０６１は、内部標準として２０００個
当り１クローンに包含された。プラスミドＤＮＡを各プ
ールから調製し、ＮｏｔＩでの消化により直鎖状にし
た；キャップ化ｃＲＮＡをインビトロで生成し（Ｋｒｉ
ｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ
（１９８７）１５５：３９７−４１５)、上記の卵母細
胞系においてトロンビンレセプター活性に対してアッセ
イした。電圧固定法および^４５Ｃａ遊離アッセイの両方
を用いて、すべてのプールをスクリーニングした。最初
の５つのスクリーニングされたプールのうち全部がいく
らかのトロンビンレセプター活性を示した；^４５Ｃａ遊
離アッセイにおいて、トロンビン誘導による^４５Ｃａ遊
離の増加は、２倍から６倍までの範囲である。最も活性
なプールを１プレート当り約２０００クローンで再びプ
レートし、卵母細胞系において再スクリーニングした。
スクリーニングされた１０個のプールのうち２個は、ト
ロンビンレセプター活性に対して陽性であった。これら
のうち最も活性なものを１プレート当り３００クローン
で再びプレートし、そのプールを再スクリーニングし
た。活性プールの漸進的選択および下位区分化により、
単一クローンを同定した。

【０１４７】３４８０−ヌクレオチドｃＤＮＡ挿入部を
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｈｏＩ部位内にサブクロー
ン化した。挿入部の制限断片をＭ１３内にサブクローン
化した。ｃＤＮＡ配列をジデオキシシークエンシング法
により各方向に２回（コード領域に対しては３回）決定
した。その結果を図１に示す。

【０１４８】図１は、トロンビンレセプタータンパク質
のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を共に示
す。推定シグナル配列および７つのトランスメンブラン
スパンを含有する疎水性領域に上線を引いている。シグ
ナルペプチダーゼによるシグナル配列のプロセシングの
後、おそらくプロリン特異性アルギニル開裂による追加
プロセシングは、図上で印を付けた２７および２８の位
置のアルギニン間で起こる。それゆえ、成熟タンパク質
のアミノ末端はＰＲＥＳＫ．．．で始まる。アスパラギ
ン連結が可能である糖結合部位は下線を引き、コンセン
サスポリアデニル化領域は太文字にしてある。Ｒ_４１／
Ｓ_４２での推定のトロンビンレセプター開裂部位もまた
印をつけてある。

【０１４９】上記のように、図２は、細胞膜におけるト
ロンビンレセプターの配置図を提供する。図２に示され
るように、無傷の、および不活性化のトロンビンレセプ
ターのアミノ末端の細胞外の伸長は、トロンビンにより
開裂され、新しいアミノ末端をさらし、本明細書中で
「活性化ペプチド」と称される短いレセプター断片を遊
離する。次いで、新たにさらされたアミノ末端は、アゴ
ニストとして機能し、トロンビンレセプターの未だ不確
定な領域に結合し、そしてそれを活性化する。それゆ
え、トロンビンレセプターは、チモーゲン−酵素の変換
に類似のメカニズムにより活性化される。モれゆえ、７
つのトランスメンブラン領域を含有する他のレセプター
のようなトロンビンレセプターは、Ｓ_４２／Ｆ_４３の天
然体Ｎ末端を有するそれ自身のリガンドを含有する。

【０１５０】トロンビンレセプターをコードするヒトｃ
ＤＮＡを利用することにより、対応するマウス型を検索
することが可能になる。高い相同性の度合いは、開裂部
位および陰イオン性外部部位の結合ドメインに示され
る。これらの配列のお互いとの、およびヒルジンの陰イ
オン性外部部位の結合ドメインとの相同性が図3に示さ
れる。

【０１５１】（実施例２：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＮＨ_２（ＳＦＬＬＲＮ−Ｎ
Ｈ_２）の合成）パラメチルベンズヒドリルアミン樹脂塩
酸塩（０．５ｍｍｏｌ合成、０．７７ｍｅｑ／ｇ、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｅｒ Ｃｉ
ｔｙ，ＣＡ）は、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中
のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を中和さ
せ、続いて洗浄し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
エステルと結合した要求されるアミノ酸を加え、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製の４３１Ａ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて順序正し
く導入した。Ｂｏｃ−アミノ酸は次の側鎖の保護を有し
ていた：Ｓｅｒ（ｏＢｚ１）およびＡｒｇ（Ｔｏｓ）。
完全ペプチド樹脂の開裂をＨＦ／アニソール／メチルエ
チルスルフィド(５６／６／１（ｖ／ｖ）)で行い、粗ペ
プチドを与えた。その粗ペプチドを０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）含有の勾配をかけたアセトニトリル−
水を用いてＣ_１８逆相液相クロマトグラフィーにより精
製した。

【０１５２】（実施例３：野生型および変異型トロンビ
ンレセプターｃＲＮＡを発現する卵母細胞上の「新しい
アミノ末端」ペプチドのアゴニスト活性）野生型トロン
ビンレセプターｃＲＮＡ（ＷＴ）５ｎｇあるいはアミノ
酸置換Ｒ４１Ａ（Ｒ４１Ａ）を有する変異型トロンビン
レセプターをコードするｃＲＮＡ５ｎｇで卵母細胞にマ
イクロインジェクトした。表示は、上記のようにトロン
ビンに対するそれと同様である−４１位でアラニンがア
ルギニンと置換する。次に、未注入の卵母細胞あるいは
トロンビンレセプターｃＲＮＡを発現する卵母細胞を４
８時間培養し、トロンビンあるいはペプチド誘導^４５Ｃ
ａ遊離を上記のように測定した。候補アゴニストを飽和
濃度で加えた：２５０ｐＭのトロンビンおよび２５μＭ
の「新しいアミノ末端」ペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ
ＹＥＰＦ（ＳＦＬＬペプチド）。対照ペプチドＦＳＬＬ
ＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（ＦＳＬＬペプチド）を１００μ
Ｍで加え、応答を誘起しなかった。表１に示されたデー
タは、３回反復測定の平均値＋／−ＳＥＭを示す；これ
らの結果は、３つ、あるいは４つの別々の実験で得られ
たデータを表す。

【０１５３】

【表１】 アゴニストＳＦＬＬペプチドは、未注入の卵母細胞に対
して活性を有しない(未掲載)。アゴニスト誘導^４５Ｃａ
遊離よりむしろ電圧固定された卵母細胞内のアゴニスト
誘導内部電流をエンドポイントとして使用したとき、定
性的に同一の結果が得られた。

【０１５４】（実施例４：血小板の分泌および凝集およ
びマイトゲン効果に対する「新しいアミノ末端」ペプチ
ドのアゴニスト機能）洗浄された血小板を調製した。こ
れは、Ｂａｅｎｚｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｇ．，Ｍｅｔｈ Ｅ
ｎｚ（１９７４）３１：１４９−１５５；およびＣｈａ
ｒｏ，Ｉ．Ｆ．ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（１９
７７）６３：８６６−８７３に記載されている。アゴニ
スト誘導応答を上記のように評価した。

【０１５５】１、１０、２０、１００あるいは２００μ
Ｍペプチド ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ 「ＳＦＬ
Ｌ」ペプチド、あるいは２０ｎＭトロンビンに応答した
血小板凝集を発光血小板凝集計(ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇ
ｏｍｅｔｅｒ)で測定した。その結果を図４Ａに示す。

【０１５６】表示の最終濃度の「新しいアミノ末端」ペ
プチドに応答した血小板ＡＴＰ分泌も、発光血小板凝集
測定法により続いて測定した。その結果を図４Ｂに示
す。

【０１５７】図４に示されたデータは、各アゴニスト濃
度に対して３回得られた凝集あるいは分泌の応答を表す
実測の軌跡であり、５つ以上の別々の実験において得ら
れた結果を表す。１００％凝集は、１分で飽和濃度のト
ロンビンに応答して起こる凝集として任意に定義され
る。１００％分泌は、飽和濃度のトロンビンに応答して
起こる最大応答として任意に定義される。「新しいアミ
ノ末端」ペプチドは、図に示されるような両アッセイに
おいて、１００μＭ濃度で２０μＭトロンビンと同等に
活性である。対照ペプチドFSLLRNPNDKYEPFおよびLLRNPN
DKYEPFは、２００μＭという高い濃度では両方とも活性
がなかった(未掲載)。

【０１５８】追加の測定において、アゴニストペプチド
のマイトゲン効果を、ＣＣＬ−３９細胞を用いて実証し
た。線維芽細胞系ＣＣＬ−３９を無血清培地中で静止さ
せ、次いで、トリチウム標識チミジンの存在下、候補ア
ゴニストで４８時間処理する。次に、標準方法を用いて
ＤＮＡへの標識の取り込みを、図５中のｃｐｍとして示
されるＴＣＡ−不溶性活性として測定した。図に示され
るデータは、６回反復測定の平均値のプラスあるいはマ
イナスの９５％信頼限界を表す。

【０１５９】図に示されるアゴニストは以下の通り:な
し（無血清）；１０％ 胎児ウシ血清（１０％ ＦＣ
Ｓ）；１００ｎＭ α−トロンビン（ａ−Ｔ）；配列SF
LLRNPNDKYEPFの１、１０あるいは１００μＭアゴニスト
ペプチド（ＮＴＰ）；１００μＭ「スクランブルされた
（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）」アゴニストペプチド、これ
は、ＦＳにスクランブルされたＮ末端を有する前記のも
の（アゴニストペプチド）である（ＦＳＬＬ）。

【０１６０】図５に示されるように、１００μＭのＮＴ
Ｐは、生育に有意な刺激を与える。アゴニストの最初の
２残基の位置を単に交換することは、活性の喪失を引き
起こす。それゆえ、アゴニストペプチドは、血小板凝集
を刺激し、そして線維芽細胞の増殖を刺激することに有
用であり、傷の治療の応用に有用である。

【０１６１】（血小板凝集アゴニスト）上記の血小板凝
集アッセイを用いて、５０％最大凝集を誘起するために
必要な種々のペプチドの濃度を測定した。ＥＣ_５０とし
て示される得られた値をマイクロモル単位で表２に示
す。

【０１６２】

【表２】 （実施例５：トロンビン阻害剤ペプチドによるトロンビ
ン誘導血小板活性化の阻害）本発明の３つのアンタゴニ
ストペプチドである、ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ
ＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（ＬＤＰＲＰペプチド）、Ｆ
^＋ＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥ
Ｓ（Ｆ^＋ＰＲＰペプチド）、およびＬＤＰＲＰＦＬＬ
（短小化ＬＤＰＲＰペプチド）を、トロンビン誘導血小
板活性化を阻害する能力について試験した。トロンビン
を候補となる阻害ペプチドと共に、５分間インキュベー
トし、次いでその混合物を洗浄した血小板に加え、血小
板活性化を発光血小板凝集法によって血小板ＡＴＰ分泌
として測定した。上記混合物は全容量２０μｌのリン酸
緩衝生理食塩水中で、上述の標題「アッセイ」の記載に
記載されるように調製されおよび懸濁された血小板４８
０μｌに加えた。候補ペプチドは、種々の濃度で用い
た。この結果を図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに示す。ＡＴ
Ｐ分泌は、候補ペプチドの非存在下１０ｎＭ トロンビ
ンによって発生した平均蛍光シグナルに対する百分率で
表示した。示される図は、３回の反復実験を行って得ら
れた結果の代表例である。

【０１６３】図６Ａは、ＬＤＰＲＰペプチドに対する結
果を示す。これは、約５００ｎＭのＩＣ_５０を示す。Ｌ
ＤＰＲＰペプチドは、開裂部位および推定のトロンビン
結合部位の両方を表す配列を含む。図６Ｂは、短小化Ｌ
ＤＰＲＰペプチドに対して得られた結果を示す。ＩＣ
_５０は、約２００μＭである。

【０１６４】しかし、図６Ｃに示されるように、別の形
の推定の開裂部位および推定の結合部位を含むＦ^＋ＰＲ
Ｐペプチドは、約２００ｎＭのＩＣ_５０を示す。従っ
て、このペプチドは、ＬＤＰＲＰペプチドまたはその短
小化形のいずれよりもより有効なアンタゴニストであ
る。

【０１６５】（実施例６：トロンビンレセプターアンタ
ゴニストペプチドの調製：Ｍｐｒ−Ｐｈｅ−Ｃｈａ−Ｃ
ｈａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−ＯＨの合成）Ｎ−α−Ｂｏｃ−ε−（Ｃｌ−ＣＢ
Ｚ）−Ｌｙｓ−Ｏ−Ｐａｍ−樹脂（０．５ｍｍｏｌ、
０．７０ｍｅｑ／ｇ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を出発物質と
し、Ｂｏｃ基をＴＦＡで除去し、中和して、洗浄した。
そして必要なアミノ酸を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ社製の４３１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒを用いて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ールエステルとして結合することにより、配列に加え
た。ペプチドを樹脂から切断し、実施例３に記載のよう
に逆相クロマトグラフィーによって精製した。

【０１６６】類似的に合成した候補ペプチドを、上述の
血小板活性化／凝集アッセイにおいて試験し、トロンビ
ンの存在下に種々の濃度で加えた。活性化または凝集の
５０％阻害を生じた濃度をＩＣ_５０と称し、試験した種
々のペプチドに対して、表３にマイクロモル単位で示
す。

【０１６７】

【表３】 表３に示されるように、ロイシンにChaおよびAsn残基に
Lysのようなアミノ酸の置換が、アンタゴニスト活性を
改良する。

【０１６８】（実施例７：活性部位トロンビン変異体の
生成）オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅ
ｌ，Ｔ．Ａ．，ら、ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ（１９８
７）１５４：３６７−３８３）を用いて、Ｂｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＳＫ−プラスミドベクター系（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にクローン化された
天然プロトロンビンｃＤＮＡ中で、活性部位の残基の置
換Ｓ２０５ＡおよびＤ９９Ｎ／Ｓ２０５Ａを生成した。
ＤＮＡシークエンスにより確認した後に、トロンビン活
性部位および天然プロトロンビンのｃＤＮＡにおいて所
望の変異（類）を有するプロトロンビンのＤＮＡコーデ
ィングを、ｐＢＪ１発現ベクター（ｐｃＤＬ−ＳＲα２
９６由来）(Ｔａｋａｂｅ，Ｙ．，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ（１９８８）８：４６６−４７２）にサブ
クローン化し、ｐＳＶ２ＤにおけるＤＨＦＲ選択マーカ
ーを用いて（Ｓａｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．，ら、Ｍｏｌ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８１）２：８５４−８６
４)、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）に
より（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．，ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１
３−７４１７)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）−マイナスＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトし
た。安定なトランスフェクト体を単離し、遺伝子増幅を
８０ｎＭ メトトトレキセート中で行った。

【０１６９】組換えプロトロンビンの生産をＥＬＩＳＡ
およびウェスタンブロットにより測定し、最も高収量の
クローンを生育させて、ＭＥＭのα−ヌクレオシド欠乏
培地で２４，０００ｃｍ^２の表面を有する細胞「ｆａｃ
ｔｏｒｙ」（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄ社，Ｎｅｐ
ｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中で培養した。上記の培地は、
８０ｎＭのメトトレキセート、１００単位／ｍｌのペニ
シリン、１００μg／ｍｌのストレプトマイシン、２５
ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、５μｇ／ｍｌのビタミンＫ、
Ｏ．２ｍｇ／ｍｌのプロリン、および１０％透析ウシ血
清を含有する。充分に増殖したとき、培地をすべて除去
し、全増殖表面をリン酸緩衝生理食塩水で６回洗浄し
て、夾雑するウシのプロトロンビンおよびトロンビンを
除去し、そして細胞をＭＥＭのα−ヌクレオシド欠乏培
地で３６−４８時間培養した。この培地は、１００単位
／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、５μｇ／ｍｌの
ビタミンＫ、０．２ｍｇ／ｍｌのプロリン、１μｇ／ｍ
ｌのインシュリン、および５μｇ／ｍｌのトランスフェ
リンを含有する。

【０１７０】調製培地から遠心分離および濾過によって
細胞残渣を取り除き、水で１：１に希釈し、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、および２０ｍＭのクエ
ン酸(最終濃度)にして、１％（ｖ／ｖ）Ｓ−セファロー
スと４℃で一晩攪拌した。Ｓ−セファロースビーズを遠
心分離によって除去し、調製培地を再濾過し、１％（ｖ
／ｖ）Ｑ−セファロース４℃で一晩攪拌した。次いで、
Ｑ−セファロースを１０ｍｌカラムに採集し、６００ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
４、０．５％のＰＥＧ６０００で１ｍｌの画分で溶出
し、抗ヒトトロンビン抗血清を用いてウェスタンブロッ
トにより同定される組換えトロンビンを含む陽性の面分
を得た。

【０１７１】陽性の画分をプールし、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌl、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、
０．５％のＰＥＧ６０００中にＳ２０５Ａ変異プロトロ
ンビンが１００μｇ／ｍｌの濃度になるように希釈し、
そして既に記載されるように（Ｋｒｉｓｈａｓｗａｍ
ｙ，Ｓ．，ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８７）２
６２：３２９１−３２９９）、プロトロンビナーゼ複合
体で１時間処理した。次いで、ｐＨを１ＭのＨＣｌで
７．０に変え、Ｓ２０５ＡまたはＤ９９Ｎ／Ｓ２０５Ａ
変異トロンビン含有溶液を約１，０００倍モル過剰の
（ｐ−アミジノフェニル）−メタンスルフォニルフルオ
ライド（ＡＰＭＳＦ）で処理し、調製物に夾雑し得るＸ
ａ因子および任意のウシトロンビンを阻害した。ＡＰＳ
ＭＦはセリン依存性の不可逆的なトロンビンアンタゴニ
ストであり、これはｐＨ７．０では天然のトロンビンを
急速に不活性化するが、ｐＨ８．０ではその半減期が１
０^−３秒でしかない。この理由のために、ＡＰＭＳＦ処
理された変異トロンビン調製物のｐＨを、次いで８．０
に１５分間変えて、全ＡＰＭＳＦを除去した。

【０１７２】変異トロンビン含有溶液を、次いで１Ｎ
ＨＣｌの添加によりｐＨ６．０に変え、１％（ｖ／ｖ）
Ｓ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。このＳ−セフ
ァロースを１０ｍｌカラムに採集し、１５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０で洗浄し、続いて
１ｍｌ画分に６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＥ
Ｓ、ｐＨ６．０、０．５％のＰＥＧ６０００で溶出し
た。陽性の面分を、抗ヒトトロンビン抗血清を用いてウ
ェスタンブロットによって同定し、組換えＳ２０５Ａま
たはＤ９９Ｎ／Ｓ２０５Ａトロンビン調製物の濃度およ
び純度をクーマシーおよび銀で染色したＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲルによって測定した。本研究で用いた変異トロンビ
ンの調製物は、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で均一で
あった。

【０１７３】（実施例８：フィブリノーゲン凝固アッセ
イ）フィブリノーゲン凝固活性を、標準のＦｉｂｒｏ
Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）凝固タイマー（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，
ＮＪ）により、種々のフィブリン濃度でフィブリン凝固
を生成するのに必要な時間として測定した。全てのフィ
ブリノーゲン凝固反応は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０
ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、
０．５％のＰＥＧ６０００中の全容量３００μｌ中で、
３７℃で行い、フィブリノーゲンの最終濃度を３．３ｍ
ｇ／ｍｌとした。標準ＷＴおよび組換えＷＴは共に同一
の曲線を示した。例えば、５ｎＭでは、凝固時間は１０
秒である。Ｓ２０５ＡおよびＤ９９Ｎ／Ｓ２０５Ａのい
ずれも凝固を誘導し得なかった。

【０１７４】（実施例９：血小板ＡＴＰ分泌および凝集
の研究）洗浄した血小板を上述のように調製し、２ｍＭ
のマグネシウムおよび１ｍＭのカルシウムを有する改変
Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液、ｐＨ７．４中で、１０^８血小板／
ｍｌの濃度で懸濁した。血小板の全ての研究は、２０μ
ｌのＣｈｒｏｍｏｌｕｍｅ（登録商標）試薬（Ｃｈｒｏ
ｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社，Ｈａｖｅｒｔ
ｏｗｎ，ＰＡ）を有する全容量５００μｌ中で行った。
血小板のＡＴＰ分泌および凝集を、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ
ｄｕａｌ Ｃｈａｎｎｅｌ ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏ
ｍｅｔｅｒ（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ社，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，ＰＡ）で、それぞれ蛍光
と光透過とにおける変化を測定することにより、個別に
定量した。血小板を３００ｒｐｎで攪拌し、アゴニスト
を速くかつ均一に分散させた。

【０１７５】５００μｌの血小板を１５分間３７℃で、
所望の最終濃度を与えるような、６００ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．５％のＰＥＧ
６０００緩衝液中の希釈されたＳ２０５Ａ貯蔵液１８μ
ｌと、または１８μｌの緩衝液のみとインキュベート
し、次いで天然トロンビン（最終濃度１ｍＭ）を投与し
た。血小板ＡＴＰ分泌および凝集を、トロンビン添加後
３０秒間測定した。血小板ＡＴＰ分泌データは、緩衝液
で前処理した血小板に１ｍＭの天然トロンビンの添加後
３０秒で得られた蛍光シグナルとして定義される、最大
に対する百分率として表示した。この結果を図７に示
す。各点は３回の反復測定の平均値を示し、３回の反復
実験の典型例である。図示されるように、Ｓ２０５Ａト
ロンビン濃度が上昇すると、トロンビン誘導血小板鈴泌
の阻害が増加する。同様の結果が、Ｄ９９Ｎ／Ｓ２０５
Ａ変異トロンビンを用いて得られた。

【０１７６】さらに測定を行ったところ、４００ｎＭの
Ｓ２０５Ａトロンビンにおいて、天然トロンビンに比べ
て、血小板の投与反応の結果が約１ｌｏｇ右にシフトす
ることが示された（図８）。この測定では、６００ｍＭ
のＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．５％
のＰＥＧ６０００緩衝液中でＳ２０５Ａを最終濃度４０
０ｎＭにしたＳ２０５Ａ １８μｌ、または同量の緩衝
液のみ（固体系）を、血小板５００μｌと、１５分間３
７℃でインキュベートした。次いで、指示した最終濃度
のαトロンビンで血小板を刺激し、血小板ＡＴＰ分泌お
よび凝集をトロンビン添加後３０秒間行った。示された
データは、血小板ＡＴＰ分泌の初速度、特にアゴニスト
添加後３０秒以内および凝集が検出される前に生ずる血
小板ＡＴＰ分泌の最大速度を示す。従って、報告された
血小板ＡＴＰ分泌速度によりアゴニスト誘導反応が示さ
れるが、凝集誘導反応は示されない。３回反復実験から
得られた曲線を図５に示す。ここでの任意の１単位は、
ＡＴＰ標準を用いた検量に基づくと、１秒当り放出され
るＡＴＰ量の３３ｐｍｏｌｅに相当する。

【０１７７】さらに実験を重ねたところ、Ｓ２０５Ａト
ロンビンは天然トロンビンに誘導される血小板分泌の割
合を阻害することが示された。血小板を種々の濃度のＳ
２０５Ａとともに予めインキュベートし、次いで天然ト
ロンビン（最終濃度１ｎＭ）で刺激した。凝集により誘
導される分泌を妨害するために、本実験での血小板を最
終濃度が２×１０^７血小板／ｍｌになるように懸濁し、
天然トロンビンを加えた後に撹拝しなかった。この条件
下では、血小板は凝集しないが、トロンビンと反応して
ＡＴＰを分泌した。血小板分泌速度は上述の任意の単位
で表した。図９は血小板分泌曲線を示し、３回反復実験
で得られた結果を表すロコントロール曲線（０ｎＭ Ｓ
２０５Ａトロンビン）で見られる蛍光の減少は本アッセ
イに特徴的であり、ルシフェラーゼの最終生産物阻害を
表す。

【０１７８】しかし、Ｓ２０５Ａトロンビンは、アゴニ
ストペプチドまたはカルシウムイオノフォアでの刺激に
より血小板に誘導されたＡＴＰ分泌を阻害しない。

【０１７９】（実施例１０：抗体の調製）トロンビンレ
セプターアミノ末端伸長の部分を表すペプチドを免疫原
として用い、ポリクローナル抗血清およびモノクローナ
ル抗体を調製した。

【０１８０】PESKATNATLDPRSFLLCペプチド(開裂部位ペ
プチド)およびYEPFWEDEEKNESGLTEYCペプチド（アニオン
外部部位ドメインペプチド）を用いて、抗体を生産し
た。これらの抗血清を、上述の血小板活性化アッセイに
おいて、アンタゴニストとして作用を試験した。いずれ
もが活性化を阻害するのに有効であった。アニオン外部
部位ドメインペプチドであるＡｂ１０４７と免疫反応性
のポリクローナル抗体調製物を、トロンビンを加える前
に１ｎＭの濃度で血小板とインキュベートし、血小板を
加えた。Ａｂ１０４７を結合するペプチドすなわち「ペ
プチド３６０」の添加により、阻害が生じなくなった。
１：１００希釈でのＡｂ１０４７は、血小板の凝集およ
び活性化をほとんど完全に阻害する。

【０１８１】レセプターの開裂部位および推定アニオン
結合外部部位を含むPESKATNATLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEE
KNESGLTECペプチドもまた用いて、モノクローナル抗体
を阻害する有効なレセプターを調製した。この４０残基
のペプチドは、天然配列のカルボキシル末端にＣｙｓ残
基を付加されており、チオール特異的試薬であるｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイ
ミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて、Ｃｙｓ残基により
キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に共有結合
した。ペプチドＫＬＨ結合体の透析の後、この物質を用
いて、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処理した。各マ
ウスから得られた脾臓細胞をＰ３Ｘ細胞と融合し、ハイ
ブリドーマのパネルを形成した。

【０１８２】これらのハイブリドーマから得られる上清
液を、免疫処理に用いた天然の４０残基ペプチドおよび
ＥＬＩＳＡアッセイで配列の長さを４０残基に拡げた１
５残基ペプチドと交叉反応する能力についてアッセイし
た。ＩｇＧ特異的クローンのみをさらに研究した。ポジ
ティブなハイブリドーマを、マイクロタイタープレート
シェーカーアッセイで、トロンビン誘導血小板凝集の阻
害の能力について試験した。最終的に、ポジティブなハ
イブリドーマを、塩濃度を増加して洗浄した条件下で、
４０残基ペプチドを用いて、ＥＬＩＳＡアッセイで再び
アッセイし、見かけ上親和性が高い６つのハイプリドー
マを選択した。この６つのハイブリドーマを限界希釈に
よりサブクローン化し、４−２、１０−５、３１−２、
３３−１、６１−１、および６２−５クローンを得た。

【０１８３】各クローンを、腹腔内にマウス当たり１×
１０^７細胞を注射することにより腹水を生産した。Ｉｇ
Ｇを豊富に含む腹水を、プロテインＡ−セファロースを
用いて精製した。これはＩｇＧの治療可能性がＩｇＭよ
りも大きいからである。これらの精製モノクローナル抗
体のトロンビン誘導血小板凝集の（アゴニストとしてト
ロンビンを用いる）阻害に対する能力を洗浄した血小板
で評価して、その結果を表５に示す。これらのＭｏＡｂ
についてのＩＣ_５０は、２．５−２０μｇ／ｍｌの範囲
の精製ＩｇＧを示した。

【０１８４】

【表５】

【０１８５】

【発明の効果】トロンビンに対する細胞表面レセプター
をコードするＤＮＡをクローン化し、そして配列決定し
た。このＤＮＡの利用により細胞表面で生産され得、そ
してトロンビン検出のためのおよびトロンビンアゴニス
トおよびアンタゴニスト候補の評価のための両アッセイ
系で有用なトロンビンレセプターの組換え生産が司能に
なる。さらに、トロンビンレセプターの構造の解明は、
診断的におよび治療的に有用なアゴニストおよびアンタ
ゴニスト化合物のデザインを可能にする。トロンビンレ
セプターの利用はまた、レセプターそれ自体または診断
的にまたは治療的にもまた有用であるその特定領域と特
異的に免疫反応性である抗体の生産を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、ヒトのトロンビンレセプターのＤ
ＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトのトロンビンレセプターのＤ
ＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。

【図２】図２は、推定アミノ酸配列に基づいて提案され
た、トロンビンレセプター活性化のモデルを示す。

【図３】図３は、ヒトのトロンビンレセプターをコード
するｃＤＮＡおよびネズミのトロンビンレセプターをコ
ードするｃＤＮＡから推定される開裂部位および外部部
位結合ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。図３はま
た、ヒルジン配列の関連部分も示す。

【図４Ａ】図４Ａは、アゴニストペプチドに対する血小
板応答を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、アゴニストペプチドに対する血小
板応答を示す。

【図４Ｃ】図４Ｃは、アゴニストペプチドに対する血小
板応答を示す。

【図５】図５は、線維芽細胞に対する、本発明のアゴニ
ストペプチドの細胞分裂促進効果を示す。

【図６Ａ】図６Ａは、トロンビンで誘導された血小板活
性化に対する、３つのトロンビン阻害剤ペプチドの効果
を示す。

【図６Ｂ】図６Ｂは、トロンビンで誘導された血小板活
性化に対する、３つのトロンビン阻害剤ペプチドの効果
を示す。

【図６Ｃ】図６Ｃは、トロンビンで誘導された血小板活
性化に対する、３つのトロンビン阻害剤ペプチドの効果
を示す。

【図７】図７は、トロンビンによって刺激された血小板
ＡＴＰ分泌に対する、変異トロンビンの効果を示す。

【図８】図８は、変異トロンビンによる血小板ＡＴＰ分
泌の阻害を克服するのに必要なトロンビンの増加を示
す。

【図９】図９は、トロンビン変異体の濃度を変化させる
ことによる、血小板ＡＴＰ分泌に対するトロンビンの効
果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/08 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 9/10 １０３ Ｃ１２Ｎ 1/15 43/00 １１１ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/74 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/74 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 501312897 コー セラピューティックス， インコー ポレイテッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94080, サウス サンフランシスコ， イースト グランド アベニュー 256 (72)発明者 ショーン アール． コウリン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131 サンフランシスコ，レイク フォレスト コート 41 (72)発明者 ロバート エム． スカボロー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002 ベルモント，ベルモント キャニオン ロード 2544 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA61 BA63 BA80 CA04 CA12 DA02 EA04 FA10 GA03 GA11 GA18 HA01 HA15 4B050 CC04 DD11 FF12E LL03 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 BD15 BD18 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 BA02 BA08 BA22 BA23 CA17 CA18 CA36 CA53 DC35 NA14 ZA392 ZA402 ZA542 ZC202 4C085 AA14 BB11 CC03 CC04 CC05 EE01

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５７位および／または９９位および／ま
   たは２０５位が野生型トロンビンｂ鎖と異なる、組換え
   的に生産される変異トロンビン。
2. 【請求項２】 組換え宿主に形質転換されるとき、該宿
   主において請求項１に記載のトロンビンを生産し得る発
   現系を含有するＤＮＡ分子であって、該発現系が該宿主
   において作動可能な異質の調節配列に作動可能に連結さ
   れた請求項１に記載のトロンビンをコードするＤＮＡ配
   列を含有する、ＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の発現系で形質転換され
   る、組換え宿主細胞。
4. 【請求項４】 ５７位および／または９９位および／ま
   たは２０５位が野生型トロンビンｂ鎖と異なる、組換え
   的に生産される変異トロンビンを生産する方法であっ
   て、発現に好適な条件下で請求項３に記載の細胞を培養
   する工程、および該培養からトロンビンを回収する工程
   を包含する、方法。
5. 【請求項５】 創傷治癒をもたらす方法であって、該方
   法は、トロンビンレセプターの活性化を阻害しうるペプ
   チドまたはトロンビンレセプターに対する抗体を含む組
   成物の有効量を該創傷に施す工程を包含する、方法。
6. 【請求項６】 所望でないトロンビン活性により仲介さ
   れる状態を処置する方法であって、該方法は、トロンビ
   ンレセプターの活性化を阻害しうるペプチドまたはトロ
   ンビンレセプターに対する抗体を含む組成物の有効量を
   該状態に施す工程を包含する、方法。