JP2003159065A

JP2003159065A - 発酵法による目的物質の製造法

Info

Publication number: JP2003159065A
Application number: JP20526699A
Authority: JP
Inventors: Eiichiro Kimura; 英一郎木村; Hisao Ito; 久生伊藤; Osamu Kurahashi; 修倉橋
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-07-19
Filing date: 1999-07-19
Publication date: 2003-06-03
Also published as: AU6018300A; WO2001005959A1

Abstract

(57)【要約】【課題】Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因
子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製
造する方法において、従来の方法と異なる原理によって
目的物質の生産性を改善する方法を提供する。【解決手段】微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取
する、微生物を利用した目的物質の製造法において、前
記微生物として、目的物質の生合成系の中間体又は基質
の排出量が低下した変異株又は組換え株を用いることに
より、目的物質の生産性を改善する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、最終目
的産物である物質の生産性を改善するための手段を開示
するものである。

【０００２】

【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的
なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知ら
れている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用い
られるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物
のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼
料添加物として、製薬業および化学工業における試薬と
して、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどの
Ｌ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。
発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物として
は、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、セラチア属細菌等が知られている。

【０００３】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するに
は、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から
誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の
薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用い
る方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持
った株を用いる方法等がある。

【０００４】さらに近年はＬ−アミノ酸の発酵生産に、
組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技
術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を
増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系
を強化することを、その原理としている。これらの事情
については例えば「アミノ酸発酵学会出版センター１
９８６年」に解説されている。

【０００５】また、Ｌ−アミノ酸以外にも微生物を用い
た発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質
や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生
産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又
はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強
が主なものである。

【０００６】一方、目的物質の細胞内から細胞外への輸
送系、すなわち排出系を強化することにより、目的物質
の生産性を向上させる技術が開示されている（特開平５
−２７６９３５号）。

【０００７】しかし、目的物質の生合成系の中間体又は
基質の排出量を低下させることにより、目的物質の生産
性を向上させる試みはなされていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ
酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など
の目的物質を微生物を利用して製造する方法において、
従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改
善する方法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、目的物質の生合
成系の中間体又は基質の排出量が低下した変異株又は組
換え株は、目的物質の生産性が向上することを見出し、
本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち本発明は、（１）微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を
生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取する、微
生物を利用した目的物質の製造法において、前記微生物
は目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出量が低下
した変異株又は組換え株であることを特徴とする方法；（２）前記微生物は、目的物質の生合成系の中間体又は
基質の排出系が欠損又は弱化したものである（１）記載
の方法；（３）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）記載の
方法；（４）前記目的物質がＬ−グルタミン酸であり、その生
合成系の中間体又は基質がα−ケトグルタル酸である
（３）記載の方法；（５）前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細
菌である（１）記載の方法；及び（６）前記微生物のα−ケトグルタレートパーミアーゼ
遺伝子の変異又は破壊により目的物質の生合成系の中間
体又は基質の排出系が欠損又は弱化した（４）記載の方
法；である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により製造される目的物質は、微生物によって生
産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−ス
レオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他に
も、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、
抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により
生合成される物質のうち、その生合成の中間体又は基質
の排出系が存在するものであれば、いかなるものでも良
い。また、現在微生物を利用して生産されていない物質
であっても、その生合成の中間体又は基質の排出系が存
在するものであれば本願発明が利用できることはいうま
でもない。

【００１２】尚、目的物質と、中間体又は基質とは、相
対的な概念であって、目的物質であるか、中間体又は基
質であるかは、製造しようとする対象に依存する。例え
ば、アミノ酸を製造しようとする場合にはそのアミノ酸
は目的物質であるが、アミノ酸を前駆体とするペプチド
抗生物質を製造しようとする場合は、目的物質は同抗生
物質であって、アミノ酸は中間体又は基質である。

【００１３】本発明に用いる微生物は特に制限されず、
従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生
物であれば使用することができる。また、従来、産業上
利用されていない微生物であっても、目的物質を生産す
る能力を有する限り、本発明を適用することができる。
本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有す
るものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術な
どを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与
されたものであってもよい。

【００１４】具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシ
ェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバ
チルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア
属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。

【００１５】より具体的には以下の菌株が挙げられる。
例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア
・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号
参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム A
J12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）
等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ1
1442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,
170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参
照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア
・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開
第2,680,178号参照）、エシェリヒア・コリAJ13199（FE
RM P-15573)(特開平7-203980号参照)、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)
(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシン
の場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)
(特公昭 62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム AJ3718（FERM P-2516)(米国特許第3,
970,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合は
エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出
願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラ
バム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参
照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ
VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113
号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参
照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェ
リヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムAJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出
願公開第 2,686,898号参照）等である。

【００１６】本発明において、目的物質の生合成系の中
間体又は基質とは、目的物質の生合成に関わる物質であ
って、排出系が存在するものであればいかなる物質であ
ってもよい。また、中間体又は基質は、前駆体など目的
物質の固有の生合成系の中間体又は基質には限られず、
例えば目的物質がＬ−アミノ酸である場合の解糖系の中
間体や基質のように、他の物質の生合成系又は代謝系の
中間体又は基質であってもよい。また、中間体又は基質
には、目的物質の生合成反応に関与するものであれば、
プロトンや電子の供与体又は受容体等の物質も含まれ
る。さらに、上記のような中間体又は基質の生合成系の
中間体又は基質も含まれる。本発明における目的物質、
その中間体又は基質、及び排出系遺伝子の例を、表１に
示す。

【００１７】

【表１】 ──────────────────────────────────── 目的物質中間体又は基質排出系遺伝子 ──────────────────────────────────── L-ク゛ルタミン酸 α-ケトク゛ルタル酸 α-ケトク゛ルタレートハ゜ーミアーセ゛遺伝子(kgtP) ──────────────────────────────────── L-アミノ酸¹⁾ 乳酸乳酸パーミアーゼ遺伝子(lactP) ²⁾ L-アミノ酸¹⁾ グリセロールク゛リセロール促進因子遺伝子(glpF)³⁾ ──────────────────────────────────── 1)：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン等 2)：Dong, J.M. et al., J. Bacteriol. 175, 6671-6678 (1993) 3)：Weissenborn, D.L. et al., J. Biol. Chem., 267, 6122-6131 (1992)

【００１８】また、従来排出系が知られていない物質で
あっても、排出系が存在するものであれば、本発明を適
用することができる。例えば、kgtP遺伝子に塩基配列に
ついて、既知のデータベースに対して検索を行うと、kg
tP遺伝子と相同性を有する多くの遺伝子が見出される。
これらの遺伝子は、本発明を適用することができる可能
性が高い。

【００１９】本発明に用いる微生物は、上記のような目
的物質の生合成系の中間体又は基質の排出量が低下した
変異株又は組換え株である。前記排出量が低下した株と
しては、前記中間体又は基質の排出系が欠損又は弱化し
た株が挙げられる。前記排出系が欠損又は弱化した株
は、同排出系が正常に機能しないように、同排出系に関
わる１又は２以上の遺伝子を破壊し、又は変異を起こさ
せることによって、取得することができる。

【００２０】本発明に用いる変異株は、微生物の野生株
又は目的物質の生産に好ましい変異を有する変異株を変
異処理し、前記中間体又は基質の排出量が野生株に比べ
て少なく、かつ、これらの中間体又は基質の細胞内濃度
が野生株と同等又はそれ以上である株を選択することに
よって得られる。前記中間体又は基質の排出量が野生株
に比べて少ない変異株であっても、目的物質の生合成系
が完全でないものは、本発明に用いる微生物として好ま
しくない。変異処理としては、紫外線照射またはN−メ
チル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もし
くは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤に
よって微生物を処理する方法が挙げられる。

【００２１】また、本発明に用いる組換え株は、相同組
換えによる遺伝子破壊によって創製することができる。
例えば、排出系に関与する遺伝子（排出系遺伝子）の
５’末端部及び／又は３’末端部を欠失し、正常に機能
しないように改変した排出系遺伝子を含むＤＮＡで微生
物を形質転換し、正常に機能しない排出系遺伝子と染色
体上の排出系遺伝子との間で組換えを起こさせることに
より、染色体上の排出系遺伝子を破壊することができ
る。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立
しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起
点を含むプラスミドを用いる方法などによっても遺伝子
破壊を行うことができる。以下に温度感受性複製起点を
含むプラスミドを用いる方法を説明する。

【００２２】排出系遺伝子の内部を欠失し、正常に機能
しないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤ
ＮＡで微生物を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の
排出系遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、
染色体上の排出系遺伝子を破壊することができる。この
ような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立してお
り、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含
むプラスミドを用いる方法などがある。

【００２３】欠失型遺伝子を、宿主染色体上の排出系遺
伝子と置換するには以下のようにすればよい。すなわ
ち、温度感受性複製起点と欠失型遺伝子とクロラムフェ
ニコール等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入
して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡで微生物
を形質転換し、温度感受性複製起点が機能しない温度で
形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培
養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み
込まれた形質転換株が得られる。

【００２４】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在する排出系遺伝子配
列との組換えを起こし、染色体上の排出系遺伝子と欠失
型遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分
（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マー
カー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したが
って、この状態では正常な排出系遺伝子が優性であるの
で、形質転換株は排出系が機能する。

【００２５】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型遺伝子のみ
を残すために、２個の排出系遺伝子の組換えにより１コ
ピーの排出系遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常な排出系遺伝子が染色
体ＤＮＡ上に残され、欠失型遺伝子が切り出される場合
と、反対に欠失型遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正
常な排出系遺伝子が切り出される場合がある。いずれの
場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれ
ば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持
される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で
培養すると、欠失型遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された
場合は、正常な排出系遺伝子を含むプラスミドが細胞か
ら脱落するため排出系は機能しないが、正常な排出系遺
伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合は排出系が機能す
る。したがって、目的物質の生合成系の中間体又は基質
を要求する変異株を用い、同変異株の要求性の相補を指
標として、目的とする遺伝子破壊株を選択することがで
きる。

【００２６】上記のようにして得られる排出系遺伝子破
壊株は、温度感受性複製起点が機能する温度（例えば低
温）で培養すれば排出系遺伝子を細胞内に保持し、温度
感受性複製起点が機能しない温度（例えば高温）で培養
すれば排出系遺伝子を欠損する。

【００２７】尚、本発明に用いる微生物を構築した後
に、ｒｅｃＡ^-株にすると、低温で培養中にプラスミド
上の排出系遺伝子が染色体へ組み込まれるのを防ぎ、遺
伝子の脱落を確実にすることができる点で好ましい。

【００２８】排出系遺伝子として具体的には、α−ケト
グルタレートパーミアーゼ遺伝子が挙げられる。同遺伝
子は、エシェリヒア・コリではkgtPとして知られてお
り、その塩基配列も報告されている（例えば、Seol, W.
and Shatkin, A.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
8, 3802-3806 (1991)）。同遺伝子の塩基配列及びこの
塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を、配列
表の配列番号１及び２に示す。同遺伝子の塩基配列は、
DDBJ/EMBL/GenBankにaccession D90886として登録され
ている塩基配列に含まれている。

【００２９】エシェリヒア・コリのkgtP遺伝子は、例え
ば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配
列表の配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼ・チェイ
ン・ターミネーション法（ＰＣＲ：polymerase chain r
eaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185
(1989)参照）によって取得することができる。

【００３０】温度感受性プラスミドとしては、エシェリ
ヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌で機能するものとし
ては、ｐＨＳＧ４１５及びｐＨＳＧ４２２（Hashimoto-
Gotoh, T. et al, Gene, 16, 227-235 (1981)）が、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型
細菌で機能するものとしては、ｐＨＳ４、ｐＨＳ２２、
ｐＨＳ２３が挙げられる。また、ｐＨＳ４から切り出し
たコリネ型細菌由来の複製起点を含むＤＮＡ断片を、エ
シェリヒア・コリ用のベクターであるｐＨＳＧ３９８に
接続して得られたプラスミドｐＨＳＣ４も、同様に温度
感受性プラスミドとして本発明に使用することができ
る。ｐＨＳＣ４は、コリネ型細菌、及びエシェリヒア・
コリ中で自律増殖して、宿主にクロラムフェニコール耐
性を付与する。ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒア・コ
リＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥ
ＲＭＰ−１１７６３として寄託され、１９９１年８月２
６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３５２４の受託番号で寄託されている。

【００３１】これらの温度感受性プラスミドはコリネ型
細菌細胞中において、約１０〜３２℃では自律増殖でき
るが、約３４℃以上では自律増殖できない。温度感受性
複製起点を有するＤＮＡ断片は、例えば上記ｐＨＳＣ４
をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切り出すことによって得られ
る。

【００３２】尚、上記の各々のプラスミドの構築及びそ
の温度感受性複製起点を含む領域の塩基配列は、特公平
７−１０８２２８号公報に記載されている。染色体ＤＮ
Ａの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣＲ、
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質
転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設
定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を
採用することができる。これらの方法は、Sambrook,
J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular C
loning A Laboratory Manual, Second Edition", ColdS
pring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されて
いる。

【００３３】上記のようにして得られる排出系遺伝子が
破壊された微生物は、目的物質の生合成系の中間体又は
基質の細胞外への排出量が減少するので、目的物質の生
合成に供給される中間体又は基質の量が多くなり、その
結果、目的物質の生産量が上昇する。

【００３４】本発明の微生物は、本発明の効果が損なわ
れない限り、目的物質の生合成系の中間体又は基質の排
出量が低下していることに加えて、目的物質の生合成系
酵素が増強されているなど、他の性質が付与されていて
もよい。目的物質の生合成系酵素としては、例えば目的
物質がＬ−グルタミン酸である場合には、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミ
ン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコ
ニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン
酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホ
スホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等があ
る。

【００３５】また、本発明の微生物は、目的物質の生合
成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損していても
よい。例えば、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合
には、前記酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロ
ゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラン
スフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン
酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ
等が挙げられる。

【００３６】さらに、本発明の微生物は、目的物質の生
産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよい。
例えば目的物質がＬ−グルタミン酸であり、微生物がコ
リネ型細菌である場合には、界面活性剤等のビオチン作
用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することによ
り、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作
用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させる
ことができる（WO96/06180号参照）。

【００３７】上記のようにして目的物質の生産能が向上
した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生
成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することに
より、目的物質を製造することができる。培養に用いる
培地や培養条件は、用いる宿主に応じて適宜選択すれば
よい。

【００３８】上記のようにして製造される目的物質は、
必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の目的物質の精製
法を用いて精製することができる。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４０】＜１＞エシェリヒア・コリＬ−グルタミン
酸生産菌のkgtP遺伝子破壊株の創製 E. coli K12株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の方法
（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製し
た。一方、公知のkgtP遺伝子の塩基配列に基づいて、配
列番号３及び４に示す配列を有する２種のプライマーを
作製した。これらを用いてＰＣＲ反応を行い、kgtP遺伝
子の増幅を行った。得られたＤＮＡを、ベクターpHSG39
9（宝酒造(株)製）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドp3
99KGTPを得た。

【００４１】上記プラスミドp399KGTPを制限酵素SphI及
びNheIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末化し
た後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてセルフライゲーショ
ンを行い、kgtP遺伝子の内部を欠失させ、p399ΔKGTPを
得た。次に、p399ΔKGTPの欠失型kgtP遺伝子を、エシェ
リヒア・コリで自律複製可能なプラスミドから取得した
自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を持
つプラスミドpHSG415（Hashimoto-Gotoh, T. et al, Ge
ne, 16, 227-235 (1981)）に導入した。具体的には、p3
99ΔKGTPをEcoRIで消化し、得られた欠失型kgtP遺伝子
を含む断片を、プラスミドpHSG415のEsoRI部位に導入
し、プラスミドp415ΔKGTPを作製した。

【００４２】このプラスミドを用いて、エシェリヒア・
コリのＬ−グルタミン酸生産菌であるエシェリヒア・コ
リAJ13199株を形質転換し、染色体上のkgtP遺伝子を欠
失型に置換した。具体的には、プラスミドが導入された
AJ13199／p415ΔKGTPをＬＢ培地（バクトトリプトン10
g、バクトイーストエクストラクト5g、NaCl 5gを１Ｌの
水に含む）で２５℃にて６時間振とう培養した後、２５
μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に撒
き、４２℃で培養して形成したコロニーをプラスミド組
み込み株として取得した。次に、この株から４２℃でカ
ナマイシンに対して感受性になった株をレプリカ法によ
り取得した。この感受性株から染色体上のkgtP遺伝子の
塩基配列を調べ、同遺伝子が欠失型に置換されているこ
とを確認し、これをΔkgtP株と命名した。前記エシェリ
ヒア・コリAJ13199株（特開平7-203980号参照）は、Ｄ
Ｌ−アスパラギン酸βヒドロキサメート耐性株であり、
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FE
RMP-15573として寄託されている。

【００４３】＜２＞kgtP遺伝子破壊株の培養液中のα−
ケトグルタル酸の測定 AJ13199株及びΔkgtP株を、グルタミン酸生産培地（組
成：グルコース４０．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム（別
殺菌）１．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０．０ｇ／
Ｌ、リン酸２水素カリウム１．０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７
水和物１０．０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン５水和物１０．
０ｍｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト２．０ｇ／
Ｌ、チアミン塩酸塩１０．０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム
（乾熱殺菌）５０．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０（ＫＣｌで調
整））で３７℃、４０時間培養し、培地中のα−ケトグ
ルタル酸の量を、旭化成（株）製バイオテックアナライ
ザーAS210により測定した。結果を表２に示す。

【００４４】

【表２】 ───────────────────── 菌株 α−ケトグルタル酸（g/L） ───────────────────── AJ13199 ３．０ ΔkgtP ０．５ ─────────────────────

【００４５】＜３＞kgtP破壊株によるＬ−グルタミン酸
の生産 AJ13199株及びΔkgtP株を、グルタミン酸生産培地で３
７℃、４０時間培養し、培地中のＬ−グルタミン酸の量
を、旭化成（株）製バイオテックアナライザーAS-210に
より測定した。結果を表３に示す。

【００４６】

【表３】 ───────────────────── 菌株Ｌ−グルタミン酸（g/L） ───────────────────── AJ13199 １９．８ ΔkgtP ２１．５ ─────────────────────

【００４７】

【発明の効果】本発明により、目的物質の生合成系の中
間体又は基質の細胞中への排出量を減少させることがで
き、その結果、目的物質の生産性を向上させることがで
きる。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法による目的物質の製造法 <130> P-6237 <141> 1999-07-19 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００４９】 <210> 1 <211> 1560 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (193)..(1488) <400> 1 ttgcccactt ccatacgtgt cctccttacc agaaatttat ccttaagctc ctcaataacc 60 attttcctgc taactaaatt catggttaag gttgcataat gatatgcaac aaatgtataa 120 tatttccttt acaaaaaaaa taaacaaaag cgaccgacaa aagcatcgga ttacggcagg 180 agacataatg gc atg gct gaa agt act gta acg gca gac agc aaa ctg aca 231 Met Ala Glu Ser Thr Val Thr Ala Asp Ser Lys Leu Thr 1 5 10 agt agt gat act cgt cgc cgc att tgg gcg att gtg ggg gcc tct tca 279 Ser Ser Asp Thr Arg Arg Arg Ile Trp Ala Ile Val Gly Ala Ser Ser 15 20 25 ggt aat ctg gtc gag tgg ttc gat ttc tat gtc tac tcg ttc tgt tca 327 Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Phe Cys Ser 30 35 40 45 ctc tac ttt gcc cac atc ttc ttc cct tcc ggg aac acg acg act caa 375 Leu Tyr Phe Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr Thr Thr Gln 50 55 60 cta cta caa aca gca ggt gtt ttt gct gcg gga ttc ctg atg cgc cca 423 Leu Leu Gln Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu Met Arg Pro 65 70 75 ata ggc ggt tgg cta ttt ggc cgc ata gcc gat aaa cat ggt cgc aaa 471 Ile Gly Gly Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Lys His Gly Arg Lys 80 85 90 aaa tcg atg ctg tta tcg gtg tgt atg atg tgt ttc gga tcg ctg gtt 519 Lys Ser Met Leu Leu Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly Ser Leu Val 95 100 105 atc gcc tgc ctc cca ggt tat gaa act ata ggt acg tgg gct ccg gca 567 Ile Ala Cys Leu Pro Gly Tyr Glu Thr Ile Gly Thr Trp Ala Pro Ala 110 115 120 125 tta ttg ctt ctc gct cgt tta ttt cag gga tta tct gtt ggc gga gaa 615 Leu Leu Leu Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val Gly Gly Glu 130 135 140 tat ggc acc agc gcc acc tat atg agt gaa gtt gcc gtt gaa ggg cgc 663 Tyr Gly Thr Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Val Ala Val Glu Gly Arg 145 150 155 aaa ggt ttt tac gca tca ttt cag tat gtg acg ttg atc ggc gga caa 711 Lys Gly Phe Tyr Ala Ser Phe Gln Tyr Val Thr Leu Ile Gly Gly Gln 160 165 170 ctg cta gcc cta ctg gtt gtc gtg gtt tta caa cac acc atg gaa gac 759 Leu Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Leu Gln His Thr Met Glu Asp 175 180 185 gct gca ctc aga gag tgg gga tgg cgt att cct ttc gcg tta gga gct 807 Ala Ala Leu Arg Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala Leu Gly Ala 190 195 200 205 gtg tta gct gtt gtg gcg ttg tgg tta cgt cgt cag tta gat gaa act 855 Val Leu Ala Val Val Ala Leu Trp Leu Arg Arg Gln Leu Asp Glu Thr 210 215 220 tcg caa caa gaa acg cgc gct tta aaa gaa gct gga tct ctg aaa gga 903 Ser Gln Gln Glu Thr Arg Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Leu Lys Gly 225 230 235 tta tgg cgc aat cgc cgt gca ttc atc atg gtt ctc ggt ttt acc gct 951 Leu Trp Arg Asn Arg Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Gly Phe Thr Ala 240 245 250 gcg ggc tcc ctt tgt ttc tat acc ttc act act tat atg cag aag tat 999 Ala Gly Ser Leu Cys Phe Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Met Gln Lys Tyr 255 260 265 ctg gta aat act gcg gga atg cat gcc aac gtg gcg agt ggc att atg 1047 Leu Val Asn Thr Ala Gly Met His Ala Asn Val Ala Ser Gly Ile Met 270 275 280 285 act gcc gca ttg ttt gta ttc atg ctt att caa cca ctc att ggc gcg 1095 Thr Ala Ala Leu Phe Val Phe Met Leu Ile Gln Pro Leu Ile Gly Ala 290 295 300 ctg tcg gat aag att ggt cgc cgt acc tca atg tta tgt ttc ggt tcg 1143 Leu Ser Asp Lys Ile Gly Arg Arg Thr Ser Met Leu Cys Phe Gly Ser 305 310 315 ctg gca gcc att ttt acc gtt cct att ctc tca gca ttg caa aac gtt 1191 Leu Ala Ala Ile Phe Thr Val Pro Ile Leu Ser Ala Leu Gln Asn Val 320 325 330 tcc tcg cct tat gcc gct ttt ggt ctg gtg atg tgt gcc ctg ctg ata 1239 Ser Ser Pro Tyr Ala Ala Phe Gly Leu Val Met Cys Ala Leu Leu Ile 335 340 345 gtg agt ttt tat aca tca atc agt gga ata ctg aag gct gag atg ttc 1287 Val Ser Phe Tyr Thr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Lys Ala Glu Met Phe 350 355 360 365 ccg gca cag gtt cgc gca tta ggc gtt ggt ctg tca tat gcg gtc gct 1335 Pro Ala Gln Val Arg Ala Leu Gly Val Gly Leu Ser Tyr Ala Val Ala 370 375 380 aat gct ata ttt ggt ggt tcg gcg gag tac gta gcg ttg tcg ctg aaa 1383 Asn Ala Ile Phe Gly Gly Ser Ala Glu Tyr Val Ala Leu Ser Leu Lys 385 390 395 tca ata gga atg gaa aca gcc ttc ttc tgg tat gtg acc ttg atg gcc 1431 Ser Ile Gly Met Glu Thr Ala Phe Phe Trp Tyr Val Thr Leu Met Ala 400 405 410 gtg gtg gcg ttt ctg gtt tct ttg atg cta cat cgc aaa ggg aag ggg 1479 Val Val Ala Phe Leu Val Ser Leu Met Leu His Arg Lys Gly Lys Gly 415 420 425 atg cgt ctt tagtgacggg tcagttgcca gacggtatag ccggtgcttg 1528 Met Arg Leu 430 caccggcgac atcccaggcc aaatccttcc ag 1560

【００５０】 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ala Glu Ser Thr Val Thr Ala Asp Ser Lys Leu Thr Ser Ser Asp 1 5 10 15 Thr Arg Arg Arg Ile Trp Ala Ile Val Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu 20 25 30 Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Phe Cys Ser Leu Tyr Phe 35 40 45 Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr Thr Thr Gln Leu Leu Gln 50 55 60 Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu Met Arg Pro Ile Gly Gly 65 70 75 80 Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Lys His Gly Arg Lys Lys Ser Met 85 90 95 Leu Leu Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly Ser Leu Val Ile Ala Cys 100 105 110 Leu Pro Gly Tyr Glu Thr Ile Gly Thr Trp Ala Pro Ala Leu Leu Leu 115 120 125 Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val Gly Gly Glu Tyr Gly Thr 130 135 140 Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Val Ala Val Glu Gly Arg Lys Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Ala Ser Phe Gln Tyr Val Thr Leu Ile Gly Gly Gln Leu Leu Ala 165 170 175 Leu Leu Val Val Val Val Leu Gln His Thr Met Glu Asp Ala Ala Leu 180 185 190 Arg Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala Leu Gly Ala Val Leu Ala 195 200 205 Val Val Ala Leu Trp Leu Arg Arg Gln Leu Asp Glu Thr Ser Gln Gln 210 215 220 Glu Thr Arg Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Leu Lys Gly Leu Trp Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Gly Phe Thr Ala Ala Gly Ser 245 250 255 Leu Cys Phe Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Met Gln Lys Tyr Leu Val Asn 260 265 270 Thr Ala Gly Met His Ala Asn Val Ala Ser Gly Ile Met Thr Ala Ala 275 280 285 Leu Phe Val Phe Met Leu Ile Gln Pro Leu Ile Gly Ala Leu Ser Asp 290 295 300 Lys Ile Gly Arg Arg Thr Ser Met Leu Cys Phe Gly Ser Leu Ala Ala 305 310 315 320 Ile Phe Thr Val Pro Ile Leu Ser Ala Leu Gln Asn Val Ser Ser Pro 325 330 335 Tyr Ala Ala Phe Gly Leu Val Met Cys Ala Leu Leu Ile Val Ser Phe 340 345 350 Tyr Thr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Lys Ala Glu Met Phe Pro Ala Gln 355 360 365 Val Arg Ala Leu Gly Val Gly Leu Ser Tyr Ala Val Ala Asn Ala Ile 370 375 380 Phe Gly Gly Ser Ala Glu Tyr Val Ala Leu Ser Leu Lys Ser Ile Gly 385 390 395 400 Met Glu Thr Ala Phe Phe Trp Tyr Val Thr Leu Met Ala Val Val Ala 405 410 415 Phe Leu Val Ser Leu Met Leu His Arg Lys Gly Lys Gly Met Arg Leu 420 425 430

【００５１】 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 gcgcgaattc attttcctgc taactaaa 28

【００５２】 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 gcgcgaattc ctggaaggat ttggcctg 28

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【整理番号】Ｐ−６２３７ＪＨ

【提出日】平成１１年８月２３日

【旧寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】微工研菌寄第ＦＥＲＭＰ−１
５５７３

【新寄託機関の名称】通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−５８０７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者倉橋修神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社発酵技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA74 BA80 CA04 DA06 GA11 HA01 4B064 AE19 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC20 BA02 CA17

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取
する、微生物を利用した目的物質の製造法において、前
記微生物は目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出
量が低下した変異株又は組換え株であることを特徴とす
る方法。
【請求項２】前記微生物は、目的物質の生合成系の中
間体又は基質の排出系が欠損又は弱化したものである請
求項１記載の方法。
【請求項３】前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求
項１記載の方法。
【請求項４】前記目的物質がＬ−グルタミン酸であ
り、その生合成系の中間体又は基質がα−ケトグルタル
酸である請求項３記載の方法。
【請求項５】前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコ
リネ型細菌である請求項１記載の方法。
【請求項６】前記微生物のα−ケトグルタレートパー
ミアーゼ遺伝子の変異又は破壊により目的物質の生合成
系の中間体又は基質の排出系が欠損又は弱化した請求項
４記載の方法。