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JP2003159048A - γ−グルタミルシステイン産生酵母とそのスクリーニング法 - Google Patents

γ−グルタミルシステイン産生酵母とそのスクリーニング法

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JP2003159048A
JP2003159048A JP2001359781A JP2001359781A JP2003159048A JP 2003159048 A JP2003159048 A JP 2003159048A JP 2001359781 A JP2001359781 A JP 2001359781A JP 2001359781 A JP2001359781 A JP 2001359781A JP 2003159048 A JP2003159048 A JP 2003159048A
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JP
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strain
yeast
glutamylcysteine
mnng
yeast strain
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Application number
JP2001359781A
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English (en)
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Hiroaki Nishiuchi
博章 西内
Mariko Suehiro
真理子 末広
Reiko Sugimoto
玲子 杉本
Yasushi Nishimura
康史 西村
Motohisa Kuroda
素央 黒田
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 グルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、
γ−グルタミルシステインを産生する酵母菌株、及び、
同酵母菌株の簡便なスクリーニング方法、並びに、同酵
母菌株を利用したγ−グルタミルシステイン含有食品を
提供する。 【解決手段】 下記の各ステップにより、グルタチオン
合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシステイ
ン産生能を有する酵母菌株をスクリーニングする： （ａ）酵母の集団から、一定の濃度範囲のＭＮＮＧに対
する耐性を有する酵母菌株を選択し、（ｂ）選択された
菌株からグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ
−グルタミルシステイン産生能を有する菌株を選択す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、γ−グルタミルシ
ステインを産生する酵母菌株とそのスクリーニング法、
及び同酵母菌株の菌体を利用した食品に関するものであ
る。γ−グルタミルシステイン、及びそれから製造され
るシステインは、食品分野で有用である。
【０００２】
【従来の技術】システインは、食品の風味改善などを目
的に用いられている。システインの製法については蛋白
分解法や半合成法などが知られているが、現在主に用い
られている方法は蛋白分解法と半合成法である。システ
インを食品の風味改善に用いることを目的として、シス
テイン含量の高い天然食品素材が求められているが、そ
のような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかっ
た。一方、γ−グルタミルシステインを含む酵母エキス
を加熱または酵素処理すれば、システインを高含有する
食品素材を得ることが可能であると報告されている（WO
00/30474）。
【０００３】γ−グルタミルシステインは、γ−グルタ
ミルシステイン合成酵素の働きによりシステインとグル
タミン酸を基質にして合成される。また、グルタチオン
はグルタチオン合成酵素の働きによりγ−グルタミルシ
ステインとグリシンを基質にして合成される。グルタチ
オン合成酵素遺伝子を破壊した酵母は、γ−グルタミル
システインを蓄積することが報告されている（Ohtake,
Y. et al., Agric. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150,
1990）。
【０００４】グルタチオン合成酵素活性を喪失した酵母
のスクリーニング方法として、メチルグリオキサール感
受性を指標とした知られている（Ohtake, Y. et al., A
gri.Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990）。この報
告によると、３００個のメチルグリオキサール感受性株
の中から、グルタチオンを産生できない１２株が選択さ
れた。更に解析を行った結果、８株はγ−グルタミルシ
ステイン合成酵素変異株であり、残り４株はグルタチオ
ン合成酵素変異株であったと述べられている。このスク
リーニング方法では、メチルグリオキサール感受性株７
５株のうち１株は、グルタチオン合成酵素の活性変異株
であったので、一見するとγ−グルタミルシステイン高
蓄積酵母の簡便なスクリーニング方法であるように思わ
れる。しかし、何株の変異酵母から前記３００株のメチ
ルグリオキサール感受性酵母が選別されたか記載されて
いないので、メチルグリオキサール感受性を指標にした
スクリーニング法は、γ−グルタミルシステイン高含有
酵母の簡便なスクリーニング法であるとはいえない。更
に、メチルグリオキサール感受性を指標にする場合は、
レプリカという煩雑な操作が必要となるので、この点か
らも、到底簡便なスクリーニング方法とはいえない。
【０００５】ところで、グルタチオン欠損株をスクリー
ニング方法としてＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン）耐性を利用する方法が知ら
れている（Kistler, M. et al., Mutation Research, 1
73 (1986) 117-120; Kistler, M. et al., Mutagenesi
s, 5(1) 39-44, 1990）が、それによると得られた酵母
はいずれもγ−グルタミルシステイン合成酵素を欠損し
ており、グルタチオン合成酵素活性が低下した株は得ら
れていない。また、グルタチオン欠損株をスクリーニン
グする他の方法として、ニトロプルシドナトリウムを利
用する方法も知られているが、やはり得られた酵母はす
べてγ−グルタミルシステイン合成酵素変異株であった
と報告している（Kistler, M. et al., Mutagenesis, 5
(1) 39-44,1990）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の技術
背景の下に、グルタチオン合成酵素活性が弱化し、か
つ、γ−グルタミルシステインを産生する酵母菌株、及
び、同酵母菌株の簡便なスクリーニング方法、並びに、
同酵母菌株を利用したγ−グルタミルシステイン含有食
品を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、一定濃度のＭ
ＮＮＧに対する耐性を指標とすることにより、グルタチ
オン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシス
テイン産生能を有する菌株を効率よく選択することがで
きることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）ＭＮＮＧ耐性を有し、かつ、γ−グルタミルシス
テインを産生する酵母菌株。 （２）液体培地で前培養した酵母菌株を集菌し、６６０
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ660）が０．１となるように
３０μｇ／ｍｌのＭＮＮＧを含むＹＰＤ培地（ＭＮＮＧ
含有培地）及びＭＮＮＧを含まないＹＰＤ培地（ＭＮＮ
Ｇ非含有培地）に植菌し、それぞれ好適な温度で静置培
養したとき、下記式で算出される生育度が０．０３以上
である、(1)の酵母菌株。
【０００９】
【数２】
【００１０】（３）グルタチオン合成酵素活性が弱化し
た(1)又は(2)の酵母菌株。 （４）ＳＤ培地で培養したとき、対数増殖期の乾燥菌体
当たりのγ−グルタミルシステイン含量が１重量％以上
である(1)〜(3)のいずれかの酵母菌株。 （５）２倍性またはそれ以上の倍数性を有する(1)〜(4)
のいずれかの酵母菌株。 （６）サッカロマイセス属又はキャンディダ属に属する
(1)〜(5)のいずれかの酵母菌株。 （７）下記の各ステップを含む、グルタチオン合成酵素
活性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシステイン産生能
を有する酵母菌株のスクリーニング法： （ａ）酵母の集団から、一定の濃度範囲のＭＮＮＧに対
する耐性を有する酵母菌株を選択し、（ｂ）選択された
菌株からグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ
−グルタミルシステイン産生能を有する菌株を選択す
る。 （８）前記ステップ（ａ）において、前記酵母の集団
を、酵母親株を突然変異処理することにより調製する
(7)の方法。 （９）前記ステップ（ａ）において、一定の濃度範囲の
ＭＮＮＧに耐性を有する酵母菌株を、ＭＮＮＧの濃度勾
配が形成された寒天培地を用いて選択する、(7)又は(8)
の方法。 （１０）前記ステップ（ａ）において、既に分離された
グルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタ
ミルシステイン産生能を有する酵母モデル菌株を用意
し、同モデル菌株と同程度のＭＮＮＧ耐性を有する酵母
菌株を選択する、(7)〜(9)のいずれかに記載の方法。 （１１）(1)〜(6)のいずれかの酵母菌株を好適な条件で
培養して得られる培養物、もしくはγ−グルタミルシス
テインを含む前記培養物の分画物、又は熱処理によって
システインが生成したこれらの培養物もしくは分画物を
含む飲食品。 （１２）飲食品がアルコール飲料、パン食品、又は発酵
食品調味料である(11)の飲食品。 （１３）(1)〜(6)のいずれかの酵母菌株を好適な条件で
培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキ
ス。 （１４）(1)〜(6)のいずれかの酵母菌株を好適な条件で
培養し、得られる培養物もしくはその分画物、又は加熱
処理した前記培養物又は分画物を、飲食品原料に混合
し、飲食品に加工することを特徴とする、γ−グルタミ
ルシステイン又はシステイン含有食品の製造法。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵母菌株は、MNNG耐性を有し、かつ、γ−グル
タミルシステインを産生する菌株である。
【００１２】本発明において「MNNG耐性を有する」と
は、ある濃度のMNNG存在下で野生株よりも生育がよいこ
とを意味するが、MNNG存在下とMNNG非存在下とで、同程
度の生育を示すことを要しない。言い換えれば、MNNG非
存在下に比べてMNNG存在下では生育が悪くても、MNNG存
在下で野生株よりも生育が良ければ、MNNG耐性を有す
る。典型的には、「MNNG耐性を有する」とは、液体培地
で前培養した酵母菌株を、660nmにおける吸光度（O
D660）が0.1となるように30μg/mlのMNNGを含むYPD培地
（MNNG含有培地）及びMNNGを含まないYPD培地（MNNG非
含有培地）で、それぞれ好適な温度で静置培養したと
き、下記式で算出される生育度が0.03以上、好ましくは
0.04以上、より好ましくは0.05以上であることをいう。
【００１３】
【数３】
【００１４】また、MNNG濃度が30μg/mlの代わりに60μ
g/mlであるMNNG含有培地を用いることを除いて、上記と
同様にして算出される生育度が0.015以上、好ましくは
0.02以上、より好ましくは0.025以上である酵母菌株
は、MNNG耐性を有する。尚、MNNG耐性が高すぎると、γ
−グルタミルシステイン合成酵素を欠損している可能性
が高くなるので、MNNG耐性は必要以上に高すぎないこと
が好ましい。具体的には、例えば、MNNG濃度が30μg/ml
のときに、生育度が1.0以下、好ましくは0.2以下、より
好ましくは0.075以下であることが望ましい。
【００１５】前記前培養に用いる培地としては、YPD培
地が挙げられる。また、前培養は振盪培養でも静置培養
でもよいが、振盪培養が好ましい。本培養に用いる培地
としてはYPD培地が挙げられる。本培養は振盪培養でも
静置培養でもよいが、静置培養が好ましい。
【００１６】培養に好適な温度は、酵母の種類又は菌株
によって異なるが、適当な培地、例えばYPD培地に酵母
を植菌し、種々の温度で培養して、増殖が良好である温
度範囲を調べることによって、決定することができる。
例えば、サッカロマイセス・セレビシエは、通常３０℃
付近が好適である。また、培養時間は、特に制限されな
いが、対数増殖期を越えない培養期、好ましくは対数増
殖期の中期〜後期まで培養することが好ましい。具体的
には、通常、２０〜４０時間程度である。
【００１７】本発明において「γ−グルタミルシステイ
ンを産生する」とは、酵母野生株よりも多量のγ−グル
タミルシステインを菌体内に蓄積することをいい、好ま
しくは、酵母菌株をSD培地で培養したとき、その対数増
殖期に乾燥酵母菌体当たり1%以上のγ−グルタミルシス
テインを蓄積することをいい、より好ましくは1.5%以上
のγ−グルタミルシステインを蓄積することをいい、特
に好ましくはγ−グルタミルシステインを蓄積し、か
つ、グルタチオンの蓄積量が0.1%以下であることをい
う。γ−グルタミルシステイン又はグルタチオンの蓄積
量は、菌体の固形成分、例えば、105℃で４時間加熱し
た後の菌体重量に対するγ−グルタミルシステイン又は
グルタチオンの含有量（％）をいう。また、「対数増殖
期」とは、培養中における酵母の細胞数が培養時間に対
して対数的に増加する時期をいう。
【００１８】尚、上記のγ−グルタミルシステインの蓄
積量は、対数増殖期のすべてにわたって維持される必要
はなく、少なくとも対数増殖期の任意の時点において、
好ましくは、対数増殖期の次に述べる状態で、上記の値
を示せばよい。即ち、前記状態とは、対数増殖期から定
常状態になったときの培養液の吸光度の１／２以上の吸
光度を有する対数増殖期である。YPD培地及びSD培地の
組成は、以下のとおりである。
【００１９】〔YPD培地組成〕 グルコース ２％ ペプトン １％ 酵母エキス ０．５％(pH5.0)
【００２０】〔SD培地組成〕 グルコース ２％ Nitrogen Base １倍濃度 （10倍濃度Nitrogen Baseは、1.7gのBacto Yeast Nitro
gen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Dif
co社)と5gの硫酸アンモニウムを混合したものを100mlの
滅菌水に溶解し、pHを5.2程度に調整し、フィルター濾
過滅菌したもの）
【００２１】本発明の酵母としては、γ−グルタミルシ
ステインを生産することができるものであれば特に制限
されないが、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエ
等のサッカロマイセス属、キャンディダ・ユティリス等
のキャンディダ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ等の
シゾサッカロマイセス属等に属する酵母が挙げられる。
また、本発明の酵母菌株は、２倍性またはそれ以上の倍
数性を有することが、生育が良好である点で好ましい。
２倍性またはそれ以上の倍数性を有する酵母は、それら
を変異処理しγ−グルタミルシステインを産生する株を
選択すること、或いはγ−グルタミルシステイン産生株
の育種に用いた１倍体酵母と、野生型グルタチオン合成
酵素保持株の１倍体を接合させ、得られた２倍体酵母を
胞子形成させることにより、グルタチオン合成酵素活性
が弱化し、γ−グルタミルシステインを産生する株を選
択し、相異なる接合型を有するγ−グルタミルシステイ
ン産生１倍体酵母２株を接合させることによって、取得
することができる。同様にして、３倍性又はそれ以上の
倍数性を有する酵母を取得することができる。
【００２２】上述したように、本発明の酵母菌株は、MN
NG耐性を有し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生
する。このような酵母菌株は、γ−グルタミルシステイ
ン合成酵素活性は欠損しておらず、かつ、グルタチオン
合成酵素活性は弱化している。その結果、γ−グルタミ
ルシステインを菌体内に蓄積する。尚、「グルタチオン
合成酵素活性が弱化した」とは、本発明の酵母菌株のグ
ルタチオン合成酵素活性が野生株の同活性に比べて低い
ことを意味し、同活性を欠損している場合も含まれる。
しかし、本発明の酵母菌株は、グルタチオン合成酵素活
性が欠損しているよりも、野生株より低い活性を保持し
ている方が好ましい。
【００２３】上記のような酵母菌株は、下記工程によっ
て、スクリーニングすることができる。 （ａ）酵母の集団から、一定の濃度範囲のMNNGに対する
耐性を有する酵母菌株を選択し、（ｂ）選択された菌株
からグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グ
ルタミルシステイン産生能を有する菌株を選択する。
【００２４】一定の濃度範囲のMNNGに耐性を有する酵母
菌株は、例えば、種々の濃度のMNNGを含有する液体培地
又は寒天培地で酵母を培養し、生育を調べることによっ
て、選択することができる。野生株に比べて生育がよい
株は、MNNG耐性を有する。また、MNNGの濃度勾配が形成
された寒天培地を用いて選択してもよい。MNNGの濃度勾
配は、寒天培地上にMNNG溶液、例えば1〜30mg/mlのMNNG
溶液を染み込ませたディスクを置くことによって、形成
させることができる。ディスクから遠ざかるにつれて、
培地中のMNNG濃度が低くなる。したがって、選択対象で
ある酵母の集団を寒天培地にまき、ディスクを培地の中
央に置いた後培養すると、多数の酵母について、種々の
濃度のMNNGに対する耐性を調べることができる。培地に
まく酵母の接種量は、出現するコロニーが互いに接触し
ないような量であることが好ましく、具体的にはプレー
ト当たり１００〜２００程度が好ましい。
【００２５】「一定の濃度範囲のMNNGに対する耐性を有
する」とは、ある濃度のMNNG存在下では野生株よりも生
育がよいが、それよりも高い濃度のMNNG存在下では生育
できないことをいう。このように、MNNG耐性が高すぎ
ず、適度なMNNG耐性を有する菌株を選択することによっ
て、γ−グルタミルシステイン合成酵素を欠損せず、か
つ、グルタチオン合成酵素活性が弱化した菌株を効率良
く選択することができる。一定の濃度範囲のMNNGに対す
る耐性を有する酵母菌株は、MNNGの濃度勾配が形成され
た寒天培地上では、ディスクから一定の距離の位置にコ
ロニーを形成する。尚、選択される酵母菌株が耐性を示
すMNNGの濃度は、必ずしも同定する必要はなく、例えば
寒天培地上のディスクからの距離のような相対値であっ
てもよい。
【００２６】好ましい濃度範囲のMNNGに耐性を有する酵
母菌株は、既に分離されたグルタチオン合成酵素活性が
弱化し、かつ、γ−グルタミルシステイン産生能を有す
る酵母菌株をモデル菌株として用意し、モデル菌株と同
程度のMNNG耐性を有する酵母菌株を選択することによっ
て、取得することができる。MNNGの濃度勾配が形成され
た寒天培地を用いる場合は、ディスクとコロニーとの距
離がモデル菌株と同程度である菌株を選択する。このよ
うにモデル菌株を対照に用いることによって、酵母の集
団から、γ−グルタミルシステイン合成酵素活性は欠損
しておらず、かつ、グルタチオン合成酵素活性は野生株
に比べて弱化している酵母菌株を効率よく選択すること
ができる。
【００２７】モデル菌株としては、実施例に記載され
る、染色体上のグルタチオン合成酵素遺伝子によってコ
ードされるグルタチオン合成酵素が、３７０位のアルギ
ニン残基以降のＣ末端側の領域を欠失しているサッカロ
マイセス・セレビシエNα３株が挙げられる。同株は、
グルタチオン合成酵素活性が弱化している。また、グル
タチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミル
システイン産生能を有する酵母菌株が一旦得られれば、
同菌株のMNNG耐性を示すMNNGの濃度を指標として、モデ
ル菌株を用いずに選択を行うことができる。
【００２８】「酵母の集団」とは、属又は種が異なる複
数の酵母を含む集団であってもよいし、種々の変異株を
含む同種の酵母の集団であってもよい。また、選択され
る酵母菌株は、人為的な突然変異処理を施された菌株で
もよいし、自然突然変異株であってもよい。酵母の集団
は、好ましくは、酵母の野生株又は適当な変異を有する
変異株を親株として、これを突然変異処理することによ
り、調製される。また、酵母の集団は、特定の変異又は
ランダムな変異を導入したグルタチオン合成酵素遺伝子
を導入した酵母形質転換体であってもよい。
【００２９】上記のような突然変異処理と、スクリーニ
ング工程を組み合わせることにより、本発明の酵母菌株
を創出することができる。突然変異処理としては、紫外
線照射、または、MNNG、エチルメタンスルフォネート
（EMS）、メチルメタンスルフォネート（MMS）等の通常
変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法
が挙げられる。
【００３０】上記のようにして選択された菌株から、グ
ルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミ
ルシステイン産生能を有する菌株を選択する。また、選
択された菌株のγ−グルタミルシステイン合成酵素活性
を測定し、同酵素活性を保持していることを確認してお
くことが好ましい。γ−グルタミルシステイン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素性は、それぞれ、Jackso
nの方法（Jackson, R.C., Biochem. J., 111, 309 (196
9)）、及びGushimaらの方法（Gushima, T. etal., J. A
ppl. Biochem., 5, 210 (1983)）によって測定すること
ができる。また、γ−グルタミルシステインの産生を調
べることによっても、γ−グルタミルシステイン合成酵
素活性を保持し、かつ、グルタチオン合成酵素活性が弱
化していることを確認することができる。また、グルタ
チオンを含有しない培地での生育を調べることによっ
て、グルタチオン合成酵素活性が弱化しているか、欠損
していることか確認することができる。
【００３１】上記のようにして得られるγ−グルタミル
システインを産生する酵母菌株を好適な条件で培養して
得られた培養物は、γ−グルタミルシステインを含有す
る。このような培養物又はその分画物は、γ−グルタミ
ルシステインを含有する。培養物は、酵母菌体を含む培
養液であってもよいし、それから採取された酵母菌体、
菌体破砕物、又は菌体抽出物（酵母エキス）であっても
よい。菌体破砕物又は酵母エキスから、γ−グルタミル
システインを含む画分を得てもよい。
【００３２】上記γ−グルタミルシステインを含む培養
物又はその分画物を加熱することにより、γ−グルタミ
ルシステインからシステインを遊離させることができ
る。培養に用いる培地は、本発明の酵母菌株が良好に生
育し、かつ、γ−グルタミルシステインを効率よく産生
するものであれば特に制限されない。特に、グルタチオ
ン合成酵素活性が弱化しているが、同活性を喪失してい
ない酵母菌株は、グルタチオンを含まない培地でも良好
に生育することができるので、通常、工業的に用いられ
る培地を用いることができる。尚、必要に応じて、用い
る菌株の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加す
る。
【００３３】培養条件及び酵母エキス等の調製は、通常
の酵母の培養、及び酵母エキスの調製尚と同様にして行
えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したもの
を処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを
処理したものでもよい。
【００３４】上記γ−グルタミルシステイン又はシステ
インを含む培養物又はその分画物は、飲食品の製造に用
いることができる。飲食品としては、アルコール飲料、
パン食品、又は発酵食品調味料が挙げられる。熱処理に
よるγ−グルタミルシステインからシステインの生成
は、飲食品の製造中、又は製造の後に行われてもよい。
上記飲食品は、γ−グルタミルシステイン又はシステイ
ンを含む培養物又はその分画物を、飲食品原料に混合
し、飲食品に加工することによって製造される。本発明
の飲食品は、前記培養物又は分画物を使用すること以外
は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によ
って製造することができる。このような原料としては、
例えばアルコール飲料では、米、大麦、コーンスターチ
等、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用
酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げら
れる。
【００３５】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【００３６】
【実施例１】MNNG耐性を指標としたグルタチオン合成酵
素弱化株のスクリーニング ＜１＞スクリーニングモデル株Nα３株の育種 （１）弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カセッ
トの作製 自然界より単離したサッカロマイセス・セレビシエか
ら、常法に従って１倍体Nα１株（ウラシル要求性）を
取得した。Nα１株を用いて以下に記載する方法によ
り、弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子を保持するモデ
ル株Nα３株を取得した。
【００３７】プライマーF1（CAGATTCCGAGTTTACTGGA（配
列番号１））及びR1（AGAAGGAATGAGCCTAAAACAGC（配列
番号２））を用い、Pyrobest DNA Polymerase（宝酒
造）を用い、製造者の指示する条件に従い、サッカロマ
イセス・セレビシエS2株のグルタチオン合成酵素遺伝子
のORFの途中からORFの下流約120塩基対をコードする領
域をPCR法により増幅した。前記S2株は、次のようにし
て取得した。食品用途に用いられる市販のサッカロマイ
セス・セレビシエを胞子形成させ、１倍体パン酵母S株
(MATα)を取得した。さらに、S株から、ウラシルを含む
SDFOA寒天培地（2%精製寒天、最終濃度で50mg/Lのウラ
シル、及び1g/Lの５−フルオロオロチン酸−水和物を含
むSD培地）を用いて、ウラシル要求性株S2株を取得し
た。
【００３８】上記のようにして増幅した遺伝子断片を精
製し、以下の条件で72℃で10分間酵素反応を行うことに
より、末端にＡを付加した。
【００３９】（反応液組成） 遺伝子断片溶液 5μｌ 10× PCR緩衝液(MgCl2フリー) 10μｌ 25mM MgCl2 3μｌ 2.5mM dATP 5μｌ Taq DNA polymerase（宝酒造） 0.5μｌ 精製水 31.5μｌ 合計 50μｌ
【００４０】上記のようにして得られた遺伝子断片（GS
H2dash）を、常法によりプラスミドpGEM-T Easy（Prome
ga社）に連結して、プラスミドGSH2dash/pGEMを得た。
【００４１】次に、GSH2dash/pGEMに含まれるグルタチ
オン合成酵素遺伝子の370番目のアミノ酸に対応するコ
ドンを終止コドンに置換した。この操作は、QuikChange
TM Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）を
用い、製造者のプロトコルに従って行った。プライマー
はGSH2M-F1（GGCAGGGAAGGCAAGTAGCTGGCATTAAGTGAGCCCTC
（配列番号３））、GSH2M-R1（GAGGGCTCACTTAATGCCAGCT
ACTTGCCTTCCCTGCC（配列番号４））を用いた。このよう
にしてプラスミドGSH2Mdash/pGEMを作製した。
【００４２】一方、プラスミドpYES2（Invitrogen社）
から2μoriを除去したプラスミドを作製した。pYES2を
制限酵素SspI、NheIで切断し、切断末端を平滑化した
後、連結させ、プラスミドpYES2dashを得た。pYES2dash
及びGSH2Mdash/pGEMを、いずれも制限酵素SacI及びSphI
で切断し、pYES2dashからはURA3遺伝子を含む断片を、G
SH2Mdash/pGEMからは変異を有するグルタチオン合成酵
素遺伝子断片を切り出し、これらを連結した。このよう
にしてプラスミドGSH2Mdash/pYES2dashを作製した。GSH
2Mdash/pYES2dashを制限酵素MunIで切断し、遺伝子置換
用カセットを得た（図１）。
【００４３】（２）弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子
置換株の構築 上記のようにして作製したカセットを用いて、Nα1株の
グルタチオン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った（図
２）。Nα1株を前培養した後に、培養物を50mlのYPD培
地に植え継ぎ、対数増殖期まで培養した。培養菌体を１
Mソルビトールに懸濁し、カセットを混和して、エレク
トロポレーションにより形質転換を行った。形質転換株
を1mMのグルタチオンを含むSDプレートで培養し、生育
する株を選択した。カセット２が染色体上の目的の位置
に組み込まれたことをPCRによって確認し、得られた株
をNα３中間体とした。
【００４４】次に、図２に示すとおり、弱化型グルタチ
オン合成酵素遺伝子のみを染色体に残すため、以下の操
作を行った。Nα３中間体をYPD培地で培養し、培養産物
を1mMのグルタチオンを含むSDFOAプレートに蒔いた。プ
レート上に生育してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝
子の配列を決定し、目的の部位の配列が正しく置換され
ていることを確認し、Nα３株を得た。
【００４５】（３）Nα３株のグルタチオン及びγ−グ
ルタミルシステインの産生 Nα３株の対数増殖期における単位時間あたりのγ−グ
ルタミルシステイン及びグルタチオンの生産量を調べ
た。Nα３株をYPD培地で前培養した後、培養物を50mlの
SD培地（必要量のウラシルを含む）に植え継ぎ、30℃で
振とう培養した。
【００４６】γ−グルタミルシステイン及びグルタチオ
ンの生産量は、次のようにして測定した。培養物を遠心
することにより菌体を取得し、この菌体を蒸留水で２回
洗浄した後、70℃で10分間の熱水抽出処理に付し、細胞
内容物を得た。これを遠心処理し、得られた上清中のγ
−グルタミルシステイン及びグルタチオン含量を測定し
た。また、一定培地中に含まれる酵母菌体を濾紙上に取
り、105℃で４時間加熱した後に残った菌体重量を測定
し、乾燥菌体重量とした。表１に、乾燥菌体重量当たり
のγ−グルタミルシステイン及びグルタチオンの含有量
を示す。
【００４７】
【表１】 表１ ────────────────────────────── 測定までの** γ−ク゛ルタミルシステイン グルタチオン 培養時間 （％） （％） ────────────────────────────── Nα３株No.1 約1.5時間 1.101 0.0043 Nα３株No.2 約3.8時間 1.117 0.0045 ──────────────────────────────
【００４８】（４）Nα３株のMNNG耐性度の測定 YPD寒天プレートの中央にフィルターを置き、1mgのMNNG
を30μlのDMSOに溶解させた溶液を全量、そのフィルタ
ーに染み込ませ、MNNG濃度が中心点から遠ざかるにつれ
て薄くなるMNNG濃度勾配寒天培地を作製した。この寒天
培地に、YPD液体培地で培養したＮ株及びNα３株をスプ
レッドした。３０℃で70時間培養後、寒天培地の中心点
から酵母がコロニーを形成するまでの距離を測定した。
その結果、Ｎα１株は2.3cm、Nα３株は1.8cmであっ
た。
【００４９】＜２＞グルタチオン合成酵素弱化株のスク
リーニング 食品用途に用いられているサッカロマイセス・セレビシ
エを、常法により胞子形成させて１倍体パン酵母MS株を
取得し、変異剤としてEMSを用いて変異処理を施した。
変異処理は、死滅率が90%になるような条件で行った。
変異処理は次のようにして行なった。MS株を50mlのYPD
培地で30℃で1日間振盪培養し、酵母菌体を集菌した。
酵母菌体を0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）
で3回洗浄した。酵母菌体を0.2Mリン酸ナトリウムバッ
ファー(pH7.5)9.2ml、40% D-グルコース0.5ml、EMS 0.3
ml（ナカライテスク社Code155-19）を含む溶液に懸濁
し、30℃で90分間振盪培養した。10%チオ硫酸ナトリウ
ム（フィルター滅菌）を10ml加えて懸濁し、10分間室温
に放置して変異剤を中和した。酵母菌体を集菌し、0.2M
リン酸ナトリウムバッファー（pH7.5）で洗浄した。こ
のようにして酵母の変異処理を行なった。なお、このと
きの死滅率は90%であった。
【００５０】上記のようにして変異処理を施したMS株
を、MNNG濃度勾配寒天培地（YPD寒天プレートの中央に
フィルターを置き、1mgのMNNGを30μlのDMSOに溶解させ
た溶液を全量フィルターに染み込ませることにより作
製）に出現コロニー数が200個以下になるようにスプレ
ッドし、30℃で5日間静地培養した。グルタチオンを通
常量産生する酵母（Nα1株）は生育できない（寒天培地
の中心点から約2.3cm）が、γ−グルタミルシステイン
を産生し、グルタチオンを産生しないか又はほとんど産
生しない酵母（Nα３株）は生育可能（寒天培地の中心
点から約1.8cm）なMNNG濃度範囲で生育した酵母変異株
を単離した。それらの変異株９３株についてγ−グルタ
ミルシステイン産生能を測定し、グルタチオン合成酵素
活性が弱化した変異株AJ14809株を取得した。
【００５１】
【実施例２】 γ−グルタミルシステインを産生する２
倍体酵母によるγ−グルタミルシステインの生産 ＜１＞γ−グルタミルシステインを産生する２倍体酵母
の作製 グルタチオン合成酵素活性が弱化したサッカロマイセス
・セレビシエとして、市販のパン酵母（２倍体）を胞子
形成させ取得した１倍体酵母を変異処理し、MNNG濃度勾
配寒天培地を利用して取得した１倍体酵母（MATα）AJ1
4809株を用いた。同株は、上記のように、Nα３株を対
照として用い、Nα３株と同程度のMNNG耐性を有する株
として選択された。AJ14809株は、2001年10月1日に、独
立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に、FERM P-18546の受託番号で寄託されて
いる。一方、サッカロマイセス・セレビシエ野生株とし
て、AJ14810株（MATa）を用いた。同株は、2001年10月1
日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センターに、FERM P-18547の受託番号で寄託されてい
る。
【００５２】AJ14809株及びAJ14810株を、各々4mlのYPD
試験管培地で30℃で振盪培養し、培養物をYPD試験管培
地で混合し、30℃で振盪培養した。顕微鏡でAJ14809株
とAJ14810株が接合していることを確認後、培養液をYPD
寒天培地にスプレッドし、30℃で培養した。寒天培地上
に生育してきた酵母の中から、AJ14809株由来のグルタ
チオン合成酵素遺伝子及びAJ14810株由来のグルタチオ
ン合成酵素遺伝子を有する２倍体を取得した。この２倍
体を胞子形成させ、ランダムスポア法により、MATaを保
持し、かつ、グルタチオン合成酵素活性が弱化し、SD培
地で培養したとき対数増殖期においてγ−グルタミルシ
ステインを乾燥酵母菌体あたり1%以上含有し、グルタチ
オンを0.1%以下蓄積する１倍体酵母を10株選抜した。こ
れら10株を各々AJ14809株と接合させ、グルタチオン合
成酵素活性が弱化し、SD培地で培養したとき、対数増殖
期においてγ−グルタミルシステインを乾燥酵母菌体あ
たり約1.5%蓄積する２倍体酵母AJ14800株を取得した。
対照として、AJ14809株とAJ14810株を接合させた２倍体
酵母から、野生型グルタチオン合成酵素を産生する株を
選択し、Ｌ株とした。
【００５３】＜２＞AJ14800株のMNNG耐性度の測定 グルタチオン合成酵素活性が弱化したAJ14800株、及び
野生型グルタチオン合成酵素を産生する２倍体サッカロ
マイセス・セレビシエＬ株をYPD培地で培養して得た培
養液を、660nmでの吸光度が0.1になるように、30μg/ml
又は60μg/mlのMNNGを含むYPD培地あるいはYPD培地に植
菌した。30℃で26時間、静地培養した際の培地の660nm
での吸光度を測定し、生育度を測定した。その結果、表
２に示すように、グルタチオン合成酵素弱化株AJ14800
株は、野生型グルタチオン合成酵素保持株よりもMNNGに
耐性であった。
【００５４】
【表２】 表２ ─────────────────────────── 30μg/mlの 60μg/mlの MNNGでの生育度 MNNGでの生育度 ─────────────────────────── L株 0.0195 0.0139 AJ14800株 0.0540 0.0254 ───────────────────────────
【００５５】＜３＞AJ14800株のγ−グルタミルシステ
イン蓄積量の測定 AJ14800株をYPD培地で40時間培養した後、集菌した。こ
の菌体を、660nmでの吸光度が0.2になるようにSD培地に
植菌した。培養開始後８時間後の菌体内γ−グルタミル
システイン蓄積量を測定したところ、蓄積量は1.50％で
あった。
【００５６】
【発明の効果】本発明により、グルタチオン合成酵素活
性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシステインを産生す
る酵母菌株が提供される。本発明の菌株は、γ−グルタ
ミルシステイン含有食品又はシステイン含有食品の製造
に利用することができる。
【００５７】
【配列表】 <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> γ-GLUTAMYLCYSTEINE PRODUCING YEAST AND METHOD FOR SCREENING THE S AME <130> P-9190 <140> <141> 2001-11-26 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 1 cagattccga gtttactgga 20
【００５８】 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 2 agaaggaatg agcctaaaac agc 23
【００５９】 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 3 ggcagggaag gcaagtagct ggcattaagt gagccctc 38
【００６０】 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 4 gagggctcac ttaatgccag ctacttgcct tccctgcc 38
【図面の簡単な説明】
【図１】 弱化型グルタチオン合成酵素遺伝子置換用カ
セットを含むプラスミドGSH2Mdash/pYES2dashの構築を
示す図。
【図２】 上記カセットを用いたグルタチオン合成酵素
遺伝子の遺伝子置換を模式的に示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72 Ｃ１２Ｒ 1:72） 1:85 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:85） (72)発明者 杉本 玲子 東京都中央区京橋１−15−１味の素株式会 社内 (72)発明者 西村 康史 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社調味料研究開発部内 (72)発明者 黒田 素央 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社調味料研究開発部内 Ｆターム(参考） 4B018 LB01 LB08 LB09 MD20 MD81 ME14 MF13 MF14 4B063 QA18 QQ07 QR08 QR33 QR42 QR59 QR62 QR76 QR80 QS05 QS25 QS36 QX01 4B065 AA72X AA72Y AB01 BA01 BA23 CA24 CA41

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＭＮＮＧ耐性を有し、かつ、γ−グルタ
    ミルシステインを産生する酵母菌株。
  2. 【請求項２】 液体培地で前培養した酵母菌株を集菌
    し、６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ660）が０．１と
    なるように３０μｇ／ｍｌのＭＮＮＧを含むＹＰＤ培地
    （ＭＮＮＧ含有培地）及びＭＮＮＧを含まないＹＰＤ培
    地（ＭＮＮＧ非含有培地）に植菌し、それぞれ好適な温
    度で静置培養したとき、下記式で算出される生育度が
    ０．０３以上である、請求項１記載の酵母菌株。 【数１】
  3. 【請求項３】 グルタチオン合成酵素活性が弱化した請
    求項１又は２に記載の酵母菌株。
  4. 【請求項４】 ＳＤ培地で培養したとき、対数増殖期の
    乾燥菌体当たりのγ−グルタミルシステイン含量が１重
    量％以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵
    母菌株。
  5. 【請求項５】 ２倍性またはそれ以上の倍数性を有する
    請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
  6. 【請求項６】 サッカロマイセス属又はキャンディダ属
    に属する請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母菌
    株。
  7. 【請求項７】 下記の各ステップを含む、グルタチオン
    合成酵素活性が弱化し、かつ、γ−グルタミルシステイ
    ン産生能を有する酵母菌株のスクリーニング法： （ａ）酵母の集団から、一定の濃度範囲のＭＮＮＧに対
    する耐性を有する酵母菌株を選択し、（ｂ）選択された
    菌株からグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ
    −グルタミルシステイン産生能を有する菌株を選択す
    る。
  8. 【請求項８】 前記ステップ（ａ）において、前記酵母
    の集団を、酵母親株を突然変異処理することにより調製
    する請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ステップ（ａ）において、一定の濃
    度範囲のＭＮＮＧに耐性を有する酵母菌株を、ＭＮＮＧ
    の濃度勾配が形成された寒天培地を用いて選択する、請
    求項７又は８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ステップ（ａ）において、既に分
    離されたグルタチオン合成酵素活性が弱化し、かつ、γ
    −グルタミルシステイン産生能を有する酵母モデル菌株
    を用意し、同モデル菌株と同程度のＭＮＮＧ耐性を有す
    る酵母菌株を選択する、請求項７〜９のいずれか一項に
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の
    酵母菌株を好適な条件で培養して得られる培養物、もし
    くはγ−グルタミルシステインを含む前記培養物の分画
    物、又は熱処理によってシステインが生成したこれらの
    培養物もしくは分画物を含む飲食品。
  12. 【請求項１２】 飲食品がアルコール飲料、パン食品、
    又は発酵食品調味料である請求項１１記載の飲食品。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の
    酵母菌株を好適な条件で培養して得られる培養物を用い
    て製造された酵母エキス。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の
    酵母菌株を好適な条件で培養し、得られる培養物もしく
    はその分画物、又は加熱処理した前記培養物又は分画物
    を、飲食品原料に混合し、飲食品に加工することを特徴
    とする、γ−グルタミルシステイン又はシステイン含有
    食品の製造法。
JP2001359781A 2001-11-26 2001-11-26 γ−グルタミルシステイン産生酵母とそのスクリーニング法 Pending JP2003159048A (ja)

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