JP2003038177A

JP2003038177A - 標的塩基配列が改変されたｄｎａライブラリーの作製方法

Info

Publication number: JP2003038177A
Application number: JP2001232520A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Suzuki; 勉鈴木
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-07-31
Filing date: 2001-07-31
Publication date: 2003-02-12

Abstract

(57)【要約】【課題】 DNAライブラリーの作製において、あらゆる
領域の配列に対してランダムに塩基配列を改変すること
ができ、塩基配列の改変部位および改変される塩基配列
のランダムさの程度を制御し得る方法を提供することを
課題とする。【解決手段】プライマー対の一方は、標的領域をN
（A,T,G,Cのミックス）で設計し、その両側に鋳型DNAと
相補的な塩基配列を結合させたプライマー（第一プライ
マー）を設計し、他の一方は、第一プライマーの5‘側
粘着部分と相補的な塩基配列を含むプライマ−を設計す
る。このようにして設計したプライマー対を用いて、標
的配列を含むDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行
う。必要に応じて、鋳型DNAの分解処理を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標的塩基配列が改
変されたDNAライブラリーの作製方法、該方法のための
キット、および、該方法により得られるDNAライブラリ
ーに関する。

【０００２】

【従来の技術】生体高分子であるタンパク質とRNAはと
もにDNAの最終産物として生命活動における様々な機能
を担っている。ゲノム解析によってヒトの遺伝子は約4
万種類存在することが示唆されているが、機能がわかっ
ているものはそのうちの半分にも見たず、約2.4万種類
の遺伝子が機能未知遺伝子として報告された。最終的に
これらの遺伝子の機能を明らかにすることが当面の課題
となるであろう。さらには遺伝子間、ひいてはその産物
であるタンパク質、RNA間の相互作用の基本原理やネッ
トワークを解明することが、生命を理解する上での最も
効果的なアプローチと成りうるであろう。

【０００３】タンパク質やRNAは翻訳後、あるいは転写
後に自発的に折りたたまることによって、立体的な分子
として、初めて触媒活性を有することができ、他のタン
パク質と相互作用ができるようになる。その情報はもと
もとタンパク質のアミノ酸配列やRNAの塩基配列といっ
た１次構造にインプットされており、DNAの塩基配列と
いう形態でゲノム中に保存されている。したがって、長
い生物進化の過程において各遺伝子の配列は、その最終
産物であるタンパク質やRNAの機能発現という制約のも
とに選択され、保存され続けている。細菌からヒトに至
る様々な生物種において保存されている遺伝子の場合、
機能的に重要でない領域の変異率は高く、一方で機能的
に不可欠な領域には高い保存性が観測される。保存性の
高い領域は、触媒中心であったり、高次構造の形成に重
要な部位であったり、他の分子と相互作用する領域であ
ったりすることが、様々な生化学的な実験や構造生物学
的な解析から証明されている。すなわち、DNAの塩基配
列の保存性に機能的重要性を見出すことができる。種を
超えて保存されている領域は機能的に選択されてきたこ
とを意味し、ある程度重要な配列であることが予想され
る。

【０００４】機能的に重要な配列を同定するためには、
一般的に、DNAの塩基を変異させた変異体を作製し、変
異体が変異前のDNAの機能を保持するか否かを検討す
る。例えば、部位特異的変異導入法により保存配列に変
異を導入し、得られた変異体の活性や性質を調べ、変異
が導入された配列が機能的に重要か否かの検討が行なわ
れてきた。

【０００５】部位特異的変異導入法として、従来はKunk
elらの方法(Kunkel, T. A., (1985)Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 82,488)が盛んに行われていたが、操作が煩
雑で時間もかかるため、最近ではPCRを活用した方法(Qu
ick Change^TM Site-DirectedMutagenesis Kit, Stratag
ene)が好んで用いられるようになった。しかし、１つの
部位に変異を導入する場合、他の19通りのアミノ酸すべ
てに置換した変異体を作成することは現実的ではなく、
通常は、親水性、疎水性、電荷などを指標として、ある
程度意図的に変換するアミノ酸を決めて変異体をデザイ
ンすることになる。また、複数の部位に同時に変異を導
入する場合はさらに変異体のバリエーションは大きくな
り、一般的にN箇所の部位に変異を導入する場合は20^N通
りの配列のバリエーションが生じることになる。こうな
ると部位特異的変異導入法によりすべての変異体を作成
することは非現実的である。

【０００６】そこで、DNAの塩基配列をランダムに改変
した変異体から構成されるDNAライブラリーを作成し、
このDNAライブラリーから機能的に重要な配列を選択す
るという方法が用いられている。DNAの塩基配列をラン
ダムに改変する方法としては、これまでに、DNAポリメ
ラーゼによるDNA合成の正確さを低下させるPCR法（Leun
g, D. W. et. al., Techinique 1: 11-15）や化学修飾
剤によって変異導入した鋳型DNAを使用するPCR法（特開
平5-192148）などが報告されている。

【０００７】しかしながら、これらの方法は、変異の導
入がDNAポリメラーゼや化学修飾剤の性質に依存してい
るため、DNAの特定の塩基配列に限定して変異を導入す
ることのみならず、改変のランダムさの程度（変異後の
塩基配列における4種の塩基の頻度）を調節することも
困難である。このためこれら方法により得られるDNAラ
イブラリーには、多様性の点で問題があり、機能的に重
要な配列の効率的な選択のために必ずしも適当であると
はいえない。

【０００８】原理的に全ての可能な配列の中から機能的
に重要な配列を選び出すためには、ある特定の領域をラ
ンダマイズしたライブラリーを作成することが考えられ
る。このような技術としては、カセット変異法（Wells,
et al., Gene, 34, 315 (1985); Grundstroem,et al.,
Nucleic Acids Res., 13, 3305 (1985)）を用いた、プ
ラスミドへのランダム変異導入DNA断片の挿入が挙げら
れる。しかし、カセット変異法においては、変異を導入
する近傍に適当な制限酵素がないと変異が導入できない
点や、DNA連結反応でライブラリーを作成するため、十
分な量のライブラリーを構築することが困難である点が
問題である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、DNAラ
イブラリーの作製において、あらゆる領域の配列に対し
てランダムに塩基配列を改変することができ、塩基配列
の改変部位および改変される塩基配列のランダムさの程
度を制御し得る方法を提供することにある。さらなる本
発明の目的は、DNAライブラリーの作製において、その
合成効率を高め、またサイズの拡大を容易にすることに
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
を行った結果、標的塩基配列を含むDNAを鋳型にしたポ
リメラーゼ連鎖反応において、特殊なプライマー設計を
行うことにより、上記課題を解決することに成功した。
本発明におけるDNAライブラリーの作製の原理は以下の
通りである。

【００１１】まず、図１に示したようなプライマー対を
調製する（図１には、第一プライマーがセンス鎖に結合
する場合のみ示してある）。プライマー対の一方は、標
的領域をN（A,T,G,Cのミックス）で設計し、その両側に
鋳型DNAと相補的な塩基配列を結合させたプライマー
（第一プライマー）である。他の一方は、第一プライマ
ーの5‘末端付近に相補的な塩基配列を含むプライマ−
（第二プライマー）を設計する。このようにして設計し
たプライマー対を用いて、標的配列を含むDNAを鋳型に
ポリメラーゼ連鎖反応を行う。標的配列は第一プライマ
ー由来のランダムな配列となる。また、第一プライマー
の標的領域におけるA,T,G,Cの混合比を変動させること
で、標的領域のランダムさの程度を制御しうる。これに
より、特定の配列を標的に、そのランダムさの程度を制
御して、目的に応じた多様なDNAライブラリーを作製す
ることができる。

【００１２】本発明者らは、上記原理に基づき、実際
に、大腸菌リボソームRNA遺伝子のオペロンrrn Bを標的
配列として、その6つの塩基がランダム化された、4⁶サ
イズのライブラリーを作製することに成功した。本発明
者らは、このライブラリーの作製過程において、鋳型DN
Aのメチル化、メチル化されたDNAの切断、およびλエキ
ソヌクレアーゼ処理を行うことで、ライブラリー中の標
的配列を有する鋳型DNAの数を減少させることにも成功
した。

【００１３】次いで、本発明者らは、機能的に重要な塩
基配列の同定において、この作製したライブラリーが有
用であることを検証するために、後述する独自に開発し
たSSER法により、この作製したライブラリーからrrn B
の機能を保持するDNAの選抜を試みた。その結果、rrn B
の機能を保持する2種の塩基配列に加えて、ミトコンド
リアリボソームRNAおよび他種生物のリボソームRNAに実
際に存在する配列が同定された。

【００１４】即ち、本発明者らは、特定の塩基配列がラ
ンダムに改変されたDNAライブラリーを作製することに
成功すると伴に、作製されたDNAライブラリーが機能的
に重要な塩基配列の同定に有用であることを実証し、こ
れにより本発明を完成するに至った。

【００１５】本発明は、より具体的には、下記（１）か
ら（１０）を提供するものである。（１）標的塩基配列が改変されたDNAライブラリーを
作製する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）のプラ
イマーを用いて、標的塩基配列を含むDNAを鋳型にポリ
メラーゼ連鎖反応を行うことを含む方法。（ａ）標的塩基配列を含む領域にハイブリダイズするプ
ライマーであって、標的塩基配列に対応するプライマー
中の塩基配列が、標的塩基配列から改変されている第一
のプライマー（ｂ）該第一のプライマーにおける、標的塩基配列に対
応する塩基配列の5'側領域と相補的な塩基配列を含む第
二のプライマー（２）ポリメラーゼ連鎖反応に供する鋳型DNAをメチ
ル化する、（１）に記載の方法。（３）鋳型DNAのメチル化が、配列特異的なDNAメチル
化酵素処理によって行われる（２）に記載の方法。（４）ポリメラーゼ連鎖反応後に、鋳型DNAの分解を
行うことを含む（１）〜（３）のいずれかに記載の方
法。（５）鋳型DNAの分解が、DNA分解酵素処理によって行
われる（４）に記載の方法。（６） DNA分解酵素処理が、制限酵素Dpn I処理である
（５）に記載の方法。（７） DNA分解酵素処理が、制限酵素Dpn I処理および
それに続くλエキソヌクレアーゼ処理である（５）に記
載の方法。（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法により
作製される、標的塩基配列が改変されたDNAライブラリ
ー。（９）（１）〜（７）のいずれかに記載の方法を実施
するためのキットであって、下記（ａ）〜（ｃ）の少な
くとも1つを含むキット。（ａ）DNAメチル化酵素（ｂ）メチル化されたDNAを切断する酵素（ｃ）λエキソヌクレアーゼ

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明において、ポリメラーゼ連
鎖反応の鋳型DNAである「標的塩基配列を含むDNA」は、
塩基配列を改変することを望む任意のDNAを用いること
ができる。鋳型DNAの形態は、一本鎖であっても二本鎖
であってもよい。また、直鎖状であっても環状であって
もよい。

【００１７】「標的塩基配列」とは、ポリメラーゼ連鎖
反応の鋳型DNAにおける塩基の改変の対象とする塩基配
列を意味する。標的塩基配列を含むDNAが二本鎖DNAの場
合には、標的塩基配列はセンス鎖における標的塩基配列
および相補鎖におけるその相補配列の両方を含む意であ
る。「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの場合は U）、G:
Cの塩基対からなる二本鎖核酸の一方の鎖に対する他方
の鎖を指す。

【００１８】本発明においては、特殊な設計のプライマ
ー対を用いて、標的塩基配列を含むDNAを鋳型にポリメ
ラーゼ連鎖反応を行う。このプライマー対の一方は、標
的塩基配列を含む領域にハイブリダイズするプライマー
であって、標的塩基配列に対応するプライマー中の塩基
配列が、標的塩基配列から改変されているプライマー
（第一プライマー）である。「標的塩基配列を含む領
域」とは、鋳型DNAにおける標的塩基配列およびその5'
側および3'側の隣接塩基配列を意味する。第一プライマ
ーにおいて、改変部位は、鋳型DNAにおける連続する塩
基であってもよく、離れた複数箇所の塩基であってもよ
い。また、改変される塩基は、1つであってもよいし、
複数であってもよい。改変される塩基数は、DNAライブ
ラリーのサイズおよび一度に形質転換できる細胞の数な
どを考慮すれば、通常、30塩基以下が適当であり、好ま
しくは10塩基以下である。ライブラリーのサイズを維持
したまま、改変する塩基の数を増加させるには、A,T,G,
Cの比率を変化させればよい。例えば、オリジナルな塩
基を70％として残りの3塩基を10％ずつとして合成すれ
ば、N塩基のライブラリーのサイズは、1/0.7^N＝1.43^Nと
なり、39塩基を改変した場合のライブラリーサイズは、
1.43³⁹＝1143156となる。これは10塩基を完全にランダ
マイズしたライブラリーのサイズ（4¹⁰＝1048576通り）
とほぼ同等である。

【００１９】第一プライマーには、必要に応じて、ポリ
メラーゼ連鎖反応の増幅産物がオリジナルな配列（標的
配列）である場合に、この配列が鋳型DNA由来である
か、ランダムな配列から選択されたものであるかを区別
するための変異が導入されていてもよい。機能的に重要
な配列の同定のためにDNAライブラリーを用いる場合に
は、この変異は、DNAの機能に影響を与えない変異であ
ることが好ましい。

【００２０】第一プライマーは、標的領域をA,T,G,Cの
ミックス（必要に応じて、これら塩基の比率を変動させ
たり、これら塩基のうち2または3のミックスであっても
よい）とし、その両側に鋳型DNAと相補的な塩基配列が
配置されるように設計する。「相補的な塩基配列」は、
完全に相補的な塩基配列であることが好ましいが、作製
するDNAライブラリーの使用目的に反せず、かつポリメ
ラーゼ連鎖反応を阻害しない限り、完全に相補的な塩基
配列でなくともよい。鋳型DNAと第一プライマーとがハ
イブリダイズする領域の全塩基対に対する相補的な塩基
対（Aに対してT、Gに対してC）の割合は、通常、少なく
とも70%、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以
上、さらに好ましくは95%以上である。このようにして
設計したオリゴヌクレオチドは、例えば、アミダイド法
で合成することができる。合成されたオリゴヌクレオチ
ドは、精製度に応じて、ゲルからの切り出しにより精製
することができる。

【００２１】第一プライマーの鎖長は、DNA合成により
調製する場合には、通常、15から150塩基であり、好ま
しくは20から100塩基であり、さらに好ましくは50から6
0塩基である。また、離れた2ヶ所の領域をランダマイズ
するような場合には、それぞれにランダム変異を導入し
た1対のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行
い、増幅したニ本鎖DNAを第一および第二プライマーと
してポリメラーゼ連鎖反応を行いライブラリーを作成す
ることができる。この場合の第一および第二プライマー
は、通常、30から500塩基対の二本鎖DNAである。

【００２２】プライマー対の他の一方は、第一のプライ
マーにおける、標的塩基配列に対応する塩基配列の5'側
領域と相補的な塩基配列を含むプライマー（第二プライ
マー）である。第二プライマーにおいては、標的塩基配
列と同一の塩基配列は含めず、その3'下流の塩基配列を
含める設計とする。そうすることにより標的塩基配列は
第一プライマーのランダム配列で置換される。

【００２３】第二プライマーは、「第一のプライマーに
おける、標的塩基配列に対応する塩基配列の5'側領域」
の全体に相補的な塩基配列を含む必要はない。ポリメラ
ーゼ連鎖反応を阻害しない限り、該領域の一部に相補的
な塩基配列を含めばよい。第二プライマーにおける第一
プライマーと「相補的な塩基配列」は、完全に相補的な
塩基配列であることが好ましいが、作製するDNAライブ
ラリーの使用目的に反せず、かつポリメラーゼ連鎖反応
を阻害しない限り、完全に相補的な塩基配列でなくとも
よい。第一プライマーに対する第二プライマーの対応領
域の全塩基対に対する相補的な塩基対（Aに対してT、G
に対してC）の割合は、通常、少なくとも70%、好ましく
は80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは
95%以上である。このような設計の第二プライマーは、
例えば、アミダイド法で合成することができる。合成さ
れたオリゴヌクレオチドは、精製度に応じて、ゲルから
の切り出しにより精製することができる。

【００２４】第二プライマーの鎖長は、第一プライマー
の設計により変動するが、DNA合成により調製する場合
には、通常、10から100塩基であり、好ましくは15塩基
から50塩基であり、さらに好ましくは20から30塩基であ
る。

【００２５】第一および第二プライマーは、鋳型DNAの
所望の領域に特異的にハイブリダイズするように設計す
る。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイ
ブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブル
ックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Labor
atory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）
において、所望の領域とハイブリダイズし、その他の領
域とはハイブリダイズしないことを意味する。第一およ
び第二プライマーは、鋳型DNAに対して、第一プライマ
ーがセンス鎖と、第二プライマーがその相補鎖とハイブ
リダイズするように設計してもよく、逆に、第一プライ
マーが相補鎖と、第二プライマーがセンス鎖とハイブリ
ダイズするように設計してもよい。

【００２６】本発明において、上記鋳型DNA並びに上記
第一および第二プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反
応は、例えば、以下のような条件により行うことができ
る。

【００２７】10ｍM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、20mM Tris-H
Cl (pH8.8)、2mM MgSO₄、0.2mM dNTPs、0.1% Triton X-
100、1mg/ml nuclease-free bovine serum albumin、鋳
型DNA10ng、それぞれのプライマー各125ng、dNTPmix 5
μl、Pfu Turbo (Stratagene社) 1μl (2.5 U) を用い
て、Pre-heat を95℃で30秒、変性を95℃で30秒（Step
1）、アニーリングを55℃で1分（Step2）、伸長を68℃
で2分/kbp（Step3）、その後、4℃で保存する条件で行
う。Step1からStep3は、18サイクル行う。また、Step3
の反応時間は、2分/kbpを目安として鋳型DNAの長さから
算出する。Step2の温度はプライマーの配列や塩基組成
から算出する。より好ましいPCR反応条件としては、上
記条件において、鋳型DNA量を150 ng、プライマー量を1
2.5 pgとする。

【００２８】ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物にお
いて、オリジナルな配列を有するDNAを減少させたい場
合には、ポリメラーゼ連鎖反応後に鋳型DNAの分解を行
う。鋳型DNAを分解するためには、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応に供する鋳型DNAをメチル化し、大腸菌等の
細胞が有する外来DNAに対する制限システム（restricti
onsystem）を利用して、メチル化されたDNAを分解すれ
ばよい。鋳型DNAをメチル化するには、配列特異的なDNA
メチル化酵素を用いる。配列特異的なDNAメチル化酵素
としては、上記制限システムを利用できるものであるな
ら、その種類や使用数等において特に制限はないが、好
ましくは、m-Alu I、m-Hae III、m-Hap IIである。本発
明においては、これらを単独でも組み合わせても用いる
ことができる。

【００２９】m-Alu I、m-Hae III、m-Hap IIはそれぞ
れ、AGCT、GGCC、CCGG の各4塩基を認識し、それぞ
れ、AG^m5CT、GG^m5CC、^m5CCGGのようにCの5位を特異的
にメチル化する酵素である。これらの部位がメチル化さ
れたDNAは、大腸菌が有する外来DNAに対する制限システ
ム（restriction system）により排除される。具体的に
は、mcrAの遺伝子産物が^m5CCGGを認識して切断し、mcrC
BがG^m5Cを認識して切断するため、上記3種類の酵素でメ
チル化された部位はすべて、制限システムの標的となり
排除される。

【００３０】一方、ポリメラーゼ連鎖反応後にDNA分解
酵素処理を行うことによっても、鋳型DNAを分解するこ
とが可能である。大腸菌の細胞内には通常DNAアデニン
メチラーゼ（dam）が存在する。この酵素は、GATC配列
を認識して、2番目のAの6位をメチル化（6-メチルアデ
ノシン；^m6A）する。従って、大腸菌から調製した鋳型D
NAにはすべてこの位置にメチル化が施されていることが
知られている。このような鋳型DNAを分解する酵素とし
ては、例えば、制限酵素Dpn Iを用いることができる。

【００３１】本発明においては、上記のメチル化された
DNAの分解処理に加え、λエキソヌクレアーゼ等のヌク
レアーゼ処理を行うこともできる。このような処理をす
ることで、DNA断片をモノヌクレオチドまで分解するこ
とが可能である。DpnI消化で生じたDNA断片は鋳型DNAと
部分的に相補鎖形成を行い、細胞内で複製されると考え
られる。特に、λエキソヌクレアーゼは、DNAの5'末端
がリン酸化されているDNAのみを基質とするため、合成D
NAより増幅されたライブラリーDNAを標的としない。従
って、λエキソヌクレアーゼにより、メチル化されたDN
Aの分解処理によって生じたDNA断片のみを消化すること
ができる。

【００３２】本発明の方法によれば、DNA上の所望の塩
基配列がランダムに改変されたDNAライブラリーを作製
することができ、しかも、改変する塩基配列のランダム
さの程度を制御することができる。また、鋳型DNAを分
解することにより、DNAライブラリーにおける改変され
た塩基を含むDNAの割合を高めることができる。このた
め本発明の方法により作製されたDNAライブラリーは、
標的塩基配列の機能を保持する変異体の選抜やDNAにお
ける機能的に重要な塩基配列の同定に好適に使用でき
る。本発明には、本発明の方法により作製された、標的
塩基配列が改変されたDNAライブラリーが含まれる。

【００３３】また、上記したDNAメチル化酵素、メチル
化されたDNAを切断する酵素、およびλエキソヌクレア
ーゼは、本発明の方法において、鋳型DNAを分解するの
に好適に用いることができる。本発明には、これら酵素
を単独若しくは組み合わせで含む本発明の方法を実施す
るためのキットが含まれる。これらの酵素の標品におい
ては、酵素以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物
油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク
質安定剤（BSAやゼラチン等）、保存剤等が必要に応じ
て混合されていてもよい。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。 [実施例１] 大腸菌リボソームRNA遺伝子のオペロンrrn
Bがランダムに改変されたDNAライブラリーの作製まず、大腸菌リボソームRNA遺伝子のオペロンrrn Bを、
pSC101由来の複製起点をもつpMW218（カナマイシン耐性
遺伝子を有する）に組み込み、pRB-Kam^rと命名した（図
２）。次いで、後述の理由から、pRB-Kam^rをDNAメチル
化酵素によりメチル化し、メチル化pRB-Kam^rを作製し
た。次いで、メチル化pRB-Kam^rを鋳型とし、図３に示す
第一プライマーと第二プライマーを用いてPCR法でライ
ブラリーを構築した。表1に示す反応液を作製し、PCR反
応を行った。具体的には、Pre-heatを95℃で30秒、変性
を95℃で30秒（Step1）、アニーリングを55℃で1分（St
ep2）、伸長を68℃で20分（Step3）、その後、4℃で保
存する条件で行った。Step1からStep3は、18サイクルで
行った。反応終了後、反応液に直接、10unitのDpn Iと5
unitのλエキソヌクレアーゼを加え、37℃で90分鋳型プ
ラスミドを消化した。QIA quick（QIAGEN社）でclean u
pしたものをライブラリーとした。最終的に4.8 mlのPCR
を行い、最終的にランダムライブラリーを58μg得た。

【００３５】

【表１】

【００３６】[実施例２] 上記DNAライブラリーを利用
したrrnBの機能解析本発明者らは、実施例１で作製したDNAライブラリーを
用いたrrnBの機能解析を行った。具体的には、本発明者
らは、プラスミドDNAの「選択圧」を利用して、DNAライ
ブラリーの中から機能的に重要な配列を選択する方法
（SSER法）で、rrnBの機能解析を行った。選択圧とは、
宿主細胞において同じレプリコン（複製起点）を有する
複数のプラスミドDNAは安定に共存することができず、
選択圧によって互いを排除しあう性質（Datta, N. 197
9. Plasmid classification: Incompatibility groupin
g. In plasmids of medical, environmental and comme
rcial importance (ed. K. N. Timmis and A. Puhler),
p3. Elsevier, Amsterdam）を意味する。

【００３７】本発明者らは、もう1つのプラスミドであ
るpRB-SacB-Amp^rを作製した。このプラスミドは、pSC10
1由来の複製起点をもつpMW118 [Nippon gene社]にrrn
Bと枯草菌Sac Bを組み込んだものである。なお、pRB-Sa
cB-Amp^rは、pRB-Kam^rとは異なる薬剤耐性遺伝子をも
つ。

【００３８】Squiresらのグループによって構築され
た、大腸菌ゲノムに存在する7つのリボソームRNA遺伝子
オペロン(rrn)の全てを破壊した大腸菌株TA542株は、rr
nオペロンを有するプラスミド（pHK-rrnC+）とrrnオペ
ロンの遺伝子破壊に伴って消失した5つのtRNA遺伝子を
クローニングしたプラスミド（pTRNA66）を有し、ゲノ
ムから失われた遺伝子の機能をプラスミドによって補完
することで生存している株である（Asai et. al., PNA
S, 96: 1971-1976, 1999）。本発明者らは、TA542株にp
RB-SacB-Amp^rを形質転換し、アンピシリンで選択するこ
とでpHK-rrnC⁺を追い出しpRB-SacB-Amp^rで置換した株
（NT101株）を作製した。

【００３９】次いで、鋳型DNAを分解するために、DNAラ
イブラリーの鋳型となるpRB-Kam^rをメチル化した。具体
的には、50mM Tris-HCl (pH8.0)、20mM NaCl、10mM EDT
A、1mM DTT、80μM S-adenosyl methionine (SAM)、pRB
-Kam^r 50μg、m-Alu I 50units、m-Hae III 50units、m
-Hap II 50unitsを混合し、dH₂Oで500μlとした。37℃
で30分反応させたのち、66μlの3M NaClを加えて、さら
に37℃で30分反応させた。QIAGEN社のQIA quickでメチ
ル化DNAをclean upしたものをPCRの鋳型とした。pRB-Ka
m^rの場合m-Alu I、m-Hae III、m-Hap IIのそれぞれのメ
チル化部位は44、32、44箇所存在し、この処理によって
120箇所がメチル化されることになる。ライブラリー作
成時のPCR反応の効率は、この処理によって全く影響を
受けないことを確認している。大腸菌内ではこのすべて
の部位がmcrAまたはmcrCBの切断部位となり、この処理
によってほぼ完璧に鋳型DNAを処理することが可能とな
った。表２はNT101株における形質転換効率をメチル化
前後で比較したものである。メチル化によってNT101株
の形質転換効率が著しく低下していることがわかる。ま
た、コントロールにmcrAとmcrCBが欠損したXL1 BlueMR
（Stratagene）を用いるとメチル化によって効率に差が
見られないことからメチル化が制限システムによって排
除されていることが明確となった。PCR後にDpn Iとλエ
キソヌクレアーゼによる鋳型の消化を行うことで、さら
に鋳型DNAの量は低下することが期待される。

【００４０】

【表２】 * XL1 BlueMR (Stratagene); (mcrA)183, (mcrCB-hsds
MR-hrr)173

【００４１】次いで、実施例１に記載の方法で作製した
DNAライブラリーを上記NT101株に導入した。具体的に
は、カルシウム法で作成したNT101株のコンピテントセ
ル400μlに1.16μgのライブラリーを加え、氷上で1時間
整置した。42℃で45秒間保温し(heat shock)、600μl
のSOC培地を加え、37℃で1時間振とう培養した(curin
g)。LB(spc/kan)寒天培地（通常のLB寒天培地に40μg/m
lスペクチノマイシン、50μg/mlカナマイシンを加えた
もの。）に広げて37℃で１〜2日培養した。最終的に20.
8 mlのコンピテントセルに58μgのライブラリーを形質
転換し、16枚の角型シャーレ寒天培地に細胞を蒔いた。

【００４２】次いで、LB(spc/kan)寒天培地に生えたコ
ロニーを200μlのLB培地に懸濁し、5μlをショ糖の入っ
たLB(spc/kan/SUC)寒天培地（LB(spc/kan)培地に5％シ
ョ糖を加えたもの）スポットした。この過程で、枯草菌
Sac Bを有する細胞は死滅させた。37℃で1日培養を行
い、生えたコロニーがライブラリーでpRB-SacB-Amp^rを
置換できたものである。

【００４３】このコロニーを1.25 mlの２ｘLB培地に植
菌し、37℃で24時間振とう培養を行った。そこからプラ
スミドを抽出し、ABIprism3100でランダマイズした領域
(2448-2454)の塩基配列を決定した。なおSequencingに
は、Foward : 5'CCTTGAAATACCACCCTTTAATG 3'（配列番
号：３）およびReverse: 5'TGCTTTCAGCACTTATCTCTTCCG
3'（配列番号：４）のプライマーを使用した。

【００４４】ランダマイズした領域のもともとの配列は
ATAACAG (2448-2454)であり、2番目(2449)のTはCに置
換できるという報告（O'Connor et. al., Nucl. Acid.
Res,29: 710-715, 2001）があったため、この位置はあ
らかじめ第一プライマー上でCに置換し、選択後の目印
（特異的変異）とした。したがって、この領域のライブ
ラリーはNCNNNNN（Nは任意の塩基）となり、4⁶通り(409
6通り)の配列のバリエーションが得られる。最終的にシ
ョ糖プレート上に生えた63コロニーの塩基配列を決定し
た結果、pRB-Kam^rが置換したバックグラウンドとして38
個、ライブラリーから選択されたもの(すなわちプライ
マー由来の2箇所の特異的変異が導入されたもの)が25個
であった。

【００４５】選択されたものは以下の5種類のいずれか
の配列を持っていた。A2448は4塩基すべてに置換可能で
あり、A2453は2448位がAの場合のみTを持ち得るという
結果が得られた。コンセンサス配列はNCAAC(A/T)Gとな
る。X線結晶解析から触媒塩基であることが指摘されたA
2451は完全に保存されていた。ACAACAGは大腸菌を含む
原核生物、古細菌リボソームRNA、ほとんどのオルガネ
ラのリボソームRNAに共通の配列である。ACAACTG (A245
3T)は真核生物リボソームRNAの配列であり、TCAACAG (A
2448T)はいくつかの原生動物ミトコンドリアリボソーム
RNAで見られる配列である。このように、大腸菌でリボ
ソームRNAの機能選択を行うと真核生物やミトコンドリ
アなど他の生物種のリボソームRNAの配列まで選択でき
るという結果が得られた。

【００４６】これはリボソームRNAの機能は種を超えて
普遍であることを意味する。また実際の生物には存在し
ない配列（A2448GとA2448C）も得られたことから、この
方法では、機能しうるが進化的に淘汰されてしまったよ
うな配列も選択されることを意味し、RNAの機能を解析
する上で非常に重要な知見が得られたことになる。また
これら5種類の配列を持つ大腸菌を共存培養したとこ
ろ、48時間後には野生型のACAACAGを持つ大腸菌のみが
生き残った。従って、この領域の高度な保存性は、進化
的な選択圧によって保たれていると言える。以上の結果
は、本発明の方法が、DNAの機能解析や機能改変等に使
用できることを示すものである。また、実施例で用いた
試薬等が、標的塩基配列が改変されたDNAライブラリー
を作製するためのキットになりうることを示すものであ
る。

【００４７】

【表３】

【００４８】

【発明の効果】本発明によれば、改変された塩基配列を
有するDNAライブラリーの作製において、変異の導入さ
れる部位および導入される変異のランダムさの程度を制
御し得る。また、必要に応じて、鋳型DNAをDNAライブラ
リーから排除することができる。このため本発明によれ
ば、多様なDNAライブラリーを厳密な制御下で作製する
ことができる。これにより、作製されるDNAライブラリ
ーの使用目的に応じて、その目的にかなったDNAライブ
ラリーを作製することが可能となる。また、本発明の方
法により作製されるDNAライブラリーを、本発明者らが
開発したSSER法に適用することで、DNAにおける機能的
に重要な配列の同定や標的塩基配列の機能を保持する変
異配列の選抜を効率的に行うことができる。

【００４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> tsutomu, suzuki kimitsuna watanabe <120> Method for DNA library construction with randomized sequence. <130> SEN-A0113 <140> <141> <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <220> <221> misc_feature <222> (20)..(26) <223> n represents a, t, c, or g <400> 1 atgcatctga ggccccgtan nnnnnntcgg atcgacgatc ataagctta 49 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <400> 2 tacgtagact ccggggcata taacagagcc tagctgctag tattcgaat 49 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <400> 3 tagctgctag tattcgaat 19 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n represents a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (20)..(24) <223> n represents a, t, c, or g <400> 4 taaaaggtac tccggggncn nnnngcttat accgcccaag agttcatatc gacggcgg 58 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <400> 5 cccggagtac cttttatccg ttgagcgatg g 31 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <400> 6 ccttgaaata ccacccttta atg 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized pri mer sequence <400> 7 tgctttcagc acttatctct tccg 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 Nは、任意の塩基を意味する。

【図２】本実施例で用いたリボソームRNAの発現ベク
ター（pRB-SacB-Amp^r）、および本実施例で用いたライ
ブラリー作成用のベクター（pRB-Kam^r）を示す図であ
る。

【図３】アンダーラインは、特異的変異部位を示す。
Nは、任意の塩基を意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 EA04 FA02 GA11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的塩基配列が改変されたDNAライブラ
リーを作製する方法であって、下記（ａ）および（ｂ）
のプライマーを用いて、標的塩基配列を含むDNAを鋳型
にポリメラーゼ連鎖反応を行うことを含む方法。（ａ）標的塩基配列を含む領域にハイブリダイズするプ
ライマーであって、標的塩基配列に対応するプライマー
中の塩基配列が、標的塩基配列から改変されている第一
のプライマー（ｂ）該第一のプライマーにおける、標的塩基配列に対
応する塩基配列の5'側領域と相補的な塩基配列を含む第
二のプライマー
【請求項２】ポリメラーゼ連鎖反応に供する鋳型DNA
をメチル化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】鋳型DNAのメチル化が、配列特異的なDNA
メチル化酵素処理によって行われる請求項２に記載の方
法。
【請求項４】ポリメラーゼ連鎖反応後に、鋳型DNAの
分解を行うことを含む請求項１〜３のいずれかに記載の
方法。
【請求項５】鋳型DNAの分解が、DNA分解酵素処理によ
って行われる請求項４に記載の方法。
【請求項６】 DNA分解酵素処理が、制限酵素Dpn I処理
である請求項５に記載の方法。
【請求項７】 DNA分解酵素処理が、制限酵素Dpn I処理
およびそれに続くλエキソヌクレアーゼ処理である請求
項５に記載の方法。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の方法に
より作製される、標的塩基配列が改変されたDNAライブ
ラリー。
【請求項９】請求項１〜７のいずれかに記載の方法を
実施するためのキットであって、下記（ａ）〜（ｃ）の
少なくとも1つを含むキット。（ａ）DNAメチル化酵素（ｂ）メチル化されたDNAを切断する酵素（ｃ）λエキソヌクレアーゼ