JP2003000239A - 酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法 - Google Patents
酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ガンやアレルギーなどのヒト疾患の治療に有
用な生理活性物質のスクリーニングを、酵母遺伝子群の
過剰発現アッセイ系を利用した効率的なスクリーニング
方法によって行うことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、酵母の遺伝子群を利用して過
剰発現アッセイ系を構築し、これを用いて、微生物の培
養液やケミカルライブラリー化合物の中から、活性物質
を効率的にスクリーニングする方法に関わるものであ
る。また、生理活性物質が有する複数の活性の有無を、
複数のアッセイを並列的に実施することにより検定でき
るという特徴を有している。
用な生理活性物質のスクリーニングを、酵母遺伝子群の
過剰発現アッセイ系を利用した効率的なスクリーニング
方法によって行うことを目的とする。 【解決手段】 本発明は、酵母の遺伝子群を利用して過
剰発現アッセイ系を構築し、これを用いて、微生物の培
養液やケミカルライブラリー化合物の中から、活性物質
を効率的にスクリーニングする方法に関わるものであ
る。また、生理活性物質が有する複数の活性の有無を、
複数のアッセイを並列的に実施することにより検定でき
るという特徴を有している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】ガンやアレルギーなどのヒト
疾患の治療に有用な生理活性物質のスクリーニングを、
酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性
物質の効率的なスクリーニング方法に関する。
疾患の治療に有用な生理活性物質のスクリーニングを、
酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性
物質の効率的なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医薬研究開発において、いわゆるインビ
トロ試験法による生理活性物質のスクリーニングは、細
胞から分離、精製したタンパクを用いることが多い。こ
の場合に、単一の生理活性をスクリーニングするような
ケースでは、このような従来の方法でも有用であろう。
しかしながら、生理活性物質が単一の化合物であったと
しても、通常は複数の生理活性を有している場合や、そ
れが薬物の副作用というマイナス面を有している場合も
多い。このような問題点が、開発がかなり進んだ段階で
見出された場合には、時間および経済的損失は大きい。
できるだけ早い段階で、生理活性物質が有する活性を幅
広く把握しておくことが重要である。
トロ試験法による生理活性物質のスクリーニングは、細
胞から分離、精製したタンパクを用いることが多い。こ
の場合に、単一の生理活性をスクリーニングするような
ケースでは、このような従来の方法でも有用であろう。
しかしながら、生理活性物質が単一の化合物であったと
しても、通常は複数の生理活性を有している場合や、そ
れが薬物の副作用というマイナス面を有している場合も
多い。このような問題点が、開発がかなり進んだ段階で
見出された場合には、時間および経済的損失は大きい。
できるだけ早い段階で、生理活性物質が有する活性を幅
広く把握しておくことが重要である。
【０００３】タンパクを用いるアッセイ系では、生理活
性物質の細胞膜透過性を評価することはできない。従っ
て、生理活性物質の細胞膜透過性と生理活性の両方を評
価するためのアッセイ系としては、従来から、ヒトや動
物の細胞が用いられることが多い。しかし、動物細胞は
酵母細胞に比べると取扱いが難しく、増殖も遅い。ま
た、遺伝子工学的手法を使うのが難しいという問題点を
有している。動物細胞の代わりに、真核生物であって遺
伝子工学的手法や分子生物学的手法が駆使でき、増殖も
早く、さらに取扱いが容易である宿主細胞の利用が好ま
しい。また、生理活性物質の活性の有無の判定が容易で
あることも重要である。このような細胞レベルのアッセ
イ系を複数セット揃えて、並列的にアッセイを行うこと
により、医薬研究開発の早い段階から、生理活性物質が
有する種々の活性の状況を把握しておくことにより、効
率的な医薬開発が期待できる。
性物質の細胞膜透過性を評価することはできない。従っ
て、生理活性物質の細胞膜透過性と生理活性の両方を評
価するためのアッセイ系としては、従来から、ヒトや動
物の細胞が用いられることが多い。しかし、動物細胞は
酵母細胞に比べると取扱いが難しく、増殖も遅い。ま
た、遺伝子工学的手法を使うのが難しいという問題点を
有している。動物細胞の代わりに、真核生物であって遺
伝子工学的手法や分子生物学的手法が駆使でき、増殖も
早く、さらに取扱いが容易である宿主細胞の利用が好ま
しい。また、生理活性物質の活性の有無の判定が容易で
あることも重要である。このような細胞レベルのアッセ
イ系を複数セット揃えて、並列的にアッセイを行うこと
により、医薬研究開発の早い段階から、生理活性物質が
有する種々の活性の状況を把握しておくことにより、効
率的な医薬開発が期待できる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】遺伝学のモデル生物と
して発展してきた酵母の全ゲノム情報から、いくつもの
ヒトの疾患原因遺伝子を含む相同遺伝子が発見され、さ
らに分子レベルで類似するタンパク機能ネットワークが
解明されたことにより、酵母がヒトの病気や生命現象の
モデル生物となりうることが示された。そこで、ガンや
アレルギーなどのヒト疾患の治療に有用な生理活性物質
を、酵母遺伝子の過剰発現アッセイ系を利用したスクリ
ーニング方法により効率化することを試みた結果、本発
明に至った。
して発展してきた酵母の全ゲノム情報から、いくつもの
ヒトの疾患原因遺伝子を含む相同遺伝子が発見され、さ
らに分子レベルで類似するタンパク機能ネットワークが
解明されたことにより、酵母がヒトの病気や生命現象の
モデル生物となりうることが示された。そこで、ガンや
アレルギーなどのヒト疾患の治療に有用な生理活性物質
を、酵母遺伝子の過剰発現アッセイ系を利用したスクリ
ーニング方法により効率化することを試みた結果、本発
明に至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】生物は、外界の環境変化
に伴う様々な刺激を感知し、それに対処するために、情
報を細胞内に伝達する機構を備えている。この機構は細
胞内情報伝達経路と呼ばれ、増殖や分化に重要な役割を
持っている。この経路に異常が生じると、ガン化やアレ
ルギーなどの免疫疾患を引き起こすと考えられている。
ガン化した細胞では、成長因子などによる調節に関係な
く、常に情報伝達経路が活性化された状態になってい
る。従って、異常な情報伝達経路の活性化を特異的に阻
害できる生理活性物質が発見できれば、それは、ガンや
免疫疾患などの疾病の治療に効果を示すことが期待でき
る。このような情報伝達経路は、ヒトのような高等動物
ばかりでなく、酵母などの微生物にも存在している。
に伴う様々な刺激を感知し、それに対処するために、情
報を細胞内に伝達する機構を備えている。この機構は細
胞内情報伝達経路と呼ばれ、増殖や分化に重要な役割を
持っている。この経路に異常が生じると、ガン化やアレ
ルギーなどの免疫疾患を引き起こすと考えられている。
ガン化した細胞では、成長因子などによる調節に関係な
く、常に情報伝達経路が活性化された状態になってい
る。従って、異常な情報伝達経路の活性化を特異的に阻
害できる生理活性物質が発見できれば、それは、ガンや
免疫疾患などの疾病の治療に効果を示すことが期待でき
る。このような情報伝達経路は、ヒトのような高等動物
ばかりでなく、酵母などの微生物にも存在している。
【０００６】出芽酵母、サッカロミセス セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）におけるシグナル伝達経
路としては、フェロモンシグナル伝達経路が良く知られ
ている。フェロモンの刺激が細胞膜上の受容体で感知さ
れると、細胞内のα、β、γの３つのサブユニットから
成る三量体Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇｐａ１）
が解離し、残りのβ／γサブユニット（Ｓｔｅ４／Ｓｔ
ｅ１８）が下流に信号を送る。その信号により、Ｓｔｅ
５やＳｔｅ２０、Ｓｔｅ１１、Ｓｔｅ７、Ｆｕｓ３／Ｋ
ｓｓ１と順次活性化され、接合に必要な遺伝子群の転写
因子であるＳｔｅ１２などが活性化されて接合に至る
（図１）。これに似た情報伝達経路（図２）は、植物や
哺乳動物からヒトに至るまで存在し、真核生物で基本的
な性質として広く保存されている（Brunet A. et al. ,
Essay Biochem. 32,1-16,1977）。そこで遺伝子操作に
より、この酵母の情報伝達経路を恒常的に活性化させた
状態にし、それを解除させる生理活性物質を、さまざま
な遺伝子的方法や分子生物学的方法を駆使して、効率的
にスクリーニングする方法を検討した。
（Saccharomyces cerevisiae）におけるシグナル伝達経
路としては、フェロモンシグナル伝達経路が良く知られ
ている。フェロモンの刺激が細胞膜上の受容体で感知さ
れると、細胞内のα、β、γの３つのサブユニットから
成る三量体Ｇタンパク質のαサブユニット（Ｇｐａ１）
が解離し、残りのβ／γサブユニット（Ｓｔｅ４／Ｓｔ
ｅ１８）が下流に信号を送る。その信号により、Ｓｔｅ
５やＳｔｅ２０、Ｓｔｅ１１、Ｓｔｅ７、Ｆｕｓ３／Ｋ
ｓｓ１と順次活性化され、接合に必要な遺伝子群の転写
因子であるＳｔｅ１２などが活性化されて接合に至る
（図１）。これに似た情報伝達経路（図２）は、植物や
哺乳動物からヒトに至るまで存在し、真核生物で基本的
な性質として広く保存されている（Brunet A. et al. ,
Essay Biochem. 32,1-16,1977）。そこで遺伝子操作に
より、この酵母の情報伝達経路を恒常的に活性化させた
状態にし、それを解除させる生理活性物質を、さまざま
な遺伝子的方法や分子生物学的方法を駆使して、効率的
にスクリーニングする方法を検討した。
【０００７】フェロモン情報伝達経路を標的とする場合
は、フェロモンを与えた酵母を利用すれば増殖停止が誘
導でき、それに生理活性物質を添加することで酵母の増
殖を回復できる場合には、目的とする生理活性物質をス
クリーニングできたということになる。フェロモン情報
伝達経路に関しては、これまでに、過剰発現により情報
伝達経路を活性化する様々な遺伝子が取得されている。
その中には、ＳＴＥ４、ＳＴＥ５、ＳＴＥ１２などの遺
伝子、ＳＴＥ２０およびＳＴＥ１１遺伝子の部分欠失体
であるＳＴＥ２０ΔＮおよびＳＴＥ１１ΔＮ、突然変異
体であるＳＴＥ１１−４およびＳＴＥ７−２５９Ｄなど
が知られている。従って、生理活性物質のスクリーニン
グに適したプロモーターの下流に、これらの遺伝子を連
結させて、これらの遺伝子を過剰発現させることによ
り、フェロモン情報伝達経路を活性化させることができ
る。これにより、酵母は接合のために増殖を停止する。
生理活性物質の共存下で酵母の増殖が回復した場合に
は、この生理活性物質は、フェロモン情報伝達経路に作
用する薬物としての活性を有することになる。
は、フェロモンを与えた酵母を利用すれば増殖停止が誘
導でき、それに生理活性物質を添加することで酵母の増
殖を回復できる場合には、目的とする生理活性物質をス
クリーニングできたということになる。フェロモン情報
伝達経路に関しては、これまでに、過剰発現により情報
伝達経路を活性化する様々な遺伝子が取得されている。
その中には、ＳＴＥ４、ＳＴＥ５、ＳＴＥ１２などの遺
伝子、ＳＴＥ２０およびＳＴＥ１１遺伝子の部分欠失体
であるＳＴＥ２０ΔＮおよびＳＴＥ１１ΔＮ、突然変異
体であるＳＴＥ１１−４およびＳＴＥ７−２５９Ｄなど
が知られている。従って、生理活性物質のスクリーニン
グに適したプロモーターの下流に、これらの遺伝子を連
結させて、これらの遺伝子を過剰発現させることによ
り、フェロモン情報伝達経路を活性化させることができ
る。これにより、酵母は接合のために増殖を停止する。
生理活性物質の共存下で酵母の増殖が回復した場合に
は、この生理活性物質は、フェロモン情報伝達経路に作
用する薬物としての活性を有することになる。
【０００８】本発明は、酵母遺伝子の過剰発現を特徴と
するものであり、フェロモンシグナル伝達経路に関与す
る遺伝子だけに限定されるものではない。例えばＢＮＩ
１遺伝子、ＧＩＮ４遺伝子、ＧＩＮ１１遺伝子も利用で
きる。これらの遺伝子を過剰発現させると、酵母の増殖
停止を引き起こすことが知られている。ＢＮＩ１は酵母
の形態形成に関与する遺伝子、ＧＩＮ４は細胞周期と形
態形成を調節する遺伝子、ＧＩＮ１１はテロメアに近接
した遺伝子である。これらの遺伝子も、ガンの悪性化や
不死化に関わる遺伝子と考えられる。なぜならばガン細
胞の悪性化では、まず細胞の増殖や分化を調節する細胞
内情報伝達経路に異常が生じ、細胞分裂が繰り返される
ようになった後、次には細胞の老化に異常が生じて細胞
が不死化する。さらに形態制御に異常をきたすと、組織
から離れてガン細胞の転移が起こる。これらの異常を治
す生理活性物質は、新しい抗ガン剤となるはずである。
するものであり、フェロモンシグナル伝達経路に関与す
る遺伝子だけに限定されるものではない。例えばＢＮＩ
１遺伝子、ＧＩＮ４遺伝子、ＧＩＮ１１遺伝子も利用で
きる。これらの遺伝子を過剰発現させると、酵母の増殖
停止を引き起こすことが知られている。ＢＮＩ１は酵母
の形態形成に関与する遺伝子、ＧＩＮ４は細胞周期と形
態形成を調節する遺伝子、ＧＩＮ１１はテロメアに近接
した遺伝子である。これらの遺伝子も、ガンの悪性化や
不死化に関わる遺伝子と考えられる。なぜならばガン細
胞の悪性化では、まず細胞の増殖や分化を調節する細胞
内情報伝達経路に異常が生じ、細胞分裂が繰り返される
ようになった後、次には細胞の老化に異常が生じて細胞
が不死化する。さらに形態制御に異常をきたすと、組織
から離れてガン細胞の転移が起こる。これらの異常を治
す生理活性物質は、新しい抗ガン剤となるはずである。
【０００９】シグナル伝達経路と同様にして、細胞骨格
や細胞周期制御、テロメアなどの異常を標的とした薬物
の開発を行うことができる。細胞骨格の主要な構成成分
は、アクチンフィラメント、中間径フィラメント、微小
管という３種類の繊維構造からできており、これらが細
胞外シグナルや細胞周期、細胞分化に応答し再構築され
て、細胞接着、形態形成、運動、分裂、極性形成といっ
た高次機能を制御していると考えられている（ Hall,
A. , Science 279,509-514,1998 ）。ヒトの細胞におい
て、このファミリーの下流の標的分子であるｍＤｉａタ
ンパクは、アクチン細胞骨格を介した細胞極性や細胞質
分裂に機能しているが、酵母におけるＢｎｉ１タンパク
とその構造や機能が非常に類似している（Watanabe ,
N. et ａｌ. , EMBO J. 16,3044-3056,1997）。Ｂｎｉ
１タンパクは、Ｒｈｏファミリー（Ｒｈｏ１、Ｃｄｃ４
２）、アクチン、アクチン結合タンパク（プロフィリ
ン、Ｂｕｄ６）および極性タンパク（Ｓｐａ２）と相互
作用すると考えられている（Ozaki-Kuroda, K. et al.
, Mol. Cell. Biol. 21,827-839,2001）。ＢＮＩ１遺
伝子の過剰発現は、形態の異常を引き起こして増殖停止
することが知られており、シグナル伝達経路と同様に、
これを用いることで細胞骨格制御の異常を標的とした薬
物の開発を行うことができる。またＢＮＩ１遺伝子と同
様に、細胞骨格制御に関わるが、異なった機能を有する
ＧＩＮ４遺伝子を用いることで、細胞周期チェックポイ
ント機構を標的とすることもできる。Ｇｉｎ４タンパク
は、母細胞と娘細胞との間のくびれにおけるセプチンの
会合に機能しているが、またそれがＳｗｅ１タンパクを
介した細胞周期のＧ２／Ｍ期の形態チェックポイント機
構にも関連している（Longtine, M. S. et al. , Mol.
Cell. Biol. 20,4049-4061,2000）。形態チェックポイ
ントとは、出芽時の芽の形成の遅れなど細胞骨格制御の
異常を感知して、細胞周期の進行を阻害する機構であ
る。
や細胞周期制御、テロメアなどの異常を標的とした薬物
の開発を行うことができる。細胞骨格の主要な構成成分
は、アクチンフィラメント、中間径フィラメント、微小
管という３種類の繊維構造からできており、これらが細
胞外シグナルや細胞周期、細胞分化に応答し再構築され
て、細胞接着、形態形成、運動、分裂、極性形成といっ
た高次機能を制御していると考えられている（ Hall,
A. , Science 279,509-514,1998 ）。ヒトの細胞におい
て、このファミリーの下流の標的分子であるｍＤｉａタ
ンパクは、アクチン細胞骨格を介した細胞極性や細胞質
分裂に機能しているが、酵母におけるＢｎｉ１タンパク
とその構造や機能が非常に類似している（Watanabe ,
N. et ａｌ. , EMBO J. 16,3044-3056,1997）。Ｂｎｉ
１タンパクは、Ｒｈｏファミリー（Ｒｈｏ１、Ｃｄｃ４
２）、アクチン、アクチン結合タンパク（プロフィリ
ン、Ｂｕｄ６）および極性タンパク（Ｓｐａ２）と相互
作用すると考えられている（Ozaki-Kuroda, K. et al.
, Mol. Cell. Biol. 21,827-839,2001）。ＢＮＩ１遺
伝子の過剰発現は、形態の異常を引き起こして増殖停止
することが知られており、シグナル伝達経路と同様に、
これを用いることで細胞骨格制御の異常を標的とした薬
物の開発を行うことができる。またＢＮＩ１遺伝子と同
様に、細胞骨格制御に関わるが、異なった機能を有する
ＧＩＮ４遺伝子を用いることで、細胞周期チェックポイ
ント機構を標的とすることもできる。Ｇｉｎ４タンパク
は、母細胞と娘細胞との間のくびれにおけるセプチンの
会合に機能しているが、またそれがＳｗｅ１タンパクを
介した細胞周期のＧ２／Ｍ期の形態チェックポイント機
構にも関連している（Longtine, M. S. et al. , Mol.
Cell. Biol. 20,4049-4061,2000）。形態チェックポイ
ントとは、出芽時の芽の形成の遅れなど細胞骨格制御の
異常を感知して、細胞周期の進行を阻害する機構であ
る。
【００１０】また、染色体末端テロメア領域のＸ−エレ
メントのＤＮＡ配列であるＧＩＮ１１を用いれば、テロ
メアの異常を標的とすることができる。この領域は、ど
の染色体にも非常に良く保存されているが、その機能は
まったく分かっていない（Louis, E. J. et al. , Gene
tics 136,789-802,1994）。しかしテロメア領域は、若
い細胞でサイレンシングにより転写抑制が行われている
が、老いた細胞ではテロメアの短小化に伴い、サイレン
シングに機能を持つタンパクが解離して分裂停止を示す
ことから、これらの機能への関与があると考えられる
（Kennedy, B. K.et al. , Cell 89, 381-391,1997）。
メントのＤＮＡ配列であるＧＩＮ１１を用いれば、テロ
メアの異常を標的とすることができる。この領域は、ど
の染色体にも非常に良く保存されているが、その機能は
まったく分かっていない（Louis, E. J. et al. , Gene
tics 136,789-802,1994）。しかしテロメア領域は、若
い細胞でサイレンシングにより転写抑制が行われている
が、老いた細胞ではテロメアの短小化に伴い、サイレン
シングに機能を持つタンパクが解離して分裂停止を示す
ことから、これらの機能への関与があると考えられる
（Kennedy, B. K.et al. , Cell 89, 381-391,1997）。
【００１１】このように、過剰発現により増殖を停止さ
せる、様々な酵母の遺伝子を用いることにより、シグナ
ル伝達経路、細胞骨格制御、チェックポイント機構、そ
してテロメアの異常など、ガンに特徴的な異常と類似の
異常を、酵母で人為的に作り出すことができた。この異
常による増殖停止を標的として、それを抑制する生理活
性物質の効率的なスクリーニング方法を開発することが
できた。ただし、本発明に利用可能な遺伝子群は、これ
までに記述した遺伝子に限定されるものではない。酵母
のゲノム情報から得られる新規遺伝子を、本発明の酵母
遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質
の効率的なスクリーニング方法に用いることが可能であ
る。
せる、様々な酵母の遺伝子を用いることにより、シグナ
ル伝達経路、細胞骨格制御、チェックポイント機構、そ
してテロメアの異常など、ガンに特徴的な異常と類似の
異常を、酵母で人為的に作り出すことができた。この異
常による増殖停止を標的として、それを抑制する生理活
性物質の効率的なスクリーニング方法を開発することが
できた。ただし、本発明に利用可能な遺伝子群は、これ
までに記述した遺伝子に限定されるものではない。酵母
のゲノム情報から得られる新規遺伝子を、本発明の酵母
遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質
の効率的なスクリーニング方法に用いることが可能であ
る。
【００１２】目的とする遺伝子を過剰発現させるために
は、遺伝子組換えによって得られるプラスミドで、酵母
を形質転換させる方法が有用である。用いるプラスミド
に関しては、酵母で利用可能なものであれば、特に制限
はない。また、過剰発現用のプロモーターに関しては、
酵母細胞内で機能するプロモーターであれば、特に制限
はない。発現のコントロールの容易さという点では、培
地にガラクトースを添加することにより、過剰発現を誘
導できるＧＡＬ１０プロモーターが適している。しか
し、ＧＡＬ１０プロモーターの場合は、培地中にグルコ
ースが共存していると、ＧＡＬ１０プロモーターからの
発現が極端に抑制されてしまうという短所があり、目的
とする生理活性物質以外のものも選択されてしまうた
め、２次的なスクリーニングが必要となる場合もある。
は、遺伝子組換えによって得られるプラスミドで、酵母
を形質転換させる方法が有用である。用いるプラスミド
に関しては、酵母で利用可能なものであれば、特に制限
はない。また、過剰発現用のプロモーターに関しては、
酵母細胞内で機能するプロモーターであれば、特に制限
はない。発現のコントロールの容易さという点では、培
地にガラクトースを添加することにより、過剰発現を誘
導できるＧＡＬ１０プロモーターが適している。しか
し、ＧＡＬ１０プロモーターの場合は、培地中にグルコ
ースが共存していると、ＧＡＬ１０プロモーターからの
発現が極端に抑制されてしまうという短所があり、目的
とする生理活性物質以外のものも選択されてしまうた
め、２次的なスクリーニングが必要となる場合もある。
【００１３】ＣＵＰ１プロモーターを利用した過剰発現
は、ＧＡＬ１０プロモーターのようにグルコースに影響
されないこと、遺伝子の発現量を培地中の銅イオン（Ｃ
ｕ++）濃度で調節できるという点で、特に有効である。
また、用いる遺伝子によって、培地中の銅イオン濃度の
最適範囲は異なっている。従って、それぞれのアッセイ
系において、培地に添加する銅イオン濃度の最適範囲を
求めておく必要がある。
は、ＧＡＬ１０プロモーターのようにグルコースに影響
されないこと、遺伝子の発現量を培地中の銅イオン（Ｃ
ｕ++）濃度で調節できるという点で、特に有効である。
また、用いる遺伝子によって、培地中の銅イオン濃度の
最適範囲は異なっている。従って、それぞれのアッセイ
系において、培地に添加する銅イオン濃度の最適範囲を
求めておく必要がある。
【００１４】自然界には数多くの物質が存在しており、
それらの活性を調べることにより医薬品の開発が行われ
ている。抗生物質のスクリーニングが、微生物の代謝産
物で行われてきたように、微生物は様々な化合物を産生
している。従って、目的とする生理活性物質も微生物の
培養液をスクリーニングすることで発見できる。また、
最近は、人工的に基本骨格を様々な官能基で修飾して合
成した化合物のライブラリーが頻繁に用いられている。
それは構造が既知の化合物から活性物質をスクリーニン
グすることで、活性物質の単離・精製や構造決定に必要
な時間と労力を省くことができ、また化合物を大量に入
手しやすいので、大きな進展が期待できる。本発明の効
率的なスクリーニング方法は、微生物の代謝産物や化合
物ライブラリーなどからの医薬開発候補物質のスクリー
ニング、特に一次スクリーニングに有用であるが、医薬
開発候補物質が絞り込まれた段階で、その候補化合物が
主薬効のほかに、どのような活性を有しているかを検定
する場合にも、同様に有用である。
それらの活性を調べることにより医薬品の開発が行われ
ている。抗生物質のスクリーニングが、微生物の代謝産
物で行われてきたように、微生物は様々な化合物を産生
している。従って、目的とする生理活性物質も微生物の
培養液をスクリーニングすることで発見できる。また、
最近は、人工的に基本骨格を様々な官能基で修飾して合
成した化合物のライブラリーが頻繁に用いられている。
それは構造が既知の化合物から活性物質をスクリーニン
グすることで、活性物質の単離・精製や構造決定に必要
な時間と労力を省くことができ、また化合物を大量に入
手しやすいので、大きな進展が期待できる。本発明の効
率的なスクリーニング方法は、微生物の代謝産物や化合
物ライブラリーなどからの医薬開発候補物質のスクリー
ニング、特に一次スクリーニングに有用であるが、医薬
開発候補物質が絞り込まれた段階で、その候補化合物が
主薬効のほかに、どのような活性を有しているかを検定
する場合にも、同様に有用である。
【００１５】以上のように、本発明では、酵母の遺伝子
群を利用して過剰発現アッセイ系を構築し、これを用い
て微生物の培養液やケミカルライブラリー化合物の中か
ら、生理活性物質を効率的にスクリーニングする方法に
関わるものである。また、生理活性物質が有する種々の
活性の有無を、複数のアッセイを並列的に実施すること
により把握できるという特徴を有している。
群を利用して過剰発現アッセイ系を構築し、これを用い
て微生物の培養液やケミカルライブラリー化合物の中か
ら、生理活性物質を効率的にスクリーニングする方法に
関わるものである。また、生理活性物質が有する種々の
活性の有無を、複数のアッセイを並列的に実施すること
により把握できるという特徴を有している。
【００１６】
【発明の実施の形態】発明の実施の形態を、実施例にも
とづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実
施例のみに限定されるものではない。
とづき図面を参照して説明するが、本発明はこれらの実
施例のみに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】Ｂｎｉ１タンパクのＣ末端側（１２２７−
１９５３アミノ酸残基の部分）だけをコードする遺伝子
ＢＮＩ１ΔＮをＧＡＬ１０プロモーターの下流に連結し
たプラスミドｐＧＡ４７を用いて、酵母Ｗ３０３−１Ａ
株を形質転換した。ＢＮＩ１ΔＮが過剰発現されている
形質転換株は、ガラクトース培地で生育させると、形態
異常を引き起こして増殖を停止するため、これを指標と
して目的の形質転換株ＲＡＫ２８４を単離した。
１９５３アミノ酸残基の部分）だけをコードする遺伝子
ＢＮＩ１ΔＮをＧＡＬ１０プロモーターの下流に連結し
たプラスミドｐＧＡ４７を用いて、酵母Ｗ３０３−１Ａ
株を形質転換した。ＢＮＩ１ΔＮが過剰発現されている
形質転換株は、ガラクトース培地で生育させると、形態
異常を引き起こして増殖を停止するため、これを指標と
して目的の形質転換株ＲＡＫ２８４を単離した。
【００１８】ＲＡＫ２８４株の増殖を阻害する物質とし
ては、放線菌の培養液を用いた。これらは、放線菌の培
養液に等量のメタノールを加えて細胞を破砕したもので
ある。なお、放線菌培養液の保存は−２０℃以下で行っ
た。Ｂｎｉ１過剰発現アッセイプレートは、ＲＡＫ２８
４株を −Ｌ液体培地（YNB 1.7g , (NH4)2SO4 5g , glu
cose 20g , -L drop out mix 0.5g に蒸留水を加えて1
リットルに調製）の２ｍｌに懸濁し、２８℃で一晩回転
振盪培養した後、酵母菌体の濁度をＯＤ600＝１．０に
調整した。なお、-L drop out mix の組成は、0.5g ade
nine sulfate,2g L-histidine HCl, 2g L-lysine HCl,
2g L-methionine, 2g uracil および L-tryptophan で
ある。１％ａｇａｒ−Ｌｇａｌ培地をオートクレーブ
後、約５０℃まで冷却した。ＯＤ600＝１．０の酵母菌
体を１／１０００量添加してプレートを作成した。微生
物培養液を、それぞれ１０μｌスポットし、２８℃で５
〜６日間培養した後、酵母の生育状況を調べた。
ては、放線菌の培養液を用いた。これらは、放線菌の培
養液に等量のメタノールを加えて細胞を破砕したもので
ある。なお、放線菌培養液の保存は−２０℃以下で行っ
た。Ｂｎｉ１過剰発現アッセイプレートは、ＲＡＫ２８
４株を −Ｌ液体培地（YNB 1.7g , (NH4)2SO4 5g , glu
cose 20g , -L drop out mix 0.5g に蒸留水を加えて1
リットルに調製）の２ｍｌに懸濁し、２８℃で一晩回転
振盪培養した後、酵母菌体の濁度をＯＤ600＝１．０に
調整した。なお、-L drop out mix の組成は、0.5g ade
nine sulfate,2g L-histidine HCl, 2g L-lysine HCl,
2g L-methionine, 2g uracil および L-tryptophan で
ある。１％ａｇａｒ−Ｌｇａｌ培地をオートクレーブ
後、約５０℃まで冷却した。ＯＤ600＝１．０の酵母菌
体を１／１０００量添加してプレートを作成した。微生
物培養液を、それぞれ１０μｌスポットし、２８℃で５
〜６日間培養した後、酵母の生育状況を調べた。
【００１９】放線菌３２４株の培養液をスクリーニング
した結果、ＳＮＡ２３０１６、ＳＮＡ２３０２７、ＳＮ
Ａ２３０２８、ＳＮＡ２３０２９、ＳＮＡ２３０３６、
ＳＮＡ２３０３７、ＳＮＡ２３０４０、ＳＮＡ２３０４
４、ＳＮＡ２３０５２、ＳＮＡ２３０５５、ＳＮＡ２３
０６２、ＳＮＡ２３０６８、ＳＮＡ２３０７５、ＳＮＡ
２３０８０、ＳＮＡ２３０８１、ＳＮＡ２３０８２、Ｓ
ＮＡ２３０８３、ＳＮＡ２３０８４、ＳＮＡ２３０８
５、ＳＮＡ２３０８６、ＳＮＡ２３０８７、ＳＮＡ２３
０８８、ＳＮＡ２３０８９、ＳＮＡ２３０９０、ＳＮＡ
２３０９１、ＳＮＡ２３０９２、ＳＮＡ２３０９３、Ｓ
ＮＡ２３０９４、ＳＮＡ２３０９５、ＳＮＡ２３０９
６、ＳＮＡ２３０９７、ＳＮＡ２３０９８、ＳＮＡ２３
０９９、ＳＮＡ２３１０９、ＳＮＡ２３１１３、ＳＮＡ
２３１１７、ＳＮＡ２３１３６、ＳＮＡ２３１３７、Ｓ
ＮＡ２３１４２、ＳＮＡ２３１５９、ＳＮＡ２３１６
２、ＳＮＡ２３１７２、ＳＮＡ２３１８１、ＳＮＡ２３
１８２、ＳＮＡ２３１８６、ＳＮＡ２３２０３、ＳＮＡ
２３２０４、ＳＮＡ２３２２９、ＳＮＡ２３２３０、Ｓ
ＮＡ２３２３４、ＳＮＡ２３２３６、ＳＮＡ２３２５
７、ＳＮＡ２３２６２、ＳＮＡ２３２６３、ＳＮＡ２３
２６４、ＳＮＡ２３２６５、ＳＮＡ２３２６８、ＳＮＡ
２３２７１、ＳＮＡ２３２７８、ＳＮＡ２３２８８、Ｓ
ＮＡ２３２９５の６１株の培養液で、酵母の増殖停止の
解除活性を示した。これは非特異的な増殖停止解除では
ない。このことからＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリ
ーニングは、非常に高い確率で活性物質を選択できるこ
とが示された。
した結果、ＳＮＡ２３０１６、ＳＮＡ２３０２７、ＳＮ
Ａ２３０２８、ＳＮＡ２３０２９、ＳＮＡ２３０３６、
ＳＮＡ２３０３７、ＳＮＡ２３０４０、ＳＮＡ２３０４
４、ＳＮＡ２３０５２、ＳＮＡ２３０５５、ＳＮＡ２３
０６２、ＳＮＡ２３０６８、ＳＮＡ２３０７５、ＳＮＡ
２３０８０、ＳＮＡ２３０８１、ＳＮＡ２３０８２、Ｓ
ＮＡ２３０８３、ＳＮＡ２３０８４、ＳＮＡ２３０８
５、ＳＮＡ２３０８６、ＳＮＡ２３０８７、ＳＮＡ２３
０８８、ＳＮＡ２３０８９、ＳＮＡ２３０９０、ＳＮＡ
２３０９１、ＳＮＡ２３０９２、ＳＮＡ２３０９３、Ｓ
ＮＡ２３０９４、ＳＮＡ２３０９５、ＳＮＡ２３０９
６、ＳＮＡ２３０９７、ＳＮＡ２３０９８、ＳＮＡ２３
０９９、ＳＮＡ２３１０９、ＳＮＡ２３１１３、ＳＮＡ
２３１１７、ＳＮＡ２３１３６、ＳＮＡ２３１３７、Ｓ
ＮＡ２３１４２、ＳＮＡ２３１５９、ＳＮＡ２３１６
２、ＳＮＡ２３１７２、ＳＮＡ２３１８１、ＳＮＡ２３
１８２、ＳＮＡ２３１８６、ＳＮＡ２３２０３、ＳＮＡ
２３２０４、ＳＮＡ２３２２９、ＳＮＡ２３２３０、Ｓ
ＮＡ２３２３４、ＳＮＡ２３２３６、ＳＮＡ２３２５
７、ＳＮＡ２３２６２、ＳＮＡ２３２６３、ＳＮＡ２３
２６４、ＳＮＡ２３２６５、ＳＮＡ２３２６８、ＳＮＡ
２３２７１、ＳＮＡ２３２７８、ＳＮＡ２３２８８、Ｓ
ＮＡ２３２９５の６１株の培養液で、酵母の増殖停止の
解除活性を示した。これは非特異的な増殖停止解除では
ない。このことからＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリ
ーニングは、非常に高い確率で活性物質を選択できるこ
とが示された。
【００２０】放線菌培養液中の活性物質の性質を知るた
めの手段の一つとして、活性物質をブタノールまたは酢
酸エチルで抽出した画分を用いて、同様に増殖停止の解
除活性を測定した。活性のあった培養液のいくつかを、
ブタノールまたは酢酸エチルと１：１で混合し、静置後
に上層の溶媒抽出液と、その下層の水層とを、二倍体の
アッセイ培地にスポットした。２８℃で５〜６日間培養
して、酵母の増殖を調べた（表１）。増殖停止解除活性
を示した物質は、ブタノ−ルで抽出されるものや、酢酸
エチルで抽出されるものなど、様々であることがわかっ
た。このＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリーニングに
より、細胞骨格制御に作用すると思われる生理活性物質
を含む培養液を選別できることが示された。
めの手段の一つとして、活性物質をブタノールまたは酢
酸エチルで抽出した画分を用いて、同様に増殖停止の解
除活性を測定した。活性のあった培養液のいくつかを、
ブタノールまたは酢酸エチルと１：１で混合し、静置後
に上層の溶媒抽出液と、その下層の水層とを、二倍体の
アッセイ培地にスポットした。２８℃で５〜６日間培養
して、酵母の増殖を調べた（表１）。増殖停止解除活性
を示した物質は、ブタノ−ルで抽出されるものや、酢酸
エチルで抽出されるものなど、様々であることがわかっ
た。このＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリーニングに
より、細胞骨格制御に作用すると思われる生理活性物質
を含む培養液を選別できることが示された。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【実施例２】実施例１のアッセイ系は、ＧＡＬ１０プロ
モーターにより、遺伝子の過剰発現を行った。ＧＡＬ１
０プロモーターは、もともとガラクトースを資化すると
きに発現する遺伝子のプロモーター領域であるため、ガ
ラクトースより先に資化されるグルコースが存在する
と、その発現は極端に抑制される。このことから、目的
とする物質ではないものを多く選択してしまい、二次的
なアッセイが必要であった。さらに、遺伝子の過剰発現
が非常に強い致死性を持つ場合は、活性物質のスクリー
ニングの感度が悪くなると考えられる。この問題を解決
するために、ＧＡＬ１０プロモーターを、外界の銅スト
レスにより発現が誘導されるＣＵＰ１プロモーターへ変
更した。このプロモーターは、ＧＡＬ１０プロモーター
ほどに発現量は高くないものの、培地中の銅濃度で発現
量を調節でき、また培地中のグルコースで発現が解除さ
れないという利点がある。
モーターにより、遺伝子の過剰発現を行った。ＧＡＬ１
０プロモーターは、もともとガラクトースを資化すると
きに発現する遺伝子のプロモーター領域であるため、ガ
ラクトースより先に資化されるグルコースが存在する
と、その発現は極端に抑制される。このことから、目的
とする物質ではないものを多く選択してしまい、二次的
なアッセイが必要であった。さらに、遺伝子の過剰発現
が非常に強い致死性を持つ場合は、活性物質のスクリー
ニングの感度が悪くなると考えられる。この問題を解決
するために、ＧＡＬ１０プロモーターを、外界の銅スト
レスにより発現が誘導されるＣＵＰ１プロモーターへ変
更した。このプロモーターは、ＧＡＬ１０プロモーター
ほどに発現量は高くないものの、培地中の銅濃度で発現
量を調節でき、また培地中のグルコースで発現が解除さ
れないという利点がある。
【００２３】そこで、ＣＵＰ１プロモーターに、過剰発
現で増殖阻害を示すＧＩＮ１１を連結したプラスミドを
用いて、グルコースの影響を調べてみた。ガラクトース
培地中ではＧＡＬ１０プロモーターによるＧＩＮ１１の
過剰発現で酵母は増殖を停止したが、培地中にグルコー
スを添加することにより増殖停止は解除された。一方、
銅含有培地中でのＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ１
１の過剰発現により酵母は増殖停止したが、培地中にグ
ルコースを添加しても増殖停止は解除されなかった。従
って、ＧＡＬ１０プロモーターよりもＣＵＰ１プロモー
ターの方が、本発明の過剰発現系に用いるプロモーター
としては適していることが示された。
現で増殖阻害を示すＧＩＮ１１を連結したプラスミドを
用いて、グルコースの影響を調べてみた。ガラクトース
培地中ではＧＡＬ１０プロモーターによるＧＩＮ１１の
過剰発現で酵母は増殖を停止したが、培地中にグルコー
スを添加することにより増殖停止は解除された。一方、
銅含有培地中でのＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ１
１の過剰発現により酵母は増殖停止したが、培地中にグ
ルコースを添加しても増殖停止は解除されなかった。従
って、ＧＡＬ１０プロモーターよりもＣＵＰ１プロモー
ターの方が、本発明の過剰発現系に用いるプロモーター
としては適していることが示された。
【００２４】
【実施例３】ＧＩＮ４遺伝子を用いることで、細胞周期
チェックポイント機構も標的とすることができる。Ｇｉ
ｎ４タンパクは、Ｃｄｃ４２、Ｎａｐ１、Ｃｌａ４と相
互作用している。また、Ｃ末端領域でセプチンと相互作
用し、それとともに母細胞と娘細胞の間のくびれに局在
して、セプチンの会合に機能していると考えられてい
る。セプチン機能の異常は、細胞周期のＧ２／Ｍ期の形
態チェックポイント機構にも関与しており、Ｇｉｎ４の
異常などによりセプチン機能に異常をきたすと、それを
Ｈｓｌ１やＨｓｌ７が感知して、そのシグナルがＳｗｅ
１に伝達されると細胞周期のＧ２からＭ期進行の遅延が
起こると考えられている。従って、Ｇｉｎ４は細胞骨格
形成や細胞周期制御に関わるタンパクであり、Ｇｉｎ４
ΔＮ過剰発現による異常な活性化を抑制する物質は、ガ
ンの転移やチェックポイント機構に関連した細胞周期制
御の異常に効果を示すことが期待できる。Ｇｉｎ４のＮ
末端側を削除したＧｉｎ４ΔＮを過剰発現させると酵母
は形態異常を引き起こし、増殖停止をすることが知られ
ている（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,26
7-274,1997）。
チェックポイント機構も標的とすることができる。Ｇｉ
ｎ４タンパクは、Ｃｄｃ４２、Ｎａｐ１、Ｃｌａ４と相
互作用している。また、Ｃ末端領域でセプチンと相互作
用し、それとともに母細胞と娘細胞の間のくびれに局在
して、セプチンの会合に機能していると考えられてい
る。セプチン機能の異常は、細胞周期のＧ２／Ｍ期の形
態チェックポイント機構にも関与しており、Ｇｉｎ４の
異常などによりセプチン機能に異常をきたすと、それを
Ｈｓｌ１やＨｓｌ７が感知して、そのシグナルがＳｗｅ
１に伝達されると細胞周期のＧ２からＭ期進行の遅延が
起こると考えられている。従って、Ｇｉｎ４は細胞骨格
形成や細胞周期制御に関わるタンパクであり、Ｇｉｎ４
ΔＮ過剰発現による異常な活性化を抑制する物質は、ガ
ンの転移やチェックポイント機構に関連した細胞周期制
御の異常に効果を示すことが期待できる。Ｇｉｎ４のＮ
末端側を削除したＧｉｎ４ΔＮを過剰発現させると酵母
は形態異常を引き起こし、増殖停止をすることが知られ
ている（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,26
7-274,1997）。
【００２５】プラスミドｐ３０３ＣＵＰＧＩＮ４を構築
して、それを酵母Ｗ３０３−１Ａ株に導入することで、
ＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ４過剰発現株ＲＡＫ
８１７を作成した。この株を銅含有培地（1% agar -L -
H 培地）に添加して、アッセイを行った。培地の銅イオ
ン濃度が０．７、０．５、０．２、０．１、０．０５ｍ
Ｍであるアッセイ培地を作成して、２８℃で４日間培養
した。バックグラウンドで生えてくる酵母を観察するこ
とでＧｉｎ４ΔＮの発現量を判断し、スクリーニングに
最適な培地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少
しバックグラウンドが生えてくる程度の０．１ｍＭの銅
含有培地が適当であると決定した（図３）。
して、それを酵母Ｗ３０３−１Ａ株に導入することで、
ＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ４過剰発現株ＲＡＫ
８１７を作成した。この株を銅含有培地（1% agar -L -
H 培地）に添加して、アッセイを行った。培地の銅イオ
ン濃度が０．７、０．５、０．２、０．１、０．０５ｍ
Ｍであるアッセイ培地を作成して、２８℃で４日間培養
した。バックグラウンドで生えてくる酵母を観察するこ
とでＧｉｎ４ΔＮの発現量を判断し、スクリーニングに
最適な培地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少
しバックグラウンドが生えてくる程度の０．１ｍＭの銅
含有培地が適当であると決定した（図３）。
【００２６】
【実施例４】ＧＩＮ４過剰発現アッセイを用いて、微生
物培養液の中から、ＧＩＮ４の異常な活性化を抑制する
生理活性物質のスクリーニングを行った。放線菌３８７
株の培養液をスクリーニングした結果、ＳＮＡ２３０１
６、ＳＮＡ２３０２７、ＳＮＡ２３０２８、ＳＮＡ２３
０２９、ＳＮＡ２３０３６、ＳＮＡ２３０３７、ＳＮＡ
２３０４０、ＳＮＡ２３０４４、ＳＮＡ２３０５２、Ｓ
ＮＡ２３０５５、ＳＮＡ２３０７５、ＳＮＡ２３０７
７、ＳＮＡ２３０８０、ＳＮＡ２３０８１、ＳＮＡ２３
０８２、ＳＮＡ２３０８３、ＳＮＡ２３０８４、ＳＮＡ
２３０８５、ＳＮＡ２３０８６、ＳＮＡ２３０８７、Ｓ
ＮＡ２３０８８、ＳＮＡ２３０８９、ＳＮＡ２３０９
１、ＳＮＡ２３０９２、ＳＮＡ２３０９３、ＳＮＡ２３
０９４、ＳＮＡ２３０９５、ＳＮＡ２３０９６、ＳＮＡ
２３０９７、ＳＮＡ２３０９８、ＳＮＡ２３０９９、Ｓ
ＮＡ２３１０９、ＳＮＡ２３１３６、ＳＮＡ２３１３
７、ＳＮＡ２３１６２、ＳＮＡ２３３４３、ＳＮＡ２３
３７１の３７株の培養液で、増殖停止の解除活性が示さ
れた。
物培養液の中から、ＧＩＮ４の異常な活性化を抑制する
生理活性物質のスクリーニングを行った。放線菌３８７
株の培養液をスクリーニングした結果、ＳＮＡ２３０１
６、ＳＮＡ２３０２７、ＳＮＡ２３０２８、ＳＮＡ２３
０２９、ＳＮＡ２３０３６、ＳＮＡ２３０３７、ＳＮＡ
２３０４０、ＳＮＡ２３０４４、ＳＮＡ２３０５２、Ｓ
ＮＡ２３０５５、ＳＮＡ２３０７５、ＳＮＡ２３０７
７、ＳＮＡ２３０８０、ＳＮＡ２３０８１、ＳＮＡ２３
０８２、ＳＮＡ２３０８３、ＳＮＡ２３０８４、ＳＮＡ
２３０８５、ＳＮＡ２３０８６、ＳＮＡ２３０８７、Ｓ
ＮＡ２３０８８、ＳＮＡ２３０８９、ＳＮＡ２３０９
１、ＳＮＡ２３０９２、ＳＮＡ２３０９３、ＳＮＡ２３
０９４、ＳＮＡ２３０９５、ＳＮＡ２３０９６、ＳＮＡ
２３０９７、ＳＮＡ２３０９８、ＳＮＡ２３０９９、Ｓ
ＮＡ２３１０９、ＳＮＡ２３１３６、ＳＮＡ２３１３
７、ＳＮＡ２３１６２、ＳＮＡ２３３４３、ＳＮＡ２３
３７１の３７株の培養液で、増殖停止の解除活性が示さ
れた。
【００２７】さらに活性物質を、ブタノ−ルまたは酢酸
エチルで抽出して、脂溶性であるか否かを調べた。スク
リーニングで増殖停止解除活性を示した物質は、ブタノ
−ルで抽出されたものや酢酸エチルで抽出されたものな
ど、様々であることが分かった。また、ＢＮＩ１のとき
と同じような活性を示す培養液もあれば、異なった活性
を示すものもあった。ＧＩＮ４過剰発現を利用したスク
リーニングにより、細胞骨格制御やチェックポイント機
構に作用すると思われる生理活性物質を含む培養液を数
多く取得することができた。またそれらには、表１に示
したＢＮＩ１過剰発現アッセイで活性を示す物質とは異
なる物質もあることがわかった（表２）。
エチルで抽出して、脂溶性であるか否かを調べた。スク
リーニングで増殖停止解除活性を示した物質は、ブタノ
−ルで抽出されたものや酢酸エチルで抽出されたものな
ど、様々であることが分かった。また、ＢＮＩ１のとき
と同じような活性を示す培養液もあれば、異なった活性
を示すものもあった。ＧＩＮ４過剰発現を利用したスク
リーニングにより、細胞骨格制御やチェックポイント機
構に作用すると思われる生理活性物質を含む培養液を数
多く取得することができた。またそれらには、表１に示
したＢＮＩ１過剰発現アッセイで活性を示す物質とは異
なる物質もあることがわかった（表２）。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【実施例５】スクリーニングにＧＩＮ１１を利用するこ
とで、テロメアをターゲットにしたスクリーニングを行
うことができる。ＧＩＮ１１は染色体末端テロメア領域
のＸ−エレメントのＤＮＡ配列であることが分かってい
る（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,267-27
4,1997）。ＧＩＮ１１を過剰発現すると酵母は増殖停止
を示すが、ＧＩＮ１１にはオープンリーディングフレー
ムが含まれておらず、過剰発現による増殖停止はＧＩＮ
１１がＲＮＡとして機能していると考えられている。テ
ロメアは、複製毎に短縮が見られ、ある程度まで短くな
ると細胞分裂が停止することから、細胞の絶対的な分裂
回数を制御していると言われている。この分裂回数制御
の異常はガン細胞の不死化と関係がある。ＧＩＮ１１の
領域はどの染色体にも非常に保存されているが、その機
能はまったく分かっていない。しかし、老いた細胞では
テロメアの短縮化に伴い、テロメアのサイレンシングに
機能を持つタンパク質が解離して分裂停止を引き起こす
ことから、ＧＩＮ１１がこれらの機能と関係があると考
えられる。従って、ＧＩＮ１１の過剰発現による異常を
抑制する生理活性物質は、ガンの不死化や老化に効果を
示すことが期待できる。
とで、テロメアをターゲットにしたスクリーニングを行
うことができる。ＧＩＮ１１は染色体末端テロメア領域
のＸ−エレメントのＤＮＡ配列であることが分かってい
る（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,267-27
4,1997）。ＧＩＮ１１を過剰発現すると酵母は増殖停止
を示すが、ＧＩＮ１１にはオープンリーディングフレー
ムが含まれておらず、過剰発現による増殖停止はＧＩＮ
１１がＲＮＡとして機能していると考えられている。テ
ロメアは、複製毎に短縮が見られ、ある程度まで短くな
ると細胞分裂が停止することから、細胞の絶対的な分裂
回数を制御していると言われている。この分裂回数制御
の異常はガン細胞の不死化と関係がある。ＧＩＮ１１の
領域はどの染色体にも非常に保存されているが、その機
能はまったく分かっていない。しかし、老いた細胞では
テロメアの短縮化に伴い、テロメアのサイレンシングに
機能を持つタンパク質が解離して分裂停止を引き起こす
ことから、ＧＩＮ１１がこれらの機能と関係があると考
えられる。従って、ＧＩＮ１１の過剰発現による異常を
抑制する生理活性物質は、ガンの不死化や老化に効果を
示すことが期待できる。
【００３０】プラスミドｐ３０６ＣＧＭ８６を酵母に導
入することで、ＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ１１
過剰発現株ＲＡＫ８０６を作成した。この株を培地に添
加してアッセイを行った。培地の銅イオン濃度が０．
７、０．５、０．２、０．１、０．０５ｍＭであるアッ
セイ培地を作成して、２８℃で４日間培養した。バック
グラウンドで生えてくる酵母を観察することでＧＩＮ１
１の発現量を判断し、スクリーニングに最適な培地銅イ
オン濃度を比較検討した。その結果、少しバックグラウ
ンドが生えてくる程度の０．２ｍＭの銅含有培地が適当
であると決定した。
入することで、ＣＵＰ１プロモーターによるＧＩＮ１１
過剰発現株ＲＡＫ８０６を作成した。この株を培地に添
加してアッセイを行った。培地の銅イオン濃度が０．
７、０．５、０．２、０．１、０．０５ｍＭであるアッ
セイ培地を作成して、２８℃で４日間培養した。バック
グラウンドで生えてくる酵母を観察することでＧＩＮ１
１の発現量を判断し、スクリーニングに最適な培地銅イ
オン濃度を比較検討した。その結果、少しバックグラウ
ンドが生えてくる程度の０．２ｍＭの銅含有培地が適当
であると決定した。
【００３１】ＧＩＮ１１過剰発現アッセイを用いて、微
生物培養液の中からＧＩＮ１１の異常な活性化を抑制す
る生理活性物質のスクリーニングを行った。ＳＮＡ２３
００１からＳＮＡ２３９０５までの放線菌９９９株の培
養液をスクリーニングした結果、ＳＮＡ２３９０５の一
株の培養液が、増殖停止の解除活性を示した。
生物培養液の中からＧＩＮ１１の異常な活性化を抑制す
る生理活性物質のスクリーニングを行った。ＳＮＡ２３
００１からＳＮＡ２３９０５までの放線菌９９９株の培
養液をスクリーニングした結果、ＳＮＡ２３９０５の一
株の培養液が、増殖停止の解除活性を示した。
【００３２】ＧＩＮ１１過剰発現アッセイで増殖停止解
除活性を示した物質を、ブタノ−ルまたは酢酸エチルと
混合して、それらに抽出されるか調べた。その結果、Ｓ
ＮＡ２３９０５の培養液に含まれる活性物質は、ブタノ
−ルや酢酸エチルで抽出されなかったことから、水溶性
の物質であることが分かった（表３）。
除活性を示した物質を、ブタノ−ルまたは酢酸エチルと
混合して、それらに抽出されるか調べた。その結果、Ｓ
ＮＡ２３９０５の培養液に含まれる活性物質は、ブタノ
−ルや酢酸エチルで抽出されなかったことから、水溶性
の物質であることが分かった（表３）。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【実施例６】本発明で開発したスクリーニングシステム
を用いて、ケミカルライブラリー化合物のスクリーニン
グを行った結果、細胞骨格制御に作用すると思われる様
々な化合物が取得できた。そこで、これらの化合物の酵
母細胞への作用を解析することにした。今回、ＢＮＩ１
過剰発現を利用したスクリーニングにおいて活性を示し
た３８種の化合物のうち、再度アッセイを行って再現性
が得られた３０種について作用の解析を行った。Ｂｎｉ
１タンパクはアクチンを介した細胞骨格制御に関わるタ
ンパクであることから、ＢＮＩ１過剰発現を利用したス
クリーニングで取得された化合物が、細胞骨格制御に作
用していることが考えられる。そこで、これらの化合物
が酵母の形態に影響を与えるか調べた。Ｂｎｉ１は様々
な細胞骨格制御に関わっている。そこで、その内の栄養
増殖中の出芽や、接合時の突起（シュムー）形成を顕微
鏡で観察することにした。
を用いて、ケミカルライブラリー化合物のスクリーニン
グを行った結果、細胞骨格制御に作用すると思われる様
々な化合物が取得できた。そこで、これらの化合物の酵
母細胞への作用を解析することにした。今回、ＢＮＩ１
過剰発現を利用したスクリーニングにおいて活性を示し
た３８種の化合物のうち、再度アッセイを行って再現性
が得られた３０種について作用の解析を行った。Ｂｎｉ
１タンパクはアクチンを介した細胞骨格制御に関わるタ
ンパクであることから、ＢＮＩ１過剰発現を利用したス
クリーニングで取得された化合物が、細胞骨格制御に作
用していることが考えられる。そこで、これらの化合物
が酵母の形態に影響を与えるか調べた。Ｂｎｉ１は様々
な細胞骨格制御に関わっている。そこで、その内の栄養
増殖中の出芽や、接合時の突起（シュムー）形成を顕微
鏡で観察することにした。
【００３５】５ａａ液体培地（YNB 1.7g , (NH4)2SO4 5
g , glucose 20g , 5aa mix 0.5gに蒸留水を加えて1リ
ットルに調製）の１８０μｌに、スクリーニングで活性
のあったライブラリーの化合物（１ｍＭ）を２μｌ加
え、Ｗ３０３−１Ａ株を２０μｌ植菌して２８℃で培養
した。なお 5aa mix の組成は、0.5g adenine sulfate,
2g L-histidine HCl, 4g L-leucine, 2g uracil およ
び L-tryptophan である。４時間後、８時間後に出芽に
おける形態を顕微鏡で観察した。ＤＭＳＯ（Dimethyl s
ulfoxide）を与えて培養したコントロールと比較した
が、出芽における形態に差は見つからなかった。
g , glucose 20g , 5aa mix 0.5gに蒸留水を加えて1リ
ットルに調製）の１８０μｌに、スクリーニングで活性
のあったライブラリーの化合物（１ｍＭ）を２μｌ加
え、Ｗ３０３−１Ａ株を２０μｌ植菌して２８℃で培養
した。なお 5aa mix の組成は、0.5g adenine sulfate,
2g L-histidine HCl, 4g L-leucine, 2g uracil およ
び L-tryptophan である。４時間後、８時間後に出芽に
おける形態を顕微鏡で観察した。ＤＭＳＯ（Dimethyl s
ulfoxide）を与えて培養したコントロールと比較した
が、出芽における形態に差は見つからなかった。
【００３６】次に、酵母にフェロモンと化合物の両方を
与え、シュムー形成における形態の変化を観察すること
にした。α-factor の濃度がそれぞれ１０、１、０．
１、０．０１ ｍｇ／ｍｌになるように５ａａ液体培地
に添加した後、フェロモンに感受性の高いＲＡＫ２１株
を植菌した。２８℃で８時間培養した後に、細胞がシュ
ムーを形成しているか調べた。その結果α-factor の濃
度が１０および１ｍｇ／ｍｌのとき、細胞がシュムーを
形成していた。そこで、α-factor の濃度の条件を１ｍ
ｇ／ｍｌとして実験を行うことにした。
与え、シュムー形成における形態の変化を観察すること
にした。α-factor の濃度がそれぞれ１０、１、０．
１、０．０１ ｍｇ／ｍｌになるように５ａａ液体培地
に添加した後、フェロモンに感受性の高いＲＡＫ２１株
を植菌した。２８℃で８時間培養した後に、細胞がシュ
ムーを形成しているか調べた。その結果α-factor の濃
度が１０および１ｍｇ／ｍｌのとき、細胞がシュムーを
形成していた。そこで、α-factor の濃度の条件を１ｍ
ｇ／ｍｌとして実験を行うことにした。
【００３７】５ａａ液体培地 １６０μｌに、１０ｍｇ
／ｍｌのα-factorを２０μｌ、ライブラリーの化合物
を２μｌ加え、それにＲＡＫ２１株を２０μｌ植菌し
た。２８℃で８時間培養した後、顕微鏡で観察すると、
１０Ｂ６や１２Ｈ１などのいくつかの化合物では、シュ
ムーが形成されていない細胞が見られた（図４）。そこ
で８時間の培養液１００μｌにホルマリン１０μｌを懸
濁して細胞を固定化した。また、残った培養液２０ｍｌ
を分取して、メチレンブルーで染色した。これらを用い
て細胞の生死を観察した。シュムーを形成した細胞と、
形成していない細胞の数を測定し、シュムーの形成率を
百分率で算出した（表４）。ライブラリーの化合物１０
Ｂ６、１２Ｈ１、２４Ｆ５、３０Ｅ３、３６Ｅ４、３９
Ｅ３、５５Ｄ７、７０Ｇ４、７０Ｈ５、７０Ｂ６、７０
Ｇ６、７０Ｈ６そして７４Ｇ６はシュムー形成を強く阻
害した。このうち、３９Ｅ３と７０Ｇ４は細胞のほとん
どがメチレンブルーで染色されたので、形態変化を起こ
す前に細胞が死んでしまったと考えられる。
／ｍｌのα-factorを２０μｌ、ライブラリーの化合物
を２μｌ加え、それにＲＡＫ２１株を２０μｌ植菌し
た。２８℃で８時間培養した後、顕微鏡で観察すると、
１０Ｂ６や１２Ｈ１などのいくつかの化合物では、シュ
ムーが形成されていない細胞が見られた（図４）。そこ
で８時間の培養液１００μｌにホルマリン１０μｌを懸
濁して細胞を固定化した。また、残った培養液２０ｍｌ
を分取して、メチレンブルーで染色した。これらを用い
て細胞の生死を観察した。シュムーを形成した細胞と、
形成していない細胞の数を測定し、シュムーの形成率を
百分率で算出した（表４）。ライブラリーの化合物１０
Ｂ６、１２Ｈ１、２４Ｆ５、３０Ｅ３、３６Ｅ４、３９
Ｅ３、５５Ｄ７、７０Ｇ４、７０Ｈ５、７０Ｂ６、７０
Ｇ６、７０Ｈ６そして７４Ｇ６はシュムー形成を強く阻
害した。このうち、３９Ｅ３と７０Ｇ４は細胞のほとん
どがメチレンブルーで染色されたので、形態変化を起こ
す前に細胞が死んでしまったと考えられる。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【実施例７】ＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリーニン
グで活性のあった化合物のいくつかは、フェロモンシグ
ナルによるシュムー形成を抑制するものがあった。そこ
でこれらの化合物が、フェロモンを与えることによって
引き起こされる細胞周期のＧ１期での増殖停止を解除で
きるかを調べた。
グで活性のあった化合物のいくつかは、フェロモンシグ
ナルによるシュムー形成を抑制するものがあった。そこ
でこれらの化合物が、フェロモンを与えることによって
引き起こされる細胞周期のＧ１期での増殖停止を解除で
きるかを調べた。
【００４０】１％ａｇａｒ ５ａａ培地にα-factor、Ｒ
ＡＫ２１株を添加して作成したプレートに、スクリーニ
ングで活性のあった化合物をスポットした。２８℃で６
日培養した後、酵母の生育状態を観察した（表５）。ラ
イブラリーの化合物１０Ｂ６、１２Ｈ１、２４Ｄ５、３
０Ｃ１１、３６Ｅ４および３９Ｅ３は、α-factorによ
るＧ１停止を解除する活性が強かった。
ＡＫ２１株を添加して作成したプレートに、スクリーニ
ングで活性のあった化合物をスポットした。２８℃で６
日培養した後、酵母の生育状態を観察した（表５）。ラ
イブラリーの化合物１０Ｂ６、１２Ｈ１、２４Ｄ５、３
０Ｃ１１、３６Ｅ４および３９Ｅ３は、α-factorによ
るＧ１停止を解除する活性が強かった。
【００４１】
【表５】
【００４２】
【実施例８】細胞骨格の主要な構成成分はアクチンやチ
ューブリンであり、それが重合や脱重合することで機能
している。従って、ＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリ
ーニングで活性のあった化合物は、それらの機構に影響
を与えるかもしれない。ラトランキュリン−Ａ（Latrun
culin-A）はアクチンモノマーに結合し、アクチンの重
合を阻害して細胞の増殖を阻害する薬剤である。化合物
にアクチンの重合を促進するような作用があれば、ラト
ランキュリン−Ａの増殖阻害に対して拮抗作用を示し、
反対にアクチン重合を抑制するような作用があれば、相
乗・相加作用を示すと考えられる。また、チューブリン
の重合阻害剤であるベノミル（Benomyl）を用いれば、
アクチン重合同様、チューブリン重合における作用を調
べることができる。そこで酵母を添加して作成したプレ
ートに、これらの薬剤と化合物を同時にスポットして、
ラトランキュリン−Ａやベノミルによる増殖阻止円（ハ
ロ）の形状を調べることにした。
ューブリンであり、それが重合や脱重合することで機能
している。従って、ＢＮＩ１過剰発現を利用したスクリ
ーニングで活性のあった化合物は、それらの機構に影響
を与えるかもしれない。ラトランキュリン−Ａ（Latrun
culin-A）はアクチンモノマーに結合し、アクチンの重
合を阻害して細胞の増殖を阻害する薬剤である。化合物
にアクチンの重合を促進するような作用があれば、ラト
ランキュリン−Ａの増殖阻害に対して拮抗作用を示し、
反対にアクチン重合を抑制するような作用があれば、相
乗・相加作用を示すと考えられる。また、チューブリン
の重合阻害剤であるベノミル（Benomyl）を用いれば、
アクチン重合同様、チューブリン重合における作用を調
べることができる。そこで酵母を添加して作成したプレ
ートに、これらの薬剤と化合物を同時にスポットして、
ラトランキュリン−Ａやベノミルによる増殖阻止円（ハ
ロ）の形状を調べることにした。
【００４３】Ｗ３０３−１Ａ株を１％ａｇａｒ ５ａａ
培地に添加してプレートを作成した。そこに１ｍＭのラ
トランキュリン−Ａと化合物をそれぞれ１０ｍｍの間隔
で３μｌスポットした。２８℃で培養後、ハロの形状を
観察した。化合物１０Ｂ６、２４Ｄ５、３０Ｃ１１、３
６Ｅ４、５５Ｄ７、７０Ｇ４、７０Ｈ５、７０Ｇ６、７
０Ｈ６で拮抗作用を示した（図５ および 表６）。これ
らの化合物はアクチンの重合を促進させる作用をしてい
ると考えられる。またＢＮＩ１で活性のあった化合物１
２Ｈ１は、強い相乗作用を示した。これはアクチンの重
合を阻害する作用があると考えられる。
培地に添加してプレートを作成した。そこに１ｍＭのラ
トランキュリン−Ａと化合物をそれぞれ１０ｍｍの間隔
で３μｌスポットした。２８℃で培養後、ハロの形状を
観察した。化合物１０Ｂ６、２４Ｄ５、３０Ｃ１１、３
６Ｅ４、５５Ｄ７、７０Ｇ４、７０Ｈ５、７０Ｇ６、７
０Ｈ６で拮抗作用を示した（図５ および 表６）。これ
らの化合物はアクチンの重合を促進させる作用をしてい
ると考えられる。またＢＮＩ１で活性のあった化合物１
２Ｈ１は、強い相乗作用を示した。これはアクチンの重
合を阻害する作用があると考えられる。
【００４４】
【表６】
【００４５】Ｗ３０３−１Ａ株を１％ａｇａｒ ５ａａ
培地に添加してプレートを作成した。そこに１ｍｇ／ｍ
ｌのベノミルと化合物をそれぞれ１０ｍｍの間隔で３μ
ｌスポットした。２８℃で培養後、ハロの形状を観察し
た。化合物７０Ｇ４、７０Ｇ５、７０Ｈ５、７０Ｇ６で
強い拮抗作用を示した。この化合物はチューブリンの重
合を促進させる作用をしていると考えられる。
培地に添加してプレートを作成した。そこに１ｍｇ／ｍ
ｌのベノミルと化合物をそれぞれ１０ｍｍの間隔で３μ
ｌスポットした。２８℃で培養後、ハロの形状を観察し
た。化合物７０Ｇ４、７０Ｇ５、７０Ｈ５、７０Ｇ６で
強い拮抗作用を示した。この化合物はチューブリンの重
合を促進させる作用をしていると考えられる。
【００４６】
【実施例９】さらにスクリーニングの系を広げるため
に、過剰発現により増殖停止を示す遺伝子を取得して、
実施例９〜１３に示すような、新しいスクリーニング系
の開発を行った。
に、過剰発現により増殖停止を示す遺伝子を取得して、
実施例９〜１３に示すような、新しいスクリーニング系
の開発を行った。
【００４７】Ｂｏｉ１はＢｅｍ１結合タンパクとして同
定され、細胞増殖や出芽の過程において機能する。Ｂｅ
ｍ１はフェロモンシグナル伝達径路のＳｔｅ２０に結合
しており、シグナル伝達に関係している。また、アクチ
ン細胞骨格や、Ｃｄｃ２４に結合しており、それらを介
して細胞骨格制御にも関わっている。従って、Ｂｏｉ１
の異常な活性化を抑制する物質は、ガンの転移や過剰増
殖に効果を示すと考えられる。ＢＯＩ１遺伝子を過剰発
現させると、酵母は増殖停止をすることが知られている
（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,267-274,
1997）。そこで、この遺伝子を利用したスクリーニング
システムを開発した。
定され、細胞増殖や出芽の過程において機能する。Ｂｅ
ｍ１はフェロモンシグナル伝達径路のＳｔｅ２０に結合
しており、シグナル伝達に関係している。また、アクチ
ン細胞骨格や、Ｃｄｃ２４に結合しており、それらを介
して細胞骨格制御にも関わっている。従って、Ｂｏｉ１
の異常な活性化を抑制する物質は、ガンの転移や過剰増
殖に効果を示すと考えられる。ＢＯＩ１遺伝子を過剰発
現させると、酵母は増殖停止をすることが知られている
（Akada, R. et al. , Mol. Gen. Genet. 254,267-274,
1997）。そこで、この遺伝子を利用したスクリーニング
システムを開発した。
【００４８】プラスミドｐ３０６ＣＵＰＢＯＩ１を構築
して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することでＣＵＰ
１プロモーターによるＢＯＩ１過剰発現株ＲＡＫ１５５
５を作成した。この株を銅含有培地に添加してアッセイ
を行うことにした。培地の銅イオン濃度が０．０８、
０．０６、０．０４、０．０２ｍＭであるアッセイ培地
を作成して、２８℃で４日間培養した。バックグラウン
ドで生えてくる酵母を観察することでＢＯＩ１の発現量
を調べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比
較検討した。その結果、少しバックグラウンドが生えて
くる程度の０．０４ｍＭの銅含有培地が適当であると判
断した。
して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することでＣＵＰ
１プロモーターによるＢＯＩ１過剰発現株ＲＡＫ１５５
５を作成した。この株を銅含有培地に添加してアッセイ
を行うことにした。培地の銅イオン濃度が０．０８、
０．０６、０．０４、０．０２ｍＭであるアッセイ培地
を作成して、２８℃で４日間培養した。バックグラウン
ドで生えてくる酵母を観察することでＢＯＩ１の発現量
を調べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比
較検討した。その結果、少しバックグラウンドが生えて
くる程度の０．０４ｍＭの銅含有培地が適当であると判
断した。
【００４９】
【実施例１０】Ｇｉｎ１２タンパクはＳｐｂ４２とも言
われ、紡錘体極の構成要素である。従って、ＧＩＮ１２
遺伝子の過剰発現による異常な活性化を抑制する物質
は、細胞分裂の異常に効果を示すことが期待できる。こ
の遺伝子を過剰発現させると、細胞周期のＧ２／Ｍ期で
停止することが知られている（Akada, R. et al. , Mo
l.Gen. Genet. 254,267-274,1997）。そこでこの遺伝子
を利用したスクリーニングシステムを開発することにし
た。
われ、紡錘体極の構成要素である。従って、ＧＩＮ１２
遺伝子の過剰発現による異常な活性化を抑制する物質
は、細胞分裂の異常に効果を示すことが期待できる。こ
の遺伝子を過剰発現させると、細胞周期のＧ２／Ｍ期で
停止することが知られている（Akada, R. et al. , Mo
l.Gen. Genet. 254,267-274,1997）。そこでこの遺伝子
を利用したスクリーニングシステムを開発することにし
た。
【００５０】プラスミドｐ３０６ＣＵＰＧＩＮ１２を構
築して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することでＣＵ
Ｐ１プロモーターによるＧＩＮ１２過剰発現株ＲＡＫ１
５５４を作成した。この株を銅含有培地に添加してアッ
セイを行うことにした。培地の銅イオン濃度が、０．
６、０．４、０．２、０．１ｍＭであるアッセイ培地を
作成し、２８℃で４日間培養して、バックグラウンドで
生えてくる酵母を観察することでＧＩＮ１２の発現量を
調べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比較
検討した。その結果、少しバックグラウンドが生えてく
る程度の０．４ｍＭの銅含有培地が適当であると判断し
た。
築して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することでＣＵ
Ｐ１プロモーターによるＧＩＮ１２過剰発現株ＲＡＫ１
５５４を作成した。この株を銅含有培地に添加してアッ
セイを行うことにした。培地の銅イオン濃度が、０．
６、０．４、０．２、０．１ｍＭであるアッセイ培地を
作成し、２８℃で４日間培養して、バックグラウンドで
生えてくる酵母を観察することでＧＩＮ１２の発現量を
調べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比較
検討した。その結果、少しバックグラウンドが生えてく
る程度の０．４ｍＭの銅含有培地が適当であると判断し
た。
【００５１】
【実施例１１】Ｔｐｋ３タンパクはｃＡＭＰ依存性タン
パク質キナーゼの触媒サブユニットであり、細胞内のシ
グナル伝達に関係する。Ｇタンパク連結型の受容体は、
小型細胞内シグナル分子の濃度を変化させる一連の過程
を活性化して、シグナルを伝達する。受容体に細胞外リ
ガンドが結合すると、細胞内のコンフォーメーション変
化によりＧタンパクが結合し、その結果、膜に結合した
酵素が活性化され、ｃＡＭＰの濃度を増幅させて下流へ
とシグナルを伝達する。従って、ＴＰＫ３の過剰発現に
よる異常を抑制する生理活性物質を探索することによ
り、シグナル伝達の阻害剤が得られると考えられる。Ｔ
ＰＫ３遺伝子の過剰発現は、酵母の増殖停止を引き起こ
すことが知られている（Akada, R. et al. , Mol. Gen.
Genet. 254,267-274,1997）。そこで、この遺伝子を利
用したスクリーニングシステムを、開発することにし
た。
パク質キナーゼの触媒サブユニットであり、細胞内のシ
グナル伝達に関係する。Ｇタンパク連結型の受容体は、
小型細胞内シグナル分子の濃度を変化させる一連の過程
を活性化して、シグナルを伝達する。受容体に細胞外リ
ガンドが結合すると、細胞内のコンフォーメーション変
化によりＧタンパクが結合し、その結果、膜に結合した
酵素が活性化され、ｃＡＭＰの濃度を増幅させて下流へ
とシグナルを伝達する。従って、ＴＰＫ３の過剰発現に
よる異常を抑制する生理活性物質を探索することによ
り、シグナル伝達の阻害剤が得られると考えられる。Ｔ
ＰＫ３遺伝子の過剰発現は、酵母の増殖停止を引き起こ
すことが知られている（Akada, R. et al. , Mol. Gen.
Genet. 254,267-274,1997）。そこで、この遺伝子を利
用したスクリーニングシステムを、開発することにし
た。
【００５２】プラスミドｐＣＵＰ３０６ＴＰＫ３を構築
して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することで、ＣＵ
Ｐ１プロモーターによるＴＰＫ３過剰発現株ＲＡＫ１５
５３を作成した。この株を銅含有培地に添加して、アッ
セイを行うことにした。培地の銅イオン濃度が、０．
８、０．６、０．４、０．２ｍＭであるアッセイ培地を
作成して、２８℃で４日間培養し、バックグラウンドで
生えてくる酵母を観察することでＴＰＫ３の発現量を調
べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比較検
討した。その結果、少しバックグラウンドが生えてくる
程度の０．６ｍＭの銅含有培地が適当であると判断し
た。
して、それをＷ３０３−１Ａ株に導入することで、ＣＵ
Ｐ１プロモーターによるＴＰＫ３過剰発現株ＲＡＫ１５
５３を作成した。この株を銅含有培地に添加して、アッ
セイを行うことにした。培地の銅イオン濃度が、０．
８、０．６、０．４、０．２ｍＭであるアッセイ培地を
作成して、２８℃で４日間培養し、バックグラウンドで
生えてくる酵母を観察することでＴＰＫ３の発現量を調
べ、スクリーニングに最適な培地銅イオン濃度を比較検
討した。その結果、少しバックグラウンドが生えてくる
程度の０．６ｍＭの銅含有培地が適当であると判断し
た。
【００５３】
【実施例１２】Ａｂｐ１タンパクはアクチンパッチの構
成要素であり、出芽時のアクチンに結合してアクチンフ
ィラメントを安定化させていると考えられる。遺伝子Ａ
ＢＰ１の過剰発現はアクチン細胞骨格を異常にして、異
常な出芽パターンを示すことが分かっている（Liu , H.
et al. , Genetics 132,665-673,1992）。このことか
ら、ＡＢＰ１の過剰発現による異常を抑制する物質は、
ガンの浸潤や転移などの細胞骨格形成異常に効果を示す
ことが期待できる。そこで、この遺伝子を利用したスク
リーニングシステムを開発することにした。
成要素であり、出芽時のアクチンに結合してアクチンフ
ィラメントを安定化させていると考えられる。遺伝子Ａ
ＢＰ１の過剰発現はアクチン細胞骨格を異常にして、異
常な出芽パターンを示すことが分かっている（Liu , H.
et al. , Genetics 132,665-673,1992）。このことか
ら、ＡＢＰ１の過剰発現による異常を抑制する物質は、
ガンの浸潤や転移などの細胞骨格形成異常に効果を示す
ことが期待できる。そこで、この遺伝子を利用したスク
リーニングシステムを開発することにした。
【００５４】Ｗ３０３−１Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲにより、ＡＢＰ１を取得して、プラスミドｐ
３０６ＣＵＰＡＢＰ１を構築した。これをＷ３０３−１
Ａ株に導入することでＣＵＰ１プロモーターによるＡＢ
Ｐ１過剰発現株ＲＡＫ１５５７を作成した。この株を銅
含有培地に添加してアッセイを行うことにした。培地の
銅イオン濃度が、０．８、０．６、０．４、０．２ｍＭ
であるアッセイ培地を作成し、２８℃で４日間培養し
て、バックグラウンドで生えてくる酵母を観察すること
でＡＢＰ１の発現量を調べ、スクリーニングに最適な培
地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少しバック
グラウンドが生えてくる程度の０．６ｍＭの銅含有培地
が適当であると判断した。
したＰＣＲにより、ＡＢＰ１を取得して、プラスミドｐ
３０６ＣＵＰＡＢＰ１を構築した。これをＷ３０３−１
Ａ株に導入することでＣＵＰ１プロモーターによるＡＢ
Ｐ１過剰発現株ＲＡＫ１５５７を作成した。この株を銅
含有培地に添加してアッセイを行うことにした。培地の
銅イオン濃度が、０．８、０．６、０．４、０．２ｍＭ
であるアッセイ培地を作成し、２８℃で４日間培養し
て、バックグラウンドで生えてくる酵母を観察すること
でＡＢＰ１の発現量を調べ、スクリーニングに最適な培
地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少しバック
グラウンドが生えてくる程度の０．６ｍＭの銅含有培地
が適当であると判断した。
【００５５】
【実施例１３】Ｋａｒ１タンパクは紡錘体極の構成要素
であり、分裂や接合において微小管が機能するためにこ
のタンパクは重要である。ＫＡＲ１遺伝子の過剰発現は
致死性を示し、母細胞だけが、非常に大きく丸くなった
状態で増殖を停止することが知られている（Rose M. D.
et al. , Cell 48,1047-1060,1987）。従って、ＫＡＲ
１過剰発現による異常を抑制する物質は、細胞核の分裂
や融合に作用する生理活性物質であることが期待でき
る。
であり、分裂や接合において微小管が機能するためにこ
のタンパクは重要である。ＫＡＲ１遺伝子の過剰発現は
致死性を示し、母細胞だけが、非常に大きく丸くなった
状態で増殖を停止することが知られている（Rose M. D.
et al. , Cell 48,1047-1060,1987）。従って、ＫＡＲ
１過剰発現による異常を抑制する物質は、細胞核の分裂
や融合に作用する生理活性物質であることが期待でき
る。
【００５６】Ｗ３０３−１Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲによりＫＡＲ１を取得して、プラスミドｐ３
０６ＣＵＰＫＡＲ１を構築した。これをＷ３０３−１Ａ
株に導入することでＣＵＰ１プロモーターによるＫＡＲ
１過剰発現株ＲＡＫ１５５８を作成した。この株を銅含
有培地に添加して、アッセイを行うことにした。培地の
銅イオン濃度が、０．８、０．６、０．４、０．２ｍＭ
であるアッセイ培地を作成し、２８℃で４日間培養し
て、バックグラウンドで生えてくる酵母を観察すること
でＫＡＲ１の発現量を調べ、スクリーニングに最適な培
地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少しバック
グラウンドが生えてくる程度の０．６ｍＭの銅含有培地
が適当であると判断した。
したＰＣＲによりＫＡＲ１を取得して、プラスミドｐ３
０６ＣＵＰＫＡＲ１を構築した。これをＷ３０３−１Ａ
株に導入することでＣＵＰ１プロモーターによるＫＡＲ
１過剰発現株ＲＡＫ１５５８を作成した。この株を銅含
有培地に添加して、アッセイを行うことにした。培地の
銅イオン濃度が、０．８、０．６、０．４、０．２ｍＭ
であるアッセイ培地を作成し、２８℃で４日間培養し
て、バックグラウンドで生えてくる酵母を観察すること
でＫＡＲ１の発現量を調べ、スクリーニングに最適な培
地銅イオン濃度を比較検討した。その結果、少しバック
グラウンドが生えてくる程度の０．６ｍＭの銅含有培地
が適当であると判断した。
【００５７】
【実施例１４】本発明の生理活性物質のスクリーニング
システムが、既知の薬剤に対し、どのような活性を検出
できるかを検定した（表７ および 表８）。本実施例で
用いた過剰発現アッセイ系の組み合せは、あくまでも一
つの例であって、試験対象とする薬剤の種類および性質
によって、最適の組み合わせを選択すべきものである。
システムが、既知の薬剤に対し、どのような活性を検出
できるかを検定した（表７ および 表８）。本実施例で
用いた過剰発現アッセイ系の組み合せは、あくまでも一
つの例であって、試験対象とする薬剤の種類および性質
によって、最適の組み合わせを選択すべきものである。
【００５８】用いた薬剤は、シグナル伝達の阻害剤とし
てラディシコール（Radicicol）、ハービマイシン−Ａ
（Herbimycin-A）、ワートマンニン（Wortmannin）、
マニュマイシン−Ａ（Manumycin-A）、Ｙ２３４９７、
Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、 細胞骨格形成の阻害剤
として ラトランキュリン−Ａとベノミルである。
てラディシコール（Radicicol）、ハービマイシン−Ａ
（Herbimycin-A）、ワートマンニン（Wortmannin）、
マニュマイシン−Ａ（Manumycin-A）、Ｙ２３４９７、
Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、 細胞骨格形成の阻害剤
として ラトランキュリン−Ａとベノミルである。
【００５９】
【表７】
【００６０】
【表８】
【００６１】ＳＴＥ１１過剰発現アッセイでは数種の薬
剤で活性が見られ、特にラディシコールでは非常に強い
活性を示した。ＢＮＩ１やＢＯＩ１過剰発現アッセイで
も、数種の薬剤で活性が見られ、特にワートマンニン、
マニュマイシン−Ａが非常に強い活性を示した。さらに
ＢＮＩ１過剰発現アッセイでは、ラトランキュリン−Ａ
やベノミルも非常に強い活性を示した。また、ＴＰＫ３
過剰発現アッセイにおいても、数種の薬剤が活性を示し
た。ＧＩＮ４、ＧＩＮ１１、ＧＩＮ１２そしてＡＢＰ１
過剰発現アッセイでは、本実施例で使用した薬剤は、活
性を有していないことが判明した。
剤で活性が見られ、特にラディシコールでは非常に強い
活性を示した。ＢＮＩ１やＢＯＩ１過剰発現アッセイで
も、数種の薬剤で活性が見られ、特にワートマンニン、
マニュマイシン−Ａが非常に強い活性を示した。さらに
ＢＮＩ１過剰発現アッセイでは、ラトランキュリン−Ａ
やベノミルも非常に強い活性を示した。また、ＴＰＫ３
過剰発現アッセイにおいても、数種の薬剤が活性を示し
た。ＧＩＮ４、ＧＩＮ１１、ＧＩＮ１２そしてＡＢＰ１
過剰発現アッセイでは、本実施例で使用した薬剤は、活
性を有していないことが判明した。
【００６２】ラディシコールはＨｓｐ９０と結合し、Ｈ
ｓｐ９０タンパクを不安定化させる。また、細胞のトラ
ンスフォーメーションに効果を示すことが知られてい
る。この薬剤は、ＳＴＥ１１のアッセイ系とＴＰＫ３の
アッセイ系で、強い活性が検出できた。また、Ｓｒｃキ
ナーゼ阻害剤であるハービマイシン−Ａも、ＳＴＥ１１
およびＴＰＫ３のアッセイ系で検出できた。Ｒａｓファ
ルネシルトランスフェラーゼ阻害薬であるマニュマイシ
ン−Ａは、ＢＮＩ１、ＳＴＥ４、ＢＯＩ１およびＴＰＫ
３の系で検出できた。ＰＩ３キナーゼ阻害剤として知ら
れるワートマンニンは、ＢＮＩ１，ＢＯＩ１の系で強い
活性が検出された。またＲＯＣＫタンパクの特異的阻害
剤であるＹ−２３４７９は、今回のアッセイ系の組み合
せでは、活性が検出されなかった。
ｓｐ９０タンパクを不安定化させる。また、細胞のトラ
ンスフォーメーションに効果を示すことが知られてい
る。この薬剤は、ＳＴＥ１１のアッセイ系とＴＰＫ３の
アッセイ系で、強い活性が検出できた。また、Ｓｒｃキ
ナーゼ阻害剤であるハービマイシン−Ａも、ＳＴＥ１１
およびＴＰＫ３のアッセイ系で検出できた。Ｒａｓファ
ルネシルトランスフェラーゼ阻害薬であるマニュマイシ
ン−Ａは、ＢＮＩ１、ＳＴＥ４、ＢＯＩ１およびＴＰＫ
３の系で検出できた。ＰＩ３キナーゼ阻害剤として知ら
れるワートマンニンは、ＢＮＩ１，ＢＯＩ１の系で強い
活性が検出された。またＲＯＣＫタンパクの特異的阻害
剤であるＹ−２３４７９は、今回のアッセイ系の組み合
せでは、活性が検出されなかった。
【００６３】アクチンモノマーに結合してアクチン重合
を阻害するラトランキュリン−Ａは、ＢＮＩ１のアッセ
イ系で強い活性を検出できた。またチューブリン重合を
阻害するベノミルも、ＢＮＩ１の系で強い活性を検出で
きた。従って、細胞骨格制御に関わるＢＮＩ１の異常を
治す薬の中には、細胞骨格形成に直接作用するものもあ
ることが判明した。ＢＮＩ１の系においては、Ｇタンパ
クファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬のようなシグ
ナル伝達の阻害剤から、細胞骨格形成の直接的な阻害剤
までにわたる、細胞骨格制御に関わるタンパクの阻害剤
が、幅広く検出できることが判明した。
を阻害するラトランキュリン−Ａは、ＢＮＩ１のアッセ
イ系で強い活性を検出できた。またチューブリン重合を
阻害するベノミルも、ＢＮＩ１の系で強い活性を検出で
きた。従って、細胞骨格制御に関わるＢＮＩ１の異常を
治す薬の中には、細胞骨格形成に直接作用するものもあ
ることが判明した。ＢＮＩ１の系においては、Ｇタンパ
クファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬のようなシグ
ナル伝達の阻害剤から、細胞骨格形成の直接的な阻害剤
までにわたる、細胞骨格制御に関わるタンパクの阻害剤
が、幅広く検出できることが判明した。
【００６４】ＢＮＩ１とＢＯＩ１の過剰発現アッセイ系
では、シグナル伝達阻害剤に対して、同じような反応を
示した。しかし、ＢＮＩ１過剰発現アッセイでは、細胞
骨格形成阻害剤であるラトランキュリン−Ａやベノミル
の活性を検出できるのに対して、ＢＯＩ１過剰発現アッ
セイでは検出できない。このような事実をふまえて、新
規薬剤のスクリーニングにおいて、本発明に示したよう
な複数のアッセイ系の中から目的にあったアッセイ系の
みを選択し、並列してスクリーニングを行うことによ
り、効率的なスクリーニングが行えるという利点を示す
ことができた。それだけでなく、単一の活性を有する化
合物であるか、それとも複数の活性を有する化合物であ
るかを、同時に知ることができた。従って、本発明の効
率的なスクリーニング方法の使用にあたり、適切なる複
数のアッセイ系の選択と並列的な実行により、目的とす
る生理活性物質の活性に関する豊富な情報が得られると
いう点で大きなメリットを有しており、医薬研究開発の
効率化に大きく寄与することができる。
では、シグナル伝達阻害剤に対して、同じような反応を
示した。しかし、ＢＮＩ１過剰発現アッセイでは、細胞
骨格形成阻害剤であるラトランキュリン−Ａやベノミル
の活性を検出できるのに対して、ＢＯＩ１過剰発現アッ
セイでは検出できない。このような事実をふまえて、新
規薬剤のスクリーニングにおいて、本発明に示したよう
な複数のアッセイ系の中から目的にあったアッセイ系の
みを選択し、並列してスクリーニングを行うことによ
り、効率的なスクリーニングが行えるという利点を示す
ことができた。それだけでなく、単一の活性を有する化
合物であるか、それとも複数の活性を有する化合物であ
るかを、同時に知ることができた。従って、本発明の効
率的なスクリーニング方法の使用にあたり、適切なる複
数のアッセイ系の選択と並列的な実行により、目的とす
る生理活性物質の活性に関する豊富な情報が得られると
いう点で大きなメリットを有しており、医薬研究開発の
効率化に大きく寄与することができる。
【００６５】
【発明の効果】本発明によれば、ガンやアレルギーなど
のヒト疾患の治療に有用な生理活性物質のスクリーニン
グを、酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用したス
クリーニング方法によって、効率的に行うことが可能で
ある。
のヒト疾患の治療に有用な生理活性物質のスクリーニン
グを、酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用したス
クリーニング方法によって、効率的に行うことが可能で
ある。
【００６６】また、酵母の増殖の有無を指標として生理
活性物質の活性を判定することを特徴とするため、試験
結果の判定が容易である。遺伝子の過剰発現にＣＵＰ１
プロモーターを用いる場合には、培地中のグルコースの
影響を受けることなく、明確で効率的なスクリーニング
結果が得られる。
活性物質の活性を判定することを特徴とするため、試験
結果の判定が容易である。遺伝子の過剰発現にＣＵＰ１
プロモーターを用いる場合には、培地中のグルコースの
影響を受けることなく、明確で効率的なスクリーニング
結果が得られる。
【００６７】過剰発現アッセイに用いる酵母の遺伝子
を、ＳＴＥ、ＢＮＩ、ＧＩＮ、ＴＰＫ、ＢＯＩ、ＡＢ
Ｐ、ＫＡＲから選択することにより、シグナル伝達経
路、細胞骨格制御機構などに作用する生理活性物質の効
率的なスクリーニングが可能であるだけでなく、選抜さ
れた化合物が有している複数の活性を検定できることか
ら、医薬研究開発の効率化に寄与することが期待でき
る。
を、ＳＴＥ、ＢＮＩ、ＧＩＮ、ＴＰＫ、ＢＯＩ、ＡＢ
Ｐ、ＫＡＲから選択することにより、シグナル伝達経
路、細胞骨格制御機構などに作用する生理活性物質の効
率的なスクリーニングが可能であるだけでなく、選抜さ
れた化合物が有している複数の活性を検定できることか
ら、医薬研究開発の効率化に寄与することが期待でき
る。
【図１】酵母のフェロモン情報伝達経路を示す図であ
る。
る。
【図２】酵母と動物細胞の細胞内情報伝達経路の共通性
を示す図である。
を示す図である。
【図３】ＧＩＮ４過剰発現アッセイ系における培地中の
銅イオン濃度の影響を示す写真である。
銅イオン濃度の影響を示す写真である。
【図４】化合物１０Ｂ６および１２Ｈ１の添加により突
起（シュムー）形成が阻害されていることを示す写真で
ある。
起（シュムー）形成が阻害されていることを示す写真で
ある。
【図５】ラトランキュリン−Ａハロアッセイにおける、
ラトランキュリン−Ａと化合物の効果の比較を示す写真
である。
ラトランキュリン−Ａと化合物の効果の比較を示す写真
である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 2G045 BB20 BB24 CB01 CB21 FA16
4B024 AA01 BA50 BA80 CA06 DA12
EA04 FA02 GA11
4B063 QA20 QQ06 QR76 QR80 QS05
QS25 QX01
4B065 AA72X AA72Y AB01 AC20
BA02 BB02 CA46
Claims (6)
- 【請求項１】 酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利
用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法。 - 【請求項２】 酵母の増殖の有無を指標として生理活性
物質の活性を判定することを特徴とする、請求項１に記
載の酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理
活性物質の効率的なスクリーニング方法。 - 【請求項３】 遺伝子の過剰発現にＣＵＰ１プロモータ
ーを用いることを特徴とする、請求項１または請求項２
に記載の酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した
生理活性物質の効率的なスクリーニング方法。 - 【請求項４】 培地中の銅イオン濃度をコントロールす
ることにより酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を最適
化することを特徴とする、請求項３に記載の酵母遺伝子
群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率
的なスクリーニング方法。 - 【請求項５】 スクリーニングに用いる遺伝子がＳＴ
Ｅ、ＢＮＩ、ＧＩＮ、ＴＰＫ、ＢＯＩ、ＡＢＰ、ＫＡＲ
から選択される複数の遺伝子であることを特徴とする酵
母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物
質の効率的なスクリーニング方法。 - 【請求項６】 スクリーニングに用いる遺伝子がＧＩＮ
１２、ＡＢＰ１、ＫＡＲ１、ＢＯＩ１、ＴＰＫ３ から
選択される複数の遺伝子であることを特徴とする酵母遺
伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の
効率的なスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001150480A JP2003000239A (ja) | 2001-05-21 | 2001-05-21 | 酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001150480A JP2003000239A (ja) | 2001-05-21 | 2001-05-21 | 酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003000239A true JP2003000239A (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=18995481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001150480A Pending JP2003000239A (ja) | 2001-05-21 | 2001-05-21 | 酵母遺伝子群の過剰発現アッセイ系を利用した生理活性物質の効率的なスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003000239A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013535185A (ja) * | 2010-07-05 | 2013-09-12 | ウニヴェルシテート フュア ボーデンクルトゥーア ウィーン | 生産細胞株 |
-
2001
- 2001-05-21 JP JP2001150480A patent/JP2003000239A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013535185A (ja) * | 2010-07-05 | 2013-09-12 | ウニヴェルシテート フュア ボーデンクルトゥーア ウィーン | 生産細胞株 |
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