JP2003083969A - Linker compound and ligand, method for immobilizing oligosaccharide chain, and support for protein analysis - Google Patents
Linker compound and ligand, method for immobilizing oligosaccharide chain, and support for protein analysisInfo
- Publication number
- JP2003083969A JP2003083969A JP2001280672A JP2001280672A JP2003083969A JP 2003083969 A JP2003083969 A JP 2003083969A JP 2001280672 A JP2001280672 A JP 2001280672A JP 2001280672 A JP2001280672 A JP 2001280672A JP 2003083969 A JP2003083969 A JP 2003083969A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ligand
- general formula
- support
- represented
- protein analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 自然界から単離、精製して得られる種々のオ
リゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体
表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共
に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との
疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響
が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的か
つ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ること
ができるリンカー化合物を提供する。
【解決手段】 リンカー化合物は、一般式（１）
【化３８】
で表される構造を有している。上記リンカー化合物は、
Ｓ−Ａｕ結合によりリガンド中のオリゴ糖鎖を蛋白質分
析用の支持体表面に一段階で固定できる。
PROBLEM TO BE SOLVED: To easily immobilize an oligosaccharide chain on the surface of a support for protein analysis in one step by directly using various oligosaccharides obtained by isolation and purification from the natural world. In addition, the effect of non-specific interactions based on hydrophobic interactions with proteins analyzed using a protein analysis support is reduced, and continuous and quantitative evaluation of binding interactions with various proteins is performed. Provided is a linker compound capable of obtaining a support for protein analysis. SOLUTION: The linker compound has a general formula (1): Has a structure represented by The linker compound,
The oligosaccharide chains in the ligand can be immobilized on the surface of the support for protein analysis in one step by S-Au bond.
Description
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴ糖鎖を、表
面プラズモン共鳴等のセンサチップやアフィニティーク
ロマトグラフィの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段
階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物およ
び該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンド
を用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを表
面に固定化させてなる蛋白質分析用の支持体に関するも
のである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a linker capable of introducing an oligosaccharide chain into a support for protein analysis such as a sensor chip for surface plasmon resonance or the like, a carrier for affinity chromatography or the like in one step, and immobilizing it. The present invention relates to a ligand using a compound and the linker compound, a method for immobilizing an oligosaccharide chain using the ligand, and a support for protein analysis in which the ligand is immobilized on the surface.
【０００２】[0002]
【従来の技術】下記一般式（６）2. Description of the Related Art The following general formula (6)
【０００３】[0003]
【化６】 [Chemical 6]
【０００４】で表される硫酸化多糖ヘパリンは、構造や
分子量が非常に不均一なものであり、多くの生物活性を
有することが知られている。そのなかでも、抗血液凝固
活性は有名であり、医薬として広く用いられている。It is known that the sulfated polysaccharide heparin represented by the formula (1) has a very heterogeneous structure and molecular weight and has many biological activities. Among them, anticoagulant activity is well known and widely used as a medicine.
【０００５】しかしながら、不均一な硫酸化多糖ヘパリ
ンは、血小板やフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）とも
結合する。このため、従来、硫酸化多糖ヘパリンを医薬
として用いた場合における血液中の血小板との結合に起
因する副作用が指摘されている。However, the heterogeneous sulfated polysaccharide heparin also binds to platelets and von Willebrand factor (vWF). For this reason, it has been conventionally pointed out that a side effect caused by binding to platelets in blood when using sulfated polysaccharide heparin as a medicine.
【０００６】これらの結合相互作用には、硫酸化多糖ヘ
パリン中の、下記一般式（７）These binding interactions include the following general formula (7) in the sulfated polysaccharide heparin.
【０００７】[0007]
【化７】 [Chemical 7]
【０００８】で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮ
Ｓ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と、それに基づくクラスタリン
グ効果が重要である。A specific partial disaccharide structure represented by (GlcN
S6S-IdoA2S) and the clustering effect based on it are important.
【０００９】本願発明者等は、以前に、この特定の部分
二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が血小板細
胞や血液凝固に関わるフォンビルブラント因子（ｖＷ
Ｆ）という蛋白質との結合に大きく関与することを見出
した。The present inventors have previously reported that this specific partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) is associated with platelet cells and blood coagulation von Willebrand factor (vW).
It was found that F) is greatly involved in binding to the protein.
【００１０】しかしながら、これらの生化学的結合実験
のためには特殊な設備や多量のオリゴ糖が必要になると
いう問題がある。生物活性測定法としては、従来、放射
標識法（ＲＩ法）とＳＰＲ法とが知られているが、ＲＩ
法は、特殊な実験設備や多量のオリゴ糖を必要とする。However, there is a problem that special equipment and a large amount of oligosaccharides are required for these biochemical binding experiments. Conventionally, the radiolabeling method (RI method) and the SPR method are known as biological activity measuring methods.
The method requires special laboratory equipment and large amounts of oligosaccharides.
【００１１】そこで、本願発明者等は、蛋白質分析用の
支持体として非放射標識法である表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）のセンサチップを使用し、図１１に示すよう
に、該センサチップの表面上に、疎水性相互作用を介し
て上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２
Ｓ）を固定化し、ＳＰＲを用いて硫酸化多糖ヘパリン中
の部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と硫
酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析し
た。ＳＰＲ法は、少量のオリゴ糖で測定が可能であり、
分子間の相互作用をリアルタイムで観測することが可能
である。なお、図１１中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖
構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮ
Ｓ６Ｓを示し、Ｉ２ＳはＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグル
コース単位を示す。Therefore, the inventors of the present invention used a sensor chip of surface plasmon resonance (SPR), which is a non-radiolabeling method, as a support for protein analysis, and as shown in FIG. In addition, the above-mentioned partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2)
S) was immobilized, and the binding behavior between the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) in the sulfated polysaccharide heparin and the sulfated polysaccharide heparin-binding protein was analyzed using SPR. The SPR method can measure with a small amount of oligosaccharides,
It is possible to observe the interaction between molecules in real time. In addition, in FIG. 11, NS6S represents GlcN in the partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) described above.
S6S is shown, I2S shows IdoA2S, G shows a glucose unit.
【００１２】具体的には、センサチップとしての疎水性
チップ上に上記部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−Ｉｄｏ
Ａ２Ｓ）を固定化し、この疎水性チップ上に、硫酸化多
糖ヘパリン結合性ドメインを有する合成ｖＷＦペプチド
（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト；ＹＩＧＬＫＤＲＫＲ
ＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−ＮＨ）をアナライトと
して添加した。Specifically, the above partial disaccharide structure (GlcNS6S-Ido) is formed on a hydrophobic chip as a sensor chip.
A2S) is immobilized and a synthetic vWF peptide having a sulfated polysaccharide heparin-binding domain (heparin-binding site in vWF; YIGLKDRKR) is immobilized on this hydrophobic chip.
PSELRRIASQVKYA-NH) was added as an analyte.
【００１３】この結果、図１２の線ａに示すように、ｖ
ＷＦペプチドの濃度変化に応じて結合量の変化、すなわ
ち、ΔＲＵ1 （オリゴ糖の結合量）／ΔＲＵ2 （ｖＷＦ
ペプチドの結合量）が観測された。As a result, as shown by the line a in FIG.
The change in the amount of binding according to the change in the concentration of the WF peptide, that is, ΔRU1 (the amount of oligosaccharide binding) / ΔRU2 (vWF
The amount of peptide bound) was observed.
【００１４】この線ａのカーブから求められる解離定数
ＫD は、以前にSobel等が生化学的手法を用いて測定(M.
Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857
、ＫD ＝ 370±100ｎＭ)した値にオーダーとして近い
ものであった。The dissociation constant K D obtained from the curve of the line a was previously measured by Sobel et al. Using a biochemical method (M.
Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857
, K D = 370 ± 100 nM).
【００１５】[0015]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この場
合、図１２の線ｂに示すように末端にグルコース残基を
有するリガンドを用いても、合成ｖＷＦペプチドとの結
合相互作用が観察されたことから、上記した値には、疎
水性親和力に起因すると思われる非特異的な相互作用、
つまり、上記センサチップの疎水性場と合成ｖＷＦペプ
チドとの非特異的な相互作用が含まれていることが判っ
た。However, in this case, the binding interaction with the synthetic vWF peptide was observed even when a ligand having a glucose residue at the end was used as shown by the line b in FIG. , The above values include non-specific interactions that may be attributed to hydrophobic affinity,
That is, it was found that the hydrophobic field of the sensor chip and the non-specific interaction with the synthetic vWF peptide are included.
【００１６】このため、このように蛋白質分析用の支持
体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく
非特異的な相互作用をほぼ無視できるリンカー化合物お
よびリガンド並びに該リガンドをチップに固定化する方
法、さらには、該リガンドを固定化した、例えばＳＰＲ
用のセンサチップ等の蛋白質分析用の支持体を提供する
ことは、上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−Ｉｄ
ｏＡ２Ｓ）と蛋白質との生化学的結合による結合相互作
用、つまり、構造が明確な硫酸化オリゴ糖と種々の蛋白
質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価する上で
非常に重要である。Therefore, a linker compound and a ligand which can substantially ignore non-specific interactions based on hydrophobic interactions with a protein to be analyzed using a support for protein analysis as described above, and the ligand are immobilized on a chip. And a method of immobilizing the ligand, for example, SPR
To provide a support for protein analysis such as a sensor chip for use in the above-mentioned partial disaccharide structure (GlcNS6S-Id).
oA2S) is a biochemical binding interaction between proteins, that is, it is very important for the continuous and quantitative evaluation of binding interactions between sulfated oligosaccharides with well-defined structures and various proteins. .
【００１７】また、近年、オリゴ糖鎖が生体内で重要な
働きを担っていることが明らかになっている。しかしな
がら、オリゴ糖鎖の分子レベルでの研究を行うには、上
記したように構造が完全に判っているオリゴ糖鎖を用い
なければならず、このようなオリゴ糖鎖を多量に天然か
ら得ることは困難であり、また、合成も容易ではないと
いう問題がある。Also, in recent years, it has been revealed that oligosaccharide chains play an important role in the living body. However, in order to study oligosaccharide chains at the molecular level, it is necessary to use oligosaccharide chains whose structures are completely known as described above, and it is necessary to obtain a large amount of such oligosaccharide chains from nature. Is difficult and the synthesis is not easy.
【００１８】また、オリゴ糖鎖は、それ一分子では活性
はそれほど高くないことが多く、蛋白質との相互作用を
解析するにはオリゴ糖鎖を集合化させる必要がある。つ
まり、一般的に、天然のオリゴ糖とそれが相互作用する
蛋白質との親和性は低いので、オリゴ糖の生物活性を評
価するためには、オリゴ糖鎖を効率よく集合化すること
が重要である。Further, the activity of oligosaccharide chains is not so high in one molecule in many cases, and it is necessary to assemble the oligosaccharide chains in order to analyze the interaction with proteins. In other words, since the affinity between natural oligosaccharides and the proteins with which they interact is generally low, it is important to efficiently assemble oligosaccharide chains in order to evaluate the biological activity of oligosaccharides. is there.
【００１９】従来、ＳＰＲ測定装置等に用いるセンサチ
ップの表面にオリゴ糖鎖を結合（固定化）する試みとし
ては、例えば、チップ表面に長鎖アルキル鎖の短分子膜
を作り、疎水性相互作用を利用してオリゴ糖鎖をチップ
に固定化する試み(G.M.Kuziemko et al., Biochemistr
y, Vol. 35, p6375, 1996年)がなされている。Conventionally, as an attempt to bind (immobilize) an oligosaccharide chain to the surface of a sensor chip used in an SPR measuring device or the like, for example, a short molecular film of a long alkyl chain is formed on the chip surface, and a hydrophobic interaction is formed. Attempt to immobilize oligosaccharide chains on a chip using GM (GM Kuziemko et al., Biochemistr
y, Vol. 35, p6375, 1996).
【００２０】しかしながら、上記文献に記載の方法は、
チップ表面に固定化することができるオリゴ糖鎖の種類
が限定され、ガングリオシド等の、疎水性基を有するオ
リゴ糖鎖はチップに固定化することはできるものの、様
々なオリゴ糖鎖をチップ表面に簡便に固定化することは
できない。また、上記従来の方法によりオリゴ糖鎖が固
定化されたチップは、チップ表面の疎水性が高すぎ、チ
ップを用いて分析する蛋白質との非特異的な相互作用が
大きく観測されてしまい、実用性に乏しいという問題点
を有している。However, the method described in the above document is
The types of oligosaccharide chains that can be immobilized on the chip surface are limited.Although oligosaccharide chains having a hydrophobic group such as ganglioside can be immobilized on the chip, various oligosaccharide chains can be immobilized on the chip surface. It cannot be immobilized easily. Further, the chip on which the oligosaccharide chain is immobilized by the above-mentioned conventional method has too high hydrophobicity on the chip surface, and a nonspecific interaction with the protein to be analyzed using the chip is largely observed, which is practical. It has a problem of poor sex.
【００２１】また、上記従来の方法でオリゴ糖鎖をチッ
プ表面に固定化するためには、合成化学を駆使し、オリ
ゴ糖鎖の水酸基に種々の保護基をまず導入し、それを化
学的に縮合した上で、さらにチップに固定化する必要が
ある。このため、従来は、自然界から単離、精製して得
られるオリゴ糖をそのまま用いてそのオリゴ糖鎖をチッ
プ表面に固定化することは事実上、不可能であった。Further, in order to immobilize oligosaccharide chains on the chip surface by the above-mentioned conventional method, synthetic chemistry is fully utilized, and various protecting groups are first introduced into the hydroxyl groups of oligosaccharide chains, which are chemically reacted. After condensation, it is necessary to further immobilize it on a chip. Therefore, conventionally, it was virtually impossible to immobilize the oligosaccharide chain on the chip surface by directly using the oligosaccharide obtained by isolation and purification from the natural world.
【００２２】さらに、オリゴ糖鎖と特異的に相互作用す
る蛋白質を分離精製するためには、構造既知のオリゴ糖
鎖をアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとし
て用いる必要がある。Further, in order to separate and purify a protein which specifically interacts with an oligosaccharide chain, it is necessary to use an oligosaccharide chain having a known structure as a ligand for affinity chromatography.
【００２３】このため、オリゴ糖鎖を集合化させ、上記
したＳＰＲ用のセンサチップまたはアフィニティークロ
マトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体上に固
定化させることができると共に、多種のオリゴ糖を一段
階で導入することが可能なリンカー化合物および該リン
カー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドをチップ
に固定化する方法、さらには、該リガンドを固定化した
蛋白質分析用の支持体が求められている。For this reason, oligosaccharide chains can be assembled and immobilized on a support for protein analysis such as the above-mentioned SPR sensor chip or carrier for affinity chromatography, and various oligosaccharides can be immobilized. There is a demand for a linker compound that can be introduced in one step, a ligand using the linker compound, a method for immobilizing the ligand on a chip, and a support for immobilizing the ligand for protein analysis. .
【００２４】本発明は、上記問題点を解決するためにな
されたものであって、その目的は、自然界から単離、精
製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階
で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定
化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用
いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異
的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との
結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分
析用の支持体を得ることができるリンカー化合物および
リガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分
析用の支持体を提供することにある。The present invention has been made to solve the above problems, and its purpose is to analyze various oligosaccharides obtained from the natural world and use them as they are for one-step protein analysis. The oligosaccharide chain can be easily immobilized on the surface of the support, and the influence of non-specific interaction based on hydrophobic interaction with the protein analyzed using the support for protein analysis is reduced. Provided are a linker compound and a ligand, a method for immobilizing oligosaccharide chains, and a support for protein analysis, which can obtain a support for protein analysis capable of continuously and quantitatively evaluating binding interactions with various proteins. To do.
【００２５】[0025]
【課題を解決するための手段】本願発明者等は、上記の
目的を達成すべく鋭意検討した結果、分子内にＳ−Ｓ結
合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカー化合物に
導入することで、オリゴ糖鎖を分子内に簡便に導入でき
る部分をリンカー化合物に組み込むと共に、オリゴ糖鎖
の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形
成されるように、蛋白質分析用の支持体表面に例えばコ
ートした金もしくは予め蛋白質分析用の支持体表面に固
定化したストレプトアビジン（またはアビジン）と結合
させ易く、強固に結合できるようにすることができ、自
然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をその
まま用いて蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を一
段階で簡便に固定化することができると共に、蛋白質分
析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作
用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、
種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評
価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができること
を見出して本発明を完成させるに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present application have conducted extensive studies to achieve the above-mentioned object, and as a result, by introducing a site having an S—S bond or biotin in the molecule into a linker compound, A part that can easily introduce an oligosaccharide chain into the molecule is incorporated into the linker compound, and at the time of introducing the oligosaccharide chain, a hydrophilic part is formed between the linker compound and the surface of the support for protein analysis. For example, it is easy to bind to coated gold or streptavidin (or avidin) that has been immobilized on the surface of a support for protein analysis in advance, and it is possible to make a strong binding, and various kinds obtained by isolation and purification from the natural world can be obtained. The oligosaccharide can be used as it is to immobilize oligosaccharide chains on the surface of a support for protein analysis in a single step, and a support for protein analysis can be used. Effects of non-specific interaction based on a hydrophobic interaction with proteins analyzed Te is reduced,
The present inventors have completed the present invention by finding that it is possible to obtain a support for protein analysis capable of continuously and quantitatively evaluating binding interactions with various proteins.
【００２６】即ち、本発明にかかるリンカー化合物は、
上記の課題を解決するために、一般式（１）That is, the linker compound according to the present invention is
In order to solve the above problems, the general formula (1)
【００２７】[0027]
【化８】 [Chemical 8]
【００２８】で表されることを特徴としている。It is characterized by being represented by
【００２９】また、本発明にかかるリンカー化合物は、
上記の課題を解決するために、一般式（２）Further, the linker compound according to the present invention is
In order to solve the above problems, the general formula (2)
【００３０】[0030]
【化９】 [Chemical 9]
【００３１】で表されることを特徴としている。It is characterized by being represented by
【００３２】本発明にかかるリガンドは、上記の課題を
解決するために、一般式（３）The ligand according to the present invention has the general formula (3) in order to solve the above problems.
【００３３】[0033]
【化１０】 [Chemical 10]
【００３４】で表されることを特徴としている。It is characterized by being represented by
【００３５】本発明にかかるリガンドは、上記の課題を
解決するために、一般式（４）The ligand according to the present invention has the general formula (4) in order to solve the above problems.
【００３６】[0036]
【化１１】 [Chemical 11]
【００３７】で表されることを特徴としている。It is characterized by being represented by
【００３８】本発明にかかるリガンドは、上記の課題を
解決するために、一般式（５）The ligand according to the present invention has the general formula (5) in order to solve the above problems.
【００３９】[0039]
【化１２】 [Chemical 12]
【００４０】で表されることを特徴としている。It is characterized by being represented by
【００４１】本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法
は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質
分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化
方法であって、上記一般式（３）または（４）で表され
るリガンドを含む溶液と、表面に金を有する支持体とを
接触させることを特徴としている。In order to solve the above-mentioned problems, the method for immobilizing oligosaccharide chains according to the present invention is a method for immobilizing oligosaccharide chains on the surface of a support for protein analysis. Then, the solution containing the ligand represented by the general formula (3) or (4) is brought into contact with the support having gold on the surface.
【００４２】本発明にかかるオリゴ糖鎖の固定化方法
は、上記の課題を解決するために、オリゴ糖鎖を蛋白質
分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化
方法であって、上記一般式（５）で表されるリガンドを
含む溶液と、表面にストレプトアビジン（またはアビジ
ン）を固定化した支持体とを接触させることを特徴とし
ている。In order to solve the above-mentioned problems, the method for immobilizing oligosaccharide chains according to the present invention is a method for immobilizing oligosaccharide chains on the surface of a support for protein analysis. Then, a solution containing the ligand represented by the general formula (5) is brought into contact with a support having streptavidin (or avidin) immobilized on its surface.
【００４３】本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、
上記の課題を解決するために、上記一般式（３）または
（４）で表されるリガンドを、Ｓ−Ａｕ結合を介して表
面に固定化させてなることを特徴としている。The support for protein analysis according to the present invention is
In order to solve the above-mentioned problems, it is characterized in that the ligand represented by the general formula (3) or (4) is immobilized on the surface via an S-Au bond.
【００４４】本発明にかかる蛋白質分析用の支持体は、
上記の課題を解決するために、上記一般式（５）で表さ
れるリガンドを、ビオチン−ストレプトアビジン（また
はアビジン）結合を介して表面に固定化させてなること
を特徴としている。The support for protein analysis according to the present invention is
In order to solve the above problems, the ligand represented by the general formula (5) is characterized in that it is immobilized on the surface via a biotin-streptavidin (or avidin) bond.
【００４５】[0045]
【発明の実施の形態】〔実施の形態１〕以下、本発明に
ついて詳細に説明する。本願発明者等は、自然界から単
離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて
一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便
に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持
体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく
非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白
質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋
白質分析用の支持体を得るべく、表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）法を用いて、構造が明確な硫酸化オリゴ糖を
上記ＳＰＲのセンサチップに効率よく固定化し、種々の
蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価でき
るシステムの開発を行った。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION [First Embodiment] The present invention will be described in detail below. The present inventors can easily immobilize oligosaccharide chains on the surface of a support for protein analysis in a single step by using various oligosaccharides obtained by isolation and purification from nature as they are, and Protein analysis that reduces the influence of non-specific interactions based on hydrophobic interactions with proteins to be analyzed using a support for analysis and enables continuous and quantitative evaluation of binding interactions with various proteins In order to obtain a support for use, a surface plasmon resonance (SPR) method is used to efficiently immobilize sulfated oligosaccharides having a clear structure on the above-mentioned SPR sensor chip, and to continuously perform binding interactions with various proteins. We have also developed a system that can be evaluated quantitatively.
【００４６】以下の説明では、蛋白質分析用の支持体と
してＳＰＲのセンサチップを使用して該センサチップ
に、構造が明確な硫酸化オリゴ糖である硫酸化多糖ヘパ
リン中の下記一般式（７）In the following description, a sensor chip of SPR is used as a support for protein analysis, and the sensor chip is provided with the following general formula (7) in the sulfated polysaccharide heparin which is a sulfated oligosaccharide having a clear structure.
【００４７】[0047]
【化１３】 [Chemical 13]
【００４８】で表される特定の部分二糖構造（ＧｌｃＮ
Ｓ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を二次元的に固定し、上記部分
二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）と種々の蛋
白質との結合相互作用を評価するシステムについて主に
説明するが、本発明は、これに限定されるものではな
い。A specific partial disaccharide structure represented by (GlcN
S6S-IdoA2S) is two-dimensionally immobilized, and a system for evaluating the binding interaction between the above partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) and various proteins will be mainly described, but the present invention is not limited to this. Not something.
【００４９】本発明では、オリゴ糖鎖を簡便に導入でき
る部位をリンカー化合物に組み込み、オリゴ糖鎖をリン
カー化合物に導入した際に親水性部分がリンカー化合物
との間に形成されるリガンド、すなわち、蛋白質と特異
的に結合する物質を得た。これにより、本発明において
は、リガンドを直接、蛋白質分析用の支持体に共有結合
させ、これによりオリゴ糖を蛋白質分析用の支持体表面
に固定化している。In the present invention, a site where an oligosaccharide chain can be easily introduced is incorporated into a linker compound, and when the oligosaccharide chain is introduced into the linker compound, a hydrophilic part is formed between the ligand compound and the linker compound, that is, A substance that specifically binds to the protein was obtained. Thus, in the present invention, the ligand is directly covalently bound to the support for protein analysis, thereby immobilizing the oligosaccharide on the surface of the support for protein analysis.
【００５０】本発明にかかるリンカー化合物は、分子内
にジスルフィド結合を有する化合物であり、一般式
（１）The linker compound according to the present invention is a compound having a disulfide bond in the molecule and has the general formula (1)
【００５１】[0051]
【化１４】 [Chemical 14]
【００５２】で表される構造を有している。It has a structure represented by
【００５３】上記一般式（１）で表されるリンカー化合
物は、例えば以下の反応式The linker compound represented by the above general formula (1) is, for example, the following reaction formula
【００５４】[0054]
【化１５】 [Chemical 15]
【００５５】で示される反応により容易に得ることがで
きる。It can be easily obtained by the reaction represented by:
【００５６】先ず、芳香族ジアミンである下記一般式
（８）First, the following general formula (8) which is an aromatic diamine is given.
【００５７】[0057]
【化１６】 [Chemical 16]
【００５８】で表されるｍ−フェニレンジアミンを、上
記反応式に示すように、ＣＨ3 ＯＨ（式中、ＭｅＯＨと
記す）および（Ｃ2 Ｈ5 ）3 Ｎ（式中、Ｅｔ3 Ｎと記
す）の存在下、（（ＣＨ3)3 ＣＯＣＯ）2 Ｏ（式中、
（Ｂｏｃ)2Ｏと記す）と反応させることにより、上記一
般式（８）で表されるｍ−フェニレンジアミンの一方の
アミノ基を、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＣＯ
（ＣＨ3)3 基; 式中、Ｂｏｃ基と記す）で保護（Ｂｏｃ
化）することにより、下記一般式（９）As shown in the above reaction formula, m-phenylenediamine represented by the formula: CH 3 OH (in the formula, referred to as MeOH) and (C 2 H 5 ) 3 N (in the formula, referred to as Et 3 N) ) In the presence of ((CH 3 ) 3 COCO) 2 O (wherein
(Boc) 2 O) to react one amino group of m-phenylenediamine represented by the general formula (8) with a t-butoxycarbonyl group (—COCO).
(CH 3 ) 3 group; in the formula, referred to as Boc group).
By converting to the following general formula (9)
【００５９】[0059]
【化１７】 [Chemical 17]
【００６０】で表される化合物が得られる。A compound of formula is obtained.
【００６１】次に、上記一般式（９）で表される化合物
を、上記反応式に示すように、ＣＨ 2 Ｃｌ2 中、水溶性
カルボジイミド（式中、ＥＤＣ・ＨＣｌと記す）、並び
に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（式中、ＨＯＢ
ｔと記す）の存在下で、ジスルフィド結合を有する下記
一般式（１０）Next, the compound represented by the above general formula (9)
As shown in the above reaction formula, 2 Cl2 Medium, water soluble
Carbodiimide (in the formula, written as EDC · HCl), aligned
1-hydroxybenzotriazole (in the formula, HOB
(hereinafter referred to as t), having a disulfide bond in the presence of
General formula (10)
【００６２】[0062]
【化１８】 [Chemical 18]
【００６３】で表されるチオクト酸と縮合反応させるこ
とにより、下記一般式（１１）By carrying out a condensation reaction with thioctic acid represented by the following general formula (11)
【００６４】[0064]
【化１９】 [Chemical 19]
【００６５】で表される化合物が得られる。The compound of formula is obtained.
【００６６】次いで、上記一般式（１１）で表される化
合物を、上記反応式に示すように、ジオキサンの存在
下、例えば０℃にてトリフルオロ酢酸（式中、ＴＦＡと
記す）によりＢｏｃ基を除去することにより、分子内に
ジスルフィド結合を有する前記一般式（１）で表される
リンカー化合物が得られる。Then, the compound represented by the above general formula (11) is treated with trifluoroacetic acid (in the formula, referred to as TFA) at a Boc group in the presence of dioxane, for example, as shown in the above reaction formula. Is removed, the linker compound represented by the general formula (1) having a disulfide bond in the molecule can be obtained.
【００６７】本実施の形態では、前記一般式（８）で表
されるｍ−フェニレンジアミンの一方のアミノ基をＢｏ
ｃ化して前記一般式（９）で表される化合物を７８％の
収率で得た後、該一般式（９）で表される化合物をＥＤ
Ｃ・ＨＣｌおよびＨＯＢｔの存在下で前記一般式（１
０）で表されるチオクト酸と縮合反応させることによ
り、前記一般式（１１）で表される化合物を収率８６％
で調製した。その後、前記一般式（１１）で表される化
合物をジオキサンの存在下、０℃にてＴＦＡでＢｏｃ基
を除去することにより、前記一般式（１）で表される目
的のリンカー化合物を収率８５％で得た。In the present embodiment, one amino group of m-phenylenediamine represented by the general formula (8) is replaced with Bo.
The compound represented by the above general formula (9) was obtained by yielding 78% of the compound represented by the above general formula (9), and then the compound represented by the above general formula (9) was ED
In the presence of C.HCl and HOBt, the above general formula (1
By subjecting the compound represented by formula (11) to a condensation reaction with thioctic acid, the yield represented by the formula (11) is 86%.
It was prepared in. Then, the Boc group is removed from the compound represented by the general formula (11) with TFA at 0 ° C. in the presence of dioxane to give the target linker compound represented by the general formula (1) in a yield. Obtained at 85%.
【００６８】続いて、このリンカー化合物の反応性を確
認するために該リンカー化合物をグルコースと反応させ
たところ、下記一般式（３）Subsequently, when the linker compound was reacted with glucose to confirm the reactivity of the linker compound, the following general formula (3)
【００６９】[0069]
【化２０】 [Chemical 20]
【００７０】で表される親水性のリガンドを合成するこ
とができた。It was possible to synthesize a hydrophilic ligand represented by
【００７１】すなわち、本発明にかかる上記一般式
（３）で表されるリガンドは、グルコースをリンカー化
合物に導入することにより、前記一般式（１）で表され
るリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ジスルフ
ィド結合をその分子内に有すると共に、グルコースの導
入、ひいてはオリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリ
ンカー化合物との間に形成される親水性のリガンドであ
り、下記反応式That is, the ligand represented by the general formula (3) according to the present invention is a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1) by introducing glucose into the linker compound, In particular, it has a disulfide bond in its molecule, and at the time of introducing glucose, and further introducing an oligosaccharide chain, a hydrophilic moiety is a hydrophilic ligand formed between the hydrophilic compound and the linker compound.
【００７２】[0072]
【化２１】 [Chemical 21]
【００７３】で示されるように、前記一般式（１）で示
されるリンカー化合物を、ＮａＢＨ3ＣＮ、ＣＨ3 ＣＯ
ＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）およびＨ2 Ｏの存在下、
ｐＨ３、反応温度３７℃にて下記一般式（１２）As shown in the formula (1), the linker compound represented by the general formula (1) is added to NaBH 3 CN, CH 3 CO
In the presence of OH (denoted AcOH in the formula) and H 2 O,
The following general formula (12) at pH 3 and reaction temperature 37 ° C.
【００７４】[0074]
【化２２】 [Chemical formula 22]
【００７５】で表されるＤ−グルコースと還元アミノ化
反応させることにより容易に調製することができる。It can be easily prepared by a reductive amination reaction with D-glucose represented by:
【００７６】本実施の形態では、前記一般式（１）で表
されるリンカー化合物を上記条件下で一般式（１２）で
表されるＤ−グルコースと還元アミノ化反応させること
により、還元末端を効率良く利用して、前記一般式
（３）で表される、親水性のリガンドを９２％という高
収率で得た。In the present embodiment, the reducing terminal is formed by subjecting the linker compound represented by the general formula (1) to a reductive amination reaction with the D-glucose represented by the general formula (12) under the above conditions. The hydrophilic ligand represented by the general formula (3) was efficiently used to obtain a high yield of 92%.
【００７７】このように分子内にジスルフィド結合（Ｓ
−Ｓ結合）を持たせた部位をリンカー化合物に導入する
ことで、該リンカー化合物を例えばＳＰＲのセンサーチ
ップ等をはじめとする蛋白質分析用の支持体表面にコー
トした金とイオウ−金結合（Ｓ−Ａｕ結合）させ易く、
かつ、これら蛋白質分析用の支持体に、上記リンカー化
合物に結合させたオリゴ糖鎖、つまり、上記したリンカ
ー化合物を用いたリガンド中に含まれるオリゴ糖鎖を強
固に結合させることができる。Thus, the disulfide bond (S
-S bond) is introduced into the linker compound, whereby the linker compound is coated on the surface of a support for protein analysis such as SPR sensor chip and the like, and gold and sulfur-gold bond (S bond). -Au bond)
Moreover, the oligosaccharide chains bound to the linker compound, that is, the oligosaccharide chains contained in the ligand using the linker compound can be firmly bound to these protein analysis supports.
【００７８】すなわち、本発明によれば、リンカー分子
内にジスルフィド結合を組み込んだ上記のリガンドを用
いることで、該リガンドを例えばＳ−Ａｕ結合を介して
蛋白質分析用の支持体に共有結合により直接結合させる
ことができる。このため、上記のリガンド、すなわち、
前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する
構造単位を含むリガンドを用いれば、オリゴ糖鎖を蛋白
質分析用の支持体表面に簡便に固定化することができる
と共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質
との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ
無視することができるシステムを構築することができ
る。That is, according to the present invention, by using the above-mentioned ligand having a disulfide bond incorporated in the linker molecule, the ligand is directly covalently bound to the support for protein analysis via, for example, S-Au bond. Can be combined. Therefore, the above ligand, namely
When a ligand containing a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1) is used, the oligosaccharide chain can be easily immobilized on the surface of the support for protein analysis, and at the same time, it can be used for protein analysis. It is possible to construct a system in which nonspecific interactions based on hydrophobic interactions with a protein to be analyzed using a support can be almost ignored.
【００７９】次に、上記したリンカー化合物並びにリガ
ンドに由来する構造単位を有する本発明にかかるリガン
ドとして、前記一般式（７）で表される特定の部分二糖
構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を有するリガン
ドについて以下に説明する。Next, a ligand having a specific partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) represented by the above general formula (7) is used as a ligand according to the present invention having a structural unit derived from the above-mentioned linker compound and ligand. Will be described below.
【００８０】本発明にかかる上記リガンドは、前記一般
式（１）で表されるリンカー化合物を前記一般式（７）
で表される部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２
Ｓ）を含む化合物と反応させることにより上記部分二糖
構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を前記した本発
明にかかるリンカー化合物に導入してなるリガンドであ
り、下記一般式（４）The above-mentioned ligand according to the present invention comprises the linker compound represented by the general formula (1) and the linker compound represented by the general formula (7).
The partial disaccharide structure represented by (GlcNS6S-IdoA2
S) is a ligand obtained by introducing the above partial disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) into the above-described linker compound according to the present invention by reacting it with a compound containing the following general formula (4):
【００８１】[0081]
【化２３】 [Chemical formula 23]
【００８２】で表される構造を有している。It has a structure represented by
【００８３】このため、上記一般式（４）で表されるリ
ガンドもまた、前記一般式（１）で表されるリンカー化
合物に由来する構造単位、特に、ジスルフィド結合をそ
の分子内に有している。Therefore, the ligand represented by the general formula (4) also has a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (1), particularly a disulfide bond in the molecule. There is.
【００８４】上記一般式（４）で表される構造を有する
リガンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎ
ｄ）は、下記反応式A ligand having a structure represented by the above general formula (4) (GlcNS6S-IdoA2S-Ligan)
d) is the following reaction formula
【００８５】[0085]
【化２４】 [Chemical formula 24]
【００８６】で示されるように、ヘパリンの部分構造で
ある二糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分
二糖構造（以下、ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓと記
す）の還元末端にグルコース単位を挿入した、下記一般
式（１３）As shown in, a disaccharide which is a partial structure of heparin, that is, a partial disaccharide structure represented by the general formula (7) (hereinafter referred to as GlcNS6S-IdoA2S) has a glucose unit at the reducing end. Inserted the following general formula (13)
【００８７】[0087]
【化２５】 [Chemical 25]
【００８８】で表される構造を有する三糖を公知の方法
で別途合成しておき、この三糖と前記一般式（１）で表
されるリンカー化合物とを、ＣＨ3 ＣＯＯＨ（式中、Ａ
ｃＯＨと記す）／Ｈ2 Ｏ／ＣＨ3 ＯＨ（式中、ＭｅＯＨ
と記す）の混合溶媒中にて、ＮａＢＨ3 ＣＮの存在下、
最適化した還元アミノ化反応させることによって調製す
ることができる。上記三糖は、例えば「S.Koshida et a
l., Tetrahedron lett.Vol. 42, p1289, 2001年」に記
載の方法により合成することができる。表１に、前記一
般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖との反応条
件を示す。なお、ＮａＢＨ3 ＣＮは、１０当量（ｅｑ）
ずつ複数回に分けて添加した。A trisaccharide having a structure represented by the following formula was separately synthesized by a known method, and the trisaccharide and the linker compound represented by the general formula (1) were mixed with CH 3 COOH (in the formula, A
cOH) / H 2 O / CH 3 OH (in the formula, MeOH
In the presence of NaBH 3 CN in a mixed solvent of
It can be prepared by carrying out an optimized reductive amination reaction. The above-mentioned trisaccharide is, for example, "S. Koshida et a
l., Tetrahedron lett. Vol. 42, p1289, 2001 ”. Table 1 shows reaction conditions of the linker compound represented by the general formula (1) and the trisaccharide. NaBH 3 CN is 10 equivalent (eq)
Each was added in multiple portions.
【００８９】[0089]
【表１】 [Table 1]
【００９０】なお、表１中、ａ）は６ｍＭ、ｂ）は１３
ｍＭ、ｃ）は３７ｍＭを示す。In Table 1, a) is 6 mM and b) is 13 mM.
mM, c) indicates 37 mM.
【００９１】前記一般式（１）で表されるリンカー化合
物は、酢酸・水・メタノール溶媒系に溶解する。表１か
ら判るように、前記一般式（１）で表されるリンカー化
合物は、酢酸・水・メタノール溶媒系にてＮａＢＨ3 Ｃ
Ｎの存在下で三糖と反応し、例えば反応例５に示す条件
下で前記一般式（１）で表されるリンカー化合物と三糖
とを反応させることにより、本発明にかかる目的のリガ
ンド（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−Ｌｉｇａｎｄ；
ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝１０７２．１５[ Ｍ
−３Ｎａ＋２Ｈ] - ) を得ることができる。The linker compound represented by the general formula (1) is dissolved in an acetic acid / water / methanol solvent system. As can be seen from Table 1, the linker compound represented by the general formula (1) is NaBH 3 C in an acetic acid / water / methanol solvent system.
By reacting with a trisaccharide in the presence of N, and reacting the linker compound represented by the general formula (1) with the trisaccharide, for example, under the conditions shown in Reaction Example 5, the target ligand of the present invention ( GlcNS6S-IdoA2S-Ligand;
ESI-MS (negative) m / z = 1072.15 [M
-3Na + 2H] - ) can be obtained.
【００９２】このようにして得られた本発明にかかるリ
ガンドは、分子内にＳ−Ｓ結合を有し、これらリガンド
を含む溶液と、表面に金を有する蛋白質分析用の支持
体、例えば金をコートした前記ＳＰＲのセンサーチップ
等のチップとを接触させることにより、これらリガンド
に含まれるオリゴ糖鎖、つまり、前記一般式（１）で表
されるリンカー化合物に組み込んだオリゴ糖のオリゴ糖
鎖を、例えば図１に示すようにＡｕ−Ｓ結合を介して、
一段階で上記蛋白質分析用の支持体表面に固定化させる
ことができる。これにより、図１に示すように、分子内
にジスルフィド基を有するリンカー化合物を還元アミノ
化反応によって一段階で糖鎖に縮合させ、これをＡｕ−
Ｓ結合を介してチップ上に固定化して部分二糖構造（Ｇ
ｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）の二次元クラスターを形
成させてなるセンサーチップが得られる。なお、図１
中、ＮＳ６Ｓは上記した部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ
−ＩｄｏＡ２Ｓ）のうちＧｌｃＮＳ６Ｓを示し、Ｉ２Ｓ
はＩｄｏＡ２Ｓを示し、Ｇはグルコース単位を示す。The thus obtained ligand according to the present invention has an S—S bond in the molecule, a solution containing these ligands, and a support for protein analysis having gold on the surface, such as gold. The oligosaccharide chains contained in these ligands, that is, the oligosaccharide chains of the oligosaccharide incorporated in the linker compound represented by the general formula (1) are brought into contact with a coated chip such as the SPR sensor chip. , For example, via an Au—S bond as shown in FIG.
It can be immobilized on the surface of the support for protein analysis in one step. As a result, as shown in FIG. 1, the linker compound having a disulfide group in the molecule is condensed in a sugar chain in one step by a reductive amination reaction, which is Au-
Partial disaccharide structure (G
A sensor chip is obtained by forming a two-dimensional cluster of (lcNS6S-IdoA2S). Note that FIG.
Among them, NS6S is a partial disaccharide structure (GlcNS6S
-IdoA2S) of GlcNS6S, I2S
Indicates IdoA2S and G indicates glucose unit.
【００９３】本発明にかかる上記した各リガンドを用い
て蛋白質分析用の支持体表面に一段階でオリゴ糖鎖を固
定化する際に用いられる上記リガンドを含む溶液として
は、特に限定されるものではないが、具体的には、例え
ば、これらリガンドのメタノール溶液等が挙げられる。A solution containing the above-mentioned ligand according to the present invention, which is used when the oligosaccharide chain is immobilized in one step on the surface of a support for protein analysis, is not particularly limited. Specific examples thereof include methanol solutions of these ligands.
【００９４】本実施の形態においては、前記一般式
（３）または（４）で表されるリガンドのメタノール溶
液（０．１ｍＭ）に、表面を金でコーティングしたガラ
ス製のチップを２時間浸漬し、前記一般式（３）または
（４）で表されるリガンド中のＳ−Ｓ結合をチップ表面
の金とのＡｕ−Ｓ結合に変換させることによって、オリ
ゴ糖をチップ表面に固定化させた。このようにして調製
した２種類のチップの非特異的相互作用を、ウシ血清ア
ルブミン（以下、ＢＳＡと記す）を試料として使用し、
表面プラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰ
Ｒ６７０）を用いて測定することにより検討した。In the present embodiment, a glass chip whose surface is coated with gold is immersed in a methanol solution (0.1 mM) of the ligand represented by the general formula (3) or (4) for 2 hours. The oligosaccharides were immobilized on the chip surface by converting the S—S bond in the ligand represented by the general formula (3) or (4) into an Au—S bond with gold on the chip surface. The non-specific interaction of the two types of chips thus prepared was used as a sample using bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA).
Surface Plasmon Resonator (Nippon Laser Electronics Co., SP
It was examined by measuring using R670).
【００９５】なお、上記測定においては、比較のため
に、「G.M.Kuziemko et al, Biochemistry, Vol. 35, p
6375, 1996年」に報告されているような疎水性相互作用
を介してチップ表面にオリゴ糖鎖を固定化した場合にお
けるチップの非特異的相互作用を、０．１ｍｇ／ｍｌの
ＢＳＡを試料として使用し、表面プラズモン共鳴装置
（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７０）を用いて測定
した。In the above measurement, for comparison, “GM Kuziemko et al, Biochemistry, Vol. 35, p.
6375, 1996 ”, the non-specific interaction of the chip when the oligosaccharide chain was immobilized on the chip surface through hydrophobic interaction was analyzed using 0.1 mg / ml BSA as a sample. The measurement was performed using a surface plasmon resonance device (SPR670 manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.).
【００９６】図２は、下記一般式（１４）FIG. 2 shows the following general formula (14).
【００９７】[0097]
【化２６】 [Chemical formula 26]
【００９８】で表される従来のリガンドを用いて疎水性
相互作用を介してオリゴ糖類（マルトース）をチップに
結合させた場合（図２中、線Ａにて示す）における非特
異的相互作用によるレスポンス（ＲＵ：Resonance Uni
t）と前記一般式（３）で表される本発明のリガンドを
用いてＡｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合
させた場合（図２中、線Ｂにて示す）における非特異的
相互作用によるレスポンス（ＲＵ）との比較を示してい
る。なお、バッファにはｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）を使用した。また、バッファの流量は５μｌ
／ｍｉｎとした。By a non-specific interaction in the case where an oligosaccharide (maltose) is bound to a chip through a hydrophobic interaction using a conventional ligand represented by (shown by line A in FIG. 2) Response (RU: Resonance Uni
t) and the ligand of the present invention represented by the above general formula (3) when glucose is bound to the chip via Au—S bond (indicated by line B in FIG. 2). A comparison with the interaction response (RU) is shown. The buffer used was phosphate buffered saline (PBS) having a pH of 7.4. The flow rate of the buffer is 5 μl
/ Min.
【００９９】ＢＳＡはマルトースやグルコースには相互
作用しないことが判っているが、前記一般式（１４）で
表される従来のリガンドによる疎水性相互作用を利用し
た測定系では、疎水性チップ上にこのようなグルコース
構造をもったリガンドを固定化し、その上に疎水性蛋白
質であるＢＳＡを加えたところ、線Ａに示すように大き
なレスポンス（ＲＵ）が観測され、１２４０もの共鳴角
度変化（ΔＲＵ）が観測され、非特異的な結合が起こっ
ていることが判る。It has been known that BSA does not interact with maltose or glucose, but in the measurement system utilizing the hydrophobic interaction with the conventional ligand represented by the above general formula (14), the BSA is on the hydrophobic chip. When a ligand having such a glucose structure was immobilized and a hydrophobic protein, BSA, was added onto it, a large response (RU) was observed as shown by line A, and a resonance angle change (ΔRU) of 1240 was observed. Is observed, and it can be seen that nonspecific binding occurs.
【０１００】これは、ＢＳＡとチップ上の疎水性場との
非特異的な相互作用によるものであり、このように大き
な非特異的相互作用があると、特異的相互作用を観測す
るのは非常に困難になる。This is due to the non-specific interaction between BSA and the hydrophobic field on the chip. With such a large non-specific interaction, it is very difficult to observe the specific interaction. Becomes difficult.
【０１０１】一方、同じ濃度のＢＳＡを、Ａｕ−Ｓ結合
を介してグルコース単位を固定化したチップ、すなわ
ち、ジスルフィド結合を有する本発明にかかる親水性リ
ガンドを固定化したチップ上に加えたところ、線Ｂに示
すように、レスポンス（ＲＵ）はほぼ直線となり、非特
異的な結合は殆ど観測されなかった。このことから、前
記一般式（３）で表される本発明のリガンドを用いてＡ
ｕ−Ｓ結合を介してグルコースをチップに結合させた場
合、疎水性相互作用に基づく非特異的相互作用は無視で
きることが判った。On the other hand, when the same concentration of BSA was added to a chip on which glucose units were immobilized via Au-S bonds, that is, on the chip on which the hydrophilic ligand according to the present invention having a disulfide bond was immobilized, As shown by the line B, the response (RU) was almost linear, and almost no nonspecific binding was observed. From this fact, when the ligand of the present invention represented by the general formula (3) is used, A
It was found that non-specific interactions based on hydrophobic interactions can be neglected when glucose is bound to the chip via the u-S bond.
【０１０２】また、同様に、前記一般式（４）で示され
るリガンドを用いて上述した方法によりヘパリンの部分
二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を固定化し
たチップを用いて、ＢＳＡ、並びに、ヒト由来フォンビ
ルプラント因子蛋白質中のヘパリン結合ドメインである
合成ｖＷＦペプチド（ｖＷＦ中のヘパリン結合サイト：
ＹＩＧＬＫＤＲＫＲＰＳＥＬＲＲＩＡＳＱＶＫＹＡ−Ｎ
Ｈ）との相互作用によるレスポンス（ＲＵ）を、表面プ
ラズモン共鳴装置（日本レーザー電子社製、ＳＰＲ６７
０）を用いて測定した。Similarly, using a chip on which a partial disaccharide structure of heparin (GlcNS6S-IdoA2S) was immobilized by the method described above using the ligand represented by the general formula (4), BSA and human were used. Synthetic vWF peptide that is a heparin-binding domain in the derived von Willeplant factor protein (heparin-binding site in vWF:
YIGLKDRKRPSELRRIASQVKYA-N
The response (RU) due to the interaction with H) is measured by the surface plasmon resonance device (SPR67 manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd.).
0) was used.
【０１０３】図３中、線Ｃは試料として０．１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを使用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示
し、線Ｄは試料として２μＭの合成ｖＷＦペプチドを使
用した場合のレスポンス（ＲＵ）を示す。なお、バッフ
ァにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用した。また、バッファ
の流量は５μｌ／ｍｉｎとした。In FIG. 3, line C is 0.1 mg / m as a sample.
1 shows the response (RU) when using 1 BSA, and line D shows the response (RU) when using 2 μM synthetic vWF peptide as a sample. PBS having a pH of 7.4 was used as the buffer. The flow rate of the buffer was 5 μl / min.
【０１０４】ＢＳＡはヘパリンと非特異的に僅かに相互
作用することが知られているが、上記測定の結果、線Ｃ
に示すように、僅かに相互作用はみられるが、その強さ
はほぼ無視できる程度であることが判明した。It is known that BSA slightly and nonspecifically interacts with heparin.
As shown in, the interaction was slightly observed, but the strength was found to be almost negligible.
【０１０５】一方、ヘパリンと結合相互作用することが
確認されている、ヒト由来フォンビルプラント因子蛋白
質中のヘパリン結合ドメインである、２μＭの合成ｖＷ
ＦペプチドをＢＳＡの代わりに用いてＳＰＲを測定した
ところ、線Ｄに示すように明らかな結合曲線が観測さ
れ、非常に高い相互作用があることが判った。このこと
から、上記したチップを用いた場合には疎水性相互作用
による非特異的な相互作用の影響を無視できると考え、
合成ｖＷＦペプチドの解離定数ＫD を求めた。On the other hand, 2 μM of synthetic vW, which is a heparin-binding domain in the human-derived von Willeplant factor protein, which has been confirmed to have a binding interaction with heparin.
When the SPR was measured using the F peptide instead of BSA, a clear binding curve was observed as shown by line D, indicating a very high interaction. From this, it is considered that the influence of non-specific interaction due to hydrophobic interaction can be ignored when the above-mentioned chip is used,
The dissociation constant K D of the synthetic vWF peptide was determined.
【０１０６】図４は、合成ｖＷＦペプチドの濃度を０．
０５μＭから２．０μＭまで連続的に変化させて前記一
般式（４）で表されるリガンドを固定化したチップ上に
加えた場合の結合曲線を示す。なお、図４中、↑は合成
ｖＷＦペプチドの注入を示し、↓はバッファに切り替わ
ったことを示す。また、合成ｖＷＦペプチドのチップへ
の固定化量は、ｖＷＦペプチド注入前のベースライン
（図中、点線にて示す）から、バッファに切り替わった
後、合成ｖＷＦペプチドが解離して平行に達したたとこ
ろまでの差をそれぞれとっている。なお、上記測定にお
いても、バッファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、バ
ッファの流量は５μｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラ
ズモン共鳴装置には、日本レーザー電子社製の表面プラ
ズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を用いた。FIG. 4 shows the concentration of synthetic vWF peptide at 0.
The binding curve when the ligand represented by the general formula (4) is added to the immobilized chip while continuously changing from 05 μM to 2.0 μM is shown. In FIG. 4, ↑ indicates injection of synthetic vWF peptide, and ↓ indicates switching to buffer. In addition, the amount of immobilized synthetic vWF peptide on the chip reached a parallel state after the synthetic vWF peptide dissociated from the baseline (indicated by a dotted line in the figure) before vWF peptide injection, after switching to the buffer. The difference up to that point is taken. Also in the above measurement, PBS having a pH of 7.4 was used as the buffer, and the flow rate of the buffer was 5 μl / min. As the surface plasmon resonance device, a surface plasmon resonance device “SPR670” manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd. was used.
【０１０７】図５の線Ｅは、このときの固定量の変化、
すなわち、前記一般式（４）で表されるリガンドを固定
化したチップを用いた場合における合成ｖＷＦペプチド
のチップへの固定化量の変化（レスポンス（ＲＵ））を
合成ｖＷＦペプチドの濃度に対してプロットした図であ
る。Line E in FIG. 5 shows the change in the fixed amount at this time.
That is, the change in the amount of immobilized vWF peptide immobilized on the chip (response (RU)) in the case of using the chip immobilized with the ligand represented by the general formula (4) was compared with the concentration of the synthetic vWF peptide. It is the plotted figure.
【０１０８】図５に示すように上記合成ｖＷＦペプチド
の濃度を変化させて該合成ｖＷＦペプチドのそれぞれの
濃度に対するレスポンス（ＲＵ）から結合度を測定し、
該結合度から解離定数ＫD を算出したところ、線Ｅで示
すように、前記一般式（４）で表されるリガンド（Ｇｌ
ｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ−ｌｉｇａｎｄ）を用いた場
合には、 Sobel等が放射標識法によって求めた値(M.Sob
el et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、
ＫD ＝370 ±100 ｎＭ)と非常に近い値（ＫD＝２１０ｎ
Ｍ）が導かれた。As shown in FIG. 5, the concentration of the synthetic vWF peptide was changed, and the binding degree was measured from the response (RU) to each concentration of the synthetic vWF peptide.
When the dissociation constant K D was calculated from the binding degree, as shown by the line E, the ligand represented by the general formula (4) (Gl
When cNS6S-IdoA2S-ligand) was used, the value obtained by the radiolabeling method by Sobel et al.
el et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857,
A value very close to K D = 370 ± 100 nM (K D = 210n)
M) was introduced.
【０１０９】一方、前記一般式（３）で表されるリガン
ド（親水性リガンド）を固定化したチップ上に合成ｖＷ
Ｆペプチドを上記と同様に注入したが、この場合は、図
５の線Ｆに示すように、合成ｖＷＦペプチドと該チップ
との結合相互作用は殆ど観測されず、非特異的な相互作
用はないことが確認された。On the other hand, synthetic vW was prepared on a chip on which the ligand (hydrophilic ligand) represented by the general formula (3) was immobilized.
The F peptide was injected in the same manner as above, but in this case, as shown by the line F in FIG. 5, almost no binding interaction between the synthetic vWF peptide and the chip was observed, and there was no nonspecific interaction. It was confirmed.
【０１１０】以上のように前記一般式（３）で表される
リガンドを固定化したチップを用いてｖＷＦ中のヘパリ
ン結合ドメインを含む合成ペプチドとの結合挙動をＳＰ
Ｒで測定した結果、特異的な相互作用のみが観測され、
さらに天然ヘパリンとこの合成ペプチド（合成ｖＷＦペ
プチド）との解離定数ＫD にほぼ等しい値がＳＰＲ解析
から得られたことから、このチップの有用性が明らかと
なった。As described above, the binding behavior with the synthetic peptide containing the heparin-binding domain in vWF was analyzed by using the chip on which the ligand represented by the general formula (3) was immobilized.
As a result of measuring with R, only specific interactions are observed,
Further, since a value approximately equal to the dissociation constant K D between natural heparin and this synthetic peptide (synthetic vWF peptide) was obtained from SPR analysis, the usefulness of this chip was clarified.
【０１１１】また、以上のことから、本発明にかかる上
記各リガンド並びにこれらリガンドに用いられる前記一
般式（１）で表されるリンカー化合物は、オリゴ糖鎖
を、例えばＡｕ−Ｓ結合を介して、蛋白質分析用の支持
体表面に固定化するために非常に優れた性質を有する化
合物であることが明らかになった。From the above, the above-mentioned respective ligands according to the present invention and the linker compound represented by the general formula (1) used for these ligands have oligosaccharide chains, for example, through an Au—S bond. It was revealed that the compound has very excellent properties for immobilization on the surface of a support for protein analysis.
【０１１２】以上のように、本発明によれば、還元アミ
ノ化反応によって、硫酸化二糖、すなわち、ヘパリンの
部分二糖構造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）に、分
子内にジスルフィド結合を有するリンカーを導入するこ
とができた。そして、このようにして合成したリガンド
を用いて、硫酸化二糖をＡｕ−Ｓ結合を介してチップへ
固定化することにより、チップとの非特異的な相互作用
を無視できる実験系を確立することができた。さらに、
このチップを用いると、硫酸化二糖と合成ｖＷＦペプチ
ドとの特異的な相互作用を観測することができることが
判った。As described above, according to the present invention, a linker having an intramolecular disulfide bond is introduced into a sulfated disaccharide, ie, a partial disaccharide structure of heparin (GlcNS6S-IdoA2S), by a reductive amination reaction. We were able to. Then, the ligand thus synthesized is used to immobilize the sulfated disaccharide on the chip via the Au-S bond, thereby establishing an experimental system in which nonspecific interaction with the chip can be ignored. I was able to. further,
It was found that this chip can be used to observe specific interactions between the sulfated disaccharide and the synthetic vWF peptide.
【０１１３】なお、本発明においては、ヘパリン結合性
蛋白質として上記した合成ｖＷＦペプチドを使用した
が、本発明はこれに限定されるものではなく、上記した
チップを用いることで、他のヘパリン結合性蛋白質との
結合挙動も解析することが可能である。Although the synthetic vWF peptide described above was used as the heparin-binding protein in the present invention, the present invention is not limited to this, and other heparin-binding proteins can be obtained by using the chip described above. It is also possible to analyze the binding behavior with proteins.
【０１１４】以上のように、本発明によれば、上記のリ
ンカー化合物を用いれば、還元末端を有しているオリゴ
糖鎖をチップ表面に簡便に固定化できるようになったば
かりでなく、チップを用いて分析する蛋白質との疎水性
相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視するこ
とができるシステムを構築することができた。As described above, according to the present invention, the use of the above-mentioned linker compound not only makes it possible to easily immobilize oligosaccharide chains having reducing ends on the chip surface, but also to It was possible to construct a system that can almost ignore nonspecific interactions based on hydrophobic interactions with the proteins to be analyzed.
【０１１５】さらに、本願発明者等は、オリゴ糖の生物
活性を評価するために、オリゴ糖を効率良く集合化し、
多糖のオリゴ糖を一段階で蛋白質分析用の支持体表面に
導入すべく鋭意検討した。この結果、本願発明者等は、
図６に示すように多価の芳香族アミン部分とビオチン部
分とを有するリンカー化合物（ビオチンリンカー）を用
いてオリゴ糖鎖を集合化させ、該オリゴ糖鎖を、ビオチ
ン−ストレプトアビジン（またはアビジン）の結合を利
用してＳＰＲのセンサチップ等のチップやアフィニティ
ークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体
表面に固定化することで、多糖のオリゴ糖を一段階で蛋
白質分析用の支持体表面に導入し、オリゴ糖の集合化と
固定化との両方を実現することができることを見い出し
た。なお、図６並びに以下に示す図において、Ｓｔはス
トレプトアビジン（またはアビジン）を示し、Ｂｉはビ
オチンを示す。Further, the inventors of the present invention efficiently assembled the oligosaccharides in order to evaluate the biological activity of the oligosaccharides,
An intensive study was carried out to introduce a polysaccharide oligosaccharide in one step onto the surface of a support for protein analysis. As a result, the present inventors
As shown in FIG. 6, an oligosaccharide chain is assembled using a linker compound (biotin linker) having a polyvalent aromatic amine moiety and a biotin moiety, and the oligosaccharide chain is biotin-streptavidin (or avidin). By immobilizing on the surface of a support for protein analysis such as a chip such as a sensor chip of SPR or a carrier for affinity chromatography by utilizing the binding of oligosaccharides, the surface of the support for protein analysis of a polysaccharide oligosaccharide can be achieved in one step. , And found that both assembly and immobilization of oligosaccharides can be achieved. In FIG. 6 and the following figures, St represents streptavidin (or avidin), and Bi represents biotin.
【０１１６】以下、本発明にかかる他のリンカー化合物
として、分子内にＳ−Ｓ結合を持たせた部位の代わりに
ビオチンをリンカー化合物に導入してなるビオチンリン
カーについて説明すると共に、該ビオチンリンカーを用
いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固
定化方法および該リガンドを固定化させた、蛋白質分析
用の支持体について説明する。Hereinafter, as another linker compound according to the present invention, a biotin linker obtained by introducing biotin into the linker compound instead of the site having an S—S bond in the molecule will be described, and the biotin linker will be described. The ligand used, the method for immobilizing oligosaccharide chains using the ligand, and the support for immobilizing the ligand for protein analysis will be described.
【０１１７】本発明にかかる他のリンカー化合物は、ビ
オチンと複数個のオリゴ糖を結合させ得る反応点を併せ
持った多岐用途型リンカーであり、一般式（２）Another linker compound according to the present invention is a versatile linker having a reaction site capable of binding biotin and a plurality of oligosaccharides, and has the general formula (2)
【０１１８】[0118]
【化２７】 [Chemical 27]
【０１１９】で表される構造を有している。It has a structure represented by:
【０１２０】上記一般式（２）で表されるリンカー化合
物は、例えば以下の式The linker compound represented by the above general formula (2) is, for example, the following formula
【０１２１】[0121]
【化２８】 [Chemical 28]
【０１２２】で示される反応により容易に得ることがで
きる。It can be easily obtained by the reaction represented by:
【０１２３】先ず、上記の反応式にしたがって下記一般
式（１５）First, according to the above reaction formula, the following general formula (15)
【０１２４】[0124]
【化２９】 [Chemical 29]
【０１２５】で表されるｐ−アミノ安息香酸を、ＭｅＯ
Ｈおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下、（Ｂｏ
ｃ）2 Ｏと室温にて反応させて上記一般式（１５）で表
されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保護
（Ｂｏｃ化）することにより、下記一般式（１６）The p-aminobenzoic acid represented by
In the presence of H and triethylamine (TEA), (Bo
c) by reacting with 2 O at room temperature to protect (Boc) the amino group of p-aminobenzoic acid represented by the above general formula (15) with a Boc group, the following general formula (16)
【０１２６】[0126]
【化３０】 [Chemical 30]
【０１２７】で表される化合物が得られる。A compound of formula is obtained.
【０１２８】次に、反応温度を０℃から室温に昇温させ
て、上記一般式（１６）で表される化合物を、ＣＨ2 Ｃ
ｌ2 中、ＨＯＢｔ、ＥＤＣ．ＨＣｌの存在下で、下記一
般式（１７）Next, the reaction temperature is raised from 0 ° C. to room temperature, and the compound represented by the general formula (16) is converted into CH 2 C.
Among l 2, HOBt, EDC. In the presence of HCl, the following general formula (17)
【０１２９】[0129]
【化３１】 [Chemical 31]
【０１３０】で表されるジエチレントリアミン（０．５
当量）と反応させて縮合させることにより、下記一般式
（１８）Diethylenetriamine represented by (0.5
By reacting with (equivalent) to condense the following general formula (18)
【０１３１】[0131]
【化３２】 [Chemical 32]
【０１３２】で表される化合物が得られる。The compound of formula is obtained.
【０１３３】次に、上記一般式（１８）で表される化合
物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解
し、ＴＥＡ（２当量）の存在下で、下記一般式（１９）Then, the compound represented by the general formula (18) is dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF), and in the presence of TEA (2 equivalents), the following general formula (19) is obtained.
【０１３４】[0134]
【化３３】 [Chemical 33]
【０１３５】で表される、ビオチンの活性エステル化合
物と反応させることにより、下記一般式（２０）By reacting with an active ester compound of biotin represented by the following general formula (20)
【０１３６】[0136]
【化３４】 [Chemical 34]
【０１３７】で表される化合物が得られる。The compound of formula is obtained.
【０１３８】次いで、反応温度を０℃から室温に昇温さ
せてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で上記一般式（２０）
で表される化合物のＢｏｃ基、すなわち、アミノ基の保
護基を外す（脱保護する）ことにより、本発明にかかる
リンカー化合物として、前記一般式（２）で表される、
糖鎖を二単位集合化させるためのビオチンリンカーが得
られる。Then, the reaction temperature was raised from 0 ° C. to room temperature, and trifluoroacetic acid (TFA) was added to the above general formula (20).
By removing (deprotecting) the Boc group of the compound represented by, that is, the amino-group-protecting group, the linker compound according to the present invention is represented by the general formula (2).
A biotin linker for assembling two units of sugar chains is obtained.
【０１３９】本実施の形態では、上記一般式（１５）で
表されるｐ−アミノ安息香酸のアミノ基をＢｏｃ基で保
護（Ｂｏｃ化）することにより、一般式（１６）で表さ
れる化合物を収率７５％で得た後、該一般式（１６）で
表される化合物を上記した条件下で一般式（１７）で表
されるジエチレントリアミン（０．５当量）と反応させ
ることにより、収率９３％で一般式（１８）で表される
化合物を調製した。その後、上記一般式（１８）で表さ
れる化合物を、上記した条件下で一般式（１９）で表さ
れるビオチンの活性エステル化合物と反応させることに
より、一般式（２０）で表される化合物（ＥＳＩ−ＭＳ
（positive）ｍ／ｚ＝５２４．４ [Ｍ＋Ｈ] + ) を得
た。上記ビオチンの活性エステル化合物並びに反応式
中、conditionsの表記にて示す反応条件（溶媒および反
応温度）を変更した場合における上記一般式（２０）で
表される化合物の各収率を表２に示す。In this embodiment, a compound represented by the general formula (16) is obtained by protecting (Boc-forming) the amino group of p-aminobenzoic acid represented by the general formula (15) with a Boc group. Was obtained in a yield of 75%, and then the compound represented by the general formula (16) was reacted with diethylenetriamine represented by the general formula (17) (0.5 equivalent) under the above-mentioned conditions to obtain A compound represented by the general formula (18) was prepared at a rate of 93%. Then, by reacting the compound represented by the general formula (18) with the active ester compound of biotin represented by the general formula (19) under the conditions described above, the compound represented by the general formula (20) (ESI-MS
(Positive) m / z = 524.4 [M + H] + ) was obtained. Table 2 shows the respective yields of the above-mentioned active ester compound of biotin and the compound represented by the above general formula (20) when the reaction conditions (solvent and reaction temperature) represented by the notation of conditions in the reaction formula are changed. .
【０１４０】[0140]
【表２】 [Table 2]
【０１４１】表２に示すように、ビオチン活性化エステ
ルとして、ペンタフルオロフェニル基（Ｐｆｐ）を用い
た系により、目的とする上記一般式（１８）で表される
化合物を最も収率良く得ることができた。As shown in Table 2, the target compound represented by the general formula (18) can be obtained in the highest yield by a system using a pentafluorophenyl group (Pfp) as a biotin-activating ester. I was able to.
【０１４２】続いて、ＴＦＡで上記一般式（１８）で表
される化合物のＢｏｃ基を脱保護することにより、上記
ビオチンリンカー、すなわち、前記一般式（２）で表さ
れるリンカー化合物を収率９１％で得た。Then, the Boc group of the compound represented by the general formula (18) is deprotected by TFA to obtain the biotin linker, that is, the linker compound represented by the general formula (2) in a yield. Obtained in 91%.
【０１４３】続いて、このリンカー化合物を用いてオリ
ゴ糖鎖を集合化させた。集合化させる糖鎖には、血液凝
固に関わるフォンビルブラント因子ペプチド（ｖＷＦペ
プチド）と相互作用する、ヘパリン中の硫酸化部分二
糖、すなわち、前記一般式（７）で表される部分二糖構
造（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）を使用した。Subsequently, oligosaccharide chains were assembled using this linker compound. The sugar chain to be assembled is a sulfated partial disaccharide in heparin that interacts with a von Willebrand factor peptide (vWF peptide) involved in blood coagulation, that is, a partial disaccharide represented by the general formula (7). The structure (GlcNS6S-IdoA2S) was used.
【０１４４】すなわち、上記ビオチンリンカーを用いた
本発明にかかるリガンドは、下記一般式（５）That is, the ligand according to the present invention using the above biotin linker is represented by the following general formula (5)
【０１４５】[0145]
【化３５】 [Chemical 35]
【０１４６】で表される構造を有し、前記一般式（２）
で表されるリンカー化合物にヘパリン中の硫酸化部分二
糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−ＩｄｏＡ２Ｓ）が導入された構造
を有している。It has a structure represented by the following general formula (2)
It has a structure in which a sulfated partial disaccharide (GlcNS6S-IdoA2S) in heparin is introduced into the linker compound represented by.
【０１４７】これにより、上記一般式（５）で表される
リガンドは、前記一般式（２）で表されるリンカー化合
物に由来する構造単位を有し、ビオチンとストレプトア
ビジン（またはアビジン）との高い親和性を利用してオ
リゴ糖鎖として上記硫酸化部分二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−
ＩｄｏＡ２Ｓ）をビオチン−ストレプトアビジン（また
はアビジン）結合により蛋白質分析用の支持体に固定化
させることができる。As a result, the ligand represented by the general formula (5) has a structural unit derived from the linker compound represented by the general formula (2), and is composed of biotin and streptavidin (or avidin). The sulfated partial disaccharide (GlcNS6S-) is used as an oligosaccharide chain by utilizing high affinity.
IdoA2S) can be immobilized on a support for protein analysis by a biotin-streptavidin (or avidin) bond.
【０１４８】上記一般式（５）で表されるリガンドは、
下記反応式The ligand represented by the above general formula (5) is
The following reaction formula
【０１４９】[0149]
【化３６】 [Chemical 36]
【０１５０】で示されるように、最適化した還元アミノ
化反応を用いて、上記硫酸化部分二糖を含む三糖体、す
なわち、ヘパリン中の部分構造二糖（ＧｌｃＮＳ６Ｓ−
ＩｄｏＡ２Ｓ）の還元末端にグルコース単位を導入した
前記一般式（１３）で表される三糖を、Ｈ2 Ｏ／ＡｃＯ
Ｈ／ＭｅＯＨの混合溶媒に溶解し、ＮａＢＨ3 ＣＮの存
在下で前記一般式（２）で表される、多岐用途型のリン
カー化合物であるビオチンリンカーに導入することによ
り調製した。As shown in (3), by using the optimized reductive amination reaction, a trisaccharide containing the above-described sulfated partial disaccharide, that is, a partial structural disaccharide (GlcNS6S- in heparin).
IdoA2S) has a glucose unit introduced at the reducing end thereof to form a trisaccharide represented by the general formula (13), which is converted into H 2 O / AcO.
It was prepared by dissolving it in a mixed solvent of H / MeOH and introducing it into a biotin linker, which is a versatile linker compound represented by the general formula (2) in the presence of NaBH 3 CN.
【０１５１】表３に、前記一般式（２）で表されるリン
カー化合物と三糖との反応条件を示す。Table 3 shows reaction conditions of the linker compound represented by the general formula (2) and the trisaccharide.
【０１５２】[0152]
【表３】 [Table 3]
【０１５３】表３から判るように、前記一般式（２）で
表されるリンカー化合物は、酢酸・水・メタノール溶媒
系にてＮａＢＨ3 ＣＮの存在下で三糖と反応し、例えば
反応例３に示す条件下で前記一般式（２）で表されるリ
ンカー化合物と三糖とを反応させることにより、糖鎖が
２単位集合化した本発明にかかる目的のリガンド、すな
わち、ヘパリン部分二糖構造を２単位含む、上記一般式
（５）で表される多岐用途型のリガンド（オリゴ糖鎖リ
ガンド；ＥＳＩ−ＭＳ（negative) ｍ／ｚ＝５２３．８
[ Ｍ−７Ｎａ＋３Ｈ]4- ） を得ることができた。As can be seen from Table 3, the linker compound represented by the general formula (2) reacts with a trisaccharide in the presence of NaBH 3 CN in an acetic acid / water / methanol solvent system. By reacting the linker compound represented by the general formula (2) with a trisaccharide under the conditions shown in, the target ligand of the present invention in which sugar chains are assembled into two units, that is, a heparin partial disaccharide structure A multipurpose ligand (oligosaccharide chain ligand; ESI-MS (negative) m / z = 523.8) represented by the above general formula (5).
[M-7Na + 3H] 4- ) could be obtained.
【０１５４】次に、上記オリゴ糖鎖リガンドを使用し、
ＳＰＲにより、該オリゴ糖鎖リガンドと合成ｖＷＦペプ
チドとの相互作用を確認した。まず、上記一般式（５）
で表される化合物をストレプトアビジンを固定化したＳ
ＰＲのセンサチップ表面上にビオチン−ストレプトアビ
ジンの高い親和性を利用して配列させ、ヘパリン結合性
のモデルペプチドとの相互作用を調べ、その有用性を検
討した。Next, using the above oligosaccharide chain ligand,
The interaction between the oligosaccharide chain ligand and the synthetic vWF peptide was confirmed by SPR. First, the above general formula (5)
The compound represented by S is streptavidin-immobilized S
The biotin-streptavidin was arrayed on the surface of the PR sensor chip using the high affinity, the interaction with a model peptide capable of binding to heparin was examined, and its usefulness was examined.
【０１５５】ここで、オリゴ糖鎖リガンドをＳＰＲのセ
ンサチップ上に固定化する操作について、図７（ａ）〜
（ｄ）を参照して以下に説明する。Here, the operation of immobilizing the oligosaccharide chain ligand on the SPR sensor chip will be described with reference to FIGS.
This will be described below with reference to (d).
【０１５６】本発明にかかる上記オリゴ糖鎖リガンド
は、該オリゴ糖鎖リガンドを含む溶液と、予めストレプ
トアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップ（ストレ
プトアビジン固定化チップ）とを接触させることによ
り、該オリゴ糖鎖リガンドに含まれるオリゴ糖鎖、つま
り、上記ビオチンリンカーに組み込んだオリゴ糖のオリ
ゴ糖鎖を一段階でＳＰＲのセンサチップ表面に固定化さ
せることができる。The oligosaccharide chain ligand according to the present invention is prepared by bringing a solution containing the oligosaccharide chain ligand into contact with a SPR sensor chip (streptavidin-immobilized chip) on which streptavidin is immobilized in advance. The oligosaccharide chain contained in the oligosaccharide chain ligand, that is, the oligosaccharide chain of the oligosaccharide incorporated in the biotin linker can be immobilized on the surface of the SPR sensor chip in one step.
【０１５７】ストレプトアビジン固定化チップは、図７
（ａ）に示すようにガラス基盤表面に金をコーティング
したＳＰＲのセンサチップに、図７（ｂ）に示すように
Ａｕ−Ｓ結合を利用して下記一般式（２１）The streptavidin-immobilized chip is shown in FIG.
As shown in FIG. 7 (b), an SPR sensor chip having a glass substrate surface coated with gold as shown in FIG.
【０１５８】[0158]
【化３７】 [Chemical 37]
【０１５９】で表される４，４−ジチオジ酪酸を固定化
させ、図７（ｃ）に示すように固定化させた４，４−ジ
チオジ酪酸を水可溶性のカルボジイミドの存在下でＮ−
ヒドロキシコハク酸イミドと反応させて活性化した後、
図７（ｄ）に示すようにストレプトアビジンの末端アミ
ノ基を縮合させることにより作成、つまり、ストレプト
アビジンを固定化することができる。The 4,4-dithiodibutyric acid represented by the formula (4) was immobilized, and the immobilized 4,4-dithiodibutyric acid as shown in FIG. 7 (c) was treated with N- in the presence of a water-soluble carbodiimide.
After activation by reacting with hydroxysuccinimide,
As shown in FIG. 7D, it can be prepared by condensing the terminal amino group of streptavidin, that is, streptavidin can be immobilized.
【０１６０】図８はＳＰＲのセンサチップ上にストレプ
トアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラムの結
果の一例であり、横軸はランニングバッファのフロー時
間を示し、縦軸は共鳴角度変化（ＲＵ：Resonance Uni
t）を示す。FIG. 8 shows an example of the result of the SPR sensorgram when streptavidin was immobilized on the SPR sensor chip, the horizontal axis represents the running buffer flow time, and the vertical axis represents the resonance angle change (RU). : Resonance Uni
t) is shown.
【０１６１】また、図８中、矢印Ｘはストレプトアビジ
ン溶液の注入を示し、矢印Ｙはランニングバッファに自
動的に切り替わったことを示す。なお、ランニングバッ
ファにはｐＨ７．４のＰＢＳを使用し、その流量は５μ
ｌ／ｍｉｎとした。また、表面プラズモン共鳴装置に
は、日本レーザー電子社製の表面プラズモン共鳴装置
「ＳＰＲ６７０」を用いた。そして、結合に関与しなか
ったストレプトアビジンをランニングバッファで洗い流
し、チップ上に残存する活性エステルを１Ｍアミノエタ
ノールによりキャッピングした。最終的なストレプトア
ビジンの固定化量はストレプトアビジン注入前のベース
ラインと、アミノエタノールによるキャッピングの後の
共鳴角度変化の差とした。このセンサグラムでのストレ
プトアビジンの固定化量は２９３０ＲＵであった。In FIG. 8, arrow X indicates injection of the streptavidin solution, and arrow Y indicates automatic switching to the running buffer. For the running buffer, use PBS with pH 7.4 and its flow rate is 5μ.
1 / min. As the surface plasmon resonance device, a surface plasmon resonance device “SPR670” manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd. was used. Then, streptavidin that did not participate in the binding was washed out with a running buffer, and the active ester remaining on the chip was capped with 1M aminoethanol. The final immobilized amount of streptavidin was defined as the difference between the baseline before streptavidin injection and the change in resonance angle after capping with aminoethanol. The immobilized amount of streptavidin in this sensorgram was 2930 RU.
【０１６２】本発明にかかるオリゴ糖鎖リガンドは、こ
のようにして作成したストレプトアビジン固定化チップ
に、ビオチン−ストレプトアビジンの高い親和性を利用
して固定化させることが可能であり、上記オリゴ糖鎖リ
ガンドを用いれば、前記したように該オリゴ糖鎖リガン
ドを含む溶液と、予めストレプトアビジンを固定化した
ＳＰＲのセンサチップとを接触させることにより、該セ
ンサチップ表面に集合化されたオリゴ糖鎖を一段階で固
定することができる。The oligosaccharide chain ligand according to the present invention can be immobilized on the thus-prepared streptavidin-immobilized chip by utilizing the high affinity of biotin-streptavidin. When a chain ligand is used, a solution containing the oligosaccharide chain ligand is brought into contact with an SPR sensor chip on which streptavidin is immobilized in advance as described above, so that the oligosaccharide chain assembled on the surface of the sensor chip is brought into contact. Can be fixed in one step.
【０１６３】このときに用いられる上記オリゴ糖鎖リガ
ンドを含む溶液としては、具体的には、例えば、上記オ
リゴ糖鎖リガンドのＰＢＳ溶液等が挙げられる。Specific examples of the solution containing the oligosaccharide chain ligand used at this time include a PBS solution of the oligosaccharide chain ligand.
【０１６４】本実施の形態によれば、上記オリゴ糖鎖リ
ガンドを含む溶液、例えば上記オリゴ糖鎖リガンドのＰ
ＢＳ溶液に、ストレプトアビジンを固定化した上記セン
サチップを浸漬するかもしくは後述するようにストレプ
トアビジンを固定化したセンサチップにオリゴ糖鎖リガ
ンドを含む溶液を注入して既知のビオチン−アビジン特
異的結合相互作用を用いたビオチン−ストレプトアビジ
ン結合によって上記オリゴ糖鎖リガンドを上記センサチ
ップに固定化させることにより、表面にヘパリン部分二
糖構造を有するセンサチップを作成することができた。According to the present embodiment, a solution containing the above oligosaccharide chain ligand, for example, P of the above oligosaccharide chain ligand is used.
A known biotin-avidin specific bond is obtained by immersing the above-mentioned sensor chip on which streptavidin is immobilized in a BS solution or injecting a solution containing an oligosaccharide chain ligand into the sensor chip on which streptavidin is immobilized as described below. A sensor chip having a heparin partial disaccharide structure on its surface could be prepared by immobilizing the oligosaccharide chain ligand on the sensor chip by biotin-streptavidin bond using interaction.
【０１６５】次に、このセンサチップを用いてｖＷＦペ
プチドとの結合定数ＫD を測定した。図９（ａ）は、ス
トレプトアビジンを固定化したＳＰＲのセンサチップを
示す。上記ｖＷＦペプチドとの結合定数の測定に際して
は、図９（ａ）に示すセンサチップに、濃度を変えてオ
リゴ糖鎖リガンドを含むＰＢＳ溶液を注入して図９
（ｂ）に示すように該オリゴ糖鎖リガンド固定化させ、
次いで、図９（ｃ）に示すようにさらに濃度を変えてｖ
ＷＦペプチドを注入した。このようにして得られたセン
サグラムの一例を図１０に示す。Next, using this sensor chip, the binding constant K D with the vWF peptide was measured. FIG. 9A shows an SPR sensor chip on which streptavidin is immobilized. In measuring the binding constant with the vWF peptide, a PBS solution containing an oligosaccharide chain ligand at different concentrations was injected into the sensor chip shown in FIG.
Immobilizing the oligosaccharide chain ligand as shown in (b),
Then, as shown in FIG.
The WF peptide was injected. An example of the sensorgram thus obtained is shown in FIG.
【０１６６】図１０はセンサチップ上にオリゴ糖鎖リガ
ンドを固定化させ、濃度を変えてｖＷＦペプチドを注入
したときのＳＰＲのセンサグラムの結果の一例であり、
横軸はランニングバッファのフロー時間を示し、縦軸は
共鳴角度変化（ＲＵ）を示す。FIG. 10 is an example of the result of the SPR sensorgram when the oligosaccharide chain ligand was immobilized on the sensor chip and the vWF peptide was injected at different concentrations.
The horizontal axis represents the flow time of the running buffer, and the vertical axis represents the resonance angle change (RU).
【０１６７】また、図１０中、↑はオリゴ糖鎖リガンド
の注入を示し、↓は結合に関与しなかったオリゴ糖鎖リ
ガンドの洗浄のためのランニングバッファの注入を示
す。オリゴ糖鎖リガンドは、その濃度を１．３９μＭか
ら２．２２μＭまで連続的に変化させて上記センサチッ
プに加えた。なお、ランニングバッファにはｐＨ７．４
のＰＢＳを使用し、その流量は１０μｌ／ｍｉｎとし
た。また、表面プラズモン共鳴装置には、日本レーザー
電子社製の表面プラズモン共鳴装置「ＳＰＲ６７０」を
用いた。オリゴ糖鎖リガンドの固定化量は、オリゴ糖鎖
リガンドの注入前のベースラインと、余分なオリゴ糖鎖
リガンドが洗い流され、共鳴角度変化（ＲＵ）が一定に
なった時の差が固定化量に相当する。上記のセンサグラ
ムではオリゴ糖鎖リガンドの固定化量は１４０ＲＵであ
った。Further, in FIG. 10, ↑ shows injection of oligosaccharide chain ligands, and ↓ shows injection of running buffer for washing oligosaccharide chain ligands not involved in binding. The oligosaccharide chain ligand was added to the sensor chip by continuously changing its concentration from 1.39 μM to 2.22 μM. The running buffer has a pH of 7.4.
PBS was used and the flow rate was 10 μl / min. As the surface plasmon resonance device, a surface plasmon resonance device “SPR670” manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd. was used. The immobilization amount of oligosaccharide chain ligand is the difference between the baseline before injection of oligosaccharide chain ligand and the difference when excess oligosaccharide chain ligand is washed away and the resonance angle change (RU) becomes constant. Equivalent to. In the above sensorgram, the immobilized amount of oligosaccharide chain ligand was 140 RU.
【０１６８】続いて、オリゴ糖鎖リガンドを固定化させ
たセンサーチップに、ｖＷＦペプチドを注入し、結合さ
せた後、ランニングバッファにより解離させ、その時の
共鳴角度変化（ＲＵ）を観測した。ｖＷＦペプチドは、
その濃度を０．５μＭから１．０μＭまで連続的に変化
させて上記センサチップに加えた。結合定数ＫD の算出
には、オリゴ糖鎖リガンドとｖＷＦペプチドとの結合に
よる正の共鳴角度変化から求めた結合速度と、解離によ
る負の共鳴角度変化から求めた解離速度とを用いた。Subsequently, the vWF peptide was injected into the sensor chip on which the oligosaccharide chain ligand was immobilized and allowed to bind, and then dissociated by the running buffer, and the change in resonance angle (RU) at that time was observed. The vWF peptide is
The concentration was continuously changed from 0.5 μM to 1.0 μM and added to the sensor chip. For the calculation of the binding constant K D , the binding rate obtained from the positive resonance angle change due to the binding of the oligosaccharide chain ligand and the vWF peptide and the dissociation rate obtained from the negative resonance angle change due to the dissociation were used.
【０１６９】上記の測定から算出された結合定数ＫD
は、Sobel 等が放射標識法によって求めた値(M.Sobel e
t al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、ＫD
＝370±100 ｎＭ）とほぼ同じ値（ＫD ＝２８０ｎＭ）
であった。The binding constant K D calculated from the above measurement
Is the value (M. Sobel e
t al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857, K D
= 370 ± 100 nM) (K D = 280 nM)
Met.
【０１７０】以上のように、本実施の形態においては、
糖鎖を集合化させるための新規なビオチンリンカーを提
供した。そして、このビオチンリンカーを用いることに
より、糖鎖を集合化させることができた。そして、この
集合化させた糖鎖と蛋白質との相互作用をＳＰＲで確認
することにより、ビオチンリンカーのＳＰＲへの応用が
可能であることが判った。As described above, in the present embodiment,
We provided a new biotin linker for assembling sugar chains. Then, by using this biotin linker, sugar chains could be assembled. Then, it was found that the biotin linker can be applied to SPR by confirming the interaction between the assembled sugar chain and the protein by SPR.
【０１７１】このように、上記ビオチンリンカーは、そ
の分子内にビオチンが導入されていることで、既知の方
法で前もってストレプトアビジンを固定化したチップや
アフィニティークロマトグラフィーの担体に、ビオチン
−アビジンの強い特異的相互作用を利用したビオチン−
ストレプトアビジン結合によりオリゴ糖鎖を固定化する
ことができる。As described above, since the biotin linker has biotin introduced into its molecule, it has a strong biotin-avidin affinity for a chip on which streptavidin has been immobilized in advance by a known method or a carrier for affinity chromatography. Biotin utilizing specific interaction-
The oligosaccharide chain can be immobilized by streptavidin bond.
【０１７２】この結果、上記ビオチンリンカーを用いる
ことで、還元末端を有しているオリゴ糖鎖を蛋白質分析
用の支持体表面に簡便に固定化できるようになった。ま
た、従来、不可能であった、自然界から単利精製して得
られるオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体
表面に固定することが可能となった。As a result, by using the biotin linker, oligosaccharide chains having a reducing end can be easily immobilized on the surface of a support for protein analysis. In addition, it has become possible to immobilize on the surface of a support for protein analysis, an oligosaccharide obtained by simple purification from nature, which has been impossible in the past, can be used as it is.
【０１７３】[0173]
【発明の効果】以上のように、本発明によれば、分子内
にＳ−Ｓ結合もしくはビオチンを持たせた部位をリンカ
ー化合物に導入することで、自然界から単離、精製して
得られる種々のオリゴ糖を一段階で、蛋白質分析用の支
持体表面に固定化することができると共に、このような
支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基
づく非特異的な相互作用による影響が低減された蛋白質
分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物およ
びリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質
分析用の支持体を提供することができるという効果を奏
する。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, according to the present invention, various sites obtained by isolation and purification from nature by introducing a site having an S—S bond or biotin in the molecule into a linker compound can be obtained. Can be immobilized in one step on the surface of a support for protein analysis, and by non-specific interaction based on hydrophobic interaction with the protein to be analyzed using such support. It is possible to provide a linker compound and a ligand capable of obtaining a support for protein analysis with reduced influence, a method for immobilizing an oligosaccharide chain, and a support for protein analysis.
【図１】一般式（４）で表される本発明のリガンドを用
いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化して
なる蛋白質分析用の支持体を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing a support for protein analysis, in which a partial disaccharide structure in a sulfated polysaccharide heparin is immobilized using the ligand of the present invention represented by the general formula (4).
【図２】従来のリガンドを用いてマルトースをセンサチ
ップに結合させた場合における非特異的相互作用による
レスポンスと一般式（３）で表される本発明のリガンド
を用いてグルコースを蛋白質分析用の支持体に結合させ
た場合における非特異的相互作用によるレスポンスとを
比較するグラフである。FIG. 2 shows a response due to non-specific interaction when maltose is bound to a sensor chip using a conventional ligand and glucose for protein analysis using the ligand of the present invention represented by the general formula (3). It is a graph which compares with the response by a non-specific interaction when it couple | bonds with a support body.
【図３】図１に示す蛋白質分析用の支持体を用いてＢＳ
Ａ並びに合成ｖＷＦペプチドとの非特異的相互作用によ
るレスポンスを測定した結果を示すグラフである。FIG. 3 shows the results of BS using the support for protein analysis shown in FIG.
It is a graph which shows the result of having measured the response by nonspecific interaction with A and a synthetic vWF peptide.
【図４】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させ
て図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合の結合
曲線を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing a binding curve when the concentration of the synthetic vWF peptide is continuously changed and added to the support for protein analysis shown in FIG.
【図５】合成ｖＷＦペプチドの濃度を連続的に変化させ
て図１に示す蛋白質分析用の支持体に加えた場合におけ
る合成ｖＷＦペプチドの上記蛋白質分析用の支持体への
固定化量の変化を示すグラフである。FIG. 5 shows changes in the amount of immobilized synthetic vWF peptide on the support for protein analysis when the concentration of the synthetic vWF peptide is continuously changed and added to the support for protein analysis shown in FIG. It is a graph shown.
【図６】一般式（５）で表される本発明のリガンドを用
いてオリゴ糖鎖を集合可能なうえ固定化してなる蛋白質
分析用の支持体を示す模式図である。FIG. 6 is a schematic diagram showing a support for protein analysis, in which oligosaccharide chains can be assembled and immobilized using the ligand of the present invention represented by the general formula (5).
【図７】（ａ）〜（ｄ）は、一般式（５）で表される本
発明のリガンドを上記蛋白質分析用の支持体上に固定化
する操作を示す説明図である。7 (a) to 7 (d) are explanatory views showing an operation of immobilizing the ligand of the present invention represented by the general formula (5) on the support for protein analysis.
【図８】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上にスト
レプトアビジンを固定化した時のＳＰＲのセンサグラム
である。FIG. 8 is a sensorgram of SPR when streptavidin is immobilized on a support for protein analysis used for SPR.
【図９】（ａ）は、ストレプトアビジンを固定化したＳ
ＰＲ用の蛋白質分析用の支持体を示す模式図であり、
（ｂ）は、（ａ）に示す蛋白質分析用の支持体に一般式
（５）で表される本発明のリガンドを固定化させた状態
を示す模式図であり、（ｃ）は、（ｂ）に示す蛋白質分
析用の支持体にさらに濃度を変えてｖＷＦペプチドを注
入したときの上記蛋白質分析用の支持体とｖＷＦペプチ
ドとの相互作用を示す模式図である。FIG. 9 (a) shows S immobilized with streptavidin.
FIG. 3 is a schematic view showing a support for protein analysis for PR,
(B) is a schematic diagram showing a state in which the ligand of the present invention represented by the general formula (5) is immobilized on the support for protein analysis shown in (a), and (c) shows (b) FIG. 7 is a schematic diagram showing the interaction between the protein analysis support and the vWF peptide when the vWF peptide is injected into the support for protein analysis shown in FIG.
【図１０】ＳＰＲに用いる蛋白質分析用の支持体上に一
般式（５）で表されるリガンドを固定化させ、濃度を変
えてｖＷＦペプチドを注入したときのＳＰＲのセンサグ
ラムである。FIG. 10 is a sensorgram of SPR when a ligand represented by the general formula (5) is immobilized on a support for protein analysis used for SPR, and vWF peptide is injected at different concentrations.
【図１１】従来のリガンドを用いて疎水性相互作用によ
り硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造を固定化してな
る従来のセンサチップを示す模式図である。FIG. 11 is a schematic diagram showing a conventional sensor chip in which a partial disaccharide structure in a sulfated polysaccharide heparin is immobilized by hydrophobic interaction using a conventional ligand.
【図１２】図１１に示すセンサチップを用いて硫酸化多
糖ヘパリン中の部分二糖構造と硫酸化多糖ヘパリン結合
性の蛋白質との結合挙動を解析した結果を示すグラフで
ある。FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of the binding behavior between a partial disaccharide structure in sulfated polysaccharide heparin and a sulfated polysaccharide heparin-binding protein using the sensor chip shown in FIG. 11.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｆターム(参考） 4C057 CC03 DD01 JJ09 4C071 AA01 BB01 CC02 CC21 EE13 FF04 GG06 HH08 JJ01 LL07─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/566 G01N 33/566 F term (reference) 4C057 CC03 DD01 JJ09 4C071 AA01 BB01 CC02 CC21 EE13 FF04 GG06 HH08 JJ01 LL07
Claims (9)
に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、 請求項３または４記載のリガンドを含む溶液と、表面に
金を有する支持体とを接触させることを特徴とするオリ
ゴ糖鎖の固定化方法。6. A method for immobilizing an oligosaccharide chain, which comprises immobilizing an oligosaccharide chain on the surface of a support for protein analysis, which comprises a solution containing the ligand according to claim 3 or 4 and gold on the surface. A method for immobilizing oligosaccharide chains, which comprises contacting with a support.
に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、 請求項５記載のリガンドを含む溶液を、表面にストレプ
トアビジンを固定化した支持体とを接触させることを特
徴とするオリゴ糖鎖の固定化方法。7. A method for immobilizing an oligosaccharide chain, which comprises immobilizing an oligosaccharide chain on the surface of a support for protein analysis, which comprises immobilizing a solution containing the ligand according to claim 5 on a surface of streptavidin. A method for immobilizing oligosaccharide chains, which comprises bringing the support into contact with the support.
Ａｕ結合を介して表面に固定化させてなることを特徴と
する蛋白質分析用の支持体。8. The ligand according to claim 3 or 4 is substituted with S-
A support for protein analysis, which is immobilized on the surface via an Au bond.
トレプトアビジン結合を介して表面に固定化させてなる
ことを特徴とする蛋白質分析用の支持体。9. A support for protein analysis, which comprises the ligand according to claim 5 immobilized on the surface via a biotin-streptavidin bond.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001280672A JP3847591B2 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ligand and support for analysis of heparin-binding protein, and oligosaccharide chain immobilization method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001280672A JP3847591B2 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ligand and support for analysis of heparin-binding protein, and oligosaccharide chain immobilization method |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005234913A Division JP4364853B2 (en) | 2005-08-12 | 2005-08-12 | Linker compound, ligand, oligosaccharide chain immobilization method, and support for protein analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003083969A true JP2003083969A (en) | 2003-03-19 |
| JP3847591B2 JP3847591B2 (en) | 2006-11-22 |
Family
ID=19104624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001280672A Expired - Lifetime JP3847591B2 (en) | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Ligand and support for analysis of heparin-binding protein, and oligosaccharide chain immobilization method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3847591B2 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022565A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Japan Science And Technology Agency | Multipurpose linker compounds and ligands and process for producing the same |
| WO2005075453A1 (en) * | 2004-02-05 | 2005-08-18 | Japan Science And Technology Agency | Linker compound, ligand complex and process for producing them |
| WO2005075493A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycolipid-containing compound, biosensor having the same fixed thereto, fine particle containing glycolipid, detection reagent containing the fine particle, and method of detecting compound combining with sugar |
| WO2005077965A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-25 | Japan Science And Technology Agency | Sugar chain ligand composite and method of analyzing protein with the ligand composite |
| JP2006347909A (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Detection of sulfate group-containing sugar compounds and thirsviruses or influenza viruses using the same |
| JP2006347908A (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Detection of sialic acid-containing trisaccharide compounds and thirsvirus or thirst spike proteins using the same |
| US7320867B2 (en) | 2002-09-09 | 2008-01-22 | Japan Science And Technology Agency | Linker compound, ligand, and producing method thereof |
| KR100877644B1 (en) * | 2004-02-05 | 2009-01-09 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | Linker compounds and ligand complexes, and methods for their preparation |
| US9239329B2 (en) | 2006-12-18 | 2016-01-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods |
| KR101603038B1 (en) * | 2015-02-06 | 2016-03-14 | 인천대학교 산학협력단 | Disulfide-confined aryldiazonium salt compound and method for preparing the same |
| JP2019077686A (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-23 | 国立大学法人 鹿児島大学 | Tlr ligand-immobilized nanoparticles |
-
2001
- 2001-09-14 JP JP2001280672A patent/JP3847591B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7183067B2 (en) | 2002-09-09 | 2007-02-27 | Japan Science And Technology Agency | Versatile linker compound, ligand, and producing method thereof |
| WO2004022565A1 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Japan Science And Technology Agency | Multipurpose linker compounds and ligands and process for producing the same |
| US7320867B2 (en) | 2002-09-09 | 2008-01-22 | Japan Science And Technology Agency | Linker compound, ligand, and producing method thereof |
| KR100877644B1 (en) * | 2004-02-05 | 2009-01-09 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | Linker compounds and ligand complexes, and methods for their preparation |
| WO2005075453A1 (en) * | 2004-02-05 | 2005-08-18 | Japan Science And Technology Agency | Linker compound, ligand complex and process for producing them |
| JP4628960B2 (en) * | 2004-02-05 | 2011-02-09 | 独立行政法人科学技術振興機構 | LINKER COMPOUND AND LIGAND COMPLEX AND METHOD FOR PRODUCING THEM |
| JPWO2005075453A1 (en) * | 2004-02-05 | 2007-08-02 | 独立行政法人科学技術振興機構 | LINKER COMPOUND AND LIGAND COMPLEX AND METHOD FOR PRODUCING THEM |
| US7838549B2 (en) | 2004-02-05 | 2010-11-23 | Japan Science And Technology Agency | Linker compound, ligand conjugate, and production methods thereof |
| JP4844920B2 (en) * | 2004-02-09 | 2011-12-28 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Glycolipid-containing compound, biosensor on which it is immobilized, glycolipid-containing microparticle, detection reagent containing the microparticle, and method for detecting a sugar-binding compound |
| JPWO2005075493A1 (en) * | 2004-02-09 | 2007-10-11 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Glycolipid-containing compound, biosensor on which it is immobilized, glycolipid-containing microparticle, detection reagent containing the microparticle, and method for detecting a sugar-binding compound |
| WO2005075493A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-18 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycolipid-containing compound, biosensor having the same fixed thereto, fine particle containing glycolipid, detection reagent containing the fine particle, and method of detecting compound combining with sugar |
| JPWO2005077965A1 (en) * | 2004-02-18 | 2007-10-18 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Glycoligand complex and protein analysis method using the ligand complex |
| KR100811969B1 (en) * | 2004-02-18 | 2008-03-10 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | Sugar chain ligand composite and method of analyzing protein with the ligand composite |
| EP1726596A4 (en) * | 2004-02-18 | 2009-08-26 | Japan Science & Tech Agency | SUGAR CHAIN LIGAND COMPOSITE AND METHOD OF PROTEIN ANALYSIS WITH LIGAND COMPOSITE |
| WO2005077965A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-25 | Japan Science And Technology Agency | Sugar chain ligand composite and method of analyzing protein with the ligand composite |
| JP2011201921A (en) * | 2004-02-18 | 2011-10-13 | Japan Science & Technology Agency | Sugar chain ligand composite and method for analyzing protein with use of the same |
| JP4800771B2 (en) * | 2004-02-18 | 2011-10-26 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Glycoligand complex and protein analysis method using the ligand complex |
| US8765384B2 (en) | 2004-02-18 | 2014-07-01 | Japan Science And Technology Agency | Carbohydrate-ligand conjugates and their application for the analysis of carbohydrate-protein interaction |
| JP2006347909A (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Detection of sulfate group-containing sugar compounds and thirsviruses or influenza viruses using the same |
| JP2006347908A (en) * | 2005-06-14 | 2006-12-28 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Detection of sialic acid-containing trisaccharide compounds and thirsvirus or thirst spike proteins using the same |
| US9239329B2 (en) | 2006-12-18 | 2016-01-19 | Japan Science And Technology Agency | Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods |
| KR101603038B1 (en) * | 2015-02-06 | 2016-03-14 | 인천대학교 산학협력단 | Disulfide-confined aryldiazonium salt compound and method for preparing the same |
| JP2019077686A (en) * | 2017-10-26 | 2019-05-23 | 国立大学法人 鹿児島大学 | Tlr ligand-immobilized nanoparticles |
| JP7023460B2 (en) | 2017-10-26 | 2022-02-22 | 国立大学法人 鹿児島大学 | TLR ligand-immobilized nanoparticles |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3847591B2 (en) | 2006-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3847591B2 (en) | Ligand and support for analysis of heparin-binding protein, and oligosaccharide chain immobilization method | |
| US7320867B2 (en) | Linker compound, ligand, and producing method thereof | |
| AU2011319626B2 (en) | Method for functionalising surfaces for analyte detection | |
| EP1644527B1 (en) | Cucurbituril derivative-bonded solid substrate and biochip using the same | |
| JPH06505340A (en) | Analytical reagent production method | |
| JP4364853B2 (en) | Linker compound, ligand, oligosaccharide chain immobilization method, and support for protein analysis | |
| US8680233B2 (en) | Heteropeptides useful for reducing nonspecific adsorption | |
| JP4800771B2 (en) | Glycoligand complex and protein analysis method using the ligand complex | |
| US7183067B2 (en) | Versatile linker compound, ligand, and producing method thereof | |
| JP2005084028A (en) | Method for immobilizing molecules on solid phase substrate and method for producing biosensor using the same | |
| NL2021443B1 (en) | Synthetic antigens for tuberculosis detection | |
| TWI270673B (en) | Molecular probe chip with covalent bonding anchoring compound | |
| KR100785655B1 (en) | Self-assembled monolayer prepared using aminocalixarene derivatives and protein chip manufactured using the self-assembled monolayer | |
| US20080299666A1 (en) | Novel Peptide-Based Borono-Lectin (PBL) Sensors | |
| Pandurangi et al. | Chemistry of Bifunctional Photoprobes: 4. Synthesis of the Chromogenic, Cleavable, Water Soluble, and Heterobifunctional Sulfosuccinimidyl (N-methylamino Perfluoroaryl Azido Benzamido)-ethyl-1, 3′-Dithiopropionate: An Efficient Protein Cross-Linking Agent | |
| KR101020212B1 (en) | Surface treatment technology of sugar chain chips with high sugar chain fixing efficiency | |
| JP4490067B2 (en) | Biochip and manufacturing method thereof | |
| KR100804022B1 (en) | Bis-aza crown ether calicsarne linkage and preparation method thereof | |
| KR20110012794A (en) | Immobilization Method of Sugars | |
| JPH09292397A (en) | Biosensor, kit, analysis method of biological substance and manufacture of biosensor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050609 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050614 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050812 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20050812 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060110 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060306 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060822 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060823 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3847591 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100901 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110901 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120901 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130901 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |