JP2002538115A - 運動誘発喘息の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＤＥ４阻害剤を使用する運動誘発喘息の治療方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、４と称されるホスホジエステラーゼ酵素の一の形態（以下、ＰＤＥ
４と記す）を優先的に阻害または結合するが、該酵素の第２の形態について同等
のまたは好ましくはそれより小さい結合または阻害を示し、かくして、喘息患者
における運動誘発気管支収縮の治療に有用である化合物を包含する。同一酵素の
相互変換不可能なコンホメーションを有する異なる形態であると考えられるこれ
らのアイソザイム形は、典型的なＰＤＥ４阻害剤であるロリプラム（rolipram）
に対するそれらの結合親和性によって区別される。ロリプラムは、一の形態の部
位に高親和性でもって結合するが、他の形態の触媒部位には低親和性でもって結
合する。本明細書では、一の形態を高親和性ロリプラム結合部位と称し、他の形
態を低親和性ロリプラム結合部位と定義する。ＰＤＥ４アイソザイムにおける低
親和性形の触媒部位を優先的に阻害することによる運動誘発喘息（ＥＩＡ）を選
択的に治療する方法もまた開示する。低親和性結合部位に優先的に結合する化合
物を投与することによるＥＩＡの治療方法もまた開示する。

【０００２】 （発明の背景） サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、広範囲に分布
する細胞内第２メッセンジャーであるアデノシン３',５'−一リン酸（ｃＡＭＰ
）およびグアノシン３',５'−一リン酸（ｃＧＭＰ）をそれらの対応する不活性
５'−一リン酸代謝物に加水分解する酵素のファミリーを表す。少なくとも９種
類のＰＤＥアイソザイムが存在すると考えられており、各々、固有の物理的およ
び動態学的特性を有しており、また、各々、異なる遺伝子ファミリーの産生物で
ある。これらは、１〜９の数字を用いて区別されている。

【０００３】 本発明における標的酵素は、全ての種々の形の、全ての細胞におけるその分布
の全範囲におけるＰＤＥ４アイソザイムである。それは、ｃＧＭＰに対してあま
り活性を有しない（Ｋ_ｍ＞１００μＭ）低Ｋ_ｍ（ｃＡＭＰ Ｋ_ｍ＝１〜５μＭ）
ｃＡＭＰ選択酵素である。このアイソザイム類のメンバーは、ロリプラムおよび
異なる順位効力を有する他のＰＤＥ４阻害剤を結合する２つ以上の相互変換不可
能なまたは緩徐に相互変換可能な形で存在するという興味深い特徴を有する。か
くして、同遺伝子産物は、２以上の触媒的に活性なコンホメーション状態で存在
することができる。重要なことに、種々の結合形の相対的な割合は、組織細胞型
に依存して変化する。例えば、炎症細胞は、ロリプラムを低親和性でもって結合
する形態を相対的に高い割合で含有するが、脳および壁（parietal）細胞は、ロ
リプラムを高親和性でもって結合する形態を相対的に高い割合で含有する。

【０００４】 この類のアイソザイムが炎症および気道平滑筋において果たす役割は、本発明
において特に興味深いものである。研究は、それが広範囲に及ぶ種々の炎症細胞
（すなわち、マスト細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単球）および気道
平滑筋においてｃＡＭＰを調節するという顕著な役割を果たすことを示している
。本発明の研究は、炎症細胞および気道平滑筋に特に適用可能である；ヒト単球
において発現される該アイソザイム型は、特に興味深いものである。これは、サ
イクリックＡＭＰが第２メッセンジャーとして炎症細胞の走化性および活性化を
阻害するのに役立つためである。さらに、ｃＡＭＰは、気道平滑筋弛緩を媒介す
る。このことをｃＡＭＰの代謝におけるＰＤＥ４の主要な役割と結びつけて、Ｐ
ＤＥ４阻害剤研究の基礎が得られた：白血球および気道平滑筋中のｃＡＭＰ含有
量を上昇させるそれらの能力のおかげで、ＰＤＥ４阻害剤は、抗炎症活性および
気管支拡張活性を有することができる。

【０００５】 炎症の治療において、および、気管支拡張薬として使用されている現行のＰＤ
Ｅ阻害剤であるテオフィリンおよびペントキシフィリンのような薬物は、無差別
的に全ての組織においてＰＤＥアイソザイムを阻害する。これらの化合物は、明
らかに、全ての組織において全てまたは大部分のＰＤＥアイソザイム類を非選択
的に阻害するので、これらの化合物は副作用を示す。このことは、これらの化合
物の治療プロフィルを評価する際に考慮すべき問題である。この標的病態は、か
かる化合物によって有効に治療されるが、望ましくない二次作用が示され、それ
らが回避または最小化できるならば、かかる化合物は、ある種の病態の治療への
このアプローチの全体的な治療効果を増加させる。ひとまとめにすると、この情
報は、目的の組織または細胞において支配的なＰＤＥに対する新規アイソザイム
選択的阻害剤を標的とすることによって標準的な非選択的ＰＤＥ阻害剤の使用に
関連する副作用を軽減できることを示唆している。理論的には、アイソザイム選
択的ＰＤＥ阻害剤は非選択的阻害剤からの改良を示すが、現在までに試験された
選択的阻害剤は、不適当なまたは標的ではない組織において目的酵素を阻害する
ことの延長として引き起こされる副作用が全くないわけではない。例えば、抗鬱
薬として開発されていた選択的ＰＤＥ阻害剤ロリプラムについての臨床試験は、
それが向精神活性を有し、胃腸作用、例えば、胸焼け、悪心および嘔吐を引き起
こすことを示している。多発梗塞性痴呆の治療を目的とする別のＰＤＥ４阻害剤
であるデンブフィリンの副作用としては、同様に、胸焼け、悪心および嘔吐が挙
げられることも示している。これらの副作用は、ＣＮＳおよび胃腸系の特定領域
におけるＰＤＥ４の阻害の結果として生じると考えられる。

【０００６】 １９８６年に、Schneider および colleagues は、ラットの脳ホモジネートに
おける高親和性血清選択的[^３Ｈ]−ロリプラム結合部位の存在および特徴を開示
した。これらの結合部位は、ラットの脳の「カルモジュリン非依存性ｃＡＭＰホ
スホジエステラーゼ」（すなわち、ＰＤＥ４）の触媒部位を表すと考えられたが
、著しい異常がデータにおいて明らかであった。同一ではないが類似している実
験条件下で、データは、ロリプラムがＫ_ｄ＝１ｎＭを有したが、Ｋ_ｉ＝１μＭで
もってラット脳ＰＤＥ４活性を阻害したことを示した。かくして、ロリプラムの
結合部位に対する親和性はその触媒活性に対する作用に対して１０００倍の差が
あった。ＰＤＥ阻害および[^３Ｈ]−ロリプラム結合競合についての包括的な構造
活性相関（ＳＡＲ）は確立されなかったが、ＰＤＥ４阻害剤としてのロリプラム
の効力を結合部位でのその効力と比べた実質的な差は、両方の活性が同一分子位
置内に含まれるという仮説の正当性を疑うものであった。

【０００７】 この難問のために、いくかの研究が始められた。一の研究では、ロリプラムの
高親和性結合部位がｃＡＭＰ触媒部位と同一のタンパク質上に存在するかを判定
しようした。別の研究では、ＰＤＥ４の阻害についてのＳＡＲが高親和性ロリプ
ラム結合部位との競合についてのＳＡＲと同一であるかを判定しようとした。第
３の研究では、特に、それが新しい薬物療法の開発に関与する場合、これらの結
果には、あるとすればどんな生物学上の意義があるかを解明しようと試みた。

【０００８】 いくつかのアッセイからデータを集めたので、阻害剤が結合するヒト単球組換
えＰＤＥ４（ｈＰＤＥ４）について少なくとも２つの結合形があったことが明ら
かになった。これらの観察結果についての一の説明は、ｈＰＤＥ４が２種類の形
態で存在するということであった。一は、ロリプラムおよびデンブフィリンなど
を高親和性でもって結合するが、他方は、これらの化合物を低親和性でもって結
合する。本明細書では、本発明者らは、これらの形態を高親和性ロリプラム結合
形（ＨＰＤＥ４）および低親和性ロリプラム結合形（ＬＰＤＥ４）と称すること
により区別する。

【０００９】 この研究結果の重要性は、高親和性ロリプラム結合形（ＨＰＤＥ４）について
強力に競合する化合物がＬＰＤＥ４（低親和性ロリプラム結合形）とさらに強力
に競合する化合物よりも多くの副作用または強い副作用を有するという知見を得
たことにある。さらなるデータは、化合物がＰＤＥ４の低親和性結合形に標的と
され得ること、およびこの形態がロリプラムが高親和性結合剤である結合形とは
異なることを示す。低親和性ロリプラム結合形と対照して高親和性ロリプラム結
合形にて作用する阻害剤について異なるＳＡＲが存在することが見出された。さ
らに、これら２つの形態は、異なる機能的役割を有すると考えられる。かくして
、低親和性ロリプラム結合形と相互に作用する化合物は、抗炎症活性を有すると
考えられ、他方、高親和性ロリプラム結合形と相互に作用する化合物は、副作用
を生じるか、またはこれらの副作用をさらに強力に示す。

【００１０】 これらの研究結果についての明確な説明はない。しかしながら、ＰＤＥ４が２
つの異なる第３または第４の状態で存在できることが提案されている。両方の形
態は、触媒活性であると考えられる。ロリプラムは、本明細書にて１０ナノモル
未満のＫ_ｉを有すると定義された高親和性でもって一の形態の一の触媒部位に結
合し、本明細書にて１００ナノモルよりも大きいＫ_ｉを有すると定義された低親
和性でもって他方の形態に結合する。

【００１１】 これらの研究結果の有用な結果は、現在、該酵素がロリプラムを低親和性でも
って結合する形態である場合にｃＡＭＰ触媒活性を優先的に阻害し、それにより
、ロリプラムを高親和性でもって結合する形態の阻害に明らかに関連付けられる
副作用を軽減する化合物を同定することが可能であるということである。

【００１２】 かくして、本発明は、副作用と対照して優れたＥＩＡ治療指数を提供する。

【００１３】 （発明の概要） 本発明は、胃腸作用および向精神作用を最小化しつつ運動誘発喘息を治療する
方法であって、かかる治療を必要とする患者に、有効量の、ロリプラムを高親和
性でもって結合するＰＤＥ４触媒形のＩＣ_５０をロリプラムを低親和性でもって
結合する該形態のＩＣ_５０で割ったＩＣ_５０比が約０.１以上である化合物を投
与することを含む方法に関する。

【００１４】 （発明の詳細な記載） 喘息は、可逆的な気道閉塞、気道炎症、ならびに種々の薬理学的および環境的
攻撃に対する非特異的な気道過剰反応により特徴付けられる複雑な多因子性疾患
である。活性化された炎症および免疫細胞から放出される種々のメディエータは
、肺水腫、気管支収縮、および気道の形態変化に至る粘液過剰分泌を引き起こす
。喘息の症状の原因となる主要な根底にある病理学的プロセスとして気道炎症が
関与していることを証明した証拠がある。

【００１５】 運動誘発喘息（ＥＩＡ）は、激しい運動の数分後に生じる気道抵抗の一時的な
増大であると定義される。ＥＩＡは、喘息の８０％に影響を及ぼし、アレルギー
性鼻炎患者の３５〜４０％がＥＩＡを経験する。ＥＩＡ患者において、運動は、
過換気、呼吸性水分損失、および気道冷却を引き起こし、次に、気道マスト細胞
および循環好塩基球を誘発して、運動の間に炎症、粘液分泌、平滑筋収縮および
血管拡張を媒介する化学物質を放出し得る。

【００１６】 運動に加えて、他の因子が気道抵抗の一時的な増大を誘発することがある。こ
れらの因子としては、汚染物質、例えば、ＳＯ_２、および温度変化、特に、冷気
のための温度変化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。かくして
、汚染誘発喘息（ＰＩＡ）および冷気誘発喘息（ＣＩＡ）の治療もまた、本発明
の範囲内である。

【００１７】 この疾患におけるＰＤＥ４阻害剤についての理論的根拠は、炎症細胞における
ほど有力ではないと考えられるがＰＤＥ４がこれらの平滑筋において主要なサイ
クリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）加水分解性アイソザイムであるという
知識に加えて、免疫および炎症細胞活性の幅広い抑制を媒介する第２メッセンジ
ャーとしてのｃＡＭＰの役割に基づいている。

【００１８】 本発明の目的のために、ロリプラムを低親和性でもって結合するｃＡＭＰ触媒
部位を「低親和性」結合部位（ＬＰＤＥ４）と称し、ロリプラムを高親和性でも
って結合するこの触媒部位の他の形態を「高親和性」結合部位と称する。

【００１９】 最初の実験は、[^３Ｈ]−ロリプラム結合アッセイを確立し、実証するために行
なった。この研究の詳細は、下記実施例１に記載する。

【００２０】 高親和性結合活性および低親和性結合活性が同一遺伝子産物中に存在していた
かを判定するために、酵母を公知の方法により形質転換し、６時間の発酵時間に
わたって組換えＰＤＥ４の発現が行なわれた。ＰＤＥ４に対して指向する抗体を
用いるウェスタンブロット分析により、ＰＤＥ４の発現量が経時的に増加し、３
時間の増殖後、最大に達したことが示された。さらに、９０％を超える免疫反応
生成物が酵母溶解産物の高速（１００,０００×ｇ）上清中にあった。[^３Ｈ]Ｒ
−(−)−ロリプラム結合活性およびＰＤＥ活性を蛋白発現と一緒にモニターした
。ＰＤＥ４活性は、ロリプラム結合活性と共に発現され、このことは、両方の機
能が同一の遺伝子産物上に存在することを示している。ウェスタンプロット分析
についての結果と同様に、８５％を超えるロリプラムにより阻害可能なＰＤＥ活
性および[^３Ｈ]−ロリプラム結合活性が酵母上清フラクション中に存在すること
が見出された。

【００２１】 全体的にみて、この系において発現されたほとんどの組換えＰＤＥ４は、ＬＰ
ＤＥ４として存在しており、ＨＰＤＥ４としてはわずかなフラクションだけであ
る。その結果、組換えＰＤＥ４触媒活性の阻害は、主に、ＬＰＤＥ４での化合物
の作用を反映している。かくして、ＰＤＥ４触媒活性の阻害は、ＬＰＤＥ４での
化合物の効力の指標として用いることができる。ＨＰＤＥ４での化合物の効力は
、それらの[^３Ｈ]Ｒ−ロリプラムについての競合能を試験することにより評価す
ることができる。低親和性ロリプラム結合部位および高親和性ロリプラム結合部
位の両方についての構造活性相関（ＳＡＲ）を明らかにするために、選択された
化合物の効力を２つのアッセイ系において測定した。標準化合物を用いた実験か
ら得た結果を表に示す。予想通り、ある種の化合物は、明らかに、ロリプラムが
高親和性結合を示す部位での方が、ロリプラムが低親和性結合剤である他の部位
と比較して、[^３Ｈ]−ロリプラムとの競合においてより強力であった。高親和性
結合と低親和性結合との間のＳＡＲ相関関係は低く、高親和性[^３Ｈ]−ロリプラ
ム結合の阻害についてのＳＡＲは低親和性ロリプラム結合部位への結合について
のＳＡＲと異なると考えられた。このＳＡＲ研究から得た結果を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】 デンブフィリンは、スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）によ
り製造された７−アセトニル,１,３−ジブチルキサンチンである。パパベリンは
、１−[(３,４−ジメトキシフェニル)メチル]−６,７−ジメトキシイソキノリン
である。トレキンシンは、２,３,６,７−テトラヒドロ−２−(メシチルイミノ)
−９,１０−ジメトキシ−３−メチル−４Ｈ−ピリミド[６,１−ａ]イソキノリン
−４−オンである。ジピリダモールは、２,２',２'',２'''−[(４,８−ジピペリ
ジノピリミド[５,４−ｄ]ピリミジン−２−６−ジイル)ジニトリロ]テトラエタ
ノールの一般名である。

【００２４】 これらの結果は、いくつかの化合物が高親和性形と比べていわゆる低親和性形
を選択的に阻害することができ、逆の化合物もあることを例示している。この研
究結果の重要性は、１つの部位を選択的に（優先的に）阻害することにより別の
望ましくない応答を除外して所望の応答に作用する化合物を設計または選択する
ことにより副作用を最小化すること、または、少なくとも、意図した治療を許容
できない程には干渉しない程度に非標的応答を最小化することが実現可能である
ということである。

【００２５】 この研究にもかかわらず、本発明者らは、ＰＤＥ４アイソザイムにおける高親
和性ロリプラム結合および低親和性ロリプラム結合についての本質的に異なるＳ
ＡＲの基礎を定義していない。しかしながら、化合物が高親和性ロリプラム結合
形についてのＩＣ_５０をロリプラムを低親和性でもって結合する形態についての
ＩＣ_５０で割った比率として算出した約０.１以上のＩＣ_５０比を示す場合、そ
れが許容される治療指数を有するという知見が得られた。すなわち、他の生理的
現象に少しもまたは許容できない程には影響を及ぼさずに、種々の免疫および炎
症性疾患を成功裏に治療することができる。本明細書において、最も好ましい実
施態様は、炎症性およびアレルギー性疾患を治療する手段として低親和性ロリプ
ラム結合部位を阻害することである。

【００２６】 化合物 本発明は、ＩＣ_５０比（高／低結合）が約０.１以上であるこれら化合物を包
含する。この化合物としては、本明細書に記載した本発明者らの試験どおりのＰ
ＤＥ４阻害剤であり、これらのアッセイまたは類似のアッセイにおいて定義され
た範囲内の比率を示す全ての化合物が挙げられる；パブリックドメインではない
か、および／または本願の出願日前にＰＤＥ４阻害剤として試験されていないか
もしくはＰＤＥ４阻害剤であることが知られていないこれらの化合物が特に重要
である。

【００２７】 該ＩＣ_５０比水準に適合する化合物の例は、上記表１に挙げられており、米国
特許第5,448,686号、第5,605,923号および第5,552,438号にも挙げられている。
これらの特許の各々は、あたかも本明細書に記載されているかのように完全に出
典明示により本明細書の記載とする。

【００２８】 有用な化合物を選択する好ましい技法は、基質として１μＭの[^３Ｈ]−ｃＡＭ
Ｐを用いてロリプラムを低親和性でもって結合する形態のＰＤＥ４触媒活性を阻
害することについてのＩＣ_５０値に対するロリプラムを高親和性でもって結合す
るＰＤＥ４の形態への１ｎＭの[^３Ｈ]Ｒ−ロリプラムの結合との競合についての
ＩＣ_５０値のＩＣ_５０比が約０.１以上である化合物を判定することである。

【００２９】 本発明の好ましい化合物は、ＩＣ_５０比が０.５よりも大きい化合物であり、
特に、該比が１.０よりも大きい化合物である。cis−[４−シアノ−４−(３−シ
クロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル)シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート]、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−(３−シクロプロピルメトキシ
−４−ジフルオロメトキシフェニル)シクロヘキサン−１−オン、およびcis−[
４−シアノ−４−(３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェ
ニル)シクロヘキサン−１−オール]のような化合物は、低親和性結合部位に優先
的に結合し、ＩＣ_５０比が０.１以上である構造物の例である。

【００３０】 本発明の化合物および医薬上許容される塩は、示された疾患の標準的な治療方
法で、例えば、経口、非経口、舌下、皮膚、経皮、直腸、吸入またはバッカル投
与により投与できる。徐放性製剤もまた使用することができる。

【００３１】 経口投与した場合に活性である本発明の化合物および医薬上許容される塩は、
シロップ剤、錠剤、カプセル剤、徐放性製剤、またはロゼンジ剤として製剤化す
ることができる。シロップ製剤は、一般に、フレーバーまたは着色料を含有する
、液体担体、例えば、エタノール、落花生油、オリーブ油、グリセリンまたは水
中の当該化合物または塩の懸濁液または溶液からなる。当該組成物が錠剤の剤形
である場合、固体製剤の調製に慣用的に使用される医薬担体を使用することがで
きる。かかる担体の例としては、ステアリン酸マグネシウム、白土、タルク、ゼ
ラチン、アラビアガム、ステアリン酸、デンプン、ラクトースおよびスクロース
が挙げられる。当該組成物がカプセル剤の剤形である場合、例えば、ハードゼラ
チンカプセルシェルにおいて上記担体を用いる慣用的なカプセル化が適している
。当該組成物がソフトゼラチンシェルカプセルの剤形である場合、分散液または
懸濁液の調製に慣用的に使用される医薬担体、例えば、水性ガム、セルロース、
シリケートまたは油が考えられ、ソフトゼラチンカプセルシェル中に取り込まれ
る。

【００３２】 典型的な非経口組成物は、非経口上許容される油、例えば、ポリエチレングリ
コール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油を含有してい
てもよい無菌水性または非水性担体中の化合物または塩の溶液または懸濁液から
なる。

【００３３】 典型的な吸入用組成物は、乾燥粉末として投与できる液剤、懸濁剤もしくは乳
剤の剤形、またはジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンの
ような慣用の噴霧剤を使用するエアゾール剤の剤形である。

【００３４】 典型的な坐剤製剤は、この方法で投与した場合に活性である本発明の化合物ま
たはその医薬上許容される塩および結合剤および／または滑沢剤、例えば、高分
子グリコール、ゼラチン、カカオ脂または他の低融点植物ろうもしくは脂肪また
はそれらの合成アナログを含む。

【００３５】 典型的な皮膚および経皮製剤、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤ま
たはパスタ剤は、慣用的な水性または非水性ビヒクルを含むか、または薬用プラ
スター剤、パッチ剤または膜剤の剤形である。

【００３６】 好ましくは、当該組成物は、患者が一回用量を投与することができるような、
単位投与剤形、例えば、錠剤、カプセル剤または定量型エアゾール剤である。

【００３７】 経口投与についての各投与単位は、適当には、化合物またはその医薬上許容さ
れる塩０.３ｍｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１ｍｇ〜３０ｍｇ／ｋｇを含
有する。好ましい投与量は、１０ｍｇおよび１５ｍｇ／ｋｇを包含する。非経口
投与についての各投与単位は、適当には、化合物またはその医薬上許容される塩
０.１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを含有する。鼻腔内投与についての各投与単位は
、適当には、１人当たり１〜４００ｍｇ、好ましくは、１０〜２００ｍｇを含有
する。局所製剤は、適当には、本発明の化合物を０.０１〜５.０％含有する。

【００３８】 活性成分は、所望の活性を示すのに十分な１日１〜６回投与できる。好ましく
は、活性成分は、１日１回または２回、さらに好ましくは、１日２回投与される
。

【００３９】 本発明の化合物は、問題になっている刺激を見越して、慢性状態としておよび
間欠的に、ＥＩＡ、ＰＩＡおよびＣＩＡの予防または治療に有用である。好まし
くは、本発明の化合物は、長期治療に使用される。

【００４０】 本発明の化合物を本発明にしたがって投与した場合、許容されない毒物学的作
用は全く予想されない。

【００４１】 以下の実施例により本発明の製造方法および使用方法を例示する。それらは、
如何なる場合も本発明の範囲をいずれかの方法にまたはいずれかの程度に限定す
るものではない。

【００４２】 （実施例） ５種類の種に及ぶ以下の種々のアッセイを用いて、約０.１以上のＩＣ_５０比
の選択を支持するデータを得た。該アッセイは、ウサギの単離した壁腺（pariet
al gland）からの酸生成の刺激；ヒト好中球におけるＦＭＬＰ誘発脱顆粒（ミエ
ロペルオキシダーゼの放出）の阻害；モルモット好酸球におけるＦＭＬＰ誘発Ｏ _２ ⁻ 形成の阻害；ヒト単球におけるＬＰＳ誘発ＴＮＦ_α生成の阻害；イヌにおけ
る嘔吐の生起；モルモットにおける抗原誘発気管支収縮の阻害；マウスにおける
レセルピン誘発低体温の逆転；およびマウスにおける養子移入したヒト単球から
のＬＰＳ誘発ＴＮＦ_α生成の阻害であった。これらのアッセイおよびデータを以
下に示す。

【００４３】 統計学的分析 低親和性部位ＰＤＥ４の阻害はこの類の化合物の抗炎症作用と関連し、他方、
高親和性部位の阻害はある種の副作用の生起と関連するという仮説を検討するた
めに、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方における種々のＰＤＥ４
阻害剤の炎症細胞機能を遮断する能力ならびにインビトロ・モデルおよびインビ
ボ・モデルにおけるこれらの化合物の副作用を生起する能力を判定した。ＰＤＥ
４阻害剤の所定の治療効果または副作用を生起する能力を、それらのＰＤＥ４の
高親和性部位を阻害する能力と対照したそれらの低親和性結合部位を阻害する能
力と比較するために、本発明者らは、（ｒ^２）の線形相関または順位相関（スピ
アマンのρ）により、インビトロ・アッセイまたはインビボ・アッセイにおける
これらの化合物の効力を、それらの単離酵素触媒活性または高親和性部位に対す
る効力と比較した。線形相関は、低親和性部位または高親和性部位のいずれかを
阻害することに対する化合物の効力を用いて所定の抗炎症作用または副作用を生
起する能力を予測することができるかを問う。順位相関は、所定の抗炎症作用ま
たは副作用を生起することにおける順位効力（rank order potency）が低親和性
部位または高親和性部位を阻害することにおける順位効力と類似しているかを試
験する。ｒ^２およびスピアマンのρは、共に、マッキントッシュ用のＳＴＡＴ
Ｖｉｅｗ IIコンピュータープログラムを用いて算出した。

【００４４】 ＰＤＥ ＩＶ対ロリプラム高親和性結合 実施例１ ホスホジエステラーゼおよびロリプラム結合アッセイ 実施例１Ａ 単離ヒト単球ＰＤＥ４およびｈｒＰＤＥ４は主として低親和性形で存在すると
判定された。したがって、ＰＤＥ４の低親和性形に対する試験化合物の活性を、
基質として１μＭ [^３Ｈ]ｃＡＭＰを使用してＰＤＥ４触媒活性に対する標準ア
ッセイを用いて評価することができる（Torphy et al., 1992）。

【００４５】 タンパク質供給源としてラット脳高速上清を使用した。[^３Ｈ]−ロリプラムの
エナンチオマーを比活性２５.６Ｃｉ／ｍｍｏｌに調製した。標準アッセイ条件
は、最後のｃＡＭＰを除いてＰＤＥアッセイ条件と同一となるように公表された
方法を変更した：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣl（ｐＨ７.５）、５ｍＭ ＭgＣl_２、
および１ｎＭの[^３Ｈ]−ロリプラム（Torphy et al., The J. of Biol. Chem.,
Vol. 267, No. 3, pp 1798-1804, 1992）。該アッセイは、３０℃で１時間行な
った。反応を停止させ、Ｂｒａｎｄｅｌセルハーベスターを使用して結合リガン
ドを遊離リガンドから分取した。[^３Ｈ]−ｃＡＭＰが存在しない以外は低親和性
ＰＤＥ活性の測定に使用した条件と同一の条件下で、高親和性結合部位について
の競合を評価した。実施例１Ａに記載したプロトコールを使用して上記表１に示
したデータを得た。

【００４６】 実施例１Ｂ ホスホジエステラーゼ活性の測定 供給者（アマシャム・ライフ・サイエンシズ（Amersham Life Sciences））に
よる説明に従って[^３Ｈ]ｃＡＭＰシンチレーション・プロキシミティー・アッセ
イ（ＳＰＡ）または[^３Ｈ]ｃＧＭＰ ＳＰＡ酵素アッセイを使用してＰＤＥ活性
を検定した。反応は、最終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣl、ｐＨ７.５、８.３ｍ
Ｍ ＭgＣl_２、１.７ｍＭ ＥＧＴＡ、[^３Ｈ]ｃＡＭＰまたは[^３Ｈ]ｃＧＭＰ（約
２０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）、酵素および種々の濃度の阻害剤を含有する反応緩
衝液０.１ｍｌ中、室温で、９６ウェルプレート中で行なった。アッセイを１時
間進行させ、硫酸亜鉛の存在下、ＳＰＡ珪酸イットリウムビーズ５０ｕｌを添加
することにより停止させた。プレートを振盪し、室温で２０分間放置した。放射
標識生成物形成をシンチレーション分光測定法により評価した。ＰＤＥ３および
ＰＤＥ７の活性は０.０５ｕＭ [^３Ｈ]ｃＡＭＰを使用して評価し、他方、ＰＤＥ
４は基質として１ｕＭ [^３Ｈ]ｃＡＭＰを使用して評価した。ＰＤＥ１Ｂ、ＰＤ
Ｅ１Ｃ、ＰＤＥ２およびＰＤＥ５の活性は基質として１ｕＭ [^３Ｈ]ｃＧＭＰを
使用して評価した。

【００４７】 [^３Ｈ]Ｒ−ロリプラム結合アッセイ Schneiderおよび共同研究者の方法の変更法により[^３Ｈ]Ｒ−ロリプラム結合
アッセイを行なった［Nicholson, et al., Trends Pharmacol. Sci., Vol. 12,
pp. 19-27 (1991) および McHale et al., Mol. Pharmacol., Vol. 39, 109-113
(1991) を参照のこと］。Ｒ−ロリプラムは、ＰＤＥ４の触媒部位に結合する［
Torphy et al., Mol. Pharmacol., Vol. 39, pp. 376-384 (1991) を参照のこと
］。その結果、[^３Ｈ]Ｒ−ロリプラム結合についての競合により、未標識競合相
手のＰＤＥ４阻害効力が独立して確認される。該アッセイは、最終濃度５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣl、ｐＨ７.５、５ｍＭ ＭgＣl_２、０.０５％ウシ血清アルブミ
ン、２ｎＭ [^３Ｈ]Ｒ−ロリプラム（５.７×１０^４ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）ならびに
種々の濃度の非放射標識阻害剤を含有する緩衝液０.５ｕｌ中、３０℃で１時間
行なった。氷冷反応緩衝液（[^３Ｈ]−Ｒ−ロリプラムを含まない）２.５ｍｌの
添加、および０.３％ポリエチレンイミン中に浸漬しておいたＷｈａｔｍａｎ Ｇ
Ｆ／Ｂフィルターによる急速減圧濾過（Ｂｒａｎｄｅｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓ
ｔｅｒ）により反応を停止した。フィルターをさらに冷緩衝液７.５ｍｌで洗浄
し、乾燥させ、液体シンチレーション分光測定法により計数した。

【００４８】 実施例２ アミノピリン蓄積 ある種のメチルキサンチンおよび他の非選択的ＰＤＥ阻害剤は、種々の種にお
いて酸分泌を増加させる。ある種の選択的ＰＤＥ４阻害剤、例えば、ロリプラム
およびＲｏ２０−１７２４は、特に、ヒスタミンのようなアデニレートシクラー
ゼのアクチベーターと合わせて投与した場合に、ラットにおいて酸分泌を増強す
る。この酸分泌の増加は、ヒスタミン誘発ｃＡＭＰ蓄積の上昇により行なわれる
。この報告された情報は、該現象が存在するかを判定するために試験された。化
合物の酸分泌誘発能は、低親和性部位または高親和性部位に対するそれらの能力
と相関関係にあった。この研究において使用したアッセイは、増加した酸分泌に
ついての生化学的マーカーとして役立つことが報告されている弱塩基である放射
標識アミノピリンの蓄積であった。アッセイは、以下のとおりである。

【００４９】 胃腺調製 いずれかの性のウサギを頚部脱臼により安楽死させ、胃を取り出した。該胃体
部から粘膜を解剖して取り出した；胃の頭部および洞部を廃棄した。Berglindh
and Obrink (1976) および Sack and Spenney (1982) により開示された方法の
変更法により胃腺を単離した。次いで、粘膜を細かく刻み、コラゲナーゼで消化
して胃腺を単離した。消化した腺を濾過し、洗浄し、以下の組成のインキュベー
ション培地中で１：１５（容量：容量）に再懸濁した：ＮaＣl、１３２.４ｍＭ
；ＫＣl、５.４ｍＭ；Ｎa_２ＨＰＯ_４、５.０ｍＭ；ＮaＨ_２ＰＯ_４、１.０ｍＭ；
ＭgＳＯ_４、１.２ｍＭ；ＣaＣl_２、１.０ｍＭ；ＮaＨＣＯ_３、１２.０ｍＭ；ウ
サギ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌ；デキストロース、２ｍｇ／ｍｌ；ｐＨ７.
４。

【００５０】 アミノピリン蓄積 酸分泌を測定するために、[^１４Ｃ]−アミノピリン、種々の濃度の選択的ＰＤ
Ｅ４阻害剤、および閾値濃度のヒスタミン（０.３〜１.０μＭ）と合わせた胃腺
を、Sack and Spinney (1982) の方法に従って、３７℃で２０分間、水平振盪器
（１１０サイクル／分）上でインキュベートした。次いで、試料を遠心分離し、
上清フラクションおよびペレットのアリコート中の放射能を測定した。Sack and
Spenney (1982) により開示されたようにアミノピリン比を算出した。データは
、ヒスタミンの最大濃度（１００μＭ）により生じる応答のパーセントで表した
。ＥＣ_５０値は、各化合物について得られた最大応答を使用して一次補間により
決定した。

【００５１】 実施例３ イヌにおける選択的ＰＤＥ阻害剤の嘔吐の可能性の評価 いずれかの性の雑種のイヌ（各実験についてｎ＝５）を動物コロニーから入手
した。一夜絶食した後、少なくとも実験の３０分前にイヌに１／２缶のドッグフ
ード（Ｂｉｇ Ｂｅｔ）を給餌した。薬物を投与するために、いずれかの前足の
橈側皮静脈にカニューレを設置した。実験化合物の投与前に、該カニューレを等
張生理食塩水（０.９％）１ｍｌでフラッシュした。化合物をポリエチレングリ
コールおよび生理食塩水の混合液または１００％ポリエチレングリコールのいず
れかに溶解し、１.０〜２.０ｍｌ／１０ｋｇの容量で投与した。全投与量が確実
に循環に入るように、カニューレをさらに生理食塩水０.５〜１.０ｍｌでフラッ
シュした。動物を１時間の観察時間の間ケージに戻した。各イヌは、むかつきま
たは嘔吐という徴候が観察され、この行動の発生についての化合物の投与後の時
間に注目した。観察期間の最後に、動物をそのホームケージに戻した。各実験日
を７日間ごとに分けた。嘔吐作用が観察されるまで連続した実験日にて投与量を
上昇させながら各化合物を各イヌに投与した。この時点で、個々のイヌを実験か
ら外し、応答しなかったこれらのイヌだけにおいてさらに高い投与量を評価した
。

【００５２】 データは、素量的用量応答曲線について文献に開示されているように各投与量
で応答するイヌの累積パーセントで表した。プロビット分析を用いて、ＥＤ_５０ 値を算出した。

【００５３】 実施例４ モルモット好酸球アッセイ 好酸球単離および精製 使用前に４〜６週間、毎週、雄性（Ｈａｒｔｌｅｙ種、ハゼルトン・ラブズ（
Hazelton Labs））モルモットにウマ血清１ｍｌを注射した。ウマ血清の注射か
ら少なくとも２４時間後、ケタミン／キシラジン混合物（８８ｍｇ；１２ｍｇ／
ｍｌ；０.４ｍｌ／ｋｇ）で動物を麻酔した。麻酔導入後、腹腔を温無菌生理食
塩水（０.９％）５０ｍｌで洗浄した。１４Ｇカテーテルを使用して５０ｍｌの
プラスチック製円錐遠心管中に洗浄液を回収した。モルモットを麻酔から回復さ
せ、２週間の休息期間の後、再度使用した。

【００５４】 遠心分離（４００×ｇ、１０分）により洗浄液から細胞を単離し、リン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）３５ｍｌに再懸濁し、等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（１.０７５ｇ
／ｍｌ）１０ｍｌを下に置いた。この懸濁液を３００×ｇで３０分間遠心分離し
た。主に好酸球および赤血球を含有するペレットをＰＢＳで洗浄し、赤血球を溶
解した。これらの細胞を、２０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再
懸濁し、加湿式５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で一夜インキュベートし
た。翌日、細胞を洗浄し、細胞生存度（トリパンブルー排除法）および純度の測
定のためにＰＢＳに再懸濁した。

【００５５】 スーパーオキシドアニオン生成（Ｏ_２ ⁻） 精製した好酸球（生存度＞９５％および純度＞９０％）を、２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ７.４）および０.１％ゼラチンを含有するＰＢＳに１〜２×１
０^６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。好酸球（１×１０^５）を９６ウェルプレー
トに添加し、３７℃で約１時間インキュベートした。反応開始の１０分前にＰＤ
Ｅ４阻害剤を添加した。６０単位のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の
不在または存在下でのシトクロームＣ（１６０μＭ）およびホルミルＭｅｔ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）（３０ｎＭ）の添加により反応を開始した。種々の時
間で、６３０ｎｍ参照を用いて、５５０ｎｍでＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ７０００
プレートリーダーにてシトクロームＣ還元をモニターした。いくつかの時点で、
ＳＯＤの不在または存在下でのウェルの正味吸光度を用いて直線回帰分析により
Ｏ_２ ⁻生成速度を測定した。結果を基礎遊離について補正したＯ_２ ⁻の対照生成
のパーセントで表した。観察された最大阻害は６０％であったので、３０％をブ
ラケッティングする濃度の一次補間を用いて対数ＩＣ_３０を算出した。

【００５６】 実施例５ モルモットにおける気管支収縮 雄性Ｈａｒｔｌｅｙ種モルモット（２００〜２５０ｇ／４週齢、ペンシルベニ
ア州デンバーのハゼルトン・リサーチ（Hazelton Research））を、１日目およ
び４日目に５％（ｗ／ｖ）オボアルブミン／生理食塩水０.３５ｍｌの各大腿へ
の筋肉注射（合計０.７ｍｌ）により麻酔した。モルモットは、２５日後に使用
可能であった。

【００５７】 実験方法 オボアルブミンに対して能動的に感作された雄性Ｈａｒｔｌｅｙ種モルモット
（６００〜８００ｇ、ハゼルトン）を手術の約１０〜１５分前にペントバルビタ
ールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。薬物投与、血圧モニタ
ーリングおよび換気のために頚静脈、頚動脈、および気管にカニューレを挿入し
た（各々、Ｄｅｓｅｒｅｔ Ｉｎｔｒａｃａｔｈ^Ｒ Ｖｉａｌｏｎ^Ｒ高分子樹脂放
射線不透過性カテーテル（ユタ州サンディのデザレット・メディカル・インコー
ポレイテッド（Deseret Medical, Inc.））、２２ＧＡおよび１９ＧＡ、ならび
にＰＥ管２６０）。両側迷走神経切断を行なってコリン作動性干渉を最小にした
。動物を麻痺させ（臭化パンクロニウム、０.１ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、Ｈａｒ
ｖａｒｄ Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ（モデル６８３、マサチューセッ
ツ州サウス・ナティックのハーバード・アパレイタス（Harvard Apparatus））
により換気した（呼吸４５回／分）。Ｅｌｃｏｍａｔｉｃトランスデューサー（
コネティカット州シャロンのバクスコ・エレクトロニクス（Buxco Electronics
））を用いて気管カニューレの側枝を介して気道圧の変化を測定した。換気スト
ローク容量は、側枝圧８ｃｍＨ_２Ｏ（室内空気約５ｃｃ）を生じるように設定し
た。Ｓｔａｔｈａｍ Ｐ２３ＸＬ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｒａｎ
ｓｄｕｃｅｒ（カリフォルニア州オックスナードのヴィゴ−スペクトラムド（Vi
ggo-Spectramed））を用いて血圧を測定した。Ｇｒａｓｓ Ｍｏｄｅｌ ７Ｄ Ｐ
ｏｌｙｇｒａｐｈ（マサチューセッツ州クウィンシーのグラス・インストゥルメ
ント・カンパニー（Grass Instrument Co.））にて圧を記録した。動物は、実験
中、加熱テーブル上にて温めておき体温を維持した。

【００５８】 抗原投与の１０分前に試験化合物またはビヒクルを静脈内経路により投与した
。０時点で、オボアルブミン０.１ｍｇ／ｋｇを静脈内経路により投与する。抗
原応答のピークで、さらに抗原オボアルブミン０.２ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し
た。累積０.３ｍｇ／ｋｇのオボアルブミンに対するピーク抗原応答が達成され
た後、飽和ＫＣl溶液１ｃｃ／ｋｇを静脈内投与し、最大気管支収縮を引き起こ
した。

【００５９】 実施例６ ヒト単球におけるＬＰＳ誘発ＴＮＦ_αの阻害 インビトロ研究 ＴＮＦ_α阻害がＬＰＤＥ４またはＨＰＤＥ４の阻害に関与しているかを測定す
るために、ＬＰＤＥ４およびＨＰＤＥ４に対してある範囲の効力を有する一連の
ＰＤＥ４阻害剤を、それらの、インビトロでリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激された
ヒト単球におけるＴＮＦ_α生成阻害能についてスクリーニングした。種が異なる
と炎症細胞におけるＬＰＤＥ４およびＨＰＤＥ４のｃＡＭＰ加水分解への相対的
な寄与が劇的に異なると考えられるとすれば、このスクリーンについての主要な
ヒト細胞の使用は、極めて重要であると考えられた。

【００６０】 方法 正常なヒトドナー由来の血液の新しく得られたバフィーコートまたは血漿瀉血
残渣から精製した（Ｃｏｌｌａｔａ）ヒト末梢血単球においてＴＮＦ_α阻害を評
価した。単球を、２４ウェルマルチディッシュにて１ウェルにつき培地１ｍｌあ
たり１×１０^６細胞の密度でプレーティングした。細胞を１時間付着させ、その
後、上清を吸引し、新鮮な培地（１％ウシ胎児血清および１０Ｕ／ｍｌのペニシ
リン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０）１ｍｌを添加した。
細胞を１ｎＭから１ｍＭの範囲の濃度で試験化合物の存在または不在下で４５分
間インキュベートした後、ＬＰＳ（イー・コリ（E. coli）０５５：Ｂ５、シグ
マ・ケミカルズ（Sigma Chemicals））を添加して１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度
を得た。試験化合物を可溶化し、単球培地中の最終溶媒濃度が０.５％ジメチル
スルホキシドおよび０.５％エタノールであるように５０：５０の濃度のジメチ
ルスルホキシド／エタノールで希釈した。３７℃／５％ＣＯ_２で１４〜１６時間
インキュベートした後、培養上清から単球を取り出し、１００×Ｇで遠心分離し
て細胞片を除去した。すぐに、または、アッセイまで培養上清を−７０℃で貯蔵
してから、サイトカインアッセイを行なった。

【００６１】 捕獲抗体としてネズミモノクローナル抗ヒトＴＮＦ_α抗体（以下を参照のこと
）および第２の抗体としてポリクローナルウサギ抗ヒトＴＮＦ_αを使用してＥＬ
ＩＳＡ（Winston）を用いてＴＮＦ_αのレベルを測定した。検出については、ペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Man
nheim）、カタログ番号６０５２２２）を添加し、次いで、ペルオキシダーゼに
対する基質（０.１％尿素過酸化物を含有する１ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレン
ジアミン）を添加した。イー・コリにおいて産生された組換えヒトＴＮＦ_αを用
いて作成した標準曲線から試料中のＴＮＦ_αレベルを算出した。Kohler および
Millstein（Nature, vo. 256, p495-497, 1975）の方法の変更法により組換えヒ
トＴＮＦ_αで免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からヒトＴＮＦ_αに対する
モノクローナル抗体を調製した。フロイント完全アジュバントに乳化した組換え
ヒトＴＮＦ_αでニュージーランド白ウサギを反復免疫化することによりポリクロ
ーナルウサギ抗ヒトＴＮＦ_α抗体を調製した。

【００６２】 養子腹膜炎モデルにおけるヒトＴＮＦ_α産生のインビボ抑制 方法 いずれの薬物治療も受けていない健康なボランティアから２分の１単位のヘパ
リン化静脈全血を採血した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に血液を積層さ
せ、２５℃で、８００×ｇで３０分間、遠心分離することにより多形核白血球を
分取した。リンパ球／単球部分を収穫し、２５℃で、１０００ｒｐｍで１０分間
、Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩
水）で２回洗浄した。該ペレットを、Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳ
５ｍｌに再懸濁し、２５℃で血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地にて調製し
たＰｅｒｃｏｌｌ溶液５ｍｌ上に積層させ、２５℃で、５５０×ｇで３０分間、
遠心分離した。単球の浮遊層を取り出し、２５℃で、１０００ｒｐｍで１０分間
、Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳで２回洗浄した。最終洗浄単球単離
体を、２５℃で、Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳに６〜１０×１０^６ 細胞／ｍｌで懸濁した。Ｓｏｕｒｃｅ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓパックから同一の
方法により単球を単離した。単球調製物は、単球６５〜９０％の範囲であり、該
細胞の生存度は、＞９７％であった（トリパンブルー排除法）。

【００６３】 ４または５匹の群におけるＢＡＬＢ／ｃ雄性（マサチューセッツ州ウィルミン
トンのチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories））
をバリア持続性設備（barrier-sustained facility）中に維持した。単球が最小
の剪断力および剪断応力に曝露されるように２３ｇａ針を装着した注射器にて軽
く圧力をかけながら１ｍｌ当たり６〜１０×１０^６個の単球を０.５ｍｌ、体重
１８〜２５ｇの同一齢のマウスの腹膜中に投与した。単球を投与して２分以内に
、マウスをビヒクルまたは化合物で１５分間の経口投与により処理した。次いで
、Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳに溶解した１２５ｍｇ／ｍｌのエン
ドトキシン（イー・コリ、野生型、ディフコ（Difco））０.２ｍｌを該動物に腹
腔内（i.p.）注射した。２時間後、該動物を二酸化炭素窒息により安楽死させ、
Ｃa^２＋およびＭg^２＋を含まないＤＰＢＳ １.５ｍｌ（４℃）を腹腔内注射した
。腹膜をやさしくマッサージし、洗液を取り出し、氷浴中のポリプロピレン管に
入れた。該試料を遠心分離（４℃で、１２,５０００×ｇで５分間）により浄化
した。上清を新しい管にデカントし（−２０℃で貯蔵してもよい）、ＥＬＩＳＡ
によりヒトおよびマウスＴＮＦ_αについてアッセイした。標準方法によりＥＤ_{５ ０} 値を算出した。

【００６４】 実施例７ ヒト好中球法 単離および精製 Ｆｉｃｏｌｌ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７）を使用して勾配遠心分離に
よりヘパリン化血から好中球（ＰＭＮ）を単離し、次いで、デキストラン沈降に
付して、赤血球を除去した。全ての残存赤血球を水で３０秒間溶解し、１０Ｘ
ＤＢ−ＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃa^２＋またはＭg^２＋）を使用して等張性を回復した。
遠心分離によりＰＭＮを単離し、１Ｘ ＤＢ−ＰＢＳでさらに１回洗浄した後、
細胞数および生存度を測定した（トリパンブルー色素排除法）。個々のドナーに
応じて細胞数を０.７５〜１.５×１０^６細胞／ｍｌに調節した。

【００６５】 脱顆粒（ミエロペルオキシダーゼの放出） 振盪している水浴中、３７℃で５分間、５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢの存
在下、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７.４）および０.１％ゼラチンを含
有するＥａｒｌｅｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で上記細
胞懸濁液のアリコート（０.１ｍｌ）をインキュベートした。ｆＭＬＰ（３０ｎ
Ｍ）の添加前に種々の濃度の選択的ＰＤＥ４阻害剤およびＰＧＥ２（３〜１０ｎ
Ｍ）で細胞をさらに５分間前処理した。ｆＭＬＰを添加し、インキュベーション
をさらに３０分間続けた。氷上に試料を置くことにより反応を停止させ、次いで
、遠心分離した。上清フラクションを取り出し、ミエロペルオキシダーゼ活性に
ついてアッセイするまで冷凍貯蔵した（−３０℃）。

【００６６】 ミエロペルオキシダーゼ活性の測定 基質としてｏ−ジアニシジンおよび標準としてホースラディッシュペルオキシ
ダーゼを使用してミエロペルオキシダーゼ活性を測定した。５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６.０）中、基質（ｏ−ジアニシジン、０.５３ｍＭ；Ｈ_２Ｏ _２ 、０.１４７ｍＭ；最終濃度）１００μｌと一緒に上清のアリコート（５０μ
ｌ）をインキュベートした。４Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ ５０μＬの添加により反応を停止
させた。４１０ｎｍで吸光度を測定することにより生成物形成を測定し、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼを使用して標準曲線と比較することにより活性を
測定した。データは、対照（ＰＧＥ２単独の存在下で放出されたミエロペルオキ
シダーゼの量）のパーセントで表した。大部分の化合物について観察された最大
阻害が３０％であったので、１５％をブラケッティングする濃度の一次補間を用
いて対数（ＩＣ_１５）値を算出した。

【００６７】 実施例８ マウスにおけるレセルピン誘発低体温の逆転 雄性ＣＦ−１またはＢＡＬＢ／ｃマウスを個々にワイヤーケージに単離した。
各マウスの直腸温度を記録した後、レセルピン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で前
処理した。レセルピン処理から４時間後、直腸温度を記録し、個々の動物に種々
の投与量（経口）の試験化合物、ビヒクル、またはロリプラム（１０ｍｇ／ｋｇ
）を投与した。次いで、直腸温度を３０分ごとに２時間記録した。データは、レ
セルピン処理後４時間目に観察された温度からの温度変化で表した（温度は基底
レベルより約１０〜１５℃低下した）。処理後、９０分目または１２０分目に記
録した温度変化を用いて用量応答曲線を作成した。動物６〜９匹の平均値のプロ
ビット分析または直線回帰によりＥＤ_５０値を測定した。化合物のレセルピン誘
発低体温逆転能をそれらの低親和性結合または高親和性結合阻害能と比較するた
めに、ＥＤ_５０およびＩＣ_５０値を−対数（値）で表した。

【００６８】 実施例９ ＰＤＥ４の生物学的機能と阻害との関係 ＰＤＥ４阻害のある種の生物学的作用がＬＰＤＥ４またはＨＰＤＥ４のいずれ
かの阻害に関連するかを判定するために、線形相関および順位相関を用いて、化
合物の作用を生じる能力と化合物のＬＰＤＥ４またはＨＰＤＥ４を阻害する能力
との比較を行なった。これらの相関は、いくつかのファクター：１）化合物の安
定性；２）化合物の細胞進入能；３）インビボ研究における化合物の生物学的利
用能；４）相関値により影響を及ぼされ得、特に、線形相関は、効力の差異に敏
感であり、効力の値の範囲が大きくなるほど、有意な線形相関を測定するのが容
易になる。これらの注意事項は、ＬＰＤＥ４またはＨＰＤＥ４の阻害と種々のア
ッセイ系における生物学的機能との相関を分析し要約する場合に考慮に入れた。

【００６９】 単離炎症細胞を使用して、モルモット好酸球における単球ＴＮＦα生成の抑制
およびスーパーオキシド生成の阻害は、ＬＰＤＥ４の阻害と良好な相関関係にあ
ったが、ＨＰＤＥ４の阻害とはそうではなかった。さらにまた、抗原誘発気管支
収縮のインビボでの予防は、ＨＰＤＥ４の阻害よりもＬＰＤＥ４の阻害と良好な
相関関係にあった。このインビボ・モデルにおいて、ＰＤＥ４阻害剤は、マスト
細胞脱顆粒を防ぐことにより作用すると考えられる（Underwood et al., 印刷中
）。しかしながら、好中球脱顆粒の阻害がＬＰＤＥ４の阻害よりもＨＰＤＥ４の
阻害と良好な相関関係にあることが見出されたので、炎症細胞機能の阻害が常に
ＬＰＤＥ４の阻害と関連しているわけではなかった。かくして、炎症細胞活性の
抑制は、全てとは限らないが多少は、ＬＰＤＥ４の阻害と関連していたと考えら
れる。対照的に、酸分泌の増強、嘔吐の生起およびレセルピン誘発低体温の逆転
（ＰＤＥ４阻害剤の向精神的可能性の尺度）は、ＨＰＤＥ４の阻害と良好な相関
関係にあったが、ＬＰＤＥ４の阻害とはそうではなかった。かくして、この類の
化合物の潜在的な副作用のほとんどは、ＨＰＤＥ４の阻害と関連していた。

【００７０】 かくして、これらの研究結果は、ＬＰＤＥ４を優先的に阻害する化合物が望ま
しくない副作用を生起する可能性を低下させつつ有益な抗炎症作用を生じること
を示唆している。かくして、高親和性でもってロリプラムを結合するＰＤＥ４触
媒形についてのＩＣ_５０を低親和性でもってロリプラムを結合するＰＤＥ４触媒
形についてのＩＣ_５０で割ったＩＣ_５０比（ＨＰＤＥ４／ＬＰＤＥ４）が約０.
１以上である化合物の選択により、それらの治療指数が上昇する；すなわち、有
益な作用が最大化され、有害な作用が最小化される。

【００７１】 この選択ガイドが実際に改善された治療指数を有する化合物を同定するかを判
定するために、治療効果と副作用とを比較する３つモデルを評価した。これらは
、化合物の単離ヒト単球からのＴＮＦα生成を抑制する能力と単離ウサギ壁腺に
おける酸分泌を刺激する能力との間のインビトロ比較ならびにモルモットにおけ
る化合物の抗原誘発気管支収縮を予防する能力およびイヌにおける嘔吐を生起す
る能力およびマウスにおける養子移入モデルにおける化合物のＴＮＦα生成を抑
制する能力およびマウスにおけるそれらのレセルピン誘発低体温を逆転する能力
を試験する２つのインビボ比較を包含した。

【００７２】 ０.１以上の選択性比（ＨＰＤＥ４／ＬＰＤＥ４）を有するＰＤＥ４阻害剤は
、それらの治療指数において著しい改善を示した。例えば、選択性比が≧０.１
であるcis−[４−シアノ−４−(３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェ
ニル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート]、２−カルボメトキシ−４−シア
ノ−４−(３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル)シク
ロヘキサン−１−オン、およびcis−[４−シアノ−４−(３−シクロプロピルメ
トキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル)シクロヘキサン−１−オール]は、全
て、それらの治療指数が典型的なＰＤＥ４阻害剤であるＲ−ロリプラムと比較し
て１００倍改善されたことを示す。かくして、このことは、ＨＰＤＥ４ ＩＣ_５
０／ＬＰＤＥ４ ＩＣ_５０≧０.１の選択ガイドの使用により、上昇した治療指数
インビトロ比較を有する化合物が同定されることを示している。

【００７３】 ＥＩＡの治療に関して、ＥＩＡを患っているヒトにcis−[４−シアノ−４−(
３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル)シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート]化合物を投与した。これらの患者は、炎症の軽減、気管支拡張お
よび肺の神経調節を体験した。

【００７４】 運動攻撃研究 無作為化二重盲検プラセボ二期間交差研究を行なって、ＥＩＡ患者におけるci
s−[４−シアノ−４−(３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル)シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート]の効力、安全性および耐容性を評価した。
ＥＩＡ患者２７人を無作為化し、化合物、１０ｍｇのＢＩＤ即時放出錠剤または
プラセボを７日間投与し、次いで、７日間ウォッシュアウトし、さらに７日間処
理した。１日目に１回投与した後、および７日目に再度（投与前および投与の３
時間後）運動攻撃試験を行った。

【００７５】 患者群は、１８〜６０歳の非喫煙の男性または女性のＥＩＡ患者からなってお
り、 ａ）彼らの１秒間の努力呼気肺活量（ＦＥＶ_１）が予想された正常値の７０％
以上であった； ｂ）証明されたＦＥＶ_１の降下は、スクリーニング訪問時の運動試験に反応し
て１５％以上であった；および ｃ）彼らは、コルチコステロイド吸入または他の喘息用調節剤投薬を受けてい
なかった。

【００７６】 運動攻撃プロトコールは、以下のとおりであった。患者は、標的心拍数で６分
間、動力化トレッドミルにて運動した。速度および勾配は、各患者について年齢
で調節した予想最大値の８５％の標的心拍数を達成するように調節した。患者は
、試験の間じゅう、フェースマスクを通して圧縮空気（室温で湿度０％）を呼吸
した。試験完了から１、５、１０、１５、２０、３０および４５分後に肺機能試
験（ＫｏＫｏ ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈ）を行ない、ＦＥＶ_１が基線の１０％以内
に戻らなかった場合には、その後、継続した。

【００７７】 主な効力変数は、運動に反応したＦＥＶ_１の最大減少率（ＭＰＤ）であった。
結果は、平均ＭＰＤ ３２.８８％から２３.５７％への、化合物の１回投与後の
ＭＰＤ ＦＥＶ_１の有意な改善を示した。投与から７日後、平均ＭＰＤ ＦＥＶ_１ の２１.８％へのさらなる改善と共に化合物の作用増大があった。治療から１週
間後、化合物を投与した患者の４０％は、運動後、ＦＥＶ_１が１５％以下の降下
した。当該化合物は、治療関与の重篤な有害体験または退薬症状を伴わずに、安
全であり、十分に耐容性があった。Am. J. Resp. Crit. Care Med. 1998:157; A
413 もまた参照のこと（出典明示によりその全内容を本明細書の記載とする）。

【００７８】 本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない
全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別
的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典
明示により本明細書の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/472 Ａ６１Ｋ 31/472 31/519 31/519 Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＺ，ＤＭ，ＥＥ，ＦＩ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 セオドア・トーフィー アメリカ合衆国19010ペンシルベニア州ブ リン・マー、マウント・プレザント・ロー ド823番 (72)発明者 ジーグフリード・クリステンセン アメリカ合衆国19103ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、チェリー・ストリート 2301番 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 MA52 NA14 ZA591 ZA592 4C086 AA02 BC07 BC30 CB10 MA01 MA04 MA52 NA06 ZA59 4C206 AA02 GA01 GA28 HA13 MA01 MA04 MA72 NA06 ZA59

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｒ−ロリプラムを低親和性でもって結合するＰＤＥ４触媒形
   を優先的に阻害することによる運動誘発喘息、冷気誘発喘息または汚染誘発喘息
   に罹患するかまたは罹患している哺乳動物における該疾患の予防または治療方法
   であって、かかる予防または治療を必要とする患者に、有効量の、Ｒ−ロリプラ
   ムを高親和性でもって結合するＰＤＥ４形のＩＣ_５０をＲ−ロリプラムを低親和
   性でもって結合する該触媒形のＩＣ_５０で割ったＩＣ_５０比が約０.１以上であ
   る化合物を投与することを含む方法。
2. 【請求項２】 ＩＣ_５０の比が０.５以上である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ＩＣ_５０の比が１.０以上である請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 投与される化合物が、即時放出型または徐放性経口製剤とし
   て投与されるcis−[４−シアノ−４−(３−シクロペンチルオキシ−４−メトキ
   シフェニル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート]である請求項１記載の方法
   。
5. 【請求項５】 予防または治療される症状が運動誘発喘息である請求項１ま
   たは４記載の方法。
6. 【請求項６】 運動誘発喘息、冷気誘発喘息または汚染誘発喘息に罹患する
   かまたは罹患している哺乳動物における該疾患の予防用または治療用薬物の製造
   におけるＰＤＥ４特異的阻害剤の使用であって、該阻害剤がＲ−ロリプラムを低
   親和性でもって結合するＰＤＥ４触媒形を阻害する能力を有するものであり、該
   方法が、かかる予防または治療を必要とする患者に、有効量の、Ｒ−ロリプラム
   を高親和性でもって結合するＰＤＥ４のＩＣ_５０をＲ−ロリプラムを低親和性で
   もって結合する該触媒形のＩＣ_５０で割ったＩＣ_５０比が約０.１以上である化
   合物を投与することを含むことを特徴とする使用。
7. 【請求項７】 ＩＣ_５０の比が０.５以上である請求項６記載の製造法。
8. 【請求項８】 ＩＣ_５０の比が１.０以上である請求項６記載の製造法。
9. 【請求項９】 使用される化合物がcis−[４−シアノ−４−(３−シクロペ
   ンチルオキシ−４−メトキシフェニル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート]
   であり、即時放出型経口製剤または徐放性経口製剤として製造される請求項６〜
   ８いずれか１項記載の製造法。