JP2002538167A - 脂質の代謝および貯蔵を調節する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘッジホッグのレセプターパッチ−１に対するヘッジホッグの結合をブロックことに指向された抗ヘッジホッグ抗体は、脂肪の代謝および貯蔵を損なう。本発明は、ヘッジホッグアンタゴニストまたはヘッジホッグアゴニストのような脂質モジュレーターを用いた種々の脂質代謝および脂質貯蔵の障害、異常なアポリポタンパク質発現、アテローム性硬化症および他の脂質関連障害の処置のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般に、脂質の代謝および貯蔵を調節するための方法に関する。本
発明は、特に、ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）活性のアゴニストまたはアン
タゴニストのような脂質の代謝および貯蔵のモジュレーターを使用して、胃腸管
における脂質代謝を変更し、そして腸上皮組織における脂質貯蔵を変更すること
に関する。

【０００２】 （発明の背景） 脂質の貯蔵、破壊および腸吸収に影響を与える病理学的状態は、いわゆる「脂
質代謝障害」という広汎なカテゴリーに含まれ、そして診断された種々の障害が
存在する。これらには：食餌誘発性高コレステロール血症および通常の高コレス
テロール血症（Ｆａｒｅｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ １９９５ ９２：１７７４−１７７８）、無βリポタンパク質血症および低
βリポタンパク質血症（Ｌｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９３
３４：５２１−５４１）が含まれる。未知の起源のいくつかの他の脂質代謝障害
もまた同定されており、これには、アンダーソン病（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｍｅ
ｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．１９６１ １１：６１７−６２１）、およびアテローム性硬
化症（Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｈｕｙｎｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５
９５：２２４６−２２５７）が含まれる。脂質代謝障害の一般的な症状は、以
下を含むがそれらに限定されない：慢性の下痢、不適切な体重増加または体重減
少、過剰体重を減らすことができないこと、および成長するための一般的な欠陥
（Ｃａｓｅ ３５−１９９９、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；３２７：６２８−６３５ １９９２）。種々の脂質代謝障
害は、アポリポタンパク質の異常発現および／または脂質代謝の種々の局面を担
う遺伝子の調節を介して発すると考えられている。

【０００３】 Ａｐｏ−Ｂは、哺乳動物においては腸および肝臓において合成される。ここで
は、Ａｐｏ−Ｂは、キロミクロンの形成ならびに超低比重（ＶＬＤＬ）、低比重
（ＬＤＬ）および中間型（ＩＤＬ）のリポタンパク質の合成における主要な構成
成分として作用する。腸によるキロミクロンの形成は、食餌の脂肪および脂溶性
ビタミンの吸収および輸送に非常に重要である。肝臓にａｐｏ−Ｂを発現するが
、腸には発現しないように遺伝子改変されたマウスは、キロミクロンを形成し得
ない（Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５ ９６：２９３２−
２９４６）。事実、アポリポタンパク質のノックアウトマウスは、早期の死（胚
１１．５日での死）、および卵黄嚢におけるリポタンパク質形成の損傷を示す（
Ｆａｒｅｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５
９２：１７７４−１７７８）。

【０００４】 種々の脂質代謝障害はまた、胚性の組織発生における機能不全を介して生じる
と考えられる。胚の腸の材料からの腸の生成は、腸の内胚葉細胞と中胚葉細胞と
の間の細胞間シグナル伝達にのみ依存する。ヘッジホッグシグナル伝達経路は、
特化された中胚葉分化を腸および膵臓へと指向させるのに重要な役割を果たすこ
とが広く認識されている（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ １９９７ ７：８０１−８０４）。ヘッジホッグは、マウス胚において、
前腸内胚葉の腹側部分においてまず発現され、そして胚性の後腸において内胚葉
に由来するシグナルを媒介することが示されている（同上）。具体的には、標的
化されたヘッジホッグの欠失を伴うマウスは、胚９．５日にもすでに明らかであ
る、明らかな前腸欠陥を有する。胚９．５日には、気管憩室が成長を始める。こ
のことは、ヘッジホッグおよびそのシグナル伝達成分が、ヒトにおける前腸欠陥
に関与することを示唆する。（Ｌｉｔｉｎｇｔｕｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ １９９８ ２０：５８−６０）。Ｙａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９７ ３：８２６−８３５もまた参照のこと。

【０００５】 脂質代謝障害を処置するための多くの試みがなされているが、実際には殆ど成
功していない（Ｃａｓｅ ３５−１９９９、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；３２７：６２８−６３５ １９９２）。現在
、供給源、すなわち腸でのその代謝を調節することによって脂質代謝障害に取り
組む処置は存在しない。それ自体における障害およびそれ自体の障害を潜在的に
除去し得る処置は何ら存在しない。従って、腸における脂質代謝を調節し得る処
置の方法を開発することが所望される。障害を実質的に除去する目的のためのみ
に脂質代謝障害を処置し得る治療の方法を開発することもまた所望される。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、部分的に、ヘッジホッグシグナル伝達経路が脂質の腸代謝において
役割を果たし得るという本発明者らの発見に基づく。この腸代謝には、アポリポ
タンパク質発現、内因性コレステロール合成、および外因性食餌コレステロール
の取り込み調節が含まれる。具体的には、本発明者らの発見は、脂質の代謝およ
び貯蔵におけるヘッジホッグ媒介性のシグナル伝達経路の役割を支持する。

【０００７】 脂質の代謝および貯蔵のモジュレーターとして作用し、結果として、特定の脂
質代謝障害の効果および症状のモジュレーターとして作用する、ヘッジホッグの
アゴニストまたはアンタゴニストを使用した方法を開発することは有用である。
本発明者らは、この問題を、ヘッジホッグによるシグナル伝達を誘発することな
くヘッジホッグレセプターに結合し得、従って、ヘッジホッグ活性に対するアン
タゴニストとして作用し得るヘッジホッグモジュレーターを使用して、脂質の代
謝および貯蔵を調節する方法を開発することによって解決した。本発明者らはま
た、ヘッジホッグタンパク質に対して結合することによりヘッジホッグアンタゴ
ニストとして作用し、従って、そのレセプターに対して結合するヘッジホッグの
能力を阻害または競合するヘッジホッグモジュレーターを使用して、脂質の代謝
および貯蔵を調節する方法を開発した。さらに、本発明者らは、ヘッジホッグの
バージョンおよびヘッジホッグに結合し得、またはその結合親和性を増強し、従
ってアゴニストとして作用する関連低分子であるモジュレーターを使用して、脂
質の代謝および貯蔵を調節する方法を開発した。さらに、本発明者らは、ヘッジ
ホッグに対して結合し得、従って、ヘッジホッグがそのレセプターに結合するの
をブロックすると言う点でアンタゴニストとして作用する抗体であるヘッジホッ
グモジュレーターを用いて脂質代謝を調節する方法を開発した。

【０００８】 本発明の１つの局面は、被験体における脂質代謝を調節するための方法に関す
る。手短には、この方法は、ヘッジホッグモジュレーターを含む組成物の薬学的
に有効な量を投与する工程を包含する。このモジュレーターは、薬学的に有効な
量でのヘッジホッグのアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかであり得る。

【０００９】 他の実施態様において、本発明の方法は、被験体における腸上皮細胞における
液胞の形成を調節するために使用され得る。

【００１０】 別の実施態様において、本発明の方法は、腸上皮細胞の脂質の隔離を制御する
ために使用され得る。

【００１１】 さらに他の実施態様において、本発明の方法は、種々の脂質代謝障害を予防ま
たは処置するために使用され得る。この予防または処置としては、コレステロー
ル関連障害について被験体を予防、処置または保護すること；アテローム性硬化
症を予防または処置すること；アポリポタンパク質障害（ａｐｏ−Ｂ欠損障害を
含む）を予防または処置すること；無βリポタンパク質血症および正常トリグリ
セリド性無βリポタンパク質血症を予防または処置すること；低βリポタンパク
質血症を処置すること；キロミクロン蓄積疾患を処置すること；ビタミンＡおよ
びビタミンＥの吸収不良および欠損障害を処置すること；ならびに肥満を処置、
予防または肥満から保護することが挙げられる。

【００１２】 一つの実施態様において、本発明は、活性成分としてヘッジホッグモジュレー
ターを含む薬学的に有効な組成物を利用した脂質代謝障害を処置するための方法
を提供する。好ましい実施態様の１つにおいて、本発明は、腸上皮の細胞または
組織における脂質材料の蓄積を含む脂質代謝障害に罹患した被験体における脂質
代謝を制御するためにモジュレーターを用いることを意図する。

【００１３】 別の実施態様において、本発明は、脂質代謝障害に罹患した被験体における脂
質代謝を調節するためにヘッジホッグモジュレーターを用いることを意図する。
この脂質代謝障害としては、肥満が挙げられるがそれに限定されない。

【００１４】 好ましい実施態様において、ヘッジホッグモジュレーターは、以下からなる群
より選択されるヘッジホッグアンタゴニストである：ヘッジホッグ模倣体もしく
はその活性フラグメント；改変されたヘッジホッグタンパク質もしくはその活性
フラグメント；ヘッジホッグ改変体；または抗ヘッジホッグホモログ。抗ヘッジ
ホッグホモログは、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはそれらの任意の活
性フラグメントであり得る。

【００１５】 特定の実施態様において、本方法は、ヘッジホッグタンパク質よりも高くなく
ても少なくとも同じ結合親和性でヘッジホッグレセプターに結合し得るヘッジホ
ッグアゴニストであるモジュレーターを使用して行われる。

【００１６】 本発明の別の局面は、低分子ヘッジホッグモジュレーター治療剤の治療調製物
に関する。ここでこのモジュレーターは、脂質代謝障害を処置するに充分な量で
薬学的に受容可能なキャリア中に提供されるヘッジホッグのアンタゴニストまた
はアゴニストのいずれかである。

【００１７】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．概観） 本発明の経過において行った実験において、抗ヘッジホッグ抗体を用いた出生
前および出生後の両方のマウスの処置は、生存の失敗、矮小化、下痢および早死
をもたらした。これらのマウスの組織学的分析によって、腸上皮細胞の液胞内で
の顕著な尖端または核内での液胞の形成および脂質蓄積が明らかになった。これ
らの症状は、ヘッジホッグシグナル伝達経路のブロックを介して誘発された。そ
して、これらの症状は、種々の脂質の代謝および貯蔵の障害と最も密接に関連す
る症状である。

【００１８】 本願は、脂質の代謝および貯蔵のモジュレーター（本明細書において「脂質モ
ジュレーター」という）の調製物が脂質の貯蔵、分解および腸吸収を制御するた
めに使用され得るという発見に関する。一般に、本発明の方法は、脂質の代謝お
よび貯蔵を変化させる脂質モジュレーターの薬学的有効量を投与する工程を包含
することによって特徴付けられ得る。脂質モジュレーターは、最も好ましくは、
ヘッジホッグのアンタゴニストまたはアゴニストである。本方法は、最も好まし
くは、インタクトな組織もしくは器官の一部であり得る腸上皮細胞において行わ
れ得る。

【００１９】 （ＩＩ．定義） 簡便のために、本明細書の発明の詳細な説明、実施例および添付の特許請求の
範囲において使用される特定の用語を、本節に収集する。すべての引用は、他の
様式で特定しない限り、本明細書において参考として援用される。

【００２０】 本明細書において使用される用語「脂質モジュレーター」は、任意の方法で脂
質の代謝および貯蔵を変更または調節するように作用する任意の化合物を含み；
用語「調節する」とは、尺度または比率に従って、調節することを意味する。本
発明の最も好ましい脂質モジュレーターは、ヘッジホッグのアゴニストまたはア
ンタゴニスト（下記に定義）であり、アゴニストまたはアンタゴニストは、それ
ぞれ、それが、ヘッジホッグシグナル伝達経路を作動させる（ａｇｏｎｉｚｅ）
かまたはそれと拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）するかのいずれかを行い、従って
、脂質の代謝および貯蔵の変化をもたらすことを意味する。

【００２１】 本明細書において使用されるように、用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」は
、ヘッジホッグがヘッジホッグレセプターと結合するのを阻害する任意の化合物
を包含する。本発明の目的について、「ヘッジホッグアンタゴニスト」とは、ヘ
ッジホッグおよび／もしくはパッチが媒介する結合を阻害もしくはブロックし得
るか、またはそうでなければヘッジホッグおよび／もしくはパッチの機能を、例
えば、ヘッジホッグリガンドが媒介するヘッジホッグシグナル伝達を阻害もしく
はブロックすることによって、調節し得る因子（例えば、抗ヘッジホッグ抗体ま
たは抗パッチ抗体のようなポリペプチド）をいう。そのようなヘッジホッグ／パ
ッチの相互作用のアンタゴニストは、以下のうち１以上の特性を有する因子であ
る：（１）それが、ヘッジホッグリガンド／ヘッジホッグ相互作用（例えば、ヘ
ッジホッグ／パッチの相互作用）を阻害するに充分な特異性を有して、ヘッジホ
ッグ保有細胞もしくはヘッジホッグ分泌細胞の表面上のヘッジホッグを覆うかま
たはそれに結合する；（２）それが、ヘッジホッグ媒介性のシグナルの伝達（例
えば、ヘッジホッグ／パッチ媒介性のシグナル伝達）を改変する（好ましくは、
阻害する）に充分な特異性を有して、ヘッジホッグ保有細胞もしくはヘッジホッ
グ分泌細胞の表面上のヘッジホッグを覆うかまたはそれに結合する；（３）それ
が、ヘッジホッグ／パッチの相互作用を阻害するに充分な特異性を有して、細胞
内またはその上のヘッジホッグレセプター（例えば、パッチの）を覆うかまたは
それに結合する；（４）それが、ヘッジホッグ媒介性のヘッジホッグシグナル伝
達の伝達（例えば、パッチ媒介性のヘッジホッグシグナル伝達）を改変（好まし
くは阻害）するに充分な特異性を有して、細胞内またはその上のヘッジホッグレ
セプター（例えば、パッチの）を覆うかまたはそれに結合する。特徴的な４つは
、機能的アンタゴニストと呼ばれる特異的なアンタゴニストである。機能的なア
ンタゴニストは、少なくとも以下の特性を有する：（ｉ）単離されたタンパク質
は、パッチ−１に対する成熟したヘッジホッグタンパク質の結合より弱くあり得
る（好ましくは、少なくとも同一）の親和性を有するレセプターパッチ−１に結
合し；そして（ｉｉ）この単離されたタンパク質は、アルカリホスファターゼ（
ＡＰ）誘導を、インビトロのＣＨ３１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイ
において試験される場合に、成熟ヘッジホッグタンパク質によってブロックする
。

【００２２】 好ましい実施態様において、そのアンタゴニストは、１および２の一方または
両方の特性を有する。他の好ましい実施態様において、そのアンタゴニストは、
３および４の一方または両方の特性を有する。さらに、１を超えるアンタゴニス
トが患者に投与され得、例えば、ヘッジホッグに結合する因子がパッチに結合す
る因子と合わされ得る。本明細書において議論されるように、本発明の方法にお
いて使用されるアンタゴニストは、分子の特定の型または構造に限定されない。
その結果、本発明の目的について、ヘッジホッグ抗原に結合し得、そしてヘッジ
ホッグを効果的にブロックするか、または覆う任意の因子は、本明細書における
実施例において使用されるアンタゴニストと等価であると考えられる。

【００２３】 例えば、抗体または抗体ホモログ（以下に議論する）ならびに他の分子（例え
ば、ヘッジホッグについての天然の結合タンパク質の可溶性形態）が有用である
。ヘッジホッグについての天然の結合タンパク質の可溶性形態としては、可溶性
のパッチのペプチド、パッチの融合タンパク質、または二機能性のパッチ／Ｉｇ
融合タンパク質が挙げられる。例えば、可溶性形態のパッチまたはそのフラグメ
ントを投与して、ヘッジホッグに結合させ（そして、好ましくは、細胞上のヘッ
ジホッグ結合部位と競合させ）、それによって、抗ヘッジホッグ抗体のようなア
ンタゴニストの投与に類似する効果をもたらし得る。特に、パッチに結合するが
、ヘッジホッグ依存性のシグナル伝達を誘発しない可溶性のヘッジホッグ変異体
は、本発明の範囲内に含まれる。そのようなヘッジホッグ変異体は、野生型のヘ
ッジホッグタンパク質の競合インヒビターとして作用し得、そして「アンタゴニ
スト」と考えられる。

【００２４】 最も好ましい実施態様は、細胞表面のヘッジホッグまたはパッチに結合する（
ブロックするかまたは覆うことを含む）本発明の方法において使用されるパッチ
またはヘッジホッグのアンタゴニストである。これらの組成物としては、モノク
ローナル抗体（例えば、抗ヘッジホッグ抗体または抗パッチ抗体のホモログ）が
挙げられる。処置のため（特に、ヒト処置のため）に好ましい抗体およびホモロ
グとしては、ヒト抗体ホモログ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆ
ａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、ならびに抗
体の重鎖もしくは軽鎖のモノマーもしくはダイマーまたはそれらの混合物が挙げ
られる。従って、ヘッジホッグに対するモノクローナル抗体は、本発明の方法に
おける好ましい結合因子である。

【００２５】 本処置は、これらの状態に罹患したヒトおよび動物の両方の被験体において有
効である。本発明が適用可能な状態に供する動物は、ペットとしてまたは商用目
的のいずれかで飼育される、家庭用動物および家畜の両方にわたる。例としては
、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギが挙げられる。

【００２６】 本明細書中で使用される場合、用語「ヘッジホッグアゴニスト」は、ヘッジホ
ッグレセプターを活性化する任意の化合物を含む。

【００２７】 本明細書中で使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を
介して結合される免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなるインタクトな抗体を含
む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖お
よびそれらの抗原結合フラグメント（これは、１つ以上の抗原に結合し得る（す
なわち、ヘッジホッグまたはパッチ））から選択される１つ以上のポリペプチド
を含むタンパク質を含むことが意図される。１つより多いポリぺプチドからなる
抗体ホモログの構成要素ポリペプチドは、必要に応じてジスルフィド結合され得
るか、そうでなければ共有結合的に架橋され得る。従って「抗体ホモログ」は、
インタクトなＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（およびそれ
らのサブタイプ）の免疫グロブリンを含み、ここで、この免疫グロブリンの軽鎖
は、κ型またはλ型であり得る。「抗体ホモログ」はまた、抗原結合特異性を保
持するインタクトな抗体の部分、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖モノマーも
しくは重鎖ダイマー、軽鎖モノマーもしくは軽鎖ダイマー、１つの重鎖および１
つの軽鎖からなるダイマーなどを含む。従って、抗原結合フラグメント、および
上記の抗体由来の全長ダイマーまたはトリマーポリペプチドは、それら自体有用
である。

【００２８】 本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組換えＤＮＡ技術
により生成される、抗体ホモログである。ここでは、抗原結合に必要ではないヒ
ト免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖のいくつかのアミノ酸または全てのアミノ酸
は、非ヒト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸に置
換されている。

【００２９】 本明細書中で使用される場合、「キメラ抗体ホモログ」は、組換えＤＮＡ技術
により生成される、抗体ホモログである。ここでは、免疫グロブリン軽鎖、免疫
グロブリン重鎖、または両方の、ヒンジ領域および定常領域の全てあるいは一部
が、別の免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖からの対応する領域に置換されている
。別の局面において、本発明は、以下を含むキメラ分子の改変体の特徴を有する
：（１）ヘッジホッグ標的部分（例えば、抗原に結合し得るパッチ部分（すなわ
ち、ヘッジホッグ））；（２）必要に応じて、第二のペプチド、例えば、溶解性
を増大させるか、またはヘッジホッグ標的部分のインビボでの寿命を増大させる
ペプチド、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそれら
のフラグメントもしくは一部分、例えば、ＩｇＧの一部分またはフラグメント、
例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ヒンジ領域；
ならびに、毒素部分。ヘッジホッグ標的部分は、任意の天然に生じるヘッジホッ
グリガンドまたはそのフラグメント（例えば、パッチペプチド）、または類似の
保存的に置換されたアミノ酸配列であり得る。好ましい標的部分は、可溶性のパ
ッチフラグメントである。このキメラ分子を用いて、毛包などのような上皮細胞
の増殖に関連した障害の危険性がある被験体（例えば、ヒト）を処置し得る。

【００３０】 本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体ホモログ」は、組換えＤＮＡ技術に
より生成される抗体ホモログである。ここでは、免疫グロブリン軽鎖または重鎖
のアミノ酸全ては、ヒト供給源由来である。

【００３１】 本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」は、ペプチド、ポリぺプチドまた
はタンパク質の単量体単位である。天然に生じるペプチド、ポリペプチドおよび
タンパク質において見出される２０のアミノ酸が存在し、それら全てはＬ−異性
体である。この用語はまた、アミノ酸のアナログならびにタンパク質アミノ酸の
Ｄ−異性体およびそのアナログを含む。

【００３２】 本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、本質的に任意の２０ア
ミノ酸からなる任意のポリマーである。「ポリペプチド」はしばしば、比較的大
きなポリペプチドに関して使用され、そして「ペプチド」はしばしば、小さなポ
リペプチドに関して使用されるが、当該分野におけるこれらの用語の使用は、重
複しており、そして変動する。本明細書中で使用される用語「タンパク質」とは
、もし他に記載がなければ、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。

【００３３】 本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ末端」とは、タンパク質の成熟形態の
、第１のアミノ酸（アミノ酸１番）をいい、タンパク質の「成熟形態」は、任意
のシグナル配列または他の配列の除去後の一次アミノ酸配列を含む。

【００３４】 本明細書中で使用される用語「フラグメント」は、単離されたアンタゴニスト
に適用する場合、単一のアミノ酸がアンタゴニスト活性を保持する場合、単一の
アミノ酸と同じくらい小さい。それは、少なくとも約１０残基長であり得、より
代表的には、少なくとも約４０残基長、好ましくは少なくとも約１００残基長で
あり得る。フラグメントは、当業者に公知の方法により生成され得る。候補フラ
グメントが単離されたヘッジホッグの生物学的活性を提示する能力はまた、本明
細書に記載されるように、当業者に公知の方法により評価され得る。

【００３５】 本明細書中で使用される場合、用語、本発明のヘッジホッグアンタゴニストの
「機能的等価物」は、ヘッジホッグアンタゴニストとは異なるアミノ酸残基を有
し得るが、それにもかかわらず機能的アンタゴニストとして作用し得る薬剤であ
る。「融合」とは、２つ以上のタンパク質またはそれらのフラグメントの、それ
らのタンパク質をコードするポリペプチド分子の遺伝子発現を通じた、それらの
個々のペプチド骨格を介した同一線型状の結合をいう。タンパク質またはそれら
のフラグメントが異なる供給源由来であることが好ましい。従って、好ましい融
合タンパク質は、ヘッジホッグでない第二の部分に共有結合された、ヘッジホッ
グタンパク質またはフラグメントを含む。詳細には、「ヘッジホッグタンパク質
／Ｉｇ融合」は、免疫グロブリン鎖のＮ末端に結合された、本発明のヘッジホッ
グタンパク質またはそれらのフラグメントを含むタンパク質であり、ここで、そ
の免疫グロブリンのＮ末端の部分がヘッジホッグタンパク質で置換されている。
一般的に、融合タンパク質は、一般式Ｘ−ｈｈ−Ｙによって表され得、ここで、
ｈｈは、脊椎動物ｈｈタンパク質の１つに由来するタンパク質の一部分を表し、
そしてＸおよびＹは、独立して存在しないか、または生物体において脊椎動物ｈ
ｈ配列の１つに関連しないアミノ酸配列（天然に生じる変異を含む）を表す。

【００３６】 本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子融合」とは、２つ以上のタンパク
質またはそれらのフラグメントの、それらのタンパク質をコードするポリヌクレ
オチド分子の遺伝子発現による、それらの個々のペプチド骨格を介した、同一線
型状の共有結合をいう。

【００３７】 本明細書中で使用される場合、用語「小胞」とは、任意の親油性分子の凝集体
をいう。この小胞は、生物学的供給源（例えば、細胞膜のような脂質二重層また
はコール酸誘導の界面活性小胞物）または非生物学的供給源（例えば、非生物学
的界面活性小胞）から得られ得る。小胞の形状、型および立体配置は、本発明の
範囲を限定しない。

【００３８】 本明細書中で使用される場合、用語「変異体」は、生物体の遺伝的物質の任意
の変化であり、特に、野生型ポリヌクレオチド配列における任意の変化（例えば
、欠失、置換、付加、または変更）、あるいは野生型タンパク質における任意の
変化である。

【００３９】 本明細書中で使用される場合、用語「野生型」は、それぞれ、インビボで正常
に存在するような、タンパク質のエキソンの天然に生じるポリヌクレオチド配列
、またはその部分、あるいはタンパク質配列またはその部分である。

【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」
とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について０．５×ＳＳＣ〜約５
×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等価な塩および温度条件をいう。従って、本明
細書中で使用される、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上
の定義であり、そしてハイブリダイゼーション条件の範囲を含む。より高いスト
リンジェンシーの条件は、例えば、プラークスクリーニング緩衝液（０．２％ポ
リビニルピロリドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００；０．２％ウシ血清アルブ
ミン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％
ピロホスフェートナトリウム；１％ＳＤＳ）；１０％デキストランスルフェート
、および１００ｇ／ｍｌの変性させて、超音波処理したサケ精子ＤＮＡを用いる
６５℃で１２〜２０時間のハイブリダイゼーション、および７５ｍＭ ＮａＣｌ
／７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／１％ＳＤＳを用いる６５
℃での洗浄工程を含み得る。低ストリンジェンシー条件は、例えば、プラークス
クリーニング緩衝液、１０％硫酸デキストランおよび１１０ｇ／ｍｌの変性させ
て、超音波処理したサケ精子ＤＮＡを用いる５５℃での１２〜２０時間ハイブリ
ダイゼーション、および３００ｍＭ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナトリウム
（２．０×ＳＳＣ）／１％ＳＤＳを用いる５５℃での洗浄工程を含み得る。Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ６．３．１−６．３．６（１９８９）を参照のこと。

【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」とは、発現ベクターが宿
主細胞中に導入される場合に、少なくとも１つの遺伝子を発現し得るＤＮＡプラ
スミドまたはファージ（他の一般的な例のうち）のような、ポリヌクレオチドを
いう。このベクターは、細胞中で複製可能であってもよいし、または可能でなく
てもよい。

【００４２】 本明細書中で使用される場合、用語「単離された」（「実質的に純粋な」と互
換的に使用される）とは、ポリペプチドをコードする、核酸（すなわち、ポリヌ
クレオチド配列）に適用される場合、その起源または操作に基づき；（ｉ）天然
で結合するポリヌクレオチドの全てと結合しない（例えば、宿主細胞中に発現ベ
クターまたはその一部分として存在する）；あるいは（ｉｉ）天然で結合する核
酸部分または他の化学的部分以外の核酸部分または他の化学的部分と結合する；
あるいは（ｉｉｉ）天然に生じない、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲ
ノムポリヌクレオチドの部分、ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドを意味する
。「単離された」とはさらに、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によりインビトロで増幅される；（ｉｉ）化学的に合成される；（ｉｉｉ）クロ
ーニングによって組換え的に産生される；あるいは（ｉｖ）切断およびゲル分離
により精製される、ポリヌクレオチド配列を意味する。従って、「実質的に純粋
な核酸」は、その核酸が由来する生物体の天然に生じるゲノム中で通常連続する
コード配列の１つまたは両方と直接連続しない核酸である。実質的に純粋なＤＮ
Ａはまた、さらなるヘッジホッグ配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部で
ある組換えＤＮＡを含む。

【００４３】 本明細書中に使用される場合、用語「単離された」（「実質的に純粋な」と互
換的に使用される）とは、ポリペプチドに適用される場合、その起源または操作
に基づき、（ｉ）発現ベクターの一部分の発現産物として宿主細胞中に存在する
か；あるいは（ｉｉ）天然で結合するタンパク質または他の化学的部分以外のタ
ンパク質または他の化学的部分と結合するか；あるいは（ｉｉｉ）天然に生じな
い、ポリペプチドまたはその一部分を意味する。「単離された」とは、さらに（
ｉ）化学的に合成された；または（ｉｉ）宿主細胞中で発現され、そして結合し
たタンパク質から分離精製されるタンパク質を意味する。この用語は一般的に、
天然に共に生じる他のタンパク質および核酸から分離されたポリペプチドを意味
する。好ましくは、ポリペプチドはまた、ポリペプチドを精製するために使用さ
れる抗体またはゲルマトリクス（ポリアクリルアミド）のような物質から分離さ
れる。

【００４４】 本明細書中で使用される、用語「異種プロモーター」は、遺伝子または精製さ
れた核酸に天然で結合しないプロモーターである。

【００４５】 「相同性」および「同一性」はそれぞれ、より厳密な比較で同一である２つの
ポリペプチド配列の間の配列類似性をいう。相同性および同一性は、それぞれ、
比較する目的で整列され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る
。比較された配列における位置が同じアミノ酸残基により占められる場合、次い
で、ポリペプチドは、その位置で同一であるといわれ得る；同じ部位が類似した
アミノ酸（例えば、立体的性質および／または電気的性質において類似した）に
より占められる場合、次いで、その分子がその位置で相同であるといわれ得る。
２つの配列間での相同性パーセントは２つの配列に共有される一致した位置また
は相同な位置の数／比較した位置の数×１００の関数である。例えば、２つの配
列中、１０の位置のうち６つが一致するかまたは相同であるならば、２つの配列
は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは
、５０％の相同性を共有する（全部で６つの位置のうち３つが一致する）。「関
連しない」または「非相同」配列は、本発明の配列と、４０パーセント未満の同
一性を共有するが、好ましくは２５パーセント未満の同一性である。一般的に、
２つの配列が整列されて最大の相同性を与える場合に、比較が行われる。このよ
うなアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
．４８：４４３〜４５３（１９７０）の方法（これは、以下にさらに詳細に記載
されるコンピュータープログラムにより都合良く実行される）を用いて提供され
得る。相同配列は、類似したの残基が整列された参照配列中の対応するアミノ酸
残基についての保存的置換、すなわち「許容（ａｌｌｏｗｅｄ）点変異」である
場合、同一のまたは類似のアミノ酸残基を共有する。この点において、参照配列
における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的または機能的に類
似する（例えば、類似したサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水
素結合を形成する能力などを含む）残基の置換である。特に好ましい保存的置換
は、Ｄａｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：Ｓｕｐｐｌ．３、２２章：３５４〜３
５２．Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９７８）における「受容される点変異」として規定される
基準を満たしている置換である。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを
含む種々のアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、使用され得
る。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）の一部として
利用可能であり、そして例えば、デフォルト設定で使用され得る。ＥＮＴＲＥＺ
は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｈｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄを通じて利用可能である。１つの実施態様において、２つ
の配列の同一性パーセントは、１のギャップ重量を用いたＧＣＧプログラムによ
り決定され得る（例えば、各アミノ酸のギャップは、それが２つの配列間の単一
のアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチであるように加重される）。

【００４６】 用語「ヘッジホッグＮ末端フラグメント」は、「ヘッジホッグ」と互換的に使
用され、そしてヘッジホッグ前駆体からタンパク質分解的に切断される活性な成
熟配列をいう。

【００４７】 用語「疎水性」とは、非極性原子を有する化学的部分の、水または他の極性原
子よりむしろ互いに相互する傾向をいう。「疎水性」の物質は、大部分は、水に
不溶である。疎水性特性を有する天然産物としては、脂質、脂肪酸、リン脂質、
スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド、テ
ルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイ
ド、レチノイド（ｒｅｔｅｎｏｉｄ）、ビオチン、および疎水性アミノ酸（例え
ば、トリプロファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メ
チオニン、アラニン、プロリン、およびチロシン）が挙げられる。化学的部分は
また、その物理特性が、非極性原子の存在により決定される場合、疎水性である
か、または疎水性特性を有する。

【００４８】 句「内部アミノ酸」とは、Ｎ末端アミノ酸でもなく、Ｃ末端アミノ酸でもない
ペプチド配列中の任意のアミノ酸を意味する。

【００４９】 本発明の「ヘッジホッグタンパク質」は、米国特許出願第６０／０６７，４２
３号に開示されるように、コンセンサスアミノ酸配列からなる部分を少なくとも
有する点において規定される。この用語はまた、ヘッジホッグポリペプチド、ま
たはヘッジホッグポリペプチドの機能的改変体、あるいは生物学的活性を有する
ヘッジホッグポリペプチドまたは機能的改変体のホモログを意味する。

【００５０】 用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、本明細書中
互換的に使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列
」もまた、本明細書中で互換的に使用される。用語「ヘッジホッグフラグメント
」は、「ヘッジホッグ」と互換的に使用される。本発明の実践には、他に示され
ることがなければ、当該分野の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分
子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来技術
を用いる。このような技術は文献にも記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５
；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ
編）、１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓおよび
Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ
編）、１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．
Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７；Ｉｍｍ
ｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
、１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｅｓ
ｆｏｒ Ｍａｍｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ
．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷ
ａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７；Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ
巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）１９８６；Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８６を参照のこ
と。

【００５１】 ヘッジホッグ分子は、ヘッジホッグ分子が以下の特性のうち少なくとも１つを
有する場合、「生物学的活性」を有する：（ｉ）その分子が、本明細書中で規定
されるように（例えば、配列番号２１または２２）、ヘッジホッグコンセンサス
基準に合致し、かつそのレセプターである、パッチ−１に結合する能力を有する
か、または発現の際、この特徴を有するポリペプチドをコードする；（ｉｉ）そ
の分子が、本明細書中で規定されるようなヘッジホグコンセンサス基準に合致す
るか、またはその分子が発現の際、この特徴を有するポリペプチドをコードする
；ならびに（ｉｉｉ）その分子が、Ｃ３Ｈ １０ Ｔ１／２細胞中でアルカリホ
スファターゼ活性を誘導する。

【００５２】 用語「パッチ（された）（の）（ｐａｔｃｈ）」または「ｐｔｃ」とは、細胞
をヘッジホッグタンパク質と接触することによって誘導されるシグナル伝達に関
連した、膜貫通タンパク質に関連したファミリーをいう。例えば、哺乳動物ｐｔ
ｃファミリーは、ｐｔｃ１およびｐｔｃ２を含む。

【００５３】 本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」または「組換え遺伝子」とは、
エキソンおよび（必要に応じて）イントロン配列の両方を含む、本発明の脊椎動
物ｈｈポリペプチドの１つをコードするオープンリーディングフレームを含む核
酸をいう。「組換え遺伝子」とは、脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードし、そし
て脊椎動物ｈｈコードエキソン配列を含む核酸をいうが、それは、必要に応じて
染色体脊椎動物ｈｈ遺伝子由来であるかまたは関連しない染色体遺伝子由来であ
るイントロン配列を含み得る。用語「イントロン」とは、所定の脊椎動物ｈｈ遺
伝子（これはタンパク質に翻訳されないが、一般的にエキソン間に見出される）
中に存在するＤＮＡ配列をいう。

【００５４】 本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、外来ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの細胞の取り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変化するプロセスをいう。
例えば、形質転換された細胞は、組換え形態の脊椎動物ｈｈポリペプチドを発現
するか、またはアンチセンス発現が移入された遺伝子から生じる場合に、天然に
生じる形態の脊椎動物ｈｈタンパク質の発現が破壊される。

【００５５】 本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、核酸（例え
ば、発現ベクター）の核酸媒介遺伝子移入によるレシピエントの細胞への導入を
意味する。

【００５６】 本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、それが連結される別の
核酸を輸送し得る核酸分子をいう。好ましいベクターの１つの型は、エピソーム
であり、すなわち、これは、染色体外で複製し得る核酸である。好ましいベクタ
ーは、自己複製し得、かつ／それらが連結される核酸を発現し得るベクターであ
る。ベクターが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得るベクターは、本
明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において
有用な発現バクターはしばしば、「プラスミド」の形態であり、これは、一般的
にそれらのベクターの形態で、染色体に結合されていない、環状二本鎖ＤＮＡル
ープをいう。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラス
ミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるために、互換的に使用され
る。しかし、本発明は、等価の機能を果たし、そして本明細書に関して後に当該
分野において公知となる、このような他の形態の発現ベクターを含むことが意図
される。

【００５７】 「転写調節配列」は、それらが作動可能に連結されるタンパク質コード配列の
転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーター
のようなＤＮＡ配列をいうために使用される一般的用語である。好ましい実施態
様において、組換え脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子の１つの転写は、発現が意図さ
れる細胞型における組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他
の転写調節配列）の制御下である。組換え遺伝子が転写調節配列（これは、天然
に生じる形態のヘッジホッグタンパク質の転写を制御する転写調節配列と同じが
、または異なる）の制御下であり得ることがまた、理解される。

【００５８】 本明細書中で使用される場合、用語「組織特異的プロモーター」とはプロモー
ターとして働く、すなわち、プロモーターに作動可能に連結される選択されたＤ
ＮＡ配列の発現を調節し、そして神経起源の細胞（例えば、神経細胞）ような組
織の特定の細胞中の選択されたＤＮＡ配列の発現をもたらすＤＮＡ配列を意味す
る。この用語はまた、いわゆる「漏出性（ｌｅａｋｙ）」プロモーターを包含し
、これは、主にある組織において選択されたＤＮＡの発現を調節するが、同様に
他の組織においても発現をもたらす。

【００５９】 「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換
的に使用される用語である。このような用語は、特定の被験体の細胞だけでなく
、そのような細胞の子孫または潜在的子孫もいうことが理解される。特定の改変
は、変異または環境の影響のいずれかに起因して続く世代で生じ得るので、その
ような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお本明細書中で
使用される用語の範囲内に含まれる。

【００６０】 用語「内部上皮組織」とは、皮膚の上皮層と類似した特徴を有する、身体の
内部組織をいう。例としては、腸の内層が挙げられる。

【００６１】 用語「液胞」とは、一般に直径が１００ｎｍより大きく、その機能が明確に
割り当てられ得ない真核生物細胞の膜結合小胞をいう。それは、リソソーム、エ
ンドソーム、分泌小胞、食作用性小器官または他の膜結合オルガネラをいい得る
。

【００６２】 用語「脂質」とは非極性溶媒（例えばエーテル、クロロホルム、ベンゼンな
ど）により生体物質から抽出され得るが水性溶媒では抽出され得ない、異種クラ
スの有機化合物をいう。いくらかの脂質（コレステロールのような）は、タンパ
ク質と複合体化してリポタンパク質を形成することが見出され得る。

【００６３】 用語「コレステロール」とは、ほとんどの真核生物の形質膜の必須の中性脂
質成分である、ステロールである。動物には通常、食餌からコレステロールを得
るが、内因的な生成からの、一日の必要な量の大部分を供給する能力が存在する
。

【００６４】 本明細書中で使用される場合、「増殖している」および「増殖」は、有糸分裂
が行われている細胞をいう。

【００６５】 本明細書中で使用される場合、「形質転換された細胞」とは、抑制されない増
殖状態に自然発生的に変換した細胞、すなわち、それらは培養物中で限りない数
の分裂を通じて増殖する能力を獲得した細胞をいう。形質転換された細胞は、そ
れらの増殖制御の欠損に関して、新形成、退形成および／または過形成のような
用語により特徴付けられ得る。

【００６６】 本明細書中で使用される場合、用語「不死化細胞」とは、細胞が培養物におい
て限りない数の分裂により増殖する能力を有するように、化学的および／または
組換え手段を介して改変された細胞をいう。

【００６７】 本発明の方法により処置される「患者」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒ
ト動物のいずれかを意味し得る。

【００６８】 本発明の処置方法に関する本発明の「有効量」のアンタゴニストまたはアゴニ
ストは、所望の投薬レジームの一部として適用される場合、そして処置される障
害の臨床的に受容可能な標準に従って、例えば、脂質代謝、液胞形成、脂肪蓄積
などの速度において変化をもたらす調製物中のアゴニストまたはアンタゴニスト
のいずれかの量をいう。

【００６９】 細胞の「増殖状態」とは、細胞の増殖速度および細胞の分化状態をいう。

【００７０】 （ＩＩＩ．ヘッジホッグタンパク質の一般的特性） 単離されたヘッジホッグタンパク質は、天然に生じるかまたは組換えのヘッジ
ホッグファミリーのタンパク質であり、そして無脊椎動物かまたは脊椎動物供給
源のいずれかから得られ得る（以下の参考を参照のこと）。脊椎動物のヘッジホ
ッグタンパク質ファミリーのメンバーは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘッジホッグ（
ｈｈ）遺伝子によりコードされるタンパク質との相同性を共有する（Ｍｏｈｌｅ
ｒおよびＶａｎｉ、（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１５、９５７〜９
７１）。これまで、マウスゲノムのスクリーニングとｃＤＮＡライブラリーとの
スクリーニング組み合わせにより、３つの哺乳動物ｈｈ対応物が同定され、これ
らは、Ｄｅｓｅｒｔヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ
）およびＩｎｄｉａｎヘッジホッグ（Ｉｈｈ）と呼ばれ、ヒトのような他の哺乳
動物ならびに魚類および鳥類においてもまた存在する。他のメンバーとしては、
Ｍｏｏｎｒａｔヘッジホッグ（Ｍｈｈ）、ならびにＴｉｇｇｙ−ｗｉｎｋｌｅヘ
ッジホッグ（ＴｗＨｈ）およびハリモグラ（ｅｃｈｉｄｎａ）ヘッジホッグ（Ｅ
ｈｈ）が挙げられる。

【００７１】 ヘッジホッグ遺伝子は、切断を受けて、シグナル伝達を担う約２０ｋＤａのＮ
末端ドメインおよび約２５ｋＤａのカルボキシ末端フラグメントを生じる糖タン
パク質をコードする。この２０ｋＤａの部分を包含する種々の他のフラグメント
は、「単離されたヘッジホッグタンパク質」の規定の範囲内であるとみなされる
。これらの配列、ならびにそれらの化学的特徴および物理的特徴を開示する刊行
物としては、以下が挙げられる（Ｈａｌｌら、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ ３
７８、２１２−２１６；Ｅｋｋｅｒら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ５、９４４−９５５；Ｆａｎら（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８１、４５７
−４６５、Ｃｈａｎｇら（１９９４）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３３
３９−３３５３；Ｅｃｈｅｌａｒｄら（１９９３）、Ｃｅｌｌ ７５、１４１４
−１４３０ ３４−３８）；ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９５２３２２３（Ｊｅｓｓｅ
ｌｌ、Ｄｏｄｄ、Ｒｏｅｌｉｎｋ、およびＥｄｌｕｎｄ）。

【００７２】 ヘッジホッグファミリーのメンバーとしては、任意の天然に存在するネイティ
ブのヘッジホッグタンパク質（対立遺伝子の系統発生的な対応物またはその他の
改変体（天然の供給源で産生されるか、または化学的に産生されるかのいずれか
（ムテインまたは変異タンパク質を含む））を含む）、ならびにヘッジホッグフ
ァミリーの組換え形態および新たな活性メンバーが挙げられる。

【００７３】 ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーは、少なくとも４つのメンバー（例
えば、単一のｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘッジホッグ遺伝子のパラログ（参照））を
含む。これらのメンバーのうちの３つは、本明細書中でＤｅｓｅｒｔヘッジホッ
グ（Ｄｈｈ）、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、およびＩｎｄｉａｎヘッジ
ホッグ（Ｉｈｈ）と言及され、これらは魚類、鳥類、および哺乳動物を含む、す
べての脊椎動物においてあきらかに存在する。本明細書中でｔｉｇｇｉｅ−ｗｉ
ｎｋｌｅヘッジホッグ（Ｔｈｈ）と言及される４番目のメンバーは、魚類に特異
的であるようである。本発明の方法において使用される単離されたヘッジホッグ
タンパク質は、ヘッジホッグファミリーの天然に存在するタンパク質であるかま
たは組換えタンパク質であり、そしてこれらは無脊椎動物の供給源または脊椎動
物の供給源のいずれかから獲得され得る（以下の参考文献を参照のこと）。脊椎
動物ヘッジホッグタンパク質ファミリーのメンバーは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘ
ッジホッグ（ｈｈ）遺伝子によってコードされるタンパク質と相同性を共有する
（ＭｏｈｌｅｒおよびＶａｎｉ（１９９２）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１５
，９５７−９７１）。他のメンバーが続いて同定されている。

【００７４】 マウスおよびニワトリのＳｈｈ遺伝子、ならびにマウスＩｈｈ遺伝子（例えば
、米国特許第５，７８９，５４３号を参照のこと）は、切断を受けて、約２０ｋ
Ｄａのアミノ末端フラグメントおよび約２５ｋＤａのカルボキシ末端フラグメン
トを生じる糖タンパク質をコードする。最も好ましい２０ｋＤａのフラグメント
は、コンセンサス配列である配列番号２２を有する。この２０ｋＤａの部分を包
含する種々の他のフラグメントは、本願発明の範囲内とみなされる。これらの配
列、ならびにこれらの化学的特徴および物理的特徴を開示する刊行物としては、
Ｈａｌｌら、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ ３７８、２１２−２１６；Ｅｋｋｅ
ｒら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５、９４４−９５５；Ｆ
ａｎら（１９９５）、Ｃｅｌｌ ８１、４５７−４６５、Ｃｈａｎｇら（１９９
４）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０、３３３９−３３５３；Ｅｃｈｅｌａｒ
ｄら（１９９３）、Ｃｅｌｌ ７５、１４１４−１４３０ ３４−３８）；ＰＣ
Ｔ特許出願ＷＯ ９５／２３２２３（Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｄｏｄｄ、Ｒｏｅｌｉｎ
ｋ、およびＥｄｌｕｎｄ；ＰＣＴ特許出願 ＷＯ９５／１８８５６（Ｉｎｇｈａ
ｍ、ＭｃＭａｈｏｎ ａｎｄ Ｔａｂｉｎ）が挙げられる。米国特許第５，７５
９，８１１号は、ヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグをコードする完全ｍＲＮＡ配列、
ヒトＩｎｄｉａｎヘッジホッグｍＲＮＡの５’末端の部分的配列、およびヒトＤ
ｅｓｅｒｔヘッジホッグｍＲＮＡの部分的配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号を列挙
する。本発明の方法のヘッジホッグ治療的組成物は、任意の種々の技術（天然に
存在するタンパク質の精製、組換え的に産生されたタンパク質、および合成化学
を含む）によって生成され得る。ヘッジホッグ治療剤のポリペプチド形態は、好
ましくは脊椎動物のヘッジホッグタンパク質に由来し、例えば、脊椎動物生物由
来の天然に存在するヘッジホッグタンパク質、またはそれらのフラグメントに対
応する配列を有する。しかし、ヘッジホッグポリペプチドが、任意の後生動物生
物において存在するヘッジホッグタンパク質（またはそのフラグメント）に対応
し得るということが認識される。

【００７５】 ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物ファミリーは、少なくとも４つのメンバー（例
えば、単一のｄｒｏｓｏｐｈｉｌａヘッジホッグ遺伝子のパラログ（配列番号１
９））を含む。本明細書中でＤｅｓｅｒｔヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、Ｓｏｎｉｃ
ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）およびＩｎｄｉａｎヘッジホッグ（Ｉｈｈ）として言及
される、これらのメンバーのうちの３つは、魚類、鳥類、および哺乳動物を含む
すべての脊椎動物において明らかに存在する。本明細書中でｔｉｇｇｉｅ−ｗｉ
ｎｋｌｅヘッジホッグ（Ｔｈｈ）と言及される４番目のメンバーは、魚類に特異
的であるようである。添付の配列表に従って（表１もまた参照のこと）、ニワト
リのＳｈｈポリペプチドは、配列番号１にコードされ；マウスＤｈｈポリペプチ
ドは、配列番号２にコードされ；マウスＩｈｈポリペプチドは、配列番号３にコ
ードされ；マウスＳｈｈポリペプチドは、配列番号４にコードされ；ゼブラフィ
ッシュＳｈｈポリペプチドは、配列番号５にコードされ；ヒトＳｈｈポリペプチ
ドは、配列番号６にコードされ；ヒトＩｈｈポリペプチドは、配列番号７にコー
ドされ；ヒトＤｈｈポリペプチドは、配列番号８にコードされ；そしてゼブラフ
ィッシュＴｈｈは、配列番号９にコードされる。

【００７６】

【表１】

【００７７】 種々のヘッジホッグホモログの間の配列変動性に加えて、ヘッジホッグタンパ
ク質は明らかに、多くの異なる形態（プロ形態、全長成熟形態、およびいくつか
のそれらのプロセスされたフラグメントを含む）で天然に存在する。プロ形態と
しては、細胞外ドメインの方向付けられた分泌のためのＮ末端シグナルペプチド
を含むが、全長成熟形態は、このシグナル配列を欠失する。

【００７８】 上記のように、いくつかの例においては、成熟形態のさらなるプロセシングが
引き起こされて、タンパク質の生物学的に活性なフラグメントを生成する。例え
ば、ｓｏｎｉｃヘッジホッグは、さらなるタンパク質分解性プロセシングを受け
て、約１９ｋＤａおよび２７ｋＤａの２つのペプチドを生成する。この１９ｋＤ
ａのフラグメントは、成熟タンパク質のタンパク質分解性Ｎ末端部分に対応する
。

【００７９】 種々のヘッジホッグホモログの間の配列変動性に加えて、タンパク質は明らか
に、多くの異なる形態（プロ形態、全長成熟形態、およびいくつかのそれらのプ
ロセスされたフラグメントを含む）で天然に存在する。プロ形態としては、細胞
外ドメインの方向付けられた分泌のためのＮ末端シグナルペプチドを含むが、全
長成熟形態は、このシグナル配列を欠失する。

【００８０】 本発明の方法において有用なファミリーのメンバーは、任意の天然に存在する
ネイティブのヘッジホッグタンパク質（対立遺伝子の系統発生的な対応物または
その他の改変体（天然の供給源で産生されるか、または化学的に産生されるかの
いずれか（ムテインまたは変異タンパク質を含む））を含む）、ならびにヘッジ
ホッグファミリーの組換え形態および新たな活性メンバーが挙げられる。特に有
用なヘッジホッグポリペプチドは、配列番号２１〜２２の全部または一部を含む
部分を有する。

【００８１】 本発明の方法において使用される単離されたヘッジホッグポリペプチドは、生
物学的活性を有する。このポリペプチドは、配列番号２１〜２２のアミノ酸配列
に対して、少なくとも６０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％
相同なアミノ酸配列を含む。このポリペプチドはまた、配列番号２１〜２２のア
ミノ酸配列と本質的に同じであるアミノ酸配列も含み得る。このポリペプチドは
、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、または１５０アミノ酸の長さであ
り、そして配列番号２１〜２２由来の、少なくとも５、好ましくは少なくとも１
０、より好ましくは少なくとも２０、最も好ましくは少なくとも５０、１００、
または１５０の連続したアミノ酸を含む。

【００８２】 １つの実施態様において、単離されたヘッジホッグは、１つ以上の以下の特徴
を有するヘッジホッグポリペプチドである： （ｉ）配列番号２１〜２２のアミノ酸と、少なくとも３０、４０、４２、５０
、６０、７０、８０、９０、または９５％の配列同一性を有する； （ｉｉ）Ｎ末端として、システインまたは機能的等価物を有する； （ｉｉｉ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、アルカリホスファターゼ活性を
誘導し得る； （ｉｖ）配列番号２１〜２２のポリペプチドと、少なくとも５０％、好ましく
は少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、また
は９５％の全体的配列同一性を有する； （ｖ）哺乳動物細胞のような天然の供給源から単離され得る； （ｖｉ）パッチと結合または相互作用し得る；および （ｖｉｉ）アミノ酸残基に付着したポリアルキレングリコールポリマーによっ
てか、または必要に応じて、アミノ酸残基に対するリンカー分子を介して、少な
くとも１つのアミノ酸残基で改変される。

【００８３】 好ましい核酸は、配列番号２１〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列
と、少なくとも６０％相同性であるか同一性である、より好ましくは７０％相同
性であるか同一性である、そして最も好ましくは８０％相同性であるか同一性で
あるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。配列番号２１〜２２のうち
の１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％、より好ましくは少なく
とも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％相同性であるか
同一性であるポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明の範囲内である。

【００８４】 別の実施態様において、ヘッジホッグタンパク質は、ストリンジェントな条件
下で、配列番号１〜９または１９のうちの１つ以上に示されるヘッジホッグコー
ド配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ得るポ
リペプチドである。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する、適切なストリン
ジェンシー条件（例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナト
リウム（ＳＳＣ）、次いで５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄）は、当業者に公知
であり、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９
）、６．３．１−６．３．６に見出され得る。例えば、洗浄工程での塩濃度は、
５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃での約０．２
×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでのうちから選択され得る。さらに、洗浄工
程での温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃で
の高ストリンジェンシー条件まで増加され得る。

【００８５】 好ましい核酸は、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列に
対して、少なくとも６０％相同性、より好ましくは７０％相同性、そして最も好
ましくは８０％相同性であるアミノ酸配列を含むヘッジホッグポリペプチドをコ
ードする。配列番号１０〜１８または２０のうちの１つに示されるアミノ酸配列
と、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ま
しくは約９８〜９９％相同性であるポリペプチドをコードする核酸もまた、本発
明の範囲内である。

【００８６】 ネイティブのヘッジホッグタンパク質に加えて、本発明に好ましいヘッジホッ
グポリペプチドは、配列番号１０〜１８または２０のいずれかによって示される
アミノ酸配列と、少なくとも６０％相同性、より好ましくは７０％相同性、そし
て最も好ましくは８０％相同性である。配列番号１０〜１８または２０からなる
群から選択される配列と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％
、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％相同性であるポリペプチドも
また、本発明の範囲内である。

【００８７】 ヘッジホッグポリペプチドのフラグメントに関して、好ましいヘッジホッグ部
分は、ヘッジホッグポリペプチドの少なくとも５０アミノ酸残基、より好ましく
は少なくとも１００、そしてなおより好ましくは少なくとも１５０を含む。

【００８８】 ヘッジホッグ治療剤において含められ得る、別の好ましいヘッジホッグポリペ
プチドは、約１９ｋＤａの分子量を有する成熟タンパク質のＮ末端フラグメント
である。

【００８９】 好ましいヒトヘッジホッグタンパク質は、配列番号１５の残基２４〜１９７、
配列番号１６の残基２８〜２０２、そして配列番号１７の残基２３〜１９８にほ
ぼ対応するＮ末端フラグメントを含む。「ほぼ対応する」とは、目的の配列は、
参照配列に対して、より好ましくは多くとも５、１０、または１５アミノ酸残基
の長さで異なるが、多くとも２０アミノ酸残基の長さで異なることを意味する。

【００９０】 さらに他の好ましいヘッジホッグポリペプチドは、式Ａ−Ｂによって表される
アミノ酸配列を含み、ここで：（ｉ）Ａは、配列番号２１の残基１〜１６８によ
って示されるアミノ酸配列の全部または一部を表し、；そしてＢは、配列番号２
１の残基１６９〜２２１によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ
のアミノ酸残基を表すか；（ｉｉ）Ａは、配列番号１５の残基２４〜１９３によ
って示されるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１５
の残基１９４〜２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの
アミノ酸残基を表すか；（ｉｉｉ）Ａは、配列番号１３の残基２５〜１９３によ
って示されるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１３
の残基１９４〜２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの
アミノ酸残基を表すか；（ｉｖ）Ａは、配列番号１１の残基２３〜１９３によっ
て示されるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１１の
残基１９４〜２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つのア
ミノ酸残基を表すか；（ｖ）Ａは、配列番号１２の残基２８〜１９７によって示
されるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１２の残基
１９８−２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つのアミノ
酸残基を表すか；（ｖｉ）Ａは、配列番号１６の残基２９〜１９７によって示さ
れるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１６の残基１
９８〜２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸
残基を表すか；あるいは（ｖｉｉ）Ａは、配列番号１７の残基２３〜１９３によ
って示されるアミノ酸配列の全部または一部を表し；そしてＢは、配列番号１７
の残基１９４〜２５０によって示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つの
アミノ酸残基を表す。特定の好ましい実施態様において、ＡおよびＢは共に、連
続したポリペプチド配列として示される配列を表し、Ａは示される配列の少なく
とも２５、５０、７５、１００、１２５、または１５０アミノ酸を表し、そして
Ｂは、配列表の対応するエントリーによって示されるアミノ酸配列の少なくとも
５、１０、または２０アミノ酸残基を表す。そしてＡおよびＢは共に、好ましく
は、配列表エントリーに対応する連続した配列を表す。他のヘッジホッグ由来の
類似のフラグメント（例えば、上記に列挙された配列表エントリーからの好まし
いフラグメントに対応するフラグメント）もまた、意図される。

【００９１】 （Ａ．ヘッジホッグポリペプチドの発現および生成） 本明細書中に記載される、全長ヘッジホッグポリペプチド、ならびにアゴニス
トポリペプチドおよびアンタゴニストポリペプチドの両方が、当該分野において
公知の任意の適切な方法によって作製され得るということは、当業者によって理
解される。そのような方法は、直接のタンパク質合成方法から、上記のヘッジホ
ッグポリペプチド配列を直接的にコードするＤＮＡ配列を構築し、そして適切に
形質転換された宿主中でこれらのヘッジホッグ配列を発現させることにわたる。
あるいは、本発明のヘッジホッグポリペプチドは、全長のヘッジホッグタンパク
質を発現させ、次いで機能的アンタゴニストを形成するように、発現後に適切に
それらを改変させることによって発達され得る。

【００９２】 （１．ヘッジホッグポリペプチドの直接発現） 一般に、ヘッジホッグ配列（アゴニストまたはアンタゴニストであるとしても
ないにしても）を作製するために完全ヘッジホッグアミノ酸配列を使用して、戻
し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅ）された遺伝子を構築し得る。Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、前出を参照のこと。さらに、全長ヘッジホッグをコードするヌクレ
オチド配列を含むＤＮＡオリゴマーが合成され得る。例えば、所望のヘッジホッ
グポリペプチドの一部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが、
合成され得、次いで連結され得る。個々のオリゴヌクレオチドは、代表的に、相
補的アセンブリのために５’突出または３’突出を含む。ヘッジホッグｃＤＮＡ
は、配列番号１〜８および１１のヘッジホッグポリペプチドをコードする標識Ｄ
ＮＡフラグメントを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そし
てオートラジオグラフィーによって陽性クローンを同定することによって獲得さ
れ得る。さらなる回のプラーク精製およびハイブリダイゼーションは従来の方法
を使用することによって実施される。

【００９３】 全長のヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が獲得されると、こ
のＤＮＡは、改変または変異誘発されて（例えば、Ｃ章およびＤ章；Ｚｏｅｌｌ
ｅｒら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、
５６６２−６６、および米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと）、アゴ
ニストポリペプチドまたはアンタゴニストポリペプチドであり得るヘッジホッグ
ポリペプチドを発現させ得る。組換え方法において、ヘッジホッグポリペプチド
の内部フラグメントまたは末端フラグメントは、単離されたヘッジホッグポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列の一端（末端フラグメントについて）または両端
（内部フラグメントについて）由来の、１つ以上のヌクレオチドを除去すること
によって作製され得る。変異誘発されたＤＮＡの発現は、生物学的活性について
試験されるポリペプチドフラグメントを作製する。「末端を削る」エンドヌクレ
アーゼでの消化もまた、フラグメントのアレイをコードするＤＮＡを作製し得る
。タンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡもまた、無作為剪断、制限酵素
消化もしくは組合わせ、またはその両方によって作製され得る。

【００９４】 類似のＤＮＡ配列を構築する別の方法は、オリゴヌクレオチドシンセサイザー
を使用する化学的合成による方法である。そのようなオリゴヌクレオチドは、好
ましくは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、そして好ましくは目
的の組換えポリペプチドが作製される宿主細胞中で好まれるそれらのコドンを選
択することによって設計され得る。

【００９５】 従って、アンタゴニストとして作用する単離されたポリヌクレオチド（例えば
、ＲＮＡまたはＤＮＡ）が、本発明の方法において使用される。従って、ヘッジ
ホッグポリペプチドは、Ｎ末端システインがＮ末端伸長部分に配置されるヘッジ
ホッグポリペプチド配列を含む、ヘッジホッグアンタゴニストまたはヘッジホッ
グアゴニストをコードし得る。従って、このポリペプチドの単離されたＤＮＡ配
列は、１つの例ではあるが、以下を有する組換え融合タンパク質をコードし得る
：（ａ）ヘッジホッグポリペプチド自体に対して５’であり得る第１のＮ末端ポ
リペプチド部分であって、ヘッジホッグ無関係であり得、そしてヘッジホッグの
Ｎ末端システインと置換される少なくとも１つのエレメント（例えば、アミノ酸
残基）を含む、Ｎ末端ポリペプチド部分であり；これは、（ｂ）ヘッジホッグタ
ンパク質またはヘッジホッグタンパク質の部分である第２のポリペプチドに連結
される。本発明の単離されたポリヌクレオチドはまた、成熟ヘッジホッグポリペ
プチド（例えば、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ）のＣｙｓ−１を含み得るＮ末端伸長
部分を含むヘッジホッグポリペプチドをコードし得る。

【００９６】 単離されたＤＮＡ配列は、発現に際して、成熟ヘッジホッグ（例えば、成熟Ｓ
ｏｎｉｃヘッジホッグのような）のＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠
失するヘッジホッグポリペプチドを含む一次アミノ酸配列を含むヘッジホッグポ
リペプチドをコードし得る。例えば、単離されたＤＮＡ配列またはその部分は、
成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応する、Ｎ末端システインから始
まる約１２アミノ酸以下の欠失を有するヘッジホッグポリペプチドをコードし得
る。他のアミノ酸残基へのＮ末端システインの変異を有するアンタゴニストまた
はアゴニストをコードする、本発明で使用される単離されたヘッジホッグポリペ
プチドもまた生成され得る。単離されたＤＮＡ配列はまた、Ｎ末端伸長部分を含
むアンタゴニストまたはアゴニストをコードし得る。

【００９７】 一旦（合成、部位特異的突然変異、または別の方法によって）アセンブルされ
ると、目的の特定のヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現
ベクター中に挿入され、そして所望の宿主中でのタンパク質の発現のために適切
な発現制御配列に作動可能に連結される。適切なアセンブリは、ヌクレオチド配
列決定、制限マッピング、および適切な宿主中での生物学的に活性なポリペプチ
ドの発現によって、確認され得る。当該分野において周知であるように、宿主に
おけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを獲得するために、遺伝
子は、選択された発現宿主において機能的である、転写発現制御配列および翻訳
発現制御配列に作動可能に連結されねばならない。

【００９８】 発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。広汎な種
々の発現宿主／ベクターの組合わせが使用され得る。真核生物宿主について有用
な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノ
ウイルス、およびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙
げられる。細菌宿主について有用な発現ベクターとしては、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ由来のプラスミド（ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれ
らの誘導体を含む）のような公知の細菌性プラスミド、Ｍ１３および糸状一本鎖
ＤＮＡファージのようなより広い宿主範囲のプラスミドが挙げられる。好ましい
Ｅ．ｃｏｌｉベクターとしては、λファージｐＬプロモーターを含有するｐＬベ
クター（米国特許第４，８７４，７０２号）、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを
含有するｐＥＴベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９、１９９０ １）、およびｐＳＰ７２ベクタ
ーが挙げられる。酵母細胞について有用な発現ベクターとしては、例えば、動原
体プラスミドが挙げられる。

【００９９】 さらに、任意の広汎な種々の発現制御配列が、これらのベクターにおいて使用
され得る。そのような有用な発現制御配列は、前述の発現ベクターの構造遺伝子
と関連した発現制御配列を含む。有用な発現制御配列の例としては、例えば、Ｓ
Ｖ４０またはアデノウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｌａ
ｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ファージλの主要なオペレーター領域
およびプロモーター領域（例えば、ｐＬ）、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素のプロモーター、酸ホスフ
ァターゼ（例えば、Ｐｈｏ５）のプロモーター、酵母α接合系のプロモーター、
および原核生物細胞または真核生物細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現
を制御することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組合わせが挙げられ
る。本明細書中に記載される単離されたヘッジホッグポリペプチドを大量に産生
するために、任意の適切な宿主が使用され得、これには細菌、真菌（酵母を含む
）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適切な動物細胞もしくは細胞株、ならび
にトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物が含まれる。より代表
的には、これらの宿主としては、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉ（実施例１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、
Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ、真菌、酵母（（例えば、Ｐｉｃｈｉａ；実施例３）、
昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）、
およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ ＴＭ）、動物細胞（例えば、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）、マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ細胞）、アフリカミドリザル
細胞ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０、およびヒ
ト細胞、ならびに植物細胞のような株が挙げられ得る。

【０１００】 すべてのベクターおよび発現制御配列が、所定の単離されたポリペプチドを発
現するために等しく十分に機能するわけではないということが理解されるべきで
ある。全ての宿主が同じ発現系を用いて、等しく十分に機能することはない。し
かし、当業者は、このようなベクター、発現制御系および宿主の中を、過剰な実
験なくして選択し得る。例えば、大規模の動物培養において目的の単離されたポ
リペプチドを生成するために、発現ベクターのコピー数が制御されなければなら
ない。増幅可能なベクターは、当該分野において周知である。例えば、Ｋａｕｆ
ｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２、１３
０４−１３１９、および米国特許第４，４７０，４６１号および同第５，１２２
，４６４号を参照のこと。発現制御配列へのＤＮＡ配列のそのような作動可能な
連結としては、ＤＮＡ配列上流の正確なリーディングフレーム中の翻訳開始シグ
ナルの提供が挙げられる。発現される特定のＤＮＡ配列がメチオニンで開始しな
い場合、開始シグナルは、この産物のＮ末端に位置付けられたさらなるアミノ酸
（メチオニン）を生じる。このことは、ヘッジホッグポリペプチドが、一旦発現
された場合に、コア構造を維持することを確証する。

【０１０１】 形質転換された宿主によって産生されるタンパク質は、任意の適切な方法に従
って精製され得る。そのような標準的な方法としては、クロマトグラフィー（例
えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、お
よびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差
的可溶性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパ
ク質精製のための任意の他の標準的技術による方法が挙げられる。免疫親和性ク
ロマトグラフィーについて、タンパク質（例えば、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ）は
、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグに対して惹起された抗体、または関連タンパク質を含
むアフィニティーカラムへの結合によって単離され得、そして固定支持体に付着
される。あるいは、親和性タグ（例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ド
メイン、インフルエンザ外被配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ）が、タンパク質に接着されて、適切なアフィニティーカラムを通過させるこ
とによって容易な精製を可能にし得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク
質分解性、質量分析法、核磁気共鳴、およびｘ線結晶学のような技術を使用する
ことによって、物理的に特徴付けられ得る。

【０１０２】 （２．全長ポリペプチドからヘッジホッグポリペプチドフラグメントの生成） ヘッジホッグアンタゴニストまたはヘッジホッグアゴニスト活性を有する単離
されたヘッジホッグタンパク質のフラグメントはまた、当業者に公知の方法を使
用して効率的に生成される。機能的ヘッジホッグポリペプチドは、インタクトな
ヘッジホッグタンパク質から生成され得る。ペプチドは、以下を含むが、これら
に限定されないタンパク質分解酵素によって特異的に切断され得る：プラスミン
、トロンビン、トリプシン、キモトリプシンまたはペプシン。これらの酵素の各
々は、これらが攻撃するペプチド結合の型に特異的である。トリプシンは、ペプ
チド結合の加水分解を触媒し、ここで、カルボニル基は、塩基性アミノ酸（通常
、アルギニンまたはロイシン）由来である。ペプシンおよびキモトリプシンは、
芳香族アミノ酸（例えば、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン）
由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。切断されるタンパク質フラグメント
の交互のセットは、タンパク質分解酵素に感受性である部位での切断を防ぐこと
によって生成される。例えば、穏やかな塩基性溶液中でのリジンのε−アミノ基
のエチルトリフルオロチオアセテートとの反応は、隣接するペプチド結合が、ト
リプシンによる加水分解をもはや受けないブロックされたアミノ酸残基を生じる
。タンパク質は、タンパク質分解酵素に感受性であるペプチド結合を作製するた
めに改変され得る。例えば、システイン残基のα−ハロエチルアミンでのアルキ
ル化は、トリプシンによって加水分解されるペプチド結合を生じる（Ｌｉｎｄｌ
ｅｙ（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ １７８，６４７）。さらに、特異的残基でペプ
チド鎖を切断する化学試薬が使用され得る。例えば、臭化シアンは、メチオニン
残基でペプチドを切断する（ＧｒｏｓｓおよびＷｉｔｋｉｐ（１９６１）Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３，１５１０）。従って、修飾剤、タンパク質酵素お
よび／または化学試薬の種々の組み合わせでタンパク質を処理することによって
、そのタンパク質は、所望の長さのフラグメントに、そのフラグメントの重複を
伴なわず分割され得るか、または所望の長さの重複フラグメントに分割され得る
。

【０１０３】 （３．化学合成方法） ヘッジホッグポリペプチドはまた、当該分野において公知の技術（例えば、Ｍ
ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相Ｆｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学）を使用して化学的に合
成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：４５１（１９６７）。アゴニストお
よびアンタゴニストの生成および試験を可能にする先行技術の方法の例は、以下
に議論される。これらまたは類似の方法は、生物学的活性を有することが示され
得る単離されたポリペプチド（例えば、ヘッジホッグ）のフラグメントおよびア
ナログを、作製およびスクリーニングするために使用され得る。ヘッジホッグポ
リペプチドはまた、ヘッジホッグキメラを生成するための化学的方法および組換
え方法の組み合わせによって作製され得る。

【０１０４】 （Ｂ．他のヘッジホッグポリペプチドＤＮＡおよびペプチド配列の生成） （１．ランダム変異誘発方法） 機能的ヘッジホッグポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、タンパク質または
その特定の部分をコードするＤＮＡのランダム変異誘発によって調製され得る。
変異を誘導するための有用な方法は、ＰＣＲ変異誘発および飽和変異誘発を含む
。このような方法の以下の例は、本発明の範囲を限定することを意図されず、単
に代表的な技術を例示するために役立つだけである。当業者は、他の方法もまた
、この点で有用であることを認識する。

【０１０５】 ＰＣＲ変異誘発：例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １
、１１−１５を参照のこと。

【０１０６】 飽和変異誘発：１つの方法が、Ｍａｙｅｒｓら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２９，２４２に一般に記載される。

【０１０７】 縮重オリゴヌクレオチド変異誘発：例えば、Ｈａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、（１９
８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，３２３、およびＩｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２７３−２８９頁（Ａ．
Ｇ．Ｗａｌｔｏｎ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８１を参
照のこと。

【０１０８】 （２．特異的変異誘発方法） 部位特異的方法は、Ｎ末端システイン（または機能的等価物）が、機能的ヘッ
ジホッグポリペプチドのコア構造を生成するために効率的に除去され得る、別の
方法である。非ランダムまたは特異的変異誘発は、単離されたポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の特異的部分において、特異的な配列または変異
を提供し、その単離されたポリペプチドの既知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿
入または置換を含む改変体を提供する。

【０１０９】 アラニンスキャニング変異誘発：ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，（
１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，１０８１−１０８５）を参照のこと。

【０１１０】 オリゴヌクレオチド媒介変異誘発：例えば、Ａｄｅｌｍａｎら（１９８３）Ｄ
ＮＡ ２，１８３を参照のこと。本発明者らは、Ｎ末端システインの、別のアミ
ノ残基（好ましくは、セリン残基）への変異を有する機能的アンタゴニストをコ
ードする単離されたＤＮＡ配列を操作することによる、オリゴヌクレオチド特異
的変異誘発を使用して機能的ヘッジホッグを作製する。

【０１１１】 カセット変異誘発：Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４，３１５を参照
のこと。

【０１１２】 コンビナトリアル変異誘発：例えば、Ｌａｎｄｎｅｒら、ＷＯ８８／０６６３
０を参照のこと。

【０１１３】 当業者は、本発明のヘッジホッグタンパク質の変異体のセットを生成するため
の方法が存在すること、そしてこれらの方法が、ヘッジホッグタンパク質の生物
学的活性の機能的アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである、潜在的な
改変体配列（例えば、ホモログ）を同定するために特に有用であることを理解す
る。この方法において、当業者は、このようなアンタゴニストおよびアゴニスト
変異体のセットを含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、例
えば、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用し得る、新規なヘ
ッジホッグホモログを生成する。ヘッジホッグホモログは、それらが、例えば、
パッチレセプターへの結合を模倣し得るが、いずれの生物学的応答も誘導せず、
これによって、真のヘッジホッグまたはヘッジホッグアゴニストの作用を阻害す
るという点で、アンタゴニストとして作用するようにこのアプローチによって生
成され得る。ヘッジホッグホモログはまた、それらが、正常のヘッジホッグと少
なくとも同じ（より大きくはなくとも）結合親和性で、ヘッジホッグレセプター
に結合し得るという点で、アゴニストとして作用するようにこのアプローチによ
って生成され得る。

【０１１４】 例示のために、ヘッジホッグホモログまたは他の関連タンパク質の集団につい
てのアミノ酸配列を整列して、好ましくは、最も高い相同性を可能にするよう促
進する。改変体のこのような集団は、例えば、１以上の種由来のヘッジホッグホ
モログを含み得る。この整列された配列の各々の位置で見られるアミノ酸は、コ
ンビナトリアル配列の縮重セットを作製するために選択される。好ましい実施態
様において、ヘッジホッグ改変体の改変ライブラリーは、その核酸レベルでのコ
ンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして改変遺伝子ライブラリーによ
ってコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子配列内
に酵素的に連結され得、この結果、潜在的なヘッジホッグ配列の縮重セットが、
個々のポリペプチドとして発現可能であるか、あるいは、本明細書のヘッジホッ
グ配列のセットを含む、より大きい融合タンパク質（例えば、ファージディスプ
レイのための）のセットとして発現可能である。

【０１１５】 ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６に例示されるように、改変体の集団の配列を
分析するために、目的のアミノ酸配列は、配列相同性に対して配列され得る。特
定の改変体の整列された配列由来のアミノ酸の存在または非存在は、参照配列（
これは、本物または人工物であり得る）の選択されたコンセンサスの長さに関連
する。

【０１１６】 例示的な実施態様において、各々のＳｈｈクローンのエキソン１コード配列、
エキソン２コード配列、およびエキソン３コード配列の一部（例えば、成熟タン
パク質のＮ末端約２２１残基）の整列化は、以下の一般式によって表されるＳｈ
ｈポリペプチドの縮重セットを生成する：

【０１１７】

【化１】

【０１１８】 ここで、各々の縮重位置「Ｘ」は、ヒト、マウス、ニワトリまたはゼブラフィ
ッシュのＳｈｈクローンの１つのこの位置で生じるアミノ酸であり得るか、また
はライブラリーを拡大するために、各々のＸはまた、これらの位置の各々で天然
に生じるアミノ酸に対する保存的置換であるアミノ酸残基の間から選択され得る
。例えば、Ｘａａ（１）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ
、ＴｙｒまたはＴｒｐを表し；Ｘａａ（２）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを
表し；Ｘａａ（３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒまた
はＴｈｒを表し；Ｘａａ（４）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ（５）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ
またはＧｌｎを表し；Ｘａａ（６）は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し；Ｘ
ａａ（７）は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅを表し；Ｘａａ（
８）は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し；Ｘａａ（９）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ
、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１０）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ
ｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１１）は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ
、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し；Ｘａａ（１２）は、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔ
ｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＣｙｓを表し；Ｘａａ（１３）は、Ｇｌｎ
、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐを表し；Ｘａａ（１４）は、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、
Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐを表し；Ｘａａ（１５）
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ＭｅｔまたはＣｙｓを表し
；Ｘａａ（１６）は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔを
表し；Ｘａａ（１７）は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓを表し、；Ｘａａ（１８）は、Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ、ＭｅｔまたはＩｌｅを表し；Ｘａａ（１９）は、Ａｌａ、Ｇｌｙ
、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＭｅｔを表
し；Ｘａａ（２０）は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕまた
はＧｌｎを表し；Ｘａａ（２１）は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ
、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎを表し；Ｘａａ（２２）は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍ
ｅｔまたはＩｌｅを表し；Ｘａａ（２３）は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ
またはＴｒｐを表し；Ｘａａ（２４）は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＭｅｔ
を表し；Ｘａａ（２５）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ
またはＳｅｒを表し；Ｘａａ（２６）は、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒまた
はＳｅｒを表す。さらにより拡大したライブラリーにおいて、各々のＸが、任意
のアミノ酸から選択され得る。

【０１１９】 同様の様式で、ヒト、マウス、ニワトリまたはゼブラフィッシュのヘッジホッ
グクローンの各々の整列化は、以下の一般式によって表される縮重ポリペプチド
配列を提供し得る：

【０１２０】

【化２】

【０１２１】 ここで、上記の、各々の縮重位置「Ｘ」は、野生株クローンの１つにおいて対応
する位置で生じるアミノ酸であり得、そして保存的置換であるアミノ酸残基をも
また含み得るか、または各々のＸはまた、任意のアミノ酸残基であり得る。例示
的な実施態様において、Ｘａａ（１）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ
ｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒを表し；Ｘａａ（２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ
、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅを表し；Ｘａａ（３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇを表し；Ｘａａ（４）は、Ｌ
ｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し；Ｘａａ（５）は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒま
たはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（６）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅまたはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（７）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ
、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ（９）は、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１０）は、
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒを表し；Ｘａａ
（１１）は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎを表し；Ｘａａ（１２）は、
Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒまたはＴｈ
ｒを表し；Ｘａａ（１３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅまたは
Ｐｒｏを表し；Ｘａａ（１４）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ
（１５）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（１６）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒを表し；Ｘａａ（１７）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓまた
はＬｙｓを表し；Ｘａａ（１８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
、Ｓｅｒ、またはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１９）は、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し
；Ｘａａ（２０）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎまたは
Ｇｌｎを表し；Ｘａａ（２１）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ
（２２）は、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し；Ｘａａ（２３）は、ＳｅｒまたはＴｈ
ｒを表し；Ｘａａ（２４）は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＡｓｎを表し；Ｘ
ａａ（２５）は、ＧｌｕまたはＡｓｐを表し；Ｘａａ（２６）は、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（２７）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕま
たはＩｌｅを表し；Ｘａａ（２８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し；Ｘａａ（２９）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、
Ａｓｎ、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓを表し；Ｘａａ（３０）は、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３１）は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、
ＨｉｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し；Ｘａａ（３３）は、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＧｌｎを表し；Ｘａａ（３４）は、Ａｓｐまたは
Ｇｌｕを表し；Ｘａａ（３５）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌ
ｅを表し；Ｘａａ（３６）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３
７）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し；Ｘａａ（３８）は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＣｙｓを
表し；Ｘａａ（３９）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒま
たはＳｅｒを表し；Ｘａａ（４０）は、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓを表し；Ｘ
ａａ（４１）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌ
ｅを表し；Ｘａａ（４２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅを
表し；Ｘａａ（４３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、
ＴｈｒまたはＣｙｓを表し；Ｘａａ（４４）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＳｅｒを表し；およびＸａａ（４５）は、Ａｓｐまた
はＧｌｕを表す。

【０１２２】 潜在的ヘッジホッグホモログのライブラリーが縮重オリゴヌクレオチド配列か
ら生成され得る、多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動Ｄ
ＮＡ合成器において行われ得、次いで合成遺伝子は、適切な発現ベクター内に連
結され得る。遺伝子の縮重セットの目的は、潜在的ヘッジホッグ配列の所望のセ
ットをコードする配列の全てを、１つの混合物で提供することである。縮重オリ
ゴヌクレオチドの合成は、当業者に周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（
１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓ
ｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２７３−２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８
４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１
９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。このような技術は、他
のタンパク質の指向された進化において使用されてきた（例えば、Ｓｃｏｔｔら
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１
９９２）ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ
８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第
５，１９８，３４６号ならびに同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。

【０１２３】 点変異によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスク
リーニングのための、および特定の特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングのための広い範囲の技術が当該分野で公知である
。このような技術は、ヘッジホッグホモログのコンビナトリアル変異誘発によっ
て生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに、一般的に適用可能
である。大きな遺伝子ライブラリーについて、最も広く使用される技術は、一般
的には、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローンニングする
工程、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換する工程、および
所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較
的容易な単離を促進する条件下で、そのコンビナトリアル遺伝子を発現する工程
を包含する。以下に記載の例示的アッセイの各々は、コンビナトリアル変異誘発
技術によって作製された多数の縮重ヘッジホッグ配列をスクリーニングするため
に必要であるような、高処理能分析に適用され得る。

【０１２４】 この方法の１つの局面において、ヘッジホッグポリペプチドの集団についての
アミノ酸配列は、好ましくは、できるだけ最も高い相同性を可能に、促進するよ
うに整列される。改変体のこのような集団は、例えば、１以上の種由来のヘッジ
ホッグアンタゴニスト、またはヘッジホッグアゴニストを含み得る。この整列さ
れたヘッジホッグポリペプチド配列の各々の位置で見られるアミノ酸は、コンビ
ナトリアル配列の縮重セットを作製するために選択される。上記の潜在的ヘッジ
ホッグホモログのライブラリーが生成され得る、多くの方法が存在する。生成さ
れた変異体遺伝子産物のスクリーニングのための種々の技術が、当該分野で公知
である。

【０１２５】 大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、しばしば、複
製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローンニングする工程、生じ
たベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換する工程、および所望の活性
（例えば、この場合、アゴニストまたはアンタゴニスト活性、または下流の細胞
内タンパク質に対する活性）の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードす
るベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、その遺伝子を発現する工程
を包含する。このような方法は、ヘッジホッグレセプターが「ベイト（餌）」タ
ンパク質として使用され、そしてヘッジホッグアンタゴニストの改変体のライブ
ラリーが、「フィッシュ（魚）」タンパク質として発現されるツーハイブリッド
システム、および候補アンタゴニストが、細胞またはウイルス粒子の表面上で提
示され、そして特定の細胞またはウイルス粒子の、提示された産物を介して適切
なレセプタータンパク質に結合する能力が、「パニングアッセイ」で検出される
種々のディスプレイライブラリーを含む。例えば、ＬａｄｎｅｒらＷＯ８８／０
６６３０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ
ら、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９
３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）ＰＮＡＳ
８９：４４５７−４４６１、Ｃｈａｒｂｉｔら（１９８６）ＥＭＢＯ ５、３０
２９−３０３７、Ｓｃｈｏｒｒら（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９１、３８７
−３９２頁、Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８８、３７−４５、
Ｔｈｉｒｙら（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５
５，９８４−９９３；Ｋｕｗａｊｉｍａら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６、
１０８０−１０８３；Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７４、４２３９−４２４５、およびＫｌａｕｓｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ
Ｊ ９、１９９１−１９９９；Ｃｕｌｌら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９
：１８６５−１８６９を参照のこと。

【０１２６】 （Ｃ．単離されたヘッジホッグポリペプチドの他の改変体） 以下の単離された分子の使用は、本発明の方法に含まれる：対立遺伝子改変体
、天然の変異体、誘導された変異体、本発明の機能的ポリペプチドのようなヘッ
ジホッグ関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高いまたは低いス
トリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるタンパク質。
本明細書中に記載の全ての改変体は、アンタゴニストの生物学的機能または完全
なアゴニストの生物学的機能を保持することが予想される。好ましいアナログは
、生物学的に活性なヘッジホッグポリペプチドフラグメントを含み、この配列は
、１以上の保存的アミノ酸置換によって、または１以上の非保存的アミノ酸置換
によって、または単離されたタンパク質の生物学的活性を消失しない欠失または
挿入によって、本明細書中の公知のヘッジホッグ配列と異なる。保存的置換は、
代表的に、以下の群内での置換のような、１つのアミノ酸を類似の特徴を有する
別のアミノ酸との置換を含む：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシンおよ
びイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグル
タミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニル
アラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよび
メチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、ト
レオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる
。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチ
ジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸お
よびグルタミン酸が挙げられる。他の保存的置換は、当業者に容易に公知であり
得る。例えば、アミノ酸、アラニンについて、保存的置換は、Ｄ−アラニン、グ
リシン、β−アラニン、Ｌ−システインおよびＤ−システインのいずれか１つか
ら選択され得る。リジンについて、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アル
ギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、または
Ｄ−オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離されたポリペプチドの
機能特性において変化を誘導することが予期され得る置換は、以下の置換である
：（ｉ）極性残基（例えば、セリンまたはトレオニン）が、疎水性残基（例えば
、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニン）の代わりに（ま
たは、疎水性残基によって）置換される；（ｉｉ）システイン残基（すなわち、
Ｎ末端システイン、および必要に応じて、１以上の他の内部システイン）が、任
意の他の残基の代わりに（または、任意の他の残基によって）置換される；（ｉ
ｉｉ）陽性側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）
が、陰性側鎖を有する残基（例えば、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）の
代わりに（または、陰性側鎖によって）置換される；あるいは、（ｉｖ）大きな
側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、このような側鎖を有さない
残基（例えば、グリシン）の代わりに（または、このような側鎖を有さない残基
よって）置換される。

【０１２７】 （Ｄ．ペプチド模倣物） 本発明はまた、模倣物（例えば、ペプチドまたは非ペプチドのヘッジホッグ因
子）の使用を提供する。ペプチド模倣物は、ヘッジホッグタンパク質の生物学的
活性を、例えば、天然に生じるリガンド（例えば、レセプター）に対するヘッジ
ホッグの結合を破壊することによって、または正常なヘッジホッグより大きい親
和性を有するレセプターへ結合することによって、アゴナイズまたはアンタゴナ
イズのいずれかが可能である。レセプターポリペプチドの分子認識に関連するか
、またはヘッジホッグ依存性シグナル伝達を促進する能力がないことに関連する
、本発明のポリペプチド重要な残基は、ペプチド模倣物を生成するために決定さ
れ得、そして使用され得る（例えば、「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎ
ｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｅｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ」
欧州特許出願ＥＰ−４１２，７６２ＡおよびＥＰ−Ｂ３１，０８０Ａを参照のこ
と）。例えば、スキャニング変異誘発は、ヘッジホッグ依存性シグナル伝達を促
進するその能力またはその能力がないことに関連する、特定のポリペプチドのア
ミノ酸残基をマッピングするために使用され得、これらの残基を模倣し、かつ従
って、ヘッジホッグの機能を阻害し得る、ペプチド模倣化合物（例えば、ジアゼ
ピンまたはイソキノリン誘導体）が、生成され得る。

【０１２８】 重要な残基の非加水分解性ペプチドアナログは、ベンゾジアゼピン（例えば、
Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら Ｐｅｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：
Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ，１９８８を参照のこと）、アゼピン（例
えば、Ｈｕｆｆｍａｎら Ｐｅｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：
Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照のこと）、置換γラク
タム環（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｅｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：
Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、ケトメチレン偽ペプチド
（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；および
Ｅｗｅｎｓｏｎら Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇ
ａｉら（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；および
Ｓａｔｏら（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １
：１２３１）、およびβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら（１９８５）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６：４１９；および
Ｄａｎｎら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕ
ｎ １３４：７１）を使用して生成され得る。

【０１２９】 （Ｅ．抗体ホモログからのヘッジホッグポリペプチドの生成） モノクローナル抗体ホモログを生成するための技術は周知である。手短には、
不死細胞株（代表的には、ミエローマ細胞）は、所定の抗原（例えば、ヘッジホ
ッグ）を発現する細胞全体で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（代表的には、脾
細胞）に融合され、そして得られるハイブリドーマ細胞の培養上清は、この抗原
に対する抗体についてスクリーニングされる。一般的に、Ｋｏｈｌｅｒら，１９
７５，Ｎａｔｕｒｅ ２６５：２９５−４９７、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」を参照のこ
と。

【０１３０】 免疫は、標準的な手順を用いて達成され得る。単位用量および免疫レジメは、
免疫される哺乳動物の種、その免疫状態、その哺乳動物の体重などに依存する。
代表的に、その免疫された哺乳動物は採血され、そして各血液サンプル由来の血
清が、適切なスクリーニングアッセイを用いて特定の抗体についてアッセイされ
る。例えば、抗ヘッジホッグ抗体は、ヘッジホッグ発現細胞由来の１２５Ｉ標識
細胞溶解産物の免疫沈降によって同定され得る。抗ヘッジホッグ抗体はまた、フ
ローサイトメトリーによって、例えば、ヘッジホッグを認識すると考えられる抗
体とともにインキュベートした抗体発現細胞の蛍光染色を測定することによって
同定され得る。ハイブリドーマ細胞の生成において用いられるリンパ球は代表的
に、その血清が、このようなスクリーニングアッセイを用いて抗ヘッジホッグ抗
体の存在について既にポジティブであると試験された、免疫した哺乳動物から単
離される。

【０１３１】 代表的に、不死細胞株（例えば、ミエローマ細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳
動物種から誘導される。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン（ａｒｎｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）およびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地
」）に感受性であるマウスミエローマ細胞株である。代表的に、ＨＡＴ感受性マ
ウスミエローマ細胞は、分子量１５００のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ
１５００」）を用いてマウス脾細胞に融合される。次いで、融合から得られるハ
イブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地を用いて選択され、ＨＡＴ培地によって、融合
していないミエローマ細胞および生産性に融合されていないミエローマ細胞が殺
傷される（融合していない脾細胞は、それらが形質転換されていないので、数日
後に死ぬ）。所望の抗体を生成するハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養上清
をスクリーニングすることにより検出される。例えば、抗ヘッジホッグ抗体を生
成するように調製されたハイブリドーマは、組換えヘッジホッグ発現細胞株に結
合する能力を有する分泌抗体についてハイブリドーマ培養上清を試験することに
よってスクリーニングされ得る。

【０１３２】 インタクトな免疫グロブリンである抗ヘッジホッグ抗体ホモログを生成するた
めに、このようなスクリーニングアッセイにおいてポジティブであると試験され
たハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を培養培地
中に分泌するのを可能にするのに十分な条件下および時間で栄養培地において培
養した。ハイブリドーマ細胞に適切な組織培養技術および培養培地は、周知であ
る。馴化ハイブリドーマ培養上清は、収集され得、そして抗ヘッジホッグ抗体は
必要に応じて、周知の方法により、さらに精製され得る。

【０１３３】 あるいは、所望の抗体は、免疫していないマウスの腹膜腔内にハイブリドーマ
細胞を注射することにより生成され得る。このハイブリドーマ細胞は、腹膜腔内
で増殖し、腹水として蓄積する抗体を分泌する。この抗体は、腹水をシリンジを
用いて腹膜腔から回収することにより収集され得る。

【０１３４】 いくつかのマウス抗ヘッジホッグモノクローナル抗体が、先行技術において記
載されている。

【０１３５】 ヘッジホッグまたはパッチに対する完全にヒトのモノクローナル抗体ホモログ
は、本発明の方法において、ヘッジホッグ抗原またはパッチ抗原をブロックまた
は被覆し得る別の好ましい結合因子である。そのインタクトな形態では、これら
は、Ｂｏｅｒｎｅｒら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５，
「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ」によって記載されると
おりにインビトロでプライムされたヒト脾細胞を用いて調製され得る。

【０１３６】 あるいは、これらは、Ｐｅｒｓｓｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４３２−２４３６，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ」ならびにＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：２２７−２３６，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒ
ｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍ
ａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ
ｏｕｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」に記載される通りにレパ
ートリークローニングによって調製され得る。米国特許第５，７９８，２３０号
（１９９８年８月２５日、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」）は、ヒトＢ細胞由来のヒトモノクローナル抗体
の調製物を記載する。このプロセスに従って、ヒト抗体産生性Ｂ細胞は、エプス
タイン−バーウイルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン−バーウ
イルスまたはその誘導体を用いる感染によって不死化される。不死化に必要とさ
れるＥＢＮＡ２の機能は、続いてブロックされ、これは、抗体生成の増加をもた
らす。

【０１３７】 完全にヒト抗体を生成するためのなお別の方法では、米国特許第５，７８９，
６５０号（１９９８年８月４日、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ
ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）は、異種抗体を生成し得るトランスジェニック非ヒト
動物、および不活化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニ
ック非ヒト動物を記載する。内因性免疫グロブリン遺伝子は、アンチセンスポリ
ヌクレオチドによって、および／または内因性免疫グロブリンに対する抗血清に
よって抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の種のゲノムにおいて通常見出され
ない免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。再配列されていない異種ヒト
免疫グロブリン重鎖の配列を含む１以上の導入遺伝子は、非ヒト動物中に導入さ
れ、それによって、トランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列し
得、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプ
の抗体のレパートリーを生成し得るトランスジェニック動物を形成する。このよ
うな異種ヒト抗体は、Ｂ細胞において生成され、このＢ細胞はその後、例えば、
不死化細胞株（例えば、ミエローマ）と融合することにより、またはこのような
Ｂ細胞を、モノクローナルの異種の完全にヒト抗体ホモログを生成し得る細胞株
を永続させる他の技術によって操作することにより不死化される。

【０１３８】 本発明の方法におけるヘッジホッグ抗原またはパッチ抗原をブロックまたは被
覆し得るなお別の好ましい結合因子は、ヘッジホッグタンパク質またはパッチタ
ンパク質への結合能力を有する、ヒト化組換え抗体ホモログである。キメラ抗体
の調製についての初期の方法に従って、新たなアプローチは、ＥＰ ０２３９４
００（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された。これによって、抗体は、ある種について
の相補性決定領域（ＣＤＲ）の、別の種の相補性決定領域による置換によって変
更される。このプロセスは、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖のＩｇ可変領域ドメ
イン由来のＣＤＲを、マウス可変領域ドメイン由来の代替のＣＤＲを用いて置換
するために用いられ得る。これらの変更されたＩｇ可変領域は、続いて、ヒトＩ
ｇ定常領域と組み合わされ得、置換されたマウスＣＤＲ以外の組成において全体
としてヒトである抗体が作製され得る。このようなＣＤＲ置換抗体は、ヒトにお
いて、キメラ抗体と比較して、免疫応答をあまり誘発しないようであると予測さ
れる。なぜなら、ＣＤＲが置換された抗体は、かなり少ない非ヒト成分を含むか
らである。モノクローナル抗体をＣＤＲ「移植」によってヒト化するプロセスは
、「再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」と名付けられている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７，「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ
ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｖｅｒｈｏ
ｅｙｅｎら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６，「Ｒｅ
ｓｈａｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＤ
Ｒ−ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」
）。

【０１３９】 代表的に、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体における対応
する領域に移植される。なぜなら、特異的抗原に結合するマウス抗体の領域であ
るのは、ＣＤＲ（抗体重鎖において３つ、軽鎖において３つ）であるからである
。ＣＤＲの移植は、遺伝子操作によって達成され、それによってＣＤＲ ＤＮＡ
配列が、マウスの重鎖および軽鎖の可変（Ｖ）領域の遺伝子セグメントのクロー
ニングによって決定され、次いで部位特異的変異誘発によって対応するヒトＶ領
域に移入される。このプロセスの最終段階では、所望のアイソタイプのヒト定常
領域の遺伝子セグメント（通常、ＣＨについてγＩ、そしてＣＬについてκ）を
付加し、そしてヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を、哺乳動物細胞において同時発現
して可溶性ヒト化抗体を生成する。

【０１４０】 ヒト抗体へのこれらのＣＤＲの移入は、この抗体に、もとのマウス抗体の抗原
結合特性を付与する。マウス抗体における６個のＣＤＲは、Ｖ領域「フレームワ
ーク」領域に構造的に載せられた。ＣＤＲ移植が好首尾である理由は、マウス抗
体とヒト抗体との間のフレームワーク領域は、類似のＣＤＲ付着点を有する非常
に類似の３次元構造を有し得ることであり、その結果、ＣＤＲが交換され得る。
このようなヒト化抗体ホモログは、Ｊｏｎｅｓら，１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３
２１：５２２−５２５，「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ
ａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ」；Ｒ
ｉｅｃｈｍａｎｎ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７，「Ｒｅ
ｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ
」；Ｑｕｅｅｎら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：１００２９，「Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ
ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」
およびＯｒｌａｎｄｉら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：３８３３ 「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔ
ｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ」に例示されると
おりに調製され得る。

【０１４１】 それにもかかわらず、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸は、ＣＤＲと相
互作用し、そして全体的な抗原結合親和性に影響を与えると考えられる。ヒトＶ
領域のフレームワークに何の改変も有さない組換えヒト化抗体を生成するための
マウス抗体由来のＣＤＲの直接移入はしばしば、結合親和性の部分的または完全
な喪失をもたらす。多数の場合、結合活性を得るために、アクセプター抗体のフ
レームワーク領域における残基を改変することが重要であるようである。（Ｑｕ
ｅｅｎら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１
００２９−１００３３，「Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａ
ｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ」）およびＷＯ ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ
ｓ Ｉｎｃ．）は、マウスｍＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲをヒト免疫グロブリンフ
レームワーク領域および定常領域と結合させることにより、アクセプター抗体の
フレームワーク領域において改変された残基を含むヒト化抗体の調製を記載した
。彼らは、ヒトＶ領域フレームワーク残基の改変を全く伴わない直接ＣＤＲ移入
からしばしば生じる結合親和性の喪失の問題に対する１つの解決策を実証した；
彼らの解決策は、２つの重要な工程を含む。第１に、ヒトＶフレームワーク領域
は、元のマウス抗体（この場合、抗Ｔａｃ ＭＡｂ）のＶ領域フレームワークに
対する最適なタンパク質配列相同性についてのコンピューター解析によって選択
される。第２工程では、マウスＶ領域の三次構造が、マウスＣＤＲと相互作用す
るようであるフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにコンピューターに
よってモデル化され、次いでこれらのマウスアミノ酸残基は、相同なヒトフレー
ムワークに重ねられる。推定のマウス接触残基とともに相同なヒトフレームワー
クを用いる彼らのアプローチは、インターロイキン２レセプターに特異的な抗体
に関して（Ｑｕｅｅｎら，１９８９［前出］）、およびまた単純ヘルペスウイル
ス（ＨＳＶ）に特異的な抗体に関して（Ｃｏ．ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９−２８７３，「Ｈｕｍａｎｉｓｅ
ｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ」、
元のマウス抗体と類似の結合親和性を有するヒト化抗体をもたらした。

【０１４２】 ＷＯ ９０／０７８６１における上記の２工程アプローチによって、Ｑｕｅｅ
ｎらは、ヒト化免疫グロブリンの設計についてのいくつかの基準を概説した。第
１の基準は、ヒト化されるべき非ヒトドナー免疫グロブリンに通常相同である特
定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークをヒトアクセプターとして用いる
こと、または多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを用いることで
ある。第２の基準は、フレームワークの特異的残基についてヒトアクセプター残
基が普通ではなく、そしてドナー残基がヒト配列に典型的である場合、アクセプ
ターではなくドナーアミノ酸を用いることである。第３の基準は、ＣＤＲにすぐ
隣接する位置ではアクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を用
いることである。

【０１４３】 異なるアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９：２６６−２７１，「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉ
ｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｖｉｖｏ」）を用い得、そしてマウス残基の基の導入を伴わないＣＤＲ移植につ
いて、それぞれ、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖由来のＶ領域フレーム
ワークを標準として利用し得る。ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構
築するためにＴｅｍｐｅｓｔら，１９９１のアプローチを用いる利点は、ＮＥＷ
Ｍ可変領域およびＲＥＩ可変領域の３次元構造が、Ｘ線結晶学から公知であり、
従って、ＣＤＲ領域のフレームワーク残基とＶ領域のフレームワーク残基との間
の特異的相互作用がモデリングされ得ることである。

【０１４４】 採用するアプローチによらず、今日までに調製された初期のヒト化抗体ホモロ
グの例は、これが、まっすぐなプロセスでないことを示した。しかし、このよう
なフレームワークの変化が必要であり得るという知識があっても、存在する場合
、所望の特異性の機能的なヒト化組換え抗体を得るためにどのフレームワーク残
基を改変することが必要であるかを、利用可能な先行技術に基づいて予測するこ
とは可能ではない。これまでのところ、結果は、特異性および／または親和性を
保存するために必要な変更は、大部分が所定の抗体について独特であり、そして
異なる抗体のヒト化に基づいて予測できないことを示す。本発明において有用な
好ましいヘッジホッグポリペプチドとしては、ヘッジホッグ特異性またはパッチ
特異性を有する、キメラ組換え抗体ホモログおよびヒト化組換え抗体ホモログ（
すなわち、インタクトな免疫グロブリンおよびその部分）が挙げられる。

【０１４５】 （Ｆ．機能性についての試験） ヘッジホッグ活性を実証するために多くのバイオアッセイが用いられているが
、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は、初代細胞培養または器官移植を用いて研究しな
ければならないという困難化を伴わずにヘッジホッグ機能を評価するための単純
な系を提供する。マウス胚線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、規定された条件
下で、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨の骨芽細胞へと分化し得る間葉幹細胞株で
ある（Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｍ．およびＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｅｌｌ １７：
７７１−７７９（１９７９）、ならびにＷａｎｇ，Ｅ．Ａ．ら，Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ ９：５７−７１（１９９３））。骨形態形成タンパク質は、Ｃ
３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の分化を、骨細胞系列へと導く。そして、アルカリホスフ
ァターゼ誘導が、このプロセスについてのマーカーとして用いられている（Ｗａ
ｎｇら，前出）。Ｓｈｈは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対して類似の効果を有し
（Ｋｉｎｔｏ，Ｎ．ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４０４：３１９−３２３（１９
９７））、そして本発明者らは、そのインビトロでの潜在能力の定量的尺度とし
てＳｈｈによるアルカリホスファターゼ誘導を慣用的に用いる。Ｓｈｈ処理はま
た、ｇｌｉ−１発現およびｐｔｃ−１発現における用量依存性増加を生じ、これ
らの発現は、ＰＣＲに基づく分析によって容易に検出され得る。

【０１４６】 （ＩＶ．機能的アンタゴニスト） 本発明の機能的アンタゴニストは、単離されたヘッジホッグタンパク質から入
手可能である。従って、Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ、またはＤｅｓｅｒｔは、米
国特許出願第６０／１０６，７０３号に開示され、そして以下に手短に記載され
るように機能的アンタゴニストへと変換され得る。他の機能的アンタゴニストは
、米国特許出願第６０／０７８，９３５号に開示されるような抗ヘッジホッグ抗
体または抗パッチ−１抗体である。

【０１４７】 本発明の方法において用いるために最も好ましいポリペプチドの１つは、天然
に存在するかまたは組換えのヘッジホッグタンパク質（例えば、上記のＳｏｎｉ
ｃ、Ｉｎｄｉａｎ、またはＤｅｓｅｒｔヘッジホッグタンパク質から入手可能な
脊椎動物ファミリーのメンバーのような単離されたヘッジホッグ）の生物学的活
性のアンタゴニストである。機能的アンタゴニストは、少なくとも以下の特性を
有する：（ｉ）単離されたタンパク質は、パッチ−１に対する成熟ヘッジホッグ
タンパク質の結合よりも弱くあり得る（しかし、好ましくは少なくとも同じであ
る）親和性でレセプターパッチ−１に結合する；そして（ｉｉ）この単離された
タンパク質は、インビトロでＣＨ３１０Ｔ１／２細胞に基づくＡＰ誘導アッセイ
において試験される場合に、成熟ヘッジホッグタンパク質によるアルカリホスフ
ァターゼ（ＡＰ）誘導をブロックする。本発明のアンタゴニストはまた、（ｉｉ
ｉ）ｐｔｃ−１発現およびｇｌｉ−１発現を誘導できないというさらなる特性を
有し得る。

【０１４８】 当業者は、これらの特性に関して任意の推定ヘッジホッグアンタゴニストを容
易に試験し得る。詳細には、マウス胚線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、ヘッ
ジホッグ応答性である間葉幹細胞株である。この細胞のヘッジホッグ処理は、ｇ
ｌｉ−１およびパッチ−１（ヘッジホッグ依存性シグナル伝達の公知のインジケ
ーター）の上方調節を生じ、そしてまた、細胞が軟骨細胞／骨の骨芽細胞系列に
分化したことのインジケーターであるアルカリホスファターゼ活性の誘導を生じ
る。いくつかのヘッジホッグ改変体は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対してヘッジ
ホッグ依存性応答を誘発できないが、これらは成熟ヘッジホッグと機能について
競合し、それゆえ、機能的アンタゴニストとして役立つ。

【０１４９】 （Ａ．アンタゴニストとしてのＮ修飾ヘッジホッグポリペプチド） Ｎ末端修飾を含む特定のヘッジホッグ改変体は、ヘッジホッグ機能をブロック
し得る。なぜなら、これらは、ヘッジホッグ依存性応答を誘発する能力を欠くが
、ヘッジホッグレセプターであるパッチ−１に結合する能力を保持するからであ
る。ヘッジホッグポリペプチド（すなわち、Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ、または
Ｄｅｓｅｒｔヘッジホッグ）が機能的なヘッジホッグアンタゴニストであるか否
かを規定する重要な一次アミノ酸配列は、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応
するＮ末端システイン残基である。ヘッジホッグポリペプチドがこのＮ末端シス
テインを完全に欠くか、または修飾形態でこのＮ末端システインを含む（例えば
、化学的に改変されるかまたはＮ末端伸長部分の一部として含まれる）かのいず
れかである限り、得られるポリペプチドは、機能的ヘッジホッグアンタゴニスト
として作用し得る。このことについて、Ｎ末端システインが「Ｃｙｓ−１に対応
する」という事実は、以下のことを意味する：（ａ）このＮ末端システインは、
成熟したＳｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ、またはＤｅｓｅｒｔヘッジホッグのＣｙｓ
−１である；または（ｂ）このＮ末端システインは、成熟したＳｏｎｉｃ、Ｉｎ
ｄｉａｎ、またはＤｅｓｅｒｔヘッジホッグのＣｙｓ−１と同じ位置を占める。
ただし、例えば、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグが、変更されているかまたは本明細書
中に記載されるように他の点で修飾されているＣｙｓ−１に対応するＮ末端シス
テインを有する場合、このＳｏｎｉｃヘッジホッグは、ヘッジホッグファミリー
の任意の他のメンバーの作用に拮抗し得る。それゆえ、当業者は、Ｉｎｄｉａｎ
ヘッジホッグタンパク質については、Ｓｏｎｉｃ、Ｄｅｓｅｒｔ、またはＩｎｄ
ｉａｎヘッジホッグの活性を拮抗することが可能であることを理解する。

【０１５０】 Ｎ末端修飾を有するこれらのアンタゴニストの例は以下に含まれ、そして当業
者は、例えば、フラグメントまたはアナログを生成することによってアンタゴニ
ストの開示された構造を変更し得、そして新たに生成された構造をアンタゴニス
ト活性について試験し得る。これらの例は、如何なるようにも任意の関連ヘッジ
ホッグアンタゴニストの構造を限定せず、さらなる説明のために提供されるだけ
である。これらの方法または類似の方法は、アンタゴニストポリペプチドのフラ
グメントおよびアナログを作製およびスクリーニングするために用いられ得る。
アンタゴニストとして機能し得るいくつかの改変体が存在する。

【０１５１】 （１．Ｎ末端伸長） 本発明のアンタゴニストポリペプチドは、Ｎ末端システインが、Ｎ末端伸長部
分に連結されているヘッジホッグポリペプチド配列を含み得る。それゆえ、単離
されたアンタゴニストポリペプチドは、以下を有する組換え融合タンパク質であ
り得るが、これは一例である：（ａ）ヘッジホッグポリペプチド自体に対して５
’側に存在し得、かつヘッジホッグに無関係であり得る少なくとも１つのエレメ
ント（例えば、アミノ酸残基）を含む、第１のＮ末端ポリペプチド部分であって
、この第１のＮ末端ポリペプチド部分は、（ｂ）本発明のヘッジホッグアンタゴ
ニストの一部であるかまたはヘッジホッグアンタゴニストの一部であるＳｏｎｉ
ｃ ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインに連結されている。
このＮ末端伸長部分（例えば、第１のＮ末端ポリペプチド部分）は、ヒスチジン
タグ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、Ｄ
ＮＡ結合ドメイン、またはポリメラーゼ活性化ドメインであり得る。機能的アン
タゴニストは、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１または成熟Ｓｏｎｉｃヘッジホッ
グのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを置換するエレメントを含むＮ末端
伸長部分を含み得る。

【０１５２】 （２．Ｎ末端欠失） 機能的アンタゴニストの別の改変体は、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応
するＮ末端システインから始まる約１２アミノ酸以下を失っているヘッジホッグ
タンパク質である。最初の約１２個よりも多くの連続したアミノ酸残基の欠失は
、機能的アンタゴニストを生成しない。好ましくは、約１０個の連続したアミノ
酸の欠失は、適切な機能的アンタゴニストを提供する。しかし、１０個より少な
い連続した残基を除去し得、そして依然としてアンタゴニスト機能を保持し得る
。さらに、種々の組合せの、連続していない残基を欠失させ得る。ただし、合計
少なくとも約３個の欠失した残基が存在する。

【０１５３】 これらの構造は、機能に関しての、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端の重要性
を強調する。全ての改変体は、パッチ−１に結合するそれらの能力において成熟
Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）と区別できなかったが、インビトロでのＣ３
Ｈ１０ Ｔ１／２ ＡＰ誘導アッセイにおいて不活性であった。これらの全ての
Ｎ末端改変体は、ヘッジホッグ依存性シグナル伝達を促進することができない。

【０１５４】 （３．Ｎ末端変異） なお別の機能的アンタゴニストは、Ｎ末端システインの、別のアミノ酸残基へ
の変異を有する。任意のアミノ酸残基が受容可能であり、そして本明細書中に記
載される教示に従って当業者は、変異をさせ、そしてこのような変異の効果を試
験し得る。１つの例は、Ｎ末端システインが、セリン残基によって置換されたＳ
ｈｈである。この変異した形態は、パッチ−１と結合するその能力において成熟
Ｓｈｈと区別できないが、これは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２ ＡＰ誘導アッセイにお
いて機能について試験した場合、成熟ＳｈｈによるＡＰ誘導をブロックする。

【０１５５】 （４．Ｎ末端システイン修飾） ヘッジホッグの一次アミノ酸配列は、生物学的活性において重要であるＣｙｓ
−１を含むので、特定の他の修飾は、ヘッジホッグタンパク質の不活性なアンタ
ゴニスト改変体を生じる。別のアンタゴニストは、ヘッジホッグポリペプチドの
単離された機能的アンタゴニストである。このアンタゴニストには、システイン
が修飾形態である以外は成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ
末端システインを含むヘッジホッグポリペプチドが含まれる。ヘッジホッグのア
ンタゴニストポリペプチドは、それらのＮ末端システインのインビボまたはイン
ビトロの化学誘導体化、ならびにアセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、
カルボキシル化、またはグリコシル化における可能な変化を含む非配列性の修飾
を有し得る。一例として、この機能的アンタゴニストは、酸化型のＮ末端システ
インを有し得る。従って、機能的アンタゴニストは、Ｎ末端伸長部分の一部とし
てそれを含むことにより効果的に修飾される、Ｎ末端システインを有し得る。

【０１５６】 （Ｂ．他の実施態様） 本発明のアンタゴニストポリペプチドは、ヘッジホッグタンパク質に対して少
なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を含み得る。このアンタゴニストは、少
なくとも以下の機能的アンタゴニスト特性を示さねばならない：（ｉ）単離され
たタンパク質は、パッチ−１に対する成熟ヘッジホッグタンパク質の結合よりも
弱くあり得る（しかし、好ましくは少なくとも同じである）親和性でレセプター
パッチ−１と結合する；そして（ｉｉ）この単離されたタンパク質は、インビト
ロでＣＨ３１０Ｔ１／２細胞に基づくＡＰ誘導アッセイにおいて試験される場合
に、成熟ヘッジホッグタンパク質によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）誘導を
ブロックする。

【０１５７】 本発明において有用なアンタゴニストはまた、多重遺伝子、選択的転写事象、
選択的ＲＮＡスプライシング事象、ならびに選択的翻訳および翻訳後事象の存在
の結果として生じるアンタゴニストを含む。このポリペプチドは、合成手段によ
って完全に作製され得るか、またはタンパク質がネイティブな細胞において発現
される場合に、結果として実質的に同じ翻訳後修飾が存在することになる系（例
えば、培養細胞）において、もしくはネイティブな細胞において発現された場合
に、結果として翻訳後修飾の省略が存在することになる系において発現され得る
。

【０１５８】 好ましい実施態様において、単離されたアンタゴニストは、１つ以上の以下の
特性を有するポリぺプチドである： （ｉ）配列番号２１〜２２のアミノ酸と、少なくとも６０％、より好ましくは
９０％、および最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、ポリぺプチド； （ｉｉ）修飾されたＮ末端システインを有するか、またはＮ末端システインを
欠くか、またはヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインと異なる
位置にＮ末端システインを有するかのいずれかである、ポリぺプチド； （ｉｉｉ）ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞の成熟ヘッジホッグによるアルカリホスフ
ァターゼの誘導をブロックする、ポリぺプチド； （ｉｖ）成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチ−１への結合未満の親和性未満
であり得るが、好ましくは少なくとも同程度の親和性で、そのレセプターパッチ
−１と結合するかまたは相互作用する、ポリぺプチド； （ｖ）ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞でインビトロにおいてｐｔｃ−１発現およびｇ
ｌｉ−１発現を誘導し得ない、ポリぺプチド；あるいは （ｖｉ）ＣＨ３１０Ｔ１／２アッセイにおいてＡＰを誘導し得ない、ポリぺプ
チド。

【０１５９】 さらに、本発明に有用な単離されたヘッジホッグアンタゴニストはまた、ヘッ
ジホッグに関連しないさらなるＣ末端配列を含む組換え融合タンパク質であり得
る。従って、アンタゴニストポリぺプチドはまた、さらなるアミノ酸残基にリー
ディングフレームにおいて融合された配列番号２１〜２２に由来するアミノ酸配
列の全てもしくはフラグメントを含み得る。本発明のポリぺプチドの１つのバー
ジョンは、第１のポリぺプチド部分およびヘッジホッグアンタゴニスト部分を有
するタンパク質であり、このアンタゴニスト部分は、第１のポリぺプチド部分の
５’または３’のいすれかに融合されるか、さもなければ連結される。従って、
まず、さらなるポリぺプチド部分は、アンタゴニストポリぺプチドに関連しない
アミノ酸配列を有する。さらなるポリぺプチド部分は、例えば、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、またはポリメラーゼ活性化ドメ
イン、ヒスチジンタグ、免疫グロブリンもしくはそれらの部分のいずれかであり
得、これらは、アンタゴニスト部分のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに融合さ
れるか、さもなければ連結される。

【０１６０】 さらなる修飾ポリぺプチドとしては、例えば、とりわけポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）および／またはデキストランのような化学部分を含むポリぺプチド
が挙げられる。このような化学部分の付加は、Ｎ末端システインに特異的であり
得るか、またはアンタゴニストポリぺプチドの他のアミノ酸残基への結合を含み
得る。ＰＥＧまたはデキストランのような部分、あるいは免疫グロブリン融合物
のような構築物は、アンタゴニストタンパク質が治療薬として使用される場合に
、有効半減期を増加させるのに役立ち得る。ヘッジホッグタンパク質は、最も好
ましくは、ポリアルキレングリコールポリマーの末端反応性基を介して結合体化
されるが、結合体はまた、非末端反応性基から分岐され得る。反応性基を有する
ポリマーは、本明細書においては「活性化ポリマー」と称される。反応性基は、
ヘッジホッグタンパク質の遊離アミノ基または他の反応性基と選択的に反応する
ことが予期される。原理的には、活性化ポリマーを、結合が利用可能な任意のヘ
ッジホッグアミノ基、例えば、リジンのα−アミノ基もしくはε−アミノ基、ま
たはシステインの−ＳＨ基で生じ得るように、反応させる。ヘッジホッグタンパ
ク質の遊離カルボキシル基、適切には、活性化したカルボニル基、ヒドロキシル
部分、グアニジル（ｇｕａｎｉｄｙｌ）部分、酸化炭水化物部分およびメルカプ
ト基もまた、（利用可能であれば）結合部位として使用され得る。

【０１６１】 特に、チオールを保護するための任意のＮ末端システインの化学的修飾（ポリ
アルキレングリコール部分（すなわち、ＰＥＧ）との同時結合体化を伴う）は、
当業者により多くの方法で行われ得る。米国特許第４，１７９，３３７号を参照
のこと。スルフヒドリル部分（活性種としてチオレートイオンを有する）は、タ
ンパク質において最も反応性の官能基である。他の任意の基よりもチオールとよ
り速く反応する多数の試薬が存在する。Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（Ｓ．Ｓ
．Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１）
を参照のこと。全てのヘッジホッグタンパク質に見出されるようなＮ末端システ
インのチオールは、この配列内の内部システインよりも、より反応性であること
が予期される。なぜなら、α−アミンのごく近傍ではチオールのｐＫａがより低
いのため、中性ｐＨもしくは酸性ｐＨで、反応性チオレートイオンへのより優れ
た程度のプロトン解離を生じるからである。さらに、この構造のＮ末端のシステ
インは、このタンパク質構造内に埋め込まれていることが見出されているヘッジ
ホッグ配列内の他の２つのシステインよりも、より露出される可能性がある。

【０１６２】 ポリアルキレングリコールとＮ末端システインとの間の結合を提供する方法の
他の例は、他のα−ハロアセチル化合物、有機水銀化合物、ジスルフィド試薬、
および他のＮ−置換マレイミドとの反応である。これらの反応種の多数の誘導体
は、市販されているか（例えば、エチルヨードアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ
ｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）、フェニルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、および
Ｎ−ピレンマレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ Ｏ
Ｒ））、または容易に合成され得る（例えば、Ｎ−アルキルヨードアセトアミド
、Ｎ−アルキルマレイミド、および有機水銀化合物）。

【０１６３】 Ｎ末端システインの反応性についての別の局面は、この１，２−アミノチオー
ルの立体配置に特有の反応化学に関係し得る。１つの例はチオエステル基との反
応であり、この反応は、チオエステルのＳからＮへの迅速なシフト（ｒａｐｉｄ
Ｓ ｔｏ Ｎ ｓｈｉｆｔ）を介してＮ末端アミド基を形成する。この反応化
学は合成ペプチドを共に共役し得、そしてこれを使用して、一つもしくは複数の
中性もしくは中性ではないアミノ酸または他の疎水性基を、適切な活性化ペプチ
ドを介して付加し得る。別の例はアルデヒドとの反応であり、この反応は、チア
ゾリジン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ）付加物を形成する。チオールエステル（
例えば、Ｃ２−Ｃ２４飽和脂肪アシル補酵素ＡエステルおよびＣ２−Ｃ２４不飽
和脂肪アシル補酵素Ａエステル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ））、アルデヒド（例えば、ブチルアルデヒド、ｎ−デシル
アルデヒド、およびｎ−ミリスチルアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ））、およびケ
トン（例えば、２−デカノン、３−デカノン、および４−デカノン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ））の多数の疎水性誘導体は、市販されているか、または容易に合成され得
る。同様の様式において、チオモルフォリンが、種々のα−ハロケトン出発材料
から調製され得る。

【０１６４】 （Ｂ．ヘッジホッグのＣ末端へのポリマー部分の結合） ポリアルキレングリコール部分を、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端のシステ
インもしくはリジンに結合させるために必要とされる化学が、容易に利用可能で
ある、という事実にもかかわらず、一旦、特定の「ＰＥＧ」結合化学が特定のア
ミノ酸のために利用可能であると、ポリマー部分のその特定のアミノ酸への結合
が意図された効果を有する、と仮定することを訂正する必要はない。

【０１６５】 実際に、ポリマーは、まだ修飾されていない（例えば、疎水性基によって）ヘ
ッジホッグ分子上の任意の部位に結合され得るが、ポリマーカップリングのため
の最も好ましい部位は、ヘッジホッグのＮ末端以外およびリジン以外の部位であ
る。最も好ましい部位は、Ｃ末端またはその近傍の部位である。いくつかの知見
により、Ｃ末端またはＣ末端近傍のアミノ酸が、ポリアルキレングリコール部分
を用いる修飾のための好ましい標的であることが示唆される：（ｉ）野生型タン
パク質はコレステロールによりこの部位で自然に修飾され、これは、この部位が
露出されておりそして修飾のために利用可能であることを示す。実際に、本発明
者らは、トロンビンでの処置が、Ｃ末端の３つのアミノ酸の選択的な放出を生じ
ることを示した（米国特許出願第６０／１０６，７０３号（１１／２／９８出願
）を参照のこと）；（ｉｉ）本発明者らは、広汎なＳＡＲ分析を行い、そして折
り畳みまたは機能に対して有害な効果を伴わないで、Ｃ末端の１１アミノ酸が欠
失され得ることを発見した；（ｉｉｉ）本発明者らは、Ｉｇ部分をヘッジホッグ
のＣ末端部分に結合させることにより、折り畳みまたは機能に対して有害な効果
を伴わないで、ヘッジホッグ／Ｉｇ融合タンパク質を作製した（本明細書中には
データを示さず）。

【０１６６】 ＰＥＧのようなポリアルキレングリコールポリマーをヘッジホッグのＣ末端に
標的化するための単純な化学ストラテジー存在しないが、部位特異的変異誘発に
ついて上記したように、このポリマー部分を標的化するために使用し得る部位を
遺伝的に操作することは複雑ではない。例えば、Ｃ末端またはその近傍に存在す
る部位でのＣｙｓの組込みは、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテー
ト活性化ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）を使用する、特定の修飾
を可能にする。上記のＡ節で議論したように、これらの誘導体は、これらの試薬
のＣｙｓに対する高い選択性に起因して、操作したＣ末端システインの修飾のた
めに特異的に使用される。標的化され得るヒスチジンタグまたはさらなるグリコ
シル化部位の取り込みのような他のストラテジー（Ｆａｎｃｙら（１９９６）Ｃ
ｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．３：５５１）は、ヘッジホッグのＣ末端を修飾するため
の他の代替ストラテジーを代表する。

【０１６７】 本発明の広汎な範囲において、１つのポリマー分子が、ヘッジホッグタンパク
質との結合体化のために使用され得、そしてそのバージョンを上記のように修飾
し得るが、１より多いポリマー分子が同様にして結合され得ることも企図される
。本発明の結合されたヘッジホッグ組成物は、インビボでの適用およびインビボ
ではない適用の両方において有用性を見出し得る。さらに、この結合体化してい
るポリマーは、最終用途の適用に適切であるように、任意の他の基、部分、また
は他の結合体化された種を利用し得ることが認識される。例示の目的では、この
ポリマーは、このポリマーに、ＵＶ−分解耐性、または抗酸化、またはポリマー
についての他の特性もしくは特徴を与える官能部分を共有結合させるような、い
くつかの適用において有用であり得る。さらなる例示としては、このポリマーに
反応性もしくは架橋可能な特性を与えて、結合体化させた材料全体の種々の特性
または特徴が増強されるように、このポリマーを機能的にすることがいくつかの
適用において有利であり得る。従って、このポリマーは、その意図された目的の
ために、任意の機能性、反復基、結合、または結合体化ヘッジホッグ組成物の有
効性を妨げない他の成分構造を含み得る。本発明の他の目的および利点は、引き
続く開示および添付の特許請求の範囲からさらに十分に明らかである。

【０１６８】 これらの所望の特性を達成するために有用に使用され得る例示的なポリマーが
、本明細書中において、以下の例示的な反応スキームで記載される。共有結合さ
れるペプチドの適用において、ポリマーは機能的にされ得、次いで、不安定な結
合を形成するようにペプチドの遊離アミノ酸に結合される。

【０１６９】 一般に、タンパク質１モルあたり、約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが
、特定の反応化学およびタンパク質濃度に依存して使用される。最終量は、産物
の非特異的な修飾を最小化しながら反応の範囲を最大化することと、可能である
ならば、同時にタンパク質の半減期を最適化しながら同時に最適な活性を維持す
る化学を規定することとの間の平衡である。好ましくは、タンパク質の生物学的
な活性の少なくとも約５０％が保持され、そして最も好ましくは１００％保持さ
れる。

【０１７０】 反応は、生物学的に活性な材料を不活性なポリマーと反応させるために使用さ
れる、任意の適切な方法により開始され得る。一般的に、このプロセスは、活性
化ポリマー（少なくとも１つの末端ヒドロキシル基を有し得る）を調製する工程
、その後に、タンパク質を活性化ポリマーと反応させて処方に適した可溶性のタ
ンパク質を生成する工程を包含する。上記の修飾反応は、１以上の工程を包含し
得るいくつかの方法によって行われ得る。

【０１７１】 ポリアルキレングリコール部分をＣ末端システインに結合する適切な方法は、
一般に上記で議論したように、チオール反応性基で活性化させた部分を使用する
ことを含む。共通のチオール反応性基としては、マレイミド、ビニルスルホンま
たはハロアセテートが挙げられる。これらの誘導体は、これらの試薬の−ＳＨに
対する高い選択性に起因して、特にシステインの修飾のために使用され得る。マ
レイミドは、わずかに酸性から中性（ｐＨ６．０〜７．５）条件下で、微量な遊
離のスルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。この反応はｐＨ５
．０で緩やかであっても進行するが、このｐＨ範囲が好ましい。ハロゲン（ヨー
ドアセチル官能基）は、生理学的なｐＨからわずかに酸性の条件で−ＳＨ基と反
応する。これらの両方の反応基は、安定なチオエステル結合の形成を生じる。

【０１７２】 本発明の実施において、Ｃ１−Ｃ４ポリアルキレングリコールのグリコール残
基、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のグリコール残基、またはこ
のようなグリコールのポリ（オキシ）アルキレングリコール残基は、目的のポリ
マー系に有利に組み込まれる。従って、タンパク質が結合されるポリマーは、ポ
リマーが室温で水溶性である全ての場合であるならば、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）のホモポリマーであり得るか、またはポリオキシエチル化ポリオール
である。このようなポリマーの非限定的な例としては、ＰＥＧまたはポリプロピ
レングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチ
ル化グリコール、それのコポリマー、およびそれのブロックコポリマー（水可溶
性のブロックコポリマーが維持されるのであれば）が挙げられる。ポリオキシエ
チル化ポリオールの例としては、例えば、ポリオキシエチル化グリコール、ポリ
オキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコースなどが挙げられる
。ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物および
ヒトにモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドで天然に存在する
のと同じ骨格である。従って、この分岐化（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）は、身体にお
いて外来因子として必ずしも認識されることはない。

【０１７３】 ポリアルキレンオキシドに対する代替物として、デキストラン、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリ
マーなどが使用され得る。さらに、米国特許第５，３５９，０３０号に記載され
るへテロポリマー（すなわち、コポリマーのような１より多いモノマー種から構
成されるポリマー）が使用され得る（例えば、ポリアルキレングリコール部分お
よび１以上の脂肪酸を含むポリマーに結合体化されたタンパク質）。当業者は、
前述の列挙は単に例示にすぎず、そして本明細書に記載される特質を有する全て
のポリマー材料が意図されることを認識する。

【０１７４】 ポリマーは、いかなる特定の分子量をも有することを必要としないが、分子量
が、約３００と１００，０００との間、より好ましくは１０，０００と４０，０
００との間であることが好ましい。特に、２０，０００以上のサイズが、腎臓で
の濾過に起因するタンパク質の損失を防止する点で最も良い。

【０１７５】 ポリアルキレングリコールの誘導体化は、本発明の実施において、ポリマー−
ヘッジホッグ結合体の形成に有利な多くの特性を有する。なぜなら、ポリアルキ
レングリコール誘導体は、以下の特性を付随するからである：水可溶性を改良す
る一方で、同時に、抗原性応答または免疫原性応答を誘起しない；高い程度の生
体適合性；ポリアルキレングリコール誘導体のインビボでの生分解の欠如；およ
び生体（ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ）からの排出の容易さ。

【０１７６】 さらに、本発明の別の局面において、ポリマー成分に共有結合されたヘッジホ
ッグを利用し得、ここにおいて、この結合体の性質は、切断可能な共有結合性化
学結合を含む。このことは、ポリマーがヘッジホッグから切断され得る時間経過
にわたって、制御を可能にする。ヘッジホッグタンパク質薬物とポリマーとの間
のこの共有結合は、化学反応または酵素反応によって切断され得る。ポリマー−
ヘッジホッグタンパク質産物は、受容可能な量の活性を保持する。同時に、ポリ
エチレングリコール部分は、ポリマー−ヘッジホッグタンパク質結合体に、高い
水可溶性および持続性の血液循環能力を与えるために結合しているポリマーに存
在する。これらの改善された特性の結果として、本発明は、インビボでの適用に
おいて、両方の活性ポリマー−ヘッジホッグタンパク質種の非経口的送達、エア
ロゾル送達、および経口送達、そして加水分解性切断の後での、ヘッジホッグタ
ンパク質それ自体のバイオアベイラビリティーを企図する。本明細書に記載され
る反応スキームは例示のみの目的のために提供され、そして例えば、非経口投与
および経口投与のための可溶性、安定化、および細胞膜親和性を達成するために
、ヘッジホッグタンパク質の修飾において利用され得る反応および構造に関して
限定されない。一般的に、使用される試薬の濃度は、活性化されるポリマーのモ
ル量が、ヘッジホッグアミノ酸上の反応基（例えば、チオール）のモル量と少な
くとも等量、好ましくは過剰量であるべきことを除いて、本明細書に提供される
手順を実行することについては重要ではない。最も好ましい結合産物を得るため
の、ヘッジホッグとのポリマーの反応は、広汎な種々の反応スキームを使用して
容易に実行される。ヘッジホッグタンパク質結合体の活性および安定性は、異な
る分子サイズのポリマーを使用するいくつかの方法において変化し得る。結合体
の可溶性は、ポリマー組成物に組み込まれるポリエチレングリコールフラグメン
トの割合およびサイズを変更することによって変化し得る。

【０１７７】 （Ｖ．アゴニスト） 本発明の方法における使用に最も好ましいポリぺプチドの１つは、天然に存在
するヘッジホッグまたは組換えヘッジホッグの、生物学的活性を有するアゴニス
トである。このアゴニストは、以下の少なくとも１つの特性を有する：（ｉ）レ
セプターパッチ−１に結合する単離されたタンパク質であって、成熟ヘッジホッ
グタンパク質のパッチ−１への結合と少なくとも同程度の親和性を有するが、好
ましくはそれより高い親和性を有する、単離されたタンパク質、または（ｉｉ）
ヘッジホッグタンパク質に結合する単離されたタンパク質であって、インビトロ
ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイで試験した場合に、パッチ−
１に対するタンパク質結合親和性を増大させる様式で結合する、単離されたタン
パク質。本発明のアゴニストはまた、（ｉｉｉ）ｐｔｃ−１発現およびｇｌｉ−
１発現を単独で誘導し得る、というさらなる特性を有する。

【０１７８】 ヒトソニックヘッジホッグ（昆虫または哺乳動物細胞のいずれかにおいて全長
構築物として発現される）は、Ｎ末端システインのα−アミンに付加された疎水
性パルミトイル基を有する（Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、印刷中）。これは、そのよう
な様式で修飾される細胞外シグナル伝達タンパク質の最初の例である。そして結
合が容易に可逆性であるチオール結合型パルミチン酸修飾とは対照的に、この新
規のＮ−結合型パルミトイル部分は、ミリスチン酸修飾との類似性により非常に
安定であるようである。

【０１７９】 この最初の発見の直接的な結果として、ヘッジホッグシグナル伝達タンパク質
の疎水性性質の増大により、タンパク質の生物学的な活性が増大し得ることが公
知である。従って、この修飾されたヘッジホッグは、それ自身のアンタゴニスト
として作用する。特に、ヘッジホッグタンパク質のようなシグナル伝達タンパク
質に疎水性部分を付加することにより、タンパク質の活性が増大し得、従って、
アゴニストとして作用し得る。生物学的に活性なタンパク質のＮ末端システイン
は、疎水性部分を付加するための便利な部位を提供し、それによりタンパク質の
物理化学的特性を修飾するだけではなく、Ｎ末端システインの修飾はタンパク質
の安定性を増大し得る。さらに、タンパク質構造の表面の内部アミノ酸残基に疎
水性部分を付加することによって、タンパク質の活性を増大する。

【０１８０】 タンパク質の細胞外フラグメントのＣ末端にコレステロールを付加することに
より見られる効果に加えて、ヘッジホッグ遺伝子産物の少なくとも特定の生物学
的な活性が、タンパク質の他の部分の親油性部分用いてのタンパク質の誘導体化
によって、および／またはコレステロール以外の部分によって予期せずに増強さ
れる。本発明の特定の局面は、ヘッジホッグアゴニストの治療的調製物に関し、
これは、タンパク質の天然にプロセスされる形態のＮ末端もしくはＣ末端以外の
部位で修飾され、および／またはＣ末端のステロールもしくはＮ末端の脂肪酸以
外の親油性部分を用いて、そのような末端残基で修飾される。従って、本発明の
方法および組成物は、ヘッジホッグアゴニストの増大された生物学的活性および
より高いパッチ−１結合親和性に起因する、ヘッジホッグアゴニストとしての全
ての使用のために誘導されたヘッジホッグポリペプチドの使用を含む。さらに、
本方法は、培養において提供される細胞（インビトロ）、または動物全体の細胞
（インビボ）に対して行われ得る。

【０１８１】 １つの局面において、本発明は、薬学的な調製物を提供し、これらは、活性な
成分として、本明細書中に記載される１つ以上の親油性部分によって誘導体化さ
れるヘッジホッグポリペプチドを含む。本発明のヘッジホッグでの処置は、ヒト
被験体および動物被験体の両方に対して効果的である。本発明が適用可能な動物
被験体は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｌｉｖｅｓｔ
ｏｃｋ）の両方にまで及び、これは、ペットとしてかまたは商業的目的のいずれ
かを生じる。例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ（ｈｏｇ）お
よびヤギである。

【０１８２】 （Ａ．アゴニストとして作用する、単離されたヘッジホッグタンパク質の一般
的な特性） 本方法のヘッジホッグ組成物のポリペプチド部分は、種々の技術のいずれかに
よって生成され得る。これらの技術としては、天然に存在するタンパク質の精製
、組換え的に産生されたタンパク質、および合成化学が挙げられる。ヘッジホッ
グ治療薬のポリペプチド形態は、好ましくは、脊椎動物のヘッジホッグタンパク
質に由来し、例えば、脊椎動物生物に由来する、天然に存在するヘッジホッグタ
ンパク質、またはそのフラグメントに対応する配列を有する。しかし、ヘッジホ
ッグポリペプチドは、任意の後生動物亜界生物に生じるヘッジホッグタンパク質
（またはそのフラグメント）に相当し得ることが明らかである。

【０１８３】 本発明の方法に有用なファミリーメンバーとしては、天然に存在する、対立遺
伝子対応物、系統発生的対応物またはそれらの他の改変体を含むネイティブのヘ
ッジホッグタンパク質のいずれか（天然の供給源のヘッジホッグタンパク質かま
たは化学的に産生されたヘッジホッグタンパク質（ムテインまたは変異タンパク
質を含む）のいずれであっても）、ならびに組換え形態およびヘッジホッグファ
ミリーの新たな活性なメンバーが挙げられる。特に有用なヘッジホッグポリペプ
チドとしては、米国特許出願第６０／１０６，７０３号に開示されるヘッジホッ
グポリペプチドが挙げられる。

【０１８４】 本発明の方法のいずれかでの使用に好ましいアゴニストは、誘導体化ヘッジホ
ッグポリペプチド配列、ならびに他のＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸配
列を含むか、あるいはヘッジホッグアミノ酸配列の全てもしくはフラグメントを
含み得る。単離されたヘッジホッグポリペプチドはまた、第一のヘッジホッグ部
分および第二のポリぺプチド部分を有する組換え融合タンパク質であり得る（例
えば、第二のポリペプチド部分は、ヘッジホッグに関連しないアミノ酸配列を有
する）。第二のポリペプチド部分は、例えば、ヒスチジンタグ、マルトース結合
タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ま
たはポリメラーゼ活性化ドメインであり得る。

【０１８５】 本発明のポリペプチドは、複数の遺伝子の存在、代替の転写事象、代替のＲＮ
Ａスプライシング事象、ならびに代替の翻訳事象および翻訳後事象の結果として
生じるポリペプチドを含む。ポリペプチドは、もっぱら合成的手段によって作製
され得るか、または、系、例えば、培養された細胞において発現され得、この系
は、タンパク質がネイティブの細胞中で発現された場合に存在するのと実質的に
同様の翻訳後修飾を生じる系か、またはネイティブの細胞において発現された場
合に存在する翻訳後修飾の省略を生じる系である。

【０１８６】 好ましい実施態様において、アゴニストは、以下の１つ以上の特性を有するヘ
ッジホッグポリペプチドである： （ｉ）配列番号２１〜２２のようなヘッジホッグ配列と、少なくとも３０％、
４０％、４２％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列
同一性を有する、ポリペプチドまたはそのフラグメント； （ｉｉ）Ｎ末端にシステインまたは機能的な等価物を有する、ポリぺプチド； （ｉｉｉ）Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、アルカリホスファターゼ活性を
誘導し得る、ポリぺプチド； （ｉｖ）ヘッジホッグ配列のポリぺプチドと、少なくとも５０％、好ましくは
少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、または
９５％の全配列同一性を有する、ポリぺプチド； （ｖ）哺乳動物細胞のような天然供給源から単離され得る、ポリぺプチド； （ｖｉ）パッチに結合し得るかまたは相互作用し得る、ポリぺプチド；ならび
に （ｖｉｉ）疎水的に修飾された、ポリぺプチド（すなわち、このポリぺプチド
に結合された少なくとも１つの疎水性部分を有する、ポリぺプチド）。

【０１８７】 ヘッジホッグタンパク質の全体的な疎水性性質を増大させることにより、この
タンパク質の生物学的な活性が増大される。ヘッジホッグのようなシグナル伝達
タンパク質の潜在能は、以下によって増大され得る：（ａ）化学的修飾（例えば
、スルフヒドリルおよび／またはＮ末端システインのα−アミンに疎水性部分を
付加する）；（ｂ）Ｎ末端システインの疎水性アミノ酸との置換；または（ｃ）
Ｎ末端システインを異なるアミノ酸と置換して、次いで、置換した残基を、置換
部位に疎水性部分を付加するように化学的に修飾すること。

【０１８８】 さらに、以下による、ヘッジホッグタンパク質のこのタンパク質表面上の内部
残基での、疎水性部分を用いた改変は、このタンパク質の生物学的活性を保持ま
たは増強する：（ａ）この内部残基を疎水性アミノ酸で置換すること；または（
ｂ）この内部残基を異なるアミノ酸で置換し、次いで、この置換された残基を化
学改変し、この置換の部位に疎水性部分を付加すること。

【０１８９】 さらに、以下による、ヘッジホッグタンパク質のようなタンパク質のＣ末端で
の、疎水性部分を用いた改変は、このタンパク質の生物学的活性を保持または増
強する：（ａ）このＣ末端残基を疎水性アミノ酸で置換すること；または（ｂ）
このＣ末端残基を異なるアミノ酸で置換し、次いで、この置換された残基を化学
改変し、この置換の部位に疎水性部分を付加すること。

【０１９０】 ヘッジホッグポリペプチドが誘導され得る広汎な親油性部分が存在する。親油
性基は、例えば、約７〜３０の炭素を有する比較的長鎖のアルキル基またはシク
ロアルキル（好ましくはｎ−アルキル）基であり得る。このアルキル基は、ヒド
ロキシまたは一級アミン「テイル」で終結し得る。さらに例示するために、親油
性分子には、天然に存在するおよび合成の芳香族部分および非芳香族部分（例え
ば、脂肪酸、エステルおよびアルコール）、他の脂質分子、ケージ構造（例えば
、アダマンタンおよびバックミンスターフラーレン）、ならびに芳香族炭化水素
（例えば、ベンゼン、ペリレン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、
ピレン、クリセンおよびナフタセン）が挙げられる。

【０１９１】 親油性分子として特に有用であるのは、脂環式炭化水素、飽和脂肪酸および不
飽和脂肪酸、ならびに他の脂質部分およびリン脂質部分、ろう、コレステロール
、イソプレノイド、テルペン、および多脂環式炭化水素（アダマンタンおよびバ
ックミンスターフラーレンを含む）、ビタミン、ポリエチレングリコールまたは
オリゴエチレングリコール、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキルホスフェートジエステ
ル、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ１２−Ｃ１８）−アルキル、そして
特にピレン誘導体との結合体である。本発明における使用に適切な親油性色素で
あり得る親油性部分には、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ジフェニ
ルヘキサトリエン、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン、ロ
ーダミン、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、スル
ホローダミン、１，１’−ジドデシル−３，３，３’，３’テトラメチルインド
カルボシアニンペルクロレート、オクタデシルローダミンＢ、ならびにＢＯＤＩ
ＰＹ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）。

【０１９２】 他の例示的な親油性部分には、以下を含む脂肪族カルボニルラジカル基が挙げ
られる：１−もしくは２−アダマンチルアセチル、３−メチルアダマント−１−
イルアセチル、３−メチル−３−ブロモ−１−アダマンチルアセチル、１−デカ
リンアセチル、カンフルアセチル（ｃａｍｐｈｏｒａｃｅｔｙｌ）、カンファン
アセチル、ノルアダマンチルアセチル、ノルボルナンアセチル、ビシクロ［２．
２．２．］−オクト−５−エンアセチル、１−メトキシビシクロ［２．２．２．
］−オクト−５−エン−２−カルボニル、シス−５−ノルボルネン−エンド−２
，３−ジカルボニル、５−ノルボルネン−２−イルアセチル、（１Ｒ）−（−）
−ミルテンタンアセチル、２−ノルボルナンアセチル、アンチ−３−オキソ−ト
リシクロ［２．２．１．０^2,6］−ヘプタン−７−カルボニル、デカノイル、ド
デカノイル、ドデセノイル、テトラデカジエノイル、デシノイルまたはドデシノ
イル。

【０１９３】 適切なアミノ酸が特定の位置で利用可能でない場合、部位特異的変異誘発を使
用して、その部位に反応性アミノ酸を置き得る。反応性アミノ酸には、システイ
ン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン
、チロシン、アルギニン、メチオニンおよびトリプトファンが挙げられる。変異
誘発を使用して、この反応アミノ酸を、Ｎ末端もしくはＣ末端または内部位置に
置き得る。

【０１９４】 例えば、改変または置換された化学部分が疎水性であるという条件で、生物学
的に活性なタンパク質（例えば、ヘッジホッグタンパク質）のＮ末端システイン
を化学的に改変するか、またはＮ末端システインを全て除去し、そしてなおその
タンパク質の生物学的活性を保持することが可能である。ヘッジホッグの生物学
的活性の増強は、その改変の疎水性とほぼ相関することが発見された。このタン
パク質活性を増強することに加えて、Ｎ末端システインを改変または置換するこ
とによって、このタンパク質の生成、精製、処方および貯蔵の間に生じ得るシス
テインの望まれない交差反応および／または改変が除去される。Ｎ末端システイ
ンのチオールは、そのシステインのｐＫａを低め、そして中性ｐＨまたは酸性ｐ
Ｈでのプロトン解離および反応性チオレートイオンの形成を増加するα−アミン
に近接していることに起因して、非常に反応性である。

【０１９５】 疎水性アミノ酸でのヘッジホッグのＮ末端システインの置換は、細胞に基づく
シグナル伝達アッセイにおいて増加した能力を有するタンパク質を生じる。この
システインを置換することによって、このアプローチは、このタンパク質の生成
、精製、処方および貯蔵の間に生じ得るシステインの望まれない他の改変を抑制
するという問題を排除する。このアプローチの一般性は、３つの異なる疎水性ア
ミノ酸（フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニン）の各々が、より活
性な形態のヘッジホッグ、従ってアゴニストを与えるという知見によって支持さ
れる。従って、任意の他の疎水性アミノ酸でのこのシステインの置換は、活性な
タンパク質を生じる。さらに、本発明者らは、アミノ酸の疎水性または化学的改
変と、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおける対応する改変されたタンパク質の能
力との間の相関（例えば、Ｐｈｅ＞Ｍｅｔ、長鎖長の脂肪酸＞短鎖長の脂肪酸）
を見出したことから、ヘッジホッグ配列に１つより多くの疎水性アミノ酸を付加
することによって、単一のアミノ酸付加で達成される増加を超えて、そのアゴニ
ストの能力が増加すると考察され得る。実際に、ヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグの
Ｎ末端への２つの連続したイソロイシン残基の付加は、単一のイソロイシンのみ
が付加された変異体と比較した場合に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおける能
力の増加を生じる。従って、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に
て、表面ループ内にて、またはいくつかの位置の組み合わせにおいて疎水性アミ
ノ酸を付加することによって、このタンパク質のより活性な形態が与えられると
予測される。置換されるアミノ酸は、２０の一般的なアミノ酸のうちの１つであ
る必要はない。タンパク質における特定の位置にて非天然アミノ酸を置換するた
めの方法が報告されており、そしてこのことは、アミノ酸が、特徴においてより
疎水性であるか、タンパク質分解攻撃に対して耐性であるか、またはその活性を
より強力もしくは特異的にするインビボでの特定の位置にヘッジホッグタンパク
質をさらに指向するために使用され得る場合、有利である。非天然アミノ酸は、
インビトロの翻訳の間にタンパク質中の特定の部位に取り込まれ得、そしてその
ような改変されたタンパク質のより大規模な生成を可能にするインビボ系を作製
することにおいて進歩が報告されている。

【０１９６】 チオールを保護し、そして疎水性部分を加える、このＮ末端システインの多く
の改変が存在する。これらの改変は、以下でより詳細に議論される。当業者は、
どの改変が特定の治療用途に最も適切であるかを決定し得る。そのような決定に
影響を及ぼす因子には、生成、精製および処方の経費および容易さ、溶解性、安
定性、効力、薬力学および薬物動態学、安全性、免疫原性、ならびに組織標的化
が挙げられる。

【０１９７】 （Ｂ．一次アミノ酸配列の化学改変） 疎水性部分による同時活性化を伴う、チオールを保護するためのＮ末端システ
インの化学改変は、当業者によって多くの方法で行われ得る。活性種としてチオ
レートイオンを有するスルフヒドリル部分は、タンパク質において最も反応性の
官能基である。任意の他の基より速くチオールと反応する多くの試薬が存在する
。Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ
ｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１）を参照のこと。すべてのヘッジホッグタ
ンパク質において見出されるようなＮ末端のシステインのチオールは、この配列
内の内部システインより反応性であると予測される。これは、α−アミンに非常
に近接することが、チオールのｐＫａを低め、中性ｐＨまたは酸性ｐＨでの反応
性チオレートイオンへのより大きな程度のプロトン解離を生じるからである。さ
らに、この構造のＮ末端のシステインは、このタンパク質構造中に埋まっている
ことが見出されているヘッジホッグ配列中の他の２つのシステインよりも曝露さ
れているようである。そのような方法の他の例は、他のα−ハロアセチル化合物
、有機水銀化合物、ジスルフィド試薬、および他のＮ置換されたマレイミドとの
反応である。これらの活性な種の多くの疎水性誘導体は、市販されているか（例
えば、エチルヨードアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）
、フェニルジスルフィド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＮ−ピレンマレイミド（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ））、または容易に合成
され得る（例えば、Ｎ−アルキルヨードアセトアミド（８４）、Ｎ−アルキルマ
レイミドおよび有機水銀化合物）。ヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグのＮ末端システ
インは、Ｎ−イソプロピルヨードアセトアミドで改変され得る。疎水性に改変さ
れたタンパク質は、改変されていないタンパク質よりもＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッ
セイにおいて２倍強力である。長鎖アルキルヨードアセトアミド誘導体でのＳｈ
ｈの改変は、さらにより大きな効力の増強を有する改変されたタンパク質を生じ
ると予測される。従って、このようなアゴニストは、より大きな結合親和性を有
する。このようなＮ−アルキルヨードアセトアミドは、当業者によって、市販の
出発物質を用いて容易に合成され得る。

【０１９８】 Ｎ末端システインの反応性に関する別の局面は、その１，２−アミノチオール
立体配置に特有の反応化学に関与し得ることである。１つの例は、チオエステル
の迅速なＳからＮへのシフトを通じてＮ末端アミド基を形成する、チオエステル
基との反応である。この反応化学は、一緒になって合成ペプチドをカップリング
し得、そして適切に活性化されたペプチドを介して、単一または複数、天然また
は非天然のアミノ酸または他の疎水性基を付加するために使用され得る。本明細
書中で実証される別の例は、チアゾリジン付加物を形成する、アルデヒドとの反
応である。チオールエステルの多くの疎水性誘導体（例えば、Ｃ２−Ｃ２４の飽
和および不飽和の脂肪アシル補酵素Ａエステル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ））、アルデヒド（例えば、ブチルアルデヒ
ド、ｎ−デシルアルデヒド、およびｎ−ミリスチルアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ
））、およびケトン（例えば、２−、３−、および４−デカノン（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ））は、市販されているか、または容易に合成され得る。類似の様式で、チオ
モルホリンは、種々のａδ−ハロケトン出発物質から調製され得る。タンパク質
中のＮ末端システインまたは任意のシステインのチオールを改変することの代替
の経路を見出すことの容易さのために、本発明者らは、本明細書中で実証される
特定の実施例によって拘束されることを望まない。

【０１９９】 タンパク質のα−アミンは、タンパク質中の他のアミンに対して優先的に改変
され得る。なぜなら、そのより低いｐＫａは、中性ｐＨまたは酸性ｐＨにてより
高い量の反応性の非プロトン化形態を生じるからである。遊離のシステインチオ
ール基を維持する一方での長鎖脂肪アミド基でのＮ末端アミンの改変は、２桁ほ
どの大きさでヘッジホッグタンパク質を活性化する。従って、Ｎ末端アミンと優
先的に反応するように指向され得る化学は、ヘッジホッグタンパク質の抗力を増
加する際に有用であると予測される。アリールハライド、アルデヒドおよびケト
ン、酸性無水物、イソシアナート、イソチオシアナート、イミドエステル、酸性
ハライド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ）（例えば、スルホ−ＮＨＳ−アセテート）、ニトロフェニルエス
テル、アシルイミダゾール、および他の活性化されたエステルは、とりわけアミ
ン官能基と反応することが公知のものである。

【０２００】 ヘッジホッグのＮ末端システインを特定の他のアミノ酸で置換することによっ
て、他の化学方法を使用して、このＮ末端に疎水性部分を付加し得る。１つの例
は、このＮ末端にセリンまたはトレオニンを置き、このアミノ酸を酸化してアル
デヒドを形成し、次いで１，２アミノチオール構造を含む化学部分（例えば、シ
ステイン）とこのタンパク質を結合体化することである。第２の例は、このＮ末
端にヒスチジンを置き、Ｃ末端チオカルボン酸に結合することである。

【０２０１】 （Ｃ．他のアミノ酸の化学改変） 多くの他のアミノ酸の改変のための特定の化学方法が存在する。従って、より
活性な形態のヘッジホッグを合成するための別の経路は、Ｎ末端システイン以外
のヘッジホッグ中のアミノ酸に疎水性部分を化学的に付着することである。適切
なアミノ酸が所望の位置にて利用可能でない場合、部位特異的変異誘発を使用し
て、ヘッジホッグ構造中のその部位（Ｎ末端もしくはＣ末端または別の位置のい
ずれか）にて反応性アミノ酸を置き得る。反応性アミノ酸には、システイン、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロ
シン、アルギニン、メチオニンおよびトリプトファンが挙げられる。従って、よ
り良好なヘッジホッグアゴニストを作製する目的は、多くの化学手段によって達
成され得、そして本発明者らは、本発明者らの結果はこのアプローチの一般性を
支持するので、特定の化学または改変部位によって拘束されることを望まない。

【０２０２】 ヘッジホッグポリペプチドは、化学カップリング手段による、または遺伝子操
作による方法を含む多くの方法で、疎水性部分に連結され得る。例示するために
、当業者に公知である大多数の化学架橋剤が存在する。本発明について、好まし
い架橋剤は、ヘテロ二官能架橋剤であり、これは、段階様式でヘッジホッグポリ
ペプチドと疎水性部分を連結するために使用され得る。ヘテロ二官能架橋剤は、
タンパク質への結合のためのより特異的なカップリング方法を設計する能力を提
供し、それによって望まれない副反応（例えば、ホモタンパク質ポリマー）の出
現を低減する。広汎な種々のヘテロ二官能架橋剤は、当該分野において公知であ
る。これらには以下が挙げられる：スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミ
ジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジ
ル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；４
−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ
）−トルン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネート］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）。Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド部分を有するそれらの架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド
アナログとして得られ得、これは一般により高い水溶性を有する。さらに、連結
鎖内にジスルフィド架橋を有するそれらの架橋剤は、インビボでのリンカー切断
の量を低減するために、代わりにアルキル誘導体として合成され得る。

【０２０３】 ヘテロ二官能架橋剤に加えて、ホモ二官能架橋剤および光反応性架橋剤を含む
多くの他の架橋剤が存在する。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス
マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、およびジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（
ＤＭＰ）は、有用なホモ二官能架橋剤の例であり、そしてビス−［β−（４−ア
ジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、およびＮ−スクシ
ンイミジル−６（４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミノ）ヘキサノエー
ト（ＳＡＮＰＡＨ）は、本発明における使用のための有用な光反応性架橋剤の例
である。タンパク質カップリング技術の近年の概説については、Ｍｅａｎｓら（
１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １：２〜１２（本
明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【０２０４】 上記に含まれる、１つの特に有用なクラスのヘテロ二官能架橋剤は、一級アミ
ン反応性基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、またはその水溶性アナ
ログＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含む。アルカリ
性ｐＨでの一級アミン（リジンε基）は、非プロトン化されており、そしてＮＨ
Ｓまたはスルホ−ＮＨＳエステル上での求核攻撃によって反応する。この反応は
、アミド結合の形成、および副産物としてのＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの放出
を生じる。

【０２０５】 ヘテロ二官能架橋剤の一部として有用な別の反応性基は、チオール反応性基で
ある。一般的なチオール反応性基には、マレイミド、ハロゲンおよびピリジルジ
スルフィドが挙げられる。マレイミドは、わずかに酸性〜中性（ｐＨ６．５〜７
．５）の条件下で、遊離のスルフヒドリル（システイン残基）とすぐに特異的に
反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、生理的ｐＨにて−ＳＨ基と反
応する。これらの反応性基の両方は、安定なチオエーテル結合の形成を生じる。

【０２０６】 ヘテロ二官能架橋剤の第３の成分は、スペーサーアームまたは架橋である。架
橋は、その２つの反応性末端を結合する構造である。架橋の最も明白な寄与は、
立体障害に対する効果である。いくつかの場合において、より大きな架橋は、２
つの複合体生体分子を連結するに必要な距離に、より容易に架橋し得る。例えば
、ＳＭＰＢは、１４．５オングストロームの長さを有する。ヘテロ二官能試薬を
使用してタンパク質−タンパク質結合体を調製することは、米国特許出願第６０
／０６７，４２３号に開示される。

【０２０７】 可溶性の非改変タンパク質を化学的に改変することによって得られる脂質改変
ヘッジホッグについて、パルミチン酸および他の脂質は、可溶性Ｓｈｈに付加さ
れ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおける増加した効力を有する脂質改変形態を
作製し得る。本発明によって含まれる別の形態のタンパク質は、種々の脂質部分
と誘導体化されたタンパク質である。本発明に含まれる主なクラスの脂質は、脂
肪酸およびステロール（例えば、コレステロール）である。本発明の誘導体化さ
れたタンパク質は、環状、非環状（すなわち、直鎖）の飽和または不飽和のモノ
カルボン酸である脂肪酸を含む。例示的な飽和脂肪酸は、以下の一般式を有する
：ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ。以下の表１は、従来の化学方法を用いて簡便に誘
導され得るいくつかの脂肪酸の例を列挙する。

【０２０８】 このタンパク質に付着され得る他の脂質には、以下が挙げられる：分枝鎖脂肪
酸およびリン脂質基の脂質（例えば、ホスファチジルイノシトール（すなわち、
ホスファチジルイノシトール４−モノホスフェート、およびホスファチジルイノ
シトール４，５−ビホスフェート）、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｉｄｙｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセ
リン、およびイソプレノイド（例えば、ファルネシル基またはゲラニル基）が挙
げられる。脂質改変ヘッジホッグタンパク質は、天然の供給源から精製され得る
か、または可溶性の非改変タンパク質を化学的に改変することによって得られ得
る。

【０２０９】

【表２】

【０２１０】 天然の供給源から精製されたタンパク質について、本発明者らは、全長ヒトＳ
ｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）が昆虫細胞において発現され、そしてＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーおよびイムノアフィニティークロマトグラ
フィーの組み合わせを用いて、膜結合Ｓｈｈが界面活性剤処理した細胞から精製
された場合に、この精製されたタンパク質が２０ｋＤａの見かけの質量を有する
単一の鋭いバンドとして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動することを示した。
この可溶性Ｓｈｈタンパク質および膜結合したＳｈｈタンパク質は、逆相ＨＰＬ
Ｃによって容易に区別可能であり、ここで繋がれた形態が、アセトニトリル勾配
においてその後に溶出した。次いで、本発明者らは、ヒトＳｏｎｉｃヘッジホッ
グが２つの形態で細胞膜に繋がれており、１つの形態はコレステロールを含み、
従ってＤｒｏｓｏｐｈｉｌａヘッジホッグについて以前に報告されたデータに類
似し、そして第２の新規な形態はコレステロールおよびパルミチン酸改変の両方
を含むことを実証した。可溶性形態のＳｈｈおよび繋がれた形態のＳｈｈを、エ
レクトロスプレーイオン源を備えた三重の四重極質量分析を用いるエレクトロス
プレー質量分析によって、ならびに液体クロマトグラフィー−質量分析によって
分析した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化した繋がれたＳｈｈからのＮ末
端ペプチドの同定を、フライト質量分析機のＭＡＬＤＩ時間でのＭＡＬＤＩ Ｐ
ＳＤ質量分析測定によって確認した。パルミトイル化の部位を、ペプチドマッピ
ングと配列分析との組み合わせを通じて同定した。この部位は、このタンパク質
のＮ末端にある。両方の繋がれた形態は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アルカリホスファ
ターゼアッセイにおいて等しく活性であるが、興味深いことにこの両方は、つな
ぎを欠く可溶性ヒトＳｈｈより約３０倍効力があった。この脂質改変は、Ｓｈｈ
の、パッチレセプターに対する見かけの結合親和性に有意には影響を及ぼさなか
った。

【０２１１】 可溶性の非改変タンパク質を化学的に改変することによって得られる脂質改変
ヘッジホッグについて、パルミチン酸および他の脂質は、可溶性Ｓｈｈに付加さ
れ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて増加した効力を有する脂質改変形態を
作製し得る。従って、一般に、反応性脂質部分は、補酵素Ａチオエステルのよう
な飽和または不飽和のカルボン酸のチオエステル形態であり得る。そのような物
質およびそれらの誘導体には、例えば市販の補酵素Ａ誘導体（例えば、パルミト
オレオイル補酵素Ａ、アラキドイル補酵素Ａ、アラキドノイル補酵素Ａ、ラウロ
イル補酵素Ａなど）が挙げられ得る。これらの物質は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．、１９８８、カタログ３０
３〜３０６頁）から容易に入手可能である。

【０２１２】 （ＶＩ．使用） （Ａ．一般） 一般に、本明細書中に記載された脂質モジュレーターは、治療状況、診断状況
および研究状況において有用なヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニストタ
ンパク質である。本発明によって示されるように、ヘッジホッグシグナル伝達経
路は、胃腸管内での脂質の代謝に関与付けられている。実際に、ヘッジホッグタ
ンパク質に対する抗体の胚性マウスへの導入によって、これらのマウスは、種々
の脂質代謝障害を罹患する被験体間で最も共通の症状を発現した。これらのマウ
スは、倭小、重症の下痢、全身性の成長障害、腸の上皮組織中の脂質の蓄積、お
よび早期の死を示し（以下の実施例１に例示される）、このすべては、アポリポ
タンパク質Ｂの異常な発現についての種々の動物モデル（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら
、１９９５、２７１：１１９６３〜１１９７０）によって、そしてアンダーソン
病、キロミクロン保持病、無β−リポタンパク質血症、低βリポタンパク質血症
、正常トリグリセリド血症、アポ−Ｂ−１００欠乏症および無β−リポタンパク
質血症に苦しむ被験体によって共有される症状である。

【０２１３】 本発明の方法は、ヘッジホッグタンパク質の正常な生物学的活性および関連す
るシグナル伝達経路を作動するかまたは拮抗するかのいずれかのために脂質モジ
ュレーターを使用する。従って、脂質代謝の調節および／または腸の上皮組織内
の貯蔵を生じる。この上皮組織は、インビボまたはエキソビボの組織培養物のい
ずれかで調節され得る。ヘッジホッグのアンタゴニストまたはアゴニストのよう
な脂質モジュレーターを使用する方法は、体重損失または肥満を罹患する被験体
における脂質の腸代謝および貯蔵を改変するために価値がある。

【０２１４】 １つの例において、ヘッジホッグアゴニストまたはアンタゴニストのような脂
質モジュレーターを投与して、リポタンパク質代謝および取り込みにおけるヘッ
ジホッグの役割、ならびに成体の腸の上皮組織におけるヘッジホッグの正常な細
胞機能をさらに研究し得る。そのような方法は、細胞培養において使用され得る
だけではなく、例えばトランスジェニックマウスの作製における動物への投与を
通じて使用され得る。この脂質モジュレーターはまた、被験体における高脂肪常
食の効果を調節することにおいて有用であり、従ってアテローム性動脈硬化症の
進行を改変し得る。別の例において、ヘッジホッグアゴニストまたはアンタゴニ
ストのような脂質モジュレータはまた、腸細胞または肝臓におけるアポリポタン
パク質、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの合成を調節することにおいて
有用である。

【０２１５】 以下の周知かつよく用いられる動物モデルは、脂質モジュレーターの有効性を
試験するのに適している。短縮型アポリポタンパク質を合成するアポリポタンパ
ク質欠損マウスは、マウス胚幹細胞を標的とする遺伝子を用いてＨｏｍａｎｉｃ
ｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３ ９０：２３
８９−２３９３）によって生み出されている。これらのマウスは、腸および肝臓
の両方におけるアポ−Ｂ ｍＲＮＡレベルを減少させ、ならびにアポ−Ｂ、コレ
ステロール、およびトリアシルグリセロール（ｔｒｉｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）
の血漿レベルを減少させた。アポリポタンパク質ノックアウトマウスまたは低β
‐リポ蛋白血症（ｈｙｐｏｂｅｔａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）の動物モ
デルは、マウスアポリポタンパク質遺伝子の５’領域の挿入破壊を用いてＦａｒ
ｅｓｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９５ ９２：
１７７４−１７７８）によって開発された。これらのマウスの両方は、食餌誘発
高コレステロール血症からの明らかな防御と相まって、コレステロールおよびリ
ポタンパク質の血漿レベルの減少を示す。従って、これらの動物モデルのいずれ
かは、脂質代謝および／または脂質貯蔵への脂質モジュレーターの影響を研究す
るために有用なはずである。これらの動物モデルはまた、脂質代謝および／また
は脂質貯蔵に対する脂質モジュレーターの有効性を試験するのに有用である。

【０２１６】 アポリポタンパク質の異常発現およびアテローム性動脈硬化症の別の動物モデ
ルは、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６ ２７１：１
１９６３−１１９７０）およびＣａｌｌｏｗら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９４ ９１：２１３０−２１３４）の両者によって生み
出された。両グループは、マウスに高レベルのマウスアポリポタンパク質を発現
させるＰ１バクテリオファージクローンを用いた。これらのトランスジェニック
マウスは、高脂肪食に対して重篤なアテローム性動脈硬化症の病変を発症する。
（Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｈｕｙｎｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５ ９
５：２２４６−２２５７）。従って、この動物モデルおよびＤａｖｉｄｓｏｎら
（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９８ ４：９３４−９３８）によって
開発された類似のモデルは、脂質代謝および脂質貯蔵、ならびにアテローム性動
脈硬化症への脂質モジュレーターの影響を研究するために有用である。これらの
動物モデルはまた、脂質代謝および脂質貯蔵、ならびにアテローム性動脈硬化症
への脂質モジュレーターの有効性を試験するのに有用である。アテローム性動脈
硬化症の他の動物モデル（例えば、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスおよびＬＤ
Ｌレセプター欠損マウス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６ ２７２：６８５−６８８
））は、脂質代謝および脂質貯蔵、ならびにアテローム性動脈硬化症への脂質モ
ジュレーターの有効性を試験するのに有用である。

【０２１７】 （Ｂ．治療学的適用） 治療学的適用において、本明細書中に記載されるヘッジホッグアゴニストおよ
びヘッジホッグアンタゴニストのような脂質モジュレーターは、一般的使用に適
した様式で使用され、そして全身投与および局所投与を含む、種々の多数の投与
において処方され得る。技術および処方は、一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡに見出され得る。全身投与について、注射
が好ましく、これは、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含む。アゴニストま
たはアンタゴニストのいずれかの液体溶液が処方され得、好ましくは、ハンクス
液またはリンガー液のような生理学的に適合性のキャリア中で処方され得る。凍
結乾燥形態もまた、含まれる。

【０２１８】 特に、治療に用いられるべき脂質モジュレーターが処方され、そして投薬は、
処置すべき障害、個々の患者の状態、単離されたポリペプチドの送達の部位、投
与の方法、および開業医に公知の他の因子を考慮して、適した医療行為に合わせ
た様式で確立される。本発明の脂質モジュレーターの治療学的な投与は、好まし
くは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、関節内注射、滑膜内注射、胸骨内注
射、鞘内注射、肝臓内注射、病巣内注射および頭蓋内注射、または輸液技術を含
む、非経口送達を介する。代替的な経路としては、錠剤など、液剤のための市販
の噴霧器、および乾燥粉末、凍結乾燥化リポソームまたはエアロゾル化リポソー
ムの吸入が挙げられる。液剤は、粉末処方物からの再構成後に利用され得るか、
または開発されて局所投与のためのクリームとなり得る。

【０２１９】 本明細書中に記載される脂質モジュレーターは、薬学的に受容可能なキャリア
を含む薬学的滅菌組成物として投与され得る。これは、水、生理食塩水、リン酸
緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール、イオン交換体、アル
ミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血
清アルブミン）、緩衝液基質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソ
ルビン酸カリウム、部分的なグリセリド混合物の植物性飽和脂肪酸、水、塩また
は電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カ
リウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、
ポリビニルピロリドン、セルロースベース基質、ポリエチレングリコール、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレ
ン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび
羊毛脂などか、あるいはこれらの組み合わせのような多数の周知のキャリアのい
ずれかであり得る。

【０２２０】 投与された用量は、医師に周知のとおり、用いられる脂質モジュレーターの特
性（例えば、その結合活性およびインビボでの血漿の半減期、処方物中の脂質モ
ジュレーターの濃度、投与経路、投薬の部位および割合、関係する患者の臨床的
な寛容、患者を冒す病理学的条件など）に依存する。一般に、１投与につき１患
者当たり約０．５×１０^-6Ｍ以下のタンパク質の用量が好ましいが、この投薬量
は、タンパク質の性質に確かに依存する。異なる投薬量が、一連の連続投与の間
に利用され得る。

【０２２１】 ヘッジホッグシグナル伝達経路は、脂質の代謝および貯蔵ならびに関係する分
子において役割を果たすことが、本明細書と共に含まれる実験から明らかである
。本発明の脂質モジュレーターは、ヘッジホッグタンパク質の異常な発現によっ
て特徴づけられるこれらの医学的状態を処置するために特に有用であり得るか、
あるいはより一般には、ヘッジホッグシグナル伝達経路をアゴナイズするか、ま
たはアンタゴナイズするかのいずれかによって、変化することが望ましい任意の
状態を処置するために特に有効であり得る。

【０２２２】 治療学的な状況における本発明の脂質モジュレーターの適用の１つの例である
が、アゴニストまたはアンタゴニストのような脂質モジュレーターは、胃腸管の
種々の脂質代謝障害または脂質貯蔵障害に罹患する患者へ投与され得る。特定の
脂質モジュレーターは、アポリポタンパク質発現の調節に関与し得る。従って、
本発明の脂質モジュレーターは、例えば、脂質輸送欠損、食事誘発高コレステロ
ール血症、肥満症、および血漿コレステロールの低下の処置において有用であり
得る。

【０２２３】 本発明の脂質モジュレーターはまた処方され、そして検出マーカー（例えば、
蛍光透視で不透明な物質または放射線写真撮影で不透明な物質）に連結されて、
そして組織の画像化を可能にするために、被験体へ投与され得る。脂質モジュレ
ーターはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼのような基質へ結合し得る。西洋ワ
サビペルオキシダーゼは、組織学的な切片上のヘッジホッグリガンド陽性細胞の
領域の可視化を可能にするために、免疫細胞化学染色剤として用いられ得る。

【０２２４】 （Ｂ．遺伝子治療） 本発明の脂質モジュレーターはまた、これらの脂質モジュレーターをコードす
るポリヌクレオチドを送達するために、遺伝子治療プロトコールの一部として用
いられ得る。本発明は、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達経路の機能を変化さ
せるために、インビボでのトランスフェクションのための発現ベクターおよび特
定の細胞型における脂質モジュレーターの発現を特徴とする。脂質モジュレータ
ーの発現構築物は、任意の生物学的に有効なキャリア（例えば、インビボで、細
胞に脂質モジュレーターを有効に送達し得る任意の処方物または組成物）で投与
され得る。

【０２２５】 アプローチとしては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウ
イルス、および単純ヘルペスウイルス１、または組換え細菌プラスミドもしくは
組換え真核生物プラスミドを含むウイルスベクター中の本遺伝子の挿入が挙げら
れる。ウイルスベクターは、細胞に直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡ
は、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）またはカチオン性リポソ
ーム誘導体（例えば、抗体結合体化物）、ポリリジン結合体、グラミシジンＳ、
人工ウイルスエンベロープまたはこのような他の細胞内キャリア、ならびにイン
ビボで行われる遺伝子構築物もしくはＣａＰＯ₄沈殿物の直接注入を用いて送達
され得る。

【０２２６】 細胞へポリヌクレオチドをインビボで導入するための好ましいアプローチは、
所望の脂質モジュレーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば
、ＣＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使用によるアプローチである。ウイルス
ベクターを用いる細胞の感染は、大量の標的細胞にポリヌクレオチドを与え得る
という利点を有する。さらに、ウイルスベクター中に（例えば、ウイルスベクタ
ー中に含まれるＣＤＮＡによって）コードされる分子は、ウイルスベクターポリ
ヌクレオチドを取り込んだ細胞中で効率的に発現される。

【０２２７】 種々のウイルスベクターは、インビボで外来遺伝子の（特にヒトへの）移入の
ための組換え遺伝子送達システムとして用いられ得る。これらのベクターは、細
胞への遺伝子の効率的な送達を提供し、そして移入されたポリヌクレオチドは、
宿主の染色体ＤＮＡへ安定に組み込まれ得る。総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，
Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照のこと）。組換えレトロ
ウイルスを産生するためのプロトコール、およびこのようなウイルスを用いて、
インビトロまたはインビボで細胞を感染するためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕ
ｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅ，（１９８９），第９．１０−９．１４節、および他の標準的な実
験マニュアルにおいて見出され得る。適切なレトロウイルスの例は、当業者に周
知である。環境栄養性レトロウイルス系および両栄養性レトロウイルス系の両方
を調製するための適切なパッケージングウイルス株の例としては、Ｃｒｉｐ、Ｃ
ｒｅ２およびＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／または
インビボでの上皮細胞を含む多くの異なる細胞型へと種々の遺伝子を導入するた
めに使用されている。例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；
Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら（
１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−
８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９
９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−７６
４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４
１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許
第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８
９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２
／０７５７３を参照のこと。

【０２２８】 本発明に有用な別のウイルス遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベク
ターを利用する。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８
：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはア
デノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切
なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、
これらが非分裂細胞に感染し得ないという点で特定の環境下で有利であり得、そ
して上皮細胞を含む広汎な種々の細胞型に感染させるために用いられ得る。Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、前出、を参照のこと。

【０２２９】 脂質モジュレーターの送達のために有用ななお別のウイルスベクター系は、ア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスま
たはヘルペスウイルスのような別のウイルスを、効率的な複製および生産ライフ
サイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠損ウイ
ルスである。総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２
９を参照のこと。種々のポリヌクレオチドが、ＡＡＶベクターを用いて異なる細
胞型へと導入されている。例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓ
ｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１
；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３
２−３９；Ｔｒａｎｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−
６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：
３７８１−３７９０、を参照のこと。

【０２３０】 上に例証される方法のようなウイルス移入法に加えて、非ウイルス方法もまた
、用いられて、動物の組織における脂質モジュレーターの発現をもたらし得る。
殆どの非ウイルス性の遺伝子移入法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のた
めに哺乳動物細胞によって用いられる通常の機構に依存する。好ましい実施態様
において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、標的細胞による本脂質
モジュレーター遺伝子の取り込みのための細胞内経路に依存する。この型の例示
的遺伝子送達システムとしては、リポソーム由来のシステム、ポリリジン結合体
、および人工ウイルスエンベロープ、ならびにｔａｔタンパク質由来の結合体が
挙げられる。米国特許第５，７４７，６４１号を参照のこと。代表的な実施態様
において、アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に正電荷を
有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中にエントラップされ得、そして
（必要に応じて）これは、標的組織の細胞表面抗原に対して抗体を用いてタグ化
される（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９号；平成１０年特許出願第４７３８１
号および欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４３０７５）。

【０２３１】 臨床学的背景において、治療学的脂質モジュレーターのための遺伝子送達シス
テムは、多くの方法のいずれかによって患者へ導入され得る。これらの各々は、
当該分野で周知である。例えば、この遺伝子送達システムの薬学的調製物は、（
例えば、静脈内注射によって）全身に投与され得、そして標的細胞中のタンパク
質の特定の形質導入が、主に、遺伝子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を
制御する転写調節配列に起因する細胞型発現または組織型発現、あるいはそれら
の組み合わせによって提供されるトランスフェクションから生じる。他の実施態
様において、組換え遺伝子の最初の送達は、完全に局在化される動物への導入に
よって、より限定される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（米国特
許第５，３２８，４７０号）によってか、または定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ
ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４
−３０５７）によって導入され得る。

【０２３２】 遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、受容可能な希釈剤による遺伝子送達シス
テムで本質的に構成され得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放
性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達システムが、組換え細
胞からインタクトに生成され得る（例えば、レトロウイルスベクター）場合、薬
学的調製物は、遺伝子送達システムを生成する１つ以上の細胞を含み得る。

【０２３３】 （例示） ここに一般的に記載される本発明は、単に本発明の特定の局面および実施態様
の例示の目的のために含まれ、そして本発明を限定することを意図しない以下の
実施例を参照することによって、より容易に理解される。

【０２３４】 （実施例１：材料および方法） （１．１ 動物飼育および処置） 妊娠マウス（Ｃ５７ＢＬ／６またはＢＡＬＢ／ｃ）は、購入するか（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）、または
Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．でのマウス施設において交配するかのいずれかである。
Ｅ１２．５妊娠の妊娠マウスに、ｉ．ｖ．注射により２日おきに１回、２００μ
ｇの抗体を注射する（６ｍｇ／ｋｇ）。続いて、生まれた子孫に、屠殺する時ま
で、２日おきに１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（３ｍｇ／ｋｇ）を与え続ける。
いくつかの実験において、マウスは、生後１回だけ（出生後１日）注射を受け、
そして上記の出生前の注射と同じ注射レジメに従った。

【０２３５】 出生後にのみ処置を受けた成体マウスでの実験において、２０匹のＢＡＬＢ／
ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ Ｍａｉｎｅ）を
各々含む２つのグループを、標準的な研究室の条件下で維持した。２つのグルー
プを、処置に依存して２つの主なセクションに分けた。Ａグループのマウスは、
ヘッジホッグアンタゴニストで処置し、一方Ｂグループは、ヘッジホッグアゴニ
ストで処置する。アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかで、Ａグループお
よびＢグループに対して完了された全ての注射は、８ｍｇ／ｋｇである。各グル
ープ（ＡおよびＢ）を、各々５匹ずつの４つのセクション（グループＡ１、Ａ２
、Ａ３およびＡ４；Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４）にさらに分ける。グループＡ
１およびＢ１は、低脂肪食（脂肪５％）を与え、そしてコントロール試薬を注射
する（ＩＰ）。グループＡ２およびＢ２は、低脂肪食を与え、そしてヘッジホッ
グアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかを注射する（ＩＰ）。グループＡ
３およびＢ３は、高脂肪食（脂肪２０％）を与え、そしてコントロール試薬を注
射する。グループＡ４およびＢ４は、高脂肪食を与え、そしてへッジホッグアン
タゴニストまたはアゴニストを注射した（ＩＰ）。マウスは、引き続き８週間注
射を受ける。

【０２３６】 屠殺後、ＧＩ管（十二指腸、空腸、回腸および盲腸）を取り出し、そしてホル
マリン中に固定した。十二指腸、空腸、回腸および盲腸の５μｍの薄さのパラフ
ィン包埋切片を調製し、そしてヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）に
供する（Ｌｕｎａ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉ
ｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；３８−４０頁 １９６０）。

【０２３７】 ＧＩ管のサンプルをまた、電子顕微鏡分析に供す。詳細には、５ｍｍのＧＩ管
のサンプル（十二指腸、空腸、回腸および盲腸）を１．２５％ホルムアルデヒド
、２．５％グルタルアルデヒド、０．０３％ピクリン酸、１００ｍＭカコジレー
ト緩衝液（ｐＨ＝７．２）で、室温にて２時間固定し、次いで洗浄し、そしてＥ
Ｍ分析のためにＰＢＳで置き換えた。腸細胞中に脂質分子の蓄積が存在するか否
かを決定するために、オイルレッドＯ分析を実施する。この染色の型は、脂質分
子（例えば、トリグリセリドおよびコレステリルオレアート）の検出に指向する
（Ｌｕｎａ、同上、１８７）。オイルレッドＯ分析のために、約４μｍの空腸の
細胞切片（ｃｙｒｏｓｅｃｔｉｏｎ）を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（
ｐＨ＝７．０）で５分間固定し、そしてＰＢＳで５分間３回リンスする。次いで
、切片を１００％のプロピレングリコールと共に２分間、室温にてインキュベー
トし、次いで、０．５％オイルレッドＯ／１００％プロピレングリコールで３０
分間室温にてインキュベートし、次いで、８５％プロピレングリコールで１分間
室温にてインキュベートし、ｄｄＨ₂Ｏで５分間５回洗浄する。ｍＡｂ ５Ｅ１
処置した切片を、Ｍａｙｅｒｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで２分間対比染色し、
水道水で洗浄し、そしてＣｒｙｓｔａｌ／Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒ
ｐ．）でマウントする。特定のマウス胚の腸組織をＯＣＴ^TM培地（Ｔｉｓｓｕｅ
−Ｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に包埋し、そして免疫化
学を、注射した抗体の結合パターンを検出するために実施する。コントロールの
ｍａｂ １Ｅ６ではなく抗ヘッジホッグｍａｂ ５Ｅ１のみが、腸の上皮層に特
異的に結合した（本明細書には写真を示さない）。

【０２３８】 さらなる実験において、βガラクトシダーゼ遺伝子の発現がパッチするための
プロモーター（ヘッジホッグのレセプター）によって制御されるマウスに、コン
トロールｍａｂ １Ｅ６または抗ヘッジホッグ５Ｅ１のいずれかで、出生後８、
１０、１２日に注射する。マウスを１４日で屠殺し、その時点で回腸、盲腸およ
び結腸を回収し、そして全マウントをｘ−ｇａｌ染色に供し、切断し、そしてエ
オシン染色に供する。本発明者らは、パッチの発現レベル（ｘ−ｇａｌ染色の強
度によって反映される）が、コントロール処置したマウスと比べて５Ｅ１処置し
た細胞において減少していることを見いだした（本明細書には写真を示さず）。
これは、５Ｅ１ ｍａｂによるヘッジホッグシグナル伝達経路の特異的な調節を
示す。

【０２３９】 （１．２ 議論） ｍＡｂ ５Ｅ１で処置したマウスは、一般的に、成長に対するその不全および
若死ににより証明されるように、ＧＩ管に位置する脂質代謝障害を示した。Ｅ１
２．５妊娠の妊娠マウスを、ブロッキング抗ｈｈモノクローナル抗体で２日おき
に１回静脈内に注射した（６ｍｇ／ｋｇ）。誕生後、子孫は、ｍＡｂ腹腔内（Ｉ
Ｐ）（３ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに、屠殺する時まで受け続けた。１Ｅ６注射マ
ウスと比較して、３日目、６日目の５Ｅ１注射マウスは、進行性の成長障害が明
らかであった（写真は明細書には示さない）。別の実験において、ブロッキング
ｍＡｂ ５Ｅ１を注射した新生仔マウス（１日）もまた、コントロール１Ｅ６
ｍＡｂ注射マウスと比較して、１４日までに成長障害を示した（写真は本明細書
には示さない）。従って、５Ｅ１での出生前（Ｅ１２〜Ｅ１８）処置および出生
後（ＮＢから３日まで）処置の両方は、成長不全、成長障害、下痢、および離乳
前の死を生じた。

【０２４０】 組織学的分析は、誕生後および老齢のマウスにおいてのみ、胃腸管の上皮細胞
（腸細胞）において突出した先端および原子核内液胞の形成を示した（写真は本
明細書には示さない）。ＧＩ管の他の細胞型および他の主要な器官の組織構造は
、２人の病理学者によって評価されたとおり、組織学的に正常であるようであっ
た。詳細には、腸細胞の液胞形成を、ＥＭ分析により確認した。正常なパッチ−
１レセプターを有する筋線維芽細胞が、存在した。さらに、上皮細胞表面への腸
細胞前駆体の再生および移動が、パルス−チェイスＢｒｄＵ標識により確認され
たように生じた。ＴＵＮＥＬアッセイは、細胞死速度の増加を示さなかった。最
終的に、これらの液胞でのＰＡＳのネガティブ染色は、上皮／杯細胞の発育系統
の関係付けが厳密に生じることを示唆した。

【０２４１】 詳細には、出生後２日（Ｄ２）から開始して、その後屠殺の時まで１日おきに
ｍＡｂ注射を受けた、出生後マウス（１７日）のＧＩ管組織切片のヘマトキシリ
ン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、ブロッキング抗ｈｈ ｍＡｂ ５Ｅ１処置され
たＧＩ管切片においてのみ腸細胞の液胞形成を示し、そしてコントロール１Ｅ６
処置した切片においては示されなかった（写真は本明細書には示さない）。マウ
スに、出生後１日でｍＡｂでの注射を開始し、そしてＧＩ管の代表的な回腸およ
び盲腸の領域を電子顕微鏡（ＥＭ）分析に供した場合、腸細胞の液胞形成は、ブ
ロッキングｍＡｂ ５Ｅ１処置された腸細胞においてのみ１１日から１５日で見
られるが、ｍＡｂ １Ｅ６コントロールでは見られない（写真は本明細書には示
さない）。これらの同じマウスにおいて、脂質（トリグリセリドおよびコレステ
リルオレアート）を染色するためにオイルレッドＯを用いる分析は、オイルレッ
ドＯ陽性脂質で占められたブロッキング抗ｈｈ ｍＡｂ ５Ｅ１処置マウスの腸
細胞での液胞形成とは対照的に、コントロールｍＡｂ １Ｅ６処置した腸細胞に
沿って、分散した断続的なオイルレッドＯ染色のみを示した（写真は明細書には
示さない）。

【０２４２】 （実施例２：ヘッジホッグアンタゴニストの調節効果に対するマウス被験体の
体重減少の評価） ３週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）および１６週齢のＢＬ／６マウス（ｎ
＝４）に、コントロール１Ｅ６ ｍａｂまたはヘッジホッグアンタゴニスト５Ｅ
１ ｍａｂ（８ｍｇ／ｋｇ；３回／週）で１８週間注射する。マウスを、抗体処
置の開始時から固形飼料または高脂肪食（脂肪１９．２％）のいずれかに供した
。体重を、毎週測定し、そして処置後最初の週の体重と比較した、体重変化のパ
ーセンテージを図１に示す。抗ヘッジホッグ５Ｅ１処置グループにおいてのみ、
高脂肪食依存体重減少が存在する。脂質の蓄積（オイル染色により証明されるよ
うに）は、このグループのマウスにおいてのみ観察された。

【０２４３】 （実施例３：肥満マウスに対するヘッジホッグアンタゴニストの調節効果の評
価） レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）遺伝子の変異を有する肥満マウスの系統を、Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から得
る。６週齢の肥満マウスを、１Ｅ６ ｍａｂまたは５Ｅ１ ｍａｂ（１０ｍｇ／
ｋｇ；３回／週）で８週間処置し、そして各注射前に体重を測定した（図２）。
体重を、最初の注射前の動物の元々の体重と比較した体重変化のパーセンテージ
として示す。ヘッジホッグアンタゴニストでの処置は、肥満マウスにおいて有意
な体重減少を示した。

【０２４４】 （実施例４：アポリポタンパク質不全およびアテローム硬化症傾向のあるマウ
スに対するヘッジホッグアンタゴニストまたはアゴニストの調節効果の評価） 各々１５のアテローム発生傾向、Ａｐｏ−Ｅ不全マウス（８週齢）を有する８
つのグループを、標準的な研究室の条件下で維持する。処置は、以下である： グループ１（ｎ＝１５）、低脂肪食条件下で、そして２００μｇのコントロール
Ａｂで注射（ｉ．ｐ．）したマウス； グループ２（ｎ＝１５）、低脂肪食条件下で、そして２００μｇの抗ｈｈ ｍＡ
ｂで注射（ｉ．ｐ．）したマウス； グループ３（ｎ＝１５）、高脂肪食条件下で、そして２００μｇのコントロール
Ａｂで注射（ｉ．ｐ．）したマウス；および、 グループ４（ｎ＝１５）、高脂肪食条件下で、そして２００μｇの抗ｈｈ ｍＡ
ｂで注射（ｉ．ｐ．）したマウス； グループ５（ｎ＝１５）、高脂肪食条件下で、そして２００μｇのヘッジホッグ
アゴニストで注射（ｉ．ｐ．）したマウス；および、 グループ６（ｎ＝１５）、高脂肪食条件下で、そしてヘッジホッグアゴニストに
対するコントロール試薬で注射（ｉ．ｐ．）したマウス；および グループ７（ｎ＝１５）、低脂肪食条件下で、そして２００μｇのヘッジホッグ
アゴニストで注射（ｉ．ｐ．）したマウス；ならびに、 グループ８（ｎ＝１５）、低脂肪食条件下で、そしてヘッジホッグアゴニストに
対するコントロール試薬で注射（ｉ．ｐ．）したマウス。

【０２４５】 ｍＡｂは、１日おきに投与されるが、一方ヘッジホッグアゴニストは、毎日投
与される。低脂肪食とは、標準的な固形飼料（５％脂肪）をいい、高脂肪（アテ
ローム発生）食を、ＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）か
ら購入する（１７．８％脂肪および１．２３％コレステロールなど）。注射およ
び高脂肪食の両方の処置を、１８週間続け、その時点でマウスを屠殺する。屠殺
後、大動脈を取り出し、そしてホルマリンで固定し、そしてスダンＩＶで染色し
、そしてアテローム硬化症のプラーク領域を測定する。組織の組織病理学的試験
を、Ｈ＆Ｅセクションに対しても行なう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ３週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）および１６週齢のＢＬ／６マウス（ｎ
＝４）に、コントロール１Ｅ６ ｍａｂまたはヘッジホッグアンタゴニスト５Ｅ
１ ｍａｂ（８ｍｇ／ｋｇ；１週間に３回）を、１８週間にわたって注射した。
マウスを、抗体処置の開始時から固形飼料食餌または高脂肪食餌（１９．２％脂
肪）のいずれかに供した。体重を毎週測定し、そして処置後の第一週の体重に比
較した体重変化のパーセンテージとして示す。

【図２】 ６週齢の肥満マウスを、１Ｅ６ ｍａｂまたは５Ｅ１ ｍａｂ（１０ｍｇ／ｋ
ｂ；１週間に３回）で、６週間にわたって処置し、そして体重を各注射前に測定
した。体重を、第一回の注射前のその動物のもとの体重に比較した体重変化のパ
ーセンテージとして示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/02 Ａ６１Ｐ 3/02 １０２ １０２ 3/04 3/04 3/06 3/06 9/10 9/10 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ワン， リ チュン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01536， ノース グラフトン， オール ド ウエストボロ ロード 177 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 BA80 CA04 EA02 GA11 HA17 4C084 AA02 AA17 BA44 DB63 NA14 ZA45 ZA70 ZC21 ZC22 ZC23 ZC29 ZC33 ZC41 ZC42 4C085 AA13 BB11 CC21 EE01

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物において脂質代謝を調節するための方法であって、以下
   ： （ａ）ヘッジホッグアンタゴニスト；および （ｂ）ヘッジホッグアゴニスト、 からなる群より選択される脂質モジュレーターの薬学的有効量を投与する工程を
   包含する、方法。
2. 【請求項２】 動物において腸上皮細胞における液胞形成を調節する方法で
   あって、以下： （ａ）ヘッジホッグアンタゴニスト；および （ｂ）ヘッジホッグアゴニスト、 からなる群より選択される脂質モジュレーターの薬学的有効量を該細胞に投与す
   る工程を包含する、方法。
3. 【請求項３】 動物において腸上皮細胞における脂質の蓄積を調節するため
   の方法であって、以下： （ａ）ヘッジホッグアンタゴニスト；および （ｂ）ヘッジホッグアゴニスト、 からなる群より選択される脂質モジュレーターの薬学的有効量を投与する工程を
   包含する、方法。
4. 【請求項４】 動物におけるコレステロール障害を処置する方法であって、
   以下： （ａ）ヘッジホッグアンタゴニスト；および （ｂ）ヘッジホッグアゴニスト、 からなる群より選択される脂質モジュレーターの薬学的有効量を投与する工程を
   包含する、方法。
5. 【請求項５】 動物における脂質代謝障害を処置する方法であって、以下： （ａ）ヘッジホッグアンタゴニスト；および （ｂ）ヘッジホッグアゴニスト、 からなる群より選択される脂質モジュレーターの薬学的有効量を投与する工程を
   包含する、方法。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、前記脂質代謝障害が以下： （ａ）脂質貯蔵障害； （ｂ）脂質輸送障害； （ｃ）アポリポタンパク質障害； （ｄ）トリグリセリド障害； （ｅ）食餌誘発性高コレステロール血症； （ｆ）高コレステロール血症； （ｇ）無βリポタンパク質血症； （ｈ）低βリポタンパク質血症； （ｉ）カイロミクロン蓄積障害； （ｊ）アンダーソン病； （ｋ）脂肪吸収障害； （ｌ）正常トリグリセリド性無βリポタンパク質血症 （ｍ）アポＢ１００欠損症； （ｎ）脂溶性ビタミン障害；および （ｏ）アテローム性硬化症、 からなる群より選択される、方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、前記脂肪吸収障害が肥満で
   ある、方法。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法であって、前記脂肪吸収障害が体重減
   少に関連する、方法。
9. 【請求項９】 請求項６に記載の方法であって、前記脂溶性ビタミンがビタ
   ミンＡである、方法。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載の方法であって、前記脂溶性ビタミンがビ
    タミンＥである、方法。
11. 【請求項１１】 請求項６に記載の方法であって、前記トリグリセリド障害
    が以下： （ａ）トリグリセリド代謝障害； （ｂ）トリグリセリド輸送障害；および （ｃ）トリグリセリド貯蔵障害、 からなる群より選択される、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前
    記ヘッジホッグアンタゴニストがヘッジホッグレセプターに結合するが、応答を
    誘発せず、そして以下： （ａ）ヘッジホッグ模倣体、またはその活性フラグメント； （ｂ）改変されたヘッジホッグタンパク質、またはその活性フラグメント；お
    よび （ｃ）抗ヘッジホッグホモログ、 からなる群より選択される、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前記抗ヘッジホッグホ
    モログが以下： （ａ）ヒト抗体またはその活性フラグメント； （ｂ）キメラ抗体またはその活性フラグメント；および （ｃ）ヒト化抗体またはその活性フラグメント、 からなる群より選択される、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前
    記ヘッジホッグアンタゴニストが、ヘッジホッグレセプターに結合するが、ヘッ
    ジホッグ媒介性シグナル伝達を誘発しない不活性ヘッジホッグ改変体である、方
    法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前
    記動物が哺乳動物である、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前記哺乳動物がヒトで
    ある、方法。