JP2002535620A

JP2002535620A - 磁性粒子を使用する精製方法

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Publication number: JP2002535620A
Application number: JP2000593954A
Authority: JP
Inventors: セパネン、ヘレナ; パロマキ、ペッカ; ツウナネン、ユッカ; カルメニエミ、ティモ
Original assignee: サーモラブシステムズオイ
Priority date: 1999-01-18
Filing date: 2000-01-18
Publication date: 2002-10-22
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: JP3546410B2; ATE298087T1; WO2000042432A1; RU2239192C2; DE60020810T2; NO20013541L; NO20013541D0; EP1145010B1; FI990082A0; EP1145010A1; DE60020810D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、磁性粒子であって該粒子に結合する試薬で処理された磁性粒子による物質の精製方法に関する。第一の媒質における結合反応の後、前記粒子およびそれらに結合された物質は分離されそして第二の媒質に移される。本発明によれば、前記粒子が媒質から分離される前に表面張力除去剤が少なくとも前記媒質に分配される。これにより粒子の完全な収集を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、混合物から物質を特異的に結合する磁性粒子を使用するの生物物質
の精製に関する。本発明は例えば、核酸ＤＮＡまたはＲＮＡを精製するために使
用できる。

【０００２】磁性粒子は所望の生物物質と特異的に反応する分離試薬で被覆することができ
る。前記粒子および結合された物質は混合物から分離され、そしてその後該物質
はさらに次の操作遂行のため前記粒子から離される。現今これは、実際には磁石
により粒子を混合物を含む容器の壁に対して引き寄せ、そして液体は容器から流
し出されるかまたは吸い出される。その後新しい液体を容器に分配することがで
きる。このような分離技術に対する手動装置または自動装置はまた、商業的に入
手可能である（例えば、セフェロテック社（Spherotec,Inc.）のオートマグプロ
セッサ（AutoMag Processor）（アメリカ合衆国）、メルクマグネティックラッ
ク（Merck Magnetic Rack）（ドイツ、ダルムシュタット）、パーセプティブバ
イオシステムズ９６ウェルプレートセパレータ(PerSeptive Biosystems 96 well
plate separator), マルチ−６セパレータ（Multi-6 Separator）、ソロ−セプ
セパレータ(Solo-Sep Separator)（アメリカ合衆国）,ダイナルマグネティッ
クパーティクルズコンセントレーターズ（Dynal Magnetic Particles Concentra
tors)）。

【０００３】旧式のＤＮＡ精製技術は濃厚な塩化セシウム勾配中における超遠心分離を必要
とした。しかし、上述した磁性粒子技術もまた核酸の精製に使用されている。

【０００４】、ＷＯ９４／１８５６５（ラブシステムズオイ(Labsystems OY)）は、磁性粒
子が、垂直穴中で移動可能でかつその下端部に磁石を備えたロッドを含むプロー
ブによって混合物から分離可能な、磁性粒子特異結合アッセイ（magnetic parti
cle specific binding assay)のための方法および装置を提案する。前記プロー
ブは、低位置にあるロッドとともに混合物中に押し入れられ、そこで粒子はプロ
ーブ上に収集される。次いでプローブを他の容器に移動しそしてそのロッドはそ
の高位置に引き上げられ、そこで粒子が離される。従って、アッセイの全ての段
階は液体を移動することなく別の容器で行うことができる。最後の容器では測定
が実施される。

【０００５】、ＷＯ９６／１２９５９（ラブシステムズオイ）は、凹状に先細にされた先端
部を有する細長い本体よりなる磁性粒子移動器具を提案する。前記本体は、該本
体の先端に粒子を収集するための縦方向の磁場を備えるための手段をさらに含む
。前記磁場は前記粒子を放出するため除去できる。この器具は特に、大容積から
粒子を収集し、そして非常に少ない容積中にそれを放出するのに使用できる。

【０００６】発明の概括的説明請求項１に記載された方法がいまや発明された。この発明の幾つかの好ましい
態様は他の請求項において規定されている。

【０００７】本発明によれば、精製されるべき材料は、材料のための結合試薬で被覆された
磁性粒子を含む第一の媒質に、分配される。結合反応が行われ、その後該粒子は
磁気プローブにより分離され、そして第二の媒質に移動され、そこで精製のため
に必要な所望の他の反応を行うことができる。粒子は、精製方法のより先の段階
を遂行するために他の媒質を介して同様に移動することができる。粒子が容器中
に移される場合、全ての容器は必要な反応媒質を前もって含むことができる。好
ましくは粒子はまた第二およびその次の媒質においてプローブから放出される。

【０００８】本発明によれば、媒質の少なくとも一つは表面張力除去剤（surface tension
releasing agent）を含む。これは粒子の完全な収集を促進する。

【０００９】これらの薬剤の幾つかは、この分離されるべき物質の結合を促進することに関
連して以前から使用されている。例えばWipat et al.,Microbiology (1994), 14
0, 2067を参照。これらの公知の方法では、粒子は容器から他の容器へ移されず
、しかし、それらは外側にある磁石によって容器の壁に保持され、同時に媒質は
容器から除去される。

【００１０】本発明は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）および
ｍＲＮＡのような核酸を精製するために、特別に使用できる。

【００１１】［図面の簡単な説明］添付された図面は記載された明細書の一部となる。図１は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェント
の効果を示す。図２は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示す。図３は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示す。図４は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果
を示す。

【００１２】発明の詳細な説明本発明は例えば細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質および、
特に核酸材料の精製のために使用できる。

【００１３】磁性粒子は好ましくは常磁性体である。粒子の大きさは通常５０μｍより小さ
く、好ましくは０．１ないし１０μｍ、および最も好ましくは１ないし５μｍで
ある。粒子の濃度は例えば０．０１ないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５な
いし３ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは０．２ないし２ｍｇ／ｍｌである。

【００１４】粒子は結合試薬、例えばシリコン、レクチンによりおよび／または、オリゴヌ
クレオチド、抗体、抗原、ストレプトアビジンまたはビオチンのような他の反応
性官能性グループにより被覆されまたは処理されている。

【００１５】粒子はまた、好ましくは、垂直方向の穴中で移動可能で、かつその下端部に磁
石を備えたロッドを含むプローブを使用することによって一つの容器から他の容
器へ移される。プローブは低位置あるロッドとともに混合物中に押し込まれ、そ
れにより粒子がプローブ上に収集される。次いでプローブは他の容器に移され、
そして前記ロッドが該プローブの高位置に引き上げられた時に、前記粒子が放出
される。

【００１６】様々な種類の表面張力除去化合物、特に水溶性化合物を、上記方法に使用でき
る。それらの例は以下のものである：Ａ．界面活性剤（tenside）、例えば − セッケン − ディタージェント；アニオン性、カチオン性、非イオン性および両性イオ
ン性化合物Ｂ．アルコール、例えば − ポリエチレンおよびポリビニルアルコールおよびそれらのタンパク質等の
誘導体。Ｃ．タンパク質Ｄ．高濃度の塩および炭化水素例えば − ＮａＣｌ − サッカロース化合物の混合物もまた使用できる。

【００１７】特にディタージェントような界面活性剤が好ましい。好ましいディタージェン
トはエトキシル化無水ソルビトールエステルである。該エステルは例えば約４な
いし２０個のエチレンオキシド基を含む。

【００１８】界面活性剤の濃度は例えば０．００１ないし０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは
０．００５ないし０．１％（ｗ／ｖ）、および最も好ましくは０．０１ないし０
．０５％（ｗ／ｖ）であってよい。タンパク質の濃度は例えば０．１ないし１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２
５ないし５％（ｗ／ｖ）、および最も好ましくは０．５ないし２％（ｗ／ｖ）で
あってよい。塩の濃度は例えば０．１ないし１０Ｍ、好ましくは０．１ないし７
Ｍであってよい。

【００１９】異なる供給源からのＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、ＰＣＲ増幅からのＤＮＡ
；血液、骨髄、培養細胞からのＤＮＡ；真核生物の全ＲＮＡからのまたは動物組
織、細胞および植物の粗抽出物からのｍＲＮＡ）の精製のために、核酸は磁性粒
子を使用して固定化される。結合はストレプトアビジンおよびビオチンの相互作
用により媒介でき、それによりストレプトアビジンで被覆された粒子およびビオ
チニル化された（biotinyled）ＤＮＡが使用できる。加えて、ＤＮＡは粒子の表
面に吸着できる。ｍＲＮＡの結合は粒子の表面と共有結合的に共役されるオリゴ
(Oligo)（ｄＴ）₂₅によって媒介することができる。

【００２０】固定化の後、増幅または他の汚染物および例えばＰＣＲインヒビターから生じ
る反応成分のすべてを除去するように、核酸は数回洗浄される。洗浄は洗浄緩衝液中の複合体を放出しおよび収集することにより、および新ら
しい洗浄緩衝液を含む他のウェルに複合体を移動することにより行われる。

【００２１】一本鎖ＤＮＡ精製のためには固定化された二本鎖ＤＮＡは、０．１ＭＮａＯ
Ｈトとのインキュベーションにより一本鎖に変換できおよび磁性分離を使用でき
る。

【００２２】ｍＲＮＡの単離には低濃度塩緩衝液を使用することにより粒子から溶出するこ
とができる。

【００２３】精製方法は、すべての媒質が別々の容器に用意される、磁性粒子プロッセッサ
によって行うことができる。表面張力除去化合物は好ましくは各々の媒質に使用
される。必要な容器を含む適当な使い捨てのプレート、例えば微量滴定プレート
を使用することができる。一つのプレートで、幾つかの並行精製を成し遂げるこ
とができる。

【００２４】一本鎖ＤＮＡ精製のために使用される試薬例１．例えば、０．１％ＢＳＡ、１５ｍＭＮａＮ₃ならびに、表面張力除去剤
として例えば０．０２％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
（登録商標Ｔｗｅｅｎ２０^TM）を含むホスフェート、トリスまたはボレート緩衝
性塩水、ｐＨ７．４中の粒子懸濁液。２．結合および洗浄緩衝液（ＴＥＮ）：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１５ｍＭＮａ
Ｎ₃、ｐＨ７．５。３．ＴＥ緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、例えば０．
０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１５ｍＭＮａＮ₃、ｐＨ７．５４．融解溶液：０．１ＭＮａＯＨ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM。５．例えば蒸留水中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１５ｍＭＮａＮ₃。

【００２５】ｍＲＮＡ直接精製のために使用される試薬例１．例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TMおよび１５ｍＭＮａＮ₃を含むＰＢ
Ｓ、ｐＨ７．４中のオリゴ（Oligo)（ｄＴ）₂₅粒子懸濁液。２．溶菌／結合緩衝液：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ
ＬｉＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％ＬｉＤＳ、５ｍＭジチオスレイトール（
ＤＴＴ）、１５ｍＭＮａＮ₃、（例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM）。３．ＬｉＤＳ（ＳＤＳ）を伴う洗浄緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、０．１５ＭＬｉＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＬｉＤＳ、１５ｍ
ＭＮａＮ₃、（例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM）。４．洗浄緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５ＭＬｉ
Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１５ｍＭＮ
ａＮ₃。５．溶出溶液：２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１５ｍＭＮａＮ₃、例えば
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM。６．回復溶液：０．１ＭＮａＯＨ、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM ７．貯蔵緩衝液オリゴ（ｄＴ）₂₅：２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２
０ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１５ｍＭＮａＮ₃。

【００２６】ｍＲＮＡ精製のために使用される試薬例１．結合緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．０ＭＬｉＣ
ｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭＮａＮ₃、例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０^TM。２．洗浄緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５ｍＭＬ
ｉＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５ｍＭＮａＮ₃、例えば０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０^TM。５．溶出溶液：２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１５ｍＭＮａＮ₃、例えば
０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TM。

【００２７】ｍＲＮＡ単離のために使用される試薬例１．４Ｍグアニジンイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ
７．０、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０１Ｍβ−メルカプトエタノー
ル。

【００２８】ＤＮＡ直接精製のために使用される試薬例１．１５ｍＭＮａＮ₃を含む溶菌緩衝液中の粒子懸濁液（例えば５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、５０ｍＭＥＤＴＡ、３％ＳＤＳ、１％２−メルカ
プトエタノール；５０ｍＭＫＣｌ、１０−２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．３、０．５Ｔｗｅｅｎ２０^TM、１００μｇ／ｍｌ
プロティナーゼＫ；１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭＥＤＴＡ
、１％ＳＤＳ、５００μｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）２．１５ｍＭＮａＮ₃および例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TMを含む洗
浄緩衝液３．１５ｍＭＮａＮ₃および例えば０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０^TMを含む再
懸濁緩衝液

【００２９】室温における磁性粒子プロセッサによるＰＣＲ生成物の精製方法の例試薬はプレートの次のウェルに分配される。試薬構成の例ウェル１試料（ビオチニル化ＤＮＡ、ＰＣＲアンプリコン）ウェル２洗浄緩衝液中のストレプトアビジンで被覆された磁性粒子ウェル３ないし５洗浄緩衝液ウェル６ＮａＯＨウェル７ＴＥ緩衝液ウェル８蒸留水

【００３０】工程段階の例ウェル２粒子の混合、洗浄および収集、それらのウェル３中への移動ウェル３粒子の洗浄、それらのウェル４中への移動ウェル４粒子の洗浄、それらのウェル１中への移動ウェル１試料のインキュベーション１０分、粒子のウェル４中への移動ウェル４粒子の洗浄、それらのウェル５中への移動ウェル５粒子の洗浄、それらのウェル６中への移動ウェル６融解溶液中でのインキュベーション５分、粒子のウェル４中への移
動ウェル４粒子の洗浄、それらのウェル５中への移動ウェル５粒子の洗浄、それらのウェル７中への移動ウェル７粒子の濯ぎ、それらのウェル８中への移動ウェル８粒子の放出

【００３１】磁性化された粒子の収集および放出段階における表面張力除去剤（ＳＴＲＡ）の効果ストレプトアビジン被覆された磁性粒子（大きさ：サイゲン（Scigen）ストレ
プトアビジン３μｍ；サイゲン（Scigen）社；スフェロ（ＳＰＨＥＲＯ^TM）スト
レプトアビジン４−４．５μｍ、スフェロテック（Spherotec）社、ダイナビー
ズ(Dynabeads) Ｍ−２８０ストレプトアビジン２．８μｍ、ダイナルDynal）社
）を＋３７℃で１時間、ビオチニル化アルカリホスファターゼ（カルバイオケム
社(Calbiochem),カリフォルニア州サンディエゴ）により飽和にする。飽和化さ
れた粒子は最初に結合されていないアルカリホスファターゼを除去するため洗浄
され、次いで磁性粒子プロセッサの収集段階および放出段階におけるＳＴＲＡの
効果を試験するのに使用した。これらの実施例の装置の設定は２０μｌから２０
０μｌまでに調節され、プロセッサの収容力範囲は一回の運転当り１−２４試料
であった。プロセッサはポリプロペンチューブ（外側幅４．５ｍｍ）中のロッド
型磁石（長さ２ｍｍ、幅３ｍｍ、軸方向に磁性化された円筒状のＮｄＦｅＢ）を
利用した。

【００３２】簡単にいえば、粒子は全ての工程が１０段階からなるように、ウェルからウェ
ルへそれらを放出および収集することにより加工された。収集後にウェル中に残
っている粒子の量はアルカリホスフォターゼアッセイにて評価した。各ウェルか
らの試料（１０μｍ）は空の微量滴定プレート（丸底ウェル、幅６．５ｍｍ）に
移された。

【００３３】このアッセイでは、アルカリホスファターゼ飽和化粒子（０．０１６μｇない
し１μｇ粒子／１０μｌ稀釈剤）を標準として使用した。１０μｌの試料および
標準を含むウェル中へジエタノールアミン（ＤＥＡ）緩衝液（ラブシステムズ(L
absystems)製）で稀釈された１００μｌｐＮＰＰ基質を加えた。基質を＋３７
℃で１５分間ラブシステムスｉＥＭＳインキュベータ／シェーカー中で連続的に
振とうした（９００ｒｐｍ）。反応は各々のウェルに１００μｌの１ＭＮａＯ
Ｈを加えることによって停止され、そして４０５ｎｍにおける吸光度を光度計に
て測定した（ラブシステムマルティスカン(Labsystems Multiskan)）。

【００３４】残存する粒子量を一次標準曲線から決定し、そして最終的な結果は粒子の初期
量（０．２ｍｇ／ウェル）の百分率として表す。

【００３５】図１は異なる濃度におけるディタージェント（Ｔｗｅｅｎ２０^TM）の効果を示
す。表面張力除去剤が収集および放出緩衝液中に添加されなかった場合、残存する
粒子（サイゲンストレプトアビジン）の程度は３％／ウェルを超えた。ディタ
ージェント濃度が≧０．００１２５％の場合、粒子は効果的に収集された。図２は収集および放出緩衝液中の塩およびサッカロースの効果を示す。これら
の成分を緩衝液に添加することによって、粒子（サイゲンストレプトアビジン
）の収集はさらに効果的である。図３はある程度粒子（スフェロストレプトアビジン）の収集段階を向上させ
ているタンパク質（カゼイン）の効果を示す。図４は異なる供給元の磁性粒子が使用された場合のディタージェント（Ｔｗｅ
ｅｎ２０^TM）の効果を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェント
の効果を示すグラフである。

【図２】図２は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示すグラ
フである。

【図３】図３は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示すグラフである。

【図４】図４は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果
を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カルメニエミ、ティモフィンランド国、00820 ヘルシンキ、プナヒルカンティエ５アー７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】物質の精製方法であって、 − 前記物質を含む材料、および磁性粒子であって該粒子を前記物質と結合さ
せる試薬で被覆されたまたは処理された磁性粒子を第一の媒質に分配し、 − 結合反応を行わせ、該反応においては前記物質が前記粒子に結合され、そ
して − 磁気プローブを前記媒質中に押し入れ、それにより前記粒子を該プローブ
に付着させ、そして前記プローブを前記粒子および該粒子に結合された前記物質
と一緒に第二の媒質に移し、ならびに所望により、第二の媒質から分離しそして
第三の媒質に移す方法であり、 − 前記プローブおよび前記粒子が媒質から移される前に、表面張力除去剤が
前記媒質の少なくとも１つに、好ましくは少なくとも第一の媒質に、および最も
好ましくは全ての媒質に分配されることを特徴とする方法。
【請求項２】前記表面張力除去剤が界面活性剤、アルコール、タンパク質
または、塩または炭化水素である請求項１記載の方法。
【請求項３】前記表面張力除去剤が、ディタージェントのような界面活性
剤である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】前記界面活性剤の濃度が０．００１ないし０．５％（ｗ／ｖ
）、好ましくは０．００５ないし０．１％（ｗ／ｖ）および最も好ましくは０．
０１ないし０．０５％（ｗ／ｖ）である請求項３記載の方法。
【請求項５】前記表面張力除去剤がタンパク質である請求項１または２記
載の方法。
【請求項６】前記タンパク質の濃度が０．１ないし１０％（ｗ／ｖ）、好
ましくは０．２５ないし５％（ｗ／ｖ）および最も好ましくは０．５ないし２％
（ｗ／ｖ）である請求項５記載の方法。
【請求項７】前記表面張力除去剤が塩である請求項１または２記載の方法
。
【請求項８】前記塩の濃度が０．１ないし１０Ｍ、好ましくは０．１ない
し７Ｍである請求項７記載の方法。
【請求項９】細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質または
核酸材料の精製のための請求項１ないし８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】核酸材料の精製のための請求項９記載の方法。
【請求項１１】前記磁性粒子の大きさが５０μｍより小さい、好ましくは
０．１ないし１０μｍ、および最も好ましくは１ないし５μｍである請求項１な
いし１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】前記磁性粒子の濃度が０．０１ないし５ｍｇ／ｍｌ、好ま
しくは０．０５ないし３ｍｇ／ｍｌおよび最も好ましくは０．２ないし２ｍｇ／
ｍｌである請求項１ないし１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】媒質から磁気プローブによって磁性粒子を分離する方法で
あって、前記粒子を分離する前に、表面張力除去剤を媒質に分配することを特徴
とする方法。
【請求項１４】液体媒質からの磁性粒子の、前記媒質中に押し入れられた
磁気プローブへの付着性を向上させる方法であって、前記粒子が前記プローブに
付着する前に表面張力除去剤を前記媒質中に分配することを特徴とする方法。