JP2002534078A

JP2002534078A - 植物における器官の重量の改変、稔性の制御ならびに無性生殖の増強のための方法

Info

Publication number: JP2002534078A
Application number: JP2000592392A
Authority: JP
Inventors: ロバートエル．フィッシャー，; ユキコミズカミ，
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-01-08
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2002-10-15
Also published as: HU225428B1; CA2363911A1; CA2363911C; EP1147122A2; WO2000040694A3; AU766797B2; US6639128B1; WO2000040694A2; EP1147122A4; US20090313723A1; US20050132445A1; US7220895B2; HUP0500499A2; US6559357B1; AU2497200A

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物の生長および細胞の増殖の調節を介して、植物における器官の重量の改変、稔性の制御ならびに無性生殖の増強のための方法を提供する。詳細には、ＡＮＴ活性を調節する工程および改変された細胞数によって植物を選択する工程を包含する植物における生長および細胞の増殖を調節する方法を提供する。本発明の方法は、植物プロモーターに結合したＡＮＴ核酸を含む組み換え発現カセットを含むトランスジェニック植物を産生する工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の引用）本出願は、米国特許出願第０９／２２７，４２１号（１９９９年１月８日出願
、これは、本明細書中に参考として援用される）に関連する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、植物遺伝子工学に関する。詳細には、これは、植物生長および細胞
増殖の調節を通じて、植物における器官の重量の改変、稔性の制御ならびに無性
生殖の増強のための方法に関連する。

【０００３】（発明の背景）植物における器官重量／大きさおよび稔性の制御は、商業的農業において意義
のある目標である。植物シュート栄養器官および／または構造（例えば、葉、茎
、および塊茎）、根、花、および花器（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮
、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（接合子、胚、内乳、およ
び種皮を含む）、果実（成熟子房）、および実生が、多数の農学的に重要な作物
の収穫産物である。従って、遺伝子制御を通じてこれらの器官／構造物の大きさ
／重量を操作できることが、重要な農業上のツールとなる。同様に、植物におけ
る不稔性の導入は、経済的に望ましいところまで、植物受粉および生殖を制限す
ることにおいて有用である。例えば、雄性不稔性植物は、雑種強勢が収量を増大
させる作物において、しばしば望ましい。

【０００４】固有の植物器官の大きさは、環境シグナル（例えば生長条件）によって大きく
改変され得るが、遺伝的に決定される。一般に、より大きな器官は、より多くの
数の細胞からなる。植物発達の間、細胞移動も細胞死も主要な役割を演じないの
で、植物器官における細胞数は、細胞増殖に依存する。細胞増殖の正確な調節は
また、植物を稔性にする生殖器官の適切な発達のために必要である。いくつかの
基礎研究が、植物器官発達および稔性に関与する遺伝子を同定したが、細胞増殖
の遺伝的制御またはその器官形成（植物における器官の大きさ／重量の制御およ
び稔性を含む）に対する関連についてはほとんど知られていない。従って、器官
形成を制御する遺伝子と細胞増殖を制御する遺伝子との間の関係を理解すること
が、重要な目標である。相当量の基礎研究が、酵母および動物において細胞周期
を制御する成分（例えば、サイクリン依存キナーゼ、サイクリン、およびそのイ
ンヒビター）および機構（例えば、リン酸化による調節、ユビキチン媒介タンパ
ク質分解）は、高等植物において保存されていることを示した（Ｂｕｒｓｓｅｎ
ｓら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：９−１９（１９９
８））。

【０００５】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、発達中の花は、胚珠を含む。Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓにおける野生型胚珠の発達が、広範に分析されてきた（Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ−Ｂｅｅｒｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：１２３７−１２４９（１９９
２）；Ｍｏｄｒｕｓａｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：３３３−３４９（１９
９４）およびＳｃｈｎｅｉｔｚら、ＰｌａｎｔＪ．７：７３１：７４９（１９
９５））。胚珠の発達に影響を与える種々の変異が同定されており（Ｋｌｕｃｈ
ｅｒら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１３７−１５３（１９９６）；Ｅｌｌｉｏ
ｔｔら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．８：１５５−１６８（１９９６）；Ｂａｋｅｒ
ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１４５：１１０９−１１２４（１９９７）；Ｒｏｂｉｎ
ｓｏｎ−Ｂｅｅｒｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．４：１２３７−１２４９（１９
９２）；Ｍｏｄｒｕｓａｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．６：３３３−３４９（１
９９４）；Ｒａｙ、Ａ．ら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．
９１：５７６１−５７６５（１９９４）；Ｌａｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１３
７：１１０１−１１１０（１９９４）；Ｌｅｏｎ−Ｋｌｏｏｓｔｅｒｚｉｅｌ、
ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．６：３８５−３９２（１９９４）；Ｇａｉｓｅｒら、Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌ７：３３３−３４５（１９９５））、そしてそれらのいく
つかは、細胞分裂のパターンに特に影響を与えることが見出されている（Ｓｃｈ
ｎｅｉｔｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１２４：１３６７−１３７６（１９９
７））。もちろん、いくつかの遺伝子がクローニングされている；ＡＩＮＴＥＧ
ＵＭＥＮＴＡ（ＡＮＴ）（Ｋｌｕｃｈｅｒら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．８：１３
７−１５３（１９９６）；Ｅｌｌｉｏｔｔら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．８：１５
５−１６８（１９９６））、ＡＧＡＭＯＵＳ（Ｙａｎｏｆｓｋｙら、Ｎａｔｕｒ
ｅ．３４６：３５−３９（１９９０）；Ｂｏｗｍａｎら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
．３：７４９−７５８（１９９１））、ＳＵＰＥＲＭＡＮ（Ｓａｋａｉら、Ｎａ
ｔｕｒｅ．３７６：１９９−２０３（１９９５））。これらの遺伝子は、発現さ
れ、そして発達中の胚珠においてのみならず、種々の発達中の器官においてもま
た機能するので、これらの変異および遺伝子の分析は、植物発達の間の細胞増殖
の制御について遺伝的情報を提供した。

【０００６】作物種の操作にとって重要である別の形質は、無性手段（特に、不稔性植物ま
たは雑種植物の栄養繁殖、および形質転換細胞からの植物の再生）を通じて植物
を再生または繁殖させることができることである。無性生殖は、細胞または組織
からの植物の再生、不定シュートおよび不定根を誘導することによる挿穂からの
植物の繁殖、および体細胞胚を形成することによるアポミクシスを含む。無性生
殖は、所望の形質を有する植物の遺伝的クローンが容易に生成され得るという利
点を有する。しかし、全ての植物が、不定シュートまたは不定根を生成し得るわ
けではなく、細胞または組織から植物体に再生し得るわけでもない。

【０００７】植物細胞増殖の遺伝的制御を規定する近年の進歩にも関わらず、細胞増殖を制
御することを通じた、農学的に重要な形質（例えば、器官の重量／大きさ、稔性
、無性生殖など）をもたらす遺伝子の同定および分析においては、進歩がほとん
ど報告されていない。このような遺伝子の特徴づけは、種々の望ましい形質を有
する植物の遺伝子工学を可能にする。本発明は、これら必要性のおよび他の必要
性に取り組む。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、植物においてＡＮＴ活性を調節することにより、細胞増殖、従って
植物における細胞数を調節するための方法を提供する。代表的には、この方法は
、植物においてＡＮＴの発現を調節する工程、および大きさ／重量、稔性、また
はその両方が改変された植物について選択する工程を包含する。いくつかの好ま
しい実施形態では、ＡＮＴ活性が増大され、そして増大された細胞増殖、従って
増大された細胞数を有する植物が選択される。ＡＮＴ発現を調節するための１つ
の方法は、植物に、プロモーターに作動可能に連結された異種ＡＮＴ核酸を含む
発現カセットを導入することによる。用いられ得る可能なＡＮＴ核酸の例は、配
列番号１および配列番号４に少なくとも５０％同一である核酸を含む。他の例は
、配列番号２または配列番号５のいずれかに少なくとも６０％同一であるポリペ
プチドをコードする核酸を含む。

【０００９】本発明はまた、細胞増殖、従って植物における不定器官の生成を調節するため
の方法を提供する。代表的には、この方法は、植物においてＡＮＴの活性または
発現を増加させる工程、および不定シュート、不定器官、または不定構造物（例
えば胚）を有する植物について選択する工程を包含する。ＡＮＴ発現を調節する
ための１つの方法は、植物に、プロモーターに作動可能に連結された異種ＡＮＴ
核酸を含む発現カセットを導入することによる。用いられ得る可能なＡＮＴ核酸
の例は、配列番号１および配列番号４に少なくとも５０％同一である核酸を含む
。他の例は、配列番号２または配列番号５のいずれかに少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする核酸を含む。

【００１０】本発明はまた、無性手段を通じて植物を再生する方法を提供する。代表的には
、この方法は、植物においてＡＮＴの活性または発現を増加させる工程、および
植物細胞または組織から再生された植物を選択する工程を包含する。ＡＮＴ発現
を調節するための１つの方法は、植物に、プロモーターに作動可能に連結された
異種ＡＮＴ核酸を含む発現カセットを導入することによる。用いられ得る可能な
ＡＮＴ核酸の例は、配列番号１および配列番号４に少なくとも５０％同一である
核酸を含む。他の例は、配列番号２または配列番号５のいずれかに少なくとも６
０％同一であるポリペプチドをコードする核酸を含む。種々の実施形態では、こ
の植物は、不定根、体細胞胚、または挿穂から生じる。

【００１１】本発明の別の実施形態では、異種遺伝子は、植物に異種ポリヌクレオチドに作
動可能に連結されたＡＮＴプロモーターを含む発現カセットを導入することより
、植物の分裂組織において発現される。本発明の好ましい実施形態では、このＡ
ＮＴプロモーターは配列番号３に示される。

【００１２】本発明はまた、配列番号４に特異的にハイブリダイズするＡＮＴ核酸を含む単
離された核酸分子を提供する。これは、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓから単離
される。

【００１３】種々の植物プロモーターが、本発明の方法において使用され得る。このプロモ
ーターは、構成的、誘導可能、または器官、組織もしくは細胞に特異的であり得
る。いくつかの実施形態では、ＡＮＴ遺伝子からのプロモーター（例えば、配列
番号３）が用いられる。本発明のＡＮＴ核酸の発現は、植物における任意の所望
の器官、組織もしくは細胞に指向され得る。本発明のいくつかの好ましい実施形
態では、このプロモーターは、シュート栄養器官／構造物（例えば、葉、茎、お
よび塊茎）においてＡＮＴ核酸の発現を指向させる。他の好ましい実施形態では
、このプロモーターは、花もしくは花器／構造物（例えば、苞葉、萼片、花弁、
雄蕊、心皮、葯および胚珠においてＡＮＴ核酸の発現を指向させる。異なる実施
形態では、このプロモーターは、種子（例えば、胚、内乳、および種皮）または
果実においてＡＮＴ核酸の発現を指向させる。

【００１４】（定義）句「核酸配列」とは、５’末端から３’末端へと読まれる、デオキシリボヌク
レオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の、一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリ
マーをいう。この句は、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの感染性ポリマー、および主に構造的役割を果たすＤＮＡまたはＲＮＡを含む
。

【００１５】用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流および／または下流に位置し
、そして転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識
および結合に関与する、領域または配列をいう。「植物プロモーター」とは、植
物細胞における転写を開始し得る、プロモーターである。

【００１６】用語「植物」とは、植物全体、シュート栄養器官および／または構造（例えば
、葉、茎および塊茎）、根、花および花器（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、
心皮、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（接合子、胚、内胚葉
、および種皮を含む）、果実（例えば、成熟子房）、実生、植物組織（例えば、
維管束組織、基本組織など）、細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、突起様構造な
ど）ならびにその後代を含む。本発明の方法において使用され得る植物の種類は
、形質転換技術を受けやすい高等植物および下等植物の種類とほぼ同じ程度の広
さであり、そのようなものとしては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）
、裸子植物、シダ類、および多細胞藻類が挙げられる。この種類は、種々の倍数
レベル（異数性、多倍数性、二倍体、半数体および半接合体を含む）の植物を含
む。

【００１７】「ＡＮＴ活性またはＡＮＴ遺伝子の発現の増加または増強」とは、ＡＮＴ活性
の増強された変化をいう。このような増加された活性または発現の例を以下に挙
げる。ＡＮＴ活性またはＡＮＴ遺伝子の発現は、野生型の非トランスジェニック
コントロール植物のレベルを超えて増加する（すなわち、ＡＮＴ活性またはＡＮ
Ｔ遺伝子の発現の量が増加する）。ＡＮＴ活性またはＡＮＴ遺伝子の発現は、そ
れが通常には野生型の非トランスジェニックコントロール動物において検出され
ない、器官、組織または細胞においてである（すなわち、ＡＮＴ活性またはＡＮ
Ｔ遺伝子の発現の空間的分布が増加する）。ＡＮＴの活性または発現は、ＡＮＴ
活性またはＡＮＴ遺伝子の発現が、野生型の非トランスジェニックコントロール
よりも長い期間、器官、組織または細胞に存在する（すなわち、ＡＮＴ活性また
はＡＮＴ遺伝子の発現の持続期間が増加する）場合に、増加する。

【００１８】本明細書中で使用される場合、用語「無性生殖」とは、受精を伴わない、植物
細胞からのシュート、根または植物全体の形成をいう。この植物全体の形成が体
性の胚を介して進行する場合、この無性生殖は、アポミクシスと呼ばれ得る。

【００１９】用語「不定器官」および「不定シュート」とは、それぞれ、その通常の部位以
外の場所にて生じる、器官（例えば、幹、葉、または根）およびシュートをいう
。例えば、葉の葉腋以外の部位にて、幹上に発達する根、または幹上に生じるシ
ュート芽である。不定器官または不定シュートはまた、インビトロにてカルス組
織にて生じ得る。次いで、このような不定器官または不定シュートは、当業者に
周知の方法を使用して、植物全体を再生するための使用され得る。

【００２０】ポリヌクレオチド配列は、それが外来の種に由来する場合に、生物または第２
のポリヌクレオチド配列に対して「異種」であるか、または同じ種に由来する場
合に、そのもとの形態から改変されている。例えば、異種コード配列に作動可能
に連結されたプロモーターとは、そのプロモーターが、由来した種と異なる種由
来のコード配列をいい、または同じ種由来の場合は、そのプロモーターと天然で
結合しないコード配列（例えば、異なる生態型または変種由来の、遺伝子操作さ
れたコード配列または対立遺伝子）をいう。

【００２１】個々の植物に対して「外因性」であるポリヌクレオチドは、有性交配以外の任
意の手段によって、その植物に導入されたポリヌクレオチドである。これが達成
され得る手段の例を以下に記載する。これらとしては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ媒介性形質転換、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）法、エレクトロポレーシ
ョンなどが、挙げられる。外因性核酸を含むこのような植物は、本明細書中で、
Ｔ₁（例えば、真空浸潤によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて）世代トランス
ジェニック植物またはＲ₀（形質転換細胞からインビトロで再生した植物につい
て）世代トランスジェニック植物と呼ばれる。有性交配または自家受粉により生
じるトランスジェニック植物は、このような植物の後代である。

【００２２】本発明の「ＡＮＴ核酸」または「ＡＮＴポリヌクレオチド配列」は、例えば、
Ｋｌｕｃｈｅｒら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１３７〜１５３（１９９６）お
よびＥｌｌｉｏｔｔら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．８：１５５〜１６８（１９９６
）（また、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４０２５６および同Ｕ４１３３９を参照の
こと）に記載されるようなポリペプチド（配列番号２）をコードする、部分配列
または全長ポリヌクレオチド配列（配列番号１）およびその相補体である。配列
番号５をコードする配列番号４は、Ｂｒａｓｓｉｃａ由来の別の「ＡＮＴ核酸」
を示す。本発明のＡＮＴ遺伝子産物は、ＡＰ２ドメインの存在によって特徴付け
られる。このドメインは、ＡＰ２において最初に同定され、このモチーフは、両
親媒性α−へリックスを形成する能力および／またはＤＮＡを結合する能力を有
する、非常に保存されたコア領域を有する、約６０〜７０アミノ酸残基の領域に
より特徴付けられる（Ｊｏｆｕｋｕら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１２１１〜
１２２５（１９９４）；Ｏｈｍｅ−ＴａｋａｇｉおよびＳｈｉｎｓｈｉ、Ｐｌａ
ｎｔＣｅｌｌ７：１７３〜１８２（１９９５））。全長ＡＮＴタンパク質は
、２つのＡＰ２ドメイン（配列番号２のアミノ酸２８１〜３５７および３８３〜
４５１）およびリンカー領域（アミノ酸３５８〜３８２）を含み、そして他のＡ
Ｐ２ドメインタンパク質に対する相同性は、この領域に限定されている。本発明
のＡＮＴポリヌクレオチドは、代表的には、長さが少なくとも約３０〜４０ヌク
レオチド〜約２５００ヌクレオチド、通常は長さが約３０００ヌクレオチド未満
の、コード配列を含む。通常、本発明のＡＮＴ核酸は、長さが約１００〜約５０
００ヌクレオチド、しばしば約５００〜約３０００ヌクレオチドである。

【００２３】導入遺伝子の発現および内因性遺伝子の阻害（例えば、アンチセンスまたはコ
サプレッションによる）の両方の場合において、当業者は、挿入されるポリヌク
レオチド配列が同一である必要はないが、その配列が由来した遺伝子の配列と単
に「実質的に同一」であり得ることを認識する。以下に説明されるように、これ
らの実質的に同一の改変体は、用語、ＡＮＴ核酸によって、特に包含される。

【００２４】挿入されたポリヌクレオチド配列が転写されそして翻訳されて、機能的ポリペ
プチドになる場合、当業者は、コドンの縮重に起因して、多数のポリヌクレオチ
ド配列が同じポリペプチドをコードすることを認識する。これらの改変体は、用
語「ＡＮＴ核酸」、「ＡＮＴポリヌクレオチド」およびこれらの等価物により特
に包含される。さらに、これらの用語は、ＡＮＴポリヌクレオチド配列と実質的
に同一であり（下記のように決定される）、そしてＡＮＴポリペプチドの機能を
保持するタンパク質（例えば、ＡＮＴポリペプチド中のアミノ酸の保存的置換か
ら生じる）をコードする、全長配列を特に包含する。

【００２５】用語「改変された稔性」とは、不稔性の誘導を含む、生殖能力のいかなる一過
性または永続性の改変、ならびに花の発達の開始（例えば、開花時期）の改変を
も含む。不稔性は、特に、花粉の発達の破壊、裂開の破壊（すなわち、雄性不稔
性）、胚珠の発達の破壊（すなわち、雌性不稔性）、あるいは雄性器官／雌性器
官（例えば、柱頭柔突起、隔膜の輸送組織（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇｔｉｓ
ｓｕｅ））の異常な発達により生じる受粉／受精プロセスの破壊によって、生じ
得る。開花時期は、植物が花組織を開始および生成する場合の発達時間または段
階である。

【００２６】２つの核酸配列またはポリペプチドは、それぞれ、その２つの配列中のヌクレ
オチドの配列またはアミノ酸残基の配列が、下記のように最大の一致について整
列された場合に同じである場合に、「同一」であると言われる。用語「同一」ま
たは「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の
文脈においては、同じである２つ以上の配列または部分配列をいうか、あるいは
以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するかまたは手作業での整列お
よび視認によって測定される場合に、比較ウィンドウにわたって最大の一致につ
いて比較および整列された場合に、特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基ま
たはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列をいう。配列同一性の
パーセンテージが、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、アミノ
酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸
残基に変えて置換され、従ってその分子の機能的特性が変化しない場合に、同一
でない残基位置が、しばしば保存的アミノ酸置換により異なることが認識される
。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、その置換の保存的
性質を補正するためにより高く調整され得る。この調整を行うための手段は、当
業者に周知である。代表的には、この手段は、完全な不一致ではなく部分的不一
致として、保存的置換をスコアリングし、それによって配列同一性のパーセンテ
ージを増加させる工程を包含する。従って、例えば、同一のアミノ酸がスコア１
を与えられ、そして非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は、
０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、Ｍ
ｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｓｃｉ．４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、計算され、この
アルゴリズムは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）にて
実行される。

【００２７】句「実質的に同一」とは、２つの核酸またはポリペプチドの文脈においては、
参照配列と少なくとも２５％の配列同一性を有する配列または部分配列をいう。
あるいは、同一性パーセントは、２５％〜１００％の任意の整数であり得る。最
も好ましい実施形態としては、本明細書中に記載されるプログラム（好ましくは
、下記のような標準的パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ）を使用して参照配列
と比較した場合に、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、
少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、
少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、
少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、
または少なくとも９９％が挙げられる。この定義はまた、試験配列が参照配列と
実質的同一性を有する場合に、その試験配列の相補性もいう。

【００２８】配列比較のために、代表的には、１つの配列が、参照配列として働き、試験配
列がその配列に対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験
配列および参照配列がコンピューターに入力され、部分配列一致が必要な場合指
定され、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォ
ールトプログラムパラメーターが使用され得るし、あるいは代わりにパラメータ
ーが指定され得る。次いで、この配列比較アルゴリズムによって、参照配列と比
較した試験配列についての配列同一性パーセントが、そのプログラムパラメータ
ーに基づいて算出される。

【００２９】「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６０、通常約
５０〜約２００、より通常約１００〜約１５０からなる群より選択される連続位
置の数のうちのいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、その中で、配列
が、同数の連続位置の参照配列に対して、その２つの配列が最適に整列された後
に、比較され得る。比較のための配列の整列方法は、当該分野で周知である。比
較のための配列の最適な整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、
Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズ
ム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４
４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａ
ｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９
８８）の類似性検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行
（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ
、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ
およびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは手作業による整列および視認によって、実行さ
れ得る。

【００３０】有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関
連性および配列同一性パーセントを示すために、進行性の対合整列を使用して、
一群の関連配列から多重配列整列を作製する。ＰＩＬＥＵＰはまた、その整列を
作製するために使用されたクラスタリングの関連性を示す、ツリーまたは樹状図
もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０（１９８７）の進行性整列方法の単純版
を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯ
Ｓ５：１５１〜１５３（１９８９）により記載される方法と類似する。このプ
ログラムは、３００個までの配列を整列し得、最大長は各々５，０００ヌクレオ
チドまたは５，０００アミノ酸である。多重整列手順は、その最も類似する２つ
の配列の対合整列で始まり、２つの整列された配列のクラスターを生じる。次い
で、このクラスターは、整列された配列のうちのその次に最も関連する配列また
はクラスターと整列される。２つの配列クラスターが、２つの個別の配列の対合
整列の単純な伸長によって、整列される。その最終整列が、一連の進行性対合整
列によって達成される。このプログラムは、特定の配列および配列比較の領域に
ついてのそれらのアミノ酸座標またはヌクレオチド座標を指定すること、および
このプログラムのパラメーターを指定することによって、実行される。例えば、
参照配列が、以下のパラメーターを使用して、配列同一性パーセント関連性を決
定するために他の試験配列に比較され得る：ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｗｅｉｇ
ｈｔ（３．００）、ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｌｅｎｇｔｈｗｅｉｇｈｔ（０
．１０）、およびｗｅｉｇｈｔｅｄｅｎｄｇａｐ。

【００３１】配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なア
ルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）に記載さ
れる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣ
ｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に利
用可能である。このアルゴリズムは、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を照会配
列中の長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって最初に同定する
工程を包含し、この照会配列は、データベース配列中の同じ長さのワードと整列
された場合に、いくらか正の値の閾値スコアＴを一致するかまたはこのＴを満た
すかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨ
ＳＰを見出す検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累
積整列スコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向
でのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最
大達成値から量Ｘの分下がる場合；１つ以上の負のスコアリング残基整列の蓄積
に起因して累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達
する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、その整列の
感度および速度を決定する。このＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、
ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ（Ｗ）＝１１、ＢＬＯＳＵＭ６２ｓｃｏｒｉｎｇｍａ
ｔｒｉｘ（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９））ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
ｓ（Ｂ）＝５０、ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、およ
び両方の鎖の比較を使用する。

【００３２】ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実施
する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこ
と）。このＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最
小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ
酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸
に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．０１未満、より好まし
くは約１０^-5未満、そして最も好ましくは約１０^-20未満である場合に、その参
照配列に類似するとみなされる。

【００３３】「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用
される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のアミ
ノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、あるい
はその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列をいう。遺
伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が、所定の任意のタンパク
質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて
、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがあるコドンにより特定さ
れるどの位置でも、そのコドンは、記載される対応するコドンのいずれかに、コ
ードされるポリペプチドを変化させることなく変化され得る。このような核酸の
バリエーションは、「サイレントなバリエーション」であり、これは、保存的に
改変されたバリエーションの１つの種類である。ポリペプチドをコードする本明
細書中のあらゆる核酸配列は、その核酸のすべての可能なサイレントなバリエー
ションもまた記載している。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンに
ついてのみのコドンであるＡＵＧは除く）が、機能的に同一の分子を生じるよう
に改変され得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイ
レントなバリエーション各々が、記載される配列各々に内包されている。

【００３４】アミノ酸配列に関して、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタ
ンパク質配列における、コードされる配列中の１つのアミノ酸または低いパーセ
ンテージのアミノ酸を変更する個々の置換が、「保存的に改変された改変体」で
あり、この改変体において、その変更が、化学的に類似するアミノ酸によるアミ
ノ酸の置換を生じることを、当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供
する保存的置換の表は、当該分野で周知である。

【００３５】以下の６つのグループ各々は、互いの保存的な置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）
。

【００３６】２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第１
の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリ
ペプチドに対して惹起される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従
って、ポリペプチドは、第２のポリペプチドに対して、例えば、その２つのペプ
チドが保存的置換によってのみ異なる場合、代表的には実質的に同一である。２
つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、その２つの分子またはそ
の成分が、下記のようなストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする
ことである。

【００３７】句「選択的（または特異的）にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチ
ド配列に対してのみ、その配列が複合混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮ
ＡあるいはライブラリーＤＮＡまたはライブラリーＲＮＡ）中に存在する場合に
、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で分子が結合、二重鎖形成
、またはハイブリダイズすることをいう。

【００３８】句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プロープが、代
表的には核酸の複合混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の
配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依
存性であり、そして異なる環境では異なる。より長い配列は、より高温で特異的
にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、
Ｔｉｊｓｓｅｎ、ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａ
ｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＰｒｏｂｅｓ「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａ
ｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｓｓａｙｓ」（１９９３）に見
出される。一般的に、非常にストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度
、ｐＨで、特定の配列についての熱融解温度（Ｔ_m）よりも約５〜１０℃低いよ
うに選択される。低いストリンジェンシー条件は、一般的に、そのＴ_mより約１
５〜３０℃低いように選択される。このＴ_mは、標的に相補的なプローブのうち
の５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度
、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合
、Ｔ_mにて、プローブのうちの５０％が平衡状態にある）。ストリンジェントな
条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて、塩濃度が、約１．０Ｍナトリウムイオン未満
、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）、そ
して温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少な
くとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）に
ついては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムア
ミドのような不安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的ハイブリダイゼ
ーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、ポジティブなシグナル
は、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドのハイブ
リダイゼーションの１０倍である。

【００３９】ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらの核
酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、依然として実質的に
同一である。このようなことは、例えば、１コピーの核酸が、遺伝コードにより
許容される最大のコドンの縮重を使用して作製される場合に生じる。このような
場合、それらの核酸は、代表的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下でハイブリダイズする。

【００４０】本発明において、本発明のＡＮＴ核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、
本明細書中に開示される核酸配列を使用して、ストリンジェントな条件下での標
準的サザンブロットにおいて同定され得る。この開示の目的のために、このよう
なハイブリダイゼーションに適切なストリンジェントな条件は、３７℃にて４０
％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼ
ーション、そして少なくとも約５０℃、通常は約５５℃〜約６０℃の温度にて、
０．２×ＳＳＣ中での２０分間にわたる少なくとも１回の洗浄、あるいは等価な
条件を含む条件である。ポジティブなハイブリダイゼーションは、少なくともバ
ックグラウンドの２倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーション条件お
よび洗浄条件が、類似のストリンジェンシーの条件を提供するために利用され得
ることを認識する。

【００４１】２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であるさらなる指標は、１対のオリゴ
ヌクレオチドプライマーにより増幅されたその参照配列が、次にストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下でプローブとして使用され得て、ｃＤＮＡラ
イブラリーまたはゲノムライブラリーから試験配列が単離され得る場合か、ある
いは例えば、ＲＮＡゲルまたはＤＮＡゲルのブロットハイブリダイゼーション分
析において試験配列が同定され得る場合である。

【００４２】（好ましい実施形態の説明）本発明は、細胞増殖の制御に関し、従って植物におけるＡＮＴ活性を調節する
ことによる植物中の細胞数の制御に関する。例えば、本発明は、ＡＮＴ遺伝子構
築物を使用して、植物シュートの栄養器官および／または構造（例えば、葉、茎
、および塊茎）、根、花、および花器（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮
、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（接合子、胚、内乳、およ
び種皮を含む）、果実（成熟子房）、および実生の、細胞の数および大きさ／重
量を制御することを通して、植物のバイオマスを操作するための分子ストラテジ
ーを提供する。従って、ＡＮＴ発現を調節することによって、増加したバイオマ
スまたは減少したバイオマスを有するトランスジェニック植物が産生され得る。
さらに、雄性または雌性の生殖器官において遺伝子の発現を調節することは、細
胞増殖のパターンの改変を通して不稔性に導き得る。従って、雄性または雌性の
不稔性のトランスジェニック植物が、適切な組織におけるＡＮＴ遺伝子発現を増
強または阻害することによって産生され得る。なお他の実施形態において、不定
器官、不定シュート、または不定構造（例えば、体細胞胚）の形成が、本発明の
この方法を使用して制御され得る。従って、植物の無性生殖の効率（特に、所望
の形質を有する不稔性植物または雑種植物の繁殖および形質転換された組織から
のトランスジェニック植物の再生）が改善され得る。

【００４３】ＡＮＴ遺伝子産物は、転写因子として機能しているらしい（Ｖｅｒｇａｎｉら
、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ．４００：２４３−２４６（１９９７））ので、当
業者は、改変されたＡＮＴ活性に付随する所望の表現型が、ＡＮＴ調節された遺
伝子の発現または活性を調節することによって得られ得ることを認識する。ＡＮ
Ｔの発現または活性を増加または減少するために記載される方法のいずれかが、
この目的のために使用され得る。

【００４４】（ＡＮＴ活性またはＡＮＴ遺伝子発現の増加）当該分野で周知の多数の手段のいずれかが、植物中のＡＮＴ活性を増加させる
ために使用され得る。増強された発現は、例えば、無性生殖を誘導もしくは増強
するために、または所望の植物器官中で器官の大きさ／重量を増加するために有
用である。任意の器官（例えば、植物シュートの栄養器官および／または構造（
例えば、葉、茎、および塊茎）、根、花、および花器（例えば、苞葉、萼片、花
弁、雄蕊、心皮、葯）、胚珠（卵細胞および中心細胞を含む）、種子（接合子、
胚、内乳、および種皮を含む）、果実、および実生）が標的化され得る。ＡＮＴ
活性を改変する有益な効果は、細胞増殖の増加の直接的な結果を必要とはしない
。例えば、増加した葉の大きさ／重量は、光合成の増加をもたらし、これは、次
には収量の増加をもたらす。同様に、根の重量／大きさの増加は、栄養の取り込
みおよび収量の増加をもたらす。茎および小花柄の厚さの増加は、破損（例えば
、穀物および果実における破損）に起因する損失を減少するために使用され得る
。

【００４５】ＡＮＴ活性またはＡＮＴ発現の増加はまた、雄性または雌性の不稔性植物を産
生するために使用され得る。雄性または雌性の不稔性は、特に、商業的に有利な
卓越した形質を有する雑種の多様性の産生において、農学および園芸学のために
重要である。雄性または雌性の不稔性は、親の植物における自己の花粉の混在を
妨害することによって、育種者が容易に雑種の多様性を作製することを可能にす
る。従って、例えば、発達している葯におけるＡＮＴ発現を標的化することは、
雄性の不稔性を引き起こすが、雌性の器官を破壊せず、従って植物を雌性稔性に
する。裂開の妨害はまた、市販の切り花のために所望される。例えば、授粉は、
花の老化をもたらし、花粉粒はまた、アレルギー性であり得、そしていくつかの
植物（例えば、ユリ）において、染みを引き起こし得る。

【００４６】トランスジェニック植物におけるＡＮＴ遺伝子の発現はまた、雌性不稔性を引
き起こし得る。胚珠においてＡＮＴ遺伝子を構成的に発現する植物は、不稔性で
ある大きな成熟胚珠を産生する。従って、ＡＮＴ機能を制御することを介する雌
性不稔性を導入することは、植物の老化を遅らせ得、そして植物の収量ならびに
穀物および園芸学的に重要な植物の品質を改善し得る。あるいは、雌性不稔性は
、ＡＮＴ活性またはＡＮＴ遺伝子発現を阻害する方法について以下に記載された
方法を使用して、減少したＡＮＴ発現から得られ得る。

【００４７】（ＡＮＴ遺伝子発現の増加）本明細書中に記載されるように調製された単離された配列は、当業者に周知の
方法を使用して、特定のＡＮＴ核酸の発現を導入するために使用されて、内因性
の遺伝子発現を増加し得る。適切な構築物の調製およびそれらを植物に導入する
ための手段は、以下に記載される。

【００４８】当業者は、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドが、他のタンパ
ク質と同様に、異なる機能を行う異なるドメインを有することを理解する。従っ
て、その遺伝子配列は、そのタンパク質の所望の機能的ドメインが発現される限
りは、全長である必要はない。ＡＮＴポリペプチド（ＡＰ２ドメイン、核局在化
シグナル、および転写活性化ドメインを含む）の顕著な特徴は、上記のＥｌｌｉ
ｏｔら、またはＫｌｕｃｈｅｒらにおいて議論される。

【００４９】改変されたタンパク質鎖はまた、当業者に周知であり、そして以下に詳細に記
載される種々の組換えＤＮＡ技術を利用して、容易に設計され得る。例えば、そ
の鎖は、アミノ酸置換、付加、欠失などによって、一次構造レベルで、天然に存
在する配列から変化され得る。これらの修飾は、最終的な改変タンパク質鎖を産
生するために多数の組み合わせにおいて使用され得る。

【００５０】（内因性ＡＮＴ遺伝子の改変）植物遺伝子への遺伝的変異の導入および所望の形質を有する植物の選択のため
の方法は、周知である。例えば、種子または他の植物材料は、標準的な技術に従
って、変異原性の化学物質で処理され得る。このような化学物質には以下が含ま
れるが、これらに限定されない：ジエチルサルフェート、エチレンイミン、エチ
ルメタンスルホネート、およびＮ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア。あるいは、Ｘ
線またはγ線のような線源からの電離放射線が使用され得る。

【００５１】あるいは、相同組換えが、インビボでＡＮＴ遺伝子を特異的に標的化すること
によって標的化された遺伝子改変を誘導するために使用され得る（一般的には、
ＧｒｅｗａｌおよびＫｌａｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１４６：１２２１−１２３８
（１９９７）およびＸｕら、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１０：２４１１−２４２２（
１９９６）を参照のこと）。相同組換えは、植物において実証されている（Ｐｕ
ｃｈｔａら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ５０：２７７−２８４（１９９４）、Ｓ
ｗｏｂｏｄａら、ＥＭＢＯＪ．１３：４８４−４８９（１９９４）；Ｏｆｆｒ
ｉｎｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７３４６
−７３５０（１９９３）；およびＫｅｍｐｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３８９：８０
２−８０３（１９９７））。

【００５２】本発明の遺伝子に相同組換え技術を適用する際に、ＡＮＴ遺伝子配列（５’上
流、３’下流、および遺伝子内領域を含む）の選択された部分における変異（例
えば、本明細書中に開示されるもの）が、インビトロで作製され、次いで、標準
的な技術を使用して所望の植物に導入される。相同組換えの効率は、使用される
ベクターに依存することが公知であるので、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４３０３−４３０７（１９９４）
；およびＶａｕｌｏｎｔら、ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．４：２４７−２５
５（１９９５）によって記載されるようなジシストロン性遺伝子標的ベクターの
使用は、簡便に使用されて、トランスジェニック植物中の改変されたＡＮＴ遺伝
子発現について選択する効率を増大させる。変異された遺伝子は、相同組換えお
よび標的化された野生型遺伝子の置換がトランスジェニック植物細胞中で起こり
、ＡＮＴ活性の抑制を生じるような方法で、標的野生型遺伝子と相互作用する。

【００５３】あるいは、末端の二重ヘアピンキャップを有する二重鎖コンホメーションにお
けるＲＮＡ残基およびＤＮＡ残基の連続するストレッチからなるオリゴヌクレオ
チドが使用され得る。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、標的ＡＮＴ遺伝子の配列と整列す
るように設計され、そして所望のヌクレオチド変化を含むように設計される。染
色体外Ｔ_i−ＤＮＡプラスミドへのキメラオリゴヌクレオチドの導入は、少数の
形質転換された植物細胞においてキメラ分子によって方向付けられる効率的かつ
特異的なＡＮＴ遺伝子の転換を生じる。この方法は、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：１３８６−１３８９（１９９６）およびＹｏｏｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２０７１−２０７
６（１９９６）において記載される。

【００５４】（ＡＮＴ活性を増加させるための他の手段）ＡＮＴ発現を増加させるための１つの方法は、「活性化変異誘発」（例えば、
Ｈｉｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１３５０−１３５３（１９９２）
を参照のこと）を使用することである。この方法において、内因性ＡＮＴ遺伝子
は、内因性ＡＮＴ遺伝子の、上流の強力な／構成的プロモーターを含むＴ−ＤＮ
Ａ配列の挿入によって、構成的に、異所的に、または過剰に発現されるように改
変され得る。以下に説明するように、ＡＮＴを過剰発現するトランスジェニック
植物の調製はまた、ＡＮＴ発現を増加させるために使用され得る。内因性ＡＮＴ
遺伝子の活性化変異誘発は、トランスジェニック植物中でのトランスジェニック
ＡＮＴ核酸の過剰発現と同じ効果を与える。あるいは、ＡＮＴ活性のエンハンサ
ーをコードする内因性遺伝子または内因性遺伝子の発現は、類似の様式で、Ｔ−
ＤＮＡ配列の挿入によって発現されるように改変され得、そしてＡＮＴ活性が増
加され得る。

【００５５】ＡＮＴ発現を増加させる別のストラテジーは、改変されたＡＮＴ導入遺伝子を
発現することによる、ＡＮＴの優性過剰活性（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ）変異体
の使用であり得る。例えば、ＡＮＴ活性の負の調節因子との相互作用に重要であ
る欠損ドメインを有する改変されたＡＮＴの発現を用いて、優性過剰活性ＡＮＴ
タンパク質を作製し得る。あるいは、負の調節因子と相互作用するドメインのみ
を有する短縮型ＡＮＴタンパク質の発現は、負の調節因子の効果を滴定様式で阻
害（ｔｉｔｒａｔｅ）し得、それにより、内因性ＡＮＴ活性を増加させ得る。過
剰活性標的遺伝子に対する優性変異体の使用は、Ｍｉｚｕｋａｍｉら，Ｐｌａｎ
ｔＣｅｌｌ８：８３１−８４５（１９９６）に記載される。

【００５６】（ＡＮＴ活性または遺伝子発現の阻害）上記で説明したように、ＡＮＴ活性は、多数の植物プロセスを、細胞増殖の調
節を通して制御する際に重要である。ＡＮＴ遺伝子発現活性の阻害は、例えば、
植物の器官の大きさ／重量を減少させるため、または雌性不稔性を植物において
誘導するために用いられ得る。特に、内因性遺伝子発現を阻害する、ＡＮＴ核酸
の標的化された発現（例えば、アンチセンスまたはコサプレッション（ｃｏ−ｓ
ｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ））を用いて、胚珠の発達を初期段階で阻害し得、従って
雌性不稔性を誘導し得る。それゆえ、トランスジェニック植物の寿命は、延長さ
れ得る。なぜなら、受精（種子形成）は、植物または器官の老化プロセスを活性
化および加速し得るからである。

【００５７】ＡＮＴ遺伝子機能の阻害はまた、栄養増殖を短縮化し、早期開花をもたらすた
めに用いられ得る。開花期を制御する方法は、所望により収穫期を最適化するた
めに、農業において極めて有用である。それゆえ、植物におけるＡＮＴ遺伝子の
機能を調節することにより、開花期を制御することが可能である。例えば、稔性
植物生長の加速は、ＡＮＴアンチセンスＲＮＡを栄養発達の間に発現させて、早
期開花を達成することによって得られ得る。次いで、ＡＮＴ導入遺伝子の発現は
、生殖発生の間、遮断されて、稔性植物を獲得し得る。

【００５８】（ＡＮＴ遺伝子発現の阻害）本明細書中に開示される核酸配列を用いて、ＡＮＴまたは関連の遺伝子の発現
を植物中で阻害するための多数の方法において有用な核酸を設計し得る。例えば
、アンチセンス技術は、便利に用いられ得る。これを達成するために、所望の遺
伝子由来の核酸セグメントをクローニングし、そしてアンチセンス鎖のＲＮＡが
転写されるように、プロモーターに作動可能に連結する。次いで、この構築物が
植物中に形質転換され、そしてこのアンチセンス鎖のＲＮＡが生成される。植物
細胞では、アンチセンス抑制は、以下を含む全てのレベルの遺伝子調節にて作用
し得ることが示唆されている：（ＲＮＡ翻訳の抑制（Ｂｏｕｒｑｕｅ，Ｐｌａｎ
ｔＳｃｉ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ）１０５：１２５−１４９（１９９５）；Ｐ
ａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ，ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第４８巻，
Ｃｏｈｎ，Ｗ．Ｅ．およびＫ．Ｍｏｌｄａｖｅ（編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．：ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ；Ｌｏｎ
ｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ．１８１−２３８頁；Ｈｅｉｓｅｒら，Ｐｌａｎ
ｔＳｃｉ．（Ｓｈａｎｎｏｎ）１２７：６１−６９（１９９７）を参照のこと
）および目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止すること（Ｂａｕ
ｌｃｏｍｂｅ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．３２：７９−８８（１９９６）；
ＰｒｉｎｓおよびＧｏｌｄｂａｃｈ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒａｌ１４１：２２５９
−２２７６（１９９６）；Ｍｅｔｚｌａｆｆら，Ｃｅｌｌ８８：８４５−８５
４（１９９７），Ｓｈｅｅｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８５：８８０５−８８０９（１９８８）およびＨｉａｔｔら，米国特許第４
，８０１，３４０号を参照のこと）。

【００５９】導入されるべき核酸セグメントは一般に、抑制されるべき内因性ＡＮＴ遺伝子
の少なくとも一部に実質的に同一である。しかし、この配列は、発現を阻害する
ためには完全に同一である必要はない。本発明のベクターは、阻害効果が、標的
遺伝子に対して同一性または実質的同一性を示す遺伝子ファミリー内の他の遺伝
子に適用されるように設計され得る。

【００６０】アンチセンス抑制については、導入された配列はまた、一次転写産物または完
全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれと比較しても、完全な長さである必要
はない。一般に、より高い同一性を用いて、より短い配列の使用を補い得る。さ
らに、導入された配列は、同じイントロンおよびエキソンのパターンを有する必
要はなく、非コードセグメントの同一性は、同等に有効であり得る。通常、約３
０ヌクレオチドまたは約４０ヌクレオチドと、ほぼ全長のヌクレオチドとの間の
配列が用いられるべきであるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ま
しく、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、そして約５００
ヌクレオチド〜約３５００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。

【００６１】多数の遺伝子領域が、ＡＮＴ遺伝子発現を抑制するために標的化され得る。標
的としては、例えば、コード領域、イントロン、エキソン／イントロン連結部由
来の配列、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域などが挙げられ得る。

【００６２】別の周知の抑制方法は、センスコサプレッションである。センス配向に配置さ
れた核酸の導入は、標的遺伝子の転写をブロックする有効な手段であることが近
年示された。内因性遺伝子の発現を調節するためのこの方法の例（Ａｓｓａａｄ
ら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏ．２２：１０６７−１０８５（１９９３）；Ｆ
ｌａｖｅｌｌＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３４９
０−３４９６（１９９４）；Ｓｔａｍら，ＡｎｎａｌｓＢｏｔ．７９：３−１
２（１９９７）；Ｎａｐｏｌｉら，ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２７９
−２８９（１９９０）；ならびに米国特許第５，０３４，３２３号、同第５，２
３１，０２０号および同第５，２８３，１８４号を参照のこと）。

【００６３】導入された配列が、コード配列自体は含まないが、内因性配列の一次転写物中
に存在する配列に相同なイントロン配列または非翻訳配列のみを含む場合、抑制
効果が生じ得る。導入された配列は一般に、抑制されることが意図される内因性
配列に対して実質的に同一である。この最少の同一性は代表的に、約６５％より
も高いが、より高い同一性は、内因性配列の発現のより有効な抑制を発揮し得る
。約８０％を超える実質的に高い同一性が好ましいが、約９５％〜完全な同一性
が最も好ましい。アンチセンス調節についてと同様に、この効果は、同一性また
は実質的同一性を示す類似の遺伝子ファミリー内の任意の他のタンパク質に適用
させるべきである。

【００６４】コサプレッションについて、完全未満の同一性を必要とする、導入された配列
はまた、一次転写産物または完全にプロセシングされたｍＲＮＡのいずれかと比
較して、全長である必要はない。これは、過剰発現物（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ
ｅｒ）であるいくつかの植物の同時生成を回避するために好適であり得る。全長
よりも短い配列における、より高い同一性は、より長い、同一性がより低い配列
を補う。さらに、導入された配列は、同じイントロンパターンまたはエキソンパ
ターンを有する必要はなく、そして非コードセグメントの同一性は、等しく有効
である。通常、アンチセンス調節について上記で示された大きさの範囲の配列が
用いられる。さらに、アンチセンス調節について示された同じ遺伝子領域が、コ
サプレッション技術を用いて標的化され得る。

【００６５】オリゴヌクレオチドに基づく三重らせん形成もまた、ＡＮＴ遺伝子発現を破壊
するために用いられ得る。三重鎖ＤＮＡは、ＤＮＡの転写および複製を阻害し得
、部位特異的変異を作製し得、ＤＮＡを切断し得、そして相同組換えを誘導し得
る（例えば、ＨａｖｒｅおよびＧｌａｚｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６７：７
３２４−７３３１（１９９３）；Ｓｃａｎｌｏｎら，ＦＡＳＥＢＪ９：１２
８８−１２９６（１９９５）；Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ３５：１０５３９−１０５４８（１９９６）；ＣｈａｎおよびＧｌ
ａｚｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ）７５：２６７−２８
２（１９９７）を参照のこと）。三重らせんＤＮＡを用いて、アンチセンス調節
について同定された同じ配列を標的化し得る。

【００６６】触媒ＲＮＡ分子すなわちリボザイムはまた、ＡＮＴ遺伝子の発現を阻害するた
めに用いられ得る。実質的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対合し、そして特定の
位置でホスホジエステル骨格を切断し、それにより、標的ＲＮＡを機能的に不活
化する、リボザイムを設計することが可能である。この切断を実施する際に、こ
のリボザイムは、それ自体改変されず、従って、他の分子を再利用および切断し
得、このリボザイムを真の酵素とする。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列
を含むことは、アンチセンスＲＮＡにＲＮＡ切断活性を付与し、それにより、構
築物の活性を増加させる。従って、リボザイムを用いて、アンチセンス調節につ
いて同定した同じ配列を標的化し得る。

【００６７】多数のクラスのリボザイムが同定された。１つのクラスのリボザイムは、植物
中で自己切断および複製し得る、多数の小さな環状ＲＮＡに由来する。このＲＮ
Ａは、単独で（ウイロイドＲＮＡ）またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ
）を伴ってのいずれかで複製する。例としては、アボカドサンブロッチ（ａｖｏ
ｃａｄｏｓｕｎｂｌｏｔｃｈ）ウイロイド由来のＲＮＡ、ならびにタバコ輪紋
ウイルス、ルツェルン一過性条斑（ｌｕｃｅｒｎｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｓｔ
ｒｅａｋ）ウイルス、ベルベットタバコ斑紋（ｖｅｌｖｅｔｔｏｂａｃｃｏ
ｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、ナスノディフォルム斑紋（ｓｏｌａｎｕｍｎｏｄｉ
ｆｌｏｒｕｍｍｏｔｔｌｅ）ウイルスおよびサブタレニアン・クローバー斑紋
（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎｃｌｏｖｅｒｍｏｔｔｌｅ）ウイルス由来のサ
テライトＲＮＡが挙げられる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用は
、ＺｈａｏおよびＰｉｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ３６５：４４８−４５１（１９９３
）；ＥａｓｔｈａｍおよびＡｈｌｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ１５６：１
１８６−１１８８（１９９６）；ＳｏｋｏｌおよびＭｕｒｒａｙ，Ｔｒａｎｓｇ
ｅｎｉｃＲｅｓ．５：３６３−３７１（１９９６）；Ｓｕｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：２４１−２５１（１９９７）；ならびにＨａｓｅ
ｌｏｆｆら，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１（１９８８）に記載される
。

【００６８】（内因性ＡＮＴ遺伝子の改変）上記の遺伝的変異を導入するための方法を用いて、ＡＮＴ発現が減少した植物
について選択もまたし得る。

【００６９】（ＡＮＴ活性を阻害するための他の手段）ＡＮＴ活性は、ＡＮＴ細胞特異的遺伝子発現に必要とされるタンパク質を除去
することによって調節され得る。従って、調節タンパク質および／またはＡＮＴ
遺伝子発現を制御する配列の発現は、本明細書に記載される方法を用いて調節さ
れ得る。

【００７０】別のストラテジーは、ＡＮＴタンパク質がそれ自体または他のタンパク質と相
互作用する能力を阻害することである。これは、例えば、ＡＮＴに特異的な抗体
を用いて達成され得る。この方法では、ＡＮＴ特異的抗体の細胞特異的発現を用
いて、抗体：抗原認識を通して機能的ドメインを不活化する（Ｈｕｐｐら，Ｃｅ
ｌｌ８３：２３７−２４５（１９９５）を参照のこと）。ＡＮＴ相互作用タン
パク質の活性の妨害は、類似の様式で適用され得る。あるいは、ＡＮＴのドミナ
ントネガティブ変異体を、短縮型ＡＮＴタンパク質をコードする導入遺伝子を発
現させることによって調製し得る。トランスジェニック植物中の標的遺伝子を不
活化するためのドミナントネガティブ変異体の使用は、Ｍｉｚｕｋａｍｉら，Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌ８：８３１−８４５（１９９６）に記載される。

【００７１】（ＡＮＴ核酸の単離）一般に、以下の組換えＤＮＡ技術における命名法および実験手順は、周知のも
のであり、そして当該分野で一般に用いられる。標準技術は、クローニング、Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅および精製に用いられる。一般に、ＤＮＡリガー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応は、製造
業者の仕様書に従って行われる。これらの技術および種々の他の技術は一般に、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９
８９）またはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ第１巻〜第３巻，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉ
ｎｃ．（１９９４−１９９８）に従って行われる。

【００７２】ＡＮＴ核酸の単離は、多数の技術によって達成され得る。例えば、本明細書に
開示される配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブ
ラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおける所望の遺伝子を同定し得る。ゲ
ノムライブラリーを構築するために、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを、例え
ば、制限エンドヌクレアーゼを用いるランダム断片化によって作製し、そしてベ
クターＤＮＡと連結してコンカテマーを形成し、このコンカテマーを適切なベク
ター中にパッケージングし得る。ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲ
ＮＡを所望の器官（例えば、花）から単離し、そしてＡＮＴ遺伝子転写物を含む
ｃＤＮＡライブラリーをこのｍＲＮＡから調製する。あるいは、ｃＤＮＡは、Ａ
ＮＴ遺伝子またはホモログが発現される他の組織から抽出されたｍＲＮＡから調
製され得る。

【００７３】次いで、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーは、本明細書に開示
されるクローニングされたＡＮＴ遺伝子の配列に基づくプローブを用いてスクリ
ーニングされ得る。プローブを用いて、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列と
ハイブリダイズさせて、同じ植物種または異なる植物種において相同遺伝子を単
離し得る。あるいは、ＡＮＴポリペプチドに対して惹起した抗体を用いて、ｍＲ
ＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし得る。

【００７４】あるいは、目的の核酸は、増幅技術を用いて核酸サンプルから増幅され得る。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ＡＮＴ遺伝子の配列を
、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーか
ら直接増幅し得る。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法もまた、例えば、発現
されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするため、サンプル
中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして用いる核酸を作製す
るため、核酸配列決定または他の目的のために有用であり得る。ＰＣＲの一般的
な概説については、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅ
ｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ，Ｇｅｌｆ
ａｎｄ，Ｄ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．編），Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９０）を参照のこと。ＡＮＴ配
列を植物組織から同定するために適切なプライマーおよびプローブは、本明細書
に提供される配列（例えば、配列番号４）とＫｌｕｃｈｅｒら，およびＥｌｌｉ
ｏｔら，前出に提供される配列との比較から作製される。

【００７５】ポリヌクレオチドはまた、技術文献に記載されるような周知の技術によって合
成され得る。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９８２
）およびＡｄａｍｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８
３）を参照のこと。次いで、二本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成し、そ
してこれらの鎖を適切な条件下で一緒にアニーリングすること、または適切なプ
ライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することのいず
れかによって、入手され得る。最も５’末端および最も３’末端では、Ａｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓＡＮＴヌクレオチド配列は、ＢｒａｓｓｉｃａＡＮＴヌクレ
オチド配列に非常に類似するが他のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＰ２ドメイン含
有遺伝子には類似しないので、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示す
ヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって、異なる
種におけるＡＮＴオーソログをスクリーニング／単離し得る。

【００７６】（組換えベクターの調製）単離された配列を上記の技術において用いるために、植物細胞の形質転換に適
切な組換えＤＮＡベクターが調製される。広範な種々の高等植物種を形質転換す
るための技術は周知であり、そして技術文献および科学文献に記載されている。
例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７
７（１９８８）を参照のこと。所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（例
えば、全長タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列）は好ましくは、形質転換され
た植物の意図される組織におけるこの遺伝子からの配列の転写を指向する、転写
開始調節配列および翻訳開始調節配列と合わされる。

【００７７】例えば、過剰発現については、再生植物の全ての組織におけるこの遺伝子の発
現を指向する、植物プロモーターフラグメントが用いられ得る。このようなプロ
モーターは、本明細書中で「構成的」プロモーターと呼ばれ、そして大部分の環
境条件下および発達または細胞分化の状態の下で活性である。構成的プロモータ
ーの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａｉｍＶ）３５Ｓ転写開始
領域、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来
の１’プロモーターまたは２’プロモーター、および当業者に公知の種々の植物
遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。このような遺伝子としては、例え
ば、以下が挙げられる：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇ
ら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９（１９９６））、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７，Ｚｈ
ｏｎｇら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３（１９９６）
）、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ由来のステアロイル−アシルキャリアタンパ
ク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４７８２，Ｓ
ｏｌｏｃｏｍｂｅら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７
６（１９９４））、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５
９６，Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．ＭｏＬＢｉｏｌ２０８：５５１−５６５（
１９８９））、およびトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５
８５５，Ｍａｎｊｕｎａｔｈら，ＰｌａｎｔＡｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７
−１１２（１９９７））。

【００７８】あるいは、植物プロモーターは、特定の組織、器官または細胞型におけるＡＮ
Ｔ核酸の発現を指向し得る（すなわち、組織特異的プロモーター）か、またはさ
もなければ、より正確な環境制御または発達制御下にあり得る（すなわち、誘導
性プロモーター）。誘導性プロモーターによる転写をもたらし得る環境条件の例
としては、嫌気条件、温度上昇、光の存在または化学物質／ホルモンの噴霧が挙
げられる。当業者は、組織特異的プロモーターが、標的組織以外の組織において
、作動可能に連結された配列の発現を駆動し得ることを認識する。従って、本明
細書中で使用される場合、組織特異的プロモーターは、標的の組織または細胞型
において発現を優先的に駆動するが、他の組織においてもいくらかの発現をもた
らし得る、プロモーターである。

【００７９】多数の組織特異的プロモーターがまた、本発明において用いられ得る。例えば
、花、胚珠または葯（特に、タペータム）において核酸の発現を指向するプロモ
ーターは、不稔性が所望される方法において有用である。胚珠における発現を指
向するプロモーターの例は、Ｒｅｉｓｅｒら，Ｃｅｌｌ８３：７３５−７４２
（１９９５）（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ３９９４４）に記載されるＢＥＬ１遺伝子
由来のプロモーターである。タペータム特異的プロモーターの例としては、タバ
コ由来のＴＡ２９（Ｍａｒｉａｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３４７：７３７−４１，
（１９９０））、ならびにＢｒａｓｓｉｃａ由来のＡ６およびＡ９（Ｐａｕｌら
，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６１１−２２，（１９９２），Ｈｉ
ｒｄら，ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ４：１０２３−１０３３（１９９３））
が挙げられる。Ｔｗｅｌｌら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１７：２４０
−４５，（１９９１））によって単離されたプロモーターのような葯特異的プロ
モーターもまた、用いられ得る。

【００８０】雄性不稔性を導入するために、例えば、第２および第３の花器（花弁および雄
蕊）特異的ＡＰ３プロモーター（Ｄａｙら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１：
２８８７，１９９５）が用いられ得る。心皮特異的ＡＧＬ１（Ｆｌａｎａｇａｎ
およびＭａ，ＰｌａｎｔＪ．１０：３４３，１９９３）またはＡＧＬ５（Ｓａ
ｖｉｄｇｅら，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ７：７２１，１９９５）プロモーターは
、雌性不稔性のみを誘導するために適用され得る。花被器官の増加をなおも有す
る、不稔性植物は、ＡＮＴ遺伝子をＡＧプロモーター（Ｓｉｅｂｕｒｔｈおよび
Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ９：３５５，１９９７）を通し
て構成的に発現することによって入手され得る。ＡＧプロモーターは、生殖器官
原基ならびに発達中の雄性器官および雌性器官においてのみ活性である。

【００８１】花原基において花発達の初期および発達中の花被器官に発現されるＡＰ１プロ
モーター（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ−Ｂｒｏｗｎら，Ｃｅｌｌ７６：１３１，１９
９４）を用いて、花被器官が広がった、稔性の花が生成され得る。空中の栄養器
官の生物量を増加させるために、光合成器官特異的プロモーター（例えば、ＲＢ
ＣＳプロモーター（Ｋｈｏｕｄｉら，Ｇｅｎｅ１９７：３４３，１９９７））
が用いられ得る。根の生物量は、根特異的ＡＮＲ１プロモーター（Ｚｈａｎｇお
よびＦｏｒｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：４０７，１９９８）の制御下で構成
的なＡＮＴ発現によって増加し得る。種子の大きさ／重量（農業的に重要な形質
）を増加させるために、種子特異的プロモーター（例えば、ＬＥＣプロモーター
（Ｌｏｔａｎら，Ｃｅｌｌ９３：１１９５（１９９８））、胚形成後期に豊富
なプロモーター（Ｗｅｓｔら，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ６：１７３（１９９４）
）、β−コングルチニンα−サブユニットプロモーター（Ｗｅｓｔら）、レクチ
ンプロモーター（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：６０５（１９
９４））またはＫｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３プロモーター（Ｇｏｌｄ
ｂｅｒｇら））が用いられ得る。任意の強力な、構成的プロモーター（ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター）は、総植物生物量を増加させるために用いられ得る。

【００８２】適切なポリペプチド発現が所望される場合、コード領域の３’末端のポリアデ
ニル化領域が含まれるべきである。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々
の他の植物遺伝子またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。

【００８３】本発明の遺伝子由来の配列（例えば、プロモーターまたはコード領域）を含む
ベクターは代表的に、選択可能な表現型を植物細胞に付与するマーカー遺伝子を
含む。例えば、このマーカーは、殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性、特に抗生物
質耐性（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン
に対する耐性）または除草剤耐性（例えば、クロロスルホンまたはＢａｓｔａに
対する耐性）をコードし得る。

【００８４】本発明はまた、ＡＮＴ遺伝子（配列番号３）由来のプロモーター配列を提供し
、これらは、所望の組織におけるＡＮＴコード配列または異種配列の発現を指向
するために用いられ得る。ＡＮＴは、植物全体の分裂組織細胞（ｍｅｒｉｓｔｅ
ｍａｔｉｃｃｅｌｌ）において発現される。それゆえ、本発明のＡＮＴプロモ
ーター配列は、側根、葉原基、発達中の葉、花原基、花器原基、発達中の花器、
胚珠原基、発達中の胚珠、発達中の胚および維管束系の分裂組織細胞に発現を標
的化するために有用である。発現が未成熟器官内のこれらの細胞に標的化され得
る遺伝子としては、若い、感受性器官における病原体および昆虫に対する耐性を
増加させるための以下が挙げられる：病害耐性遺伝子（例えば、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓＮＰＲ１遺伝子（Ｃａｏら，Ｃｅｌｌ８８：５７，１９９７））な
らびにジャガイモの線虫耐性遺伝子座Ｇｒｏ１およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
ｉｎｆｅｓｔａｎｓ耐性遺伝子座Ｒ７（Ｌｅｉｓｔｅｒら，ＮａｔｕｒｅＧ
ｅｎｅｔｉｃｓ１４：４２１，１９９６）。

【００８５】ＡＮＴプロモーターは発生中の胚において後期に発現されるので、貯蔵油、タ
ンパク質または澱粉の生合成についての調節因子または重要な酵素をコードする
いくつかの遺伝子（例えば、ＢｉＰ（Ｈａｔａｎｏら，ＰｌａｎｔａｎｄＣ
ｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ３８：３４４，１９９７））は、ＡＮＴプロモ
ーターの制御によって発現され得る。

【００８６】（トランスジェニック植物の生成）本発明のＤＮＡ構築物は、所望の植物宿主のゲノム内に、種々の従来技術によ
って導入され得る。例えば、ＤＮＡ構築物は、植物細胞のゲノムＤＮＡ内に植物
細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション
のような技術を用いて直接導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、バリスティ
ック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）法（例えば、ＤＮＡ粒子ボンバードメント）を用い
て植物組織へと直接導入され得る。

【００８７】マイクロインジェクション技術は当該分野で公知であり、そして科学文献およ
び特許文献に充分に記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を用いたＤＮ
Ａ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら，ＥｍｂｏＪ．３：２７１７−２
７２２（１９８４）に記載される。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５８２４（１９８
５）に記載される。バリスティック形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒ
ｅ３２７：７０−７３（１９８７）に記載される。

【００８８】あるいは、ＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせられ得、
そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクタ
ー内に導入され得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿
主のビルレンス機能は、細胞がこの細菌に感染される場合に、構築物および隣接
マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指向する。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換技術（安全化（ｄｉｓａｒｍｉｎｇ）およ
びバイナリーベクターの使用を含む）は、科学文献に十分に記載される。例えば
、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４９６−４９８（１９８４）、お
よびＦｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：
４８０３（１９８３）およびＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｔｏＰｌａｎｔｓ
，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ１９
９５）を参照のこと。

【００８９】任意の上記形質転換技術によって誘導される形質転換された植物細胞を培養し
、形質転換された遺伝子型および従って所望の表現型（例えば、種子重量の増加
）を有する植物全体を再生し得る。このような再生技術は、組織培養増殖培地に
おける特定の植物ホルモンの操作に依存し、この操作は、代表的に、所望のヌク
レオチド配列と共に導入された殺生物剤マーカーおよび／または除草剤マーカー
に依存する。培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔｓＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋｏｆＰｌａｎｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，１２４〜１７６頁，Ｍａｃ
ＭｉｌｌｉｌａｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ
，１９８３；およびＢｉｎｄｉｎｇ，ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＰｌａ
ｎｔｓ，ＰｌａｎｔＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，２１〜７３頁，ＣＲＣＰｒｅ
ｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９８５に記載される。再生はまた、植物カルス
、外植片、器官、またはそれらの部分からも得られ得る。このような再生技術は
、Ｋｌｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓ．３８：４６７−
４８６（１９８７）に一般的に記載される。

【００９０】本発明の核酸を使用して、実質的に任意の植物に所望の特性を付与し得る。従
って、本発明は、以下の属からの種を含む、広範な植物に対する用途を有する：
Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｔｒｏｐａ、
Ａｖｅｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌ
ｌａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍ
ｕｓ、Ｃｏｃｏｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙ
ｒｔｏｍｉｕｍ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ
、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌａｍｉｎａｒｉ
ａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、
Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｍ
ｅｄｉｃａｇｏ、Ｎｅｒｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｌｅａ、Ｏ
ｒｙｚａ、Ｏｓｍｕｎｄａ、Ｐａｎｉｅｕｍ、Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ、Ｐｅｒｓ
ｅａ、Ｐｈａｓｏｌｕｓ、Ｐｉｓｔａｃｈｉａ、Ｐｉｓｕｍ、Ｐｙｒｕｓ、Ｐｏ
ｌｙｐｏｄｉｕｍ、Ｐｒｕｎｕｓ、Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｒ
ｉｃｉｎｕｓ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ｓｏｌａｎｕ
ｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｉｔ
ｉｃｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ｖｉｔｉｓ、ＶｉｇｎａおよびＺｅａ。

【００９１】当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、そし
て作動可能であることが確認された後に、有性交雑によって他の植物に導入され
得ることを認識する。任意の多くの標準的な育種技術が、交雑される種に依存し
て使用され得る。

【００９２】公知の手段を使用して、当業者は、トランスジェニック植物中のＡＮＴｍＲ
ＮＡまたはＡＮＴタンパク質の増加または減少を検出することによって、本発明
の植物についてスクリーニングし得る。ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出および
定量するための方法は、当該分野で周知である。本発明の植物はまた、所望の表
現型を検出することによって同定され得る。例えば、器官または植物の生物量の
増加は、周知技術に従って検出され得る。雄性または雌性の不稔性は、生存可能
な花粉および／または種子を発育させ能力について試験することによって同定さ
れ得る。

【００９３】以下の実施例は、限定目的でなく、例示目的で提供される。

【００９４】（実施例１）本実施例は、ＡＮＴ発現の増加が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける、細胞数
ならびに根、葉、花器、胚珠および種子の大きさ／重量を増加することを示す。

【００９５】ＡＮＴコードヌクレオチド配列の開始コドンの直前にＢａｍＨＩ部位を有する
ＡＮＴｃＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲに
よって作製した。このＡＮＴ核酸（配列番号１の２６８位のＣから２１４８位の
Ｔまで（１８８１ヌクレオチド））を、構成的３５Ｓプロモーター下の、プラス
ミドベクターｐＭＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１
５３：２５３，１９８７）のＢｇｌＩＩ部位で連結した。そしてＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターに対してセンス方向にあるＡＮＴｃＤＮＡ挿入物（３５Ｓ：：Ａ
ＮＴ）を有する組換えプラスミドＤＮＡを、選択した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ細胞を、この組換えプラスミドＤＮＡを用いて形質転換し、そしてＡｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓ植物（Ｃｏｌ−０生態型）での真空浸潤によるＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ媒介植物形質転換のために使用した。Ｔ₁種子を、真空浸潤後約３週
間の形質転換した植物から収集し、そしてカナマイシンを含むＭＳプレート上に
プレートして、Ｔ₁トランスジェニック実生についてスクリーニングした。

【００９６】Ｔ₁種子は、非常に大きい種子を含み、これらは、これらが規定の大きさのメ
ッシュを通過しないので区別された。これらの種子の大部分は、この３５Ｓ：：
ＡＮＴ導入遺伝子を有し、カナマイシン耐性であった。この表現型は、ベクター
のみのコントロールでは観察されなかった。

【００９７】複数のＴ₁実生は、ベクターのみのコントロールトランスジェニック実生より
大きかった。これらが発生するにつれて、Ｔ₁植物は、高度に分枝した根系を生
成し、この根系は、ベクターのみのコントロールよりも大きい重量を有する。さ
らに、この植物は、ベクターのみのコントロールと比較した場合に、拡大した葉
、花器および胚珠を有した。例えば、Ｔ₁系統の花および葉の平均生物量は、ベ
クターのみのコントロールの花および葉の平均生物量の、それぞれ、約３倍およ
び２．５倍であった。ＤＩＣ顕微鏡法および走査電子顕微鏡法は、Ｔ₁植物のこ
の拡大した器官の表現型が、器官の細胞数の増加に起因することを示した。さら
に、Ｔ₁植物は、不稔性であった。予備実験は、葯が花粉（これは、形態学的に
正常である）を飛散させず、そして胚珠が、雌性配偶体を圧縮／置換（ｄｉｓｐ
ｌａｃｅ）する珠心細胞の数の増加によって、異常に大きいかったことを示唆す
る。

【００９８】不稔性が、ホモ接合性トランスジェニック系統を生成および増殖することを困
難にするために、本発明者らは、Ａｏｙａｍａ，およびＣｈｕａＰｌａｎｔ
Ｊ．１１：６０５−６１２（１９９７）ならびにＭｃＮｅｌｌｉｓら、Ｐｌａｎ
ｔＪ．１４：２４７−２５７（１９９８）に記載のような化学誘導系を使用し
て、異所性のＡＮＴ転写を調節した。この系は、キメラ転写因子遺伝子（３５Ｓ
：：ＧＶＧ）を利用し、これは、３５Ｓプロモーター、酵母転写因子ＧＡＬ４の
ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、およびグルココルチコイドレセ
プター（ＧＲ）のレセプタードメインからなる。ＡＮＴ遺伝子を、ＧＶＧ転写因
子の結合部位を含むプロモーターから下流に挿入した（ＵＡＳ：：ＡＮＴ）。こ
の３５Ｓ：：ＧＶＧ／ＵＡＳ：：ＡＮＴ構築物を、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓに導入し、そして稔性トランスジェニック系統を、上記のように一般的に得た
。

【００９９】トランスジェニックＴ₂植物を、ＭＳ寒天プレート上で発芽させ、そして化学
誘導物質デキサメタゾン（ＤＥＸ）を含むか、または含まないプレートに移した
。このＤＥＸは、ＧＶＧ転写因子を結合および活性化する合成グルココルチコイ
ドホルモンである。ＤＥＸでの処理後に拡大葉の表現型を提示する、複数のトラ
ンスジェニック系統を得た。器官の大きさ／重量の増加は、細胞数の増加に起因
する。ＤＥＸは、３５Ｓ：：ＧＶＧ／ＵＡＳベクターのみを含むコントロールト
ランスジェニック植物に対して効果を有さなかった。まとめて考えると、これら
の結果は、異所性のＡＮＴ発現が、細胞数を増加することによって器官の大きさ
／重量を増加することを示唆する。

【０１００】（実施例２）本実施例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに観察された表現型と実質的に同じ表現
型変化が、タバコにおいて観察されたことを示す。

【０１０１】構成的３５Ｓプロモーターの制御下でＡＮＴｃＤＮＡを発現するタバコトラ
ンスジェニック植物を生成するために、上記の組換えプラスミドＤＮＡを、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介タバコカルス形質転換のために使用した。タバコカ
ルスを、カルス誘導プレート上に配置した滅菌したタバコの葉（ＳＲ１変種）か
ら誘導し、次いで、上記組換えＤＮＡを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細
胞と共に、３日間共存培養した。細菌細胞を洗い流した後、葉のカルスを、カナ
マイシンおよびカルベニシリンを含有する、シュート誘導性寒天プレート上に配
置し、形質転換されたシュートを生成した。これらのＲ₀シュートを、根誘導性
寒天プレートに移し、次いで、根の再生後に土壌に移植した。［一文削除］ＡＮＴ遺伝子が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下で構成的に発現され
るＲ₀植物は、より大きな葉（ベクターのみのコントロールトランスジェニック
植物の葉の約１．５倍）、比較的大きな花（ベクターのみのコントロールトラン
スジェニック植物より約１．７倍大きい重量）、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
で観察されたような不稔性を生じた。この不稔性は、主に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓトランスジェニック葯に見られたような、葯の裂開の不全によって引き起こ
される。いくつかのＲ₀植物は、それらの閉じられた葯中に機能的な花粉粒を生
成し、そして葯から切開された花粉粒を手を使って自家受粉させることによって
種子（Ｒ₁種子）を生成した。これらのＲ₁種子は、ベクターのみのコントロール
植物由来の種子の重量の約１．５倍の重量を有した。

【０１０２】（実施例３）本実施例は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコにおけるＡＮＴ導入遺伝子
による内因性遺伝子活性をコサプレッションすることによる、植物器官の大きさ
／重量の減少および開花の改変を記載する。

【０１０３】上記のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＴ₁系統は、器官の大きさ／重量および器官
細胞数の減少を示す系統を含んだ。これらの植物は、機能損失ａｎｔ変異体であ
るので、完全または部分的に雌性不稔性であった。これらの系統において、ＡＮ
ＴｍＲＮＡの発現は、大きく減少され、これは、内因性ＡＮＴ遺伝子のコサプ
レッション、およびＡＮＴｃＤＮＡのコサプレッションが、これらの系統にお
いて生じたことを示唆する。部分的に不稔性のＴ₁系統から、Ｔ₁親植物における
表現型と同じコサプレッションされた表現型について分離した、トランスジェニ
ックＴ₂植物が得られた。器官の大きさ／重量の減少はまた、コサプレッション
されたＲ₀タバコ植物においても観察された。

【０１０４】複数のコサプレッションされた系統はまた、早期の開花を示した。これらの系
統の植物は、ロゼット葉の数の減少および抽だい前の日数の減少を示す。早期開
花の表現型は、機能損失ａｎｔ変異体において観察されなかったので、ＡＮＴ導
入遺伝子によるコサプレッションはまた、それ自体でまたはＡＮＴと共に開花時
間を調節する、他の未知のＡＮＴ関連遺伝子に影響し得る。類似の結果がまた、
コサプレッションされたトランスジェニックタバコ植物においても観察された。

【０１０５】（実施例４）本実施例は、ＡＮＴ機能の損失が、細胞数を減少することによって成熟器官の
大きさを減少することを示す。

【０１０６】ＡＮＴｍＲＮＡは、葉に蓄積したので（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｃ．ら（１９
９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１５５−１６８）、本発明者らは、栄養性シ
ュート発生に対する機能損失ａｎｔ変異の影響を試験した。ａｎｔ−１植物とコ
ントロールの野生型植物との間で、葉原基の開始のタイミングまたは葉原基の数
に差異はなかったが（示さず）、成熟ａｎｔ−１の葉の幅および長さは、対応す
る野生型の葉の幅および長さと比較して、両方とも減少した。ａｎｔ変異体花器
は、大きさの減少が見出されているので（Ｋｌｕｃｈｅｒ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９
６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１３７−１５３；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｃ．ら
（１９９６）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８：１５５−１６８）、これらの観察は、
ＡＮＴ機能の損失が、シュート発生を通して器官のを減少することを実証する。

【０１０７】器官の大きさにおける変化は、細胞の大きさまたは細胞数、あるいは両方にお
ける改変を反映し得る。なぜａｎｔ−１器官がより小さいのかを理解するために
、本発明者らは、成熟ａｎｔ−１器官における細胞の大きさおよび細胞数を試験
し、そしてこれらを野生型コントロールの細胞の大きさおよび細胞数と比較した
。花弁表皮の遠位部分を最初に観察した。なぜなら、それは、二倍体であり、か
つ大きさおよび形状が均一である細胞を有するからである。本発明者らは、ａｎ
ｔ−１器官が、野生型よりも、単位面積あたりおよび器官あたりの細胞数がより
少ないが、しかし、ａｎｔ−１細胞は、正常よりもはるかに大きいことを見出し
た。実質的に同じ表現型が、全てのａｎｔ−１の花器および葉の表皮ならびに皮
下細胞層において観察された。従って、ａｎｔ−１器官の大きさの全身的減少は
、細胞数の減少に関連するが、細胞の大きさの減少には関連しない。

【０１０８】ａｎｔ変異体は、花器の数を減少するので、ＡＮＴは、器官原基のパターン形
成および器官生長に関連し得ることが示唆された。この可能性を評価するために
、本発明者らは、ＳＥＭ下で発生中の野生型花芽およびａｎｔ−１花芽における
萼片原基のパターンを観察した。花段階（ｆｌｏｒａｌｓｔａｇｅ）４（Ｓｍ
ｙｔｈ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：７５５−７６７）
の終わりまで、４つの全ての萼片原基は、発生中の野生型花芽の周辺で開始され
た。対応する段階でのａｎｔ−１花芽において、開始された器官原基は、ａｎｔ
−１花芽においては通常に配置されたが、花器の数は減少した（示さず）。従っ
て、ＡＮＴは、発生中の花芽における花器原基の位置を制御する役割をほとんど
有さないようである。

【０１０９】（実施例５）本実施例は、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（カノーラ）由来のＡＮＴオーソ
ログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の単離を示す。

【０１１０】ＢｒａｓｓｉｃａｃＤＮＡの核酸配列およびコードされるタンパク質は、そ
れぞれ、配列番号４および配列番号５に示される。

【０１１１】この核酸を調製するために、総ＲＮＡを、Ｃｏｌａｓａｎｔｉら（Ｃｅｌｌ．
９３：５９３−６０３（１９９８））に記載されるようにＴＲＩＺＯＬを使用し
て、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（カノーラ）実生の若いシュート頂端から単
離した。ｃＤＮＡを逆転写によって作製し、そして高忠実度の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼＰＦＵおよびオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって
増幅させた。これらのプライマーは、それぞれ、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＮ
Ｔヌクレオチド配列の開始コドン、および終止コドンの下流の逆平行ヌクレオチ
ド配列を有した。ＰＣＲ産物をＥ．ｃｏｌｉベクター内にサブクローニングし、
そして内部ＡＮＴヌクレオチド配列を有する異なるオリゴヌクレオチドプライマ
ーのセットを使用するＰＣＲによってスクリーニングした。選択された組換えプ
ラスミドクローンの挿入されたＢｒａｓｓｉｃａＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定して、そして確認のためにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＮＴヌクレオチド配
列と比較した。ＢｒａｓｓｉｃａＡＮＴ（ＢＡＮＴ）遺伝子は、それぞれ、Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＮＴ遺伝子に対して、それらのコード領域においてヌ
クレオチドレベルで８５．５％の同一性を共有し、そしてＢＡＮＴポリペプチド
配列は、ＡＮＴポリペプチド配列に対して８３．７％同一であった。

【０１１２】（実施例６）本実施例は、分裂組織細胞において異種遺伝子を発現させるための、ＡＮＴ
５’上流ヌクレオチド配列（プロモーター）の使用を示す。

【０１１３】正しく配向されたＡＮＴプロモーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩフラ
グメントを、ｐＢＩ１０１プラスミドベクターＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）内に
、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位で挿入した。これらの部位は、ＧＵＳ（
β−グルクロニダーゼ）遺伝子の開始コドンの直前に位置される。同じフラグメ
ントをまた、プラスミドｐＢＩＮｍ−ｇｆｐ５−ＥＲ（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：２１２２−２１２
７、（１９９７））に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。この部位
は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）遺伝子の開始コドンの直前に位置される
。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介真空
浸潤方法を使用して、これらの組換えプラスミドで形質転換した。複数のＴ₁系
統、およびそれらのその後の世代は、予測されるように、植物発生の間を通して
分裂組織細胞においてＧＵＳ活性またはＧＦＰ発現を示した。これは、ＡＮＴプ
ロモーターが、分裂組織細胞において異種遺伝子を発現させるために有用である
ことを示す。

【０１１４】（実施例７）本実施例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物においてＡＮＴ遺伝子発現を増加さ
せることによる、サイクリンＤ３（ＣＹＣＤ３）遺伝子発現の活性化を示す。

【０１１５】細胞増殖は、細胞周期調節遺伝子（例えば、サイクリンおよびｃｄｋｓ（Ｎａ
ｓｍｙｔｈ，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．，１２：４０５−４１２（１９９６）
；Ｍｏｒｇａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３７４：１３１−１３４，１９９５；およびＢ
ｕｒｓｓｅｎｓら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：９
−１９（１９９８））の活性によって直接的に制御される。ＡＮＴ遺伝子発現が
、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって制御されるＴ₁トランスジェニック系
統由来の器官は、増加した細胞数、従って増加された細胞増殖活性を有したので
、Ｔ₁植物の若い器官および成熟器官におけるサイクリン遺伝子の発現を、定量
的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した。若い発生中の器官において、細胞増殖は
、３５Ｓ：：ＡＮＴ植物およびコントロール植物の両方で観察されたが、両者の
間のサイクリン遺伝子の発現レベルの差異は、有意ではなかった。しかし、成熟
器官において、ＣＹＣＤ３（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞周期のＧ１／Ｓ進入に
ついての重要な調節因子をコードする（Ｓｏｎｉら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．７
：８５−１０３（１９９５）；Ｆｕｅｒｓｔら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．
１１２：１０２３−１０３３（１９９６））のｍＲＮＡ蓄積は、コントロールで
はもはや検出されないが、これは、３５Ｓ：：ＡＮＴ系統において検出された。
これらの結果は、３５Ｓ：：ＡＮＴ系統とコントロール系統との間で、器官発生
の初期段階では生長の差異は検出されなかったが；コントロール植物の器官が成
熟し、そして細胞増殖を停止した場合に、同じ齢の３５Ｓ：：ＡＮＴ植物の器官
の細胞は、増殖を継続し、そして結果として拡大された器官を生じるという観察
と一致する。

【０１１６】この結果は、構成的ＡＮＴ活性の増加は、細胞周期調節因子遺伝子の発現を調
節し、そして発生中の器官において細胞増殖を継続的に活性化することによって
、その細胞周期機構を直接的および／または間接的に制御することを実証する。
これはまた、細胞周期機構に関連する特定の遺伝子が、ＡＮＴ転写因子遺伝子（
Ｋｌｕｃｈｅｒら、およびＥｌｌｉｏｔら）の標的であることを示す。まとめて
考慮すると、これらの結果は、これらのＡＮＴ標的遺伝子の発現の調節が、植物
における器官の大きさ／重量および稔性を調節し得ることを示唆する。

【０１１７】（実施例８）本実施例は、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ（カノーラ）由来のＡＮＴオーソ
ログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であるＢＡＮＴの異所性発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓにおける器官の重量／大きさを増加することを示す。

【０１１８】配列番号４に示される核酸配列を有するアブラナ属のＡＮＴ（ＢＡＮＴ）ｃＤ
ＮＡを、センス方向で構成的３５Ｓプロモーター下で、プラスミドベクターｐＭ
ＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｚｙｍｏｌ．１５３：２５３
、１９８７）に挿入した。組換えプラスミドＤＮＡを、アグロバクテリウム形質
転換のために使用し、そして３５Ｓ：：ＢＡＮＴプラスミドＤＮＡで形質転換さ
れたアグロバクテリウム細胞を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物（Ｃｏｌ−０生態
型）を用いる吸引浸潤（ｖａｃｕｕｍｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によるアグ
ロバクテリウム媒介性植物形質転換のために使用した。Ｔ₁種子を、吸引浸潤の
約３週間後に収集し、そしてＴ₁トランスジェニック実生のスクリーニングのた
めのカナマイシンを含むＭＳ寒天プレート上に植えた。

【０１１９】３５Ｓ：：ＢＡＮＴ導入遺伝子を異所性に発現するＴ₁植物は、上記の３５Ｓ
：：ＡＮＴトランスジェニック植物において見られるように、複数の器官の過形
成を示した（実施例１）。すなわち、葉器および花器は、コントロール器官より
せいぜい３倍大きかった。これらのトランスジェニック植物は、実質的に雄性不
稔性であり、そしてしばしば同様に雌性不稔性であった。しかし、いくつかの植
物は、手による受粉による野生型花粉粒の受精の際に、種子を産生し、そしてＴ ₂ 種子は、増加した重量／大きさを示した。カナマイシン耐性Ｔ₂実生は、Ｔ₁植
物と同一の表現型を示す植物に発生し、このことは、ＡＮＴの異所性発現の影響
が遺伝性であることを示唆した。

【０１２０】（実施例９）この実施例は、増加したＡＮＴ発現が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物における
無性生殖、ならびに不定シュート、器官および胚の形成を誘導することを示す。

【０１２１】完全に成熟した茎または器官（例えば、葉）を、ＡＮＴを異所性に発現するＴ ₁ 植物から切り出し、そして植物ホルモンを全く含まない水中またはＭＳ寒天プ
レート上に配置した。約２週間のインキュベーションの後、不定根の形成を、茎
または葉の切断表面において観察した。時折、不定根もまた、葉の表面から生じ
た。この不定根の形成は、コントロールの茎または同様に処理された葉において
は、全く観察されなかった。

【０１２２】ＡＮＴを異所性に発現する完全に成熟したＴ₁植物由来の切除された花序（花
を有する）茎を、１０日間、植物ホルモンを含まないＭＳ寒天プレート上に配置
した。不定根の形成を、茎の切断表面において観察したが、老化した花芽（ｆｌ
ｏｒａｌｂｕｄ）においては、不定シュート形成を観察した。これらのシュー
トは、最終的に、同様に根を生じ、起源の植物と同様のトランスジェニック形質
（拡大した器官の大きさ／重量）を示す完全な植物に発生した。コントロールの
花序の茎は、同一の条件下において無性生殖の活性を全く示さなかった。

【０１２３】同様の無性生殖は、発生中の３５Ｓ：：ＡＮＴトランスジェニック種子より切
除された胚において観察された。魚雷段階（ｔｏｒｐｅｄｏ−ｓｔａｇｅ）後期
からほとんど成熟した胚を、発生している緑色種子から切除し、そして５０μｇ
／ｍｌカナマイシンを含有する植物ホルモンを含まないＭＳ寒天培地上で生長さ
せた。これらの胚は、実生に発生したが、いくつかの細胞は、二次胚または不定
根を再生し、これらはまた完全な植物に発生した。コントロール胚は、同一の条
件下において無性生殖の繁殖をしなかった。

【０１２４】（結論）高等植物において、内因性器官の大きさは、遺伝的に決定されるが、環境因子
によって大きく影響され得る。器官の大きさは、細胞の数および大きさを反映す
る。器官の総細胞数は、分裂能を有する未分化の分裂組織細胞の増殖によって決
定される。シュートの発生の間、側方の器官は、頂端分裂組織または側方分裂組
織から、原基として開始する。器官原基内のほとんどの細胞は、分裂性であり、
そして増殖するが、器官の発生の際に、細胞は、分裂能を失い、そして細胞周期
から抜け出る。従って、細胞の分裂能の維持は、総細胞数を規定し、それによっ
て植物器官の大きさを規定することによって、器官生長および細胞増殖を媒介す
る鍵となる機序である。しかし、分裂能の分子的性質および分裂能を制御する発
生の調節因子は、十分に理解されていない。

【０１２５】ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＮＴ遺伝子は、植物系においてのみ見出されてい
るＡＰ−２ドメインファミリーの転写因子をコードする。ＡＮＴｍＲＮＡは、
全ての側方根器官の原基中に蓄積し、そして器官発生の際に減少する。このこと
は、ＡＮＴは、器官生長において一般的な機能を有し得ることを示唆する。葉原
基および未分化の生長中の葉におけるＡＮＴ発現と一致して、ａｎｔ−１の機能
喪失変異の全ての成熟した葉が、対応する野生型の葉と比較して、大きさが減少
したことが、見出された。ａｎｔ−１花器もまた、正常より小さかったので、Ａ
ＮＴは、胚以降のシュート発生を通じた器官生長に必要とされる可能性が高い。
器官の大きさは、細胞の大きさ、細胞数、またはその両方の影響を受け得る。ａ
ｎｔ−１器官が、野生型よりも、単位面積あたりおよび１器官あたりより少ない
細胞を有するが、ａｎｔ−１細胞は、正常よりもかなり大きかったことが見出さ
れた。このことは、ａｎｔ−１器官の大きさの全身的な減少は、細胞数の減少の
結果であるが、細胞の大きさの減少の結果ではないことを実証する。従って、Ａ
ＮＴ機能は、植物器官の内因性細胞数を達成するために必要である。

【０１２６】本願明細書において記載される実験は、異所性のＡＮＴ発現が、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ植物の器官形態形成と協調する器官生長を増強することによる、器官
の大きさおよび器官重量の増加のために十分であることを実証する。完全に成熟
した３５Ｓ：：ＡＮＴ花弁内の分化した細胞は、野生型花弁内の細胞と同一の大
きさであった。同様に、花弁以外のコントロール器官と３５Ｓ：：ＡＮＴ器官と
の間で、表皮における明らかな細胞の大きさの差異は検出されなかった。従って
、細胞の大きさではなく、細胞数の増加は、拡大した３５Ｓ：：ＡＮＴ器官の主
な原因である。植物を短期間の日数、連続する照射条件、そして貧栄養培地また
は富栄養培地において生長させた場合、類似の機能の喪失および獲得の器官の大
きさに対する影響を観察した。従って、ＡＮＴ機能は、外部の生長シグナルの認
識と独立しているようである。最終的な器官の大きさに対する驚くべき効果とは
対照的に、異所性のＡＮＴ発現は、頂端分裂組織および側方分裂組織の大きさも
構造も改変せず、また器官の原基の大きさも数も変化しなかった。ＡＮＴ機能の
喪失は、花器の数を減少したが、開始した器官原基は、ａｎｔ−１花芽において
正常に配置され、そして正常な大きさとなった。従って、ＡＮＴは、器官原基の
大きさを決定せず、そして頂端分裂組織および側方分裂組織の構成を制御するこ
とによって器官原基数に影響することもないようである。

【０１２７】ＡＮＴは、いかにして器官形成の間に細胞数を制御するのであろうか？一般に
、植物器官の生長は、細胞移動も細胞死も含まない；従って、器官細胞数は、発
生している器官の分裂組織細胞の増殖に本質的に依存する。ＡＮＴは、発生して
いる器官の分裂組織細胞において発現するので、器官形成の間の細胞増殖を調節
し、それによって成熟器官の総細胞数を決定し得る。この考えを試験するために
、コントロール器官およびａｎｔ−１器官における細胞増殖の程度を、発生中の
花弁および完全に成熟した花弁の両方の細胞数および細胞の大きさを測定するこ
とによって試験した。中花段階（ｍｉｄ−ｆｌｏｒａｌｓｔａｇｅ）９の間、
野生型花弁の向軸性の表皮細胞は分化せず、そして頻繁に分裂した。一方、ａｎ
ｔ−１花弁は、単位面積あたりおよび１器官あたり、正常よりも少ない未分化細
胞を有した。細胞数のこの減少は、段階１５における完全に分化したａｎｔ−１
花弁においてよりより明白となった。従って、器官形成を通じて（特に成熟前の
後期発生段階の間）、ａｎｔ−１花弁において、正常よりも少ない細胞分裂が存
在する。ａｎｔ−１花弁における細胞分裂を伴わない細胞生長が生じ、非常に大
きな細胞を生じた。

【０１２８】これらの結果は、ＡＮＴが正常な程度の細胞増殖に必要であるが、細胞成長に
は主として必要ではないことを示唆する。どのようにしてＡＮＴが細胞増殖の程
度を調節するのか理解するために、本発明者らは、いかにして異所性ＡＮＴ発現
が花弁発生の間に器官の大きさ、細胞の大きさ、および細胞数に影響するのか研
究した。ａｎｔ−１花弁の細胞数に対する初期の効果とは対照的に、段階９にお
ける３５Ｓ：：ＡＮＴ花弁の細胞数および細胞の大きさは、正常であった。この
ことは、異所性のＡＮＴ発現は、初期段階の間の発生中の花弁の細胞生長または
細胞増殖の頻度を増加しないことを実証し、そして、増加したＡＮＴ活性は、内
因性細胞周期時間を改変しないことを示唆する。しかし、段階１５までに、完全
に成熟した３５Ｓ：：ＡＮＴ花弁の総細胞数は、コントロールの約２．５倍に達
し、このことは、段階９の後においてのみでさえも、器官成熟前にさらなる細胞
分裂が３５Ｓ：：ＡＮＴ花弁において生じたことを示す。成熟３５Ｓ：：ＡＮＴ
花弁における細胞の大きさは正常であるので、余分な細胞分裂は、細胞生長と協
調しなければならない。従って、異所性ＡＮＴ発現は、内因性の細胞周期時間を
改変することなく、花弁細胞を正常よりも長い期間増殖させるようである。類似
の結果は、３５Ｓ：：ＡＮＴのロゼット葉とコントロール実生の増殖を比較した
場合に得られた。発芽の１６日後（１６ＤＡＧ）、３５Ｓ：：ＡＮＴおよびコン
トロール実生の両方が、同数のロゼット葉を有し、そして全ての３５Ｓ：：ＡＮ
Ｔ実生の葉は、対応するコントロール葉と同一の大きさであった。しかし、３５
Ｓ：：ＡＮＴ葉は、対応するコントロール葉が生長を止める時点を越えて生長し
続け、最終的に正常より大きな葉を生じた。この観察は、細胞生長と協調する長
期の細胞増殖が、３５Ｓ：：ＡＮＴ植物における過形成を生じるという仮説を支
持する。合わせて考えると、これらの観察は、ＡＮＴが器官形成の間の細胞の分
裂能を維持することによって、細胞増殖の期間を調節することを示唆する。本明
細書において表される結果はまた、ほとんどの細胞が分裂性である組織における
ＣｙｃＤ３発現に対してＡＮＴが影響しないことを示唆する。類似の結果は、Ｃ
ｙｃＢ１ｂ（Ｃｙｃ１ｂＡｔ）（有糸分裂サイクリン遺伝子）のｍＲＮＡレベル
の比較において得られた。従って、ＡＮＴは、細胞の分裂能を維持し、そして結
果として細胞周期調節因子の発現を維持する。

【０１２９】ＡＮＴ機能と分裂能の維持とを結びつける別の驚くべき知見は、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ３５Ｓ：：ＡＮＴ器官において見出される新生物である。すなわち
、未分化細胞の塊（すなわち、カルス）が、外因性の植物ホルモン処理を行わず
に、３５Ｓ：：ＡＮＴ植物の創傷または老化表面、あるいは完全に分化した３５
Ｓ：：ＡＮＴ器官の剥離した末端から生成された。これらのカルスは、しばしば
、器官（例えば、根、葉またはシュート）に分化した。この新生物は、一貫して
３５Ｓ：：ＡＮＴ器官において観察されたが、同一の方法で処理されたコントロ
ール器官においては、決して見られなかった。分化した植物組織が、植物ホルモ
ン処理後に、カルスを誘導し得ることは、十分に確立されている。通常静止状態
である分化した細胞中の異所性ＡＮＴ発現は、分裂能を維持し、そして細胞周期
への再進入についてのその植物ホルモン依存性を減少する。

【０１３０】本明細書において示される知見は、ＡＮＴが器官形成の間に器官生長および細
胞増殖期間に影響する内因性の器官の大きさの調節因子であることを実証する。
植物器官の大きさの調節におけるＡＮＴ作用の提唱されたモデルにおいて、発生
生長シグナルは、器官形成の間にＡＮＴを正に調節する生長調節因子を活性化す
る。ＡＮＴは、細胞の分裂能を維持するように機能し、それによって細胞周期お
よび細胞生長の調節因子の発現を調節する。結果として、ＡＮＴは、発生してい
る器官の細胞生長と共役した細胞増殖を持続する。従って、異所性発現したＡＮ
Ｔは、細胞の分裂能の異常な保持を生じ、過形成および新生物を生じる。一方、
ＡＮＴの欠損は、細胞増殖および器官生長の早熟な終結を生じる。植物および動
物の系において、生長シグナル伝達経路および細胞周期機構は、多くの共通の因
子を共有するようである。そうであるにもかかわらず、強固な細胞壁に囲まれた
、植物生命体および植物細胞の不動である性状のために、植物生長および細胞増
殖のいくつかの局面は、動物のものとは異なった方法において調節および協調さ
れているようである。従って、ＡＮＴが植物特異的調節因子であり、そしてＡＮ
Ｔの上流調節因子および下流標的の同定は、植物が、いかにして独自に器官の大
きさを制御するパターン形成をともなう細胞増殖を協調するのかを明らかにし得
る。表現型の植物種間の多様性についての遺伝的基礎は、オーソログ調節遺伝子
の構造または発現における小さな変化であり得ることが示唆されている。従って
、ＡＮＴおよびそのオーソログの構造および発現パターンにおける差異は、少な
くとも部分的に、高等植物の器官の大きさにおける種間の多様性の原因である機
構であり得る。結局、異所性ＡＮＴ発現による器官重量の増加は、農業において
重要な植物の収量の新しい改善方法であり得る。

【０１３１】上記の実施例は、本発明の説明のために提供されたが、本発明の範囲を限定し
ない。本発明のほかのバリエーションは、当業者にとって容易に明らかであり、
そして添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書において引用される全ての刊
行物、特許、および特許出願は、本明細書によって、全ての目的のために参考と
して援用される。

【０１３２】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ミズカミ，ユキコアメリカ合衆国カリフォルニア 94708，ケンジントン，レイクドライブ 214 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD07 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 CG01 HA01 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 4B065 AA88X AA88Y AB01 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物における生長および細胞の増殖を調節する方法であって
、該方法が、ＡＮＴ活性を調節する工程；および改変された細胞数によって植物を選択する工程を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、改変された大きさ、重量ま
たは稔性によって植物を選択する工程を包含し；そして前記調節された細胞の増
殖が、改変された植物の大きさ、重量または稔性と関連する、方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、増加した細胞数によって植
物を選択する工程を包含し、そして前記ＡＮＴ活性を増加させる、方法。
【請求項４】植物器官の大きさまたは重量を増加させる、請求項３に記載
の方法。
【請求項５】稔性を減少させる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】ＡＮＴ活性を増加させる工程がＡＮＴ発現を増加させる工程
を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】請求項３に記載の方法であって、ＡＮＴ発現を増加させる工
程が、異種ＡＮＴ核酸に作動可能に連結された植物プロモーターを含む発現カセ
ットを前記植物に導入することを包含する、方法。
【請求項８】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１と少なくとも５０％同一である
、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１である、請求項８に記載の方法
。
【請求項１０】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と同一のポリペプチドをコ
ードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４と少なくとも５０％同一であ
る、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４である、請求項１２に記載の
方法。
【請求項１４】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と同一であるポリペプチド
をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記ＡＮＴ活性をシュート栄養器官において増加させる、
請求項３に記載の方法。
【請求項１７】前記ＡＮＴ活性を根において増加させる、請求項３に記載
の方法。
【請求項１８】前記ＡＮＴ活性を花器において増加させる、請求項３に記
載の方法。
【請求項１９】前記ＡＮＴ活性を胚珠において増加させる、請求項３に記
載の方法。
【請求項２０】前記ＡＮＴ活性を体細胞胚において増加させる、請求項３
に記載の方法。
【請求項２１】前記ＡＮＴ活性を種子において増加させる、請求項３に記
載の方法。
【請求項２２】前記ＡＮＴ活性を果実において増加させる、請求項３に記
載の方法。
【請求項２３】請求項１に記載の方法であって、減少した細胞数の植物を
選択する工程を包含し、そして前記ＡＮＴ活性を減少させる、方法。
【請求項２４】前記ＡＮＴ活性を減少させる工程がＡＮＴの発現を減少さ
せることを包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】請求項２４に記載の方法であって、ＡＮＴの発現を減少さ
せる工程が、異種ＡＮＴ核酸に作動可能に連結された植物プロモーターを含む発
現カセットを前記植物に導入することを包含する、方法。
【請求項２６】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１と少なくとも５０％同一であ
る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１である、請求項２６に記載の
方法。
【請求項２８】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と同一であるポリペプチド
をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４と少なくとも５０％同一であ
る、請求項２５に記載に方法。
【請求項３１】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４である、請求項３０に記載の
方法。
【請求項３２】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と同一であるポリペプチド
をコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記ＡＮＴ活性をシュート栄養器官において減少させる、
請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】前記ＡＮＴ活性を根において減少させる、請求項２３に記
載の方法。
【請求項３６】前記ＡＮＴ活性を花器において減少させる、請求項２３に
記載の方法。
【請求項３７】前記ＡＮＴ活性を種子において減少させる、請求項２３に
記載の方法。
【請求項３８】前記ＡＮＴ活性を体細胞胚において減少させる、請求項２
３に記載の方法。
【請求項３９】前記ＡＮＴ活性を果実において減少させる、請求項２３に
記載の方法。
【請求項４０】前記植物プロモーターが構成的プロモーターである、請求
項７または２５に記載の方法。
【請求項４１】前記植物プロモーターが誘導性プロモーターである、請求
項７または２５に記載の方法。
【請求項４２】前記植物プロモーターが組織特異的プロモーターである、
請求項７または２５に記載の方法。
【請求項４３】請求項４２に記載の方法であって、改変されたシュート栄
養器官の大きさまたは重量によって植物を選択する工程を包含し、そして前記プ
ロモーターがシュート栄養器官における前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法
。
【請求項４４】請求項４２に記載の方法であって、改変された根の大きさ
または重量によって植物を選択する工程を包含しそして前記プロモーターが根に
おける前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法。
【請求項４５】請求項４２に記載の方法であって、不稔性である植物を選
択する工程かあるいは改変された花器の大きさまたは重量によって植物を選択す
る工程を包含し、そして前記プロモーターが花器における前記ＡＮＴ核酸の発現
を指向する、方法。
【請求項４６】請求項４２に記載の方法であって、雌性不稔性である植物
を選択する工程かあるいは改変された胚珠の大きさまたは重量によって植物を選
択する工程を包含し、そして前記プロモーターが胚珠における前記ＡＮＴ核酸の
発現を指向する、方法。
【請求項４７】請求項４２に記載の方法であって、雄性不稔性である植物
を選択する工程、改変された葯の大きさまたは重量によって植物を選択する工程
あるいは裂開しない葯によって植物を確認する工程を包含し、そして前記プロモ
ーターが葯における前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法。
【請求項４８】請求項４２に記載の方法であって、改変された種子の大き
さまたは重量によって植物を選択する工程を包含し、そして前記プロモーターが
種における前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法。
【請求項４９】請求項４２に記載の方法であって、前記プロモーターが体
細胞胚における前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法。
【請求項５０】請求項４２に記載の方法であって、改変された果実の大き
さまたは重量によって植物を選択する工程を包含し、そして前記プロモーターが
果実における前記ＡＮＴ核酸の発現を指向する、方法。
【請求項５１】前記植物プロモーターがＡＮＴ遺伝子由来である、請求項
７または２５に記載の方法。
【請求項５２】前記プロモーターが配列番号３に示される通りである、請
求項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記細胞の増殖が無性生殖と関連する、請求項３に記載の
方法。
【請求項５４】前記ＡＮＴ活性を増加させる工程がＡＮＴ発現を増加させ
ることを包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】請求項５３に記載の方法であって、ＡＮＴ発現を増加させ
る工程が、異種ＡＮＴ核酸に作動可能に連結された植物プロモーターを含む発現
カセットを前記植物に導入することを包含する、方法。
【請求項５６】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１と少なくとも５０％同一であ
る、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１である、請求項５６に記載の
方法。
【請求項５８】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と同一であるポリペプチド
をコードする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４と少なくとも５０％同一であ
る、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４である請求項６０に記載の方
法。
【請求項６２】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と同一であるポリペプチド
をコードする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】前記植物がカルス組織において生じる、請求項５３に記載
の方法。
【請求項６５】前記植物が不定シュートより生じる、請求項６４に記載の
方法。
【請求項６６】前記植物が体細胞胚より生じる、請求項５３に記載の方法
。
【請求項６７】前記植物が挿穂より生じる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】前記方法が不定器官によって植物を選択する工程を包含す
る、請求項３に記載の方法。
【請求項６９】前記ＡＮＴ活性を増加させる工程がＡＮＴ発現を増加させ
ることを包含する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】請求項６９に記載の方法であって、ＡＮＴの発現を増加さ
せる工程が、異種ＡＮＴ核酸に作動可能に連結された植物プロモーターを含む発
現カセットを前記植物に導入することを包含する、方法。
【請求項７１】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１と少なくとも５０％同一であ
る、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】前記ＡＮＴ核酸が配列番号１である、請求項７１に記載の
方法。
【請求項７３】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号２と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号と同一であるポリペプチドを
コードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４と少なくとも５０％同一であ
る、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】前記ＡＮＴ核酸が配列番号４である、請求項７５に記載の
方法。
【請求項７７】前記ＡＮＴ核酸が、配列番号５と少なくとも６０％同一で
あるポリペプチドをコードする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】前記ＡＮＴ核酸が配列番号５と同一であるポリペプチドを
コードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】前記植物がカルス組織において生じる、請求項６８に記載
の方法。
【請求項８０】植物の分裂組織細胞における異種核酸の発現を指向する方
法であって、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＡＮＴプロモーター
を含む発現カセットを該植物に導入する工程を包含する、方法。
【請求項８１】前記プロモーターが配列番号３に記載される、請求項８０
に記載の方法。
【請求項８２】配列番号３と少なくとも８０％同一であるＡＮＴプロモー
ター配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項８３】前記ＡＮＴプロモーター配列に作動可能に連結された異種
ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８４】前記ＡＮＴプロモーター配列が配列番号３に示される通り
である、請求項８２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８５】配列番号４と少なくとも５０％同一であるＡＮＴ核酸配列
を含む単離された核酸分子であって、該ＡＮＴ核酸配列が配列番号１ではない、
単離された核酸分子。
【請求項８６】請求項８５に記載された単離された核酸分子であって、前
記ＡＮＴ核酸配列が配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選
択される配列を有するプライマーによって増幅され得る、核酸分子。
【請求項８７】前記ＡＮＴ核酸配列が配列番号４に示される通りである、
請求項８５に記載の単離された核酸分子。
【請求項８８】請求項８５に記載の単離された核酸分子であって、前記Ａ
ＮＴ核酸配列がＡＰ２ドメイン内で配列番号５と少なくとも約９０％同一である
配列を有するポリペプチドをコードするか、または全体の領域において配列番号
５と少なくとも約６０％同一である配列を有するポリペプチドをコードする、核
酸分子。
【請求項８９】配列番号５に示される通りのポリペプチドをコードするＡ
ＮＴ核酸配列を含む、単離された核酸分子。