JP2002528558A

JP2002528558A - 遺伝的に修飾されたグラム陰性細菌由来の低毒性ｌｐｓ

Info

Publication number: JP2002528558A
Application number: JP2000579756A
Authority: JP
Inventors: バン・デル・レイ、ペーター・アンドレ; ハムストラ、ヘンドリーク・ヤン; ステーグス、リアナ・ジュリアナ・ジョゼフィーヌ・マルグリート
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2002-09-03
Anticipated expiration: 2018-11-03
Also published as: US6482807B1; DK1127137T4; EP1127137B1; DK1127137T3; DE69838460T3; WO2000026384A1; CA2348928C; CA2348928A1; EP1127137A1; ATE373714T1; EP1870468A2; JP3595264B2; NZ511438A; PT1127137E; DE69838460D1; AU1178299A; ES2294821T3; AU762369B2; ES2294821T5; DE69838460T2

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝的に修飾されたグラム陰性細菌由来の低毒性ＬＰＳ【解決手段】本発明の目的はワクチンの分野にある。具体的にはアジュバントとして利用できる新規化合物を提供する。このような化合物の一例は、対応する非修飾型ＬＰＳ分子に比べＬＰＳ分子当たり二次アシル鎖の数が少なく、前期二次アシル鎖は一次アシル鎖に結合し、前期一次アシル鎖は前期組換えＬＰＳ分子のグルコサミンに結合し、前期組換えＬＰＳはアシル化パターンに関し均一である組換えＬＰＳである。またさらなる例は、組換えＬＰＳ分子当たりにＬＰＳ分子の非還元末端のグルコサミンに結合した１個のリン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１個のリン酸基を持つ組換えＬＰＳである。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明の目的はワクチンの分野にあり、より具体的にはワクチン内にアジュバ
ントとして利用できる新規化合物を提供する。多くのアジュバント、例えばフロ
イント型の鉱油エマルジョン、アルミニウム塩、サポニン、ムラミン化ジペプチ
ド及び誘導体ＭＰＬ、ＭＦ５９等が報告されている。しかし、実際にヒトへの利
用が許可されているものは極僅かに過ぎない。一般にその原因は免疫刺激活性と
毒性との比率が不適であるあることによる。アジュバントに関する一般的参考文
献はアジュバントの理論と実務（ＴｈｅＴｈｅｏｒｙａｎｄＰｒａｃｔｉ
ｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｄｊｕｖａｎｔｓ）（Ｄ．Ｅ．Ｓ．
Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ編集、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９５）
及び参照され本書内に取り込まれている情報に見いだすことができる。従来技術
は多くの生物体に関しＬＰＳの酵素処理により毒性の低下ができきることも教示
している。これら処理を受けたものとして例示されるＬＰＳにはＳａｌｍｏｎｅ
ｌａａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｎｅｓｏｔ
ａがある。以下についても同様のことが示唆されている：全てのグラム陰性細菌
、特にサルモネラ菌、大腸菌、ヘモフィルス菌、モラキセラ菌、キャンビロバク
ター及びナイセリア菌。しかし、アジュバント活性に関し詳細な証明が提供され
たものは無い。

【０００２】本先行技術を詳細に見ると、Ｍｕｎｆｏｒｄら（１９９０年発行の米国特許第
４，９２９，６０４号内）は、ＳｔｙｈｉｍｕｒｉｕｍのＬＰＳでは酵素処理
により二次アシル基の９５％が取り除かれることを示していることが分かる。Ｍ
ｕｎｆｏｒｄの処理はアシル鎖のみを特異的に取り除き、確実に部分的脱アシル
化のみを実施することはできない。Ｍｕｎｆｏｒｄ法は均一な製品を提供するこ
とはできず、せいぜいほぼ全ての二次アシル基を除かれるだけであろう。

【０００３】彼らはＢ細胞マイトージェン試験よりアジュバント活性があることを示唆して
いる。しかしＢ細胞マイトージェン試験試験は、アジュバント活性を示すには信
頼に足る試験ではない。そのような産物がアジュバント活性を示さない可能性が
ある。実際Ｍｕｎｆｏｒｄ法では、ＬＰＳ非還元端からの二次アシル鎖除去を示
しているに過ぎない。得られた産物はＬＰＳの還元端上には二次アシル基を含ん
でいない。Ｍｕｎｆｏｒｄ産物はミリストイル及びラウロイル二次側鎖の両方を
欠いている。Ｍｕｎｆｏｒｄ法はミリストイルだけ、あるいはラウロイルだけを
除去することはできない。Ｍｕｎｆｏｒｄ法は１カ所の特定部位から二次アシル
鎖だけを除去することはできない。Ｍｕｎｆｏｒｄ法は大腸菌、ヘモフィルス菌
及びナイセリア菌にも適用可能であることが示唆されている。

【０００４】彼らはサルモネラＬＰＳでは非還元端に１リン酸基を、そして還元端に１リン
酸基を持つことを示している。サルモネラＬＰＳは非還元端にミリストイル及び
ラウロイルをそれぞれ１つづつ持っている。サルモネラＬＰＳは還元端には二次
アシル基を持っていない。

【０００５】米国特許第４，９１２，０９４号にてＭｙｅｒｓらはコントロール条件下にア
ルカリ加水分解を実施し、位置３にある還元端グルコサミンに結合したエステル
であるベータ−ヒドロキシミリスチン酸アシル残基のみを除去した。従って、一
次アシル鎖の一つが化学的に除去された産物について記述している。相対する二
次アシル鎖の除去についての記述は無い。得られた産物は毒性は低いが抗原特性
は維持されていると報告されている。この事は、脱アシル化体に関しＭＰＬＡ
（酸加水分解）のマイトージェン活性の低下、及びそれに応じＢ細胞増殖が低下
することにのみ基づいている。しかしＢ細胞マイトージェン活性試験はアジュバ
ント活性を提示する確実な試験ではない。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ及
びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｎｅｓｏｔａＬＰＳが例として挙げられてい
る。しかし、生物学的活性が提示されているのはＳａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎ
ｎｅｓｏｔａＬＰＳのみである。かれらはこの方法が全てのＬＰＳに提供でき
ることを示唆しているが、それを支持するものは提供していない。

【０００６】同主題はＭｕｎｆｏｒｄを共著者とするＥｒｗｉｎらの著書の中でも考察され
ている（１９９１）。Ｅｒｗｉｎの著書自体の要約から引用すれば、要約の中で
次の様に述べている。「これら研究は、リピドＡについて報告されている構造−
活性相関、又は他の脱アシル化ＬＰＳの挙動より特定のＬＰＳの生物活性を自信
を持って推測することはできない。」リピドＡアシルオキシアシル化に関係する遺伝子は当分や既知である。最近、
大腸菌のリピドＡ生合成において２種類の後期機能型アシルトランスフェラーゼ
、ｈｔｒＢ及びｍｓｂＢ遺伝子が同定された（Ｃｌｅｍｅｎｔｚら、１９９６、
１９９７）；ｈｒｔＢ遺伝子はこれまで３３℃以上の富培地上での増殖に必要な
遺伝子として報告されており、一方ｍｓｂ遺伝子はｈｔｒＢの多コピー抑制因子
として報告されている。最適な反応では、ＨｔｒＢはラウリン酸塩を（ＫＤＯ）
２−リピドＩＶＡに転移し、その後ＭｓｂＢがミリスチン酸塩を加えリピドＡア
シル化を完了できる（図１）。ｈｔｒＢ及びｍｓｂＢ突然変異体により形成され
る主要産物はそれぞれテトラ−及びペンタ−アシル体である。遺伝子は２７．５
％の同一性を示した；本ファミリーに属する３番目の遺伝子も大腸菌染色体上に
存在しているが、リピドＡ生合成における機能については不明である。

【０００７】Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの遺伝子配列にはｈｔｒＢと
ｍｓｂＢ両方の相同体が含まれている；ｈｔｒＢの突然変異に伴いＬＰＳのリン
酸化とアシル化の両方の修飾が起こり、オリゴサッカライド鎖の装飾に関しアシ
ルオキシアシル鎖の消失が多面的に作用することが示唆されている（Ｌｅｅら、
１９９５）。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｈｔｒＢ遺伝子内のノックアウト突然
変異はＬＰＳ−関連毒性を誘導することが示されている（Ｎｉｃｈｏｌｓら、１
９９７）。

【０００８】Ａｐｉｃｅｌｌａ（引用したＬｅｅらの文献の共著者でもある）らもＷＯ９７
／１９６８８号の中でｈｔｒＢノックアウト変異について報告している。彼らは
ｈｔｒＢ内の突然変異を介して得たＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅテトラアシル変異
体では、該突然変異体のＬＰＳは本質的に低下した毒性を持ちながら、抗原性を
維持していると考えられると記している。

【０００９】彼らは大腸菌ｈｔｒ−Ｂ配列の相同体を利用し、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓにつ
いて同様の配列を見いだした。この類似配列は大腸菌のｈｔｒＢ配列に対し５６
％の同一性と７３％の類似性を有していた。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの突然変
異体を作成し、増殖させた。変異型ヘモフィルスＬＰＳの分析は、内部コア内で
はいずれの型のフォスフォエタノールアミン量も５０％未満に低下したことを示
した。Ａｐｉｃｅｌｌａはさらに、二次アシル鎖（例えばミリスチン酸成分）の
一方を約１０％失ったＨ．ｉｎｆｕｌｅｎｚａｅのモノ又はジフォスフォリルペ
ンタアシルリピドＡ体についても報告している。更にテトラアシルは約９０％に
存在していることも示されている。従って、Ａｐｉｃｅｌｌａ法は主要産物が二
次アシル鎖を持たない組換え体Ｈ．ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａｅＬＰＳ構造体の混合
物を産生する。Ａｐｉｃｅｌｌａによれば、ＬＯＳ標本の殺菌剤アッセイはＨ．
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ変異体株を利用したラット胎児モデル及びチンチラ免疫と
して提供される。試験ではＬＰＳ自体を免疫源に利用しているが、彼らはアジュ
バント活性については何も例示、又は示唆していない。ＬＰＳ自体に対する免疫
反応はＡｐｉｃｅｌｌａらの試験にて示されている。

【００１０】サルモネラ変異体も開示されている。本変異体は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
の方法に類似の方法により得られた。サルモネラ変異体は、Ｎ結合Ｃ１４上の３
’置換がＣ１２脂肪酸ではなくむしろＣ１４であるＬＰＳを提供する。本実施形
態は野生型に比べ２０倍以上毒性が低かった。本物質について、抗原性に関する
詳細は提供されていない。

【００１１】彼らはこの方法がナイセリア、モラキセラ及びキャンビロバクターにも応用可
能であることを示唆している。実施例６において、例えばＡｐｉｃｅｌｌａはＨ
．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに類似の方法がナイセリアに実施可能であることを示唆
しているが、例示はなく、方法も明瞭に実施されていない。現在、ナイセリアの
リピドＡ合成におけるこれら遺伝子に関する教示は存在せず、ナイセリアのリピ
ドＡ合成のこの段階に関係する遺伝子が提供される試験の詳細も知られていない
。

【００１２】Ａｐｉｃｅｌｌａの従来の報告は、サルモネラの突然変異体がＨ．ｉｎｆｌｕ
ｅｎａｅの場合の結果とは異なり二次アシル化を省くのではなく、むしろ別のア
シルトランスフェラーゼを誘導すると思われることを示した。このことは各種グ
ラム陰性菌におけるリピドＡ合成に関連する遺伝子の突然変異がＥｒｗｉｎとＭ
ｕｎｆｏｒｄの教示するところのものであるのであれば、予想外の結果である。

【００１３】サルモネラの産物はヘプタ又はヘキサアシルであり、即ち非突然変異体と同数
の二次及び一次アシル鎖を有している。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ産物は大部分
（９０％）が二次アシル鎖を含まないものであるが、ペンタアシル構造の混合体
も提供する。各種構造体について活性に差が無いことが示されている。

【００１４】ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのリピドＡ構造体は１９９２
年にＫｕｌｓｈｉｎらにより解析された。しかし、ナイセリアの遺伝子構造に関
してはｈｔｒＢ遺伝子の有無については知られておらず、又は同定もされていな
い。更に、たとえそれを見いだすことができたとしても、それら遺伝子内の変異
が、生ずる変異体株や、産物及び産物類に及ぼす影響については何も知られてい
ない。

【００１５】

【発明の概要】

我々はＬＰＳの二次アシル化に関連する遺伝的配列を探索し、そして同定した
。我々はＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓゲノム内に２種類の配
列を見いだした。この情報に基づき、我々は様々な様式にて機能できる２種類の
アシルオキシアシルトランスフェラーゼの存在を仮定した。このような様式の一
つでは、これらトランスフェラーゼの内１種類だけが別の類似体を大腸菌の工程
、即ちＨｔｒＢに触媒できるものだろう（図１）。あるいは、この髄膜炎菌のリ
ピドＡが対称性構造を有することから、単一の酵素が両方のアシル化を触媒する
ことも考えられる。従って我々はＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓのリピドＡ合成遺伝子内に突然変異を起こし、この突然変異体株が生存可能で
あることを見いだした。我々はこれらの株が変異型ＬＰＳを産することも見いだ
した。この変異型ＬＰＳの毒性は低下していた。しかし、ｈｔｒＢ２遺伝子の突
然変異は免疫刺激活性を保持しない産物を生じた。その結果生じた産物は、ワク
チンに有用ではないと考えられた。ワクチンのアジュバントとして利用できない
産物が生じた。

【００１６】しかし、驚くべきことに我々はＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓのｈｔｒＢ１遺伝子の変異により、毒性が低くアジュバント活性化を提供する
産物をもたらすことを見いだした。我々はこの得られた産物の分子構造を解析し
、グラム陰性菌の相当分子が同様の様式にて有用であるはずであるという結論に
達した。我々は毒性だけでなくアジュバント活性も分子の構造に密接に関係して
いることを見いだした。具体的には、二次アシル成分が特に関連が深い。更に我
々はリン酸化のパターンも関連していることも見いだした。

【００１７】その結果、今回我々は明瞭なアジュバント活性を持つ毒性の低いＬＰＳ誘導体
であり、その天然での存在は既知でなく且つ従来技術からは知ることも、あるい
は推測することもできない特性を有している前記誘導体を特異的に産ずる方法を
提供する。

【００１８】

【発明の詳細な記載】

本発明は、遺伝的に修飾されたグラム陰性菌より得られるＬＰＳの新規低毒性
型を目的とする。これら新規ＬＰＳ構造体はアジュバント活性を有する。

【００１９】新規ＬＰＳ構造体は対応する非修飾型ＬＰＳ分子に比べＬＰＳ分子当たり二次
アシル鎖の数が少なく組換え体として定義され、前期二次アシル鎖は一次アシル
鎖に結合し、前期アシル鎖は前期組換えＬＰＳ分子のグルコサミンに結合し、前
期組換えＬＰＳはアシル化パターンに関し均一である。化学的に修飾されたＬＰ
Ｓが記述され、Ａｐｉｃｅｌｌａに従い遺伝的に加工されたＨ．ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅＬＰＳである従来技術に比べ、本発明による新規ＬＰＳはアシル化パター
ン、特に二次アシル化パターンの均一性も保証されているものとして得ることが
できる。当然これはワクチンに標準化の観点を加える上でよりよい基礎を提要す
るだけでなく、得られた発現産物の活性の解析の観点からもよりよい基礎を提供
する。より具体的には、本発明による好ましいＬＰＳは対応する非修飾型ＬＰＳ
分子に比べ、二次アシル化鎖の数が少なく、前期二次アシル化鎖が一次アシル鎖
に結合し、前期一次アシル鎖は前期組換えＬＰＳ分子内のグルコサミンに結合し
、前期組換えＬＰＳ分子が前期組換えＬＰＳの還元端上にあるグルコサミンに結
合した一次アシル鎖に結合した二次アシル鎖を少なくとも１個有している組換え
ＬＰＳ分子である。実施形態の本発明による組換えＬＰＳは、非修飾型ＬＰＳと
同数の一次アシル鎖を有することができる。本発明による組換えＬＰＳは、非修
飾型ＬＰＳと同一の一次アシル鎖組成を有することができる。例示すると、上記
本発明のいずれかの実施形態による組換えＬＰＳは組換えＬＰＳ分子当たり、還
元端のグルコサミンに結合した一次アシル鎖を２個有している。好ましい実施形
態では、本発明のＬＰＳは組換えＬＰＳ分子当たり、還元端のグルコサミンの３
位にある一次アシル鎖を有するだろう。より具体的には、非修飾型ＬＰＳに対し
ラウロイルアシル化が組換えＬＰＳ修飾の標的である。この様な組換えＬＰＳは
非修飾型ＬＰＳに比べると、組換えＬＰＳ分子当たりの二次ラウロイル鎖の数は
少ない。好ましくは、本発明の組換えＬＰＳは非修飾型ＬＰＳに比べ、組換えＬ
ＰＳ分子当たりの組換えＬＰＳ分子の非還元末端に結合した二次ラウロイル鎖の
数は少ないだろう。上記いずれかのタイプの本発明による実施形態は好ましくは
、組換えＬＰＳは、組換え体当たりＬＰＳ分子の還元末端の一次アシル鎖に結合
したＬＰＳ二次ラウロイル鎖を少なくとも１個有している。この様な組換え体の
例は、組換えＬＰＳ分子当たりＬＰＳ分子の還元末端にあるグルコサミンの２位
にある一次アシル鎖上に二次ラウロイル鎖を有している。具体的には前期実施形
態のいずれかによる組換えＬＰＳでは、組換えＬＰＳ分子当たりＬＰＳ分子の還
元端にあるグルコサミンの２位にある一次アシル鎖上に二次アシル鎖を有する前
期組換え体が実際に重要であることが見いだされている。対象となる別の実施形
態は、本発明の上記規定のいずれかによる組換えＬＰＳであり、各組換えＬＰＳ
分子当たり全体として５アシル鎖を有するものである。

【００２０】別の好ましい実施形態では、本発明の前期実施形態による組換えＬＰＳは、各
ＬＰＳ分子の非還元端にあるグルコサミンに結合するリン酸基、及び各組み換え
体ＬＰＳ分子の還元端にあるグルコサミンに結合するリン酸基を有する。上記に
加え、本発明の別の実施形態は各組換えＬＰＳ分子のフォスフォエタノールアミ
ン基を一つ持つ組換え体から成る。更に、本発明による好ましいＬＰＳは、各組
換えＬＰＳ分子当たり１個のフォスフォエタノールアミンを有する。ＬＰＳ分子
の非還元末端にあるグルコサミンに結合するリン酸基と分子の還元末端のグルコ
サミンに結合するリン酸基を有し、後者のリン酸記は更に各組換えＬＰＳ分子の
分子の還元末端にあるフォスフォエタノールアミンにも結合している組換えＬＰ
Ｓは、特に好ましい実施形態を形成する。各種ＬＰＳ実施形態に記載の要素のい
ずれかの組み合わせもまた本発明の範囲にはいることに留意せよ。グラム陰性細
菌は、本発明による組換えＬＰＳの資源として利用できる。特にこの観点では、
細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＨ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕｓより成るグループから選択された細菌が好ましい資源と考
えられる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ菌は特に有害であり、
これら細菌に由来するＬＰＳが好ましい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏａｅは、Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａの定義内にある細菌のグループに属する細菌の中にある好ましい２細菌であ
る。実施例では、我々はＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｈ４
４／７６由来のＬＰＳを利用した。この株を基本として、我々はきわめて有用で
ある以下のＬＰＳ構造体を見いだした。

【００２１】

【化２】上記の如く、本発明による組換えＬＰＳは低い毒性を有する。毒性の低下は実
施例に提供される毒性に関する一般的アッセイを利用して決定できるが、その他
多くのアッセイも当業者には明らかである。本発明のいずれかの実施形態による
組換えＬＰＳは、対応する非修飾型ＬＰＳに対し低い毒性を有している。対応す
るアッセイを利用し試験される場合、低毒性が試験された別の物質はＭＰＬであ
る。本発明のいずれかの実施形態による組換えＬＰＳはアジュバント活性を有す
る。対応するアッセイを利用し試験する場合、アジュバント活性が比較される物
質はＭＰＬである。本発明の実施形態のいずれかによる組換えＬＰＳはアジュバ
ント活性を示す。本発明による組換えＬＰＳは、対応するアッセイを利用し試験
した場合にはＭＰＬより高いアジュバント活性を揺する。あるいは、アジュバン
ト活性はＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳの活性と比
較することができ、対応するアッセイを利用し試験された場合には、本発明のＬ
ＰＳはより高いアジュバント活性を示すだろう。本発明による組換えＬＰＳのア
ジュバント活性を試験する別の方法は、アルカリ加水分解した髄膜炎菌のＬＰＳ
に対するものである。本発明による好ましい組換えＬＰＳは、対応するアッセイ
を利用し試験する場合には、アルカリ加水分解された髄膜炎菌のアジュバント活
性に比べ高い活性を有するだろう。アジュバント活性は、非修飾型ＬＰＳを得た
同一細菌群に対する抗原を利用して調べることができるだろう。更にアジュバン
ト活性は、非修飾型ＬＰＳを得た細菌群に属するもの以外の各種細菌に対する抗
原を用い評価することもできる。実施例はアジュバント活性の試験の例示を提供
する。本発明による組換えＬＰＳは細菌培養からのＬＰＳ分離に適した標準的方
法を利用し、実質的単離及び精製することができる。

【００２２】本発明は本発明による組換えＬＰＳの前期実施形態のいずれかに規定されたＬ
ＰＳだけを目的とするものではない。その様な組換えＬＰＳを含む組成体も目的
としている。より具体的には、これら組成体は医薬品として許容されるキャリア
ーと組み合わせた、活性成分としてＬＰＳを利用したワクチンである。本発明に
よる組成体及び特に本発明によるワクチンはアジュバントとして組換えＬＰＳを
含む。組成体はグラム陰性細菌に対する免疫反応の刺激に関し好ましい。組成物
は、組換えＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌以外の細菌を原因とする感染症と
の戦いに利用できる。しかし、同一型の細菌との戦いに関してきわめて好ましく
利用できる。ＮｅｉｓｅｒｉａのＬＰＳはＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染と戦うワクチ
ンに利用できるが、同時にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａの感染と戦うものにも利用でき
る。麻疹に対するワクチンは本発明による組換えＬＰＳを本発明によるアジュバ
ントとして含む事ができるとも予想される。本発明による組成体は他アジュバン
トなしに利用することができる。具体的には本発明の組成体、好ましくはワクチ
ンは市販のワクチンに通常使用されるいずれのアジュバントを含まない。好まし
くは、本発明の組成物はフロイント型ミネラルエマルジョン、アルミニウム塩、
サポニン、ムラミールジペプチド、及び誘導体ＭＰＬとＭＦ５９を含まない。あ
るいは、本発明のワクチンは一般的に使用されている市販のアジュバントを、現
在使用されている市販ワクチン製品より低用量含み、それにより本発明によるＬ
ＰＳを含まず、通常のアジュバントの組成及び量を含む対応するワクチンに比べ
を低い毒性を示す様になる。本発明の成分が免疫促進作用を有し、ワクチンとし
て有用となることに関しては、組成体は免疫反応を促進するために、アジュバン
トに加え抗原を含むことが好ましい。好ましくは、抗原は組換えＬＰＳに対応す
るＰＬＳを得た細菌に対応する細菌類以外の細菌に対する免疫反応の促進獲得に
特異的である。本発明の組成体は、免疫反応を促進するアジュバント以外に抗原
を含み、この抗原が組み換えた体ＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌群に対応す
る１種類の細菌に対する免疫反応の促進獲得に特異的であるものも、実施形態の
一つである。例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、及び本発明による組換え体Ｎｅｉ
ｓｓｅｒｉａＬＰＳである。この場合同一種である必要はないが、それらが同一
種であっても良い。即ちＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ組換え
ＬＰＳはＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原と共に存在するこ
とができる。しかし、このＬＰＳはＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種より得たものでも良い。好ましくは、本発明の組
成物は医療投与形状である。例えば、注射投与形状である。好ましくは、本発明
の組成体は全身受け入れ可能な形状であろう。アジュバントと追加の抗原は、ヒ
ト又は動物に免疫刺激反応を提供するのに好ましい量存在するだろう。それは無
毒量又は寛容可能な有毒量存在するだろう。ワクチンの好ましい適用では病的な
副作用を提供しない。本発明は更に、本発明の実施形態の何れかによる組換えＬ
ＰＳの、特にワクチン製剤中での免疫反応促進を目的とした組成体中でのアジュ
バントとしての利用も含む。本発明は更に、組換えＬＰＳ又は本発明による組成
粒に関し記述された実施形態の何れかの様なものを含む組成体を、免疫促進を提
供するのに十分な量投与することにより、ヒト又は動物の免疫系を刺激する治療
法も包含する。ワクチン分野の熟練者は、被験者及び／又は疾患、あるいは闘う
感染症を基本とし、どの様な製剤及び投与量が適用できるか確認することもでき
るだろう。通常利用可能な抗原及びワクチンのキャリアーは、既知ワクチン同様
に利用できる。緩衝液はキャリアーの好ましい例である。投与方法は、例えば非
腸管的（例えば静脈内又は筋肉内）又は経口的（例えば活性物質を密封するため
のチフス菌細胞の利用）投与に関する一般的方法により実施できる。

【００２３】本発明は、本発明による組換えＬＰＳを生産するための方法も提供する。方法
は、リピドＡ合成経路の中のＬＰＳ分子のグルコサミンに結合した一次アシル鎖
に二次アシル鎖を付加するレベルに突然変異を含む組換え体グラム陰性菌を培養
し、続いて随意得られたＬＰＳを分離、精製することを含む。具体的には、突然
変異は二次アシル付加に関連する酵素をコードする遺伝子内の突然変異である。
上記開示の様に、各種グラム陰性細菌の分野では多くの合成経路が利用できる。
従来技術分野に存在するデータを本書に開示される主題と組合せ利用することで
、各種グラム陰性菌に関し本発明よる組換えＬＰＳを提供する各種方法を得るこ
とができる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｈ４４／７６に
ついて提供されたｈｔｒＢの配列データを利用することで、例えば他のＮｅｉｓ
ｓｅｒｉａ菌の様な他生物に於ける対応配列を得ることができる。これら生物体
での活性型ｈｔｒＢ１発現産物の発現を排除する突然変異を導入することで、所
望の組換えＬＰＳの産生が保証される。ｈｔｒＢ１遺伝子の局在及び同定は、Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｓ株Ｈ４４／７６に関する実施例の中
に詳述される。得られた配列データは他株の推測に利用できる。利用できる配列
データと実施例中に利用されるプローブの相同性を利用するか、又はＮｅｉｓｓ
ｅｒｉａｍ，ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｈ４４／７６ｈｔｒＢ１の全配列又
は部分配列に基づく別のプローブを利用することで、別の細菌の変形したｈｔｒ
Ｂ配列を同定することができる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ菌に関しては上記に加えて
、ｈｔｒＢ１がｒｕｖｃ遺伝子の下流に位置すること、そしてｒｕｖｃ配列の下
流にあるｈｔｒをコードする遺伝子配列が突然変異導入に関し最適な場所である
ことが判明している。グラム陰性菌内にある、図２のコーディング配列に対し３
３％異常の相同性を有する何れの遺伝子配列も、本発明の組換えＬＰＳを提供す
る変異に関し可能性を有する場所である。相同性の強さは更に高い、例えば５０
％以上であることが好ましく、より好ましくは６０％異常である。少なくとも５
００ｂｐの全長にわたり、より好ましくはコーディング配列の全長にわたり相同
性が１００％に近づくほど良い。あるいは又は組合せにより、同一または近似の
アミノ酸配列のコーディング配列を探索することができ、非活性型発現産物を生
じる配列に突然変異を起こすことができる。より好ましくは、配列はｒｕｖｃ配
列の下流に位置する。好ましくは、選択される突然変異は、ＬＰＳの還元末端に
ある一次アシル鎖への二次アシル鎖付加に関連する酵素をコードしている遺伝子
内の突然変異である。実施例より明らかな様に、二次ラウロイルに関連する酵素
をコードしている遺伝子内の突然変異が好ましい。特異的な好ましい突然変異は
、ＬＰＳ分子の非還元末端にあるグルコサミンの２’位に存在する一次アシル鎖
への二次アシル鎖付加に関連する酵素をコードしている遺伝子内の突然変異であ
る。

【００２４】本発明の実施形態では、組換えＬＰＳは他の形状のＬＰＳが無い状態で単離、
精製される。ワクチンを製剤化する方法では、ワクチンの正確な製剤を得るため
にＬＰＳをまず単離することが好ましい。好ましくは、本発明の方法は、非修飾
型ＬＰＳに比べ組換えＬＰＳ分子当たり少ない数の二次ラウロイル鎖数を有し、
他の形状のＬＰＳを含まない様に単離精製された組換えＬＰＳを提供することを
含む。好ましい実施形態では、非修飾型ＬＰＳに比べて組換えＬＰＳ分子当たり
の、組換えＬＰＳ非還元末端に結合した二次ラウロイル鎖の数が少ない組換えＬ
ＰＳが提供される。好ましい実施形態では、組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分
子の還元末端にある一次アシル鎖に結合した二次ラウロイル鎖を少なくとも１個
有する組換えＬＰＳが提供される。好ましくは、この様な方法では突然変異は組
換えＬＰＳが、組換えＬＰＳ分子当たりＬＰＳ分子の還元末端にあるグルコサミ
ンの２位にある一次アシル鎖上に二次アシル鎖を有する様なものである。好まし
くは、この二次アシル鎖は二次ラウロイル鎖である。好ましい方法は、全体とし
て組換えＬＰＳ分子当たり５個のアシル鎖を有する、本発明の組換えＬＰＳを生
ずる様な突然変異工程を含む。本発明の別の方法は、組換えＬＰＳ分子当たりに
ＬＰＳ分子の非還元末端のグルコサミンに結合した１個のリン酸基と、分子の還
元末端のグルコサミンに結合した１個のリン酸基を持つ組換えＬＰＳを産生する
ことを含む。好ましくは、ＬＰＳ産物は、他の形状のＬＰＳを含まない様に単離
され、精製される。あるいは、方法は他の形状のＬＰＳを含まない様に好ましく
単離され分離される、組換えＬＰＳ分子当たり１個のフォスフォエタノールアミ
ン基を有する組換えＬＰＳを産生することを含むことができる。

【００２５】本発明により、組換えＬＰＳ分子当たりＬＰＳ分子の非還元末端のグルコサミ
ンに結合した１個のリン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１個
のリン酸基を有し、後者が更に分子の還元末端のフォスフォエタノールアミンに
結合している組換えＬＰＳが産生され、そして他の形状のＬＰＳを含まない様に
好ましく単離され、精製される方法が提供される。

【００２６】本発明は、本発明の範囲を限定するこものと考えられない実施例により更に例
示される。本発明によるＬＰＳの多数の変異体とその利用は、遺伝子工学分野、
特にグラム陰性細菌及びワクチン産生の一般的知識と組み合わせたクレーム、記
述及び図面内に提供される情報を基に、当業者にとって明瞭になるだろう。具体
的には引用した参考文献、及び出願日まえに入手可能であるグラム陰性ゲノム配
列により公的に利用可能なＤＮＡデータベース内の情報は、参照されここに取り
込まれている。分離、精製の方法又は工程が記述される場合、それらは当分野に
一般的であり、公知の他の方法に類似している。ｈｔｒＢ１遺伝子内に突然変異
を導入する場合にも同じことが言える。これは、変異するために選択されたＤＮ
Ａ配列が生体内にある場合には、自明な方法による挿入、欠失又は置換により起
こすことができる。ワクチン製剤化及びその投与の方法も、説明を必要としない
一般的な方法である。

【００２７】使用した用語は当業者にとって認識される用語であり、遺伝子工学、グラム陰
性菌及び免疫学の分野に関する一般的教科書、及び／又は引用参考文献より得る
ことができる。

【００２８】

【実施例】

実施例１変更リピドＡを持つＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ突然変異体
ｈｔｒＢ１の構築Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ由来のｈｔｒＢ／ｍｓｂＢ遺伝子配列を利用し、我々はオクラホマ大
学によりインターネント上に提供されている淋菌遺伝子配列についてＢＬＡＳＴ
探索を実施した。有意な相同性を有する複数のコンティグが同定され、これら配
列に基づきＰＣＲプライマーを設計した。髄膜炎菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、
プライマーｐｒ４４７−２及びｐｒ６７０−１により約５００ｂｐのＰＣＲ産物
を得、これをベクターｐＣＲＩＩにクローニングし配列決定を行った結果、複数
の細菌種よりｈｔｒＢ／ｍｓｂＢ配列に対し相同である配列を見いだした（大腸
菌遺伝子に関し、それぞれ３３％と３１％）。この断片をＮｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全なｈｔｒＢ１遺伝子を含むより大型の染色体断
片を分離するためのプローブとして利用した（図２）。この遺伝子のすぐ上流に
、ＤＮＡ修復と組み換えに関与するがＬＰＳ生合成には関与しないと考えられて
いる、大腸菌のｒｕｖＣ遺伝子に相同であるオープンリーディングフレームが見
いだされた。

【００２９】カナマイシン耐性カセットをクローン化されたｈｔｒＢ１のＰＣＲ産物内にあ
るＢｇｌＩ内に挿入し、得られた構築体（淋菌取り込み配列も含むプラスミドｐ
ＢＳＮＫ６）を利用して髄膜遠菌株Ｈ４４／７６をカナマイシン耐性に形質転換
した。ＰＣＲを利用し、染色体ｈｔｒＢ１遺伝子による正確な対立遺伝子交換が
起こったことを確認した。こうして得た全ての形質転換体は、トリシン−ＳＤＳ
−ＰＡＧＥとそれに続く銀染色法により分析した結果、ＬＰＳの移動度が増加し
ていることが示された（図３）。

【００３０】髄膜炎菌のＬＰＳの多糖類部分に対し特異的であるモノクローナル抗体の結合
は突然変異の影響を受けないことから、リピドＡ部分のみが変化したことが示唆
された。

【００３１】実施例２ｈｔｒＢ１変異体リピドＡの構造分析全細胞のガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリーによる脂肪酸分析
からは、野生親株に比べｈｔｒＢ１変異体ではＣ１２：０／Ｃ１２：０３−Ｏ
Ｈの割合が低下していることが示され、二次Ｃ１２：０アシル鎖の（部分的）消
失が示唆された。この変異体より得たＬＰＳを温フェノール／水抽出により精製
し、酸加水分解とクロロフォルム／メタノール抽出によりリピドＡ分画を得た。
続いてその構造をタンデムマススペクトロメトリーを利用して調べた。

【００３２】分析の結果、主要のペンタアシル種ではＣ１２：０アシルオキシアシル鎖が分
子の非還元末端より消失していることが示された（図４）。

【００３３】更に２糖類の還元末端のリン酸かパターンにも親株と違いが見られ、追加のリ
ン酸基が存在することが判明した。この突然変異型リピドＡ分子は他のグラム陰
性菌に関しこれまで報告されたいずれの突然変異体に見いだされたことのない特
異的な構造を有している。

【００３４】実施例３ｈｔｒＢ１突然変異ＬＰＳの生物学的活性変異株ｈｔｒＢ１の全細胞について、リムルスアメーバ分解産物（ＬＡＬ）と
腫瘍壊死因子−ａ）（ＴＮＦ−ａ）誘導アッセイを利用しそれらのＬＰＳ関連生
物学活性を調べた。ＬＡＬアッセイでは、野生型に比べ変異体では全細胞に関し
活性の７倍の低下が観察された。ＭＭ６によるＴＮＦ−ａ誘導に関しては、ｈｔ
ｒＢ１細菌細胞は野生型に比べ活性は少なくとも１００倍低く、ＬＰＳ完全欠損
変異体の全細胞について認められた低下と同様であることが示された（図５）（
Ｌ．Ｓｔｅｅｇｈｓら、１９９８）。

【００３５】ＬＰＳ欠失髄膜炎菌変異体より分離された外膜複合体を利用したマウス免疫を
利用して、各種ＬＰＳ標本のアジュバント活性を比較した。抗体反応は全細胞Ｅ
ＬＩＳＡと親株Ｈ４４／７６に対する殺菌アッセイにて測定された。

【００３６】主要膜蛋白質の免疫原性は野生型及びｈｔｒＢ１変異体ＬＰＳの何れについて
も正常レベルに保たれていたが、無毒ＬＰＳ種のモノフォスフォリルリピドＡ（
ＭＰＬ）、ＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳ、及びア
ルカリ加水分解髄膜炎菌ＬＰＳでは消失していた（図６）（ＮａｋａｎｏＭ及
びＭａｔｓｕｕｒａＭ．）。従って、ｈｔｒＢ１変異体のＬＰＳは毒性は低下
したが、アジュバント活性は維持していた。

【００３７】実施例４ｈｔｒＢ２リピドＡ変異体の特性大腸菌及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｈｔｒＢ／ｍｓｂＢに相同な他の遺伝
子も、前記ｈｔｒＢ１例と同様に同定され、また不活性化された。しかしｈｔｒ
Ｂ１と異なり、この変異体（ｈｔｒＢ２と命名）のＬＰＳは毒性だけでなくアジ
ュバント活性も大きく低下した（図６）。

【００３８】同様にｈｔｒＢ１と異なり、本変異体はＨ４４／７６内に野生型ＬＰＳを導入
することはできず、ただガラクトースを欠損し切り詰められた多糖鎖を持つｇａ
ｌＥ誘導体内にのみ導入できた。

【００３９】方法細菌株及びプラスミド大腸菌株ＮＭ５２２及びＩＮＶａＦ’をＬＢ培地内、３７℃にて増殖させた。
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｈ４４／７６及びその誘導体は、３７℃、Ｉｓ
ｏＶｉｔａｌｅＸ（ベクトンディキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ
）社）を加えたＧＣ培地ベース（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社）上、５％ＣＯ２を
含む湿潤雰囲気内、あるいは既報（ｖａｎｄｅｒＬｅｙら、１９９３）の液
体培地内にて増殖させた。髄膜炎菌の形質転換体の選別には（ｖａｎｄｅｒ
Ｌｅｙら、１９９６）カナマイシンを７５−１００マイクログラム／ｍｌの濃度
で使用した。大腸菌の場合、抗生物質は以下の濃度で使用した：アンピシリン、１００マイクログラム／ｍｌ；カナマイシ、１００マイクログ
ラム／ｍｌ。

【００４０】ＰＣＲ断片のクローニングに関しては、ベクターｐＣＲＩＩを利用したＴＡク
ローニングキット（インビトロゲンン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）を利用した
。

【００４１】組み換えＤＮＡ技術大部分の組み換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記述された
通りである。プラスミドＤＮＡはｐＬＡＳｍｉｘ（タレント（Ｔａｌｅｎｔ）社
）を利用し単離された。ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）はＴａｑ
ポリメラーゼを使い、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシス
テム９６００にて実施された。配列分析はアプライドバイオシステムス社（Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の自動シークエンサーを使い、２本鎖プラ
スミド鋳型ＤＮＡ（キアゲン社カラムにて単離された）を使い、サイクルシーク
エンシング法にて実施された。

【００４２】ＬＰＳ分析Ｌｅｓｓｅら記載の様にして（１９９０）トリシン−ドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、４％の濃縮ゲルと１６％の分離ゲルを利用
し実施した。プロテアーゼＫ処理した煮沸細菌細胞をサンプルに利用した。ゲル
は２０ｍＡ定電流にて１７時間泳動され、ＴｓａｉとＦｒａｓｃｈ（１９８２）
の方法にて銀染色された。エンドトキシン活性に関する発色ＬＡＬアッセイは、
バイウイッタッカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＩｎｃ．）（Ｗａｌｋｅｒｓ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ、ＵＳＡ）社のＱＣＬ−１０００キットをメーカーの指示書通
りに使用し実施した。一晩培養したものを髄膜炎近培地にて６２０ｎｍのＯＤが
０．１なるまで希釈し、この保存体の連続希釈液をＬＡＬアッセイのサンプルに
利用した。細菌懸濁液のＴＮＦ−ａ誘導は、ヒトマクロファージ細胞株ＭＭ６に
て試験し、ＴＮＦ−ａ感受性細胞株ＷＥＨＩ１６４（ＥｓｐｅｖｉｋとＮｉｓｓ
ｅｎ、１９８６）を利用し、培養体上清より定量化した。ＧＣ−ＭＳによる脂肪
酸分析に関しては、ＯＭＣサンプルを３時間、９００℃にてピリジン及び無水酢
酸中にてアセチル化しＬＰＳを完全に溶解した。続いてサンプルはＬｉＡＩＨ４
存在下にテトラヒドロフラン中にて、３時間、６５０Ｃで加熱され、Ｏ−結合型
脂肪酸を遊離型アルコールに還元した。これらはＧＳＴＦＡ＋１％ＴＭＣＳのピ
リジン液を利用し、１時間、６００ＣにてＴＭＳ−エーテルに誘導され、電子イ
ンパクトモードのＡｕｔｏｓｐｅｃ（ミクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）社、マ
ンチェスター（Ｍａｎ−ｃｈｅｓ−ｔｅｒ）、ＵＫ）を用いたＧＣ−ＭＳにて分
析された。サンプル中の３−ＯＨＣ１２量は２−ＯＨＣ１２を内部標準とし
て利用し、定量化された。ＬＰＳは温フェノール−水抽出法（Ｗｅｓｔｐｈａｌ
とＪａｎｎ、１９６５）により分離された。リピドＡの単離に関しては、ＬＰＳ
を軽い酸加水分解（１＆酢酸、２．５時間、１０００℃）にかけ、続いて再沈殿
し、クロロフォルム−メタノール−水中に最終分画した。精製リピドＡの構造分
析は、電子スプレータンデムマススペクトロメトリーを用い実施された。マスス
ペクトロメトリーは、６００Ｖにて作動するナノエレクトロスプレーイオン源を
装着した４極子イオントラップ装置（ＬＣＱフィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）社
、サンジョセ（ＳａｎＪｏｓｅ）ＵＳＡ）を用い実施された。インレットキャ
ピラリーの温度は２００℃に設定され、トラップ中の最大イオン数は１，０×１
０７であり、最大注入時間は１５０ｍｓであった。ナノエレクトロスプレーニー
ドルには２マイクロリッターのサンプル液が充填された。全ＭＳスペクトラムが
１５０−１８５０ａｍｕにわたり記録された。常に全ＭＳ（ｎ）スペクトラムに
先行して親イオンのズームスキャンを実施し、親イオンのｍ／ｚ比をより正確に
決定すると同時に、その荷電状態も決定した。ＭＳ／ＭＳスペクトラムは親イオ
ン選択に関しては３ａｍｕのウィンドウを利用し記録された。励起エネルギーは
親に対する基礎ピークの強度比が３から２０の間にくる様に調製された。ズーム
スキャンスペクトラム以外は質量中心モードで記録された。

【００４３】ＯＭＣ組成体の特徴付けクラス１、３及び４のＩＭＰｓ、ならびに免疫型Ｌ３ＬＰＳの多糖部分に特異
的なｍＡｂｓの結合は、全細胞ＥＬＩＳＡ（ｖａｎｄｅｒＬｅｙら、１９９
５、１９９６）にて試験された。ザルコシル抽出によるＯＭＣｓの分離と、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによるその分析は既報（ｖａｎｄｅｒＬｅｙら、１９９３）の
如くに実施された。

【００４４】マウスの免疫各５匹ずつから成る６ないし８週齢のＢａｌＢ／Ｃマウスのグループを、０日
目にアジュバントを添加された、０．５ｍｌのＰＢＳ中に溶解された２０マイク
ログラムのＬＰＳ−欠損Ｈ４４／７６ＯＭＣｓを皮下に作用させ免疫した。１４
日目と２８日目に免疫を繰り返し、４２日目にマウスを屠殺した。血清を集め４
℃に保管した。血清の株Ｈ４４／７６に対する殺菌活性はＨｏｏｇｅｒｈｏｕｔ
ら（１９９５）記載如く、最終濃度２０％のウサギ補体を利用しアッセイした。
殺菌力価は９０％以上の殺滅を示す血清希釈の逆数として測定された。

【００４５】

【参考文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌リピドＡ生合成中のｈｔｒＢ及びｍｓｂＢ遺伝子産物の役割。

【図２a】ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｈｔｒＢ１遺伝子の構造（
Ａ）配列（Ｂ）。

【図２b(1)】ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｈｔｒＢ１遺伝子の配列（
Ｂ）。

【図２b(2)】ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのｈｔｒＢ１遺伝子の配列（
Ｂ）。

【図３】Ｈ４４／７６野生型及びプラスミドｐＢＳＮＫ６を利用し得たカナマイシン耐
性形質転換体のＬＰＳのトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

【図４a】Ｈ４４／７６野生型（Ａ）のリピドＡのマススペクトロメトリーによる構造分
析。

【図４b】Ｈ４４／７６のｈｔｒＢ１変異体（Ｂ）のリピドＡのマススペクトロメトリー
による構造分析。

【図５】株Ｈ４４／７６、突然変異ｈｔｒＢ１及びＬＰＳ欠失株ｐＬＡＫ３３の完全菌
によるＭＭ６細胞内へのＴＮＦ−ａ誘導。

【図６】ＬＰＳ欠失ＯＭＣｓと共にマウス免疫に利用した場合の各種ＬＰＳ標本のアジ
ュバント活性の比較。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01） //(Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01）Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハムストラ、ヘンドリーク・ヤンオランダ国、エヌエル−3961 エルジェイ・ビーク・ビー・デュールステーデ、ロスモレン 36 (72)発明者ステーグス、リアナ・ジュリアナ・ジョゼフィーヌ・マルグリートオランダ国、エヌエル−3511 エムピー・ユトレヒト、アーサー・バン・シェンデルストラート 539 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA38 DA02 EA04 GA11 HA12 HA15 4B064 AG30 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 4C057 BB03 DD03 GG05 4C085 AA03 AA38 BA16 CC31 DD23 EE06 FF14 GG01 4C090 AA01 AA04 AA09 BA76 BC15 BD31 CA42 DA23 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】対応する非修飾型ＬＰＳ分子に比べＬＰＳ分子当たりの二次
アシル鎖の数が少なく、そして前記二次アシル鎖は一次アシル鎖に結合されてお
り、さらに前記一次アシル鎖はその組換えＬＰＳ分子のグルコサミンに結合して
おり、そしてその組換えＬＰＳのアシル化パターンが均一である組換えＬＰＳ。
【請求項２】対応する非修飾型ＬＰＳ分子に比べ二次アシル鎖の数が少な
く、前記二次アシル鎖は一次アシル鎖に結合され、さらに前記一次アシル鎖はそ
の組換えＬＰＳ分子のグルコサミンに結合し、そしてその組換えＬＰＳがその組
換えＬＰＳ分子の還元末端にあるグルコサミンに結合している一次アシル鎖に結
合する二次アシル鎖を少なくとも１個有している組換えＬＰＳ。
【請求項３】前記ＬＰＳが非修飾型ＬＰＳと同数の一次アシル鎖を有する
、請求項１又は２の組換えＬＰＳ。
【請求項４】前記ＬＰＳが非修飾型ＬＰＳと同一の一次アシル鎖の組成を
有する、前記請求項何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項５】前記ＬＰＳが、組換えＬＰＳ分子の還元末端グルコサミンに
結合する一次アシル鎖を２個有している、前記請求項の何れか一項に記載の組換
えＬＰＳ。
【請求項６】一次アシル鎖が、組換えＬＰＳ分子の還元末端グルコサミン
の３位置にあるに存在している、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ
。
【請求項７】前記組換えＬＰＳが非修飾型ＬＰＳに比べ、組換えＬＰＳ分
子当たり少ない数の二次ラウロイル鎖を有している、前記請求項の何れか一項に
記載の組換えＬＰＳ。
【請求項８】非修飾型ＬＰＳに比べて組換えＬＰＳ分子当たりの組換えＬ
ＰＳ分子非還元末端に結合する二次ラウロイル鎖数が少ない組換えＬＰＳである
、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項９】前記組換えＬＰＳが、組換えＬＰＳ分子当たり、組換えＬＰ
Ｓ分子還元末端の一次アシル鎖に結合した二次ラウロイル鎖を少なくとも１つ有
している、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項１０】組換えＬＰＳ分子当たり、組換えＬＰＳ分子のグリコサミ
ンの２位にある一次アシル鎖上に二次アシル鎖を有する組換えＬＰＳである、前
記請求の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項１１】組換えＬＰＳ分子当たり、組換えＬＰＳ分子のグリコサミ
ンの２位にある一次アシル鎖上にラウロイル鎖を有している組換えＬＰＳである
、前記請求の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項１２】組換えＬＰＳ分子当たり合計で個のアシル鎖を有する前記
請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ分子。
【請求項１３】組換えＬＰＳ分子当たり、分子の非還元末端のグルコサミ
ンに結合した１リン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１リン酸
基を更に有する組換えＬＰＳである、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬ
ＰＳ。
【請求項１４】組換えＬＰＳ分子当たり、更に１個のフォスフォエタノー
ルアミン基を有する組換えＬＰＳである、前記請求項の何れか一項に記載の組換
えＬＰＳ。
【請求項１５】組換えＬＰＳ分子当たり、分子の非還元末端のグルコサミ
ンに結合した１リン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１リン酸
基を更に有する組換えＬＰＳである、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬ
ＰＳ。
【請求項１６】組換えＬＰＳ分子当たり、分子の非還元末端のグルコサミ
ンに結合した１リン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１リン酸
基を更に有する組換えＬＰＳ。
【請求項１７】組換えＬＰＳ分子当たり１個のフォス路エタノールアミン
基を有する組換えＬＰＳ。
【請求項１８】組換えＬＰＳ分子当たり、分子の非還元末端のグルコサミ
ンに結合した１リン酸基と、分子の還元末端のグルコサミンに結合した１リン酸
基を更に有し、後者リン酸基が更に分子の還元末端のフォスフォエタノールアミ
ンに結合している組換えＬＰＳ。
【請求項１９】グラム陰性細菌のＬＰＳに由来する、前記請求項の何れか
一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２０】前記ＬＰＳがＮｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属の細菌より成るグループか
ら選択された細菌に由来する、前記請求項何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２１】前記ＬＰＳがＮｅｉｓｓｅｒｉａに由来する、前記請求項
何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２２】前記ＬＰＳがＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓに由来する、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２３】前記ＬＰＳがＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ株Ｈ４４／７６に由来する、前記請求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ
。
【請求項２４】前記ＬＰＳが以下の分子構造を有する、前記請求項の何れ
か一項に記載の組換えＬＰＳ。【化１】
【請求項２５】対応する非修飾型ＬＰＳに比べ低い毒性を有する、前記請
求項の何れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２６】対応するアッセイを利用し試験した場合、ＭＰＬに比べ低
い毒性を有する前記請求項のいずれか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２７】アジュバント化性を有する前記請求項の何れか一項に記載
の組換えＬＰＳ。
【請求項２８】対応するアッセイを利用し試験した場合、ＭＰＬに比べ高
いアジュバント活性を有する前記請求項のいずれか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項２９】対応するアッセイを利用し試験した場合、Ｒｈｏｄｏｂａ
ｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰＳに比べ高いアジュバント活性を有す
る前記請求項のいずれか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項３０】対応するアッセイを利用し試験した場合、アルカリ加水分
解された髄膜炎菌のＬＰＳに比べ高いアジュバント活性を有する前記請求項のい
ずれか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項３１】アジュバント活性が、非修飾型ＬＰＳを得た同一細菌群に
対する抗原を利用し評価される、請求項２７〜３０の何れか一項に記載の組換え
ＬＰＳ。
【請求項３２】アジュバント活性が、非修飾型ＬＰＳを得た細菌群に属す
る細菌以外の別の細菌に対する抗原を利用し評価される、請求項２７−３１の何
れか一項に記載の組換えＬＰＳ。
【請求項３３】前記請求項の何れか一項に記載の、本質的に単離され精製
された組換えＬＰＳ。
【請求項３４】前記請求項の何れか一項に記載の組み換えＬＰＳを産生す
る方法であって、前記方法は組換え体グラム陰性細菌を培養することと、続いて
生じたＬＰＳを随意単離し精製することを含み、前記組換えグラム陰性細菌は、
ＬＰＳ分子のグルコサミンに結合した一次アシル鎖に二次アシル鎖が付加するレ
ベルでリピドＡ生合成経路に突然変異を含む方法。
【請求項３５】突然変異が二次アシル付加に関連した酵素をコードする遺
伝子内の突然変異である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】突然変異がＬＰＳの還元末端にある一次アシル鎖への二次
アシル付加に関連した酵素をコードする遺伝子内の突然変異である、請求項３４
又は３５に記載の方法。
【請求項３７】突然変異が二次ラウロイル付加に関連する酵素をコードし
ている遺伝子内の突然変異である、請求項３４〜３６に記載の方法。
【請求項３８】突然変異がＬＰＳの還元末端にあるグルコサミンの２’位
に存在する一次アシル鎖への二次アシル付加に関連する酵素をコードしている遺
伝子内の突然変異である、請求項３４〜３７に記載の方法。
【請求項３９】突然変異がｈｔｒＢ１遺伝子内の突然変異である、請求項
３４−３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】組換えＬＰＳが他の形状のＬＰＳを含まない様に単離され
、精製される、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】非修飾型ＬＰＳに比べ、組換えＬＰＳ分子当たりの二次ラ
ウロイル鎖の数が少ない組換えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単
離され、精製される請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】非修飾型ＬＰＳに比べ、組換えＬＰＳ分子当たりの組換え
ＬＰＳ分子非還元型末端に結合した二次ラウロイル鎖の数が少ない組換えＬＰＳ
が、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精製される請求項３４〜４１
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分子還元型末端にある一
次アシル鎖に少なくとも１個の二次ラウロイル鎖が結合している組換えＬＰＳが
、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精製される請求項３４〜４２の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分子還元型末端にあるグ
ルコサミンの２位にある一次アシル鎖上に１個の二次アシル鎖を有する組換えＬ
ＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精製される請求項３４〜
４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分子還元型末端にあるグ
ルコサミンの２位にある一次アシル鎖上に１個の二次ラウロイル鎖を有する組換
えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精製される請求項３
４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】組換えＬＰＳ分子当たり、合計で５個のアシル鎖を有する
組換えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精製される請求
項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分子の非還元型末端にあ
るグルコサミンに結合するリン酸基１個と、分子の還元型末端にあるグルコサミ
ンに結合するリン酸基１個を有する組換えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まな
い状態で単離され、精製される請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】組換えＬＰＳ分子当たり１個のフォスフォエタノールアミ
ン基を有する組換えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まない状態で単離され、精
製される請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】組換えＬＰＳ分子当たり、ＬＰＳ分子の非還元型末端にあ
るグルコサミンに結合するリン酸基１個と、分子の還元型末端にあるグルコサミ
ンに結合するリン酸基１個を有し、後者がさらに分子の還元末端にあるフォスフ
ォエタノールアミンに結合している組換えＬＰＳが、他の形状のＬＰＳを含まな
い状態で単離され、精製される請求項３４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】請求項１〜３３の何れかによる、又は請求項３４〜４９の
何れかの一項に記載の方法により得ることができる組換えＬＰＳを含む組成体。
【請求項５１】請求項１〜３３の何れかによる、又は請求項３４〜４９の
何れか一項に記載の方法により得ることができる組換えＬＰＳを活性物質として
、医薬品として受け入れ可能なキャリアーと組合せて含んでいる組成物である、
免疫反応を刺激するのに適した組成物（例えばワクチン）。
【請求項５２】請求項５１に記載の組成物であって、前記組成物は組換えＬ
ＰＳをアジュバントとして含む組成物。
【請求項５３】組成物がグラム陰性細菌に対する免疫反応を刺激すること
に適している、請求項５１又は５２に記載の組成物。
【請求項５４】組成物が、組換えＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌に対
応する細菌以外の細菌によって引き起こされる感染症との闘いに利用することが
できる請求項５１〜５３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５５】他のアジュバントを含まない請求項５１〜５４の何れか一
項に記載の組成物。
【請求項５６】以下のアジュバント、フロイント型好物油エマルジョン、
アルミニウム塩、サポニン、ムラミールジペプチド及び誘導型ＭＰＬとＭＦ５９
を含まない請求項５１〜５５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５７】アジュバントに加え、免疫反応を促進するための抗原を含
んでいる請求項５１〜５６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５８】アジュバントに加え、免疫反応を促進するための抗原を含
み、該抗原が組換えＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌に対応する細菌以外の菌
に対する免疫反応の促進獲得に特異的である、請求項５１〜５７の何れか一項に
記載の組成物。
【請求項５９】アジュバントに加え、免疫反応を促進するための抗原を含
み、該抗原が組換えＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌群に対応する細菌に対す
る免疫反応の促進獲得に特異的である、請求項５１〜５７の何れか一項に記載の
組成物。
【請求項６０】医療投与形状にある請求項５１〜５９の何れか一項に記載
の組成物。
【請求項６１】全身性に受け入れ可能な形状にある請求項５１〜６０の何
れか一項に記載の組成物。
【請求項６２】組換えＬＰＳに対応するＬＰＳを得た細菌に対応する細菌
以外の細菌によって引き起こされる感染症との闘いに適した、又は組換えＬＰＳ
に対応するＬＰＳを得た細菌に対応する群に属する細菌によって引き起こされる
感染症との闘いに適したワクチンとしての利用に適した形状にある、請求項５１
〜６１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６３】請求項１〜３３の何れかによる、又は請求項３４〜４９の
何れか一項に記載の方法により得られる組換えＬＰＳの、免疫反応を刺激するた
めの組成物中でのアジュバントとしての使用。
【請求項６４】請求項１〜３３の何れかによる、又は請求項３４〜４９の
何れかの方法により得ることができる組換えＬＰＳの、ワクチン製剤中でのアジ
ュバントとしての使用。