JP2002528129A

JP2002528129A - 組換え方法およびそれに有用な試薬

Info

Publication number: JP2002528129A
Application number: JP2000579768A
Authority: JP
Inventors: パノス・イオアノウ; クマラン・ナラヤナン
Original assignee: ザ・マードック・インスティテュート
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-09-29
Publication date: 2002-09-03
Also published as: EP1127152A1; EP1127152A4; WO2000026396A1; AUPP684998A0; CN1331748A

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般に、少なくとも２つの核酸配列の組換え方法および該方法に有用な試薬に関する。さらに詳しくは、本発明は、ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼまたはその機能的な誘導体を発現する宿主細胞において環状の核酸配列を線状の核酸配列と組換える方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、細菌の人工的な染色体を相同的組換えにより線状ＤＮＡ配列で修飾するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、少なくとも２つの核酸配列の組換え方法および該方法に有
用な試薬に関する。さらに詳しくは、本発明は、ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼまた
はその機能的な誘導体を発現する宿主細胞において環状の核酸配列を線状の核酸
配列と組換える方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、細菌の人工的な染色
体を相同的組換えにより線状ＤＮＡ配列で修飾するのに有用である。

【０００２】（背景技術）本明細書中に数字により言及した刊行物の詳細は本明細書の最後にまとめて示
してある。高等な真核生物のゲノムの構造および構成をより深く理解する必要性が存在す
る。ゲノム配列は、しばしばコード配列よりも遥かに長い。殆どの非コード配列
の機能は未だわかっていないが、該配列が遺伝子発現の制御、安定性および進化
において重要な役割を果たしていることは明らかである。非関連またはウイルス
由来のプロモーターにより駆動されるｃＤＮＡ構築物とは対照的に、大きなゲノ
ム断片の遺伝子伝達は正確な時間（temporal）特異的および組織特異的な遺伝子
発現を示す^１−７。

【０００３】酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、多くの疾患遺伝子のゲノムクローンを提供して
いる^８−１０。多くのヒト遺伝子座についてのＹＡＣを有するトランスジェニッ
クモデルは、種々の疾患の正確なモデルを作製するうえでのそのような大きなゲ
ノム断片の有用性を示している^{１１−１４}。酵母での相同的組換えの高い効率は
、機能分析のためのＹＡＣの遺伝子操作^{３，８，１５}、ＰＡＣまたはＢＡＣへの
ＹＡＣの環状化^{１６，１７}およびより小さな重複するＹＡＣからのより大きなＹ
ＡＣの生成^１８において極めて重要である。

【０００４】しかしながら、ＹＡＣ系には幾つかの制限があり、このことがＹＡＣ系の使用
をひどく妨げてきた。ＹＡＣはクローンの不安定性およびキメラ形成の度合いが
高い^{１９，２０}。さらに、ＹＡＣトランスジェニックを生成するために幾つかの
方法が開発されているが、トランスジェニック生成（transgenesis）のために完
全なＹＡＣＤＮＡを精製することは困難である^２１。ＹＡＣに修飾を導入する
うえでまたはＴＡＲクローニングのうえでの酵母の相同的組換え系の重要な欠陥
は^２２、相同的組換えの程度を制御するのが困難であること、および正確な生成
物を同定するために多数の「組換え」クローンをスクリーニングする必要がある
ことである。

【０００５】大きな挿入のＢＡＣ／ＰＡＣクローニング系^{２３，２４}は、ＹＡＣ系の困難の
多くを克服している。ＢＡＣ／ＰＡＣは、長い範囲のフィジカルマッピング^２５ ^，２６、疾患遺伝子のポジショナルクローニング^２７、全ゲノム配列決定プロジ
ェクト^{２８−３０}および機能的な研究^{３１，３２}にますます用いられている。高
品質のＢＡＣ／ＰＡＣゲノムライブラリーは、細菌でのクローニング効率が高い
ためにＹＡＣライブラリーよりも構築が遥かに容易である。ＢＡＣ／ＰＡＣは、
よく定められた組換え欠失大腸菌株ＤＨ１０Ｂにおいて１菌体当たり１〜２コピ
ーで維持され、多くの世代にわたって高いクローン安定性を示す。ＢＡＣ／ＰＡ
Ｃはサイズが約３００ｋｂまでの挿入物を運ぶが、従来の細菌プラスミド単離法
により機能的研究のために大量に精製することができる。これらクローン中のゲ
ノム挿入物は、大抵のヒト遺伝子座の完全性を保存するに充分な大きさであり、
それゆえ機能的な研究には理想的である。

【０００６】多くの系でゲノム研究を行うための重要な手段としてＢＡＣ／ＰＡＣが上記利
点を有し、その人気が高まっているにもかかわらず、これらクローンで遺伝子操
作を行うための都合のよい技術が存在しない。これらクローン中のゲノム挿入物
の大きなサイズは、通常の操作での都合のよい制限部位の発見を排除している。大腸菌中でＦプラスミドベースのベクターの相同的組換えを用いて重複するDr
osophilaコスミド断片と結合させて１２５ｋｂの断片を生成することが１９８９
年に最初に行われた^３５。ｒｅｃ^＋株での温度感受性の複製起点を有するシャト
ルプラスミド間の同時組み込みは、同時組み込み体を分離するにはｒｅｃ⁻宿主
での第二の部位特異的な組換え事象が必要であった。Sternberg^３４は、大きな
Ｐ１クローン中への真核選択マーカーの転位挿入を記載しているが、これは転位
部位を正確に制御することは困難かもしれないがＰＡＣおよびＢＡＣにも適用可
能なはずである。ＲｅｃＡの助けを借りた（RecA-assisted）制限エンドヌクレ
アーゼ（ＲＡＲＥ）開裂法もまた、多くのＰ１クローンおよびＢＡＣクローンに
修飾を導入するのに首尾よく用いられているが^３５、これは技術的に非常に制限
された方法である。ＰＡＣクローニング系およびＢＡＣクローニング系はともに
各ベクターの骨格上にｌｏｘＰ部位を含むので、多くの研究者はｃｒｅリコンビ
ナーゼを用いてこの部位に真核選択マーカーおよびリポーター遺伝子の挿入をタ
ーゲティングしている^{３６，３７}。

【０００７】 Yangら^３８は、ＤＨ１０Ｂ細胞に一過性の組換え能（proficiency）を付与す
る手段として、温度感受性の複製起点を有するシャトルプラスミド中で野生型ｒ
ｅｃＡ遺伝子を用いた１３１ｋｂＢＡＣのターゲティングした修飾を報告して
いる。しかしながら、この方法を用いてクローンの有意の再配列を行うためには
、サザーンブロッティングにより組換えクローンを特徴付けて正しい生成物を同
定する必要があるという証拠があった。ｒｅｃＡ遺伝子中に温度感受性のアムバ
ー変異を含む大腸菌のＣＢＴＳ株を用いた別の方法もまた、完全なマウスＣＭＶ
ゲノムを含む２３０ｋｂＢＡＣに修飾を導入するのに用いられている^３９。し
かしながら、ＤＨ１０Ｂから条件ｒｅｃＡ株へのＢＡＣの直接的な伝達は困難で
ある。最近、適切な方向にｃｈｉ部位を含むターゲティング構築物を用い、グリ
ーン蛍光タンパク質遺伝子がＧＡＴＡ−２遺伝子座を含むゼブラフィッシュＢＡ
Ｃ中にターゲティングされている^４０。しかしながら、この方法では、ＢＡＣを
組換え能を有する株に移す必要があり、そのため繰返し配列を有するクローンに
おいて不安定性を導きうる。

【０００８】大腸菌のＲｅｃＢＣＤ機能をバクテリオファージλのＲｅｄ−Ｇａｍ系で置換
する方法もまた記載されている^４１。この置換は、ｒｅｃＢＣｓｂｓＢＣまた
はｒｅｃＤ株によって示されるものに比べて少なくとも７０倍高い率で宿主染色
体と短いＤＮＡ断片との間の相同的組換えを行うことを可能にした。しかしなが
ら、この系のＢＡＣ／ＰＡＣの修飾での有用性は検討されていない。

【０００９】（発明の開示）（発明が解決しようとする技術的課題）上記のいずれの方法もＰＡＣおよびＢＡＣの遺伝子操作にとって最適ではない
。これら方法はＲｅｃＢＣＤを発現するＤＨ１０Ｂなどの宿主細胞に直接適用す
ることができず、あるいは複雑なシャトルベクターの構築を必要とする。相同的
組換えの程度もまた、これらの方法の殆どにおいて充分に制御できず、それゆえ
所望としない再配列のリスクを負うことになる。従って、ＰＡＣ／ＢＡＣと線状
ＤＮＡ配列などの２つの核酸配列を宿主細胞中で直接、制御された仕方で組み換
える方法を開発する必要性が存在する。

【００１０】本発明に至るまでの研究過程で、本発明者らは環状ＤＮＡ配列と線状ＤＮＡ配
列などの２つの核酸配列のインビボでの制御された相同的組換えの方法を開発す
べく探究した。とりわけ、本発明者らは、宿主細胞中にて、変調しうる（modula
table）ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ組換え系をｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼインヒビター
の変調しうるレベルとともに発現させることによりＢＡＣとのＤＮＡ配列の相同
的組換えを可能とすることによりＢＡＣを修飾した。ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ
インヒビターの発現は、内生で産生されたｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼの機能的な
活性を阻害するように働く。さらに、ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ相同的組換え系とｒｅ
ｃＢＣＤヌクレアーゼインヒビターとの両者の発現を変調および整合しうること
は、相同的組換え事象の制御を容易にし、ランダムで所望でない組換え事象を最
小にする。相同的組換え系とｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼインヒビターとの両者の
発現を変調および整合しうることは、インビボでは、組換えに供される核酸配列
の少なくとも１つがたとえばＢＡＣのようにＦプラスミド中に位置する場合、あ
るいは宿主細胞が組換え系分子、またはｇａｍなどのｒｅｃＢＣＤインヒビター
の過剰発現に対して感受性である場合のいずれの場合も相同的組換え事象の誘導
を容易にする。

【００１１】（その解決方法）本明細書において言及した核酸配列およびアミノ酸配列の配列同定番号（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ）は文献の後に定めてある。従って、本発明は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換えを
容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的組換え
を容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ、
組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞で
該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該エキ
ソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変
調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００１２】本発明の他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換え
を容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的組換
えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およ
びｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を
発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞で該少なくとも２つのヌ
クレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよび
ｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードするヌクレオチド配列の発現は変調しうるも
のであることを特徴とする方法を提供する。

【００１３】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同
的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ
、およびｇａｍまたはその機能的誘導体を発現しうる宿主細胞を培養することに
より、該宿主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導する
ことを含み、該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍの発現は変調しうるものである
ことを特徴とする方法を提供する。

【００１４】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同
的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ
、およびｇａｍまたはその誘導体を発現しうる宿主細胞を培養することにより、
該宿主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを
含み、該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍの発現は変調しうるものであることを
特徴とする方法を提供する。

【００１５】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同
的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレ
アーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体を
コードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿
主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み
、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの
発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００１６】本発明のさらに他の側面は、環状ヌクレオチド配列と線状ヌクレオチド配列と
の間での相同的組換えを容易にする方法であって、該環状ヌクレオチド配列と該
線状ヌクレオチド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅ
ｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤイ
ンヒビターまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細
胞を培養することにより、該宿主細胞で該環状ヌクレオチド配列と該線状ヌクレ
オチド配列との間で組換えを誘導することを含み、該エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものであるこ
とを特徴とする方法を提供する。

【００１７】本発明のさらに他の側面は、環状ヌクレオチド配列と線状ヌクレオチド配列と
の間での相同的組換えを容易にする方法であって、該環状ヌクレオチド配列と該
線状ヌクレオチド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅ
ｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍまたはその機能的誘導体を発現し
うるＤＨ１０Ｂ細胞またはそのホモログまたは変異体を培養することにより、該
ＤＨ１０Ｂ細胞またはそのホモログまたは変異体で該環状ヌクレオチド配列と該
線状ヌクレオチド配列との間で組換えを誘導することを含み、該ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍの発現は変調しうるものであることを特徴と
する方法を提供する。

【００１８】本発明のさらに他の側面は、少なくとも１つのヌクレオチド配列がＦプラスミ
ド部分を含むものである少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換え
を容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的組換
えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ
、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体をコード
するヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞
で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該エ
キソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は
変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００１９】本発明のさらに他の側面は、ＢＡＣと線状ヌクレオチド配列との間での相同的
組換えを容易にする方法であって、該ＢＡＣと該線状ヌクレオチド配列との相同
的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレ
アーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体を
コードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿
主細胞で該ＢＡＣと該線状ヌクレオチド配列との間で組換えを誘導することを含
み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビター
の発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００２０】本発明の他の側面は、宿主細胞中での少なくとも２つのヌクレオチド配列の相
同的組換えを容易にする方法であって、工程：（i）宿主細胞を形質転換し、その際、形質転換した宿主細胞は、エキソヌクレ
アーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘
導体をコードする第一のヌクレオチド配列、および該少なくとも２つのヌクレオ
チド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質，およびｒｅｃＢＣ
Ｄインヒビターをコードする遺伝子の発現は変調しうるものであり、ついで（ii）該形質転換した宿主細胞を、該第一のヌクレオチド配列の発現が起こるの
に充分な時間および条件下で培養し、その際、該第一のヌクレオチド配列の発現
産物は該第二のヌクレオチド配列と該第三のヌクレオチド配列との相同的組換え
を容易にするを含む方法を包含する。

【００２１】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にするのに有用な微生物の製造方法であって、ｒｅｃＢＣＤ、変調
しうるレベルのエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤイン
ヒビターをコードする遺伝子および該少なくとも２つの他のヌクレオチド配列の
発現が可能となるように宿主細胞を遺伝子操作することを含む方法を包含する。

【００２２】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にし得る細胞であって、エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質お
よびｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードするヌクレオチド配列、ｒｅｃＢＣＤお
よび該少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものであるこ
とを特徴とする細胞を包含する。

【００２３】本発明のさらに他の側面は、本発明の方法によって相同的組換えをした核酸分
子を包含する。本発明の他の側面は、１またはそれ以上の薬理学的に許容しうる担体および／
または希釈剤とともに本発明の方法により製造した修飾核酸分子を含む医薬組成
物を包含する。

【００２４】本発明のさらに他の側面は、宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配列
の相同的組換えを容易にするためのキットであって、エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質、ｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体をコードする
１またはそれ以上のヌクレオチド配列、および相同的組換えを容易にするのに有
用な試薬を収容すべく適合させた区画を含むキットに関する。さらに、たとえば
、組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列、宿主細胞または組換える
べき１またはそれ以上のヌクレオチド配列ですでに安定に形質転換した宿主細胞
などの生物学的試料を収容するためにさらなる区画が含まれていてよい。

【００２５】本発明のさらに他の側面は、宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配列
の相同的組換えを容易にするためのキットであって、エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質、ｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体および相同的
組換えを容易にするのに有用な試薬を収容すべく適合させた区画を含むキットに
関する。さらに、たとえば、組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列
、宿主細胞または組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列ですでに安
定に形質転換した宿主細胞などの生物学的試料を収容するためにさらなる区画が
含まれていてよい。

【００２６】（発明を実施するための最良の形態）本発明は、一部、変調しうるレベルのエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質
およびｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼインヒビターを発現するヌクレオチド配列を宿
主細胞中に導入することにより、宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配
列の相同的組換えを行う方法の開発に基づく。ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼインヒ
ビターの発現は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株などの宿主細胞により内生的に発現される
ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼの線状ＤＮＡ分解活性を阻害するのに必要である。そ
れゆえ、本発明の方法は、相同的組換え系の変調しうるかつ整合した誘導および
ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ活性の阻害に基づく。変調しうるかつ整合した誘導系
の出現は、とりわけ、１またはそれ以上の組換え系分子かまたはｒｅｃＢＣＤイ
ンヒビターのいずれかの過剰発現に感受性の宿主細胞への相同的組換え法の適用
を容易にした。本発明の方法はまた、とりわけ、Ｆプラスミド部分を含む核酸配
列の相同的組換えが望まれる場合に適用できる。

【００２７】従って、本発明は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換えを
容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的組換え
を容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ、
組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞で
該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該エキ
ソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変
調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００２８】「エキソヌクレアーゼ」への言及は、二本鎖核酸配列上に一本鎖領域を暴露す
る（かかる一本鎖領域は、この領域と他の核酸配列の相補的領域との間で組換え
を起こすのに必要である）ことにより相同的組換えを容易にする分子への言及と
して理解されなければならない。エキソヌクレアーゼは、選択した組換えタンパ
ク質とともに用いるのに適しているものである。本発明に用いるのに適したエキ
ソヌクレアーゼの例としては、これらに限られるものではないが、ｅｘｏと称す
るＲｅｄλ組換え系エキソヌクレアーゼ、およびｒｅｃＥと称するｒｅｃＥ／ｒ
ｅｃＴ組換え系分子エキソヌクレアーゼ、またはそれらの機能的誘導体が挙げら
れる。好ましくは該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥまたはその機能的誘導体であ
る。「組換えタンパク質」への言及は、一つの核酸配列の一本鎖領域（エキソヌ
クレアーゼにより生成した一本鎖領域など）と他の核酸配列の相補的領域との間
で組換えを媒体することにより相同的組換えを容易にするペプチド、ポリペプチ
ドまたはタンパク質への言及として理解されなければならない。組換えタンパク
質の例としては、これらに限られるものではないが、Ｒｅｄλ組換えタンパク質
ｂｅｔおよびｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ組換えタンパク質ｒｅｃＴ、またはそれらの機
能的誘導体が挙げられる。ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴをコードするヌクレオチド配
列は、本明細書ではそれぞれｒｅｃＥおよびｒｅｃＴと称する。

【００２９】従って、本発明は、さらに詳しくは、少なくとも２つのヌクレオチド配列間で
の相同的組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配
列の相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞で
該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該ｒｅ
ｃＥ、ｒｅｃＴおよびｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードするヌクレオチド配列
の発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。

【００３０】「発現」なる語は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成という結
果となるヌクレオチド配列の転写および翻訳をいう。「ｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードする遺伝子」への言及は、線状ＤＮＡ配
列がｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼによって分解されることなく、それによって相同
的組換えが起こりうるように、ｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼを阻害するかまたはそ
の活性を充分にダウンレギュレーションしうる発現産物をコードするヌクレオチ
ド配列への言及として理解されなければならない。本発明に用いるのに適したｒ
ｅｃＢＣＤインヒビターの例としては、これらに限られるものではないが、ｇａ
ｍ、Ｐ２２Ａｂｃタンパク質またはＳＳＢタンパク質またはそれらの機能的誘導
体が挙げられる。好ましくは該ｒｅｃＢＣＤインヒビターはｇａｍである。ｇａ
ｍをコードするヌクレオチド配列は、本明細書ではｇａｍと称する。

【００３１】本発明の好ましい態様によれば、本発明は、少なくとも２つのヌクレオチド配
列間での相同的組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオ
チド配列の相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅ
ｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍまたはその機能的誘導体を発現しうる宿主細胞を
培養することにより、該宿主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組
換えを誘導することを含み、該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍの発現は変調し
うるものであることを特徴とする方法を提供する

【００３２】本明細書において「宿主細胞」への言及は、核酸配列で形質転換またはトラン
スフェクションしうるあらゆる原核または真核細胞への言及として理解されなけ
ればならない。たとえば、本発明に包含されるのは、ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡラ
イブラリーを作製するのに用いる宿主細胞または目的ＤＮＡ配列挿入物を含むベ
クターをクローニングするのに用いる宿主細胞などのようなヌクレオチド配列の
クローニングおよび／または発現に適した宿主細胞である。本発明によれば、宿
主細胞はｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ（「エキソヌクレアーゼＶ」とも称する；と
りわけ線状の二本鎖ＤＮＡを分解する）を発現するものが好ましい。宿主細胞は
、天然に存在するｒｅｃＢＣＤ遺伝子の発現によるか、またはｒｅｃＢＣＤをコ
ードする核酸分子で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることに
より、ｒｅｃＢＣＤを発現してよい。

【００３３】本発明をいかなる一つの理論または作用機序に限定することなく、本発明者ら
は、宿主細胞のある種の株が、ｒｅｃＢＣＤインヒビターおよび／または相同的
組換え系の１またはそれ以上の分子の過剰産生、たとえば構成的産生に対して感
受性であることを決定した。「感受性である」とは、宿主細胞が何らかの仕方で
損われること、たとえばその生存能の低下またはその機能的活性の１またはそれ
以上の望ましくない変調を意味する。たとえば、ＤＨ１０Ｂ宿主細胞でのｒｅｃ
ＢＣＤインヒビター、ｇａｍの構成的産生は、ＤＨ１０Ｂ細胞の生存能が低下す
る点で毒性であることがわかっている。組換え系分子およびｒｅｃＢＣＤインヒ
ビターの発現を変調および整合することのできるインビボ組換え系の開発は、こ
の毒性の問題を克服した。従って、好ましい態様において、宿主細胞は、ｒｅｃ
ＢＣＤインヒビター、エキソヌクレアーゼまたは組換えタンパク質の１またはそ
れ以上の構成的産生に対して感受性の宿主細胞である。さらに一層好ましくは、
該宿主細胞はＤＨ１０Ｂまたはその変異体またはホモログである。本発明は、宿主細胞の変異体およびホモログの使用をも包含する。

【００３４】この最も好ましい態様によれば、本発明は、少なくとも２つのヌクレオチド配
列間での相同的組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオ
チド配列の相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およ
びエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまた
はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養するこ
とにより、該宿主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導
することを含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤ
インヒビターの発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。さらに一層好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換えタ
ンパク質はｒｅｃＴであり、該ｒｅｃＢＣＤインヒビターはｇａｍである。

【００３５】「少なくとも２つのヌクレオチド配列」への言及は、本発明の方法によって相
同的組換えをなすべき２またはそれ以上のヌクレオチド配列への言及として理解
されなければならない。これらヌクレオチド配列は、たとえば、２つの環状ベク
ター（たとえば、２つのプラスミドなど）、プラスミドと線状ＤＮＡ配列または
染色体と線状ＤＮＡ配列などのように別々の核酸分子であってよい。別の態様と
して、これらヌクレオチド配列は、たとえば、ローリングサークル複製の際に生
じるような単一のヌクレオチド分子の線状ヌクレオチド配列部分と環状ヌクレオ
チド配列部分のように単一の核酸分子の２つの部分であってよい。好ましくは、
これらヌクレオチド配列は、環状ヌクレオチド配列と線状ヌクレオチド配列とで
ある。この文脈において、「環状」ヌクレオチド配列は、あらゆるヌクレオチド
分子の環状ヌクレオチド配列部分への言及として理解されなければならない。た
とえば、環状ヌクレオチド配列はプラスミドのように完全に環状であってもよい
し、あるいはローリングサークル複製の際に生じるヌクレオチド分子の環状部分
のように部分的に環状であってもよい。この文脈において、「環状」ヌクレオチ
ド配列はこの分子の環状部分に対応する。好ましくは、環状核酸配列はＢＡＣま
たはＰＡＣ型の人工染色体である。

【００３６】「線状」ヌクレオチド配列は、本質的に線状の形態であるあらゆるヌクレオチ
ド配列への言及として理解されなければならない。線状配列は線状ヌクレオチド
分子であってもよいし、あるいは環状部分のような非線状部分をも含むヌクレオ
チド分子の線状部分であってもよい。線状ヌクレオチド配列の例としては、これ
らに限られるものではないが、ＰＣＲ産物、切断産物、合成ＤＮＡまたはローリ
ングサークル複製の際に生じるヌクレオチド分子の線状部分が挙げられる。線状
ヌクレオチド配列と環状ヌクレオチド配列との組換えは、たとえば、環状ヌクレ
オチド配列中に選択マーカーまたは特定の変異を導入してよい。本発明の相同的
組換えは細胞中に導入したヌクレオチド配列間で起こってもよいし、または細胞
中に天然に認められるヌクレオチド配列と１またはそれ以上の導入ヌクレオチド
配列との間で起こってもよい。

【００３７】従って、本発明は好ましくは、環状ヌクレオチド配列と線状ヌクレオチド配列
との間での相同的組換えを容易にする方法であって、該環状ヌクレオチド配列と
該線状ヌクレオチド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒ
ｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤ
インヒビターまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主
細胞を培養することにより、該宿主細胞で該環状ヌクレオチド配列と該線状ヌク
レオチド配列との間で組換えを誘導することを含み、該エキソヌクレアーゼ、組
換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものである
ことを特徴とする方法を提供する。好ましくは該宿主細胞はＤＨ１０Ｂ細胞である。さらに一層好ましくは、該エ
キソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換えタンパク質はｒｅｃＴであり、該
ｒｅｃＢＣＤインヒビターはｇａｍまたはその機能的誘導体である。

【００３８】好ましい態様によれば、本発明は、環状ヌクレオチド配列と線状ヌクレオチド
配列との間での相同的組換えを容易にする方法であって、該環状ヌクレオチド配
列と該線状ヌクレオチド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で
、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍまたはその機能的誘導体を
発現しうるＤＨ１０Ｂ細胞またはそのホモログまたは変異体を培養することによ
り、該ＤＨ１０Ｂ細胞またはそのホモログまたは変異体で該環状ヌクレオチド配
列と該線状ヌクレオチド配列との間で組換えを誘導することを含み、該ｒｅｃＢ
ＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ、およびｇａｍの発現は変調しうるものであることを
特徴とする方法を提供する。

【００３９】本発明の核酸配列はヒトゲノムに由来するのが好ましいが、非ヒト動物および
植物からのゲノムおよびヌクレオチド配列もまた本発明により包含される。本発
明により包含される非ヒト動物としては、霊長類、家畜動物（たとえば、ヒツジ
、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ロバ）、研究室の試験動物（たとえば、マウス、ラ
ット、モルモット、ハムスター、ウサギ）、飼いならされたペット動物（たとえ
ば、イヌ、ネコ）、鳥類（たとえば、ニワトリ、ガチョウ、アヒルその他の家禽
類、猟鳥、エミュー、ダチョウ）および捕らえられた（captive）野性のまたは
飼いならされた動物（たとえば、キツネ、カンガルー、ディンゴ）が挙げられる
。

【００４０】本発明者らは、本発明の相同的組換え系が、少なくとも２つのヌクレオチド配
列のうち少なくとも１つがＦプラスミド部分を含むような少なくとも２つのヌク
レオチド配列を組み換えるのに適していることを決定した。Ｆプラスミド部分を
「含む」ヌクレオチド配列への言及は、Ｆプラスミドの全体または一部に融合、
結合または他の仕方で会合したヌクレオチド配列への言及として理解されなけれ
ばならない。たとえば、目的のヌクレオチド配列はベクター内に位置していてよ
く、該ベクターの骨格はＦプラスミドの全体または一部に対応する配列を含んで
いる。ＦプラスミドベースのＢＡＣは、たとえば、野生型のＦプラスミド複製起
点およびｐａｒＡ、ｐａｒＢおよびｐａｒＣコードヌクレオチド配列を発現する
ベクター中に位置した目的ゲノム配列を含んでいる。

【００４１】従って、他の好ましい態様において、本発明は、少なくとも１つのヌクレオチ
ド配列がＦプラスミド部分を含むものである少なくとも２つのヌクレオチド配列
間での相同的組換えを容易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチ
ド配列の相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、および
エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたは
その誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養すること
により、該宿主細胞で該少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導す
ることを含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤイ
ンヒビターの発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、Ｆプラスミド部分を含む該ヌクレオチド配列はＢＡＣである。さらに一層好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂまたはその変異体またはホモ
ログである。

【００４２】ＢＡＣ／ＰＡＣクローニング系は、正確な時間および組織特異的遺伝子発現を
示す大きなゲノム断片の遺伝子伝達により、哺乳動物ゲノムの研究を容易にした
。それゆえ、大きな挿入ＢＡＣ／ＰＡＣクローニング系は、長い範囲の物理的マ
ッピング、疾患遺伝子のポジショナルクローニング、全ゲノムシークエンシング
プロジェクトおよび機能研究のために広範に用いられている。従って、ＢＡＣ／
ＰＡＣ大腸菌ライブラリーを、ヒトゲノムＤＮＡのために、並びにヒヒ、イヌ、
ウシ、ヒツジ、ヤギおよびイネを含む他の動物および植物種のゲノムＤＮＡのた
めに作製している。ＢＡＣ／ＰＡＣは、一般に、よく定められた組換え欠失大腸
菌株ＤＨ１０Ｂにおいて細胞当たり１〜２コピーで維持される。線状ＤＮＡセグ
メントを導入することによりＢＡＣおよびＰＡＣを修飾することへの興味のため
、本発明の特に好ましい態様はＢＡＣまたはＰＡＣ中への線状ＤＮＡセグメント
の相同的組換えによるＢＡＣまたはＰＡＣの修飾に関する。

【００４３】この最も好ましい態様によれば、本発明は、ＢＡＣと線状ヌクレオチド配列と
の間での相同的組換えを容易にする方法であって、該ＢＡＣと該線状ヌクレオチ
ド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およ
びエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまた
はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養するこ
とにより、該宿主細胞で該ＢＡＣと該線状ヌクレオチド配列との間で組換えを誘
導することを含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣ
Ｄインヒビターの発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提供する
。好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂ細胞またはその変異体またはホモログで
ある。さらに一層好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換
えタンパク質はｒｅｃＴであり、該ｒｅｃＢＣＤインヒビターはｇａｍである。

【００４４】さらに他の最も好ましい態様において、本発明は、ＰＡＣと線状ヌクレオチド
配列との間での相同的組換えを容易にする方法であって、該ＰＡＣと該線状ヌク
レオチド配列との相同的組換えを容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ
、およびエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビタ
ーまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養
することにより、該宿主細胞で該ＰＡＣと該線状ヌクレオチド配列との間で組換
えを誘導することを含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅ
ｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものであることを特徴とする方法を提
供する。好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂ細胞またはその変異体またはホモログで
ある。さらに一層好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換
えタンパク質はｒｅｃＴであり、該ｒｅｃＢＣＤインヒビターはｇａｍである。

【００４５】本発明の方法は、１またはそれ以上のｒｅｃＢＣＤ、エキソヌクレアーゼおよ
び組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ｒｅｃＢＣＤインヒビター
またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列および該少なくとも２つのヌク
レオチド配列で宿主細胞を形質転換することを含む。本発明の方法の操作を容易
にするためにどれだけ多くのこれら分子を宿主細胞中に導入する必要があるかは
、問題となっている特定の場合に依存するであろう。たとえば、例示したｒｅｃ
Ｅ／ｒｅｃＴ組換え系に関しては、市販のＢＡＣまたはＰＡＣＤＨ１０Ｂライ
ブラリーからの宿主細胞の集団を用いるのが望ましい。ＢＡＣまたはＰＡＣ分子
は、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子で形質転換した後に
該ライブラリーからの市販のＤＨ１０Ｂクローン中に導入された線状ヌクレオチ
ド配列と組み換えることにより修飾することができる。ＤＨ１０Ｂ細胞は内生的
にｒｅｃＢＣＤを発現している。別法として、すでにｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードするヌクレオチド配列を発現
している宿主細胞を使用すれば、相同的組換えをすべき未だ宿主細胞に存在して
いないヌクレオチド配列で形質転換するだけでよいであろう。これら宿主細胞は
、ｒｅｃＢＣＤ、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｒｅｃＢＣＤインヒビターをコード
するヌクレオチド配列を、これら１またはそれ以上の分子を発現させるために遺
伝子操作した細胞かまたはこれら分子を内生的に発現している細胞かのいずれか
によって発現することができる。

【００４６】本発明の方法によれば、エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃ
ＢＣＤインヒビターの発現は変調することができる。このことにより、これらタ
ンパク質の一過性で整合した発現が可能となる。「変調しうる」とは、これらタ
ンパク質をコードする遺伝子の発現を転写レベルまたは翻訳レベルでアップレギ
ュレーションまたはダウンレギュレーションしうることを意味する。この変調は
、プロモーター発現の制御またはメチル化の制御を含む（これらに限られるもの
ではない）多くの技術のいずれかにより達成することができる。たとえば、本明
細書に例示しているように、ＢＡＣ核酸分子であるｐＥＢＡＣ１４０で形質転換
したＤＨ１０Ｂ細胞を、誘導性の発現プラスミドｐＧＥＴｒｅｃ（誘導性のＬ−
アラビノースプロモーターの制御下にｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコード
する核酸分子を含む）でトランスフェクションする。これら細胞をＬ−アラビノ
ースの存在下で培養することによりｐＧＥＴｒｅｃプラスミドの発現が誘導され
る。ついで、これら細胞にＰＣＲｋａｎ１４０などの二本鎖線状ＤＮＡをエレク
トロポレーションすると、ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ相同的組換え系の働きおよびそれ
と同時のｇａｍ発現産物によるｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ活性の阻害により、Ｐ
ＣＲｋａｎ１４０とｐＥＢＡＣ１４０との相同的組換えが起こる。相同的組換え
が完了したらＤＨ１０Ｂ細胞をＬ−アラビノースに富む培地から取り出すことに
よってｐＧＥＴｒｅｃプラスミドの発現をダウンレギュレーションすることがで
きる。このことは、ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ相同的組換え経路の活性を停止するよう
に働く。

【００４７】本発明の例示を核酸配列ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍを含む単一のプラス
ミドを誘導性プロモーターの制御下で（すなわち、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇ
ａｍをコードする核酸分子は共通のプロモーターに作動可能に連結されている）
宿主細胞中に導入することにより行ったが、本発明の方法はｒｅｃＥ、ｒｅｃＴ
およびｇａｍを別々に含む２またはそれ以上のベクターの使用をも包含すると理
解しなければならない。しかしながら、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍの同時
発現に関して整合性を達成するためには、たとえば、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍの各々に関して同じ誘導性プロモーターを用いることによりｒｅｃＥ、ｒ
ｅｃＴおよびｇａｍの発現の誘導を同時に達成しうることを確実にする必要があ
る。それゆえ、ｒｅｃＥ／ｒｅｃＴ相同的組換え系はｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ
活性のｇａｍ阻害と同時に機能できるであろう。

【００４８】相同的組換えを「容易にしうる」とは、相同的組換え系の機能的な作動を誘導
し、促進し、あるいは他の仕方で該作動に貢献することを意味すると理解されな
ければならない。たとえば、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ発現産物はｒｅｃＥ／ｒｅ
ｃＴベースの組換えを誘導し、一方、ｇａｍ発現産物はｒｅｃＢＣＤヌクレアー
ゼ（線状ＤＮＡを分解することによってその組換えを妨害する）の活性を阻害す
る。

【００４９】本発明をいかなる一つの理論または作用機序に限定することなく、ｐＧＥＴｒ
ｅｃは大腸菌ＤＨ１０Ｂ菌体中でＢＡＣ／ＰＡＣと安定に共存しうる。ｐＧＥＴ
ｒｅｃを用いることにより、線状核酸断片と標的環状核酸分子との間での相同的
組換えを高効率で行うことができる。相同的組換えの効率は、ホモロジーの長さ
が５０ｂｐから１４０ｂｐに増大すると向上する。さらに、ＢＡＣ／ＰＡＣを用
いた相同的組換えの効率の有意の増大は、ターゲティングしたホモロジー領域に
非隣接配列を使用することにより達成できると考えられる。

【００５０】本発明は、宿主細胞中に相同的組換えを容易にするタンパク質またはその機能
的誘導体を発現するように誘導される核酸分子を導入するよりも、宿主細胞中に
相同的組換えを容易にするタンパク質またはその機能的誘導体を導入することに
よる、インビボでの相同的組換えの誘導をも包含すると理解されなければならな
い。たとえば、ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍタンパク質またはその機能的誘
導体と、組換えに供すべきヌクレオチド配列との宿主細胞中への整合した導入が
考えられる。また、本発明の方法を、相同的組換え系のタンパク質の幾つかを宿
主細胞中で発現させ、残りのタンパク質はタンパク質の形態で宿主細胞中に導入
することにより行うことも考えられる。たとえば、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴまた
はその機能的誘導体の宿主細胞中での発現をｇａｍタンパク質の整合した投与と
ともに行うことが考えられる。本発明のこの側面は、エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質またはｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体のいずれ
か１つまたはそれ以上の送達をも包含すると理解されなければならない。

【００５１】「誘導体」は、断片、部品、部分、化学的な等価物、変異体、ホモログ、アナ
ログ、天然、合成または組換え源からのミメチック（融合タンパク質を含む）を
含む。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換によるものであってよい。ア
ミノ酸の挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシ末端での融合並びに単
一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。挿入アミノ酸配列変異体は、タン
パク質中の前以て決められた部位に１またはそれ以上のアミノ酸が導入されたも
のであるが、得られる生成物の適当なスクリーニングを行えばランダムな挿入も
可能である。欠失変異体は、配列からの１またはそれ以上のアミノ酸の除去を特
徴とする。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、
その場所に異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸配列への付加は、他の
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。

【００５２】該ヌクレオチド配列および発現産物（「成分」と称する）の誘導体としては、
特定のエピトープを有する断片またはペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパ
ク質性分子もしくは非タンパク質性分子に融合した全成分の部分が挙げられる。
たとえば、該成分またはその誘導体は、細胞中への進入を容易にする分子と融合
させてよい。本発明において考えられる該成分のアナログとしては、これらに限
られるものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質
の合成の際の非天然アミノ酸および／またはその誘導体の導入、およびタンパク
質性分子またはそのアナログにコンホメーション上の制約を付与する架橋および
他の方法の使用が挙げられる。核酸配列の誘導体も同様に、単一または複数のヌ
クレオチドの置換、欠失および／または付加（他の核酸分子との融合を含む）に
よるものであってよい。本発明の核酸分子の誘導体としては、オリゴヌクレオチ
ド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の同時抑制および融合に使
用するのに適した分子が挙げられる。

【００５３】本発明によって考えられる側鎖修飾の例としては、アルデヒドと反応させた後
にＮａＢＨ_４で還元することによる還元的アルキル化；メチルアセトイミデート
によるアミジン化（amidination）；無水酢酸によるアシル化；シアン酸エステ
ルによるアミノ基のカルバモイル化；２,４,６−トリニトロベンゼンスルホン酸
（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水
テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサール−５−
リン酸でリジンをピリドキサール化した後にＮａＢＨ_４で還元するなどによるア
ミノ基の修飾が挙げられる。

【００５４】アルギニン残基のグアニジン基は、２,３−ブタンジオン、フェニルグリオキ
サールおよびグリオキサールなどの試薬を用いてへテロ環縮合生成物を生成する
ことにより修飾することができる。カルボキシル基は、カルボジイミド活性化によりＯ−アシルイソ尿素の生成を
経てその後にたとえば対応のアミドに誘導体化することで修飾することができる
。

【００５５】スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシ
メチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフ
ィドの生成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；
４−クロロメルクリ安息香酸エステル、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸
、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールおよび他の水
銀化合物を用いた水銀誘導体の生成；アルカリｐＨでのシアン酸エステルによる
カルバモイル化などの方法により修飾することができる。

【００５６】トリプトファン残基は、たとえば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化また
は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドまたはスルフェニルハライド
によるインドール環のアルキル化によって修飾することができる。一方、チロシ
ン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を生成
することにより変化させることができる。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキ
ル化またはピロ炭酸ジエチルを用いたＮ−カルボエトキシ化により行うことがで
きる。

【００５７】タンパク質合成の際に導入する非天然アミノ酸および誘導体の例としては、こ
れらに限られるものではないが、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−
３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチル
グリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／ま
たはアミノ酸のＤ−異性体が挙げられる。本発明で考えられる非天然アミノ酸の
一覧を表１に示す。

【００５８】表１一般的でないアミノ酸コード α−アミノ酪酸Ａｂｕ α−アミノ−α−メチル酪酸ＭｇａｂｕアミノシクロプロパンカルボキシレートＣｐｒｏアミノイソ酪酸ＡｉｂアミノノルボルニルカルボキシレートＮｏｒｂシクロヘキシルアラニンＣｈｅｘａシクロペンチルアラニンＣｐｅｎＤ−アラニンＤａｌＤ−アルギニンＤａｒｇＤ−アスパラギン酸ＤａｓｐＤ−システインＤｃｙｓＤ−グルタミンＤｇｌｎＤ−グルタミン酸ＤｇｌｕＤ−ヒスチジンＤｈｉｓＤ−イソロイシンＤｉｌｅＤ−ロイシンＤｌｅｕＤ−リジンＤｌｙｓＤ−メチオニンＤｍｅｔＤ−オルニチンＤｏｒｎＤ−フェニルアラニンＤｐｈｅＤ−プロリンＤｐｒｏＤ−セリンＤｓｅｒＤ−トレオニンＤｔｈｒＤ−トリプトファンＤｔｒｐＤ−チロシンＤｔｙｒＤ−バリンＤｖａｌ

【００５９】Ｄ−α−メチルアラニンＤｍａｌａＤ−α−メチルアルギニンＤｍａｒｇＤ−α−メチルアスパラギンＤｍａｓｎＤ−α−メチルアスパラギン酸ＤｍａｓｐＤ−α−メチルシステインＤｍｃｙｓＤ−α−メチルグルタミンＤｍｇｌｎＤ−α−メチルヒスチジンＤｍｈｉｓＤ−α−メチルイソロイシンＤｍｉｌｅＤ−α−メチルロイシンＤｍｌｅｕＤ−α−メチルリジンＤｍｌｙｓＤ−α−メチルメチオニンＤｍｍｅｔＤ−α−メチルオルニチンＤｍｏｒｎＤ−α−メチルフェニルアラニンＤｍｐｈｅＤ−α−メチルプロリンＤｍｐｒｏＤ−α−メチルセリンＤｍｓｅｒＤ−α−メチルトレオニンＤｍｔｈｒＤ−α−メチルトリプトファンＤｍｔｒｐＤ−α−メチルチロシンＤｍｔｙＤ−α−メチルバリンＤｍｖａｌ

【００６０】Ｄ−Ｎ−メチルアラニンＤｎｍａｌａＤ−Ｎ−メチルアルギニンＤｎｍａｒｇＤ−Ｎ−メチルアスパラギンＤｎｍａｓｎＤ−Ｎ−メチルアスパラギン酸ＤｎｍａｓｐＤ−Ｎ−メチルシステインＤｎｍｃｙｓＤ−Ｎ−メチルグルタミンＤｎｍｇｌｎＤ−Ｎ−メチルグルタミン酸ＤｎｍｇｌｕＤ−Ｎ−メチルヒスチジンＤｎｍｈｉｓＤ−Ｎ−メチルイソロイシンＤｎｍｉｌｅＤ−Ｎ−メチルロイシンＤｎｍｌｅｕＤ−Ｎ−メチルリジンＤｎｍｌｙｓＮ−メチルシクロヘキシルアラニンＮｍｃｈｅｘａＤ−Ｎ−メチルオルニチンＤｎｍｏｒｎＮ−メチルグリシンＮａｌａＮ−メチルアミノイソ酪酸ＮｍａｉｂＮ−(１−メチルプロピル)グリシンＮｉｌｅＮ−(２−メチルプロピル)グリシンＮｌｅｕＤ−Ｎ−メチルトリプトファンＤｎｍｔｒｐＤ−Ｎ−メチルチロシンＤｎｍｔｙｒＤ−Ｎ−メチルバリンＤｎｍｖａｌ

【００６１】 γ−アミノ酪酸ＧａｂｕＬ−ｔ−ブチルグリシンＴｂｕｇＬ−エチルグリシンＥｔｇＬ−ホモフェニルアラニンＨｐｈｅＬ−α−メチルアルギニンＭａｒｇＬ−α−メチルアスパラギン酸ＭａｓｐＬ−α−メチルシステインＭｃｙｓＬ−α−メチルグルタミンＭｇｌｎＬ−α−メチルヒスチジンＭｈｉｓＬ−α−メチルイソロイシンＭｉｌｅＬ−α−メチルロイシンＭｌｅｕＬ−α−メチルメチオニンＭｍｅｔＬ−α−メチルノルバリンＭｎｖａＬ−α−メチルフェニルアラニンＭｐｈｅＬ−α−メチルセリンＭｓｅｒＬ−α−メチルトリプトファンＭｔｒｐＬ−α−メチルバリンＭｖａｌ

【００６２】Ｎ−(Ｎ−(２,２−ジフェニルエチル) Ｎｎｂｈｍカルバミルメチル)グリシン１−カルボキシ−１−(２,２−ジフェニルＮｍｂｃエチルアミノ)シクロプロパンＬ−Ｎ−メチルアラニンＮｍａｌａＬ−Ｎ−メチルアルギニンＮｍａｒｇＬ−Ｎ−メチルアスパラギンＮｍａｓｎＬ−Ｎ−メチルアスパラギン酸ＮｍａｓｐＬ−Ｎ−メチルシステインＮｍｃｙｓＬ−Ｎ−メチルグルタミンＮｍｇｌｎＬ−Ｎ−メチルグルタミン酸ＮｍｇｌｕＬ−Ｎ−メチルヒスチジンＮｍｈｉｓＬ−Ｎ−メチルイソロイシンＮｍｉｌｅＬ−Ｎ−メチルロイシンＮｍｌｅｕＬ−Ｎ−メチルリジンＮｍｌｙｓＬ−Ｎ−メチルメチオニンＮｍｍｅｔＬ−Ｎ−メチルノルロイシンＮｍｎｌｅＬ−メチルノルバリンＮｍｎｖａＬ−メチルオルニチンＮｍｏｒｎＬ−Ｎ−メチルフェニルアラニンＮｍｐｈｅＬ−Ｎ−メチルプロリンＮｍｐｒｏＬ−Ｎ−メチルセリンＮｍｓｅｒＬ−Ｎ−メチルトレオニンＮｍｔｈｒＬ−Ｎ−メチルトリプトファンＮｍｔｒｐＬ−Ｎ−メチルチロシンＮｍｔｙｒＬ−Ｎ−メチルバリンＮｍｖａｌＬ−Ｎ−メチルエチルグリシンＮｍｅｔｇＬ−Ｎ−メチル−ｔ−ブチルグリシンＮｍｔｂｕｇ

【００６３】Ｌ−ノルロイシンＮｌｅＬ−ノルバリンＮｖａ α−メチル−アミノイソ酪酸Ｍａｉｂ α−メチル−γ−アミノ酪酸Ｍｇａｂｕ α−メチルシクロヘキシルアラニンＭｃｈｅｘａ α−メチルシクロペンチルアラニンＭｃｐｅｎ α−メチル−α−ナフチルアラニンＭａｎａｐ α−メチルペニシルアミンＭｐｅｎＮ−(４−アミノブチル)グリシンＮｇｌｕＮ−(２−アミノエチル)グリシンＮａｅｇＮ−(３−アミノプロピル)グリシンＮｏｒｎＮ−アミノ−α−メチル酪酸Ｎｍａａｂｕ α−ナフチルアラニンＡｎａｐ

【００６４】Ｎ−ベンジルグリシンＮｐｈｅＮ−(２−カルバミルエチル)グリシンＮｇｌｎＮ−(カルバミルメチル)グリシンＮａｓｎＮ−(２−カルボキシエチル)グリシンＮｇｌｕＮ−(カルボキシメチル)グリシンＮａｓｐＮ−シクロブチルグリシンＮｃｂｕｔＮ−シクロヘプチルグリシンＮｃｈｅｐＮ−シクロヘキシルグリシンＮｃｈｅｘＮ−シクロデシルグリシンＮｃｄｅｃＮ−シクロドデシルグリシンＮｃｄｏｄＮ−シクロオクチルグリシンＮｃｏｃｔＮ−シクロプロピルグリシンＮｃｐｒｏＮ−シクロウンデシルグリシンＮｃｕｎｄＮ−(２,２−ジフェニルエチル)グリシンＮｂｈｍＮ−(３,３−ジフェニルプロピル)グリシンＮｂｈｅＮ−(３−グアニジノプロピル)グリシンＮａｒｇＮ−(１−ヒドロキシエチル)グリシンＮｔｈｒＮ−(ヒドロキシエチル)グリシンＮｓｅｒＮ−(イミダゾリルエチル)グリシンＮｈｉｓＮ−(３−インドリルエチル)グリシンＮｈｔｒｐ

【００６５】Ｎ−メチル−γ−アミノ酪酸ＮｍｇａｂｕＤ−Ｎ−メチルメチオニンＤｎｍｍｅｔＮ−メチルシクロペンチルアラニンＮｍｃｐｅｎＤ−Ｎ−メチルフェニルアラニンＤｎｍｐｈｅＤ−Ｎ−メチルプロリンＤｎｍｐｒｏＤ−Ｎ−メチルセリンＤｎｍｓｅｒＤ−Ｎ−メチルトレオニンＤｎｍｔｈｒＮ−(１−メチルエチル)グリシンＮｖａｌＮ−メチル−α−ナフチルアラニンＮｍａｎａｐＮ−メチルペニシルアミンＮｍｐｅｎＮ−(ｐ−ヒドロキシフェニル)グリシンＮｈｔｙｒＮ−(チオメチル)グリシンＮｃｙｓ

【００６６】ペニシルアミンＰｅｎＬ−α−メチルアラニンＭａｌａＬ−α−メチルアスパラギンＭａｓｎＬ−α−メチル−ｔ−ブチルグリシンＭｔｂｕｇＬ−メチルエチルグリシンＭｅｔｇＬ−α−メチルグルタミン酸ＭｇｌｕＬ−α−メチルホモフェニルアラニンＭｈｐｈｅＮ−(２−メチルチオエチル)グリシンＮｍｅｔＬ−α−メチルリジンＭｌｙｓＬ−α−メチルノルロイシンＭｎｌｅＬ−α−メチルオルニチンＭｏｒｎＬ−α−メチルプロリンＭｐｒｏＬ−α−メチルトレオニンＭｔｈｒＬ−α−メチルチロシンＭｔｙｒＬ−Ｎ−メチルホモフェニルアラニンＮｍｈｐｈｅＮ−(Ｎ−(３３−ジフェニルプロピル) Ｎｎｂｈｅカルバミルメチル)グリシン

【００６７】三次元コンホメーションを確立するために架橋剤を用いることができ、たとえ
ば、(ＣＨ_２)_ｎスペーサー基（ｎ＝１〜ｎ＝６）を有する２官能性イミドエステ
ル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ２
官能性架橋剤、および通常、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性
残基とマレイミドやジチオ残基（ＳＨ）やカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの他
の基に対して特異的に反応性の残基とを含むへテロ２官能性試薬を用いることが
できる。さらに、たとえば、Ｃ_αおよびＮ_α−メチルアミノ酸の導入、アミノ酸
のＣ_α原子とＣ_β原子との間の二重結合の導入、およびＮ末端とＣ末端との間、
２つの側鎖の間、または側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間のアミド結合の形成
などのような共有結合の導入により、ペプチドのコンホメーションを制約するこ
とができる。

【００６８】（従来技術より有効な効果）本発明の方法は、所望でない再配列を起こすことなくＢＡＣやＰＡＣなどの環
状ＤＮＡクローン中のいかなる位置にでも所望の修飾を導入することを可能にす
る簡単かつ効率的な技術として有用である。選択マーカーまたはヒトの病気を引
き起こすことがわかっているものに対応する特定の変異の導入などの修飾は、本
発明の方法を適用できる例である。本発明の方法は、クローニングしたＢＡＣ／
ＰＡＣなどの環状ＤＮＡ分子を相同的組換えのために他の大腸菌に移す必要性を
低減させる。本発明の方法はまた、特別のシャトルベクターの作製の必要性を低
減させる。この方法は簡単なので単一のクローンに対して繰返し用いて複合的な
変化を形成することができる。本発明の方法は、リポーター遺伝子や他の所望の
配列を環状核酸分子中に含めるように改変することができる。

【００６９】特定の変異のための正確な細胞および動物モデルを作製するには、正常な遺伝
子構造への妨害を最小にする必要がある。遺伝子構造への特定の変異変化の導入
は、本発明の組換え法を用いて２段階で導入することができる。まず、テトラサ
イクリンを有するＰＣＲ産物または第二の対抗選択マーカー（たとえば、ｃｃｄ
Ｂ、ｓａｃＢ）に連結した抗生物質選択マーカーを含むカセットを標的部位に導
入し、ついでこれを所望の修飾のみを有するゲノム断片を用いた第二の工程で正
確にノックアウトする。正確な生成物は、テトラサイクリン遺伝子または第二の
対抗選択マーカーを喪失したクローンを対抗選択することにより容易に得ること
ができる^{３３，３９，３９，４３}。環状ＤＮＡ分子中の組み込みのための標的部
位に依存してこれら方法は、遺伝子転写の組織および発生特異性、スプライシン
グおよび完全な機能性遺伝子座からの発現に対する種々の配列要素および変異の
影響をモニターするための非常に感度の高いアッセイ系を可能とする。これら技
術は、様々なヒトの遺伝病を緩和ないし治療するための手段として、組織および
遺伝子座特異性が増大した遺伝子発現に変更することを目指した薬理学的アプロ
ーチ並びにヒト人工染色体の開発を容易にする。正常なおよび変異した機能的遺
伝子座を有する正確な動物モデルの作製はまた、遺伝子の補充または変異した遺
伝子座の補正を含む遺伝子療法を容易にする。

【００７０】本発明の他の側面は、宿主細胞中での少なくとも２つのヌクレオチド配列の相
同的組換えを容易にする方法であって、工程：（i）宿主細胞を形質転換し、その際、形質転換した宿主細胞は、エキソヌクレ
アーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘
導体をコードする第一のヌクレオチド配列、および該少なくとも２つのヌクレオ
チド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質、およびｒｅｃＢＣ
Ｄインヒビターをコードする遺伝子の発現は変調しうるものであり、ついで（ii）該形質転換した宿主細胞を、該第一のヌクレオチド配列の発現が起こるの
に充分な時間および条件下で培養し、その際、該第一のヌクレオチド配列の発現
産物は該第二のヌクレオチド配列と該第三のヌクレオチド配列との相同的組換え
を容易にするを含む方法を包含する。

【００７１】好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換えタンパク質は
ｒｅｃＴであり、ｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードする該遺伝子はｇａｍであ
る。さらに一層好ましくは、該少なくとも２つのヌクレオチド配列はＦプラスミド
部分を含むヌクレオチド配列および線状ヌクレオチド配列である。さらに一層好
ましくは、Ｆプラスミド部分を含む該ヌクレオチド配列はＢＡＣである。さらに好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂまたはその変異体またはホモログ
である。

【００７２】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にするのに有用な微生物の製造方法であって、ｒｅｃＢＣＤ、変調
しうるレベルのエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤイン
ヒビターをコードする遺伝子および該少なくとも２つの他のヌクレオチド配列の
発現が可能となるように宿主細胞を遺伝子操作することを含む方法を包含する。好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換えタンパク質は
ｒｅｃＴであり、ｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードする該遺伝子はｇａｍであ
る。さらに一層好ましくは、該少なくとも２つのヌクレオチド配列はＦプラスミド
部分を含むヌクレオチド配列および線状ヌクレオチド配列である。さらに一層好
ましくは、Ｆプラスミド部分を含む該ヌクレオチド配列はＢＡＣである。さらに好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂまたはその変異体またはホモログ
である。

【００７３】本発明のさらに他の側面は、少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的
組換えを容易にする細胞であって、エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質およ
びｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードするヌクレオチド配列、ｒｅｃＢＣＤおよ
び該少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換え
タンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものであること
を特徴とする細胞を包含する。好ましくは、該エキソヌクレアーゼはｒｅｃＥであり、該組換えタンパク質は
ｒｅｃＴであり、ｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードする該遺伝子はｇａｍであ
る。さらに一層好ましくは、該少なくとも２つのヌクレオチド配列はＦプラスミド
部分を含むヌクレオチド配列および線状ヌクレオチド配列である。さらに一層好
ましくは、Ｆプラスミド部分を含む該ヌクレオチド配列はＢＡＣである。さらに好ましくは、該宿主細胞はＤＨ１０Ｂまたはその変異体またはホモログ
である。

【００７４】本発明のさらに他の側面は、本発明の方法によって相同的組換えをした核酸分
子を包含する。好ましくは、該修飾した核酸分子は修飾したＢＡＣまたは修飾したＰＡＣであ
る。本発明はまた、患者の治療および／または診断への該修飾した核酸分子の使用
をも包含する。治療方法には遺伝子療法が含まれる。本発明はまた、該修飾した
核酸分子を用いたスクリーニング法をも包含する。従って、本発明の他の側面は、１またはそれ以上の薬理学的に許容しうる担体
および／または希釈剤とともに本発明の方法により製造した修飾核酸分子を含む
医薬組成物を包含する。最も好ましい態様において、実質的に図３に示す遺伝子構築物またはその機能
的誘導体を含む発現ベクターが提供される。

【００７５】本発明のさらに他の側面は、宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配列
の相同的組換えを容易にするためのキットであって、エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質、ｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体をコードする
１またはそれ以上のヌクレオチド配列、および相同的組換えを容易にするのに有
用な試薬を収容すべく適合させた区画を含むキットに関する。さらに、たとえば
、組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列、宿主細胞または組換える
べき１またはそれ以上のヌクレオチド配列ですでに安定に形質転換した宿主細胞
などの生物学的試料を収容するためにさらなる区画が含まれていてよい。

【００７６】本発明のさらに他の側面は、宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配列
の相同的組換えを容易にするためのキットであって、エキソヌクレアーゼ、組換
えタンパク質、ｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体および相同的
組換えを容易にするのに有用な試薬を収容すべく適合させた区画を含むキットに
関する。さらに、たとえば、組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列
、宿主細胞または組換えるべき１またはそれ以上のヌクレオチド配列ですでに安
定に形質転換した宿主細胞などの生物学的試料を収容するためにさらなる区画が
含まれていてよい。

【００７７】本発明のこの側面によるキットはまた、１またはそれ以上の組換え系タンパク
質をコードするヌクレオチド配列の組合せまたは組換え系タンパク質自体の組合
せを含むキットをも包含すると理解されなければならない。本発明のさらなる特徴を下記の限定されない実施例および／または図面にさら
に詳細に記載する。しかしながら、このような詳細な記載は本発明を説明する目
的のみをもって本明細書に含まれることが理解されなければならない。

【００７８】実施例１大腸菌ＤＨ１０Ｂ菌体中での環状基質へのＰＣＲ断片の相同的組換えの誘導性ｒ
ｅｃＥ経路線状基質と環状基質との間の相同的組換えのｒｅｃＥ経路は、ｓｂｃＡｒｅ
ｃＢＣ株ＪＣ８６７９およびＪＣ９６０４において活性である^{４２−４５}。この
経路はｒｅｃＡに依存しない^４６。なぜならｒｅｃＴ遺伝子が相同配列の対合に
おいてｒｅｃＡの役割を果たしていると思われるからである^４７。これら細胞中
でのクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ^ｒ）ｐＥＢＡＣ１４０ベクターの骨格中へ
の５０ｂｐフランキングホモロジーアームを有するカナマイシン耐性（Ｋｍ^ｒ）
遺伝子のＰＣＲ断片（ＰＣＲｋａｎ５０）の正確な相同的組換えが得られ、ｐＥ
ＢＡＣ１４０：：ｋａｎ５０を生成した。しかしながら、ＤＨ１０Ｂからの２０
０ｋｂｐＥＢＡＣ／１４８−グロビンクローンをその後の修飾のためにＪＣ９
６０４電気的コンピテント細胞へ移すことはできなかった。これは、これら２つ
の株の間での宿主制限の違い（host restriction differences）によるものと思
われた。ＢＡＣ／ＰＡＣは通常、ＤＨ１０Ｂ菌体に保持されているので、各ＢＡ
Ｃ／ＰＡＣを他の大腸菌株に移すよりも目的のＢＡＣ／ＰＡＣを有しているＤＨ
１０Ｂ菌体中で直接、修飾を行うのが望ましい。しかしながら、ＤＨ１０Ｂ（ｐ
ＥＢＡＣ１４０）中へのＰＣＲｋａｎ５０のエレクトロポレーションはＣｍ^ｒＫ
ｍ^ｒ組換え体を生成しなかった。また、ＤＨ１０Ｂ菌体中でのＰＣＲｋａｎ１４
０（約１４０ｂｐのフランキングホモロジーアームを有する１４５０ｂｐＰＣ
Ｒ断片）によるｐＥＢＡＣ１４０の骨格への組換え体を得ることもできなかった
。

【００７９】誘導性のアラビノースプロモーターの制御下にｒｅｃＥ遺伝子およびｒｅｃＴ
遺伝子を有するｐＢＡＤ２４−ｒｅｃＥＴプラスミドをＤＨ１０Ｂ（ｐＥＢＡＣ
１４０）菌体中にエレクトロポレーションし、両方のプラスミドを含むクローン
をアンピシリンおよびクロラムフェニコールを含む培地上で選択した。両方のプ
ラスミドを有する単一のコロニーであるＤＨ１０Ｂ（ｐＢＡＤ２４−ｒｅｃＥＴ
，ｐＥＢＡＣ１４０）を用い、菌体の増殖の間にＬ−アラビノース誘導して電気
的にコンピテントな菌体を調製した。この場合も、これら菌体にＰＣＲｋａｎ５
０をエレクトロポレーションした後にＣｍ^ｒＫｍ^ｒ組換え体クローンは得られな
かった。

【００８０】ｇａｍ遺伝子を含むＰＣＲ断片をｐＢＡＤ２４−ｒｅｃＥＴプラスミド中に挿
入してプラスミドｐＧＥＴｒｅｃを調製した（図３）。ｇａｍ遺伝子をｒｅｃＥ
遺伝子およびｒｅｃＴ遺伝子と同じＬ−アラビノースプロモーターのもとに置く
ことにより、ｒｅｃＥ経路の整合した誘導およびその後に導入される線状二本鎖
ＤＮＡに対するｒｅｃＢＣＤヌクレアーゼ活性の阻害を得ようとした。この誘導
性の発現プラスミドｐＧＥＴｒｅｃを既にｐＥＢＡＣ１４０を有する電気的にコ
ンピテントなＤＨ１０Ｂ菌体中に導入した。両方のプラスミドを含む電気的にコ
ンピテントな菌体ＤＨ１０Ｂ（ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢＡＣ１４０）を、Ｌ−ア
ラビノースを菌体の最初の接種のときから増殖培地に含めた他は標準プロトコー
ルに従って調製した。これら菌体にＰＣＲｋａｎ５０をエレクトロポレーション
したところ、２回の独立したエレクトロポレーションからそれぞれ３００近い組
換え体が得られた（表１、実験１、２）。ＸｈｏＩまたはＨｉｎｄIIIによる制
限酵素消化および１２のランダムに取り出した組換え体のＰＣＲ分析は、全ての
Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒ組換え体が所望でない再配列の証拠を示すことなくｐＥＢＡＣ１４
０上の正しい標的部位でＰＣＲｋａｎ１４０の相同的組換えを起こしていること
を示した。このことは、カナマイシン遺伝子をフランキングしている両ホモロジ
ー領域のＤＮＡシークエンシングにより確認された。これら組換え体の増殖の間
にクロラムフェニコール／カナマイシン上でのｐＧＥＴｒｅｃプラスミドに対す
る選択は行わなかったが、種々の量の該マルチコピープラスミドが異なるクロー
ン中で単一コピーのｐＥＢＡＣ１４０：：ｋａｎ１４０プラスミドとともに生き
残った。

【００８１】実施例２ＤＨ１０Ｂ菌体中での２００ｋｂ β−グロビンクローンｐＥＢＡＣ／１４８の
ベクター骨格へのＰＣＲｋａｎ５０およびＰＣＲｋａｎ１４０の相同的組換え同じ方法を用いて大きな単一コピーＢＡＣクローンを修飾できるか否かを決定
するため、ＰＣＲｋａｎ１４０を用いて２００ｋｂ β−グロビンクローンｐＥ
ＢＡＣ／１４８の修飾を試みた。ｐＧＥＴｒｅｃをＤＨ１０Ｂ（ｐＥＢＡＣ／１
４８）菌体中にエレクトロポレーションした。両方のプラスミドを有するクロー
ンＤＨ１０Ｂ（ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢＡＣ／１４８）を用いて電気的にコンピ
テントな菌体を調製した。菌体を回収する前にＬ−アラビノースで４０分間誘導
し、電気的にコンピテントにした。これら菌体中へのＰＣＲｋａｎ１４０のエレ
クトロポレーションによりエレクトロポレーション当たり１０００を超えるＣｍ ^ｒＫｍ^ｒ組換え体が得られた（表１、実験３、４）。電気的にコンピテントな菌
体を調製するに先立って培養の開始時からＬ−アラビノースで菌体を誘導した場
合には、ＰＣＲｋａｎ１４０でエレクトロポレーションした後にＣｍ^ｒＫｍ^ｒ組
換え体は得られなかった。Ｌ−アラビノース誘導によるｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよ
びｇａｍ遺伝子の長引いた過剰発現はＤＨ１０Ｂ菌体にとって毒性である。２０
０ｋｂＢＡＣを有する菌体はｐＥＢＡＣ１４０ベクターを有する菌体よりも長
引いた誘導に対して一層感受性であると思われた。

【００８２】２０の独立したＣｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーを一夜の培養で直接ＰＣＲにより分析し
た。プライマー１４０ＫＡおよび１４０ＫＢをｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１
４０から１５５５ｂｐの生成物を生成するようにデザインした。分析した２０の
Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーはすべて予期されたＰＣＲ産物を生成した（図６）。親の
ｐＥＢＡＣ／１４８クローンを対照として用いた。対照のＰＣＲはｐＥＢＡＣ／
１４８から３９３ｂｐの予期された断片を生成した。この断片はいずれの組換え
体クローンからも生成されなかったが、この断片はＰＣＲｋａｎ１４０の組み込
みが細菌染色体のどこかに起っておれば検出されたはずのものであった。それゆ
え、ＰＣＲ分析は組換え事象が２０の独立したクローンのいずれにおいても正確
に生じていることを示している。

【００８３】これらＣｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーのうちの６つのコロニーからＤＮＡを単離した。
多量で種々の量のマルチコピーｐＧＥＴｒｅｃプラスミドが単一コピーｐＥＢＡ
Ｃ／１４８：：ｋａｎ１４０ＢＡＣとともに回収され、ＢＡＣの制限消化の解釈
を妨げた。４つのクローンからの１μｌのＤＮＡをＤＨ１０Ｂ菌体中に再度エレ
クトロポレーションして各クローンから多くの独立した二次Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒコロニ
ーを得た。各一次クローンの２つの独立した二次クローンからＤＮＡを単離し、
ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩで消化した後にパルスフィールドゲル電気泳動により分
析した（図７）。８つの二次クローンはすべて大きなＢＡＣのみを含んでおり、
カナマイシン耐性マーカーはこれらクローンではｐＥＢＡＣ／１４８中に組み込
まれた一部として存在することを示していた。ＮｏｔＩ消化（図７ａ）は、８つ
の二次クローンがすべて予期された１８５ｋｂのβ−グロビン挿入物を放出し、
雑な再配列を全く蒙っていないことを示している。また、８つのすべてのクロー
ンからのＮｏｔＩ消化ベクターのバンドのサイズは親クローンであるｐＥＢＡＣ
／１４８のＮｏｔＩ消化ベクターのバンドに比べてわずかだが明らかに増大して
いたが、これは標的部位へのＰＣＲｋａｎ１４０の組み込み後に予期されるベク
ターバンドのサイズ変化に対応していた。同じ８つのクローンを、ＸｈｏＩで制
限消化した後にさらに分析した（図７ｂ）。親のｐＥＢＡＣ／１４８クローンで
のみ観察される約７０ｋｂの断片を除いて、すべてクローンは対照である親のｐ
ＥＢＡＣ／１４８クローンと同じ制限断片を示した。８つの二次クローンでは７
０ｋｂの断片はそれぞれ約３０ｋｂと４０ｋｂの２つの断片に切断されていると
思われた。４０ｋｂの断片は親のｐＥＢＡＣ／１４８クローンに存在する長さが
約４０ｋｂの他の断片とともに移動するので、Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒクローンでは親のｐ
ＥＢＡＣ／１４８クローンにより生成される４０ｋｂのバンドに比べて有意に強
いバンドをこの位置で示した。親ベクターの骨格にはＸｈｏＩ部位が存在しない
ので、７０ｋｂの断片は該ベクター骨格と隣接するグロビン配列に由来するに違
いない。ＰＣＲｋａｎ１４０が相同的組換えによりベクター骨格中に組み込まれ
た後、７０ｋｂの断片はカナマイシン遺伝子中に存在する単一のＸｈｏＩ部位で
２つのより小さい断片に切断される。

【００８４】これら結果により、相同的組換えによるＰＣＲｋａｎ１４０の組み込みが４つ
のすべての一次Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒクローン中のベクターの骨格上の標的部位で正確に
起っていることが確認される。さらに、これらクローンのいずれもこの手順の際
に不安定性を示さなかったことが明らかであり、ｐＧＥＴｒｅｃプラスミドを用
いたＤＨ１０Ｂ菌体中への相同的組換えの一過性の誘導が少なくとも約２００ｋ
ｂのサイズまでＢＡＣクローンでの所望でない再配列のリスクを最小にすること
を示している。相同的組換えによる組み込みに用いたホモロジー領域の一層詳細
な分析を行った。ｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０クローンおよびｐＥＢＡ
Ｃ１４０：：ｋａｎ５０クローンの両者においてカナマイシン遺伝子にフランキ
ングするホモロジー領域の全域にわたるシークエンシングは、予期される配列か
らのいかなる逸脱も示さなかった。

【００８５】わずか５０ｂｐの短いホモロジー領域を導入するＰＣＲ産物は、ＪＣ８６７９
またはＪＣ９６０４大腸菌株で良効率で組換えられることが示されている^４２， ^４３。このことは、あらゆる目的断片を標的部位（プライマーの５'末端にある
）に対する５０ｂｐのホモロジーを含む７０〜８０ｍｅｒを合成することにより
増幅し、エレクトロポレーションによるターゲティングに直接用いることを可能
にする。この方法を、ＰＣＲｋａｎ５０をＤＨ１０Ｂ（ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢ
ＡＣ／１４８）菌体中にエレクトロポレーションすることにより現在のシステム
で試験した。該菌体は調製の際にＬ−アラビノースで４０分間だけ誘導した。各
エレクトロポレーションから１００を超えるＣｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーが得られた（
表１、実験５、６）。プライマー１４０ＫＦおよび１４０ＫＲを用いたこれらＣ
ｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーからの２０の独立した一夜培養物の直接ＰＣＲスクリーニン
グは正確な１４５０ｂｐ産物を生成した。

【００８６】５０−ｍｅｒのターゲティング部位を用いた場合は１４０−ｍｅｒのターゲテ
ィング部位に比べて組換え体の頻度が約１０倍低減したが、相同的組換えによる
組み込みの正確さは変わることがなかった。Ｌ−アラビノース誘導なしではＤＨ１０Ｂ菌体中でｐＧＥＴｒｅｃプラスミド
による組換え体は得られなかったが、Ｌ−アラビノースによる長引いた誘導は菌
体にとって明らかに毒性である。電気的にコンピテントな菌体の調製の際および
エレクトロポレーション後の回収の際の４時間を越える誘導は菌体の生存能を大
きく損うと思われ、いかなる組換え体も得られなかった。一方、１０分間だけＬ
−アラビノースで誘導したＤＨ１０Ｂ（ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢＡＣ／１４８）
菌体中へのＰＣＲｋａｎ５０のエレクトロポレーションは、約４０分間の誘導後
のものに比べて約１０倍少ないＣｍ^ｒＫｍ^ｒを生成した。４０分間の誘導は組換
え体クローンを高効率で生成したが、組換え効率を変調する手段としてパラメー
タの変調を用いることができる。

【００８７】実施例３ｐＥＢＡＣ／１４８の構築第二世代のｐＥＢＡＣ１４０ＢＡＣ／ＰＡＣクローニングベクター（図１）は
、第一世代のＰＡＣクローニング系^２４およびＢＡＣクローニング系^２３からの
幾つかの特性並びにＨＡＥＣ系^４８からのエプスタインバーウイルスのｏｒｉＰ
およびＥＢＮＡ−１を組み合せたものである。該クローニングベクターはまた、
稀なカッターマルチプルクローニング領域を含む幾つかのさらなる特性を含む。
ｐＥＢＡＣ／１４８（図２）の調製は、ＰＡＣクローニングプロトコール^４９に
基づいた手順を用い、全β−グロビン遺伝子座を含む１８５ｋｂのゲノム断片を
改装することによりｐＥＢＡＣ１４０から行った。

【００８８】簡単に説明すると、ＲＰＣＩ１ヒト全ゲノムＰＡＣライブラリー^４９をβ−グ
ロビン遺伝子座の５'末端および３'末端からのＰＣＲプライマーによりスクリー
ニングした。１８５ｋｂのゲノム挿入物を有するＰＡＣクローンを同定し（ＰＡ
Ｃ１４８／β−グロビン）、全β−グロビン遺伝子座（約７３ｋｂ）並びに５'
および３'の両末端にさらなる配列を含むことが示された。１８５ｋｂのゲノム
挿入物をＮｏｔＩ消化により単一の断片として単離し、パルスフィールドゲル電
気泳動にかけ（ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩ、BIO-RAD Labs、ハーキュールズ、カリフォ
ルニア）、ゲラーゼ（gelase）（Epicentre Technologies、マジソン、ウイスコ
ンシン）消化した。ｐＥＢＡＣ１４０ベクターもＮｏｔＩ消化し、精製した１８
５ｋｂのグロビン断片にライゲートする前に脱リン酸化しゲル精製した。ＤＨ１
０Ｂ菌体中にエレクトロポレーションした後に３つの独立したｐＥＢＡＣ／１４
８クローンが単離された。ＮｏｔＩ消化およびパルスフィールドゲル電気泳動に
よる分析は、これらクローンはすべて再配列を示すことなく全１８５ｋｂのβ−
グロビンゲノム断片を含むことを示した。ｐＥＢＡＣ／１４８がエピソームの形
態で保持されている安定な細胞株でｐＥＢＡＣ／１４８中のβ−グロビン遺伝子
の発現が観察された^５０。

【００８９】実施例４ｐＧＥＴｒｅｃ誘導性組換えベクターの構築バクテリオファージλのｇａｍ遺伝子を、プライマーとしてｇａｍ−Ｆ、

【化１】（配列番号１）およびｇａｍ−Ｒ、

【化２】（配列番号２）を用いてＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴＰ２２３^４１から
ＰＣＲ増幅し、ｐＢＡＤ２４−ｒｅｃＥＴ^４３のＢｇｌＩＩ部位にクローニング
した。アラビノースプロモーターに対して正しい方向にてｇａｍ遺伝子を有する
クローンをｐＧＥＴｒｅｃと称した（図３）。

【００９０】実施例５ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびλｇａｍ遺伝子のＬ−アラビノース誘導および電気的
にコンピテントな菌体の調製ｐＧＥＴｒｅｃとｐＥＢＡＣ１４０かまたはｐＥＢＡＣ／１４８との両者を有
するＤＨ１０Ｂ菌体（GIBCO-BRL、ゲイサーズバーグ、メリーランド）の一夜培
養液を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１２.５μｇ／ｍｌのクロラム
フェニコールを含む２５０ｍｌの新たなＬＢ培地中に５０倍に希釈した。菌体の
ＯＤ６００が０.４０〜０.４２に達したときにＬ−アラビノース（SIGMA、セン
トルイス、ミズーリ）を最終濃度０.２％（ｗ／ｖ）にて加えた。製造業者によ
って推奨されたプロトコールを用い、ＯＤ_６０００.５５〜０.６０で回収する
ことによって電気的にコンピテントな菌体を調製した。最終的な菌体ペレットを
全量４００〜５００μｌの１０％グリセリン中に再浮遊させた。菌体を前以て冷
却した１.５ｍｌ容のミクロ遠心管にアリコートし（４０μｌ／管）、ドライア
イス−エタノール浴中に凍結した。凍結した菌体を−７０℃で貯蔵した。

【００９１】実施例６ターゲティングＤＮＡ断片ＰＣＲｋａｎ５０およびＰＣＲｋａｎ１４０の調製ベクターｐＣＹＰＡＣ２^４９からのカナマイシン遺伝子を、下記プライマーを
用いて増幅した：ｋａｎ５０Ｆ

【化３】（配列番号３）およびｋａｎ５０Ｒ

【化４】（配列番号４）。各プライマー配列の最初の５０ヌクレオチド（下線を引いてあ
る）は唯一のＢｓｔ１１０７１部位と境を接するｐＥＢＡＣ１４０ベクターの上
流鎖および下流鎖中の配列に対応し、一方、各プライマーの最後の２０ヌクレオ
チドはｐＣＹＰＡＣ２ベクター中のカナマイシン遺伝子にフランキングする配列
に対応する。ＰＣＲ産物のＰＣＲｋａｎ５０は１２６２ｂｐの長さであり、カナ
マイシン遺伝子およびプロモーター領域並びに相同的組換えによりｐＥＢＡＣ１
４０ベクター上のＢｓｔ１１０７１部位への組み込みをターゲティングするため
の両末端の５０ｍｅｒ配列を含んでいる（図４）。このＰＣＲ産物を用いて大腸
菌ＪＣ８６７９菌体中でｐＥＢＡＣ１４０中へのＰＣＲｋａｎ５０の組み込みを
ターゲティングすることによりｐＥＢＡＣ１４０：：ｋａｎ５０を生成した。Ｐ
ＣＲｋａｎ１４０は１４５０ｂｐの長さであり、プライマー１４０ＫＦ

【化５】（配列番号５）および１４０ＫＲ

【化６】（配列番号６）を用いることによりｐＥＢＡＣ１４０：：ｋａｎ５０からのＰＣ
Ｒにより生成した。ＰＣＲｋａｎ１４０は、カナマイシン遺伝子の５'末端およ
び３'末端にそれぞれ１４５ｂｐおよび１４３ｂｐの相同なターゲティング配列
を有する。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動により精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出
キット（Qiagen, GmbH、ヒルデン、ドイツ）により回収し、ついで定量した。

【００９２】実施例７組換え体の生成組換え体の生成の全体の手順は概略を示してある（図５）。ミクロ遠心管中の
４０μｌの電気的にコンピテントな菌体の凍結ストックを氷上で解凍し、２００
ｎｇのＰＣＲｋａｎ５０またはＰＣＲｋａｎ１４０を各管の菌体に加えた。ＤＮ
Ａとコンピテントな菌体との混合物を前以て冷却した０.２ｃｍの電極ギャップ
キュベット（BIO-RAD Labs、ハーキュールズ、カリフォルニア）に速やかに移し
、BIO-RAD Gene Pulser装置を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロ
ポレーションの条件は、２.５ｋＶ、２００Ω、２５μＦであった。エレクトロ
ポレーション後、直ちに１ｍｌのＬＢ培地をキュベットに加え、菌体を１７×１
００ｍｍのＦＡＬＣＯＮポリスチレン管（BECKTON-DICKINSON Labware、リンカ
ーンパーク、ニュージャージー）に移した。管を３７℃のシェーカー（２２０ｒ
ｐｍ）中で１.５時間インキュベートした。各エレクトロポレーションからの菌
体を、１２.５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび３５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含むＬＢプレート上に広げ、組換え体を同定した。コンピテントな菌
体の各バッチのエレクトロポレーション効率の測定を、１０ｎｇのｐＺｅｏＳＶ
２（Invitrogen、カールスバード、カリフォルニア）を用いた独立のエレクトロ
ポレーションおよび２５μｇ／ｍｌのゼオシン（Zeocin）を含む低塩ＬＢ（ｐＨ
７.５）プレート上にエレクトロポレーション混合物の系列希釈をプレーティン
グすることにより行った。エレクトロポレーション後に生き残った菌体の全数の
測定を、ＤＨ１０Ｂ（ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢＡＣ１４０）またはＤＨ１０Ｂ（
ｐＧＥＴｒｅｃ，ｐＥＢＡＣ／１４８）のエレクトロポレーションしたコンピテ
ントな菌体（ＤＮＡを添加せず）の系列希釈を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンおよび１.２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にプ
レーティングすることにより行った。組換えのパーセントは、エレクトロポレー
ション後に生き残ったコロニー当たりのカナマイシンおよびクロラムフェニコー
ルに耐性のコロニーのパーセントとして測定した。

【００９３】実施例８組換え体の分析改変したアルカリ溶解ミニプレップ法^４９を用い、クロラムフェニコールおよ
びカナマイシン耐性コロニーからのＤＮＡを、１２.５μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールおよび３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で増殖させた２
ｍｌの一夜培養液から単離した。ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩで消化したＢＡＣＤ
ＮＡを、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（SeaKem，FMC Bioproducts，ロックラ
ンド、メイン）中、０.５×ＴＢＥ緩衝液中、６Ｖ／ｃｍ、１４℃にてパルスフ
ィールドゲル電気泳動により分析した。ローレンジ（Low Range）およびミッド
レンジ（Midrange）のＩＰＦＧマーカー（NEB, Inc.、ビバリー、マサチューセ
ッツ）を標準として用いた。組換えクローンのＰＣＲ分析を、AmpliTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼキット（Perkin Elmer Corp.、ノーウォーク、コネチカット）を用
いて一夜培養液に対して直接行った。組換え体（１２.５μｇ／ｍｌのクロラム
フェニコールおよび３５μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で増殖させた２ｍｌ
の一夜培養液から）および親クローン（１２.５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコ
ールのみの存在下で増殖）の１μｌアリコートをＰＣＲ反応液に直接加えた。ｐ
ＥＢＡＣ１４０とＰＣＲｋａｎ５０との組換え産物をｐＥＢＡＣ１４０：：ｋａ
ｎ５０として表示した。同様に、ｐＥＢＡＣ／１４８とＰＣＲｋａｎ５０または
ＰＣＲｋａｎ１４０との組換え産物を、それぞれｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ
５０およびｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０として表示した。ｐＥＢＡＣ１
４０：：ｋａｎ１４０およびｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０を確かめるた
めに用いたＰＣＲプライマーは、１４０ＫＡ、

【化７】（配列番号７）および１４０ＫＢ、

【化８】（配列番号８）であった。ｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ５０およびｐＥＢＡＣ
１４０：：ｋａｎ５０の両者を確かめるのに用いたＰＣＲプライマーは１４０Ｋ
Ｆおよび１４０ＫＲであった（図４）。ＰＣＲ産物を１.５％（ｗ／ｖ）アガロ
ースゲル上で分離した。ＰＣＲ産物を、サーモシークエナーゼ放射性標識ターミ
ネーターサイクルシークエンシングキット（American Life Sciences, Inc.、ク
リーブランド、オハイオ）を用いて組換えの結合部（junctions）でシークエン
シングした。

【００９４】当業者であれば本明細書に記載した本発明が本明細書に特別に記載した事柄の
他に変更および修飾を施しうることが認識されるであろう。本発明はそのような
変更および修飾をすべて包含することが理解されなければならない。本発明はま
た、本明細書において個々にまたは全体として言及したまたは示した工程、特徴
、組成物および複合体のすべて、および該工程または特徴の２またはそれ以上の
組み合せをも包含する。

【００９５】参考文献

【表１】

【００９６】

【表２】

【００９７】

【表３】

【００９８】

【表４】

【００９９】

【表５】

【０１００】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＥＢＡＣ１４０ベクターマップの模式図であり、その主たる特
徴を示す。このベクターは、ＦプラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１の骨格に基づい
ている^２３。ハイグロマイシン遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子は真核細胞
での選択を可能にし、一方、エプスタインバーウイルスからのｏｒｉＰ遺伝子お
よびＥＢＮＡ−１遺伝子はエピソーム維持を容易にする。このベクターは、ｌａ
ｃＺ遺伝子中にインフレームで挿入された独特の稀なカッター（cutter）マルチ
プルクローニングサイトを含んでおり、組換え体のブルー／ホワイト選択および
ＢａｍＨＩクローニングサイトにフランキングする多くの異なるカッターのいず
れかによるゲノム挿入物の回収を可能にしている。改変ｐＵＣ１９−Ｘｈｏは該
ベクターの後の段階でＸｈｏＩ部位に挿入され、多コピーを可能とし、クローニ
ングの適用を容易にする。

【図２】ｐＥＢＡＣ１４０ベクターのＮｏｔＩ部位に完全なβ−グロビン
ゲノム領域を含むＰＡＣクローンからの１８５ｋｂゲノム断片を挿入することに
よって得られたｐＥＢＡＣ／１４８の模式図である。このクローン中で相同的組
換えによりカナマイシン耐性遺伝子の組み込みをターゲティングする位置および
最初のｐＥＢＡＣ１４０ベクター中での位置を示してある。

【図３】ｐＧＥＴｒｅｃプラスミドの主たる特徴を示すマップの模式図で
ある。バクテリオファージλのｇａｍ遺伝子を含むＰＣＲ産物をｐＢＡＤ２４−
ｒｅｃＥＴプラスミド^４５中に挿入してｐＧＥＴｒｅｃを生成する。それゆえ、ｇａｍ遺伝子は、ｒｅｃＥ遺伝子およびｒｅｃＴ遺伝子とともにアラビノースプ
ロモーターの制御下にある。

【図４】使用したオリゴヌクレオチドプライマーの模式図である。プライ
マーｋａｎ５０Ｆおよびｋａｎ５０Ｒを用いてｐＣＹＰＡＣ２からカナマイシン
遺伝子を増幅することによりＰＣＲｋａｎ５０（１２６２ｂｐ）を生成した。プ
ライマーｋａｎ５０Ｆおよびｋａｎ５０Ｒはまた、ベクター標的配列上の唯一の
Ｂｓｔ１１０７Ｉ部位をフランキングする配列に相同な５０−ｍｅｒのターゲテ
ィング領域をも含んでいる。ｐＥＢＡＣ１４０ベクター中へのＰＣＲｋａｎ５０
の相同的組換え後に、プライマーＫＦおよびＫＲを用いてＰＣＲｋａｎ１４０ベ
クターを生成した。プライマーＫＦ／ＫＲを用いたＰＣＲ産物の予期されるサイ
ズは、カナマイシン遺伝子の不在下および存在下でそれぞれ２８８ｂｐおよび１
４５０ｂｐである。プライマーＫＡ／ＫＢを含む対応ＰＣＲ産物の予期されるサ
イズは、３９３ｂｐおよび１５５５ｂｐである。

【図５】相同的組換えによりＰＣＲ断片をＤＨ１０Ｂ菌体中のＢＡＣ／Ｐ
ＡＣ中に組み込むための「ＧＥＴ組換え」法を示す模式図である。ＰＣＲプライ
マーは、それぞれ、選択マーカーを有するＤＮＡ断片を増幅するための３'末端
の特定の配列とともに、ＰＡＣまたはＢＡＣ中のターゲティング部位に対する５
０−ｍｅｒのホモロジー領域を含むようにデザインしてある。さらなる配列また
はマーカーも含まれていてよい。これらプライマーによって生成したＰＣＲ産物
を、目的のＢＡＣまたはＰＡＣクローンおよびｐＧＥＴｒｅｃプラスミドの両者
を含む電気的にコンピテントな（electrocompetent）ＤＨ１０Ｂ菌体中にエレク
トロポレーションし、該電気的にコンピテントな菌体を、調製の際に０.２％の
Ｌ−アラビノースで一過性に誘導する。ＰＣＲ断片のホモロジー領域とＢＡＣま
たはＰＡＣクローンとの間の組換えはＰＣＲ断片の組み込みを可能とする。修飾
したＢＡＣまたはＰＡＣクローンは、ミニプレップＤＮＡ単離およびＤＨ１０Ｂ
菌体中へのエレクトロポレーションにより、または培地で抗生物質により条をつ
ける（streaking）ことにより、ｐＧＥＴｒｅｃから精製する。

【図６】ｐＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０を有する２０の独立したＣ
ｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーのＰＣＲ分析の写真表示である。各Ｃｍ^ｒＫｍ^ｒコロニーか
ら増殖させた一夜培養液の１μｌを、ＰＣＲプライマーＫＦおよびＫＲを用いた
ＰＣＲ反応に加えた。ＰＣＲ産物を１.５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて
分離した。レーン：１および２４、１−ｋｂＤＮＡラダー標準；レーン２〜２
１、２０の独立のＣｍ^ｒＫｍ^ｒコロニー；レーン２２、親のｐＥＢＡＣ／１４８
クローン；レーン２３、陰性の対照（菌体なし）。

【図７】相同的組換えによりＰＣＲｋａｎ１４０をｐＥＢＡＣ／１４８中
に組み込んだ後にランダムに取り出した４つのＣｍ^ｒＫｍ^ｒコロニー（Ａ〜Ｄ）
のＰＦＧＥ分析の写真表示である。各クローンからのＤＮＡをＤＨ１０Ｂ菌体中
に再度、エレクトロポレーションした。２複写のうちの第二のコロニーを、ＤＮ
Ａミニプレップ抽出およびＮｏｔＩとＸｈｏＩを用いた制限酵素消化に用いた。
（ａ）ＮｏｔＩ消化：Ｍ、低範囲のＰＦＧマーカー；レーン１〜８、２複写のｐ
ＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０クローン；Ｐ、親のｐＥＢＡＣ／１４８クロ
ーン。ＰＦＧＥの条件：６Ｖ／ｃｍ、スイッチ時間０.１〜２５.０秒、１４℃、
１７時間。（ｂ）ＸｈｏＩ消化：Ｍ、低範囲のＰＦＧマーカー；レーン１〜８、２複写のｐ
ＥＢＡＣ／１４８：：ｋａｎ１４０クローン；Ｐ、親のｐＥＢＡＣ／１４８クロ
ーン；Ｍ２、中くらいの範囲のＩＰＦＧマーカー。ＰＦＧＥの条件：６Ｖ／ｃｍ
、スイッチ時間０.１〜８.０秒、１４℃、１８時間。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/7088 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ４Ｃ０８６ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クマラン・ナラヤナンマレイシア94300サラワク、コタ・ファマラハン、ユニビシティ・マレイシア・サラワク、ファカルティ・オブ・リサーチ・サイエンス・アンド・テクノロジーＦターム(参考） 2G045 BB20 DA12 DA13 DA14 FB02 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA03 DA06 EA04 HA17 4B065 AA26X AA90Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA44 CA60 4C057 MM09 4C084 AA13 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換えを容
易にする方法であって、該少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的組換えを
容易にするのに充分な条件下で、ｒｅｃＢＣＤ、およびエキソヌクレアーゼ、組
換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその誘導体をコードする
ヌクレオチド配列を発現しうる宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞で該
少なくとも２つのヌクレオチド配列間で組換えを誘導することを含み、該エキソ
ヌクレアーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調
しうるものであることを特徴とする方法。
【請求項２】該少なくとも２つのヌクレオチド配列が環状ヌクレオチド配
列および線状ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】該環状ヌクレオチド配列がＦプラスミド部分を含む、請求項
２に記載の方法。
【請求項４】該Ｆプラスミド部分がＢＡＣである、請求項３に記載の方法
。
【請求項５】該Ｆプラスミド部分がＰＡＣである、請求項３に記載の方法
。
【請求項６】該エキソヌクレアーゼがｒｅｃＥまたはその機能的誘導体で
あり、該組換えタンパク質がｒｅｃＴまたはその機能的誘導体である、請求項１
ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍ、Ｐ２２Ａｂｃまたは
ＳＳＢまたはその機能的誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍまたはその機能的誘導
体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子が
誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子
が共通の誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項９に記載の
方法。
【請求項１１】該プロモーターがＬ−アラビノースである、請求項９また
は１０に記載の方法。
【請求項１２】共通のＬ−アラビノースプロモーターに作動可能に連結し
た該核酸分子が発現プラスミドｐＧＥＴｒｅｃに対応する、請求項１１に記載の
方法。
【請求項１３】該宿主細胞が大腸菌である、請求項１ないし１２のいずれ
かに記載の方法。
【請求項１４】該大腸菌がｒｅｃＢＣＤを発現する、請求項１３に記載の
方法。
【請求項１５】該大腸菌が株ＲＲ１、ＤＭ１またはＤＨ１０Ｂである、請
求項１４に記載の方法。
【請求項１６】該株がＤＨ１０Ｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】宿主細胞中での少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同
的組換えを容易にする方法であって、工程：（i）宿主細胞を形質転換し、その際、形質転換した宿主細胞は、エキソヌクレ
アーゼ、組換えタンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘
導体をコードする第一のヌクレオチド配列、および該少なくとも２つのヌクレオ
チド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質、およびｒｅｃＢＣ
Ｄインヒビターをコードする遺伝子の発現は変調しうるものであり、ついで（ii）該形質転換した宿主細胞を、該第一のヌクレオチド配列の発現が起こるの
に充分な時間および条件下で培養し、その際、該第一のヌクレオチド配列の発現
産物は該第二のヌクレオチド配列と該第三のヌクレオチド配列との相同的組換え
を容易にするを含む方法。
【請求項１８】該少なくとも２つのヌクレオチド配列が環状ヌクレオチド
配列および線状ヌクレオチド配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】該環状ヌクレオチド配列がＦプラスミド部分を含む、請求
項１８に記載の方法。
【請求項２０】該Ｆプラスミド部分がＢＡＣである、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２１】該Ｆプラスミド部分がＰＡＣである、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２２】該エキソヌクレアーゼがｒｅｃＥまたはその機能的誘導体
であり、該組換えタンパク質がｒｅｃＴまたはその機能的誘導体である、請求項
１７ないし２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍ、Ｐ２２Ａｂｃまた
はＳＳＢまたはその機能的誘導体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍまたはその機能的誘
導体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子
が誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２４に記載の方法
。
【請求項２６】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子
が共通の誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５に記載
の方法。
【請求項２７】該プロモーターがＬ−アラビノースである、請求項２５ま
たは２６に記載の方法。
【請求項２８】共通のＬ−アラビノースプロモーターに作動可能に連結し
た該核酸分子が発現プラスミドｐＧＥＴｒｅｃに対応する、請求項２７に記載の
方法。
【請求項２９】該宿主細胞が大腸菌である、請求項１７ないし２８のいず
れかに記載の方法。
【請求項３０】該大腸菌がｒｅｃＢＣＤを発現する、請求項２９に記載の
方法。
【請求項３１】該大腸菌が株ＲＲ１、ＤＭ１またはＤＨ１０Ｂである、請
求項３０に記載の方法。
【請求項３２】該株がＤＨ１０Ｂである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換えを
容易にするのに有用な微生物の製造方法であって、ｒｅｃＢＣＤ、変調しうるレ
ベルのエキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質、およびｒｅｃＢＣＤインヒビタ
ーをコードする遺伝子、および該少なくとも２つの他のヌクレオチド配列の発現
が可能となるように宿主細胞を遺伝子操作することを含む方法。
【請求項３４】該少なくとも２つのヌクレオチド配列が環状ヌクレオチド
配列および線状ヌクレオチド配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】該環状ヌクレオチド配列がＦプラスミド部分を含む、請求
項３４に記載の方法。
【請求項３６】該Ｆプラスミド部分がＢＡＣである、請求項３５に記載の
方法。
【請求項３７】該Ｆプラスミド部分がＰＡＣである、請求項３５に記載の
方法。
【請求項３８】該エキソヌクレアーゼがｒｅｃＥまたはその機能的誘導体
であり、該組換えタンパク質がｒｅｃＴまたはその機能的誘導体である、請求項
３３ないし３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍ、Ｐ２２Ａｂｃまた
はＳＳＢまたはその機能的誘導体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】該ｒｅｃＢＣＤインヒビターがｇａｍまたはその機能的誘
導体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子
が誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４０に記載の方法
。
【請求項４２】該ｒｅｃＥ、ｒｅｃＴおよびｇａｍをコードする核酸分子
が共通の誘導性のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４１に記載
の方法。
【請求項４３】該プロモーターがＬ−アラビノースである、請求項４１ま
たは４２に記載の方法。
【請求項４４】共通のＬ−アラビノースプロモーターに作動可能に連結し
た該核酸分子が発現プラスミドｐＧＥＴｒｅｃに対応する、請求項４３に記載の
方法。
【請求項４５】該宿主細胞が大腸菌である、請求項３３ないし４４のいず
れかに記載の方法。
【請求項４６】該大腸菌がｒｅｃＢＣＤを発現する、請求項４５に記載の
方法。
【請求項４７】該大腸菌が株ＲＲ１、ＤＭ１またはＤＨ１０Ｂである、請
求項４５に記載の方法。
【請求項４８】該株がＤＨ１０Ｂである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】少なくとも２つのヌクレオチド配列間での相同的組換えを
容易にし得る細胞であって、エキソヌクレアーゼ、組換えタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列およびｒｅｃＢＣＤインヒビターをコードする遺伝子、およ
び該少なくとも２つのヌクレオチド配列を含み、該エキソヌクレアーゼ、組換え
タンパク質およびｒｅｃＢＣＤインヒビターの発現は変調しうるものであること
を特徴とする細胞。
【請求項５０】該相同的組換えを請求項１ないし３２のいずれかに記載の
方法に従って行う、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】請求項１ないし３２のいずれかに記載の方法により相同的
組換えを行った核酸分子。
【請求項５２】哺乳動物における疾患の治療のための医薬を製造するうえ
での請求項５１に記載の核酸分子の使用。
【請求項５３】哺乳動物における状態を診断するうえでの請求項５１に記
載の核酸分子の使用。
【請求項５４】１またはそれ以上の薬理学的に許容しうる担体および／ま
たは希釈剤とともに請求項５１に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項５５】宿主細胞中で少なくとも２つのヌクレオチド配列の相同的
組換えを容易にするためのキットであって、エキソヌクレアーゼ、組換えタンパ
ク質、ｒｅｃＢＣＤインヒビターまたはその機能的誘導体をコードする１または
それ以上のヌクレオチド配列、および相同的組換えを容易にするのに有用な試薬
を収容すべく適合させた区画を含むキット。