JP2002528115A - ＴｃＲγδＴ細胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
培養中の ＴｃＲγδ+Ｔ細胞を取得し、拡大増殖させる方法が記述されている。この方法では、１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の培地中で、ＴｃＲγδ+Ｔ細胞 またはその前駆体を含む試料から得られる細胞を培養すること、および２）少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、ステップ１）で得られた細胞を培養することが、実施される。好ましくは、本方法は、１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、その細胞を培養すること、および２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ１）で得られた細胞を培養することにより、ＴｃＲγδ+Ｔ細胞を得ることを含む。本方法により得られるＴｃＲγδ+Ｔ細胞を実験的、治療的および商業的な様々な用途に使用することができる。
Description
【０００１】
本発明はｅｘ ｖｉｖｏでＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を増すための新規な培養方法に
関する。
関する。
【０００２】
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は循環性Ｔリンパ球中の小サブセットであって、古典的ク
ラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束的に、異物ペ
プチド抗原を精密な特異性で認識する従来のＴｃＲαβ＋Ｔ細胞とは異なる。Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞は、ウィルスによる感染やトランスフォーメーションなどのス
トレスによって誘発される内因性細胞生成物に由来するか、または外来微生物に
由来する、ペプチド性抗原と非ペプチド性抗原の双方を認識することができる。
その上、ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞による抗原認識と異なり、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞によ
る抗原認識はＭＨＣによって拘束されない。
ラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束的に、異物ペ
プチド抗原を精密な特異性で認識する従来のＴｃＲαβ＋Ｔ細胞とは異なる。Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞は、ウィルスによる感染やトランスフォーメーションなどのス
トレスによって誘発される内因性細胞生成物に由来するか、または外来微生物に
由来する、ペプチド性抗原と非ペプチド性抗原の双方を認識することができる。
その上、ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞による抗原認識と異なり、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞によ
る抗原認識はＭＨＣによって拘束されない。
【０００３】 ＴｃＲαβ＋ およびＴｃＲγδ＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、それらをコード
する異なる遺伝子エレメントによって識別される。大部分のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞
は、そのδ鎖をコードする遺伝子に基いて、２種の主要なサブセット、Ｖδ１＋ およびＶδ２＋に分類される。ヒト末梢血中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の主要サブセ
ットはＶγ９と共にＶδ２を発現するが、その他の多くのものはＶγ２、Ｖγ３
、Ｖγ４、Ｖγ５またはＶγ８と共にＶδ１を発現する（Ｓａｌｅｒｎｏ，Ａ．
とＤｉｅｌｉ，Ｆ．，１９９８年）。
する異なる遺伝子エレメントによって識別される。大部分のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞
は、そのδ鎖をコードする遺伝子に基いて、２種の主要なサブセット、Ｖδ１＋ およびＶδ２＋に分類される。ヒト末梢血中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の主要サブセ
ットはＶγ９と共にＶδ２を発現するが、その他の多くのものはＶγ２、Ｖγ３
、Ｖγ４、Ｖγ５またはＶγ８と共にＶδ１を発現する（Ｓａｌｅｒｎｏ，Ａ．
とＤｉｅｌｉ，Ｆ．，１９９８年）。
【０００４】 ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞はＴｃＲαβ＋Ｔ細胞が有する精密な特異性を欠いている
ことから、これらが感染や腫瘍に対する最前線の監視機能をになっている、より
原始的な免疫機構であるという考えが出されている（Ｂｏｉｓｍｅｎｕ，Ｒ．等
、１９９７年）。幾つかの研究で、様々なウィルス、細菌および寄生体に対する
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の反応（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４年；Ｗａ
ｌｌａｃｅ，Ｍ．等、１９９５年；Ｌａｎｇ，Ｆ．等、１９９５年；Ｅｌｌｏｓ
ｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）および、これらの細胞が様々な起源の腫瘍細胞の
溶解を引き起こす能力を持つこと（Ｚｏｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年；Ｋ
ｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等；１９９３年；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ａ．等、１９９５
年）が記録されている。Ｖγ１．１トランスジーンを発現するトランスジェニッ
クマウスは注入されたＴ細胞白血病に対し自発的な抵抗性を示し、これらのマウ
スから誘導されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞ハイブリドーマは非造血性腫瘍細胞より造
血性悪性細胞に選択的に反応する（Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．等、１９９５）こ
とから、造血性腫瘍はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞による溶解作用を特に受け易いようで
ある。加えて、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄白血病の患者の末梢血お
よび骨髄に由来するヒトＴｃＲγδ＋Ｔ細胞クローンは、自家白血病細胞をそれ
ぞれ溶解することが示された（Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，Ａ．等、１９８９；Ｊａｈ
ｎ，Ｂ．等、１９９５年）。更に、同種骨髄移植後の白血病患者の無病生存期間
の伸長は、末梢血中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の数や割合の増加と関連があることが
示されている（Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．等、１９９６年）。まとめると、これらの結
果からＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が癌や感染症の治療において潜在的な治療能力を有す
ることが示唆される。
ことから、これらが感染や腫瘍に対する最前線の監視機能をになっている、より
原始的な免疫機構であるという考えが出されている（Ｂｏｉｓｍｅｎｕ，Ｒ．等
、１９９７年）。幾つかの研究で、様々なウィルス、細菌および寄生体に対する
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の反応（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４年；Ｗａ
ｌｌａｃｅ，Ｍ．等、１９９５年；Ｌａｎｇ，Ｆ．等、１９９５年；Ｅｌｌｏｓ
ｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）および、これらの細胞が様々な起源の腫瘍細胞の
溶解を引き起こす能力を持つこと（Ｚｏｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年；Ｋ
ｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等；１９９３年；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ａ．等、１９９５
年）が記録されている。Ｖγ１．１トランスジーンを発現するトランスジェニッ
クマウスは注入されたＴ細胞白血病に対し自発的な抵抗性を示し、これらのマウ
スから誘導されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞ハイブリドーマは非造血性腫瘍細胞より造
血性悪性細胞に選択的に反応する（Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．等、１９９５）こ
とから、造血性腫瘍はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞による溶解作用を特に受け易いようで
ある。加えて、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄白血病の患者の末梢血お
よび骨髄に由来するヒトＴｃＲγδ＋Ｔ細胞クローンは、自家白血病細胞をそれ
ぞれ溶解することが示された（Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，Ａ．等、１９８９；Ｊａｈ
ｎ，Ｂ．等、１９９５年）。更に、同種骨髄移植後の白血病患者の無病生存期間
の伸長は、末梢血中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の数や割合の増加と関連があることが
示されている（Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．等、１９９６年）。まとめると、これらの結
果からＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が癌や感染症の治療において潜在的な治療能力を有す
ることが示唆される。
【０００５】 ヒトＴｃＲγδ＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖について報告されてい
る方法の多くは、抗原の存在を必要としている。確立された腫瘍細胞系と同様に
、ウィルス感染細胞やトランスフォーム細胞や細胞系、細菌、寄生体がＴｃＲγ
δ＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を刺激することが示されている。例えば、
ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（ＨＳＶ）感染細胞がＶδ２＋細胞の増
殖を刺激するために使用されており（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４
年）、またＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）でトランスフォームさ
れたＢリンパ芽球様細胞系がＶδ１＋細胞の拡大増殖を刺激するために使用され
ている（Ｏｒｓｉｎｉ，Ｄ．Ｌ．Ｍ．等、１９９３年）。結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の抽出物および血中期のＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのマラリア抗原が、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の
増殖を刺激することが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．等、１９９４年；
Ｅｌｌｏｓｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）。不死化ヒトバーキットリンパ腫細胞
系であるＤａｕｄｉもＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の増殖を刺激することができる（Ｋａ
ｕｒ，Ｉ．等、１９９３年）。その上、性質のよくわかっているプレニルリン酸
系の非ペプチド性抗原、例えばイソペンテニリルピロリン酸が、ＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖を刺激することが示された（Ｇａｒｃｉａ，
Ｖ．Ｅ．等、１９９８年）。これらの系のいくつかでは、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の
抗原刺激培養にＩＬ−２、ＩＬ−４または他のサイトカインが添加されている。
る方法の多くは、抗原の存在を必要としている。確立された腫瘍細胞系と同様に
、ウィルス感染細胞やトランスフォーム細胞や細胞系、細菌、寄生体がＴｃＲγ
δ＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を刺激することが示されている。例えば、
ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（ＨＳＶ）感染細胞がＶδ２＋細胞の増
殖を刺激するために使用されており（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４
年）、またＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）でトランスフォームさ
れたＢリンパ芽球様細胞系がＶδ１＋細胞の拡大増殖を刺激するために使用され
ている（Ｏｒｓｉｎｉ，Ｄ．Ｌ．Ｍ．等、１９９３年）。結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の抽出物および血中期のＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのマラリア抗原が、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の
増殖を刺激することが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．等、１９９４年；
Ｅｌｌｏｓｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）。不死化ヒトバーキットリンパ腫細胞
系であるＤａｕｄｉもＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の増殖を刺激することができる（Ｋａ
ｕｒ，Ｉ．等、１９９３年）。その上、性質のよくわかっているプレニルリン酸
系の非ペプチド性抗原、例えばイソペンテニリルピロリン酸が、ＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖を刺激することが示された（Ｇａｒｃｉａ，
Ｖ．Ｅ．等、１９９８年）。これらの系のいくつかでは、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の
抗原刺激培養にＩＬ−２、ＩＬ−４または他のサイトカインが添加されている。
【０００６】 ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は次のような方法で腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の集団
からもｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖されている。ＩＬ−２と一緒に培養する（Ｚｏ
ｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年）；固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２を併用す
る（Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等、１９９３年）；抗ＴｃＲγδ抗体と一緒に培養
する（Ｙｕ，Ｓ．等、１９９９年）；などである。これらの系では、癌組織から
Ｔ細胞を単離する前にすでに、腫瘍抗原によるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の選択的刺激
がｉｎ ｖｉｖｏで起こっていると推定される。
からもｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖されている。ＩＬ−２と一緒に培養する（Ｚｏ
ｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年）；固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２を併用す
る（Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等、１９９３年）；抗ＴｃＲγδ抗体と一緒に培養
する（Ｙｕ，Ｓ．等、１９９９年）；などである。これらの系では、癌組織から
Ｔ細胞を単離する前にすでに、腫瘍抗原によるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の選択的刺激
がｉｎ ｖｉｖｏで起こっていると推定される。
【０００７】 別の系では、グリオブラストーマ患者の末梢血からＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大
増殖させるのに、まず固相の固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２とを組み合わせて用
いた後、ＩＬ−２だけで培養している（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．等、１９９７
年）。この著者等は、それから精製されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞はＩＬ−２だけが
存在する条件下で１週間以上増殖を続けることができなかったと報告し、したが
ってこの方法は短期の研究にしか適用できないだろうと結論している。彼等は更
に、その方法ではＴｃＲγδ＋Ｔ細胞とＴｃＲαβ＋Ｔ細胞双方の拡大増殖と富
化が起こり、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の純度は２８％程度であることを示した。その
後の報告で、同じ著者等は、この方法が選択的にＶδ２＋サブセットを拡大増殖
させることを示した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．等、１９９９年）。
増殖させるのに、まず固相の固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２とを組み合わせて用
いた後、ＩＬ−２だけで培養している（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．等、１９９７
年）。この著者等は、それから精製されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞はＩＬ−２だけが
存在する条件下で１週間以上増殖を続けることができなかったと報告し、したが
ってこの方法は短期の研究にしか適用できないだろうと結論している。彼等は更
に、その方法ではＴｃＲγδ＋Ｔ細胞とＴｃＲαβ＋Ｔ細胞双方の拡大増殖と富
化が起こり、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の純度は２８％程度であることを示した。その
後の報告で、同じ著者等は、この方法が選択的にＶδ２＋サブセットを拡大増殖
させることを示した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．等、１９９９年）。
【０００８】 したがって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養し拡大増殖させるた
めの現行の方法では、細胞増殖に限界があり、および／または抗原刺激が必要で
ある。更に、多くの報文がＶδ２＋サブセットの増殖を報告しているが、Ｖδ１ ＋ サブセットの増殖を報告している報文はほとんどなく、単一の培養でＶδ１＋ およびＶδ２＋Ｔ細胞サブセット双方の増殖を報告している報文は全くない。
めの現行の方法では、細胞増殖に限界があり、および／または抗原刺激が必要で
ある。更に、多くの報文がＶδ２＋サブセットの増殖を報告しているが、Ｖδ１ ＋ サブセットの増殖を報告している報文はほとんどなく、単一の培養でＶδ１＋ およびＶδ２＋Ｔ細胞サブセット双方の増殖を報告している報文は全くない。
【０００９】 以上を考えると、ＴｃＲγδ＋細胞を多量にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に培養
する方法が当分野で必要とされている。
する方法が当分野で必要とされている。
【００１０】
本発明は、外因性抗原の不在下の培養でＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる
新規な方法を提供する。したがって、本発明は （１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の
培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させるために、少なくとも２種のサイト
カインを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
新規な方法を提供する。したがって、本発明は （１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の
培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させるために、少なくとも２種のサイト
カインを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、
とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
【００１１】 実施形態の１つでは、本発明は （１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養し、 （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞を拡大増殖させること を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養し、 （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞を拡大増殖させること を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
【００１２】 他の実施形態では、本発明は （１）出発試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得て、 （２）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を
培養し、 （３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる、 事を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を
培養し、 （３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる、 事を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
【００１３】 好ましい実施形態では、第１の培地中で細胞を培養する前に、細胞から非ＣＤ
４＋細胞または非ＴｃＲγδ＋細胞を除去しておく。
４＋細胞または非ＴｃＲγδ＋細胞を除去しておく。
【００１４】 他の実施形態では、本発明は （１）白血球馴らし培地（コンディションドメディウム)からなる第１の培地
中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、 を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する
。
中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、 を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する
。
【００１５】 更に他の実施形態では、本発明は （１）出発試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得ることと、 （２）白血球馴らし培地からなる第１の培地中で、ステップ（１）で得られた
細胞を培養することと、 （３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、 を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する
。
細胞を培養することと、 （３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、 を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する
。
【００１６】 本方法により得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を実験的、治療的および商業的な様
々な用途に使用することができる。
々な用途に使用することができる。
【００１７】 本発明のその他の特徴および利点は、次の詳細な説明から明らかとなろう。し
かし、本発明の精神および範囲の中での様々な変更や改変は、当分野の技術者に
は詳細な記述から明らかになると思われるので、この詳細な記述および本発明の
好ましい実施形態を示す個々の実施例は例示だけのために提示されていると理解
すべきである。
かし、本発明の精神および範囲の中での様々な変更や改変は、当分野の技術者に
は詳細な記述から明らかになると思われるので、この詳細な記述および本発明の
好ましい実施形態を示す個々の実施例は例示だけのために提示されていると理解
すべきである。
【００１８】 ［発明の詳細な説明］ 図を参照しながら本発明を以下に説明する。 本発明は、培養中にＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を選択的に拡大増殖させる新規な方法
を提供する。本法は未分画出発試料またはＴ細胞の富化された出発試料のいずれ
をも使用することができる。本発明の方法の利点は、他の方法のほとんどが必要
とする抗原刺激の使用を必要としないことである。
を提供する。本法は未分画出発試料またはＴ細胞の富化された出発試料のいずれ
をも使用することができる。本発明の方法の利点は、他の方法のほとんどが必要
とする抗原刺激の使用を必要としないことである。
【００１９】 したがって、本発明は （１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の
培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、ステップ（１）
で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる
こと、 を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、ステップ（１）
で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる
こと、 を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
【００２０】 第１および第２の培地中の２種のサイトカインは、同一であつても異なってい
てもよい。２種のサイトカインは培地間で同一であることが好ましく、２種のサ
イトカインがインターロイキン−２およびインターロイキン−４であることがよ
り好ましい。
てもよい。２種のサイトカインは培地間で同一であることが好ましく、２種のサ
イトカインがインターロイキン−２およびインターロイキン−４であることがよ
り好ましい。
【００２１】 本発明は、一態様として、 （１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること
、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること
、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させること を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供す
る。
【００２２】 出発試料はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞またはその前駆体を含有する任意の試料であっ
てよく、血液、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、リンパ節
組織、感染組織、胎児組織およびそれらの分画物または富化部分などがあるが、
特に限定されない。好ましくは出発試料は、軟膜(buffy coat)細胞、単核細胞お
よび低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を含んでいる末梢血または臍帯血などの血液
またはその分画物などである。細胞は、密度勾配遠心分離などの当分野で公知の
技術を用いて、出発血液試料から得られる。例えば、全血を等体積のＦｉｃｏｌ
ｌ−ＨｙｐａｑｕｅＴＭ上に重層後、室温で３０分間４００×ｇで遠心分離する
。界面にくるものには低密度単核細胞が含れると予想され、この細胞を集めて、
培地で洗浄し、室温で１０分間１００×ｇで遠心分離することができる。ＴｃＲ
γδ＋Ｔ細胞を得るために培養する前は、細胞はＡＩＭ−ＶＴＭ、ＲＰＭＩ１６
４０またはＩＭＤＭなどの任意の適当な哺乳類用培地中に維持することができる
。
てよく、血液、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、リンパ節
組織、感染組織、胎児組織およびそれらの分画物または富化部分などがあるが、
特に限定されない。好ましくは出発試料は、軟膜(buffy coat)細胞、単核細胞お
よび低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を含んでいる末梢血または臍帯血などの血液
またはその分画物などである。細胞は、密度勾配遠心分離などの当分野で公知の
技術を用いて、出発血液試料から得られる。例えば、全血を等体積のＦｉｃｏｌ
ｌ−ＨｙｐａｑｕｅＴＭ上に重層後、室温で３０分間４００×ｇで遠心分離する
。界面にくるものには低密度単核細胞が含れると予想され、この細胞を集めて、
培地で洗浄し、室温で１０分間１００×ｇで遠心分離することができる。ＴｃＲ
γδ＋Ｔ細胞を得るために培養する前は、細胞はＡＩＭ−ＶＴＭ、ＲＰＭＩ１６
４０またはＩＭＤＭなどの任意の適当な哺乳類用培地中に維持することができる
。
【００２３】 出発試料またはその分画物（ＬＤＭＮＣなど）を第１の培地中で培養する前に
、出発試料またはその分画物を一定の細胞型について富化し、および／または他
の細胞型を除去してもよい。特に、出発試料またはその分画物をＣＤ４＋細胞に
ついて富化してもよいし、またはＴｃＲαβ＋Ｔ細胞を除去してＴ細胞を富化し
てもよい。試料は当分野で公知の技術を用いて、ある細胞型を富化または除去す
ることができる。一実施形態では、出発試料またはその分画物を、除去する細胞
上のマーカーに特異的な抗体を含有する抗体カクテルと共に培養することによつ
て、特定の表現型の細胞を除去してもよい。カクテル中の抗体は、Ｌａｎｄｓｄ
ｏｒｐに与えられた米国特許第４８６８１０９号に記載のような四量体抗体複合
体であることが好ましい。
、出発試料またはその分画物を一定の細胞型について富化し、および／または他
の細胞型を除去してもよい。特に、出発試料またはその分画物をＣＤ４＋細胞に
ついて富化してもよいし、またはＴｃＲαβ＋Ｔ細胞を除去してＴ細胞を富化し
てもよい。試料は当分野で公知の技術を用いて、ある細胞型を富化または除去す
ることができる。一実施形態では、出発試料またはその分画物を、除去する細胞
上のマーカーに特異的な抗体を含有する抗体カクテルと共に培養することによつ
て、特定の表現型の細胞を除去してもよい。カクテル中の抗体は、Ｌａｎｄｓｄ
ｏｒｐに与えられた米国特許第４８６８１０９号に記載のような四量体抗体複合
体であることが好ましい。
【００２４】 必要に応じて出発試料中の細胞を分画し、富化したならば、Ｔ細胞マイトジェ
ンおよび少なくとも２種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を含む第１の培地中で細胞を
培養する。Ｔ細胞マイトジェンは約０．０１から約１００μｇ／ｍｌの量で存在
し、ＩＬ−２は約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４は約
０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい。Ｔ細胞マイト
ジェンが約０．１から約５０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約１から約１
００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存
在することがより好ましい。Ｔ細胞マイトジェンが約０．５から約１０μｇ／ｍ
ｌの量で存在し、ＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４
が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより一層好ましい。第１培地
がＴ細胞マイトジェンを１μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−
４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
ンおよび少なくとも２種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を含む第１の培地中で細胞を
培養する。Ｔ細胞マイトジェンは約０．０１から約１００μｇ／ｍｌの量で存在
し、ＩＬ−２は約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４は約
０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい。Ｔ細胞マイト
ジェンが約０．１から約５０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約１から約１
００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存
在することがより好ましい。Ｔ細胞マイトジェンが約０．５から約１０μｇ／ｍ
ｌの量で存在し、ＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４
が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより一層好ましい。第１培地
がＴ細胞マイトジェンを１μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−
４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
【００２５】 細胞は第１培地中で約３日から２１日間培養することが好ましく、約５日から
１４日間培養することがより好ましい。
１４日間培養することがより好ましい。
【００２６】 Ｔ細胞マイトジェンは、植物起源および非植物起源のレクチン、Ｔ細胞を活性
化させるモノクローナル抗体、および他の非レクチン／非抗体マイトジェンを含
むがそれに限定されずに、Ｔ細胞を刺激することのできる任意の物質であってよ
い。好ましいレクチンはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）であるが、フィトヘマグ
ルチニン（ＰＨＡ）などの他の植物レクチンが使用されてもよい。好ましい抗体
はＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体である。他のマイトジェンは、ホルボール１２−
ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）とその関連化合物、メゼレイン、ス
タフィロコッカスのエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）およびストレプトコッカスの
プロテインＡを含む。Ｔ細胞マイトジェンは、可溶形態で、例えば、培地に溶か
してから添加するのが好ましい。
化させるモノクローナル抗体、および他の非レクチン／非抗体マイトジェンを含
むがそれに限定されずに、Ｔ細胞を刺激することのできる任意の物質であってよ
い。好ましいレクチンはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）であるが、フィトヘマグ
ルチニン（ＰＨＡ）などの他の植物レクチンが使用されてもよい。好ましい抗体
はＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体である。他のマイトジェンは、ホルボール１２−
ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）とその関連化合物、メゼレイン、ス
タフィロコッカスのエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）およびストレプトコッカスの
プロテインＡを含む。Ｔ細胞マイトジェンは、可溶形態で、例えば、培地に溶か
してから添加するのが好ましい。
【００２７】 第１の培地中で培養した後、細胞を遠心によって洗浄し、少なくとも２種のサ
イトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイ
キン−４（ＩＬ−４）を含む第２の培地中で二次培養する。第２の培地中では、
ＩＬ−２とＩＬ−４の両物質が細胞を最大限に拡大増殖させるのに必要である。
細胞をＩＬ−２だけで二次培養すると、拡大増殖は２〜３日間連続するが、その
後速やかに衰える。また、細胞をＩＬ−４だけで二次培養すると、連続的な拡大
増殖はさらに少ない。したがって、マイトジェンを除去した後連続的に細胞増殖
させるためには、第２の培地中にＩＬ−２とＩＬ−４が共に存在することが必須
である。
イトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイ
キン−４（ＩＬ−４）を含む第２の培地中で二次培養する。第２の培地中では、
ＩＬ−２とＩＬ−４の両物質が細胞を最大限に拡大増殖させるのに必要である。
細胞をＩＬ−２だけで二次培養すると、拡大増殖は２〜３日間連続するが、その
後速やかに衰える。また、細胞をＩＬ−４だけで二次培養すると、連続的な拡大
増殖はさらに少ない。したがって、マイトジェンを除去した後連続的に細胞増殖
させるためには、第２の培地中にＩＬ−２とＩＬ−４が共に存在することが必須
である。
【００２８】 二次培養のステップは、出発試料またはＬＤＭＮＣが第１の培地中での培養前
に分画されていない場合には特に、本発明の方法によるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の拡
大増殖にとって重要である。ＬＤＭＮＣを分画した場合は二次培養のステップは
任意選択となる。ＬＤＭＮＣを（ＩＬ−２／ＩＬ−４中で二次培養せずに）ｃｏ
ｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４中で連続的に培養した場合は、ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞だ
けが拡大増殖するであろう（実施例４参照）。ＩＬ−２／ＩＬ−４中で（即ち、
Ｔ細胞マイトジェンのｃｏｎＡを除去して）二次培養すると、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞の拡大増殖が起こる。逆にｃｏｎＡを第１の培地から除いた場合、細胞の拡大
増殖は全く起こらない。残存コンカナバリンＡが患者に投与されることは望まし
くないので、二次培養によってｃｏｎＡを除去することには、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞が治療用途に一層ふさわしくなるというさらなる利点がある。ＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞が実験、診断または他の非治療の用途向けならば、二次培養の段階でのＴ細
胞マイトジェンの除去は不要かもしれない。
に分画されていない場合には特に、本発明の方法によるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の拡
大増殖にとって重要である。ＬＤＭＮＣを分画した場合は二次培養のステップは
任意選択となる。ＬＤＭＮＣを（ＩＬ−２／ＩＬ−４中で二次培養せずに）ｃｏ
ｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４中で連続的に培養した場合は、ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞だ
けが拡大増殖するであろう（実施例４参照）。ＩＬ−２／ＩＬ−４中で（即ち、
Ｔ細胞マイトジェンのｃｏｎＡを除去して）二次培養すると、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞の拡大増殖が起こる。逆にｃｏｎＡを第１の培地から除いた場合、細胞の拡大
増殖は全く起こらない。残存コンカナバリンＡが患者に投与されることは望まし
くないので、二次培養によってｃｏｎＡを除去することには、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞が治療用途に一層ふさわしくなるというさらなる利点がある。ＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞が実験、診断または他の非治療の用途向けならば、二次培養の段階でのＴ細
胞マイトジェンの除去は不要かもしれない。
【００２９】 第２の培地中に、ＩＬ−２が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し
、ＩＬ−４が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい
。ＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約
１００ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより好ましい。ＩＬ−２が約２から約５
０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在す
ることがより一層好ましい。第２の培地がＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ
−４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
、ＩＬ−４が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい
。ＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約
１００ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより好ましい。ＩＬ−２が約２から約５
０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在す
ることがより一層好ましい。第２の培地がＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ
−４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
【００３０】 ＬＤＭＮＣを第２の培地中で約３日から約２１日にわたり培養することが好ま
しく、約９日から約１３日にわたり培養することがより好ましい。
しく、約９日から約１３日にわたり培養することがより好ましい。
【００３１】 第１および第２の培地は、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の生育と拡大増殖を補助し得る
他の成分を追加として含んでもよい。添加してもよい他の成分の例は、血清また
は血漿、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェ
ロン（ＩＦＮ）、アルブミンなどの精製蛋白質、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）な
どの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイドおよび成長および／または生存を
支持、促進する任意の他の補助物質を含むが、このようなものに限定されるわけ
ではない。
他の成分を追加として含んでもよい。添加してもよい他の成分の例は、血清また
は血漿、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェ
ロン（ＩＦＮ）、アルブミンなどの精製蛋白質、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）な
どの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイドおよび成長および／または生存を
支持、促進する任意の他の補助物質を含むが、このようなものに限定されるわけ
ではない。
【００３２】 第１および第２の培地には、共に血清または血漿（Ｐ）を添加しておくことが
好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約１％から約２５％であることが好
ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２％から約２０％であることがより
好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２．５％から約１０％であること
がより一層好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、５％であることが最も好
ましい。血清または血漿（Ｐ）は、ヒト末梢血、臍帯血、または他の哺乳動物種
由来の血液などの、任意の供給源から得ることができるが、これらに限定されな
い。血漿は１人のドナーから得たものでも、数人のドナーからまとめたものでも
よい。自家ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を臨床的に使用する、即ち、出発試料を得た同じ
患者に再注入しようとする場合、異物（例えばウィルス）がその患者に導入され
ることを避けるために、Ｐも自家性の（即ち、同じ患者由来の）Ｐを使用するこ
とが好ましい。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を同種間で使用しようとする（即ち、出発試
料を得た人と異なる人に注入する）場合、異物がその患者に導入されるのを最小
限に抑えるために、どちらか一方から得た血漿を使用することが好ましい。動物
生成物の患者への投与を避けるために、最低でもその血漿はヒト由来のものとす
べきである。
好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約１％から約２５％であることが好
ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２％から約２０％であることがより
好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２．５％から約１０％であること
がより一層好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、５％であることが最も好
ましい。血清または血漿（Ｐ）は、ヒト末梢血、臍帯血、または他の哺乳動物種
由来の血液などの、任意の供給源から得ることができるが、これらに限定されな
い。血漿は１人のドナーから得たものでも、数人のドナーからまとめたものでも
よい。自家ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を臨床的に使用する、即ち、出発試料を得た同じ
患者に再注入しようとする場合、異物（例えばウィルス）がその患者に導入され
ることを避けるために、Ｐも自家性の（即ち、同じ患者由来の）Ｐを使用するこ
とが好ましい。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を同種間で使用しようとする（即ち、出発試
料を得た人と異なる人に注入する）場合、異物がその患者に導入されるのを最小
限に抑えるために、どちらか一方から得た血漿を使用することが好ましい。動物
生成物の患者への投与を避けるために、最低でもその血漿はヒト由来のものとす
べきである。
【００３３】 本発明の他の態様では、第１の培地中のＴ細胞マイトジェンおよび少なくとも
２種のサイトカインは、ＸＬＣＭなどの白血球馴らし培地から由来するものであ
ってもよい。ＸＬＣＭＴＭは、実施例１に記載されるような、臍帯血から調製さ
れる馴らし培地であり、Ｔ細胞マイトジェン（ＣｏｎＡ）および数種のサイトカ
インを含有する。ＸＬＣＭはごく僅かのＩＬ−２およびほとんど検出できないＩ
Ｌ−４を含有する。
２種のサイトカインは、ＸＬＣＭなどの白血球馴らし培地から由来するものであ
ってもよい。ＸＬＣＭＴＭは、実施例１に記載されるような、臍帯血から調製さ
れる馴らし培地であり、Ｔ細胞マイトジェン（ＣｏｎＡ）および数種のサイトカ
インを含有する。ＸＬＣＭはごく僅かのＩＬ−２およびほとんど検出できないＩ
Ｌ−４を含有する。
【００３４】 したがって、本発明は、 （１）白血球馴らし培地を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養する
こと、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞を拡大増殖させること、 とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
こと、および （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞を拡大増殖させること、 とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供
する。
【００３５】 ステップ（１）で出発試料中の細胞群を培養する前に、前記のようにＴ細胞を
富化しておくことが好ましい。 好ましい実施形態では、白血球馴らし培地はＸＬＣＭである。ＸＬＣＭは、約
１％から約２５％の量で第１の培地中に存在するのが好ましい。ＸＬＣＭは、約
２％から約２０％の量で第１の培地中に存在するのがより好ましい。ＸＬＣＭは
、約２．５％から約１０％の量で第１の培地中に存在するのがより一層好ましい
。第１の培地が５％のＸＬＣＭを含有するのが最も好ましい。第２の培地中のＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４は、前記の通りであることが好ましい。第１および第２の
培地は、前記のように血清または血漿を含有することが好ましい。
富化しておくことが好ましい。 好ましい実施形態では、白血球馴らし培地はＸＬＣＭである。ＸＬＣＭは、約
１％から約２５％の量で第１の培地中に存在するのが好ましい。ＸＬＣＭは、約
２％から約２０％の量で第１の培地中に存在するのがより好ましい。ＸＬＣＭは
、約２．５％から約１０％の量で第１の培地中に存在するのがより一層好ましい
。第１の培地が５％のＸＬＣＭを含有するのが最も好ましい。第２の培地中のＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４は、前記の通りであることが好ましい。第１および第２の
培地は、前記のように血清または血漿を含有することが好ましい。
【００３６】 本発明の方法はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の拡大増殖細胞集団を生じる。「拡大増殖
」とは、最終調製品中の所望または標的の細胞型（即ち、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞）
の数が、開始時の、すなわち出発細胞集団中の数より多いことを意味する。
」とは、最終調製品中の所望または標的の細胞型（即ち、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞）
の数が、開始時の、すなわち出発細胞集団中の数より多いことを意味する。
【００３７】 本発明の方法により得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞選別、免
疫磁気分離、アフィニティーカラムクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離および
細胞パニング(panning)を含む当分野で公知の技術を用いて、最終培養物中に存
在する他の細胞から分離することができる。
疫磁気分離、アフィニティーカラムクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離および
細胞パニング(panning)を含む当分野で公知の技術を用いて、最終培養物中に存
在する他の細胞から分離することができる。
【００３８】 本発明には、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が含まれる。
したがって、本発明はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞調製品を提供する。ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞は、富化した集団中の全細胞の好ましくは６０％超、より好ましくは８
０％超、最も好ましくは９０％超を含む。
したがって、本発明はＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞調製品を提供する。ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞は、富化した集団中の全細胞の好ましくは６０％超、より好ましくは８
０％超、最も好ましくは９０％超を含む。
【００３９】 従来技術の方法とは異なり、Ｖδ１＋とＶδ２＋ の両方のＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞が本発明の方法によって増大する。したがって、本発明はＶδ１＋ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞とＶδ２＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含むＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞調製
品を提供する。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の内、約５０〜
９０％のＶδ１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞および約１０〜５０％のＶδ２＋ Ｔｃ
Ｒγδ＋Ｔ細胞を含むことが好ましい。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞の内、約７０％のＶδ１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞および約３０％のＶδ
２＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含むことがより好ましい。本発明のＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞調製品は、Ｔ細胞マイトジェンを含まないか、実質的に含まないという利点
がある。
胞が本発明の方法によって増大する。したがって、本発明はＶδ１＋ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞とＶδ２＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含むＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞調製
品を提供する。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の内、約５０〜
９０％のＶδ１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞および約１０〜５０％のＶδ２＋ Ｔｃ
Ｒγδ＋Ｔ細胞を含むことが好ましい。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞の内、約７０％のＶδ１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞および約３０％のＶδ
２＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含むことがより好ましい。本発明のＴｃＲγδ＋Ｔ
細胞調製品は、Ｔ細胞マイトジェンを含まないか、実質的に含まないという利点
がある。
【００４０】 本発明は、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の、任意のあら
ゆる用途における使用も含む。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、感染性病原体に対する防
御における第一線と考えられている。その上、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞リ
ンパ腫、肉腫および癌腫を含む様々な起源のトランスフォーム細胞に対して、固
有の細胞溶解活性を有する。その結果、本発明の方法により得られ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏで培養されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、感染症、癌または免疫抑制から生じる
疾患の治療や予防のために、患者に注入することができる。本発明のＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞にはＣｏｎＡやウシ胎児血清が含まれないので、ヒトの治療用途に有用
であることは利点である。したがって、本発明は、本発明の方法によって調製し
た有効量のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、
免疫反応を調節する方法を提供する。
ゆる用途における使用も含む。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、感染性病原体に対する防
御における第一線と考えられている。その上、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞リ
ンパ腫、肉腫および癌腫を含む様々な起源のトランスフォーム細胞に対して、固
有の細胞溶解活性を有する。その結果、本発明の方法により得られ、ｅｘ ｖｉ
ｖｏで培養されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、感染症、癌または免疫抑制から生じる
疾患の治療や予防のために、患者に注入することができる。本発明のＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞にはＣｏｎＡやウシ胎児血清が含まれないので、ヒトの治療用途に有用
であることは利点である。したがって、本発明は、本発明の方法によって調製し
た有効量のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、
免疫反応を調節する方法を提供する。
【００４１】 本明細書で使用する「有効量」という用語は、所望の結果を得るのに必要な投
与量と期間において効果のある量を意味する。
与量と期間において効果のある量を意味する。
【００４２】 本明細書で使用する「動物」という用語は、動物界の全ての種を含む。好まし
くは、動物は哺乳類、もっと好ましくはヒトである。
くは、動物は哺乳類、もっと好ましくはヒトである。
【００４３】 本発明は、実施形態の１つとして、本発明の方法で調製した有効量のＴｃＲγ
δ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、感染症を治療する方
法を提供する。
δ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、感染症を治療する方
法を提供する。
【００４４】 治療される感染症の例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａによって起こされるもの
（例えば結核）などの細菌感染症、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（Ｈ
ＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、または肝炎ウィルスによって起こさ
れるものなどのウィルス感染症、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍによって起こされ
るもの（例えばマラリア）などの寄生体感染症を含むが、これらに限定されない
。
（例えば結核）などの細菌感染症、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（Ｈ
ＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、または肝炎ウィルスによって起こさ
れるものなどのウィルス感染症、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍによって起こされ
るもの（例えばマラリア）などの寄生体感染症を含むが、これらに限定されない
。
【００４５】 本発明は、別の実施形態として、本発明の方法で調製した有効量のＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、癌を治療する方法を提
供する。
供する。
【００４６】 本発明によって治療される癌の例は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、
急性リンパ芽球性白血病、およびＴ細胞白血病とＢ細胞白血病を含む白血病、リ
ンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、リンパ増殖性疾患、プラズマ細胞腫
、組織球腫、黒色腫、アデノーマ、肉腫、充実組織の癌腫、低酸素性腫瘍、扁平
上皮癌、子宮頚部癌や膀胱癌などの泌尿生殖器癌、造血癌、頭部癌と頚部癌、お
よび神経系癌を含むが、これらに限定されない。
急性リンパ芽球性白血病、およびＴ細胞白血病とＢ細胞白血病を含む白血病、リ
ンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、リンパ増殖性疾患、プラズマ細胞腫
、組織球腫、黒色腫、アデノーマ、肉腫、充実組織の癌腫、低酸素性腫瘍、扁平
上皮癌、子宮頚部癌や膀胱癌などの泌尿生殖器癌、造血癌、頭部癌と頚部癌、お
よび神経系癌を含むが、これらに限定されない。
【００４７】 好ましい実施形態の１つで本発明は、本発明の方法によって調製した有効量の
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、慢性骨髄性
白血病を治療する方法を提供する。このような実施形態では、慢性骨髄性白血病
（ＣＭＬ）患者からＬＤＭＮＣを得ることができる。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を得る
ために培養し増大させた後は、単離される細胞はＣＭＬ癌細胞を含まないので、
その患者に再輸血するのに好適である。
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、慢性骨髄性
白血病を治療する方法を提供する。このような実施形態では、慢性骨髄性白血病
（ＣＭＬ）患者からＬＤＭＮＣを得ることができる。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を得る
ために培養し増大させた後は、単離される細胞はＣＭＬ癌細胞を含まないので、
その患者に再輸血するのに好適である。
【００４８】 本発明には、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し、または癌を治
療するために、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を使用するこ
とも含まれる。本発明は更に、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し
、または癌を治療するための医薬または製剤組成物を調製するための、本発明の
方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の使用も含む。
療するために、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を使用するこ
とも含まれる。本発明は更に、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し
、または癌を治療するための医薬または製剤組成物を調製するための、本発明の
方法によって得られるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の使用も含む。
【００４９】 本発明に従って単離されるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を、例えばその細胞の機能を更
に研究し、解明するために、実験モデルにおいて使用することもできる。その上
、これらの細胞を、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞によって認識される抗原／エピトープの
同定を目標とした研究、およびワクチンの設計と開発のために使用してもよい。
に研究し、解明するために、実験モデルにおいて使用することもできる。その上
、これらの細胞を、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞によって認識される抗原／エピトープの
同定を目標とした研究、およびワクチンの設計と開発のために使用してもよい。
【００５０】 本発明に従って単離されるＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を、上記の治療、実験または商
業の用途に直ちに使用してもよいし、あるいは、後日使用するためにその細胞を
凍結保存してもよい。
業の用途に直ちに使用してもよいし、あるいは、後日使用するためにその細胞を
凍結保存してもよい。
【００５１】 以下の非限定的実施例は、本発明を例示するものである。
【００５２】
以下の方法は、抗原や補助細胞の不在下、液体培養中でのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞
の大規模なｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖に関する。出発材料はヒト末梢血から採
取した低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）からなる。ＬＤＭＮＣは、 （１）ＣＤ４＋Ｔ細胞の富化、または （２）ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞の除去を伴ったＴ細胞の富化、によって更に分画して
もよいし、あるいは （３）それ以上分画しなくてもよい。その細胞を、ＸＬＣＭ、ヒト血清または血
漿（Ｐ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）
およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の組合せを含有する培地中で培養する
のが好ましい。頻繁に細胞をカウントし、新鮮培地、およびＸＬＣＭ、Ｐ、ｃｏ
ｎＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の組合せと共に再植種する。特定の表面マーカー
を発現する細胞のパーセントを、特異抗体およびフローサイトメトリーを用いて
決定する。
の大規模なｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖に関する。出発材料はヒト末梢血から採
取した低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）からなる。ＬＤＭＮＣは、 （１）ＣＤ４＋Ｔ細胞の富化、または （２）ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞の除去を伴ったＴ細胞の富化、によって更に分画して
もよいし、あるいは （３）それ以上分画しなくてもよい。その細胞を、ＸＬＣＭ、ヒト血清または血
漿（Ｐ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）
およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の組合せを含有する培地中で培養する
のが好ましい。頻繁に細胞をカウントし、新鮮培地、およびＸＬＣＭ、Ｐ、ｃｏ
ｎＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の組合せと共に再植種する。特定の表面マーカー
を発現する細胞のパーセントを、特異抗体およびフローサイトメトリーを用いて
決定する。
【００５３】 実施例１ ＣＤ４ｅ：ＸＬＣＭ／Ｐ⇒ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞 低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を成人末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ
ｅ（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。
体積１５ｍｌの全血を、５０ｍｌの組織培養コニカルチューブ中で等体積のＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上に重層し、次いで室温で３０分間４００×ｇで遠心
分離した。単核細胞が含まれる界面物質を集め、細胞を室温で１０分間１００×
ｇで遠心分離することにより、培地（２０単位／ｍｌのヘパリンおよび５０μＭ
の２−メルカプトエタノールを含有するＡＩＭ−Ｖ；無血清培地＝ＨＣＢＭ−２
）中で２回洗浄した。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨＣＢＭ−２で
希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、ポリスチレン製組織培養フラスコ中でイン
キュベートした。翌朝、細胞を遠心分離によって２回洗浄し、ＨＣＢＭ−２中に
再懸濁した。細胞懸濁液からとったサンプルを２％酢酸で１：２０に希釈し、有
核細胞の全数を血球計数器を用いて決定した。
ｅ（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。
体積１５ｍｌの全血を、５０ｍｌの組織培養コニカルチューブ中で等体積のＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上に重層し、次いで室温で３０分間４００×ｇで遠心
分離した。単核細胞が含まれる界面物質を集め、細胞を室温で１０分間１００×
ｇで遠心分離することにより、培地（２０単位／ｍｌのヘパリンおよび５０μＭ
の２−メルカプトエタノールを含有するＡＩＭ−Ｖ；無血清培地＝ＨＣＢＭ−２
）中で２回洗浄した。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨＣＢＭ−２で
希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、ポリスチレン製組織培養フラスコ中でイン
キュベートした。翌朝、細胞を遠心分離によって２回洗浄し、ＨＣＢＭ−２中に
再懸濁した。細胞懸濁液からとったサンプルを２％酢酸で１：２０に希釈し、有
核細胞の全数を血球計数器を用いて決定した。
【００５４】 ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４ｅ）を、系統特異抗体および免疫磁気アフィニティー
クロマトグラフィ（ＳｔｅｍＳＥＰ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いた負の選択によってＬＤＭＮＣから
富化した。合計１．７×１０７個のＬＤＭＮＣを遠心分離によってペレット化し
、２％ＦＢＳを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ＦＢＳ）中
で２回洗浄した。その細胞を１ｍｌのＰＢＳ／ＦＢＳ中に再懸濁し、系統特異性
モノクローナル抗体のカクテルを添加した。このカクテルはＣＤ８（細胞傷害性
Ｔ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、Ｃ
Ｄ５６（ＮＫ細胞）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体を含
有している。これらは、挙げられた系統特異マーカーに対する特異性およびデキ
ストランに対する特異性とを有する両特異性抗体である。ＬＤＭＮＣを氷上で３
０分間、二重特異性抗体とインキュベートし、その後鉄デキストランコロイドを
添加し、インキュベーションを更に３０分間継続した。次いで、抗体が結合した
細胞および鉄デキストラン粒子を除去するため懸濁液の免疫磁気クロマトグラフ
ィを行った。したがって、回収された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋、Ｔｃ
Ｒαβ＋）ならびにＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含む標的抗原欠損細胞の富化集団であ
った。得られたＣＤ４ｅの収量は２×１０６個であった。
クロマトグラフィ（ＳｔｅｍＳＥＰ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いた負の選択によってＬＤＭＮＣから
富化した。合計１．７×１０７個のＬＤＭＮＣを遠心分離によってペレット化し
、２％ＦＢＳを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ＦＢＳ）中
で２回洗浄した。その細胞を１ｍｌのＰＢＳ／ＦＢＳ中に再懸濁し、系統特異性
モノクローナル抗体のカクテルを添加した。このカクテルはＣＤ８（細胞傷害性
Ｔ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、Ｃ
Ｄ５６（ＮＫ細胞）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体を含
有している。これらは、挙げられた系統特異マーカーに対する特異性およびデキ
ストランに対する特異性とを有する両特異性抗体である。ＬＤＭＮＣを氷上で３
０分間、二重特異性抗体とインキュベートし、その後鉄デキストランコロイドを
添加し、インキュベーションを更に３０分間継続した。次いで、抗体が結合した
細胞および鉄デキストラン粒子を除去するため懸濁液の免疫磁気クロマトグラフ
ィを行った。したがって、回収された細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋、Ｔｃ
Ｒαβ＋）ならびにＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を含む標的抗原欠損細胞の富化集団であ
った。得られたＣＤ４ｅの収量は２×１０６個であった。
【００５５】 ＣＤ４ｅ細胞を、５％（体積で）ＸＬＣＭおよび５％ヒト臍帯血漿（Ｐ）を含
有するＨＣＢＭ−２中で拡大増殖させた。ＸＬＣＭは、ヒト臍帯血細胞をメゼレ
インとコンカナバリンＡで刺激することによって調製された馴らし培地である（
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ８：１２９，１９９９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，
１９９９；および国際公開第９８３３８９１号）。ＸＬＣＭは刺激因子および阻
害因子の複雑な混合物であり、それらの因子中少なくとも２３種が測定されてい
る（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。
有するＨＣＢＭ−２中で拡大増殖させた。ＸＬＣＭは、ヒト臍帯血細胞をメゼレ
インとコンカナバリンＡで刺激することによって調製された馴らし培地である（
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ８：１２９，１９９９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，
１９９９；および国際公開第９８３３８９１号）。ＸＬＣＭは刺激因子および阻
害因子の複雑な混合物であり、それらの因子中少なくとも２３種が測定されてい
る（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。
【００５６】 ＣＤ４ｅ細胞を５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２中で、１×
１０５細胞／ｍｌに希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で数日間インキュベートした。
その間に細胞は８倍に拡大増殖した。細胞数および生存率は、細胞再懸濁液から
取ったサンプルを等体積の０．４％トリパンブルーと混合し、血球計数器を用い
て非染色細胞（生存している）および青色細胞（生存していない）を計数するこ
とによって、決定した。細胞を継代するには、少量の培養物を新鮮培地で１×１
０５細胞／ｍｌに再希釈し、新鮮ＸＬＣＭおよびＰを各々５％の最終濃度になる
よう加えた。培養物の残りはフローサイトメトリー分析のために使用するか、ま
たは廃棄した。その後、同じように細胞を５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐで補給した
新鮮培地の中で２〜３日毎に継代した。総増殖倍率を各継代で測定した拡大増殖
倍率の積として計算し、細胞が全て連続培養中に保持されていると仮定して、全
生存細胞の理論収量を初期播種濃度と量、および各継代における拡大増殖倍率に
基いて計算した。約３から４週後には、細胞は１０万倍以上拡大増殖した（図１
）。
１０５細胞／ｍｌに希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で数日間インキュベートした。
その間に細胞は８倍に拡大増殖した。細胞数および生存率は、細胞再懸濁液から
取ったサンプルを等体積の０．４％トリパンブルーと混合し、血球計数器を用い
て非染色細胞（生存している）および青色細胞（生存していない）を計数するこ
とによって、決定した。細胞を継代するには、少量の培養物を新鮮培地で１×１
０５細胞／ｍｌに再希釈し、新鮮ＸＬＣＭおよびＰを各々５％の最終濃度になる
よう加えた。培養物の残りはフローサイトメトリー分析のために使用するか、ま
たは廃棄した。その後、同じように細胞を５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐで補給した
新鮮培地の中で２〜３日毎に継代した。総増殖倍率を各継代で測定した拡大増殖
倍率の積として計算し、細胞が全て連続培養中に保持されていると仮定して、全
生存細胞の理論収量を初期播種濃度と量、および各継代における拡大増殖倍率に
基いて計算した。約３から４週後には、細胞は１０万倍以上拡大増殖した（図１
）。
【００５７】 各継代において、ＴｃＲγδを発現するパーセントおよびＶδ１を発現するパ
ーセントを決定するために、拡大増殖細胞の一部をフローサイトメトリーによっ
て分析した。培養して２１日後、培養細胞の６５％超がＴｃＲγδ＋であり、こ
れらのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の大部分（＞７０％）がＶδ１＋であった（図１）。
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の割合は２７日までに更に増加し、その時点で培養細胞の７
０％超がＴｃＲγδ＋であり、これらの約９０％がＶδ１＋であった。
ーセントを決定するために、拡大増殖細胞の一部をフローサイトメトリーによっ
て分析した。培養して２１日後、培養細胞の６５％超がＴｃＲγδ＋であり、こ
れらのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の大部分（＞７０％）がＶδ１＋であった（図１）。
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の割合は２７日までに更に増加し、その時点で培養細胞の７
０％超がＴｃＲγδ＋であり、これらの約９０％がＶδ１＋であった。
【００５８】 これらのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ｅの中に存在する、この条件下で選択
的に拡大増殖する小集団に由来すると考えられている。
的に拡大増殖する小集団に由来すると考えられている。
【００５９】 これは予想外で新規な知見であった。その理由は以下の通りである。 （ａ）ＸＬＣＭまたはＸＬＣＭ＋Ｐの中で連続的に拡大増殖する未分画ＬＤＭ
ＮＣは、ほぼ完全にＴｃＲαβ＋であって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は存在する場合
でもごく僅かである（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。 （ｂ）（血漿なしの）ＸＬＣＭだけでは、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセットの拡
大増殖は起こらない（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９）。 （ｃ）ＸＬＣＭなしでは細胞拡大増殖は全く起こらない。
ＮＣは、ほぼ完全にＴｃＲαβ＋であって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は存在する場合
でもごく僅かである（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。 （ｂ）（血漿なしの）ＸＬＣＭだけでは、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセットの拡
大増殖は起こらない（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９）。 （ｃ）ＸＬＣＭなしでは細胞拡大増殖は全く起こらない。
【００６０】 実施例２ ＴｅＡＢｄ：ＸＬＣＭ／Ｐ⇒ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離した。抗体カク
テルがＴｃＲαβ＋細胞除去抗体（ＡＢｄ）とＴ細胞富化カクテル（Ｔｅ）から
できていること以外は、実施例１に記載の方法と同じ方法の負の選択によって、
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をＬＤＭＮＣから富化した。Ｔ細胞富化カクテルは、ＣＤ１
４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞
）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体からなっている。１．
７×１０７個の開始時ＬＤＭＮＣ数から、合計１．３×１０５個のＴｅＡＢｄ細
胞を得た。
テルがＴｃＲαβ＋細胞除去抗体（ＡＢｄ）とＴ細胞富化カクテル（Ｔｅ）から
できていること以外は、実施例１に記載の方法と同じ方法の負の選択によって、
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞をＬＤＭＮＣから富化した。Ｔ細胞富化カクテルは、ＣＤ１
４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞
）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体からなっている。１．
７×１０７個の開始時ＬＤＭＮＣ数から、合計１．３×１０５個のＴｅＡＢｄ細
胞を得た。
【００６１】 ＴｅＡＢｄ細胞を、実施例１に記載するように、５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐを
含有するＨＣＢＭ−２中で培養した。
含有するＨＣＢＭ−２中で培養した。
【００６２】 約４週の期間を経て、細胞は１０万倍を超えるまでに拡大増殖した（図２）。
培養８日目から、拡大増殖細胞は５０％超がＴｃＲγδ＋であり、１２日目後に
８０％超の純度に達した。やはりＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の大多数はＶδ１＋であっ
た（＞７０％）。
培養８日目から、拡大増殖細胞は５０％超がＴｃＲγδ＋であり、１２日目後に
８０％超の純度に達した。やはりＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の大多数はＶδ１＋であっ
た（＞７０％）。
【００６３】 実施例２の方法は、論理的に実施例１の方法から導かれる。即ち、ＣＤ４ｅ中
に存在する細胞の小亜集団から、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を増大させることができる
ならば、ＴｅＡＢｄ中に存在する相対的により富化された集団からも、それらの
細胞を増大させることができるはずである。
に存在する細胞の小亜集団から、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を増大させることができる
ならば、ＴｅＡＢｄ中に存在する相対的により富化された集団からも、それらの
細胞を増大させることができるはずである。
【００６４】 −実施例２に記載する方法の利点− 実施例２の方法では、実施例１の方法を用いて得られるものに比較して、Ｔｃ
Ｒγδ＋Ｔ細胞がより速やかに、より高い水準にまで拡大増殖し、かつより純粋
であった。
Ｒγδ＋Ｔ細胞がより速やかに、より高い水準にまで拡大増殖し、かつより純粋
であった。
【００６５】 実施例３ ＬＤＭＮＣ：ＸＬＣＭ／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰまたはＩＬ−２／Ｐまたは
ＩＬ−４／ＰまたはＰ 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、更なる分画
や富化をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭを含有するＨＣＢＭ−２の中で４日間拡大増殖さ
せ、その後遠心分離によってペレット化し、洗浄し、５等分した。５％ＸＬＣＭ
および５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で、１部分を二次培養した。別の１部
分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣ
ＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋５％Ｐを
含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−
４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。最後の１部分は５％Ｐ
だけを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。
ＩＬ−４／ＰまたはＰ 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、更なる分画
や富化をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭを含有するＨＣＢＭ−２の中で４日間拡大増殖さ
せ、その後遠心分離によってペレット化し、洗浄し、５等分した。５％ＸＬＣＭ
および５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で、１部分を二次培養した。別の１部
分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣ
ＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋５％Ｐを
含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−
４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。最後の１部分は５％Ｐ
だけを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。
【００６６】 ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐで二次培養した細胞は、ＸＬＣＭの存在下で連続培養
したものと同等か、それより良好に拡大増殖したが、Ｐだけで二次培養した細胞
は速やかに死滅した（図３）。ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞は、短期間は低
速で拡大増殖し、その後完全に増殖が止まった。ＩＬ−４＋Ｐで二次培養した細
胞の拡大増殖は、ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞よりさらに悪かった。
したものと同等か、それより良好に拡大増殖したが、Ｐだけで二次培養した細胞
は速やかに死滅した（図３）。ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞は、短期間は低
速で拡大増殖し、その後完全に増殖が止まった。ＩＬ−４＋Ｐで二次培養した細
胞の拡大増殖は、ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞よりさらに悪かった。
【００６７】 これらの結果は、最大の細胞拡大増殖を実現するためには、ＩＬ−２とＩＬ−
４が共に必要であることを示す。
４が共に必要であることを示す。
【００６８】 実施例４ ＬＤＭＮＣ：ＸＬＣＭ／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、更なる分画
や富化をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡
大増殖させから、その後２分して、一方は５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣ
ＢＭ−２の中で連続培養し、もう一方は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０
ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いず
れの場合にも、細胞は４週間で１０万倍を超えて拡大増殖した（図４）。しかし
、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類が異な
ることが判明した。即ち、ＸＬＣＭ／Ｐ中で連続培養した細胞のうちＴｃＲγδ ＋ は５％未満であったが、ＸＬＣＭ／Ｐ中で培養された後、ＩＬ−２／ＩＬ−４
／Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃＲγδ＋であった。この実験では
フローサイトメトリー分析は２２日目のみ行った。
や富化をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡
大増殖させから、その後２分して、一方は５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣ
ＢＭ−２の中で連続培養し、もう一方は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０
ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いず
れの場合にも、細胞は４週間で１０万倍を超えて拡大増殖した（図４）。しかし
、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類が異な
ることが判明した。即ち、ＸＬＣＭ／Ｐ中で連続培養した細胞のうちＴｃＲγδ ＋ は５％未満であったが、ＸＬＣＭ／Ｐ中で培養された後、ＩＬ−２／ＩＬ−４
／Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃＲγδ＋であった。この実験では
フローサイトメトリー分析は２２日目のみ行った。
【００６９】 これらの条件下でのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の拡大増殖の知見は全く予想外であっ
た。限定されたサイトカイン中での二次培養を行ったのは、培養細胞からＸＬＣ
Ｍを、より具体的には残存するメゼレインおよびコンカナバリンＡを除去するた
めであった。この技法はＸＬＣＭ中の連続培養で実現する水準と同等の拡大増殖
水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセットが選
択的に拡大増殖することが判明した。
た。限定されたサイトカイン中での二次培養を行ったのは、培養細胞からＸＬＣ
Ｍを、より具体的には残存するメゼレインおよびコンカナバリンＡを除去するた
めであった。この技法はＸＬＣＭ中の連続培養で実現する水準と同等の拡大増殖
水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセットが選
択的に拡大増殖することが判明した。
【００７０】 −利点− 実施例１および２に記載した方法と比較して、実施例４に記載した方法は開始
時細胞集団の初期分画または富化を必要とせず、したがって開始時の細胞数は極
めて少なくてもよい（例えば１×１０５）。その上、二次培養法は、ＸＬＣＭお
よびその成分、例えばコンカナバリンＡ、メゼレインおよび他の既知や未知の因
子を培養細胞から除去する。
時細胞集団の初期分画または富化を必要とせず、したがって開始時の細胞数は極
めて少なくてもよい（例えば１×１０５）。その上、二次培養法は、ＸＬＣＭお
よびその成分、例えばコンカナバリンＡ、メゼレインおよび他の既知や未知の因
子を培養細胞から除去する。
【００７１】 実施例５ ＬＤＭＮＣ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、分画や富化
をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１
０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡大増殖さ
せた後、２分し、一方を１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−
２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で連続培養し
、残りの半分は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５
％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は４
週間で１０万倍超拡大増殖した（図５）。しかし、フローサイトメトリーによる
分析で、条件が異なると生じる細胞の種類も異なることが判明した。即ち、コン
カナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で連続培養された細胞の５％未満が
ＴｃＲγδ＋であったが、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で培
養された後、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃ
Ｒγδ＋であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は２２日目だけ行っ
た。
ｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、分画や富化
をすることなく培養した。 ＬＤＭＮＣを、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１
０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡大増殖さ
せた後、２分し、一方を１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−
２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で連続培養し
、残りの半分は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５
％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は４
週間で１０万倍超拡大増殖した（図５）。しかし、フローサイトメトリーによる
分析で、条件が異なると生じる細胞の種類も異なることが判明した。即ち、コン
カナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で連続培養された細胞の５％未満が
ＴｃＲγδ＋であったが、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で培
養された後、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃ
Ｒγδ＋であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は２２日目だけ行っ
た。
【００７２】 これらの条件下でのＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の拡大増殖の知見は、実施例４に述べ
た理由により予想外であった。即ち、限定されたサイトカイン中での二次培養は
、培養細胞からＸＬＣＭを、より詳しくは残存するメゼレインおよびコンカナバ
リンＡを除去するために行ったのである。この方法は、ＸＬＣＭ中またはコンカ
ナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中での連続培養が達成する水準と同等の拡
大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセッ
トが選択的に拡大増殖されることが判明した。
た理由により予想外であった。即ち、限定されたサイトカイン中での二次培養は
、培養細胞からＸＬＣＭを、より詳しくは残存するメゼレインおよびコンカナバ
リンＡを除去するために行ったのである。この方法は、ＸＬＣＭ中またはコンカ
ナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中での連続培養が達成する水準と同等の拡
大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ＋Ｔ細胞サブセッ
トが選択的に拡大増殖されることが判明した。
【００７３】 −利点− 実施例４に記載した方法と同様に、ＬＤＭＮＣの初期分画や富化が不要で、細
胞が非常に効果的に拡大増殖するので、開始時の細胞数は極めて少なくてもよい
。その上、培養条件が完全に確定され、ＸＬＣＭは本法のいかなる段階でも使用
されず、かつ培養細胞はメゼレインに曝されない。
胞が非常に効果的に拡大増殖するので、開始時の細胞数は極めて少なくてもよい
。その上、培養条件が完全に確定され、ＸＬＣＭは本法のいかなる段階でも使用
されず、かつ培養細胞はメゼレインに曝されない。
【００７４】 実施例６ ＴｅＡＢｄ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒Ｔ
ｃＲγδ＋Ｔ細胞 ＬＤＭＮＣを、実施例１に記載のように成人末梢血から単離し、実施例２に記
載のようにＴｅＡＢｄを富化した。実施例５に記載のようにＴｅＡＢｄを拡大増
殖させた。即ち、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１
０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中でそれを培養し、そ
の後、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨ
ＣＢＭ−２の中で二次培養した。一方で、培養物のあまりを廃棄しながら少量の
培養物をサイトカインおよび血漿を加えた新鮮培地中に希釈することによって細
胞を継代する代わりに、全量の培養物を増殖させ、連続培養の量をふやしながら
全細胞を維持した。
ｃＲγδ＋Ｔ細胞 ＬＤＭＮＣを、実施例１に記載のように成人末梢血から単離し、実施例２に記
載のようにＴｅＡＢｄを富化した。実施例５に記載のようにＴｅＡＢｄを拡大増
殖させた。即ち、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１
０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中でそれを培養し、そ
の後、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨ
ＣＢＭ−２の中で二次培養した。一方で、培養物のあまりを廃棄しながら少量の
培養物をサイトカインおよび血漿を加えた新鮮培地中に希釈することによって細
胞を継代する代わりに、全量の培養物を増殖させ、連続培養の量をふやしながら
全細胞を維持した。
【００７５】 全血の開始時体積は５０ｍｌであった。開始時のＬＤＭＮＣ数は３．６×１０ ７ であった。ＴｅＡＢｄの収量は１×１０５であった。ＴｅＡＢｄをコンカナバ
リンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で計１２日間培養した結果、その時点まで
に１．４ｍｌの全体積中に合計３×１０６の細胞数に増殖した。この時点で培養
細胞を遠心分離によってペレット化し、ＨＣＢＭ−２で１回洗浄した。洗浄細胞
を全量３０ｍｌの培地に１×１０５細胞／ｍｌとなるよう接種し、１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを添加した。この培養では同種臍
帯血漿ではなく、自家血漿を使用した。１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で更に９日間、細胞をさらに増
殖させた。全培養期間は２１日であった。この時点で、細胞は３００ｍｌの全体
積中に合計４．５×１０８にまで増殖した（図６ａ）。
リンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で計１２日間培養した結果、その時点まで
に１．４ｍｌの全体積中に合計３×１０６の細胞数に増殖した。この時点で培養
細胞を遠心分離によってペレット化し、ＨＣＢＭ−２で１回洗浄した。洗浄細胞
を全量３０ｍｌの培地に１×１０５細胞／ｍｌとなるよう接種し、１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを添加した。この培養では同種臍
帯血漿ではなく、自家血漿を使用した。１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で更に９日間、細胞をさらに増
殖させた。全培養期間は２１日であった。この時点で、細胞は３００ｍｌの全体
積中に合計４．５×１０８にまで増殖した（図６ａ）。
【００７６】 フローサイトメトリーによる分析の結果、培養２１日の細胞の８５％超がＴｃ
Ｒγδ＋であり、かつこれらの大部分（＞７０％）がＶδ１＋である一方、小さ
いが有意の割合（約１０％）がＶδ２＋であった。その上、細胞の約１０％がＣ
Ｄ５６を発現したが、３％未満しかＣＤ１６を発現せず、この方法がナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞の有意な拡大増殖を生じないことを示した。
Ｒγδ＋であり、かつこれらの大部分（＞７０％）がＶδ１＋である一方、小さ
いが有意の割合（約１０％）がＶδ２＋であった。その上、細胞の約１０％がＣ
Ｄ５６を発現したが、３％未満しかＣＤ１６を発現せず、この方法がナチュラル
キラー（ＮＫ）細胞の有意な拡大増殖を生じないことを示した。
【００７７】 拡大増殖ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、カルセイン放出試験を用いて
示された。標的細胞を蛍光基質カルセインＡＭで標識し、ＴｃＲγδ＋エフェク
ター細胞と共に様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。
標的細胞の溶解を、カルセインの上清液中への放出を測定することによって検定
した。エフェクターによる標的の特異的殺細胞率（パーセント）を、次式による
相対蛍光単位（ｒｆｕ）から計算した（式中「実験的ｒｆｕ」とは、エフェクタ
ー細胞と共にインキュベートした標的細胞から放出されるカルセインによる蛍光
測定量であり、「最大ｒｆｕ」とは、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で溶解
される同数の標的細胞から得られる蛍光であり、「自発的ｒｆｕ」とは、エフェ
クター細胞や洗剤のない状態でインキュベートした同数の標的細胞から得られる
蛍光である）。即ち、 特異的溶解パーセント＝（実験的ｒｆｕ−自発的ｒｆｕ）／（最大ｒｆｕ−
自発的ｒｆｕ）×１００
示された。標的細胞を蛍光基質カルセインＡＭで標識し、ＴｃＲγδ＋エフェク
ター細胞と共に様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。
標的細胞の溶解を、カルセインの上清液中への放出を測定することによって検定
した。エフェクターによる標的の特異的殺細胞率（パーセント）を、次式による
相対蛍光単位（ｒｆｕ）から計算した（式中「実験的ｒｆｕ」とは、エフェクタ
ー細胞と共にインキュベートした標的細胞から放出されるカルセインによる蛍光
測定量であり、「最大ｒｆｕ」とは、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で溶解
される同数の標的細胞から得られる蛍光であり、「自発的ｒｆｕ」とは、エフェ
クター細胞や洗剤のない状態でインキュベートした同数の標的細胞から得られる
蛍光である）。即ち、 特異的溶解パーセント＝（実験的ｒｆｕ−自発的ｒｆｕ）／（最大ｒｆｕ−
自発的ｒｆｕ）×１００
【００７８】 Ｐ８１５は、表面にＩｇＧのＦｃ領域に対する受容体を有する、マウスの肥満
細胞腫細胞系である。Ｐ８１５標的をＯＫＴ３（抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗
体）で被覆することによって、標的細胞のエフェクターＴ細胞への結合が、Ｔ細
胞特異性に関係なく、ＣＤ３発現によって実現される。したがって、ＯＫＴ３被
覆Ｐ８１５標的細胞の死滅は、特異性とは独立のエフェクター細胞の細胞溶解能
を示す。ＥＭ−２およびＫ５６２はＣＭＬ由来の細胞系であるが、Ｄａｕｄｉは
Ｂ細胞系でＪｕｒｋａｔはＴ細胞系である。これらの全ての標的細胞は、殺され
るには、エフェクター細胞によって認識される必要がある。図６ｂ〜ｆは、実施
例６の方法によって拡大増殖したＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が細胞溶解能を有し、その
上ＣＭＬ由来および非ＣＭＬ由来双方の標的細胞を認識し、死滅させることがで
きたことを示す。
細胞腫細胞系である。Ｐ８１５標的をＯＫＴ３（抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗
体）で被覆することによって、標的細胞のエフェクターＴ細胞への結合が、Ｔ細
胞特異性に関係なく、ＣＤ３発現によって実現される。したがって、ＯＫＴ３被
覆Ｐ８１５標的細胞の死滅は、特異性とは独立のエフェクター細胞の細胞溶解能
を示す。ＥＭ−２およびＫ５６２はＣＭＬ由来の細胞系であるが、Ｄａｕｄｉは
Ｂ細胞系でＪｕｒｋａｔはＴ細胞系である。これらの全ての標的細胞は、殺され
るには、エフェクター細胞によって認識される必要がある。図６ｂ〜ｆは、実施
例６の方法によって拡大増殖したＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が細胞溶解能を有し、その
上ＣＭＬ由来および非ＣＭＬ由来双方の標的細胞を認識し、死滅させることがで
きたことを示す。
【００７９】 ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の一部を液体窒素中、１０％自家Ｐおよび１０％ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＨＣＢＭ−２中２×１０７細胞／ｍｌの濃
度で凍結保存した。融解後、凍結細胞の約７１％が生存したまま回収され、融解
細胞の全生存率は９０％であった。融解細胞の約７０％はＴｃＲγδ＋であり、
その＞７０％はＶδ１＋であった。エフェクターとして融解細胞を用いたカルセ
イン放出試験は、融解細胞が凍結保存および融解の後で細胞溶解活性を保持して
いるが、その活性は試験された標的細胞の一部に対してある程度減少することを
示した（図６ｇ〜ｋ）。これらの結果は、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を後日使用するた
めに凍結保存することができることを示す。
スルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＨＣＢＭ−２中２×１０７細胞／ｍｌの濃
度で凍結保存した。融解後、凍結細胞の約７１％が生存したまま回収され、融解
細胞の全生存率は９０％であった。融解細胞の約７０％はＴｃＲγδ＋であり、
その＞７０％はＶδ１＋であった。エフェクターとして融解細胞を用いたカルセ
イン放出試験は、融解細胞が凍結保存および融解の後で細胞溶解活性を保持して
いるが、その活性は試験された標的細胞の一部に対してある程度減少することを
示した（図６ｇ〜ｋ）。これらの結果は、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を後日使用するた
めに凍結保存することができることを示す。
【００８０】 実施例７ ＴｅＡＢｄ３３ｄ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／
Ｐ⇒ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを慢性骨髄性白血病患者の末梢血から
単離し、実施例２に記載したように、ＴｅＡＢｄを富化した。全血の開始時体積
は４３ｍｌであった。ＬＤＭＮＣの開始時細胞数は８．６×１０７であり、Ｔｅ
ＡＢｄの収量は２．５×１０７であって、開始時ＬＤＭＮＣの２９％であった。
この収量は、健常成人末梢血ＬＤＭＮＣから得られる収量（ｎ＝３、平均ＬＤＭ
ＮＣ＝５．２×１０７、平均ＴｅＡＢｄ＝３．４×１０５＝＜１％）に比較して
極めて高かった。ＣＭＬ患者由来ＴｅＡＢｄのフローサイトメトリーによるその
後の分析から、ＣＤ３３＋骨髄前駆細胞の主要な非Ｔ細胞集団がＣＭＬ−ＴｅＡ
Ｂｄの約７８％を占めることが明らかとなった。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を得るため
の培養の前にこの細胞サブセットを除去するために、ＣＭＬ患者細胞を用いる以
後の実験では、抗ＣＤ３３抗体をＴｅＡＢｄカクテルに添加した。できた抗体カ
クテルであるＴｅＡＢｄ３３ｄは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、
ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対して特異的な抗体を含んでいる。
Ｐ⇒ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞 実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを慢性骨髄性白血病患者の末梢血から
単離し、実施例２に記載したように、ＴｅＡＢｄを富化した。全血の開始時体積
は４３ｍｌであった。ＬＤＭＮＣの開始時細胞数は８．６×１０７であり、Ｔｅ
ＡＢｄの収量は２．５×１０７であって、開始時ＬＤＭＮＣの２９％であった。
この収量は、健常成人末梢血ＬＤＭＮＣから得られる収量（ｎ＝３、平均ＬＤＭ
ＮＣ＝５．２×１０７、平均ＴｅＡＢｄ＝３．４×１０５＝＜１％）に比較して
極めて高かった。ＣＭＬ患者由来ＴｅＡＢｄのフローサイトメトリーによるその
後の分析から、ＣＤ３３＋骨髄前駆細胞の主要な非Ｔ細胞集団がＣＭＬ−ＴｅＡ
Ｂｄの約７８％を占めることが明らかとなった。ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を得るため
の培養の前にこの細胞サブセットを除去するために、ＣＭＬ患者細胞を用いる以
後の実験では、抗ＣＤ３３抗体をＴｅＡＢｄカクテルに添加した。できた抗体カ
クテルであるＴｅＡＢｄ３３ｄは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、
ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対して特異的な抗体を含んでいる。
【００８１】 次の実験で、実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを（別の）ＣＭＬ患者の
末梢血から単離し、前記の改良抗体カクテルを用いて、実施例２に記載したよう
にＴｅＡＢｄ３３ｄを富化した。全血の開始時体積は４０ｍｌであった。ＬＤＭ
ＮＣの開始時細胞数は８．６５×１０７であり、ＴｅＡＢｄ３３ｄの収量は１．
３×１０６（１．５％）であった。実施例６に記載したようにＴｅＡＢｄ３３ｄ
を拡大増殖させた。すなわち１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩ
Ｌ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中に、その
細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で接種した。その細胞を全体積５ｍｌ中、１
４日間にわたりコンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの存在下で増殖させ
、その時点で細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄した後、１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二
次培養した。次の１３日間（全培養期間は２７日であった）で細胞は全部で１６
００ｍｌの培養体積まで殖え、その時点で細胞収量は１．２×１０９であった。
細胞は尚も増殖中であったが、細胞を収穫し、この時点で使用した。増殖速度の
グラフを図７ａに示す。
末梢血から単離し、前記の改良抗体カクテルを用いて、実施例２に記載したよう
にＴｅＡＢｄ３３ｄを富化した。全血の開始時体積は４０ｍｌであった。ＬＤＭ
ＮＣの開始時細胞数は８．６５×１０７であり、ＴｅＡＢｄ３３ｄの収量は１．
３×１０６（１．５％）であった。実施例６に記載したようにＴｅＡＢｄ３３ｄ
を拡大増殖させた。すなわち１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩ
Ｌ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中に、その
細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度で接種した。その細胞を全体積５ｍｌ中、１
４日間にわたりコンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの存在下で増殖させ
、その時点で細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄した後、１０ｎｇ／ｍ
ｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二
次培養した。次の１３日間（全培養期間は２７日であった）で細胞は全部で１６
００ｍｌの培養体積まで殖え、その時点で細胞収量は１．２×１０９であった。
細胞は尚も増殖中であったが、細胞を収穫し、この時点で使用した。増殖速度の
グラフを図７ａに示す。
【００８２】 フローサイトメトリーによる分析の結果、細胞の７２％がＴｃＲγδ＋であり
、かつこれらの大部分（＞６０％）がＶδ１＋であって、一方３３％がＶδ２＋ であった。やはり、３％未満の細胞しかＣＤ１６を発現せず、ＮＫ細胞はこの培
養中拡大増殖しなかった。
、かつこれらの大部分（＞６０％）がＶδ１＋であって、一方３３％がＶδ２＋ であった。やはり、３％未満の細胞しかＣＤ１６を発現せず、ＮＫ細胞はこの培
養中拡大増殖しなかった。
【００８３】 標準的なＧバンド法を用いた細胞遺伝学的分析によれば、拡大増殖細胞は非白
血病性で、クローンの細胞遺伝学的異常は、ＣＭＬの特徴であるフィラデルフィ
ア染色体を含めて検出されなかった。ＩＬ−２およびＩＬ−４のない状態でＨＣ
ＢＭ−２＋５％Ｐの中で細胞を引き続き培養すると、細胞死が起こり、細胞拡大
増殖がサイトカイン依存性であって、かつ培養細胞は培養工程によってトランス
フォームされていないことを示した。
血病性で、クローンの細胞遺伝学的異常は、ＣＭＬの特徴であるフィラデルフィ
ア染色体を含めて検出されなかった。ＩＬ−２およびＩＬ−４のない状態でＨＣ
ＢＭ−２＋５％Ｐの中で細胞を引き続き培養すると、細胞死が起こり、細胞拡大
増殖がサイトカイン依存性であって、かつ培養細胞は培養工程によってトランス
フォームされていないことを示した。
【００８４】 拡大増殖した細胞の表面にコンカナバリンＡが結合しているかどうかを調べた
。その細胞をウサギ抗コンカナバリンＡ ＩｇＧ抗体（ＲａＣｏｎＡ）または等
価量の健常ウサギＩｇＧで処理した。その後に細胞を洗浄し、ＦＩＴＣヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
陽性対照として、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ（Ｋ）の中で新鮮
培養をしたＬＤＭＮＣを同様に染色した。ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体で染色
された陽性対照細胞（Ｋ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同一細胞を健常ウサギ
ＩｇＧで染色したときに得られるＭＦＩよりずっと大きく（表１）、細胞表面上
にコンカナバリンＡがあることを示した。それとは対照的に、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞のＭＦＩは、ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体および健常ウサギＩｇＧのどちら
に対しても同じようであった。これらのデータは、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中
（コンカナバリンＡの不在下）で細胞の二次培養することにより、恐らくインタ
ーナリゼーションや異化によるか、または細胞表面から剥げ落ちることによって
、検出し得るコンカナバリンＡは培養細胞から消えたことを示している。
。その細胞をウサギ抗コンカナバリンＡ ＩｇＧ抗体（ＲａＣｏｎＡ）または等
価量の健常ウサギＩｇＧで処理した。その後に細胞を洗浄し、ＦＩＴＣヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
陽性対照として、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ（Ｋ）の中で新鮮
培養をしたＬＤＭＮＣを同様に染色した。ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体で染色
された陽性対照細胞（Ｋ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同一細胞を健常ウサギ
ＩｇＧで染色したときに得られるＭＦＩよりずっと大きく（表１）、細胞表面上
にコンカナバリンＡがあることを示した。それとは対照的に、ＴｃＲγδ＋Ｔ細
胞のＭＦＩは、ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体および健常ウサギＩｇＧのどちら
に対しても同じようであった。これらのデータは、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中
（コンカナバリンＡの不在下）で細胞の二次培養することにより、恐らくインタ
ーナリゼーションや異化によるか、または細胞表面から剥げ落ちることによって
、検出し得るコンカナバリンＡは培養細胞から消えたことを示している。
【００８５】 ＣＭＬ患者由来のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、実施例６に記述した
カルセイン放出試験を用いて確認された（図７ｃ〜ｇ）。 ＣＭＬ患者由来のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、１０％自家Ｐおよび１０％ＤＭＳＯ
を含有するＨＣＢＭ−２中、４．４×１０７細胞／ｍｌの濃度で液体窒素の中に
凍結保存された。凍結融解後の生存細胞の回収率は７６％で、凍結融解細胞の全
生存率は８４％であった。細胞傷害活性は保持されたが、やや減少した（図７ｈ
〜ｌ）。
カルセイン放出試験を用いて確認された（図７ｃ〜ｇ）。 ＣＭＬ患者由来のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞は、１０％自家Ｐおよび１０％ＤＭＳＯ
を含有するＨＣＢＭ−２中、４．４×１０７細胞／ｍｌの濃度で液体窒素の中に
凍結保存された。凍結融解後の生存細胞の回収率は７６％で、凍結融解細胞の全
生存率は８４％であった。細胞傷害活性は保持されたが、やや減少した（図７ｈ
〜ｌ）。
【００８６】 これらの結果は、治療上有用な数の機能的に細胞傷害性のＴｃＲγδ＋Ｔ細胞
を、ＣＭＬ患者から採取した比較的少量の末梢血試料から、ｅｘ ｖｉｖｏで拡
大増殖することができることを実証している。その上、これらの細胞は非白血病
性でかつトランスフォームしておらず、表面に検出し得るコンカナバリンＡがな
く、後日使用するために凍結保存も可能である。
を、ＣＭＬ患者から採取した比較的少量の末梢血試料から、ｅｘ ｖｉｖｏで拡
大増殖することができることを実証している。その上、これらの細胞は非白血病
性でかつトランスフォームしておらず、表面に検出し得るコンカナバリンＡがな
く、後日使用するために凍結保存も可能である。
【００８７】 好ましいと現在考えられている実施例を参照しながら本発明を記述したが、本
発明は開示された実施例に限定されるものではないと理解されたい。それどころ
か、本発明は、付随する請求項の精神および範囲の中に含まれる様々な改変およ
び同等のとり合せを包含することを意図されている。 全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が
参考として完全な形で挿入されるように特異に、かつ個別に指示された場合と同
程度に、参考として完全な形で本明細書に挿入されている。
発明は開示された実施例に限定されるものではないと理解されたい。それどころ
か、本発明は、付随する請求項の精神および範囲の中に含まれる様々な改変およ
び同等のとり合せを包含することを意図されている。 全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が
参考として完全な形で挿入されるように特異に、かつ個別に指示された場合と同
程度に、参考として完全な形で本明細書に挿入されている。
【表１】 ＊ １以下の比は、ウサギ抗ｃｏｎＡ抗体（ＲａＣｏｎＡ）による染色が、健常
ウサギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）によるバックグランド染色より少ないことを示す。
これらの結果は、培養されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の表面上で、ｃｏｎＡを検出す
ることができないことを示す。
ウサギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）によるバックグランド染色より少ないことを示す。
これらの結果は、培養されたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の表面上で、ｃｏｎＡを検出す
ることができないことを示す。
【図１】 図１はＸＬＣＭ／ＰによるＣＤ４富化細胞の培養中の様々な時間における全細
胞収量およびＴｃＲγδ＋とＶδ１＋のＴ細胞のパーセンテージを示す図である
。
胞収量およびＴｃＲγδ＋とＶδ１＋のＴ細胞のパーセンテージを示す図である
。
【図２】 図２はＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去を行った細胞をＸＬＣＭ／Ｐとともに
培養中の様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ＋とＶδ１＋のＴ細胞
のパーセンテージを示す図である。
培養中の様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ＋とＶδ１＋のＴ細胞
のパーセンテージを示す図である。
【図３】 図３はＸＬＣＭによるＬＤＭＮＣの培養と、その後のＸＬＣＭ／Ｐ、ＩＬ−２
／ＩＬ−４／Ｐ、ＩＬ−２／Ｐ、ＩＬ−４／ＰまたはＰ単独による二次培養中の
様々な時間における全細胞収量を示す図である。
／ＩＬ−４／Ｐ、ＩＬ−２／Ｐ、ＩＬ−４／ＰまたはＰ単独による二次培養中の
様々な時間における全細胞収量を示す図である。
【図４】 図４はＸＬＣＭ／ＰによるＬＤＭＮＣの培養中、またはＸＬＣＭ／ＰによるＬ
ＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な
時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図で
ある。
ＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な
時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図で
ある。
【図５】 図５はｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰによるＬＤＭＮＣの培養中、または
ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰによるＬＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２
／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびＴｃ
Ｒγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰによるＬＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２
／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびＴｃ
Ｒγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図６】 図６ａはＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去を行った細胞の、ｃｏｎＡ／ＩＬ−
２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培
養中の経時的な全生細胞数を示す図である。 図６ｂ−６ｆは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ＋エフェクターに
よる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。 図６ｇ−６ｋはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比での
ＴｃＲγδ＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図
である。
２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培
養中の経時的な全生細胞数を示す図である。 図６ｂ−６ｆは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ＋エフェクターに
よる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。 図６ｇ−６ｋはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比での
ＴｃＲγδ＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図
である。
【図７】 図７ａはＣＭＬ患者由来のＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去／ＣＤ３３細胞除
去を行った細胞の、ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後の
ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である
。 図７ｂはサイトカイン除去後の経時的な生存パーセントを示す。 図７ｃ−７ｇは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ＋エフェクターに
よる様々な標的の死滅パーセンテージを示す図である。 図７ｈ−７ｌはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比での
ＴｃＲγδ＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図
である。
去を行った細胞の、ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後の
ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である
。 図７ｂはサイトカイン除去後の経時的な生存パーセントを示す。 図７ｃ−７ｇは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ＋エフェクターに
よる様々な標的の死滅パーセンテージを示す図である。 図７ｈ−７ｌはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比での
ＴｃＲγδ＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/36 Ａ６１Ｋ 35/407 35/407 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 35/00 35/02 35/02 37/02 37/02 43/00 43/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スケア，ダナ，リン カナダ．エル５エム ５ダブリュ９ オン タリオ，ミシシューガ，グレン エリン ドライヴ 5940，ユニット ナンバー20エ ー (72)発明者 ヘッジ，フィリス，ロビン カナダ．エヌ３シー ２ヴィ４ オンタリ オ，ケンブリッジ，ウェリングトン カン トリー ロード 34 6806，アールアール ナンバー22 Ｆターム(参考） 4B065 AA94X BB19 BB25 BC13 BD15 CA44 4C087 AA01 AA02 AA03 BB34 BB42 BB43 BB44 BB48 BB52 BB63 BB64 ZB07 ZB26 ZB27 ZB31 ZC80
Claims (50)
- 【請求項１】 （１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカ
インを含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および （２）少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、上記（１）で得
られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞を増殖させること を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδＴ細胞を増殖させる方法。 - 【請求項２】 第１の培地が（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロ
イキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含み、第２の培地が（ｉ）イン
ターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 第１の培地が白血球馴らし培地を含み、第２の培地が（ｉ）
インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む請求項１に記
載の方法。 - 【請求項４】 白血球馴らし培地がＸＬＣＭである請求項３に記載の方法。
- 【請求項５】 第１および第２の培地が血清または血漿を含有する請求項１
から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞をＴ細胞について
富化する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞をＣＤ４＋細胞に
ついて富化する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項８】 ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞からＣＤ１４＋、
ＣＤ１６＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ５６＋およびグリコホリンＡ＋細胞を除去する請
求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞からＴｃＲαβ＋ Ｔ細胞を除去する請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 【請求項１０】ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞から非ＴｃＲγδ
Ｔ細胞を除去する請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 出発試料が末梢血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓
、ひ臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織またはそれらの分画物から選択される
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 出発試料がヒト末梢血またはその分画物である請求項１１
に記載の方法。 - 【請求項１３】 出発試料が低密度単核細胞である請求項１から１２のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが約０．０１から約１
００μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの
量で存在し、ＩＬ−４が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求
項２から１３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１５】 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが約０．１から約５０
μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し
、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項２から１３のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１６】 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが約０．５から約１０
μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、
ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項２から１３のいずれ
か一項に記載の方法。 - 【請求項１７】 第１の培地がＴ細胞マイトジェンを１μｇ／ｍｌ、ＩＬ−
２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を１０ｎｇ／ｍｌ含む請求項１から１６のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１８】 Ｔ細胞マイトジェンがコンカナバリンＡである請求項１４
から１７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】 血清または血漿が約１から約２５体積％の量で存在する請
求項５に記載の方法。 - 【請求項２０】 血清または血漿が約２から約２０体積％の量で存在する請
求項５に記載の方法。 - 【請求項２１】 血清または血漿が約２．５から約１０体積％の量で存在す
る請求項５に記載の方法。 - 【請求項２２】 血清または血漿が約５体積％の量で存在する請求項５に記
載の方法。 - 【請求項２３】 第２の培地中にＩＬ−２が約０．１から約１０００ｎｇ／
ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在す
る請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２４】 第２の培地中にＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの
量で存在し、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項２か
ら２２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２５】 第２の培地中にＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量
で存在し、ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項２から２
２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２６】 第２の培地がＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を
１０ｎｇ／ｍｌ含む請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２７】 ＸＬＣＭが約１から約２５％の量で存在する請求項４に記
載の方法。 - 【請求項２８】 ＸＬＣＭが約２から約２０％の量で存在する請求項４に記
載の方法。 - 【請求項２９】 ＸＬＣＭが約２．５から約１０％の量で存在する請求項４
に記載の方法。 - 【請求項３０】 ＸＬＣＭが約５％の量で存在する請求項４に記載の方法。
- 【請求項３１】 慢性骨髄性白血病患者から採取した試料からＴｃＲγδＴ ＋ 細胞を得る方法であって、 （１）試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得ることと、 （２）ステップ（１）で得られた細胞からＣＤ３３＋細胞を除去することと、 （３）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）
インターロイキン−４を含む第１の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を
培養することと、 （４）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含
む第２の培地中で、ステップ（３）で得られた細胞を培養することにより、Ｔｃ
ＲγδＴ＋細胞を増殖させること を含む方法。 - 【請求項３２】 ステップ（２）がその細胞から更にＣＤ１４＋、ＣＤ１６ ＋ 、ＣＤ１９＋、ＣＤ５６＋およびグリコホスホリンＡ＋の各細胞を除去するこ
とを含む請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 ステップ（２）がその細胞から更にＴｃＲαβ＋Ｔ細胞を
除去することを含む請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３４】 請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法に従って調
製された、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製品。 - 【請求項３５】 全細胞の７０％を超える細胞がＴｃＲγδＴ＋細胞である
、ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製品。 - 【請求項３６】 全細胞の８０％を超える細胞がＴｃＲγδ＋Ｔ細胞である
請求項３４または３５に記載の細胞調製品。 - 【請求項３７】 全細胞の９０％を超える細胞がＴｃＲγδ＋Ｔ細胞である
請求項３４、３５または３６に記載の細胞調製品。 - 【請求項３８】 Ｖδ１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞およびＶδ２＋ＴｃＲγδ ＋ Ｔ細胞を含む請求項３４から３７のいずれか一項に記載の細胞調製品。
- 【請求項３９】 調製品中の全ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の約５０〜９０％がＶδ
１＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞で約１０〜５０％がＶδ２＋ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞であ
る請求項３８に記載の細胞調製品。 - 【請求項４０】 調製品中の全ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の約７０％がＶδ１＋
ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞で約３０％がＶδ２＋ ＴｃＲγδ＋Ｔ細胞である請求項３
８に記載の細胞調製品。 - 【請求項４１】 Ｔ細胞マイトジェンを実質的に含まない請求項３４から４
０のいずれか一項に記載の細胞調製品。 - 【請求項４２】 免疫反応を調節する医薬品を調製するための、請求項３４
から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品の使用。 - 【請求項４３】 感染症を治療する医薬品を調製するための、請求項３４か
ら４１のいずれか一項に記載の細胞調製品の使用。 - 【請求項４４】 癌を治療する医薬品を調製するための、請求項３４から４
１のいずれか一項に記載の細胞調製品の使用。 - 【請求項４５】 慢性骨髄性白血病を治療する医薬品を調製するための、請
求項３４から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品の使用。 - 【請求項４６】 ワクチンを調製するための、請求項３４から４１のいずれ
か一項に記載の細胞調製品の使用。 - 【請求項４７】 請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法に従って得
られたか、または請求項３４から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品から得
られたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを
含む免疫反応を調節する方法。 - 【請求項４８】 請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法に従って得
られたか、または請求項３４から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品から得
られたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを
含む感染症を治療する方法。 - 【請求項４９】 請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法に従って得
られたか、または請求項３４から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品から得
られたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを
含む癌を治療する方法。 - 【請求項５０】 請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法に従って得
られたか、または請求項３４から４１のいずれか一項に記載の細胞調製品から得
られたＴｃＲγδ＋Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする動物に投与することを
含む慢性骨髄性白血病を治療する方法。
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