JP2002528140A

JP2002528140A - ヒトｐａｎ−ｈｃｖヒトモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2002528140A
Application number: JP2000579790A
Authority: JP
Inventors: ケイ．エイチ．ファウングスティーブン; ジー．ハドロックケニス
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブリーランドスタンフォードジュニアユニバーシティ
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2002-09-03
Also published as: AU1462300A; EP1127170A1; US6692908B1; WO2000026418A1; EP1127170A4

Abstract

(57)【要約】型１及び２のＨＣＶに共通のエピトープに結合するヒトモノクローナル抗体、および配座を保存したＨＣＶＥ２の２ａ、２ｂ蛋白質が提供される。これらの抗体を含む組成物は診断および治療に使用できる。これらの抗体は複数のＨＣＶに共通に保存されている配座エピトープを認識する。そのためこれらの抗体は大多数のＨＣＶ感染の予防と治療に使用できる能力を有する。抗体のサブセット（ＣＢＨ２，ＣＢＨ５，ＣＢＨ７，ＣＢＨ８Ｃ，ＣＢＨ８Ｅ及びＣＢＨ１１）は複数の遺伝子型を有するＨＣＶＥ２蛋白質のヒトＣＤ８１への結合を抑制する能力を有し、ＨＣＶ感染に対する可能なコアレセプタである。サブセット（ＣＢＨ２及びＣＢＨ５）は（精製Ｅ２蛋白質とは対照的に）ＨＣＶビビロンのヒトＣＤ８１への結合を抑制する。他の抗体サブセット（ＣＢＨ４Ｄ，ＣＢＨ４Ｂ，ＣＢＨ８Ｃ，及びＣＢＨ９）はＨＣＶ擬似型を使用するＨＣＶエンベロープ媒介融合を阻止する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の分野は、診断及び治療用の高比率の患者に見出されるＨＣＶの構造的
に変換された抗原決定基へのヒトモノクローナル抗体（ＨＭａｂ）の調製に関す
る。

【０００２】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、９．５ｋｂの正鎖ＲＮＡゲノムにコードされ
た遺伝情報を内包するウイルスである。３４１ｂｐの高度に保存された非コード
領域は、ウイルスゲノムの５’末端に局在する。この後に、約３，０１０アミノ
酸のポリプロテインのための長いオープンリーディングフレームが続く。２つの
推定上のエンベロープグリコプロテインＥ１（ｇｐ３５）及びＥ２（ｇｐ７２）
は、各々５若しくは６及び１１Ｎ−結合グリコシレーション部位と同定されてい
る。高レベルの遺伝子の変異性が、エンベロープ遺伝子と関係している。これは
、Ｅ２遺伝子の５’末端で非常に強められる。ここで、ＨＶＲ１及びＨＶＲ２の
２つの高度可変領域を示した。ＨＶＲ１に対する抗体は細胞培地及びチンパンジ
ー保護研究におけるウイルスの中和を媒介するようである（Farciら、１９９６
年,proc Natl Acad Sci USA. 93:15394〜15399;清水ら、１９９４年Ｊ Virol.
68:1494〜1500）。不幸にして、ＨＶＲ１に対する抗体は、株を分離すると現存
する免疫応答が認識しない新しいウイルスの変種の複製を次第に行う傾向にある
（Farciら、１９９４年,proc Natl Acad Sci USA. 91:7792〜7796;Weinerら、１
９９２年,proc Natl Acad Sci USA. 89:3468〜3472;加藤ら１９９３年Ｊ Virol.
67:3923〜3930）しかし、ＨＶＲ１関連配列に対するより広い免疫応答における
進歩がなされた(Puntorieroら、１９９８年ＥＭＢＯＪｏｕｎａｌ１７：
３５３１〜３５３３)。ＨＣＶエンベロープ抗原は、グリコシル化した形態で表
現される場合に高度に免疫原性を有するようである（da Silva Cardosoら、１９
９７年 Ann. Hematolら７４：１３５〜７）。予備的なデータは、Ｅ２蛋白質
内の保存される抗原決定基の存在を示唆する。感染した患者からの血清中の抗体
を中和するものの存在が提案されていた。

【０００３】哺乳動物の細胞中で表現されるＨＣＶＥ１−Ｅ２蛋白質を用いる研究により
、感染した個体が現実にコンフォメーショナル(conformational)な抗原決定基に
含まれるＨＣＶＥ２に応答する抗体を有することが示された（原田ら、１９９
４年ＪＧｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１２２３〜１２３１）。ヒトモノクロー
ナルの分離又はＨＣＶＥ２との再結合を含む研究が、これらの抗体の実質的な
画分がコンフォメーショナル(comformational)な抗原決定基を認識することを示
した(da Silva Cardosoら、１９９８年Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８：８１０〜８
１４；Habersetzerら、（１９９８年)Virology 249:32〜４１）。これらのドメ
インの生物学的機能について、ウイルスはインビートロで性徴することができな
いので、研究者は代用的検定を用いてウイルスの中和を洞察している（Ｈｏｕｇ
ｔｏｎ．ＨｅｐａｔｉｔｉｅｓＣｖｉｒｕｓｓＩｎＦｉｅｌｄｓＢＮ
、ＫｎｉｐｅＤＭ，ＨｏｗｌｅｙＰＭ（ｅｄｓ））Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉ
ｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１０３５〜１０５
８頁。）。代用検定、結合中和（ＮＯＢ）検定は、ヒトＴ細胞ラインとＨＣＶ
Ｅ２の結合を妨げる所定の抗体又は血清の能力を評価する（Ｒｏｓａら、１９９
６年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９３：１７５９〜１７
６３）。接種により保護されたチンパンジーから得られた血清抗体は、ＮＯＢ検
定で強い陽性であったという知見は、ウイルス中和能の測定として検定の信頼を
支持するものである。（Ｒｏｓａら、上記；Ｉｓｈｉｉら、１９９８年Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ２８：１１１７〜１１２０）。

【０００４】ヒトテトラスパンニン(tetraspannin)細胞表面蛋白質ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１
，Ｌｅｖｙら、１９９８年ＡｎｎＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：８９〜１０
９）は、ＮＯＢ検定でＨＣＶＥ２により結合される標的蛋白質である。ＨＣＶ
１ａＥ２蛋白質を用いて、いくつかのヒトモノクローナル抗体が、ＨＣＶ
Ｅ２のヒト細胞との相互作用を阻害することが報告されている（Ｂｕｒｉｏｒｉ
ら、１９９８年Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８：８１０〜８１４；Ｈａｂｅｒｓｅｔ
ｚｅｒら、１９９８Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４９：３２〜４１）。しかしながら、異
なった遺伝型のＨＣＶＥ２中のＮＯＢ陽性抗体により認識される抗原決定基の
保存についてはほとんど知られていない。

【０００５】ＨＣＶの検出及びＨＣＶに対する保護は、ペプチドを模倣物の開発を含む。例
として、検出検定及びワクチン治療に用いるためにランダムに生成した合成かつ
ファージ表示ペプチドライブラリのために用いるＡ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎
ウイルス蛋白質の模倣物を作り出してきた（Ｍｔｔｉｏｌｉら、１９９５年Ｊ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６９：５２９４〜５２９９及びＰｒｅｚｚｉら、１９９６年Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５０４〜４５１３）。しかしながら、これらのミ
モトープ効果的な抗体結合は、線形のウイルス抗原決定基と唯一比較されてきた
。いくつかの線形の免疫支配的なＨＣＶ抗原決定基の配列組換融合が、診断検定
に用いるために記載されてきた（Ｃｈｅｉｎら、１９９９年ＪＣｌｉｎＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１３９３〜１３９７）。しかしながら、線形抗原決定基
から設計されるこの複合的抗原決定基は、コンフォーメーショナルな模倣物と同
一の能力で機能するためには作られなかった：標的受容体に結合することを阻止
するように設計されなかった。

【０００６】それゆえ、抗体をヒト細胞を起源とし、抗体が特に地理的領域において遺伝子
型の広いスペクトラムの中和を提供する場合にから診断及び消極的な免疫的治療
に用いることができる感染患者からの血清中の抗体を中和することを同定するこ
とに実質的な興味がある。複合型ＨＣＶ遺伝子型に対する反応性の幅及びＨＣＶ
ビリオンの感染しやすい細胞に対する結合を阻害することの両方が、治療的に有
用な中和抗体に寄与する鍵となるであろう。ＨＣＶ蛋白質のエンベロープのペプ
チド及び非ペプチド（無機質）構造の設計も興味深い。

【０００７】公知文献ＨＣＶに関連した背景情報を提供する文献は、Ａｂｒｉｇｎａｎｉ１９９７
ＳｐｒｉｎｇｅｒＳｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ１９：４７
〜５５；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，１９９５Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２１：５７０〜
５８３；及びＭａｈａｎｅｙら、１９９４Ｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｙ２０：１
４０５〜１４１１．を含む。

【０００８】ｄａＳｉｌｖａＣａｒｄｏｓａらの１９９８Ｊ．ｏｆＭｅｄ．Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ５５：２８〜３４は、ヒトモノクローナル抗体をＨＣＶＥ１／Ｅ２
を記載している。Ｈａｂｅｒｓｅｔｚｅｒらの、１９９８年Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２
４９：３２〜４１は、ＨＣＶＥ２遺伝子型１ａ及び１ｂを認識するヒトモノク
ローナル抗体を記載している。Ｂｕｒｉｏｎｉらの１９９８年にＨＣＶＥ２反
応性ヒトモノクローナル抗体を報告していいる。Ｄｅｌｅｅｒｓｎｙｄｅｒらの
１９９７年Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ７１：６９７−７０４は、Ｅ２反応性モ
ノクローナル抗体を記載している。ＨＣＶに対する抗体の使用に関連した他の文
献は、Ｂｕｒｉｏｎｉらの１９９８年Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２８：８１０〜８１
４；Ａｋａｔｓｕｋａら１９９３年Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１８：５０３〜５１０
；ＤｅＬａｌｌａの１９９３年Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１８：１６３〜１６７；Ｍ
ｏｎｄｅｌｌｉら、１９９４Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４８２９〜４８３６；Ｓ
ｉｅｍｏｎｅｉｔら１９９４年Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１３：９〜１３；及びＭｏｒ
ａｄｐｏｕｒら１９９６年Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４８：２３４〜２４１であ
り；ヒト抗体を産生することについては、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
７０：８３〜９０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９０年Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ１３４：４３〜５０；組み合わせライブラリを用いた改変抗体を生
成することについては、Ｂｕｒｔｏｎ及びＢａｒｂａｓ，Ｄｉｘｏｎ，ＦＪ（Ｅ
ｄ．）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｖｉ＋
３９１ｐ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ，１９１〜２８０，１９９４年；Ｐｌａｉｓａｎｔら、１９９７年Ｒｅｓ．Ｖ
ｉｒｏｌ．１４８〜１６９；及びＢａｒｂａｓ及びＢｕｒｔｏｎ，Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｒｏｍＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＬ
ｉｂｒａｒｉｅｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，
ＮＹ，１９９４年である。

【０００９】ＨＣＶＥ２に結合する抗体についての検定は、Ｒｏｓａら１９９６年Ｐｒｏ
ｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３：１７５９〜１７６３により記
載されている。

【００１０】ＨＣＶゲノムの一部を有するワクシニアウイルス又はバキュロウイルス（bacu
lovirus）は、Ｒａｌｓｏｎら１９９３年Ｊ．ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ６７：６
７３３〜６７６１及びＬａｎｆｏｒｄら１９９３年Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９７：２
２５〜２３５に記載されている。

【００１１】発明の概要大部分の地理的領域の主たるＨＣＶ型に結合するヒトモノクローナル抗体を含
むモノクローナル抗体を提供する。特にＨＣＶＥ２蛋白質のコンフォメーショ
ン的に保存されている抗原決定基に結合する一群のモノクローナル抗体を提供す
る。米国において診断されてきたＨＣＶ感染のほとんど全てのケース並びに他の
地理的にみた場合の地方におけるケースの少なくともかなりの部分に結合するこ
とができる点で実質的に汎モノクローナル抗体であるような、米国で見出だされ
た主たる遺伝子型に結合する抗体がその群の中に存在する。モノクローナル抗体
は、多様な診断検定において用られる。更に、組み換え型１型及び２型のＨＣＶ
Ｅ２蛋白質がコンフォメーション的に保存されている発現型を、検定、ドラッ
グスクリーニング及びその他の目的のために用いるために提供する。ヒト抗体は
、感染した個体のウイルス負荷を減ずるため及び標的細胞の感染を妨害するため
の受動的免疫的治療戦略において用いられる。コンフォメーション的に従属的な
抗原決定基を認識する抗体は、ペプチド及び無機質的なコンフォメーション的に
定まった抗原決定基模倣物の合理的設計用の鋳型を提供する。

【００１２】図１は、本願において記載されたワクシニアウイルス構造のいくつかによりＨ
ＣＶＥ２蛋白質の発現型を示したものである。細胞質抽出物を野生型ワクシニ
アウイルスに感染させ、次いで遺伝型１ａ（Ｑ１ａ）又は２ｂ（Ｑ２ｂ）のＨＣ
ＶＥ２を発現するｐＶＯＴＥ（ｗｔ）又は組み換えｐＶＯＴＥでトランスフェ
クションしたＣＶ１細胞から調整した。細胞は、誘導物質ＩＰＴＧの存在（＋）
又は不存在（−）において２４時間培養した。２×１０⁵に対応する抽出物がＳ
ＤＳＰＡＧＥにより分画され、ニトロセルロース上にブロットされた。ＨＣＶ
２Ｅ蛋白質は、ＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いたＭａｂＥ
２Ｇの１／５００希釈腹水流体でインキュベーションすることにより明らかにさ
れた。分子量標準物質の泳動により正しく示された。

【００１３】図２（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：９〜１２）は、ＨＣＶＥ２ワクシニアウイル
スクローンの中心領域から増幅された配列を示す。適当なＨＣＶ遺伝型の代表的
な配列と比較してＨＣＶＥ２ワクシニア構造Ｑ１ａ，Ｑ１ｂ，Ｑ２ａ＆Ｑ２ｂ
についての中心断片の配列を示した。各遺伝型の代表的配列についての登録番号
は以下の通りである。ＨＣＶ１Ａ＝Ｍ６２６３１，ＨＣＶ１Ｂ＝Ｄ１０７５
０，ＨＣＶ２Ａ＝Ｄ００９４４，ＨＣＶ２Ｂ＝Ｄ１０９８８。系統分類分析が
ＰＨＹＬＩＰパッケージのＣＬＵＳＴＡＬＴ及びＤＮＡＰＡＲＳで行われた。

【００１４】図３（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１〜８）は、ＨＣＶの配列（−１ａ，Ｑ１ａ−
，ＦＲ，−１ｂ，−Ｑ１Ｂ−ＦＲ，−２ａ，Ｑ２ａ−ＦＲ，−２ｂ，−Ｑ２ｂ−
ＦＲ）の比較である。見出だされた大部分の倹約的な木を用いた。

【００１５】図４は、ＨＣＶ血清の異なる遺伝子型のＨＣＶＥ２との反応のグラフである
。ワクシニアウイルスＱ１ａ■，Ｑ１ｂ▲，Ｑ２ａ▼，Ｑ２ｂ◆で感染させた６
×１０⁵のヒーラ細胞により発現したＨＣＶＥ２蛋白質、又は非組換ワクシニ
アウイルスＶＷＡを５００ｎｇＧＮＡレクチンで被覆した壁面上に捕らえた。壁
面を洗浄及びブロックして、結合した蛋白質を遺伝型ＨＣＶ血清又はＨＣＶ陰性
血清（グラフ上に示した）を希釈して（ｘ軸）インキュベートした。値は、折り
重ねた壁面の平均吸収値である。エラーバーは、平均からの標準偏差を示す。

【００１６】図５は、ＨＣＶＥ２に感染した個体からの血清と複合遺伝子型のＨＣＶＥ
２蛋白質との反応性を示したバーグラフである。ＨＣＶ遺伝型２ｂに感染した個
体からの１２の血清（ｘ軸）を、遺伝子型１ａ（暗青色のバー），１ｂ（マゼン
タ色のバー），２ａ（黄色のバー），２ｂ（淡青色のバー）のＨＣＶ蛋白質に対
して滴定した。平均比吸収率０．５（ＶＷＡ抽出物で得られた平均比吸収率から
減じた抽出物を含有するＨＣＶＥ２で得られた平均吸収率）の結果となった血
清の希釈物は、Ｙ軸上に示した。この値は、図４において示されたものと類似の
滴定曲線から算出された。

【００１７】図６は、図７、８、及び９に記載された実験に用いられたＨＣＶＥ２エンベ
ロープ蛋白質のコンフォメーショナルな抗原決定基を認識する抗体についての評
価をするための直接結合検定の概略図を示す。ＧＮＡレクチンを固体表面上に被
覆して、次いで添加されたＥ２−含有蛋白質抽出物をレクチンで捕らえる。試験
抗体が、捕らえられたＥ２に結合できるようにして、過剰の未結合ものは、除去
する。そして結合した抗体をラベルされた２次抗体で検出する。

【００１８】図７は、レクチンにより捕らえられたＨＣＶＥ２へのＨＣＶＨＭＡｂｓの
反応性のバーグラフである。ワクシニアウイルスを発現した野生型（バーはＶＷ
Ａをラベルした）又はＨＣＶ１ａＥ２（ＨＣＶ１ａ）（バーはＨＣＶをラベ
ルした）で感染した６×１０Ｅ５の細胞数の細胞質抽出物を５００ｎｇのＧａｌ
ａｎｔｈｕｓｎｉｖａｌｉｓ（ＧＮＡ）又はＴｒｉｔｉｃｕｍｖｕｌｇａｒ
ｉｓ（ＷＧＡ）で被覆したマイクロタイタープレートに塗布した。補足された蛋
白質を表示されたＨＭＡｂｓ（ｘ軸）５μｇ／ｍｌでイキュベートした。Ｒ０４
は、イソ型−適合対照である。結合ＨＭＡｂを抗ヒト抗体−アルカリホスファタ
ーゼ及び適当な基質で検出した。バーは、折り重ねた壁の平均ＯＤ値を示す。エ
ラーバーは、平均からの標準偏差を示す。

【００１９】図８は、分岐型ＨＣＶ遺伝型のＥ２蛋白質とＨＣＶ抗体の反応性のグラフを示
している。ワクシニアウイルスＱ１ａ■，Ｑ１ｂ▲，Ｑ２ａ▼，Ｑ２ｂ◆で感染
させた６×１０Ｅ５のヒーラ細胞により発現したＨＣＶＥ２を５００ｎｇＧＮ
Ａレクチンで被覆した壁面上に捕らえた。壁面を洗浄及びブロックして、結合し
た蛋白質を表示されたＨＣＶＨＭＡｂｓ（図９Ａ〜図９Ｊの各々上に同定され
たＨＭＡｂ）及びＣＭＶ蛋白質（Ｗａｒｄら１９９５年、ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９２：６７７３〜６７７７）の対照ＨＭＡｂ（Ｒ０
４）図９Ｋでインキュベートした。値は、折り重ねた壁面の比結合率（ＨＣＶ
Ｅ２蛋白質を発現するワクシニアウイルスで感染させた細胞抽出物−ｗｔワクシ
ニア抽出物）である。ＨＣＶ及び対照ＨＭＡｂｓの細胞に感染したｗｔワクシニ
アウイルス由来の蛋白質との反応性は、吸収率０．０４を越えなかった。エラー
バーは、平均からの標準偏差を示している。

【００２０】図９は、ＨＣＶＨＭＡｂｓの非変性（ＮＡＴ）及び変性（ＤＮＴ）ＨＣＶ１
ｂＥ２蛋白質との反応を示す。ワクシニアウイルスＱ１ｂ及びＶＷＡ又はＶＷＡ
単独で感染した６×１０Ｅ５ヒーラ細胞由来の細胞質抽出物を未処理のままか（
青バー）又は０．５％ＳＤＳ及び５ｍＭジチオスレイトールで１５分５６℃でイ
ンキュベーションすることにより変性した（黄色バー）。処理の後に、蛋白質を
ＢＬＯＴＴＯ中に１：５で希釈して、５００ｎｇＧＮＡレクチンで被覆した壁面
上に捕らえた。壁面を洗浄、ブロックして、結合蛋白質をＨＣＶＨＭＡｂｓ及
び対照ＨＭＡｂ（Ｒ０４）の示した濃度でインキュベートした。結合した抗体を
抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ抱合体及びＰＮＰＰで検出した。発色は４
５分間で進行させることができた。非変性及び変性ＨＣＶ１ｂについての値は、
折り重なった壁面から得られた平均的シグナルである。ＨｅＬａ細胞に感染した
ＶＷＡ由来の非変性及び変性蛋白質のシグナル壁面からのシグナルは区別不可能
であり、また平均化されている（赤色バー）。エラーバーは、平均からの標準偏
差である。

【００２１】図１０は、図１１、１２及び１３に記載された実験に用いられた競合結合分析
の概略図である。ＧＮＡレクチンを固体表面上に被覆して、次いで添加されたＥ
２−含有蛋白質抽出物をレクチンにより捕らえた。競合抗体を、未結合過剰物を
除去して、ラベルされた試験抗体を添加する前に補足されたＥ２に結合させるこ
とができる。

【００２２】図１１は、ＨＣＶＭＮＡｂＣＢＨ−５を用いた競合分析のバーグラフであ
る。ワクシニアウイルスＱ１ａ（青色バー）又はＱ１ｂ（赤色バー）で感染させ
たヒーラ細胞由来のＨＣＶＥ２蛋白質を５００ｎｇＧＮＡで捕らえた。示され
たＨＭＡｂｓ（ｘ軸）２５μｇ／ｍｌの存在下で５μｇ／ｍｌビオチン添加のＣ
ＢＨ−５で結合ＨＣＶＥ２を検出した。結果を、競合物の不在下のビオチン添
加のＣＢＨ−５の結合と比較する。バーは、折り重なった壁面から得られた平均
値を示している。エラーバーは、平均唐の標準偏差を示す。

【００２３】図１２は、ＨＭＡｂＣＢＨ−２の複合的遺伝子型のＨＣＶＥ２蛋白質の結
合を妨げる可能性を示す競合分析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ（青色バー
），Ｑ１ｂ（赤色バー），Ｑ２ａ（黄色バー），Ｑ２ｂ（淡青色バー）で感染さ
せたＨｅＬａ細胞の細胞抽出物由来のＨＣＶＥ２蛋白質を５００ｎｇＧＮＡレ
クチンで捕らえた。ＨＭＡｂｓＣＢＨ−４Ｄ，−４Ｂ，及び−１７のみをＨＣ
ＶＥ２蛋白質で、それらの遺伝型２Ｅ２蛋白質に対する反応性により評価し
た。表示されたＨＭＡｂｓ（ｘ軸）２０μｇ／ｍｌの存在において結合ＨＣＶ
Ｅ２を２μｇ／ｍｌのビオチン添加ＣＢＨ−２Ｅ２蛋白質で検出した。バーは
、競合抗体の不在下（ｙ軸）ＨＣＶＥ２へのでビオチン添加ＣＢＨ−２の結合
に対する表示された抗体の存在において観察された結合を示す。Ｒ０４は、サイ
トメガロウイルス蛋白質を認識する対照ＨＭＡｂである。バーは、折り重なった
壁面から得られた平均値を示す。エラーバーは、平均からの標準偏差である。

【００２４】図１３は、ＨＣＶＨＭＡｂＣＢＨ−７が単一の抗原決定基を認識すること
を示す競合分析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ（青色バー），Ｑ１ｂ（赤色
バー）で感染させたＨｅＬａ細胞の細胞抽出物由来のＨＣＶＥ２蛋白質を５０
０ｎｇＧＮＡレクチンで捕らえた。結合ＨＣＶＥ２を示されたＨＭＡｂｓ（ｘ
軸）２０μｇ／ｍｌの存在下ビオチン添加ＣＢＨ−７２μｇ／ｍｌで検出した
。バーは、競合抗体の不在下（ｙ軸）ＨＣＶＥ２へのでビオチン添加ＣＢＨ−
７の結合に対する表示された抗体の存在において観察された結合を示す。Ｒ０４
は、サイトメガロウイルス蛋白質を認識する対照ＨＭＡｂである。バーは、折り
重なった壁面から得られた平均値を示す。エラーバーは、平均唐の標準偏差であ
る。

【００２５】図１４は、図１５に記載された実験で用いられたＥ２蛋白質に結合するＣＤ８
１をブロックする抗体の能力を評価するための概略図を示す。Ｅ２−含有蛋白質
抽出物を、固体表面上に被覆する。次いでＥ２−含有蛋白質抽出物を直接又は試
験抗体でプレインキュベーションした後に添加する。結合された試験抗体−Ｅ２
複合体を、適当にラベルされた２次抗体を用いて検出する。

【００２６】図１５は、ＣＤ８１−ＬＥＬに結合した場合に、１組のＨＣＶＨＭＡｂｓが
ＨＣＶＥ２と反応することを示すバーグラフを示す。ＨＣＶＥ２蛋白質を発
現する組み換えワクシニアウイルスで感染したＢＳＣ−１細胞由来の抽出物を、
全量１００μｇ中の示されたＨＭＡｂｓ（ｘ軸）５μｇ／ｍｌと組み合わせてＧ
ＳＴＣＤ８１−ＬＥＬ融合蛋白質又は非組換ＧＳＴで被覆されたマイクロタイ
タープレートで一晩インキュベートした。壁面を洗浄して、適当なアルカリホス
ファターゼ抱合２次抗体及びＰＮＰＰ基質を（更に例６において記載されている
ように）用いて結合抗体を検出した。値は、１ａ（紫色バー），１ｂ（赤色バー
），２ａ（黄色バー）又は２ｂ（緑色バー）Ｅ２蛋白質の存在下ＧＳＴにより捕
らえられた抗体についての平均ＯＤ値により除したＣＤ８１により捕らえられた
抗体の平均ＯＤ値である。ＧＳＴで被覆された壁面から得られたＯＤ値は、０．
０２１〜０．０８１の間の範囲である。

【００２７】図１６は、図１７に記載された実験に用いられたＨＣＶビリオンに結合したＣ
Ｄ８１をブロックする抗体の能力を評価するための概略図を示す。ＨＣＶビリオ
ンは、試験抗体でプレインキュベートされ、次いで固定化されたＣＤ８１に結合
することができる。結合されたＨＣＶビリオンの検出を定量ＰＣＲにより測定す
る。

【００２８】図１７は、ＨＭＡｂｓＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５がＨＣＶビリオンのＣＤ８
１への結合を阻害することを示すバーグラフである。ポリスチレンビーズ（ｘ軸
）と結合するＨＣＶＲＮＡ分子は、ＨＣＶ１ａチンパンジー血清を示された抗
体（ｙ軸）１０μｇと結合して、その後にＣＤ８１−ＬＥＬで被覆されたビーズ
に結合することができるようになる（例７に記載されたように）。図１８は、Ｈ
ＣＶＥ２のＣＤ８１への結合を阻害する抗体の存在を検出するために、ＨＭＡ
ｂＣＢＨ−４Ｇを用いることができることを示すバーグラフである。ワクシニ
アウイルスＱ１ａで感染したＢＳＣ−１の抽出物由来のＨＣＶ１ａＥ２蛋白質を
ビオチン添加調整ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ４μｇ／ｍｌで２０分間４℃でインキ
ュベートした。Ｅ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合体の５０μｌ分別を、４０μｇ／ｍｌの
示された抗体（ｘ軸）５０μｌ添加したＧＮＡ（青バー）５００ｎｇ又はＧＳＴ
−ＣＤ８１−ＬＥＬ（赤バー）１００ｎｇで被覆された壁面に添加した。Ｒ０４
は、サイトメガロウイルス蛋白質を認識する対照ＨＭＡｂである。４℃で一晩イ
ンキュベートした後に、壁面を洗浄して、結合したビオチン添加のＣＢＨ−４Ｇ
を検出した（例８に記載されているように）。バーは、競合抗体の不在における
得られたシグナルに対する示された抗体の存在における二重壁面から得られた平
均的シグナルを示す。エラーバーは、平均からの標準偏差である。

【００２９】図１９は、ＨＣＶに感染した個体由来の血清におけるＨＣＶＥ２のＣＤ８１
に対する結合を阻害する抗体の存在を検出するために、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ
を用いることができることを示すバーグラフである。ワクシニアウイルスＱａ１
又は２ｂで感染したＢＳＣ−１細胞の抽出物由来のＨＣＶ１ａ又は２ｂＥ２蛋白
質を、ビオチン添加のＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ４μｇ／ｍｌで２０分間４℃でイ
ンキュベートした。左の４つの血清をＨＣＶ１ａＥ２蛋白質で試験して、右の４
つの血清をＨＣＶ２ｂＥ２蛋白質で試験した。次いで、Ｅ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合
体を、遺伝子型ＨＣＶ感染（１ａもしくは１ｂ）又は不感染（ＮＥＧ）の個体（
ｘ軸）の示された血清の１／５００希釈物の存在下ＧＮＡ（青バー）５００ｎｇ
又はＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ（赤バー）１００ｎｇで被覆された壁面に添加し
た。４℃で一晩インキュベーションした後に例８に記載されたように結合された
ビオチン添加のＣＢＨ−４Ｇを検出した。バーは、競合抗体の不在下で得られた
シグナルに対する示された血清（最終希釈１／１０００）の存在下二重壁面から
得られた平均シグナルを示す。エラーバーは、平均からの標準偏差である。

【００３０】１種以上のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型に結合するモノクローナル抗体、特にヒ
トモノクローナル抗体（「ＨＭＡｂｓ」）を提供する、この抗体は診断及び治療
に用いることが見出だされる。自覚症状のないＨＣＶ肝炎及び高い血清中和の結
合滴定を有する個体の末梢Ｂ細胞由来のヒトモノクローナル抗体（ＨＭＡｂｓ）
の標本を生成して特徴化する。ＨＣＶＥ２に対する１１個のＨＭＡｂｓを生成
した。１群の抗体は、遺伝子型ＨＣＶ１型及び２型に結合する、一方で他の抗体
はこの群の遺伝子型よりも少なく結合する。ＨＣＶ１型及び２型はともに西半球
及び他の地理的地域に現れる主たるウイルス型である。抗体は、ウイルス型及び
遺伝子型にわたり保存されているコンフォメーショナルな抗原決定基と結合する
。抗体はＨＣＶＥ２蛋白質の遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ及び２ｂと結合して、
１組のこれらの抗体はヒトＣＤ８１とこれらのＥ２蛋白質の相互作用を阻害する
。抗体の結合特性の多様性により、米国に出現するＨＣＶに対する汎抗−ＨＣＶ
抗体を提供するように、複数の型及び遺伝子型を検出する診断検定を用いること
ができる（他方同時に差し引き分析により個々の遺伝子型を分析することができ
る）。更に抗体がヒトの場合に、それらは、ＨＣＶのための個人のための保護的
治療又はＨＣＶ血清陽性の人々のための治療として受動的免疫のために用いられ
ることができる。

【００３１】発明のＨＭＡｂｓは、ＨＣＶに対する既存のＨＭＡｂｓを上回るいくつかの利
点を提供する。非相同的プライマリアミノ酸配列でもなお、免疫学的に同一の蛋
白質三次元構造を持つことができるので、構造的に保存された抗原決定基に結合
するＨＭＡｂｓは複合的で配列が分散しているＨＣＶ遺伝子型を本来のコンフォ
メーションで認識することができるが、一方で線形又は変性抗原決定基のみを認
識する抗体はそれを行うことができない。特に、コンフォメーション的に依存す
る抗−ＨＣＶＥ２ＨＭＡｂｓは、本来のＨＣＶウイルスとその細胞標的受容
体との相互作用を効果的に妨害することができる。ＣＤ８１のような細胞受容体
を標的として結合する本来のＨＣＶウイルスの能力はを活発に妨害するコンフォ
メーション的に依存するＨＭＡを用いることは，感染した個人のウイルス負荷を
減ずるための特定の治療用途を有する、そして非感染者における感染又は再感染
を防止する（特に近年の臓器移植受容者において）。ある組のＨＭＡｂｓは、Ｃ
Ｄ８１と直接の相互作用を妨げる以外の機構によりＥ２−関連ウイルス感染を妨
げる。この組の抗体は、Ｅ２が助受容体蛋白質に結合するのを妨げること、標的
細胞へのＥ１及びＥ２−媒介ウイルス拡散及びＨＣＶビリオンの非被覆を含む多
数の可能な機構によりウイルス感染を妨げる。抗体は、異なる抗原決定基に結合
するので、Ｅ２がＣＤ８１と結合するのを直接妨害するＨＭＡｂｓの組は、両方
の治療及び診断用途のための他の機構による感染を妨害する組におけるＨＭＡｂ
ｓを補って完全なものとする。

【００３２】コンフォメーション的に規定されるウイルス抗原決定基を認識するＨＭＡｂｓ
は、ウイルス／標的受容体相互作用を妨げ、そしてそのようなＨＭＡｂｓに結合
するウイルスのコンフォメーショナルな抗原決定基は、また合理的にデザインさ
れたペプチド及びウイルス抗原決定基の無機質な構造的模倣についての鋳型とし
ての役立つことができる。これらのコンフォメーション的に依存性の抗−ＨＣＶ
ＨＭＡｂｓにより規定される構造的な分子模倣物は、標的受容体自身に結合す
ることにより本来のウイルスが標的受容体への結合をブロックするそれらの能力
において用いられる。

【００３３】ヒトモノクローナル抗体を生成することにより、ＨＣＶに対するヒト免疫応答
を直接分析することが可能である。ヒトモノクローナル抗体を用いることにより
、外来抗原としての抗体自身に対する免疫応答は最小限である一方、ヒト起源で
はないものから産生されるモノクローナル抗体に対して産生される、なぜならば
それらを外来抗原として認識するからである。コンフォメーションナルに保存さ
れるウイルス抗原決定基を認識するＨＭＡｂｓについての選択は、抗体が線形的
又は変性抗原決定基のみを結合することができる抗体よりもＨＣＶ感染を改善す
る又は防ぐためのこれらの薬剤のより幅広くかつより効果的な治療の用途を可能
なものにする。ＨＣＶ感染又は標的細胞中への取り込みを防止する性質を有する
ものとして記載される全ての従来の抗体は、可変領域として知られるＨＣＶＥ
２の高度に可変な配列を認識する。対照的に、上記の抗体は、コンフォメーショ
ンナルな抗原決定基を認識し、抗原決定基の大部分は、複合的に異なった遺伝子
型のＨＣＶＥ２蛋白質中に高度に保存されるものである。かくして、ここで記
載された抗体は、従来に記載された中和抗体よりもずっと広い範囲のＨＣＶイソ
型に対して活性であるという利点を有する。付加的な利点は、ここで記載された
抗体により抗認識される抗原決定基の高度な保存が、ＨＣＶＥ２蛋白質内に機
能的及び／又は構造的に重要な配列を認識することを示していることである。か
くしてこれらの抗体とともに分離されたペプチド又は小分子が、ＨＣＶＥ２内
の機能的領域を標的とする高度の性質を有する。これは、かつて記載された他の
抗体にはあてはまらないことである。

【００３４】記載された検出抗体のうちで、ＣＢＨ−４Ｇは、複合的ＨＣＶ遺伝子型のＨＣ
ＶＥ２−ＣＤ８１複合体と本質的に等しい反応性を有するが、一方ＣＢＨ−４
Ｇは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ，１ｂを認識する。ＨＣＶ抗血清中に存在する抗体を
阻害するレベルは、全く低いものであることも示されている。それゆえ、抗体は
、複合的なサイトメトリック分析に依存することなくマイクロタイタープレート
フォーマット中の試料に存在する抗体を中和するレベルを検定する直接的な手段
を提供する。

【００３５】対象のＨＭＡｂｓ開発に用いられた全般的な戦略は以下の通りである：（１）
ＨＣＶに暴露した証拠のある個人を特定した；（２）その個人からの末梢血液か
ら抗原特異的なＢ細胞をインビートロで増殖させて活性化させる；（３）これら
の細胞を適当なマウス−ヒトヘテロミエローマで電気融合した；（４）ハイブリ
ドーマを分泌する適切なヒト抗体を特定した；（５）適切なハイブリドーマをク
ローンニングにより安定化させた。この戦略は、ＨＣＶＥ２蛋白質に特異的な
ＨＭＡｂｓの特定することとなった。このＨＭＡｂｓの多くは、１型１ａ及び１
ｂ並びに２型のＥ２のコンフォメーション抗原決定基に結合して、単一の抗体で
米国及びその他に現れるプライマリ遺伝子型を認識した。他方他のものは、より
少数の上記遺伝子型に結合し、ＨＣＶ型又は遺伝子型を特定するのに有用であっ
た。

【００３６】例えば、自覚症状のないＨＣＶ感染を有する個人からの末梢Ｂ細胞、結合滴定
の高血清中和を用いて、ヒトモノクローナル抗体の標本を作成及び特徴化するこ
とができる。初期のスクリーニングは、ＨＣＶ−１イソ型の同一領域に９８％の
相同性を有する網ノン酸を有する遺伝子型１ａＥ２を用いて行われた（Ｌａｎｆ
ｏｒｄら、１９９３年Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９７：２２５−２３５）。この段階
は、ドナーが１ｂイソ型に感染しているので遺伝子型１ａ及び１ｂ間に保存され
た抗原決定基に対する抗体の選択に用いられるスクリーニングアプローチに重き
をおいた。ＨＭＡｂｓの全ては、また異種ＨＣＶ１ｂイソ型Ｑ１ｂ（ＨＭＡｂｓ
の選択において用いられたＨＣＶ１ａイソ型と７９％の相同性があった）からの
Ｅ２とも反応した。組換Ｅ２の変性は、１１のＨＣＶＨＭＡｂｓのうち１０と
反応がしないようにした。かくして、ＨＭＡｂｓの大部分は、コンフォメーショ
ナルな抗原決定基を認識した。

【００３７】５つのＨＭＡｂｓ、ＣＢＨ−４Ｄ，４Ｂ，４Ｇ，−９及び１７は、ＮＯＢ検定
において陰性であり、ＨＣＶＥ２−ＣＤ８１複合体と反応した。これらの抗体
のうち２つ、ＣＢＨ−４Ｄ及びＣＢＨ−９は、ＧＮＡ及びＣＤ８１捕捉検定の両
方において遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ及び２ｂのＨＣＶＥ２蛋白質と反応した
。他の３つの抗体、ＣＢＨ−４Ｂ，４Ｄ及び１７は、遺伝子型１ａ及び１ｂもＥ
２蛋白質との限定的な反応性を呈した。ＨＭＡｂｓＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−
４Ｄは、各々かκ及びλ軽鎖を有し、おそらく異なる抗原決定基を認識する。Ｈ
ＭＡｂＣＢＨ−１７は、変性不感受性抗原決定基を認識する唯一の抗体である
。かくして、ＮＯＢ陰性抗体の各々は、異なった抗原決定基を認識する。

【００３８】コンフォメーショナルな抗原決定基ＣＢＨ−２，５，７，８Ｃ，８Ｅ及び１１
を認識する６つのＨＭＡｂｓは、ＨＣＶ１ａＥ２蛋白質を用いた結合検定の
中和を用いる試験を行った場合には陽性であった。同一の６つの抗体は、ＣＤ８
１−ＬＥＬと複合体を形成する場合に遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ，又は２ｂのＥ
２に結合しなかった。かくして、ＨＣＶＥ２内のＣＤ８１結合部位と一部又は
完全に重複する抗原決定基は、本来的に及び高度に保存されたコンフォメーショ
ナルなものである。ＣＤ８１結合部位における高度な配列保存は、ＨＣＶＥ２
及びＣＤ８１間の相互作用が生物学的に適切であるということを提示することと
一致する。試験された４つのＮＯＢ陽性抗体のうちの２つ、ＨＢＡｂｓＣＢＨ
−２及びＣＢＨ−５は、無傷のＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合を妨げること
ができた。ＨＭＡｂｓＣＢＨ−７及びＣＢＨ−１１は、ＨＣＶビリオンのＣＤ
８１への結合をたいして妨げなかった（抗体がＮＯＢ検定で同等の活性を有して
いるにもかかわらず）。このことは、ＨＣＶビリオンがＥ１−Ｅ２複合体を表面
において有しているものと考えられ、Ｅ２において存在する抗原決定基は全くそ
のような複合体にさらされる可能性がないということを反映していると考えられ
る。Ｅ１−Ｅ２複合体とのＨＭＡｂｓの試験は、この出願で明らかにされる。そ
の代わりに、ＮＯＢ及びビリオン阻害検定での異なった結果は、ＨＭＡｂｓのＥ
２蛋白質又はＥ１−Ｅ２複合体についての真の親和性における差を反映している
ものと考えられる。いずれにせよ、自身の結合活性の強力な中和は、抗体が無傷
のＨＣＶビリオンに結合するということ確実なものとはしない。かくして、イン
ビトロでのＥ２蛋白質のＣＤ８１−ＬＥＬとの相互作用を阻害する抗体は全てが
インビボで感染性を中和するわけではないという可能性がある。

【００３９】これらの６つのＮＯＢ陽性抗体のうち５つは、この研究で用いられた５つのＨ
ＣＶイソ型で抗原決定基を共有する。他の抗体ＣＢＨ−１１は、２つの異なる反
応性を呈し、かつ他の抗体と異なる抗原決定基をおそらく認識している。実際、
異なる１ａイソ型に対するＣＢＨ−１１の多様な反応性は、ビリオン結合実験で
陰性の結果に寄与していたものと考えられる。ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７のＨＣ
Ｖビリオンとの異なる反応性及び競合実験の両方が、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７
が異なった抗原決定基を認識していることを示している。競合実験はまた、ＨＭ
ＡｂｓＣＢＨ−５及びＣＢＨ−２により識別される抗原決定基が異なることを
も示唆している。しかしながら、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−８Ｅが同一又は極めて
類似する抗原決定基を認識するということは可能なままである。一義的な抗原決
定基の全数を決定することは、ハイブルドーマにより産生される抗体遺伝子の配
列並びに競合の研究及び付加的なＨＣＶイソ型で試験することを要求する。

【００４０】これらの結果は、ＨＣＶＥ２内のいくつかのコンフォメーショナルな抗原決
定基が、分散ＨＣＶ遺伝子型中に高度に保存されていることを示している。これ
らの抗原決定基を認識する抗体は、ＨＣＶＥ２の構造をよりよく定める薬剤と
して有用である。より重要なのは、ＨＣＶビリオンがヒトＣＤ８１に結合するこ
とを阻害したＣＨＢ−２及びＣＨＢ−５が、ウイルス中和を媒介する第１候補で
あることである。しかしながら、ウイルス中和のための真のインビトロモデルの
不在は、基礎的な証拠が、選択されたＨＭＡｂｓが適切な動物モデルでＨＣＶ感
染を妨害又は改変することができることにより得られるということを要求するで
あろう。首尾よくいけば、広い反応性中和抗体がたぶん治療に利用されるであろ
う。肝移植においてＢ型肝炎免疫グロブリンで達成された成功と同様に（Ｄｉｃ
ｋｓｏｎＲＣ１９９８ＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌＳｕｒｇ４（５Ｓｕ
ｐｐｌ１）：Ｓ７３〜Ｓ７８；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９９８年Ｈｅｐａｔｏ
ｌｏｇｙ２８：５８５〜５８９）、可能な用途は、広い反応性を有する中和ヒト
モノクローナル抗体で肝移植受容者におけるＨＣＶ感染を抑えることである。

【００４１】ヒトモノクローナル抗体を提供する一方、他のソース由来の他の抗体が、ここ
に記載されたヒト抗体により認識される同一の抗原決定基を認識することができ
、それを用いることもできる。一般にマウスソース（マウス、ラット、ウサギ及
び家畜）由来の抗体を使用する。遺伝子工学を用い、ここで提供されるＨＭＡｂ
ｓの定常領域を置換してこれらの哺乳類ソースの保存領域を有する抗体を生成し
、動物に免疫性を与えて、生成されるための免疫原として以下に記載された蛋白
質を使用することができ、次いでその結果生ずるＢ細胞を不死化して、広い範囲
の結合特性を有するモノクローナル抗体を産生する不死化細胞のための以下に記
載されたスクリーニングを行うことができる。対象であるＨＭＡｂｓとの競合試
験におけるスクリーニングにより、非ヒト抗体が同一の抗原決定基に結合するか
否かを決定することができる。

【００４２】診断のために、環化ＨＣＶビリオン、Ｅ２蛋白質又は抗−Ｅ２を捕捉及び（又
は）同定するために、種々の方法で抗体を用いることができる。抗体を、免疫治
療、予防、治療のために用いることができる。抗体を、ＨＣＶ用のワクチンの開
発のために用いることもできる。

【００４３】抗体は、ＩｇＧクラス、特にＩｇＧ₁である。抗体及び抗体を認識するＨＣＶ
遺伝子型のための設計は以下の通りである。ＨＭＡｂｓの全部がＨＣＶＥ２に
ついて良好な親和性を呈し、抗体は１〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で最大のシ
グナルを呈した。

【００４４】

【表１】

【００４５】抗体を本来の形で用いてもよく、又はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）₂断片を提供す
るために切除することもできる。重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子を多くの異な
った方法で分離及び改変することができる。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、更に操作に
便利な構造の遺伝子のためにｃＤＮＡを得ることができる。重鎖及び軽鎖の可変
領域のヌクレオチド配列を直接又は３ｎヌクレオチドの鎖を介して（ここでｎは
少なくとも１及び約６０以下、大抵は約４０以下）分離及び結合して、２つの可
変領域間のアミノ酸リンカーを提供することができる。その鎖の長さを実験的に
決定して、最適な親和性及び他の性質（例えば、キレート化、他の分子表面又は
他の分子への結合等のためのメルカプト、カルボキシ又はアミノ基を介した結合
）を提供することができる。更に、遺伝子、無傷なもの又はその一部（少なくと
も可変領域を含む）が、他の配列に融合して、表面に付着することを容易にする
こと、細胞毒性についての毒、同定用のラベル又はタグ、親和性分離用の配列な
どを提供することができる。

【００４６】ラベルがポリペプチドである場合に、配列は直接抗体鎖のうちの１つの遺伝子
に直接融合することができる。いずれの場合でも、ラベルに結合するための部位
（例えばマレイミド基とチオエーテルを形成するシステイン、種々の分子と結合
することのできるキレート金属のためのポリヒスチジン／アスパラギン酸、還元
アミノ化におけるアルデヒドと反応するポリリシン）を提供することができる。
ラベルは、酵素、キレート群、配位子結合蛋白質に結合する配位子、例えばビオ
チン及びストレプタビジン、ジゴキシゲニン及び抗ジゴキシゲニン等、緑色蛍光
蛋白質等である。Ｅ．ｃｏｌｉビオチンカルボキシラーゼ担体蛋白質（ＢＣＣＰ
）のビオチン対応配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉで発現するする蛋白質のインビト
ロビオチン化に用いることができる、またＥ．ｃｏｌｉのｌｙｓａｔｅ中に導入
することができる。抗体がカラム含有固定化２価カチオンに結合することを可能
にする６つのヒスチジンの配列又はヒスチジン及びアスパラギン酸が交互に並ぶ
配列を用いることができる。高い親和性の抗原決定基をコードする配列を用いる
ことができる。例えば、ＦＬＡＧ抗原決定基ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１３），Ｔ７タグ配列ＭＡＳＭＴＧＧＱＭＧ（ＳＥＱＩＤ：ＮＯ１４）
，Ｓ−タグ配列ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（ＳＥＱＩＤ：ＮＯ：１５）
又は相関結合部位又は蛋白質薬剤に高い親和性で結合することを付与する他の配
列である。上記に示したものの他に融合蛋白質は、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ、ルシフェラーゼ、肝細胞上に見出だされる細胞表面受容体への配位
子、Ｔ細胞又は他の所望の細胞標的等を含む。そのような融合は、蛋白質の２機
能性を促進する３〜５０個のアミノ酸のリンカー配列を介して結合する。これら
の分子を固着可能アーム（プロテアーゼ部位）又は他の手段を介して抗体に結合
させることができる。抗体は、種々の毒（例えば、ジフテリア毒、リシン、アブ
リン、リボソーム不活性化蛋白質、アポトーシスシグナル蛋白質、孔形成蛋白質
、例えばパーフォリン等）に化学的に結合又は融合することができる。その代わ
りに、抗体は、配位子化毒性重金属又はラジオアイソトープ、特にテクネチウム
、放射能を有するヨウ素等にも結合することができる。抗体は、フルオロフォア
又はケミルミネセント分子に化学的に結合することができる。化学的な結合は、
活性カルボン酸基又はビオチン−Ｃ１１−ヒドロキシサクシイミドエステル（こ
れらはシステインと反応する）を用いるビオチン化；種々のビーズ（セファロー
ス、アガロース、磁性体、ポリスチレン等）のＣＮＢｒ活性化を用いた結合等；
抗体を有用な化学的部分を架橋すること（大抵はリシン又は他の基本的な残基を
改変することにより又は遊離のスルフィドリル基について特異的な薬剤を使用す
ることを介して達成される）を一般に含む多くの他の方法を含むことができる。

【００４７】重鎖及び軽鎖可変領域についての遺伝子を使用することは、抗体の結合親和性
を強める又は反応性を広める公知の方法と一致して、特に可変領域の超可変領域
を突然変異させることができる。ファージ表示方法論、ランダム若しくは直接突
然変異又は他の類似の方法論を用いて最適な結合抗体を同定するインビートロ選
択を用いることができる。その代わりに、超可変領域のアルカリ又はグリシンウ
オークを用いて必須アミノ酸を同定して、次いで抗原決定基の改善された結合を
同定するそれらの又は他の部位でアミノ酸を課得ることができる。技術分野にお
いて公知の他の技術を用いて、突然変異させた抗体を提供することができる。

【００４８】ハイブリドーマを抗体のソースとして用いる代わりに、遺伝子を分離して、適
当な哺乳動物の宿主細胞（ＣＨＯ，Ｈｅｌａ，ＣＶ１等）に導入することができ
る。適切な発現プラスミドを、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ，ｐＩＮＤ（ＳＰ１）
，ｐＲＥＰ８（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｌ及び，ＣＡから入手可
能）等により増幅させる。抗原遺伝子を、ウイルス又はレトロウイルスベクター
（ＭＬＶをベースにしたベクター、ワクシニアウイルスをベースにしたベクター
等）を介して発現させることができる。同様に、Ｍ１３ファージの表面のｐＣＯ
ＭＢシリーズのベクターを、２つの独立な鎖（変性していたものを元に戻し無傷
の抗体を形成する）として用いて抗体遺伝子を発現させることができる。その代
わりに、抗体を、少なくとも可変領域を含む単一鎖として発現することができる
。遺伝子を適当な細胞（例えばリンパ細胞、筋細胞、繊維芽細胞等）に導入する
ことにより遺伝子治療のための遺伝子を使用することができる。これら細胞で抗
体が（構成的に又は誘導的にのいずれかで）発現され分泌され、所定の期間にわ
たって抗体の連続的又は断続的なソースを提供することができる。マーカー遺伝
子（例えば、抗生物質に耐性のもの）と結合させた遺伝子を、対象（マーカーに
より選択された改変細胞及び宿主に戻されたマークされた細胞）から取った細胞
の細胞培地に導入する。ＤＮＡを、種々のプラスミドＤＮＡ、ネイクドＤＮＡ，
ＤＮＡウイルス構成物（例えば、アデノウイルス、アでノ関連ウイルス、又はワ
クシニアウイルス若しくはＲＮＡウイルス（例えば、名を挙げれば数少ないがベ
シキュラーストマチスウイルス、シンドビスウイルス、及びセミリキウイルス）
）に導入することができる。ＤＮＡであれば、対象細胞中に存在する転写因子の
プロモーター又は誘導若しくは導入することのできるプロモーター及びそのよう
なプロモーターの転写制御下で遺伝子を有する構成を有する。他の制御配列（分
泌のためのリーダー、ＲＮＡ安定配列等）もまた存在する。

【００４９】診断の目的のために、抗体は、Ｅ２蛋白質を検出し、ＨＣＶ遺伝子型を識別し
、ウイルス及び抗体を検出する広い多様性のフォーマットで用いることができる
（例えば米国特許５，６９５，３９０を見よ）。抗体を、個別に又は対象群以外
の若しくは他の抗体又はＥ２上に存在するグリコシル基；ビリオンエンベロープ
蛋白質、ＨＣＶＥ２が複合体を形成している他の蛋白質（例えば、ＨＣＶＥ
１）と組み合わせて用いることができる。診断の目的のために、ラベルの広い多
様性を用いることができる（これらの大部分は先に述べた）。これらは（これら
のみに限定されないが）、フルオロフォア、ケミルミネセンス、ラジオアイソト
ープ、酵素、粒子（例えばコロイド状カーボン及び金ラテックス粒子等）、高い
親和性受容体が存在する配位子及びプロラベル（活性化させ検出可能なシグナル
を提供することができる）を含む。

【００５０】実施例において、遊離若しくは球状の蛋白質又はとして、又は無傷のビリオン
若しくは部分的に無傷のビリオンとしてのＨＣＶ抗体に結合させる蛋白質で表面
を被覆する。１型及び２型ＨＣＶの両方又はレクチン（例えばＧａｌａｎｔｈｕ
ｓｎｉｖａｌｉｓレクチン）に結合された対象となる発明の抗体を用いるこ
とができる。検定は、表面を媒体（遊離の又はビリオン関連の蛋白質を含んでい
てもよく、ここで媒体は１以上の遺伝子型の公知のＥ２の試料又は溶液であって
もよい）と接触させることを含む。インキュベーション及び洗浄して非特異的な
結合蛋白質を除去した後、検定は、検定されるものに依存して種々の方法で進行
することができる。血清陽性が疑われている血液試料を検定する場合に、試料を
Ｅ２蛋白質の層に塗布して、インキュベートして洗浄して、蛋白質層に結合して
いるヒト抗体の存在を測定する。ラベルされた抗−（ヒト抗体）（対象抗体を最
初に使用している場合には、対象抗体のイソ型に対するもの以外）。血清陽性の
対象における抗体についての検定では、そのような対象の血清におけるヒト抗−
ＨＣＶを検出するために用いられるのと同一の薬剤を用いた対照として、対象抗
体を使用することができる。抗−（ヒト抗体）由来の特異的にラベルされた対象
抗体を用いることにより、試料における抗体の特異性を確定し、対象抗体を試料
の抗体でブロックするか否かを決定することができる。

【００５１】試料をＨＣＶＥ２蛋白質について検定する場合に、検出は、ラベルされた対
象抗体を用いて行う、選択はＥ２蛋白質の遺伝子型の決定又は検出のいずれかに
興味があるか否かにより定まる。非特異的な結合抗体を洗浄除去した後に、ラベ
ルされた抗体の存在が、公知の技術に従ってラベルの存在の検出を行うことによ
り測定される。その代わりに、対象抗体を表面に結合させる場合には、Ｅ２用の
ラベルされたレクチンを用いてＥ２蛋白質の存在を検出する。

【００５２】対象抗体はを用いて、他の抗体（血清中抗体、モノクローナル抗体、遺伝子効
果の結果として発現された抗体を含む）の反応性を測定することができる。コン
フォメーショナルに保存されたエンベロープ蛋白質を用いることもできるが、Ｈ
ＣＶ蛋白質よりむしろ、無傷のビリオンを用いることが望ましい。ビリオンの捕
捉については、例えばＫｉｍｕｒａら、１９９８年Ｊ．ｏｆＭｅｄ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ５６：２５〜３２；Ｍｏｒｉｔａら、１９９６年Ｈａｐａｔｏ−Ｇａｓ
ｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏｒｙ４３：５８２−５８５；Ｓａｔｏら、１９９３年Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１９６：３５４〜３５７；及びＨｉｊｉｋａｔａら、１９９３年Ｊ
．ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ６７：１９５３〜１９５８を見よ。手順は、レクチン
（例えばＧＮＡ）で固体支持体を被覆して、次いで無傷のＨＣＶビリオンを含む
媒体（例えば血清陽性患者の血清）と表面を接触させる。ビリオンを破壊する可
能性のある添加物（例えば界面活性剤）を除去すべきである。媒体をインキュベ
ートして、媒体の非特異的結合成分を除去するために洗浄した後、ビリオンを対
象たる発明の抗体及び試料の抗体と接触させることができる。試料を最初に添加
した場合には、同時に又は連続的に、このことを実行することができる。別の抗
体による置換に感受性のある対象抗体の量を用いる。そのような量を実験的に決
定することができ、一連の試験における対象抗体の異なった量を使用することを
望むことができる。試料の不在及び存在において得られるシグナルを知ることに
より、試料中の抗体の反応性又は結合親和性を測定することができる。種々の技
術を用いて、ビリオンに結合した対象抗体の量を測定することができる。対象抗
体をラベルした場合には、フルオロフォア又は検出可能なシグナルを生成する基
質である酵素でラベルしたビオチン又はジゴキシニゲン、ストレプチジン又は抗
（ジゴキシニゲン）が、対象抗体の量を測定するのに役立つことができる。

【００５３】ＰＣＲのラベル配列及び標準状態に相同性のあるプライマーを用いることによ
り、直接的又は間接的（ビリオンに結合された受容体の空の部位に結合できる配
位子−核酸配列抱合物を間接的に意図している）に、受容体（抗体又はレクチン
）をＤＮＡ配列でラベルした場合には、配列を拡張することができる。次いで、
ＤＮＡを分離ハイブリダイゼイション反応又はアガロースゲル電気泳動において
検出することができる。その代わりに、一端部及び他端部のクエンチング部に発
光ラベル（フルオロフォア又はルミネセア）を有する増幅された配列に相同的な
ラベルされた初期オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｔａｑｍａｎ法を用い
てもよい。断片を増幅するにつれて、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性は、クエンチャーからフルオロフォアを自由にするハイブリダイ
ジングオリゴヌクレオチドを分解する。その結果、フルオロフォアを、適当な波
長の光で媒体の発光を検出することが今やできる。

【００５４】サイクリングプローブ技術を行うのに適したラベルされたオリゴヌクレオチド
プローブを用いることができる。オリゴヌクレオチドは、ラベルされたものと同
一でＴＭ≦４５℃を有する約１５〜２０個のデオキシヌクレオチド初期配列と相
同な約５以上のリボヌクレオチドから構成され、この後にラベルされたものと同
一でＴＭ≦４５℃を有する約１５〜２０個のデオキシヌクレオチドが続く。その
ままのオリゴヌクレオチドは、ＴＭ＞４５℃を有する。オリゴヌクレオチドは、
発光ラベル及びクエンチャーラベルで上記で記載されたようにさらに改変される
。ラベルに結合する過剰のオリゴヌクレオチド構造のを添加すること及びそれを
約５５℃の温度で結合ラベルにハイブリダイズすることができるようにした後、
ＲＮａｓｅＨ（５５℃で活性）を添加することによりリボヌクレオチドを分解す
る。変性の際に発光ラベルを解放し、クエンチャーが自由になるであろう、そし
て発光及び活性化の際に発光を測定する。

【００５５】その代わりに、転写媒介増幅（ＴＭＡ）を用いることてもよい。この場合には
、結合したヌクレオチドラベルがＴ７ポリメラーゼ又は他の便利なポリメラーゼ
により認識されるプロモーターを含む。適当な条件の下でのＴ７又は他の適当な
ポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの添加は、結合オリゴヌクレオチドのオリゴリボヌ
クレオチドへの転写を招き、これは便利な手段（例えば電気泳動）により検出す
ることができる。

【００５６】ラベルされた対象抗体は、生体組織片由来のＨＣＶの存在についての検定にお
いて用いることができる。１以上の対象ラベル抗体の溶液を用いていラベルされ
た対象抗体を固定化した生体組織片（例えば、肝臓のスライス片）でインキュベ
ートすることができる。非特異的結合抗体を洗浄により除去した後、生体組織片
の細胞と結合した抗体の存在が、ラベルの性質により検出される。

【００５７】コンフォメーショナルに保存されたＥ２遺伝子型蛋白質１ａ，１ｂ，２ａ及び
２ｂ（後者の２つは新規の発現成分である）をワクシニアウイルス構成物由来の
発現蛋白質として提供される。それらの調整を、実験の部で記載する。蛋白質は
Ｅ１蛋白質のアミノ酸なしで得られた（それらは、Ｅ１及びＥ２の両方にコード
された遺伝子から調整できるものであるが）。ここでその結果生じる融合蛋白質
を処理してもはや共有結合しない２つの蛋白質を提供するが、それらは複合体と
して存在する。その蛋白質をライサイト又はその構成物が分泌した場所から分離
することができる。その蛋白質は、アフィニティクロマトガラフィー、ＨＰＬＣ
又は非変性ゲル電気泳動を用いて容易に生成することができる。その蛋白質を、
９５重量％を越える純度（大抵は少なくとも９９重量％）で得ることができる。
蛋白質が薬物の標的である場合に薬物を評価するための、抗血清及びモノクロー
ナル抗体に免疫を付与するための親和性及び特異性のためのモノクローナル抗体
スクリーニングにおけるＨＣＶ感染患者由来の血清を遺伝子型に分類する検定で
その蛋白質を用いることができる。

【００５８】抗体を用いて、それと結合するＥ２蛋白質上の構造的抗原決定基を同定するこ
とができる。コンフォメーショナルな抗原決定基を同定するためのモノクローナ
ル抗体を用いて、２つの基本的なアプローチを用いることができる。まず第１に
は、ＨＣＶイソ型の本来の変種又は突然変異分析を用いて、モノクローナル抗体
により認識される抗原決定基に関連する領域及び最終的な個々のアミノ酸を同定
することができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９９年ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２８
７：９８３〜９９９）抗体を、多くの異なるＨＣＶＥ２イソ型に対してスクリ
ーンニングして、個々の抗体と選択的に反応しないイソ型を同定する。例えば、
ＨＣＶＥ２とのＨＭＡｂＣＢＨ−１１の反応性を、ＨＣＶＥ２Ｑ２ａとの
反応性に比較して減ずる（図９）。次いで、「キメラ」のＥ２エンベロープ蛋白
質を構成する（その蛋白質中においてキメラの部分は、ＨＣＶ遺伝子型のＥ２蛋
白質由来もののであり、別のＨＣＶ遺伝子型のＥ２蛋白質由来のものである。）
これらのキメラＥ２蛋白質は、ＰＣＲ増幅重複断片により及び（又は）両方のＥ
２蛋白質に共通の制限部位を用いることにより構成されている。代わりの方法は
、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｎｙＭａｘｙ−Ｇｅｎにより開拓
されたＤＮＡシャフリングである。異なるキメラＥ２の異なるモノクローナル抗
体との観察される結合反応性を調べることにより、コンフォメーショナルな抗原
決定基を形成することにおいてＥ２蛋白質におけるアミノ酸領域を同定すること
ができる。一旦重要な領域が同定されれば、異なる遺伝子型の間で異なる個々の
アミノ酸を突然変異させて、反応性Ｅ２配列を生成する。十分な反応性を保持し
ている突然変異体は、抗原決定基を形成することと関連のあるアミノ酸を同定す
る。

【００５９】コンフォメーショナルな抗原決定基を決定する第２の基本的なアプローチは、
ＨＣＶＥ２の所望の配列をコードする１０〜１５残基の長さの一連のオーバー
ラッピングペプチドを合成することである。次いで、これらのペプチドを、高濃
度の抗体（多くの場合１００μｇ／ｍｌ以上）を用いる抗体に対してスクリーニ
ングする。十分にコンフォメーショナルな抗原決定基を含む個々の領域は、検出
することができる抗体との残りの結合活性を保持している。一旦これらの領域が
同定されれば、１０〜１５残基のペプチドを含む突然変異の研究を用いて（ペプ
チドに関連して又はコンフォメーショナル的に無傷なＨＣＶＥ２蛋白質）、そ
れらを確証させることができる。

【００６０】対象となる抗体は、ミモトープのためのスクリーニングのために用いることも
できる。ミモトープを、対象となる抗体でスクリーニングされたファージ表示及
びペプチドを用いて調整することができる（（Ｌｉｖａｎら１９９６年Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２７３：４６４〜４７１）；Ｐｒｅｚｚｉら、１９９６年Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５６：４５０６〜４５１３）。コンフォメーショナル的に保存されたＨ
ＣＶ抗原決定基を認識する抗体は、コンフォメーショナルな抗原決定基又はミモ
トープのペプチド若しくは非ペプチド構造の模倣物のための鋳型として用いるこ
とができる。

【００６１】ミモトープの生成は、生物学的に意義のあることである。コンフォメーショナ
ル的に規定されたウイルス抗原決定基の構造の模倣により、ミモトープは受容体
自体に結合することにより標的受容体を結合することのできるウイルスの能力を
妨げることができる。例えば、モノクローナル抗体及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
間の接触領域を規定する溶解した結晶構造の分析により、ＴＮＦ受容体に結合す
ることによりＴＮＦの生物学的機能を中和する能力を有する非ペプチド模倣物の
合理的設計を可能にした（Ｔａｋａｓａｋｉら、１９９７年ＮａｔＢｉｏｔ
ｅｃｈ．１５：１２６６〜１２７０）。ペプチド構造模倣物を設計することにお
いて用いるプライマリアミノ酸配列から合理的に蛋白質の折り畳みを推論するの
に用いることができるコンピューター的技術が、Ｔｅｉｃｈｍａｎｎら１９９９
年ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ．９：３９０〜３９９に概説
されている。コンフォメーショナル的に保存された抗原決定基を構造的にモデル
化ことにおいて用いるコンピュータープログラムの実用的な応用は、Ｓｃｈｗａ
ｒｔｚら１９９９年ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２８７：９８３−９９９．により記
載されている。抗体の抗原決定基のペプチド構造模倣物を合理的に作り出す別の
方法は、断続的な抗体結合部位の線形形状に設計する合成ペプチドの系統的な置
換を含む（Ｒｅｉｎｅｋｅら１９９９年ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ．１７：２７
１〜２７５）。

【００６２】モノクローナル抗体についての特異的な親和性を有し、コンフォメーショナル
的に無傷のＥ２蛋白質の抗原決定基と（それ自身又はＥ１との複合体により）競
合するペプチド又は他の小分子を、ワクチンとして、抗体の非特異的ＨＣＶ決定
基の産生についての診断検定、遺伝子型を定める競合検定等において用いること
ができる。例えば、Ｐｕｎｔｏｒｉｅｒｏら，１９９８年ＥＭＢＯＪ１７：３
５２１〜３５３３；Ｍｅｏｌａら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：
３１６２〜３１７２；Ｔａｆｉら、１９９７年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８：
４９５〜５０２を見よ。

【００６３】コンフォメーショナル的に保存されたＨＣＶ抗原決定基の構造模倣物を効果的
に作り出す別のアプローチは、コンフォメーショナルに依存した抗−ＨＣＶＨ
ＭＡｂｓＮＩ対する抗−イディオタイプ抗体を生成することである。抗−イディ
オタイプ抗体は、本来のウイルスの標的受容体との結合を効果的にブロックする
ことができる（Ｃｈａｎｈら、１９９７年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳ
ｃｉ．８４：３８９１〜３８９５；Ｋｏｐｅｃｋｙら、１９９９年Ｉｎｔｅｒ
ｖｉｒｏｌ．４２：９〜１６及びＸｕｅら、１９９３年ＪＧｅｎＶｉｒｏ
ｌ．７４：７３〜７９）。抗−ＨＣＶＨＭＡｂｓＣＢＨ−２，５，４Ｂ，４
Ｄ，４Ｇ，７，８Ｃ，８Ｅ，９又は１１のどれか１つをのコンフォメーショナル
結合部位を認識している抗−イディオタイプ抗体ならば、Ｅ２結合が標的細胞蛋
白質に結合するのを妨害することにより又はビリオンが標的細胞に付着するのを
妨害することによっても、ウイルス感染を防ぐことができる。

【００６４】ウイルスを標的蛋白質に結合することを阻害することにより、標的細胞とのウ
イルス媒介融合を阻害することにより、及び細胞感染に必要なウイルスエンベロ
ープ蛋白質中のコンフォメーショナルな変化を妨害することにより、対象抗体は
、予防治療又はＨＣＶ感染のために用いられる。用いられる成分は、単一のコン
フォメーショナルな抗原決定基を目的としたモノクローナル抗体、又は１以上の
ウイルスエンベロープ蛋白質上の異なったコンフォメーショナルな抗原決定基を
認識する相補的なモノクローナル抗体の混合物であり、これにより感染プロセス
における複合的な機構を同時に妨げる。

【００６５】体の成分、特にＨＣＶに感染している患者の体の成分については、患者の血液
は、ＨＣＶを捕捉する表面に結合する抗体を含む装置を通って流れる。例えば、
米国特許５、６９８、３９０及び４、６９２、４１１を見よ。その文献において
見出だされる種々の他の装置を、対象の抗体とともに用いて、同様の結果を達成
することができる。体の成分は、生物学的流体、器官（例えば肝臓）等とするこ
とができる。

【００６６】抗体をまた、受動的免疫治療又は他のインビボ治療のために用いることができ
る。例えば、Ｐｉａｚｚｌら、１９９７年ＡｒｃｈＩｎｔｅｒｎＭｅｄ．１
５７：１５３７〜１５４４；Ｆａｒｃｉら、１９９６年ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉ．９３：１５３９４〜１５９３３；ａｌ−Ｈｅｍｓｉら、１９
９６年ＣｌｉｎＴｒｎｓｐｌａｎｔ．１０；６６８−６７５；Ｋｒａｗｃｚ
ｙｎｓｋｉら，１９９６年ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１７３：８２２−８２８で
ある。そのような治療の使用について、抗体を注射や点滴投与のための便利な方
法で調合することができる。種々の媒体（例えばホスフェートバッファード含塩
、含塩等）を用いることができる。一般に、投与される抗体の量は、約０．１〜
５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、Ａｎｄｒｅら、１９９８年Ｊ．Ｉｎｆｅ
ｃｔ．Ｄｉｓ．１７７：８８９〜９７及びＫｒｅｉｌら、１９９８年ＪＶｉ
ｒｏｌｏｇｙ７２：３０７６〜３０８１を見よ。

【００６７】チンパンジーをスクリーニングＨＣＶワクチン及び治療のために受け入れられ
た動物モデルである。例えば、Ｆａｒｃｉら、１９９６年ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉ．９３：１５３９４〜１５３９９；Ｆａｒｃｉら、１９９４
年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ．９１：７７９２〜７７９６；Ｆａ
ｒｃｉら、１９９２年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ．２５８：１３
５〜１４０；Ｋｒａｗｃｚｙｎｓｋｉら、１９９６年ＪＩｎｆｅｃｔＤｉ
ｓ１７３：８２２〜８２８；Ｂａｓｓｅｒｔら、ＪＶｉｒｏｌｏｇｙ７２
：２５８９〜２５９９を見よ。抗体の効果は、定量ＰＣＲ法を使用したＨＣＶ
ＲＮＡの存在及びタイターのモニターにより測定することができる。ウイルス負
荷が首尾よく減少すること又は試験動物若しくは対象における感染の防止は、血
清中のＨＣＶＲＮＡの減少又は消失として反映される。アラニンアミノトラン
スフェラーゼの測定及び（又は）連続穿孔針肝臓生体組織片の使用のような酵素
的試験を用いて効果を試験することができる。ここでいずれかの結果の改善があ
れば、ウイルス−誘導肝損傷の減少を示している。

【００６８】発明の具体的な説明以下の例を、実際の例により、限定することなく提供する。

【００６９】例１ワクシニアウイルスにおける複合遺伝子型由来のＨＣＶＥ２蛋白質の産生ＨＣＶ血清の反応性を分析して、ＨＣＶ−ＨＭＡｂｓ反応性の広さを試験する
ために、ＨＣＶの完全なコード配列をＨＣＶ遺伝子型（１ａ，１ｂ，２ａ及び２
ｂ）のイソ型からクローンして、ＨＣＶ陽性血清からＰＣＲ増幅して、ｐＶＣＴ
Ｅ（Ｗａｒｄら、１９９５年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ
．９２：６７７３〜６７７７）トランスファーベクター（ＨＣＶ遺伝型１ａ，１
ｂ，２ａ及び２ｂに対して各々構成Ｑ１ａ，Ｑ１ｂ，Ｑ２ａ及びＱ２ｂ）を使用
してワクシニアウイルスで発現させた。遺伝子型の選択は、米国のＨＣＶ感染者
中の分散及び頻度に基づいた（Ｍａｈａｎｅｙら、１９９４年Ｈｅｐａｔｏｌ
ｏｇｙ２０：１４０５〜１４１１）。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅ１の
最後の３９個のアミノ酸、Ｅ２／ｐ７及びＮＳ２のＮ末端の９８個のアミノ酸を
発現する断片を増幅することを目的とした。

【００７０】従って、企業（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃ、Ｇｈｅｎｔ，ベルギー）の教示に従
って行われたＩｎｎｏＬｉｐａＨＣＶ遺伝子型分析検定を用いて、ＨＣＶＲＮ
ＡについてＰＣＲ陽性の個人由来の血しょう画分を得て、遺伝子型分類をした。
企業（ＧｅｎｔａＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）の教示に従って
ＰｕｒｅｓｃｒｉｐｔＲＮＡキットを用いてＨＣＶ遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ
及び２ｂで感染した個人由来の血しょう１２５μｌから、ＲＮＡをちょうせいし
た。ＲＮＡペレットをＲＮＡｓｅ（Ｈ₂Ｏを含まないもの）の２５μｌで再懸濁
して、１０μｌを逆転写酵素ＰＣＲにかけた。逆ＨＣＶ特異的プライマーＨＣＶ

【００７１】Ｅ２−Ｒ１５’−ＣＧＣＧＣＡＣｒＡＡＧＴＡｓＧＧｙＡＣＴ
−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）を用いたＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて、逆
転写反応を行った。逆転写は、６０分間４０℃であった。逆転写ｃＤＮＡを５分
感９８℃のインキュベーションにより変性させて、次に４℃まで冷却させて、０
．１５ｍＭｄＮＴＰ、３μｌ１０ＸＰＣＲバッファー、Ａｍｐｌｉｔａｑポリメ
ラーゼ３ユニット及びフォワードプライマーＨＣＶＥ２−Ｆ１５’−ＣＧＣ

【００７２】ＡＴＧＧＣｉＴＧＧＧＡｙＡＴＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１７）を含むＰＣＲミックスの添加を行なった。増幅は、１分間９４℃、３
分間５５℃及び３分間７２℃を３０サイクルであった。次いで、各遺伝子型、イ
ンターナルリバースプライマーＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ（表２、ＳＥＱＩＤ
ＮＯＳ：１８〜２７）又は各遺伝子型及びＩＮＴ−Ｆｏｒｗａｒｄに適したリバ
ースプライマーをクローンニングするのに適当なフォワードプライマーを用いて
、増幅生成物２〜８μｌを、２回目のＰＣＲ増幅にかけた。ＰＣＲ増幅は、１分
間９４℃、２．５分間６０℃及び分間７２℃を３０サイクルであった。適切にサ
イズのバンド（遺伝子型特異的及びＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ及びフォワードプラ
イマーについては〜８２０ヌクレオチド並びにＩＮＴｆｏｒｗａｒｄ及び遺伝
子型特異的リバースプライマーについては〜１０８０）をエチジウム−ブロマイ
ド染色アガロースゲルから削り取り、商業的に入手可能な樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。各バンドの約５０ｎｇを結合させ
、各遺伝子型（表２）に適当なフォワード及びリバースプライマーで再増幅した
。ＰＣＲ増幅は、１分間９４℃、２．５分間５５℃及び２分間７２℃を３０サイ
クルであった。次いで、増幅された生成物をエチジウム−ブロマイド染色アガロ
ースゲルから削り取り、精製し、適当な制限酵素で分解した。この３段階の増幅
処理により、標準的な２段階処理よりもずっと高収率の十分な長さの挿入配列を
得た。次いで、この分解されたＤＮＡを同様に分解されたｐＶＯＴＥ１又はｐＶ
ＯＴＥ２ベクター（Ｗａｒｄら、１９９５年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
ＳｃｉＵＳＡ９２：６７７３〜６７７７）中に結合させる。標準的方法（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈＥ及びＭａｎｉａｔｉｓＴ．Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を用いて、結合させたプラスミドを、コンピテント
Ｅ．ｃｏｌｉ中にトランスフェクションさせ、挿入配列含有クローンを同定して
増殖させた。得られたクローンは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ，１ｂ，２ａ及び２ｂの
十分な長さのＥ２及びｐ７を発現している構成物について企図されたＱ１ａ，Ｑ
１ｂ，Ｑ２ａ及びＱ２ｂであった。

【００７３】

【表２】

【００７４】ワクシニアウイルス構成物Ｑ１ａ及びＱ１ｂによる無傷のＥ２蛋白質の発現が
、過渡発現検定において実証された。野生型ワクシニアウイルス株ＶＷＡ（Ｗａ
ｒｄら、上記）の５プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で、ＣＶ−１細胞を感染さ
せ、次いで企業の教示に従ってＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｐＶＯＴＥで感染させた。細胞を１ｍＭイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で補った培地で培養して、Ｈ
ＣＶ蛋白質（Ｗａｒｄら、上記）の発現を誘導した。トランスフェクション後４
８時間で、ＰＢＳで培養した細胞を洗浄し、その細胞をリシスバッファー（１５
０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５，０．５％デオキシレー
ト、１．０％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０，１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁すること
により回収する。リシスバッファーには、アプロチニン、ロイペプチン、及びペ
プスタチンを、各々最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ，２μｇ／ｍｌ，２μｇ／ｍｌ及
び１μｇ／ｍｌ添加する。回収した３×１０⁶個の細胞ごとについて、リシスバ
ッファーの１００個のミクロフィルターを添加する。次いで、核酸を、１８，０
００×ｇ、４℃で１０分間遠心力によりペレット化し、直接使用するか使用前の
２日以内の間４℃で貯蔵した。

【００７５】ウエスタンブロット分析のためにリシスバッファー抽出物の１０ｍｌを２×Ｓ
ＤＳ試料バッファー（２０％グリセロール、１０％メルカプトエタノール、４．
８％ＳＤＳ，０．１２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ６．８）と組み合わせて、９５℃
で５分感加熱して、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により画分を採取
する（Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５
）。次いで、画分採取された蛋白質をニトルセルロースへ電気泳動させ、ウエス
タンブロットされたＨＣＶＥ２（Ｄｒ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｓｔａｎｆｏｒ
ｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙから得られる）を認識するマウスモノクローナル抗体
（ｍＭａｂ）２Ｃ８で一晩インキュベートした。ｍＭａｂ２Ｃ８をＢＬＯＴＴＯ
（２．５％脱脂乳、２．５％正常なヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉ
ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＴＢＳ中の０．０２％アジ化ナトリウム：
１５０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５）中で１：５００に希
釈した。精製されたＨＣＶ若しくは対照抗体又はＨＭＡｂ含有培地は、ＢＬＯＴ
ＴＯ中で５ｍＭ／ｍｌのＩｇＧに希釈された。ブロットをＴＢＳで３回洗浄し、
結合された抗体を、企業（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈ
ｔ，ＩＬ）の教示に従ってウエスタンブロットキットで検出した。

【００７６】構成物Ｑ１ａ及びＱ２ｂが、ｍＭａｂ２Ｃ８で免疫的反応性のある約７０ｋｄ
ａｌの蛋白質を生成した。予期したように、ｐＶＯＴＥ系（Ｗａｒｄら、１９９
５年ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：６７７３〜６７
７７）で、ＨＣＶＥ２蛋白質の発現が、インデューサーＩＰＴＧの存在に高度
に依存した。発現した蛋白質は、１０の遺伝子型ＨＣＶ血清（データは示さず）
でＩＦＡにより４つの構成物全部から構成された。構成物のいずれも、ＨＣＶ−
陰性血清と反応しなかったし、ＨＣＶ抗血清のいずれもは野生型ワクシニアウイ
ルスに感染した細胞と反応しなかった。

【００７７】クローンされたＥ２の遺伝子型が、４つのクローンの各々由来のＨＣＶＥ２
の中心に由来する１６０ｂｐのインターナル断片（ＨＣＶ−１の２００９〜２１
６８）のＤＮＡ配列により裏付けられた。図２（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：９〜１
２）を見よ、又は完全な挿入配列（構成物Ｑ１ｂ）は、末端染色法及び自動ＤＮ
Ａシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙＣＡ）を用いた。挿入配列は、非フレームシフト又は末端突然変異を有す
る種々のデータベースで入手可能なＨＣＶＥ２の適当な配列に高度に相同的で
ある。図３（ＳＥＱＩＤＮＯＳ：１−８）を見よ。かくして、このことは、
４つの遺伝子型のＨＣＶＥ２がｐＶＯＴＥ構成物により正確に発現されたこと
のよい証拠となっている。次いで、無傷のＨＣＶを産生するプラスミドは、ワク
シニアウイルス株ＶＷＡのヘマグルチニン遺伝子座中に相同な組換による組換体
ワクシニアウイルスを産生するために用いられた（Ｗａｒｄら、上記；Ｍｏｓｓ
及びＥａｒｌ．ＩｎＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ及びＲＢｒｅｎｔ及びＲＫｉｎｇ
ｓｔｏｎ（ｅｄ），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９９４）。組換体ワクシニアウイルスをＢＳＣ−１細
胞の感染を介して同定され、続いてウイルス含有グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼを、ミコフェノール酸、キサンチン及びヒポキサンチンを含有する
媒体で、標準的な方法を用いて選択した（Ｍｏｓｓら、上記）。精製されたウイ
ルスストックを、５〜１０×１０⁸ｐｆｕ／ｍｌの範囲でＢＳＣ−１細胞を用い
て測定された各組換体ウイルス及びタイターについて得た。

【００７８】実施例２潜在ＨＣＶ陽性Ｂ細胞ドナーの抗体スクリーニングＨＣＶはインビトロでは信頼性良く成長しない。ＨＣＶ蛋白質に対して大きい
抗体力価を有する個体を同定するには真核細胞中で発現した組み換えエンベロー
プ蛋白質を使用することが必要である。このようなスクリーニングでは、エンベ
ロープ蛋白質の自然構造を保持する方法を使用して配座エピトープに対する抗体
の検出を可能にする必要がある。ＨＣＶＨＭＡｂの発生に対する血清の同定に
おいては、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）が使用された。このアッセイはアセ
トンで固定した細胞を使用するもので、ヒトＴリンパ球親和性のウイルスエンベ
ロープ蛋白質上の配座エピトープに対する中和性ＨＭＡｂの製造に使用される(H
adlock et al., 1997 J. Virology 7 1:5828-5840)。

【００７９】ＨＣＶに対してはＨＣＶＥ２エンベロープ蛋白質を発現するアセトン固定細
胞が使用された。種々な点でＥ２エンベロープ蛋白質はＳＦ９細胞中で組み換え
バキュロウイルスを使用して、上記のようにＨｅＬａ細胞または市販のベクター
を使用するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で種痘（バクシニア）
ウイルスを使用して発現された(pDisplay, In Vitrogen, Carlsbad, CA)。昆虫
由来の細胞は、真に自然の配座中ではウイルスエンベロープ蛋白質を発現しない
ので(上記のRosa et al, 及びArp et al, 1996 J Virology, 70:7349-7359.)、
種痘ウイルス又はほ乳類細胞表現系の使用が好ましい。与えられた血清で観察さ
れる蛍光は蛍光顕微鏡で肉眼で計数され、ある場合には血清の希釈を増加させた
物を測定して潜在的ドナー血清の終点希釈滴定値を得る。免疫蛍光法により得た結果を確認するために、マイクロ滴定プレートアッセイ
を開発して、血清のＨＣＶＥ２に対する反応性を調べた。ＢｅＬａ細胞の単層
を８０％合流まで成長させ、５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡ及び５ｐｆｕ／細胞の組み
換え種痘ウイルス、又は５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡ単独で感染させた。ＨＣＶ組み
換えウイルスを完全なヘマグルチニン遺伝子を有する野生型種痘ウイルスと混合
して、ヘマグルチニン陰性ウイルスで観察される、種痘ウイルス誘起性の細胞交
感効果(Seki et at 1990, Virology 175:372-384)を最低に押さえた。

【００８０】感染してから２４時間後に細胞を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１
ｍｌの溶解バッファ(150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 0.5%デオキシクロレー
ト, 1.0% ノニデット-P40, 1 mM EDTA, 0.5 mg/ml Pefabloc (Boehringer Mannh
eim, Indianapolis, IN), 2 μg/mlアプロチニン, 2μg/mlロイペプチン, 及び
lμg/mlペプスタチン)中に３０×１０⁶個の細胞を再懸濁することにより抽出物
を調製した。これを１８０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離して核をペレット
化した。抽出物を４℃で保存し、調製から２４時間以内にＥＬＩＺＡに対して使
用した。マイクロ滴定プレート(Maxisorp, Nalge Nunc International, Rochest
er, NY)を、個々のウエルを５００ｎｇの精製したGalanthus nivalis及びレクチ
ン（入手先SIGMA, St. Louis, MO）を１００μｌのＰＢＳ中に溶かしたもので被
覆することにより調製し、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ (TBS plus 0.1% Tween-20
, 2.5%正常ヤギ血清, 2.5% 脱脂乾燥ミルク)で室温１時間培養することによりブ
ロックした。プレートをＴＢＳにより２回洗浄し、次いで、２０μｌの種痘ウイ
ルス感染ＨｅＬａ細胞をＢＬＯＴＴＯに対して１：５の割合で添加した。室温で
１．５時間維持した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、次いで種痘ウイルスＶ
ＷＡで感染したＨｅＬａからの５μｌの可溶性抽出物を補充した９５μｌのＢＬ
ＯＴＴＯ中への各種希釈度のＨＣＶ血清希釈物を添加した。可溶性抽出物の添加
はＧＮＡレクチンにより捕捉される可能性のある種痘ウイルス蛋白質に対する反
応性を抑制する。プレートを１．５時間維持し、ウエルをＴＢＳで３回洗浄し、
ＢＬＯＴＴＯに１／５０００の割合で希釈した１００μｌのアンチヒトアルカリ
−フォスフォターゼ複合物 (Promega, Madison, WI)を添加した。室温で１時間
保持した後、プレートをＴＢＳで４回洗浄し、次いで１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロ
フェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）溶液と共に保持した。基質の成長は３０〜４
５分間行い、次いでマルチウエルプレートリーダ(Du Pont Co,Wilmington, DE)
により４０５ｎｍでウエルの吸光率を測定した。

【００８１】典型的な結果は図４に示す。この実験では５個の遺伝子型ＨＣＶ血清とＨＣＶ
陰性のドナーからの血清が、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶＥ２
蛋白質、及び非組み換え種痘ウイルスＶＷＡで感染した抽出物から捕捉した蛋白
質に対して滴定された。ＨＣＶＥ２に対する最低の反応性は感染しない個体から
の血清（グラフの陰性血清）について観察された。さらにＨＣＶ感染した個体か
らの全ての５種の血清は野生型種痘ウイルスで感染した抽出物から捕捉した蛋白
質（全てのグラフの細い黒線）に対してはほとんど又は全く反応性を示さなかっ
た。ＨＣＶＥ２蛋白質に対する血清反応性の広い変動が試験した５種の血清に次
いで得られ、ＨＣＶ２ａ個体は最も高い全体的な反応性を示した。ＨＣＶ遺伝子
型２ｂで感染した個体からの１２の血清で得られた滴定結果は図５に示されてい
る。このグラフでは、４種の全てのＨＣＶＥ２に対する固有ＯＤ＝０．５を得た
血清希釈物が比較されている（固有ＯＤ＝ＨＣＶＥ２構造体の抽出物でコート
したウエルから得たＯＤ−非組み換え種痘ウイルスの抽出物でコートしたウエル
から得たＯＤ）。

【００８２】ＨＣＶ２ｂ又は２ａＥ２蛋白質に対する反応性はＨＣＶ１ａ又は１ｂＥ２蛋白
質で得られる反応性よりも有意に大きい。これはＨＣＶ遺伝子型２Ｅ２蛋白質が
、ＨＣＶ遺伝子型２ａ又は２ｂで感染した個体におけるＨＣＶエンベロープを認
識する抗体の検出にすぐれていることを示す。またグラフの右側に示された個体
は遺伝子型２ａ又は２ｂＥ２蛋白質中に存在するエピトープに対して特異的なＨ
ＣＶＨＭＡｂの単離のためのより見込みの大きいドナーであろう。

【００８３】ＨＣＶＨＭａｂを生成するのに使用されたドナーは、自己移植中の最初の生成
ＨＣＶスクリーニングアッセイでＨＣＶ血清反応陽性であることが決定された。
献体ユニットのアラニンアミノトランスファーゼ（ＡＬＴ）試験をしたところ、
献体７個のうち６個が正常範囲（＜４５ＩＵ＞となった。一つの献体はＡＬＴ値
４９を持ち、これは通常のカットオフの少し上であった。その他では、ドナーは
肝炎の外的兆候を示さなかった。この個体は後にＲｏｃｈｅａｍｐｌｉｃｏｒ
ＨＣＶアッセイ (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ)を使用したＰＣＲによ
りＨＣＶ陽性であること、ＩｎｎｏＬｉｐａプローブアッセイ (Innogenetics,
Ghent, Belgium)により１ｂ遺伝子型のＨＣＶで感染されていることが確認され
た。この個体はＩＦＡを使用してＨＣＶＥ２を認識できる高い力価の抗体を有
することが見いだされた。結合アッセイの中和についての試験は又このドナーが
高力価の潜在的に中和性の抗体を有することを示した。周辺血液Ｂ細胞はこの個
体から単離され、ＨＣＶ抗体スクリーニングヒトハイブリドーマを生成するのに
使用された（以下に述べる）。

【００８４】実施例３抗原特異性のヒトモノクローナル抗体の製造周辺Ｂ細胞が、Ｔ細胞ロゼット形成法(Foung et al., 1984 J. inimunol. Met
hods 134:35-42参照)によりドナーＴ細胞から生成された。１×１０⁴個のＢ細胞
の個々の培養体をマイクロ滴定プレートにおいてＥＢＶ活性化した。ＨＣＶ特異
性抗体は免疫蛍光アッセイ（ＩＥＡ）で検出した。ＨＣＶＥ２蛋白質を発現す
る組み換え種痘ウイルスで感染した細胞、ＨＣＶＥ２を発現するバキュウロウ
イルス、及び／又はそれらのＤＮＡからＨＣＶＥ２を発現するように加工され
た哺乳動物細胞系が、ＨＴＣでスーパーキュアした２４スポットのスライドに固
定された。細胞は１００％アセトンに室温、１０分で固定された。固定細胞をＥ
ＢＶ活性化Ｂ細胞またはハイブリドーマからの希釈しない培養媒体とともに、３
７℃で３０分培養し、次いでリン酸塩バッファ塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で５
分間洗浄した。スライドを次にエバンスブルー対比色素及びフルオレセインイソ
チオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ヤギ−アンチヒトＩｇＧ(Zymed, South San Fr
ancisco, CA)の０．００１％溶液と共に、３７℃で３０分間保持した。結合した
抗体は蛍光顕微鏡で観察した。

【００８５】５４０培養体のうち、ＨＣＶＥ２に対する有意な免疫蛍光を示す９９ウエル
が検出され（収率約１８％）異なった免疫蛍光パターンを有する３０個のＥＢＶ
活性化培養体はマウス−ヒトヘテロミエローマへの電気融合のために選択された
(Foung et al., 1990 J. Immunol. Methods 134:35-42; Zimmerman, et al., 19
90 J. immunol. Methods 134:43-50; 及び Perkins, et at, 1991 Hum. Antibod
. Hybridomas 2:155-159参照)。１２個の融合体（ある融合体は１個以上の陽性
ＥＢＶ活性化培養体を含んだ）のうち、４５６個の初期ハイブリドーマ培養体は
ＩＦＡによりＨＣＶＥ２に対する反応性を示した。６個の追加の融合は、ウエ
スタンブロットによりＨＣＶＥ２に対して反応性を示した２つの初めのＥＢＶ
活性化培養体で実施した。ウエスタンブロット（及びＩＦＡでも）により反応性
であるＨＣＶＥ２抗体を分泌するハイブリドーマは２つの融合体から単離した
。全体で３０個のヒトハイビルドーマを冷凍した。限定的な希釈クローンを１２
個の親ハイブリドーマから単離し、その１１個のハイブリドーマからのＨＣＶ−
ＨＭＡｂをその後の研究のためにバルクで生成した。８個のＨＣＶＨＭＡｂは
カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１であり、２個はλ軽鎖を有するＩｇＧであった。Ｈ
ＭＡＣＢＨ−９はＩｇＧ１であったが、ラムダ或いはカッパ軽鎖として使用で
きるかどうかは分からない。１０個のＨＣＶＨＭＡｂのＰＣＲ及びＤＮＡ配列
分析により（唯一の例外はＨＭＡｂＣＢＨ−９）全てのＨＭＡｂが明確な重鎖
及び軽鎖を発現することを確認した。融合のパートナー、ＩｇＧサブタイプ、及
びＩＦＡで得られた結果は表３に示す。

【００８６】

【表３】

【００８７】表３の注：表示した遺伝子型のＨＣＶＥ２を発現する組み換え種痘ウイルスに
より感染したＨｅＬａ細胞よるＨＣＶＨＭＡｂのＩＦＡによる反応性。反応性
は＋＋が強反応、＋が陽性、＋／−が弱陽性、−が陰性である。抗体の重鎖及び
軽鎖サブタイプを表示した。Ｒ０４はアイソタイプ適合対照抗体である。抗体は
１０μｇ／ｍｌで試験した。

【００８８】実施例４ＨＣＶＥ２ＥＬＩＳＡＨＣＶＥ２蛋白質は高度にグリコシル化されること、及びGalanthus nivali
s (GNA), Tiriticum vulgaris (WGA),及び Ricinus communisを含む任意のレク
チンにより結合できることが以前の研究で分かっている (Ralston, et al., 199
3, supra; da Silva Cardosa, 1998, supra; 及び Sato et al., 1993 Virology
196:354-357)。従って、２つのレクチンＧＮＡ及びＷＧＡ試薬としての有用性
を、ＨＣＶＥ２蛋白質をマイクロ滴定プレートに捕捉するために評価した。こ
のアッセイの概略は図６に示した。

【００８９】ＨｅＬａ細胞の単層を８０％合流が起きるまで成長させ、５ｐｆｌ／細胞のＶ
ＷＡ及び５ｐｆｌ／細胞の組み換え種痘ウイルス又は５ｐｆｌ／細胞のＶＷＡ単
独に感染させた。ＨＣＶ組み換えウイルスを完全なヘマグルチニン遺伝子を有す
る野生型種痘ウイルスと混合して、ヘマグルチニンマイナスウイルスに観察され
る種痘ウイルス誘導細胞交感効果(Seki et al. 1990; Virology 175:372-384)を
抑制した。感染後２４時間してから、細胞を収集した。抽出物は細胞をＰＢＳで
洗浄し、次いで１ｍｌの溶解バッファ(150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 0.5%
デオキシクロレート, 1.0% ノニデット-P40, 1 mM EDTA, 0.5 mg/ml Pefabloc (
Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 2 μg/mlアプロチニン, 2μg/mlロ
イペプチン, 及び lμg/mlペプスタチン)中に３０×１０⁶個の細胞を再懸濁する
ことにより抽出物を調製した。これを１８０００×ｇで４℃、１０分間遠心分離
して核をペレット化した。抽出物を４℃で保存し、調製から２４時間以内にＥＬ
ＩＺＡに対して使用した。

【００９０】マイクロ滴定プレート(Maxisorp, Nalge Nunc International, Rochester, NY
)を、個々のウエルを５００ｎｇの精製したレクチンを１００μｌのＰＢＳ中に
溶かしたもで被覆することにより調製した。ウエルをＴＢＳ (150 mM NAC1, 20
mM TrisHCL, pH 7.5)で洗浄し、次いで１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ (TBS plus 0.
1% Tween-20, 2.5%正常ヤギ血清, 2.5% 脱脂乾燥ミルク)で室温１時間培養する
ことによりブロックした。プレートをＴＢＳにより２回洗浄し、次いで、２０μ
ｌの種痘ウイルス感染ＨｅＬａ細胞をＢＬＯＴＴＯに対して１：５の割合で添加
した。室温で１．５時間維持した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、次いで１
００ミクロンｌのＢＬＯＴＴＯ中に色々な濃度で標識しない抗体を添加した。プ
レートを１．５時間維持し、ウエルをＴＢＳで３回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯに１／
５０００の割合で希釈した１００μｌのアンチヒトアルカリ−フォスフォターゼ
複合物 (Promega, Madison, WI)を添加した。室温で１時間保持した後、プレー
トをＴＢＳで４回洗浄し、プレートを次いで１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニル
ホスフェート（ＰＮＰＰ）溶液と共に保持した。基質の成長は３０〜４５分間行
い、次いでマルチウエルプレートリーダ(Du Pont Co,Wilmington, DE)により４
０５ｎｍでウエルの吸光率を測定した。

【００９１】組み換えＱ１ａ種痘ウイルスにより生成されたＨＣＶ１ａＥ２をＨＣＶＥ２
源として使用し、また６個のＨＣＶＨＭＡｂが検出試薬として使用した（図７
）。いずれかのレクチンに捕捉された蛋白質の対照モノクローナルに対する反応
性は観察されず、ＷＧＡにより捕捉された蛋白質に対する全てのＨＣＶＨＭＡ
ｂの反応性は背景レベルに過ぎなかった。これに対して、ＨＣＶＨＭＡｂＣ
ＢＨ−２，ＣＢＨ−２，ＣＢＨ−５，ＣＢＨ−７は全て、ＧＮＡに捕捉された蛋
白質に対して強い反応性を示した。さらに、ＨＣＶＨＭＡｂＣＢＨ−１７，
ＣＢＨ−４ＤがＧＮＡに捕捉された蛋白質に対して低い反応性を示した。ＨＣＶ
ＨＭＡｂＣＢＨ−１１はＧＮＡに捕捉された蛋白質に反応しなかった。これ
はＨＣＶＨＭＡｂＣＢＨ−１１がこの特定のＥ２を認識しないことを示して
いる。しかしながら、ＧＮＡ捕捉ＥＬＩＳＡはＨＭＡｂのＨＣＶＥ２に対する
反応性を分析するのに非常に有効であることを示している。従って、ＨＣＶＨ
ＭＡｂの反応性を、異なった遺伝子型のＥ２蛋白質を発現する組み換え種痘ウイ
ルスにより調べた（図８）。全ての１１個のＨＭＡｂは２以上のＨＣＶＥ２構
造体に結合したが、対照ＨＭＡｂについてはシグナルは得られなかった（Ｒ０４
で表したもの）。４種全てのＥ２蛋白質に対して最も高い親和性及び反応性を有
するＨＭＡｂはＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃであり、次にＣＢＨ−５，−２及び−
８Ｅであった。ＨＭＡｂＣＢＨ−４０、ＣＢＨ−９は遺伝子型２ａ，２ｂの蛋
白質ＨＣＶＥ２蛋白質に対して充分に大きい反応性を示したが、ＨＭＡｂＣ
ＢＨ−１１はＱ１ａ蛋白質に対して目立って低い反応性を示した。ＨＭＡｂＣ
ＢＨ−１７及びより少ない程度であるがＣＢＨ−４Ｄ及びＣＢＨ−４Ｂは、遺伝
子型２ａ又は２ｂのＥ２蛋白質に比較して、遺伝子型１ａまたは１ｂのＥ２蛋白
質に対して優先的な結合を示した。これらの変動は異なったＥ２蛋白質の捕捉効
率が異なる事によるのでないことは、異なったＥ２蛋白質で得られる最大シグナ
ルが全ての実験で非常に似ていることから分かる。これらの結果は同じ構造体で
のＩＦＡにおいて得られた結果と首尾一貫している（上記の表３参照）。７個の
抗体ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−４０、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢ
Ｈ−８Ｂ、及びＣＢＨ−９は全てのテストしたＨＣＶＥ２蛋白質構造体とかな
り大きい反応性を示した。

【００９２】全てのテストしたＨＭＡｂが少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型と反応性を有す
ることは、ＨＣＶＨＭＡｂにより認識されるエピトープが高度に保存されるこ
とを示している（図９）。ＨＭＡｂにより認識されるエピトープが配座している
のか線状であるのかを決定することには興味がある。これを自然及び変性ＨＣＶ
Ｅ２蛋白質の両者に対するＨＣＶＨＭＡｂの反応性を比較することにより直
接調べた。予想されたように全てのＨＣＶＨＭＡｂはＨＣＶＥ２蛋白質を認
識した。ＨＣＶＥ２を０．５％ＳＤＳ及び５ｍＭのジチオスレイトールの存在
下に５６℃に加熱することにより、１１個のＨＭＡｂのうち１０個の反応性を完
全に喪失した。唯一の例外はＨＭＡｂＣＢＨ−１７であり、変性したＥ２蛋白
質に対する反応性を９０％保持した。ウエスタンブロット分析によると、ＨＭＡ
ｂＣＢＨ−１７はｖＱ１ａ及びｖＱ１ｂで発現されるＨＣＶエンベロープ蛋白
質に対して弱い反応性を示すことが確認された。残りの１０のＨＭＡｂのいずれ
に対してもウエスタンブロット試験したｖＱ１ａに対する反応性はなかった。このように、１１個のＨＣＶＨＭＡｂｓは配座エピトープを認識する。

【００９３】最後に、競合分析を使用してどのＨＣＶＨＭＡｂｓが同一の（又は非常に近
接した）エピトープを認識するかを決定した。この方法の概略は図１０に示され
ている。ＨＣＶＨＭＡｂｓＣＢＨ−５、ＣＢＨ−２，又はＣＢＨ−７を標準的
な方法でビオチニル化し、選択したＨＭＡｂの過剰な存在下にＨＣＶ型１及び型
２Ｅ２蛋白質へのビオチニル化ＨＭＡｂの反応性を、抗体を添加しない試料に見
られる反応性に対比した。図１１に示したように、対照ＨＭＡｂＲ０４とＨＣ
ＶＨＭＡｂｓＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ、−４０、−７、−９、及び−１７は全て実
質的にＨＭＡｂＣＢＨ−５の結合の抑制を示さなかった。これに対して、ＨＭＡ
ｂＣＢＨ−ＣＢＨ−５はそれ自体の過剰により８５％抑制され、ＨＭＡｂＣＢＨ
−８Ｅにより約７５％抑制された。ＨＭＡｂＣＢＨ−ＣＢＨ−５はＨＭＡｂＣ
ＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１によりより変動的に抑制され、ＨＭＡｂＣＢＨ−
２により約５０％まで抑制された。特に、ＨＭＡｂＣＢＨ−２に見られる競合
はあまりはっきりせず、ＣＢＨ−２が減少した親和性でＣＢＨ−５と同一のエピ
トープを認識するか、或いは別個の空間的に近接したエピトープを認識するかど
うかは分からない。

【００９４】ＨＭＡｂＣＢＨ−２に対する抗体の競合の分析は（図１２）、ＨＭＡｂＣＢ
Ｈ−２の結合がそれ自身及びＨＭＡｂＣＢＨ−５、−８Ｃ、−８Ｅにより７５％
以上まで抑制されることを示した。これに対して、ＣＢＨ−７はＱ１ａ蛋白質
に対する結合を６０％抑制し、ＣＢＨ−１１はＱ１ｂ及びＱ２ｂ蛋白質に対する
結合のみ抑制した。ＨＭＡｂＣＢＨ−５の場合と同様に、ＨＭＡｂＣＢＨ−
４０、４Ｄ、４Ｂ、９、又は１７では競合が観察されなかった。ＨＭＡｂＣＢＨ
−７での競合分析では（図１３）、ＣＢＨ−７の結合を充分に抑制するのはそれ
自身であることが示された。これらのデータは広い反応性を有するＨＭＡｂのう
ち、ＣＢＨ−２、−５、−１１、及び−７の全てが別個のエピトープを認識する
ことを示す。ＣＢＨ−２，−８Ｃ、−８Ｅが同一又は２つの別個のエピトープを
認識する可能性が残る。さらに、ＣＢＨ−９及び−４０が同一又は２つの別個の
エピトープを認識する可能性があるが、それらはＣＢＨ−２，−５等と競合しな
いことから、他の広範囲に反応性のＨＭＡｂと同じエピトープを認識しないこと
が確かである。このように、最低限、広範囲に反応性のＨＭＡｂは５つの別個の
エピトープを認識する。

【００９５】実施例５結合中和アッセイにおけるＨＭＡｂと同じエピトープ活性の評価結合中和（ＮＯＢ）アッセイは、抗体又は血清が、ＨＣＶＥ２蛋白質がヒト
Ｔ細胞系（ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ）上で発現される推定レセプタに対する結合を
抑制するかどうかを試験する。結合中和アッセイは上記のＲｏｓａ他、Ｉｓｈｉ
ｉ他に記載された方法とＨＣＶＥ２蛋白質を使用して行った。簡単に述べると
、哺乳動物細胞中で生産されるＨＣＶＥ２１ａ蛋白質（上記Ｒｏｓａ他）の
１μｇを、抗体の血清希釈物（０．１〜３００μｇ／ｍｌ）と混合し、３７℃で
３０分間培養した。Ｍｏｌｔ−４細胞（１０⁵）を混合物に添加し、氷上で１時
間保持した。水洗後、Ｍｏｌｔ−４細胞に結合したＨＣＶＥ２の量を流動細胞
計（上記Ｒｏｓａ他）により評価した。結合中和滴定はＥ２結合の５０％中和を
示す血清希釈として定義される

【００９６】ＨＣＶＥ２が目標細胞を発現するＣＤ８１に対する結合を抑制するＨＭＡｂの
能力は、上記Ｒｏｓａ他の中和結合アッセイで評価した。ＨＭＡｂＣＢＨ−４
Ｄ、４Ｂ、４０、１７は２５μｇ／ｍｌの濃度では目標細胞に対するＥ２蛋白質
の結合を遮断しなかった。１０μｇ／ｍｌの濃度でＨＭＡｂＣＢＨ−２、５、
７、８Ｃ、８Ｂ及び１１はＥ２の結合を５０％の抑制を達成した（表４）。

【００９７】実施例６ＨＣＶＨＭＡｂのＥ２−ＣＤ８１結合に及ぼす効果（マイクロ滴定プレート
アッセイ）最近、ヒトテトラスパニン蛋白質ＣＤ８１はＨＣＶに対する潜在的なレセプタ
であることが分かり、結合中和（ＮＯＢ）アッセイにおいてＨＣＶＥ２に対す
る細胞標的蛋白質として使用される。ＣＤ８１のＨＣＶＥ２に対する結合部位
は、前に細胞外ループ２又はＬＥＬとして言及した大きい細胞外ループCD81-LEL
に局在化されている(Pileri, et aL, 1998 Science 282:938-941)。Ｅ２とＬＥ
Ｌの混同を避けるために、この領域をLEL(Large Extracellular Loop)と呼ぶ。
ヒトＣＤ８１のＬＥＬ（ＣＤ８１−ＬＥＬ）はｐＧＥＸベクタ(OST-2T)を用いる
グルタチオン−Ｓ−トランスファーゼによる融合蛋白質として発現された。蛋白
質の構造と精製はFlint et al, 1999 J Virology 73:6235-6244に記載されてい
る。このＣＤ８１−ＬＥＬ−ＧＳＴ融合蛋白質はどのＨＭＡｂがＣＤ８１−ＨＣ
ＶＥ２複合体を認識できるのかを決定するのに使用された。このアッセイの概
略は図１４に記載されている。マイクロ滴定プレートウェルをＰＢＳ注に希釈し
た１００ｎｇの精製ＣＤ８１−ＬＥＬ−ＧＳＴ又は非組み換えＯＳＴでコートし
た。３７℃で２時間洗浄した後、ウェルをＴＢＳで１回洗浄し、次いで１５０μ
ｌのＢＬＯＴＴＯと共に室温で１時間培養することによりブロックした。種痘ウ
イルスを発現するＨＣＶＥ２で感染させたＢＳＣ１細胞からの抽出物を、コー
トしたプレート中で１００μｌのＢＬＯＴＴＯの試験抗体と結合させ、４℃でゆ
っくりと攪拌しながら一夜保持した。ウエルを次にＴＢＳで３回洗浄し、次いで
適当なアルカリ−リン酸塩と複合した二次抗体及び実施例４で述べたＰＮＰＰ基
質を加えた。

【００９８】複数の遺伝子型のＥ２蛋白質を使用したＮＯＢの結果を確認するために、ＨＣ
ＶＨＭＡｂがＨＣＶＥ２のＣＤ８１との相互作用を抑制することができるか
どうかを調べた。マイクロ滴定プレートをまず精製ＣＤ８１−ＬＥＬグルタチオ
ン−Ｓ−トランスファーゼ融合蛋白質でコートし、それに過剰なＨＣＶＥ２を
ＨＣＶＨＭＡｂの存在下に添加した。ＨＣＶＥ２はヒトＣＤ８１に特異的に
結合し、他のほとんどの霊長類のＣＤ８１には結合しないので（上記Ｒｏｓａ他
）、内在ＣＤ８１の影響を最小にするために、Ｅ２蛋白質をグリーモンキーの腎
臓の細胞系ＢＳＣ−１中で生成した。アンチＨＣＶ及び対照抗体は生成非組み換
えグルタチオン−Ｓ−トランスファーゼにより捕捉されなかった。また、ＨＣＶ
及び対照抗体は、野生型種痘ウイルスで感染したＢＳＣ−１の抽出物と結合する
ときにＣＤ８１により捕捉されなかった（データは示さない）。

【００９９】ＮＯＢ陰性のＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇは、試験した４種全ての遺伝子型のＥ２
蛋白質に対して同程度にＣＤ８１被覆プレートに捕捉された。ＨＭＡｂＣＢＨ
−４Ｂ、４Ｄ、１７はＨＣＶ１ａ又は１ｂＥ２蛋白質によりＣＤ８１被覆プレ
ートに異なった程度に捕捉された。これはＧＮＡに捕捉されたＥ２蛋白質に対す
るＨＭＡｂの反応性に一致している（図１５）。４つのＮＯＢ陰性ＨＭＡｂの滴
定分析は、これら全てが濃度１〜１０μｇ／ｍｌで５０％の最大結合度でＨＣＶ
１ｂＥ２に結合することを示した（表４）。ＮＯＢ陽性の抗体ＣＢＨ−２、５
、７、８Ｃ、８Ｅ、及び１１は、４つの遺伝子型のどのＥ２蛋白質についてもＣ
Ｄ８１により捕捉されなかった（図１５）。同様な結果はＨＣＶ抗体が、ＨＣＶ
１ｂＥ２蛋白質が既にＣＤ８１−ＬＥＬに結合しているウエルに添加されたと
きに得られた（データは挙げない）。これは結果がＥ２蛋白質とＨＣＶＨＭＡ
ｂの各添加と互いに独立であることを示す。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、７の滴定分
析ではそれらがＧＮＡ捕捉Ｅ２と強い反応性を有するがＣＤ８１に結合したＥ２
には陰性であることを示したが、これはこれらの抗体が２５μｇ／ｍｌまでの濃
度ではＣＤ８１−ＬＥＬ−Ｅ２複合体に結合しないことを示した（データは示さ
ない）。このように６つのＨＭＡｂは複数の遺伝子型のＨＣＶＥ２の、ＣＤ８
１−ＬＥＬに対する結合を抑制した。

【０１００】

【表４】

【０１０１】表４の注ａ：ＮＯＢアッセイにおけるＨＭＡｂの反応性は、Ｅ２蛋白質の、Ｔ細
胞を発現するＣＤ８１への結合を５０％抑制する抗体の量で表す。抗体は０．１
−３００μｇ／ｍｌの範囲で使用した。（−）は陰性。注ｂ：ＮＯＢアッセイにおけるＨＭＡｂの反応性は、ＣＤ８１−ＬＥＬにより捕
捉されたＧＮＡまたはＥ２への最大結合の５０％を生じる抗体濃度で表す。（−
）は陰性。

【０１０２】実施例７ＨＣＶビリオンのＣＤ８１への結合に及ぼすＨＣＶＨＭＡｂの影響ビリオン−ＣＤ８１結合アッセイを前述のように行った(Pileri, et at, 1998
Science 282:938-941)。簡単に述べると、６．３５ｍｍのポリスチレンビーズ
(Pierce, Rockford IL)をクエン酸塩バッファｐＨ４．０中の５０μｇ／ｍｌの
精製組み換えＬＥＸ−ＴＲＸ蛋白質（上記Pileri, et al）でコートし、一夜室
温に保持し、次いでＴＥＮバッファ（50mM Tris.Cl pH 8中2% BSA, 1mM EDTA, 1
00mM NaC1 ）で１時間ブロックした。５×１０⁵のＨＣＶＲＮＡゲノムを含有
する血清を、１０μｇの精製モノクローナル抗体の２００μｌのＴＥＮバッファ
で希釈し、ついで、４℃で１時間培養した。希釈した血清は次に被覆したビーズ
に添加し、２７℃で１〜２時間培養した。上澄みを除去した後、各ビーズを１５
ｍｌのＴＥＮで５回洗浄し、結合ウイルスを市販のキット(Qiagen, Basel, Swit
zerland)を使用して抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＲＮＡコピー数の
測定を、Perkin Elmer ABI 7700配列測定装置（上記Pileri他参照）を使用して
行った。

【０１０３】ＣＤ８１への組み換えＥ２の結合をブロックした数種のＨＣＶＨＭＡｂを、
ＣＤ８１へのＨＣＶビリオン（脂質バイレーヤ中で発現されるＥ１及びＥ２蛋白
質を含む）の結合に干渉する能力を調べるために試験した。インビトロでのＨＣ
Ｖ培養アッセイ手段がなかったので、エンベロープ関連のＨＣＶＲＮＡのＣＤ
８１への結合を示すために開発されたＰＣＲアッセイを利用した（上記Pileri,
et al）。このアッセイの概略は図１６に示した。簡単に説明すると、ＣＤ８１
の主細胞外ループがポリスチレンビーズに固着され、既知量のＨＣＶ１ａＲＮＡ
分子を含有している感染性血漿と共に培養する。ウイルスに会合しているビーズ
を洗浄した後、定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。見かけの活性が最高の４つの
ＮＯＢ陽性ＨＭＡｂであるCBH-2, CBH-5, CBH-7,及び CBH-11を評価した。対照
抗体又はＮＯＢ陽性抗体CBH-7または CBH-11にはウイルス結合の抑制は観察さ
れなかった。これに対して１０μｇ／ｍｌのＨＭＡｂＣＢＨ−２及びＣＢＨ
−５はＨＣＶのＣＤ８１への結合を抑制した（図１７）。

【０１０４】これらの結果は、これらの抗体がＨＣＶＥ２ビリオンに結合しうること、また
インビボで中和効果を有することを示す。上記のアッセイで得られた全ての結果を総合すると、ここに記載した１１のＨ
ＭＡｂの予備的なエピトープ評価を行うことができる。これは表５に示した。Ｈ
ＭＡｂＣＢＨ−８Ｃにより認識されるエピトープは、４つ全てのＨＣＶＥ２
遺伝子型についてＣＢＨ−８Ｃで得られる非常に類似した滴定結果のため、ＨＭ
ＡｂＣＢＨ−２及び／又はＣＢＨ−８Ｅにより認識されるエピトープとは区別
される。なぜならCBH-2と CBH-8Eは遺伝子型２ａ、１ａで得られる値よりも１ｂ
、２ｂで得られる値の方が若干低い反応性を繰り返して示すからである。他の区
別し得るエピトープの評価は得られた結果から非常に分かりやすい。しかし、追
加実験を行えばCBH 40と CBH 9及び／又はＣＢＨ−８Ｅ及びＣＢＨ−５はＨＣＶ
２により認識されるエピトープを分離するのに役立つであろう。

【０１０５】

【表５】

【０１０６】表５の注１：ＣＯＮＦ＝配座エピトープの認識、ＬＩＮ＝線状エピトープの認識注２：ＮＯＢアッセイにおいて得られＣＤ８１−Ｅ２結合注３：−／＋は相互的な部分競合が存在しないことを示す。ＣＢＨ−２は
ＣＢＨ−５のＨＣＶ１ａまたは１ｂＥ２への結合を約５０％のレベルで抑制する
。ＣＢＨ−５は遺伝子型１ａ，１ｂ、２ａ、２ｂに対して約８０％のレベルでＣ
ＢＨ−２のＨＣＶＥ２への結合を抑制する。

【０１０７】実施例８ＨＣＶ中和抗体のに対するマイクロ滴定プレートアッセイそれぞれの個体のＨＣＶ感染の処理と管理を助けるために、それらがアンチウ
イルス免疫反応の潜在的能力を知ることが望ましい。中和性抗体滴定値を測定で
きる数種のアッセイ法、例えば上に述べた結合中和アッセイ、チンパンジーの接
種前のエックスビボ中和が記載されたが、これらのアッセイ法は全て面倒であり
、多数の試料を試験するには適していない。従って、ここではヒト血清における
抗体のような結合を中和する程度を決定するため、抑制アッセイにおける複数遺
伝型のＥ２蛋白質を有するＥ２−ＣＤ８１複合体に等価な反応性を示すＨＭＡｂ
ＣＢＨ４Ｇを使用した。マイクロ滴定プレートの個々のウエルを５００ｎｇの
精製ＯＮＡレクチン又は１００ｎｇのGST-CD81-LEL融合蛋白質でコートし、３７
℃で１時間保持した。次にウエルをＴＢＳで一回洗浄し、室温において１５０μ
ｌのBLOTTOでブロックした。ウエルを一回洗浄し、各種の希釈度の試験血清又は
モノクローナル抗体を容積５０μｌの適当なウエルに加えた。同時に抽出物を含
有する１５μｌのHCV E2蛋白質を、各ウエルあたり５０μｌのBLOTTO中４μｇ／
ｍｌのビオチニル化HMAb CBH-40と合体させた。４℃で２０分間の保持の後、E2
CBH-40混合物を既に試験抗体を収容しているマイクロ滴定プレートに加えた。次
にプレート全体をゆっくりと攪拌しながら４℃で一夜保持した。次の朝、ウエル
の内容物を捨て、ウエルをＴＢＳで３回洗浄した。次に１００μｌのストレバビ
ジンと複合したアルカリホスホターゼ(Amersham-Pharmacia, Piscataway NJ) を
ＰＢＳに１／１０００の割合で希釈したもの及び０．１％Tween-20 (Sigma, St
Louis MO)を加えた。プレートを次に室温で１時間保持し、その後、ウエルを４
回ＴＢＳで洗浄し、そして実施例２，４のようにしてＰＢＰＰ基質と共に培養す
ることに検出したビオチニル化抗体を結合した。

【０１０８】１１個のＨＣＶＨＭＡｂを試験抗体として使用した時に結果を図１８に示す
。この実験では２０ｍｇ／ｍｌのＨＣＶＨＭＡｂが、ＨＣＶ遺伝子型１ａＥ２
蛋白質のヒトＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を抑制する能力を評価した。ＣＤ８１−
ＬＥＬでコートしてウエルに観察される結合の抑制は、同じ抗体がＯＮＡ−レシ
チンでコートしたウエルについて観察される結果と比較される。ＯＮＡでコート
してウエル中のＥ２の結合の抑制は、ＣＢＨ−４０検出抗体と競合抗体との間の
相互作用に抑制を反映するものである。ＣＤ８１−ＬＥＬでコートしたウエル中
で特に観察される抑制は、ＣＤ８１−ＬＥＬとＥ２蛋白質の間の相互作用の抑制
を反映している。１１個のＨＣＶＨＭＡｂ又は対照抗体Ｒ０４のどれもＯＮＡ
により捕捉されたＥ２へのＣＢＨ−４Ｇの結合を５０％以上抑制しなかった。こ
れに対して、前に結合の中和が陽性であることを示した６個のＨＣＶＨＭＡｂ
のうち５個がＣＢＨ−４Ｇ−Ｅ２複合体のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を強く抑制
した。唯一の例外はＨＭＡｂＣＢＨ−１１であり、このものは１ａＥ２蛋白質
のＱ１ａ単離体を効率的に認識しない。 CD81-LEL-E2複合体を認識するＨＭＡｂ
ＣＢＨ−４Ｂ、４Ｄ、９、及び１７は、全てＣＢＨ−４Ｇ結合Ｅ２のＣＤ８１−
ＬＥＬへの結合に最小の影響しか与えなかった。従って、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ
は、ＨＣＶＥ２のＣＤ８１への相互作用を抑制することができ或いはできない
抗体の間の識別を有効になし得る。

【０１０９】従って、この実験は次にＨＣＶＨＭＡｂの代わりにＨＣＶ及び対照血清を使
用して反復された（図１９）。６個の遺伝子型のＨＣＶ血清（３個の遺伝子型１
ａ血清及び３個の遺伝子型２ｂ血清）と、２個のＨＣＶ陰性の血清が、希釈率１
／１０００で相同Ｅ２蛋白質に対して試験された。ＨＣＶＨＭＡｂで見られた
ように、ＯＮＡへのＨＣＶＥ２の結合はほとんど又は全然抑制されなかった。
陰性血清のいずれも有意にはＨＣＶＥ２のＣＤ８１−ＬＥＬへの結合に影響し
なかった。これに対して、ＨＣＶ血清については広範囲なＨＣＶＥ２のＣＤ８
１−ＬＥＬへの広範囲な結合の抑制が見られた。このようにして、ＨＭＡｂＣＢ
Ｈ−４０は、マイクロ滴定プレート形式で、推定レセプタＣＤ８１−ＬＥＬへの
ＨＣＶ結合を抑制できる抗体の量を定量するに使用できる。

【０１１０】上の結果からこれらのモノクローナル抗体はＨＣＶを有する患者の診断治療の
開発における重要な貢献であることが明らかである。遺伝子型１及び２を認識す
るため、ＨＣＶアッセイは誤って陰性とする可能性を減らし、ＨＣＶ感染を識別
するため抗体は少数しか要しない。これら抗体は広範囲の利用があるであろう。
加えてこれら抗体は遺伝子型の識別に使用でき、ビリオン粒子の単離に利用でき
、またミモトープの識別に使用できる。それらはヒト関連であるので、それらは
治療又は予防医学的に使用でき、ウイルスに曝され或いは治療中の人を保護し、
患者にウイルスが負荷されることを効果的に減じる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ケニスジー．ハドロックアメリカ合衆国 94116 カリフォルニア、サンフランシスコ、サンティアゴストリート 345 Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA33 CA03 GA03 HA15 4B063 QA18 QQ02 QQ04 QR48 QR51 QS33 4B064 AG27 CA20 CC24 4B065 AA90Y AB04 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA02 CA40 DA76 DA86 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一つのＨＣＶ遺伝子型からのエンベロープ蛋白質の配座エピ
トープに結合する個別のモノクローナル抗体を含有する複数のモノクローナル抗
体が使用されるＨＣＶ感染の検出方法において、一種以上のＨＣＶ遺伝子型から
のエンベロープ蛋白質の配座エピトープに結合する個体モノクローナル抗体が使
用されることを特徴とするＨＣＶ感染の検出方法。
【請求項２】エンベロープ蛋白質の少なくとも一つの配座エピトープに結
合する個別のモノクローナル抗体を含有する複数のモノクローナル抗体が使用さ
れるＨＣＶ感染の検出方法において、ＨＣＶの型１及び型２のエピトープに結合
する個体モノクローナル抗体が使用されることを特徴とするＨＣＶ感染の検出方
法。
【請求項３】ＣＢＨ−２，ＣＢＨ−４Ｄ、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｇ、
ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−９，ＣＢＨ−
１１，及びＣＢＨ−１７なる群より選択されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】請求項３のヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドー
マ。
【請求項５】請求項４のヒトモノクローナル抗体と同一の抗原特異性を有
するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ。
【請求項６】ＨＣＶＥ２２ａのアミノ酸配列を有し且つＨＣＶＥ１を
有さない精製された配座保存の蛋白質。
【請求項７】ＨＣＶＥ２２ｂのアミノ酸配列を有し且つＨＣＶＥ１を
有さない精製された配座保存の蛋白質。
【請求項８】被検動物（ｓｕｂｊｅｃｔ）のＨＣＶ２型に対する血清陽性
を検出する方法において、ＨＣＶＥ１のアミノ酸が存在しないＨＣＶＥ２の
２ａ又は２ｂの少なくとも一つのアミノ酸配列を有する、不動化され精製され配
座が保存された蛋白質に、被検動物から得た血液試料を結合し、前記血液試料中の抗体を前記蛋白質に結合するに充分な時間接触させ、結合し
なかった抗体を洗い流し、次いで前記蛋白出に結合した抗体の存在を検出してＨＣＶ血清陽性の指標とする方法
。
【請求項９】体成分中のウイルス負荷を減少する方法において、前記体成
分を前記ウイルスにより規定される配座エピトープに結合する組成物と接触させ
、それにより前記組成物を前記配座エピトープに結合して複合体を形成し、次いで前記複合体を体成分から除去することよりなる体成分中のウイルス負荷
を減少する方法。
【請求項１０】ウイルスに関連するウイルスエンベロープ蛋白質がターゲ
ット分子に結合するのを抑制する方法であって、前記ウイルスエンベロープ蛋白
質を前記ウイルスエンベロープ蛋白質により規定される１つ以上の配座エピトー
プに結合する一種以上の組成物に接触させることよりなる、ウイルスエンベロー
プ蛋白質がターゲット分子に結合するのを抑制する方法。
【請求項１１】ＨＣＶＥ２ウイルスエンベロープ蛋白質がターゲット分
子に結合するのを抑制する方法であって、前記ＨＣＶＥ２ウイルスエンベロー
プ蛋白質を前記ＨＣＶＥ２ウイルスエンベロープ蛋白質内の配座の保存された
エピトープに結合する一種以上の組成物に接触させることよりなる、ウイルスエ
ンベロープ蛋白質がターゲット分子に結合するのを抑制する方法。
【請求項１２】配座ウイルスエピトープを認識するアンチウイルス抗体の
相補決定領域に結合する小分子よりなる組成物。
【請求項１３】配座ウイルスエピトープがＨＣＶＥ２エンベロープ蛋白
質でる請求項１２の組成物。
【請求項１４】前記アンチウイルス抗体が、ＣＢＨ−２，ＣＢＨ−４Ｄ、
ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ
−８Ｅ、ＣＢＨ−９，ＣＢＨ−１１，及びＣＢＨ−１７なる群より選択されたヒ
トモノクローナル抗体である請求項１２の組成物。
【請求項１５】前記配座ウイルスエピトープはＣＤ８１に結合するもので
ある請求項１２の組成物。
【請求項１６】前記分子は蛋白質である請求項１２の組成物。
【請求項１７】前記小分子は無機分子である請求項１２の組成物。
【請求項１８】前記小分子はアンチイデオタイプ抗体である請求項１２の
組成物。
【請求項１９】前記アンチイデオタイプ抗体は、ＣＢＨ−２，ＣＢＨ−４
Ｄ、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、Ｃ
ＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−９，ＣＢＨ−１１なる群より選択された抗体結合部位を認
識するものである請求項１８の組成物。
【請求項２０】ＨＣＶビリオンがターゲット細胞レセプタに結合するのを
抑制する方法であって、前記ＨＣＶビリオンを前記ＨＣＶビリオンにより規定さ
れる配座エピトープを認識するアンチウイルス抗体の相補的決定領域に結合する
小分子と接触させることよりなる、ＨＣＶビリオンがターゲットレセプタに結合
するのを抑制する方法。
【請求項２１】ウイルスエンベロープ蛋白質が媒介するターゲット細胞へ
のウイルス融合を抑制する方法において、ウイルスエンベロープ蛋白質を該ウイ
ルスエンベロープ蛋白質により規定される配座エピトープを認識するアンチウイ
ルス抗体の相補的決定領域に結合する小分子と接触させることよりなる、ウイル
スエンベロープ蛋白質が媒介するターゲット細胞へのウイルス融合を抑制する方
法。
【請求項２２】体成分試料中のアンチウイルス抗体を定量測定するための
方法において、ラベルしたウイルスエンベロープ蛋白質を、該ラベルしたウイル
スエンベロープ蛋白質にも結合するターゲット分子の存在下に前記体成分試料に
接触させ、次いで、前記ターゲット分子に結合した前記レベルしたウイルスエン
ベロープ蛋白質の量を測定することよりなる、少量のラベルされたウイルスエン
ベロープ蛋白質が、前記体成分使用中の多量のアンチウイルス抗体を指示するよ
うにした、測定方法。
【請求項２３】ウイルスエンベロープ蛋白質の線形エピトープを認識する
モノクローナルアンチ抗体が使用される、ウイルスエンベロープ蛋白質が媒介す
るターゲット細胞へのウイルス融合を抑制する方法において、該ウイルスエンベ
ロープ蛋白質を認識する一種以上のモノクローナルアンチ抗体が使用されること
を特徴とするターゲット細胞へのウイルス融合を抑制する方法。
【請求項２４】完全なビリオンの線形エピトープを認識するモノクローナ
ルアンチ抗体が使用される、該ビリオンがターゲット細胞レセプタへの結合を抑
制する方法において、該ビリオンを認識する一種以上のモノクローナルアンチ抗
体が使用されることを特徴とする完全なビリオンがターゲット細胞レセプタへ結
合するのを抑制する方法。
【請求項２５】ＨＣＶＥ１及びＥ２エンベロープ蛋白質上の線形エピト
ープを認識するモノクローナル抗体が使用される、ターゲット細胞に結合するに
必要なＨＣＶＥ１及びＥ２エンベロープにおける配座変化を抑制する方法にお
いて、前記エンベロープ蛋白質上の線形エピトープを認識するモノクローナル抗
体が使用される、配座変化を抑制する方法。
【請求項２６】ビリオン上の線形エピトープを認識するモノクローナル抗
体が使用される、ＨＣＶビリオンの剥脱を抑制する方法において、前記ビリオン
上の配座エピトープを認識を認識するモノクローナル抗体を使用することを特徴
とするＨＣＶビリオンの剥脱を抑制する方法。