JP2002526772A - Diagnostic assays for matrix metalloproteinase 9 and uses thereof - Google Patents
Diagnostic assays for matrix metalloproteinase 9 and uses thereofInfo
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、ヒト血清および血漿を含む生物学的サンプルにおいてＭＭＰ−９の全ての型（ＴＩＭＰと複合体化される型および「遊離」の非複合体化型の両方）を検出する改良免疫アッセイを行う。本発明者らは、本免疫アッセイの使用が、以前のアッセイを用いるよりずっと高い程度での検出および定量が可能であるという驚くべき発見をした。本アッセイは、好ましくは、互いに競合しない（すなわち、別個のエピトープに結合する）ＭＭＰ−９に対する２つの抗体を使用する捕捉アッセイである。結合されるこのエピトープは、複合体化ＭＭＰ−９ならびに遊離のＭＭＰ−９の両方にさらされなければならない。 (57) [Summary] The present invention provides an improved immunoassay for detecting all forms of MMP-9 (both forms complexed with TIMP and "free" uncomplexed form) in biological samples including human serum and plasma. I do. We have made the surprising discovery that the use of this immunoassay allows for a much higher degree of detection and quantification than with previous assays. The assay is preferably a capture assay using two antibodies to MMP-9 that do not compete with each other (ie, bind to distinct epitopes). This epitope to be bound must be exposed to both complexed MMP-9 as well as free MMP-9.
Description
【０００１】 （発明の背景） （１．発明の分野） 本発明は、免疫捕捉技術を使用して、生物学的サンプルにおけるメタロプロテ
イナーゼ９（ＭＭＰ−９）を定量するためのアッセイ方法に関する。このアッセ
イは、遊離のＭＭＰ−９およびメタロプロテイナーゼ９の組織インヒビター（Ｔ
ＩＭＰ−１）と複合体化されたＭＭＰ−９の両方を定量するために設計される。
１つの好ましい実施態様において、本発明は、抗体の使用により生物学的サンプ
ルからＭＭＰ−９を特異的に選択し、そして単離するための方法および技術、そ
の後のＭＭＰ−９量の測定に関する。このアッセイ方法は、癌を含む、ＭＭＰ−
９に関する疾患および障害の診断および予後において有用である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to assay methods for quantifying metalloproteinase 9 (MMP-9) in biological samples using immunocapture techniques. This assay is based on tissue inhibitors of free MMP-9 and metalloproteinase 9 (T
It is designed to quantify both IMP-1) and complexed MMP-9.
In one preferred embodiment, the present invention relates to methods and techniques for specifically selecting and isolating MMP-9 from biological samples through the use of antibodies, followed by determination of MMP-9 levels. This assay method involves MMP-
9 is useful in the diagnosis and prognosis of diseases and disorders related to.
【０００２】 （２．背景） 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞との相互作用は、生物体の正常な発達お
よび機能に対して重要である。細胞−マトリックス相互作用の調節は、種々のＥ
ＣＭ成分の加水分解の原因となる独特のタンパク質分解系の作用を通じて起こる
。ＥＣＭ構造の完全性および組成の調節により、これらの酵素系は、マトリック
ス分子より誘発されるシグナルの制御において中心的役割を果たし、これは、細
胞の増殖、分化および細胞死を調節する。制御できないタンパク質分解は、異常
発達およびＥＣＭ成分の過剰分解または分解の欠如のいずれかにより特徴付けら
れる多くの病的症状の発生に寄与するため、ＥＣＭの代謝回転および再構築は、
高度に調節されるはずである。Ｍａｓｓｏｖａら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：１０
７５−１０９５（１９９８）を参照のこと。2. Background The interaction of extracellular matrix (ECM) with cells is important for the normal development and function of an organism. Modulation of cell-matrix interactions is dependent on various E
It occurs through the action of a unique proteolytic system that causes hydrolysis of CM components. By regulating the integrity and composition of the ECM structure, these enzyme systems play a central role in controlling signals evoked by matrix molecules, which regulate cell growth, differentiation and cell death. Because uncontrolled proteolysis contributes to the development of many pathological conditions characterized either by abnormal development and excessive or lack of degradation of ECM components, ECM turnover and remodeling
It should be highly regulated. Massova et al., FASEB J .; 12:10
75-1095 (1998).
【０００３】 蓄積体の形跡は、正常増殖、創傷修復および新脈管形成の間、ならびに悪性疾
患を含む病的状態の発生および進行の間に起こるＥＣＭの再構築は、主にＭＭＰ
の作用を通じて達成されることを示唆する（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，
Ｈ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．７：７２
８−７３５，１９９５；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．
６：１２１−１２５，１９９０；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７３２：１１−２１，１９９４）。[0003] Evidence of accumulators indicates that ECM remodeling, which occurs during normal growth, wound repair and angiogenesis, and during the development and progression of pathological conditions, including malignant diseases, is primarily due to MMP
(Birkedal-Hansen,
H. , Current Opinions in Cell Bio. 7:72
8-735, 1995; Matrisian, L .; Trends Genet.
6: 121-125, 1990; Woessner, J. et al. F. Ann. N. Y.
Acad. Sci. 732: 11-21, 1994).
【０００４】 ＭＭＰは、金属依存性酵素の多重遺伝子ファミリーのメンバーである。これら
のプロテアーゼは、基質特異性に本来基づいて４つの広範なカテゴリーに分類さ
れている。これらの特異的酵素は、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１／ＥＣ３．４．２
４．７；ＭＭＰ−８／ＥＣ３．４．２４．３４；ＭＭＰ−１３）、ゼラチナーゼ
Ａ（ＭＭＰ−２／ＥＣ３．４．２４．２４）、およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−
９／ＥＣ３．４．２４．３５）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を含むス
トロメライシン（ＭＭＰ−３／ＥＣ３．４．２４．１７：ＭＭＰ−１０／ＥＣ３
．４．２４．２２；ＭＭＰ−１１／ＥＣ３．４．２４．７）および膜ＭＭＰ（Ｍ
ＭＰ−１４）である。Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．７：７２８−７３５，１９９５
；Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．６：１２１−１２５
，１９９０；Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ． Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．７３２：１１−２１，１９９４。新規な基質特異性を有するさらなるＭＭＰは
同定されることが予想される。[0004] MMPs are members of a multigene family of metal-dependent enzymes. These proteases have been classified into four broad categories based on substrate specificity. These specific enzymes are collagenase (MMP-1 / EC3.4.2).
4.7; MMP-8 / EC 3.4.4.34; MMP-13), gelatinase A (MMP-2 / EC 3.4.24.24), and gelatinase B (MMP-
9 / EC 3.4.24.35), stromelysin (MMP-3 / EC 3.4.24.17: MMP-10 / EC3) containing metalloelastase (MMP-12).
. 4.24.22; MMP-11 / EC 3.4.24.7) and membrane MMP (M
MP-14). Birkedal-Hansen, H .; , Current
Opinions in Cell Bio. 7: 728-735, 1995
Matrisian, L .; Trends Genet. 6: 121-125
Woessner, J. et al., 1990; F. Ann. N. Y. Acad. Sci
. 732: 11-21, 1994. It is expected that additional MMPs with novel substrate specificities will be identified.
【０００５】 ＭＭＰ活性の調節は、遺伝子転写制御、プロ酵素活性化および内因性インヒビ
ターにより活性化されるＭＭＰの阻害を含むいくつかのレベルにおいて生じる。
多くの他の酵素ファミリーのように、ＭＭＰは、「平衡化タンパク質分解」系の
主要構成要素であり、ここで微細に調節される平衡が、活性酵素量およびプロテ
アーゼインヒビター（複数）量の間に存在する。Ｌｉｏｔｔａら、Ｃｅｌｌ．６
４：３２７−３３６，１９９１。これらのネイティブなメタロプロテイナーゼイ
ンヒビターは、一般にＴＩＭＰＳ（メタロプロテイナーゼ組織インヒビター）と
していわれるタンパク質のファミリーを含む。Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒ
ｅ．３１８：６６−６９，１９８５；Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：２４０７−２４１１，１９８６；Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２３０−２３５，１９９１；
Ｍｕｒｒａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１５４−４１５９，１９
８６；Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９
：１７３７４−１７３７８，１９８９；Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６，１９９２；ＤｅＣｌｅｒｋら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７４４５−１７４５３，１９８９。[0005] Modulation of MMP activity occurs at several levels, including gene transcription control, proenzyme activation, and inhibition of MMPs activated by endogenous inhibitors.
Like many other enzyme families, MMPs are a key component of the "equilibrated proteolysis" system, where a finely regulated equilibrium is established between the amount of active enzyme and the amount of protease inhibitor (s). Exists. Liotta et al., Cell. 6
4: 327-336, 1991. These native metalloproteinase inhibitors include a family of proteins commonly referred to as TIMPS (metalloproteinase tissue inhibitors). Docherty et al., Nature
e. 318: 66-69, 1985; Carmichael et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA. 83: 2407-2411, 1986; Mo
ses et al. Cell. Biochem. 47: 230-235, 1991;
Murray et al. Biol. Chem. 261: 4154-4159,19
86; Stetterer-Stevenson et al. Biol. Chem. 29
: 17374-17378, 1989; Pavloff et al. Biol. Ch
em. 267: 17321-17326, 1992; DeClerk et al. B
iol. Chem. 264: 17445-17453, 1989.
【０００６】 マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９；９２ｋＤａ ゼラチナー
ゼＢ）は、腫瘍浸潤および腫瘍転移に関与するＭＭＰファミリーの重要なメンバ
ーである。Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ．８０（補遺８）：１５２９−
１５３７．１９９７；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ
ｓｔ．８９：１２６０−１２７０，１９９７；Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．３：８９５−９０４，１９９６；Ｙｕら、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ．
１１：２２９−２２４，１９９７；Ｋｏｈｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：
１８５６−１８６２，１９９５。ＭＭＰ−９は、基底膜の骨格を構成する、ＩＶ
型コラーゲンに対する特異性を有するコラーゲナーゼである。ＥＣＭのタンパク
質分解は、結合組織タンパク質（例えば、胚芽着床、形態形成、創傷治癒、排卵
、細胞移動、組織退縮、新脈管形成、および腫瘍浸潤）における変化と関連する
多くの生理学的または病的状態の重要な局面である。ＤｅＣｌｅｒｋら、Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４２５：８９−９７，１９９７。ＭＭＰ−９は、
潜在形態において刺激化マクロファージ、好中球および形質転換細胞から分泌さ
れる。実際、膜型メタロプロテイナーゼを除く全てのＭＭＰは、不活性チモーゲ
ンとして細胞外マトリックスへ分泌され、そこで後の活性化が活性種へのプロ酵
素の切断を生じる。活性化剤の存在または非存在、およびメタロプロテイナーゼ
組織インヒビター（ＴＩＭＰ）の結合は、細胞外空間におけるこのような酵素の
活性化に対し厳密な制御を維持する。Ｂｏｒｄｅｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕ
ｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．７：１５９−１７８，１９９７
；Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）．３８９：７７−８
１，１９９７。このＴＩＭＰファミリーは、４つの膜：ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ
−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４を有する。Ｂｏｒｄｅｎら、Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．７：１５９−１
７８，１９９７；Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８９：４１１−４
１６，１９９３。このＴＩＭＰとそれらの特異的ＭＭＰとの結合は、ＭＭＰの酵
素活性の進行および活性化を調節する。ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−９およびＭＭＰ
−２）の場合、このＴＩＭＰは、酵素のチモーゲン形態と結合することを示され
ている。Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８９：４１１−４１６，１
９９３；Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４５８３−４
５９１，１９９２。[0006] Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9; 92 kDa gelatinase B) is an important member of the MMP family involved in tumor invasion and metastasis. Woodhouse et al., Cancer. 80 (Addendum 8): 1529-
1537. 1997; Chambers et al. Natl. Cancer. In
st. 89: 1260-1270, 1997; Coussens et al., Chem.
Biol. 3: 895-904, 1996; Yu et al., Drugs Aging.
11: 229-224, 1997; Kohn et al., Cancer Res. 55:
1856-1862, 1995. MMP-9 constitutes the skeleton of the basement membrane, IV
It is a collagenase having specificity for type collagen. ECM proteolysis is associated with many physiological or disease states associated with changes in connective tissue proteins (eg, embryo implantation, morphogenesis, wound healing, ovulation, cell migration, tissue regression, angiogenesis, and tumor invasion). This is an important aspect of the objective state. DeClerk et al., Adv
. Exp. Med. Biol. 425: 89-97, 1997. MMP-9 is
Secreted by stimulated macrophages, neutrophils and transformed cells in a latent form. In fact, all MMPs except membrane metalloproteinases are secreted as inactive zymogens into the extracellular matrix, where subsequent activation results in cleavage of the proenzyme into active species. The presence or absence of activators, and the binding of metalloproteinase tissue inhibitors (TIMPs) maintain tight control over the activation of such enzymes in the extracellular space. Borden et al., Crit. Rev .. Eu
karyot. Gen. Expression. 7: 159-178, 1997
Gomis-Ruth et al., Nature (London). 389: 77-8
1, 1997. The TIMP family comprises four membranes: TIMP-1, TIMP
-2, TIMP-3, and TIMP-4. Borden et al., Crit
. Rev .. Eukaryot. Gen. Expression. 7: 159-1
78, 1997; Fridman et al., Biochem J .; 289: 411-4
16, 1993. This binding of TIMPs to their specific MMPs regulates the progress and activation of MMP enzymatic activity. Gelatinase (MMP-9 and MMP
In case -2), this TIMP has been shown to bind to the zymogen form of the enzyme. Fridman et al., Biochem J. et al. 289: 411-416, 1
993; Goldberg et al. Biol. Chem. 267: 4583-4
591, 1992.
【０００７】 ＭＭＰ−９タンパク質は、４つの構造ドメインを有する。：アミノ末端プロペ
プチド、触媒ドメイン、触媒ドメイン内のフィブロネクチンＩＩ型様ドメインお
よびカルボキシル基末端におけるヘモペキシン様ドメイン。Ｍａｓｓｏｖａら、
ＦＡＳＥＢ Ｊ．１２：１０７５−１０９５，１９９８。プロペプチドの切断は
、チモーゲン活性化を引き起こす。触媒ドメインは、２つの亜鉛イオンおよび１
つのカルシウムイオンを含む。ＭＭＰ−９は、３つのフィブロネクチンＩＩ型モ
ジュール相同反復を触媒ドメインへ組み込む。この領域はまた、ゼラチン結合ド
メインとして公知であり、そして変性コラーゲンまたは変性ゼラチンへの結合に
関与する。Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６６３２−６６
３６，１９９４。ヘモペキシン様ドメインは、ＭＭＰの間で高く保存され、そし
て血漿タンパク質、すなわちヘモペキシンと配列類似性を示す。ヘモペキシン様
ドメインは、メタロプロテイナーゼ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）との基質結合
および／または相互作用において機能的役割を果たすことが示されている。潜在
形態のこれらの酵素へのＴＩＭＰの結合において、高い程度の特異性が存在する
。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ−９（Ｋｄ〜３５ｎＭ）のチモーゲン形態に独占的に
結合するが、ＴＩＭＰ−２は、ＭＭＰ−２（Ｋｄ〜５ｎＭ）のチモーゲン形態に
結合する。Ｍｕｒｐｈｙら、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１５：５１１−５１８，
１９９７。高親和性結合部位を表わすヘモペキシン様ドメインを用いたＴＩＭＰ
−１の、チモーゲン形態のＭＭＰ−９への二相結合が存在する。Ｏｌｓｏｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９９７５−２９９８３，１９９７。[0007] The MMP-9 protein has four structural domains. : Amino terminal propeptide, catalytic domain, fibronectin type II-like domain in catalytic domain and hemopexin-like domain at carboxyl terminal. Massova et al.,
FASEB J. 12: 1075-1095, 1998. Cleavage of the propeptide causes zymogen activation. The catalytic domain consists of two zinc ions and one
Contains two calcium ions. MMP-9 incorporates three fibronectin type II module homologous repeats into the catalytic domain. This region is also known as the gelatin binding domain and is involved in binding to denatured collagen or denatured gelatin. Murphy et al. Biol. Chem. 269: 6632-66
36, 1994. The hemopexin-like domain is highly conserved among MMPs and shows sequence similarity to plasma proteins, ie, hemopexin. The hemopexin-like domain has been shown to play a functional role in substrate binding and / or interaction with metalloproteinase tissue inhibitors (TIMPs). There is a high degree of specificity in binding TIMPs to latent forms of these enzymes. TIMP-1 binds exclusively to the zymogen form of MMP-9 (Kdｄ35 nM), while TIMP-2 binds to the zymogen form of MMP-2 (Kd〜5 nM). Murphy et al., Matrix Biol. 15: 511-518,
1997. TIMP using a hemopexin-like domain displaying a high affinity binding site
There is a two-phase binding of -1 to the zymogen form of MMP-9. Olson et al.
J. Biol. Chem. 272: 29975-29983, 1997.
【０００８】 伝統的な免疫アッセイは、主に、複合体化されていないプロＭＭＰ−９を検出
する。従って、小さい割合（％）の癌サンプルのみが正常サンプルよりも上に読
めるという点において、臨床的有用性が貧弱である。[0008] Traditional immunoassays primarily detect uncomplexed pro-MMP-9. Thus, the clinical utility is poor in that only a small percentage of cancer samples can be read above normal samples.
【０００９】 ＭＭＰは、正常プロセスおよび病的プロセス（胚形成、創傷治癒、炎症、関節
炎および癌を含む）において重要な役割を果たすため、高い特異性を有すること
、そして患者サンプルにおいてＭＭＰレベルを測定するための正確なアッセイを
有することが所望される。MMPs play an important role in normal and pathological processes, including embryogenesis, wound healing, inflammation, arthritis and cancer, and therefore have high specificity and measure MMP levels in patient samples It is desirable to have an accurate assay to perform.
【００１０】 （発明の要旨） 本発明は、ヒト血清および血漿を含む生物学的サンプルにおいて全ての型のＭ
ＭＰ−９（ＴＩＭＰとの複合体化形態および「遊離」の非複合体化型の両方）を
検出する改良型免疫アッセイを行う。本免疫アッセイを使用して、本発明者は、
以前のアッセイに比べ、ずっと高い程度の検出および定量が可能であるという驚
くべき発見をした。このアッセイは、好ましくは、互いに競合しないＭＭＰ−９
に対する２つの抗体（すなわち、別個のエピトープに結合する）を使用する捕捉
アッセイである。結合されるエピトープは、複合体化ＭＭＰ−９ならびに遊離Ｍ
ＭＰ−９の両方に曝されなければならない。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to all forms of M in biological samples, including human serum and plasma.
An improved immunoassay is performed to detect MP-9 (both complexed with TIMP and "free" uncomplexed form). Using the present immunoassay, the present inventors:
A surprising finding was that a much higher degree of detection and quantification was possible than in previous assays. This assay is preferably for MMP-9 that does not compete with each other.
Is a capture assay that uses two antibodies (ie, that bind to distinct epitopes). The bound epitopes are complexed MMP-9 as well as free MMP-9.
Must be exposed to both MP-9.
【００１１】 １つの好ましい実施態様において、本発明者らは、ＭＭＰ−９抗体および捕捉
抗ＭＭＰ−９抗体の検出器を使用し得ることを見い出した。例えば、血清プロマ
トリックスメタロプロテイナーゼ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９の
前駆物質、プロＭＭＰ−９、プロゲラチナーゼＢ）レベルおよびプロＭＭＰ−９
／ＴＩＭＰ１複合体レベル（メタロプロテイナーゼ組織インヒビター（ＴＩＭＰ
−１）と非共有結合的に結合するプロＭＭＰ−９）は、癌患者において高くなる
。これらのレベルは、モノクローナル抗ＭＭＰ−９抗体（例えば、クローン６−
６Ｂ（ＯＲＰ産生ＭＭＰ９（Ａｂ−１）、カタログ番号ＩＭＯ９Ｌ））およびＭ
ＭＰ−９に対するポリクローナル抗体（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎから入手可能（カタ
ログ番号Ｋ９０１６３Ｃ））を使用して決定され得る。伝統的な免疫アッセイと
異なり、本発明の改良免疫アッセイは、優秀な臨床上の有用性を有する。例えば
、９０％の癌性血清は、正常サンプルより上に読まれ、そして癌性血清の大部分
のプロＭＭＰ−９は、ＴＩＭＰ−１と複合体化されて見い出される。In one preferred embodiment, the inventors have found that MMP-9 antibodies and capture anti-MMP-9 antibody detectors can be used. For example, serum promatrix metalloproteinase-9 (a precursor of matrix metalloproteinase 9, pro-MMP-9, progelatinase B) levels and pro-MMP-9
/ TIMP1 complex level (metalloproteinase tissue inhibitor (TIMP)
Pro-MMP-9), which binds non-covalently to -1), is elevated in cancer patients. These levels were measured using a monoclonal anti-MMP-9 antibody (eg, clone 6-
6B (ORP-producing MMP9 (Ab-1), catalog number IMO9L)) and M
It can be determined using a polyclonal antibody against MP-9 (available from BioDesign (catalog number K90163C)). Unlike traditional immunoassays, the improved immunoassays of the present invention have excellent clinical utility. For example, 90% of cancerous sera read above normal samples, and the majority of pro-MMP-9 in cancerous sera is found complexed with TIMP-1.
【００１２】 本発明は、患者から得られる生物学的サンプルを遊離のＭＭＰおよびＭＭＰ／
ＴＩＭＰ複合体（例えば、ＭＭＰ−９およびプロＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合
体）の存在に対してアッセイする工程を包含する、障害（例えば、癌）に関連す
るＭＭＰ−９の存在を決定する方法を提供する。通常の限度より上のＭＭＰ−９
の存在は、癌の存在と相関がある。生物学的サンプルにおけるＭＭＰ−９レベル
の測定は、癌の診断、予後および処置、ならびに治療および疾患の段階に対する
患者の応答のモニタリングにおいて有用である。[0012] The present invention provides a method for preparing a biological sample obtained from a patient comprising free MMP and MMP /
Determining the presence of MMP-9 associated with a disorder (eg, cancer) comprising assaying for the presence of a TIMP complex (eg, MMP-9 and pro-MMP-9 / TIMP-1 complex) Provide a way. MMP-9 above normal limit
Is correlated with the presence of cancer. Measuring MMP-9 levels in biological samples is useful in diagnosing, prognosing and treating cancer, and monitoring patient response to therapeutic and disease stages.
【００１３】 本アッセイを使用して、本発明は、ヒト血清および血漿サンプルおよび細胞培
養上清において、ＴＩＭＰ−１と複合体化するプロＭＭＰ−９タンパク質および
非複合体ＭＭＰ−９を検出した。特異性は、特異性プロＭＭＰ−９抗体および特
異的ＴＩＭＰ−１抗体によるプロＭＭＰ−９陽性サンプルの免疫親和性抽出（ア
ッセイシグナルの阻害）により実証された。例えば、ＭＭＰ−９抗体（これはＥ
ＬＩＳＡの構成要素ではない）は、ＭＭＰ−９を抽出し、これはアッセイにおけ
るシグナルの喪失（ほとんど全てのシグナルが喪失する）を導いたが、一方コン
トロール抗体（例えば、非ＭＭＰ−９）は、ＭＭＰ−９陽性サンプルのシグナル
に影響を及ぼさなかった（図３を参照のこと）。ＴＩＭＰ−１抗体は、この免疫
アッセイにより検出されるプロＭＭＰ−９活性を抽出したが、他の伝統的な免疫
アッセイでは、プロＭＭＰ−９活性は、ほとんど検出されなかった。このことは
、伝統的アッセイは、主に非複合体化ＭＭＰ−９タンパク質を検出し、従って患
者サンプルにおけるＭＭＰ−９レベルを正確に測定できないことを示す。陽性サ
ンプルおよび陰性サンプル両方にＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２組換えタンパ
ク質を添加しても、ＭＭＰ−９検出レベルは変化しない。Using this assay, the present invention detected pro-MMP-9 protein complexed with TIMP-1 and uncomplexed MMP-9 in human serum and plasma samples and cell culture supernatants. Specificity was demonstrated by immunoaffinity extraction of proMMP-9 positive samples (inhibition of assay signal) with specific proMMP-9 and specific TIMP-1 antibodies. For example, the MMP-9 antibody (this is E
(Not a component of the LISA) extracted MMP-9, which led to a loss of signal in the assay (almost all signal was lost), while control antibodies (eg, non-MMP-9) It did not affect the signal of MMP-9 positive samples (see FIG. 3). The TIMP-1 antibody extracted the pro-MMP-9 activity detected by this immunoassay, whereas other traditional immunoassays showed little detection of pro-MMP-9 activity. This indicates that traditional assays mainly detect uncomplexed MMP-9 protein and therefore cannot accurately measure MMP-9 levels in patient samples. The addition of TIMP-1 and TIMP-2 recombinant proteins to both positive and negative samples does not change the level of MMP-9 detection.
【００１４】 従って、本発明はさらに、ヒトからの生物学的液体におけるＭＭＰ−９の検出
および定量のための一般的方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する
： （ａ）液相中の遊離の形態または複合体化形態のいずれかにおいて曝されるか
、または固体支持体上に吸着されるＭＭＰ−９のエピトープを特異的に結合する
第１の抗体に、生物学的サンプル量を曝して、その結果、生物学的サンプルにお
ける任意のＭＭＰ−９が抗体によって捕捉される工程； （ｂ）遊離の形態または化合物形態（好ましくは、プロＭＭＰ−９）のいずれ
かで曝される第２のエピトープを特異的に結合する、第２の検出可能な標識化抗
体に、捕捉されたＭＭＰ−９を曝す工程； （ｃ）非結合物質を除去する工程；および （ｄ）検出される第２の検出可能な標識化抗体の量を検出および定量する工程
。Accordingly, the present invention further provides a general method for the detection and quantification of MMP-9 in biological fluids from humans. The method comprises the steps of: (a) identifying an epitope of MMP-9 that is exposed in either free or complexed form in a liquid phase or adsorbed on a solid support; Exposing a biological sample volume to a first antibody that specifically binds, such that any MMP-9 in the biological sample is captured by the antibody; (b) free or compound form Exposing the captured MMP-9 to a second detectable labeled antibody that specifically binds a second epitope exposed by any of the (preferably pro-MMP-9); (c) A) removing unbound material; and d) detecting and quantifying the amount of the second detectable labeled antibody to be detected.
【００１５】 第１の抗体および第２の抗体に関して、好ましくは、１つの抗体はポリクロー
ナルであり、そしてもう１つはモノクローナルである。With respect to the first and second antibodies, preferably, one antibody is polyclonal and the other is monoclonal.
【００１６】 生物学的サンプル中のＭＭＰ−９の量は、固体支持体に結合した検出可能な標
識化抗体の量から決定される。検出可能に標識化される抗体は、検出可能な物質
（例えば、ビオチン、放射性物質、色素産生物質、酵素的物質、化学発光、蛍光
およびハプテン）で、標識化され得る。[0016] The amount of MMP-9 in the biological sample is determined from the amount of detectable labeled antibody bound to the solid support. Antibodies that are detectably labeled can be labeled with a detectable substance, such as biotin, radioactive substances, chromogenic substances, enzymatic substances, chemiluminescent, fluorescent and haptens.
【００１７】 生物学的サンプルにおけるＭＭＰレベルを測定するための本発明の方法は、捕
捉抗体（これは、モノクローナル抗体、ポリクローナル組換え抗体またはキメラ
抗体であり得る）および検出可能に標識化される抗体（これはまた、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル組換え抗体またはキメラ抗体であり得る）の使用を意
図する。[0017] The method of the invention for measuring MMP levels in a biological sample comprises a capture antibody, which may be a monoclonal, polyclonal recombinant or chimeric antibody, and a detectably labeled antibody. (This can also be a monoclonal, polyclonal recombinant or chimeric antibody).
【００１８】 本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるＭＭＰ−９の検出に対して有効な
キットを提供する。このキットは、サンプル中に存在するＭＭＰ−９を捕捉する
ためのＭＭＰ−９を特異的に結合する抗体を含み、そしてＭＭＰ−９量を定量す
るために、ＭＭＰ−９に特異的に結合する検出可能に標識化される抗体（例えば
、プロＭＭＰ−９）を含む。[0018] The invention further provides kits that are effective for detecting MMP-9 in a biological sample. The kit includes an antibody that specifically binds MMP-9 to capture MMP-9 present in the sample, and specifically binds to MMP-9 to quantify the amount of MMP-9. Includes an antibody that is detectably labeled (eg, pro-MMP-9).
【００１９】 本発明の他の局面は、以下に開示される。Another aspect of the present invention is disclosed below.
【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明は、免疫アッセイ（例えば、遊離のＭＭＰ−９および複合体化ＭＭＰ−
９の両方に対して特異的な抗体を用いる「サンドウィッチ」酵素免疫アッセイ）
を提供する。そのエピトープは、遊離の形態および複合体化形態の両方において
曝される必要がある。好ましくは、検出抗体は、プロＭＭＰ−９形態に結合する
。例えば、本アッセイの１つの実施態様において、ヒトＭＭＰ−９タンパク質に
対して特異的な抗体は、固相支持体（例えば、免疫アッセイプレート）の表面に
固定される（ビーズ、チューブまたは磁気粒子のような他の固体支持体が同様に
使用され得る）。プロＭＭＰ−９に対して特異的である標識化（例えば、ビチオ
ン化）検出抗体とともに、アッセイされるサンプルが添加される。例えば、検出
抗体は、同時にウェルにピペッティングされ得、そして任意の存在するＭＭＰ−
９が、捕捉抗体および検出抗体両方に結合する間の一定時間（例えば、２時間）
インキュベートされ得る。非結合物質は、洗浄して取り除かれ、そして検出抗体
がビチオン化される場合、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン
が添加され、これは検出抗体に結合する。西洋わさびペルオキシダーゼは、色素
原性基質（すなわち、テトラメチルベンジジン）の無色溶液から着色溶液への転
換を触媒し、その強度は、サンプル中のプロＭＭＰ−９タンパク質の量に比例す
る。着色反応産物は、分光光度計を使用して定量される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to immunoassays (eg, free MMP-9 and complexed MMP-
"Sandwich" enzyme immunoassay using antibodies specific for both 9)
I will provide a. The epitope needs to be exposed in both free and complexed forms. Preferably, the detection antibody binds to the pro-MMP-9 form. For example, in one embodiment of the assay, antibodies specific for the human MMP-9 protein are immobilized on a surface of a solid support (eg, an immunoassay plate) (beads, tubes, or magnetic particles). Other solid supports can be used as well). The sample to be assayed is added along with a labeled (eg, biotinylated) detection antibody that is specific for pro-MMP-9. For example, the detection antibody can be simultaneously pipetted into the wells and any existing MMP-
9 for a fixed period of time (eg, 2 hours) during binding to both capture and detection antibodies
Can be incubated. Unbound material is washed away and if the detection antibody is bitionized, horseradish peroxidase-conjugated streptavidin is added, which binds to the detection antibody. Horseradish peroxidase catalyzes the conversion of a chromogenic substrate (ie, tetramethylbenzidine) from a colorless solution to a colored solution, the intensity of which is proportional to the amount of pro-MMP-9 protein in the sample. The color reaction product is quantified using a spectrophotometer.
【００２１】 あるいは、他の検出方法が、ストレプトアビジン−ビチオン−西洋わさびペル
オキシダーゼ標識化免疫学的応答基質（例えば、放射性物質、化学発光物質、生
物発光物質、蛍光物質、または他の色素形成物質）の代わりに、使用され得る。
さらに、検出抗体は、直接的に標識化され得るか、またはビチオンの代わりに他
の分子を用いて間接的に標識化され得る。Alternatively, another method of detection is a streptavidin-bition-horseradish peroxidase-labeled immunological response substrate (eg, a radioactive, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, or other chromogenic material). Alternatively, it can be used.
In addition, the detection antibody can be directly labeled or indirectly labeled with another molecule in place of bition.
【００２２】 定量は、既知の、例えばプロＭＭＰ−９の濃度を使用して標準曲線を作製する
ことによって達成される。未知量のプロＭＭＰ−９を含むサンプルから得られる
シグナルを、既知のプロＭＭＰ−９の濃度から得られるシグナルと比較すること
により、サンプル中のＭＭＰ−９の濃度が、決定され得る。Quantitation is achieved by generating a standard curve using known, eg, pro-MMP-9, concentrations. By comparing the signal obtained from a sample containing an unknown amount of pro-MMP-9 with the signal obtained from a known concentration of pro-MMP-9, the concentration of MMP-9 in the sample can be determined.
【００２３】 本発明の好ましい方法は、当該分野で公知の標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使
用する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈ
ａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．編）１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．およびＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ
ｅ（Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｗ．ら、編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．を参照のこと）。好ましくは、ＥＬＩＳＡは、同じ抗原
において重複していないエピトープに結合する２つの抗体を使用し、そして抗原
上の別々の部位を認識する２つの抗体か、またはアフィニティー精製ポリクロー
ナル抗体の１つのバッチのいずれかを利用し得る。しかし、他の実施態様におい
て、本発明のアッセイは、遊離のＭＭＰ−９および複合体化ＭＭＰ−９両方に対
して特異的な捕捉抗体、ならびに捕捉されたタンパク質を検出するための非抗体
系を使用し得る。例えば、捕捉化ＭＭＰ−９または捕捉化ＴＩＭＰ−１と反応す
る高分子を使用し得る。The preferred method of the present invention uses a standard ELISA assay known in the art (Antibodies, A Laboratory Manual (H
arrow, E .; And Lane, D.M. Ed.) 1988, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
r, N. Y. And Immunology, A Practical Guide
e (Chan, EW et al., eds.) Academic Press Inc, Sa
n Diego, CA. checking). Preferably, the ELISA uses two antibodies that bind to non-overlapping epitopes on the same antigen, and either two antibodies recognizing distinct sites on the antigen or one batch of affinity purified polyclonal antibody Can be used. However, in other embodiments, the assays of the present invention include a capture antibody specific for both free and complexed MMP-9, and a non-antibody system for detecting the captured protein. Can be used. For example, macromolecules that react with trapped MMP-9 or trapped TIMP-1 may be used.
【００２４】 ＭＭＰ−９を特異的に結合する抗体は、ヒトまたは動物（例えば、ウサギ、マ
ウス、ラットなど）のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、または組
換え型抗体、またはキメラ抗体を含み得る。ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、組換え型抗体、またはキメラ抗体を調製および精製するために使用され
る方法は、当該分野において公知である。Antibodies that specifically bind MMP-9 can include human or animal (eg, rabbit, mouse, rat, etc.) polyclonal or monoclonal antibodies, or recombinant antibodies, or chimeric antibodies. Methods used to prepare and purify polyclonal, monoclonal, recombinant, or chimeric antibodies are known in the art.
【００２５】 このような抗体はまた、市販されている。市販の抗ＭＭＰ−９抗体のいくつか
の例は以下を含む。[0025] Such antibodies are also commercially available. Some examples of commercially available anti-MMP-9 antibodies include:
【００２６】[0026]
【表１】 検出可能な標識化抗体は、任意の種々の標識および当該分野において公知であ
る標識方法を使用して標識され得る。標識の型の例は、本発明においては以下を
含むが、これらに限定されない：放射性同位体標識（例えば、125Ｉ、131Ｉ、35 Ｓ、14Ｃなど）、非放射性同位体標識（55Ｍｎ、56Ｆｅなど）、蛍光標識（例え
ば、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエ
リトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルデヒ
ド標識、フルオレサミン標識など）、化学発光標識、酵素標識（例えば、アルカ
リホスホターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなど）、タンパク質標識など。[Table 1] Detectable labeled antibodies can be labeled using any of a variety of labels and labeling methods known in the art. Examples of label types include, but are not limited to, the following in the present invention: radioactive isotope labels (eg, 125 I, 131 I, 35 S, 14 C, etc.), non-radioactive isotope labels ( 55 Mn). , 56 Fe, etc.), fluorescent labels (eg, fluorescein label, isothiocyanate label, rhodamine label, phycoerythrin label, phycocyanin label, allophycocyanin label, o-phthalaldehyde label, fluoresamine label, etc.), chemiluminescent label, enzyme label (eg, Alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc.), protein labeling, etc.
【００２７】 生物学的サンプルには、体液（例えば、血漿、血清、唾液、尿、肺洗浄液、嚢
胞液など）および組織抽出物（ここで、組織切片は、液体抽出物から取り除かれ
、そして分離される）が挙げられる。[0027] Biological samples include bodily fluids (eg, plasma, serum, saliva, urine, lung lavage fluid, cystic fluid, etc.) and tissue extracts (where tissue sections are removed from the liquid extract and separated). Is performed).
【００２８】 本発明の方法において、生物学的サンプル（例えば、血漿、血清、唾液、尿、
肺洗浄液、嚢胞液、組織抽出物など）に存在するプロＭＭＰ−９は、抗プロ−Ｍ
ＭＰ−９抗体によりサンプルから選択的に捕捉される。この免疫捕捉アッセイは
、当該分野において周知であるように、液相中または固体支持体上において実行
され得る。本発明の好ましい実施態様において、抗−プロＭＭＰ−９抗体は、固
体支持体上へ、当該分野で公知のいずれかの安定な相互作用（例えば、疎水性相
互作用、静電的相互作用または共有結合性相互作用）により、付加される。固体
支持体のいくつかの例は、マイクロタイタープレート、磁気性粒子、ビーズ、シ
ート、膜、クロマトグラフィー樹脂（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）などである
。好ましくは、マルチウェルマイクロタイタープレートまたはニトロセルロース
膜が使用されて、そのため、プロＭＭＰ−９が抗体により捕捉される場合、生じ
る免疫学的複合体は固定されて、例えば、生物学的サンプルに残存する非結合物
質を洗い落とすことにより、容易に分離される。In the method of the present invention, the biological sample (eg, plasma, serum, saliva, urine,
Pro-MMP-9 present in lung lavage, cyst fluid, tissue extracts, etc.)
It is selectively captured from the sample by the MP-9 antibody. The immunocapture assay may be performed in a liquid phase or on a solid support, as is well known in the art. In a preferred embodiment of the invention, the anti-pro-MMP-9 antibody is applied to a solid support by any stable interaction known in the art (eg, hydrophobic, electrostatic, or shared). (Associative interaction). Some examples of solid supports are microtiter plates, magnetic particles, beads, sheets, membranes, chromatography resins (eg, Sepharose), and the like. Preferably, a multi-well microtiter plate or nitrocellulose membrane is used, so that when pro-MMP-9 is captured by the antibody, the resulting immunological complex is immobilized, e.g., remaining in the biological sample. It is easily separated by washing off unbound material.
【００２９】 本発明の方法は、サンプル物質におけるＭＭＰ９およびプロＭＭＰ−９の高レ
ベルの測定を通じて悪性度を検出するための、生物学的サンプルのスクリーニン
グにおいて有用性を有する。本発明はまた、生物学的サンプルにおけるプロＭＭ
Ｐ−９の検出に対して有用なキットの調製を企図する。このようなキットは、固
体支持体（好ましくは、約４〜約９６ウェルを有するマイクロタイタープレート
）に吸着される抗プロＭＭＰ−９抗体、および標識に結合される第２の抗プロＭ
ＭＰ−９抗体を含み、そしてここで必要である、上記標識を測定するための手段
を含む。The methods of the present invention have utility in screening biological samples to detect malignancy through the measurement of high levels of MMP9 and pro-MMP-9 in a sample material. The present invention also relates to pro-MM in biological samples.
The preparation of a kit useful for the detection of P-9 is contemplated. Such a kit comprises an anti-proMMP-9 antibody adsorbed on a solid support (preferably, a microtiter plate having about 4 to about 96 wells), and a second anti-proMMP bound to a label
Means for measuring the label, including and required for the MP-9 antibody.
【００３０】 本発明の目的が、周知の変異体、改変体、または本明細書に記載される同等の
方法および技術を使用して過度の実験の支出を必要とせずに達成し得ることが、
当業者に認識される。当業者はまた、特異的に記載される手段以外の代替的な手
段は、本明細書に記載されるＭＭＰ−９の測定方法、および本発明の方法の機能
的等価物を達成するためのこれらの代替物の使用法を達成するために当該分野に
おいて利用可能であることを認識する。本発明は、当業者により認識され、そし
て本発明の開示の精神および範囲に含まれるこれらの変異体、改変体、代替物お
よび等価物を含むことを意図する。It can be seen that the objects of the present invention can be achieved without the need for undue experimentation using well-known variants, variants, or equivalent methods and techniques described herein.
It will be recognized by those skilled in the art. One of skill in the art will also appreciate that alternative means other than those specifically described are methods for measuring MMP-9 described herein, and those for achieving functional equivalents of the methods of the invention. It is recognized that it is available in the art to achieve the use of alternatives. The present invention is intended to include these variants, modifications, alternatives, and equivalents, as recognized by those skilled in the art and are within the spirit and scope of the disclosure.
【００３１】 改変は、ＭＭＰ測定のためのアッセイの感度を増強するために免疫捕捉酵素ア
ッセイにおいて使用される反応条件および特異的要素となり得ることが、当該分
野において理解される。例えば、置換は色素原性基質の選択においてなされ得る
こと、またはリガンド（例えば、化学基）は本発明のアッセイの特異性に影響さ
れずにシグナル抗体に添加され得ることを企図する。この開示の教示を使用する
当業者に明らかなように、例えばＭＭＰ決定の最適化は、当該分野で公知の薬剤
の変更および、改変ならびに発明の方法の条件を包含することがまた、理解され
る。[0031] It is understood in the art that the modifications can be reaction conditions and specific factors used in immunocapture enzyme assays to enhance the sensitivity of the assay for MMP measurement. For example, it is contemplated that substitutions can be made in the selection of a chromogenic substrate, or that ligands (eg, chemical groups) can be added to the signal antibody without affecting the specificity of the assay of the invention. It will also be appreciated that optimization of MMP determination, for example, will involve alterations and modifications of agents known in the art and conditions of the inventive method, as will be apparent to those of skill in the art using the teachings of this disclosure. .
【００３２】 本発明はさらに、以下の実施例により例証される。これらの実施例は、本発明
の理解における補助のために提供されるが、これらの限定をしては解釈されない
。The present invention is further illustrated by the following examples. These examples are provided to aid in understanding the invention, but are not to be construed as limiting these.
【００３３】 （実施例１） 本実施例で開示されるＭＭＰ−９ＥＬＩＳＡは、マウスモノクローナルおよび
ヒツジポリクローナル抗体を使用する「サンドウィッチ」酵素免疫アッセイであ
る。抗体（ヒトＭＭＰ−９タンパク質に特異的である）は、標準的な技術を使用
するマイクロタイターウェルの表面上へ、固定化される。アッセイされるサンプ
ルおよびビオチン化される検出用モノクローナル抗体は、ウェルへピペッティン
グされ、そして２時間（いずれかの存在するＭＭＰ−９が捕捉および検出抗体と
結合する時間の間）、インキュベートされる。結合しない物質を、洗浄して取り
除き、そして、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを添加し、
これは、検出抗体に結合する。Example 1 The MMP-9 ELISA disclosed in this example is a “sandwich” enzyme immunoassay using mouse monoclonal and sheep polyclonal antibodies. Antibodies (specific for human MMP-9 protein) are immobilized on the surface of microtiter wells using standard techniques. The sample to be assayed and the detection monoclonal antibody to be biotinylated are pipetted into the wells and incubated for 2 hours (during which time any MMP-9 present binds to the capture and detection antibodies). Unbound material is washed away and horseradish peroxidase-conjugated streptavidin is added,
It binds to the detection antibody.
【００３４】 検出抗体は、抗ＭＭＰ−９マウスモノクローナル抗体クローン６−６Ｂ（ＯＲ
Ｐ産物ＭＭＰ９（Ａｂ−１）、カタログ番号ＩＭ０９Ｌ）である。この捕捉抗体
は、ヒツジで産生し、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，Ｍａｉ
ｎｅ（カタログ番号Ｋ９０１６３Ｃ）から得られる抗ＭＭＰ−９ポリクローナル
である。The detection antibody was anti-MMP-9 mouse monoclonal antibody clone 6-6B (OR
P product MMP9 (Ab-1), catalog number IM09L). This capture antibody is produced in sheep and is available from BioDesign of Kennebunk, Mai.
ne (catalog number K90163C) is an anti-MMP-9 polyclonal.
【００３５】 西洋わさびペルオキシダーゼは、色素原性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）の無色溶液から青色溶液へ（または停止試薬の添加後黄色）の転化を触媒し
、そしてこの強度は、サンプル内のＭＭＰ−９タンパク質の量に比例する。着色
反応産物は、分光光度計を使用して定量される。Horseradish peroxidase is a chromogenic substrate tetramethylbenzidine (TM
It catalyzes the conversion of B) from a colorless solution to a blue solution (or yellow after addition of a stop reagent), and this intensity is proportional to the amount of MMP-9 protein in the sample. The color reaction product is quantified using a spectrophotometer.
【００３６】 定量を、既知の濃度のＭＭＰ−９を使用して標準曲線の構築により達成する。
未知量のＭＭＰ−９を含むサンプルから得られる吸光度とスタンダードから得ら
れる吸光度とを比較することにより、サンプル中のＭＭＰ−９の濃度を決定し得
る。Quantitation is achieved by construction of a standard curve using known concentrations of MMP-9.
By comparing the absorbance obtained from a sample containing an unknown amount of MMP-9 with the absorbance obtained from a standard, the concentration of MMP-9 in the sample can be determined.
【００３７】 （実施例２） 酢酸２−アミノフェニル第二水銀（ＡＭＰＡ）処置が、潜在性９２ｋＤａ酵素
のＮ末端プロ配列の自己触媒作用性切断を促進し、８４ｋＤａ酵素を生ずること
が公知である。さらなる処置により、カルボキシ末端の自己触媒性切断が引き起
こされ、ＭＭＰ−９の６８ｋＤａ形態が生じる。組織培養の上清および血漿サン
プルの両方を、ＡＰＭＡ処置後ＭＭＰ−９ ＥＬＩＳＡにおいて試験した。各々
の場合において、ＡＰＭＡ処置後に、ほとんど全てのシグナルが消滅した（図４
参照）。ザイモグラフィーによるサンプルの分析により、ＡＰＭＡによるプロ酵
素の切断、およびＭＭＰ−９ ＥＬＩＳＡを用いて決定されるプロ酵素のレベル
との良好な相関関係の両方が示された。さらに、このアッセイは、純粋な組換え
型プロＭＭＰ−９タンパク質を認識するが、活性ＭＭＰ−９組替え型タンパク質
を認識しない。これらの結果は、本発明のアッセイが特異的に遊離のＭＭＰ−９
およびＭＭＰ−９のＴＩＭＰ結合チモーゲン型を認識することを、実証している
。Example 2 It is known that 2-aminophenylmercuric acetate (AMPA) treatment promotes autocatalytic cleavage of the N-terminal prosequence of the cryptic 92 kDa enzyme, yielding an 84 kDa enzyme. . Further treatment causes autocatalytic cleavage of the carboxy terminus, resulting in a 68 kDa form of MMP-9. Both tissue culture supernatant and plasma samples were tested in MMP-9 ELISA after APMA treatment. In each case, almost all signals disappeared after APMA treatment (FIG. 4).
reference). Analysis of the sample by zymography showed both cleavage of the proenzyme by APMA and good correlation with the level of proenzyme determined using the MMP-9 ELISA. In addition, this assay recognizes pure recombinant pro-MMP-9 protein but does not recognize active MMP-9 recombinant protein. These results indicate that the assay of the present invention specifically yields free MMP-9.
And recognizes the TIMP binding zymogen form of MMP-9.
【００３８】 （実施例３） この実施例は、本発明のアッセイの１つの実施態様の使用を開示する。Example 3 This example discloses the use of one embodiment of the assay of the present invention.
【００３９】 （提供される物質） スタンダードを、２連でアッセイするべきである。標準曲線を、同じプレート
上で、そしてサンプルと同時に実行しなければならない。ＭＭＰ−９ ＥＬＩＳ
Ａは、標準曲線の２つのセットを実行するのに十分な試薬、および４１サンプル
（１つの標準曲線を用いて全てを一度に２連でアッセイする場合）、または３４
サンプル（２つの標準曲線を用いて２つの別々の場合でアッセイする場合）を提
供する。Materials Provided Standards should be assayed in duplicate. A standard curve must be run on the same plate and at the same time as the sample. MMP-9 ELIS
A shows enough reagents to perform two sets of standard curves, and 41 samples (if one standard curve is used to assay all at one time in duplicate), or 34
Samples (if assaying in two separate cases using two standard curves) are provided.
【００４０】 ・コートしたマイクロタイタープレート：ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体でコ
ートした９６の取り外し可能なウェル。• Coated microtiter plate: 96 removable wells coated with MMP-9 polyclonal antibody.
【００４１】 ・ＭＭＰ−９ スタンダード：組換えＭＭＰ−９タンパク質に対して較正され
る、凍結乾燥されたＭＭＰ−９タンパク質を含む２種のウイルス。再構築したス
タンダードは、１回使用後に廃棄されるべきである。MMP-9 standard: two viruses containing lyophilized MMP-9 protein, calibrated against recombinant MMP-9 protein. Reconstituted standards should be discarded after a single use.
【００４２】 ・検出抗体：ビオチン化モノクローナル抗ヒトＭＭＰ−９抗体。Detection antibody: biotinylated monoclonal anti-human MMP-9 antibody.
【００４３】 ・４００倍結合物：ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合物：４００倍
濃縮液。-400-fold conjugate: streptavidin-peroxidase conjugate: 400-fold concentrated solution.
【００４４】 ・結合物希釈液：４００倍結合物を希釈するための緩衝液。• Conjugate diluent: Buffer for diluting the conjugate 400-fold.
【００４５】 ・基質：色素原性基質。Substrate: chromogenic substrate.
【００４６】 ・サンプル希釈液：スタンダードおよびサンプルを希釈するために使用される
緩衝液。Sample diluent: buffer used to dilute standards and samples.
【００４７】 ・２０倍プレート洗浄濃縮液：ＰＢＳおよび界面活性剤の２０倍濃縮液。２％
クロロアセトアミド含有。20 × plate wash concentrate: 20 × concentrate of PBS and surfactant. 2%
Contains chloroacetamide.
【００４８】 ・停止溶液：２．５Ｎ硫酸。Stop solution: 2.5N sulfuric acid.
【００４９】 ・プレートシーラー：インキュベーション中プレートにふたをするため。• Plate sealer: to cover the plate during incubation.
【００５０】 （サンプルの調製） 懸濁細胞：遠心分離（１０００×ｇ、１０分間、４℃）によりペレット化し、そ
してテストするために上清を取り除く。サンプルを、−２０℃で保存し得る。 付着細胞：組織培養の培地を取り除き、組織培養培地を遠心分離し（１０００×
ｇ、１０分間）、そしてテストするために上清を取り除く。サンプルを、−２０
℃で保存し得る。 ２０ｎｇ／ｍｌより多くのＭＭＰ−９を含むことが見い出されたサンプル（すな
わち、標準曲線の範囲外である）を、サンプル希釈液（提供した）を用いて希釈
しなければならない。その結果、ＭＭＰ−９濃度を標準曲線範囲内に減少させ、
そして再びアッセイする。Sample Preparation Suspended cells: Pellet by centrifugation (1000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) and remove supernatant for testing. Samples may be stored at -20 <0> C. Adherent cells: Remove the tissue culture medium and centrifuge the tissue culture medium (1000 ×
g, 10 minutes), and remove the supernatant for testing. Samples were taken at -20
Can be stored at ° C. Samples found to contain more than 20 ng / ml MMP-9 (i.e., outside the range of the standard curve) must be diluted with sample diluent (provided). As a result, the MMP-9 concentration was reduced within the standard curve range,
Then assay again.
【００５１】 （詳細なプロトコル） ＭＭＰ−９ ＥＬＩＳＡを、取り外し可能な小板のウェルで提供し、そのため
アッセイは、２つの分離した場合で実行され得る。状態は、変化し得、標準曲線
は、アッセイが実行される各時間を決定しなければならない。スタンダードを、
２連でアッセイするべきである。試薬またはサンプルの交差汚染を避けるために
、ディスポーザブルピペットチップおよび試薬トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）を、全て
の移動について使用するべきである。Detailed Protocol The MMP-9 ELISA is provided in removable platelet wells, so the assay can be performed in two separate cases. Conditions can vary, and a standard curve must determine each time the assay is performed. Standard
Assays should be performed in duplicate. Disposable pipette tips and reagent troughs should be used for all transfers to avoid cross-contamination of reagents or samples.
【００５２】 １．ホイルポーチ（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈ）から適当な数のマイクロタイター
ウェルを取り出し、そしてそれらを空のウェルホルダーに移す。任意の未使用の
ウェルをホイルポーチに戻し、再び密封しそして４℃で保存する。1. Remove the appropriate number of microtiter wells from the foil pouch and transfer them to an empty well holder. Return any unused wells to the foil pouch, reseal and store at 4 ° C.
【００５３】 ２．洗浄緩衝液の作用溶液（１倍）を、２５ｍｌの２０倍濃縮溶液（提供され
る）を４７５ｍｌの脱イオン水に添加して調製する。十分に混合させる。[0053] 2. A working solution (1 ×) of the wash buffer is prepared by adding 25 ml of a 20 × concentrated solution (provided) to 475 ml of deionized water. Mix well.
【００５４】 ３．アッセイが実行される各時間、記載されるように、凍結乾燥したＭＭＰ−
９スタンダードウイルス標識に注意深くそして正確にｄＨ2Ｏおよびサンプル希
釈液をピペッティングすることにより凍結乾燥されたスタンダードを再構成して
、２０ｎｇ／ｍｌの濃度を与える。再構築した標準を時々かき混ぜながら、室温
で１５分間置いた。スタンダードの過剰な攪拌を避ける。ＭＭＰ−９スタンダー
ドを再構築した後、サンプル希釈液で希釈するべきである。７つのチューブを得
て、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５および０ｎｇ／ｍｌとラベ
ルする。２５０μｌのサンプル希釈液を、２０ｎｇ／ｍｌチューブ（最初のチュ
ーブ）を除いて（これは「非希釈」再構成標準となる）各チューブに添加する。
凍結乾燥された物質のもともとのバイアルから５００μｌを取り除き、そしてこ
れを、最初のチューブに加える。この最初のチューブ（２０ｎｇ／ｍｌ）から２
５０μｌを取り除き、そしてこれを２番目のチューブ（１０ｎｇ／ｍｌ）に添加
し穏やかに混合する。６番目のチューブ（０．６２５ｎｇ／ｍｌ）に達するまで
、この手順を繰り返す。最後のチューブ（０ｎｇ／ｍｌ）は、ちょうどサンプル
希釈液のみになるはずである。再構築したスタンダードは、１回使用後に廃棄す
るべきである。[0054] 3. Each time the assay is run, lyophilized MMP-
Reconstitute the lyophilized standard by careful and accurate pipetting of dH 2 O and sample diluent to 9 standard viral labels to give a concentration of 20 ng / ml. The reconstituted standard was left at room temperature for 15 minutes with occasional stirring. Avoid excessive agitation of the standard. After reconstitution of the MMP-9 standard, it should be diluted with the sample diluent. Seven tubes are obtained and labeled as 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0 ng / ml. Add 250 μl of sample diluent to each tube except for the 20 ng / ml tube (the first tube) (this will be the “undiluted” reconstituted standard).
Remove 500 μl from the original vial of lyophilized material and add this to the first tube. From this first tube (20 ng / ml)
Remove 50 μl and add it to the second tube (10 ng / ml) and mix gently. This procedure is repeated until the sixth tube (0.625 ng / ml) is reached. The last tube (0 ng / ml) should be just sample diluent. Reconstituted standards should be discarded after a single use.
【００５５】 ４．全てのサンプルを調製する（４頁参照のこと）。血清および血漿サンプル
は、サンプル希釈液１：１０（正常なサンプル）または１：４０（大部分の癌サ
ンプル）または必要に応じてより多くのサンプル希釈液で、希釈するべきである
。[0055] 4. Prepare all samples (see page 4). Serum and plasma samples should be diluted with sample diluent 1:10 (normal sample) or 1:40 (most cancer samples) or more sample diluent as needed.
【００５６】 ５．５０μｌの検出抗体を各ウェルへピペッティングする。5. Pipette 50 μl of detection antibody into each well.
【００５７】 ６．各サンプルについてきれいなピペットチップを用いて５０μｌを適切なウ
ェルへピペッティングすることによって、サンプルおよび各ＭＭＰ−９スタンダ
ード（２連）に添加する。6 Add 50 μl to the sample and each MMP-9 standard (duplicate) by pipetting 50 μl into the appropriate well using a clean pipette tip for each sample.
【００５８】 ７．プレートシーラーでウェルにふたをし、そして室温で２時間インキュベー
トする。[0058] 7. Cap the wells with a plate sealer and incubate for 2 hours at room temperature.
【００５９】 ８．１倍の洗浄緩衝液で各ウェルが完全に満たされるのを確かめながら、ウェ
ルを３回洗浄する。8. Wash wells three times, making sure each well is completely filled with 1 × wash buffer.
【００６０】 ９．各サンプルウェルおよび標準ウェルについて１００μｌの１倍溶液を供給
するために、結合物希釈液中１：４００で十分な量の４００倍結合物を希釈し（
例えば：３０μｌを１２ｍｌの結合物希釈溶液に添加する）、穏やかに混合する
。使用前に０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。9. Dilute enough 400-fold conjugate 1: 400 in conjugate diluent to provide 100 μl of 1 × solution for each sample well and standard well (
For example: add 30 μl to 12 ml of conjugate dilution solution), mix gently. Filter through a 0.2 μm syringe filter before use.
【００６１】 １０．１００μｌの１倍結合物を各ウェルへピペッティングし、プレートシー
ラーでふたをして、そして室温で３０分間インキュベートする。未使用の１倍結
合物をいずれも廃棄する。10. Pipet 100 μl of 1 × conjugate into each well, cover with plate sealer and incubate at room temperature for 30 minutes. Discard any unused 1x conjugate.
【００６２】 １１．１倍の洗浄緩衝液で各ウェルが完全に満たされるのを確かめながら、ウ
ェルを３回洗浄する。Wash wells three times, making sure each well is completely filled with 11.1 × wash buffer.
【００６３】 １２．ｄＨ2Ｏでプレート全体を流す。シンクの上に逆さにして、そしてペー
パータオル上でタッピングして、ウェルの内容物を取り除く。12. Flush the entire plate with dH 2 O. Invert over the sink and tap on a paper towel to remove the contents of the well.
【００６４】 １３．１００μｌの基質溶液を各ウェルに加え、そして室温で、３０分間暗所
でインキュベートする。13. Add 100 μl of substrate solution to each well and incubate at room temperature for 30 minutes in the dark.
【００６５】 １４．前に添加した基質溶液と同じオーダーで１００μｌの停止溶液を各ウェ
ルに加える。14. Add 100 μl of stop solution to each well in the same order as the previously added substrate solution.
【００６６】 １５．分光光度計プレートリーダーを用いて、４５０／５９５ｎｍ（または、
４５０／５４０ｎｍ）の２波長で各ウェルの吸光度を測定する。停止溶液を加え
て３０分間以内に、ウェルを測定しなければならない。15. Using a spectrophotometer plate reader, 450/595 nm (or
The absorbance of each well is measured at two wavelengths (450/540 nm). Wells must be measured within 30 minutes of adding stop solution.
【００６７】 （結果の評価） １．０を含む各スタンダードの２連の吸光度の値および全てのサンプルの値を
平均する。(Evaluation of Results) Duplicate absorbance values of each standard including 1.0 and the values of all samples are averaged.
【００６８】 ２．グラフ用紙に、Ｘ軸上の各スタンダードの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対し、Ｙ
軸上に各スタンダードの吸光度の平均値をプロットする。2. On the graph paper, for each standard concentration (ng / ml) on the X axis, Y
The average value of the absorbance of each standard is plotted on the axis.
【００６９】 ３．標準曲線から補間することにより未知濃度を決定する。マイクロタイター
プレートデータの分析について利用可能な、種々のマイクロタイタープレートリ
ーダーソフトウェアパッケージ（Ｓｏｆｔｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ
ｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ；Ｋｉｎｅｔ
ｉＣａｌｃ，ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗｉｎｏｏｓｋ
ｉ，ＴＶ）が存在し、これは、この過程を容易にする。[0069] 3. The unknown concentration is determined by interpolation from the standard curve. Various microtiter plate reader software packages available for analysis of microtiter plate data (Softmax, Molecular Dev)
ices Corporation, Menlo Park, CA; Kinet
iCalc, BioTek Instruments, Inc. Winoosk
i, TV), which facilitates this process.
【００７０】 ４．希釈されるサンプルに対し、ＭＭＰ−９濃度は、希釈要因により増加され
なければならない（すなわち、もしサンプルを５倍希釈したならば、標準曲線か
ら得られるＭＭＰ−９値は、５倍増加しなければならない）。[0070] 4. For the sample to be diluted, the MMP-9 concentration must be increased by the dilution factor (ie, if the sample is diluted 5-fold, the MMP-9 value obtained from the standard curve must increase 5-fold). Must).
【００７１】 本出願で引用される参考文献は、本明細書において参考として援用される。The references cited in the present application are hereby incorporated by reference.
【００７２】 本発明は、これらの好ましい実施態様の参照として、詳細に記載される。しか
し。本開示を考慮する上において、当業者は本発明の精神および範囲内での改変
および改良をし得ることを認識する。The present invention is described in detail with reference to these preferred embodiments. However. In view of the present disclosure, those skilled in the art will recognize that modifications and improvements may be made within the spirit and scope of the invention.
【図１】 図１は、標準曲線を示す：各標準の平均シグナルは、２種の異なるロットのプ
レートおよび２種のロットの検出抗体を使用して８アッセイ中４回の反復実験に
おいて実行される。FIG. 1 shows the standard curves: the average signal of each standard was performed in four replicates in eight assays using two different lots of plates and two lots of detection antibody. You.
【図２】 図２は、本発明のアッセイの１つの実施態様の感度を示す：検出の低限界（Ｌ
ＬＤ）（感度を規定するために一般的に使用される）を、２種の異なるロットの
プレートおよび２種の異なるロットの検出抗体を使用して、０の４回の反復実験
を８回アッセイして測定した。全平均シグナルおよび共に計算される標準偏差の
ゼロを算出した。各スタンダードの全平均値（８アッセイ中４つの反復において
実行する）を、標準曲線について使用した（図１）。そして応答、標準曲線から
の投与量におけると解される０プラス２の標準偏差のシグナル平均値が、ＬＬＤ
である；これは、９５％の信頼度を有する０でない最も小さい投与量である。FIG. 2 shows the sensitivity of one embodiment of the assay of the invention: low limit of detection (L
LD) (commonly used to define sensitivity) was assayed eight times in four replicates of 0 using two different lots of plates and two different lots of detection antibody And measured. The total mean signal and zero of the standard deviation calculated with it were calculated. The overall average of each standard (performed in 4 replicates of 8 assays) was used for the standard curve (FIG. 1). The response, the signal mean of 0 plus 2 standard deviations, interpreted at the dose from the standard curve, is the LLD
This is the smallest non-zero dose with 95% confidence.
【図３】 図３は、本発明のアッセイの特異性を示す：ＥＬＩＳＡ中で使用されないＭＭ
Ｐ−９抗体、ＴＩＭＰ−１抗体、ＴＩＭＰ−２抗体およびＴＩＭＰ−３抗体を有
するＭＭＰ−９陽性サンプル（ＰＭＡ処置されたＨＴ１０８０細胞およびＨＬ−
６０細胞）の免疫親和性抽出後、ＥＬＩＳＡにより検出されるＭＭＰ−９のレベ
ルを示す。FIG. 3 shows the specificity of the assay of the invention: MM not used in the ELISA
MMP-9 positive samples with P-9, TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3 antibodies (PM1080 treated HT1080 cells and HL-
10 shows the levels of MMP-9 detected by ELISA after immunoaffinity extraction of (60 cells).
【図４】 図４Ａ−４Ｄは、酢酸２−アミノフェニル第二水銀（ＡＰＭＡ）処置後、本発
明のＭＭＰ−９ＥＬＩＳＡにより検出されるＭＭＰ−９のレベルを示す。ＡＰＭ
Ａは、潜伏性９２ｋＤａ酵素のＮ末端プロ配列の自己触媒切断を促進し、活性型
酵素を生ずる。Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６３５１
−６３５６，１９９５。ザイモグラフィーによるサンプルの分析は、ＡＰＭＡに
よるプロ酵素の切断およびＭＭＰ−９ＥＬＩＳＡで決定されたプロ酵素のレベル
との良い相関の両方を示した。ＭＭＰ−９誘導のいくつかの方法は、陽性サンプ
ル（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ（ＡＲ）、５０ｎｇ／
ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１ｎｇ／ｍｌトランスホーミング増殖因子ベータ
（ＴＧＦｂ）および２５ｎｇ／ｍｌホルボール１２−ミリステート１３−アセテ
ート（ＰＭＡ）を用いる処置）を生成させるために使用した。ＭＭＰ−９のレベ
ルの調節を含む正常なヒト血清（ＮＨＳ）は、ＡＰＭＡで処置され、そして分析
されるようなものであった。FIGS. 4A-4D show levels of MMP-9 detected by the MMP-9 ELISA of the present invention following 2-aminophenylmercuric acetate (APMA) treatment. APM
A promotes autocatalytic cleavage of the N-terminal prosequence of the latent 92 kDa enzyme, yielding the active enzyme. Shapiro et al. Biol. Chem. 270: 6351
-6356, 1995. Analysis of the sample by zymography showed both pro-enzyme cleavage by APMA and good correlation with pro-enzyme levels determined by MMP-9 ELISA. Some methods of MMP-9 induction include positive samples (eg, 50 ng / ml amphiregulin (AR), 50 ng / ml).
ml epithelial growth factor (EGF), 1 ng / ml transforming growth factor beta (TGFb) and 25 ng / ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Normal human serum (NHS) containing modulation of MMP-9 levels was as if treated with APMA and analyzed.
【図５】 図５は、ＨＬ−６０細胞においてＭＭＰ−９タンパク質のアップレギュレーシ
ョンを誘導するホルボールエステルを示す。ＭＭＰ−９遺伝子発現の誘導が、マ
クロファージの分化に関係することが示されている。Ｘｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７３：１１５７６−１１５８２，１９９８。ホルボール１２−ミリ
ステート１３−アセテート（ＰＭＡ）は、研究された全ての濃度でＭＭＰ−９タ
ンパク質の合成を誘導した。ＰＭＡのタイミングに密接に並行するこのアップレ
ギュレーションは、細胞接着および拡散、マクロファージの分化の特徴を誘導し
た。FIG. 5 shows phorbol esters that induce up-regulation of MMP-9 protein in HL-60 cells. Induction of MMP-9 gene expression has been shown to be involved in macrophage differentiation. Xie et al. Biol.
Chem. 273: 11576-11582, 1998. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) induced the synthesis of MMP-9 protein at all concentrations studied. This upregulation, closely parallel to the timing of PMA, induced characteristics of cell adhesion and spread, macrophage differentiation.
【図６】 図６は、ＨＴ１０８０におけるＭＭＰ−９のアップレギュレーションを誘導す
るホルボールエステルを示す。ＰＭＡは、ＨＴ１０８０細胞によるＭＭＰ−９の
発現の増加を示す。Ｍｏｒｏｄｏｍｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：６０３
−６１１，１９９２；Ｌｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６７：３３
３−３４０，１９９６。本発明のＭＭＰ−９ ＥＬＩＳＡは、時間依存的な様式
で合成におけるこの増加を検出する。FIG. 6 shows phorbol esters that induce up-regulation of MMP-9 in HT1080. PMA shows increased expression of MMP-9 by HT1080 cells. Mordomi et al., Biochem. J. 285: 603
-611, 1992; Lim et al. Cell. Physiol. 167: 33
3-340, 1996. The MMP-9 ELISA of the present invention detects this increase in synthesis in a time-dependent manner.
【図７】 図７Ａおよび図７Ｂは、ヒト血清および血漿におけるＭＭＰ−９の検出を示す
：本発明のアッセイにより検出されるＭＭＰ−９のレベルは、正常な血清および
血漿サンプルと比較して、癌血清サンプルにおいて有意に高まった（左図は、対
数スケールにおけるデータであり、右図は、直線スケールである）。以下のサン
プルを、アッセイした：正常ヒト血清（ＮＨＳ）、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）、子
宮頚癌（ＣＶ）患者からの血清、乳癌（ＢＲ）患者からの血清、および前立腺癌
（ＰＴ）患者からの血清。FIGS. 7A and 7B show the detection of MMP-9 in human serum and plasma: the levels of MMP-9 detected by the assays of the present invention were compared to normal serum and plasma samples. Significantly increased in cancer serum samples (left panel data on log scale, right panel on linear scale). The following samples were assayed: normal human serum (NHS), normal human plasma (NHP), serum from cervical cancer (CV) patients, serum from breast cancer (BR) patients, and from prostate cancer (PT) patients. Serum.
【図８】 図８は、本発明のＭＭＰ−９免疫アッセイの臨床的有用性を示す。このアッセ
イは、９５％臨床的特異性（非影響の個体を認識する能力）において９０％の臨
床的感受性（影響される個体を認識する能力）を有する。FIG. 8 shows the clinical utility of the MMP-9 immunoassay of the present invention. This assay has 90% clinical sensitivity (ability to recognize affected individuals) at 95% clinical specificity (ability to recognize unaffected individuals).
【図９】 図９は、本発明のアッセイを使用する並行性を示す：本研究では、１０の陽性
サンプルの希釈回収を試験した。この希釈液で、ＭＭＰ−９ ＥＬＩＳＡを行い
、そして希釈の直線性を決定するために「予想された」用量に対して「見い出さ
れた」用量をプロットした。その傾きは、有意には異ならなかった。そして切片
は、ゼロと有意には異ならなかった。これらの研究は、交差反応および本アッセ
イで使用される試薬と干渉するマトリックスの効果（例えば、ｐＨ、塩、および
内因性結合物）の非存在下で一貫している。記号：Ｃａ＝癌；ＮＨＳ＝正常ヒト
血清；ＮＨＰ＝正常ヒト血漿；ＰＭＡ＝ホルボール１２−ミリステート１３−ア
セテート；ＥＧＦ＝上皮増殖因子；ＡＲ＝Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ；Ｂｏｔｈ
＝ＥＧＦおよびＡＲ；Ａ＝２×１０6細胞／ｍｌ；Ｂ＝１．０×１０6細胞／ｍｌ
。FIG. 9 shows parallelism using the assay of the invention: In this study, dilution recovery of 10 positive samples was tested. With this dilution, an MMP-9 ELISA was performed and the "found" dose was plotted against the "expected" dose to determine the linearity of the dilution. The slope did not differ significantly. And the intercept did not differ significantly from zero. These studies are consistent in the absence of cross-reactivity and matrix effects (eg, pH, salts, and endogenous binders) that interfere with the reagents used in the assay. Symbol: Ca = cancer; NHS = normal human serum; NHP = normal human plasma; PMA = phorbol 12-myristate 13-acetate; EGF = epidermal growth factor; AR = Amphiregulin;
= EGF and AR; A = 2 × 10 6 cells /Ml;B=1.0×10 6 cells / ml
.
【図１０】 図１０は、本発明のアッセイの精度を示す。：プールされる変動係数（Ｈｅｎ
ｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｎｎｏｎ，Ｃ．Ｄ．，およびＷｉｎｋｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｗ
．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７４ ＨａｒｐｅｒおよびＲ
ｏｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．の公式に従って）およびアッセイ間の変動係
数を、ＭＭＰ−９濃度に対してプロットした。プールされたデータは、２つの異
なるロットのプレートおよび２つの異なるロットの検出抗体を使用して、２つの
別々の場合で４回の反復において８回行ったサンプルから収集した。FIG. 10 shows the accuracy of the assay of the present invention. : Pooled coefficient of variation (Hen
ry, R.R. J. , Cannon, C .; D. And Winkleman, J .; W
. , Clinical Chemistry, 1974 Harper and R.
ow, New York, N.W. Y. And the coefficient of variation between assays was plotted against MMP-9 concentration. Pooled data was collected from samples performed eight times in four separate replicates, using two different lots of plates and two different lots of detection antibody.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウィンシェル， リサ エフ． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02031， カントン， チャップマン ス トリート 447 (72)発明者 デメオ， ローラ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02144， ソマービル， ボストン アベ ニュー 25 (72)発明者 プロバンチャー， ゲイル アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02038， フランクリン， デナ ドライ ブ １ (72)発明者 ミラー， トーマス イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02128， イースト ボストン， レイデ ン ストリート 246 (72)発明者 ソレンセン， クレイグ エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02446， ボストン， サマー ロード 131 (72)発明者 ヒル， デイビッド イー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02474， アーリントン， リッジ スト リート 85 Ｆターム(参考） 4B050 CC10 DD07 LL03 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (72) Inventor Winshel, Lisa F. United States Massachusetts 02031, Canton, Chapman Street 447 (72) Inventor Demeo, Laura United States Massachusetts 02144, Somerville, Boston Avenue 25 (72) Inventor Probuncher, Gail United States Massachusetts 02038, Franklin, Dena Drive 1 (72) Inventor Miller, Thomas E. United States Massachusetts 02128, East Boston, Leiden Street 246 (72) Inventors Sorensen, Craig M. USA, Massachusetts 02446, Boston, Summer Road 131 (72) Inventor Hill, David E. United States Massachusetts 02474, Arlington, Ridge Street 85 F-term (reference) 4B050 CC10 DD07 LL03
Claims (9)
−９の複合体化形態として言及される、メタロプロテイナーゼ１組織インヒビタ
ー（ＴＩＭＰ−１）と複合体化されたＭＭＰ−９を測定する方法であって、以下
の工程、 （ａ）固形支持体上で、該遊離のＭＭＰ−９および複合体化形態のＭＭＰ−９
の両方に特異的に結合する抗体を吸着する工程； （ｂ）該固体支持体上へ吸着される該抗体により、該生物学的サンプルのある
量を該支持体上へ吸着された該抗体に接触させて、その結果該生物学的サンプル
における該遊離のＭＭＰ−９および複合体化形態のＭＭＰ−９が捕捉され、捕捉
ＭＭＰ−９として集合的に呼ばれる、工程； （ｃ）それを検出可能に標識化された抗体に接触させることによって該捕捉Ｍ
ＭＰ−９を検出し、そして該固体支持体から非結合物質を洗い流す工程；および （ｄ）遊離のＭＭＰ−９および複合体化形態のＭＭＰ−９のレベルを、該固体
支持体に結合される該検出可能な標識化抗体の量を検出する工程、 を包含する、方法。1. Free MMP-9 and MMPs in biological samples
A method for measuring MMP-9 complexed with a metalloproteinase 1 tissue inhibitor (TIMP-1), referred to as the complexed form of -9, comprising the following steps: (a) on a solid support The free MMP-9 and the complexed form of MMP-9
Adsorbing an antibody that specifically binds to both; (b) allowing the antibody adsorbed on the solid support to allow an amount of the biological sample to be adsorbed to the antibody adsorbed on the support Contacting so that the free and complexed forms of MMP-9 in the biological sample are captured and collectively referred to as captured MMP-9; (c) detectable thereof By contacting the antibody labeled with
Detecting MP-9 and washing off unbound material from the solid support; and (d) binding the level of free MMP-9 and complexed forms of MMP-9 to the solid support Detecting the amount of the detectable labeled antibody.
記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said biological sample is serum or plasma.
ン、アビジン、ストレプアビジン、色素体、蛍光体、化学発光部分、ハプテンお
よび酵素からなる群から選択される標識に結合される、請求項１に記載の方法。3. The detectably labeled antibody conjugates to a label selected from the group consisting of radioisotopes, bition, avidin, streptavidin, plastids, fluorophores, chemiluminescent moieties, haptens and enzymes. The method of claim 1 wherein the method is performed.
に有用なキットであって、以下： 固体支持体上へ吸着される前記遊離のＭＭＰ−９および複合体化形態のＭＭＰ
−９の両方に特異的に結合する第１の抗体；および 標識に結合されるＭＭＰ−９を特異的に結合する第２の抗体、 を含む、キット。4. A kit useful for measuring MMP-9 in a human biological sample, comprising: the free MMP-9 and a complexed form of MMP adsorbed on a solid support.
A first antibody that specifically binds to both -9; and a second antibody that specifically binds MMP-9, which is conjugated to a label.
学発光部分、ハプテンおよび酵素からなる群から選択される、請求項４に記載の
キット。5. The kit of claim 4, wherein said label is selected from the group consisting of radioisotopes, biotin, plastids, fluorophores, chemiluminescent moieties, haptens and enzymes.
を特異的に結合する抗体に接触させ、その結果、該生物学的サンプルにおける該
ＭＭＰ−９が、該固体支持体上へ吸着された該抗体により捕捉される工程； （ｃ）前記捕捉ＭＭＰ−９を標識に結合されたプロＭＭＰ−９を特異的に結合
する第２の抗体に接触させる工程； （ｄ）該固体支持体から非結合物質を洗い除く工程； （ｅ）該固体支持体に結合される該標識の量を決定する工程；および （ｆ）それによって癌の症状が該患者に対して示される、バックグラウンドま
たはコントロール正常レベルを超える該生物学的サンプルにおけるＭＭＰ−９レ
ベルを工程（ｅ）において提示する工程、 を包含する、方法。6. A method for the detection of cancer in a patient, comprising: (a) obtaining a biological sample from the patient; (b) transferring an amount of the biological sample to a solid. MMP-9 adsorbed on a support
Is contacted with an antibody that specifically binds, so that the MMP-9 in the biological sample is captured by the antibody adsorbed on the solid support; (c) the captured MMP- Contacting 9 with a second antibody that specifically binds pro-MMP-9 bound to a label; (d) washing off unbound material from said solid support; (e) attaching to said solid support Determining the amount of the label bound; and (f) determining the level of MMP-9 in the biological sample above background or control normal levels, whereby cancer symptoms are indicated for the patient. (E).
を吸着させる工程； （ｂ）ヒト血清または血漿のある量を、該血清または血漿中のプロＭＭＰ−９
が該固体支持体に結合された抗体により捕捉されるような、該固体支持体に結合
した該抗体にさらす工程； （ｃ）該捕捉プロＭＭＰ−９を、ＭＭＰ−９を特異的に結合するビオチン化モ
ノクローナル抗体にさらす工程； （ｄ）該固体支持体に結合されない任意の物質を洗い流す工程；および （ｅ）該捕捉プロＭＭＰ−９を、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ストレプト
アビジンおよび該血清または血漿中のＭＭＰ−９量の測定としてのペルオキシダ
ーゼ活性を測定するためのテトラメチルベンジジンのような色素原性基質にさら
す工程、 を包含する方法。7. A method for measuring pro-MMP-9, comprising: (a) adsorbing a polyclonal antibody that specifically binds to pro-MMP-9 on a solid support; (b) human serum or The amount of plasma is determined by the amount of pro-MMP-9 in the serum or plasma.
Exposing the captured pro-MMP-9 to MMP-9 specifically so that is captured by the antibody bound to the solid support; Exposing to a biotinylated monoclonal antibody; (d) washing away any material not bound to the solid support; and (e) removing the captured pro-MMP-9 from horseradish peroxidase-conjugated streptavidin and the serum or plasma. Exposing to a chromogenic substrate such as tetramethylbenzidine to measure peroxidase activity as a measure of MMP-9 levels.
複合体化形態のＭＭＰ−９のレベルが、既知の正常サンプルと比較され、そして
既知の正常サンプルと比較される該遊離のＭＭＰ−９および複合体化形態のＭＭ
Ｐ−９のレベルの上昇の発見が癌の診断である、請求項１に記載の方法。8. The level of free MMP-9 and the complexed form of MMP-9 measured in step (d) is compared to a known normal sample and compared to a known normal sample. Free MMP-9 and complexed forms of MM
2. The method of claim 1, wherein the finding of elevated levels of P-9 is a diagnosis of cancer.
および複合体化形態のＭＭＰ−９測定が癌の診断である、請求項１に記載の方法
。9. In step (d), MMP-9 free of 40 ng / ml or more is used.
2. The method of claim 1, wherein the MMP-9 measurement in a complexed form is a diagnosis of cancer.
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