JP2002524021A - 分子相互作用の検出および薬剤発見のための電気化学的プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、電気化学的分析を実施するための方法および装置に関する。本発明は、電気化学的メディエータの存在下で、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素と電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素との間の特異的結合を検出するための電位測定分析を実施するための電気化学的装置を提供する。結合および競合結合分析を実施するために、本発明の装置を使用する方法も提供する。本発明は、薬剤開発、生化学的分析およびタンパク質精製分析に使用するための、.生物学的結合対の要素間の特異的結合の阻害を検出するための高処理能力スクリーニング分析法を実施する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、生物学的結合対の要素間の特異的結合に依存する電気化学分析を実 施するための方法および装置に関する。詳細には、本発明は、電気化学的メディ エータの存在下で、電極上に固定化される生物学的結合対の第１要素と、電気化 学的に標識された生物学的結合対の第２要素との間の特異的結合を検出するため の電位差測定分析法を実施するための電気化学分析装置を提供する。あるいは、 生物学的結合対の第２の要素が、電気化学的メディエータおよび電気化学的触媒 の基質の存在下で、電気化学的触媒、好ましくは酵素、最も好ましくは酸化還元 酵素に連結される。特に、電気化学的に標識された生物学的に活性な結合物質の 存在下で加わる電圧の全範囲で生じる電流の循環ボルタンメトリー分析を実施す るための装置が本発明によって提供される。また、結合および競合結合分析、詳 細には生物学的に活性な化学物質の複雑な混合物を使用する競合結合分析を実施 するために、本発明の装置を使用する方法も提供される。本発明は、薬剤開発、 生化学的分析およびタンパク質精製アッセイ用の生物学的結合対の要素間の特異 的結合の阻害を検出するために高処理能力スクリーニング分析を実施する方法も 提供する。 ２．先行技術の背景 １９９６年７月９日にＶｒｅｅｋｅらに発行された米国特許第５，５３４，１ ３２号には、親和反応検出用の電極が開示されている。 １９９３年１１月１６日にＧｒｅｇｇらに発行された米国特許第５，２６２， ０３５号には、酸化還元酵素を使用したバイオセンサー電極が開示されている。 Vogt et al.,1965,Inorg.Chem.4: 1157-1163には、ルテニウム−二酸化イオウ 配位化合物について記述されている。 Ford et al.,1968,J.Amer.chem.Soc.90: 1187-1194には、芳香族窒素複素環の ペンタアミンルテニウム錯体の合成について記述されている。 Yocum et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 7051-7055には、ウマ心臓fe rricytochrome cのペンタアミンルテニウム誘導体の調製方法について記述され ている。 Nocera et 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、電気化学的メディエータとの還元／酸化反応に関与することができる化学物質 により電気化学的に標識されている第２の要素をさらに含むものである。 この装置を使用する際に、生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１ 要素に結合している条件で電極に電位が加わると電流が生じる。 好ましい実施態様では、電気化学的分析は、循環ボルタンメトリーかクロノア ンペロメトリーである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は受容体タンパク質か、そ のリガンド結合フラグメントである。別の好ましい実施態様では、生物学的結合 対の第１要素は抗体タンパク質か、その抗原結合フラグメントである。さらに別 の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は、第２のタンパク質に特 異的に結合する第１のタンパク質またはそのフラグメントである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、リガンド、および本発 明の装置の第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素に結合する抗原 またはタンパク質である。当業者には、生物学的結合対の第１要素および第２要 素の適切な選択（たとえば、受容体／リガンド、抗原／抗体等々）がわかるであ ろう。 本発明の特に好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は生物学的結 合対の第１要素の代理リガンド(surrogate ligand)あって、約５０ピコモル濃度 （ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１０ ０マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの結合親 和力を有する。 本発明の装置は、装置が、本発明のそれぞれ多数の前記電極および反応チャン バをさらに含み、各反応チャンバには電解質が入っており、各反応チャンバは、 装置内のこれら多数の電極の中で３つの前記電極のそれぞれ１つと電気化学的に 接触しており、各反応チャンバと電気化学的に接触している電極が、それぞれポ テンシオスタットに電気的に接続していることを特徴とする実施態様も含む。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素はルテニウムで電気化学的 に標識されている。好ましい実施態様では、電気化学的メディエータはルテニウ ム化合物である。特に好ましい実施態様では、電気化学的メディエータまたは電 気化学的標識として使用されるルテニウム化合物は、｛Ｒｕ（ＮＨ₃）₅Ｃｌ｝Ｃ ｌ、Ｒｕ（ＨＮ₃）₆ ³⁺またはＲｕ（ＮＨ₃）₅（Ｈ₂Ｏ）²⁺のようなペンタアミン ルテニウム化合物である。 本発明は、生物学的結合対の第１要素が固定化される対象である多孔性親水性 高分子層で被覆された表面を有し、本発明の装置と一緒に使用するための、また は他の電気化学的分析を実施するための導体または半導体を含む電極も提供する 。 本発明は、本発明の装置の第１電極を製作するためのキットも提供する。本発 明が提供するキットは、導体または半導体を含む第１電極と、生物学的結合対の 第１要素と、電極の表面上に多孔性親水性高分子層を作るための試薬と、電極の 表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素を固定化するため の試薬とを含む。 したがって、本発明は、本明細書で提供されるキットを使用するかまたは他の 方法で、本発明の装置の第１電極を製作する方法も提供する。この方法は、 ａ）導体または半導体を含む電極を提供するステップと、 ｂ）電極の表面上に多孔性親水性高分子層を製作するステップと、 ｃ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素を固 定化するステップと を含む。 本発明は、生物学的結合対の第１要素である本明細書に記載の固定化されたタ ンパク質で被覆された第１電極を含むキットか、あるいは、このキットが上記電 極を製作するための試薬を含み、その試薬が、電極上に固定化されるべき生物学 的結合対の第１要素、好ましくはタンパク質を含む、したがって、電気化学的標 的を含むキットも提供する。また、これらの本発明のキットの実施態様の成分と して提供されるものは、好ましくは、約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍ Ｍ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（ μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの解離定数（Ｋ_d）を特徴とす る、生物学的結合対の第１要素特異性を有する代理リガンドを含む、従って、電 気化学的プローブを含む、少なくとも１つの生物学的結合対の第２要素である。 本発明のキットのある種の実施態様では、生物学的結合対の上記第２要素は、電 気化学的に標識された実施態様として提供される。本発明のキットの他のある種 の実施態様では、生物学的結合対の上記第２要素は、電気化学的に標識された実 施態様をユーザーが製作するのに適した電気化学的標識を含む試薬と一緒に提供 される。キットは、電極に電位が加わる条件で、電極との還元／酸化に関与する ことができる化学物質を含む電気化学的メディエータも提供する。電気化学的に 標識されたプローブを用いた本発明の方法に従えば、任意に且つ有利に、電気化 学的に有用な量の電気化学的メディエータを含むキットも提供される。本発明の 補足的で且つ任意の成分には、本明細書に記載の緩衝液、試薬および電極が含ま れる。 本発明の装置の使用方法も提供される。第１の実施態様では、電気化学的に標 識された生物学的結合対第２要素と、本発明のこの態様による装置を使用して電 極に上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合を検出する方法を提供 する。この実施態様では、検出方法は ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、該第１電極はそれに固定された生物学的結合対の第 １要素を含み、第１電極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み 、各電極はポテンシオスタットに電気的に接続しており、 ここで、第１反応チャンバは、本発明の装置の電気化学的メディエータと、固 定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する、電気化学的に標識さ れた生物学的結合対の第２要素とを含み、第２反応チャンバは、本発明の装置の 電気化学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に 結合しない電気化学的に標識された物質とを含み、他の実施態様では、固定化さ れた生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する電気化学的に標識された生物 学的結合対の第２要素が第１反応チャンバにも第２反応チャンバにも存在するが 、第２反応チャンバ内の電極上に固定化された第１要素は電気化学的に標識され た第２要素を特異的に結合しないことを特徴とする。本方法は、さらに、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと を含み、 ここで、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と、固定化された 生物学的結合対の第１要素との結合が、第２反応チャンバで発生した電流より大 きい電流が第１反応チャンバで発生することによって検出されることを特徴とす る。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、各チャンバ内の電極に電位が 加わるとき各反応チャンバ内で発生する、この電極電流の比較によって検出され る。第１反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素の特異的結合は 、第２反応チャンバで発生するものよりも高い電流出力が第１反応チャンバで発 生し、生物学的結合対の第２要素と、そのチャンバ内の電極に固定化された無関 係の物質との間、または第２反応チャンバ内の電極に固定化された生物学的結合 対の第１要素と、第２反応チャンバ内に含まれる無関係の、電気化学的に標識さ れた物質との間に特異的相互作用は全くない。 本発明の第２の実施態様では、本発明のこの態様による装置を使用して、電気 化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と電極上に固定化された生物学的 結合対の第１要素との結合の阻害因子を同定する方法を提供する。この実施態様 では、検出方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１および第２反応チャンバにおいて、第１電極が それに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極はポテンシオスタ ットに電気的に接続しており、 ここで、各反応チャンバは、本発明の装置の電気化学的メディエータと、固定 化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する電気化学的に標識された 生物学的結合対の第２要素を含み、且つ、第２反応チャンバは、固定化された生 物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素の結合の 阻害因子をさらに含むことを特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子が、第２反応チャンバで発生するものよりも 大きい電流が第１反応チャンバで発生することによって同定されることを特徴と する。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、反応チャンバ内の電極間に 電位が加わるときに各反応チャンバで発生する電流の比較によって検出される。 次いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素との特異的結合 によって発生する電流のレベルおよび量を、特異的結合の阻害因子の存在下でチ ャンバ内で発生する電流のレベルおよび量、および濃度および／または阻害因子 の生物学的結合対の第１要素に対する結合親和力に関連のある差と比較する。 本発明の方法の第３の実施態様では、本発明のこの態様を使用して、電気化学 的に標識された生物学的結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子に関する複雑な化学混合物をスクリーニング する方法を提供し、その方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１および第２反応チャンバにおいて第１電極がそ れに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極はポテンシオスタッ トに電気的に接続しており、ここで、各反応チャンバは、本発明の装置の電気化 学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合す る電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素を含み、且つ第２反応チャ ンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結 合対の第２要素の結合の阻害因子を含む複雑な混合物の一部をさらに含むことを 特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 ここで、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生 物学的結合対の第１要素との結合の阻害因子を有する複雑な混合物が、第２反応 チャンバで発生するものよりも大きい電流が第１反応チャンバで発生することに よって同定されることを特徴とする。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用 は、反応チャンバ内の電極間に電位が加わるときに各反応チャンバで発生する電 流の比較によって検出される。次いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１ 要素と第２要素との特異的結合によって発生する電流のレベルおよび量を、特異 的結合の阻害因子を含む複雑な化学混合物の存在下でチャンバ内で発生する電流 のレベルおよび量、および濃度および／または阻害因子の生物学的結合対の第１ 要素に対する結合親和力に関連のある差と比較する。 本発明のこの実施態様の別の態様では、本方法を使用して、本発明の装置の第 １電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合対の第１ 要素の結合の阻害因子を単離して同定する。この実施態様では、本方法は、 ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合 対の第２要素の結合の阻害因子を化学的に分画して、分画された半混合物を生成 するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対してステップ（ａ）〜ステップ（ｃ） を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合物を同定するステッ プと をさらに含む。 この態様で、ステップ（ａ）〜ステップ（ｅ）を、化学的に分画された半混合 物に対して繰り返し実施して、さらに精製された阻害因子調製物を含む半混合物 を生成できることが理解されるであろう。好ましい実施態様では、化学的分画は 、阻害因子の化学物質または生化学物質を分画するための、化学的方法、生物学 的方法、物理的方法、および免疫学的方法を含む。 本発明の各方法の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、約５ ０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１ ０μＭという生物学的結合対の第１要素に対する解離定数（Ｋ_d）を特徴とする 電気化学的に標識された代理リガンド(surrogate ligand)である。 本発明の第２の態様では、生物学的結合対の要素間の結合を検出するための電 気化学的分析を実施するための別の装置を提供する。本発明のこの態様では、装 置は下記の構成要素： １．導体または半導体であり、多孔性親水性高分子層で被覆された表面を具有 し、生物学的結合対の第１要素および電極に電位が加わる条件で電極との還元／ 酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気化学的メディエータが固定 化されている第１電極と、 ２．電解質水溶液と接触している導体を含む第２の照合電極と、 ３．導電性金属を含む第３の補助電極と を含み、 各電極がポテンシオスタットに電気的に接続しており、さらに本装置は、 ４．各電極が電気化学的に接触している電解質溶液が入っている反応チャンバ をさらに含み、その溶液はさらに、 ５．生物学的結合対の第２の要素であって、電極に電位が加わる条件で、電気 化学的メディエータとの還元／酸化反応に関与することができる化学物質により 電気化学的に標識される第２の要素をさらに含むものである。 この装置を使用する際に、生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１ 要素に結合している条件で電極に電位が加わると電流が生じる。 好ましい実施態様では、電気化学的分析は、循環ボルタンメトリーかクロノア ンペロメトリーである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は受容体タンパク質か、そ のリガンド結合フラグメントである。別の好ましい実施態様では、生物学的結合 対の第１要素は抗体タンパク質か、その抗原結合フラグメントである。さらに別 の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は、第２のタンパク質に特 異的に結合する第１のタンパク質またはそのフラグメントである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、リガンド、および本発 明の装置の第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素に結合する抗原 またはタンパク質である。当業者には、生物学的結合対の第１要素および第２要 素の適切な選択（たとえば、受容体／リガンド、抗原／抗体等々）がわかるであ ろう。 本発明の特に好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は生物学的結 合対の第１要素の代理リガンドあって、約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度 （μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの結合親和力を有する。 本発明の装置は、装置が、本発明の多数の前記の各電極および反応チャンバを さらに含み、各反応チャンバには電解質が入っており、各反応チャンバは、装置 内の多数の電極の中で３つの前記電極のそれぞれ１つと電気化学的に接触してお り、各反応チャンバと電気化学的に接触している電極が、それぞれポテンシオス タットに電気的に接続していることを特徴とする実施態様も含む。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素はルテニウムで電気化学的 に標識されている。好ましい実施態様では、電気化学的メディエータはルテニウ ム化合物またはオスミウム化合物である。特に好ましい実施態様では、電気化学 的メディエータまたは電気化学的標識として使用されるルテニウム化合物は、｛ Ｒｕ（ＮＨ₃）₅Ｃｌ｝Ｃｌ、Ｒｕ（ＨＮ₃）₆ ³⁺またはＲｕ（ＮＨ₃）₅（Ｈ₂ Ｏ）²⁺のようなペンタアミンルテニウム化合物である。好ましい実施態様では、 本発明の装置の第１電極上に固定化された電気化学的メディエータは、オスミウ ム二ピリジン化合物である。 本発明のこの実施態様を使用する際に、生物学的結合対の要素間の特異的結合 相互作用は、電流の観測によって検出される。上記電流は、固定化された電気化 学的メディエータをおよび生物学的結合対の第２要素につけられた電気化学的標 識を活性化する（酸化または還元する）のに十分な電極電位で発生する。上記適 当な電極電位で、酸化された（または還元された）電気化学的メディエータは、 電気化学的標識によって還元（酸化）される。電極電位は、電気化学的メディエ ータ/電気化学的標識の酸化／還元の循環を可能にし、その結果、電流が発生す る。本発明を実行する際に、生物学的結合対の要素の特異的結合によって発生す る電流の量を、生物学的結合対の第２要素を加える前に発生する電流の量、また は既知の非結合要素を加えたときに発生する電流の量（それによって陰性コント ロールを提供する）と比較する。結合の特異性は、結合の既知の阻害因子の存在 下で発生する電流の比較によって決定される。結合阻害、活性化または競合の程 度、能力または速度のさらなる比較は、想定される阻害因子、競合因子、活性化 因子または薬剤リード候補の存在下で発生する電流の程度の分析によって決定さ れ、当業者には、このような比較を実施する具体的な詳細が理解されるであろう が、以下に、さらに十分に開示する。 本発明は、生物学的結合対の第１要素および電極に電位が加わる条件で、電極 により還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気化学的メディ エータがそれぞれ固定化される対象である多孔性親水性高分子層で被覆された表 面を有する、本発明の装置と一緒に使用するための、あるいは他の任意の電気化 学的分析を実施するための、導体または半導体を含む電極も提供する。 本発明は、本発明の装置の第１電極を製作するためのキットも提供する。本発 明が提供するキットは、導体または半導体、生物学的結合対の第１要素、電極上 の多孔性親水性高分子層、電気化学的メディエータ、および電極の表面上の多孔 性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素および電気化学的メディエータ を固定化するための試薬を含む。 したがって、本発明は、本明細書に記載のキットを使用するかまたは他の方法 で、本発明の装置の第１電極を製作する方法も提供する。これらの方法は、 ａ）導体または半導体を含む電極を提供するステップと、 ｂ）電極の表面上に多孔性親水性高分子層を製作するステップと、 ｃ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素およ び電気化学的メディエータを固定化するステップと を含む。 本発明は、生物学的結合対の第１要素である本明細書に記載の固定化されたタ ンパク質および電気化学的メディエータで被覆された第１電極を含むキットか、 あるいは、このキットが上記電極を製作するための試薬を含み、その試薬が、電 極上に固定化されるべき生物学的結合対の第１要素、好ましくはタンパク質を含 む、したがって、電気化学的標的と、電気化学的メディエータを含むキットも提 供する。また、これらの本発明のキットの実施態様の成分として提供されるもの は、好ましくは、約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましく は約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好まし くは約１０ｎＭ〜約１０μＭの解離定数（Ｋ_d）を特徴とする、生物学的結合対 の第１要素特異性を有する代理リガンドを含む、従って、電気化学的プローブを 含む、少なくとも１つの生物学的結合対の第２要素である。本発明のキットのあ る種の実施態様では、生物学的結合対の上記第２要素は、電気化学的に標識され た実施態様として提供される。本発明のキットの他のある種の実施態様では、生 物学的結合対の上記第２要素は、電気化学的に標識された実施態様をユーザーが 製作するのに適した電気化学的標識を含む試薬と一緒に提供される。電気化学的 に標識されたプローブを用いた本発明の方法に従えば、任意に且つ有利に、電気 化学的に有用な量の電気化学的メディエータを含むキットも提供される。本発明 の補足的で且つ任意の成分には、本明細書に記載の緩衝液、試薬および電極が含 まれる。 本発明の装置の使用方法も提供する。第１の実施態様では、電気化学的に標識 された生物学的結合対第２要素と、本発明のこの態様による装置を使用して電極 に上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合を検出する方法を提供す る。この実施態様では、検出方法は、 ａ）本発明の装置の各電極に電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて、第 １電極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加わ る条件で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気 化学的メディエータとを含み、各電極はポテンシオスタットに電気的に接続して おり、 ここで、第１反応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異 的に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素を含み、第２反 応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合しない電 気化学的に標識された物質を含み、他の実施態様では、固定化された生物学的結 合対の第１要素に特異的に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第 ２要素が第１反応チャンバにも第２反応チャンバにも存在するが、第２反応チャ ンバ内の電極上に固定化された第１要素は電気化学的に標識された第２要素に特 異的に結合しないことを特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 ここで、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と、固定化された 生物学的結合対の第１要素との結合が、第２反応チャンバで発生した電流より大 きい電流が第１反応チャンバで発生することによって検出される。生物学的結合 対の要素間の特異的相互作用は、各チャンバ内の電極に電位が加わるとき各反応 チャンバ内で発生する、この電極電流の比較によって検出される。第１反応チャ ンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素の特異的結合は、第２反応チャン バで発生するものよりも高い電流出力が第１反応チャンバで発生し、生物学的結 合対の第２要素と、そのチャンバ内の電極に固定化された無関係の物質との間、 または固定化された生物学的結合対の第１要素と、第２反応チャンバ内に含まれ る無関係の、電気化学的に標識された物質との間に特異的相互作用は全くない。 本発明のこの態様の方法の第２の実施態様では、本発明による装置を使用して 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と電極上に固定化された生 物学的結合対の第１要素との間の結合の阻害因子を同定する方法を提供する。こ の実施態様では、検出方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて、第 １電極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加え られている条件下で電極との還元／酸化反応に関与することができる化学物質を 含む電気化学的メディエータとを含み、各電極はポテンシオスタットに電気的に 接続されており、 ここで、各反応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的 に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素を含み、且つ、第 ２反応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する 生物学的結合対の第２要素の結合の阻害因子をさらに含むことを特徴とする。本 方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子が、第２反応チャンバで発生するものよりも 大きい電流が第１反応チャンバで発生することによって確認されることを特徴と する。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、反応チャンバ内の電極間に 電位が加わるときに各反応チャンバで発生する電流の比較によって検出される。 次いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素との特異的結合 によって発生する電流のレベルおよび量を、特異的結合の阻害因子の存在下でチ ャンバ内で発生する電流のレベルおよび量、および濃度および／または阻害因子 の生物学的結合対の第１要素に対する結合親和力に関連のある差と比較する。 本発明の方法の第３の実施態様では、本発明の装置を使用して、電気化学的に 標識された生物学的結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対 の第１要素との結合の阻害因子に関する複雑な化学混合物をスクリーニングする 方法を提供する。この方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップと、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて、第１電 極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加えられ ている条件下で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含 む電気化学的メディエータとを含み、本装置の各電極はポテンシオスタットに電 気的に接続しており、 各反応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合す る電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素を含み、且つ第２反応チャ ンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結 合対の第２要素の結合の阻害因子を含む複雑な混合物の一部をさらに含むことを 特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子を有する複雑な混合物が、第２反応チャンバ で発生するものよりも大きい電流が第１反応チャンバで発生することによって確 認されることを特徴とする。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、反応 チャンバ内の電極間に電位が加わるときに各反応チャンバで発生する電流の比較 によって検出される。次いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第 ２要素との特異的結合によって発生する電流のレベルおよび量を、特異的結合の 阻害因子を含む複雑な化学混合物の存在下でチャンバ内で発生する電流のレベル および量、および濃度および／または阻害因子の生物学的結合対の第１要素に対 する結合親和力に関連のある差と比較する。 本発明のこの実施態様の別の態様では、本方法を使用して、本発明の装置の第 １電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合対の第１ 要素の結合の阻害因子を単離して同定する。この実施態様では、本方法は、 ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合 対の第２要素の結合の阻害因子を化学的に分画して、分画された半混合物を生成 するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対してステップ（ａ）〜ステップ（ｃ） を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合物を同定するステッ プと をさらに含む。 この態様では、ステップ（ａ）〜ステップ（ｅ）を、化学的に分画された半混 合物に対して繰り返し実施して、ますます精製された阻害因子調製物を含む半混 合物を生成できることが理解されるであろう。好ましい実施態様では、化学的分 画は、阻害因子の化学物質または生化学物質を分画するための、化学的方法、生 物学的方法、物理的方法、および免疫学的方法を含む。 本発明の各方法の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、約５ ０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１ ０μＭという生物学的結合対の第１要素に対する解離定数（Ｋ_d）を特徴とする 電気化学的に標識された代理リガンドである。 本発明の第３の態様では、生物学的結合対の要素間の結合を検出するための電 気化学的分析を実施するためのさらに別の装置を提供する。本発明のこの態様で は、装置は下記の構成要素： １．導体または半導体であり、多孔性親水性高分子層で被覆された表面を有し 、生物学的結合対の第１要素および電極に電位が加わる条件で電極との還元／酸 化反応に関与することができる化学物質を含む電気化学的メディエータが固定化 されている第１電極と ２．電解質水溶液と接触している導体を含む第２の照合電極と、 ３．導電性金属を含む第３の補助電極と を含み、 各電極がポテンシオスタットに電気的に接続しており、さらに本装置は、 ４．各電極が電気化学的に接触している電解質溶液が入っている反応チャンバ をさらに含み、その溶液はさらに、 ５．電極に電位が加えられている条件下で電気化学的メディエータとの還元／ 酸化反応に関与することができる電気化学的触媒に結合している生物学的結合対 の第２の要素であって、反応チャンバ内の電解質溶液が電気化学的触媒の基質を さらに含む第２の要素をさらに含むものである。 この装置を使用する際に、生物学的結合対の第２要素に結合した電気化学的触 媒の存在下、生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１要素に結合して いる条件で電極に電位が加わると電流が生じる。 好ましい実施態様では、電気化学的分析は、循環ボルタンメトリーかクロノア ンペロメトリーである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は受容体タンパク質または そのリガンド結合フラグメントである。別の好ましい実施態様では、生物学的結 合対の第１要素は抗体タンパク質またはその抗原結合フラグメントである。さら に別の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第１要素は、第２のタンパク質 に特異的に結合する第１のタンパク質またはそのフラグメントである。 好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、リガンド、および本発 明の装置の第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素に結合する抗原 またはタンパク質である。当業者には、生物学的結合対の第１要素および第２要 素の適切な選択（たとえば、受容体／リガンド、抗原／抗体、等々）がわかるで あろう。 本発明の特に好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は生物学的結 合対の第１要素の代理リガンドあって、約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度 （μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの結合親和力を有する。 本発明の装置は、装置が、本発明の多数の前記の各電極および反応チャンバを さらに含み、各反応チャンバには電解質が入っており、各反応チャンバは、装置 内の多数の電極の中で３つの前記電極のそれぞれ１つと電気化学的に接触してお り、各反応チャンバと電気化学的に接触している電極が、それぞれポテンシオス タットに電気的に接続していることを特徴とする実施態様も含む。 本発明のこの態様で提供される生物学的結合対の第２要素は、電気化学的触媒 で標識されている。好ましい実施態様では、この電気化学的触媒は酵素であり、 最も好ましくは、結合した補助因子の酵素上の官能基のいずれかが酸化／還元サ イクルに関与する酸化／還元機構によって、その基質から生成物への反応を触媒 することができる酸化還元酵素である。好ましい実施態様では、電気化学的はペ ルオキシダーゼ、たとえば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼである。好まし い実施態様では、本発明の装置の第１電極上に固定化された電気化学的メディエ ータは、オスミウム化合物であり、さらに好ましくはオスミウム二ピリジン化合 物である。 本発明のこの実施態様を使用する際に、生物学的結合対の要素間の特異的結合 相互作用は、電流の観測によって検出される。本発明の装置は、電気化学的メデ ィエータおよび生物学的結合対の第１要素が両者とも、電極を被覆している高分 子層内に固定化されている電極を含む。この装置は、固定化されたメディエータ によって酸化または還元されることができ、且つ溶液中に存在する第３の物質を 触媒的に酸化または還元することができる物質、好ましくは酵素と化学的に結合 した生物学的結合対の第２要素も含み、電気化学的触媒が酵素である実施態様で は、第３の物質は酵素の基質である。しかし、第３の物質は、電極上に存在する 固定化されたメディエータ物質によって直接酸化されたり還元されたりすること はできない。本発明のこの実施態様を使用する際に、生物学的結合対の要素間の 特異的結合相互作用は、電流の観測によって検出される。上記電流は、固定化さ れた電気化学的メディエータをおよび生物学的結合対の第２要素につけられた電 気化学的触媒を活性化する（酸化または還元する）のに十分な電極電位で発生す る。上記適当な電極電位で、酸化された（または還元された）電気化学的メ ディエータは、電気化学的触媒によって還元（酸化）され、その結果、その基質 の触媒を活性化する。基質が消費されると、電極電位は、電気化学的メディエー タ/電気化学的触媒の酸化／還元の循環を可能にし、その結果、電気化学的触媒 による基質の触媒作用に関連した電流が発生する。本発明を実行する際に、生物 学的結合対の要素の特異的結合によって発生する電流の量を、生物学的結合対の 第２要素を加える前に発生する電流の量、または既知の非結合要素を加えたとき に発生する電流の量（それによって陰性コントロールを提供する）と比較する。 結合の特異性は、結合の既知の阻害因子の存在下で発生する電流の比較によって 決定される。結合阻害、活性化または競合の程度、能力または速度のさらなる比 較は、想定される阻害因子、競合因子、活性化因子または薬剤リード候補の存在 下で発生する電流の程度の分析によって決定され、当業者には、このような比較 を実施する具体的な詳細が理解されるであろうが、以下に、さらに十分に開示す る。 本発明のこの態様は、生物学的結合対の第１要素および電極に電位が加わる条 件で、電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気化 学的メディエータがそれぞれ固定化される対象である多孔性親水性高分子層で被 覆された表面を有する電極であって、本発明の装置と一緒に使用するための、あ るいは他の任意の電気化学的分析を実施するための、導体または半導体を含む電 極も提供する。 本発明は、本発明の装置の第１電極を製作するためのキットも提供する。本発 明が提供するキットは、導体または半導体、生物学的結合対の第１要素、電極上 の多孔性親水性高分子層、電気化学的メディエータ、および電極の表面上の多孔 性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素および電気化学的メディエータ を固定化するための試薬を含む。 したがって、本発明は、本明細書に記載のキットを使用するかまたは他の方法 で、本発明の装置の第１電極を製作する方法も提供する。これらの方法は、 ａ）導体または半導体を含む電極を提供するステップと ｂ）電極の表面上に多孔性親水性高分子層を製作するステップと、 ｃ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要素およ び電気化学的メディエータを固定化するステップと を含む。 本発明は、生物学的結合対の第１要素である本明細書に記載の固定化された タンパク質および電気化学的メディエータで被覆された第１電極を含むキットか 、あるいは、このキットが上記電極を製作するための試薬を含み、その試薬が、 電極上に固定化されるべき生物学的結合対の第１要素、好ましくはタンパク質を 含む、したがって、電気化学的標的と、電気化学的メディエータを含むキットも 提供する。また、これらの本発明のキットの実施態様の成分として提供されるも のは、好ましくは、約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好まし くは約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ま しくは約１０ｎＭ〜約１０μＭの解離定数（Ｋ_d）を特徴とする、生物学的結合 対の第１要素特異性を有する代理リガンドを含む、従って、電気化学的プローブ を含む、少なくとも１つの生物学的結合対の第２要素である。本発明のキットの ある種の実施態様では、生物学的結合対の上記第２要素は、電気化学的触媒に結 合されて提供される。本発明のキットの他のある種の実施態様では、生物学的結 合対の上記第２要素は、電気化学的触媒に結合した第２要素をユーザーが製作す るのに適した電気化学的触媒を含む試薬と一緒に提供される。電気化学的触媒を 用いた本発明の方法に従えば、任意に且つ有利に、電気化学的に有用な量の電気 化学的メディエータを含むキットも提供される。本発明の補足的で且つ任意の成 分には、本明細書に記載の緩衝液、試薬および電極が含まれる。 本発明のこの装置の使用方法も提供する。第１の実施態様では、電気化学的に 標識された生物学的結合対第２要素と、本発明のこの態様による装置を使用して 電極に上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合を検出する方法を提 供する。この実施態様では、検出方法は ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて、第 １電極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加え られている条件下で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質 を含む電気化学的メディエータとを含み、本装置の各電極はポテンシオスタット に電気的に接続しており、 第１反応チャンバは、電気化学的触媒に結合した、固定化された生物学的結合 対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素を含み、第２反応チ ャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合しない電気化 学的触媒に結合した物質を含み、且つ各反応チャンバは電気化学的触媒の基質を さらに含み、他の実施態様では、電気化学的触媒に結合した、固定化された生物 学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素が第１反応 チャンバにも第２反応チャンバにも存在するが、第２反応チャンバ内の電極上に 固定化された第１要素は電気化学的触媒に結合した第２要素を特異的に結合しな いことを特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と、固定化された生物学的 結合対の第１要素との結合が、第２反応チャンバで発生した電流より大きい電流 が第１反応チャンバで発生することによって検出されることを特徴とする。生物 学的結合対の要素間の特異的相互作用は、各チャンバ内の電極に電位が加わると き各反応チャンバ内で発生する、この電極電流の比較によって検出される。第１ 反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素の特異的結合は、第２反 応チャンバで発生するものよりも高い電流出力が第１反応チャンバで発生し、生 物学的結合対の第２要素と、そのチャンバ内の電極に固定化された無関係の物質 との間、または固定化された生物学的結合対の第１要素と、第２反応チャンバ内 に含まれる無関係の、電気化学的に標識された物質との間に特異的相互作用は全 くない。 本発明のこの態様の方法の第２の実施態様では、本発明による装置を使用して 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と電極上に固定化された生 物学的結合対の第１要素との間の結合の阻害因子を同定する方法を提供する。 この実施態様では、検出方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて、第 １電極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加え られている条件下で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質 を含む電気化学的メディエータとを含み、本装置の各電極はポテンシオスタット に電気的に接続しており、 各反応チャンバは、電気化学的触媒に結合した、固定化された生物学的結合対 の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素および電気化学的触媒 の基質を含み、且つ第２反応チャンバは、固定化された生物学的結合対の第１要 素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素の結合の阻害因子をさらに含む ことを特徴とする。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子が、第２反応チャンバで発生するものよりも 大きい電流が第１反応チャンバで発生することによって確認されることを特徴と する。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、反応チャンバ内の電極間に 電位が加わるときに反応チャンバで発生する電流の比較によって検出される。次 いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素との特異的結合に よって発生する電流のレベルおよび量を、特異的結合の阻害因子の存在下でチャ ンバ内で発生する電流のレベルおよび量と比較する。 本発明の方法の第３の実施態様では、本発明の装置を使用して、電気化学的に 標識された生物学的結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対 の第１要素との結合の阻害因子に関する複雑な化学混合物をスクリーニングする 方法を提供する。この方法は、 ａ）本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第１反応チャンバと、 本発明の装置の各電極と電気化学的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、ここで、第１チャンバと第２反応チャンバにおいて、第１電 極が、それに固定化された生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加えられ ている条件下で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含 む電気化学的メディエータとを含み、本装置の各電極はポテンシオスタットに電 気的に接続しており、 各反応チャンバは、電気化学的触媒の基質と、電気化学的触媒に結合した、固 定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する電気化学的に標識され た生物学的結合対の第２要素を含み、且つ第２反応チャンバは、固定化された生 物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素の結合の 阻害因子を含む複雑な混合物の一部をさらに含む。本方法は、 ｂ）本発明の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバでそれぞれ電気 化学的分析を実施して、装置の電極内に電流を発生させるステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生した電流を、第２反応チャ ンバ内での電気化学的分析で発生した電流と比較するステップと をさらに含み、 電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子を有する複雑な混合物が、第２反応チャンバ で発生するものよりも大きい電流が第１反応チャンバで発生することによって確 認される。生物学的結合対の要素間の特異的相互作用は、反応チャンバ内の電極 間に電位が加わるときに各反応チャンバで発生する電流の比較によって検出され る。次いで、反応チャンバ内の生物学的結合対の第１要素と第２要素との特異的 結合によって発生する電流のレベルおよび量を、特異的結合の阻害因子を含む複 雑な化学混合物の存在下でチャンバ内で発生する電流のレベルおよび量、および 濃度および／または阻害因子の生物学的結合対の第１要素に対する結合親和力に 関連のある差と比較する。 本発明のこの実施態様の別の態様では、本方法を使用して、本発明の装置の第 １電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合対の第１ 要素の結合の阻害因子を単離して同定する。この実施態様では、本方法は、 ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への、生物学的結合 対の第２要素の結合の阻害因子を化学的に分画して、分画された半混合物を生成 するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対してステップ（ａ）〜ステップ（ｃ） を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合物を同定するステッ プと をさらに含む。 この態様で、ステップ（ａ）〜ステップ（ｅ）を、化学的に分画された半混合 物に対して繰り返し実施して、ますます精製された阻害因子調製物を含む半混合 物を生成できることが理解されるであろう。好ましい実施態様では、化学的分画 は、阻害因子の化学物質または生化学物質を分画するための、化学的方法、生物 学的方法、物理的方法、および免疫学的方法を含む。 本発明の各方法の好ましい実施態様では、生物学的結合対の第２要素は、生物 学的結合対の第１要素の、電気化学的に標識された代理リガンドであって、約５ ０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃度（ ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約１ ０μＭという結合親和力を有する。 本発明の具体的な好ましい実施態様は、下記のある特定の実施態様に関するさ らに詳しい説明および請求の範囲から明白になるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、生物学的結合対の第１要素であるタンパク質標的が固定化される対象 である、活性化ポリマーまたは自己集合単層で被覆された導電性または半導電性 の電極を含み、生物学的結合対の第２要素を含む電気化学的標識ペプチドと相互 に作用する、本発明の第１電極の成分の配置を示す図である。 図２は、ＧＳＴ−ＳｒｃＳＨ３ドメイン融合タンパク質および電気化学的に標 識されたＳＨ３ドメイン特異的結合ペプチドを使用した電気化学的分析プロトコ ールを示す図である。 図３は、図２に示したプロトコールを使用した循環ボルタンメトリーの結果を 示す図である。 図４は、図３に示した実験結果のボルタンメトリー出力の積分およびデータ操 作を示す図である。 図５は、固定されたＧＳＴのみを有する電極を使用して実施した反応と比較し た、図２に示す、固定されたＧＳＴ−ＳｒｃＳＨ３ドメイン融合タンパク質を有 する電極を使用して実施した電気化学的反応との間の、積分した電流出力の差を 示すグラフである。 図６は、ペプチドの電気化学的標識および標識タンパク質と電気化学的メディ エータとの酸化還元相互作用に関する化学反応の図式を示す図である。 図７は、循環ボルタンメトリー法の特徴を示す図である。 図８は、ｓｒｃ標的タンパク質とセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した 代理リガンドとの結合ときに発生する電流を示す図である。この図は、非結合代 理リガンドを加えたときに発生する電流も示す。３００秒で過酸化水素を加えた 後、６００秒で代理リガンドを加えた。 図９は、図８と同じ条件で、代理リガンドがチロシンＲＮＡシンセターゼに結 合したときに測定した電流を示す図である。 図１０は、既知の阻害因子が、チロシンＲＮＡシンセターゼから代理リガンド を離したときに観測された電流の損失を示す図である。 図１１は、代理リガンドと既知の競合因子であるチロシンＲＮＡシンセターゼ を同ときに加えたときの電流応答を示す図である。 図１２は、阻害因子とともに予めインキュベートしておいたチロシンＲＮＡシ ンセターゼに代理リガンドを加えたときの電流応答を示す図である。 図１３は、チロシンＲＮＡシンセターゼ競合阻害因子濃度が漸増する条件で代 理リガンドを使用した電流応答の減少を示す図である。 図１４は、チロシンＲＮＡシンセターゼ競合阻害因子濃度と、実施例１１に記 載の競合阻害因子を使用した電流の減少との関係を表すグラフである。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、生物学的結合対の要素間の、特に結合を含む特異的相互作用を検出 するための装置および方法を提供する。本発明に関しては、用語「生物学的結合 対」は、少なくとも５０ｍＭの解離定数を示す化学的親和力で特異的に結合する 、任意の２つの生物学的に誘導された分子または単離された分子、またはそれら と特異的に相互に作用する任意の化学物質を含むものとする。具体的には、この 生 物学的結合対の定義に含まれるものは、他のタンパク質と相互に作用するタンパ ク質（そのフラグメントを含む）、タンパク質とペプチド、タンパク質とリガン ド、タンパク質と補助因子、タンパク質とアロステリック調節因子または協同因 子、タンパク質と核酸、タンパク質と炭水化物、抗原と抗体、タンパク質または ペプチドと相互に作用する、脂肪酸、トリグリセリドおよび極性脂質を含む脂質 、受容体とリガンド、特にサイトカイン類、ウイルス受容体対、酵素と基質、酵 素と阻害因子である。生物学的結合対の少なくとも１つの要素と相互に作用する 任意の化学化合物または混合物もこの定義に含まれる。本発明の生物学的結合対 の要素は、天然分子、合成分子、またはリコンビナント遺伝学的方法、生化学的 単離方法、生化学的抽出方法によって調製された分子を含むものとする。生物学 的結合対の要素の合成的実施態様は、一般に、それらが似ているか、似ているか 模倣するように構築される、任意の天然の類似物の少なくとも一部との構造的類 似性を共有すると理解される。以上の定義は、非排他的的且つ非限定的であり、 規定の化学的親和力で特異的に相互に作用することができる任意の２つの生物学 物質または化学物質を含む。 本発明の装置は、第１の、多孔性親水性高分子材料で被覆された導電性または 半導電性の電極を含む。本発明の導電性または半導電性の電極を製作するのに有 用な材料の非限定的例には、金属含浸ガラス、たとえば、スズドープ処理酸化イ ンジウムやフッ素ドープ処理酸化スズガラス、金、炭素またはプラチナなどが含 まれる。本発明の第１電極のコーティングとして有用な材料の例には、寒天、ア ガロース、デキストランおよび改良型デキストラン、アクリルアミド、ピロール 、およびピロール−カルボキシレート、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロ ース、マイラー、ナフィオン（Ｎａｆｉｏｎ）、ポリエチレン、ポリプロピレン 、ポリピロール、ポリチオフェン、およびポリアニリンが含まれる。本発明の第 １電極のコーティングは、コーティング物質の化学的性質および導電性または半 導電性の電極材料に応じた方法を使用して製作される。たとえば、ピロールを使 用 して電気重合によって、あるいは可溶性担体、たとえば、ポリスチレン、マイラ ーやナフィオンを使用して、回転成形、蒸発またはin situ重合によって、電極 表面を被覆することができる。これらのコーティングを、たとえば、その厚さを 調節することによって、未結合不純物に対する耐性に関して最適化する。電極コ ーティング材料の性質に応じた様々な化学結合技術を使用して、生物学的結合対 の要素、たとえば、タンパク質を電極に結合させる。たとえば、電極が、酸化金 属、炭素または金の上のマイラー、炭素または金の上の酸化ポリスチレン、金の 上のアルカンチオール−カルボキシレート自己集合単層（ＳＡＭＳ）、酸化金属 の上のカルボキシレートＳＡＭＳ、または電気重合したカルボキシレート含有モ ノマーを含むとき、カルボジイミド架橋が有用である。あるいは、上記のいずれ かの方法または高分子コーティングへの受動吸着によってアビジンまたはストレ プトアビジンを電極に結合させることができ、次いで、アビジンまたはストレプ トアビジンとの相互作用を介して、ビオチン−結合標的タンパク質を結合させる 。さらに、二価ニッケルイオン（Ｎｉ²⁺）を結合することができるコーティング を具有する電極に、ポリ−ヒスチジン付加標的を結合させてもよい。以上の方法 は、タンパク質および温度安定性、結合リガンドの溶剤接近可能性およびリガン ド結合効率に適するように選択し、最適化される。 本発明の装置は、生物学的結合対の第２要素も提供し、上記第２要素は、電気 化学的に標識されていることを特徴とする。電気化学的標識は、本装置の反応チ ャンバ内の電極間に電位が加わったときに、電気化学的メディエータおよび本装 置の第１電極との還元／酸化（酸化還元）反応に関与することができる化学物質 、一般に、ルテニウム、オスミウムまたはコバルトを含む陽イオンを含む陽イオ ン物質と定義される。ペプチドを含む生物学的結合対の第２要素の場合、Ｒｕ^{2+ /3+} −アミン錯体のような無機錯体、フェロセン、オスミウム−ポリピルジル錯 体およびコバルト−ポリピルジル錯体が、ヒスチジン残基またはシステイン残基 を介して、またはアミノ末端で、ペプチドに結合される。酸化還元−活性有機 分子、たとえば、パラコート誘導体やキノン類は、リジン残基またはシステイン 残基を介して、またはアミノ末端で、酸化還元−活性有機部分を結合することに よって、ペプチドに結合される。 このような酸化還元−活性な有機分子および無機分子は、本発明の装置の反応 チャンバの電解質溶液中の電気化学的メディエータとしても使用され、メディエ ータが、使用される電気化学的標識との電気化学的適合性が得られるように選択 される。電気化学的標識とメディエータとの組み合わせの選択は、電流感度、標 識の特異性および半導体電極コーティングのポリマーマトリックス内を拡散する 能力に合わせて最適化される。 本発明を実行する際に、生物学的結合対の第２要素を含む好ましい化合物は、 生物学的結合対の第１要素に対する「代理(surrogate)」リガンドである。本発 明では、用語「代理リガンド」は、生物学的結合対の第１要素を含む規定された 標的に特異的に結合する一組の生物学的活性化合物を定義するものとする。この 定義は、生物学的結合対の第１要素を含む標的、特に標的タンパク質の、天然リ ガンドを含む様々なリガンドを含むが、本発明の代理リガンドは、好ましくは、 約５０ピコモル濃度（ｐＭ）〜約０．５ｍＭ、さらに好ましくは約１ナノモル濃 度（ｎＭ）〜約１００マイクロモル濃度（μＭ）、最も好ましくは約１０ｎＭ〜 約１０μＭの解離定数（Ｋ_d）を示す化学的親和力で標的タンパク質に特異的に 結合するものを含む。このような代理リガンドは、本発明の装置の第１電極の表 面における電気化学的標識の濃度で実験的に検出可能な電流が発生するだけの十 分な親和力で結合するが、同時に、経済的で且つ実験的に実行されるこれらの化 合物の濃度で、競合因子および阻害因子によって置き換わるほど結合親和力が弱 いため、好ましい。したがって、代理リガンドは、本発明の方法および装置で、 競合因子物質による結合阻害を検出できるようにするのに必要な程度の特異性お よび必要な程度の解離しやすさの両者を提供する。結合ペプチドが同定されてい る標的の一部を表Ｉに示す。 本発明の方法を実行する際に、電気化学的に標識された代理リガンドである生 物学的結合対の第２要素としては、ペプチド、核酸、カルボキシレート、および 小さな分子などがあるが、その限りではない。ペプチドを生物学的結合対の第２ 要素として使用した本発明の方法の実施態様では、ペプチドをファージ展示組合 せペプチドライブラリー（１９９６年１０月２１日提出の、共同所有で且つ同時 係属の米国特許出願番号第０８／７４０，６７１号（参照により、本明細書に援 用する）参照）ならびに他の方法、たとえば、ピンおよびビーズを用いて調製さ れる合成ペプチドから得ることが好ましい。天然のアミノ酸のみを含むこのよう なペプチドは、電極固定化標的である生物学的結合対の第１要素が立てる電圧条 件で、十分な酸化還元能がないため、電気化学的に標識しなければならない。電 気化学プローブを含むペプチドおよびタンパク質、および本発明の装置および方 法の標的は、固相ペプチド合成を含む合成方法、生化学的単離および部分的タン パク質分解を含む改良技術、およびリコンビナント遺伝学的方法で製作すること ができる（Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning,2d ed,Cold Spring Harbo r 37 Laboratory Press,N.Y.参照）。 有用な電気化学的標識方法の１例は、ペプチド配列内のヒスチジン残基にルテ ニウム基（Ｒｕ（ＮＨ₃）₅（ＯＨ₂）₂ ²⁺を加える方法である。あるいは、合成後 に、電気化学的標識をアミノ末端またはカルボキシ末端に加えるか、あるいはシ ステイン残基の反応性側鎖チオール基、セリン残基またはトレオニン残基の（ま たは炭水化物上の）ヒドロキシル基、またはペプチドのリジン残基のアミノ基に 加えることができる。さらに、ペプチド合成中に組み込むことが可能な「非天然 」アミノ酸（たとえば、Ｄ−アミノ酸や、ε−アミノカプロン酸のようなアミノ 酸類縁体）のFomic誘導体を使用してもよい。 さらに、様々な非ペプチド代理リガンドを、この電極系に合わせて改変するこ とができる。たとえば、標的分子に特異的に結合する核酸（すなわち、ポリヌク レオチドおよびオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ物質およびＤＮＡ物質）を、組 合せ核酸ライブラリーから得ることができ、これらの分子は、（Gold et al.,19 95,Ann.Rev.Biochem.64: 763に開示されている通り）「アプタマー」と呼ばれる 。このようなアプタマーは、３'または５'末端に、標識基で電気化学的に標識す ることができ、あるいは、アプトマーのin vitro生成中に、非分析用ＲＮＡポリ メラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼによって、電気化学的標識基を結合する修飾 されたヌクレオチド三リン酸をオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。最 後に、ある特定の小さい分子を、その結合活性を破壊しない方法で、電気化学的 に標識することがてきる。たとえば、プロテインキナーゼＡへの結合を減少させ ずにサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を電気化学的に標識することができ、その 結果、プロテインキナーゼＡへのｃＡＭＰ結合に影響を及ぼす化合物の電気化学 的分析用の生物学的結合対が提供される。 本発明の装置に有用な電解質溶液には、生理学的に適切なイオン強度（約０． １５Ｍ ＮａＣｌと同等）で且つ中性のｐＨの任意の電解質溶液が含まれる。本 発明の装置の場合に有用な電解質溶液の非限定的な例としては、リン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、および重炭酸ナトリウム緩衝液などがある。参考文献：1．Devlin et al.,1990,Science 249: 404; 2．Lam et al.,199 1,Na ture 354: 82; 3．Fowlkes,1993,Gene 128: 59; 4．Hammer et al.,1992,J Exp. 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、治療薬を開発するための潜在的薬剤リードとして製薬業界で有益である。本発 明のこれらの方法を実行する際に、生物学的結合対の第１要素を含む標的タンパ ク質を電極表面に固定する。この第１電極を、本発明の装置の反応チャンバ、好 ましくは微量滴定プレートのウェルに入れる。上記反応チャンバには、電気化学 的 に標識された代理リガンドおよび代理リガンドが標的タンパク質に結合するのを 阻害する能力について試験する対象である化合物または化合物の混合物が入って いる。（その特異的結合特性を保持している生物学的に活性なタンパク質のフラ グメントも、本発明の電極の標的タンパク質の範囲内に含まれることが理解され るであろう。）たとえば、代表的な実験では、各反応チャンバまたは微量滴定試 料ウェルには、別個の組合せ化合物または精製された天然産物（たとえば、ポリ ケチドまたは醗酵ブロス成分）が入っていてもよい。この化合物を電極の存在下 でインキュベートした後、反応チャンバ内で発生した電流の電位差測定分析法を 実施するが、好ましくは、この分析法は循環ボルタンメトリーである。被験化合 物または被験化合物の混合物の存在下および非存在下で、電気化学的に標識され た代理リガンドが入っているウェルについて、この分析結果を比較する。電気化 学的に標識された代理リガンドが、電極表面上の固定化された標的細胞に結合す るのを阻害する化合物は、標的に結合しない、代理リガンド結合に対して全く影 響を示さない化合物と比較して少ない電流量を生成する。本発明を実行する際に 、標的タンパク質変性に起因する、観測される電流の減少を検出するための適当 なコントロールを各測定に含める。これらのコントロールは、電気化学的メディ エータおよび電気化学的に標識された代理リガンドを含む溶液で用時調製した反 応チャンバ内で、被験化合物の存在下で、無関係の標的タンパク質で被覆した電 極を使用してこれらの化合物を試験することによって、実験用電極を試験するこ とを含む。場合に応じて、本発明の方法は、９６の電極が同時に使用されるよう に作られた９６ウェル微量滴定プレートで実行される。他の実施態様では、固定 化された異なる標的タンパク質を含む複数の電極が各ウェルと電気的に接触して おり、生物学的結合対の第１要素を含む一連の異なる標的と、生物学的結合対の 第２要素を含む様々な異なる電気化学的に標識された代理リガンドとの結合に対 する阻害能力について、１つの化合物を評価するのに使用される。 あるいは、標的タンパク質の立体配座に変化を引き起こすことによって、標的 タンパク質と電気化学的に標識された代理リガンドとの間の特異的結合に影響を 及ぼす化合物を検出するために、競合結合分析を実施する。本発明の方法のこの 実施態様では、先ず第１に、電極を、電気化学的に標識された代理リガンドとと もにインキュベートし、洗浄し、次いで被験化合物が入っている反応チャンバに 入れる。標的上の利用可能部位に結合して標的に立体配座の変化またはアロステ リック変化を引き起こす化合物は、電気化学的に標識された代理リガンドを放出 させ、たとえば、循環ボルタンメトリー分析によって検出される、観測される反 応チャンバ内での電流の減少によって検出される。上述の通り、適切なコントロ ール反応を実施して、標的タンパク質変性による代理リガンドの損失を検出する 。 本発明は、生物学的結合対の要素間の相互作用、たとえば、タンパク質−ペプ チド相互作用やタンパク質−タンパク質相互作用の結合親和力を測定する方法も 提供する。これらの測定は，生物学的結合対の成分間の相互作用の解離定数（Ｋ ｄ）を測定するのに有用である。これらの方法は、結合親和力および解離定数を 測定するための既存の方法、たとえば、表面プラズモン共鳴装置（たとえば、Ｂ このような以前に開示されたテクノロジーと比較して、より迅速で安価であり、 且つ生物学的材料をさほど必要としないため、有利である。さらに、本発明の方 法は、電気プローブおよび分子量が３００ダルトン以上の電気化学的リガンドを 使用して実行することができる。対照的に、従来技術の方法を使用した信号強度 は、結合リガンドのサイズに比例するため、従来技術上周知の方法は、少なくと も約５キロダルトン（ｋＤ）のサイズのリガンドを必要とする。この制限によっ て、カットオフ閾値である５ｋＤ未満の分子量を有する分子の結合相互作用特性 の分析が妨げられる。低分子量化合物は、潜在的薬剤リード化合物の大部分を構 成するため、この制限は重要である。さらに、プローブ濃度、塩濃度および有機 溶剤の存在下での分析性能を含め、本発明の方法および装置を使用する分析条件 は、従来技術を使用するのに必要な分析条件よりも許容範囲が広い。 本発明は、生物学的結合対の要素間の結合親和力および相互作用の化学的「強 さ」を測定する方法も提供する。生物学的結合対の要素間の相互作用の強さを知 ることは、相互作用が薬剤発見用の良好な標的としての可能性を有するかどうか を決定する上で重要である。迅速で、安価で且つ便利なアセイを使用してこれら の相互作用を検出できれば、標的の検証およびスクリーニングが大幅に加速する ことができる。本発明の方法は、特異的に結合するかあるいは特異的に相互に作 用する能力について、生物学的結合対の任意の２つの要素をスクリーニングする を提供する。本発明は、生物学的結合対の一方または両方の、様々な切頭形また は変形を使用して、その結合対の要素間の相互作用の領域の地図を作成するする 方法も提供する。タンパク質−タンパク質相互作用の場合、現在、薬剤発見に重 要なものが幾つかあり、これを表IIに示す。 本発明の方法のさらに別の実施態様では、化学的分子と生化学的分子との複雑 な混合物中の生物学的結合対の要素間の特異的結合および他の相互作用を検出す る方法を提供する。１つの実施態様では、タンパク質：タンパク質相互作用方法 を提供する。このような相互作用は、既存のテクノロジーを使用して検出したり 特性化することが困難である。本発明の方法を使用すると、特定の標的タンパク 質で被覆した電極を、電気化学的に標識された代理リガンドと、電極上の標的タ ンパク質と特異的に相互に作用するタンパク質を含む細胞抽出物とを含む電解質 溶液とともにインキュベートする。本発明の方法を使用した競合結合実験の他の 実施態様の場合に記載した通り、電気化学的に標識された代理リガンドの代わり の相互に作用するタンパク質が結合すると、電気化学的分析、たとえば、循環ボ ルタンメトリーの間に発生する電流の量が減少する。 タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための本発明の方法は、タンパク 質精製中にカラム分画を分析する現在の方法と比較することによって例証される 通り、現在利用できる方法と比較して有利である。現在利用できる技術としては 、 放射性生成物を生成し、既知の酵素活性.を有するタンパク質のみに適用できる クロマトグラフカラム分画の酵素分析がある。 未知の酵素活性を有するタンパ ク質の場合、ＥＬＩＳＡ分析法、放射標識した標的を使用するバンドシフト分析 法、または共免疫沈降法（放射標識した標的に対する抗体を必要とする）が使用 される。これらの各方法は、多くの時間を必要とし且つ退屈であり、不利な安全 性および管理の問題に関して不利な放射化学的検出方法の使用を頻繁に必要とす る。 対照的に、本発明の方法は迅速で特異的で且つ安価である。本発明の方法の電 気化学的スクリーニングのさらなる利点は、このようなスクリーニング方法は、 既存の技術で検出できない弱いタンパク質−タンパク質相互作を検出できること である。本発明の方法は、クロマトグラフィー分画の分析、腫瘍の組織試料中の 標的結合タンパの存在、および、たとえば、期細胞の抽出物を使用することによ る、細胞周期特異的相互作用に関する組織分布調査を含め、タンパク質精製技術 の様々な代替実施態様にも応用できる。 参考文献 Iwabuchi et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 6098; Holmes et al.,1996 ,Science 274: 2089; Rozakis-Adcock et al.,1993,Nature 363: 83; Phizicky et al.,1995,Microbiol.Rev.5 9: 94; Chan et al.,1996,EMBO J. 15: 1045; Ch en et al.,1995,Proc.Natl.Acad Sci.USA 92: 7819; Sudol et al.,1995,FEBS L ett.369: 6 本発明の方法および装置は、下記の理由で、本技術分野で周知の分析技術およ び装置より有利である。第１に、本発明の方法の感度は、生物学的結合対の要素 間の特異的結合相互作用検出を、４〜５桁の濃度の大きさ（すなわち、１０，０ ００〜１００，０００倍）の検出を可能にする。本発明は、放射化学に基づいた 方法に随伴する健康、安全性および管理の問題がない、放射化学検出方法の感度 を有する検出方法を提供する。本発明は、生物学的結合相互作用を、広範囲の結 合親和力にわたって高感度で検出することも可能である.。第２に、本分析方法 は迅速で、安価で且つin vitroで実施される。第３に、本発明を実行する際に使 用される試薬（すなわち、電極および電気化学的に標識された代理リガンド）は 、安定で、且つ、たとえば，放射化学試薬と比べて比較的長い蔵寿命を有する。 第４に、たとえば、循環ボルタンメトリーを使用して観測される薬剤結合反応速 度の変化の測定によって、構造−活性関係を定量的に測定することができる。第 ５に、分析を多重送信することができる。すなわち、各反応を、１種以上の固定 化された標的タンパク質を含有する電極を含む反応チャンバ内で実施することが でき、潜在的薬剤リード化合物の１つまたは混合物を、様々な潜在的標的への結 合について分析することができる。第６に、本発明の方法および装置は、マルチ ウェル（たとえば、９６ウェル微量滴定）分析用プレート、およびその電極およ び反応チャンバの電気化学的成分のロボット制御の使用を含むが、それらに限定 されず、自動化しやすい。第７に、本発明の電気化学的分の感度は、少量の（標 的に結合した約５０，０００電気化学的標識）代理リガンド、阻害化合物、のい ずれかまたは両者を検出することが可能であり、その結果、薬剤スクリーニング のような分析を実施する能率が上がる。第８に、能率が上がった結果、スクリー ニング処理能力が高くなり、薬剤開発の主な障害に対処できる。第９に、本発明 は、既知の方法（たとえば、平衡透析、分析用超高速遠心分離、分析用マイ 料が少なくてすむ、生物学的結合対相互作用の解離定数を測定する方法を提供す る。第１０に、本発明が提供する分析方法は、任意の標的タンパク質または代理 リガンドの結合パートナーの本質に関する情報がない条件で実施することができ る。この利点があるため、タンパク質を特性化することができないうちに標的タ ンパク質の生物学的活性を知っている必要がなくなる。第１１に、本発明の分析 は柔軟であり、任意の生物学的結合対に関する結合または競合結合の分析が可能 である。結合対のいずれかを電気化学的に標識することができ、また適当な分析 条件で、反応チャンバ内の電解質溶液中の生物学的結合対の両要素を電気化学的 に標識することができる。 本発明の装置は、生物学的結合対の第１要素、好ましくはタンパク質、最も好 ましくは受容体またはそのフラグメントと、固定化された電気化学的メディエー タとを含む親水性ポリマー修飾電極も提供する。上記第生物学的結合対の１要素 、たとえばタンパク質と、電気化学的メディエータは、反応基間の共有結合形成 を介して直接か、または互いに反応性の化学的リンカーを介するかのいずれかに よって、高分子担体に化学的に結合している。たとえば、幾つかのアミノ酸の側 鎖はポリエチレングリコールジグリシジルエーテルのエポキシド官能性に付加す ることができる求核性ヘテロ原子を含んでいる。あるいは、ポリリジンのような ポリマーに存在する求核分子は、二官能価活性化電子分子、たとえば、ジシクロ ヘキシルカルボジイミド−活性化ジカルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシン イミド−活性化ジカルボキシレート、またはヒドロキシベンゾトリアゾール−活 性化ジカルボキシレートを介してタンパク質に結合させることができる。電気化 学的メディエータをカップリングする技術には、ポリマー上の求核性原子への遷 移金属錯体の配位、有機メディエータまたは金属錯体リガンド内への反応基の組 み込み、または、ポリマー主鎖に沿った遷移金属−結合部位の組み込みなどがあ る。たとえば、ビスビピリジンクロロオスミウム（II）にポリビニルイミダゾー ルを配位すると、適度の印加電位でＯｓ（II）とＯｓ（III）が互いに取り替わ る、非常に安定なポリマーが生成する。ビピリジンリガンドの化学的修飾 によって、求核分子と、自動化生体ポリマー合成の状況で錯体の直接組み込みが 可能な他の官能基とのカップリングに適した活性化されたカルボキシレート部分 を含有する金属錯体が生成した。 本発明の装置のこれらの実施態様では、電気化学的に活性化された触媒物質を 含む電気化学的触媒にカップリングしている生物学的結合対の第２要素、好まし くは、本明細書に規定されているペプチドまたは核酸代理リガンドも含む。この ような電気化学的触媒の例は、グルコースオキシダーゼやセイヨウワサビペルオ キシダーゼのような酵素であり、それらの基質の酸化または還元に影響を及ぼし 、基質の電気化学に直接影響するには不十分な電位で電気化学的に反応性である 。このような酵素は、基質酸化還元化学における電気化学的バリヤーを低下させ ることによって触媒作用を遂行するため、電極電位の賢明な選択によって電極付 近の酵素触媒反応の選択的な電気化学的検出が可能になると、本技術分野で理解 されている。また、幾つかの合成遷移金属錯体、たとえば、オキソルテニウム（ ＩＶ）、オキソオスミウム（ＩＶ）、オキソモリブデン（ＩＶ）、ジオキソモリ ブデン（ＶＩ）、ジオキソルテニウム（ＶＩ）は、直接電気化学が不可能な電位 で、基質の様々な有機官能基を酸化または還元することができる（たとえば、St ultz et al.,1995,J.Am.Chem.Soc.117: 2520、Cheng et al.,1995,J.Am.Chem.So c.117: 2970、Neyhart et al.,1993,J.Am Chem.Soc. 115: 4423、Schultz et al .,1993,J.Am Chem.Soc.115: 4244、Thorp et al.,1989,Inorg.Chem.28: 889を参 照）。． 本発明のこの実施態様を使用する際に、生物学的結合対の第１要素への生物学 的結合対の第２要素の結合は、電極およびその上に固定化されたメディエータに 接近している電気触媒を集める。電気触媒間、基質と電気化学的メディエータと の酸化還元反応によって、酸化還元等価物が基質に移動するため、電極に電流が 生じる。十分な電位が電極に加わると、固定化されたメディエータは完全に酸化 されるか完全還元される。たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合 した代理リガンドを使用すると、電極表面における代理リガンドと生物学的結合 対の第１要素との結合は、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ酵素を、電極上の 還元された電気化学的メディエータに十分近づけて、酵素そのものを還元する。 この還元形の酵素は活性形であり、したがって、酵素的に作用して溶液中の過酸 化水素に電子を移動することができ、酸素と水を生成する。この酵素は、各触媒 サイクルの後、電極を含むポリマー中の電気化学的メディエータによって構造的 に還元され、工程全体が繰り返されると、代理リガンドの結合が検出され、電極 を通って溶液に流れる電流として計量される。したがって、電極における基質濃 度および印加電位の適当な条件で、発生する電流の量は、電極表面における生物 学的結合対の要素の結合の量およひ程度に比例する。 本明細書で提供される本発明の方法の１つの用途は、生物学的結合対の結合反 応速度を測定する方法である。代理リガンド−酵素複合物の非存在下で（または 非結合物質に結合した酵素の存在下で）、非常に小さい電流をポリマー修飾電極 から酵素基質に移動させる。電気化学的触媒と固定化された生物学的結合対の第 １要素に対する結合特異性がある代理リガンドとの間に複合物を加え、且つ十分 な濃度の電気化学的触媒の基質が存在する条件で、電流が劇的に増加し、最終的 に安定した定常状態値を実現する。酵素の瞬間の再活性化が行われるように電極 電位が選択され、且つ基質が溶液中に非常に余分に存在するため、可能な結合部 位が全部占拠されるまで、電極表面における結合した代理リガンド複合物の数が 漸増するにつれて電流が増加する。電流は、結合反応の速度定数である一般的な 速度定数で増加し、その結果、本発明は上記速度定数を測定するための能率的な 方法を提供する。逆に、複合物で飽和した電極を複合物を含まない溶液中に浸漬 し、発生する電流の減少速度を測定することによって、解離速度定数を測定する ことができる。これらの結合速度および結合強度を知ることは、タンパク質−タ ンパク質、タンパク質−薬剤およびタンパク質−核薬物結合現象を含むがこれに 限定されない、生体分子間の相互作用の理解に不可欠である。 本発明の別の用途では、複合物の結合または結合の欠如を使用して、電気化学 的に不活性な物質による、利用できる結合部位の占拠を測定する。一般に、この 物質は、天然産物か組合せ合成分子のいずれかの大きなライブライーからの１つ の薬剤候補になる。薬剤候補の結合は、少なくとも３つの関連技術によって確認 される。第１の実施態様では、電極を薬剤候補とともにインキュベートして、代 理リガンド複合物を加える前に、候補の薬剤と、電極に固定化された生物学的結 合対の第１要素との間の全ての可能な結合相互作用を起こさせる。薬剤候補の非 存在下で発生する電流と比較したときの、複合物を加えたときの電流の減少は、 電極に固定化された生物学的結合対の第１要素の利用できる結合部位が、薬剤に よって占拠された程度の尺度である。第２の実施態様では、異なる濃度で、代理 リガンド複合物と薬剤候補を同時に加え、薬剤候補の存在が発生する電流に及ぼ す影響を使用して、代理リガンドに対する薬剤の結合阻害定数を測定する。第３ の実施態様では、薬剤を加える前に電極を複合物で飽和することができ、観測可 能な電流の損失が、薬剤候補が代理リガンド結合と置き換わる能力を示す。当業 者は、関心事の任意の生物学的結合対に対する薬剤候補の結合および阻害特性を 特性化するためのこれらの方法の有用性を理解するであろう。 本発明のさらなる特徴を、以下の実施例でさらに十分に例証する。これらの実 施例は、上述の方法および有利な結果のある特定の態様を示す。これらの実施例 は、例示の目的で示すものであって、限定する目的ではない。 実施例１ 電気化学的に標識されたペプチドの調製 当技術分野で認められた技術（Yocom et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7 9 : 7052-7055; Nocera et al.,1984,J.Amer.Chem.Soc.106: 5145-5150参照）を 使用して、電気化学的に標識されたペプチドを調製した。１例では、アミノ酸配 列： Gly-His-Gly-Ser-Gly-Arg-Ala-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Arg-Tyr-NH₂ （SEQ ID No: 1） を有する誘導ペプチドＮＰＤＦ−１を以下の通りに標識した。従来の技術素使用 して、｛Ｒｕ（ＮＨ₃）₅Ｃｌ｝Ｃｌ₂を亜鉛／水銀アマルガム上で還元すること により、電気化学的標識Ｒｕ（ＮＨ₃）₅（Ｈ₂Ｏ）²⁺を生成した（Ford et al.,1 968,J.Amer.chem.Soc.90: 1187-1194: Vogt et al.,1965,Inorg.Chem.4: 1157-1 163参照）。アルゴン雰囲気、室温、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７ ．０）中で、濃度約０．２ｍＭのペプチド（約５ｍｇ）を５０倍モル濃度過剰（ 約１０ｍＭ）のＲｕ（ＮＨ₃）₅（Ｈ₂Ｏ）²⁺と４８時間反応させた（図６）。５ ０ｍＭk緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（Pharmacia,Upsal a,Sweden）にこの溶液を適用することによって、反応を終わらせた。このカラム からのペプチドを含む分画をプールし、酸化し、濃縮した。次いで、酸化混合物 の成分を、４℃の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化して おいたＷｈａｔｍａｎ ＣＭ−セルロース（ＣＭ５２）クロマトグラフィカラム を使用した陽イオン交換クロマトグラフィで分離した。電気化学的標識ペプチド 含有分画を回収し、使用まで４℃で維持した。 実施例２ タンパク質固定化電極の製作 スズドープ処理酸化インジウム電極を２ｃｍ²の四角いガラススライドとして 購入し（Delta Technologies）、以下の通りに使用する準備をした。Ａｌｋｏｎ ｏｘ、純イソプロピリアルコール、蒸留して脱イオンした水（３回）、および、 最後に、所望の緩衝液の中で順次処理することにより、実験室用超音波発生器内 で超音波処理して、電極をきれいにした。各超音波処理を１０分間実施した。次 いで、きれいにした電極を、１，１２−ドデカジカルボン酸の５ｍＭ溶液に浸漬 して室温で４８〜７２時間インキュベートした後、この電極をヘキサン（分析用 グレード）ですすいだ。 下記の通りに、製作した電極へのタンパク質架橋を実施した。１−（３−ジメ チルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドの５ｍＭ溶液５０μＬを電極 の片側に載せ、室温で乾燥させた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）／０．１％Ｔｗ ｅｅｎ２０に溶かした融合タンパク質の４ｍｇ/ｍＬ溶液２０ｍＬを、予めカル ボジイミド処理して乾燥した電極の表面に載せ、４℃で一晩インキュベートして 架橋を進行させた。このインキュバーションの後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液で電極を一度、５分間洗浄し、使 用するまで４℃のＰＢＳ中で保存した。 実施例３循環ボルタンメトリー 改良型スズドープ処理酸化インジウム（ＩＴＯ）電極（面積＝０．３２ｃｍ² ）、プラチナ（Ｐｔ）線対電極および銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）照合電極を 備えた１室ボルタンメトリセルを用いた、ＥＧ＆ＧＰＡＲ２７３Ａポテンシオス タット／ガルバノスタットを使用して、循環ボルタモグラムを収集した。（John ston et al.,1994,Inorg.Chem.33: 6388-6390参照）。図７は、このようなボル タモグラムの１例であり、下記の条件で作成した。５０ｍＭリン酸ナトリム緩衝 液（ｐＨ６．８）／７００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝化水溶液（７８０ｍＭの総 ナトリウムイオン濃度を有する）に溶解した５０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₆ ³⁺標識ペ プチドおよび２０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₅ ³⁺標識ペプチドを含む試料を、１５ｍＶ ／秒の速度で走査した。電気化学的標識ペプチドで走査した後、電極を同じ５０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ですすぎ、次いで５０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₆ ³⁺また は５０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₆ ³⁺を含む未標識ペプチド溶液ですすいだ。洗浄後、 ５０ｍＭ Ｒｕ（ＮＨ₃）₆ ³⁺で循環ボルタモグラムが得られた。電気化学的メデ ィエータの非存在下で、Ｒｕ（ＮＨ₃）₅ ³⁺標識ペプチドの走査では、Ａｇ／Ａｇ Ｃｌに対して−０．２Ｖまでの感知できる還元電流を示さなかった。新たに製作 した電極を各実験に使用し、各電極について緩衝液のみのバックグラウンド走査 を収集し、その後の走査から減じた。 実施例４ 特異的結合検出のための電気化学的アッセイ 本発明の電気化学的分析装置および方法を使用して、以下の通りに、ＳｒｃＳ Ｈ３ドメインと特異的結合ＳＨ３ペプチドとの間の特異的結合相互作用を検出し 、あわせて分析した。実施例２に記載の通りに製作した電極をグルタチオン−Ｓ −トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＳｒｃＳＨ３融合タンパク質（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａから入手した、ＧＳＴ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎシステムを使用して調製 した）、またはＧＳＴ自体を被覆した。実施例１で上述し、図６に示した通り、 ＮＰＤＦ−１ペプチド（ＧＨＧＳＧＲＡＬＰＰＬＰＲＹ：SEQ ID No:１）をルテ ニウムで標識した。この電極を標識ペプチド溶液およびルテニウムメディエータ （ヘキサアミンルテニウム（III））とともに２時間インキュベートした。実施 例３に記載の通りに、電極を緩衝液で洗浄してボルタンメトリーを実施した。ル テニウム電気化学的メディエータの存在下およびルテニウム標識ペプチドの非存 在下でもアッセイを実施した。循環ボルタンメトリー曲線（図３に示す）を積分 し、電気化学的メディエータのみが存在する条件で（図４に示す）、インキュベ ーションおよび循環ボルタンメトリーによって発生するバックグラウンド信号を 減算することによって、データ解析を実施した。積分プログラムを使用してボル タモグラム曲線下面積を積分し、メディエータのみが存在する条件で得られた積 分した電流データを、ＧＳＴのみで被覆した電極とＧＳＴ−ｓｒｃ−ＳＨ３融合 タンパク質で被覆した電極に対する電気化学的に標識されたプローブの存在下で 得られたデータから減じた。これらの結果は、ペプチドとＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ ３被覆電極との相互作用によってはるかに高い信号が発生することを示した（図 ５に信号解析を示す）。これらの結果から、本発明の電気化学的分析法は特異的 タンパク質−ペプチド相互作用を検出できることが証明された。 本発明の電気化学的分析法を使用して、電気化学的に標識されたS113−結合ペ プチドの相互作用は、時間依存性であることが証明される。この時間依存性を 証明するために、ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３融合タンパク質またはＧＳＴで被覆し た電極を、実施例１に記載の通りに製作した、電気化学的に標識された過剰なＳ Ｈ３結合ペプチドとともにインキュベートする。循環ボルタンメトリーを３０分 間隔で少なくとも４時間使用して、電気化学的測定値を得た。ボルタンメトリー の信号の増強（電気化学的に標識されたペプチドの存在下および非存在下での積 分した電流の差を含む）が、電気化学的に標識された特異的合ペプチドの飽和濃 度.でプラトーに達するまで、融合タンパク質−固定化された電極を使用した実 験の時間経過全域で検出される。 ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３−ＳＨ３結合ペプチド結合対を使用して、電気化学的 信号の本発明の電気化学的に標識されたペプチド濃度依存性が証明される。これ らの実験では、異なる量のＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３融合タンパク質の量を、実施 例２に記載の電極に固定化する。個々のインキュベーション時間後に、電気化学 的信号の発生について分析した電気化学的に標識されたＳＨ３−結合ペプチド濃 度範囲を使用して、各ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３固定化電極について、循環ボルタ ンメトリーを実施する。各濃度の固定化されたＧＳＴ−Sre ＳＨ３の信号は、ペ プチド濃度が上昇するにつれて増強し、同等のペプチド濃度では、電極上に固定 化される標的融合タンパク質の量が増加するにつれてボルタンメトリーの信号が 増強する。以上の結果から、電気化学的信号の強さは電極上に固定化されるタン パク質濃度、ならびに溶液の電気化学的に標識されたペプチド濃度に比例するこ とが証明される。 特異的タンパク質−ペプチド相互作用も、ストレプトアビジンとビオチン結合 部位に結合するペプチドとの間の相互作用の電気化学的分析によって証明される 。実施例２に記載の手順を使用して、上述のＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３融合タンパ ク質またはストレプトアビジで被覆することによって電極を製作する。被覆され た電極を 適当な電気化学的メディエータおよび上述の電気化学的に標識されたｓｒｃ Ｓ Ｈ３結合ペプチド物質の存在下で、またはストレプトアビジン上のビオチン結合 部位に結合する、アミノ酸配列： His−Gly−Ser−Gly−Ser−Phe−Ser−His−Pro−Gln−Asn−Thr （SEQ ID No.:２） を有する電気化学的に標識されたペプチド物質とともにインキュベートする。こ のインキュベーションの後、電極を洗浄し、実施例３に記載の通りに循環ボルタ ンメトリーを実施する。上述の通り、循環ボルタンメトリーデータを積分し、電 気化学的メディエータの存在下で且つ電気化学的に標識された特異的ペプチドの 非存在下で、これらの電極を使用して得られた積分したバックグラウンド電流を 、それから減じる。固定化されたGS Ｔ−ｓｒｃ ＳＨ３を有し且つ電気化学的に 標識されたＳＨ３結合ペプチドの存在下で分析される電極、ならびに固定化され たトレプトアビジンを有し且つ電気化学的に標識されたストレプトアビジン結合 ペプチドの存在下で分析される電極では、特異的信号が検出される。しかし、固 定化されたＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３を有し且つ電気化学的に標識されたストレプ トアビジン結合ペプチドの存在下で分析される電極、または電気化学的に標識さ れたＳＨ３結合ペプチドの存在下で固定化されたストレプトアビジンを有する電 極では、特異的信号は検出されない。 固定化された標的タンパク質ＭＤＭ２を有する電極と、電気化学的に標識され た腫瘍サプレッサー遺伝子Ｐ５３のフラグメントに対応するペプチドとの間の特 異的相互作用検出するための、本発明の電気化学的分析法の使用説明を実施する 。実施例２に記載の通りに標的タンパク質ＭＤＭ２で被覆した電極を使用して、 ＭＤＭ２に特異的に結合することが判明している、ｐ５３の生来のアミノ酸配列 ： ビオチン−His−His−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gln−Thr−Phe−Ser−Asp−Le u−Trp−Lys−Leu （SEQ ID No.:3） に由来するアミノ酸配列を有する代理５３リガンドを捕捉する（Picksley et al .,1994,Oncogene 9: 2523参照）。ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３融合タンパク質または ストレプトアビジンで被覆した電極を、非特異的信号用コントロールとして使用 する。ＭＤＭ２固定化電極を、電気化学的に標識されたｐ５３ペプチドの存在下 でインキュベートする。上述の通り電極を洗浄し、電気化学的メディエータ存在 下で循環ボルタンメトリーを実施する。上述の通り、循環ボルタンメトリーデー タを積分し、メディエータの存在下で且つ電気化学的に標識された特異的ペプチ ドの非存在下で、これらの電極を使用して得られた積分したバックグラウンド電 流を、それから減じる。電気化学的に標識されたｐ５３ペプチドおよびメディエ ータの存在下で、ＭＤＭ２固定化電極を使用した循環ボルタンメトリー実験で、 特異的信号が検出され、ｐ５３ペプチドとＭＤＭ２との間の特異的相互作用がわ かる。電気化学的に標識されたｐ５３ペプチドおよび固定化されたＧＳＴ−ｓｒ ｃ ＳＨ３またはストレプトアビジンを有する電極を使用した循環ボルタンメト リー実験では、特異的相互作用は検出されない。以上の結果から、本発明の固定 化された電極を使用して、タンパク質を含む生物学的結合対と電気化学的に標識 された特異的結合ペプチドとの間の特異的相互作用を検出できることがわかる。 実施例５ 組合せライブラリーをスクリーニングするための電気化学的分析法 循環ボルタンメトリーによってＧＳＴ−ｓｒｃ−ＳＨ３融合タンパク質と電気 化学的に標識されたＳＨ３結合ペプチドとの間の相互作用から得られる電気化学 的信号を乱す試料を検出するために、本発明の電気化学的分析法を使用して、組 合せ化学ライブラリーをスクリーニングした。標的：ペプチド相互作用を混乱さ せる化合物に関する化学化合物のライブラリーのスクリーニングに有用な電気化 学的分析では、スクリーニング条件を容易に乱すことができるか、それによって 循環ボルタンメトリー出力を減少させなければならない。場合に応じて、このよ うなスクリーニングを広範囲のｐＨおよび濃度で実施しなければならず、組合 せ化学的ライブラリーで頻繁に遭遇する.一般的な汚染（たとえば、カプリング 試薬）に鈍感でなければならない。 様々な条件で組合せライブラリーをスクリーニングための電気化学的分析法の 活性を評価するために、上述の通りに、本発明のＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３−固定 化電極を電気化学的に標識されたＳＨ３結合ペプチドとともにインキュベートす る。酸、塩基、塩のような選択された化学物質、およびアルデヒド、ケトン、ア ルコールのような官能基を含む化学物質の存在下で、循環ボルタンメトリー実験 を実施する。これらの実験で、これらの化学物質の大部分は、その存在が、電気 化学的信号に影響を及ぼさないことが確認される。 実施例６ 既知のタンパク質：ペプチド相互作用の Ｋｄを測定するための電気化学的分析法 本発明の電気化学的分析方法を使用して、ｓｒｃ−ＳＨ３ドメインと多数の短 い多プロリン特異的結合ペプチドとの間の相互作用のＫｄを測定する。ｓｒｃ ＳＨ３ドメインと、短い多プロリンペプチド、たとえば、Arg−Pro−Leu−Pro− Pro−Leu−Pro（SEQ ID No.: 4）やAla−Pro−Pro−Val−Pro−Pro−Arg（SEQ I D No.: 5）との間の相互作用は、広範に研究されており、ＢＩＡｃ ている。平均すると、これらのペプチドは、５μＭのＫｄでｓｒｃ ＳＨ３ドメ インに結合することがわかっている。これらのデータは、電気化学的分析法が同 じ相互作用に正確なＫｄ値を与える能力を比較するための堅実な基礎を提供する 。 薬理学的に承認された方法との比較を提供するために、本発明の電気化学的分 析方法を使用して、ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３とＳＨ３結合ペプチドの相互作用に 関するＫｄ値を決定する。上述の通り、ＧＳＴ−Ｓｒｃ ＳＨ３融合タンパク質 で被覆した電極を、電気化学的に標識された多プロリンＳＨ３−ドメイン特異的 結合ペプチド物質とともにインキュベートする。上述の通りに循環ボルタンメト リーを使用して電気化学的信号を発生させ、上記実施例５に記載の通りに、その 信号を経時的にモニタリングする。様々なペプチド濃度における電気化学的信号 データを収集し、電気化学的信号を使用してペプチドのＫｄ値を算出する。ＢＩ Ａｃｏｒｅ法を内部コントロールとして使用したＫｄ値も決定し、２つの分析方 法の結果を比較して、本発明の電気化学的分析法を使用して決定した値を検証す る。 実施例７ 複雑な混合物中の タンパク質：ペプチド相互作用を検出するための電気化学的分析法 本発明の電気化学的分析方法および装置を使用して、複雑な混合物中のタンパ ク質：ペプチド相互作用を使用する。様々な異なる標的分子および特異的結合ペ プチド源を個の実験で使用する。 通常、ファージ展示ライブラリーを使用するか、または組合せライブラリーを スクリーニングすることによって、タンパク質の代理リガンドを見つけることが 可能である（１９９６年１０月３１日提出の、共同所有で且つ同時係属の米国特 許出願番号第０８／７４０，６７１号（参照により、本明細書に援用する）参照 ）が、タンパク質の天然リガンドは同定することがさらに困難である。本発明の 電気化学的スクリーニング分析法は、比較的簡単な天然リガンド同定方法を提供 する。本発明の電気化学的分析方法のこの態様を説明するために、細胞抽出物中 のｓｒｃ ＳＨ３ドメインの天然リガンドを検出する。ＧＳＴ−ｓｒｃ ＳＨ３ド メイン融合タンパク質−被覆電極を、電気化学的に標識されたｓｒｃ−ＳＨ３結 合ペプチドとともにインキュベートして、電気化学的に標識されたペプチドを、 ＳＨ３ドメインに特異的に「ローディング」する。次いで、この電極を、約１０⁷ 〜１０⁸のヘラ（HeLa）細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートし、循環ボ ルタンメトリーを実施する。データ分析を実施して、ヘラ細胞抽出物中に存 在する化合物が、電気化学的に標識されたペプチドと置き換わったことに起因す る電気化学的信号の減少の程度を求める。次いで、様々なクロマトグラフィ方法 （たとえば、ＤＥＡＥセファロースを使用する陰イオン交換クロマトグラフィ、 カルボキシメチルを使用する陽イオン交換クロマトグラフィ、セファデックスお よびセファロースを使用するサイズ排除クロマトグラフィ）を含む従来の生化学 的分画技術を使用して、この細胞抽出物を分画する。それぞれの分画後、循環ボ ルタンメトリーで検出される、電気化学的に標識された特異的結合ペプチドの結 合と置き換わることができる化合物の存在について、分画を分析する。このよう な活性を含む分画のみに、生化学的分画の次のステップを実施する。幾つかのこ のような生化学的精製ステップの後で、活性な分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法で分析して、分画の相対的純度を求める。次いで、同種タンパ ク質含有「バンド」のミクロシークエンシングを使用して、特異的ペプチド置換 活性を有する分画を含む活性なタンパク質を単離し、同定する。本発明の方法は 、それによって、生物学的化合物の異種混合物からタンパク質−タンパク質相互 作用を検出するための敏感な分析法を提供する。 The 本発明の電気化学的分析法は、リコンビナント遺伝学的方法によって単離さ れ、同定されるオーファン受容体に対する作用を決定するのにも使用される。多 くの場合、受容体コーディングドメインに似た領域をコーロ化しているＤＮＡ配 列が発見される。これらの配列が発見されたとき、今のところ、コード化された 受容体またはこれらの受容体の天然リガンドの生物学的機能または活性を決定す ることはかなり難しい。未知の受容体配列の場合、受容体の細胞外ドメインを発 現させてファージ展示ペプチドライブラリーのスクリーニングの標的として使用 して、代理リガンドを同定する。次いで、代理リガンドを多くの方法で使用する 。組合せライブラリーの電気化学的スクリーニングを実施して、分析の拮抗物質 を同定する。次いで、これらの化合物をモデル生体系に使用して、受容体の生物 学的役割を明らかにする。代理リガンドは、電気化学的スクリーニング分析に 使用して、天然リガンドも同定する。細胞溶解物または上清を分画し、本発明の 電気化学的スクリーニング分析法で分析して、標識された代理リガンドを電極− 結合標的から退去させる分子を含む分画を同定する。それによって単離されたタ ンパク質リガンドまたはペプチドリガンドをシークエンシングによって同定する ことができる。小分子リガンドを質量スペクトル分析法および多の分析システム で同定することができる。 本発明の電気化学的析法のそのような使用の１例は、ｆａｓ受容体に対するリ ガンドの同定である（Hahne et al.,1996,Science 274: 1363; Nagata et al.,1 995,Science 267: 1449; Takahashi et al.,19 94,Cell 76: 969; Wanatabe−Fu kunaga et al.,1992,Nature 356: 314を参照）。ｆａｓ受容体は、ほぼ全ての細 胞タイプに発現され、そのリガンドによって結合されたとき、アポトーシス経路 を誘発する。受容体に対するリガンドの発現は、はるかに制限されている。１つ の細胞上のリガンドが他の細胞上の受容体と相互に作用するとき、アポトーシス が誘発される。一部の黒色腫細胞の表面上にｆａｓリガンドが発現すると、身体 の免疫細胞にアポトーシスを誘発し、その結果、癌細胞が宿主免疫応答を回避で きることが最近証明されたため、ｆａｓリガンドは、治療上有用な標的である。 標的として使用するために、ｆａｓの細胞外ドメインを代理リガンドを同定す るためのファージ展示に発現させる（たとえば、１９９６年１０月３１日提出の 、共同所有で且つ同時係属の米国特許出願番号第０８／７４０，６７１号（参照 により、本明細書に援用する）に開示されている方法を使用して）。このように して同定された代理リガンドを、電気化学的に標識して、ｆａｓ細胞外ドメイン で被覆された電極上にローディングする。プラズマ細胞上清を分画し、本明細書 に記載の通りに循環ボルタンメトリーおよび電気化学的スクリーニングでその分 画をで分析し、標識された代理リガンドを電極から退去させることができる活性 を含む分画を検出する。従来のクロマトグラフィ技術による一連の分画の後、ｆ ａ ｓ受容体リガンドが検出される。 さらに、本発明の電気化学的分析方法を使用して、ｆａｓ受容体の機能が同定 される。これらの分析法では、ｆａｓ受容体の細胞外ドメインを使用して、上記 の通り、ファージ展示を介して、代理リガンドを得る。次に、標識された代理リ ガンドを電気化学的スクリーニングに使用して、標識されたリガンドを被覆電極 から退去させるか標識されたリガンドと競合する化合物を組合せ化学ライブラリ ーから同定する。同定される化合物は、ｆａｓ活性の作動物質であっても拮抗物 質であってもよい。このスクリーニングで同定された化合物をモデル生物系で試 験し、次の通りに受容体機能を試験する。たとえば、ｆａｓを発現する培養中の 細胞にその化合物を加え、細胞の生物学的応答を観察する。受容体拮抗物質は、 ｆａｓリガンドの存在下でアポトーシス経路を遮断するが、受容体作動物質はｆ ａｓリガンドを模倣し、アポトーシス経路を刺激する結果となる。したがって、 アポトーシスの検出は本発明の電気化学的分析法と併用することができる、ｆａ ｓ受容体機能を分析するための敏感な分析法を提供する。 実施例８ クロノアンペロメトリーおよびヒドロゲルを使用した電気化学的分析法 生物学的結合対の第１要素を含むヒドロゲル被覆電極およびその上に固定化さ れた電気化学的メディエータを使用して、生物学的結合対の要素間の特異的結合 の電気化学分析を実施した。 Ａ．ヒドロゲルおよび電極の調製 Vreekeら（1995,Anal.Chem 67: 303-306）の方法でヒドロゲルを調製した。ガラ ス質のカーボンボルタンメトリー電極（直径３ｍｍ）をBioanalytical Systems （West Lafayette,IN）から購入し、アルミナで磨いた後、Branson 1210 Sonica tor（Fischer Scientific,Raleigh,NC）で超音波処理することによって、使用す る準備をした。電極をメタノールですすぎ、風乾させた。ポリ（エチレングリコ ール４００ジグリシジルエーテル）（ＰＥＧＤＧＥ）を Polysciences（Warrington,PA）から購入した。Ｏｓビピリジン酸化還元中心（ ＰＶＩ-Ｏｓ）で修飾した酸化還元ポリマーポリ（１−ビニルイミダゾール）を 、Oharaら（1993,Anal.Chem.65: 3512−3517）の記載通りに合成した。詳細には 、下記の各溶液を５μＬ混合することによってヒドロゲルを調製した：一般に、 ４〜６ｍｇ/ｍＬのタンパク質濃度で受容体タンパク質またはフラグメントを含 む生物学的結合対の第１要素の溶液、１０ｍｇ/ｍＬ ＰＶＩ−Ｏｓ、および２ ．５ｍｇ/ｍＬＰＥＧＤＧＥ。１μＬの混合物をガラス質カーボン電極の表面上 に広げた。使用する前に、このヒドロゲル被覆電極を室温で一晩硬化させた。 Ｂ．ヒドロゲルを使用した、代理リガンドのｓｒｃＳＨ３への結合の電気化学的 検出 。 セクションＡに上述した通りに、ｓｒｃ ＳＨ３ドメインをヒドロゲルに固定 化した。この電極を、次の通りに調製した代理リガンドを使用した、代理リガン ド結合の電気化学的検出に使用した。 ストレプトアビジン（ＳＡ）（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）、ビオチニ ル化セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｂ−ＨＲＰ）（Sigma）およびビオチニ ル化ｓｒｃＳＨ３代理リガンド（His−Gly−Ser−Gly−Ser−Phe−Ser−His−Pr o−Gln−Asn−Thr;SEQ ID No.2）の複合物を次の通りに調製した。ビオチニル化 ｓｒｃＳＨ３代理リガンドの複合物（１２０μＭ（４ｍｇ／ｍＬ）溶液３μＬ、 ４００pmol）をＢ-ＨＰＲ（２５μＭ（１ｍｇ／ｍＬ）４μＬ、１００pmol）と 混合し、この混合物を、ＳＡ（１６μＭ（１ｍｇ／ｍＬ）溶液１７μＬ）１６μ ｇが入っている管に移した。この混合物を、室温で２０分間、静かにインキュベ ートした。次に、ビオチン（１００μＭ溶液２５μＬ、２５０pmol）を加え、リ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で溶液の体積を１００μＬに増やした。 ＢＡＳ１００Ｂ電気化学アナライザー（BAS,West Lafayette,IN）を使用し て、.電気化学的分析（クロノアンペロメトリー）を実施した。上述のｓｒｃＳ Ｈ３−ヒドロゲル被覆電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ照合電極（ＢＡＳ）およびプラチナ 補助電極を、１％ウシ血清アルビミンを含むＰＢＳ溶液５ｍＬに浸漬した。電気 化学的分析経過を通じて、この溶液を攪拌した。ｓｒｃＳＨ３−ヒドロゲル被覆 （作用）電極と照合電極との間の電位を１００ｍＶに設定した。ｔ＝３００秒に 、０．１Ｍ過酸化水素溶液５μＬを加えることによって、最終濃度を１００μＭ Ｈ₂Ｏ₂とした。ｔ＝６００秒に、ストレプトアビジン／ビオチニル化セイヨウワ サビペルオキシダーゼ（ＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ）複合代理リガンド３１μｇを加えて 、最終濃度を１μｇ／ｍＬＳＡとした。 これらの成分を電気化学的分析溶液に順次加えることによって発生した電流（ ｎＡ）を示すグラフである図８に、この実験結果示す。図８からわかるように、 ｓｒｃＳＨ３代理リガンドを添加すると、経時的に電流の増加が検出された。こ の電流は、ＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合代理リガンドを加えると直ちに発生し、約１５ ００〜２０００秒にプラトーに達した。陰性コントロールとして、上述の通りに 調製した無関係の代理リガンドをクロノアンペロメトリー実験に使用した。代理 リガンドを使用すると、電流は検出されなかった。 以上の結果から、生物学的結合対の第１要素を含むヒドロゲル電極およびその 上に固定化された電気化学的メディエータを、生物学的結合対の第２要素と酸化 還元−依存性酵素触媒との複合物と一緒に、その基質の存在下で使用し、クロノ アンペロメトリーを使用して生物学的結合対の要素間の結合を検出できることが 証明された。 Ｃ.ｔｙｒＲＳへの代理リガンド結合の電気化学的検出 セクションＡに記載の通りに、チロシンアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（ ｔｙｒＲＳ）をヒドロゲル内に固定化した。セクションＢのｓｒｃＳＨ３代理リ ガンドに関する記載の通りに、ｔｙｒＲＳ代理リガンドを含む複合物を調製した 。セクションＢに記載の通りに、クロノアンペロメトリーを実施し、その結果 をＢに示す。ｔｙｒＲＳ代理リガンドは、アミノ酸配列： Leu−Tyr−Ser−Trp−Pro−Asp−Glu−Gln−Tyr−Glu−Arg−Pro−Ser−Gly−Se r−Gly−Lys （SEQ ID No.:6） を持っていた。 ｓｒｃＳＨ３−ＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合代理リガンド実験でみられた通り、ｔｙ ｒＲＳ−ＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合物代理リガンド結合対を使用した実験で、複合代 理リガンドを電解質溶液に加えたときに限って、電流が検出された。無関係の代 理リガンドのＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合物を使用した陰性コントロール実験では、こ れらの実験条件で、検出可能な電流の増加を生じなかった。これらの実験で、セ クションＢに記載の結果が確認され、生物学的結合対間の結合の電気化学的検出 に対するこの実験的アプローチの普遍性が証明された。 実施例９ 生物学的対結合の阻害因子の電気化学的検出 電気化学的分析装置および実施例８に記載の方法を使用して、生物学的結合対 の要素間特異的結合を阻害する能力について化合物の電気化学的分析を実施した 。 実施例８に記載の、生物学的対結合の阻害因子を検出するための、本発明の方 法の代替実施態様は３通りある。第１の実施態様では、複合代理リガンドが、ヒ ドロゲル中の標的に結合された後で、阻害因子を電解質溶液に加えた。これは、 複合物代理リガンドを電解質溶液に加え、プラトーの電流に到達するまで、電流 の発生を検出し、想定される阻害因子を加えて発生する電流量の減少を検出する ことによって実施した。第２の実施態様では、阻害因子と複合代理リガンドを電 解質溶液に同時に加え、想定される阻害因子の存在下で発生する電流の量を、そ の非存在下で発生する電流の量と比較した。第３の実施態様では、複合代理リガ ンドを加える前に、阻害因子を電解質溶液に加えた。第１の方法を使用した分析 結果を図１０に示す。実施例８に記載の通りに、ｔｙｒＲＳおよびＳＡＭ−ＨＲ Ｐ複合ｔｙｒＲＳ代理リガンドを含むヒドロゲル電極を調製した。ｔ＝１３００ 秒に、１ｍＭの阻害因子溶液１００μを加えることによって、最終濃度１０μＭ の、ｔｙｒＲＳの特異的阻害因子であるＮＬ９３２にしたこと以外は、電解質溶 液を実施例８に記載の通りに、クロノアンペロメトリーを実施した。図１０から わかるように、阻害因子を加えると電流が突然減少した（発生電流が約２５％減 少）。以上の結果から、生物学的結合対の結合後であっても、本発明のヒドロゲ ル電極を使用して、生物学的結合対結合の阻害因子を検出できることがわかる。 第２の方法を使用した分析結果を図１１に示す。実施例８に記載の通りに、ｔ ｙｒＲＳおよびｔｙｒＲＳ代理リガンドのＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合物を含むをヒド ロゲルを調製した。１０μＭ ＮＬ９３２（最終濃度、上述の通りに加えた）を 、代理リガンドと同時に（約ｔ＝０）電解質溶液に加えたこと以外は、実施例８ に記載の通りに、クロノアンペロメトリーを実施した。図１１からわかるように 、阻害因子と複合代理リガンドを同時に加えると、ピーク電流が５８％減少した 。本方法を使用して観測された減少は、上記第１の方法を使用して観測された減 少より大きかった。 第３の方法を使用した分析結果を図１２に示す。ｔｙｒＲＳおよびｔｙｒＲＳ 代理リガンドのＳＡ／Ｂ−ＨＲＰ複合物を含むヒドロゲルを調製した。クロノア ンペロメトリー開始する前に、１０μＭ ＮＬ９３２を含む５ｍＬ溶液中で攪拌 しながらヒドロゲル電極を１５分間インキュベートしたこと以外は実施例８に記 載の通りに、クロノアンペロメトリーを実施した。複合物ｔｙｒＲＳ代理リガン ドおよび基質を加えることによって、クロノアンペロメトリー実験を開始し、複 合代理リガンドを加える前に、電極を阻害因溶液中にさらに１５分間維持した。 図１２からわかる通り、ヒドロゲルを阻害因子とともにプレインキュベートする と、阻害因子の非存在下で実施したクロノアンペロメトリーと比較して、ピーク 電流が８０％減少した。 記載した３つの方法は全てｔｙｒＲＳ阻害因子を検出できることが確認された が、最も敏感な方法は、阻害因子とヒドロゲルとをプレインキュベートする方法 であった（３番目に記載の方法）。阻害因子と代理リガンドを同時に加える方法 （２番目に記載の方法）は、感度が中間であり、阻害因子に続いて代理リガンド を加える方法（最初に記載の方法）は、感度が最も低かった。以上の結果から、 本発明の方法および装置が、生物学的結合対の結合を阻害する化合物の敏感な検 出を提供し、それによって、不適当な生物学的結合対結合または疾病と関連した 病理学的生物学的結合対結合の分断に導く潜在的薬剤リードの敏感なスクリーニ ング方法を提供することできる能力が証明された。 実施例１０代理リガンドを使用した結合速度定数の電気化学的測定 実施例８、セクションＣに開示されている、ｔｙｒＲＳとその代理リガンドと の間の結合分析のクロノアンペロメトリー分析を使用して、本発明による電極上 に固定化されたｔｙｒＲＳへの代理リガンドの結合速度定数を決定した。実施例 ８、セクションＡに記載の通りに、ｔｙｒＲＳを含むヒドロゲルを調製した。ｔ ｙｒＲＳ代理リガンドを含む複合物を調製し、実施例８、セクションＣに記載の 通りに、クロノアンペロメトリーを実施した。図９からわかる通り、代理リガン ド複合物を加えると、電流が劇的に減少した。この電流は、単一指数関数的な速 度反応速度論に従って、飽和限界値を達成する。代理リガンド複合物の結合また は置換に関する一次速度定数は、式： （Ｉ_sat−Ｉ）＝（Ｉ_sat−Ｉ₀）exp(-kt) （式中、Ｉは時刻ｔにおける電流であり、ｋは一次速度定数であり、下付き文字 「０」および「sat」は、それぞれ、複合物を添加したとき、および結合が飽和 したときに観測される値を示す）に従って算出することができる。一次速度定数 は、関係： ｋ＝−｛ｌｎ（Ｉ−Ｉ₀）−ｌｎ（Ｉ_sat−Ｉ₀）｝／ｔ を使用して決定することができる。この式を使用して、ｔｙｒＲＳ−代理リ ガンド結合反応の結合速度定数０．００１２／秒を決定した。 同様に、結合の阻害因子をｔｙｒＲＳ−代理リガンドに加えると、図９に示す 通り、また実施例９に記載の通りに、電流が減少した。この電流の減少も、上式 を使用して、阻害因子による代理リガンドの退去に関する速度定数の決定に使用 することができる飽和限界値を達成する。競合阻害因子ＮＬ９３２との代理リガ ンドの置換に関する結合速度定数は０．００３５／秒であった。 実施例１１ 代理リガンド複合物に対する競合阻害因子の阻害定数の決定 実施例８、セクションＣに開示されている通りに、ｔｙｒＲＳとその代理リガ ンド間の結合分析のクロノアンペロメトリー分析を使用して、本発明による電極 上に固定化されたｔｙｒＲＳに結合する代理リガンドの競合阻害因子の阻害定数 を求めた。実施例８、セクションＡに記載の通りに、ｔｙｒＲＳを含むヒドロゲ ルを調製した。実施例８、セクションＣに記載の通りに、ｔｙｒＲＳ代理リガン ドを含む複合物を調製し、クロノアンペロメトリーを実施した。図１３からわか るように、漸増濃度の競合阻害因子ＮＬ９３２を、電極に固定定化されたｔｙｒ ＲＳ−代理リガンド複合物に加えると、代理リガンドのｔｙｒＲＳへの特異的結 合が抑制された。阻害された分画と阻害因子濃度のグラフを図１４に示す。約５ ０ｍＭの阻害因子濃度で競合阻害が開始することがわかる。同様に、他の競合阻 害因子の分析を使用して、ｔｙｒＲＳ−代理リガンド複合物結合の各競合阻害因 子の特異的阻害定数を決定することができる。 前述の開示は、本発明のある特定の具体的な実施態様を強調し、それと同等ま たは等価である修正および変更はすべて、添付の請求の範囲に記載の本発明の精 神および範囲内であると理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フォークス，ダナ・エム アメリカ合衆国、27516 ノース・キャロ ライナ、チャペル・ヒル、ダマスカス・チ ャーチ・ロード 2013 (72)発明者 ソープ，エイチ・ホールデン アメリカ合衆国、27514 ノース・キャロ ライナ、チャペル・ヒル、マリリン・レイ ン 215

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的結合対の要素間の結合を検出するための電気化学的分析を実施す るための装置であって、 導体または半導体を含み、生物学的結合対の第１要素が固定される対象である 多孔性親水性高分子層で被覆された表面を有する第１電極と、 電解質水溶と接触している導電性金属を含む第２の照合電極と、 導電性金属を含む第３の補助電極と を含み、 ここで、各電極はポテンシオスタットに電気的に接続されており、 各電極が該溶液に電気化学的に接触している電解質溶液が入っている反応チャ ンバをさらに含み、 該溶液が、電位が電極に加えられている条件下で電極による還元／酸化反応に 関与することができる化学物質を含む電気化学的メディエータを含み、 前記溶液が、さらに、電位が電極に加えられている条件下で電気化学的メディ エータとの還元／酸化反応に関与することができる化学物質により電気化学的に 標識されている生物学的結合対の第２要素を含み、 生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１要素に結合している条件の 下で、電位が電極に加えられるとき当該装置内で電流が発生することを特徴とす る装置。 ２．電気化学的分析が循環ボルタンメトリーであることを特徴とする請求項１ に記載の装置。 ３．それぞれ多数の前記電極および多数の反応チャンバをさらに含み、各反応 チャンバには電解質が入っており、各反応チャンバが装置内の多数の電極の中の ３つの前記電極のそれぞれ１つに電気的に接触していることを特徴とする請求項 １に記載の装置。 ４．生物学的結合対の第２要素がルテニウムで電気化学的に標識されているこ とを特徴とする請求項１に記載の装置。 ５．電気化学的メディエータがルテニウム化合物であることを特徴とする請求 項１に記載の装置。 ６．生物学的結合対の第１要素が受容体タンパク質またはそのリガンド結合フ ラグメントであり、生物学的結合対の第２要素が受容体タンパク質に特異的に結 合するリガンドであることを特徴とする請求項１に記載の装置。 ７．生物学的結合対の第１要素が、抗体タンパク質またはその抗原結合フラグ メントであり、生物学的結合対の第２要素が、該抗体に特異的に結合する抗原で あることを特徴とする請求項１に記載の装置。 ８．生物学的結合対の第１要素が、第１タンパク質またはそのフラグメントで あり、生物学的結合対の第２要素が、第１タンパク質に特異的に結合する第２タ ンパク質またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の装置 。 ９．導電性金属または半導体を含む電極であって、生物学的結合対の第１要素 が固定された多孔性親水性高分子層で被覆された表面を有する電極。 １０．請求項９に記載の電極を製作するためのキットであって、導体または半 導体を含む電極と、生物学的結合対の第１要素と、電極の表面上の多孔性親水性 高分子層を調製するための試薬と、生物学的結合対の第１要素を電極の表面上の 多孔性親水性高分子層内に固定化するための試薬とを含むキット。 １１．ａ）導体または半導体を含む電極を提供するステップと、 ｂ）電極の表面上に多孔性親水性高分子層を調製するステップと、 ｃ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要 素を固定化するステップと を含む請求項９に記載の電極を製作する方法。 １２．生物学的結合対の第１要素に対して、約１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１ ００マイクロモル濃度（μＭ）の結合親和力を有する生物学的結合対の第２要素 を含む電気化学的に標識された代理リガンド。 １３．ルテニウム化合物で標識された、請求項１２に記載の電気化学的に標識 された代理リガンド。 １４．式：Gly−His−Gly−Ser−Gly−Arg−Ala−Leu−Pro−Pro−Leu−Pro− Arg−Tyr−NH₂（SEQ ID No.:1）、 His−Gly−Ser−Gly−Ser−Phe−Ser−His−Pro−Gln−Asn−Thr（SEQ ID No. :2）、 ビオチン−His−His−Ser−Gly−Ser−Gly−Ser−Gln−Thr−Phe−Ser−Asp− Leu−Trp−Lys−Leu（SEQ ID No.:3）、 Arg−Pro−Leu−Pro−Pro−Leu−Pro（SEQ ID No.:4）、 Ala−Pro−Pro−Val−Pro−Pro−Arg（SEQ ID No.:5）、または、 Leu−Tyr−Ser−Trp−Pro−Asp−Glu−Gln−Tyr−Glu−A.rg−Pro−Ser−Gly −Ser−Gly−Lys（SEQ ID No.:6） で表されるペプチドを含む請求項１２に記載の電気化学的に標識された代理リガ ンド。 １５．ルテニウム化合物を含む請求項１に記載の電気化学的メディエータ。 １６．請求項１に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的結 合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合を 検出する方法であって、 ａ）請求項１に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、請 求項１に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供するス テップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第１電 極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテンシオ スタット電気的に接続されており、ここで、前記第１反応チャンバが請求項１に 記載の電気化学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要素に特 異的に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含み、且 つ、第２反応チャンバが請求項１に記載の電気化学的メディエータと、固定化さ れた生物学的結合対の第１要素に特異的に結合しない電気化学的に標識された物 質とを含むステップを含み、さらに、 ｂ）請求項１に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそれ ぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合が検出されることを特徴とするステップと を含む方法。 １７．請求項１に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的結 合対の第２要素と電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合の阻 害因子を同定する方法であって、 ａ）請求項１に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、請 求項１に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供するス テップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第１電 極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテンシオ スタット電気的に接続されており、ここで、前記各チャンバが請求項１に記載の 電気化学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に 結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含み、且つ、第 ２反応チャンバが、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する 生物学的結合対の第２要素の結合の阻害因子をさらに含むステップを含み、さら に、 ｂ）請求項１に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそれ ぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子が同定されることを特徴とするステップと を含む方法。 １８．請求項１に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的結 合対の第２要素と電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合の阻 害因子について、複雑な化学混合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項１に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、請 求項１に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供するス テップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第１電 極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテンシオ スタット電気的に接続されており、ここで、前記各チャンバが請求項１に記載の 電気化学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に 結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含み、且つ、第 ２反応チャンバが、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する 生物学的結合対の第２要素の結合の阻害因子の一部を含む複雑な混合物をさらに 含むステップを含み、さらに、 ｂ）請求項１に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそれ ぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合 対の第１要素との結合の阻害因子を有する複雑な混合物が同定されることを特徴 とするステップと を含む方法。 １９．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項１６に記載の方法。 ２０．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 ２１．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項１８に記載方法。 ２２．ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への生物学的 結合対の第２要素の結合の阻害因子を化学的に分画して、分画された半混合物を 生成するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対して請求項１８に記載のステップ（ａ ）〜ステップ（ｃ）を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合 物を同定するステップと をさらに含む請求項１８に記載の方法。 ２３．生物学的結合対の要素間の結合を検出するための電気化学的分析を実施 するための装置であって、 導体または半導体を含み、且つ、多孔性親水性高分子層で被覆された表面を有 し、電極に電位が加えられている条件下で生物学的結合対の第１要素および電極 との還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気化学的メディエ ータがそれぞれその上に固定化されていることを特徴とする第１電極と、 電解質水溶と接触している導電性金属を含む第２の照合電極と、 導電性金属を含む第３の補助電極と を含み、 各電極はポテンシオスタットに電気的に接続されており、さらに、 各電極が電気化学的に接触する電解質溶液が入っている反応チャンバをさらに 含み、 前記溶液が、電位が電極に加えられている条件下で電気化学的メディエータと の還元／酸化反応に関与することができる化学物質により電気化学的に標識され ている生物学的結合対の第２要素をさらに含み、 生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１要素に結合している条件下 で、電位が電極に加えられるとき装置内で電流が発生することを特徴とする装置 。 ２４．電気化学的分析が循環ボルタンメトリーであることを特徴とする請求項 ２３に記載の装置。 ２５．それぞれ多数の前記電極および多数の反応チャンバをさらに含み、各反 応チャンバが電解質を含み、且つ、当該装置内の多数の電極中の３つの前記電極 のそれぞれ１つと電気化学的に接触していることを特徴とする請求項２３に記載 の装置。 ２６．生物学的結合対の第２要素がルテニウム電気化学的に標識されているこ とを特徴とする請求項２３に記載の装置。 ２７．電気化学的メディエータがオスミウム化合物であることを特徴とする請 求項２３に記載の装置。 ２８．電気化学的メディエータがルテニウム化合物であることを特徴とする、 請求項２３に記載の装置。 ２９．生物学的結合対の第１要素が受容体タンパク質またはそのリガンド結合 フラグメントであり、生物学的結合対の第２要素が前記受容体タンパク質に特異 的に結合するリガンドであることを特徴とする請求項２３に記載の装置。 ３０．生物学的結合対の第１要素が抗体タンパク質またはその抗原結合フラグ メントであり、生物学的結合対の第２要素が前記抗体に特異的に結合する抗原で あることを特徴とする請求項２３に記載の装置。 ３１．生物学的結合対の第１要素が第１タンパク質またはそのフラグメントで あり、生物学的結合対の第２要素が第１タンパク質に特異的に結合する第２タン パク質またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項２３に記載の装置 。 ３２．導体または半導体を含む電極であって、且つ多孔性親水性高分子層で被 覆された表面を有し、生物学的結合対の第１要素と、電極に電位が加えられてい る条件下で電極による還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電 気化学的メディエータとがそれぞれその上に固定化されていることを特徴とする 電極。 ３３．請求項３２に記載の電極を調製するためのキットであって、導体または 半導を含む電極と、生物学的結合対の第１要素と、電気化学的メディエータと、 電極の表面上の多孔性親水性高分子層を調製するための試薬と、生物学的結合対 の第１要素および電気化学的メディエータを電極の表面上の多孔性親水性高分子 層内に固定化するための試薬とを含むキット。 ３４．ａ）導体または半導体を含む電極を提供するステップと、 ｂ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層を調製するステップと、 ｃ）電極の表面上の多孔性親水性高分子層内に生物学的結合対の第１要 素および電気化学的メディエータを固定化するステップと を含む請求項３２に記載の電極を製作する方法。 ３５．請求項２３に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合 を検出する方法であって、 ａ）請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第 １電極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテン シオスタット電気的に接続されており、ここで、前記第１反応チャンバが請求項 ２３に記載の電気化学的メディエータと、固定化された生物学的結合対の第１要 素に特異的に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含 み、且つ第２反応チャンバが請求項２３に記載の電気化学的メディエータと、固 定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合しない電気化学的に標識さ れた物質とを含むステップを含み、さらに ｂ）請求項２３に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合が検出されることを特徴とするステップと、 を含む方法。 ３６．請求項２３に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合の 阻害因子を同定する方法であって、 ａ）請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第 １電極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテン シオスタット電気的に接続されており、ここで、前記各反応チャンバが固定化さ れた生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する電気化学的に標識された生物 学的結合対の第２要素を含み、且つ、第２反応チャンバが、固定化された生物学 的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の第２要素の結合の阻害 因子をさらに含むステップを含み、さらに、 ｂ）請求項２３に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子が同定されることを特徴とするステップと、 を含む方法。 ３７．請求項２３に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合の 阻害因子について、複雑な化学混合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項２３に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第 １電極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテン シオスタット電気的に接続されており、ここで、前記各チャンバが電気化学的に 標識された、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する電気化 学的に標識された生物学的結合対の第２要素を含み、且つ、第２反応チャンバが 、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物学的結合対の 第２要素の結合の阻害因子の一部を含む複雑な混合物をさらに含むステップを含 み、さらに、 ｂ）請求項２３に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結 合対の第１要素との結合の阻害因子を有する複雑な混合物が同定されるステップ と を含む方法。 ３８．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項３５に記載の方法。 ３９．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項３６に記載の方法。 ４０．生物学的結合対の第２要素が電気化学的に標識された代理リガンドであ ることを特徴とする請求項３７に記載の方法。 ４１．ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への生物学的 結合対の第２要素の結合についての阻害因子を化学的に分画して、分画された半 混合物を生成するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対して請求項３７に記載のステップ（ａ ）〜ステップ（ｃ）を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合 物を同定するステップと をさらに含む請求項３７に記載の方法。 ４２．生物学的結合対の要素間の結合を検出するための電気化学的分析を実施 するための装置であって、 導体または半導体を含み、且つ、多孔性親水性高分子層で被覆された表面を有 し、電極に電位が加わえられた条件下で、生物学的結合対の第１要素および電極 との還元／酸化反応に関与することができる化学物質を含む電気化学的メディエ ータがそれぞれその上に固定化されている第１電極と、 電解質水溶と接触している導電性金属を含む第２の照合電極と、 導電性金属を含む第３の補助電極と を含み、 各電極はポテンシオスタットに電気的に接続されており、さらに、 各電極が電気化学的に接触している電解質溶液が入っている反応チャンバをさ らに含み、 前記溶液が、電位が電極に加えられている条件下で電気化学的メディエータに よる還元／酸化反応に関与することができる電気化学的触媒に結合する生物学的 結合対の第２要素をさらに含み、 生物学的結合対の第２要素に結合している電気化学的触媒の基質の存在下で、 生物学的結合対の第２要素が生物学的結合対の第１要素に結合している条件で電 位が電極に加わるとき、当該装置内で電流が発生することを特徴とする装置。 ４３．電気化学的分析がクロノアンペロメトリーであることを特徴とする請求 項４２に記載の装置。 ４４．それぞれ多数の前記電極および多数の反応チャンバをさらに含み、各反 応チャンバが電解質を含み、且つ、当該装置内の多数の電極の中で３つの前記電 極のそれぞれ１つと電気化学的に接触していることを特徴とする請求項４２に記 載の装置。 ４５．生物学的結合対の第２要素に結合している電気化学的触媒が酵素である ことを特徴とする請求項４２に記載の装置。 ４６．酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項 ４５に記載の装置。 ４７．電気化学的メディエータがオスミウム化合物であることを特徴とする請 求項４２に記載の装置。 ４８．生物学的結合対の第１要素が受容体タンパク質またはそのリガンド結合 フラグメントであり、生物学的結合対の第２要素が前記受容体タンパク質に特異 的に結合するリガンドであることを特徴とする請求項４２に記載の装置。 ４９．生物学的結合対の第１要素が抗体タンパク質またはその抗原結合フラグ メントであり、生物学的結合対の第２要素が前記抗体に特異的に結合する抗原で あることを特徴とする請求項４２に記載の装置。 ５０．生物学的結合対の第１要素が第１タンパク質またはそのフラグメントで あり、生物学的結合対の第２要素が前記第１タンパク質に特異的に結合する第２ タンパク質であることを特徴とする請求項４２に記載の装置。 ５１．請求項４２に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合 を検出する方法であって、 ａ）請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、 ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第１電極がそれに固定 化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテンシオスタット電気的 に接続されており、ここで、前記第１反応チャンバが電気化学的触媒の基質と、 電気化学的触媒に結合し、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結 合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含み、且つ、第２ 反応チャンバが電気化学的触媒の基質と、電気化学的触媒に結合し、固定化され た生物学的結合対の第１要素に特異的に結合しない化学物質とを含み、さらに、 ｂ）請求項４２に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を第２反応チャン バでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応チ ャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって、 生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結合対の第１要素との結合が 検出されることを特徴とするステップと、 を含む方法。 ５２．請求項４２に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合 の阻害因子を同定する方法であって、 ａ）請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップを含み、 ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第１電極がそれに固定 化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテンシオスタット電気的 に接続されており、ここで、前記各反応チャンバが電気化学的触媒の基質と、電 気化学的触媒に結合し、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合 する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素とを含み、且つ、第２反 応チャンバが、固定化された生物学的結合対の第１要素に特異的に結合する生物 学的結合対の第２要素の結合の阻害因子をさらに含み、そして、電気化学的触媒 の基質をさらに含み、さらに、 ｂ）請求項４２に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で、電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を第２反応チャン バでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応チ ャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって、 生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結合対の第１要素との結合の 阻害因子が同定されることを特徴とするステップと、 を含む方法。 ５３．請求項４２に記載の装置を使用して、電気化学的に標識された生物学的 結合対の第２要素と、電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素との結合 の阻害因子について、複雑な化学混合をスクリーニングする方法であって、 ａ）請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第１反応チャンバと、 請求項４２に記載の各電極と電気的に接触している第２反応チャンバとを提供す るステップであって、ここで、第１反応チャンバと第２反応チャンバにおいて第 １電極がそれに固定化された生物学的結合対の第１要素を含み、各電極がポテン シオスタット電気的に接続されており、ここで、前記各反応チャンバが電気化学 的触媒の基質と、電気化学的触媒に結合した、固定化された生物学的結合対の第 １要素に特異的に結合する電気化学的に標識された生物学的結合対の第２要素と を含み、且つ、第２反応チャンバが固定化された生物学的結合対の第１要素に特 異的に結合する、生物学的結合対の第２要素の結合の阻害因子を含む複雑な混合 物の一部をさらに含み、電気化学的触媒の基質をさらに含むステップを含み、さ らに、 ｂ）請求項４２に記載の装置の第１反応チャンバおよび第２反応チャンバのそ れぞれの中で電気化学的分析を実施するステップと、 ｃ）第１反応チャンバ内での電気化学的分析で発生する電流を、第２反応チャ ンバでの電気化学的分析で発生する電流と比較するステップであって、第２反応 チャンバで発生するより第１反応チャンバで大きい電流が発生することによって 、生物学的結合対の第２要素と固定化された生物学的結合対の第１要素との結合 の阻害因子を有する複雑な混合物が同定されるステップと、 を含む方法。 ５４．生物学的結合対の第２要素が代理リガンドであることを特徴とする請求 項５１に記載の方法。 ５５．生物学的結合対の第２要素が代理リガンドであることを特徴とする請求 項５２に記載の方法。 ５６．生物学的結合対の第２要素が代理リガンドであることを特徴とする請求 項５３に記載の方法。 ５７．ｄ）第１電極上に固定化された生物学的結合対の第１要素への生物学的 結合対の第２要素の結合についての阻害因子を化学的に分画して、分画された半 混合物を生成するステップと、 ｅ）分画された半混合物のそれぞれに対して請求項５３に記載のステップ（ａ ）〜ステップ（ｃ）を実施し、生物学的結合対の結合の阻害因子を有する半混合 物を同定するステップと をさらに含む請求項５３に記載の方法。 ５８．代理リガンドを第２反応チャンバに加えた後に、阻害因子を第２反応チ ャンバ加えることを特徴とする請求項５５に記載の方法。 ５９．代理リガンドを第２反応チャンバに加える前に、阻害因子を第２反応チ ャンバ加えること ６０．代理リガンドと一緒に阻害因子を第２反応チャンバに加えることを特徴 とする請求項５５に記載の方法。