JP2002524050A - ヘルペスウィルス調製品及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘルペスウィルス調製品、例えばかかる粒子が産生された細胞培養物から単離されたヘルペスウィルス粒子の調製品は、ＶＰ２２外被タンパク質の少なくとも一部を、ＶＰ２２の組換突然変異形態の中で、例えばＶＰ２２活性配列と、非ＶＰ２２ポリペプチド配列、例えば蛍光ＧＦＰ配列とを含んで成る組換融合ポリペプチドとして有しうる。対応のＤＮＡ調製品を記載する。ウィルスによる細胞感染の進行を検出する、及び中和抗体又は感染阻害剤をスクリーニングするための蛍光融合タンパク質を含むウィルス粒子の利用も記載する。修飾ヘルペスウィルス粒子のワクチン用途も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野： 本発明は修飾ヘルペスウィルス並びにその調製のための材料及び方法、更には
その利用、例えばアッセイ、診断、免疫療法及び免疫予防法におけるその利用に
関する。

【０００２】 背景 ＶＰ２２タンパク質の輸送特性は例えばＰＣＴ ＷＯ９７／０５２６５（Ｏ’
Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ）に記載されている。この明細書にはＶＰ２
２とグリーンフルオレセントタンパク質との融合タンパク質等のＶＰ２２の融合
生成物が更に記載されている。

【０００３】 本発明は修飾ＶＰ２２タンパク質を含んで成るヘルペスウィルス調製品の提供
、及びかかる調製品の様々な用途の提供を課題とする。

【０００４】 発明の概要及び説明 本発明の一の観点はヘルペスウィルス粒子、例えばかかる粒子の産生された細
胞培養物から単離されたヘルペスウィルス粒子の調製品を提供し、それにおいて
はＶＰ２２外被タンパク質の少なくとも一部がＶＰ２２−活性配列と、（ａ）検
出可能遺伝子生成物を担う配列、例えばグリーンフルオレセントタンパク質（Ｇ
ＦＰ）をコードする遺伝子の融合体及び（ｂ）ヒト疾患に関連する抗原に対応す
る免疫原配列から選択される非ＶＰ２２ペプチド又はポリペプチド配列とを含ん
で成る融合ポリペプチドとして存在する。

【０００５】 本発明は更にヘルペスウィルス粒子、例えばかかる粒子の産生された細胞培養
物から単離されたヘルペスウィルス粒子の調製品であって、ＶＰ２２外被タンパ
ク質の少なくとも一部がＶＰ２２の組換突然変異体の形態、例えばＶＰ２２活性
配列と非ＶＰ２２ペプチド又はポリペプチド配列とを含んで成る組換融合ポリペ
プチドの形態で存在する調製品を提供する。本発明のこの観点に従って製造され
うるヘルペスウィルス粒子はとりわけ、ウィルスゲノム、例えば感染性ヘルペス
ウィルス粒子、死滅ヘルペスウィルス粒子、軽粒子及びアンプリコン（それらは
全て、本明細書に記載の特徴を含まないウィルスタイプからヘルペスウィルス粒
子を製造するための周知の技術に従って、又はそれらに習った技術により作製で
きうる）を有する又は有さないものである。

【０００６】 本発明は更に、例えば上記の組換ＶＰ２２融合ポリペプチドをコードするＶＰ
２２組換融合遺伝子が存在するウィルスゲノムＤＮＡ調製品等のＤＮＡ調製品を
提供する。この融合ポリペプチドは例えば蛍光により検出可能なもの、例えばＶ
Ｐ２２とグリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）とに由来する融合タンパ
ク質であってよい。

【０００７】 所定の例において、ビリオンのＶＰ２２成分全体がかかる組換タンパク質であ
ってよい。例えば、本発明の具体例に係る修飾ヘルペスウィルスにおいて、天然
ＶＰ２２コード遺伝子はＶＰ２２とＧＦＰとの融合タンパク質をコードするハイ
ブリド遺伝子により置換されていてよい。

【０００８】 他方、このウィルス粒子は修飾又は異種ＶＰ２２と共に正常／天然ＶＰ２２を
含んで成ってよい。かかる本発明の具体例は例えば突然変異ＨＳＶであって、ｇ
Ｈ−であり（即ち、ｇＨ糖タンパク質をコードする必須ウィルス遺伝子に関して
欠失している）、且つ欠失した必須遺伝子の座において、プロモーター、例えば
ＣＭＶ ＩＥプロモーターのコントロール下でＶＰ２２とＧＦＰとの融合生成物
をコードする遺伝子が挿入された突然変異ＨＳＶを含んで成ってよい。

【０００９】 このヘルペスウィルス粒子は感染性ヘルペスウィルスであるか、又は死滅ヘル
ペスウィルス、又は不活化ヘルペスウィルス、又は欠陥ヘルペスウィルス粒子（
例えばヘルペスウィルスアンプリコン）であってよい。

【００１０】 外被の中に修飾ＶＰ２２が含まれている感染性ヘルペスウィルスは弱毒ウィル
ス、例えばゲノムの中に弱毒突然変異を担持するウィルスであってよい。本明細
書における「弱毒突然変異」には（ｉ）正常宿主細胞でのその複製を妨害するこ
となくウィルスの毒性を弱める突然変異、例えばｔｋ−突然変異を有するウィル
ス、及び（ii）致死突然変異であって、その存在下ではウィルスはこの致死突然
変異を補う宿主細胞でのみ増殖できうる突然変異、例えばｇＨ−突然変異を有す
るウィルス、が挙げられるものと解される。

【００１１】 ヘルペスウィルスは、ＶＰ２２遺伝子のコピーだけが修飾ＶＰ２２タンパク質
をコードするように突然変異された突然変異体であってよい。他方、それは修飾
又は異種ＶＰ２２遺伝子が挿入され、天然ＶＰ２２遺伝子の欠失した又は欠失し
ていない突然変異体であってよい。

【００１２】 あるいはまた、ヘルペスウィルスはそのＶＰ２２遺伝子の観点で野生型である
か、又は修飾もしくは異種ＶＰ２２を発現する宿主細胞の感染により増殖して生
成されうるものであってよい。このような状況では、ヘルペスウィルスは所望す
るなら、その外被が修飾ＶＰ２２タンパク質を担持するにもかかわらず、全体的
に又は少なくともＶＰ２２に関して野生型ゲノムを有してよい。

【００１３】 本発明はかかるヘルペスウィルス粒子の単離された調製品、即ち、それらの産
生された細胞培養物及び培地から実質的に分離されたもの、例えばそれで処置す
る被検体への注射、又は後の医薬的用途のためにそれで処理する細胞調製品への
接種のために適当なかかるヘルペスウィルス粒子の医薬形態を提供する。

【００１４】 かかるウィルス粒子は様々な種のヘルペスウィルスを基礎としてよい。例えば
、それらはとりわけ単純ヘルペスウィルス、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２、又はＶ
ＺＶ，ＢＨＶ，ＥＨＶ又はＭＤＶを基礎としてよい。

【００１５】 この修飾ウィルスは様々な方法に利用できうる。例えば、それらはＶＰ２２と
融合したペプチドに対する免疫応答を誘導するためのワクチン又はワクチン成分
として利用できうる。これとの関係で含ませるための適当な抗原は例えばＷＯ９
６／２６２６７（Ｃａｎｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌｔｄ）に挙げられているものであってよい。

【００１６】 融合ＶＰ２２ポリペプチドが検出可能タンパク質、例えばＧＦＰタンパク質を
含んで成る場合、修飾ウィルスはウィルス粒子の単純蛍光同定又は検出を所望す
るとき、例えば感染細胞調製品の中の低レベルでのウィルス粒子形成を検出する
とき、利用されうる。

【００１７】 例えば、本発明は更に細胞のヘルペスウィルス感染の進行を検出するための、
前記融合ポリペプチド配列が検出可能ＶＰ２２融合タンパク質を担う配列を含ん
で成るヘルペスウィルス粒子を利用する方法を提供し、この方法は（ｉ）かかる
粒子をかかる細胞と接触させ、そして（ii）かかる細胞内のかかる融合タンパク
質を検出することを含んで成る。これはタンパク質が蛍光融合タンパク質であり
、そしてこの融合タンパク質の蛍光、例えばＧＦＰ−ＶＰ２２融合タンパク質の
蛍光を細胞内で検出するときに特に好都合でありうる。この方法はウィルスによ
る細胞感染の進行を検出する、及び／又はウィルスによる細胞の感染の中和抗体
もしくは阻害剤をスクリーニングするために利用できうる。

【００１８】 従って、例えば本発明の観点において、本明細書に記載の感染性ウィルス粒子
を利用するための方法は、例えば試験方法、例えばヘルペスウィルス粒子の中和
を検出するためのスクリーニング方法を含んで成る。この方法は、（ａ）感染性
ウィルス粒子を、本試験の対象である考えられる中和条件で処理する、例えば、
ウィルスを考えられる試験すべき中和因子、例えば中和抗体を含む可能性のある
血清サンプルで処理し（ここで、このようにして処理するウィルス粒子において
、ＶＰ２２をコードする遺伝子は検出可能遺伝子生成物を有する遺伝子との融合
体として存在する（又は、そのゲノムが挿入されたもしくは修飾された別の遺伝
子を有することで、かかる遺伝子は対応の野生型ウィルスによっては通常発現さ
れない容易に検出可能な遺伝子生成物、例えばＧＦＰ、もしくはＧＦＰを含む融
合タンパク質を有する））；（ｂ）かかる処理ウィルス粒子を宿主細胞の感染に
使用し、そしてかかる検出可能な遺伝子生成物の産生についてかかる宿主細胞を
検査する、ことを含んで成ってよい。中和条件の存在は、遺伝子生成物がＧＦＰ
もしくはそれに関連する融合タンパク質である場合、例えば単に緑蛍光を観察す
ることにより又は感染細胞培養物中のその非存在を観察することにより高感度且
つ簡単に検出できる。観察される蛍光は試験すべき考えられる中和条件によるウ
ィルス中和の程度と反比例し、そして完全な中和は往々にして感染性ウィルスを
利用した適当な平行コントロールプロセスによる結果との対比における発蛍光の
欠如により容易に認められうる。

【００１９】 対応して、この方法はウィルス複製の可能な阻害因子となる任意の条件のスク
リーニングとして機能するように簡単に改良できうる。

【００２０】 特に、本発明の観点において、所望するなら任意の様々な検出可能遺伝子及び
遺伝子生成物をＧＦＰの代わりに使用してよい（例えば、周知のベーターガラク
トシダーゼ遺伝子及び遺伝子生成物又はルシフェラーゼ遺伝子及び遺伝子生成物
）。ベーターガラクトシダーゼの場合、遺伝子生成物は適当な基質反応により周
知の手段で感染細胞において目視化及び／もしくは定量化でき、そしてルシフェ
ラーゼ遺伝子生成物も適当な周知の光基質により感染細胞において検出もしくは
定量化できうる。ＧＦＰの例が特に有利であり、なぜならその蛍光は直ちに且つ
簡単に目視化でき、そして例えば追加の工程を要しないからである。

【００２１】 この目的に組込まれるその他のペプチドは例えば抗原ポリペプチド、例えばヘ
ルペスウィルスもしくはパピロマウィルスの抗原、免疫応答の所望される細菌抗
原であってよい。かかる調製品は例えばウィルスワクチンについて周知の任意の
適当な手段で調剤できうる。

【００２２】 本発明を限定することなく以下で説明する。

【００２３】 エクオリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ）（クラゲ）グリーンフルオレセントタンパク
質ＧＦＰ及びその利用についての一般文献はChalfie M, Tu Y, Euskirchen G, W
ard D and Prasher D. (1994) : 「Green fluorescent protein as a marker fo
r gene expression」Science 263, 802-805 である。

【００２４】 下記の所定の具態例において、出発ＨＳＶウィルス株は必須ｇＨ遺伝子に関し
て欠失しており、そしてウィルスｇＨを発現する細胞系で培養する。例えば、引
用することで本明細書に組入れるＷＯ９２／０５２６３及びＷＯ９４／２１８０
７を参照されたい。ｇＨ欠失ウィルスは以降ＤＩＳＣウィルスと呼ぶ。本発明の
対応のその他の例は、ｇＨ欠失でない親ウィルスに基づき、例えば以降に更に説
明するように、野生型ＨＳＶ株から作ることもできる。

【００２５】 ＶＰ２２及びグリーンフルオレセントタンパク質の遺伝子融合体を発現するＨＳ
Ｖウィルス（ｇＨについて欠失）の構築 プラスミド構築体の調製 注目の遺伝子をＤＩＳＣ ＨＳＶウィルスに挿入するため、プラスミドを構築
した。それにおいて、ＣＭＶプロモーター、注目の遺伝子及びポリアデニル化配
列（まとめて、発現カセットと呼ぶ）を制限配列（ＰａｃＩ）間でライゲーショ
ンさせている。この構築体の親株として用いたＨＳＶ１及びＨＳＶ２ウィルスは
ｇＨ遺伝子が欠失し（例えば、ＷＯ９２／０５２６３及びＷＯ９４／２１８０７
参照）、そして更にＰａｃＩ制限部位を欠失ｇＨ遺伝子部位に挿入するために部
位特異的突然変異誘発により突然変異している。これはＰａｃＩによる消化によ
るプラスミドからの発現カセットの切り出し、及びその後のＰａｃＩ消化ウィル
スＤＮＡへのライゲーションを可能にする。

【００２６】 ＶＰ２２−ｇｆｐ，ｇｆｐ−ＶＰ２２及びｇｆｐコード配列を含む発現カセッ
トを含む３つのプラスミドを構築した。

【００２７】 ＤＩＳＣウィルスからＶＰ２２−ｅｇｆｐを発現させるためのプラスミド構築体
の構築 プラスミドｐＩＭＪ２をＸｂａＩで消化し、ＣＩＰでリン酸化し、そしてフェ
ノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。プラスミドｐＧ
Ｅ１５０をＸｂｏＩ及びＮｈｅＩで消化し、そして得られるフラグメントをＰｒ
ｏｍｅｇａ「Ｗｉｚａｒｄ」精製キットを用いてアガロースゲルから精製した。
精製フラグメントをＸｂａＩ−消化ｐＩＭＪ２にライゲーションし、そしてその
ライゲーション物をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５アルファーを形質転換する
ために用いた。得られるコロニーをスクリーニングし、そしてｐＶＰ１と称す適
正なプラスミドが調製された。

【００２８】 プロモーターとＶＰ２２−ｇｆｐの開始コドンとの間の追加の配列を除くため
、プラスミドｐＶＰ１をＨｉｎｄIII で消化し、ベクターを介在フラグメントか
ら精製し、そして再ライゲーションした。ｐＶＰ２と称する得られるプラスミド
を調製した。

【００２９】 ＤＩＳＣウィルスからｅｇｆｐ−ＶＰ２２を発現させるためのプラスミド構築体
の構築 プラスミドｐＩＭＪ２をＸｂａＩで消化し、ＣＩＰでリン酸化し、そしてフェ
ノール−クロロホルム抽出により精製し、そしてエタノール沈殿させた。プラス
ミドｐＧＥ１５５をＸｂａＩ及びＮｈｅＩで消化し、そして得られるフラグメン
トをＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ精製キットを利用してアガロースゲルから精
製した。精製フラグメントをＸｂａＩ消化ｐＩＭＪ２にライゲーションし、そし
てこのライゲーション体をＥ．コリＤＨ５アルファーを形質転換するのに用いた
。得られるコロニーをスクリーニングし、そしてｐＶＰ３と称する適正なプラス
ミドが調製された。

【００３０】 プロモーターとＶＰ２２−ｇｆｐの開始コドンとの間にある追加の配列を除去
するため、プラスミドｐＶＰ３をＮｏｔＩ及びＡｇｅＩで消化し、クレノウで処
理して突き出しＤＮＡ末端を除き、そして再ライゲーションした。このライゲー
ション混合物を用いてＥ．コリＤＨ５アルファーを形質転換し、そして得られる
コロニーからプラスミドを調製した。プロモーターと開始コドンとの間のＤＮＡ
配列を獲得し、そしてｐＶＰ４ａと称する一のクローンを組換ＤＩＳＣウィルス
の調製のために選別した。このクローンにおいて、ＮｏｔＩ部位の５′側の追加
の５１bpが除去され、これによりプロモーターと開始コドンとの間の距離の最適
化が図れる。

【００３１】 ＤＩＳＣウィルスからｅｇｆｐを発現させるためのプラスミド構築体の構築 プラスミドｐＩＭＪ２をＨｉｎｄIII 及びＮｈｅＩで消化し、そして切断ベク
ターをＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲプレプキットを用いてアガロース
ゲルから精製した。プラスミドＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨｉｎｄ
III 及びＮｏｔＩで消化し、そしてその後フラグメントをアガロースゲルから精
製した。次いでこのフラグメントをＨｉｎｄIII ／ＮｏｔＩ消化ｐＩＭＪ２にラ
イゲーションし、そしてこのライゲーション混合物を用いてＥ．コリＤＨ５アル
ファーを形質転換した。得られるコロニーをスクリーニングし、そしてｐＶＰ５
と称する適正なクローンが調製された。

【００３２】 組換ＤＩＳＣウィルスの構築 ３つの組換ＤＩＳＣウィルスを作るために下記に概略する戦略を利用した。

【００３３】 インサートの調製 ２０μｇづつのプラスミド（ｐＶＰ２，ｐＶＰ４ａ及びｐＶＰ５）をＰａｃＩ
で消化し、そして得られるフラグメントをＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣ
Ｒ精製キットを用いてアガロースゲルから精製した。得られる調製品の中のＤＮ
Ａの量は２６０nmでの吸収の測定により概算した。

【００３４】 ＤＮＡフラグメントを１μｇのウィルスＤＮＡを含む５０μｌのライゲーショ
ン反応物中でＰａｃＩ−消化ｄＨ２ＧウィルスＤＮＡにライゲーションさせた。
種々の比のウィルス、対、フラグメントを試験したが、０．０２〜０．２μｇの
フラグメントを含むライゲーション物が最も有効であると認められた。

【００３５】 １５℃で一夜のライゲーションの後、ライゲーション混合物を用いてリポフェ
クタミンによりＣＲ２細胞をトランスフェクションした。３７℃で７２〜９０ｈ
インキュベーション後、細胞を皿から取り出し、そして音波処理してウィルスを
放出させた。音波処理細胞／ウィルス調製品の希釈系列をＣＲ２細胞に載せ、そ
してアガロースをかぶせた。３７℃で７２時間後、得られるプラークを倒立蛍光
顕微鏡で観察し、そして緑色蛍光を示すプラークに印を付けた。印を付けたプラ
ークは、パスツールピペットを用いてアガロースを吸い込むことで拾い、そして
得られるアガロースプラグをＣＲ２細胞の接種に用いた。この富化手段を更に２
回繰り返し、倒立蛍光顕微鏡によりウィルスプラークを観察しても非蛍光プラー
クが認められなくなるようにした。

【００３６】 マスター及びワーキングウィルスストックをこのプラーク精製ウィルス調製品
から調製し、そして力価をＴＣ−ＩＤ₅₀計算法によりもとめた。

【００３７】 得られるウィルスは下記の通りに命名した： ｐＶＰ２．１１ａ（iv） ＶＰ２２−ｅｇｆｐ融合タンパク質発現ＤＩＳＣタイ
プ２ ｐＶＰ４ａ．３ｂ（ｉ） ｅｇｆｐ−ＶＰ２２融合タンパク質発現ＤＩＳＣタイ
プ２ ｐＶＰ５．２ｆ（ii） ｅｇｆｐタンパク質発現ＤＩＳＣタイプ２

【００３８】 略語： ｇｆｐ：グリーンフルオレセントタンパク質 ＶＰ２２−ｇｆｐ：ＶＰ２２とｇｆｐとの遺伝子融合体であり、ｇｆｐコード
配列はＶＰ２２コード配列の３′末端に融合している ｇｆｐ−ＶＰ２２：ＶＰ２２とｇｆｐとの遺伝子融合体であり、ｇｆｐコード
配列はＶＰ２２コード配列の５′末端に融合している ＢＧＨポリＡ：牛成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列 ＣＩＰ：仔牛小腸ホスファターゼ

【００３９】 材料： プラスミド／ＤＮＡ： ｐＩＭＪ２：ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位及び２つのＰａｃＩ
部位の間にあるＢＧＨポリアデニル化配列を含むｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）由来のプラスミド。 ｐＧＥ１５０：ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるＶＰ２２−ｅｇｆ
ｐ遺伝子融合体を含むｐＥＧＦＰＮ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のプラスミド。 ｐＧＥ１５５：ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるｅｇｆｐ−ＶＰ２
２遺伝子融合体を含むｐＥＧＦＰＣ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のプラスミド。

【００４０】 ｄＨ２Ｇ：ＤＩＳＣタイプ２ウィルスｄＨ２Ｇ（ｇＨに関して欠失しており、
そしてこの欠失ｇＨ遺伝子部位においてＰａｃＩ制限部位を含むように修飾され
ている）から精製され、且つ制限酵素ＰａｃＩで消化されたＤＮＡ。 制限酵素：ＸｂａＩ，ＮｈｅＩ，ＨｉｎｄIII ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，Ａｇｅ
Ｉ ＤＮＡ修飾酵素：仔牛小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）；Ｔ４リガーゼ；ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ大型（クレノウ）フラグメント ＤＮＡ精製キット：Ｐｒｏｍｅｇａ「Ｗｉｚａｒｄ」ミニプレプキット（小ス
ケールプラスミド調製）；Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉプレプキット（大スケールプ
ラスミド調製）；Ｐｒｏｍｅｇａ「Ｗｉｚａｒｄ」ＰＣＲプレプキット（ＤＮＡ
フラグメントの精製） 試薬：フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール２５：２４：１（ｖ
：ｖ：ｖ）２００mMのＥＧＴＡエタノール： Ｅ．コリ株：Ｅ．コリＤＨ５アルファー

【００４１】 本発明の別の態様 本発明の別の態様を実施するために適当な材料は例えば下記の通りである： ＧＦＰの別の起源：ＧＦＰの増強バージョンを含むプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ
１はＣｌｏｎｔｅｃｈより商業的に入手できる。３７５５bpのＤＮＡフラグメン
トはＡｓｅＩ及びＢｓａＩを用いるｐＥＧＦＰ−Ｎ１の共同消化により作製でき
、そしてＣＭＶプロモーター−ＧＦＰ−ポリＡ及びネオマイシンカセットを含む
。これは例えば既知の通りにしてブラント末端ライゲーションにより適当な末端
配列又は適当に修飾された末端配列を有する所望の構築体へとクローニングでき
うる。

【００４２】 ＶＰ２２のＧＦＰへのＣ末端融合 ＶＰ２２をその末端において２７kDのグリーンフルオレセントタンパク質（Ｇ
ＦＰ）へと融合させ（Ｃｈａｌｆｉｅら、１９９４）、約６５kDの融合タンパク
質を得ることができる。

【００４３】 ＧＦＰ発現ベクター。ｐＥＧＦＰＮ１はＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓより入手できる。プラスミドｐＧＥ１５０は全ＶＰ２２オープンリーデ
ィングフレームを含むｐＵＬ４９ｅｐ由来のＢａｍＨＩフラグメントをｐＥＧＦ
ＰＮ１のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ＶＰ２２とＧＦＰとの融合体を得ることに
より構築できる。

【００４４】 ６mmの皿の中のＣＯＳ−１細胞は、ＵＬ４９オープンリーディングフレームを
プラスミドｐＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、グ
リーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）のＮ末端にＶＰ２２の融合したもの
を供することにより構築されたＶＰ２２−ＧＦＰをコードするプラスミドでトラ
ンスフェクションすることができる。トランスフェクションの４０時間後、細胞
を回収し、そして高塩抽出物を調製することができる。これらの抽出物のウェス
タンブロッティングはこの抽出物中に存在するＶＰ２２を示す。

【００４５】 ＶＰ２２−ＧＦＰをコードするプラスミドは任意の適当な所望の手段でＨＳＶ
ウィルスゲノムに挿入することができる。

【００４６】 本発明の更なる態様は、例えば野生型ヘルペスウィルスＨＳＶ１に基づいて作
ることができ、それにおいて天然ＶＰ２２遺伝子は、相同組換についての周知の
手順を利用し、例えばＷＯ９７／０５２６５（Ｏ’Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｅｌｌｉ
ｏｔｔ）に基づき、ＶＰ２２のコード配列の上流又は下流のいずれかに未だ天然
ＶＰ２２プロモーターのコントロール下にあるＧＦＰのコード配列を含んで成る
融合遺伝子で置換されている。得られるウィルスはＨＳＶについての通常の技術
を利用してＶｅｒｏ細胞で培養し、そして得られるウィルス粒子において、ＶＰ
２２成分の全てがＧＦＰとの融合タンパク質により占められる。かかるウィルス
の例は以下の通りである。

【００４７】 ＧＦＰ−２２を発現するＨＳＶ−１組換ウィルスの構築 本発明の例に係るＧＦＰ−２２を発現するＨＳＶ１組換ウィルスの構築を図１
に模式的に示す。

【００４８】 ＨＳＶ−１構造タンパク質ＶＰ２２はゲノムの長い固有の領域（図１、ライン
１及び２）のＢａｍＦ制限フラグメント内に位置するＵＬ４９遺伝子（GD Ellio
ttら、1992, J Gen Virol 73, pp 723-6）によりコードされる。ＵＬ４９はＧＦ
Ｐ−２２をコードする遺伝子と下記の通りにして置換した：

【００４９】 ＨＳＶ−１ ＵＬ４９遺伝子（図１、ライン３）の４００bpのフランキング配
列を精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより一緒に増幅し、一端にＥｃｏＲＩ部位を
、そして他端にＸｂａＩ部位を、ＵＬ４９遺伝子の代わりに操作されたＢａｍＨ
Ｉ部位と共に含む単一の８００bpのフラグメントを構築した（図１、ライン４）
。これをプラスミドｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ
フラグメントとして挿入し、プラスミドｐＧＥ１２０を作った（図１、ライン４
）。ＢａｍＨＩフラグメント上に含まれるＧＦＰ−ＵＬ４９カセットをｐＧＥ１
２０のＢａｍＨＩ部位に挿入し、プラスミドｐＧＥ１６６を作った（図１、ライ
ン５）。これはＵＬ４９フランキング配列で囲まれたＧＦＰ−ＵＬ４９オープン
リーディングフレームを含み、それ故ＵＬ４９プロモーターにより駆動される。

【００５０】 等量（２μｇ）のプラスミドｐＧＥ１６６及び精製感染性ＨＳＶ−１株１７
ＤＮＡを、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水の代わりにＢＥＳ（Ｎ，Ｎビス（２−ヒドロキ
シエチル）２アミノエタンスルホン酸）緩衝食塩水を伴うことで改良したリン酸
カルシウム沈殿技術を利用して６０mmの皿の中で増殖させた１×１０⁶ 個のＣＯ
Ｓ−１細胞にトランスフェクションし、そして細胞障害作用が全ての細胞に存在
するようになるまで４日間インキュベーションした。４日後、ウィルスは感染細
胞から細胞培地の中へと回収され、３回の凍結融解にかけ、そして得られるウィ
ルスをＶｅｒｏ細胞で力価検定した。次いで約６０００プラークをＶｅｒｏ細胞
上にまき、そしてＧＦＰ蛍光により組換体をスクリーニングした。

【００５１】 緑色のプラークが検出され、そして更にプラークを精製した（２回）。待望の
蛍光を示すウィルスプラークの選定の例を１６６ｖと命名する（図１、ライン６
）。

【００５２】 組換がゲノム上の適正な位置で行われたことを確証するため、及びＶＰ２２遺
伝子の内因性コピーがＧＦＰ−２２遺伝子により置換されたことを確認するため
、ゲノムＤＮＡを親／野生型（株１７）ウィルス及び選定の１６６ｖウィルスの
両者から精製し、そしてＥｃｏＲＶによる制限消化にかけた（図２）。ゲノムへ
のＧＦＰ−２２の組込みはゲノムのＥｃｏＲＶフラグメントのサイズを５．５５
kbから６．３kbへと増大させた（図１、ライン２とライン６を対比）。ＥｃｏＲ
Ｖ消化ウィルスＤＮＡの制限パターンは組換ウィルス内のもとの５．５５kbのフ
ラグメントの消失及び６．３kbの大きめのフラグメントの出現を示した（図２Ａ
、染色ゲル）。ＵＬ４９プローブ及びＧＦＰプローブの両者を用いてこのゲルで
実施したサザンブロッティング（図２Ｂ及び２Ｃ、ＵＬ４９及びＧＦＰ）はこの
新たな大きめのフラグメントが双方の配列にハイブリダイズし、そして大きめの
フラグメントだけがＧＦＰプローブにハイブリダイズすることを示し（図２Ｃ）
、ＥｃｏＲＶ Ｋフラグメント内のＧＦＰ−２２融合遺伝子の存在を確証する。

【００５３】 ＧＦＰ−ＶＰ２２（１６６ｖ）及び親タイプのＨＳＶ１ウィルス粒子を感染細
胞培地から獲得し、そして５−１５％のフィコール勾配で精製し、そしてＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析及びクマジーブルー染色又はウェスタンブロットにかけると、そ
の結果はビリオンタンパク質がゲノム変化の結果として予測されるであろうもの
に対応することを示し（即ち、１６６ｖウィルスは正常３８kD ＶＰ２２種の代
わりに、ＧＦＰ−２２融合タンパク質と期待される６５kDのタンパク質種を含む
）、そして抗ＶＰ２２及び抗ＧＦＰ抗体の利用により得られる結果はこの新たな
ビリオン成分が予測の融合タンパク質を提示することを確証する。

【００５４】 １６６ｖウィルスの蛍光は、例えばＭＯＩ１０において、例えばウィルスと接
触するようにさらされた層中の例えばＶｅｒｏ細胞の外層上の蛍光顕微鏡観察に
より検出できる。

【００５５】 蛍光構造タンパク質を発現するウィルスは、このウィルスによる細胞の感染の
様々な段階での細胞内の蛍光タンパク質を介する蛍光により位置決定できうる。

【００５６】 従って、本明細書に記載のウィルスの構造タンパク質の一部として指示体、例
えば蛍光指示体を含むヘルペスウィルスは、ヘルペスウィルスによる細胞の感染
の過程の研究のための手段として利用できうる。これはウィルス感染の過程を研
究及び分析することを所望する研究者にとって相当有用である。

【００５７】 本発明の利用により供される指示効果は、引用することで本明細書に組入れる
先の特許出願ＷＯ９７／０５２６５及びＷＯ９８／３２８６６（Ｍａｒｉｅ Ｃ
ｕｒｉｅ：Ｐ Ｏ’Ｈａｒｅ ＆ ＧＤ Ｅｌｌｉｏｔｔ）に記載の効果と合わ
せることができる。

【００５８】 また、１６６ｖウィルス感染は細胞微小管の安定性を、野生型ウィルスによる
感染と同じぐらいに効果的に高め、それ故本発明の例に従うＶＰ２２−ＧＦＰ発
現ウィルス及び対応のＶＰ２２−ＧＦＰタンパク質は、その他のＶＰ２２タンパ
ク質の代わりに、引用することで本明細書に組入れるＷＯ９８／４２７４２（Ｐ
ｈｏｇｅｎ Ｌｔｄ：ＧＤ Ｅｌｌｉｏｔｔ）に記載の全ての目的と一緒に本明
細書に記載の指示効果を供するように利用できうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然ＵＬ４９／ＶＰ２２遺伝子の代わりにＶＰ２２−ＧＦＰ融合タンパク質を
コードするウィルスの構築の模式工程。

【図２】 図１の通りに構築したウィルスの構造を確認する目的での、かかる構築体から
得られるウィルスの制限消化物由来のアガロースゲル。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年８月７日（２０００．８．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】 背景 ＶＰ２２タンパク質の輸送特性は例えばＰＣＴ ＷＯ９７／０５２６５（Ｏ’
Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ）に記載されている。この明細書にはＶＰ２
２とグリーンフルオレセントタンパク質との融合タンパク質等のＶＰ２２の融合
生成物が更に記載されている。かかる融合体はＥｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａ
ｒｅ（１９９７）ＣＥＬＬ，８８（２）２２３−２３３にも記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 (Ｃ１２Ｑ 1/70 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:93） //(Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｘ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BB20 DA36 FA16 FB07 FB12 4B024 AA01 AA14 DA20 EA02 FA10 GA25 HA01 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ08 QQ79 QQ96 QR48 QR56 QS33 QX02 4B065 AA95X AA95Y AB01 BA01 BA16 CA24 CA45 CA46

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘルペスウィルス粒子の調製品（例えば、かかる粒子が産生
   された細胞培養物から単離されたヘルペスウィルス粒子の調製品）であって、Ｖ
   Ｐ２２外被タンパク質の少なくとも一部がＶＰ２２活性配列と、検出可能遺伝子
   生成物を担う配列、例えばグリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）をコー
   ドする遺伝子との融合体から選択された非ＶＰ２２ペプチド又はポリペプチドと
   の組換融合ポリペプチドとして存在する、ヘルペスウィルス粒子の調製品。
2. 【請求項２】 前記融合ポリペプチドが蛍光により検出可能である、請求項
   １記載のヘルペスウィルス粒子の調製品。
3. 【請求項３】 ビリオンのＶＰ２２成分全体が前記融合ポリペプチド、例え
   ばＶＰ２２とＧＦＰとの融合タンパク質である、請求項１記載の調製品。
4. 【請求項４】 前記ウィルスが必須ウィルス遺伝子に関して欠失したヘルペ
   スウィルス突然変異体である、請求項１記載の調製品。
5. 【請求項５】 細胞のヘルペスウィルス感染の進行を検出するために請求項
   １記載のヘルペスウィルス粒子の調製品を利用する方法であって、前記融合ポリ
   ペプチド配列は検出可能ＶＰ２２融合タンパク質を担う配列を含んで成り、ここ
   で当該方法は（ｉ）前記粒子を前記細胞と接触させ、そして（ii）前記細胞内の
   前記融合タンパク質を検出することを含んで成る方法。
6. 【請求項６】 前記タンパク質が蛍光融合タンパク質であり、そして前記検
   出工程が前記細胞内の当該融合タンパク質の蛍光、例えばＧＦＰ−ＶＰ２２融合
   タンパク質の蛍光を検出することを含んで成る、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 前記蛍光融合タンパク質を含む前記ウィルス粒子をウィルス
   による細胞感染の進行を検出する及び／又はウィルスによる細胞の感染の中和抗
   体もしくは阻害剤をスクリーニングするために利用する、請求項６記載の方法。