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JP2002522090A - 抗体エンベロープ融合タンパク質および野生型エンベロープタンパク質を含有するレトロウイルスベクターを用いる細胞型特異的遺伝子移入 - Google Patents

抗体エンベロープ融合タンパク質および野生型エンベロープタンパク質を含有するレトロウイルスベクターを用いる細胞型特異的遺伝子移入

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JP2002522090A
JP2002522090A JP2000565164A JP2000565164A JP2002522090A JP 2002522090 A JP2002522090 A JP 2002522090A JP 2000565164 A JP2000565164 A JP 2000565164A JP 2000565164 A JP2000565164 A JP 2000565164A JP 2002522090 A JP2002522090 A JP 2002522090A
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JP
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envelope
cells
retroviral vector
target
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2000565164A
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English (en)
Inventor
ラルフ シー． ドーンバーグ，
Original Assignee
トーマス ジェファーソン ユニヴァーシティー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トーマス ジェファーソン ユニヴァーシティー filed Critical トーマス ジェファーソン ユニヴァーシティー
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Abstract

(57)【要約】 標的細胞特異性を有するレトロウイルスベクター粒子に標的細胞を感染させる方法。このレトロウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクターのエンベロープタンパク質に融合された、抗体または別のペプチドの抗原結合部位からなるキメラエンベロープタンパク質を有する。抗原結合部位または他のペプチドは、天然のウイルスレセプター結合部位を破壊する。この方法は、レトロウイルスベクターを産生する工程、およびベクターが標的細胞によってインターナライズされるようにこの標的細胞とこのベクターを接触させる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 本出願は、１９９７年８月２８日に出願された係属中の米国特許出願第０８／
９３３，６１６号の一部係属出願であり、米国特許出願第０８／９３３，６１６
号は、１９９４年３月４日に出願された米国特許出願第０８／２０５，９８０号
（現在、放棄されている）の係属出願であり、米国特許出願第０８／２０５，９
８０号は、１９９２年１１月２０日に出願された米国特許出願第０７／９７９，
６１９号の一部係属出願である。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウイルスベクター粒子に関する。こ
のレトロウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクターのエンベロープタン
パク質に融合された抗体の抗原結合部位または別のペプチドからなるキメラエン
ベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクターを含む。抗原結合部位また
は他のペプチドは、天然のウイルスレセプター結合部位を置換または破壊する。
得られたキメラエンベロープは、「標的エンベロープ」という。本発明は、標的
エンベロープだけでなく野生型エンベロープタンパク質も含むレトロウイルスベ
クターに関する。標的エンベロープに加えて野生型エンベロープの存在は、完全
な機能的膜融合ドメイン（これは、標的エンベロープにおいて損なわれ得る）を
補充することによって、ヘルパー分子として作用する。このヘルパー機能は、野
生型エンベロープについてのレセプターを含むのではなく、標的分子に対する結
合についてのレセプターを含む細胞の感染を可能にし、そして／または増強する
。本発明はまた、このレトロウイルス粒子を調製するための方法、およびこのレ
トロウイルスベクターを使用して遺伝子を脊椎動物細胞に導入するための方法に
関する。
【０００３】 （背景の説明） 本明細書中に参照される開示は、本発明の背景を例示するため、およびその実
施に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書中に参考として援用される
。便宜上、この開示は、以下のテキストに参照され、そして添付の著書目録にそ
れぞれグループ分けされる。
【０００４】 レトロウイルスベクターは、脊椎動物細胞に遺伝子を導入するための最も効果
的なツールである。臨床実験は、レトロウイルスベクターを使用してヒトにおけ
る遺伝子疾患（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損）を治癒するために行わ
れてきた。先天性代謝異常の矯正の他に、遺伝子療法はまた、癌および様々な他
の疾患を治癒するための臨床試験において試験されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９９２、第２５８巻、７４４−７４６頁）。
【０００５】 レトロウイルスベクターは、基本的には、全てのウイルスタンパク質コード配
列が目的の遺伝子で置換されているゲノムを含むレトロウイルス粒子である。そ
の結果、このようなウイルスは、１回の感染の後にさらに複製できない。レトロ
ウイルスベクター粒子は、ヘルパー細胞によって産生される（図１）。このよう
なヘルパー細胞は、複製に必要な全てのレトロウイルスタンパク質を発現するプ
ラスミド構築物を含む細胞株である。ベクターゲノムのこのようなヘルパー細胞
へのトランスフェクション後、このベクターゲノムは、ウイルス粒子にキャプシ
ド形成される（特異的キャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）配列の存
在に起因する）。ウイルス粒子は、目的の遺伝子のみを含有するゲノムを保有す
るヘルパー細胞から遊離される（図１）。最近１０年間に、ニワトリまたはマウ
スのレトロウイルスに由来するいくつかのレトロウイルスベクター系が、様々な
遺伝子の発現のために開発されている（概説については、Ｔｅｍｉｎ，１９８７
；Ｇｉｌｂｏａ，１９９０を参照のこと）。
【０００６】 レトロウイルスベクターはいくつかの制限を有する。ウイルス粒子中にキャプ
シド形成され得る制限されたゲノムサイズの他に、レトロウイルスベクターの適
用についての最も制限される要因は、ベクター粒子の限定された宿主範囲である
。いくつかのレトロウイルスは、ある種（エコトロピックレトロウイルス）の細
胞のみ、またはある種（例えば、ＨＩＶ）のある細胞型のみを感染し得る。他の
レトロウイルスは、非常に広範な宿主範囲を有し、そして多くの異なる種の組織
の多くの異なる型を感染し得る（両栄養性レトロウイルス）。
【０００７】 レトロウイルス感染の最初の過程は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）糖タン
パク質の特異的細胞膜レセプターへの結合であり、その性質は、ほとんどのレト
ロウイルスについて未知である。しかし、ウイルスｅｎｖタンパク質の細胞表面
レセプターとの相互作用は非常に特異的であり、そして特定のウイルスの細胞型
特異性を決定する（Ｗｅｉｓｓら、１９８５）。全ての公知のレトロウイルスの
エンベロープタンパク質は、２つの会合したペプチド（例えば、ＳＮＶ中のｇｐ
７０およびｐ２０（Ｅ））から構成される。これらのペプチドは、レトロウイル
スｅｎｖ遺伝子によってコードされる同じ前駆体（ｇＰＲ９０ｅｎｖ）から、タ
ンパク質分解性切断によって誘導される。１つのペプチドｐ２０（Ｅ）（ＴＭと
も称され、ウイルスの膜におけるタンパク質をアンカーし、そしてＨＩＶととも
に示される）は、ウイルスおよび細胞膜の融合を媒介する。第２のペプチドｇｐ
７０は（ＳＵとも称される）は、ウイルスのそのレセプターへの結合を媒介し、
それゆえ、宿主範囲を決定する（Ｗｅｉｓｓら、１９８５；Ｖａｒｍｕｓおよび
Ｂｒｏｗｎ，１９８９）。
【０００８】 いくつかのレトロウイルスから得られたデータは、レトロウイルスエンベロー
プタンパク質が三量体または四量体を形成することを示す。三量体の形成は、Ｔ
Ｍペプチドによって媒介されるようである（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｅ．ら、１９９０に
よって概説される）。標的エンベロープは、（ｉ）膜融合機能を維持し、そして
（ｉｉ）オリゴマー化を維持するために、ＴＭを保持する。しかし、Ｘ線写真が
利用可能ではないため、標的分子の構築が膜融合ドメインの構造を損なうか否か
、またはどの程度損なうかは不明である。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、標的エンベロープの性質によって媒介される、規定された標的細胞
特異性を有するレトロウイルスベクター粒子に関する。この標的エンベロープは
、レトロウイルスエンベロープタンパク質のカルボキシ末端部分に融合された特
異的細胞表面構造（例えば、別のウイルスのレセプター結合ドメイン）に結合す
る抗体の抗原結合部位または別のペプチドからなるキメラタンパク質であり得る
。この標的エンベロープは、レトロウイルス感染の第１の過程を媒介し、この媒
介は、特異的細胞表面レセプターへのこのウイルスの結合である。本発明はまた
、この標的エンベロープに加えて野生型エンベロープを含むレトロウイルス粒子
に関する。この野生型エンベロープの存在は、機能性膜融合ドメインを改良また
は補充するためのヘルパー分子として作用するように働く。この野生型エンベロ
ープについてのレセプターを含まない標的細胞（例えば、ＳＮＶはヒト細胞に感
染しない）を使用して、この野生型エンベロープは、レトロウイルス感染の第２
の過程にのみ関与し、この過程は、ウイルスおよび細胞膜の効果的な融合である
。本発明はまた、標的エンベロープに加えて野生型エンベロープを含むレトロウ
イルスベクター粒子の構築に関し、これは、標的エンベロープのみを含むレトロ
ウイルス粒子で観察された感染性の損失について補償し得る。
【００１０】 １つの実施態様において、本発明は、標的細胞特性を有するレトロウイルスベ
クター粒子に関し、この粒子は、標的エンベロープを形成するためにレトロウイ
ルスベクターのエンベロープタンパク質に融合された標的ペプチドを有するレト
ロウイルスベクターを含み、ここでこの標的ペプチドは、天然のウイルスレセプ
ター結合部位を置換または破壊し、そしてこの標的ペプチドは、抗体の抗原結合
部位、別のウイルスのレセプター結合ペプチドであるか、または標的の特異的レ
セプターに特異的に結合するペプチドである。
【００１１】 別の実施態様において、本発明は、レトロウイルスを使用して脊椎動物細胞に
遺伝子を導入するための細胞型特異的方法に関し、この方法は、標的細胞特異性
を有するレトロウイルスベクター粒子を細胞に投与する工程を包含し、この粒子
は、標的エンベロープを形成するためにレトロウイルスベクターのエンベロープ
タンパク質に融合された標的ペプチドを有するレトロウイルスベクターを含み、
ここで、標的ペプチドは、天然のウイルスレセプター結合部位を置換または破壊
し、そしてこの標的ペプチドは、抗体の抗原結合部位、別のウイルスのレセプタ
ー結合ペプチドであるか、または標的の特異的レセプターに特異的に結合するペ
プチドである。
【００１２】 なお別の実施態様において、本発明は、標的細胞特性を有するレトロウイルス
ベクター粒子を調製するための方法に関し、この粒子は、標的エンベロープを形
成するためにレトロウイルスベクターのエンベロープタンパク質に融合された標
的ペプチドを有するレトロウイルスベクターを含み、ここで、標的ペプチドは、
天然のウイルスレセプター結合部位を置換または破壊し、そしてこの標的ペプチ
ドは、抗体の抗原結合部位、別のウイルスのレセプター結合ペプチドであるか、
または標的の特異的レセプターに特異的に結合するペプチドであり、この方法は
、以下の工程を包含する： （ａ）標的ペプチドを提供する工程； （ｂ）ウイルスレセプター結合部位をコードするエンベロープ遺伝子の一部を
この標的ペプチドと置換して、キメラエンベロープ遺伝子を形成する工程； （ｃ）真核生物遺伝子発現ベクターにこのキメラエンベロープ遺伝子をクロー
ニングする工程；ならびに （ｄ）キメラエンベロープ発現プラスミド、レトロウイルスコアタンパク質発
現プラスミド、および選択マーカー遺伝子発現プラスミドを、真核生物細胞にト
ランスフェクトする工程。
【００１３】 （発明の詳細な説明） （標的化エンベロープ） 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウイルスベクター粒子に関する。こ
のレトロウイルスベクター粒子は、抗体の抗原結合部位またはレトロウイルスベ
クターのエンベロープタンパク質に融合する別のペプチドからなるキメラエンベ
ロープタンパク質を有するレトロウイルスベクターを含む。抗原結合部位または
他のペプチドは、天然のウイルスレセプター結合部位を解離するかまたは崩壊さ
せる。得られるキメラエンベロープは、「標的化エンベロープ」といわれる。本発
明は、標的エンベロープだけでなく野生型エンベロープタンパク質も含むレトロ
ウイルスベクターに関する。標的エンベロープに加えて野生型エンベロープの存
在は、標的化するエンベロープで障害され得る十分に機能的な膜融合ドメインを
供給することによりヘルパー分子として作用する。このヘルパー機能は、野生型
エンベロープについてのレセプターを含まないが、標的分子の結合のためのレセ
プターを含む細胞の感染を可能および／または増強する。本発明はまた、レトロ
ウイルス粒子を調製するための方法および脊椎動物細胞に遺伝子を導入するため
のレトロウイルスベクターの使用のための方法に関する。
【００１４】 ベクター粒子の宿主範囲を変化するため、目的の標的細胞に特異的な細胞表面
構造（レセプター）のみを認識する改変したエンベロープタンパク質を含むレト
ロウイルスベクター粒子が構築され得る。タンパク質の特定の構造を認識するこ
とが公知のタンパク質は、抗体分子である。従って、目的の細胞型に特異的なレ
トロウイルスベクター粒子を作製するため、ウイルスレセプター結合ペプチドが
抗体分子の抗原結合部位で置換され得る。このような抗原結合部位を含有するベ
クター粒子が感染についてコンピテントであるか否かを試験するため、脾臓壊死
ウイルス（ＳＮＶ）のエンベロープ遺伝子に融合したハプテンジニトロフェノー
ル（ＤＮＰ）に対する抗体の抗原結合ペプチドを用いて、モデル系を開発した。
【００１５】 抗ハプテン（抗−ＤＮＰ）抗体の使用は、多くの利点を有する。（１）この抗
原と抗体との相互作用は十分に特徴付けられている（ＤａｖｉｅｓおよびＭｅｔ
ｚｇｅｒ、１９８３）。（２）このハプテンは容易に入手可能である。（３）広
範な多様性の細胞（野生型ベクター粒子では感染され得ない）がこのハプテンと
結合体化され得る。ＤＮＰ結合体化細胞は、このハプテンに対する抗体に結合す
る。従って、このハプテンは、キメラベクター粒子についてのレセプターの（豊
富な）存在を模倣し得る。（４）抗−ハプテン抗体は、細胞によって頻繁にイン
ターナライズされる。従って、キメラエンベロープタンパク質の構築は、ＴＭの
膜融合ドメインを破壊する。この特性は、この機能の損失を補償し得る。（５）
インビトロ結合アッセイは、ウイルス粒子形成およびこのようなウイルスのＤＮ
Ｐへの結合を試験するために容易に確立され得る。（６）。
【００１６】 （野生型エンベロープ） 本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウイルス粒子に関する。このレトロ
ウイルスベクター粒子は、標的細胞の細胞表面レセプターへのレトロウイルスベ
クター粒子の結合を媒介する標的エンベロープを有するレトロウイルスベクター
を含む。この結合は、非常に特異的であり、そして宿主範囲および細胞型特異性
を決定する。この粒子はまた、野生型エンベロープを有する。野生型エンベロー
プに対して生存可能なレセプターを含まない標的細胞を用いると、野生型エンベ
ロープの機能は、十分に機能的な膜融合ドメインを供給することのみである。こ
の発明はまた、レトロウイルスベクター粒子を調製するための方法および脊椎動
物細胞に遺伝子を導入するためにレトロウイルスベクターを用いるための方法に
関する。
【００１７】 野生型エンベロープ単独を含有する脾臓壊死ウイルスに由来するレトロウイル
スベクターは、ヒト細胞またはハムスター細胞に感染し得ない。これらの感染性
研究において、ＤＳＮ細胞から収集したレトロウイルス粒子を用いて（Ｄｏｕｇ
ｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｐ．およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．１９８９）ヒトＨｅＬａ細胞
およびＣｏｌ−１細胞ならびにハムスターＣＨＴＧ（ｒｅｔ．１）細胞を感染さ
せた（表１および２）。ＤＳＮ細胞は、レトロウイルスコアタンパク質を発現す
るプラスミドおよび野生型エンベロープを発現する別のプラスミドを含有する標
準的レトロウイルスパッケージング細胞である（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｐ．
およびＴｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．１９８９）。
【００１８】 ＳＮＶレトロウイルスベクター粒子を用いてこのような細胞に遺伝子を導入す
るため、さらなる野生型エンベロープと組み合わせて、そして組み合わせずに、
異なる標的化エンベロープを用いて、２つの異なるアプローチを行った。
【００１９】 １．ＳＮＶレトロウイルスベクターを用いたヒト癌細胞（ＨｅＬａおよびＣｏ
ｌ−１）の標的化。ハプテンＤＮＰに対する抗体の抗原結合部位を用いた。以下
に記載の実験において、標的化エンベロープにおいて用いる抗原結合部位を種々
のヒト癌（例えば、ＨｅＬａ細胞およびＣｏｌ−１細胞、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら
、１９８８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄｒａ、１９９０）上で発現される細胞表面
タンパク質に対する抗体（Ｂ６．２と名付けた、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、１９８
８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄら、１９９０）から誘導した。標的エンベロープの
発現のための遺伝子構築物（図６）は、上記のものと類似している。特に、２つ
の構築物（図６、ｐＴＣ２４およびｐＴＣ２５）抗体部分は、下記の抗ＤＮＰ抗
体と同じ位置のＳＮＶエンベロープ遺伝子に融合した（さらに詳細には、以下、
材料および方法を参照のこと）。十分に機能的な膜融合ドメイン（野生型エンベ
ロープにより提供される）の付加が感染の有効性を増加するか否かを試験するた
め、レトロウイルスコアタンパク質、野生型エンベロープ、および標的化エンベ
ロープを発現するヘルパー細胞を開発した（図４）。このようなヘルパー細胞か
らウイルスを回収し、そして感染性研究に供した。
【００２０】 ２．エコトロピック（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）マウス白血病ウイルスのレセプタ
ーを発現するＣＨＴＧ細胞の標的化。抗体の抗原結合部位以外の標的分子を提示
するＳＮＶ由来のレトロウイルス粒子が感染性であるか否かを試験するため、Ｓ
ＮＶのエンベロープに融合する別のウイルス（マウス白血病ウイルス）のレセプ
ター結合ペプチドを含んだ標的エンベロープを構築した。野生型エンベロープを
伴うかまたは伴わずにこのような標的エンベロープを提示するウイルス粒子の感
染性を試験した。
【００２１】 （実施例） （標的化エンベロープ） （材料および方法） （抗体エンベロープ融合遺伝子の構築） 脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子は
、抗体−エンベロープ融合遺伝子の構築を可能にする適切な制限酵素部位を含ま
ない。従って、ＳＮＶ ｅｎｖ遺伝子に（部位特異的変異誘発により）異なる位
置で点変異を導入し制限酵素認識部位を作製した。この目的のために、ＳＮＶ
ｅｎｖ遺伝子（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩフラグメント）をｐＳｅｌｅｃｔ（部
位特異的変異誘発のために特に設計したベクター）にサブクローニングした。制
限酵素が２つのコドンの間で切断する方法で、平滑末端を作製する酵素の制限部
位を導入した。この一貫したストラテジー後に、全ての変異を用いて読取り枠を
変化することなく任意の組み合わせで欠失、挿入および融合を作製し得た。さら
に、疎水性ドメインをコードする領域と親水性ドメインをコードする領域との間
で、制限酵素部位をネスト化した。特定のドメインの欠失は以下のドメインの適
切な折り畳みを妨害しないと仮定される。この仮説は、多くのタンパク質が機能
的ドメインのエキソンシャッフリングにより進化しているという知見に基づく。
【００２２】 作製されたいくつかの変異エンベロープを図２に示す。ｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍ
Ｃ（図２ａ）は、疎水性ペプチドドメインと親水性ペプチドドメインとの間に位
置する新しい制限酵素部位を含む。この変異において、ヌクレオチド配列におけ
る変化は、アミノ酸配列を変化しない。従って、ｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＣは、陽
性コントロールと考えられ得る。ｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＤは、エンベロープ前駆
体の切断部位内に新しい制限酵素部位を含む。変異の導入はまた、試験された全
てのレトロウイルスの全ての切断部位において見出される共通の動機を破壊する
アミノ酸配列を変化した。従って、得られるエンベロープ前駆体が切断されず、
従ってウイルス粒子を感染性にしないことが予期された。変異したｅｎｖ遺伝子
を真核生物遺伝子発現ベクターであるｐＨＢ３に挿入した（図２）。
【００２３】 ＤＮＰに対する抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、Ｏｇａｗａ博士
（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のご好意で提供さ
れた。この遺伝子を配列決定し、そして公表した（Ｒｉｌｅｙら、１９８６）。
記載されるＰＣＲ技術（ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、１９９０）を用
いて、ＤＮＰに対する単一ペプチドを含む単鎖抗体遺伝子を構築した。ＰＣＲ産
物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位にクローニングした。ＤＮＡ配列決
定により、抗原結合ペプチドの可変領域をコードする２つの遺伝子セグメントの
首尾良い組み合わせを確認した。抗ＤＮＰ ｓｃＦｖ遺伝子の完全配列を図３に
示す。ＳａｃＩＩ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカーに位置する）〜Ｓｍ
ａＩ（３’ＰＣＲプライマーに位置する）のフラグメントを、以下のようにエン
ベロープ遺伝子のアミノ末端部分を置換する真核生物発現ベクター中に挿入した
：ＰＣＴ４において、ｅｎｖのＳａｃＩＩ（ｅｎｖ遺伝子のＡＴＧコドンの上流
に位置する）〜ＳｍａＩフラグメントをｐＴＣ５中のｓｃＦｖ遺伝子で置換した
。ｅｎｖのＳａｃＩＩ〜ＭｓｃＩフラグメントをｓｃＦｖ遺伝子で置換した（そ
れぞれ、図２Ｃおよび２Ｄ）。クローニング後、抗体エンベロープ結合を配列決
定して、キメラ遺伝子の正しい読取り枠の維持を確認した。
【００２４】 （結合アッセイ） インビトロ結合アッセイを以下の様式で実行した。ＤＮＰをＢＳＡに結合体化
した（ＤＮＰ−ＢＳＡを用いて、ｓｃＦｖ遺伝子が由来する最初の抗体を惹起し
た）。ＤＮＰ−ＢＳＡを供給業者（Ｓｉｇｍａ）が推奨するプロトコールに従っ
て活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した。抗ＤＮＰ抗体（Ｓ．Ｐｅｓｔｋａ博士
のご好意により提供された）を用いるＥｌｉｓａアッセイにより、首尾良い結合
反応を確認した。１００ｍｌの組織培養上清培地を５０ｍｌのＤＮＰ−ＢＳＡ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとともに３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベ
ーション後、セファロース粒子をＱｕａｌｉｔｒｏｎ微量遠心分離器での３０分
間の遠心分離によりペレットにした。このペレットをＰＢＳで１回リンスした。
このＰＢＳを取り除き、そしてセファロースペレットへ反応物を添加することに
より逆転写アッセイを実行した。標準的な手順を用いて逆転写アッセイを行った
；ｃＤＮＡへの３２ＰｄＴＴＰの組み込みを記載のようにＴＣＡ沈降により決定
した（Ｓｃｈｌｅｉｆ および Ｗｅｎｓｉｎｋ、１９８１）。
【００２５】 （抗体−エンベロープ融合タンパク質を含有する粒子の感染性に関する試験） 図２に示すエンベロープ発現プラスミドを、ｐＢＲ１およびｐＪＤ２１４ＨＹ
（それぞれ、レトロウイルスコアタンパク質を発現するプラスミド、およびハイ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのレトロウイルスベ
クターを含有するプラスミド）（図２）と同時トランスフェクションにおいてＤ
１７細胞（イヌ骨肉腫細胞株）にトランスフェクトした（図１もまた参照のこと
）。細胞をハイグロマイシン耐性について選択した。ハイグロマイシン耐性につ
いての選択後、ウイルスをコンフルエントな細胞培養物から回収し、そして感染
性アッセイを実行した（以下を参照のこと）。感染した標的細胞をハイグロマイ
シン耐性について選択した（Ｄ１７細胞を６０ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン含
有培地でインキュベートし、ＣＨＯ細胞を２５０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン含
有培地でインキュベートした）。ハイグロマイシン耐性細胞コロニーは、感染性
ウイルス粒子を示す。
【００２６】 感染性アッセイを結合体化ＤＮＰとともに、およびともなわずにＤ１７細胞お
よびＣＨＯ細胞で実行した。ＤＮＰを以下のように細胞に結合体化した：細胞を
ナトリウムココダイレート（ｓｏｄｉｕｍ ｃｏｃｏｄｙｌａｔｅ）緩衝液（０
．２５Ｍ）中に１．４ｍｇ／ｍｌのＤＮＢＳ（２，４−ジニトロベンゼン−スル
ホン酸、２−水和物、Ｋｏｄａｋから購入）を含有する５００ｍｌの溶液で室温
で３〜５分間インキュベートした。細胞に５ｍｌの培地を添加することにより結
合体化反応を停止した。
【００２７】 標準的なプロトコールを用い、５０ｍＭポリブレンの存在下で、非結合体化細
胞の感染を実行した。ＤＮＰ結合体化細胞の場合、ポリブレンなしで感染を実行
した。
【００２８】 （野生型エンベロープ） （材料および方法） （ｓｃＡ標的化ベクター） いくつかのヒト腫瘍細胞上で発現する細胞表面タンパク質に対する抗体の抗原
結合部位を含有する標的化エンベロープを構築するため、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発
現のために作製した対応する単鎖抗体遺伝子（Ｂ６．２と名付けられた、Ｂｉｒ
ｄ，Ｒ．Ｅ．ら、１９８８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄら、１９９０）を以下の方
法で改変した：テンプレートとして元来のＥ．ｃｏｌｉ．発現プラスミドを用い
てＢ６．２ ｓｃＡ遺伝子を増幅するためにＰＣＲ技術を用いた（Ｂｉｒｄ，Ｒ
．Ｅ．ら、１９８８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄら、１９９０）。用いたプライマ
ーは以下の配列を有した： プライマーＡ：５’ＧＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ
Ｃ３’ プライマーＢ：５’ＣＣＴＣＧＣＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧ
ＡＧＡＧＴＧＧＴＧＣ３’ このＰＣＲ増幅は、細菌のｏｍｐＡシグナル配列および元来のＢ６．２遺伝子に
存在する停止コドンを含まないフラグメントを生じる（Ｂｉｒｄ．Ｒ．Ｅ．ら、
１９８８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ら、１９９０）このＰＣＲ産物を、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）のＳｍａＩ部位にクロー
ニングし、そして配列決定して正しい読み取り枠を確認した。このプラスミドを
ｐＴＣ９と名付けた。このＢ６．２遺伝子をＥｃｏ４７ＩＩＩおよびＮｒｕＩで
ｐＴＣ９プラスミドを消化することにより単離した。対応する制限酵素認識部位
にＰＣＲ増幅に用いたプライマーを導入した。このＢ６．２遺伝子（Ｅｃｏ４７
ＩＩＩ〜Ｎｒｕフラグメント）を遺伝子発現ベクターであるｐＴＣ１３にクロー
ニングした（図５）。対応するベクター（ｐＴＣ２３と名付けた）は、Ｂ６．２
遺伝子に融合して小胞体を通じて輸送し得るＳＮＶエンベロープタンパク質のＥ
Ｒ輸送シグナル配列を含む。このクローニングで、Ｂ６．２遺伝子の３’末端で
ＮｒｕＩ部位を再構成した。ＳＮＶエンベロープ遺伝子のカルボキシ末端部分を
単離し、そしてＢ．２遺伝子（ＮｒｕＩ部位）に融合し、プラスミドｐＴＣ２４
、ｐＴＣ２５、およびｐＴＧ２６を得た（図６）。これらの構築物は、抗ＤＮＰ
抗体を含むプラスミドｐＴＣ４およびｐＴＣ５に非常に類似している。プラスミ
ドｐＴＣ２６において、抗体をＳＮＶエンベロープのコドン１６８に融合させる
。
【００２９】 （キメラ性ＳＮＶ−ＭＬＶ標的化エンベロープ） 別のウイルスのレセプター結合ペプチドを含む標的化エンベロープを、以下の
ように作製した：エコトロピックマウス白血病ウイルスの遺伝子セグメント（そ
のＥＲ輸送シグナル配列を含むＳＵペプチドをコードするほぼ完全領域を含むＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢａｌＩフラグメント、Ｏｔｔ，Ｄ．およびＲｅｉｎ，Ａ．１９
９２）を単離し、そしてベクターｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＣおよびｐＳＮＶ−ｅｎ
ｖ−ｍＤ（ｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＣおよびｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＤを図２に記載
した）に挿入した。これらのベクターは、ＳＮＶエンベロープ遺伝子のアミノ末
端部分を置換している。得られた構築物は、抗ＤＮＰ抗体ペプチド（抗ＤＮＰｓ
ｃＡ）がｅｃｏＭＬＶのレセプター結合ペプチドに置換されることを除いて、そ
れぞれプラスミドｐＴＣ４およびｐＴＣ５と同一である（図６、それぞれ、ｐＳ
ＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉＣおよびｐＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉ−Ｄ）。
【００３０】 （実験系） 簡略に言えば、上記のように、標的化エンベロープのみを含有するヘルパー細
胞株または標的化エンベロープおよび野生型エンベロープの両方を含有するヘル
パー細胞を得るために、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌタンパク質、レトロウイ
ルス標的化エンベロープおよび野生型エンベロープを発現するプラスミドを、選
択マーカーと同時トランスフェクションで、Ｄ１７細胞中にトランスフェクトす
ることにより、ヘルパー細胞を作製した。Ｄ１７細胞、エコトロピックマウス白
血病ウイルスレセプターを発現するＣＨＴＧ細胞（Ａｌｂｒｉｔｔｏｎ，Ｌ．Ｍ
．ら、１９８９）ならびにヒトＨｅＬａ細胞およびヒトＣｏｌ−Ｉ細胞を含んだ
種々の異なる細胞株で感染性アッセイを実行した。記載のように（Ｍｉｋａｗａ
，Ｔら）、細菌βガラクトシダーゼ遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを
用いて感染性を決定した。
【００３１】 （結果） （標的化エンベロープ） インビトロ結合アッセイ。インビトロ結合アッセイは、ｐＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍ
Ｄでトランスフェクトした細胞のみが、ＤＮＰに結合し得るキメラエンベロープ
を含むウイルスベクター粒子を生成することを示した（表１も参照のこと）。
【００３２】 感染性研究。感染性実験の結果を表１にまとめる。野生型エンベロープ（ｐＳ
ＮＶ−ｅｎｖ−ｍＣ）を含むベクター粒子は、Ｄ１７細胞に感染した。この効率
は、組織培養上清培地の１ｍｌあたり約１０5（＝１００，０００）コロニー形
成単位であった。このようなウイルス粒子はまたＤＮＰと結合体化したＤ１７細
胞に感染した。しかし、感染の効率は、ＤＮＰと結合体化していない細胞の効率
より３ケタ小さかった。ウイルス力価のこの低下は主に、抗生物質を用いるＤＮ
Ｐ結合体化細胞の選択の困難性に起因する。結合体化反応は、薬物に対して細胞
を非常に無防備にし、そして結合体化作用後、２から３日で細胞の９０％より多
くが死んだようである。野生型エンベロープを有するウイルス粒子は、ＣＨＯ細
胞に感染しない。
【００３３】 エンベロープ前駆体タンパク質（ＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＤ）の切断部位の変異は
、完全に感染性を廃した。ＤＮＰと結合体化していないＤ１７細胞でただ１つの
コロニーを観察した。この知見は、エンベロープ前駆体切断部位中の変異が非感
染性ウイルス粒子をもたらすという初期の報告と一致する。ｐＴＣ４でトランス
フェクトした細胞（図２）は、有意な効率性でＤ１７細胞またはＣＨＯ細胞に感
染し得るベクター粒子を生成しない。ｐＴＣ５でトランスフェクトした細胞は、
Ｄ１７細胞またはＣＨＯ細胞に感染し得ないウイルス粒子を生成した。しかし、
このような粒子は、ＤＮＰと結合体化した細胞に有意に感染した。
【００３４】 （野生型エンベロープ） まず、ＤＮＰに対する抗原結合部位を提示する粒子中の野生型エンベロープの
存在を試験し、ＤＮＰと結合体化した細胞の感染効率が上昇したか否かを決定し
た。ＤＮＰ結合体化ＨｅＬａ細胞が、野生型エンベロープ単独を含んだベクター
ウイルス粒子で感染され得ないことが見出された。しかし、ＤＮＰ結合体化細胞
は、抗ＤＮＰ提示レトロウイルスベクターで、非常に低効率で感染され得た。測
定した力価は、組織培養培地上清の１ｍｌあたり約１０感染単位であった。標的
化抗ＤＮＰエンベロープに加えて、野生型エンベロープを含んだウイルス粒子は
、さらに１０〜３０倍効率的に細胞に感染した。このデータは、野生型エンベロ
ープの存在が標的ベクターの感染の効率を増大し得ることを示す。この知見を実
証するために、他の標的化分子を用いる２つのさらなる実験セットを行った。
【００３５】 １．抗体−エンベロープ融合タンパク質を含むウイルス粒子での感染性研究。
Ｄ１７細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣｏｌ−１細胞を、種々のヒト癌細胞上で発現
される細胞表面タンパク質に対する抗体（Ｂ６．２、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、１
９８８およびＣｏｌｃｈｅｒ，Ｄら、１９９０）の抗原結合部位を提示するウイ
ルス粒子で感染させた。ベクターウイルス粒子を種々の異なるヘルパー細胞株か
ら回収した（表２）。全てのウイルス粒子が、細菌のβガラクトシダーゼ遺伝子
を形質導入するベクターを保有していた。感染性を記載のように（Ｍｉｋａｗａ
，Ｔら）Ｘ−ｇａｌで細胞を染色することにより決定した。ブルー細胞コロニー
の数を感染後２〜３日で決定した。以下のウイルス粒子を感染性について試験し
た：エンベロープを含まないウイルス粒子（「ｅｎｖなし（ｎｏ ｅｎｖ）」と
名付けた）、野生型エンベロープのみを含むウイルス粒子（ｗｔ−ｅｎｖ−ＤＳ
Ｎと名付けた）、抗体−エンベロープ融合タンパク質である標的化エンベロープ
のみを含むウイルス粒子（図６に記載のようにＴＣ２４、ＴＣ２５、およびＴＣ
２６と名付けた）および野生型エンベロープおよび標的化エンベロープを含む粒
子（ＴＣ２４＋ｗｔ−ｅｎｖ、ＴＣ２５＋ｗｔ−ｅｎｖ、およびＴＣ２６＋ｗｔ
−ｅｎｖと名付けた）。いずれのエンベロープも含まない粒子は、基本的に感染
性でないことが見出された。野生型エンベロープを含む粒子は、野生型ＳＮＶに
対する生存可能なレセプターを含むＤ１７細胞にのみ感染性であった。この粒子
は、ＨｅＬａ細胞またはＣｏｌ−１細胞に感染性ではない。標的化エンベロープ
のみを含む粒子は、Ｄ１７細胞およびＨｅＬａ細胞に感染性であった。Ｄ１７細
胞に対する感染性効率は、野生型エンベロープを含むウイルスの感染性の５％未
満であった。このような粒子は、Ｃｏｌ−１細胞に感染性ではなかった。野生型
エンベロープの付加は、感染の効率を１０〜５０倍に増加した。さらに、いずれ
かのエンベロープのみを含有する粒子で感染され得ないＣｏｌ−１細胞を、野生
型ｅｎｖおよび標的化ｅｎｖの両方を含有する粒子で感染し得た。このデータは
、野生型エンベロープが、ウイルス侵入を改善するかまたは完全に可能にさえす
る機能を付加することを示す（表２）。これらのデータはまた、抗体がエンベロ
ープに融合するエンベロープ遺伝子内の位置に、感染性のレベルが依存すること
を示す。
【００３６】 ２．ＳＮＶ−ＭＬＶ−融合タンパク質を含有するウイルス粒子での感染性試験
。エコトロピックマウス白血病ウイルスのレセプターを発現するＣＨＴＧ細胞（
Ａｌｂｒｉｔｔｏｎ，Ｌ．Ｍ．ら、１９８９に記載）およびＤ１７細胞を、標的
化エンベロープ（ＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉ−ＣおよびＳＮＶＭＬＶ−ｃｈｉｃ−
Ｄ）単独を発現する細胞からか、または標的化エンベロープおよび野生型エンベ
ロープを発現するヘルパー細胞から収集したウイルスで感染させた。ウイルス粒
子は、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を保有していた。感染した細胞をハイグロ
マイシン耐性から選択し、そしてハイグロマイシン耐性細胞コロニーの数を決定
した。標的化エンベロープのみを含有するレトロウイルスベクター粒子は感染性
でなかった。野生型エンベロープが粒子に付加された後、この粒子は、感染性に
なった。野生型エンベロープのみを有する粒子はＣＨＴＧ細胞上で感染性ではな
い（表３）。
【００３７】 （考察） （標的化エンベロープ） 抗体−エンベロープ融合タンパク質を含むレトロウイルス粒子で得られたデー
タは、このような粒子が感染についてコンピテントであることを示した。驚くべ
きことに、ＳＵの中間でｅｎｖに融合されたｓｃＦｖ遺伝子を含む構築物ＴＣ４
は、ＤＮＰに結合し得るウイルス粒子を生じなかった。これは、ＳＵ−ＴＭ複合
体が不安定であることに起因し得る。この仮説は、このような粒子がＤＮＰ−Ｂ
ＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合し得ないという知見により支持される。Ｄ１７
細胞に対するこのような粒子の低レベルの感染性は、ＴＭのみを含むウイルス粒
子の非特異的な吸着から生じ得る。非特異的に吸着したウイルス粒子（ＳＵを欠
失した）は、時々、細胞に侵入し得る。
【００３８】 ｐＴＣ５でトランスフェクトした細胞は、機能的なレトロウイルス膜融合ドメ
インを有さないキメラエンベロープを有するウイルス粒子を産生する。この仮定
は、開裂しないエンベロープ前駆タンパク質（ＳＮＶ−ｅｎｖ−ｍＤ）を含むウ
イルス粒子が感染性でないという知見に基づく。しかし、いくつかの抗体分子が
未知のメカニズムによる細胞表面への結合の後、細胞によりインターナライズさ
れることが公知である。このデータは、このようなインターナリゼーションメカ
ニズムは、ウイルス粒子のインターナリゼーションおよび引き続く首尾良い感染
の確立を可能にするのに十分であり得る。
【００３９】 （遺伝子治療における抗体−エンベロープ融合タンパク質を用いるベクター粒
子の適用） 現在まで、ヒト遺伝子治療のすべての適用において、目的の細胞を患者から単
離し、他の細胞型から精製し、そしてヘルパー細胞から収集したレトロウイルス
ベクター粒子とともに組織培養に感染させた。組織培養において処理した細胞の
増殖後、それらを患者に再注射した。細胞の感染はインビトロで行うべきである
。なぜなら、用いるレトロウイルスベクター粒子（広宿主性のマウスレトロウイ
ルスに由来する）は、広範な宿主範囲を有するからである。従って、患者の血流
に直接注射した場合、このようなウイルス粒子は、すべての種類の組織に感染す
る。他の危険性に加えて、この処置は非能率的である。なぜなら遺伝子がその適
切な標的細胞に送達される機会は非常に低いからである。
【００４０】 この臨床的な遺伝子治療のプロトコールは、遺伝子治療が患者にいかに効率的
でいかに利益があるかを見抜くために十分であり得る。実際、この臨床データは
非常に有望にみえる（Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎ）。しかし、現在の臨床プロトコールは非常に困難であり、時間を浪費
し、非常に経費がかかり、従って一般的な臨床適用には適さない。一般的な臨床
適用のためには、患者の体内に遺伝子移入ビヒクルを直接注射することが必要で
ある。
【００４１】 特定の単一の細胞型にのみ感染するレトロウイルスベクター粒子の開発は、患
者の血流内へのベクターの直接の注射を可能にし得る。抗体−エンベロープキメ
ラを含有するベクター粒子の開発は、この目標への第１ステップであり得、そし
てインビボにおける遺伝子治療の潜在的な適用の新しい領域を拓き得る。
【００４２】 （単鎖抗体を提示するレトロウイルスベクターを用いる、治療用遺伝子のイン
ビボ送達） ウイルス表面上に単鎖抗体を提示するレトロウイルスベクター粒子を用いたイ
ンビボ遺伝子送達を試験するために、ＳＣＩＤマウスを第１のモデル系として使
用した。レトロウイルスベクターは、異種の種の細胞から産生される場合には、
補体によって迅速に不活化されることが周知である。しかし、ＳＣＩＤマウスは
、機能的な免疫系を有していない。
【００４３】 （ＳＣＩＤマウス血清が、ＳＮＶレトロウイルス粒子を不活化しないことの確
認） 本発明者らの実験では、レトロウイルスベクター粒子をＤＳＨ−ｃｘｌパ
ッケージング株（ＭａｒｔｉｎｅｚおよびＤｏｒｎｂｕｒｇ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
２０８：２３４−２４１、１９９５；ＣｈｕおよびＤｏｒｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６９：２６５９−２６６３、１９９５に記載）から収集した。これら
のパッケージング細胞は、細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子
）を発現するレトロウイルスベクターを形質導入する。プラスミドｐＣＸＬ（Ｍ
ｉｋａｗａ Ｔ．Ｄ．ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９５：５１６−５２３
、１９９２）は、ｌａｃＺ遺伝子を発現するＳＮＶ由来のレトロウイルスベクタ
ーを含む。１００μｌアリコートのレトロウイルスベクター溶液を調製し、そし
てそれぞれ０．１、１、１０、および１００μｌのＳＣＩＤマウス血清と１０分
間インキュベートした。第２の実験では、同じ量の熱非働化（６０℃で３０分間
）ＳＣＩＤマウス血清を１００μｌのベクターストックに添加した。次いで、感
染性アッセイにおいて、混合物を２×１０5のＤ１７細胞に添加した。この感染
の２日後に、細胞をｘ−ｇａｌで染色し、そして記載のように（Ｍａｒｔｉｎｅ
ｚおよびＤｏｒｎｂｕｒｇ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０８：２３４−２４１、１９
９５；ＣｈｕおよびＤｏｒｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６５９−２６
６３、１９９５）青色コロニーの数を測定した。新鮮な血清または熱非働化血清
とインキュベートされたサンプル間で、感染性における有意差は観察されなかっ
た。従って、ＳＣＩＤマウス血清は、ＳＮＶレトロウイルス粒子を不活化する抗
体および／または補体因子を含まないとの結論がなされ得る。
【００４４】 （インビボでの細胞型特異的遺伝子送達） 別の実験では、ハイグロマイシン
耐性ヒトＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞（これは、細胞表面マーカーＨｅｒ２ｎｅｕを
発現する）（ＡＴＣＣ登録番号 ＣＣＬ２２０）、またはハイグロマイシン耐性
Ａ４３１細胞（これは、Ｈｅｒ２ｎｅｕを発現しない）（ＡＴＣＣ登録番号 Ｈ
Ｂ−９６２９）を、マウスの腹膜内に注射した。翌日、抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ単鎖抗
体を提示するベクターウイルス粒子（１０6個の感染性粒子）を注射した。これ
らのウイルス粒子の調製は、以下に記載される。ベクターウイルス粒子は、マー
カー遺伝子である細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、感染細胞に形質導入し
た。従って、感染後に細胞を染色することによって、遺伝子を形質導入された細
胞は青色に着色し、従って容易に検出され得る。
【００４５】 （パッケージング細胞株の構築） 抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ抗体を提示するレトロウ
イルスベクター粒子を産生する安定なパッケージング細胞の構築は、Ｃｈｕ、Ｔ
．−Ｈ．およびＤｏｒｎｂｕｒｇ，Ｒ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２０−７２
５、１９９７において詳細に記載されるプロトコールに従った。簡潔には、キャ
プシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）陰性ＳＮＶ ｇａｇ−ｐｏｌタンパ
ク質を発現するイヌＤ１７細胞由来の細胞株ＤＳｇｐ１３−ｃｘｌ、およびパッ
ケージング可能なレトロウイルスベクターｐＣＸＬを使用して、キメラｓｃＡ−
ｅｎｖ融合タンパク質を発現する細胞株を作製した。これに関し、ｓｃＡ−Ｅｎ
ｖ遺伝子発現ベクターｐＡＪ７（以下に記載）を、選択マーカー遺伝子を発現す
るプラスミドでの同時トランスフェクションで、ＤＳｇｐ１３−ｘｃｌ細胞にト
ランスフェクトした。この実験において、本発明者らは、ＳＮＶプロモーターに
よって駆動され、ｐＲＤ１１８−ｐｕｒｏに含まれ、ｐＲＤ１１８に由来する（
Ｃｈｕ Ｔ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｇ １８：８９０−８９９、１９９５
）、プロマイシン耐性遺伝子を使用した。しかし、当業者は適切な選択マーカー
遺伝子を容易に選択し得る。各トランスフェクションについて、約１００〜２０
０の単一の抗生物質耐性細胞コロニーを単離した。細胞を２４ウェルプレートに
移してすぐに、ｓｃＡ−Ｅｎｖタンパク質の発現をＥＬＩＳＡアッセイおよび感
染性アッセイによって試験した。この方法でヘルパー細胞を作製する理由は、ト
ランスフェクトされたプラスミドＤＮＡはしばしば、不充分に転写されるやや不
活性な染色体部位に組み込む、ということである。
【００４６】 次に、ＳＮＶ野生型エンベロープ遺伝子発現ベクターｐＩＭ２９（Ｍａｒｔｉ
ｎｅｚ Ｉ．およびＤｏｒｎｂｕｒｇ，Ｒ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：４３３９
−４３４６、１９９５；ならびにＭａｒｔｉｎｅｚ，Ｉ．およびＤｏｒｎｂｕｒ
ｇ，Ｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８：２３４−２４１、１９９５）を、上記の
単一コロニーから樹立された細胞株にトランスフェクトした。再度、選択マーカ
ー（例えば、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を発現する
プラスミドを同時トランスフェクションすることによって、トランスフェクショ
ンを実施した。１００〜２００個の単一細胞コロニーを単離し、そしてヒトの標
的細胞に対する感染性について試験した。最も高い感染性を有する細胞クローン
を選択し、１回または２回再クローニングし、最終的にインビボ実験に使用した
。 ｐＡＪ７は、ＳＮＶ−Ｅｎｖ−ＴＭコード領域に融合された抗Ｈｅｒ１ｎｅ
ｕ ｓｃＡを含むプラスミドである。このプラスミドは、プラスミドｐＴＣ２５
と非常に類似している（図６）。しかし、これは、わずかに異なる方法で作製し
た：最初に、図７および８を参照して、アミノ酸ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｓｅ
ｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒをコードするＤＮＡリンカーを、プラスミドＮ２９−γ中の
抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ ｓｃＡ遺伝子（これは、ＥＲを通した輸送のために、抗体遺
伝子の確証済み疎水性リーダー配列を含む）のカルボキシ末端で挿入して、プラ
スミドｐＲＤ１６１（示さず）を得た。ｐＲＤ１６１から単離され、そして完全
な抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ ｓｃＡ（疎水性リーダー配列を含む）を含むＤＮＡフラグ
メント（ＳｎａＢ１〜Ｅｃｏ４７ＩＩＩ）を、Ｓａｃ２（平滑末端）およびＮａ
ｅＩで消化したｐＴＣ５３（図９）内にクローニングして、プラスミドｐＡＪ７
を得た。このキメラタンパク質をコードする遺伝子の正確な読み取り枠の維持を
確認するために、すべてのクローニング工程の後にＤＮＡ配列決定を実施した。
【００４７】 プラスミドｐＴＣ５３（図９）は、レトロウイルス粒子上での提示のための、
単鎖抗体−エンベロープ融合タンパク質の高速クローニングおよび効率的発現の
ための遺伝子発現プラスミドである。ｐＴＣ５３は、ｐＴＣ１３（Ｃｈｕ，Ｔ．
−Ｈ．およびＲ．Ｄｏｒｎｂｕｒｇ、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６５
９−２６６３；ならびにＣｈｕ，Ｔ．−Ｈ．ら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｑ．１８：８９０−８９９）に由来している。これは、ＭＬＶ−Ｕ３プロモータ
ーおよびアデノウイルス２三分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列、次い
でＳＮＶエンベロープ遺伝子の疎水性リーダー配列をコードする配列を含む。次
いで、このプラスミドは、単鎖抗体遺伝子（例えば、ＰＣＲ産物）のクローニン
グのために、唯一のＮａｅＩ部位（これは、２つのコドン間を切断する）を含む
。ＮａｅＩ部位の下流は、ｓｃＡの可撓性を可能にするために、アミノ酸モチー
フ（ｇｌｙ4−ｓｅｒ）3をコードするＤＮＡリンカーである。このｇｌｙ−ｓｅ
ｒリンカーを、インフレームで、ＳＮＶエンベロープ遺伝子の完全な膜貫通ペプ
チド（ＴＭ）コード領域に融合する。ＴＭコード領域の下流のポリアデニル化部
位は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来した。このプラスミドの骨格は
ｐＵＣ１９の骨格である。
【００４８】 （ベクターウイルスストックの濃縮） 濃縮したベクターウイルスストックを
、ＣｈｕおよびＤｏｒｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２０−７２５、１
９９７に記載のように調製した。簡潔には、限外濾過によってウイルス粒子を濃
縮するために、１５ｍｌの上清を、１００ｋＤまたは５００ｋＤの分子量カット
オフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）（ＭＷＣＯ）メンブランを備えるＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎ
ｔｒｉｐｒｅｐ濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に添加し
た。１００ｋＤカットオフのメンブランはセルロース製であり、５００ｋＤメン
ブランは、ポリスルホン製である（Ｄａｖｉｄ Ｂｒｅｗｓｔｅｒ、Ａｍｉｃｏ
ｎ、個人通信）。ベクター粒子溶液を、３，０００ｒｐｍで３０分間、２０℃に
て、スイングアウト（ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ）バケットを備えるＳｏｒｖａｌｌ
ＲＣ５０００Ｂ卓上型遠心機で遠心分離した。上清培地を破棄し、そしてこの溶
液を少なくとももう１度、１０分間または最終容量１ｍｌ（またはそれ未満、例
えば、０．７ｍｌ）が得られるまで遠心分離する。最終濃縮物を、感染性実験の
ために迅速に使用した。
【００４９】 （インビボでの細胞型特異的遺伝子送達の確認） ベクターウイルス注射の翌
日、マウスを屠殺した。腹膜のトリプシン処理によって、ヒト細胞を回収した。
細胞を単離し、そして組織培養において異なる抗生物質選択に供した。ハイグロ
マイシン選択は、ヒトＣＯＬＯ３２０ＤＭ Ｈｅｒ２ｎｅｕ＋標的細胞またはＡ
４３１ Ｈｅｒ２ｎｅｕ−非標的細胞の増殖を可能にするが、マウス細胞の増殖
は可能としない。両方の実験において、マウス細胞の広大なバックグラウンドで
、ヒト細胞をコロニーとして増殖させ始めた。選択の４日後、細胞をｘ−ｇａｌ
で染色した（Ｃｈｕ，Ｔ．−Ｈ．およびＲ．Ｄｏｒｎｂｕｒｇ、１９９７、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７１：７２０−７２５）。本発明者らは、２〜３％のＣＯＬＯ３２
０ＤＭ標的細胞がインビボで感染されることを見出した。Ａ４３１はいずれも感
染しなかった。さらに、いずれのマウス細胞も（主に、腹膜の上皮細胞）青色に
着色せず、これはそれらが感染しなかったことを示す。このデータは、細胞型特
異的遺伝子送達がインビボで獲得され得ること、およびＳＣＩＤマウスが、イン
ビボ遺伝子送達を研究するために適切なモデル系であることを示す。
【００５０】 （野生型エンベロープ） 抗体の抗原結合部位を提示するレトロウイルスベクター粒子は、この抗体に特
異的な抗原を含む細胞に特異的に感染し得る。しかし、遺伝子移入の効率は低い
ものであり得る。本発明者らは、エンベロープへの標的化ペプチドの融合が、ウ
イルスの効率的な貫入に必須であるエンベロープの天然の融合機能を損なうと仮
定した。従って、野生型エンベロープの添加がこの欠点を補完し得るという仮説
を試験した。
【００５１】 ２つの異なる型の標的化エンベロープを含む新たなレトロウイルスベクター粒
子を構築した。これらの標的化エンベロープは、以下であった：（１）脾臓壊死
ウイルス（ＳＮＶ）のエンベロープタンパク質の種々のカルボキシ末端部分に融
合された抗体の抗原結合部位を含む、融合タンパク質；および（２）ＳＮＶの種
々のカルボキシ末端部分に融合されたｅｃｏＭＬＶのレセプター結合ドメインか
らなり、抗体エンベロープ構築物に類似した（図６）、融合タンパク質。
【００５２】 標的化エンベロープ単独では、この標的化エンベロープのレセプターを含む細
胞に対してほとんどまたは全く感染性ではない。標的化エンベロープを含有する
粒子への野生型エンベロープの添加は、いずれかのエンベロープを単独で含むウ
イルス粒子では、ほとんどまたは全く感染され得ない標的細胞に対する感染性を
、劇的に増加させるか、またはほぼ完全に可能にする。このデータは、混合エン
ベロープを含む粒子の構築が、特定の標的細胞への遺伝子移入の効率を劇的に改
善することを示し、従って、特定の標的細胞に遺伝子を導入するための価値ある
ツールを提供する。
【００５３】 本方法は、野生型エンベロープの天然のレセプター結合ドメインを（例えば、
部位特異的変異誘発によって）変異させることによって、おそらく改善され得る
。混合エンベロープレトロウイルスベクター粒子中に非機能的レセプター結合部
位を含む野生型エンベロープを使用することは、標的細胞特異性を緩めることな
く、野生型エンベロープのレセプターを含む細胞もまた標的化することを可能に
し得る。
【００５４】
【表１】 *ウイルスを、ＳＮＶ ｇａｇ−ｐｏｌおよび左欄に示されるエンベロープタ
ンパク質を発現する組織培養細胞から収集した（図２もまた、参照のこと）。す
べての細胞が、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を発現する
レトロウイルスベクターであるｐＪＤ２１４ＨＹを含んだ。感染した細胞を、ハ
イグロマイシン耐性について選択した。ハイグロマイシン耐性細胞コロニーの数
を、感染の２〜３週間後（未感染コントロールのプレートにおいて、すべての細
胞が死滅した後）に決定した。ベクター粒子のＤＮＰ結合を、ＤＮＰ−ＢＳＡ−
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ粒子に結合した逆転写酵素活性を測定することによって決定
した。ｎｄ：測定されず；０：ハイグロマイシン耐性コロニーが全く検出されな
かった。ウイルス力価を、組織培養上清培地１ｍｌあたりのコロニー形成単位（
ｃｆｕ）として表す。
【００５５】
【表２】 プラスミド構築物ｐＴＣ２４、ｐＴＣ２５、およびｐＴＣ２６を、レトロウイ
ルスコアタンパク質（ｇａｇ−ｐｏｌ）およびベクターｐＣＸＬ（Ｍｉｋａｗａ
，Ｔ．）を発現するＤ１７細胞、またはｐＣＸＬベクターもまた含むレトロウイ
ルスパッケージング株ＤＳＮにトランスフェクトした（抗生物質耐性遺伝子を発
現するプラスミドでの同時トランスフェクションにおいて）。ｐＣＸＬベクター
は、細菌性β−ガラクトシダーゼ（ｔａｃｏ遺伝子を移入する。ウイルスを安定
にトランスフェクトされた細胞株から収集し、そして新鮮なＤ１７細胞、ＨｅＬ
ａ細胞、またはＣｏｌ−１細胞に感染させた。感染の２日後、細胞をＸ−ｇａｌ
で染色した。青色細胞は、ｌａｃＺ遺伝子を発現している感染細胞を示す。ウイ
ルス力価を、ヘルパー細胞から収集された、組織培養上清培地１ｍｌあたりのコ
ロニー形成単位として表す（ｃｆｕ／ｍｌ）。 −*実験を実施せず。 ｎｄ：合計２ｍｌの上清組織培養培地を使用する感染性実験において、全く感染
細胞が検出されなかった。
【００５６】
【表３】 ウイルスを、ＳＮＶ ｇａｇ−ｐｏｌおよび左欄に示されるエンベロープタン
パク質を発現する組織培養細胞から収集した（図６もまた、参照のこと）。すべ
ての実験を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を移入するレトロウイルスベクターｐ
ＪＤ２１４ＨＹを用いて実施した。ウイルス力価を、組織培養上清培地１ｍｌあ
たりのハイグロマイシン耐性コロニー形成単位として表す。ＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃ
ｈｉＣ＋ｗｔ ＳＮＶおよびＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉＤ＋ｗｔ ＳＮＶは、ＭＬ
ＶおよびＳＮＶのキメラエンベロープ、ならびに野生型（ｗｔ）ＳＮＶのエンベ
ロープを発現する細胞株である。ＤＳＮ細胞は、２つの異なるプラスミド構築物
由来のｇａｇ−ｐｏｌおよびＳＮＶ ｅｎｖを発現するＳＮＶベースのヘルパー
細胞である。ウイルス力価を、組織培養上清培地１ｍｌあたりのコロニー形成単
位（ｃｆｕ）として表す。ｎｄ：合計５ｍｌの組織培養培地を使用して、ハイグ
ロマイシン耐性コロニーは全く検出されなかった。
【００５７】 用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、プライマー、
プローブ、検出されるべきオリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロール、
および非標識ブロッキングオリゴマーをいう。オリゴヌクレオチドは、２つ以上
のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子である
。用語「プライマー」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在する（例え
ば、精製された制限消化物）かまたは合成的に生成されるかのいずれかの、オリ
ゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドをいい、これはプ
ライマー伸長産物（これは、核酸鎖に対して相補的である）の合成が誘導される
条件（すなわち、ヌクレオチド、重合のための因子（例えば、ＤＮＡポリメラー
ゼ）、ならびに適切な温度およびｐＨの存在下）に供される場合に、合成の開始
点として作用し得る。プライマーは、重合因子の存在下で伸長産物の合成を開始
するに十分に長くなければならない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
核酸配列を増幅および検出するための方法は、米国特許第４，６８３，１９５号
、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，２８８号（これらの開示
は、本明細書中で参考として援用される）において、詳細に記載される。
【００５８】 図１は、レトロウイルスタンパク質を発現するヘルパー細胞を例示する図であ
る。Ａ）ヘルパー細胞を、感染性ウイルス粒子を形成するために必要とされるす
べてのレトロウイルスタンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクション
によって作製する。一方のプラスミドを、すべてのコアタンパク質を発現するよ
うに設計する（ｇａｇおよびｐｏｌの発現）。他方のプラスミドを、エンベロー
プ前駆体タンパク質を発現するように設計する。両方のプラスミド構築物は、ウ
イルス複製のためのレトロウイルスシス作用配列（例えば、キャプシド形成配列
、プライマー構築部位など）を含まない。ポリアデニル化は、非レトロウイルス
性ポリアデニル化認識配列において起こる。Ｂ）レトロウイルスベクターのトラ
ンスフェクション後、ベクターＲＮＡゲノムをコア構造内にキャプシド形成させ
る。ヘルパー細胞は、目的の遺伝子（１つまたは複数）を有するベクターゲノム
のみを含むレトロウイルス粒子を産生する。ベクターは、複製のためのすべての
シス作用配列を含む。従って、感染した標的細胞において、ベクターゲノムは逆
転写され、そしてゲノム中に組み込まれる。ベクターゲノムにおけるレトロウイ
ルスタンパク質コード遺伝子の欠如に起因して、感染した標的細胞からウイルス
粒子は全く産生されない。Ｃ）プラスミドを含むヘルパー細胞は、改変されたエ
ンベロープ遺伝子を発現する。ヘルパー細胞は、上記に示されるヘルパー細胞と
非常に類似する。しかし、エンベロープ遺伝子のカルボキシ末端に融合されたア
ミノ末端で抗体の抗原結合ドメインを含む、キメラエンベロープ遺伝子を構築し
た。このような粒子は、キメラエンベロープタンパク質の抗体部分によって認識
される抗原構造を含む標的細胞にのみ結合し得、そして感染し得る。
【００５９】 図２は、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）の変異エンベロープ遺伝子を発現するプ
ラスミドを例示する図である。遺伝子は、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｒ
ＳＶ ｐｒｏ）から発現され、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の
ポリアデニル化シグナル（ＴＫポリ（Ａ））内でポリアデニル化される。ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカーは、プロモーターとポリアデニル化配列との間
に挿入されて、このベクター内への遺伝子の容易なクローニングを可能にした（
ベクターに隣接するプラスミド配列は示さず）。ａ／ｂ）部位特異的変異誘発に
よってｅｎｖ遺伝子内に点変異を導入して、新たな制限酵素認識部位を作製した
（１つの*によって示される）。すべての酵素は、２つのコドンの間を正確に切
断して、読み取り枠のシフトを伴わない容易な連結のための平滑末端を作製する
。ｃ／ｄ）ｅｎｖのカルボキシ末端に融合された抗原結合ペプチドを含むキメラ
エンベロープ。ｅ）レトロウイルスベクター粒子による遺伝子の移入を試験する
ためのすべての研究で使用されたレトロウイルスベクターであるｐＪＤ２１４Ｈ
ｙ。
【００６０】 図３は、ハプテンＤＮＰに対する単鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ）の配列を示す。
【００６１】 図４は、レトロウイルスパッケージング細胞を例示する。Ａ）レトロウイルス
ベクター粒子タンパク質の産生のために２つの異なるプラスミドを含む、真核生
物細胞。このような細胞においてトランスフェクトされ、かつ目的の遺伝子を保
有するレトロウイルスベクターを、レトロウイルスコアタンパク質によってキャ
プシド形成する。エンベロープ発現ベクターは、標的化エンベロープ（例えば、
エンベロープに融合された抗原結合ペプチド）を発現する。抗原結合部位に特異
的なレセプターを含む標的細胞のみに感染するウイルス粒子を産生する。Ｂ）に
おいて示されるヘルパーは、野生型エンベロープをコードする遺伝子発現ベクタ
ーを同様に含むことを除いて、上記に示されるヘルパーに類似する。このような
ヘルパー細胞から産生されるウイルス粒子は、標的化エンベロープおよび野生型
エンベロープからなる「混合」エンベロープを含む。標的化エンベロープおよび
野生型エンベロープの両方が、オリゴマーの形成を媒介する完全ＴＭペプチドを
含むので、混合オリゴマーの形成が可能である。
【００６２】 図５は、ＥＲ認識配列を含む高レベルの遺伝子産物を得るための真核生物遺伝
子発現ベクター（ｐＴＣ１３）を例示する。示されるベクターは、Ｓｈｅａｙ，
Ｗ．ら、１９９３に記載される別の遺伝子発現ベクター（ｐＲＤ１１４と命名）
に由来している。示されるベクターは、小胞体を通したタンパク質の輸送を可能
にするためのＥＲ認識シグナル配列をコードする遺伝子フラグメントを含むとい
う点で、ｐＲＤ１１４とは異なる。これは、ＥＲシグナル配列コード領域の下流
の２つのコドンの間を切断する、制限酵素ＮｒｕＩおよびＳｔｕＩの２つの認識
部位を含む。任意のペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、このベクター
中に挿入し得る。挿入された遺伝子の翻訳は、３つの終止コドンのうちの１つを
使用することによって終結される。ＭＬＶ−Ｕ３−ｐｒｏ：マウス白血病ウイル
スのプロモーターおよびエンハンサー；Ａｄ．Ｖ．リーダー：アデノウイルスの
三分節リーダー配列；ＳＶ４０ポリ（Ａ）：シミアンウイルス４０のポリアデニ
ル化シグナル配列。
【００６３】 図６は、標的化エンベロープタンパク質を発現するプラスミドベクターを例示
する。単鎖抗体Ｂ６．２をコードする遺伝子のＰＣＲ産物（Ｅｃｏ４７ＩＩＩ〜
ＮｒｕＩフラグメント、材料および方法を参照のこと）をｐＴＣ１３（図５）の
ＮｒｕＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＴＣ２３を得た。ＳＮＶエンベロ
ープ遺伝子のカルボキシ末端部分を単離し、そしてＢ６．２抗体遺伝子の下流の
ＮｒｕＩ部位にクローン化した。ｐＴＣ２４およびｐＴＣ２５の得られた標的化
抗体−エンベロープ融合遺伝子は、ｐＴＣ４およびｐＴＣ５に類似する。ｐＴＣ
２４およびｐＴＣ２５は、それぞれｐＴＣ２４およびｐＴＣ２５と正確に同じ量
のＳＮＶエンベロープを保持する。ｐＴＣ２６において、抗体コード遺伝子は、
エンベロープ遺伝子のコドン１６７でエンベロープコード領域に隣接する。プラ
スミドｐＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉＣおよびｐＳＮＶ−ＭＬＶ−ｃｈｉＤは、抗体
遺伝子が、ＭＬＶのほぼ完全なＳＵペプチドをコードする遺伝子フラグメントで
置換されていることを除いて、ｐＴＣ４およびｐＴＣ５と同一である。これらの
クローンにおいて、ＥＲ輸送シグナル配列（Ｌ）は、ＭＬＶ由来である。ＭＬＶ
−ｐｒｏ：マウス白血病ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー；Ａｖｔｌ
：アデノウイルスの三分節リーダー配列；Ｌ：ＥＲ輸送シグナル配列；Ｂ６．２
ｓｃＦＶ：単鎖抗体Ｂ６．２をコードする遺伝子；ポリ（Ａ）：ＳＶ４０のポリ
アデニル化シグナル配列；ＳＵ：ＳＮＶエンベロープの表面ペプチドコード領域
；ＴＭ：ＳＮＶエンベロープの膜貫通コード領域；ＲＳＶ：ラウス肉腫ウイルス
のプロモーターおよびエンハンサー。
【００６４】 （参考文献の添付）
【００６５】
【表４】 本明細書を通して、様々な刊行物が参照された。これらの刊行物の開示は、当
該技術常識をより完全に記載するために、本明細書中で参考として援用される。
【００６６】 本発明はこのように記載され、多くの様式で改変され得ることが自明である。
このような変動は、本発明の精神および範囲からの逸脱としてみなされるべきで
はなく、すべてのこのような改変物は、特許請求の範囲内に含まれると意図され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、レトロウイルスタンパク質を発現するヘルパー細胞を例示する図であ
る：（Ａ）ヘルパー細胞は、感染性ウイルス粒子を形成するに必要な全てのレト
ロウイルスタンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクションによって作
製される；（Ｂ）レトロウイルスベクターのトランスフェクション後、ベクター
ＲＮＡゲノムをコア構造へとキャプシド形成する；（Ｃ）プラスミドを含むヘル
パー細胞は改変されたエンベロープ遺伝子を発現する。
【図２】 図２は、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）の変異エンベロープ遺伝子を発現するプ
ラスミドを例示する図である。
【図３】 図３は、ハプテンＤＮＰに対する単鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ）の配列を示す。
【図４】 図４は、標的エンベロープおよび野生型エンベロープを発現するヘルパー細胞
を例示する図である。このようなヘルパー細胞は、対応するタンパク質を発現す
るプラスミドのトランスフェクションにより作製される：（Ａ）（１）レトロウ
イルスコアタンパク質、および（２）標的エンベロープ、を形成するに必要な全
てのレトロウイルスタンパク質を発現するヘルパー細胞；（Ｂ）標的エンベロー
プおよび野生型エンベロープを含むヘルパー細胞は、このようなタンパク質をコ
ードする遺伝子を発現するプラスミドをトランスフェクトすることによって作製
される。目的の遺伝子を有するレトロウイルスベクターのトランスフェクション
後、レトロウイルスベクターＲＮＡゲノムは、エンベロープを提示するレトロウ
イルスベクター粒子へとキャプシド形成される。
【図５】 図５は、真核生物遺伝子発現ベクター構築物の図である。この遺伝子発現ベク
ターは、Ｓｈｅａｙ，Ｗ．ら、１９９３によって記載されるのと類似のベクター
から誘導された。
【図６】 図６は、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）のコア構造タンパク質、野生型エンベロ
ープタンパク質、および様々な標的エンベロープタンパク質を発現するプラスミ
ドを例示する図である。
【図７】 図７は、標準の疎水性リーダー配列を含む抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ単鎖抗体遺伝子を
発現するｐＲＳＶ−ｓｃＦｖＮ２９−γの制限マップである。
【図８】 図８は、抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ単鎖抗体の配列を示す。
【図９】 図９は、ｐＴＣ５３の制限マップである。単鎖抗体遺伝子のＰＣＲ産物は、Ｎ
ａｅＩ部位にクローニングされ得、そして得られた構築物はキメラエンベロープ
を発現し、これは、ＥＲを通じて輸送され、そしてＳＮＶ由来レトロウイルスベ
クター粒子の表面に提示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 (Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA41 CA04 CA07 DA03 GA11 HA17 4B065 AA97 AB01 AC14 CA44 CA45 4C084 AA13 MA01 NA14 ZC802 4C087 AA01 AA02 BB65 BC83 MA01 NA14 ZC80 4H045 AA10 AA11 BA10 CA01 CA40 DA76 EA20

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択された抗原を有する細胞を感染させる方法であって、該
    方法は、以下： （ａ）エンベロープタンパク質を有するレトロウイルスベクターを産生する工
    程であって、ここでウイルスレセプター部分が、単鎖抗体によって少なくとも部
    分的に規定され、そして該ウイルスレセプター部分が該選択された抗原に結合す
    る、工程；および （ｂ）該ウイルス粒子またはその部分が該細胞にインターナライズされるよう
    に、該レトロウイルスベクターを、該細胞と接触させる工程、 を包含し、 ここで、該選択された抗原を有する細胞が、該レトロウイルスベクターによっ
    て感染される、方法。
  2. 【請求項２】 前記レトロウイルスベクターが、エンベロープタンパク質の
    部分および単鎖抗体の部分を含む単一の分子をコードするヌクレオチド配列を含
    むプラスミドを用いて産生される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が、脾臓壊死ウイルスのエンベロープ
    タンパク質の部分をコードする、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記プラスミドが、図２ｄにおいてｐＴＣ５として同定され
    るプラスミドである、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 選択された抗原を有する細胞を感染させる方法であって、該
    方法は、以下： （ａ）レトロウイルスベクターのエンベロープタンパク質に融合された標的ペ
    プチドを有する該レトロウイルスベクターを産生して、標的エンベロープを形成
    する工程；および （ｂ）該ウイルス粒子またはその部分が該細胞にインターナライズされるよう
    に、該レトロウイルスベクターを該細胞と接触させる工程； を包含し、 ここで、該選択された抗原を有する細胞が、該レトロウイルスベクターによっ
    て感染される、方法。
  6. 【請求項６】 前記標的ペプチドが、天然のウイルスレセプター結合部位を
    置換または破壊する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記標的ペプチドが、抗体の抗原結合部位である、請求項５
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記標的ペプチドが、別のウイルスのレセプター結合ペプチ
    ドである、請求項５に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記標的ペプチドが、標的の特異的レセプターに特異的に結
    合するペプチドである、請求項５に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記レトロウイルスベクター粒子が、脾臓壊死ウイルスで
    ある、請求項５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記標的ペプチドが、ハプテンジノトロフェノールに対する
    単鎖抗体（抗−ＤＮＰ−ｓｃＦｖ）である、請求項５に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記標的ペプチドが、標的細胞の細胞表面タンパク質に対
    して指向される抗原結合部位である、請求項５に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記レトロウイルスベクターが、標的エンベロープおよび
    野生型エンベロープを含む、請求項５に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 レトロウイルスベクターを使用して遺伝子を脊椎動物細胞
    に導入するための細胞型特異的方法であって、該方法は、該細胞に標的細胞特異
    性を有するレトロウイルスベクター粒子を投与する工程を包含し、該細胞は、該
    レトロウイルスのエンベロープタンパク質に融合された抗体の抗原結合部位を有
    するレトロウイルスベクターを含み、ここで該抗体の抗原結合部位は、天然のウ
    イルスレセプター結合部位を置換する、方法。
  15. 【請求項１５】 前記レトロウイルス粒子が、脾臓壊死ウイルスである、請
    求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記抗体が、ハプテンジニトロフェノールに対する単鎖抗
    体である、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記標的ペプチドが、標的細胞の細胞表面タンパク質に対
    して指向される抗原結合部位である、請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記標的ペプチドが、別のウイルスのレセプター結合ペプ
    チドである、請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記レトロウイルスベクターが、標的エンベロープおよび
    野生型エンベロープを含む、請求項１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記野生型エンベロープが、脾臓壊死ウイルスに由来する
    、請求項１９に記載の方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012521197A (ja) * 2009-03-20 2012-09-13 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
WO2018135598A1 (ja) * 2017-01-19 2018-07-26 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物
JP2022507454A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物
WO2025244108A1 (ja) * 2024-05-23 2025-11-27 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534051B1 (en) * 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
IT1290428B1 (it) * 1997-03-21 1998-12-03 Ausimont Spa Grassi fluorurati
EP1133523A1 (en) 1998-11-16 2001-09-19 Genway Biotech, Inc. Generation of antibodies using polynucleotide vaccination in avian species
US7348014B2 (en) 2000-04-14 2008-03-25 Transgene, S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
CA2341356C (en) * 2000-04-14 2011-10-11 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
EP1444989A1 (en) * 2003-02-07 2004-08-11 Giorgio Dr. Stassi Sensitizing cells for apoptosis by selectively blocking cytokines
DE10361167A1 (de) * 2003-12-22 2005-07-28 Brand Gmbh + Co Kg Verpackungsbox für Laborgegenstände
US20070020238A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-25 David Baltimore Method of targeted gene delivery using viral vectors
AU2007263265A1 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Apogenix Gmbh Differential IL-4 and/or IL-10 cytokine expression in human cancer
CA2656135A1 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Apogenix Gmbh Human il-4 muteins in cancer therapy
EP2526774A3 (en) 2006-07-21 2013-03-06 California Institute of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
EA032403B1 (ru) 2009-07-24 2019-05-31 Иммьюн Дизайн Корп. Лентивирусные векторы, псевдотипированные гликопротеином оболочки вируса синдбис
CN103339145A (zh) 2010-09-22 2013-10-02 安姆根有限公司 运载体免疫球蛋白及其用途
EP3480316B1 (en) 2012-03-30 2022-09-14 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc-sign
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
US9713635B2 (en) 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
WO2019030757A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Ctg Pharma Ltd. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR HER2 / NEU AND LYMPHOCYTES T THE EXPRESSANT
EP3820509A1 (en) 2018-07-09 2021-05-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions and uses thereof
WO2020102578A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery
US20210396703A1 (en) * 2020-06-17 2021-12-23 Northeastern University Rapid Electrochemical Point-of-Care COVID-19 Detection in Human Saliva

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6133029A (en) * 1988-03-21 2000-10-17 Chiron Corporation Replication defective viral vectors for infecting human cells
WO1990012087A1 (en) 1989-04-05 1990-10-18 Novacell Corporation Infectious targetted replication-defective virion
AU665176B2 (en) 1990-09-21 1995-12-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Packaging cells
JPH07500961A (ja) 1990-10-01 1995-02-02 ユニバーシティ オブ コネチカット 細胞による選択的内在化を目的としたウイルス及び細胞の標的設定
WO1993000103A1 (en) 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
ATE245703T1 (de) 1992-09-22 2003-08-15 Biofocus Discovery Ltd Rekombinante viren, die an ihrer äusseren oberfläche ein nichtvirales polypeptid präsentieren
US6534051B1 (en) * 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
EP0672129A4 (en) 1992-11-20 1997-06-11 Univ New Jersey Med CELL TYPE SPECIFIC GENE TRANSFER WITH THE HELP OF RETROVIRAL VECTORS WHICH ANTIBODY COVER HAVE FUSION PROTEINS.
US5869331A (en) * 1992-11-20 1999-02-09 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
EP0786010A1 (en) 1994-03-04 1997-07-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell-type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope and wild-type envelope-fusion proteins

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012521197A (ja) * 2009-03-20 2012-09-13 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
JP2015120706A (ja) * 2009-03-20 2015-07-02 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
JP2017163986A (ja) * 2009-03-20 2017-09-21 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
JP2018139609A (ja) * 2009-03-20 2018-09-13 アムジエン・インコーポレーテツド 担体免疫グロブリンおよびその使用
WO2018135598A1 (ja) * 2017-01-19 2018-07-26 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法
JPWO2018135598A1 (ja) * 2017-01-19 2019-12-12 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法
JP7178701B2 (ja) 2017-01-19 2022-11-28 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法
JP2022507453A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｔ細胞送達のためのフソソーム組成物
JP2022507454A (ja) * 2018-11-14 2022-01-18 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物
JP7676305B2 (ja) 2018-11-14 2025-05-14 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド Ｃｎｓ送達のためのフソソーム組成物
WO2025244108A1 (ja) * 2024-05-23 2025-11-27 国立大学法人 東京大学 新規蛍光標識方法

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