JP2002522055A

JP2002522055A - バクテリア性超抗原ワクチン

Info

Publication number: JP2002522055A
Application number: JP2000564656A
Authority: JP
Inventors: ロバート，ジーウルリッチ，; マーク，エーオルソン，; シナババリ，
Original assignee: ウォルターリードアーミーインスティテュートオブリサーチ
Priority date: 1998-08-13
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2002-07-23
Also published as: MXPA01001631A; AU8904998A; EP1105154A1; EP1105154B1; AU762813B2; CA2338184A1; WO2000009154A1; EP1105154A4

Abstract

(57)【要約】本発明は超抗原特性がないが、超抗原が有効に認識され、適切な免疫応答がつくり出されるように変性された遺伝子操作によって減衰された超抗原毒性ワクチンに関連している。この減衰された超抗原毒素は野生タイプ毒素による刺激から動物を護ることが示されている。この変性された超抗原毒素の生産及び使用方法について開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ブドウ球菌エントロトキシン（ES）Ａ−Eは食物中毒の最も共通な原因であり
［Bergdoll, M.S.(1983) In Case CSF, Aslam C. , eds. Staphylococci and st
aphylococal infections. London. Academic Press, pp559-598］、バクテリア
性関節炎［Schwab et al. (1993) J. Immunol. 150; 4151-4159; Goldenberg et
al. (1985) N. Engl. J. Med. 312:764-771］、自己免疫不全［Psnett, D. N.
(1993) Semin. Immunol. 5:65-72］、及び毒性ショック症候群[Schlieverst, P.
M. (1986) Lancet 1: 1149-1150; Bohach et al. (1990) Crit. Rev. Microbio
l. 17: 251-272] などのその他のいくつかの重要な疾病とも関係している［Schilievert, P. M. (
1993) J. Infect. Dis. 167: 997-1002; Ulrich et al. (1995) Trends Microbi
ol. 3: 463-468］。非エンテロトキシン性ブドウ球菌超抗原毒性ショック症候群
毒素−1（TSST−1）は月経関連毒性ショック症候群の病原性因子として最初に確
認された［Schlievert et al., (1981) J. Infect. Dis. 143: 509-516］。超抗
原をつくりだす黄色ブドウ球菌系統も子どもの炎症性疾患である川崎症候群と関
係している［Leung et al. (1993) Lancet 342: 1385-1388］。

【０００２】ブドウ球菌エントロトキシンA−E、毒性ショック症候群毒素−1（TSST−1）、
及び化膿レンサ球菌外毒素A−Cは普通バクテリア性超抗原（SAG）と呼ばれる可
溶性の23−29KD蛋白質である。バクテリア性超抗原は抗原提示細胞上に発言され
る主な組織適合性複合体（MHC）クラスII分子とT細胞抗原受容体β鎖（TCR Vβ
）の可変部分の両方に対するリガンドである[Choi et al. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 8941- 8945; Fraser, J. D. (1989) Nature 339: 221-22
3; Narrack et al. (1990) Science 248: 705-711; Herman et al. (1991) Annu
. Rev. Immunol. 9: 745-772; Mollick et al., (1989) Science 244: 817-820
]。

【０００３】各バクテリア性超抗原は1組のTCR Vβに対する明確な親和性を有しており、
MHCクラスII分子はポリクローナル的にT細胞を刺激する[White et al. (1989) C
ell 56: 27-85; Kappler et al. (1989) Science 244: 811- 813; Takimoto et
al. (1990) Fur J. Immunol. 140: 617-621]。活性化されたT細胞によってつく
りだされる病理学的の高められたレベルのサイトカインは毒性ショック症候群の
蓋然的な原因である［Calson et al. (1985) Cell. Immunol. 96: 175-183; Sti
les et al. (1993) Cell. Immunol. 96: 175-183; Stiles et al. (1993) Inf
ect. Immun. 61: 5333-5338］。加えて、致死性のグラム陰性外毒素ショックは
いくつかのバクテリア性超抗原によって増強される［Stiles, et al., supra］
。超抗原に反応性を示す抗体はヒト血清内に低いレベルで存在しており［Takei
et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 602-607］、特殊な免疫化によって抗体の
力価を向上させると毒性ショック症候群や一般の病因によるその他の不全の危険
を有する患者に対して有効である可能性がある。

【０００４】バクテリア性超抗原関連疾患を制御するためのワクチン方式は一連の独特な課
題を提出する。バクテリア性超抗原に対して急に露出させるとT細胞アレルギー
、つまり特殊な非反応性状態がつくりだされるが［Kawabe et al. (1991) Natur
e 349: 245-246］、それでもT細胞を助けることは抗体反応を起こすための必要
条件であると考えられる。現段階で、利用可能な唯一の超抗原ワクチンは種々のバクテリアから得られる
化学的に非活性化されたトキソイドであるが、これらはいくつかの欠陥を有して
いる。化学的非活性化プロセスは各生産ロットで使うことができるので、生成物
の特徴づけが難しくなる。非活性化のために用いられる化学物質（例えば、ホル
ムアルデヒド）は多くの場合毒性を示し、非活性化された超抗原が活性形態に逆
転させてしまう可能性も否定できない。加えて、トキソイドをつくるために用い
られるバクテリア系統からの野生種毒素の収率も多くの場合低くなってしまう。

【０００５】（発明の分野）本発明は上に述べたような化学的に非活性化されたトキソイドの欠陥を克服す
るワクチンに関係している。本発明による超抗原ワクチンは１つの、あるいはい
くつかのブドウ球菌及びレンサ球菌毒素への露出から起きる病態に対して個人を
保護するように工夫されている。超抗原ワクチンは超抗原属性がなくなるが、超
抗原は免疫系によって有効に認識され、そして適切な抗体反応がつくりだされる
ようにDNA操作方法で遺伝子的に減衰された精製された蛋白質生成物により構成
されている。

【０００６】具体的には、本発明によるワクチンはMHCクラスII受容体とT細胞抗原受容体の
両方に対する結合の破壊につながる超抗原毒素のDNAコード配列のサイト指向突
然変異誘発の生成物である。TSST−1、化膿レンサ球菌外毒素−A（SPFａ）、ブ
ドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）、及びブドウ球菌エンテロトキシンAの超抗
原構造の受容体結合に対する関連性についての広範な研究が行われ、ワクチンの
設計に対する示唆が提供されている。これらの研究から、超抗原のヒトMHC受容
体に対する抗原に関与する毒素の重要なアミノ酸残基がつきとめられた。その毒
素をコードする遺伝子のサイト指向突然変異誘発と新しい蛋白質生成物の発現は
MHC受容体に対する結合が破壊されている超抗原毒素をもたらした。

【０００７】従って、本発明の目的は、コードされ変性された毒素のMHCクラスIIまたはＴ
細胞抗原受容体に対する結合が破壊されるように遺伝子的に変性された超抗原毒
素DNAフラグメントを提供することである。こうしたDNAフラグメントは超抗原毒
素感染に対するワクチンの生産において有益である。

【０００８】本発明の別の目的は、コードされ変性された毒素のMHCクラスIIまたはT細胞抗
原受容体に対する結合が破壊されるように変性された超抗原毒素アミノ酸配列を
提供することである。こうした配列は超抗原毒素ワクチンの生産のために有益で
ある。

【０００９】本発明のさらに別の目的は、ベクターと上に述べたDNAフラグメントで構成さ
れる遺伝子組換えベクターを提供することである。

【００１０】本発明のさらに別の目的は、上に述べた遺伝子組換えDNA構成物で形質転換さ
れたホスト細胞を提供することである。ホスト細胞はイースト菌、真菌類、直物
培養体、哺乳動物及び非哺乳動物細胞株、昆虫の細胞、そして遺伝子操作植物や
動物などを含め他の原核性種あるいは真核性植物あるいは動物種などを含んでい
る。

【００１１】本発明のさらに別の目的は、ベクターと上に述べたDNAフラグメントで構成さ
れる遺伝子組換えベクターが発現され、変性された超抗原毒素がそれによってつ
くりだされるような条件下でホスト細胞を培養するステップと、超抗原毒素関連
バクテリア性感染に対するワクチンとして、そして診断用試薬として使用するた
めの超抗原毒素を単離するステップで構成されるMHCクラスII及びT細胞抗原受容
体結合が破壊された変性超抗原毒素をつくるための方法を提供することである。

【００１２】本発明におけるさらに別の目的は、ワクチン及び診断用試薬として有益な精製
された変性超抗原毒素を提供することである。

【００１３】本発明のさらに別の目的は、選択性T細胞サブセットの治療目的のための刺激
あるいはその他のin vivo操作のための、あるいは、哺乳動物におけるin vivo
治療目的のためのT細胞のex vivo操作のための精製された変性超抗原毒素を提
供することである。自己免疫性などの疾患においては、一定程度の多様性（オリ
ゴクローナル）T細胞作用が明らかになっている。変性された超抗原は、例えば
自己免疫病などオリゴクローナルT細胞反応が明らかな疾病にいてT細胞を臨床的
に非活性化させるため（あるいはT細胞内にアレルギーを誘発するため）に用い
ることができる。特定のT細胞サブセットが活性でなく、あるいはアレルギー性
である疾病においては、変性された超抗原はこれらのT細胞を臨床的に刺激する
ために用いることができる。そうした病気には、例えば、細胞毒性あるいはヘル
パーT細胞が非活性化され、あるいは何らかの理由でそうした病気部分の抗原性
刺激に対して正常に反応できなくなっている感染症及び癌などである。

【００１４】本発明のさらに別の目的は、治療薬及び診断用試薬として使用するための上に
述べた変性超抗原毒素に対する抗体を提供することである。

【００１５】本発明のさらに別の目的は、抗原性及び免疫原性反応をつくりだして超抗原毒
素感染から動物を護るために有効な変性超抗原毒素で構成される超抗原毒素ワク
チンを提供することである。

【００１６】本発明のさらに別の目的は、抗原性及び免疫原性反応をつくりだしてバクテリ
ア性超抗原度発現系統及び消化、吸入、注射、皮膚経由あるいはその他の手段で
起きる可能性があるバクテリア性超抗原毒性に対するその他の直接、関節の露出
に対する感染から動物を護る上で有効な種々のブドウ球菌及びレンサ球菌毒から
の変性毒素で構成された多価超抗原毒素ワクチンを提供することである。

【００１７】本発明のさらに別の目的は、（ｉ）超抗原毒素関連バクテリア性感染症にかかっていると疑われる個人から
得たサンプルを上記変性された超抗原毒素から発生された抗体を用いて超抗原毒
素を認識する抗体と接触させるステップと、（ｉｉ）前記サンプル内の超抗原毒素とそれに固有性を示す抗体との間で形成
される複合体の存在あるいは不存在を検出することで超抗原関連バクテリア性感
染症の存在、不存在を検出するステップで構成される超抗原毒素関連バクテリア性感染症を診断するための方法を提供す
ることである。

【００１８】本発明のさらに別の目的は、（ｉ）そうした病気にかかっていると疑われる個人からのサンプルを変性超抗原
毒素を認識する前記超抗原バクテリアあるいはリンパ球によってつくりだされる
超抗原毒素を識別するリンパ球と接触させるステップと、（ｉｉ）超抗原毒素の認識によってもたらされるリンパ球応答の存在、不存在を
検出するステップとでこうせいされる超抗原バクテリア性感染症の診断のための方法を提供するこ
とである。反応は、例えば、測定されるレベルのサイトカイン放出、活性化マー
カー、分裂活性、あるいは細胞溶解の増大などである。上記変性された超抗原毒
素からに応答するリンパ球はそれらを超抗原としてではなく、欠陥抗原として認
識し、従って、その応答はその特定の超抗原に対する以前の露出を示唆するもの
である。反応の不在は以前の露出がなかったこと、欠陥のある免疫反応、あるい
はT細胞アネルギーの発現のいずれかを示唆している可能性がある。アネルギー
とはここではT細胞のサブセットの抗原特有または一般的な非反応性を意味して
いる。

【００１９】本発明のさらに別の目的は、動物組織あるいは血清内の超抗原毒素の存在検出
において用いるのに適した変性超抗原毒素に対する抗体と補助的な試薬で構成さ
れる診断用キットを提供することである。

【００２０】本発明のさらに別の目的は、サンプル中の超抗原毒素あるいは超抗原毒素に対
する抗体を掲出するための方法を提供することであり、この方法はバイオセンサ
ー方式を用いるステップを含んでいる。こうした方法は先行技術でも知られてお
り、例えば、Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240 and
Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11, 620-627に述べられている。

【００２１】本発明のさらに別の目的は、超抗原関連バクテリア性感染症の症状を治療ある
いは改善するための治療方法を提供することであり、この方法はそうした治療を
必要としている個人に対して、種々のバクテリアからの１つまたは複数の変性超
抗原毒素で免疫された個人からの血清を薬学的に受け入れ可能な賦形剤内に入れ
た状態で有効量投与するステップを含んでいる。

【００２２】本発明のさらに別の目的は、超抗原関連バクテリア性感染症の症状を治療また
は改善するための治療方法を提供することであり、この方法はそうした治療を必
要とする個人に対して、変性超抗原毒素に対する抗体を薬学的に受け入れ可能な
賦形剤に入れた状態で有効量投与するステップを含んでいる。

【００２３】本発明のさらに別の目的は、バクテリア性感染症を治療または改善するための
治療方法を提供することであり、この方法は、こうした治療を必要とする個人に
これらの感染症の競合的抑止によって超抗原バクテリア性毒素のMHCクラスIIま
たはT細胞に対する接着を抑止するために種々のブドウ球菌及びレンサ球菌から
得た変性超抗原を結う香料投与するステップを含んでいる。

【００２４】本発明のさらに別の目的は、超抗原毒素と直接には関係していないかもしれな
いが、T細胞サブセットの特有の非反応性化をもたらす疾病を治療するための治
療方法を提供することであり、この方法はT細胞サブセットが拡大あるいは刺激
されるようにin vivoあるいはex vivoで変性超抗原毒素を投与するステップを
含んでいる。T細胞のアネルギーまたは非応答性を引き起こす疾病としては、例
えば感染性疾病がある。

【００２５】本発明の別の目的は、例えば自己免疫など、拡張された、あるいは過剰に刺激
されたT細胞サブセットに関連した疾病を治療するための治療方法を提供するこ
とであり、前記方法は病気に関連したT細胞のアネルギーまたは非活性化がつく
りだされるように変性された超抗原毒素をin vivoまたはex vivoで投与するス
テップを含んでいる。この場合、超抗原突然変異体は変性されているがT細胞受
容体結合は低下されないように良性化して、病理的に活性化されたT細胞（例え
ば1−3）だけのアネルギーを起こさせるようにすることができる。

【００２６】本発明は一部では超抗原毒素関連バクテリア性疾患に対するワクチンに関連し
ている。本研究で用いられる超抗原ワクチンは抗原性を保持しつつ受容体結合親
和性及び毒性を低下させるように超抗原毒素の受容体結合部分を変えるように操
作することによって開発された。

【００２７】この応用例では５つの異なった超抗原ワクチン、つまり、ブドウ球菌塩エンテ
ロトキシンA、ブドウ球菌エンテロトキシンB、ブドウ球菌エンテロトキシンC1、
毒性ショック症候群毒素−1、及び化膿レンサ球菌外毒素−Aについて述べる。上
の超抗原毒素のそれぞれに関して、ワクチン設計の手がかりを得るために、毒素
蛋白質構造と受容体結合との関連性についての広範な研究が行われた。この研究
は毒素及び受容体分子のサイト指向突然変異誘発、分子モデル化、蛋白質構造、
そして結合に関する調査が行われた。これらの研究に続いて、MHCクラスII結合
と生物学的活性を基本的特別でないレベルまで低下させるためにサイト指向突然
変異誘発を行うことによって変性された。操作されたワクチンは分析のそれぞれ
の段階で評価して、in vitroでのマウス及びヒトT細胞、血清反応、及びマウス
とサルにおける毒性についての判定を行った。

【００２８】１つの実施の形態で、本発明はその毒素のMHCクラスII受容体の結合が破壊さ
れるように変性されたアミノ酸配列を有する変性超抗原毒素蛋白質に関係してい
る。

【００２９】アミノ酸配列を比較したところ（図１）、バクテリア性超抗原は（１）SEA、S
ED、及びSEE、（２）SEB、ブドウ球菌エンテロトキシンC1−C3（SEC1−3）、化
膿レンサ球菌外毒素A（SPE−A）及びC（SPE-C）、（３）TSST−1及び（4）配列
においては他のものからは最も遠い擦過細胞毒素（ETA、ETA）と化膿レンサ球菌
外毒素B（SPE−B）で構成されるグループに分かれることが示唆された。本発明
について最初に思いつき、原理の証明が得られた段階では入手できなかったが、
いくつかのバクテリア性超抗原のX線結晶学的構造は現在では分かっている。SEB
及びTSST−1などの多様な超抗原は配列においてはほとんど共通性を有している
ようには思われないが、それでも、それらは２つの異なったストランド内でほと
んどβストランドで構成される相同性蛋白質フォールドを示す［Prasad, G.S. e
t al. (1994) Biochemistry 32, 13761- 13766; Acharya, R. K. et al. (1994
) Nature 367, 94-97; Swaminathan, S et al., (1992) Nature 359, 801- 806
］。これらの蛋白質間の違いは主としてTSST−1には存在しないジスルフィド結
合ループなどのいくつかの表面ループで構成される高度に可変性のある領域とア
ミノ末端である。

【００３０】 HLA DR1と複合化されたSEB及びTSST−1のX線結晶構造が知られている［Kim,
J. et al. (1994) Science 266, 1870-1874; Jardetzky, T. S. et al. 81994］
Nature 368, 711-718]。SEBに接触するHLA DR1の領域はαサブユニット表面だ
けで構成されている。関連するSEBの主な領域は２つの保存サイト、つまり、β
バレル領域の３つのβストランドから誘導された極性ポケットと高度に溶剤露出
された疎水性逆ターンである。SEBの極性結合ポケットはグルタメートとHLA DR
1のαサブユニットのLys39を収容する２つのチロシンをふくんでおり、上記疎水
性領域はロイシンとHLA DRα鎖とのいくつかの接触部分を含む側鎖残基で構成
されている。TSST−1とSEB両方のHLA DR1結合サイトはかなり重複している。他
のSAｇのHLA DRα鎖との疎水性結合接触［Ulrich, et al. (1995). Nature, St
ruct. Biol 2, 554-560］はSEB及びTSST−1内で見出されるものと同様だといわ
れている。逆ターン内のロイシンで構成されるモチーフ［Ulrich et al. (1995
), supra］はバクテリア性超抗原間に保存されており、結合HLA−DRに関する（
疎水性またはその他の）最も重要な決定因子を提供してくれる可能性がある。し
かしながら、TSST−1はHLA DRα鎖のLys39と相互作用し、TSST−1がHLA DR1
β−鎖残基及び抗原性ペプチドのカルボキシル末端領域と相互作用できるように
する高い電荷の残基を有しておらず、別の構造的結合モードを用いる。

【００３１】 SEAとSEBの両方とも単一亜鉛原子によってDRのβサブユニットに結合する［Fr
aser, J. D. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5507-5511］。
SEAのアミノ末端領域はHLA DRαとの間のインターフェースとしての役割を果た
し［Ultrich, et al. (1995)］、一方、SEA C−末端領域残基 His187、His225
及びAsp227は亜鉛配位複合体を形成し、そしてHis−81と共に隣接HLA DR分子の
β鎖を形成する。しかしながら、我々が行った実験の結果は、超抗原のHLA DR
βに対する結合はT細胞を直接には刺激しない［Ulrich et al. (1995) Nature,
Struct. Biol. 2, 554-560］が、別のHLA DRのα鎖と相互作用する結合SEAの
ポテンシャルを増大し、それによって生物学的活性を増強させる。

【００３２】モデル化されたSEAの未結合分子の最小二乗重ね合わせと、その構造的に保存
されたアルファ−らせん及びβ−ストランド領域に従って位置的に整合されたSE
Bの結晶構造は非常に類似したグローバル・フォールディング・パターンを示し
た。これら２つの構造の間の違いは低配列相同性のループ内に配置され、最大の
位置的な偏差は残基18−20、30−32、173−181、191−194の構造的に保存された
領域とシスチン−ループ領域（90−111）との間に起きると計算されている。SEB
内のこれらの領域の１つだけがHLA−DR1分子との重要な接触（特に残基Y94［Ｙ
＝チロシン］を形成する［Jardatzky, T. S. et al., (1994) Nature 368, 711
-718］。

【００３３】 SEBとHLA−DR1との間の結合インターフェースは主に２つのN末端領域に存在す
る構造的に保存された表面、βバレル領域のβストランド要素から誘導された極
性結合ポケットと疎水性逆ターンで構成されている。このSEBの結合ポケットは
残基E67（E＝グルタミン酸）、Y89（Y＝チロシン）、及びY115（Y＝チロシン）
を含んでおり、DRαサブユニットのK39（K＝リシン）と結合する。アミノ酸の１文字コードは以下のように定義されている。A＝アラニン（Ala）、
I＝イソロイシン（Ile）、L＝ロイシン（Leu）、M＝メチオニン（Met）、F＝フ
ェニルアラニン（Phe）、P＝プロリン（Pro）、W＝トリプトファン（Trp）、Ｖ
＝ヴァリン（Val）、N＝アスパラギン（Asn）、Ｃ＝シスチン（Cys）、Q＝グル
タミン（Q）、G=グリシン（Gly）、S=セリン（Ser）、T＝トレオニン（Thr）、Y
＝チロシン（Tyr）、R＝アルギニン（Arg）、H＝ヒスチジン（His）、K＝リシン
（Lys）、 D=アスパルチン酸（Asp）、そしてE＝グルタミン酸（Glu）。SEAの場合、DR分子
との結合インターフェースは残基D70、Y92、及びY108で構成される同様の結合ポ
ケットを含むように結合された。SEBにおける残基Y89及びSEAにおける残基Y92の
アラニンへの突然変異（図２）はDR1結合より100分の１以下に減少した。SEBに
おけるY89及びSEAにおけるY92のアラニンによる置換はK39との水素結合をなくし
、隣接蛋白質残基とのパッキング作用を破壊する。SEA突然変異体Y92Aのモデル
化は野生タイプの構造より２倍以上Y108に対する溶媒アクセス可能表面積を増大
させ、それによってD70のカルボキシレート基に対する水素結合の形成を可能に
して、従ってHLA DR1に対するキー・アンカリング及び認識ポイントを破壊して
しまう。この影響はE67での側鎖がより長いのでSEBでは多少小さいと予想される
。SEB Y115のアラニンによる置換は結合頻度を100分の１以下に減少させるとい
う結果ももたらす。対照的に、SEAにおけるY108の同様の置換はDR1結合には何の
変化ももたらさない（図２ａ）が、このことはK39との相互作用安定化の上でのS
EA残基Y92及びD70の基本的な重要性を示唆している。DRαのK39側鎖はSEB E67
カルボキシレート基との強力なイオン−ペア相互作用、及びY89及びY115のヒド
ロキシル基の水素結合を形成する。グルタミンによるSEB E67の置換は結合親和
性を100分の１以下に減少させた（図２）が、これは弱い水素結合による強力な
イオン結合の置換を反映している。類似のSEAさいとのイオン対相互作用を最適
化するためには、D70のより短いカルボキシレート側鎖がDRαのK39をシフトさせ
て、SEA Y108おの相互作用を弱めるものと予想される。アラニンによるSEA Y1
08の置換は従ってSEB Y115の相同的置換の場合よりずっと対応しやすく、DR1結
合の喪失も起こらない。

【００３４】その後、その極性ポケットと他のバクテリア性超抗原との比較を行った。SEC1
−3及びSPE−Aは重要なDR1結合−インターフェース残基（図1）を保存しており
、SEB及びSEAとの間でDR1−結合構造の二次的な構造要素を共有している。SED（
N70）のアスパアラギンはSEA、SEB、SPE−A及びSEC1−3に存在する賛成側鎖と置
換する。従って、SEDの場合、その極性ポケットの塩ブリッジは水素結合によっ
て置換される可能性がある。全体として、SED及びSEAに対するDR1親和性はほぼ
同等であるように思われ（図２ｂ）、このことは他の超抗原で観察されるイオン
対のSEDの不在を他の相互作用が補っているのではないかということを示唆して
いる。TSST−1の場合、DRα残基K39のセリンまたはM36のイソロイシンに対する
突然変異は結合を大幅に減少させることが示されている［Pania-Bordignon et a
l., (1992) J. Exp. Med. 176: 1779-1784］。基本的には疎水性であるが、重
要なTSST-1構造要素はSEA、SEB極性結合ポケットと共に保存されている。SEB残
基Y89及びY115はTSST-1内のT69及びI85とそれぞれ相同であり、SEB E67はI46に
より置換される。これらのTSST−1残基はSEB及びSEAの両方で見出される保存さ
れたβバレル領域内に位置している。しかしながら、このTSST−1歳とはSEB／SE
Aに相当する極性をもっておらず、TSST−1残基T69との水素結合にはDRαK39がそ
のポケット内に５オングストローム延びていることを必要とするであろう。TSST
−1結合は残基I46週へ塩の疎水性接触部分、及びDRα残基E71とK67をTSST−1のR
34及びD27にそれぞれ結合させる強力なイオン性あるいは水素結合で構成される
別の基本的な方式を用いる［Kim et al. (1994) Science 266: 1870- 1874］。

【００３５】 SEBとHLA−DR1分子間の結合インターフェースの疎水性領域はSEBのβストラン
ド1及び２を接続している大きな逆方向ターン内に位置しているSEB残基44−47で
構成されている。これらの残基はそのバックボーン原子を通じてDRαとの間に強
力な静電作用を行うようである。L45のアルギニンへの突然変異はHLA−DR1結合
を100分の１以下に減少させ、これはDR1分子上の疎水性凹部内への高荷電残基が
エネルギー的に好ましくない状態で挿入されることに原因が求められる。モデル
されたDR1−SEA複合体はグルタミン（Q49）がSEB Y46を置換することを除けば
、SEAバックボーン原子と同様に相互作用を示す。SEAにおけるL48のグリシンへ
の突然変異（SEBのＬ45と相同）はT細胞反応を減少させると報告されている。SE
B L45及びそれと同様のTSST−1のL30はDR1インターフェース内に最も後半に埋
め込まれている残基である。ロイシンはバクテリア性超抗原の間に保存されてお
り（図３）、そして、DR1との表面相補性のために必要な疎水性表面要素を提供
してくれ、このことはSEB及びSEAに関する突然変異発現データとの一貫性を示し
ている。

【００３６】本発明者はTSST−1、SEC1、及びSPE−Aを用いて同様の構造及び機能研究を行
った。

【００３７】 DR1に対する超抗原の全体的な親和性について調べる上で、共通結合モチーフ
周辺の構造的偏差が大きな役割を果たす。短い、可変的に構造化された、ジスル
フィド結合ループがSEAで観察され、SEBでは相同的で、より長めのループが観察
されている。このループ内に含まれているSEB残基Y94はDRαサブユニットのL60
及びA61と疎水性の相互作用を形成する。Y94をアラニンで置換するとDR1結合が
部分的に抑制される（図２ａ，ｂ）。アラニンはSEA（A97）とSEEでもSEB Y94
に相当する位置で見出され、SEA内でこの残基をチロシンに突然変異すると、DR1
との相互作用が安定せず、かえって破壊される（図２ａ）。ジスルフィド・ループはSEAとSEBとの間でその構造に違いがあるが、A97はSEBの
Y94と同様の方法でDRα結合インターフェースに貢献しているように見える。TSS
T−1はジスルフィド・ループを欠いているので、DRαとの同様に接触部分はTSST
−1のβ−ストランドによって置換される。同様に、DRαのK39残基とSEDのN65の
間に塩ブリッジが存在しないことはそうでなれけば保存されている主要な結合表
面の外側で起きる相互作用を安定化させることで補償されているように見える（
図２ａ）。

【００３８】 TCRと接触しているアミノ酸残基は配列の可変性が高い領域に存在しており、T
CRと反応するための独特な表面を形成している。SEAとSEBの突然変異誘発によっ
てTCR作用内につくられた残基は可変ループ領域に残るが、TCR結合に影響を及ぼ
すTSST-1突然変異体は主にαらせん部分に位置している［Achara, R. K. et al.
(1994) Nature 367, 94-97; Kim, J. et al. (1994)］ Science 266, 1870 -
1874]。特に、SEBのT細胞受容体認識を低下させる突然変異体は残基N23、Y61、
及び相同性SEA N25またはY64を含んでいる（図２ｃ）。SEA残基S206及びN207も
T細胞反応を制御する［Hudson, et al. (1992) J. Exp. Med. 177: 175-184］
。極性結合ポケット、SEA Y92Ａ及びSEB Y８９Aはそれぞれ同様にT細胞反応を
減少させた（図２ｃ）が、これはDR1−結合内で観察された現象を反映している
（図２ａ、ｂ）。低下したT細胞反応をサポートしつつ、突然変異体SEA Y64A及
びSEB Y61AはDR1に対する正常な親和性を保持していた（図２ａ−ｃ）。

【００３９】本発明の詳細な説明、上に述べたブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原毒素の分子
モデル化と構造研究の結果を考慮に入れれば、超抗原毒素から誘導されたいずれ
もアミノ酸配列も変性させることができる。いくつかの超抗原毒素の配列はすで
に分かっており、例えば、Genbankなどの配列データベースで一般に公開されて
いる。超抗原毒素配列は好ましくはその超抗原に応じて、疎水性ループあるいは
極性結合ポケットで編成される。また、その疎水性ループあるいは極性ポケット
の構造を間接的に変えることができるサイトで、この疎水性ループあるいは極性
結合ポケットに隣接した残基を変えることもできる。変えることができる残基の
数は変更可能で、好ましくは１か２、より好ましくは２から３、最も好ましくは
３から４、あるいはそれ以上で、コンピュータ的な方法でそうした突然変異を導
入した結果を分析する能力だけがその限界である。変えることができる残基は（
SEBのL45などの）疎水性ループの中心ロイシンの５つのアミノ酸残基内、あるい
は（SEBのE67、Y89、あるいはY115など）HLA−DRと接触することができる極性結
合ポケットの１つのアミノ酸残基の１つの５つの残基内、より好ましくは、（SE
BのL45などの）疎水性ループの中心ロイシンの３つのアミノ酸残基、あるいは（
SEBのE67、Y89、あるいはY115などの）HLA−DRに接触することができる極性ポケ
ットのアミノ酸残基の１つの３つの残基内、そして最も好ましくは（SEBのL45な
ど）上記疎水性ループの中心ロイシン、あるいは（SEBのE67、Y89、あるいはY11
5）などのHLA−DRと接触することができる極性結合ポケットのアミノ酸残基の１
であってよい。これらの残基は蛋白質構造の最小限の破壊のためにアラニンに変
更あるいは置換させることができ、より好ましくは疎水性から親水性、あるいは
酸性から中性のアミドなど、反対の化学的性質を持つ残基へ、最も好ましくはア
ルギニンあるいはリシンなどの大型の含水側鎖を有する残基の導入によって変更
、あるいは置換することができる。加えて、低結合親和性を有する超抗原毒素を
設計する場合には、ある種の非保存受容体−結合表面の側鎖も変えることができ
る。これらの残基はSEBのY94、及びSEAのA97などの他の超抗原の構造的に同等な
残基、あるいはこれらの位置から５つの残基内のいずれかの側鎖、あるいは、上
記極性結合ポケットあるいは疎水性ループの外側の非保存受容体接触表面と直接
あるいは間接的に関係しているジスルフィド結合側鎖などの非連続的位置（この
非連続的位置とはまとまって１つの３次元的構造単位の一部を形成するが、同じ
二次的構造単位、例えばαらせんあるいはβ−ストランド上には存在していない
アミノ酸残基と定義される）にあるいずれかの側鎖などを含んでいてもよい。さ
らに、低結合親和性を有する超抗原毒素を設計する際、蛋白質フォールディング
あるいはパッキングに関与するアミノ酸残基を変えることもできる［Sundstrom
et al. (1996) EMBO J. 15, 6832-6840; Sundstrom et al. (1996) J. Biol.
Chem. 271, 32212-32216; Acharya et al. (1994) Nature 367, 94-97; Pras
ad et al. (1993) Biochem. 32, 13761- 13766; Swaminathan et al. (1992)
Nature 359, 801-806］。さらに、特にT細胞抗原受容体に対するより高い親和
性を有する超抗原の場合、低結合親和性の超抗原毒素を設計する際に、N23で示
される位置の５つの残基内のアミノ酸の側鎖（ほとんどの超抗原の保存残基）、
N60（ほとんどの超抗原の保存されたAsnまたはTrp）、Y91（ほとんどの超抗原内
の準保存疎水性残基Trp、Ile、Val、His）及びSEBのD210（ほとんどの超抗原の
保存Asp）を変えることができる。これらの残基はT細胞抗原受容体と接触している一体化分子表面の一部を形成す
る可能性がある。超抗原毒素のT細胞受容体接触エリアはT細胞サブセットの特殊
な活性化あるいは非活性化を引き起こすのに基本的に必要であるので、各超抗原
に固有であるが、N23、N60、及びY91によって示される位置の５つの残基内に位
置している残基を変えることでより少数（例えば1−3）のサブセットに影響を及
ぼす超抗原をつくりだすことができる。そうした編制超抗原毒素は治療剤として
有益である可能性がある。

【００４０】別の実施の形態で、本発明は、MHCクラスII及び／またはT細胞受容体に対する
変性結合能力を有する毒素蛋白質をつくりだすために、その配列が上に述べたよ
うに変性されたSEA、SEB、SEC−1，SPEａ、及びTSST−1などの超抗原をコードす
るDNAまたはDNAセグメントに関連している。SEAの場合、毒素分子に対して以下
の３つの突然変異、つまり、アミノ酸位置92のチロシンのアラニンへの変更、ア
ミノ酸位置70のアスパルチン酸のアルギニンへの変更、そしてアミノ酸位置48の
ロイシンのアルギニンへの変更を導入する。HLA DRに対する結合の減少はそれ
ぞれの突然変異に追加的に付随して起きる現象であるが、１つまたは２つの突然
変異がワクチンをつくりだしたり、１つの分子内で３つの突然変異すべてを組み
合わせるとよりよいワクチンがつくりだされる場合もある。他の置換で結合の減
少がもたらされる場合もある。

【００４１】 B899445は上記毒素分子内に以下の３つの突然変異、つまり、アミノ酸位置89
のチロシンのアラニンへの変更、アミノ酸位置94のチロシンのアラニンへの変更
、そしてアミノ酸位置45のロイシンのアルギニンへの変更を含んでいる。変成さ
れた超抗原毒素は全長プロポリペプチド、あるいはリーダー・ペプチドが欠失さ
れたポリペプチドとして発現させることができる。全長で発現された生成物（SE
Aワクチン、A489270p；SEBワクチンB899445p、Ｂ236210p）は大腸菌ホスト細胞
の原形質スペース内に分泌され、リーダー・ペプチドが天然のバクテリア性酵素
メカニズムによって認識され、切断される。リーダー・ペプチドが欠失された変
性超抗原毒素（A489270C、B899445C）においては、成熟した蛋白質の第1の残基
は転写開始サイト及びメチオニン（ATG）に対するコドンでコードされ、蛋白質
はホスト大腸菌細胞内で非分泌生成物として発現される。TSST−1ワクチンTST30
の場合、位置30でのロイシンはアルギニンに変えられた。SEC1ワクチン、SEC45
の場合、位置45のロイシンはアルギニンに変更された。 SPE−AワクチンであるSPEA42の場合、位置42のロイシンはアルギニンに変えられ
た。

【００４２】別の実施の形態で、本発明は上に述べたようにベクターとDNA配列を含む遺伝
子組換えDNA分子に関係している。このベクターは、例えば、pUC18／19、pSE380
、pHIL、pET21／24、及び先行技術で知られているその他のいずれかの広範なホ
スト範囲発現ベクターなどのプラスミドの形態をとることができる。DNA配列は
発現システム内に存在している場合にその遺伝子が発現され、変性超抗原毒素が
つくられるようにプロモータに機能的に結合されている。この発現システムはin
vitro発現システムあるいは原核細胞などのホスト細胞、あるいはDNAワクチン
などのin vivo発現システムなどであってよい。

【００４３】別の実施の形態で、本発明は安定的あるいは一時的に形質転換され、あるいは
上に述べた遺伝子組換えDNA構成物にトランスフェクトされたホスト細胞に関連
している。このホストは大腸菌DHαまたはBL21などのいずれかの真核あるいは原
核細胞であってよい。変性された超抗原毒素遺伝子を含むベクターは上記ホスト
細胞内で発現され、その変性毒素遺伝子の生成物は分泌された成熟した蛋白質あ
るいは細胞生成物のいずれであるかを問わず、ワクチン、あるいは診断的アッセ
イあるいは検出方法、あるいは治療目的のための試薬として用いることができる
。一般的なクローニング方法に関しては、例えば、Maniatis, Fitsch and Sambr
ook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982) or DNA Cloning, Volu
mes I and II (D. N. Glover ed. 1985)参照。DNA配列は変性毒素の精製を援助
するために高度に精製されたIgG分子、アジュバンド、基質、あるいは薬剤に操
作的に結合されたベクター内に存在することができる。こうした遺伝子組換え分
子は１つの発現システムの形態を取った場合は、形質転換あるいはトランスフェ
クトされた細胞は上に述べた変性毒素としてソースとして用いることができる。

【００４４】遺伝子組換えされた、あるいは誘導された変性超抗原毒素は必ずしも指定され
た核酸配列から翻訳されたものではなく、例えば、化学合成や遺伝子組換え体発
現システムを含むいずれかの方法で発生することも可能である。さらに、変性さ
れた毒素は例えば細胞質への直接移入のため、あるいは細胞から分泌させるため
に他の蛋白質やポリペプチドに融合させることができる。これには、遺伝子組換
え体または誘導された変性超抗原の他のワクチンあるいはHis−付加、エピトー
プ付加、あるいは抗体Ｆｃ融合など精製に役立つように設計された配列への融合
を含んでいる。

【００４５】別の実施の形態で、本発明はDNAフラグメントが発現され、超抗原毒素蛋白質
がつくりだされるような条件の下で上に述べたホスト細胞を培養することを含む
変性超抗原毒素をつくりだす方法に関連している。この超抗原毒素はその後免疫
親和性クロマトグラフィあるいはあるいは予備的等電フォーカシングなど先行技
術で公知の方法を用いて単離し、精製することができる。しかしながら、精製の
方法はワクチンの性能に基本的な要素ではない。変性された超抗原毒素はバクテ
リア性超抗原度による感染に対する免疫性のためのワクチン、あるいは超抗原毒
素関連疾患あるいはバクテリア感染を検出するための診断用ツールとして用いる
ことができる。形質転換されたホスト細胞は超抗原のMHCクラスIIあるいはT細胞
抗原受容体に対する結合に影響を及ぼす薬品や薬剤の有効性を分析するために用
いることができる。化学的に誘導された薬剤、超抗原毒素発現の下方規制あるい
は変化につながる、あるいはその受容体に対する超抗原毒素の結合親和性に影響
を及ぼす他の蛋白質を検出、分析することができる。超抗原毒素のその受容体に
対する結合を変えることができる薬品あるいは薬剤の有効性をテストするための
方法は、例えば、ファージ表示技術などのコンピュータ支援合理的設計あるいは
組み合わせライブラリー・スクリーニングである。

【００４６】別の実施の形態で、本発明は上に述べた変性超抗原毒素に対して特有の抗体に
関連している。例えば、完全な毒素に対する、あるいはその一部に対する抗体を
発生させることができる。標準的な技術を用いる当業者は本発明による変性超抗
原あるいは変性超抗原の一部に対するモノクローナルあるいはポリクローナル抗
体を発生させることができる。固体を発生させるための素材と方法はこの技術分
野では公知である（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practices, Chapter 4, 1986参照）。これらの抗体は超抗原毒素関連感染を検出
するための診断アッセイで用いることができる。抗体の中性化はアネルジーの治
療や改善及び／または超抗原毒素関連感染の治療のための治療用組成物において
用いることができる。

【００４７】別の実施の形態で、本発明はサンプル内の超抗原関連バクテリア感染の存在を
検出するための方法に関係している。そうした診断的アッセイはこの技術分野で
良く知られている標準的な技術を用いて、例えば微量滴定プレートあるいは薄膜
（例えばニトロセルロース膜）などの表面（つまり、固体基質）上に上に述べた
変性超抗原の全体、あるいはその独特な部分を被覆して、そして、それを超抗原
関連バクテリア性感染にかかっていると疑われる人の血清にそれを接触させるこ
とによって実施することができる。その結果そしての変性超抗原毒素と血清中の
それに対して固有性を示す抗体との間に形成される複合体の存在を、蛍光抗体分
光測定あるいは色彩測定など公知の方法のいずれかを用いて検出することができ
る。この検出方法は、例えば、超抗原関連バクテリア感染の診断に用いることが
できる。

【００４８】さらに別の実施の形態で、本発明はサンプル中の超抗原毒素の存在を検出する
ための方法に関係している。先行技術で高氏の標準的な方法を用いて、診断アッ
セイを、例えば微量滴定プレートあるいは薄膜（例えばニトロセルロース膜）な
どの表面（つまり、固体基質）上に変性された超抗原毒素に対して固有性を示す
抗体を被覆して、それを超抗原関連バクテリア性感染を有していると疑われる人
の結成や組織サンプルと接触させることで行うことができる。その結果そしての
変性超抗原毒素と血清中のそれに対して固有性を示す抗体との間に形成される複
合体の存在を、蛍光抗体分光測定あるいは色彩測定など公知の方法のいずれかを
用いて検出することができる。こうした検出方法は、例えば、超抗原関連バクテ
リア感染症あるいは食中毒や毒性ショック症候群の診断、または食物や飲料内の
超抗原毒素の検出に用いることができる。

【００４９】他の実施の形態で、本発明は特定のバクテリアから得られる変性超抗原毒素あ
るいはバクテリアから得られるいくつかの異なった超抗原毒素と先行技術で良く
知られ、血清あるいは組織サンプル内の超抗原関連バクテリアに対する抗体の存
在を検出するための使用に適した試薬で構成された診断用キットに関係している
。想定されている組織サンプルは鳥、魚、あるいはサル及びヒトを含む哺乳動物で
ある。

【００５０】さらに別の実施の形態で、本発明は超抗原毒素関連バクテリア感染症から護る
ためのワクチンに関連している。このワクチンは１つの個別的な変性超抗原毒素
、あるいはそれらの一部、あるいはその混合物を含むことができる。異なったバ
クテリアからの２つ以上の異なった超抗原毒素の混合物が用いられた場合、その
ワクチンは多価バクテリア性超抗原ワクチンと呼ばれる。このワクチンは１つあ
るいは複数の関連したブドウ球菌及びレンサ球菌毒素に対する露出から発生する
病態から護るために設計されている。さらに、その蛋白質あるいはポリペプチド
は他の蛋白質あるいはポリペプチドに融合あるいは吸着させることができ、それ
によって抗原性が増大し、ワクチンとして用いられた場合、抗体を中性化するよ
り高い力価がつくりだされる。そうした蛋白質あるいはポリペプチドの例として
は水酸化アルミニウムなどのヒトに対して安全に使用できるアジュバンドあるい
は担体などである。

【００５１】ブドウ球菌エンテロトキシン（SE）抗原型SEA、SED、及びSEEはアミノ酸配列
によって密接に結合されており、他方、SEB、SEC1、SEC3、及び化膿レンサ球菌
外毒素Bは他の毒素と重要なアミノ酸残基を共有しているが、全体としては弱い
配列相同性を示すだけである。しかしながら、SEA、SEB、SEC1、SEC3、及びTSST
−1の公知の３次元的構造にはかなりの類似性がある。こうした構造的類似性の
故に、各SEまたはTSST−1によって免疫されたマウスから得られたポリクローナ
ル抗体は低レベルから高レベルの交差反応を示す。マウスにおいては、これらの
抗体交差反応はほとんどの他のSE／TSST−1の毒性を用量に応じて中性化するの
に十分である。例えば、SEA、SEB、TSST−1、及びSPEの混合物による免疫化は強
力な毒素単独、あるいはその組み合わせによる刺激からの抗体保護を提供するの
に十分であった。

【００５２】かなりの交差反応性の化膿性は、最低限のワクチン混合組成物を用いて他の（
あるいはすべての）ブドウ球菌超抗原に対する免疫保護を獲得することを可能に
してくれる。ブドウ球菌超抗原の場合、SEA、SEB、SEC1及びTSST−1からの成分
ワクチンの組み合わせはSEA、SEB、SEC1−3、及びTSST−1に対する免疫保護を十
分に提供してくれるはずである。三価混合物に対してSPE成分を加えると、レン
サ球菌毒素SPEa及びSPEｃに対して十分な保護を可能にしてくれる。従って、上
に述べたようなSEA、SEB、SEC1及びTSST−1、及びSPEから得られた変性超抗原毒
素で構成される多価ワクチンはバクテリア性超抗原毒素の大多数に対する保護的
免疫性を提供してくれると予想される。

【００５３】このワクチンは上記の変性毒素に対する遺伝子で構成された遺伝子組換え表現
ベクターの発現を誘導することによって調製することができる。その溶液を滅菌
するためのろ過、溶液の希釈、アジュバンドの付加、そして溶液の安定化を含め
先行技術で公知の方法を用いて哺乳動物に投入するためにその精製した溶液を調
製する。輸送や保存をし易くするために、乾燥した形態で超抗原毒素関連バクテ
リアに対するワクチンをつくるために、そのワクチンを凍結乾燥することができ
る。さらに、ワクチンは上に述べた変性超抗原毒素と、付加された抗原がワクチ
ンの有効性に影響を及ぼさず、そして、副作用や望ましくない反応があったとし
てもそれが付加的あるいは相乗的に増強されない限り、少なくとも１つの他の抗
原を含んだ混合ワクチンの形態で調製される。さらに、このワクチンはバクテリ
ア性伝達システムによって投与され、サルモネラspp、シゲラspp、ストレプトコ
ッカスsppなどの遺伝子組換えホスト細胞によって表示することができる。遺伝
子組換えベクターをホスト細胞に導入し、そしてホスト細胞をDNA伝達システム
として導入する方法はこの技術分野で公知である［Harokopakis et al. (1997)
Infect. Immun. 65, 1445-1454; Anderson et al. (1996) Vaccine 14, 1384-
1390; Megalini t al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 6868-68
72］。

【００５４】このワクチンは密封した壜、アンプルなどに保存することができる。本ワクチ
ンは通常は液体あるいは懸濁液の形態で投与することができる。ワクチンが乾燥
形態の場合は、ワクチンは投与前に滅菌された蒸留水内に溶解あるいは懸濁され
る。一般的に、ワクチンは経口、皮下注射、皮膚内あるいは筋肉内などの方法で
投与することができるが、好ましくは中性化された抗体をつくりだし、感染症あ
るいは疾患からの保護に有効な用量で鼻腔内に投与される。

【００５５】別の実施の形態で、本発明は患者に対して上述の変性超抗原毒素抗体の有効量
だけ投与することによって患者内の超抗原関連バクテリア感染を減らすための方
法に関係している。患者に対して抗超抗原毒素毒素抗体あるいは受容患者に対す
る超抗原機能を抑止することができる薬剤を提供する場合、投与される用量はそ
の患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状況、従来の治療歴などのフ
ァクターに従って変わる。一般的に、受容者に対しては上の化合物を約1pg／Kg
から10mg／kg（患者の体重）の範囲で提供するのが望ましいが、より低い、ある
いは高い容量で投与される場合もある。

【００５６】さらに別の実施の形態で、本発明は超抗原毒素とは直接関連していないかもし
れないが、T細胞サブセットの特殊な非反応性状態をもたらす疾患の措置、ある
いは抹消血液におけるサブセットの以上に低いレベルを検出するための方法に関
係しており、この方法はT細胞サブセットが拡張あるいは刺激されるように変性
超抗原毒素をin vivoあるいはex vivoで投与するステップを含んでいる。T細胞
のアネルギーあるいは非反応状態を引き起こす疾病は感染症、及び癌などである
。例えば抗原または抗CD3抗原による検出可能なT細胞サブセットの増大、あるい
はその抗原受容体を介してのex vivoでのT細胞の刺激の増大は標準的な実験室に
おける免疫アッセイによって測定することができる。

【００５７】別の実施の形態で、本発明は例えば自己免疫などの拡張された、あるいは過剰
に刺激されたT細胞サブセットに関連した疾病を措置するための治療方法に関係
しており、この方法は、限定された（1−3）T細胞サブユニットだけが刺激され
るが、MHCクラスII結合親和性は残るようにし、さらにT細胞のアネルジーまたは
非活性化がつくりだされるような方法で超抗原毒素をin vivoあるいはex vivoで
投与するステップを含んでいる。望ましい臨床結果はこの技術分野で知られてい
るアッセイによって標的とされたサブセットの循環血液T細胞の減少として、あ
るいは抗原あるいはその他の抗原受容体媒介刺激性反応の減少として測定される
。

【００５８】説明的な目的だけで、本発明の範囲の限定を意図しない本発明の実施例を以下
に説明する。本開示に照らせば、当業者には請求項の範囲内での多数の実施の形
態が可能であることは自明であろう。

【００５９】以下の実施例では、以下に説明するような素材と方法が用いられた。

【００６０】構造的比較 SEA、SED、SED、SEB、SEC1、TSST-1を含めいくつかのバクテリア性超抗原1次
蛋白質構造データが入手できる。構造が分からなかった超抗原は比較手法（HOMO
LOGY program; Biosym Technologies, Inc., San Diego, CA）を用いてモデル
化された。X線結晶学データは入手できるようになる前に、SEAはこの方法を用い
てモデル化され、そしてそのモデルは実験的に判定された構造と非常に類似して
いた。例えば、SEAのアミノ酸配列は遊離及びHLA−DR1結合SEBと合わせられ、SE
A分子は遊離及びDR1結合蛋白質の両方に関してつくられた。SEAのループ・セグ
メントをde novo法で発生させた。モデル化された構造は分子ダイナミックス刺
激（DISCOVER，Biosym）の手段でより精密にされた。構成された遊離SEA分子を
５オングストロームの溶媒水層に浸潤させ、構造的に保存された領域にあるα炭
素原子を刺激中にその最初の位置につないだ。結合SEA分子に関しては、DR1−SE
B複合体の結晶構造から導かれるように、10オングストローム・インターフェー
ス境界内にSEA分子及びDR1分子の部分で構成された活性サイト領域を構成するこ
とで刺激が与えられた。外側の境界にあるアミノ酸残基はその最初の位置にしっ
かりと固定された。活性サイト領域は５オングストローム位置内に浸たされた。
蛋白質相互作用は11.0オングストロームの非結合カットオフ距離と一貫性のある
原子結合力場を用いてモデル化した。刺激は最急峻下降アルゴリズムを用いて最
小限化を行い、その後（1.0fsタイムステップを用いて）100−ps弛緩を行う操作
を100回繰り返して行われた。SEB、SEC1、及びTSST−1間の構造的比較は通常の
二次構造要素に基づいて及び／または配列及び構造相同性モデリングによって整
合化された結晶構造（brookhaven date holdings）を用いて行われた。

【００６１】サイト固有突然変異誘発サイト固有突然変異誘発はSEAを発現する黄色ブドウ球菌（FDA196E、a clinic
al isolate, Fraser, J. D. (1994) Nature 368: 711-718）、SEBを発現するも
の（14458，clinical isolate）、SEC1を発現するもの（Toxin Technologies
，Sarasota，FL）、TSST−1（pRN6550 cloned product, a clinical isolate, K
reiswirth, B. N et al (1987) Mol Gen. Genet. 208, 84-87］、そしてSPEaを
発現するもの（Toxin Technologies）からそれぞれか単離された遺伝子テンプ
レートを用いて、Kunelが開発した方法で行われた。修正Ｔ７ポリメラーゼ（Seq
uenase，U．S．Biochemical Corp．，Cleveland，OH）を用いて変性コドンと単
一鎖ウラシル増大M13テンプレートを含んだ合成オリゴヌクレオチドから二次的
ストランドDNAを合成した。また、二重鎖DNAを突然変異誘発のためのテンプレー
トとして用いた。突然変異誘発された配列は公知のプライマーあるいはユニバー
サル・プライマーから誘導された合成プライマーを用いてDNA配列決定で確認さ
れた（Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467; Sa
mbrook et al., 1989）。大腸菌ホスト内で生産するために、完全なコード配列
がpUC19、pSE380、あるいはpET21などの発現プラスミドに挿入された。

【００６２】蛋白質の精製適切な大腸菌ホストを突然変異体毒素遺伝子を含んでいるプラスミドを用いて
形質転換させた。一般的に、バクテリアは50μg／mLアンピシリンあるいはカナ
マイシンを含んだTeriffic Broth（Difco Laboratories，Detroit，MI）内でA
600 0.6−0.6に成長させた。遺伝子組換え蛋白質はイソプロピル−β−D−チオ
−ガラクトピラノシド（Life Technologies，Gaithersburg，MD）で誘発させて
、細胞質あるいはバクテリア細胞質分泌生成物として回収された。バクテリアは
遠心分離で回収され、30mM NaCl、10mM TRIS（pH7.6）によって洗浄され、遠
心分離でペレット化され、細胞溶解されるか、あるいは分泌された蛋白質を回収
するために浸透圧ショックを加えた。調製物はCMセファロース・イオン交換クロ
マトグラフィ、ウサギ抗体（Toxin Technologies，Sarasota，FL）親和性カラ
ム、イオン交換HPLC、あるいはその他の類似の方法で単離した。いくつかの場合
、部分的に精製された超抗原を予備的等電フォーカシング（MinipHor；Rainin
Instrument Company，Inc．，Woburn，MA）によってさらに精製された。MinipH
orに10％（ｖ／ｖ）グリセロル及び1％（ｖ／ｖ）pH６−８両性電解質（Protein
Technologies，Inc．，Tuscon，AZ）を含む溶液内でCMセファロース・クロマ
トグラフィを行うことで得られたSEA増強フラクションを負荷した。この蛋白質
調製物を均衡状態が到達されるまで（4℃の温度下で約４時間）凝集させた。20
個の凝集したフラクションを回収して、それぞれのアリコットをSDS−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動（SDS−PAGE）及び免疫ブロッティングによって分析
された。SEA含有フラクションが集められ、さらに４時間かけて再凝集させた。
精製SEAを含むフラクションを集めて、最初は１M NaClで透析させ（4℃で48時
間）て両性電解質を取り除き、その後、 PBSで透析した（4℃で、12時間）。真正なアミノ末端残基を蛋白質配列決定で確
認した。蛋白質濃度の正確な測定は野生タイプ超抗原で親和性精製されたウサギ
抗体を用いる免疫アッセイと基準として野生種タイプ蛋白質を用いるビシンコニ
ン酸法（Pierce，Rockford，IL）によって行われた。すべての蛋白質調製物はSD
S−PAGE及びウェスタン・ブロッティングで測定して純度99％以上であった。い
くつかの場合、リンパ球アッセイに対して用いられた場合と同様、バクテリア性
発熱物質はその蛋白質調製物をPolymyxin Ｂ親和性カラムを通過させることで
取り除かれた。

【００６３】超抗原のHLA−DR1に対する結合 HLA−DR1αβをコードするプラスミドで感染されたDR1同型接合型のヒトB−リ
ンパ芽球状細胞株LG2またはL細胞を結合実験で用いた。細胞は野生タイプあるい
は突然変異体超抗原を用いて、0.5％仔ウシ血清アルブミンを含有するHanks均衡
化塩溶液（HBSS）内で40分間（37℃の温度下で）培養した。これらの細胞をHBSS
で洗浄して、５μgの特殊なウサギ抗体（Toxin Technologies，Sarasota，FL）
を用いて氷上で１時間培養した。結合しなかった抗体を取り除いて、細胞をFITC
でラベルしたヤギ抗ウサギＩgG（Organon Tekinika Corp．，
Durham，N．C）を用いて氷上で30分間培養した。これらの細胞を洗浄して、フロ
ー・サイトトメトリー（FACScan; Becton Dikinson & Co., Mountain View, CA
）で分析した。比較対象物は親和性精製した抗毒素とFITCラベル抗体を用いて事
前に超抗原を加えずに培養した細胞で構成されていた。

【００６４】リンパ球増殖ヒト抹消血液分子細胞をFicoll−hypaque（Sigma，St．Louis，MO）上昇密度
勾配遠心分離によって精製した。ヒトMHCクラスII分子DR1αβをコードする遺伝
子（DRA及びDRB＊0101cDNA［Bavari and Ulirich (1995) Infect. Immun. 63,
421-429］を真核性発現ベクターpRC／RSV（Invitrogen，Carlsbad，CA）内にク
ローンされ、マウスL細胞を安定的にトランスフェクトさせた。トランスフェク
タントは高レベルのDRαβ21を発現する細胞をつくりだすために、ウサギ抗DRαβ抗血清及びFITC−ヤギ抗ウサギIgGを用いた蛍光活性化細胞ソー
ティング（EPICS C，Coutler Corp．，Hialeah，FL）で選択した。96−ウェル
・プレートの１ｘ10^５細胞／ウェルを照射して（15,000Rad）、そして野生タイ
プあるいは突然変異体SFを加えた。短い培養時間（37℃、45分間）後、結合しな
かったSEは暖かい媒体を用いて培養プレートから洗浄された。これらの細胞を5
％FBSを用いて72時間、RPMI−1640（USAMRIID）内で培養し、１μCi［^３Ｈ］−
チミジン［Amersham，Arlington Heights，IL］を用いて12時間パルス−ラベル
した。細胞はグラスファイバー・フィルター上に取り出して、細胞DNA内への［
^３Ｈ］−チミジンの組み込みを液体シンチレーション・カウンターで測定した（
Betaplate，Wallac Inc．，Gaithersburg，MD）。脾臓単核細胞あるいはヒト末
梢血液単核細胞を上昇密度遠心分離（Histopaque；Sigma Chemical Corp．）
によって得て、3回洗浄した。これらの細胞を5％仔ウシ胎児血清（FSB）を含ん
でいる培養液内に再懸濁し、この細胞懸濁液の100μl（４ｘ10⁵細胞）を96ウェ
ル平底プレートの３つ組ウェルに加えた。これらの単核細胞をWTあるいは突然変
異体SEAを用いて培養した（37℃、5％CO_２）。3日後、これらの培養物を［^３Ｈ］−チミジン［Amersham，Arlington Heights，IL］の
ウェルあたり１μCiでパルスし、組み込まれた放射活性を液体シンチレーション
を測定した。

【００６５】ゲル電気泳動及び免疫ブロッティング分析上記蛋白質調製物をSDS−PAGE（12％）で分析し、メタノール（10％ｖ／ｖ）
酢酸（10％ｖ／ｖ）内でCommassie Brillant Blue R−250（Sigma Chemical
Comp．St Louis，MO）で染色した。SDS−PAGEで単離された蛋白質（染色され
ていない）をニトロセルロース膜（Bio−Rad Lab．Inc．，Melville，NY）上に
電子ブロッティングで移動させ、それらの膜を50mMリン酸ナトリウム、140ｍＭ
塩化ナトリウムで構成される緩衝液内で0.2％カゼインを用いてブロットした（1
2時間、4℃）。その後、0.2％カゼインを含むPBS内で、２μg／mLの親和性精製
された抗毒素抗体（Toxin Technology，Sarasota，FL）を用いて培養された（
１時間、37℃、振動）。これらの膜を徹底的に洗浄し、ペロキシダーゼ接合ヤギ
抗ウサギIgG（Cappel／Organon Teknika Corp．，West Chester，PA）を加え
て（1：5,000）、そしてそれらの膜を振動させながら１時間（37℃）培養した。
未結合の抗体をPBSで洗浄して取り除き、結合した抗体をBio−Radペロキシダー
ゼ開発キット（Biorad，Hercules，CA）を用いて視覚化した。定量を行うため、
野生タイプ調製物の希釈物をSlot−Blot装置（Bio−Rad）を用いてニトロセルロ
ース膜上に固定した。これらの膜をSlot−Blot装置から取り出して、未反応サイ
トをPBS内で0.2％カゼインでブロットした（12時間、4℃）。PBSで一度洗浄した
後、この膜を0.02％カゼインを含んだPBS内で２μg／mLウサギ親和性精製抗毒素
抗体（Toxin Technology）を用いて培養した（１時間、37℃）。４回洗浄した
後、結合したウサギ抗体をホースラディッシュ・ペロキシダーゼと接合されたヤ
ギ抗ウサギIgGと反応させ（１時間、37℃）、そして強化化学蛍光（ECL；Amersh
am Life Sciences，Arlington Heights，IL）または類似の方法を用いてブロ
ットを開発した。突然変異体蛋白質の量は露出されたX線フィルム濃度計（NIH I
mage 1.57 software, National Institutes of Health, Bethesda, MD）で測定
した。毒物標準の各希釈物に関して二重濃度測定読み取り値の平均をプロットす
ることによって標準曲線を作成した。その結果得られる値を直線回帰法によって
直線にあてはめた。蛋白質の濃度を突然変異体の種々の希釈物の平均値を標準曲
線と比較することによって判定した。

【００６６】生物学的活性及び免疫化生後10−12週間目の雄C57BL／6マウスをHarlan Spraque−Dawley，Inc．Fred
erick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD)から入手した
。WTまたは突然変異体SEAの致命的効果をStiles et al．（1993）Infect．Imm
un．61，5333−5338に述べられている手順に従って評価した。免疫化を行うため
、免疫化を行うため、マウスに対して、２または10μgのWTあるいは突然変異体
毒素を100μgのアジュバンドに溶かしたもの（RIBI、Immunochem Research, Inc
. Hamilton, MT or alum）、あるいはアジュバンドだけを腹膜内注射で与えて、
２週間目及び4週間目にさらに同じ措置を行った。最後の免疫化から１週間後に
尾の欠陥から血清を回収した。最後の注射を行った後、マウスに毒素と大腸菌05
5：B5血清タイプ（Difco Laboratories，Detroit，MI）から入手したリポポリ
サッカライド（LPS，150μg）で刺激を与えた。この実験における比較対象はア
ジュバンド免疫化あるいは免疫化しなかったマウスで両方の薬剤を注射するか（
100％致死）、あるいは野生タイプ毒素またはLPSを注射した。これらのネガティ
ブ・コントロールでは死亡例は認められなかった。サルは右側の足の大腿部後部
筋肉内に抗原を注入して免疫化した。それぞれのサルに超抗原ワクチン＋アジュ
バンドを３回筋肉内注射を行って免疫化した。比較対象のサルには総量0.5ｍｌ
のアジュバンド（Alhydrogel，Michigann Department of Public Health）
及び滅菌PBSを免疫化されたサルの場合と同じ技術及び装置を用いて与えた。免
疫化剤は28＋２日の間隔を置いて投与され、20μgのワクチンをアジュバンドに
入れて総量0.5mlで構成されていた。免疫化剤は1mlツベルクリン注射器に取りつ
けた23−27ga 1／2−5／8”針を用いて、０日目、28＋2日目、及び56＋２日目
に投与された。

【００６７】抗体アッセイ微量滴定プレートを１μg／ウェルのWT毒素を100μlのPBSに溶かしたもので被
覆した（37℃、２時間）。抗原を被覆した後、ウェルをPBS内に250μlのカゼイ
ン0.2％を溶かしたものでブロットして、0.2％Tween20を含むPBSで４回洗浄した
。免疫または非免疫血清を0.02％カゼインを含んだPBSに希釈して、各希釈液100
μlを二重ウェルに加えた。各ウェルを４回洗浄した後、結合した抗体をホース
ラディッシュ・ペロキシダーゼ（Sigma Chemical Corp．，St。Luois，MO）で
検出し、色原体としてO−フェニレンジアミンを用いて、ヤギ抗種固有IgGをラベ
ルした（37℃、1時間）。各措置グループの二重OD（490ｎｍでの吸収）の平均値
を得て、これらのデータをネガティブ・コントロール・ウェルより上のOD読取り
値を4回発生させた最も高い血清希釈物の逆数に基づいて比較した。ネガティブ
・コントロールの場合、ウェルには抗原あるいは血清を入れなかった。

【００６８】超抗原結合及びTCRサブセット分析マウスB−リンパ腫系統A20（ATCC、Rockville、MD）から得た細胞（2−4ｘ10
^５細胞）をWTあるいは突然変異体毒素を0.5％仔ウシ血清アルブミンを含んだ胃H
anks均衡塩溶液に溶かしたもの（HBSS、USAMRIID）で培養した（40分、37℃）。
細胞をHBSSで洗浄して、５μgの親和性精製抗毒素抗体をHBSSに溶かしたもので
培養した（4℃、45分間）。結合しなかった抗体を取り除いて、結合した抗体を
蛍光性イソチオシアネート（FITC）でラベルしたヤギ抗ウサギIgG（Organon Te
knika Corp．，Durham，NC）で検出した。未結合の抗体を取り出して、それら
の細胞を FACSortフロー・サイトメトリー（Becton Dikinson & Co., Mountain
View, CA ）によって分析した。

【００６９】 TCRサブセット分析を行うために、WTあるいは突然変異体毒素で免疫化された
マウスから脾臓単核細胞を得た。これらの単核細胞をWT毒素（100ng／mL）で５
日間培養し（37℃）、その後、85％RPMI−1640、10％インターロイキン−2補強
剤（Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD）内で5％FBSを用いてさら
に５日間培養した。T細胞を２度培養して、抗TCR（Biosource，Camarillo，CA）
あるいは抗Vβ固有TCR（Biosource，Camarillo，CA）で染色した（45分間、4℃
）。分析されたすべての細胞はT細胞マーカーCD3＋に対してはポジティブであり
、CD25活性化マーカーを発現した（データは示さず）。比較対象は無関係な特性
を有するアイソタイプ抗体で培養した。未反応抗体を取り除いて、それらの細胞
をFITCでラベルした抗マウスIgG（Organon Teknika Corp。，Durham，NC）を
用いて氷上で30分間培養した。これらの細胞を洗浄して、フロー・サイトトメト
リー（FACSort）で分析した。

【００７０】体重18−20ｇのC57BL／6またはBALB／ｃマウス（Harlan Spraque Dawley, Inc
., Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, MD）にそ
れぞれ、SEA、SEB、あるいはSEC１またはTSST−1、あるいはSPEａをいろいろな
量で含んだ200μlを腹膜内注射し、その後、4時間後に70μgまたは150μgのLPS
（200μl）を腹膜内に注射した。比較対象にはSE（30mg）かLPS（150mg）をそれ
ぞれ注射した。LPS注射後72時間、動物を観察した。LP50の計算を95％標準限界
（SAS Institute Inc．，Cary，NC）を用いてProbit分析で行った。

【００７１】 SEA及びSEBの生物学的効果についてもMHCクラスIまたはII発現が欠損した［St
iles et at．（1993） Infect. Immun. 61, 5333-5338］遺伝子改変C57BL／6
マウス（Genpharm International, Mountain View, CA）において、毒素を１回
投与するだけで（30μg／マウス）、上に述べた手順に従ってテストした。 β
２ミクログロブリントMHCクラスIIβ DNAプローブを用いて、尾のDNAのサザン
分析によって遺伝子的同型接合性が確認された。

【００７２】マウス（1グループあたり18匹）に毒素（10μg）、LPS（150μg）、あるいは
毒素＋LPSを注射した。LPS注射後の各時点（２、４、６、８、10、22時間後）に
1グループあたり３匹のマウスから血清を回収して、プールした。血清は毒素注
射後の種々の時点（データ作表のためLPS注射の４時間前から４時間後までの範
囲で）採取した。LPS比較対象血清の回収は注射直後（０時間後）に開始された
。

【００７３】 TNFα及びIL−αの血清レベルを酵素結合免疫吸着剤アッセイで検出した。TNF
αは最初マウスTNFα（GIBCO−BRL、Grand Island、NY）に対するモノクローナ
ル抗体によって補足され、そして、ウサギ抗マウスTNFα（Genzyme，Boston，MA
）で培養された。ELISAプレートを洗浄して、ウエルに抗ウサギ抗体（Borhringe
r Manheim, Indianapolis，IN）のペロキシダーゼ接合体を加えた。プレート
を洗浄して基質（Kirkegaard and Perry，Gaithersburg，MD）を加えてから、
二重サンプルの平均A450読取り値を用いてTNFα濃度を測定し、遺伝子組換えマ
ウスTNFα（GIBCO−BRL）から標準曲線を作成した。マウスIL−１αだけを検出
するELISAキット（Genzyme，Boston，MA）を用いて二重サンプルから得た平均読
取り値からいくつかのIL−１αが判定された。TNFα及びIL−1α読取り値の標準
偏差は＋／−5％であった。

【００７４】 IL−6とIFNγの量はバイオアッセイで測定された［See et al., (1990) Infec
t. Immun. 58: 2392-2396］。IL−６依存細胞株、7TD１（Ｔ．Krakauerから提供
していただいたもの）を用いて、血清サンプルの連続２場合希釈物による増殖ア
ッセイを行い、アッセイは１つのサンプルに対して3回行った。微量滴定プレー
ト内での７TD1細胞の増殖を［^３H］−チミジン（１μCi／ウェル；Amersham，
Arlington Heights，IL）の摂取で測定し、血清から得た遺伝子組換えマウスIL
−6標準（R and D Systems，Minneapolis，MN）と前に述べた手順で比較した
［See et al. (1990) Infect. Immun. 58: 2392-2396］。三つ組みサンプルのSE
Mは＋／−10％であった。

【００７５】 IFNγはL929細胞上に対する小胞性口内炎ウィルス（New Jersey系統）の細胞
変性効果を、上に述べた手順［Torr et al. (1993) J. Infect. Dis. 167: 762-
765］に従って測定した。要約的に言うと、血清の連続２倍希釈を二重に行って
、L929細胞（５ｘ10^４／ウェル）を含む微量滴定ウェルに加えた。24時間培養し
た後、ウィルス（５ｘ10^５PFU／ウェル）を加えて、48時間後に還元された3−［
4，5−ジメチルチアゾール−2−yl］−２，5ジフェニル・テトラゾリウム・ブロ
マイド（Sigma）の吸収を読取ることで細胞変性効果を測定した。各血清サンプ
ルの活性を遺伝子組換えマウスIFNγを基準として（Biosource，Camarillo，CA
）用いることで判定した。二重サンプルのSEMは＋／−5％であった。

【００７６】実施例１ブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原の分子モデル化及び構造調査：バクテリア超抗
原は共通３次元構造を共有しているアミノ酸配列を比較したところ（図１）、バクテリア性超抗原は（１）SEA、S
ED、及びSEE、（２）SEB、ブドウ球菌エンテロトキシンC1−C3（SEC1−3）、化
膿ブドウ球菌外毒素A（SPE−A）及びＣ（SPE−C）、（３）TSST−1、及び（４）
配列において他とは最も離れている剥脱性毒素（ETA、ETB）及び化膿レンサ球菌
外毒素B（SPE−B）に分かれることを示唆した。本発明を最初に思いつき、原理
の証明が得られた段階で本発明者はデータが入手できなかったが、いくつかのバ
クテリア性超抗原のX線結晶学的構造が現在では分かっている。SEBとTSST−1な
どの別種の超抗原は配列にほとんど共通性がないが、それでもそれらは２つの異
なった領域で主にβストランドで構成された相同性蛋白質フォールドを示す［Pr
asad, G. S. et al. (1993) Biochemistry 32: 13761-13766; Acharya, R. K.
et al. (1994) nature 367, 94-97; Swaminathan, S et al. (1992) Nature
359, 801-806］。これらの蛋白質間の相違は主にTSST−1がなく、そしてアミノ
末端にあるジスルフィド結合ループなどいくつかの表面ループで構成される高度
の可変領域内に存在している。

【００７７】 HLA DR1と複合化したSEB及びTSST−1のX線結晶構造は知られており［Kim et
al. (1994) Science 266, 1870-1874; Jardetzky , T. S. et al. (1994 ) Nat
ure 368, 717-718］、このデータはサイト固有突然変異誘発による超抗原の減衰
結果を十分に紹介する上で有用であった。SEBに接触するFLA DR１の領域はαサ
ブユニット表面だけで構成されている。関係するSEBの主要領域は２つの保存サ
イト、βバレル領域の３つのβストランドから誘導された極性ポケットと高度に
溶媒露出された疎水性逆ターンである。SEBの極性結合ポケットは１つのグルタ
ミンと、HLA DR1のαサブユニットのLys39を含む２つのリシンを含んでおり、
一方、疎水性領域はロイシン及びHLA DRα鎖と何重もの接触を行っている側鎖
残基で構成されている。TSST−1とSEBの両方のHLA DR1結合サイトはかなり相互
に重複している。他のSAｇのHLA DRαとの疎水性結合接触はSEB及びTSST−1で
見出されるものと類似しているという考え方が提案されている[Ulrich et al. (
1995) Nature, Struct. Biol. 2, 554-560]。逆ターン内のロイシンで構成され
たモチーフ［Ulrich et al．（1995），supra］はバクテリア性超抗原の間に
保存されており、HLD−DR結合に関する（疎水性あるいはその他の）決定因子を
提供しているのかもしれない。しかしながら、TSST−１はHLA DRα鎖のLys39と
相互作用する極性ポケット内に電荷の高い残基を有しておらず、TSST−1がHLA
DR１−鎖残基及び抗原性ペプチドのカルボキシル末端領域と相互作用できるよう
にする別の構造的結合モードを用いている。

【００７８】 SEAとSEEの両方とも単一亜鉛原子によってβサブユニットに結合する［Fraser
，Ｊ．D．et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5507-5511］。SEA
のアミノ末端領域はHLA DRα鎖とのインターフェースの役割を果たし［Ulrich
et al．（1995），supra］、一方、SEA C末端領域残基His187、His225、及
びAsp227は隣接するHLA DR分子のβ鎖からのHis−81との場合と同様、亜鉛配位
複合体を形成する。しかしながら、我々が研究の結果は超抗原のHLA DRβサブ
ユニットの結合はT細胞を直接には刺激しないことを示した［Ulrich et al．
（1995），supra］が、結合SEAの別のHLA DRのα鎖との相互作用の可能性は増
大し、この傾向は生物学的能力の増強を示唆する。

【００７９】実施例２ブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原の分子モデル化及び構造研究：SEBとSEAの詳細
な蛋白質構造分析は、すべてのバクテリア性超抗原がMHCクラスII受容体の結合
に関して共通のメカニズムを有していることを示唆した。それぞれの構造的に保存されたα−らせん及びβストランド領域で整合された
モデル化されたSEAと結晶構造の未結合分子の最小二乗重ね合わせを行ったとこ
ろ、非常に類似した全体的フォールディング・パターンが示された。これら２つ
の構造の間の相違は主に低配列相同性のループ内にあり、最大の偏差は残基18−
20、30−32、173−181、191−194の構造的に保存された領域とシスチン−ループ
領域（90−111）との間に発生している。SEB内のこれらの領域の１つだけがHLA
−DR1分子とかなりの接触［特に残基Y94］をしている［Jardetzky et al., (199
4) Nature 368, 711-718］。

【００８０】 SEB及びHLA−DR1との間の結合インターフェースはN末端領域内に位置している
２つの構造的に保存された表面、つまり、βバレル領域の３つのβストランド要
素から誘導された極性結合ポケットと疎水性逆ターンとで構成されている。このSEBの結合ポケットは残基E67、Y89及びY115を含んでおり、DRαサブユニッ
トのK39と結合している。SEAの場合、DR分子との結合インターフェースを残基D7
0、Y92、及びY108で構成される類似の結合ポケットを含むようにモデル化された
。SEB内の残基Y89あるいはSEA内のY92のアラニンへの突然変異（図２）はDR1結
合を100分の１以下に減少した。SEBのY89とSEA内のY92のアラニンとの置換によ
ってK39との水素結合がなくなり、隣接蛋白質残基とのパッキング作用が破壊さ
れる。SEA突然変異体Y92Aのモデル化はY108に対して溶媒アクセス可能な表面面
積を野生タイプ構造の２倍以上に増大して、D70のカルボキシル基に対する水素
結合の形成を可能にしてくれ、従ってHLA−DR1に対する重要な固定及び識別ポイ
ントを破壊してしまうことを予想させる。この影響はSEBではE67の側鎖がより長
いので多少低めであると予想される。SEB Y115のアラニンとの置換も結合の100
分の１以下の減少をもたらす。対照的に、SEA内のY108と同じように置換してもD
R1結合にまったく変化をもたらさず（図２ａ）、このことはK39との相互作用の
安定化にとって、SEA残基Y92とD70の基本的な重要性を示唆している。DRαのK39
側鎖はSEB E67カルボキシル基との強力なイオン対相互作用、及びY89及びY115
のヒドロキシル基との水素結合を形成する。グルタミンによるSEBの置換は結合
親和性を100分の１以下に減少させたが（図２）、このことは強力なイオン結合
のより弱い水素結合との置換を反映している。類似のSEAサイトのイオン対相互
作用を最適化するために、D70のより短めのカルボキシレート側鎖はDRαのK39を
シフトさせて、SEA Y108との相互作用を弱めると考えられる。SEA Y108とアラ
ニンとの置換は従ってSEB Y115の相同性置換より対応しやすく、DR1結合の喪失
は起こらない。

【００８１】次にこの極性ポケットと他のバクテリア性超抗原の比較を行った。SEC1−3とS
PE−Aは重要なDR1結合インターフェース残基（図１）を保存しており、SEB及びS
EAとの間でDR1−結合表面の構造的要素を共有している。SED（N70）内のアスパ
ラギンはSEA、SEB、SPE−A、及びSEC1−3内に存在している酸性の側鎖と置換す
る。従って、SEDの場合、極性ポケットの塩ブリッジは水素結合と置換される可
能性がある。SEDとSEAに対する全体的なDR1親和性はほぼ同様に思われ（図２ｂ
）、このことは他の超抗原に見出されるイオン対におけるSEDの不在を他の相互
作用が補っている可能性を示唆している。TSST−1の場合、DRα残基K39のセリン
またはM36への突然変異は結合を大幅に減少させることが示されている［Pania-B
ordignon et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1779-1784］。基本的には疎水性
であるが、重要なTSST−1構造要素はSEA及びSEB極性結合ポケットと共に保存さ
れている。SEB残基Y89及びY115はそれぞれTSST−１のT69及びI85と相同であり、
SEB E67はI46によって置換される。これらのTSST−1はSEB及びSEA両方に見出さ
れる保存されたβバレル領域内に位置している。しかしながら、TSST−1サイト
はSEB／SEAと同様の極性を欠いており、そして、TSST−1残基T69のヒドロキシル
基との水素結合はDRαK39は上記ポケット内に５オングストローム延伸する。TSS
T−1結合は残基I46周辺に集中する疎水性結合及びDRα残基E71及びK67をTSST-1
のR34及びD27とそれぞれに架橋しているイオン性または水素結合によって構成さ
れる別の方式［Kim et al. (1994) Science 266: 1870-1874］を利用する。

【００８２】 SEB及びHLA−DR1分子との結合インターフェースの疎水性領域はSEBのβ−スト
ランド１及び２を接続している大型逆ターン内に位置しているSEB残基44−47で
構成されている。これらの残基はそれらのバックボーン原子を通じて強力な静電
結合を行うように思われる。L45のアルギニンに対する突然変異はHLA−DR1結合
を100分の１以下に減少させたが（図２ｂ）、この減少はDR1分子の疎水性凹部へ
の高電荷残基のエネルギー的に好ましくない残基に原因を求めることができる。
モデル化されたDR1−SEA複合体はグルタミン（Q49）がSEB Y46と置換すること
を除いて、SEAバックボーン原子と同様の相互作用を行う。SEA内でのL48（SEB内
のL45と相同）のグリシンへの突然変異はT細胞反応を減少させることが報告され
ている。SEB L45とそれと比較されるTSST-1のL30はDR1インターフェース内に最
も広範に組み込まれている残基である。ロイシンはバクテリア性超抗原の間に保
存されており（図３）、表面相補性のために必要な疎水性構造要素に対してDR1
を提供している可能性があり、これはSEB及びSEAに関するデータとの一貫性を示
す。

【００８３】本発明者はTSST-1、SEC1及びSPE−Aを用いて同様の構造的及び機能的調査を行
った。

【００８４】実施例３ブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原の分子モデル化及び構造的研究：バクテリア性
超抗原のMHCクラスII受容体との一部の相互作用は保存されないが、疎水性ルー
プ及び極性ポケット結合サイトほど重要ではないちょこのDR1に対する全体的な親和性について調べる上で、共通結合モチーフ
周辺の構造的変差が大きな役割を演じている。SEAで短い、可変的に構成された
ジスルフィド・ループが見出されており、SEBではより長いループが見出される
。このループ内に含まれているSEB残基Y94はDRαサブユニットのL60及びA61との
疎水性相互作用を形成する。Y94のアラニンによる置換はDR1結合を部分的に抑制
する（図２ａ，ｂ）。アラニンはSEA（A97）とSEE内でSEB Y94に相当する位置
に見出され、SEAにおけるこの残基のチロシンへの突然変異はDR1との相互作用を
安定化させるのではなくて、それを破壊してしまう（図２ａ）。これらのジスル
フィド・ループはSEAとSEBとの間の構造において異なっているが、A97はSEBのY9
4と同様の方法でDRα結合インターフェースに対して貢献しているようである。T
SST-1はジスルフィド・ループを有していないので、 DRａとの同様に接触がTSST-1のβ−ストランドとの相互作用によって行われてい
る。同様の方法で、DRαの残基K39とSEDのE67との間の塩ブリッジの不在はそう
でなければ保存される優勢結合表面の外側で起きる相互作用を安定させることで
補われているようである（図２ａ）。

【００８５】実施例４ブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原の分子モデル化及び構造的調査：超抗原はT細
胞抗原受容体と相互作用する TCRと接触しているアミノ酸残基は高配列可変性の領域に位置しており、TCRと
の相互作用のための独特の表面を提供している。SEA及びSEB内の突然変異誘発に
よるTCR相互作用において実現される残基は可変ループ領域に残留し、TCR結合に
影響を及ぼすTSST-1突然変異体は主にαらせん内に主に位置している［Acharya,
R. K. et al. (1994) Nature 367, 94-97; Kim, J. et al. (1994) Science
266, 1870-1874］。特に、SEBのT細胞受容体認識を減少させる突然変異は残基N
23、Y61、そして相同性SEA N25あるいはＹ64を含んでいる（図２ｃ）。

【００８６】実施例５バクテリア超抗原の生物学的活性を判定するための動物モデル：マウス霊長類と比較すると、マウスはSEの毒性効果に対して非常に影響を受けやすい
訳ではなく、従って、我々はグラム陰性菌からのリポポリサッカライド（LPS）
の相乗的用量を用いて感作性を増大しようと考えた［Stiles et al. (1993) In
fect. Immun. 61, 5333-5338］。いずれかのSE（最大30μg／マウス）あるいはL
PS（150μg／マウス）だけを注射された比較対象の動物においては明らかな影響
は認められなかった（表１）。LPSの用量を徐々に増大して、250μg／マウスの
最大投与量までは注射しても致命的な影響はなかった（データは示さず）。しか
しながら、SE及びLPSを同じ動物に与えてから24−48時間の範囲でマウスは死亡
した（表１）。SEAはSEBあるいはSEC１のいずれかよりずっと毒性が高く、95％
基準限度で計算されたSEA、SEB、及びSEC1のLD50（最大毒素／Kg）はそれぞれ18
.5（6.5、38.5）、789.0（582.5、1044.5）、そして369.0（197.5、676.0）であ
った。

【００８７】

【表１】

【００８８】 LPSで増強されるSE毒性におけるMHCクラスI及びクラスII分子の役割について
、遺伝子変性MHC欠損マウスを用いて調べた（表２）。クラスII欠損動物は野生
タイプに対しては93％、そしてクラスI欠損マウスの30％に対して致命性を有す
るSE（30μg）＋PLS（150μg）では影響を受けなかった。クラスII欠損動物から
の単核細胞は増殖性反応によって測定してSEAを示すことはできなかった。MHCク
ラスI欠損細胞はT細胞増殖の促進において役割を果たすが、ただしMHC野生タイ
プ表示細胞によって促進される増殖反応のレベルは30％以下である（表３）。細
胞表面発現レベルは、非遺伝子改変C57／BL／６と比較して、クラスI欠損マウス
のA^ｂ、及びクラスII欠損マウスのＫ^ｂ／Ｄ^ｂに対しては正常であった。MHCI−
あるいはクラスII欠損マウスのT細胞反応はクラスI及びII分子の両方を発現する
単核細胞によって示された場合、基本的に野生タイプと基本的に同等であった（
表３）。

【００８９】

【表２】

【００９０】

【表３】

【００９１】 SEA、LPSあるいはSEA＋LPSを注射したマウスにおけるTNFα、IL−1α、IL−６
、及びINFγの血清レベルを注射後のいろいろな時点に測定した（図４）。 SEAかSEBのいずれかだけを注射したマウスと比較して、TNFα、IL−６、及びＩ
ＦＮγの血清レベルはSEA＋LPSを与えたマウスではぞれぞれ5倍、10倍、及び15
倍増大した。SEAだけではTNFα、IL−６、あるいはIFNγのバックグランドと比
較しての検出可能な増大は発生しなかった。他のサイトカインと比較して、SEA
＋PLAを注射されたマウスにおけるIL−１αレベルは単純な付加的効果をもたら
しただけだった。

【００９２】 TNFα、IL−6及びIFNγの血清レベルはLPS注射から2−4時間に最大となり、10
時間後に正常に戻った。SEA＋PLSを与えられたマウスにおけるIL−１αの濃度は
LPS注射から2時間後にピークに達し、残りの判定でもバックグランド以上であっ
た。LPSまたはSEAだけを与えたマウスにおけるIL−１αのレベルはそれぞれ４時
間ごと６時間後にピークに達した。他のサイトカインの特徴と違って、SEA及びL
PSを注射されたマウスにおけるIL−１αの最高量はSEAで刺激を与えたピークに
は対応したが、LPSの場合とは対応していなかった。

【００９３】この動物モデルは発明開発の種々の段階で、突然変異された超抗原の生理学的
活性を評価するための手段として用いられた。比較対象の動物はSEあるいはLPS
いずれの最高用量に対しても生き延びたが、両方の薬剤を注入されたマウスは死
亡した。野生タイプSEAはSEBより43倍以上強力であり、SEC1より20倍以上強力で
あった。BALB／ｃマウスを用いることによって、SEBの毒性は10−20倍高かった
。これらのデータはSEの毒性は主にMHCクラスII分子の発現に依存するメカニズ
ムを通じて発揮され、刺激されたサイトカイン放出と関係していた。従って、こ
れはヒトの反応を予想するために使える適切な臨床前モデルである。

【００９４】実施例６バクテリア性超抗原の生物学的活性を判定するための動物モデル：アカゲザルアカゲザルのバクテリア性超抗原に対する生理学的反応はおそらくヒトのもと
と同様であると考えられ、違いは影響の受けやすさだけである［Bavari and Ulr
ich (1995) CLin. Immunol. Immunopath. 76: 248］。一般的に、SEBを与え
たサルは露出後24時間後に胃腸系に症状を示した。臨床的な症状としては咀嚼、
拒食症、嘔吐、及び下痢などである。穏やかな、短時間の、自己限定的胃腸型症
状に続いて、サルは最大40時間の期間にわたって臨床的改善を示した。露出後48
時間程度で、中毒したサルでは通常無気力状態、呼吸困難、顔面蒼白などの症状
が急激に開始され、こうした症状の開始から４時間以内に死亡が始まった。生理
学的／病理学的効果を判定するためにSEBだけを用いてアカゲザルを刺激した。
バクテリア性超抗原に対するヒトの反応は血圧の急激な降下、体温の上昇、そし
て、多重器官不全−典型的毒性ショック症候群（TSS）などで特徴づけられる。
しかしながら、露出の呼吸器系統はいくつかの独特のメカニズムを含んでいる。
TSSの深甚な低血圧特性は観察されなかったが、TSSの場合とは違って、呼吸器系
の改善は速やかである。SEB注射の場合、吸入露出からかなり時間が経つと、熱
は一般的には観察されない。

【００９５】ワクチン開発のための標的を決めた受容体相互作用 DR1結合が減少したSEA突然変異体Ｙ92Ａ、及びTCR作用が低下したY64A、そし
て野生タイプ（比較対象）活性を有するK14Eを用いて、ワクチン開発のための正
しい受容体の判定を行った。WTあるいは突然変異体SEAの結合をMHCクラスII発現
マウスB−細胞リンパ球細胞系A20を用いて評価した（表４）。WT SEAのマウスM
HCクラスII（H−２^ｄ）分子の結合親和性はヒトMHCクラスII発現細胞で観察され
るレベルより低く、これはバクテリアSAｇがマウス体内で発揮する毒性の低下を
反映している。WT SEA、Y64A及びK14EはすべてマウスMHCクラスII分子に対して
同じ相対的親和性を示した。ヒトMHCクラスII分子で得られた結果と同様、Y92A
突然変異体はA20細胞への結合のかなりの減少を示した（表４）。

【００９６】

【表４】

【００９７】 WT SEAあるいはサイト固有SEA突然変異体の非免疫化マウスC57BL/6(H-2^b)マ
ウスから取り出した脾臓単核細胞への影響を表４に要約して示す。WTと比較対象
突然変異体K14Eの両方とも強力はT細胞活性化因子であり、その作用は10−100ｐ
ｇ／ｍＬの最低濃度で発揮される。しかしながら、Y92Aに対するT細胞反応はSEA
野生タイプと比較して少なくとも100分の１に減少したのに対して、Y64Aで刺激
した反応はY92Aの場合よりやや高かった。これらの結果は、MHCクラスIIあるい
はTCR分子のいずれかに対する超抗原結合の減少がマウスT細胞の増殖を劇的に低
下させることを裏付けている。これらの結果は変性毒素がTCR結合に関して野生
タイプ毒素と競合するのかもしれないことを示唆している。

【００９８】 SEA WT（10 LD50）、サイト固有SEA突然変異体（10μg／マウス）あるいはL
PS（100μg／マウス）だけの注射はマウスを致死させなかった（表５）。しかし
ながら、LPSとWT SEAあるいは突然変異体K14Eを組み合わせると、100％の致死
効果が得られた。LPSとWTあるいはK14Eの両方を与えられたマウスの場合、80％
は24時間以内に死亡し、48時間以内に100％が死亡した。対照的に、Y92Aを注射
されたマウスの100％とY64Aを注射されたマウス（いずれもLPSも投与）の80％が
生き延びた。Y64の注射で生残れなかったマウスの20％の死に至るまでの時間は4
8−72時間であった。これらのin vivoデータはリンパ球培養で得られた結果との
相関性を示した。マウスで観察された毒性の低下はT細胞増殖減少の直接の結果
であると結論づけられた。

【００９９】

【表５】

【０１００】受容体結合の低下が毒性の低下につながることを確認した後、我々は次にSEA
突然変異体の免疫原性について調べた。マウスをWTまたはSEAで免疫化した。比較対象のマウスに対してはアジュバンドだけを与えるか、あるいは何も与えな
かった。WT SEAで刺激を与えるより１週間前に、マウスを出血させて、血清抗
体力価をグループ毎に判定した。２μgのY64AまたはY92Aで免疫化させたマウス
はそれぞれ1：5000及び1：1000の抗体力価を有していた。2μgのWT SEAあるい
は比較対象突然変異体による免疫化はそれぞれ1：5000及び1：10000の力価をも
たらした。最高の免疫化用量（10μg／マウス）はすべての動物において最も有
効で、1：10000以上の抗体力価がもたらされた。すべてのマウスに10 LD50のWT
SEA（LPSで補強）による刺激が試みられた。生残データは免疫化マウスにおけ
る血清抗体のレベルとの相関性を示した。10μgのY92AまたはY64Aでワクチン接
種を受けたすべてのマウスは致死量のWT SEAを与えても生き延びた。突然変異
体Y64AあるいはY92Aのより低いワクチン化用量では多少低めの保護効果が得られ
ただけであった。WT SEAの両方の用量で免疫化されたすべてのマウスはLPSで補
強したWTを致死量投与しても生き延びた。

【０１０１】

【表６】

【０１０２】実施例８SEg突然変異体の免疫認識バクテリア性SAｇはマウスにおけるT細胞の特定のサブセットのクローン性ア
ネルギーを誘発する。減衰された突然変異体形態によってワクチン接種されたマ
ウスの間でのWT SEAに対する感作性の喪失が特殊な免疫性を示す変わりに特殊
な非反応性状態を示すことは可能であった。この問題を調べるために、SEA WT
に対するリンパ球反応を三回目の免疫化から2週間後に回収された脾臓単核細胞
で測定した。予想された通り、WT SEAあるいは比較対象SEA突然変異体で免疫化
されたマウスからのリンパ球はWT SEgによって接種された場合にほとんど、あ
るいはまったく増殖を示さなかった。対照的に、比較対象のマウスあるいはY64A
かY92Aで免疫化されたマウスから得られたリンパ球はWT SEAに対して活発に反応
した（図５）。次に、SEAワクチン接種マウスから得たT細胞によって用いられた
TCRの特徴づけをフロー・サイトメトリーで測定した。免疫化されたマウスある
いは比較対象マウスからのT細胞を7日間WT SEAで培養して、その後、IL−2含有
培地内で５日間拡張させた。活性化されたTCR Vβ11ポジティブ細胞の明確なポ
ピュレーションがY92A及びY64Aで免疫化されたマウスから得られたT細胞で観察
され、それぞれT細胞の48％と40％がその傾向を示した。しかしながら、SEA WT
あるいはK14E免疫化マウスから得られたVβ11発現細胞はそれぞれT細胞ポピュレ
ーション全体の約1％と6％で、このことはこのサブセットがWT SAgによる再刺激
に対して反応しないことを示している。Vβ 17ａ、３、７、及び10ｂを含んだT
細胞はすべてのマウスに対して変わらなかった。TCR及びMCHクラスII結合減衰SE
A突然変異体の両方に対するT細胞反応は相互に類似しているが、比較対象あるい
はWT分子に対する反応とは異なっているように見えた。これらの結果はSEｇ突然
変異体Y64A及びY92Aの発現において別の、恐らくは通常の抗原処理メカニズムが
機能していることを示した。

【０１０３】実施例９単価ワクチンによるアカゲザルの免疫化 SEAワクチンL48R、Y89A、D70R（A489270）及びSEBワクチンY89A、Y94A、L45R
（B899445）を用いてアカゲザルを免疫化した。全部で３回の注射（10−20μg／
動物）を受け、注射は1ヶ月毎の間隔を設けて行われた。これらのワクチンの接
種を受けたアカゲザルでは血清サイトカインの検出可能な増大は認められなかっ
たし、はっきりした毒性も観察されなかった。ホルマリン処理したSEB毒素（100
μg／注射）を３回ワクチン接種された動物の血清学的反応は１回または2回のB8
99445接種を行った場合とほぼ同様の結果を示したが（表７）、これらの遺伝子
組換えが非常に免疫原性であることを示唆している。免疫化されたアカゲザルは
野生タイプSEBのLD50以上の致死的な刺激に耐えて生き延びた（表７、８）。全
体的に、これらの結果は操作されたSEBワクチンが安全であり、高度に免疫原性
で、致死量のSEBエアロゾルに対する露出から免疫化された個体を保護する上で
有効であることを示唆している。

【０１０４】

【表７】

【０１０５】

【表８】

【０１０６】遺伝子操作で減衰されたワクチンによって免疫化されたサルからの血清はSEB
毒素を与えられたサルと同等か、あるいはそれより高い野生タイプSEBに対するT
リンパ球反応を示した（表７）。全体として、これらの結果は遺伝子組換えSAg
ワクチンが安全であり、高度に抗原原性で、そして保護的免疫を誘発することを
示している。

【０１０７】 B899445免疫化アカゲザルから得た血清はex vivo培養体でテストした場合、野
生タイプ超抗原に対するヒト・リンパ球反応を阻止した（表７）。これらのデー
タもワクチンの第2及び第3のワクチンが中性化抗体反応の発現においてほぼ同等
であることを示している。免疫化された動物で、野生タイプ蛋白質を含めていく
つかの超抗原に対する正常なT細胞反応が観察され、特定の、あるいは一般化ア
ネルギーが起こらなかったことを示している（図６）。

【０１０８】実施例10A: 多価超抗原ワクチン：アカゲザルの免疫化 B899445とA489270で構成される汲み合わせワクチンでアカゲザルを免疫化した
。３回目の接種後、野生タイプ・バクテリア性超抗原の抗体認識を調べた（図７
）。抗SEB、SEC1及びSEA抗体の高い力価が示された。

【０１０９】B：マウスの免疫化 SEA、SEB、SEC1及びTSST−1（すべて野生タイプ）で構成される汲み合わせワ
クチンでマウス（BALB／ｃ）を免疫化した。各個別超抗原に対する抗体返納に対
する評価を行った（表９）。成分抗原のそれぞれに対して抗体を発現させ、LPS
で補強された致死的な量の超抗原から十分にマウスを護れるようにした。表には
示していないが、SPE−Aに対する抗体反応についても観察した。マウスは個々の
超抗原によっても免疫化され、他の超抗原に対する抗体反応を測定した（表10）
。各個別の免疫原はテストされた他のすべての超抗原に対して部分的あるいは完
全な保護効果を誘発した。

【０１１０】

【表９】

【０１１１】

【表１０】

【０１１２】実施例１１変性TSST-1毒素ワクチン、TST30の設計ワクチンTST30の設計に対する手がかりを求めるために、受容体結合とTSST−1
蛋白質構造の関係についての広範な研究を行った。その結果、我々はTSST−1と
ヒトMHCクラスII受容体、HDL−DRとの相互作用は比較的弱いこと、そして、その
毒素のたった1つのアミノ酸残基を変性させるだけでその作用を破壊できること
を見出した。そして、その毒素をコードする遺伝子のサイト指向突然変異誘発と
大腸菌における新しい蛋白質生成物の発現を用いて、そのワクチンのデザインを
テストした。用いられたTSST−1遺伝子は黄色ブドウ球菌の毒原性系統から単離
された遺伝子をBgII制限酵素で消化することによって単離されたDNAフラグメン
ト内に含まれていた（AB259; Kreiswirth and Novick (1987) Mol. Gen. Genet.
208, 84-87）。この遺伝子の配列はヒトからの現在知られているすべてTSST−1
単離物と同じである。野生タイプTSST−1遺伝子は多数の臨床的黄色ブドウ球菌
単離物から簡単にクローンすることができる。TSST−1遺伝子を含んでいるDNAフ
ラグメントはアガロース・ゲル電気泳動で単離され、原核性発現ベクターpSE380
にむすび付けられた（Invitrogen Corp.）。このDNAクローンはリーダー・ペプ
チドをコードする配列と成熟したTSST−1蛋白質の全長で構成されていた。この
遺伝子的に操作されたワクチンは現在、マウス及びヒトのT細胞とのin vitroで
の反応性を持っているかどうか、及びマウスにおける致死性について評価中であ
る。TST30ワクチンは毒素分子に導入された以下の突然変異、つまり、アミノ酸
残基30のロイシンのアルギニンへの変化を含んでいた。他の２つの突然変異、つ
まり、Asp27のAlaへの変化と、Ile46のAlaへの変化も設計された。最終的なワク
チンはこうした付加的な突然変異の１つか２つを含んでいた。

【０１１３】 TSST−1とHLD−DRとの間の結合インターフェースは大型で、かなり平坦な表面
をN末端領域に有している。ロイシン3０はTSST−１の表面上の逆ターンから突き
出ており、HLA−DR受容体分子との重要な疎水性接触を形成している。TSST−１
の単一の残基ロイシン３０のアルギニンの荷電アミノ酸側鎖への突然変異はこの
受容体分子との重要な接触を破壊して、DR1結合の重要な減少をもたらすと予想
される。この突然変異体分子は従って、野生タイプ分子の毒性特性を失っている
はずである。

【０１１４】 TST30はペリプラズムに分泌された蛋白質か、あるいは細胞による生成物かの
いずれかとして大腸菌内で遺伝子組換え蛋白質として発現された。精製は最初の
イオン交換CM−セファロース増強ステップ後に免疫親和性クロマトグラフィーあ
るいは予備的等電フォーカシングによって行われた。この精製方法は、ワクチン
の性能には重要な要素ではなかった。グラム陰性バクテリア内での発現から生じ
るリポポリサッカライド汚染物質は種々の標準的な方法を用いて（リムルス・ア
ッセイで判定して）簡単に取り除くことができた。最終的に精製されたワクチン
は天然のTSST−1の10LD₅₀に相当するレベルで毒性を示さなかった。ヒトT細胞刺
激における代理アッセイでも毒性を示すものは観察されなかった。

【０１１５】 TST30が高度に抗原性で保護的な免疫を誘発することを証明するための最終的
なワクチン調査が現在マウス・モデルで進行中である。グラム陰性バクテリア（
LPS）からの相乗信号上のリポポリサッカライドを与えると、１μｇ／動物ある
いはそれ以下のレベルでマウスに対する致死性が示された。LPSと共に供与する
と、野生タイプTSST−1はマウスに対して100％の致死性を示す（10LD₅₀）。アルヒドロゲルに20μg／マウスの割合で入れたものを３回注射して（２週間お
き）、10LD₅₀のTSST−1の致死効果に対する保護について調べた。

【０１１６】実施例１１変性SPEA毒素ワクチン、SPEａ42の設計ヒトMHCクラスII受容体、HLA−DRとのSPEA相互作用は比較的弱く、その毒素の唯
１つのアミノ酸残基を変えるだけでも、その作用を破壊することができる。その
毒素をコードする遺伝子のサイト指向突然変異と大腸菌における新しい蛋白質生
成物を用いて、そのワクチンのデザインをテストした。用いられたSPEa遺伝子は
特殊なDNAオリゴヌクレオチド・プライマー及びポリメラーゼ鎖反応法を用いて
得られたレンサ球菌のSPEa−毒原性系統からのクローンであった。一般的に知ら
れているヒト起原のSPEａ単離物とまったく同じである。SPEa遺伝子を含むDNAフ
ラグメントをアガロース・ゲル電気泳動で単離して、原核性発現ベクター内（pE
TxあるいはpSE380）に結さつさせた。このDNAクローンはリーダー・ペプチドと
成熟したSPEa蛋白質の全長、あるいはリーダー配列を持たないSPEａ42で構成さ
れていた。我々は成熟したSPEａワクチンを発現あるいはつくりだす別の方法が
あることを認識している。SPEａワクチンは毒素分子に導入された以下の突然変
異、つまり、アミノ酸残基42のロイシンのアルギニンへの変化。

【０１１７】 SPEａとHLA−DRとの間の結合インターフェースは他のバクテリア性超抗原の間
に保存されているN末端領域にある接触部で構成されていることが予想される。S
PEaのロイシンはSPEaの表面上の逆ターンから突起しているおり、HLA−DR受容体
分子との主要な疎水性接触を形成していることが予想されている。SPEaの単一残
基ロイシン42のアルギニン荷電アミノ酸側鎖は受容体分子とのこの大型の接触を
破壊して、DR1結合のかなりの低下をもたらすことが予想される。この突然変異
体分子は従って野生タイプ分子の毒素特性を失っているものと考えられる。

【０１１８】 SPEa42は大腸菌内で、ペリプラスミド分泌蛋白質あるいは細胞生成物のいずれ
かとして遺伝子組換え蛋白質として表現された。精製は最初のイオン交換CM−セ
ファロース増強ステップ後に免疫クロマトグラフィあるいはとして行われた。精製の方法はこのワクチンにとって重要な要素ではなかった。グラム陰性バクテ
リア内での発現から生じるリポポリサッカライドは種々の標準的な方法を用いて
（リムルス・アッセイで判定して）簡単に除去された。最終的に精製されたワク
チンは天然のTSST−1の10LD₅₀に相当するレベルで、マウスに対する毒性を示さ
なかった。ヒトT細胞刺激での代理アッセイでも毒性の指標は示されなかった。

【０１１９】 SPEaが高度に抗原性で保護的な免疫を誘発することを証明するための最終的な
ワクチン調査が現在マウス・モデルで進行中である。グラム陰性バクテリア（LP
S）からの相乗信号上のリポポリサッカライドを与えると、１μｇ／動物あるい
はそれ以下のレベルでマウスに対する致死性が示された。LPSと共に供与すると
、野生タイプSPEaはマウスに対して100％の致死性を示す（10LD₅₀）。アルヒドロゲルに20μg／マウスの割合で入れたものを３回注射して（２週間お
き）、10LD₅₀のSPEaの致死効果に対する保護について調べた。￥

【０１２０】実施例１３変性超抗原毒素ワクチン、SEC45の設計ブドウ球菌エンテロトキシンC1（SEC1）の場合、位置45のロイシンをリシン（
SEC45）に変えた。この突然変異は、その疎水性ループ（ロイシン45の周辺に集
中している）が受容体のα鎖に結合することを阻止することによってSEC1がMHC
クラスII受容体と相互作用することを阻止すると予想される。SEC1はSEAあるい
は他の超抗原毒素よりSEBに対してより相同的である。SEC１内の亜鉛の存在は、
いくつかの場合、この超抗原毒素がMHCクラスII分子の相互作用を必要とせずにT
細胞抗原受容体に結合させるような付加的な結合特性を付与するのかも知れない
。T細胞抗原受容体への結合を抑えるために、SEC1残基N23（のアラニンへの）、
そしてV91（リシンへの）突然変異をテスト中である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

本発明のこれら及びその他の特徴、側面及び利点は以下の説明、特許請求の範
囲、及び図面を参照することでより明らかになるであろう。

【図１】ブドウ球菌及びレンサ球菌超抗原の分子モデル化及び構造研究：SEBとSEAの詳
細な蛋白質構造分析はすべてのバクテリア性超抗原はMHCクラスII受容体結合に
関して共通のメカニズムを有していることを示唆している Wisconsin大学のGeentics Computers Groupによって作成されたブドウ球菌及
びレンサ球菌超抗原アミノ酸配列相同体を示す図。

【図２】突然変異体SEB及びSEAの生物学的活性を比較する図。 A：SEB突然変異体HLA−DR1−結合；Ｂ：SEA突然変異体HLA−DR1−結合；Ｃ：S
EA及びSEB突然変異体のT細胞認識。細胞表面DR1に対するバクテリア性超抗原の
結合はレーザー蛍光活性化フロー・サイトメトリーによって測定された。３回行
われたうちの代表的な実験を示している。突然変異体SEA D197N、相同性SEB D
1997、及びSEA L11Yは結合あるいはT細胞認識には影響を示さず、比較対象とし
て用いられた。［³Ｈ］チミジン組込みで評価されたヒトT細胞増殖をSEA（Y64A
）あるいはSEB（Y61A）突然変異体及びDR1−結合親和性を保有している比較対象
に対応して測定した。各データ・ポイントは３回の判定の平均を示している。SE
A＜5％。

【図３】バクテリア性超抗原毒素の配列及び二次的構造整合を示す図。分析は種々の供
給原から得られた配列データを用いてComputer Genentics Group（Madison,
WI）から入手したPILEUP及びPROFILE装置を用いて行った。アミノ酸残基の番号
付けはSEA配列に基づいて行われた。

【図４】 SEA（白丸）、LPS（白い三角形）、あるいはSEA＋LPS（白い四角）を注射され
たマウスの血清内のTNF−α（ａ）、IL−１α（B）、IL−６（C）、及びIFN−γ
（D）の検出を示す図。TNF−α及びIL−１αは３つのサンプルの平均値を示し、
SEMは＋5％。TNF−αとIL−６値はそれぞれ２つと３つのサンプルの平均値を示
す。IFN−γとIL−６の値は読み取り値に対するSEMはそれぞれ＋5％と＋10％で
ある。

【図５】主要な組織適合性複合体クラスIIまたはT細胞抗原受容体が減少した突然変異
体SEAワクチンはT細胞アネルギーを誘発しなかった。マウスには野生タイプ（WT
）SEAあるいはサイト固有突然変異体ワクチン＋アジュバンドを３回与えた。比
較対象の動物にはアジュバンドだけを与えるか、あるいは措置を行わなかった。
そして、最終的な注射から２週間後に、プールされた単核細胞は各グループから
の４匹のマウスの脾臓から集められた。その結果は100ng／ml WT SEAで72時間
培養され、その後［^３H］チミジンで12時間培養された4組ウェルの平均cpm（＋S
D）で示した。P＜0.00001（未処理、アジュバンド、Y64、及びY92AをWT SEAグ
ループと比較して反復的に測定した偏差の分析）。

【図６】超抗原誘発T細胞アネルギーはワクチンB899445で免疫されたアカゲザルでは示
されなかった。抹消血液リンパ球をB899445で免疫化された個々のアカゲザル（
Ｋ422及びN103）から得た滴定濃度で培養した。T細胞の増殖を［^３H］チミジン
組込みで評価した。各データは３回の判定の平均を示している。SEM＜5％。

【図７】 B899445（SEB）及びA489270（SEA）で構成される組み合わせワクチンで免疫化
されたアカゲザルの抗体反応を示す図。抗体レベルはSEA、SEB、あるいはSEC1で
被覆したプレートを用いてELISAで測定した。サルG8は免疫化されていない比較
対象である。SEM＜３回の測定で５％。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＳＧ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｅ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オルソン，マーク，エーアメリカ合衆国メリーランド州 20877，ガイサースバーグ，フェアグローブテラス 107 (72)発明者ババリ，シナアメリカ合衆国ペンシルバニア州 17019，ディリスバーグ，フェアウェイドライブ 109 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 BA38 CA04 DA05 DA06 EA04 GA11 HA01 HA15 4B064 AG30 CA02 CA19 CC24 DA01 DA15 4B065 AA26X AA53Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 CA46 4C085 AA03 BA21 BA41 CC07 4H045 AA10 BA10 CA11 DA83 DA86 EA29 EA52 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 MHCクラスIIまたはT細胞抗原受容体のいずれかに対するコー
ド、変性された毒素が変性されるように変性された単離、精製された超抗原毒素
DNAフラグメント。
【請求項２】前記超抗原毒素が配列識別番号Ｎｏ：１の配列、その一部、
あるいはその対立遺伝子を有するブドウ球菌エントロトキシンAであることを特
徴とする請求項１記載の単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項３】前記超抗原毒素が配列識別番号No：３の配列、その一部、あ
るいはその対立遺伝子を有することを特徴とする請求項1記載の単離精製されたD
NAフラグメント。
【請求項４】前記超抗原毒素が配列識別番号Ｎｏ：５の配列、その一部、
あるいはその対立遺伝子を有するブドウ球菌エントロトキシンＢであることを特
徴とする請求項１記載の単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項５】前記超抗原毒素が配列識別番号No：７の配列、その一部、あ
るいはその対立遺伝子を有しているブドウ球菌エントロトキシンBであることを
特徴とする請求項1記載の単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項６】前記超抗原毒素が配列識別番号No：９の配列、その一部、あ
るいはその対立遺伝子を有しているブドウ球菌エントロトキシンBであることを
特徴とする請求項1記載の単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項７】前記フラグメントが配列識別番号No：２のアミノ酸配列、そ
の一部、あるいはその対立遺伝子をコードすることを特徴とする請求項2記載の
単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項８】前記フラグメントが配列識別番号No：４のアミノ酸配列、そ
の一部、あるいはその対立遺伝子をコードすることを特徴とする請求項３記載の
単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項９】前記フラグメントが配列識別番号No：６のアミノ酸配列、そ
の一部、あるいはその対立遺伝子をコードすることを特徴とする請求項４記載の
単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項１０】前記フラグメントが配列識別番号No：８のアミノ酸配列、
その一部、あるいはその対立遺伝子をコードすることを特徴とする請求５記載の
単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項１１】前記フラグメントが配列識別番号No：10のアミノ酸配列、
その一部、あるいはその対立遺伝子をコードすることを特徴とする請求項６記載
の単離精製されたDNAフラグメント。
【請求項１２】（i）ベクターと、そして（ii）請求項１による単離精製された変性超抗原毒素DNAフラグメントで構成される遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１３】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：１の配列、その
一部、あるいはその対立遺伝子を有していることを特徴とする請求項１２記載の
遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１４】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：３の配列、その
一部、あるいはその対立遺伝子を有していることを特徴とする請求項１２記載の
遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１５】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：５の配列、その
一部、あるいはその対立遺伝子を有していることを特徴とする請求項１２記載の
遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１６】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：７の配列、その
一部、あるいはその対立遺伝子を有していることを特徴とする請求項１２記載の
遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１７】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：９の配列、その
一部、あるいはその対立遺伝子を有していることを特徴とする請求項１２記載の
遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項１８】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：２で指定される
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項13の遺伝子組換えDNA構成物
。
【請求項１９】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：４で指定される
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項1４の遺伝子組換えDNA構成物
。
【請求項２０】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：６で指定される
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項1５の遺伝子組換えDNA構成物
。
【請求項２１】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：８で指定される
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項16の遺伝子組換えDNA構成物
。
【請求項２２】前記DNAフラグメントが配列識別番号No：10で指定される
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする請求項17の遺伝子組換えDNA構成物
。
【請求項２３】前記構成物がｐETA489270Ｐであることを特徴とする請求
項１３記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２４】前記構成物がｐETA489270Cであることを特徴とする請求項
１４記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２５】前記構成物がｐETA2360210であることを特徴とする請求項
１５記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２６】前記構成物がｐETA899445Pであることを特徴とする請求項
１６記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２７】前記構成物がｐETA899445Cであることを特徴とする請求項
１７記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２８】前記ベクターが発現ベクターであることを特徴とする請求
項１２記載の遺伝子組換えDNA構成物。
【請求項２９】請求項１２の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３０】請求項１８の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３１】請求項１９の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３２】請求項２０の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３３】請求項２１の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３４】請求項２２の遺伝子組換えDNA構成物で形質転換されたホ
スト細胞。
【請求項３５】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項２９記載
のホスト細胞。
【請求項３６】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項３０記載
のホスト細胞。
【請求項３７】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項３１記載
のホスト細胞。
【請求項３８】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項３２記載
のホスト細胞。
【請求項３９】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項３３記載
のホスト細胞。
【請求項４０】前記細胞が原核性であることを特徴とする請求項３４記載
のホスト細胞。
【請求項４１】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項２９の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４２】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項３０の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４３】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項３１の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４４】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項３２の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４５】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項３３の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４６】前記DNAフラグメントが発現され、前記超抗原毒素がそれ
によってつくりだされるような条件下で請求項３４の細胞を培養するステップと
、前記超抗原毒素を単離するステップを含む変性された超抗原毒素をつくる方法。
【請求項４７】 MHCクラスIIまたはI細胞抗原受容体のいずれかに対するコ
ード、変性された毒素が変性されるように変性された単離、精製された超抗原毒
素。
【請求項４８】前記毒素がブドウ球菌エントロトキシンAであることを特
徴とする請求項４７記載の単離、精製された超抗原毒素。
【請求項４９】前記毒素がブドウ球菌エントロトキシンBであることを特
徴とする請求項４７記載の単離、精製された超抗原毒素。
【請求項５０】位置92がアラニンに変えられた請求項４８記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５１】位置70がアルギニンに変えられた請求項４８記載の変性SE
A超抗原毒素ペプチド。
【請求項５２】位置48がアルギニンに変えられた請求項４８記載の変性SE
A超抗原毒素ペプチド。
【請求項５３】位置64がアラニンに変えられた請求項４８記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５４】位置115がアラニンに変えられた請求項４９記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５５】位置89がアラニンに変えられた請求項４９記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５６】位置67がグルタミンに変えられた請求項４９記載の変性SE
A超抗原毒素ペプチド。
【請求項５７】位置94がアラニンに変えられた請求項４９記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５８】位置61がアラニンに変えられた請求項４９記載の変性SEA
超抗原毒素ペプチド。
【請求項５９】超抗原関連バクテリア感染を診断するための方法において
、（i）超抗原関連バクテリア感染を有している疑いのある個人からのサンプル
を変性された超抗原毒素と接触させるステップと、（ii）上記変性された超抗原毒素と上記サンプル中の超抗原に固有の抗体との
間で形成される複合体の存在または不存在を検出することによって超抗原関連バ
クテリア感染の存在または不存在を検出するステップで構成されることを特徴とする方法。
【請求項６０】上記変性された超抗原毒素がSEB、及びSEAで構成されるグ
ループから選択されることを特徴とする請求項42記載の超抗原毒素関連バクテリ
ア感染を診断するための方法。
【請求項６１】前記毒素がSEBと、SEAと、そして哺乳動物サンプル内の超
抗原毒素に対する抗体の存在、不存在の検出において使用するのに適した補助剤
で構成されることを特徴とする請求項1記載の変性超抗原毒素で構成される超抗
原毒素関連感染診断キット。
【請求項６２】超抗原関連バクテリア感染に対する哺乳動物の保護をもた
らす抗原性及び免疫性反応をつくりだすのに有効な請求項１記載の変性長抗原毒
素で構成されるワクチン。
【請求項６３】前記変性超抗原毒素がSEBとSEAで構成されるグループから
選択されることを特徴とする請求項６２記載のワクチン。
【請求項６４】前記ワクチンがさらに、SEB及びSEAで構成されるグループ
から選択される少なくとも他の１つの異なった変性超抗原毒素で構成されている
ことを特徴とする請求項６３記載のワクチン。
【請求項６５】上記超抗原毒素がSEBであり、上記ワクチンがB899445とし
て識別されることを特徴とする請求項６２記載のワクチン。
【請求項６６】上記超抗原毒素がSEAであり、上記ワクチンがA489270とし
て識別されることを特徴とする請求項６２記載のワクチン。
【請求項６７】前記変性された超抗原毒素がSEAとSEBであることを特徴と
する請求項64記載の二価ワクチン。
【請求項６８】前記変性された超抗原毒素SEAがA489270であり、SEBがB89
9445であることを特徴とする請求項６７記載の二価ワクチン。
【請求項６９】基本的にSEA、SEB、あるいはその一部またはその対立遺伝
子で構成されるグループから選択される変性超抗原毒素の組み合わせを含み、薬
学的に受け入れ可能な賦形剤内に薬学的に受け入れ可能な量で超抗原毒素に対す
る防御的抗体を導き出すことができる超抗原関連バクテリア感染に対する多価ワ
クチン。
【請求項７０】超抗原関連バクテリア感染の治療あるいは改善のための治
療方法において、前記方法がそうした治療を必要とする個人に対して、薬学的に
受け入れ可能な用量で薬学的に受け入れ可能な賦形剤にいれた状態の請求項６２
によるより変性された超抗原毒素ワクチンで免疫化された個人からの有効量の血
清を投与するステップを含んでいる方法。
【請求項７１】超抗原関連バクテリア感染の治療あるいは改善のための治
療方法において、前記方法がそうした治療を必要とする個人に対して、薬学的に
受け入れ可能な用量で薬学的に受け入れ可能な賦形剤にいれた状態で変性された
超抗原毒素に対するする有効量の抗体を投与するステップを含んでいる方法。
【請求項７２】超抗原関連バクテリア感染の治療あるいは改善のための治
療方法において、前記方法が、これらの感染の競合的抑止によって超抗原毒素の
MHCクラスIIまたはT細胞受容体への接着を抑止するために、そうした治療を必要
とする個人に対して、有効量のブドウ球菌からの変性超抗原毒素を薬学的に受け
入れ可能な用量を薬学的に受け入れ可能な賦形剤に入れた状態で投与するステッ
プを含んでいる方法。
【請求項７３】T細胞サブセットの特殊な非反応性を起こさせるか、あるい
は、変性された超抗原毒素を使ってin vivoあるいはex vivoで特殊なT細胞サ
ブセットを拡張あるいは刺激することで超抗原毒素とは直接関係しない可能性の
ある疾患を治療するための治療方法。