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JP2002521679A - 心血管疾患を治療および診断するための組成物ならびに方法 - Google Patents

心血管疾患を治療および診断するための組成物ならびに方法

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JP2002521679A
JP2002521679A JP2000562059A JP2000562059A JP2002521679A JP 2002521679 A JP2002521679 A JP 2002521679A JP 2000562059 A JP2000562059 A JP 2000562059A JP 2000562059 A JP2000562059 A JP 2000562059A JP 2002521679 A JP2002521679 A JP 2002521679A
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gene
protein
expression
genes
substance
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JP2000562059A
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ファルブ，ディーン，エー．
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ミレニウム ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄症、および動脈炎症を含むがこれらに限らない心血管疾患を治療および診断するための方法ならびに組成物に関する。具体的には、本発明は、正常な状態または非心血管疾患状態における発現に比して、および／または心血管疾患に関連した操作に応答して、心血管疾患状態において示差的に発現する遺伝子を同定し、記載するものである。さらに、本発明は、遺伝子を、それらの遺伝子産物が心血管疾患に関与する遺伝子産物と相互作用する能力によって同定し、記載するものである。さらにまた、本発明は、心血管疾患を治療するための化合物を同定し、それを治療に使用する方法を提供する。さらに、本発明は、心血管疾患の治療について臨床評価を受ける患者を診断モニタリングする方法、ならびに臨床試験において化合物の効力をモニタリングする方法を提供する。さらに、本発明は、種々の心血管疾患を診断的および予後的に評価する方法、ならびにそのような症状の素因を示す被検者を同定する方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1997年6月6日出願の出願番号第08/870,434号（該出願は、1997年2
月13日出願の出願番号第08/799,910号の一部継続出願である）の一部継続出願で
あり、1996年2月16日出願の同時継続仮出願第60/011,787号について35 U.S.C 11
9条(e)の利益を主張するものである。これらの各出願の全体をそれぞれ参照によ
り本明細書に組み入れる。
【０００２】 １．序論 本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈
の炎症を含むがこれらに限らない、心血管疾患の治療および診断のための方法並
びに組成物に関する。本発明はさらに、線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患、特
にTGF-β関連疾患の治療および診断のための方法および組成物に関する。該疾患
には、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症、新脈管形成、炎症、線維症、
腫瘍増殖および血管新生が含まれる。さらにまた本発明は、このような治療およ
び診断において使用する組成物を同定するためのスクリーニング法に関する。正
常な状態または非疾患状態での遺伝子発現に対して、心血管疾患または腫瘍形成
疾患の状態では示差的に発現される遺伝子が同定される。また、その遺伝子産物
が心血管疾患または腫瘍形成疾患に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能
力によっても遺伝子が同定される。同定された遺伝子は診断的に使用されるか、
または治療的介入の標的として使用される。さらに、心血管疾患、線維増殖性疾
患または腫瘍形成関連疾患の治療の臨床的評価を受ける患者の診断的モニター法
、臨床試験における化合物の効力のモニター法、およびこのような疾患の素因を
もつ患者の同定法も提供する。
【０００３】 ２．発明の背景 心血管疾患は産業の発達した世界の至る所で主要な健康上の問題となっている
。アテローム性動脈硬化症は、心血管疾患のうちで最も一般的なもので、心臓発
作、卒中、四肢の壊疽の主な原因となり、それゆえ米国では第一位の死亡原因で
もある。アテローム性動脈硬化症は多くの細胞型と分子因子を巻き込んだ複雑な
疾患である（詳細については、Ross, 1993, Nature 362: 801-809 を参照のこと
）。その過程は、正常な状況では動脈壁の内皮および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の傷
害に対する防御反応であり、炎症が先行し、炎症を伴った繊維脂肪質または繊維
質の病変部または斑の形成から成り立っている。アテローム性動脈硬化の進行し
た病変部は関係した動脈を閉塞させることがあり、多数の異なる形の傷害に対す
る過度の炎症−線維増殖性応答が原因である。例えば、分岐点や不規則な構造の
ような、乱れた血流が起こる循環系の領域にアテローム性動脈硬化斑がよく生じ
るのは、ずれ応力(shear stress)が関与していると考えられている。
【０００４】 アテローム性動脈硬化斑の形成において最初に観察される現象は、血液由来の
単球が血管内皮層に付着して内皮下腔に移行するときに起こる。同時に隣接内皮
細胞が酸化された低密度リポタンパク質（LDL）を産生する。その後これらの酸
化型LDLは、単球の表面に発現されたスカベンジャー受容体を介して単球によっ
て大量に取り込まれる。調節された経路（これにより天然LDL（ｎLDL）がｎLDL
特異的受容体により取り込まれる）とは対照的に、取込みのスカベンジャー経路
は単球によって調節されない。
【０００５】 こうした脂質に富む単球は泡沫細胞(foam cell) と呼ばれ、脂肪線条(fatty s
treak)の主成分である。泡沫細胞とそれらを取り囲む内皮およびＳＭＣとの相互
作用は慢性の限局的炎症状態をもたらし、最終的には平滑筋細胞の増殖および移
動、そして繊維質の斑(plaque)の形成を引き起こす。この種の斑は血管を閉塞さ
せ、血液の流れを制限し、結果的に虚血を生じさせる。
【０００６】 虚血は不十分な灌流による器官組織への酸素供給の欠乏により特徴づけられる
症状である。このような不十分な灌流は多くの症状の自然因となり得、二三の名
を挙げると、アテローム性動脈硬化または再狭窄、貧血、卒中などである。多く
の医学的介入（例えばバイパス手術中の血流の遮断）も虚血をまねく。疾病状態
の心臓血管組織により時々引き起こされることに加えて、虚血は虚血性心疾患に
おけるように心臓血管組織に影響を及ぼすことがある。しかしながら、虚血は酸
素供給の欠乏という問題を抱えているどの器官でも起こり得る。
【０００７】 心臓における虚血の最も一般的な原因は、噴門上部の冠状動脈のアテローム性
動脈硬化である。これらの血管の内腔を狭めることにより、アテローム性動脈硬
化は基底状態の心筋灌流の絶対的低下を引き起こすか、または血流に対する要求
が増大するときには適切な灌流増加を制限することになる。冠状動脈の血流は、
動脈の血栓、痙攣、稀には冠状動脈の塞栓により、さらに梅毒性大動脈炎による
口狭窄によっても制限される。肺動脈からの左前下行冠状動脈の異常な起点のよ
うな先天異常は、幼児では心筋虚血や梗塞を引き起こすことがあるが、この原因
は成人では非常に稀である。また、高血圧や大動脈弁狭窄による重症の心室肥厚
におけるように、心筋の酸素要求が異常に増大したときにも心筋虚血が起こりう
る。大動脈弁狭窄は冠状動脈のアテローム性動脈硬化によって引き起こされるも
のと区別のつかない狭心症とともに存在する。極端に重度の貧血や一酸化炭素ヘ
モグロビンの存在におけるような、血液の酸素運搬能の低下は心筋虚血の原因と
しては稀である。それほど多くはないが、虚血の２以上の原因も同時に存在する
ことができ、例えば、左心室肥厚による酸素要求の増加と、冠状動脈のアテロー
ム性動脈硬化にとって二次的な酸素供給の低下が共存できるだろう。
【０００８】 虚血性アテローム性動脈硬化の治療に対する主要な外科的アプローチは、バイ
パス移植術、動脈内膜切除術および経皮経管冠状動脈形成術（PCTA）である。こ
れら外科的アプローチ後の再狭窄（閉塞が再び発生して、しばしば一層ひどくな
る）による失敗率は驚くほど高い（30〜50％）。再狭窄の多くはさらなる炎症、
平滑筋の蓄積および血栓によるものと思われる。
【０００９】 ブタの動脈再狭窄を遺伝子治療により治療するために、改良されたバルーン血
管形成術が採用された (Ohnoら, 1994, Science 265: 781-784) 。特殊なカテー
テルを使って、動脈閉塞部位の細胞にチミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする遺
伝子を担持する組換えアデノウイルスが導入された。続いて、ブタをガンシクロ
ビルで治療した。ガンシクロビルはＤＮＡに組み込まれたとき細胞を殺す毒性形
態にｔｋにより変換されるヌクレオシド類似体である。治療した動物は動脈壁の
厚さが50〜90％縮小し、いかなる局所または全身毒性も観察されなかった。
【００１０】 アテローム性動脈硬化および虚血における過度の炎症−線維増殖性応答の推定
される役割のために、多くの研究者らは、動脈損傷の概念において、炎症、細胞
漸増(cell recruitment)および増殖に関与するいくつかの因子の発現を研究して
きた。こうした因子としては、増殖因子、サイトカインおよび他の化学物質（細
胞漸増および移動、細胞増殖、脂質およびタンパク質の合成の制御に関与する脂
質類を含む）が挙げられる。
【００１１】 例えば、PDGF（血小板由来増殖因子）またはその受容体の発現が、動脈損傷の
修復中のラットで (Majesky ら, 1990, J. Cell Biol. 111: 2149); 酸化型LDL
で処置したヒト単球由来マクロファージの接着性培養物で (Maldenら, 1991, J.
Biol. Chem. 266: 13901); および流体ずれ応力を受けたウシ大動脈内皮細胞で
(Resnick ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4591-4595) 研究された
。IGF-I（インスリン様増殖因子−Ｉ）の発現はラット大動脈のバルーン脱内皮
化 (deendothelialization) 後に研究された (Cercekら, 1990, Circulation Re
search 66: 1755-1760) 。
【００１２】 その他の研究は、単球の接着を媒介する活性化内皮細胞の表面上の接着分子の
発現に集中していた。これらの接着分子としては、細胞内接着分子−１、ICAM-1
(Simmons ら, 1988, Nature, 331: 624-627) 、ELAM (Bevilacquaら, 1989, Sc
ience 243: 1160-1165; Bevilacquaら, 1991, Cell 67: 233) 、および血管細胞
接着分子、VCAM-1 (Osbornら, 1989, Cell 59: 1203-1211) があり、これらの表
面分子はすべてIL-1の存在下で転写的に誘導される。組織学的研究は、ICAM-1、
ELAMおよびVCAM-1がin vivo で病変部位の内皮細胞上に発現されることを明らか
にした (Cybulskyら, 1991, Science 251: 788-791; 1991, Arterioscler. Thro
mb. 11: 1397a; Poston ら, 1992, Am. J. Pathol. 140: 665-673)。VCAM-1とIC
AM-1は、培養下のウサギ動脈内皮ばかりでなく培養下のヒト回腸動脈内皮細胞に
おいて、リゾホスファチジルコリン（アテローム発生リポタンパク質の主要なリ
ン脂質成分）により誘導されることが示された (Kumeら, 1992, J. Clin. Inves
t. 90: 1138-1144) 。VCAM-1、ICAM-1およびクラスII主要組織適合性抗原は、ウ
サギ大動脈の損傷に応答して誘導されることが報告された (Tanakaら, 1993, Ci
rculation 88: 1788-1803)。
【００１３】 サイトメガロウイルス（CMV）は一般にアテローム性動脈硬化と同様に再狭窄
にも関与していることが示された (Speir ら, 1994, Science 265: 391-394) 。
CMVタンパク質IE84は、ｐ53（その活性形で腫瘍を抑制することが知られている
）と結合してそれを不活性化することにより、平滑筋細胞を再狭窄部位で明らか
に増殖しやすくすることが観察された。
【００１４】 前述の研究は、アテローム性動脈硬化斑を形成させる過度の炎症−線維増殖性
応答に関与すると予想された特定の遺伝子産物の役割を規定することにねらいを
定めていた。しかしながら、このようなアプローチでは病気の過程で関係のある
一そろいの遺伝子産物を同定することはできず、ましてや、さまざまな心血管疾
患の診断および治療の標的として機能しうるものを同定することなど及びもつか
ない。
【００１５】 ３．発明の概要 本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈
の炎症を含むがこれらに限らない、心血管疾患の治療および診断のための方法並
びに組成物に関する。詳細には、正常な状態または非心血管疾患の状態での遺伝
子発現に対して、心血管疾患の状態では示差的に発現される遺伝子が同定され、
記載される。さらに本発明は、このような診断的治療用途の一部として利用でき
る組成物を同定するためのスクリーニング法に関する。
【００１６】 本発明はさらに、線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患、特にTGF-β関連疾患の
治療および診断のための方法および組成物に関する。該疾患には、糖尿病性網膜
症、アテローム性動脈硬化症、新脈管形成、炎症、線維症、腫瘍増殖および血管
新生が含まれる。詳細には、正常な状態または非腫瘍形成疾患の状態での遺伝子
発現に対して、腫瘍形成疾患の状態では示差的に発現される遺伝子が同定され、
記載される。さらにまた本発明は、TGF-βシグナル伝達経路の活性化または増強
に関与する組成物を同定するためのスクリーニング法、ならびにこのような疾患
に対する診断および治療における該組成物の使用に関する。
【００１７】 本明細書中で用いる「活性化」(activation)とは、シグナル伝達経路または生
物学的応答における何らかの変化、例えば、基底レベルを超える増強、抑制状態
からの基底レベルの回復、および基底レベルを超える経路の刺激を表す。
【００１８】 本明細書中で用いる「示差発現」(differential expression) とは、遺伝子の
時間的および／または組織発現パターンの定量的および定性的差異を意味する。
示差発現される遺伝子は「フィンガープリント遺伝子」および／または「ターゲ
ット遺伝子」でありうる。本明細書中で用いる「フィンガープリント遺伝子」と
は、その発現パターンが心血管疾患の予後または診断評価の一部として利用され
得るか、または心血管疾患治療用化合物の同定方法に使用し得る示差発現遺伝子
のことである。本明細書中で用いる「ターゲット遺伝子」とは、ターゲット遺伝
子の発現レベルの調節またはターゲット遺伝子産物の活性の調節が心血管疾患の
症状を改善するように働くような、心血管疾患に関与する示差発現遺伝子のこと
である。ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子産物の活性を調節する
化合物は、心血管疾患の治療に使用することができる。
【００１９】 さらに、「パスウェイ遺伝子」(pathway gene)は、その遺伝子の産物が心血管
疾患に係わりのある他の遺伝子の産物と相互作用する能力により定義される。パ
スウェイ遺伝子はまた、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺
伝子の特徴を示すこともできる。本明細書中に記載する遺伝子は心血管疾患に関
して示差的に発現され、そして／また、それらの産物が心血管疾患にとって重要
な遺伝子産物と相互作用しうるが、別の心臓血管プロセスにとって重要なメカニ
ズムにそれらの遺伝子が関与していてもよい。
【００２０】 本発明は、このようなフィンガープリント、ターゲットおよびパスウェイ遺伝
子の産物、並びにこのような遺伝子産物に対する抗体を包含する。さらに、この
ような遺伝子産物が寄与しうる心血管疾患の細胞および動物を土台としたモデル
の遺伝子工学的作製および使用も記載される。
【００２１】 本発明は、心血管疾患、線維増殖性疾患および腫瘍形成関連疾患の症状の予後
判定および診断評価法、このような疾病に対する素因をもつ被験者の同定法を包
含する。さらに、本発明は、心血管疾患、線維増殖性疾患および腫瘍形成関連疾
患の治療の臨床試験に関係する薬物の効力を評価し、かつ患者の疾病の経過をモ
ニターする方法を提供する。
【００２２】 本発明はまた、心血管疾患に関係のある遺伝子の発現または遺伝子産物の活性
を調節する化合物の同定法、並びに心血管疾患の症状または傾向を示す個体にこ
の種の化合物を投与することを含んでなる心血管疾患の治療法を提供する。
【００２３】 本発明はまた、腫瘍形成および腫瘍の血管新生を含む、腫瘍形成疾患または線
維増殖性疾患に関与する遺伝子の発現または遺伝子産物の活性をモジュレートす
る化合物を同定するための方法を提供する。
【００２４】 本発明は、一部には、感度のよい高処理量の遺伝子発現アッセイと結びついた
in vivo およびin vitro心血管疾患パラダイムを巻き込んだ体系的な検索戦略に
基づいている。疾病の過程で何らかの役割を果たすと推定された所与の遺伝子産
物の発現を単に評価するだけのアプローチとは対照的に、ここで用いる検索戦略
およびアッセイは、既知であろうと新規であろうと、疾病状態で発現または抑制
されるあらゆる遺伝子の同定を可能にし、同時に疾病の進行中のそれらの時間的
調節および機能の評価を可能にする。この包括的なアプローチおよび評価は、新
規な遺伝子と遺伝子産物の発見のみならず、その疾病の病理学において主要な役
割を果たす新規な経路（パスウェイ）において関与する（新規であろうと既知で
あろうと）一そろいの遺伝子および遺伝子産物の同定を可能にする。かくして、
本発明は診断、モニター、合理的薬物スクリーニングおよびデザイン、および／
または他の治療的介入に有用な標的を規定することを可能にする。
【００２５】 ここに記載する実施例では５つの新規なヒト遺伝子が同定され、これらの遺伝
子は異なる心血管疾患の状態で示差発現されることが実証される。これらの遺伝
子の同定並びに特定の疾病状態でのそれらの発現の特性づけは、これらの遺伝子
の心血管疾患における新たな役割を認識させる。
【００２６】 具体的には、fchd531、fchd540およびfchd545が、ずれ応力を受けた内皮細胞
においてそれぞれ示差的に調節される新規遺伝子である。ずれ応力によって、fc
hd531およびfchd545は、それぞれダウンレギュレートされ、一方、fchd540はア
ップレギュレートされる。fchd602およびfchd605は、酸化型LDLで処理された単
球においてそれぞれアップレギュレートされる新規遺伝子である。したがって、
fchd531、fchd540、fchd545、fchd602およびfchd605の発現パターンに関する本
発明の発見に基づいて、診断、臨床試験におけるモニタリング、治療上有効な化
合物のスクリーニング、および心血管疾患の治療のための方法が提供される。
【００２７】 fchd540およびrchd534の双方は、層のずれ応力に応答してアップレギュレート
され、血管組織において特異的に発現する。fchd540もまた、本明細書において
、膵臓癌などの腫瘍形成関連疾患においてアップレギュレートされることが示さ
れる。さらに、膵臓におけるfchd540発現構築物の過剰発現は、この細胞におけ
るTGF-β応答の完全な喪失をもたらす。これらの発見とfchd540およびrchd534の
双方が特異的にTGF-βシグナル伝達を阻害するという観察結果ならびにいくつか
のヒト悪性疾患の病因に関係を有するヒトゲノム領域上にこれらの遺伝子が位置
するという観察結果を総合することにより、それらの遺伝子が、腫瘍形成および
血管新生を含む腫瘍形成疾患および線維増殖性疾患の治療における治療的介入の
ための優れたかつ特異的な標的であることが示される。
【００２８】 遺伝子fchd540、fchd602、およびfchd605の特徴的なアップレギュレーション
を用いて、心血管疾患治療戦略を計画することができる。疾病状態において原因
となる作用を有するアップレギュレートされたそれらの遺伝子については、特に
内皮細胞または単球におけるそれらの発現を低下または排除するように治療方法
を計画することができる。また、治療方法には、これらの遺伝子のタンパク質産
物の活性を阻害することが含まれる。防御効果を有するアップレギュレートされ
たそれらの遺伝子については、かかる遺伝子の産物の活性を高めるように治療方
法を計画することができる。
【００２９】 いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を越える発現を検出すること
が心血管疾患の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、
これらの遺伝子の発現レベルの低下は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し
、それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモ
ニターされ、治療される心血管疾患には、制限するものではないが、アテローム
性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。
【００３０】 fchd531およびfchd545の特徴的なダウンレギュレーションも、心血管疾患治療
戦略の計画に用いることもがきる。そのダウンレギュレーションが病原性作用を
有するそれらの遺伝子については、特に内皮細胞中でそれらの発現が回復または
増大するように治療方法を計画することができる。また、治療方法には、これら
の遺伝子のタンパク質産物の活性を増大させることが含まれる。そのダウンレギ
ュレーションが防御効果を有するそれらの遺伝子については、かかる遺伝子の産
物の量または活性を低下させるように治療方法を設計することができる。
【００３１】 いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を下回る発現を検出すること
が心血管疾患の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、
これらの遺伝子の発現レベルの増加は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し
、それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモ
ニターされ、治療される心血管疾患には、制限するものではないが、アテローム
性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。
【００３２】 本発明は、心血管疾患の治療用の化合物およびその他の物質を、本発明で開示
されたターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子のタンパク質産物の活性
を調節するそれらの能力をアッセイすることによりスクリーニングする方法を包
含する。さらに本発明は、線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患を治療するための
化合物およびその他の物質を、本明細書に記載したターゲット遺伝子の発現また
は該ターゲット遺伝子のタンパク質産物の活性をモジュレートするその能力をア
ッセイすることにより、スクリーニングする方法を包含する。そのようなスクリ
ーニング方法としては、限定するものではないが、ターゲット遺伝子タンパク質
産物と相互作用する（例えば、結合する）化合物およびその他の物質を同定する
ためのアッセイが挙げられる。
【００３３】 さらに、本発明は、ターゲット遺伝子産物の全活性を調節する化合物およびそ
の他の物質を投与することにより心血管疾患、線維増殖性疾患および腫瘍形成関
連疾患を治療する方法を包含する。化合物およびその他の物質は、ターゲット遺
伝子発現またはターゲットタンパク質活性のレベルのいずれかにおけるかかる調
節に影響を及ぼすことができる。
【００３４】 本発明は、一つには、rchd534タンパク質同士の、およびrchd534タンパク質と
fchd540タンパク質との新規タンパク質−タンパク質相互作用、ならびにrchd534
タンパク質またはfchd540タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路のその他のタン
パク質メンバーとの相互作用の同定に基づくものである。rchd534遺伝子は、本
出願人の1995年6月7日出願の同時係属出願第08/485,573号に記載されており、こ
れは、参照により本明細書に含まれるものである。それらのかかる相互作用を阻
害する能力をアッセイすることによって、心血管疾患の治療用の化合物およびそ
の他の物質を同定するためのスクリーニング方法が提供される。さらに、線維増
殖性疾患および腫瘍形成疾患の治療のための、rchd534もしくはfchd540遺伝子の
発現またはそれらの遺伝子産物の活性を調節することによりTGF-β応答を増大さ
せる化合物およびその他の物質を同定する方法が提供される。例えば、fchd540
の活性または発現の増大は、TGF-β応答を阻害することにより線維増殖性疾患お
よび腫瘍形成疾患に関与する。例えば、fchd540、rchd534またはその他のTGF-β
シグナル伝達タンパク質によって媒介される際のTGF-β応答を活性化または増強
する治療上の標的は、重要な用途を有する。さらに、心血管疾患を、これらのタ
ンパク質相互作用を阻害する化合物およびその他の物質を投与することによって
治療する方法が提供される。
【００３５】 本発明は、一つには、そのタンパク質産物がTGF-β応答を阻害する２つの遺伝
子rchd534およびrchd540の内皮細胞特異的発現パターンの同定に基づくものであ
る。fchd540遺伝子は、いくつかのヒト悪性疾患の病因に関係している、ヒトゲ
ノム領域にマッピングされている。さらに本発明は、これらの遺伝子およびその
突然変異を使用して、内皮細胞におけるTGF-β誘導シグナル伝達をモジュレート
しうるという発見に基づく。したがって、rchd534およびrchd540遺伝子は、限定
するものではないが、癌血管形成、炎症、および線維症などの血管新生に関連す
る疾患、腫瘍形成関連疾患を含む、内皮細胞が関与する種々の炎症性障害および
線維増殖性障害における介入の標的であり得る。
【００３６】 細胞外ドメインを含む、膜に結合したターゲット遺伝子産物は、治療法、診断
法および臨床モニター法にとって特に有用な標的でありうる。例えば、fchd602
遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、この膜貫通タンパク質は多数の膜貫通ド
メインを含むため、細胞表面で他の化合物と容易に接触することができる。した
がって、fchd602遺伝子産物と結合する天然リガンド、天然リガンドの誘導体お
よび抗体は、その活性を抑制するために、あるいはその遺伝子を発現する細胞を
特異的に破壊するために使用することができる。さらに、fchd602遺伝子産物の
細胞外ドメインは、fchd602遺伝子産物と結合する化合物を同定するための特別
に効率のよいスクリーニング系の設計を可能とするための標的を提供する。
【００３７】 また、このようなアッセイ系は、fchd602 遺伝子産物とfchd602 遺伝子産物に
結合するリガンドとの相互作用のアンタゴニストをスクリーニングして同定する
にも使用され得る。例えば、これらの化合物はfchd602 遺伝子産物の内因性（す
なわち、天然の）リガンドと結合することでおとり(decoy)として作用すること
ができる。こうして、リガンドと結合したfchd602 遺伝子膜貫通タンパク質の量
の低下は、疾病状態にある単球のような細胞の活性を調節するだろう。fchd602
遺伝子産物の可溶性タンパク質またはペプチド（例えば、１以上の細胞外ドメイ
ンを含むペプチド）、またはfchd602 遺伝子産物の一部および／またはその類似
体（例えば、Ｉｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含
む）は、この目的のために特に有用でありうる。
【００３８】 同様に、fchd602 産物の１以上の細胞外ドメインに特異的な抗体は、診断試験
または臨床試験モニターにおけるこのターゲット遺伝子産物の簡便な検出を可能
にする。したがって、内皮細胞をこのような標識抗体でin vivo またはin vitro
のいずれかで処理することで、内皮細胞の疾病状態を判定することができる。fc
hd602 遺伝子産物は疾病状態の単球においてアップレギュレートされるので、そ
の検出は心血管疾患と正の相関関係にある。
【００３９】 上記のfchd602 遺伝子産物を用いる治療法、診断法および臨床試験モニター法
はまた、fchd545（多くの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインをコードする）
を含むがこれらに限らない膜貫通遺伝子産物をコードする他のターゲット遺伝子
にも応用できる。
【００４０】 以下の第６および７節に示した実施例では、心血管疾患のターゲット遺伝子を
同定するための本発明の心血管疾患パラダイムの使用を示す。
【００４１】 以下の第８節に示した実施例では、診断法におけるフィンガープリント遺伝子
の使用、並びに基礎研究および臨床試験で候補薬剤の効力を試験するための代理
マーカーとしてのフィンガープリント遺伝子の使用を示す。
【００４２】 以下の第９節に示した実施例では、疾病状態の心臓血管組織のイメージングに
おけるフィンガープリント遺伝子、特にfchd545 、の使用を示す。
【００４３】 下記の第11節の実施例は、２つの遺伝子産物、rchd534タンパク質およびfchd5
40タンパク質の相互作用、さらに腫瘍形成、新脈管形成、心血管疾患およびTGF-
βシグナル伝達経路におけるそれらの役割の特性付けを示すものである。
【００４４】 以下の第13節に示す実施例は、fchd540が膵臓癌などの腫瘍形成関連疾患にお
いて過剰発現可能であることを表し、膵臓細胞系におけるfchd540構築物の過剰
発現はTGF-β応答の完全な喪失をもたらすことを示す。
【００４５】 ４．図面の説明 以下図面の簡単な説明の記載を参照されたい。
【００４６】 ５．発明の説明 アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流(reperfusion) 、高血圧、再狭窄、お
よび動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心血管疾患の診断および治療の
ための方法および組成物が記載される。腫瘍形成および腫瘍の血管新生を含む腫
瘍形成関連疾患の治療のための方法および組成物もまた記載される。本発明は、
症状に生理的に関連するパラダイムにおいて示差的に発現される全ての遺伝子の
発現および役割の評価に一部基いている。これは疾病経路の特定並びに診断上お
よび治療上の両方に有益である該経路における標的の同定を可能にする。
【００４７】 正常な状態または非心血管疾患の状態におけるそれらの発現に対して、心血管
疾患の状態で示差的に発現される“ターゲット遺伝子" および／または“フィン
ガープリント遺伝子" と称される遺伝子は、5.4 節に記載される。更に、遺伝子
産物が心血管疾患に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す“パスウェイ
遺伝子" と称される遺伝子がまた5.4 節に記載される。パスウェイ遺伝子は更に
フィンガープリントおよび／またはターゲット遺伝子特性を更に有していてもよ
い。このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパスウェ
イ遺伝子の同定方法が5.1 節、5.2 節、および5.3 節に記載される。
【００４８】 更に、このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパス
ウェイ遺伝子の遺伝子産物が5.4.2 節に記載され、このような遺伝子産物の抗体
が5.4.3 節に記載され、同様に、このような遺伝子産物が寄与し得る心血管疾患
および腫瘍形成関連疾患の細胞をベースとするモデルおよび動物をベースとする
モデルが5.4.4 節に記載される。
【００４９】 心血管疾患、腫瘍形成を含む腫瘍形成関連疾患および線維増殖性疾患に関係す
る遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定方法が5.5 節に
記載される。臨床試験中の化合物の効力のモニタリング方法が5.5.4 節に記載さ
れる。更に、心血管疾患および腫瘍形成関連疾患の治療方法が5.6 節に記載され
る。
【００５０】 また、この疾病の疾病素質を示す被験者の同定を含む、心血管疾患の予後判定
方法および診断評価方法、および心血管疾患の状態のイメージングが5.8 節に説
明される。
【００５１】 5.1. 示差的に発現される遺伝子の同定 この節は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄、および
動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心血管疾患に関係する遺伝子の同定
方法を記載する。このような遺伝子は、正常な状態、または非心血管疾患状態に
おけるそれらの発現に対し心血管疾患状態で示差的に発現される遺伝子に相当し
得る。このような示差的に発現される遺伝子は「ターゲット」遺伝子および／ま
たは“フィンガープリント”遺伝子に相当し得る。このような示差的に発現され
る遺伝子の同定方法がこの節で以下に記載される。このような示差的に発現され
る遺伝子の更なる特性決定方法、およびターゲット遺伝子および／またはフィン
ガープリント遺伝子としてのそれらの同定方法が5.3 節に示される。
【００５２】 本明細書に使用される“示差的発現" は、遺伝子の時間的および／または組織
発現パターンの定量的差異並びに定性的差異の両方を表す。こうして、示差的に
発現される遺伝子は正常な状態vs心血管疾患状態（例えば、酸化LDL で処理vs未
処理）で、または対照状態vs実験状態下で活性化または完全に不活化されたその
発現を有し得る。このような定性的に調節された遺伝子は対照または心血管疾患
被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得ない所定の組織内または細
胞型内の発現パターンを示すであろう。また、このような定性的に調節された遺
伝子は、対照または実験被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得な
い所定の組織内または細胞型内の発現パターンを示すであろう。本明細書に使用
される「検出し得る」は、示差的ディスプレイ、逆転写酵素-(RT-)PCR および／
またはノーザン分析（これらは当業者に周知である）の通常の技術により検出し
得るＲＮＡ発現パターンを表す。
【００５３】 また、示差的に発現される遺伝子は、正常な状態vs心血管疾患状態で、または
対照状態vs実験状態下で、調節された、すなわち、定量的に増加または減少され
たその発現を有し得る。発現が正常な状態vs心血管疾患状態または対照状態vs実
験状態で異なる程度は、通常の特性決定技術、例えば、以下に記載される示差的
ディスプレイ技術により視覚化されるのに充分に大きいことのみを必要とする。
発現の差異が視覚化し得るその他のこのような通常の特性決定技術として、定量
的RT-PCRおよびノーザン分析が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】 示差的に発現される遺伝子はターゲット遺伝子および／またはフィンガープリ
ント遺伝子として更に記載し得る。本明細書に使用される「フィンガープリント
遺伝子」は、その発現パターンが予後判定または診断の心血管疾患評価の一部と
して利用されてもよく、または心血管疾患の治療に有益な化合物の同定方法に使
用されてもよい示差的に発現される遺伝子を表す。また、フィンガープリント遺
伝子はターゲット遺伝子の特徴を有していてもよい。
【００５５】 本明細書に使用される「ターゲット遺伝子」は、ターゲット遺伝子発現のレベ
ルまたはターゲット遺伝子産物活性のレベルの調節が心血管疾患の症状を改善す
るように作用し得る様式で心血管疾患に関与する示差的に発現される遺伝子を表
す。また、ターゲット遺伝子はフィンガープリント遺伝子の特徴を有していても
よい。
【００５６】 種々の方法が心血管疾患に関係する遺伝子の同定に利用し得る。これらの方法
として、5.1.1 節に記載される実験パラダイムが挙げられるが、これに限定され
ない。パラダイムからの物質が5.1.2 節に記載される示差的に発現される遺伝子
配列の存在について特性決定され得る。
【００５７】 5.1.1. 示差的に発現される遺伝子の同定に関するパラダイム 心血管疾患に関係する遺伝子を同定するための一つの戦略は、疾病状態vs非疾
病状態に関連する状態のもとに示差的に発現される遺伝子を検出することである
。下記の分節は、このような示差的に発現される遺伝子を検出するのに使用し得
る、パラダイムと称される、幾つかの実験系を記載する。一般に、パラダイムは
、このような疾病に関連する治療を欠いている少なくとも一つの実験対照状態に
加えて、被験者またはサンプルが心血管疾患と関連する方法で治療される、少な
くとも一つの実験状態を含む。示差的に発現される遺伝子は、実験状態と対照状
態の間で遺伝子発現のパターンを比較することにより、本明細書に以下に記載さ
れるように、検出される。
【００５８】 特定の遺伝子が一つのこのようなパラダイムの使用により一旦同定されると、
その発現パターンが異なるパラダイムでその発現を研究することにより更に特性
決定され得る。遺伝子は、例えば、所定のパラダイムで一つの方法（例えば、ア
ップレギュレーション）で調節されてもよいが、或る別のパラダイムで異なって
（例えば、ダウンレギュレーション）調節されてもよい。更に、異なる遺伝子が
一つのパラダイムで同様の発現パターンを有していてもよいが、それらのそれぞ
れの発現パターンが異なるパラダイムのもとで互いに異なっていてもよい。複数
のパラダイムのこのような使用は心血管疾患における特定の遺伝子の役割および
相対的重要性を区別するのに有益であるかもしれない。
【００５９】 5.1.1.1. 泡沫細胞パラダイム−１ 例えば、アテローム性動脈硬化症に関係する示差的に発現される遺伝子の同定
に利用し得るパラダイムの中に、泡沫細胞形成に関係し得る遺伝子を分析するよ
うに設計されたパラダイムがある。このようなパラダイムはこの細胞型の分化、
または酸化LDL のそれらの摂取に関係する遺伝子を同定するのに利用し得る。
【００６０】 このようなパラダイムの一実施態様が、以下パラダイムＡと称され、次のよう
にして行われる。最初に、ヒト血液を採取し、末梢単球を当分野でルーチンに実
施される方法により単離する。次にこれらのヒト単球は直ちに使用してもよく、
または５〜９日にわたって、当分野でルーチンに実施される方法を使用して、in
vitroで培養してもよく、この場合、それらはスカベンジャー受容体のアップレ
ギュレーションの如きマクロファージ様特性を発現する。次にこれらの細胞を泡
沫細胞形成に関係すると考えられる薬剤で種々の時間の長さにわたって処理する
。これらの薬剤として、酸化LDL 、アセチル化LDL 、リゾホスファチジルコリン
、およびホモシステインが挙げられるが、これらに限定されない。処理されない
か、または天然LDL で処理された対照単球を平行して増殖させる。試験薬剤の添
加後の或る時点で、細胞を回収し、以下の5.1.2.節に詳しく記載されるようにし
て示差的発現について分析する。以下の６節に示される実施例は、処理された細
胞vs対照細胞中で示差的に発現される遺伝子を同定するためのこのような泡沫細
胞パラダイムの使用を詳しく実証する。
【００６１】 5.1.1.2. 泡沫細胞パラダイム−２ アテローム性動脈硬化症と関連する示差的に発現される遺伝子を検出するため
の単球を必要とする別のパラダイムは移行(transmigration)現象の刺激を伴う。
単球が動脈損傷に遭遇する時、それらは血管内皮層に付着し、この層を横切って
移行し、内皮と動脈を取り囲む平滑筋細胞の層の間に位置を定める。この現象は
、例えば、ヒト臍帯から単離された内皮細胞の層を培養することによりin vitro
で模擬し得る。内皮単層が一旦形成すると、末梢血から採取された単球をLDL の
存在下および不在下で内皮の上で培養する。数時間後に、単球は内皮を通って移
行し、LDL に露出された３〜５日後に泡沫細胞に発達する。この系では、in viv
o のように、内皮細胞がLDL の酸化を行い、次にこれが単球により吸収される。
以下の5.1.2.節に記載されるように、次に遺伝子発現のパターンがこれらの泡沫
細胞と未処理単球の間で比較される。
【００６２】 5.1.1.3. 泡沫細胞パラダイム−３ 更に別の系は第三の細胞型、すなわち、アテローム発生に重要な役割を果たす
平滑筋細胞を含む（Navab ら, 1988, J.Clin.Invest., 82:1853)。この系では、
ヒト大動脈平滑筋細胞の多層を天然コラーゲンのゲル層で覆われたミクロポアー
フィルター上で増殖させ、ヒト大動脈内皮細胞の単層をコラーゲン層の上で増殖
させる。走化性因子rFMLP の存在下でのヒト単球へのこの共培養物の露出は、内
皮細胞への単球付着、続いて内皮単層を横切って内皮下腔のコラーゲン層への移
行をもたらした。また、この型の培養物はLDL で処理すると泡沫細胞を生じるこ
とができる。次に泡沫細胞を回収して、遺伝子発現のそれらのパターンを5.1.2.
節に以下に説明されるように未処理細胞のパターンと比較する。
【００６３】 5.1.1.4. in vivo 単球パラダイム 以下パラダイムＢと称される、単球の研究のためのこのようなパラダイムの別
の実施態様は、脂質消費の食事管理によるヒト被験者の示差的治療を伴う。この
ようなヒト被験者を３週間にわたって低脂肪／低コレステロール食に保ち、その
時点で血液を採取し、単球を当分野でルーチンに実施される方法に従って単離し
、ＲＮＡを以下の5.1.2.節に記載されるようにして精製する。これらの同一患者
を続いて高脂肪／高コレステロール食に切り換え、単球ＲＮＡを再度精製する。
また、患者に高脂肪／低コレステロールを含む第三の組み合わせ食を支給しても
よく、単球ＲＮＡをもう一度精製してもよい。患者が食事を受ける順序を変えて
もよい。次いで２種の食事、または３種全ての食事で管理された患者に由来する
ＲＮＡを比較し、5.1.2.節に以下に説明するように示差的遺伝子発現について分
析することができる。
【００６４】 5.1.1.5. 内皮細胞−IL-1パラダイム 単球中の示差的遺伝子発現の検出に加えて、内皮細胞に焦点を合わせたパラダ
イムが心血管疾患に関係する遺伝子を検出するのに使用し得る。以下パラダイム
Ｃと称される、一つのこのようなパラダイムでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC
)をin vitro で増殖させる。アテローム性動脈硬化症状に関係する生理条件を模
擬するために、炎症反応に関係することが知られている因子であるヒトIL-1βで
実験培養物を処理する。また、実験HUVEC 培養物はアテローム発生性リポタンパ
ク質の主要リン脂質成分であるリゾホスファチジルコリンまたは酸化ヒトLDL で
処理してもよい。対照培養物はこれらの化合物の不在下で増殖させる。
【００６５】 露出処理の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2.節
に記載されるように示差的遺伝子発現について分析する。
【００６６】 5.1.1.6. 内皮細胞−ずれ応力パラダイム 以下パラダイムＤと称される、内皮細胞を必要とする別のパラダイムでは、培
養物を流体ずれ応力に露出するが、流体ずれ応力は異常な循環流の領域における
アテローム性動脈硬化病変の広がりの原因であると考えられる。また、異常な血
流は虚血／再灌流の有害な作用においてある役割を果たし、虚血はその障害が克
服される時に、不十分な血液供給を受けている器管が過剰に多量の血液で急激に
再灌流される。
【００６７】 培養HUVEC 単層は、液体培地を含む特殊装置(Nagelら, 1994, J.Clin.Invest.
94: 885-891) 中で培養物を回転させることにより層状ずれ応力に露出される。
同一培地中で増殖させた静的培養物が対照として利用できる。ずれ応力への露出
の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2 節に記載され
るように示差的遺伝子発現について分析する。以下の９節に示された実施例は、
露出細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこのようなず
れ応力を受けた内皮細胞パラダイムの使用を実証する。
【００６８】 5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に上記されたパラダイムを含むが、これらに限定され
ない、心血管疾患に関係する遺伝子を同定するために設計された全てのこのよう
なパラダイムでは、その疾病症状に対する改善作用を有することが知られている
薬剤の如き化合物が実験系に含まれてもよい。このような化合物は既知治療薬、
並びに有害な副作用のために治療薬として有用ではない化合物を含んでもよい。
5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に記載されたパラダイムに説明されるように培養される
試験細胞は、例えば、これらの化合物の一つに露出され、以下の5.1.2 節に記載
される方法に従って未処理細胞に対する示差的遺伝子発現について分析されても
よい。原理的に、特定のパラダイムに従って、その疾病に関係するあらゆる細胞
型をこれらの化合物により疾病プロセスのあらゆる段階で治療することができる
。
【００６９】 また、試験細胞は、その疾病に関係しないかもしれない遺伝子発現に関する全
般的作用をスクリーニングするために、その化合物でまた治療される無関係の細
胞（例えば、繊維芽細胞）と比較されてもよい。このような全般的作用は、その
化合物による治療後に試験細胞および無関係の細胞に共通である遺伝子発現の変
化により顕在化し得る。
【００７０】 これらの方法により、これらの化合物が作用する遺伝子および遺伝子産物が同
定され、心血管疾患治療用の新規な治療化合物を同定するために以下に記載され
るアッセイで使用される。
【００７１】 5.1.2. パラダイム物質の分析 示差的に発現される遺伝子を同定するために、この節に先に記載されたような
パラダイムに利用された被験者の一つ以上の組織から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを
単離する。ＲＮＡサンプルは実験被験者の組織および対照被験者の相当する組織
から得られる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しないＲＮＡ単離技術はどれもこの
ようなＲＮＡサンプルの精製に利用し得る。例えば、Sambrookら, 1989, Mol-ec
ular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. 、およ
びAusubel, F.M. ら編集, 1987-1993, Current Protocols in Molecular Bio-lo
gy, John Wiley＆Sons, Inc. New York(これらの両方が参考として本明細書にそ
のまま含まれる）を参照のこと。更に、多数の組織サンプルが、当業者に公知の
技術、例えば、Chomczynski, P. (1989,米国特許第4,843,155 号)(これが参考と
して本明細書にそのまま含まれる）の単一工程ＲＮＡ単離方法を使用して容易に
処理し得る。
【００７２】 示差的に発現される遺伝子により産生されたＲＮＡに相当する回収されたＲＮ
Ａサンプル中の転写産物は、当業者に公知である種々の方法を利用することによ
り同定し得る。例えば、示差的スクリーニング(Tedder, T.F. ら, 1988, Proc.N
atl.Acad.Sci. USA 85:208-212) 、サブトラクティブハイブリダイゼーション(H
edrick, S.M.ら, 1984, Nature 308:149-153; Lee,S.W.ら, 1984, Proc.Natl.Ac
ad.Sci. USA 88:2825)、および、好ましくは、示差的ディスプレイ(Liang,P. 、
およびPardee,A.B., 1993,米国特許第5,262,311 号（これが参考として本明細書
にそのまま含まれる))が、示差的に発現される遺伝子に由来する核酸配列を同定
するのに利用し得る。
【００７３】 示差的スクリーニングは、ライブラリーの一つのコピーが一つの細胞型のｍＲ
ＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブでスクリーニングされ、一方、ｃＤ
ＮＡライブラリーの重複コピーが第二細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全ｃＤＮ
Ａプローブでスクリーニングされる、ｃＤＮＡライブラリーの重複スクリーニン
グを伴う。例えば、一つのｃＤＮＡプローブが対照被験者に由来する細胞型の全
細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよく、一方、第二ｃＤＮＡプローブが実験被
験者に由来する同一細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよい。一つの
プローブにハイブリダイズするが、他のプローブにハイブリダイズしないクロー
ンは、対照被験者vs実験被験者の関心のある細胞型中で示差的に発現される遺伝
子に由来するクローンである可能性がある。
【００７４】 サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は２種の異なる起源、例えば、
対照組織および実験組織から採取されたｍＲＮＡの単離、ｍＲＮＡまたは単離さ
れたｍＲＮＡから逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、およ
び全てのハイブリダイズされ、それ故、二本鎖となった配列の除去を一般に伴う
。残りのハイブリダイズされなかった、一本鎖のｃＤＮＡは、２種のｍＲＮＡ起
源中で示差的に発現される遺伝子に由来するクローンである可能性がある。次に
このような一本鎖ｃＤＮＡが示差的に発現される遺伝子から誘導されるクローン
を含むライブラリーの構築のために出発物質として使用される。
【００７５】 示差的ディスプレイ技術は、示差的に発現される遺伝子に由来する配列の同定
を可能にする公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR; Mullis, K.B., 1987,米国特許
第4,683,202 号に示された実験実施態様）を利用する方法を記載している。最初
に、単離されたＲＮＡが、当業者に公知である通常の技術を利用して、一本鎖ｃ
ＤＮＡに逆転写される。逆転写酵素反応のプライマーとして、好ましくは以下に
記載されるオリゴヌクレオチドのリバースプライマー型の、オリゴdTを含むプラ
イマーが挙げられるが、これに限定されない。次に、この技術は、所定の細胞内
に存在するＲＮＡ転写産物のランダムサブセットを提示するクローンの増幅を可
能にする、下記のPCR プライマーの対を使用する。異なる対のプライマーの利用
は、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写産物のそれぞれが増幅されることを可能にす
る。このような増幅された転写産物の中で、示差的に発現される遺伝子から生じ
た転写産物が同定され得る。
【００７６】 プライマー対のリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、その5'末端に、好
ましくは11ヌクレオチドの長さの、ヌクレオチドのオリゴdTストレッチを含むこ
とができ、これがｍＲＮＡのpoly(A) テイルまたはｍＲＮＡpoly(A) テイルから
逆転写されたｃＤＮＡの相補体にハイブリダイズする。第二に、リバースプライ
マーの特異性を増大するために、プライマーはその3'末端に一つ以上、好ましく
は二つの付加的なヌクレオチドを含むことができる。統計上、対象のサンプル中
に存在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみがこのようなプライマーに
ハイブリダイズするので、付加的なヌクレオチドはプライマーに該サンプル中に
存在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみを増幅させる。これは、それ
が増幅された配列に相当するバンドのそれぞれのより一層状正確かつ完全な視覚
化および特性決定を可能にする点で好ましい。
【００７７】 フォワードプライマーは、対象の組織に由来するｃＤＮＡ配列にハイブリダイ
ズする能力を有することが統計上期待されたヌクレオチド配列を含むことができ
る。そのヌクレオチド配列は任意の配列であってもよく、フォワードオリゴヌク
レオチドプライマーの長さは約９〜約13のヌクレオチドの範囲であってもよく、
約10のヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列は、生成される増幅され
た部分ｃＤＮＡの長さを可変にし、こうして通常の変性配列決定用ゲル電気泳動
を使用することにより異なるクローンを分離させる。増幅産物の収率および特異
性を最適化し、更に、通常のゲル電気泳動技術を利用して分割され得る長さの増
幅産物を生じるようなPCR 反応条件が選ばれるべきである。このような反応条件
は当業者に公知であり、重要な反応パラメーターとして、例えば、先に説明され
たオリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌクレオチド配列、並びにアニー
リングおよび伸長工程の温度および反応時間が挙げられる。
【００７８】 ２種の異なる細胞型のｍＲＮＡの逆転写および増幅から得られるクローンのパ
ターンが配列決定用ゲル電気泳動により表示され、比較される。２種のバンド形
成パターンの差異が示差的に発現される遺伝子を潜在的に示す。
【００７９】 示差的に発現される可能性がある遺伝子配列がバルク技術、例えば、上記の技
術により一旦同定されたら、このような推定上の示差的に発現される遺伝子の示
差的発現が確証されるべきである。確証は、例えば、ノーザン分析および／また
はRT- PCR の如き公知技術により行い得る。
【００８０】 確証後に、示差的に発現される遺伝子が更に特性決定されてもよく、以下の5.
3 節に説明されるようにターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺
伝子として同定され得る。
【００８１】 また、例えば、示差的ディスプレイにより得られた示差的に発現される遺伝子
の増幅配列が、対応する遺伝子の完全長クローンを単離するのに使用されてもよ
い。遺伝子の完全長コード部分は、当分野で公知の分子生物学的技術により、過
度の実験をしないで、容易に単離し得る。例えば、単離された示差的に発現され
た増幅断片が標識され、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用さ
れてもよい。また、標識断片がゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使
用されてもよい。
【００８２】 また、PCR 技術が完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用されてもよい。この
節に上記されたように、示差的ディスプレイにより得られた単離された、増幅さ
れた遺伝子断片は遺伝子内の或るランダムな位置に5'末端を有し、また好ましく
は遺伝子の転写部分の3'末端に相当する位置に3'末端を有する。増幅断片からの
ヌクレオチド配列情報が一旦得られると、遺伝子の残部（すなわち、示差的ディ
スプレイを利用する場合には、遺伝子の5'末端）が、例えば、RT-PCRを使用して
得ることができる。
【００８３】 完全長遺伝子配列の同定およびクローニングのためのこのような操作の一実施
態様では、ＲＮＡが適当な組織または細胞起源から通常の操作に従って単離し得
る。次に逆転写反応が、第一鎖合成のプライミングのために、増幅断片に対応す
るｍＲＮＡに相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡについて
行われてもよい。プライマーはｍＲＮＡに逆行性であるので、伸長はｍＲＮＡの
5'末端に向かって進行するであろう。次に得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
が、通常の末端トランスフェラーゼ反応を使用してグアニンで“テイルド(taile
d)”されてもよく、そのハイブリッドがRNAase Hで消化されてもよく、次に第二
鎖合成がpoly-Cプライマーで開始されてもよい。２種のプライマーを使用して、
遺伝子の5'部分が、PCR を使用して増幅される。次に得られた配列が単離され、
先に単離された配列で組換えられて、本発明の示差的に発現される遺伝子の完全
長ｃＤＮＡを生成し得る。クローニング戦略および組換えＤＮＡ技術の総説につ
いて、例えば、Sambrookら, 1989, 上記文献、およびAusubel ら, 1989, 上記文
献を参照のこと。
【００８４】 5.2. パスウェイ遺伝子の同定 この節は、心血管疾患に関係する、「パスウェイ遺伝子」と称される、遺伝子
の同定方法を記載する。本明細書に使用される「パスウェイ遺伝子」は、その遺
伝子産物が心血管疾患に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を
表す。パスウェイ遺伝子は示差的に発現され、それ故、ターゲット遺伝子および
／またはフィンガープリント遺伝子の特性を更に有し得る。
【００８５】 タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した方法が、心血管疾患に
関係することが知られている遺伝子産物と遺伝子産物との相互作用を同定するこ
とによりパスウェイ遺伝子産物を同定するのに使用し得る。このような既知の遺
伝子産物は細胞タンパク質または細胞外タンパク質であってもよい。このような
既知の遺伝子産物と相互作用する遺伝子産物はパスウェイ遺伝子産物に相当し、
またそれらをコードする遺伝子がパスウェイ遺伝子に相当する。
【００８６】 使用し得る従来の方法の中に、同時免疫沈殿、架橋および勾配カラムまたはク
ロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。これらのような操作の利用はパ
スウェイ遺伝子産物の同定を可能にする。一旦同定されると、パスウェイ遺伝子
産物は、通常の技術と連係して、その対応するパスウェイ遺伝子を同定するのに
使用し得る。例えば、パスウェイ遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部が
、エドマン分解技術（例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Mo
lecular Principles, W.H.Fre-eman＆Co., N.Y., 34-49頁を参照のこと）による
ような当業者に公知の技術を使用して確かめられてもよい。得られたアミノ酸配
列は、パスウェイ遺伝子配列のスクリーニングに使用し得るオリゴヌクレオチド
混合物の生成のためのガイドとして使用し得る。行われるスクリーニングは、例
えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR 技術により達成し得る。オ
リゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングに関する技術は公知である
（例えば、Ausubel ら, 上記文献、およびPCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications, 1990, Innis, M. ら編集, Academic Press, Inc., New York
を参照のこと) 。
【００８７】 更に、心血管疾患に関係するタンパク質と相互作用するタンパク質をコードす
るパスウェイ遺伝子の同時同定をもたらす方法が使用し得る。これらの方法は、
例えば、λgt11ライブラリーの抗体検索の公知技術と同様の方法でこのタンパク
質を使用して、発現ライブラリーを心血管疾患に関係することが知られ、または
示唆される標識タンパク質で検索することを含む。
【００８８】 in vivo でタンパク質相互作用を検出する一つのこのような方法、ツーハイブ
リッド系が、限定のためではなく、例示のみのために詳しく記載される。この系
の一つの別型が記載されており（Chien ら, 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88
: 9578-9582)、Clontech (Palo Alto, CA)から市販されている。
【００８９】 簡単に言えば、このような系を利用して、二つのハイブリッドタンパク質をコ
ードするプラスミドが構築される。一つは既知タンパク質に融合された転写アク
チベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、他方がｃＤＮＡライブラ
リーの一部としてこのプラスミドに組換えられたｃＤＮＡによりコードされる未
知タンパク質に融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる
。プラスミドは、調節領域がアクチベーターの結合部位を含むリポーター遺伝子
（例えば、lacZ) を含む酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cer
evisiae)の株に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではリ
ポーター遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド（それは活性化機能を提供し
ないから）および活性化ドメインハイブリッド（それはアクチベーターの結合部
位に局在化することができないから）の転写を活性化することができない。２種
のタンパク質の相互作用は機能性アクチベータータンパク質を再構成し、リポー
ター遺伝子の発現をもたらし、これがリポーター遺伝子産物に関するアッセイに
より検出される。
【００９０】 ツーハイブリッド系または関連方法が、既知「餌(bait)」遺伝子タンパク質と
相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニング
するのに使用し得る。全ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコ
ードするＤＮＡに融合されてもよい。このようなライブラリーおよびＤＮＡ結合
ドメインに融合された餌遺伝子タンパク質のハイブリッドをコードするプラスミ
ドが酵母リポーター株に同時形質転換され、得られる形質転換体がリポーター遺
伝子を発現する形質転換体についてスクリーニングし得る。これらのコロニーが
精製され、リポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドが単離し得る。
次にＤＮＡ配列決定が、ライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質
を同定するのに使用し得る。
【００９１】 例えば、限定のためではなく、餌遺伝子は、それがGAL4タンパク質のＤＮＡ結
合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳融合されるようにベクターにクローン化し
得る。また、例えば、心血管疾患に関係する遺伝子の単離について、心血管疾患
にある種の役割を果たすことが知られ、または示唆されている既に単離された遺
伝子が餌遺伝子として使用し得る。これらとして、二三名を挙げると、bFGF、IG
F-I 、VEGF、IL-1、M-CSF 、TGF-β、TGF-α、TNF-α、HB-EGF、PDGF、IFN-γ、
およびGM-CSFがあるが、これらに限定されない。
【００９２】 餌遺伝子と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のｃＤＮＡライブラリ
ーが、当分野でルーチンに実施される方法を使用してつくられる。本明細書に記
載された特別な系によれば、例えば、ｃＤＮＡ断片が、それらがGAL4の活性化ド
メインに翻訳融合されるようにベクターに挿入し得る。このライブラリーが餌遺
伝子-GAL4 融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターにより
誘導されたlacZ遺伝子を含む酵母株に同時形質転換し得る。餌遺伝子と相互作用
する、GAL4活性化ドメインに融合された、ｃＤＮＡコードされたタンパク質が活
性GAL4タンパク質を再構成し、それによりlacZ遺伝子の発現を誘導するであろう
。lacZを発現するコロニーがX-gal の存在下でそれらの青色により検出し得る。
次にｃＤＮＡがこれらの株から精製され、当分野でルーチンに実施される技術を
使用して餌遺伝子相互作用タンパク質を生成し、単離するのに使用し得る。
【００９３】 パスウェイ遺伝子が同定され、一旦単離されると、それは、例えば、以下の5.
3 節に説明されるように更に特性決定し得る。
【００９４】 酵母タンパク質複合体検出システムの使用についての好ましい実施態様は、以
下の12節の実施例に詳細に記載されている。12節に記載されるように、酵母タン
パク質複合体検出システムは、２つのターゲット遺伝子(rchd534およびfchd540)
のタンパク質産物の相互作用を検出するために用いた。
【００９５】 5.3. 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の特性決定 示差的に発現される遺伝子、例えば、上記の5.1.1 節に説明された方法により
同定された遺伝子、パスウェイ遺伝子、例えば、上記の5.2 節に説明された方法
により同定された遺伝子、並びに別の手段により同定された遺伝子は、例えば、
本明細書に説明されたような方法を利用することにより更に特性決定し得る。こ
のような遺伝子が本明細書中「同定された遺伝子」と称される。
【００９６】 本明細書に記載された分析の如き分析が同定された遺伝子の生物学的機能に関
する情報をもたらすであろう。加えて、示差的に発現される遺伝子の生物学的機
能の評価が、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子として
のそれらの指定を可能にするであろう。詳しくは、更なる特性決定が、遺伝子の
発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心血管疾患を回復し得ることを示す
、示差的に発現される遺伝子のいずれかが、上記5.1 節に特定されたような「タ
ーゲット遺伝子」と指定されるであろう。このようなターゲット遺伝子およびタ
ーゲット遺伝子産物が、以下に説明されるものとともに、下記の5.5 節に説明さ
れる化合物発見戦略の焦点を構成するであろう。
【００９７】 更なる特性決定が、このような調節が心血管疾患に積極的に影響しないかもし
れないことを示すが、その発現パターンが、例えば、心血管疾患状態の相関関係
のある遺伝子発現「フィンガープリントパターン」に寄与する、示差的に発現さ
れる遺伝子のいずれかが、「フィンガープリント遺伝子」と指定されるであろう
。「フィンガープリントパターン」が下記の5.8 節に更に充分に説明される。タ
ーゲット遺伝子のそれぞれがまたパスウェイ遺伝子の全部またはサブセットと同
様にフィンガープリント遺伝子として機能し得ることが注目されるべきである。
【００９８】 パスウェイ遺伝子はまた本明細書に記載された技術の如き技術に従って特性決
定し得ることが更に注目されるべきである。パスウェイ遺伝子が示差的に発現さ
れること、および遺伝子の発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心血管疾
患を改善し得ることを指示する情報をもたらすこれらのパスウェイ遺伝子がまた
「ターゲット遺伝子」と称される。このようなターゲット遺伝子およびターゲッ
ト遺伝子産物は、先に説明されたものとともに、下記の5.5 節に説明される化合
物発見戦略の焦点を構成するであろう。
【００９９】 パスウェイ遺伝子の一つ以上の特性決定が示差的発現の欠如を明らかにし得る
が、遺伝子の活性または発現の調節が、それにもかかわらず、心血管疾患症候を
改善し得ることが更に注目されるべきである。このような場合、これらの遺伝子
および遺伝子産物がまた下記の5.5 節の化合物発見戦略の焦点と考えられるであ
ろう。 パスウェイ遺伝子の特性決定が、遺伝子発現または遺伝子産物活性の調
節が心血管疾患に積極的に影響しないかもしれないが、その発現が示差的に発現
され、これが例えば心血管疾患状態の相関関係のある遺伝子発現フィンガープリ
ントパターンに寄与する場合、このようなパスウェイ遺伝子は更にフィンガープ
リント遺伝子と称し得る。
【０１００】 同定された遺伝子が更に特性決定し得る技術の中で、同定された遺伝子のヌク
レオチド配列（これは当業者に公知の通常の技術を利用することにより得られて
もよい）がこのような遺伝子を更に特性決定するのに使用し得る。例えば、同定
された遺伝子の配列が、同定された遺伝子産物の生物学的機能に関する情報を生
じ得る一つ以上の既知の配列モチーフに対する相同性を明らかにし得る。
【０１０１】 第二に、同定された遺伝子により生成されたｍＲＮＡの組織分布の分析が、当
業者に公知の通常の技術を利用して、行い得る。このような技術として、例えば
、ノーザン分析およびRT-PCRが挙げられる。このような分析は、同定された遺伝
子が心血管疾患に寄与すると予想される組織中で発現されるか否かについて情報
を与える。また、このような分析は定常状態ｍＲＮＡ調節に関する定量的情報を
与え、どの同定された遺伝子が、好ましくは、心血管疾患に寄与すると予想し得
る組織中の高レベルの調節を示すのかに関するデータを生じ得る。
【０１０２】 また、このような分析は所定の組織に由来する特別な細胞型の単離された細胞
集団について行われてもよい。更に、通常のin situ ハイブリダイゼーション技
術が、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するのかに関する情報
を与えるのに利用し得る。このような分析は、組織内の細胞のサブセットのみが
心血管疾患に関係すると考えられる場合に心血管疾患に対する同定された遺伝子
の生物学的機能に関する情報を与え得る。
【０１０３】 第三に、同定された遺伝子の配列が、通常の技術を使用して、遺伝子を遺伝子
地図、例えば、マウス遺伝子地図(Copeland ＆Jenkins, 1991, Trends in Gene-
tics 7:113-118) およびヒト遺伝子地図(Cohenら, 1993, Nature 366: 698-701)
に入れるのに使用し得る。このようなマッピング情報が、例えば、既知の遺伝子
心血管疾患傾向がマッピングする近遺伝子領域をマッピングする遺伝子を同定す
ることによりヒト疾病に対する遺伝子の重要性に関する情報を生じ得る。
【０１０４】 第四に、同定された遺伝子の生物学的機能が、妥当なin vivo 系およびin vi-
tro 系を利用することにより更に直接に評価し得る。in vivo 系として、心血管
疾患疾素質を自然に示す動物系、またはapoE欠乏アテローム動脈硬化症マウスモ
デル(Plumpら, 1992, Cell 71: 343-353) を含むが、これに限定されない、この
ような症候を示すように操作された動物系が挙げられるが、これらに限定されな
い。このような系が下記の5.4.4.1 節に説明される。
【０１０５】 in vitro系として、心血管疾患の関係について知られており、またはその疑い
のある細胞型を含む細胞をベースとする系が挙げられるが、これらに限定されな
い。このような系が下記の5.4.4.2 節に詳しく説明される。
【０１０６】 同定された遺伝子の生物学的機能を更に特性決定する際に、これらの遺伝子の
発現がin vivo 系および／またはin vitro系中で調節され、すなわち、過剰発現
または過小発現され、次にその系に関するその後の効果が分析し得る。また、同
定された遺伝子の産物の活性が、関係するin vivo 系および／またはin vitro系
における活性のレベルを増加または減少することにより調節され、次にその後の
効果が分析し得る。
【０１０７】 このような特性決定により得られた情報は、関係する遺伝子を伴う心血管疾患
の治療に適した方法を示唆し得る。例えば、治療は遺伝子発現および／または遺
伝子産物活性の調節を含んでもよい。本明細書に記載された特性決定操作の如き
特性決定操作は、このような調節が関係する遺伝子または遺伝子産物の発現また
は活性の増加または減少を伴うべき場所を示し得る。
【０１０８】 例えば、症状のもとにアップレギュレーションされる遺伝子は症状を発生また
は悪化するのに関係し得る。このような有害に発現された遺伝子の活性をダウン
レギュレーションするのに指示された治療は症状を回復するであろう。一方、症
状下の遺伝子のアップレギュレーションは冒された細胞による保護応答の一部で
あり得る。特に正常なアップレギュレーションを欠いている個体中の、このよう
なアップレギュレーションされた遺伝子産物の活性を増大または増進するのに指
示された治療は、同様に症状を回復するであろう。このような治療の方法が下記
の5.6 節に説明される。
【０１０９】 5.4. 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子 同定された遺伝子（これらは上記5.1.1 節に同定されたような示差的に発現さ
れる遺伝子、および上記5.2 節に同定されたようなパスウェイ遺伝子を含むが、
これらに限定されない）が本明細書に記載される。詳しくは、このような同定さ
れた遺伝子の核酸配列および遺伝子産物が本明細書に記載される。更に、同定さ
れた遺伝子の産物、および同定された遺伝子が更に特性決定され、利用される細
胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルに対し誘導された抗体
がまたこの節に説明される。
【０１１０】 5.4.1. 示差的に発現される遺伝子配列およびパスウェイ遺伝子配列 本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子が下記の表１にリ
ストされる。示差的に発現される遺伝子ヌクレオチド配列およびパスウェイ遺伝
子ヌクレオチド配列が図８、12、15、18、22、28、31、および35に示される。
【０１１１】 表１は、例えば、上記5.1.1 節、および下記の６節〜９節に示される実施例に
説明されたパラダイムにより同定された示差的に発現される遺伝子をリストする
。また、表１はこのような遺伝子の更なる特性決定に関する情報を要約する。
【０１１２】 第一に、示差的に発現される遺伝子を検出するのに最初に使用されたパラダイ
ムが「最初の検出のパラダイム」と標題された欄の下に記載される。例えば、5.
1.1 節に記載されたパラダイム条件の一つ以上のもとに示差的に発現されること
が示された遺伝子の発現パターンが「パラダイム発現パターン」と標題された欄
の下に要約される。試験した遺伝子のそれぞれについて、使用されたパラダイム
および生成されたサンプル中の遺伝子の発現の相違が示される。「↑」 は、遺
伝子発現が生成されたサンプル中でアップレギュレーションされる（すなわち、
検出可能なｍＲＮＡの量の増加がある）ことを示し、一方、「↓」は、遺伝子発
現が生成されたサンプル中でダウンレギュレーションされる（すなわち、検出可
能なｍＲＮＡの量の減少がある）ことを示す。本明細書に使用される「検出可能
な」は、例えば、当業者に周知である標準のノーザン技術および／またはRT-PCR
技術により検出可能であるｍＲＮＡのレベルをいう。
【０１１３】 示差的発現が検出された細胞型がまた表１中で「検出された細胞型」と標題さ
れた欄の下に要約される。「染色体位置」と標題された欄は、遺伝子が位置され
るヒト染色体番号を示す。更に、遺伝子が核酸データベースに見られる配列と同
様または相同のヌクレオチド配列を含む場合、このような類似性に関する文献が
リストされる。
【０１１４】 表１にリストされた遺伝子は、適当なｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ
）ライブラリー内の遺伝子を検出するのに適したプローブの使用を含むが、これ
らに限定されない、当業者に周知のクローニング方法を使用して得られてもよい
（例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratories (これが参考として本明細書にそのまま含まれる）
を参照のこと）。本明細書に報告された新規な配列のプローブは、下記の表２に
示されるような、ATCCに寄託された単離クローンから直接に得られてもよい。ま
た、新規な遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブは図１〜５に開示されたＤＮＡ
配列に基いて合成されてもよい。
【０１１５】 部分コード配列または非コード配列を含むクローンから得られた配列が、RACE
方法(Chenchik ら, 1995, CLONTECHniques (X) 1: 5-8; Barnes, 1994, Proc.Na
tl. Acad. Sci. USA 91: 2216-2220; およびCheng ら, Proc.Natl.Acad.Sci. US
A 91: 5695-5699)を使用することにより全コード領域を得るのに使用し得る。オ
リゴヌクレオチドが全コード配列をコードする逆転写されたｍＲＮＡを増幅し得
る部分クローンから得られた配列に基いて設計し得る。
【０１１６】 また、プローブは、遺伝子が転写される適当な細胞または細胞系から調製され
たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。例えば、単球中
に検出された、本明細書に記載された遺伝子が、下記の6.1.1 節に記載されるよ
うに単離された単球から調製されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化し得る
。
【０１１７】 内皮細胞中で検出された、本明細書に記載された遺伝子はまたProgress in H-
emostasis and Thrombosis, 3 巻, P.Spaet 編集者, Grune ＆Stratton Inc.,Ne
w York, 1-28に記載されたように単離された内皮細胞から構築されたｃＤＮＡラ
イブラリーからクローン化し得る。また、遺伝子が、例えば、Takahashi ら, 19
90, 上記文献に従ってヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(Clontech Laboratories,
Palo Alto, CA)、Jones ら, 1993, 上記文献に記載されたHUVEC ｃＤＮＡライブ
ラリー、またはClearyら, 1986, 上記文献に記載された急性リンパ芽球性白血病
(SUP-B2)ｃＤＮＡライブラリーから回収し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーはあ
らゆる供給源から調製し得る。
【０１１８】
【表１】 下記の表２は表１にリストされた新規な遺伝子を含むプラスミドを含む、ＡＴ
ＣＣに寄託されたE.coli株をリストする。
【０１１９】
【表２】 本明細書において、「示差的に発現される遺伝子」（すなわち、ターゲットお
よびフィンガープリント遺伝子）または「パスウェイ遺伝子（pathway gene）」
とは、（ａ）本明細書に開示（図１−５に示すように）されるＤＮＡ配列の少な
くとも１つを含有するか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン
内に含有されている遺伝子；（ｂ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクロー
ン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように）さ
れるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されてい
る、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開
示（図１−５に示すように）されるＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列
をコードする任意のＤＮＡ配列；（ｃ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のク
ローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように
）されるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有され
ている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書
に開示されているコード配列の相補体に、高ストリンジェント条件下（例えば、
０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM ＥＤ
ＴＡ中で６５℃でフィルター結合したＤＮＡにハイブリダイゼーションし、０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する（Ausubel F.M.ら編、1989、
分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular Biology）、Vol.I,
グリーンパブリシングアソシエーツ社（Green Publishing Associates, Inc.）
、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons, Inc.）、ニュー
ヨーク、第２頁１０．３）でハイブリダイズし、表２に記載のクローン内に含有
される配列によりコードされる遺伝子産物と機能的に同等の遺伝子産物をコード
する、任意のＤＮＡ配列、および／または（ｄ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に
記載のクローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示
すように）されるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に
含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、
本明細書に開示（図１−５に示すように）されるコード配列の相補体に、あまり
ストリンジェントでない条件下（例えば0.2×SSC／0.1％SDSで42℃で洗浄すると
いう中程度のストリンジェント条件下（Ausubelら、1989、同上）でハイブリダ
イズするが、機能的に同等の遺伝子産物をコードする任意のＤＮＡ配列、を意味
する。
【０１２０】 本発明はまた、前節のＤＮＡ配列（ａ）から（ｃ）にハイブリダイズする、従
ってその相補体である、核酸分子好ましくはＤＮＡ分子も含有する。このような
ハイブリダイゼーション条件は、前述のように高ストリンジェントであっても、
またはあまり高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシヌクレオ
チド（「オリゴ」）であるとき、高ストリンジェント条件とは、例えば6×SSC／
0.05％ピロリン酸ナトリウム中で37℃（14塩基オリゴについて）、48℃（17塩基
オリゴについて）、55℃（20塩基オリゴについて）、および60℃（23塩基オリゴ
について）での洗浄を意味する。これらの核酸分子は、例えばターゲット遺伝子
制御に有用なターゲット遺伝子アンチセンス分子として、および／またはターゲ
ット遺伝子核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライマーとして作用してもよい
。さらに、このような分子は、ターゲット遺伝子制御にも有用なリボザイムおよ
び／または三重らせん配列の一部として使用することができる。さらに、このよ
うな分子は、診断法の成分として使用でき、ここで心血管疾患を引き起こす対立
遺伝子の存在が検出される。
【０１２１】 本発明はまた、（ａ）前記コード配列の任意のものおよび／またはその相補体
（すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）コード配列の発
現を指令する調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有す
るＤＮＡ発現ベクター、および（ｃ）宿主細胞中でコード配列の発現を指令する
調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有する、遺伝子操
作した宿主細胞、も包含する。本明細書において、調節要素は、誘導性または非
誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を指令および制御
することが当該分野で公知の他の要素を含むが、これらに限定されない。本発明
は、本明細書に開示したＤＮＡ配列の任意のものの断片を含む。
【０１２２】 前記の遺伝子配列以外に、例えば他の種に存在するそのような配列の相同体が
、当該分野で公知の分子生物学的方法により同定され、過度の実験をすることな
く容易に単離される。さらにこのような遺伝子産物の１つまたはそれ以上のドメ
インに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝
子座に遺伝子が存在するかも知れない。これらの遺伝子もまた同様の方法により
同定される。
【０１２３】 例えば、単離された示差的に発現される遺伝子配列は標識され、目的の生物か
ら得られたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
のに使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が得られた生物の型と
は異なる生物から得られた時、ハイブリダイゼーション条件は低ストリンジェン
トであろう。あるいは、標識断片は、再度、適度のストリンジェント条件を用い
て、目的の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングするために使
用される。このような低ストリンジェント条件は当業者に周知であり、ライブラ
リーおよび標識配列が得られた特定の生物に依存して変動するであろう。このよ
うな条件に関する指針は、例えば Sambrookら、1989、分子クローニング、実験
室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク；Ausube
l F.M.ら編、1989、分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular
Biology）、グリーンパブリシングアソシエーツ・アンド・ワイリー・インタイ
ーサイエンス（Green Publishing AssociatesとWiley Interscience）、ニュー
ヨークを参照のこと。
【０１２４】 さらに、従来は未知の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子型配
列が、目的の遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計された、２つの縮重オリゴ
ヌクレオチドプライマープールを用いてPCRを行うことにより単離される。反応
の鋳型は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子対立遺伝子を発現
することが知られているかまたは疑われる、ヒトまたは非ヒト細胞株または組織
から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡでもよい。
【０１２５】 PCR産物は、増幅された配列が、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ
遺伝子様の核酸配列の配列であることを確認するために、サブクローニングまた
は配列決定してもよい。次にPCR断片を用いて、種々の方法で全長ｃＤＮＡクロ
ーンを単離する。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは標識断片を用いて、
ゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１２６】 PCR技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用できる。例えば適当な
細胞または組織供給源から、標準的方法を用いてＲＮＡが単離される。第１の鎖
の合成のプライミングのための増幅断片の最も５’末端に特異的なオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、ＲＮＡについて逆転写反応を行う。得られるＲＮＡ
／ＤＮＡハイブリッドを次に、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いてグア
ニンで「テイル」を作り（tailed）、ＲＮＡａｓｅＨを用いてハイブリッドを消
化し、次にポリ−Ｃプライマーを用いて第２の鎖の合成をプライミングする。こ
うして、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列が容易に単離される。使用されるクロー
ニング法の総説については、Sambrookら、1989（前述）を参照のこと。
【０１２７】 同定される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子が正常（すなわ
ち、野生型）な場合、この遺伝子は遺伝子の突然変異対立遺伝子を単離するのに
使用される。このような単離は、遺伝的基礎を有することが知られているかまた
は疑われる過程および疾患において好適である。突然変異対立遺伝子は、心血管
疾患の症状に寄与する遺伝子型を有することが知られているかまたは疑われる個
人から単離される。突然変異対立遺伝子と突然変異対立遺伝子産物は次に、後述
の治療および診断アッセイ系に使用される。
【０１２８】 突然変異遺伝子のｃＤＮＡは、例えば当業者に周知のPCR法を用いて単離され
る。この場合、第１のｃＤＮＡ鎖は、突然変異対立遺伝子を有すると考えられる
個人で発現されることが知られているかまたは疑われる組織から単離されるｍＲ
ＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、新しい鎖を逆
転写酵素を用いて伸長するることにより合成できる。次にｃＤＮＡの第２の鎖は
、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを
用いて合成される。次にこれらの２つのプライマーを用いて、PCRにより生成物
を増幅し、適切なベクターにクローン化させ、当業者に周知の方法によりＤＮＡ
配列解析を行う。突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を正常な遺伝子と比較して、突然
変異遺伝子産物の機能の喪失または変化に関係する突然変異を確認することがで
きる。
【０１２９】 あるいは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは、突然変異対立
遺伝子を有することが知られているかまたは疑われる個体の目的の遺伝子を発現
することが知られているかまたは疑われる組織から、それぞれＤＮＡまたはＲＮ
Ａを用いて構築し、スクリーニングすることができる。正常な遺伝子またはその
適切な断片は次に、標識して、ライブラリー中の対応する突然変異対立遺伝子を
同定するためのプローブとして使用される。次にこの遺伝子を含有するクローン
を、当該分野で通常使用される方法により精製して、この節で前記したように配
列分析にかける。
【０１３０】 さらに発現ライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが疑われるかま
たは知られている個体の目的の遺伝子を発現することが知られているかまたは疑
われる組織から合成されるｃＤＮＡから単離されたＤＮＡを用いて作製される。
こうして、推定の突然変異組織により作成した遺伝子産物を発現させ、以下の５
．４．３節で説明するように正常な遺伝子産物に対して作成した抗体とともに標
準的抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングする。（スクリーニング法
については、Harlow, E.とLane編、1988、「抗体：実験室マニュアル（Antibodi
es: A Labratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバーを参照のこと）。突然変異により、機能が変化した
（例えば、ミスセンス突然変異の結果として）遺伝子産物が発現される場合、ポ
リクローナルな抗体のセットは、突然変異遺伝子産物と交差反応する可能性があ
る。そのような標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンを精
製し、この節で前記したように配列分析にかける。
【０１３１】 5.4.2. 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物には、前記５．４．
１節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列によりコー
ドされるタンパク質がある。具体的には、示差的に発現される遺伝子およびパス
ウェイ遺伝子の産物は、ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載の前記クローン内に
含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように）されるか
、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、Ｄ
ＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、示差的に発現される
遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる示差的に発現される遺
伝子およびパスウェイ遺伝子ポリペプチドを含む。
【０１３２】 さらに、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、機能的
に同等の同等の遺伝子産物であるタンパク質を含んでもよい。このような同等の
示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、前記５．４．１節
に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコード
されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を有してもよいが
、サイレント変化であるため、機能的に同等の示差的に発現される遺伝子および
パスウェイ遺伝子の産物を産生する欠失、付加または置換を含有してもよい。ア
ミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／
または両性に基づいて行われる。
【０１３３】 例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが
あり、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チ
ロシン、アスパラギン、およびグルタミンがあり、陽性に荷電した（塩基性）ア
ミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがあり、陰性に荷電（酸性
）したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。本明細書にお
いて「機能的に同等である」とは、前記５．４．１節に記載の示差的に発現され
る遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる内因性の示差的に発
現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物と、in vivoで実質的に同様の活
性を示すことができるタンパク質を意味する。あるいは以下の５．５節に記載の
ようなアッセイの一部として使用される時、「機能的同等である」とは、内因性
の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物の対応する部分が相
互作用するのと実質的に同じ方法で、他の細胞性または細胞外分子と相互作用す
ることができるペプチドを意味する。
【０１３４】 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、当該分野で周知
の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により産生してよい。すなわち、示差的に発
現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列をコードする核酸を発現することに
より、本発明の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子ポリペプチド
およびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。示差的に発現される
遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写／翻訳制
御シグナルを含有する発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が使
用できる。これらの方法には例えば、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およ
びin vivo組換え／遺伝的組換えがある。例えば、Sambrookら、1989（前述）お
よびAusubelら、1989（前述）を参照のこと。あるいは、示差的に発現される遺
伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質配列をコードすることができるＲＮＡは
、例えば合成機を用いて化学的に合成できる。例えば、「オリゴヌクレオチド合
成（Oligonucleotide Synthesis）」、１９８４、Gait, J.J.編、ＩＲＬプレス
、オックスフォオード（これは参考のためその全体が本明細書に引用される）を
参照のこと。
【０１３５】 本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子コード配列を発現
するために、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。このような宿主−発現
ベクター系は、目的のコード配列を産生し、次に精製するが、適切なヌクレオチ
ドコード配列で形質転換またはトランスフェクションした時には、本発明の示差
的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質をその場で示すビヒク
ルである。これらは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパ
ク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌（E. c
oli）、枯草菌（Bacillus subtilis））、示差的に発現される遺伝子またはパス
ウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転
換した酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia））
、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含
有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた
昆虫細胞系、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コー
ド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイク
ウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））で感染させたか、または
組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細
胞系、または哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム
または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニ
アウイルス７．５Kプロモーター）から得られるプロモーターを含有する組換え
発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3）を含
むが、これらに限定されない。
【０１３６】 細菌系では、発現される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ
ンパク質の使用目的に依存して、多くの発現ベクターが有利に選択できる。例え
ば、抗体の産生のために、あるいはペプチドライブラリーをスクリーニングする
ために、このようなタンパク質を大量に産生する時、容易に精製できる融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが好ましい。このようなベクタ
ーには、大腸菌（E. coli）発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、1983、EMBO
J. 2:1791）（ここでは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ
ンパク質をコードする配列は、lacZコード領域と一緒にフレーム内でベクターに
個々に連結され、その結果融合タンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（In
ouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schus
ter, 1989, J. Biol. Chem 264:: 5503-5509）などがあるが、これらに限定され
ない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用することがで
きる。一般的にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガ
ロースビーズに吸着させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより
、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クロー
ン化されたターゲット遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出されるように、ト
ロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１３７】 好適な実施態様において、標準的PCR法（Innisら、1990、前述）を用いて、ア
ミノ末端のフレーム内（in-frame) のＢａｍＨＩ部位とカルボキシ末端のＥｃｏ
ＲＩ部位に、全長ｃＤＮＡ配列を追加し、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（ファルマ
シア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）に連結することができ
る。得られるｃＤＮＡ構築物は、放射能標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識
部位を含有し、親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ配列を有する（Nilssonら、1985、EMBO J. 4: 1075；ZabeauとStan
ley, 1982, EMBO J. 1: 1217）。
【０１３８】 昆虫の系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）
多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとし
て使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera fru
giperda）細胞中で増殖する。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝
子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々
にクローン化され、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、、ポリヘドリンプ
ロモーター）の制御下に置かれる。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ
遺伝子コード配列の挿入が成功すれば、、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、
非閉塞組換えウイルス（すなわち、、ポリヘドリン遺伝子にコードされるタンパ
ク質性コートが欠如したウイルス）が産生される。次にこれらの組換えウイルス
は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞を感染させる
のに使用され、そこで挿入遺伝子が発現される（例えば、Smithら、1983, J. Vi
rol. 46: 584; Smith、米国特許第４，２１５，０５１号）。
【０１３９】 哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が使用される。アデノ
ウイルスが発現ベクターとして使用される時、目的の示差的に発現される遺伝子
またはパスウェイ遺伝子コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（
例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列）に連結される。次にこの
キメラ遺伝子は、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム中
に挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ
の挿入により、感染宿主中で生存活性がありそこで示差的に発現される遺伝子ま
たはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスができ
る。（例えば、LoganとShenk、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-365
9）。挿入された示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列
の効率的な翻訳のために具体的な開始シグナルがまた必要とされる。これらのシ
グナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。示差的に発現される遺伝
子またはパスウェイ遺伝子の全遺伝子（それ自身の開始コドンと隣接配列を含む
）が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ない
。しかし、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の一部
のみが挿入される場合、内因性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドン
を含む）が提供される必要がある。さらに開始コドンは、完全な挿入体の翻訳を
確認するために、開始コドンは目的のコード配列の読みとり枠と同じフェーズに
なければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然
および合成の種々の起源のものでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサ
ー要素、転写ターミネーターなど（Bittner ら、1987, Methods in Enzymol. 15
3: 516-544）を含めることにより増強されてもよい。
【０１４０】 好適な実施態様において、全長読みとり枠をコードするｃＤＮＡ配列は、ｃＤ
ＮＡ発現がCMVプロモーターにより指令されるように、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子を置換してｐCMVβ中に連結される（Alam, 1990, Anal. Biochem. 188: 245
-254; MacGregorとCaskey, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 2365; NortonとCorrin
, 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 281）。
【０１４１】 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の具体的な方法で遺
伝子産物を修飾しプロセシングする、宿主細胞株が選択される。タンパク質産物
のこのような修飾（例えば、グリコシル化）やプロセシング（例えば、切断）は
、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳
後プロセシングや修飾の特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または
宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確保するよ
うに選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、遺
伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細
胞が使用される。このような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、CO
S、MDCK、293、3T3、WI38などがあるが、これらに限定されない。
【０１４２】 組換えタンパク質の長期、高収率産生のために安定な発現が好ましい。例えば
、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を安定に産生す
る細胞株が操作される。ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを用いる
より、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー
、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択性マーカー
により制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、
作成した細胞は、高富化培地中で１〜２日間増殖され、次に選択培地に交換され
る。組換えプラスミド中の選択性マーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、その
染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成させ、次にこれ
がクローン化され細胞株に拡大されることを可能にする。この方法は、示差的に
発現されるあるいはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するの
に有利に用いられる。このような作成した細胞株は、示差的に発現される遺伝子
またはパスウェイ遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリ
ーニングや評価に特に有用である。
【０１４３】 多くの選択系が利用でき、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wi
glerら、1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（SzybalskaとSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4
8: 2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980,
Cell 22: 817）遺伝子が、それぞれｔｋ− 、ｈｇｐｒｔ− またはａｐｒｔ
− 細胞に用いられるが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性が、ｄｈ
ｆｒ（これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Wiglerら、1980, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hareら、1981, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 78: 1527）；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える）（Mu
lliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；ｎｅｏ（これ
は、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与える）（Colberre-Garapinら、
1981, J. Mol. Biol. 150: 1）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ヒグロマイシンに
対する耐性を与える）（Santerreら、1984, Gene 30: 147）遺伝子の選択の基礎
として使用することができる。
【０１４４】 別の融合タンパク質系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の容
易な精製を可能にする（Janknechtら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8972-8976）。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子の読みとり枠が一過性に、
６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合されるように、ワクシニア
組換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスで感
染させた細胞の抽出物を、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムにのせ、ヒ
スチジンが付加されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する
。
【０１４５】 ５．５節で後述するようなアッセイ系の成分として使用される時、示差的に発
現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質は、示差的に発現される遺伝
子またはパスウェイ遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成される複合体の検出
を促進するために、直接または間接に標識される。種々の適切な標識系の任意の
ものが使用でき、例えば、１２５Ｉ；基質に接触させた時、検出可能な発色シグ
ナルまたは光を産生する酵素標識系；および蛍光標識物があるが、これらに限定
されない。
【０１４６】 このようなアッセイ系のために示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺
伝子タンパク質を産生するために組換えＤＮＡ技術が使用される時、標識化、固
定化および／または検出を促進できる融合タンパク質を作成することが有利であ
る。
【０１４７】 間接標識化では、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物に特
異的に結合する、標識抗体のようなタンパク質を使用する。そのような抗体には
、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ
断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生される断片があるが、これらに限
定されない。
【０１４８】 5.4.3. 示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物抗体 本明細書に、１つまたはそれ以上の示差的に発現される遺伝子またはパスウェ
イ遺伝子エピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法が記載され
る。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ab')２断片、Ｆａｂ
発現ライブラリーから産生される断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、お
よび前記いずれかのエピトープ結合断片があるが、これらに限定されない。この
ような抗体は、例えば生物試料中のフィンガープリント、ターゲット、またはパ
スウェイ遺伝子の検出に用いられるか、あるいは異常ターゲット遺伝子活性の阻
害方法として使用される。すなわち、このような抗体は、心血管疾患治療法の一
部として、および／または診断法（こうして、患者は、フィンガープリント、タ
ーゲット、またはパスウェイ遺伝子タンパク質の異常レベル、あるいはこのよう
なタンパク質の異常な型の存在の試験のために用いられる）の一部として使用さ
れる。
【０１４９】 示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子に対する抗体の産生のため
に、種々の宿主動物を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タン
パク質またはその部分を注射して免疫する。このような宿主動物には、ウサギ、
マウス、およびラットなどがあるが、これらに限定されない。宿主の種に依存し
て、免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントが使用できる。例えば、フ
ロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物
ゲル、表面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリア
ニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジ
ニトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテ
リウム・パルブム（Corynebacterium parvum）のような有用である可能性のある
ヒト用アジュバントがあるが、これらに限定されない。
【０１５０】 好適な実施態様において、ターゲット遺伝子産物のアミノ酸配列に対応するペ
プチド配列が選択され、合成と抗体産生のためにリサーチジェネティクス（Rese
arch Genetics）（ハンツビル（Huntsville）、アラバマ州）に提出された。ペ
プチドは、記載されている（Tam, J.P., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
: 5409-5413; Tam, J.P.,とZavala, F., 1989, J. Immunol. Methods 124: 53-6
1; Tam, J.P.,とLu, Y.A., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9084-9088
）ように修飾され、等量のフロイントアジュバントに乳化させ、ウサギの背中側
の皮下に１回の免疫当たり総量１．０ml（ペプチド０．５mg）を注射した。２週
間および６週間後ウサギに追加免疫し、４、８、および１０週間目に採血した。
血液を凝固させ、遠心分離して血清を採取した。fchd545遺伝子産物に対するポ
リクローナル抗体の作製は以下の第10節中、実施例において詳細に記載する。
【０１５１】 ポリクローナル抗体は、ターゲット遺伝子産物のような抗原またはその抗原機
能のある誘導体で免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団であ
る。ポリクローナル抗体の産生のために、前述のような宿主動物を、これも前述
のアジュバントを補足した示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産
物を注射して免疫する。
【０１５２】 特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、細胞株の
連続培養により抗体分子の産生を提供する任意の方法により得られる。これらに
は、KohlerとMilstein のハイブリドーマ法（1975, Nature 256: 495-497；およ
び米国特許第４, ３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら
、1983, Immunolgy Today 4: 72; Coleら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: 2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985, モノクロ
ーナル抗体と癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）、アランア
ールリス社（Alan R. Liss, Inc.）、pp. 77-96）があるが、これらに限定され
ない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれ
らの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスである。本発明のｍＡ
ｂを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養できる。in vivo
での高力価のｍＡｂの産生は、本発明の好適な産生方法である。
【０１５３】 さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生
物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによる、
「キメラ抗体」の産生のために開発されている方法（Morrisonら、1984, Proc.
Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neubergerら、1984, Nature, 317: 604-608
; Takedaら、1985, Nature, 314: 452-454）が使用できる。キメラ抗体は、マウ
スｍＡｂ由来の可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域を有するような、異な
る部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０１５４】 あるいは、１本鎖抗体の産生について記載されている方法（米国特許第４，９
４６，７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Hustonら、1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883；およびWardら、1989, Nature 334: 544-
546）を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子１本鎖抗体を産生
するように応用することができる。１本鎖抗体は、アミノ酸の橋を介してＦｖ領
域の重鎖と軽鎖フラグメントを連結し、１本鎖ポリペプチドを得ることにより形
成される。
【０１５５】 特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の方法により産生される。この
ような断片には例えば、抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ(ab')２断
片、およびＦ(ab')２断片のジスルフィド架橋を還元することにより形成される
Ｆａｂ断片があるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有する
モノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にするように、Ｆａｂ発現
ライブラリーが構築される（Huseら、1989, Science, 246: 1275-1281）。
【０１５６】 5.4.4. 細胞ベースおよび動物ベースのモデル系 本明細書において、心血管疾患のモデルとして作用する細胞ベースおよび動物
ベースの系が記載される。これらの系は、種々の応用に使用される。例えば、細
胞ベースおよび動物ベースの系は、前記５．３節に記載したように示差的に発現
される遺伝子またはパスウェイ遺伝子をさらに性状解析するために使用される。
このようなさらなる特性解析は、例えば示差的に発現される遺伝子はターゲット
遺伝子であることを示す。第２に、そのようなアッセイ法は、以下の５．５．４
節で説明されるように、心血管疾患の症状を緩和することができる化合物を同定
するように設計されるスクリーニング方策の一部として使用することができる。
すなわち、動物ベースおよび細胞ベースのモデルは、心血管疾患の治療に有効な
薬物、医薬、治療法および介入方法を同定するのに、使用される。さらに以下の
５．７．１節で詳述されるように、そのような動物モデルは、動物被験体中のＬ
Ｄ５０およびＥＤ５０を求めるために使用され、そしてそのようなデータは、心
血管疾患治療法の可能性のある方法のin vivoの有効性を求めるために使用する
ことができる。
【０１５７】 5.4.4.1. 動物ベースの系 心血管疾患の動物ベースのモデル系には、非組換え動物および作成したトラン
スジェニック動物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】 心血管疾患の非組換え動物モデルには、例えば遺伝的モデルがある。そのよう
な遺伝的心血管疾患モデルには、例えばａｐｏＢまたはａｐｏＲ欠損ブタ（Rapa
czら、1986, Science 234: 1573-1577）およびワタナベ（Watanebe）遺伝性高脂
血症（WHHL）ウサギ（Kitaら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5928-59
31）がある。
【０１５９】 動脈硬化の非組換え、非遺伝的動物モデルには、例えばLDLを食餌に補足する
ことによる化学的傷害、または例えばバルーンカテーテル血管形成術による機械
的傷害を受けたブタ、ウサギ、またはラットモデルがある。
【０１６０】 さらに、心血管疾患の症状を示す動物モデルは、前記５．４．１節に記載のよ
うなターゲット遺伝子配列を、当業者に周知のトランスジェニック動物を産生す
る技術とともに用いて、作成できる。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の
動物のゲノム内に導入、およびゲノム内で過剰発現するか、あるいは内因性ター
ゲット遺伝子配列が存在するなら、過剰発現されるかまたは、例えばマウスのａ
ｐｏＥの破壊について記載（Plumpら、1992, Cell 71: 343-353）されているよ
うに、ターゲット遺伝子を過少発現するかもしくは発現を不活性化するために破
壊される。
【０１６１】 ターゲット遺伝子配列を過剰発現させるために、ターゲット遺伝子配列のコー
ド部分を、目的の型の動物または細胞中の遺伝子発現を指令することができる制
御配列に連結してもよい。そのような制御領域は、当業者に周知であり、過度の
実験をすることなく利用できる。
【０１６２】 内因性ターゲット遺伝子配列の過少発現のために、そのような配列を単離し、
目的の動物のゲノムに再導入された時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が不
活性化されるように作成される。好ましくは、作成されるターゲット遺伝子配列
は、作成されたターゲット遺伝子配列が動物のゲノム内に組み込まれると内因性
標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。遺伝子
ターゲティングは、本節で後述される。
【０１６３】 マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、および非
ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）など（ただしこれらに
限定されない）の任意の種の動物を用いて、心血管疾患動物モデルを作成できる
。
【０１６４】 トランスジェニック動物の創始系統を産生するために動物内にターゲット遺伝
子トランスジーンを導入するのに、当該分野で公知の任意の方法が利用できる。
そのような方法には、前核微量注入法（Hoppe, P.C.とWagner, T.E., 1989, 米
国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス介在遺伝子導入
（Van der Puttenら、1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152）；
胚幹細胞中の遺伝子ターゲティング（Thompsonら、1989, Cell 56: 313-321）；
胚の電気穿孔法（Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3: 1803-1814）；および精子介在
遺伝子導入（Lavitranoら、1989, Cell 57: 717-723）などがあるが、これらに
限定されない。そのような方法の総説については、Gordon, 1989, トランスジェ
ニック動物（Transgenic Animals）、Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229（これは
参考のためその全体が本明細書に引用される）を参照のこと。
【０１６５】 本発明は、そのすべての細胞中にトランスジーンを有する動物並びにすべてで
はないが一部の細胞にトランスジーンを有する動物（すなわち、モザイク動物）
を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてまたはコンカタマ
ー（例えば、頭対頭縦列（head-to head tandem）もしくは頭対尾縦列（head-to
-tail tandem）として組み込まれる。トランスジーンはまた、例えばLaskoら（L
asko, M.ら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236）の教示に従っ
て、特定の細胞型中に導入され活性化される。そのような細胞型に特異的な活性
化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者には公知である。
ターゲット遺伝子トランスジーンを、内因性ターゲット遺伝子の染色体部位内に
組み込みたい場合は、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に説明すると、そ
のような方法が使用される場合、目的の内因性ターゲット遺伝子に相同的ないく
つかのヌクレオチド配列を含有するベクターが、染色体配列との相同的組換えを
介して、内因性ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込まれ、その機
能を破壊することを目的として設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞
型に選択的に導入され、こうして、例えばGuら（Guら、1994, Science 265: 103
-106）の教示に従って、その細胞型のみの目的の内因性遺伝子を不活性化する。
そのような細胞型特異的不活性化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依
存し、当業者に公知である。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前
記５．４．２節に記載されている。
【０１６６】 トランスジェニック動物がいったん作成されると、標準的方法を用いて組換え
ターゲット遺伝子およびタンパク質の発現がアッセイされる。最初のスクリーニ
ングは、サザンブロット解析またはPCR法により行って、動物組織を解析し、ト
ランスジーンの組み込みが起きた否かをアッセイすることができる。トランスジ
ェニック動物の組織中のトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から
得られる組織試料のノーザンブロット解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョン解析、およびＲＴ−PCRなどの方法（しかし、これらに限定されない）でも
測定できる。ターゲット遺伝子発現組織の試料はまた、目的のターゲット遺伝子
トランスジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価される。
【０１６７】 容易に検出可能なレベルでターゲット遺伝子ｍＲＮＡまたはターゲット遺伝子
トランスジーンペプチド（ターゲット遺伝子産物のエピトープに対して作成され
た抗体を用いて免疫組織化学的に検出される）を発現するターゲット遺伝子トラ
ンスジェニック動物は、次にさらに評価して特徴的な心血管疾患の症状を示す動
物を同定する。そのような症状には、例えば脂肪の縞および／または心血管疾患
班の数やサイズの増加がある。
【０１６８】 さらにトランスジェニック動物内の特異的細胞型を解析し、心血管疾患に特徴
的な細胞表現型についてアッセイする。単核細胞の場合は、そのような表現型に
は、LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細
胞特異的産物の産生の増加があるが、これらに限定されない。細胞表現型アッセ
イ法は、以下の５．４．４．２節で詳述される。さらに、そのような細胞表現型
は、心血管疾患の症状を示す動物での特定の細胞型の既知のフィンガープリント
発現プロフィールに比較して、特定の細胞型のフィンガープリントパターンの発
現を含んでもよい。フィンガープリントプロフィールは、以下の５．８．１節で
詳述される。そのようなトランスジェニック動物は、心血管疾患の適切なモデル
系になる。
【０１６９】 ターゲット遺伝子トランスジェニック創始動物がいったん産生されると、これ
らは育種、同系交配、異系交配、または交雑して特定の動物のコロニーが産生さ
れる。このような育種の例には、創始動物を２つ以上の組み込み部位で異系交配
して別の系統を樹立すること、別の系統を同系交配して、各ターゲット遺伝子ト
ランスジーンの付加的発現の作用のために、より高レベルで目的のターゲット遺
伝子トランスジーンを発現する複合ターゲット遺伝子トランスジェニック体を産
生すること、異型接合トランスジェニック動物を交配させて、特定の組み込み部
位で同型接合である動物を産生させて、発現を増強することおよびＤＮＡ解析で
動物をスクリーニングする必要性をなくすこと、別の同系接合系統を交配させて
、複合異型接合または同型接合系統を産生させること、動物を異なる近交系遺伝
的バックグランドに品種改良してターゲット遺伝子トランスジーンの発現および
心血管疾患の症状の進展に及ぼす対立遺伝子修飾の影響を調べることがあるが、
これらに限定されない。そのような方法の１つは、ターゲット遺伝子トランスジ
ェニック創始動物を野生型系統と交配させて、心血管疾患の症状を示すＦ１世代
を産生することである。次に同型接合ターゲット遺伝子トランスジェニック動物
が生存活性を有することがわかれば、Ｆ１世代を同系交配して同型接合系統を出
現させる。
【０１７０】 5.4.4.2. 細胞ベースのアッセイ法 ターゲット遺伝子タンパク質をコードし、さらに心血管疾患に関連した細胞表
現型を示すターゲット遺伝子配列を含有し発現する細胞は、抗心血管疾患活性を
示す化合物を同定するのに利用される。
【０１７１】 そのような細胞は、非組換え単核細胞株、例えばＵ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ
−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１
（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）；内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣおよびウシ大動脈内
皮細胞（ＢＡＥＣ）；並びに一般的哺乳動物細胞株、例えばＨｅＬａ細胞および
ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃−１６５１）がある。さらにそのよ
うな細胞には、組換えトランスジェニック細胞株がある。例えば、前記５．４．
４．１節で考察した本発明の心血管疾患動物モデルは、心血管疾患の細胞培養モ
デルとして使用できる、心血管疾患に関与する１つまたはそれ以上の細胞型を含
有する、細胞株を産生するために使用される。本発明の心血管疾患トランスジェ
ニック動物から得られる初代培養物が利用できるが、連続細胞系の産生が好まし
い。トランスジェニック動物から連続細胞系を得るために使用される方法の例に
ついては、Smallら、1985, Mol. Cell Biol. 5: 642-648を参照。
【０１７２】 あるいは、心血管疾患に関与することが知られている細胞型の細胞を、細胞内
のターゲット遺伝子発現の量を増加または低下させることができる配列でトラン
スフェクションしてもよい。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の細胞のゲ
ノム内に導入され過剰発現されるか、またはもし内因性ターゲット遺伝子配列が
存在するなら、これらは過剰発現されるかまたは破壊されてターゲット遺伝子を
過少発現または発現を不活性化する。
【０１７３】 ターゲット遺伝子配列を過剰発現するために、ターゲット遺伝子配列のコード
部分を、目的の細胞型中で遺伝子発現を指令することができる制御配列に連結す
る。そのような制御配列は当業者に周知であり、過度の実験をすることなく利用
できる。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記５．４．２節に記
載されている。
【０１７４】 内因性ターゲット遺伝子配列の過少発現のために、そのような配列は単離され
、目的の細胞型のゲノムに再導入される時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子
が不活性化されるように作成される。好ましくは作成されるターゲット遺伝子配
列は、作成されたターゲット遺伝子配列が細胞のゲノムに組み込まれた時、内因
性標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。ター
ゲット遺伝子を用いる宿主細胞のトランスフェクション法は、前記５．４．４．
１節に記載される。
【０１７５】 化合物で処理される細胞またはターゲット遺伝子でトランスフェクションされ
る細胞を、心血管疾患に関連した表現型について調べることができる。単核細胞
の場合は、そのような表現型は、LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細
胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞によるｂＦＧＦ、IGF-I、VEGF、IL-1、Ｍ−ＣＳ
Ｆ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、PDGF、ＩＦＮ−γ、および
ＧＭ−ＣＳＦのような成長因子の産生の増加があるが、これらに限定されない。
例えば、遊出速度は、前記５．１．１．３節に記載のNavabらのin vitroの系を
用いて、内皮単層を通過して移動し内皮下スペースのコラーゲン層に入る単核細
胞の数を定量することにより、測定される。
【０１７６】 同様に、ＨＵＶＥＣは、試験化合物で処理できるか、または前記５．４．２節
に記載の遺伝子操作したターゲット遺伝子によりトランスフェクションできる。
次にＨＵＶＥＣは、心血管疾患に関連する表現型、例えば細胞形態、細胞増殖、
細胞遊走、および単核細胞接着など（ただし、これらに限定されない）、または
心血管疾患に関与する他のタンパク質（例えば、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、PDGF−β
、およびＥ−セレクチン）の産生に及ぼす作用について、試験される。
【０１７７】 ターゲット遺伝子配列核酸のトランスフェクションは、標準的方法を使用して
行われる。例えば、Ausubelら、1989（前述）を参照のこと。トランスフェクシ
ョンされた細胞は、組換えターゲット遺伝子配列の有無、ターゲット遺伝子ｍＲ
ＮＡの発現と蓄積、および組換えターゲット遺伝子タンパク質産生があることに
ついて評価される。ターゲット遺伝子発現の減少が好ましい場合、標準的方法を
使用して内因性ターゲット遺伝子発現および／またはターゲット遺伝子産物の産
生の減少が達成されるかどうかを証明する。
【０１７８】 5.5. ターゲット遺伝子産物と相互作用する、および/またはターゲット遺伝子
発現を調節する化合物のスクリーニングアッセイ ターゲット遺伝子産物に結合する化合物、ターゲット遺伝子産物と相互作用す
る他の細胞性または細胞外タンパク質に結合する化合物、およびターゲット遺伝
子産物と他の細胞性または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同
定するために以下のアッセイが設計される。そのような化合物は、ターゲット遺
伝子のタンパク質産物の活性を調節することによって、例えば動脈硬化、虚血／
再潅流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症のような心血管疾患の緩和の基礎とし
て作用する。またそのような化合物は、例えば、腫瘍形成および癌の血管新生を
含む、繊維増殖性疾患および腫瘍形成関連疾患を緩和するための基礎として、TG
F-bシグナル伝達応答（TGF-β細胞増殖抑制応答など）のアクチベーターもしく
はエンハンサーとして作用し得る。そのような化合物には、ペプチド、抗体また
は小さい有機もしくは無機化合物があるが、これらに限定されない。このような
化合物の同定方法は、以下の５．５．１節で説明される。このような化合物には
、他の細胞性タンパク質も含まれ得る。このような細胞性タンパク質の同定方法
は、以下の５．５．２節で説明される。
【０１７９】 本明細書に記載のようなアッセイにより同定される化合物は、例えばターゲッ
ト遺伝子産物の生物学的機能を調べたり、心血管疾患、繊維増殖性疾患および腫
瘍形成関連疾患の緩和に有用である。心血管疾患の症状がターゲット遺伝子発現
の総合的な低レベルおよび／または細胞または組織でのターゲット遺伝子産物の
総合的な低レベルに起因する場合は、ターゲット遺伝子産物と相互作用する化合
物は、結合したターゲット遺伝子タンパク質の活性を強調もしくは増幅する化合
物を含んでよい。このような化合物は、ターゲット遺伝子産物活性のレベルを有
効に上昇させ、こうして症状を緩和する。
【０１８０】 場合によって、病気の状態下でアップレギュレーションされていることが観察
されるターゲット遺伝子は、保護作用を示しているかも知れない。このようなア
ップレギュレーション遺伝子の発現、またはその遺伝子産物の活性を増強する化
合物はまた、特にターゲット遺伝子が正常な場合にはアップレギュレーションさ
れない個体で、症状を緩和するであろう。
【０１８１】 他の場合には、ターゲット遺伝子内の突然変異は、ターゲット遺伝子タンパク
質の異常な型もしくは過剰量の産生を引き起こし、これは有害作用を引き起こし
心血管疾患、繊維増殖性疾患および腫瘍形成関連疾患をもたらす。同様に生理学
的条件が、ターゲット遺伝子発現の過剰な上昇を引き起こし、心血管疾患、繊維
増殖性疾患および腫瘍形成関連疾患をもたらすことがある。このような場合は、
結合したターゲット遺伝子タンパク質の活性を阻害する、ターゲット遺伝子タン
パク質に結合する化合物が同定される。例えばこの節で説明したような技術によ
り同定される化合物の有効性を試験するためのアッセイは、５．５．４節で考察
される。
【０１８２】 5.5.1. ターゲット遺伝子産物に結合する化合物のin vitroスクリーニングアッ
セイ 本発明のターゲット遺伝子に結合することができる化合物を同定するために、
in vitroの系を設計することができる。このような化合物は、Ｄ−および／また
はＬ−立体配置のアミノ酸から作られるペプチド（例えば、ランダムペプチドラ
イブラリーの形で；例えば、Lam, K.S.ら, 1991, Nature 354: 82-84を参照のこ
と）、ホスホペプチド（例えば、ランダムまたは部分縮重指向性ホスホペプチド
ライブラリー(partially degenerate, directed phosphopeptide libraries) の
形で；例えば、Songyang, Z.ら, 1993, Cell 72: 767-778を参照のこと）、抗体
、および有機または無機小分子を含むが、これらに限定されない。同定される化
合物は、例えば、ターゲット遺伝子タンパク質、好ましくは突然変異ターゲット
遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であったり、ターゲット遺伝子タン
パク質の生物学的機能を調べるのに有用であったり、正常なターゲット遺伝子相
互作用を妨害する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用されたり
、またはこれら自体がこのような相互作用を妨害しうる。例えば、以下の１２節
の実施例では、rchd534タンパク質とfchd540タンパク質との間の相互作用につい
て記載する。この２つのタンパク質の間の相互作用を妨害する化合物は、心血管
疾患の治療に有用で有り得る。
【０１８３】 ターゲット遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるア
ッセイの原理は、ターゲット遺伝子タンパク質および試験化合物の２つの成分を
相互作用させ結合させるのに十分な条件および時間で、この２つの成分の反応混
合物を調製して、そして反応混合物中で除去および／または検出することができ
る複合体を形成することを伴う。これらのアッセイは、種々の方法で行うことが
できる。例えば、このようなアッセイを行うための１つの方法では、固相にター
ゲット遺伝子または試験物質を定着し、固相に定着したターゲット遺伝子／試験
物質複合体を反応後に検出する。このような方法の１つの実施態様において、タ
ーゲット遺伝子タンパク質は固相表面に定着され、定着されない試験化合物が、
直接または間接に標識される。
【０１８４】 実際には、マイクロタイタープレートが都合よく利用されている。定着される
成分は、非共有または共有結合により固定化され得る。非共有結合は、単に、タ
ンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより達成できる。
あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を
使用して、タンパク質を固相表面に定着させる。表面は、前もって調製して保存
することができる。
【０１８５】 アッセイを行うために、定着された成分を含有するコーティングされた表面に
非固定化成分を添加する。反応終了後、形成された複合体が固相表面に固定化さ
れて残るような条件下で、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）する。固相
表面に定着された複合体の検出は、多くの方法で達成され得る。予め固定化され
ない成分を前もって標識してある場合、表面上に固定化された標識の検出は、複
合体が形成されたことを示している。非固定化成分を前もって標識しない場合、
表面に定着された複合体を検出するために、間接的標識を使用することができる
。例えば、予め固定化されない成分に特異的な標識抗体を使用する（抗体は、次
に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。
【０１８６】 あるいは、反応を液相で行い、反応生成物を未反応成分から分離し、そして複
合体を検出することができる（例えば、ターゲット遺伝子産物または試験化合物
に特異的な固定化抗体を使用して溶液中で形成された任意の複合体も定着し、可
能性のある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して定着された複合体を
検出する）。
【０１８７】 前記方法の１つにより特定のターゲット遺伝子産物に結合することが判明した
化合物は、さらに、ターゲット遺伝子タンパク質から生物化学的応答を誘発する
能力について試験することができる。本明細書では、シグナル伝達に関与する受
容体タンパク質についての特定の実施態様を記載する。ターゲット遺伝子産物受
容体ドメインと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する（すなわち、シ
グナル伝達経路を開始(trigger)させるように、受容体タンパク質に結合する）
能力についてスクリーニングすることができる。本発明の有用な受容体断片また
は類似体は、リガンドと相互作用するものである。受容体成分は、機能的に（す
なわち、リガンドに結合し、Ｃａ++を移動する能力について）アッセイすること
ができる（下記を参照のこと）。これらのアッセイは、成分として、結合の検出
を可能にする配置の、リガンドと組換えターゲット遺伝子産物（または適切な断
片若しくは類似体）を含む。
【０１８８】 例えば、組換え受容体は、カルシウムのリガンド依存性の移動を媒介する能力
により、リガンドのスクリーニングのために使用することができるが、これに限
定されない。ターゲット遺伝子発現ベクター（前記５．４．２節に記載された方
法により構築される）でトランスフェクトされた細胞、好ましくはミエローマ細
胞若しくはアフリカツメガエル卵母細胞は、標準法によりＦＵＲＡ−２またはＩ
ＮＤＯ−１を付加する。リガンドにより誘導されるＣａ2+の移動は、上記した（
Grynkiewiczら, 1985, J. Biol. Chem. 260: 3440）ように蛍光分光法により測
定される。したがってターゲット遺伝子産物の受容体ドメインと反応するリガン
ドは、蛍光シグナルを生成する能力により同定することができる。これらの受容
体結合活性は、バックグラウンド以上に生成された蛍光のレベルを測定すること
により定量し比較することができる。以下の５．５．３節に記載するように、リ
ガンドを同定し、リガンド−受容体複合体の活性を測定することにより、この相
互作用のアンタゴニストを同定することができる。このようなアンタゴニストは
、心血管疾患の治療に有用である。
【０１８９】 ５．５．２．ターゲット遺伝子産物と相互作用する細胞性または細胞外タンパク
質のアッセイ タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切な任意の方法を使用して
、新規な標的タンパク質−細胞性または細胞外タンパク質相互作用を同定するこ
とができる。これらの方法は、パスウェイ遺伝子の同定に関して上記５．２．節
に略述されており、そして同定された標的タンパク質と相互作用するタンパク質
の同定に関して本明細書において利用することができる。このような場合に、タ
ーゲット遺伝子は、既知の「餌（bait）」遺伝子として働く。
【０１９０】 以下の１２節に記載する実施例は、共に標的タンパク質であると同定されたrch
d534タンパク質とfchd540タンパク質との間の相互作用を検出する本方法の使用
を実証する。
【０１９１】 ５．５．３．ターゲット遺伝子産物と他の化合物との間の相互作用を妨害する化
合物のアッセイ 本発明のターゲット遺伝子タンパク質は、in vivoで、１つまたはそれ以上の
細胞性または細胞外タンパク質と相互作用しうる。このようなタンパク質は、上
記５．５．２．節に記載したような方法により同定されるタンパク質を含むが、
これらに限定されない。説明の便宜上、ターゲット遺伝子産物とこのような細胞
性および細胞外タンパク質は、本明細書では「結合パートナー」と呼ぶ。そのよ
うな相互作用を妨害する化合物は、ターゲット遺伝子タンパク質、特に突然変異
ターゲット遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であり得る。このような
化合物は、前記５．５．１．節に記載される、抗体、ペプチドなどのような分子
を含むが、これらに限定されない。
【０１９２】 ターゲット遺伝子タンパク質と、その細胞性または細胞外タンパク質結合パー
トナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ
系の基本的原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と結合パートナーが相互作用し
結合するのに充分な条件および時間で、この２つのタンパク質を含有する反応混
合物を調製して、複合体を形成する。阻害活性について化合物を試験するために
、反応混合物を、試験化合物の存在下および非存在下で調製する。試験化合物は
、最初から反応混合物に含ませるか、またはターゲット遺伝子およびその細胞性
または細胞外結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照の反応混合物は、
試験化合物なしで、またはプラセボと共にインキュベートする。次に、ターゲッ
ト遺伝子タンパク質と、細胞性または細胞外結合パートナーとの間の複合体の形
成が検出される。対照反応においては複合体の形成があるが、試験化合物を含有
する反応混合物ではそれがないということは、その化合物が、ターゲット遺伝子
タンパク質とその相互作用する結合パートナータンパク質との相互作用を妨害し
ていることを示している。さらに、試験化合物と正常なターゲット遺伝子タンパ
ク質を含有する反応混合物内での複合体形成はまた、試験化合物と突然変異ター
ゲット遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較すること
ができる。この比較は、突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の相互作用は妨害
するが、正常なターゲット遺伝子タンパク質のそれは妨害しない化合物を同定す
ることを目的とする場合に重要となり得る。
【０１９３】 結合パートナーの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均一系または均
一系で行うことができる。不均一系アッセイは、結合パートナーの１つを固相に
定着し、反応の最後に固相に定着されている複合体を検出することを含む。均一
系アッセイでは、全反応は液相で行われる。いずれのアプローチにおいても、反
応物の添加の順番は、試験する化合物について異なる情報を得るために変化させ
てよい。例えば、結合パートナーの間の相互作用を、例えば競合により妨害する
試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより（すなわち、試験物質
を、ターゲット遺伝子タンパク質と相互作用する細胞性または細胞外タンパク質
の前またはこれらと同時に反応混合物に添加することにより）同定することがで
きる。あるいは、前もって形成された複合体を妨害する試験化合物（例えば、複
合体の結合パートナーの１つを置き換える高い結合定数を有する化合物）は、複
合体形成後に反応混合物に試験化合物を添加することにより試験することができ
る。種々の系を以下に簡単に記載する。
【０１９４】 不均一アッセイ系においては、ターゲット遺伝子タンパク質または相互作用す
る細胞性あるいは細胞外結合パートナータンパク質のいずれかを固相表面に定着
して、そして定着していない結合パートナーを、直接的または間接的に標識する
。実際には、マイクロタイタープレートが都合よく利用される。定着される分子
種は、非共有または共有結合により固定化することができる。非共有結合は、単
に、タンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うこ
とができる。あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク
質を固相表面に定着することができる。表面は、前もって調製して保存すること
ができる。
【０１９５】 アッセイを行うために、固定化された分子種の結合パートナーを、試験化合物
の存在下または非存在下で、コーティングした表面に暴露する。反応終了後、未
反応成分を除去（例えば、洗浄により）すると、形成した複合体は固相表面に固
定化されて残る。固相表面に定着された複合体の検出は、多くの方法で行うこと
ができる。結合パートナーが前もって標識されていた場合、表面上に固定化され
た標識検出により、複合体の形成が判る。結合パートナーが前もって標識されて
いなかった場合、表面に定着された複合体を検出するために間接標識を使用する
ことができる。例えば、結合パートナーに特異的な標識抗体を使用する（抗体は
、次に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。反応成分の添加
の順番に応じて、複合体形成を阻害または前もって形成された複合体を妨害する
試験化合物を検出することができる。
【０１９６】 あるいは反応は、試験化合物、未反応物成分から分離された反応物生成物、お
よび検出される複合体の存在下または非存在下で液相で行うことができる（例え
ば、一方の結合パートナーに特異的な固定化抗体を用いて溶液中で形成した複合
体を定着し、他方の結合パートナーに特異的な標識抗体を使用して定着された複
合体を検出する）。ここでも再度、液相への反応物の添加の順番に応じて、複合
体を阻害するかまたは前もって形成された複合体を妨害する試験化合物を同定す
ることができる。
【０１９７】 本発明の別の実施態様において、均一アッセイを使用することができる。この
アプローチでは、ターゲット遺伝子タンパク質と、相互作用する細胞性または細
胞外タンパク質との前もって形成される複合体は、結合パートナーの１つが標識
されて調製されるが、標識により生成するシグナルは、複合体形成により消失す
る（例えば、このアプローチをイムノアッセイに利用している、Rubensteinの米
国特許第4,109,496号を参照のこと）。前もって形成された複合体の結合パート
ナーの１つに競合してこれを置き換える試験物質の添加により、バックグラウン
ド以上のシグナルの生成が起こる。このように、ターゲット遺伝子タンパク質−
細胞性または細胞外タンパク質の相互作用を妨害する試験物質を同定することが
できる。
【０１９８】 特定の実施態様において、ターゲット遺伝子タンパク質は、前記５．４．２節
に記載された組換えＤＮＡ技術を使用して固定化のために調製することができる
。例えば、ターゲット遺伝子コード領域は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベ
クターを使用して、得られる融合タンパク質においてその結合活性が維持される
ように、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合するこ
とができる。相互作用する細胞性または細胞外タンパク質は、当該分野で通常行
われ上記５．４．３節に記載した方法を使用して、精製し、かつモノクローナル
抗体を作成するために使用することができる。この抗体は、例えば、放射性同位
体125Iを用いて、当該分野で通常行われる方法により標識することができる。不
均一アッセイでは、例えばＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質をグルタチ
オン−アガロースビーズに定着させることができる。次に、相互作用する細胞性
又は細胞外結合パートナータンパク質を、試験化合物の存在下又は不在下におい
て相互作用および結合を生じるような方法で加える。反応期間の終わりに、未結
合物質を洗い流し、標識モノクローナル抗体を系に加えて複合化結合パートナー
と結合させる。ターゲット遺伝子タンパク質および相互作用する細胞性又は細胞
外結合パートナータンパク質との間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビ
ーズに残存する放射能量を測定することにより検出できる。試験化合物によって
相互作用がうまく阻害された場合には、測定放射能が減少する。
【０１９９】 あるいは、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質と、相互作用する細胞性
又は細胞外結合パートナータンパク質とを、固体グルタチオン−アガロースビー
ズの不在下において、液体中で混合することができる。結合パートナー間で相互
作用が起きる間又はその後に、試験化合物を加え得る。この混合物を次にグルタ
チオン−アガロースビーズに加えて、未結合物質を洗い流す。ここでも、結合パ
ートナー相互作用の阻害の程度が、標識抗体を加えてビーズに残存する放射能を
測定することにより検出できる。
【０２００】 本発明の別の態様では、ターゲット遺伝子タンパク質及び相互作用的細胞性又
は細胞外タンパク質の一方又は両方の全長タンパク質に代えて、これらのタンパ
ク質の結合ドメインにそれぞれに対応するペプチド断片を用いて同じ技術を行う
ことができる。当該分野で日常的に実施されているあらゆる方法を用いてタンパ
ク質の結合部位を同定し単離することができる。これらの方法は、タンパク質を
コードする遺伝子の一つを突然変異誘発し、共免疫沈降アッセイで結合の妨害を
スクリーニングすることを含むが、これに限定されない。ターゲット遺伝子中の
代償性突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺
伝子の配列分析により、相互作用する結合に関与するタンパク質の領域に対応す
る突然変異が明らかになるであろう。あるいは、先に本節で記載した方法を用い
て、一つのタンパク質を固体表面に定着させ、トリプシンなどのタンパク質分解
酵素で処理したその標識結合パートナーと相互作用させ結合させる。洗浄後に、
結合ドメインを含む短い標識ペプチドが固体物質と会合したまま残るので、これ
を単離しアミノ酸配列決定により同定する。また、細胞性又は細胞外タンパク質
をコードする遺伝子がいったん得られると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作
してこのタンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでこの結合活
性について試験し、精製又は合成することができる。
【０２０１】 これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タン
パク質を作製し、これをグルタチオンアガロースビーズに結合させることによっ
て、この節で上述したように固体物質にターゲット遺伝子を定着させることがで
きる。相互作用する細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質を35Ｓなどの放
射性同位体で標識し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で切断することがで
きる。次に切断産物を、定着させたＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質に
加えて結合させる。未結合ペプチドを洗い流した後、細胞性又は細胞外結合パー
トナータンパク質結合ドメインを表す標識された結合物質を溶出し、精製し、当
業者に公知の方法、例えばエドマン分解法（例えば、Creighton, 1983, Protein
s: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., pp.34-
49参照）によってアミノ酸配列を分析する。このようにして同定されたペプチド
は、合成的（例えば、Creighton, 1983,前出, pp.50-60参照）又は、もしも遺伝
子が既に単離されているのであれば、５．４．２節で上述したような組換えＤＮ
Ａ技術等の当業者に公知の方法を用いて製造することができる。
【０２０２】 本発明の特定の態様は、リガンドと、ターゲット遺伝子産物の受容体ドメイン
との間の相互作用に拮抗する能力について候補化合物をスクリーニングする方法
を特徴とする。この方法は、ａ）候補アンタゴニスト化合物を、受容体ドメイン
を含む組換えターゲット遺伝子産物（又はリガンド結合断片又は類似体）を含む
第１化合物と一方で混合し、またリガンドを含む第２化合物と他方で混合し；ｂ
）第１化合物と第２化合物が結合するかどうかを決定し；そしてｃ）第１化合物
の第２化合物への結合を妨害すること、及び／又はリガンドに媒介される細胞内
Ｃａ++の放出を低下する化合物としてアンタゴニスト化合物を同定することを含
んでなる。
【０２０３】 “アンタゴニスト”の語は、特定の活性、この場合では、リガンドがターゲッ
ト遺伝子産物受容体ドメインと相互作用する能力及び／又はこのような相互作用
の結果生じる生物学的事象（例えば、細胞内Ｃａ++の放出）を引き起こす能力を
阻害するような分子を意味する。好ましい治療剤には、リガンド−受容体相互作
用を妨げることによってリガンド又はターゲット遺伝子産物機能をブロックする
、アンタゴニスト、例えばペプチド断片（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインに由来
する断片）、抗体（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインを認識しこれと結合する抗体
）、又は薬剤を含む。
【０２０４】 ターゲット遺伝子産物の受容体成分は組換え技術で生産され、また候補アンタ
ゴニストはin vitroでスクリーニングされ得るので、本発明は有用な治療剤を同
定するための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。
【０２０５】 目的とする特異的受容体断片には、リガンドと相互作用できるターゲット遺伝
子産物のあらゆる部分、例えば、Ｎ−末端細胞外ドメインの全て又は一部を含む
。このような部分には、膜貫通セグメント及び細胞外にあると推論される受容体
の部分を含む。このような断片は、（上述したような）アンタゴニストとして有
用であり、またターゲット遺伝子産物の活性をin vivoで中和する抗体（例えば
、受容体とリガンドとの間の相互作用を妨げることによって；下記参照）を産生
するための免疫源としても有用である。細胞外領域は類似の構造をもつ関連タン
パク質と比較することによって同定でき；有用な領域はファミリー中のよく性状
決定されたメンバーの細胞外ドメインと相同性を示すものである。
【０２０６】 あるいは、アミノ酸の一次配列から、Chou-Fasman法（例えばChouおよびFasma
n, Ann. Rev. Biochem. 47:251, 1978参照）などによる疎水性／親水性の計算を
用いてタンパク質の二次構造、そして細胞外ドメイン領域を半経験的に推定でき
る。親水性ドメイン、特に疎水性領域に囲まれた親水性ドメイン（例えば膜貫通
ドメイン）は細胞外ドメインの強力な候補である。最後に、細胞外ドメインは、
トリプシン消化分析などの標準的酵素消化分析を用いて経験的に同定できる。
【０２０７】 候補の断片（例えば、膜貫通セグメントの全て又は一部又はあらゆる細胞外断
片）を用いて、本明細書で記載するアッセイ（例えば上述のアッセイ）によって
リガンドとの相互作用を試験する。このような断片を、本明細書で記載するアッ
セイによってリガンドとその内在性受容体との間の相互作用を拮抗する能力につ
いても試験する。有用な受容体断片の類似体（上述したような）を作製してスク
リーニング成分又はアンタゴニストとしての有効性について試験することもでき
（本明細書に記載するアッセイを用いて）；このような類似体も本発明で有用で
あると考えられる。
【０２０８】 特に目的とするのは、細胞外主要末端領域を含む受容体断片（又はそのリガン
ド結合断片）である。同様に目的とするのは、ターゲット遺伝子産物の細胞外ル
ープである。これらの細胞外ループに由来するペプチド断片もアンタゴニストと
して使用でき、特にループがアミノ末端ドメインと協力してリガンド結合を容易
にしている場合には使用できる。あるいは、このようなループと細胞外Ｎ−末端
ドメインは（全長のターゲット遺伝子産物と同様に）、抗−ターゲット遺伝子産
物抗体を産生するための免疫原を提供する。
【０２０９】 リガンドのその受容体への結合は５．５．１節で上述した方法のいずれでもア
ッセイしてもよい。好ましくは、組換えターゲット遺伝子産物（又は適当なター
ゲット遺伝子産物断片又は類似体）を発現する細胞を固体基質（例えばミクロタ
イタープレート又はカラムの壁）に固定化し、検出可能に標識されたリガンドと
反応させる（上述したように）。結合は、受容体成分と会合した（従って固体基
質と会合した）検出標識によってアッセイする。標識リガンドの受容体−保持細
胞への結合を、アンタゴニストアッセイを測定する“対照”として用いる。アン
タゴニストアッセイには、ターゲット遺伝子産物−保持細胞を適当な量の候補ア
ンタゴニストとともにインキュベートすることを含む。この混合物に、標識リガ
ンドと等量を加える。本発明で有用なアンタゴニストは、固定化された受容体−
発現細胞に結合している標識リガンドを特異的に妨げる。
【０２１０】 次にアンタゴニストを、リガンド機能を妨げる能力、すなわち受容体によって
通常媒介されるシグナル形質導入を生じることなく結合した標識化リガンド結合
を特異的に妨げる能力について試験する。機能アッセイを用いてこの試験を行う
には、ターゲット遺伝子産物を含む安定に形質転換された細胞系を本明細書に記
載するように調製し、そしてカルシウム結合剤であるＦＵＲＡ−２などのレポー
ター化合物を標準的な方法で細胞質に充填した。異種のターゲット遺伝子産物を
リガンド又はその他のアゴニストで刺激すると、細胞内カルシウムの放出とこれ
に付随するカルシウム−ＦＵＲＡ−２複合体の蛍光をもたらす。これはアゴニス
ト活性を測定するための便利な手段を提供する。アンタゴニストとなりうるもの
とリガンドとを含むことによって、蛍光の発生を伴わずに（すなわち、細胞内Ｃ
ａ++の移動を引き起こすことなく）リガンド結合を有効にブロックするような真
性の受容体アンタゴニストをスクリーニングし同定することが可能になる。この
ようなアンタゴニストは、心臓血管障害の有用な治療剤となることが期待できる
。
【０２１１】 適当な候補アンタゴニストは、ターゲット遺伝子産物断片、特に１以上の膜貫
通セグメント又は受容体の細胞外ドメイン（上述したもの）に隣接するか又はこ
れを含むリガンド−結合性部分を含む断片を含み；このような断片は好ましくは
５個以上のアミノ酸を含む。その他の候補アンタゴニストには、リガンド類似体
及びその他のペプチドならびに非ペプチド化合物及び受容体の分析により設計さ
れる又はこれに由来する抗−ターゲット遺伝子産物抗体を含む。
【０２１２】 ある実施形態では、候補化合物を、TGF-bシグナル伝達経路の１メンバーであ
る標的遺伝子産物と該経路の第２のメンバーとの間の相互作用に拮抗する能力に
ついてスクリーニングしてもよい。その方法は、以下の工程を要する：a) 少な
くとも、第２の化合物への結合に関与する標的遺伝子産物の部分を含んでなる、
第１の化合物、および少なくとも、標的遺伝子産物への結合に関与する前記第２
の化合物の部分、に候補アンタゴニスト化合物を接触させる工程、b) 第１の化
合物と第２の化合物が被験化合物の存在下で結合するかどうかを判定する工程、
c) 被験化合物の不在下でみられる結合と比較して、第１の化合物と第２の化合
物との結合を妨げるものとして、および／または、TGF-β応答を活性化または増
強するものとして、アンタゴニスト化合物を同定する工程。
【０２１３】 上記実施形態の一部として使用され得る前記標的遺伝子産物のうちの１つは、
fchd540標的遺伝子産物である。あるいは、例として、rchd534標的遺伝子産物を
使用することができる。第２のTGF-βシグナル伝達関連化合物としては、例えば
fchd540、rchd534、および活性化Tβ1Rを挙げることができる。
【０２１４】 ５．５．１節において前述したいずれかの方法により、受容体に対するリガン
ドの結合をアッセイすることができる。好ましくは、アッセイの結果に対する読
み取り値として、下流のシグナル伝達事象をモニターすることができる。例えば
、多くのシグナル伝達タンパク質は、シグナル伝達経路の「下流」の基質タンパ
ク質をリン酸化する。したがって、TGF-β経路などのシグナル伝達経路の活性を
測定するアッセイでは、基質タンパク質のリン酸化状態を調べればよい。標的遺
伝子産物の受容体構成部分は組換え技術によって作製することができ、また候補
アンタゴニストは例えばin vitroでスクリーニングすることができるため、本発
明は有用な治療法を同定するための簡便かつ迅速な方法を提供する。
【０２１５】 ５．５．３．心血管疾患症状および細胞増殖性疾患症状の軽減についてのアッセ
イ 上述したアッセイ系で同定された化合物を含む（ただしこれに限定されない）
あらゆる結合性化合物を、その心血管疾患症状を軽減する能力について試験し得
る。心血管疾患症状を軽減する能力を示す化合物を同定するための細胞及び動物
モデルに基づくアッセイを以下に記載する。
【０２１６】 まず、５．４．４．２．節で上述したような細胞に基づく系を用いて心血管疾
患症状を軽減するように機能し得る化合物を同定することができる。例えば、そ
のような細胞系を心血管疾患症状を軽減する能力を示すと疑われる化合物に対し
て、暴露した細胞中で心血管疾患症状の軽減を引き出すのに十分な濃度および時
間の間暴露する。暴露の後、細胞を検査して、１以上の心血管疾患の細胞表現型
が、より正常な又はより野生型の非心血管疾患の表現型に類似するように変化し
たかどうかを決定する。例えば単球の場合では、より正常な表現型には、LDL取
り込み速度の低下、内皮細胞への付着、移行（transmigration）、泡沫細胞の形
成、脂肪線条の形成、及び泡沫細胞によるｂＦＧＦ、IGF-I、VEGF、IL-1、Ｍ−
ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、PDGF、ＩＦＮ−γ、及
びＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子の産生を含むが、これに限定されない。例えば移
行速度は５．１．１．３．節で上述したNavabらのin vitro系を用いて、内皮単
層を横切って内皮下空間のコラーゲン層に移動する単球の数を定量することによ
って測定できる。
【０２１７】 さらに、５．４．４．１．節で上述したような動物モデルに基づく心血管疾患
系を用いて、心血管疾患症状を軽減できる化合物を同定することができる。この
ような動物モデルは、心血管疾患の治療に有効な薬剤、医薬、治療及び介在の同
定のための試験基質として用いることができる。例えば、動物モデルを心血管疾
患症状を軽減する能力を示すと思われる化合物に対して、暴露した動物中で心血
管疾患症状の軽減を引き出すのに十分な濃度と時間で、暴露する。暴露に対する
動物の応答を、例えばアテローム性動脈硬化症プラークの数の計数及び／又は治
療の前後におけるその大きさの測定によって、心血管疾患に関連する障害の好転
を評価することによってモニターできる。
【０２１８】 さらに、本明細書に記載する細胞に基づく系と動物に基づく系の両方を用いて
、腫瘍形成および腫瘍の血管形成を含む腫瘍形成関連疾患ならびに線維増殖性疾
患の症状を軽減するはたらきをする化合物を同定することができる。この細胞に
基づく系と動物に基づく系を、TGF-β関連線維増殖性疾患または腫瘍形成疾患の
症状を軽減する能力を示すと考えられる化合物に対して、暴露される系において
そのような線維増殖性疾患症状の軽減を誘導するのに十分な濃度および時間にて
、暴露する。その応答は、線維増殖性疾患と関連のある障害の好転を評価する（
例えば、治療の前および後に、腫瘍の大きさおよび成長量または腫瘍の血管形成
を測定する）ことにより、モニターすることができる。
【０２１９】 介入に関しては、心血管疾患、線維増殖性疾患、および腫瘍形成関連疾患の症
状のいかなる様相をも好転するいかなる治療も、ヒト心血管疾患、線維増殖性疾
患、および腫瘍形成関連疾患に対する治療的介入の候補として考慮すべきである
。試験薬剤の投与量は下記の５．７．１．節で記載する用量−応答曲線から決定
できる。
【０２２０】 さらに、遺伝子発現パターンを、心血管疾患症状を軽減する化合物の能力評価
に用いることができる。例えば、１以上のフィンガープリント遺伝子の発現パタ
ーンで“フィンガープリントプロフィール”の一部を形成し、次いでこれを用い
てそのような評価を行う。本明細書における“フィンガープリントプロフィール
”という語は、一定の条件下における所与の組織又は細胞型について得られたｍ
ＲＮＡ発現パターンを指す。このような条件には、上記５．１．１．節のパラダ
イムに記載したあらゆるコントロール又は実験条件をも含み、アテローム性動脈
硬化症、虚血症／再灌流、高血圧症、再狭窄、及び動脈炎症を含むが、これらに
限定されない。フィンガープリントプロフィールは例えば５．１．２．節で上述
した示差的ディスプレイ法、ノーザン分析及び／又はＲＴ−PCRを用いて作製で
きる。５．４．１．節で上述したあらゆる遺伝子配列を、このようなフィンガー
プリントプロフィールの作製及び確証のためのプローブ及び／又はPCRプライマ
ーとして用いることができる。
【０２２１】 フィンガープリントプロフィールを、細胞及び／又は動物に基づくモデル系に
おける心血管疾患であるか正常であるかの既知の状態について特徴付けることが
できる。次いで、これらの既知のフィンガープリントプロフィールを比較して、
試験化合物がこのようなフィンガープリントプロフィールを修飾したり、またよ
り望ましいフィンガープリントのプロフィールにより似させる効果を確かめるこ
とができる。
【０２２２】 例えば、ある化合物の投与によって、心血管疾患モデル系のフィンガープリン
トプロフィールが対照系により類似し得る。あるいは、ある化合物の投与によっ
て、対照系のフィンガープリントプロフィールが心血管疾患状態を模倣し始め得
る。このような化合物は、例えば、目的とする化合物のさらなる特徴付けを、あ
るいは別の動物モデルを作製するために使用され得る。
【０２２３】 ５．５．４．臨床試験中の効果のモニタリング 化合物が心血管疾患、線維増殖性疾患、および腫瘍形成関連疾患の状態に対し
て及ぼす影響のモニタリングは、基礎的な薬剤スクリーニングのみでなく、臨床
試験においても適用できる。このような臨床試験では、５．１．１．１節から５
．１．１．６節に記載したパラダイムのいずれかで発見した遺伝子パネルの発現
を、心血管疾患、線維増殖性疾患、および腫瘍形成関連疾患の状態に及ぼす特定
薬剤の効果の“読み取り値”として用いることができる。
【０２２４】 これに限定するものではないが、例えば、パラダイムＡは、酸化LDLで処置し
た単球においてアップレギュレートされるフィンガープリント遺伝子の同定を提
供する。従って、例えば臨床試験で抗酸化剤の効果を研究するために、このよう
な薬剤で処置する前及び処置中の種々の段階で患者から血液を採取し得る。次い
でその単球を単離してＲＮＡを調製し、６．１．１及び６．１．２節で記載する
示差的ディスプレイによって分析する。これらのフィンガープリント遺伝子の発
現レベルは、６．１．２節で記載するノーザンブロット分析又はＲＴ−PCR、又
は５．８．１節で記載するいずれかの方法を用いて定量するか、あるいは５．８
．２節で記載するいずれかの方法を用いて産生されたタンパク質の量を測定する
。このようにして、フィンガープリントプロフィールは、酸化型LDLを取り込ん
だ単球の生理学的応答を示す代理マーカーとして作用する。従って、薬剤処置の
前及び処置中の種々の時点でこの応答状態を決定する。この方法は下記の８節の
実施例でさらに詳しく説明する。特に、酸化型LDLで処置したfchd602およびfchd
605のアップレギュレーションにより、酸性ストレス(oxidative stress)下にあ
る単球のフィンガープリントプロフィールが得られる。そのため、fchd602およ
びfchd605遺伝子は、心血管疾患の臨床治療において代理マーカーとして機能し
得る。従って、酸化ポテンシャル (oxidative potential)に対する抗-酸化剤の
影響は、臨床治療を受けている患者の単球中のfchd602およびfchd605の示差ディ
スプレイを記録することによって測定する。
【０２２５】 同様に、fchd540および／またはrchd534の発現を、線維増殖性疾患、および腫
瘍形成関連疾患の臨床治療の際に代理マーカーとして用いることができる。この
場合、これらの遺伝子からの発現の低下が検知されることになろう。
【０２２６】 ５．５．５. ターゲット遺伝子の発現を調整する化合物についてのアッセイ ターゲット遺伝子の発現を調整する化合物および他の物質は、in vitro細胞系
を用いてスクリーニングし得る。上記節5.5.5に記載した化合物臨床サンプルの
モニタリングに類似した手法で、組織培養物等の細胞使用を試験物質に暴露する
。適切な組織培養細胞には、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、ウシ動脈内皮細胞(BA
EC)、および293細胞(ヒト胚腎細胞)が含まれるが、これらには限定されない。次
いで、ＲＮＡを細胞から抽出する。特異的ターゲット遺伝子の転写のレベルを、
例えば、標準RT-PCR増幅技術および/またはノーザン分析を用いて(以下の６．１
．２節の実施例に記載のように)検出し得る。あるいは、標的タンパク質産生の
レベルを、上記５．５．１節に記載したようなターゲット遺伝子タンパク質を検
出する抗体を用いてアッセイし得る。発現のレベルを、試験物質に暴露しなかっ
た対照細胞サンプルと比較する。
【０２２７】 ターゲット遺伝子の発現の調節についてスクリーニングし得る化合物には、無
機または有機小分子、ペプチドホルモン類似体等のペプチド、ステロイドホルモ
ン、そのようなホルモンの類似体、およびその他のタンパク質を含まれるがこれ
らに限定されない。発現をダウンレギュレートする化合物には、ターゲット遺伝
子のｍＲＮＡの５’末端に相補的、且つ三重らせん構造を形成して転写を阻害す
るオリゴヌクレオチド、ならびにターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害するリ
ボザイムまたはアンチセンス分子を含むがこれらに限定されない。このようなダ
ウンレギュレート試験化合物を設計するための技術および方法は、以下の５．６
節に詳細に記載する。
【０２２８】 ５．６．心血管疾患および線維増殖性疾患の治療ならびにTGF-β抑制応答の活性
化のための、化合物及び方法 TGF-βによってモジュレートされる線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患の症状
を、TGF-β応答を活性化もしくは増強する化合物によって軽減し得るように用い
る該方法及び組成物、および、心血管疾患症状を軽減し得るように用いる方法及
び組成物について以下に記載する。特定の例における異常なTGF-βシグナル伝達
と関連した線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患、または特定の心血管疾患は、少
なくとも部分的には、過剰レベルの遺伝子産物又は異常若しくは過剰活性を示す
遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、このような遺伝子産物のレベ
ル及び／又は活性の低下は、TGF-b応答の活性化または増強、およびしたがって
疾患症状の軽減をもたらす。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲット遺伝
子産物の活性レベルを低下する方法は下記の５．６．１節で記載する。
【０２２９】 あるいは、異常なTGF-bシグナル伝達と関連したその他の特定の線維増殖性疾
患および腫瘍形成疾患、または特定の心血管疾患は、少なくとも一部には、遺伝
子の発現レベルの欠損若しくは低下、又は遺伝子産物の活性レベルの低下によっ
て生じる。従って、遺伝子発現レベル及び／又はこのような遺伝子産物の活性の
上昇により心血管疾患症状の軽減を生じる。
【０２３０】 場合によっては、疾患状態にある遺伝子のアップレギュレーションは、疾患状
態に対する応答におけるその遺伝子産物についての防御的役割を反映する。この
ようなターゲット遺伝子の発現又はターゲット遺伝子産物の活性の増強は、それ
が及ぼす防御的効果を補強するであろう。異常なTGF-βシグナル伝達と関連した
線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患、または特定の心血管疾患の病的状態は、こ
のような防御的遺伝子の活性レベルが異常に低いことによって生じる。このよう
な場合にも、遺伝子発現レベル及び／又はこのような遺伝子産物の活性の上昇は
心血管疾患症状の軽減をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又は
ターゲット遺伝子産物の活性レベルを上昇させる方法は下記の５．６．２節で記
載する。
【０２３１】 異常ＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する特定の線維増殖性疾患および腫瘍形成
疾患に関して、本発明の方法によって治療または予防することができる疾患とし
ては、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫
、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫
、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、
乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳
頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管
癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣腫瘍、肺癌、小
細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣
腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、
網膜芽腫、；白血病、例えば、急性リンパ性白血病ならびに急性骨髄性白血病（
骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（
慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血
球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァル
デンストレーム−マクログロブリン血症、およびＨ鎖病が挙げられるが、これら
に限定されない。
【０２３２】 ５．６．１．突然変異体ターゲット遺伝子活性の発現、合成又は活性を阻害する
化合物 上述したように、心血管疾患障害に関与するターゲット遺伝子は、ターゲット
遺伝子の活性レベルの上昇によりこのような障害を引き起こし得る。上述した表
１にまとめ、また下記の６節及び７節の実施例で記載するように、疾患状態下で
は多数の遺伝子が単球および内皮細胞でアップレギュレートされていることが知
られている。特に、fchd602及びfchd605はそれぞれ、酸化型LDLで処理した単球
中でアップレギュレートされている。さらに、fchd540は、ずれ応力をかけられ
た内皮細胞中、およびある種の癌細胞中でアップレギュレートされる。場合によ
っては、このようなアップレギュレーションは疾患状態の原因となったり悪化さ
せたりする影響がある。このようなターゲット遺伝子及び／またタンパク質の発
現、合成又は活性を阻害するために種々の方法を用いることができる。
【０２３３】 例えば、５．５節で上述したアッセイで同定された阻害活性を示す化合物を、
本発明において心血管疾患症状の軽減に用いることができる。５．５節で上述し
たように、このような分子には小さい有機分子、ペプチド、抗体等が含まれるが
、これらに限定されない。阻害性抗体法は下記の５．６．１．２節で記載する。
【０２３４】 例えば、膜貫通ターゲット遺伝子産物に対する内在性リガンドと競合する化合
物を投与できる。その結果としてリガンド結合したターゲット遺伝子膜貫通タン
パク質の量が低下すると、細胞の生理機能が調節される。この目的に特に有用な
化合物は、例えばターゲット遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインを含むペプチ
ド又はその部分及び／又は類似体等の可溶性タンパク質又はペプチド、例えばＩ
ｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む。（Ｉｇ−テ
イルド融合タンパク質の生産については例えば米国特許第5,116,964号を参照さ
れたい）。あるいは、リガンド類似体又は抗体などの、ターゲット遺伝子産物受
容体部位と結合するがタンパク質を活性化しないような化合物（例えば、受容体
−リガンドアンタゴニスト）が、ターゲット遺伝子産物の活性を阻害するのに有
効でありうる。
【０２３５】 さらに、ターゲット遺伝子の発現を阻害するアンチセンス又はリボザイム分子
も本発明において異常なターゲット遺伝子活性を阻害するのに用いることができ
る。このような方法は下記の５．６．１．１節に記載する。さらにまた、下記の
５．６．１．１に記載するように、異常なターゲット遺伝子活性の阻害に三重ら
せん分子を用いることもできる。
【０２３６】 5.6.1.1. 阻害性アンチセンス、リボザイム及び三重らせん、及び遺伝子不活化
アプローチ 心血管疾患症状の軽減能を示す化合物には、アンチセンス、リボザイム及び三
重らせん分子がある。突然変異体ターゲット遺伝子活性を低下又は阻害するため
にこのような分子をデザインすることができる。このような分子の製造法及び使
用法は当業者に公知である。
【０２３７】 アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしてタン
パク質の翻訳を妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックする作用を有
する。
【０２３８】 アンチセンスを用いるアプローチは、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡに相補的な
オリゴヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれか）のデザインを必要とす
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それと相補的なターゲット遺伝子のｍ
ＲＮＡ転写物と結合し、翻訳を阻止する。完全に相補的であることが好ましいが
、要求されてはいない。本明細書中でいうＲＮＡの一部分に「相補的」な配列と
は、そのＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二重らせんを形成するために十分な
相補性を有する配列を意味する。二本鎖のアンチセンス核酸の場合には、二重ら
せんＤＮＡの一本鎖を調べるかあるいは三重らせん形成をアッセイして相補性を
調べることができる。ハイブリダイズ能は、相補性の程度及びアンチセンス核酸
の長さに依存する。通常、ハイブリダイズさせる核酸が長ければ長いほど、ＲＮ
Ａとの塩基のミスマッチをより多く含むようになるが、その場合でも、依然とし
て安定な二重らせん（場合によっては三重らせん）は形成されている。当業者で
あれば、ハイブリダイズさせた複合体の融解温度を標準的な操作法を用いて測定
することにより、許容しうるミスマッチの度合いを確かめることができる。
【０２３９】 メッセージの5’末端部、例えば、AUG開始コドンまで及びそれを含む5’非翻
訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際、最も効率的に働く
はずである。しかし、ｍＲＮＡの3’非翻訳配列に対して相補的な配列も、ｍＲ
ＮＡの翻訳の阻害に効果的であることが最近示された。概説はWagner, R., 1994
, Nature 372:333-335を参照されたい。このように、ターゲット遺伝子の5’-ま
たは3’-末端の非翻訳、非コーディング領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレ
オチドは、内因性ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプ
ローチに用いうる。ｍＲＮＡの5’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは
、AUG開始コドンに相補的な部分を含まねばならない。ｍＲＮＡのコーディング
領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率の劣る翻訳阻害剤では
あるが、本発明に用いることができる。ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの5’-、3’-
、またはコーディング領域のいずれとハイブリダイズするようにデザインされた
ものであっても、アンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチド長を有する
ものでなければならず、好ましくは６個〜約50個のヌクレオチド長のオリゴヌク
レオチドである。いくつかの特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは、少
なくともヌクレオチド10個、少なくともヌクレオチド17個、少なくともヌクレオ
チド25個、または少なくともヌクレオチド50個を有する。
【０２４０】 標的配列の選択にかかわらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現
阻害能を定量するためのin vitro実験をまず最初に行うことが好ましい。これら
の実験においては、アンチセンスによる遺伝子阻害と、オリゴヌクレオチドの非
特異的な生物活性とを判別しうる対照を用いることが好ましい。これらの実験に
おいてはまた、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質と標的ＲＮＡまたはタンパク質
のレベルを比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド
を用いて得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較
することが考えられる。対照オリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとほ
ぼ同じ長さで、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列と特異
的なハイブリダイゼーションを起こすことを阻止するのに必要な以上にはアンチ
センス配列と相違しないものであることが好ましい。
【０２４１】 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、あるいはそれらの誘
導体または修飾したもの、一本鎖または二本鎖のものを用いうる。オリゴヌクレ
オチドは、例えば分子の安定性やハイブリダイゼーションなどを向上させるため
、塩基部位、糖部位、またはリン酸主鎖を修飾しうる。オリゴヌクレオチドには
他のグループ、例えばペプチド（例えば、in vivoで宿主細胞の受容体をターゲ
ッティングするため）、細胞膜（例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84
:648-652; PCT公開公報 No.WO88/09810, 1988年12月15日公開を参照）や脳血液
関門（例えば、PCT公開公報No.WO89/10134, 1988年4月25日公開を参照）を通過
しやすくするための薬剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断
剤（例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976を参照）またはインター
カレート剤（例えば、Zon, 1988, Pharma. Res. 5:539-549を参照）などを含む
ことができる。この目的のためにオリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプ
チド、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる架橋剤、輸送剤、ハイブ
リダイゼーションによってトリガーされる切断剤などを含むことができる。
【０２４２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは次の群から選択される少なくとも１種の修
飾塩基部位を有している。該群は、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、
５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-ア
セチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５-カルボキ
シメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウ
ラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６
-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２-ジ
メチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン
、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメ
チルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンノシル
キューオシン、５’-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル
、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸(v)、
ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２-チオシトシン、５-メ
チル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシ
ル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸(v)、５-
メチル-２-チオウラシル、３-（３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル）ウラ
シル、(acp３)w、及び２,６-ジアミノプリンからなるが、それらに限定されない
。
【０２４３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、アラビノース、２-フルオロアラ
ビノース、キシルロース、及びヘキソースからなるがそれらに限定されない群か
ら選択される、修飾された糖部位を少なくとも一つ有する。
【０２４４】 また別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデー
ト、ホスホジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、
及びホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択されるリン酸主
鎖を少なくとも一つ有する。
【０２４５】 また別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮ
Ａと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、それは通常のβ-ユニットとは逆に、
鎖がお互いに同一方向に平行に走っている（Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res
. 15:6625-6641）。それらのオリゴヌクレオチドは２'-o-メチルリボヌクレオチ
ド（Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、またはキメラＲＮＡ-
ＤＮＡ類似体（Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
【０２４６】 本発明のオリゴヌクレオチドは当業界で公知の標準的な方法、例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（例えばBiosearch社やApplied Biosystems社などから市販されてい
る）を用いて合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドは、Steinら（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）の方法で合成でき、
メチルホスホネートオリゴヌクレオチドはコントロールドポアグラスポリマー支
持体（Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451）を用い
て合成できる、などがある。
【０２４７】 ターゲット遺伝子のコーディング領域配列に対して相補的なアンチセンスヌク
レオチドを用いることは可能ではあるが、転写されるが翻訳されない領域に対し
て相補的なものが最も好ましい。
【０２４８】 rchd534遺伝子及びfchd540遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
については下記の第１３節の実施例で述べる。
【０２４９】 アンチセンス分子は、in vivoでターゲット遺伝子を発現している細胞、例え
ば、内皮細胞に送達しなければならない。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細
胞に送達するための方法は多数開発されている。例えば、アンチセンス分子を組
織部位に直接注入するか、あるいは、目的とする細胞を標的とするようにデザイ
ンされた修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面に発現している受容体あ
るいは抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体とリンクさせたアンチセンス
）であれば全身投与が可能である。
【０２５０】 しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細
胞内濃度を達成することはしばしば困難なことである。それ故、好適なアプロー
チでは、強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下にアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを置いた組換えＤＮＡ構築物を使用する。患者体内の標的細胞を
トランスフェクトさせるためにそのような構築物を用いると、内因性ターゲット
遺伝子構築物と相補的な塩基対を形成してターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻
止する一本鎖ＲＮＡの十分量の転写をもたらす。例えば、細胞に取り込ませてア
ンチセンスＲＮＡの転写を起こすように、ベクターをin vivoで導入することが
できる。このようなベクターは、目的とするアンチセンスＲＮＡを産生するため
に転写されうるものである限りは、エピソームのままであってもよいし、あるい
は染色体中に組み込んでもよい。このようなベクターは当業界で標準的なものと
なっている組換えＤＮＡ技術を用いて構築しうる。ベクターはプラスミド、ウイ
ルスまたはその他の当業界で知られたものであって哺乳動物細胞中での複製及び
発現のために用いられるものであればよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配
列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で作用する当業界で公知の任意
のプロモーターでも可能である。このようなプロモーターは誘導しうるものでも
よいし、構成的なものであってもよい。このようなものとしては、SV40初期プロ
モーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉
腫ウイルスの3’長鎖末端反復に含まれるプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cel
l 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調
節配列（Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42）などが挙げられるが、それらに
限定されない。特定の組織部位、例えば動脈硬化を生じた血管組織へ直接導入し
うる組換えＤＮＡ構築物を調製するのに、任意の種類のプラスミド、コスミド、
ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いることができる。あるいは、目的とする組
織に選択的に感染するウイルスベクターを用いることもでき、その場合には、投
与は別の経路（例えば全身投与）で行ってもよい。
【０２５１】 リボザイムはＲＮＡの特定の開裂を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザ
イムの作用メカニズムには、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的
ハイブリダイゼーション及びそれに続くエンドヌクレオ分解的開裂が含まれる。
ターゲット遺伝子ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するようにデザインされたリボ
ザイム分子は、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳及びターゲット遺伝子の発現も
阻止する（例えば、PCT 国際公開 WO90/11364, 1990年10月4日公開；Sarverら,
1990, Science 247:1222-1225を参照）。部位特異的認識配列の位置でｍＲＮＡ
を切断するリボザイムはターゲット遺伝子のｍＲＮＡを破壊しうるが、ハンマー
ヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは標的ｍＲ
ＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって定められる位置でｍ
ＲＮＡを切断する。唯一の要求事項は、標的ｍＲＮＡが２個の塩基の配列、5'-U
G-3'を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築と産生は当業界で
周知であり、より詳細にはHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591
に述べられている。例えば、rchd534及びfchd540 ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
中にはハンマーヘッド型リボザイムの切断部位となりうる箇所が何百カ所かある
。リボザイムは、その切断認識部位が標的ｍＲＮＡの5'末端に近いところに位置
するように設計すること、すなわち、効率を向上させ、かつ機能を持たないｍＲ
ＮＡ転写物の細胞内への蓄積を最小限とすることが好ましい。
【０２５２】 rchd534及びfchd540遺伝子に対する特異的ハンマーヘッド型リボザイム分子に
ついては、下記の第13節中の実施例中に述べる。
【０２５３】 本発明のリボザイムとしては、例えば、Tetrahymena Thermophila中に天然に
含まれているもの（IVSまたはL-19 IVS ＲＮＡとして知られる）などのＲＮＡエ
ンドリボヌクレアーゼ（これ以後「Cech型リボザイム」と呼ぶ）も含まれるが、
これについてはThomas Cechと共同研究者が広範囲に述べている（Zaugら, 1984,
Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaugら
, 1986, Nature, 324:429-433; 国際特許出願公開公報 No. WO/88/04300 Univer
sity Patents Inc.による; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216）。Cech型
リボザイムは標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８個の塩基対からなる活性部
位を有し、そこで標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明はターゲット遺伝子中に存
在する８個の塩基対からなる活性部位配列を標的とするCech型リボザイムをも包
含する。
【０２５４】 アンチセンスアプローチと同様、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチド（例え
ば、安定性、標的性などを向上させたもの）で構成することもでき、in vivoで
ターゲット遺伝子を発現している細胞、例えば内皮細胞に送達しなければならな
い。送達方法として好ましいのは、強力な構成的pol IIIまたはpol IIプロモー
ターの制御下でリボザイムをコードするＤＮＡ構築物を用いることであり、その
結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性ターゲット遺伝子のメッセージを
破壊し翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するようになる。アンチ
センス分子とは異なりリボザイムは触媒活性を持つため、より低い細胞内濃度し
か要求されない。
【０２５５】 転写阻害のための三重らせん形成に用いる核酸分子は、一本鎖でデオキシリボ
ヌクレオチドからなるものであるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩
基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対則による三重らせん形成を
促進するようにデザインされねばならず、これは一般に二本鎖のうちの一方の鎖
にプリン又はピリミジンのかなり大きな連なりを必要とする。ヌクレオチド配列
はピリミジンをベースにするものであってよく、このときは生じる三重らせんの
３つの会合した鎖を横切ってTAT又はCGCトリプレットになる。ピリミジンに富む
分子は、二本鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域と、その鎖と平行な方向にお
いて塩基相補性を与える。また、核酸分子は例えばG残基の連なりを含むプリン
に富むものであるように選択できる。これらの分子はGC対に富むＤＮＡ二本鎖と
三重らせんを形成することができ、このときプリン残基のほとんどは標的二本鎖
の一本鎖上に位置しており、三重らせん中の３本の鎖を横切ってGGCトリプレッ
トになる。
【０２５６】 あるいは、三重らせん形成のための標的となりうる候補配列を、いわゆる”ス
イッチバック”核酸分子を作ることによって増加できる。スイッチバック分子は
、5’-3’と3’-5’に方向を変えるように合成され、このため二本鎖のうちの一
本鎖とまず塩基対をつくり、次に他方と塩基対をつくり、従ってプリン又はピリ
ミジンのいずれかからなるかなりの大きさの連なりが二本鎖の一方の鎖に存在す
るように作製する必要がない。
【０２５７】 本明細書に記載するアンチセンス、リボザイム及び／又は三重らせん分子は、
正常体及び突然変異体の両方のターゲット遺伝子の対立遺伝子によって生産され
るｍＲＮＡの転写（三重らせん）及び／又は翻訳（アンチセンス、リボザイム）
を低下又は阻害することができる。実質的に正常なレベルのターゲット遺伝子活
性が維持されていることを確認するために、正常な活性を示すターゲット遺伝子
ポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、下記の5.7節で記載するような遺
伝子治療法によって細胞中に導入することができ、これにはアンチセンス、リボ
ザイム又は三重らせん治療に用いられる可能性のあるいかなる配列も含まない。
あるいは、細胞又は組織のターゲット遺伝子活性の必要レベルを維持するために
、正常なターゲット遺伝子タンパク質を細胞又は組織に同時投与することが好ま
しい。
【０２５８】 内因性ターゲット遺伝子発現は、標的相同的組換えを用いてターゲット遺伝子
またはそのプロモーターを不活化するかまたは「ノックアウト」することによっ
ても低減しうる。（例えば、Smithiesら, 1985, Nature 317:230-234; Thomas &
Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompsonら, 1989 Cell 5:313-321; これ
ら各論文は、その全体を引用により本明細書に組み込むものとする）。例えば、
in vivoで標的を発現している細胞をトランフェクトするために、内因性ターゲ
ット遺伝子（ターゲット遺伝子のコーディング領域あるいは調節領域のどちらか
）に相同なＤＮＡに隣接するが機能を持たない変異体標的（または完全に無関係
なＤＮＡ配列）を、選択的マーカー及び／または陰性選択的マーカーと共にある
いはマーカーなしで用いうる。標的となった相同組換えを介してＤＮＡ構築物を
挿入すると、ターゲット遺伝子が不活化される。このようなアプローチは、組換
えＤＮＡ構築物を直接投与するか、あるいはin vivoで必要とされる部位へ適当
なウイルスベクター、例えば血管組織への送達用ベクターを用いて標的とする場
合には、ヒトに適用しうる。
【０２５９】 あるいはまた、内因性ターゲット遺伝子の発現は、体内の標的細胞中のターゲ
ット遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成するために、ターゲット遺伝
子の調節領域（すなわち標的プロモーター及び/またはエンハンサー）に相補的
なデオキシリボヌクレオチド配列を標的とすることによって低減させうる。（概
説は、Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C.ら,
1992, Ann, N.Y. Accad. Sci., 660:27-36; 及びMaher, L.J., 1992, Bioassays
14(12):807-15を参照）。
【０２６０】 また本発明の別の実施態様においては、心血管疾患の症状の軽減を実現するた
めに標的の活性を「ドミナントネガティブ（dominant negative）」アプローチ
を用いて低下させうる。例えば、２種の遺伝子産物、例えばrchd534及びfchd540
のタンパク質が相互作用すれば、これら２種のタンパク質のうちの一方あるいは
双方の変異体が細胞中に存在することによって、野生型のタンパク質のみででき
た複合体のプールを全体として減らしうる。このようなやり方で、rchd534/fchd
540タンパク質相互作用より得られる活性レベルを全体的に低減することができ
る。
【０２６１】 5.6.1.2. ターゲット遺伝子産物に対する抗体 ターゲット遺伝子タンパク質に特異的でかつその活性を妨げる抗体をターゲッ
ト遺伝子機能の阻害に用いることができる。このような抗体は5.4.3節で上述し
た標準的方法を用いて、タンパク質自体又はタンパク質の一部に対応するペプチ
ドに対して作製することができる。このような抗体にはポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、Fab断片、一本鎖抗体、キメラ抗体などを含むが、これらに
限定されない。
【０２６２】 ターゲット遺伝子タンパク質が細胞内性であって全抗体を用いるときには、イ
ンターナリゼーションする抗体が好ましい。しかしながら、ターゲット遺伝子の
エピトープと結合する抗体又はFab領域の断片を細胞に送達するためにリポフェ
クチンリポソームを用いることができる。抗体断片を用いる場合には、標的タン
パク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、ターゲ
ット遺伝子タンパク質と結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸
配列をもつペプチドを用いることができる。このようなペプチドは当業者に公知
の方法を用いて化学合成又は組換えＤＮＡ法で生産できる（例えば、Creighton,
1983,前出; 及びSambrookら, 1989, 前出、参照）。あるいは、細胞内ターゲッ
ト遺伝子エピトープと結合する一本鎖中和抗体も投与できる。このような一本鎖
抗体は例えば、Marascoら（Marasco, W. ら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 90:7889-7893）の記載するような方法を用いて標的細胞集団中で一本鎖抗体を
コードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与できる。
【０２６３】 いくつかの場合には、fchd545及びfchd602遺伝子産物のように、ターゲット遺
伝子タンパク質は細胞外性であるか、又は膜貫通タンパク質である。例えば、こ
れらの遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインに特異的でかつその活性を妨げる抗
体は、心血管疾患の治療に特に有用である。このような抗体は血流から標的ドメ
インに直接アクセスできるので、特に有効である。ペプチド投与に適した下記の
5.7節で記載するあらゆる投与法を用いて、阻害性ターゲット遺伝子抗体をその
作用部位に有効に投与することができる。
【０２６４】 5.6.2. ターゲット遺伝子活性を回復又は増強する方法 心血管疾患を引き起こすターゲット遺伝子は心血管疾患の状況では低く発現さ
れていることがある。上述の表１にまとめ、また下記の７節の実施例で記載する
ように、疾患状態の単球ではいくつかの遺伝子がダウンレギュレートされている
ことが知られている。特に、ずれ応力に暴露された内皮細胞では、fchd531及びf
chd545がダウンレギュレートされている。あるいは、ターゲット遺伝子産物の活
性が低下して、心血管疾患症状の進展を導くのかも知れない。このようなターゲ
ット遺伝子発現のダウンレギュレーション又はターゲット遺伝子産物活性の低下
は、疾患状態を引き起こしたり悪化させるかも知れない。
【０２６５】 いくつかの場合では、疾患状態でアップレギュレートされるターゲット遺伝子
が防御効果を及ぼす。上述の表１にまとめ、また下記の６節及び７節の実施例で
記載するように、多数の遺伝子が疾患状態の単球及び内皮細胞中でアップレギュ
レートされていることが今や知られている。特に、fchd602及びfchd605は各々、
酸化LDLで処理された単球中でアップレギュレートされている。さらに、fchd540
は、ずれ応力をかけた内皮細胞中でアップレギュレートされている。種々の方法
を用いて、このようなターゲット遺伝子の発現、合成又は活性を上昇させ、それ
らの遺伝子の疾患状態に応答した防御効果を発揮させることができる。
【０２６６】 この節ではターゲット遺伝子の活性レベルを心血管疾患症状が改善されるよう
なレベルまで上昇させる方法を記載する。遺伝子の活性レベルは例えば、ターゲ
ット遺伝子産物の存在レベルを上昇させるか、あるいは存在する活性ターゲット
遺伝子産物のレベルを上昇させることによって上昇させることができる。
【０２６７】 例えば、心血管疾患症状の改善に十分なレベルでターゲット遺伝子産物をこの
ような症状を示す患者に投与する。投与には下記の5.7節で記載するあらゆる方
法を用いることができる。下記の5.7.1節に記載する方法を用いて、当業者であ
れば正常なターゲット遺伝子タンパク質の有効で無毒性な投与濃度を容易に知る
ことができる。
【０２６８】 さらに、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列を、心血管疾患
症状が改善されるようなターゲット遺伝子タンパク質のレベルを生じるのに十分
な濃度で、心血管疾患症状を示す患者に直接投与できる。化合物の細胞内投与を
達成する下記の5.7節で記載するあらゆる方法、例えばリポソーム投与などの方
法を用いて、このようなＲＮＡ分子を投与できる。ＲＮＡ分子は例えば5.4.2節
で上述した組換え法で作製できる。
【０２６９】 さらに、遺伝子置換治療によって患者を治療することができる。ターゲット遺
伝子機能をもつ正常なターゲット遺伝子タンパク質の産生を指示する正常なター
ゲット遺伝子又は該遺伝子の一部の１コピー以上を、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス及びレトロウイルスを含む（ただしこれに限定されない）ベクターを
用いて、リポソームなどのＤＮＡを細胞中に導入するためのその他の分子ととも
に、細胞中に挿入する。また、正常なターゲット遺伝子配列をヒト細胞中に導入
するために上述の方法を用いることができる。
【０２７０】 次いで、遺伝子配列を発現する正常なターゲット遺伝子を含む細胞、特に自己
由来細胞を、心血管疾患症状の改善を可能にする部位において患者に導入又は再
導入する。このような細胞置換法は、例えばターゲット遺伝子産物が分泌された
細胞外遺伝子産物であるような場合に好ましい。
【０２７１】 5.7. 医薬調製物及び投与方法 ターゲット遺伝子の発現、合成及び／又は活性を阻害する同定された化合物を
心血管疾患を治療又は改善をするための治療的有効投与量で患者に投与すること
ができる。治療的有効投与量とは、心血管疾患の症状の改善をもたらすのに十分
な化合物の量をいう。
【０２７２】 5.7.1. 有効用量 このような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えばLD50（集団の50％を致死
にする用量）やED50（集団の50％に治療的有効性をもたらす用量）を決定するた
めの細胞培養又は実験動物における標準的薬学的方法によって決定できる。毒性
効果と治療効果との間の用量比を治療インデックスといい、LD50／ED50で表され
る。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用い
ることもできるが、影響されない細胞への損傷の可能性を最少にし、副作用を減
少するように、病気に冒された組織部位へのこのような化合物を標的とする送達
系をデザインするよう注意すべきである。
【０２７３】 細胞培養系及び動物研究から得られたデータを用いてヒトに使用するための用
量範囲を設定する。このような化合物の用量は、ほとんど又は全く毒性を伴わな
いED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は使用する投与形態及
び投与経路により、この範囲内で変動する。本発明の方法で使用するあらゆる化
合物について、治療的有効投与量を細胞培養系からまず推定できる。動物モデル
では、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大阻害の半分）を設定でき
る。このような情報を用いてヒトでの有用投与量をより正確に決定できる。例え
ば血漿中のレベルは高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。
【０２７４】 5.7.2. 製剤及び用途 本発明で使用する医薬組成物は、１以上の生理学的に許容できる担体又は賦形
剤を用いて慣用法で処方できる。
【０２７５】 従って、該化合物及びその生理学的に許容できる塩及び溶媒和物は、吸入若し
くは通気法（口又は鼻から）又は経口、頬、腹腔、若しくは直腸投与による投与
用に処方できる。
【０２７６】 経口投与には、医薬組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したト
ウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース又はリン酸水素カルシウ
ム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊
剤（例えば、ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（
例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬剤学的に許容できる賦形剤とともに
慣用法で調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は、当業者に公知
の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロ
ップ又は懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水又はその他の適当
なビヒクルで構成できるように乾燥粉末としてもよい。このような液体製剤は、
懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化脂肪）
；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、ア
ーモンド油、油脂エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び保存剤（
例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）な
どの薬剤学的に許容できる添加物とともに慣用法で調製できる。製剤には緩衝塩
、着香剤、着色剤及び甘味料も適宜含むことができる。
【０２７７】 経口投与用製剤は適当に処方することにより活性化合物を制御放出させること
ができる。
【０２７８】 頬投与用には、組成物は慣用法で処方した錠剤又はトローチ剤の形態をとりう
る。
【０２７９】 吸入による投与用には、本発明の化合物を、例えばジクロロジフルオロメタン
、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は
その他の適当なガスなどの適当な噴射剤を用いることにより、加圧パック又はネ
ブライザーからのエアロゾルスプレー製剤の形態で便宜送達する。加圧エアロゾ
ルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを装備することによ
って決定できる。吸入器又は通気器で使用するゼラチンなどのカプセル及びカー
トリッジは、化合物とラクトース又は澱粉などの適当な粉末ベースとの粉末混合
物を含むよう処方される。
【０２８０】 化合物は、例えばボーラス注射や連続注射などの注射によって非経口投与する
ように処方できる。注射用製剤は、添加の保存料とともにアンプル又は複数投与
量容器中に入れた単位投与量形態とすることができる。組成物は油性又は水性ビ
ヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとしての形態をとることができ、また
懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含むことができる。あるいは
、活性成分を、適当なビヒクル、例えば滅菌された発熱質を含まない水で構成す
るように、使用前に粉末形態とすることができる。
【０２８１】 化合物は、例えばカカオバターやその他のグリセリドなどの慣用の坐薬ベース
を含む坐薬又は保持浣腸のような直腸組成物で処方することもできる。
【０２８２】 上述した処方に加えて、化合物はデポ製剤として処方することもできる。この
ような長時間作用性製剤は移植（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射により
投与できる。従って、例えば化合物は適当な重合体又は疎水性物質（例えば、許
容できるオイル中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は例
えばやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として処方することができる
。
【０２８３】 所望するならば、組成物は活性成分を含む１以上の単位投与形態を含むパック
又はディスペンサー装置で提供してもよい。例えばパックは発疱剤（blister）
パックのような金属又はプラスチックホイルからなる。パック又はディスペンサ
ー装置には投与の説明書を付けてもよい。
【０２８４】 5.8. 心血管疾患および線維増殖性疾患の異常の診断 5.4.1節で記載するフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列のような試薬
、ならびに5.4.2節（ペプチド）及び5.4.3節（抗体）で記載する示差的に発現さ
れたパスウェイ遺伝子ペプチドに対する抗体を用いて、種々の方法を実施できる
。特に、このような試薬は例えばターゲット遺伝子の突然変異の存在の検出、又
はターゲット遺伝子ｍＲＮＡの過剰若しくは不足発現の検出に用いることができ
る。
【０２８５】 本明細書で記載する方法は、本明細書に記載する少なくとも１つの特異的フィ
ンガープリント遺伝子核酸又は抗−フィンガープリント遺伝子抗体試薬を含んで
なる予めパッケージングされた診断キットを用いて実施することができ、これは
心血管疾患症状を示す患者又は心血管疾患を進行させる危険のある患者を診断す
るために、例えば臨床現場において便宜用い得る。
【０２８６】 フィンガープリント遺伝子が発現しているあらゆる細胞型又は組織、好ましく
は単球、内皮細胞、又は平滑筋細胞を下記の診断に使用できる。
【０２８７】 5.8.1. フィンガープリント遺伝子核酸の検出 分析すべき細胞型又は組織からのＤＮＡ又はＲＮＡは当業者に公知の方法を用
いて容易に単離できる。診断法は、核酸の精製の必要がない、バイオプシーや切
除から得られた患者組織の組織切片（固定及び／又は凍結）上で直接”in situ
”で実施することもできる。5.1節で記載するような核酸試薬をこのようなin si
tu法のプローブ及び／又はプライマーとして使用できる（例えば、Nuovo, G.J.,
1992, PCR in situ hybridization: protocols and application, Raven Press
, NY参照）。
【０２８８】 ＲＮＡ又はＤＮＡのフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列は、例えば心
血管疾患関連の遺伝子構造及び発現を検出するための生物学的サンプルのハイブ
リダイゼーション又は増幅アッセイに使用できる。このようなアッセイには、サ
ザン又はノーザン分析、一本鎖高次多型分析、in situハイブリダイゼーション
アッセイ、及びポリメラーゼ連鎖反応分析を含むが、これに限定されない。この
ような分析によって、フィンガープリント遺伝子の発現パターンの定量的側面と
、フィンガープリント遺伝子の発現及び／又は遺伝子組成物の定性的側面の両方
が明らかになる。このような側面には例えば、点突然変異、挿入、欠失、染色体
の組換え、及び／又は遺伝子発現の活性化若しくは不活化を含む。
【０２８９】 フィンガープリント遺伝子−特異的核酸分子を検出する好ましい診断法は、例
えば分析すべき細胞型又は組織に由来する核酸を、5.1節で記載するような１以
上の標識した核酸試薬と、このような試薬が興味のある核酸分子中のその相補的
配列と特異的にアニーリングするのに好ましい条件下に、接触させインキュベー
トすることを含む。好ましくは、核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレオチ
ドである。インキュベーションの後、核酸：フィンガープリント分子ハイブリッ
ドから全てのアニーリングしない核酸を除去する。ハイブリダイズしたフィンガ
ープリント組織からの核酸の存在を、もしもそのような分子が存在する場合には
、検出する。このような検出法を用いることにより、興味のある組織又は細胞型
由来の核酸を、例えば膜、又はマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ
などのプラスチック表面のような固体支持体に固定することができる。この場合
には、インキュベーション後に、5.1節で記載する型のアニーリングしなかった
標識フィンガープリント核酸試薬は容易に除去される。残存するアニーリングし
た標識核酸試薬の検出は当業者に公知の標準的方法を用いて実施できる。
【０２９０】 フィンガープリント遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断法は、例えばPC
R（Mullis, K.B., 1987, 米国特許第4,683,202号に記載の実施態様）、リガーゼ
連鎖反応（Barany, F., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）、自
己持続性（self sustained）配列複製（Guatelli, J.C.ら, 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878 ）、転写増幅系（Kwoh, D.Y.ら, 1989, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 ）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi, P.M. ら
, 1988, Bio/Technology 6:1197）、又はあらゆるその他の核酸増幅法による増
幅と、それに続く当業者に公知の方法を用いる増幅分子の検出を含む。これらの
検出法は、核酸分子が非常に少数で存在する場合の検出に特に有用である。
【０２９１】 このような検出法のある態様では、興味のあるＲＮＡ分子からｃＤＮＡ分子を
得る（例えば、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写により）。このようなＲＮＡ
が単離される細胞型又は組織には、単球、内皮、及び／又は平滑筋を含む（ただ
しこれに限定されない）野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが知
られているあらゆる組織を含む。次にｃＤＮＡ中のフィンガープリント配列をPC
R増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として用いる。この方法の逆転写工
程及び核酸増幅工程において合成開始試薬として使用する核酸試薬（例えばプラ
イマー）は、5.1節で記載するフィンガープリント遺伝子核酸試薬の中から選択
される。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも15〜30ヌクレオチド
である。増幅産物を検出するには、核酸増幅を放射能又は非放射能で標識したヌ
クレオチドを用いて実施する。あるいは、増幅産物が標準の臭化エチジウム染色
又はあらゆるその他の適当な核酸染色法で可視化できるのに十分な程度に増幅産
物を生産する。
【０２９２】 遺伝子構造の変異または多型について、上記の方法に加えて、またはこれと組
み合わせて以下に記載の方法を使用することができる。本明細書において、多く
の技法を利用することによって、本発明の任意の標的遺伝子、例えば、fchd540
もしくは関連遺伝子内の変異または多型を検出することができる。任意の有核細
胞由来の核酸は、前記アッセイ技法のための出発点として使用することができ、
当業者に周知の標準的な核酸調製方法に従って単離し得る。
【０２９３】 点突然変異、挿入、欠失および染色体再配列を含む標的遺伝子構造に関する異
常を検出するために、生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅ア
ッセイにおいてゲノムＤＮＡを使用することができる。前記アッセイとして、サ
ザン分析、一本鎖高次構造多型解析（SSCP）、およびＰＣＲ分析が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０２９４】 さらに、周知の遺伝子型決定技法を実施して、線維増殖性、腫瘍形成障害また
は心血管障害に関連する変異を含む標的遺伝子自体の変異に極めて近接する多型
を類型に分けることができる。前記多型を使用して、標的遺伝子、例えば、fchd
540または関連遺伝子の変異を担持している可能性がある集団の個体を同定する
ことができる。多型が、標的遺伝子、例えば、fchd540における変異との連鎖不
平衡を示す場合、該多型を使用して、前記変異を担持している可能性がある一般
集団中の個体を同定することもできる。この方法において使用することができる
多型としては、制限酵素標的配列内に配列変異を含む制限酵素断片長多型（RFLP
）、単一塩基多型、および単純配列長多型（SSLP）が挙げられる。
【０２９５】 例えばWeber（米国特許第5,075,217号）は、(ｄC−dA)n-(ｄG-dT)nの縦列反復
配列のブロックにおける長多型に基づくＤＮＡ配列について記載している。（(
ｄC−dA)n-(ｄG-dT)nブロックの平均分離は、30,000〜60,000ｂbpと見積もられ
ている。間隔が非常に接近しているマーカーは、高頻度の同時遺伝を示し、例え
ば、fchd540または関連遺伝子内の変異などの遺伝子変異の同定、ならびに標的
遺伝子の変異に関連する疾患および障害の診断に極めて有用である。
【０２９６】 また、Caskeyら（米国特許第5,364,759号）は、短い３および４のヌクレオチ
ド反復配列を検出するためのＤＮＡプロフィーリングアッセイについて記載して
いる。その方法は、標的遺伝子、例えば、fchd540または関連遺伝子などの目的
のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを増幅し、反復配列を標識して個体ＤＮＡ
の遺伝子型地図を作成することを含む。
【０２９７】 標的遺伝子、例えば、fchd540または関連プローブは、さらに、RFLPを直接同
定するために使用し得る。さらに、標的配列に由来する標的遺伝子もしくはその
関連プローブまたはプライマーを使用して、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド
、ファージ、またはプラスミドなどのゲノムクローンを単離し得る。標準的なハ
イブリダイゼーションまたは配列決定方法を使用して、これらのクローンに含ま
れるＤＮＡを、単一塩基多型またはSSLPについてスクリーニングすることができ
る。
【０２９８】 さらに、本発明から発達されるトランスジェニック動物は、標的遺伝子、例え
ば、fchd540または関連遺伝子の変異型または多型を発現する動物を含み、特に
、線維増殖性障害、腫瘍形成障害または心血管障害に関連する、fchd540または
関連遺伝子の変異型または多型は、前記疾患の診断および治療において使用され
る。
【０２９９】 主として１つの核酸配列の検出に焦点をあてる方法に加えて、5.5.4節で記載
するフィンガープリントプロフィールもこのような検出法で評価できる。例えば
、ノーザン分析及び／又はRT-PCRなどの5.1.2節で記載する示差的ディスプレイ
法を用いてフィンガープリントプロフィールを作製する。このようなフィンガー
プリントプロフィールの作製及び確証に5.4.1節で記載するあらゆる遺伝子配列
をプローブ及び／又はPCRプライマーとして使用できる。
【０３００】 5.8.2. フィンガープリント遺伝子ペプチドの検出 5.4.3節で記載する野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド
に対する抗体も、例えば本明細書で記載する心血管疾患の診断及び予後判定に使
用できる。このような診断法は、フィンガープリント遺伝子タンパク質の発現レ
ベルの異常、又はフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造及び／又は組織、
細胞、又は細胞下（subcellular）での位置の異常の検出に使用できる。構造的
相違には、例えば正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質と比較した突然変
異型フィンガープリント遺伝子タンパク質のサイズ、電気陰性度、又は抗原性の
相違を含む。
【０３０１】 分析すべき組織又は細胞型からのタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含
む（ただしこれに限定されない）当業者に公知の方法を用いて容易に検出又は単
離できる。ウエスタンブロット分析を行う詳細な説明はSambrookら（1989、 前出
）の18章を参照されたい。ここで使用するタンパク質の検出及び単離方法は、例
えばHarlowとLaneの記載する方法（Harlow, E. and Lane, D., 1988, "Antibodi
es: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York）によっても実施でき、この文献の全てを参照としてここ
に援用する。
【０３０２】 野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチド分子を検出するた
めの好ましい診断法には、例えばフィンガープリント遺伝子ペプチドと抗−フィ
ンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との間の相互作用によって検出するイ
ムノアッセイを含む。
【０３０３】 例えば、本発明で有用な5.4.3節で記載するような抗体又は抗体断片を、野生
型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドの存在の定量的又は定性
的検出に使用できる。これは例えば、蛍光標識した抗体（下記参照）を光学顕微
鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光定量的検出とともに用いる免疫蛍光法によ
って実施できる。フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面で発現している
ときにはこの方法は特に好ましい。
【０３０４】 本発明で有用な抗体（又はその断片）はさらに、フィンガープリント遺伝子ペ
プチドをin situ検出するための免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡において組織学的
に使用することもできる。in situ検出は、患者から組織学的標本を取り、これ
に本発明の標識抗体を適用することによって実施できる。生物学的サンプル上の
標識抗体（又はその断片）に上乗せすることにより抗体（又はその断片）を適用
するのが好ましい。このような方法を用いることにより、フィンガープリント遺
伝子ペプチドの存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定することが
できる。本発明の方法を用いることにより、このようなin situ検出を行うため
のあらゆる広範な組織学的方法（染色法など）を修飾し得ることは当業者であれ
ば容易に認識できるであろう。
【０３０５】 野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドのイムノアッセイ
には典型的に、生物学的流体、組織抽出物、新たに回収した細胞、又は組織培養
で予めインキュベートしておいた細胞のような生物学的サンプルを、フィンガー
プリント遺伝子ペプチドを同定できる検出可能に標識された抗体の存在下にイン
キュベートし、そして当業者に公知の多くの方法のいずれかによって結合抗体を
検出することを含む。
【０３０６】 生物学的サンプルを、細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定できるニト
ロセルロースのような固相支持体又は担体又はその他の固体支持体と接触させこ
れに固定する。次いで支持体を適当なバッファーで洗浄し、検出可能に標識され
たフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理する。次いで固相支持体をバッフ
ァーで２度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体に結合した標識の量
を次いで慣用法により検出する。
【０３０７】 「固相支持体又は担体」とは、抗原又は抗体を支持できるあらゆる支持体を意
味する。よく知られた支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セル
ロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発明
の目的にとってはいくらか可溶性か又は不溶性のものである。支持体物質は、結
合分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質上いかなる構造的配置をもってい
てもよい。従って、支持体の配置はビーズのような球状であっても、試験管の内
側表面又はロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面は
シート、試験ストリップなどのように平面であってもよい。好ましい支持体には
ポリスチレンビーズを含む。当業者であれば抗体又は抗原を結合するための他の
多くの適当な担体を知っているし、また日常的実験を用いてこれを確認できるで
あろう。
【０３０８】 あるロットの抗−野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド抗
体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者は日常的実験を用いて決定
したそれぞれについての作動可能で最適なアッセイ条件を決定できる。
【０３０９】 フィンガープリント遺伝子ペプチド−特異的抗体を検出可能に標識する方法の
１つは、これを酵素と結合してエンザイムイムノアッセイ（EIA）に用いる（Vol
ler,"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons
2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersv
ille, MD; Voller ら, J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, Meth. E
nzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press,
Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa,ら, (eds.) Enzyme Immunoassay, Kagaku Sho
in, Tokyo, 1981 ）。抗体に結合した酵素は、適当な基質、好ましくは色原体基
質と、例えば分光光学的、蛍光定量的又は可視手段によって検出できるような化
学的部分を生じるように反応する。抗体を検出可能に標識するために用いる酵素
には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイ
ドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート
、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタ
ラーゼ、グルコースー６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセ
チルコリンエステラーゼを含むが、これに限定されない。酵素のための色原体基
質を用いる比色法によって検出を行うことができる。基質の酵素反応の程度を同
様に調製した標準と目視で比較することによっても検出を行うことができる。
【０３１０】 その他の各種イムノアッセイのいずれを用いても検出を行うことができる。例
えば、抗体又は抗体断片を放射能標識することにより、フィンガープリント遺伝
子野生型又は突然変異型ペプチドをラジオイムノアッセイ（RIA）を用いて検出
できる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh
Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society,
March, 1986,参照によりここに援用する）。放射性同位体はガンマカウンター又
はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーのような手段を用い
て検出できる。
【０３１１】 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な
波長の光に暴露し、蛍光によってその存在を検出する。最も普通に用いられる蛍
光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ
リスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフ
ルオレスアミンである。
【０３１２】 例えば152Eu又はその他のランタニド系のような蛍光発生金属を用いて抗体を
検出可能に標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸
(DTPA)又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート基を用いて抗体
に結合できる。
【０３１３】 抗体を化学発光化合物に結合することによって抗体を検出可能に標識すること
もできる。次いで化学発光標識された抗体の存在を、化学反応中に生じる発光の
存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例とし
ては、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、
イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０３１４】 同様に、生物発光化合物を本発明の抗体の標識に用いることもできる。生物発
光は生物系で見いだされた化学発光の一種であり、ここでは触媒タンパク質が化
学発光反応の有効性を増加する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出
することにより決定できる。標識の目的にとって重要な生物発光化合物は、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０３１５】 5.8.3. 心血管疾患状態のイメージング いくつかの場合では、本明細書で同定した示差的に発現した遺伝子産物は、心
血管疾患状態下ではアップレギュレートされて影響を受けた組織の表面で発現す
る。このようなターゲット遺伝子産物は、病気の診断及び治療を指示する目的で
、損傷を受けたり病気の心臓血管組織を非侵入的にイメージングすることができ
る。例えば、このような示差的に発現する遺伝子産物には、動脈硬化症発生の原
因となるアテローム性動脈硬化症特異的付着分子、又は２節で上述した酸化LDL
に応答してアップレギュレートされる単球スカベンジャー受容体を含むが、これ
に限定されない。あるいは、虚血症／再灌流に悩む組織、あるいはアテローム性
動脈硬化症又は再狭窄病変をもつ他の組織においては、別のこのような表面タン
パク質が特異的にアップレギュレートされているかも知れない。
【０３１６】 後記第６節の実施例に記載するように、fchd602遺伝子は、疾患状態の単球で
アップレギュレートされている遺伝子である。さらに、そのfchd602遺伝子は、
複数の膜貫通ドメインを含有する新規なタンパク質をコードする。アテローム性
動脈硬化症の発症および進行に役割を果たす単球で発現されたfchd602だけでな
く、そのような疾患状態の単球でもアップレギュレートされている。したがって
、fchd602遺伝子産物より、心血管疾患の状態をイメージングするための優れた
道具が得られる。
【０３１７】 この方法は、fchd545遺伝子産物のような他の膜貫通ターゲット遺伝子産物に
対しても同様に応用できる。下記７節の実施例に記載されるとおり、そのfchd54
5遺伝子は、新規なアニオンチャンネルをコードし、複数の膜貫通ドメインを含
む。疾患状態にある組織と反対に、fchd545遺伝子産物は、正常な組織では容易
に検出される可能性があるため、心血管疾患症状をイメージングする優れた道具
も得られる。
【０３１８】 この本発明の方法の使用例を示す実施例は、下記９節に記載する。上記5.6.1.
2節に記載したように、このような表面タンパク質（例えば、fchd602およびfchd
545遺伝子産物）に特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体
は、in vivo組織イメージング技術によって心血管疾患の診断に使用できる。fch
d545遺伝子産物に対して誘導されるこのような抗体は、下記10節の実施例で詳細
に記載する。ターゲット遺伝子産物に特異的な抗体、または好ましくはその抗原
結合断片は、検出可能なシグナルを発生し、心血管疾患を有することが予測され
る被験者（ヒトまたは動物）に投与される標識（例えば、ガンマ線を放射する放
射性同位体）に複合される。十分な時間の後、検出可能な標識抗体を、罹患した
または損傷を受けた組織部位に局在させ、標識によって発生するシグナルをフォ
トスキャニング装置によって検出する。次いで、検出シグナルを組織の画像に変
換する。この画像により、in vivoでの組織の局在化が可能となる。次いで、こ
のデータを使用して適切な治療方策を開発することができる。
【０３１９】 一般に組織イメージングに使用するには抗体分子全体よりも抗体断片の方が好
ましい。抗体断片は全抗体分子より迅速に分配されるので迅速に組織（１つまた
は複数）に蓄積される。したがって、抗体全体を使用するよりも短い時間で画像
を得ることができる。また、これらの断片は、より迅速に組織から除去され、そ
の結果バックグラウンド信号が低くなる。たとえば、Haberらの米国特許第4,036
,945号、Goldenbergらの米国特許第4,331,647号参照。二価の抗原結合性断片(Fa
b’)2および一価のFabが特に好ましい。このような断片は、よく知られているい
くつかのプロトコルのいずれかに従って全イムノグロブリン分子を酵素ペプシン
またはパパインで消化することによって調製することができる。罹病または損傷
組織の位置確定用のモノクローナル抗体に結合するのに適したタイプの標識とし
ては、放射性標識（すなわち、放射性同位体）、蛍光性標識およびビオチン標識
があるがこれらに限られることはない。
【０３２０】 抗体または抗体断片を標識するのに使用することができる放射性同位体のうち
、ガンマ線エミッター、ポジトロンエミッター、Ｘ線エミッターおよび蛍光エミ
ッターが位置確定に適している。抗体標識用に適した放射性同位体としては、ヨ
ウ素‐131、ヨウ素‐123、ヨウ素‐125、ヨウ素‐126、ヨウ素‐133、臭素‐77
、インジウム‐111、インジウム‐113m、ガリウム‐67、ガリウム‐68、ルテニ
ウム‐95、ルテニウム‐97、ルテニウム‐103、ルテニウム‐105、水銀‐107、
水銀‐203、レニウム‐99m、レニウム‐105、レニウム‐101、テルル‐121m、テ
ルル‐122m、テルル‐125m、ツリウム‐165、ツリウム‐167、ツリウム‐168、
テクネチウム‐99mおよびフッ素‐18がある。ハロゲンは多かれ少なかれ相互に
互換的に使用することができる。というのは、ハロゲンで標識された抗体および
／または通常のイムノグロブリンはほとんど同じ動力学および分布ならびに類似
の代謝性をもっているからである。
【０３２１】 ガンマ線エミッターであるインジウム‐111とテクネチウム‐99mが好ましい。
すなわち、これらの放射性金属はガンマカメラで検出可能であり、in vivoでの
イメージングに好適な半減期をもっているからである。抗体は、DTPA（ジエチレ
ントリアミンペンタ酢酸）のような複合金属キレート剤によってインジウム‐11
1またはテクネチウム‐99mで標識することができる。Krejcarekら、1977年、Bio
chem. Biophys. Rec. Comm. 77:581、Khawら、1980年、Science 209:295、Ganso
wらの米国特許第4,472,509号、Hnatowichの米国特許第4,479,930号（これらの教
示は引用したことにより本明細書に含まれているものとする）参照。
【０３２２】 モノクローナル抗体に結合するのに適した蛍光性化合物としては、フルオレセ
インナトリウム、フルオレセインイソチオシアネートおよびテキサスレッドスル
ホニルクロライドがある。DeBelder & Wik、1975年、Carbohydrate Research 44
:254-257参照。当業者であれば、モノクローナル抗体を標識するのに適した他の
蛍光性化合物を知っているであろうし、または通常以上の実験をすることなく確
かめることができるであろう。
【０３２３】 ６．実施例：例Ａに応答して示差的に発現する遺伝子の同定：in vitro泡沫細胞
の例 本発明によると、示差的ディスプレイを用いて、アテローム形成の間に泡沫細
胞が発生する条件をシミュレートするように処理した単球で示差的に発現する遺
伝子を検出することができる。例Ａを使用することによって、新規な遺伝子fchd
602およびfchd605を同定した。fchd602およびfchd605は両方とも、酸化LDLで処
理された疾患状態下でアップレギュレートされている。
【０３２４】 fchd602遺伝子産物は、複数の膜貫通ドメインを含み、ラットのCl-6遺伝子に
配列類似性を示す。該Cl-6遺伝子は、ラットの肝臓の再生において誘発され、イ
ンシュリン誘導性であり、複数の膜貫通ドメインも含む(Diamond,R.H.ら、J.Biol
.Chem.,268:15185-15192、1993年)。fchd605遺伝子産物は、マウスのgly96遺伝子(
Charles,C.H.,Oncogene，8:797-801，1993年)、およびEST T49562に対して配列
類似性を示す。
【０３２５】 これら２つの遺伝子のアップレギュレーションの知見より、泡沫細胞の形成の
過程で単球についてのフィンガープリントプロフィール、例えばマーカーが得ら
れる。このプロフィールは、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化
症、虚血症／再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈の炎症を含めた心血管疾患の
治療及び診断に使用できる。
【０３２６】 さらに、膜貫通タンパク質として、fchd602遺伝子産物は、他の化合物によっ
て単球の表面上で容易に誘発される(access)かまたは検出できる。したがって、
治験での化合物の有効性をモニターする場合と同様に、診断システムで心血管疾
患の状態を検出するのに優れた標的が得られる。さらに、この遺伝子産物の細胞
外ドメインより、それに結合する化合物を同定するための特に有効なスクリーニ
ングシステムの設計を考慮した標的が得られる。このような化合物は、膜貫通遺
伝子産物の活性を調節することによって、心血管疾患を治療するのに有用である
。
【０３２７】 6.1. 材料と方法 6.1.1. 細胞の単離と培養 クエン酸リン酸デキストロース(Sigma)３mlを入れた20mlの冷却vacutainerチ
ューブに血液（〜200ml）を吸い込んだ。次に血液を50mlのチューブにプールし
、Beckman GS-6R中において1250 RPM、４℃で15分間遠心した。次いで透明な上
層（〜25 ml）をピペットで取って捨て、代わりに同容量の４℃のPBSを入れた。
その後血液を混合し、再び2680 RPM、４℃で15分間遠心した。次いで上層を取っ
て捨て、界面のバフィーコートを〜５ml取り出し、別の50 mlのチューブに入れ
、ピペットを20 mlのPBSで洗浄した。細胞をＴフラスコに入れ、４℃で16時間保
存した。次に細胞サンプルを少し取り出し、血球計を用いて計数した。次いでバ
フィーコート集団中の最終赤血球細胞濃度をPBSで1.5×109/mlに調節し、その細
胞を室温に戻した後Leucoprepチューブ(Becton Dickinson)に入れ、2300 RPM、2
5℃で25分間遠心した。透明な上層を取って捨て、ゲル上の濁った層を取り出し
て50 mlのチューブにプールした。次にサンプルをPBS(25℃)で50 mlに希釈し、1
000 RPMで10分間遠心した。次いで上清を除き、ペレットを50 mlのPBSに再懸濁
させた。この手順をさらに三回繰り返した。最後の遠心後細胞を小容量のPBSに
再懸濁させ、計数した。
【０３２８】 単球を拡げる前に組織培養皿をウシコラーゲンで被覆した。1/6容量の7×RPMI
（JRH Biosciences）をVitrogen 100コラーゲン（Celtrix）に入れた後これをRP
MIで1:10に希釈して最終濃度を0.35mg/mlとした。次にコラーゲン混合物をプレ
ートに加え(2.5 ml/100mm皿)、少なくとも1時間37℃にしてゲルを形成させた。
ゲルが生成した後RPMIを除き、細胞をRPMI/10％血漿由来血清(PDS)に加えた。PD
Sは、1/10倍容量の3.8％クエン酸ナトリウムを含有する排気し冷却したチューブ
に血液を吸い込んで調製した。次に血液を新しいSorvallチューブに移し、14,00
0〜16,000 RPM、4℃で20分間遠心した。血漿層を取り、1/50倍容量の1ＭのCaCl2 を加えた新しいチューブにプールした。血漿を混合し、そのサンプルを新しいSo
rvallチューブに入れ、37％で２時間インキュベートしてフィブリンクロットを
形成させた。次にこのクロットをピペットで掻き混ぜて収縮させ、チューブを14
,500 RPM、25℃で20分間遠心した。上清を集め、プールし、56℃で熱不活化させ
てから滅菌濾過し凍結した。
【０３２９】 精製したヒト単球を、５単位／mlのGenzyme組換えヒトMCSFを含有する10％PDS
/RPMI中で５日間培養した後、LDL、酸化LDL、アセチル化LDL（LDLは全て50μg/m
l）、リゾホスファチジルコリン（Sigma、37.5μM）またはホモシステイン（Sig
ma、１mM）で処理した。これらの試薬と共に２時間から３日間までの範囲の期間
インキュベーションした後、培地を除去し、細胞をＲＮＡ溶菌バッファーに溶解
させ、上記第6.1節に記載したようにしてＲＮＡを調製した。
【０３３０】 リポタンパク質 酸化させるため、最初にヒトLDL（Sigam）をPBSで１mg/mlに
希釈した後、４℃でPBSに対して一晩透析した。次に、LDLをPBSで0.3mg/mlに希
釈した。次いで、CuSO4・5H2Oを５μMの最終濃度まで加え、その溶液を37℃のイ
ンキュベーターにおいてＴフラスコ中で24時間インキュベートした。次にLDL溶
液を４℃で0.15Ｍ NaCl/0.3mM EDTAに対して２日間数回交換しながら透析した後
取り出し、Amiconスピンカラムを用いて１時間4000 RPM、４℃で遠心することに
よって遠心分離した。
【０３３１】 アセチル化のためには、１mlの5mg/mlLDLを４℃のシェーカー上の氷上で15 ml
のチューブ中の１mlのNaOAc飽和溶液に加えた。８μlの無水酢酸を一度に２μl
ずつ１時間かけて加えた。次にLDLを４℃で48時間0.15Ｍ NaCl/0.3mM EDTAに対
して数回交換しながら48時間透析した。誘導体化したLDLの最終濃度はOD280で分
析した天然LDLの希釈曲線と比較することによって決定した。いずれの場合も希
釈剤としては0.15Ｍ NaCl/0.3mM EDTAを使用した。
【０３３２】 6.1.2. パラダイム材料の分析 示差的ディスプレイ ：ＤＮＡの除去 ：ＲＮＡペレットをH2Oに再懸濁させ、OD260で分光光度法によって
定量した。次に、サンプルのほぼ半分をDNAseIで処理して夾雑する染色体ＤＮＡ
を除去した。以下の手順を用いてPCRによりＲＮＡを増幅した。50μlのＲＮＡサ
ンプル(10〜20μg)、5.7μlの10×PCRバッファー（Perkin-Elmer/Cetus）、１μ
lのRNAse阻害剤(40単位/μl)（Boehringer Mannheim、ドイツ）を一緒に混合し
、ボルテックスで掻き混ぜ、簡単に遠心した。２μlのDNAseI(10単位/μl)（Boe
hringer Mannheim）を反応混合物に加え、これを37℃で30分間インキュベートし
た。DEPC H2Oで全容量を200μlにし、フェノール／クロロホルムで一回、クロロ
ホルムで一回抽出し、そして、20μlの３Ｍ NaOAc、pH4.8(DEPC処理したもの）
、500μlの無水ETOHを加えドライアイス上で１時間または−20℃で一晩インキュ
ベートすることによって沈殿させた。こうして沈殿したサンプルを15分間遠心分
離し、ペレットを70％ETOHで洗浄した。サンプルを再度遠心分離し、残った液体
を吸引し、ペレットを100μlのH2Oに再懸濁させた。ＲＮＡの濃度はOD260で読み
取ることによって測定した。
【０３３３】 第一ストランドｃＤＮＡ合成：各ＲＮＡサンプルに対して重複反応を平行して
行なった。400ngのRNA+DEPC H2O(合計容量10μl)を4μlのT11XX逆プライマー(10
μM)（Operon）に加えた。各実験で使用した特異的プライマーは上記第４節の図
面の説明に挙げてある。混合物を70℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性
させた後室温にした。以下の成分を含有する26μlの反応混合物を各変性ＲＮＡ
／プライマーサンプルに加えた。8μlの5×First Strand Buffer（Gibco/BRL、G
aithersburg、MD）、4μlの0.1M DTT（Gibco/BRL）、2μlのRNAse阻害剤(40単位
/μl)（Boehringer Mannheim）、４μlの200μM dNTP混合物、6μlのH2O、2μl
のSuperscript逆転写酵素(200単位/μl)（Gibco/BRL）。反応混合物を穏やかに
混合し、42℃で30分間インキュベートした。次に60μlのH2O(最終容量＝100μl)
を加え、サンプルを85℃で５分間変性させ、−20℃で保存した。
【０３３４】 PCR反応：13μlの反応混合物を氷上の96ウェルプレートの各チューブに加えた
。この反応混合物は、6.4μlのH2O、2μlの10×PCRバッファー（Perkin-Elmer）
、2μlの20μM dNTP、0.4μlの35S dATP(12.5μCi/μl、合計50μCi)(Dupont/NEN
)、2μlの前方(for-)プライマー(10μM)（Operon）、および0.2μlのAmpliTaqポ
リメラーゼ(5単位/μl)（Perkin-Elmer）を含有していた。次に、2μlの逆(rev-
)プライマー(T11XX、10μM)を各チューブの側に加えた後、５μlのｃＤＮＡもこ
れらチューブの側（これらはまだ氷上にあった）に加えた。各実験で使用した特
異的プライマーは以下の通りである： fchd602：rev-T11XC及びfor-GTGAGGCGTC fchd605：rev-T11XC及びfor-TGGACCGGTG チューブに蓋をし、混合し、遠心管中で1000 RPMまで上げた後すぐに氷に戻した
。このPCR機（Perkin-Elmer 9600）は、示差的ディスプレイ用に以下のようにプ
ログラムを組んだ。
【０３３５】 94℃ 2分 *94℃ 15秒 *40℃ 2分 *＝×40 *ramp 72℃ 1分 *72℃ 30秒 72℃ 5分 4℃ 保持 このPCR機が94℃に達したときプレートを氷から取り出し、Perkin-Elmer 9600
PCR機に直接入れた。PCRの後15μlの負荷(loading)染料(80％ホルムアミド、10
mM EDTA、１mg/mlのキシレンシアノール、1mg/mlのブロモフェノールブルーを含
有する）を加えた。負荷染料と反応混合物を混合し、85℃で５分間インキュベー
トし、氷で冷却し、遠心分離し、氷上に載せた。各チューブから約４μlを取っ
てprerun(60V)６％アクリルアミドゲルに載せた。このゲルを約80Vで、最上の染
料前面が底から約１インチに達するまで走らせた。ゲルを3MM紙（Whatman Paper
、英国）に移し、真空中で乾燥した。バンドはオートラジオグラフィーで可視化
した。
【０３３６】 バンドの単離と増幅：示差的に発現したバンドを、乾燥したゲルからかみそり
の刃で切り出し、100μlのH2Oと共にマイクロ遠心管(microfuge tube)に入れ、
５分間100℃に加熱し、ボルテックスで掻き混ぜ、再び５分間100℃に加熱し、再
度ボルテックスで掻き混ぜた。冷却後、100μlのH2O、20μlの3Ｍ NaOAc、1μl
のグリコーゲン(20mg/ml)、および500μlのエタノールを加え、冷却した。遠心
分離後ペレットを洗浄し、10μlのH2Oに再懸濁させた。
【０３３７】 次に、こうして単離した示差的に発現したバンドを、以下の反応条件を用いて
PCRにより増幅した。
【０３３８】 58 μl H2O 10 μl 10×PCRバッファー 10 μl 200μm dNTP 10 μl 10μM 逆プライマー 10 μl 10μM 前方プライマー 1.5μl 増幅したバンド 0.5μl AmpliTaqポリメラーゼ（５単位/μl）（Perkin-Elmer） PCRは、本節で示差的ディスプレイに関して前記したプログラムを用いて実施
した。PCRの後、グリセロール負荷染料を加え、サンプルを２％調製用TAE/Bioge
l（Bio101、La Jolla、CA）アガロースゲルにかけ、溶出した。次いでバンドを
かみそりの刃でゲルから切り出し、室温にて15分間ボルテックスで掻き混ぜ、Bi
o101製のMermaidキットを用い、マイクロ遠心管中で３容量のMermaid高塩結合性
溶液と８μlの再懸濁したglassfogを加えることによって精製した。次にglassfo
gをペレット化し、エタノール洗浄溶液で３回洗浄した後、ＤＮＡを50℃で10μl
中に二回溶出させた。
【０３３９】 サブクローニング：増幅したバンドをサブクローニングするにはTAクローニン
グキット（Invitrogen、San Diego、CA）を用いた。典型的な連結反応混合物は
４μlの無菌H2O、１μlの連結バッファー、２μlのTAクローニングベクター、２
μlのPCR産物、および１μlのT4ＤＮＡリガーゼから成っていた。PCR産物の容量
は変えることができるが、PCR産物とH2Oの合計容量は常に６μlとした。（ベク
ターのみを含む）連結混合物は細菌の形質転換前に12℃で一晩インキュベートし
た。TAクローニングキットのコンピテント細菌(INVαF’：enda1, recA1, hsdR1
7(r-k, m+k), supE44, λ-, thi-1, gyrA, relA1,φ80lacZαΔM15Δ(lacZYA-ar
gF), deoR+, F'）を氷上で解凍し、各チューブに２μlの0.5Ｍβ‐メルカプトエ
タノールを加えた。各連結混合物の２μlを各チューブのコンピテント細胞(50μ
l)に加え、ボルテックスで掻き混ぜることなく混合し、氷上で30分間インキュベ
ートした。次にチューブを42℃の浴にちょうど30秒入れた後、２分間氷に戻した
。次いで、450μlのSOC培地（Sambrookら、1989年、上掲）を各チューブに加え
た後37℃で１時間振盪した。次に細菌をペレット化し、〜200μlのSOCに再懸濁
させ、X‐galおよび60μg/mlのアンピシリンを含有するLuriaブロス寒天プレー
トに撒き、37℃で一晩インキュベートした。次に白色のコロニーを摘出し、PCR
を用いてインサートに関してスクリーニングした。
【０３４０】 ２μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5 mM dNTP、0.1μlの25 mM MgCl2、0.
2μlのM13逆プライマー(100ng/μl)、0.2μlのM13前方プライマー(100ng/μl)、
0.1μlのAmpliTaq（Perkin-Elmer）、および15.8μlのH2Oを含有するマスターミ
ックスを作成した。40μlのマスターミックスサンプルを96ウェルプレートのチ
ューブに入れ、PCRの前にピペットチップで全細菌を加えた。PCR機（Perkin-Elm
er 9600）は、インサートスクリーニング用に以下のようにプログラムを組んだ
。
【０３４１】 94℃ 2分 *94℃ 15秒 *47℃ 2分 *＝×35 *ramp 72℃ 30秒 *72℃ 30秒 72℃ 10分 4℃ 保持 反応生成物を２％アガロースゲル上で溶出し、ベクターコントロールと比較し
た。インサートを含有するベクターを有するコロニーをLB/Ampプレート上に画線
することによって精製した。そのような菌株からベクターを単離し、Applied Bi
osystems Automated Sequencer（Applied Biosystems, Inc. Seattle, WA）を用
いて配列を解析した。
【０３４２】 ノーザン解析：ノーザン解析を実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子の
示差発現を確認した。ｍＲＮＡを検出するのに使用したプローブは以下のように
して合成した。典型的には２μlの増幅したバンド(〜30ng)、7μlのH2O、および
2μlの10×Hexanucleotide mix (Boehringer-Mannheim)を混合し、５分間95℃に
加熱した後、氷上で冷却した。増幅したバンドの容量は変えることができるが、
バンドとH2Oの合計容量は常に9μlとした。3μlのdATP/dGTP/dTTP混合物(各々0.
5 mMで1:1:1)、5μlのα32PdCTP(3000Ci/mM、合計50μCi)（Amersham, Arlington
, Heights, IL）、および１μlのKlenow（２単位)(Boehringer-Mannheim）を混
合し、37℃でインキュベートした。１時間後、30μlのTEを加え、反応混合物をB
iospin-6（登録商標）カラム（Biorad, Hercules, CA）上に載せ、遠心分離した
。溶出液のサンプル１μlを用い、scintillantを用いたシンチレーションカウン
ターで取込みを測定して、106cpm/μlの取込みが達成されたことを確認した。
【０３４３】 サンプルを変性アガロースゲル上に載せた。300 mlの１％ゲルは、３ｇのアガ
ロース（SeaKem（登録商標）LE, FMC BioProducts, Rockland, ME）と60 mlの5
×MOPSバッファーを210 mlの無菌H2Oに加えることによって作成した。5×MOPSバ
ッファー(0.1Ｍ MOPS(pH7.0)、40 mM NaOAc、5 mM EDTA(pH8.0))は、20.6gのMOP
Sを800 mlの50 mM NaOAc(800 mlの無菌H2O中の13.3 mlの3ＭNaOAcpH4.8)に加え、
次に10ＭのNaOHでpHを7.0に調節し、0.5ＭのEDTA(pH8.0)を10 ml加え、最終容量1
LになるまでH2Oを加えることによって作成した。混合物を融解するまで加熱した
後50℃に冷却し、この時点で５μlの臭化エチジウム(5mg/ml)と30 mlの37％ホル
ムアルデヒドのゲルを加えた。このゲルをすばやく回転させて混合した後すぐに
注いだ。
【０３４４】 ２μｇのＲＮＡサンプル、1×最終1.5×ＲＮＡ負荷染料（60％ホルムアミド、
９％ホルムアルデヒド、1.5×MOPS、0.075％XC/BPB染料）およびH2Oを混合して
最終容量を40μlとした。チューブを５分間65℃に加熱した後氷上で冷却した。1
0μgのＲＮＡ MW標本（New England Biolabs, Beverly, MA）も染料で変性させ
、ゲル上に載せた。ゲルをMOPS泳動バッファー中32Vで一晩泳動した。
【０３４５】 次にゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウムに45分間、50mMのNaOH/0.1ＭのNaClに3
0分間、0.1ＭのTris(pH8.0)に30分間、そして20×のSSCに20分間浸した。各々の
浸漬ステップは室温で振盪しながら行なった。次にゲルを蛍光ルーラーに沿って
写真に取った後、Sambrookら、1989年、上掲の方法に従ってHybond-Nメンブラン
(Amersham)を用いて20×のSSCに一晩ブロッティングした。
【０３４６】 ノーザンブロット・ハイブリダイゼーションは以下のように行った。プレハイ
ブリダイゼーションでは、10mlのラピッド−hyb溶液（Amersham）を含有するロ
ーラーボトルにブロットを入れ、少なくとも１時間、65℃のインキュベーターに
入れた。ハイブリダイゼーションでは、次いで１×107cpmのプローブを95℃まで
加熱し、氷上で冷却し、10mlのラピッド−hyb溶液に添加した。その後、プレハ
イブリダイゼーション溶液をプローブ溶液に交換し、３時間、65℃でインキュベ
ートした。次の日、室温で20分間2×SSC/0.1％SDSで一回、65℃で15分間0.1×SS
C/0.1％SDSで二回、ブロットを洗浄し、その後プラスチックラップで覆い、照射
にかけた。
【０３４７】 RT-PCR解析：RT-PCRを実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子から示差的
に発現したｍＲＮＡのレベルを検出した。第一ストランド合成は、20μlのDNase
を加えたＲＮＡ(〜2μg)、１μlのオリゴdT(Operon)（１μg）、および9.75μl
のH2Oを混合することによって実施した。サンプルを10分間70℃に加熱した後、
氷上で冷却した。反応混合物に10μlの第一ストランドバッファー(Gibco/BRL)、
5μlの0.1Ｍ DTT、1.25μlの20 mM dNTP(最終500μM)、1μlのRNAsin(40単位/μ
l)(Boehringer Mannheim) および2μlのSuperscript逆転写酵素(200単位/μl)(G
ibco/BRL)を加え、1時間42℃にインキュベートした後、５分間85℃にし、−20℃
に保存した。
【０３４８】 この逆転写したサンプルでPCRを実施した。各反応混合物は、2μlの10×PCRバ
ッファー、14.5μlのH2O、0.2μlの20 mM dNTP(最終200μM)、0.5μlの20μM前
方プライマー(最終0.4μM)、0.5μlの20μM逆プライマー(最終0.4μM)、0.3μl
のAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer/Cetus）、２μlのｃＤＮＡ希釈または
陽性コントロール(〜40pg)を含有していた。各実験で使用した特異的プライマー
は上記第４節の図面の説明に挙げてある。サンプルを94℃のPCR9600機に入れた
（高温開始）。このPCR機は以下のようにプログラムを組んだ。
【０３４９】 94℃ 2分(サンプル負荷) *94℃ 45秒 *＝35× *55℃ 45秒 *72℃ 2分 72℃ 5分 4℃ 保持
【０３５０】 反応はｃＤＮＡ希釈系列に対して行ない、いろいろなサイクルで72℃のステッ
プ中にチューブを機械から取り出した。反応生成物を1.8％アガロースゲル上で
溶出させ、臭化エチジウムで可視化した。
【０３５１】遺伝子の回収 ：該遺伝子の一部を含有した増幅配列をサブクローニングし、次い
で対応する遺伝子をコードするｃＤＮＡを回収するのにそれぞれ使用した。ベク
ターＤＮＡから得たサブクローン化挿入ＤＮＡを単離し、6.1.2節で上述したよ
うに32Ｐで標識することによってプローブを作製した。fchd602配列を含有する
標識挿入ＤＮＡは、ヒトマクロファージ細胞系U937から作製したｃＤＮＡライブ
ラリーをプローブするのに使用した。fchd605配列を含有する標識挿入ＤＮＡは
、ヒトの一次血液単球から作製したｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに使
用した。ｃＤＮＡライブラリーを作製し、当業界で通常行われている方法にした
がってスクリーニングを行った(Sambrookら、前掲、1989年参照)。プローブによ
って検出されたライブラリーから得たプラークを単離し、ファージベクター内の
ｃＤＮＡインサートを配列決定した。
【０３５２】 RACE法キットを、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに対する代替物として
、またはｃＤＮＡライブラリーが全長遺伝子をコードするクローンを生じない場
合に該遺伝子の隣接配列を得るために使用した。取扱説明書にしたがって操作を
行った(Clontech，CA、Palo Alto);Chenchikら，CLONTECHniques(X)1，5-8，1995
年;Barnes，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2216-2220，1994年;およびChengら
，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699)。増幅配列、またはｃＤＮＡライ
ブラリーからの単離物から得られた配列に基づいて、プライマーを設計した。ヒ
トの一次血液単球から、fchd605の鋳型ｍＲＮＡを単離した。
【０３５３】 6.1.3. ターゲット遺伝子の染色体上位置確定 ヌクレオチド配列が決定されれば特定の染色体上の遺伝子の存在が検出される
。ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、個々のヒト染色体を鋳型として用いるPCR反応に使用する。各23のヒト染
色体の個々のサンプルは市販されている(Coriel Institute for Medical Resear
ch, Camden, NJ)。次の条件に従って染色体ＤＮＡを増幅する。10ngの染色体Ｄ
ＮＡ、2μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5 mM dNTP、0.1μlの25mM MgCl2、
0.2μlの逆プライマー(100ng/μl)、0.2μlの前方プライマー(100ng/μl)、0.1
μlのTaqポリメラーゼおよび15.8μlのH2O。サンプルを94℃のPCR9600機に入れ
た（高温開始）。このPCRは以下のようにプログラムを組んだ。
【０３５４】 94℃ 2分(サンプル負荷) *94℃ 20秒 *＝35× *55℃ 30秒 *72℃ 30秒 72℃ 5分 4℃ 保持
【０３５５】 6.2. 結果 酸化LDLで処理した単球および未処理の単球について示差的ディスプレイを行
った。未処理の単球と比較して、酸化LDLによってアップレギュレートされるた
めfchd602およびfchd605に対応するバンドが検出された。ノーザンブロット分析
によって、アップレギュレーションを確認した。
【０３５６】 fchd602遺伝子は、酸化LDL、最小限に酸化したLDL、およびリソホスファチジ
ルコリンで５時間処理した後、アップレギュレートされた2.5kbのｍＲＮＡを産
生した。未処理または天然LDLで処理した対照単球ではメッセージは検出されな
かった。増幅ＤＮＡ配列を使用して、およそ182個のアミノ酸をコードするオー
プンリーディングフレームを含有するおよそ875bpのｃＤＮＡを回収した。fchd6
02遺伝子から得たこのｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を
図４に示す。オープンリーディングフレームは、ラットの肝臓の再生において誘
発され、インシュリン誘導性であり、複数の膜貫通ドメインも含有するラットCl
-6遺伝子に対して88％の配列類似性を示す(Diamond，R.H.ら，J. Biol.Chem.268
:15185-15192，1993年)。
【０３５７】 未処理の単球と比較して、fchd605は、酸化LDLで５時間処理した後ではアップ
レギュレートされた1.5bpのｍＲＮＡを産生したが、天然のLDLでの処理ではもっ
と少なかった。増幅ＤＮＡを配列決定し、これを使用して、配列決定によってお
よそ86個のアミノ酸をコードするおよそ258bpの部分オープンリーディングフレ
ームが明らかとなったおよそ2.2kbのｃＤＮＡを回収した。fchd605遺伝子から得
られたＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を図５A〜Bに示す。該配列は
、マウスの肺、精巣、および子宮で発現されるサイトカイン誘導性グリコシル化
タンパク質をコードするマウスのgly96遺伝子に類似性を示す。
【０３５８】 ７．実施例：パラダイムＤに応答して示差的に発現する遺伝子の同定：内皮細胞
ずれ応力 本発明により、示差的ディスプレイを用いて、in vitroで流体ずれ応力にかけ
た内皮細胞中で示差的に発現する遺伝子を検出した。ずれ応力は、異常な循環流
の領域におけるアテローム性動脈硬化症の損傷の原因として有力であると考えら
れている。パラダイムＤの方法を用いて３つの新規なＤＮＡ配列が同定された。
【０３５９】 fchd531遺伝子は、静的対照と比較して、乱流および層流ずれ応力の両方の下
で、内皮細胞中にダウンレギュレートされる。fchd531遺伝子は、新規な570個の
アミノ酸からなるポリペプチドをコードし、マウスのペンタ亜鉛フィンガー遺伝
子(Pzf)に94％配列類似性を示し、公表されていないが、受け入れ番号U05343号
としてGenBank配列データベースに含まれている。
【０３６０】 fchd540遺伝子は、層流ずれ応力下で内皮細胞にアップレギュレートされるが
、IL-1処理ではアップレギュレートされない。fchd540遺伝子は、ショウジョウ
バエ(Drosophila Mad)のタンパク質に配列類似性を示す新規な細胞間タンパク質
をコードする(Sekelskyら，Genetics 139:1347-1358，1995年)。
【０３６１】 fchd545遺伝子は、乱流ずれ応力下での内皮細胞および静的対照内皮膚細胞と
比較して、層流ずれ応力下で内皮細胞にダウンレギュレートされる。fchd545遺
伝子は、電圧依存性アニオンチャンネル・タンパク質に73％配列類似性を示す84
8個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする(Blachly-Dyson，E.ら，J. Bi
ol. Chem. 268:1835-1841，1993年)。fchd545遺伝子は、ヒト心臓、平滑筋、お
よび精巣でも発現される。
【０３６２】 ずれ応力を受けた内皮細胞でのfchd540遺伝子のアップレギュレーションおよ
びfchd531、fchd545遺伝子のダウンレギュレーションより、心血管疾患（アテロ
ーム性動脈硬化症、虚血症／再灌流、高血圧、および再狭窄が含まれるがこれら
に限定されない）の研究のためのフィンガープリントが得られる。これらの遺伝
子の１つであるfchd540がパラダイムＣ（IL-1誘発）でアップレギュレートされ
ないという事実より、ずれ応力に特異的な生理学的現象を区別し、標的とする非
常に有用な手段が得られる。
【０３６３】 さらに、膜貫通タンパク質として、fchd545遺伝子産物は、他の化合物によっ
て内皮細胞表面上で容易に誘発される(access)かまたは検出できる。したがって
、治験での化合物の有効性をモニターする場合と同様に、診断システムで心血管
疾患の状態を検出するのに優れた標的が得られる。さらに、この遺伝子産物の細
胞外部のドメインより、それらに結合する化合物を同定するための特に有効なス
クリーニングシステムを設計することを考慮した標的が得られる。このような化
合物は、膜貫通遺伝子産物の活性を調節することによって、心血管疾患を治療す
るのに有用である。
【０３６４】 7.1. 材料および方法 すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombosi
s, Vol. 3, P. Spaet, editor, Grune & Stratton Inc., New York, 1-28)、正
常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を20％牛胎児血清完全培地(
1989, J. Immunol. 142:2257-2263)で増殖させ、ずれ応力誘発の前に１〜３回継
代した。
【０３６５】 誘発のためには、第二継代HUVECを組織培養処理ポリスチレンに載せ、すでに
記載されているようにして(1994年、J. Clin. Invest. 94:885-891)10dyn/cm2の
層流に1時間および6時間、またはすでに記載されているようにして(1986年、Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2114-2117)３〜10dyn/cm2の乱流にかけた。Ｒ
ＮＡを、上記6.1節に記載したように単離した。上記6.1.2節に記載したように、
示差的ディスプレイ、ノーザン分析、RT-PCR、サブクローニング、およびＤＮＡ
配列決定を行った。示差的ディスプレイに使用した特定のプライマーは、以下の
とおりである： fchd531: for-T11XAおよびrev-AGACGTCCAC fchd540: for-T11XAおよびrev-ACTTCGCCAC fchd545: for-T11XCおよびrev-TCGGACGTGA 遺伝子の一部を含有する増幅した配列をサブクローニングした後、別個に使用
して対応する遺伝子をコードしているｃＤＮＡを回収した。プローブは、ベクタ
ーＤＮＡからサブクローニングした挿入ＤＮＡを単離し、6.1.2節で上述したよ
うに32Ｐで標識することによって作製した。標識挿入ＤＮＡを用いて、ずれ応力
誘導内皮細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをプローブした。該ライブラリ
ーは、当業界で通常行われる方法を使用して作製し、プローブした(Sambrookら
，前掲，1989年参照)。プローブによって検出されたライブラリーから得たプラ
ークを単離し、ファージベクター内のｃＤＮＡインサートを配列決定した。
【０３６６】 RACE法キットを、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに対する代替物として
、またはｃＤＮＡライブラリーが全長遺伝子をコードするクローンを生じない場
合に該遺伝子の隣接配列を得るために使用した。取扱説明書にしたがって操作を
行った(Clontech，CA、Palo Alto);Chenchikら，CLONTECHniques(X)1，5-8，1995
年;Barnes，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2216-2220，1994年;およびChengら
，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699)。増幅配列、またはｃＤＮＡライ
ブラリーからの単離物から得られた配列に基づいてプライマーを設計した。ずれ
応力をかけたHUVECから鋳型ｍＲＮＡを単離した。
【０３６７】 各種ヒト臓器および組織から抽出したＲＮＡのノーザンブロット解析は、市販
されているプレブロットフィルター(Clontech, Palo Alto, CA)を用いて行なっ
た。
【０３６８】 7.2. 結果 示唆的ディスプレイから得られた増幅fchd531断片をサブクローニングし、配
列決定し、全fchd531コーディング領域を含む1.9kbのｃＤＮＡを得るのに使用し
た。新規なfchd531遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を図１A
〜Dに示す。fchd531遺伝子は、570個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
し、マウスのペンタ亜鉛フィンガー遺伝子(Pzf)に94％配列類似性を示す(GenBan
k受け入れ番号U05343号)。乱流および層流ずれ応力をかけたHUVECのノーザン分
析より、fchd531遺伝子が、静的対照と比較して、乱流ずれ応力下ではなくて層
流ずれ応力下でダウンレギュレートされるおよそ５kbのメッセージを産生するこ
とが判明した。
【０３６９】 ずれ応力下でアップレギュレートされたメッセージとしてfchd540遺伝子を検
出した。増幅断片を使用して、層流ずれ応力で処理したHUVECから得られたサン
プルを含有するノーザンブロットをプローブした。層流ずれ応力で６時間処理し
た後、4.4kbのfchd540ｍＲＮＡがアップレギュレートされた。fchd540遺伝子は
、パラダイムＣの方法によるIL-1では誘導されない（上記5.1.1.5節）。増幅断
片を配列決定し、全fchd540コーディング領域を含有する2.7kbのｃＤＮＡを得る
のに使用した。fchd540遺伝子から得られるＤＮＡ配列およびコードされたアミ
ノ酸配列を図２A〜Eに示す。fchd540遺伝子は、426個のアミノ酸からなるポリペ
プチドをコードし、ショウジョウバエ(Dorosophila Mad)の遺伝子に配列類似性
を示す(Sekelskyら，Genetics 139:1347-1358，1995年)。
【０３７０】 ずれ応力下でダウンレギュレートされたメッセージとしてfchd545遺伝子を検
出した。ノーザン分析より、fchd545遺伝子が、静的対照と比較して、層流ずれ
応力ではなくて乱流ずれ応力によってダウンレギュレートされる1.4kbのメッセ
ージを産生することが判明した。増幅断片を配列決定し、完全なfchd545コーデ
ィング配列を含有する1.4kbのｃＤＮＡを単離するのに使用した。fchd545遺伝子
のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を図３A〜Cに示す。fchd545遺伝
子は、ヒトの電圧依存性アニオンチャンネルに73％の配列類似性を示す283個の
アミノ酸からなるポリペプチドをコードする(Blachly-Dyson,E.ら，J. Biol. Ch
em. 268:1835-1841，1993年)。市販のノーザンブロット（Clontech,PaloAlto,Ca
lifornia）によるノーザン分析より、fchd545遺伝子がヒトの心臓、平滑筋およ
び精巣で発現されることが明らかとなった。
【０３７１】 ８．実施例：臨床試験の代用マーカーとしてのパラダイムＡ下での遺伝子の使用
本発明にしたがって、5.1.1.1 節から5.1.1.6 節に記載したいずれかのパラダ イムから誘導されたフィンガープリントプロフィールを使用して、ヒト患者にお
ける薬剤の臨床試験をモニターすることができる。上記5.5.4 節で一般的に記載
したフィンガープリントプロフィールは特定の病状に対応する特定的な遺伝子調
節の特性的なパターンを示す。5.1.1.1 節に記載した、および例えば上記第６節
の例で示したパラダイムＡは酸性ストレス下における単球のフィンガープリント
プロフィールを提供する。従って、酸化LDLの取り込みに対する単球の生理的応
答を読み取ることにより、ターゲット遺伝子は代用マーカーとして作用する。こ
れによって、臨床試験を実施している患者の単球上に示差的ディスプレイが表れ
ることによって、酸化ポテンシャルに対する抗酸化薬剤の影響を測定することが
できる。
【０３７２】 8.1. 患者の処置および細胞の単離 抗酸化活性を有すると推測される化合物を試験患者に投与することができる。
対照患者にはプラシーボを与える。
【０３７３】 12時間の絶食後に各患者から血液を取り、上記第7.1.1 節のように単球を精製
する。上記第6.1.1 節にしたがってＲＮＡを単離することができる。次いでプラ
イマーを、fchd602およびfchd605のようなアップレギュレートされたものとして
、またはパラダイムＡでのダウンレギュレートされたものとして同定されたター
ゲット遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、増幅用に設計することができる。
【０３７４】 8.2. サンプルの分析 上記第6.1.2 節にしたがって、ＲＮＡを示差的ディスプレイ分析に供すること
ができる。上記第6.2 節にしたがって、パラダイムＡにおいて酸化LDLによって
アップレギュレートされたfchd602及びfchd605に対応するバンドの強度の減少に
よって、単球の生理的応答状態の減少が示される。
【０３７５】 ９．実施例：心血管疾患の状態のイメージング 本発明にしたがって、病気のまたは損傷された組織をイメージングするために
、患部組織の表面に位置する示差的に発現された遺伝子産生物をマーカーとして
使用することができる。示差的に発現された遺伝子産生物に特異的な複合抗体を
患者または試験動物に静脈内投与することができる。この方法は、病気のまたは
損傷した組織を侵害しないで可視化させるという利点を与える。
【０３７６】 説明の目的で、この方法をfchd602遺伝子産生物について詳細に記載する。こ
の原理および手法を、例えばfchd545遺伝子産生物を含む、いずれの膜貫通ター
ゲット遺伝子産生物に対しても適用することができる。
【０３７７】 9.1. モノクローナル複合抗体 上記第5.4.2 節の方法を使用して、fchd602遺伝子産生物などの示差的に発現
された表面遺伝子産生物が組換え体宿主中に発現され、精製される。好ましくは
、fchd602産生物の１以上の細胞外ドメインを含有するタンパク質断片が産生さ
れる。精製後、上記第5.4.3 節にしたがって、F(ab')2またはFab 断片を産生さ
せるのに使用される。その後、上記第5.8.3 節にしたがって、DTPAなどの複合金
属キレート剤を使用して、これらの断片をテクネチウム-99m（99mTc）で標識す
る。
【０３７８】 9.2．イメージング剤の投与および検出 アテローム性動脈硬化、再狭窄、または虚血／再潅流と診断された患者に対し
て、標識MAbを静脈内投与することができる。検出を可能にするために標識した
抗体が病気のまたは損傷した組織部位（または複数の部位）に局在して、fchd60
2遺伝子産生物と結合するのに十分な時間を与える。標識によって発生するシグ
ナルを光走査装置によって検出する。その後、検出されたシグナルを、fchd602
遺伝子発現がアップレギュレートされる単球などの細胞を示す組織の画像に転換
する。
【０３７９】 10．ターゲット遺伝子ペプチド配列に対するポリクローナル抗体 示されたｃＤＮＡのアミノ酸配列に相当するペプチド配列を選定し、合成およ
び抗体の製造のためにResearch Genetics(Huntsville,AL)に提出した。ペプチド
を文献の記載（Tam,J.P.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413；Tam,J.P
.,and Zavala,F.,1989,J.Immunol.Methods 124:53-61；Tam,J.P.,and Lu,Y.A.,1
989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9084-9088 ）にしたがって修飾し、同容量の F
reund アジュバンド中で乳化し、ウサギの背部の３，４箇所に１免疫当たり総量
で1.0 ml（ペプチド 0.5 mg）となるように皮下注入した。この動物に２および
６週間後に追加免疫し、４，８，および10週間目に採血した。血液を凝固させて
、遠心分離によって血清を採取した。
【０３８０】 使用したペプチドを下記に要約する。
【０３８１】fchd545 ペプチド抗体 名称 位置 配列 fchd545.1 48-63 YTDTGKASGNLETKYK fchd545.2 107-121 YGKKSGKLKASYKRD １１．実施例：RCHD534およびFCHD540遺伝子産物の相互作用 新規fchd540遺伝子およびそのヌクレオチド配列は、上記第７節に記載される
。fchd540遺伝子は、Drosophila Mad遺伝子と相同性を有する。rchd534遺伝子（
1995年6月7日に出願された本出願人の共同係属中の特許出願第08/485,573号に記
載され、それは参照としてここに全部組み込まれる）は、ずれ応力によって内皮
細胞でアップレギュレートされる別の遺伝子である。rchd534遺伝子のＤＮＡお
よびコードされたアミノ酸配列は、図６A〜Dに示される。rchd534遺伝子は、199
5年6月6日に、ジ・アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コ
レクション(the Agricultural Research Service Culture Collection)(NRRL)に
微生物FCHD534で寄託され、NRRL受託番号B-21459号で受託された。rchd534遺伝
子も、Drosophila Mad遺伝子と相同性を有する。Mad遺伝子は、TGF-βシグナル
伝達経路で役割を果たすことが示された(Sekelskyら，Genetics 139:1347-1358
，1995年;Chenら，Nature 383:691-696，1996年;Serraら，Nature Medicine 2:3
90-391，1996年)。TGF-βシグナル伝達は、アテローム性動脈硬化症および再発
性狭窄症に有益であると考えられる(Borderら，Nature Medicine 1:1000，1995
年;Graingerら，Nature Medicine 1:1067-1073，1995年;Kojimaら，J. Cell Bio
l. 113:1439-1445，1991年;Nikolら，J. Clin. Invest.，90:1582-1592，1992年
)。
【０３８２】 以下で記載されたデータは、rchd534およびfchd540タンパク質が互いに相互作
用することを示す。そしてこの相互作用は、TGF-βシグナル伝達の阻害に至る可
能性がある。さらに、これら２つの遺伝子の発現は、以下に記載するとおり、内
皮細胞に特異的である。これらの２つの遺伝子は、１）両方とも内皮細胞におい
て特異的に発現され、２）両方とも、ある種の条件下で内皮細胞においてアップ
レギュレートされ、３）内皮細胞で互いに相互作用するＭＡＤタンパク質をコー
ドし、４）TGF-βシグナル伝達（アテローム性動脈硬化症に有益であると考えら
れる）を阻害するので、rchd534およびfchd540タンパク質は、心血管疾患に治療
介入のための魅力的な標的である。特に、rchd534およびfchd540タンパク質の相
互作用または活性を阻害する治療管理は、心血管疾患治療に有益でありうる。
【０３８３】 さらに別の分析は、rchd534タンパク質がそれ自身と相互作用してホモダイマ
ーを形成することを例示する。したがって、rchd534タンパク質がそれ自身と相
互作用するのを阻害する治療管理は、心血管疾患治療に有益でありうる。
【０３８４】 さらに、以下に記載された分析は、rchd534およびfchd540タンパク質の両方が
、TGF-βシグナル伝達経路に含まれることが知られている他のタンパク質と新規
に相互作用することを示した。試験されたTGF-βシグナル伝達経路のタンパク質
メンバーとしては、MADR1(Hoodlessら，Cell，85:489-500，1996年)、MADR2(Epp
ertら，Cell，86:543-552，1996年)、DPC4(Rafteryら，Genetics，139:241-254
，1988年)、TβRI、TSR1、ActRIb、ALK3、およびALK6(Wieserら、EMBO J.，14:2199-2
208，1995年)が挙げられる。例えば、rchd534タンパク質は、MADR1、MADR2、DPC
4、と内皮細胞で強く、レセプターTβRIおよびActRIの活性形態と293（ヒト胚腎
）細胞で弱く相互作用する。fchd540タンパク質は、レセプターTβRIおよびALK6
の活性形態と293細胞と強く相互作用する。
【０３８５】 形質移入rchd543およびfchd540遺伝子が不在のとき、トランスフェクトされた
MADR1またはトランスフェクトされたＭＡＤＲ２は、BAECにおいてTGF-β誘導プ
ロモーターの誘導を20倍にした。この系でのトランスフェクトされたrchd534ま
たはトランスフェクトされたrchd540のいずれかの共発現は、誘導物を削除し、T
GF-βシグナル伝達に応答して核にMADR2が局在するのも防止した。したがって、
TGF-β経路に含まれるrchd534およびfchd540タンパク質が他のタンパク質と相互
作用するのを阻害する処理管理は、心臓血管の疾病の処置に有益でもある。上記
記載されるとおり、rchd534およびfchd540の発現は、内皮細胞に動脈組織内で特
異性がある。したがって、rchd534およびrchd540遺伝子は、限定されるものでは
ないが、癌性血管形成、炎症、および線維症を含めた内皮細胞を包含する種々の
炎症および線維増殖性障害での介在についての標的でありうる。
【０３８６】 11.1. 材料および方法 11.1.1. 酵母株、培地、および微生物技術 Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−ヒスチジンを欠く合成完全培
地を含めた標準酵母培地が製造され、酵母遺伝子操作は、記載のとおり行われた
(Sherman，Meth. Enzymol.、194:3-21，1991年)。標準プロトコールを用いて、酵
母の形質転換を行った(Gietzら，Nucleic Acids Res.，20:1425，1992年。Itoら
，J. Bacteriol.，153:163-168，1983年)。標準法により、酵母株からプラスミド
ＤＮＡを単離した(HoffmanおよびWinston，Gene，57:267-272，1987年)。
【０３８７】 11.1.2. プラスミドおよび酵母株の構築 PCRによって、ヒトfchd540のコーディング領域を増幅し、フレームで(in fram
e)pGBT9にクローン化して(Bartelら，Cellular Interactions in Development，
p153-159，1993年)、プラスミドpGBT9-fchd540を生じた。pGBT9-fchd540をツー
ハイブリッド・スクリーニング株HF7cに形質導入し、１つの生じた形質転換体を
、TB35とした。
【０３８８】 11.1.3. ツーハイブリッド・スクリーニング レシピエント株としてTB35を、ヒト胸ツーハイブリッド・ライブラリーを使用
して、実質的に記載された(Bartelら，上述文献，1993年)とおり、ツーハイブリ
ッドのスクリーニングを行った。
【０３８９】 11.1.4. 濾紙β−ガラクトシダーゼアッセイ 実質的に先に記載されたとおり(Brillら，Mol. Biol. Cell、5:297-312，1994
年)、濾紙β−ガラクトシダーゼアッセイ(ベータ-gal)アッセイを行った。
【０３９０】 11.2 結果 11.2.1. ツーハイブリッドアッセイによって測定されたrchd534とfchd540との
強力な物理的相互作用 PCRによって、fchd540コーディング配列を増幅し、pGBT9にクローニングして
、GAL4ＤＮＡ結合ドメイン−fchd540融合遺伝子を作製した。この構築物で、ス
クリーニング株HF7cを形質転換した。pGAD424に、rchd534コーディング配列をク
ローニングして(Bartelら、1993年、上掲)、GAL4転写活性ドメイン−rchd534融
合遺伝子を作製し、その後形質転換株Y187に使用した。
【０３９１】 GAL4ＤＮＡ結合ドメインを単独でコードするか、またはfchd540、rchd534、Dr
osophila Mad、DPC4またはp53にフレーム内で(in frame)融合した酵母発現プラ
スミドを、MATaのツーハイブリッド・スクリーニング株HF7cに形質転換させた。
GAL4転写活性ドメインを単独で、およびrchd534およびSV40に対するGAL4活性ド
メイン融合体をコードする酵母発現プラスミドを、MATαのツーハイブリッドス
クリーニング株Y187に形質転換した。p53およびSV40は、互いに相互作用し、実
験的タンパク質とは相互に作用すべきでない。HF7c形質転換体を、Ｌ−トリプト
ファンを欠く半固形の合成完全培地上でストライプ(stripe)として、増殖させ、
Y187形質転換体は、Ｌ−ロイシンを欠く半固形の合成完全培地上のストライプと
して育成された。ストライプの両方のセットを、単独の富YPADプレートの上にグ
リッド(grid)の形態でレプリカプレートし、反対の交配型のハプロイド株を30℃
で一晩交配させた。交配プレート上の酵母株を、二倍体について選択するＬ−ロ
イシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレートにレプリカプレートし
、30℃で一晩インキュベートした。Ｌ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠
く合成完全プレート上の二倍体株を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファンおよび
Ｌ−ヒシチジンを欠く合成完全プレートにレプリカプレート、HIS3発現およびＬ
−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレート上の濾紙をアッセ
イした。次の日に、濾紙を濾紙ベータ−ガラクトシダーゼアッセイにかけて、la
cZレセプター遺伝子の発現を測定した。HIS3発現を、30℃での成長の３日後に記
録した。結果を表３に示す。
【０３９２】 rchd534魚タンパク質が、fchd540餌(bait)タンパク質と強力に相互作用し、rc
hd534、MAD、DPC4、p53、およびGAL4DNA結合ドメイン餌タンパク質と相互作用し
ないことが分かった。この結果では、rchd534およびfchd540が、目立った特異性
を有して互いに強力に物理的に作用することが示された。
【０３９３】 11.2.2. fchd540と物理的に作用するタンパク質の同定 PCRによって、fchd540コーディング配列を増幅させ、pGBT9(Bartelら，上述文
献，1993年)にクローニングさせて、GAL4 ＤＮＡ結合ドメイン−fchd540融合遺
伝子を作った。HF7cをこの構築物で形質転換させて、株TB35を生じた。TB35は、
Ｌ−トリプトファンを欠く合成完全培地で成育し、Ｌ−トリプトファンおよびＬ
−ヒスタミンを欠く合成完全培地で成育せず、これは、GAL4 ＤＮＡ結合ドメイ
ンfchd540融合が、固有の転写活性化活性を示さないことを示した。
【０３９４】 TB35を、ヒト胸ツーハイブリッド・ライブラリーで形質転換し、500万の形質
転換体を得た。その形質転換体を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、および
Ｌ−ヒスチジンを欠く合成完全培地に載せて、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファ
ン、およびＬ−ヒスチジンを欠く合成完全培地で成育させるとともに、ベータ−
ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を発現した酵母コロニーを同定した。最も強
いベータ−ガラクトシダーゼ誘導を示す30の株が特徴づけられた。ライブラリー
・プラスミドをこれらの株から単離し、ｃＤＮＡ挿入物の全ての５'末端が配列
決定された。
【０３９５】 11.2.3. tchv03AおよびtchvR4Aの再形質転換および特異性試験 最も強い相互作用物(interactor)をコードしたプラスミドの内の２つは、rchd
534 ｃＤＮＡを含有することが分かった。プラスミドtchv03Aが、rchd534のアミ
ノ酸17-235をコードすると分かり、プラスミドtchvR4Aは、rchd534のアミノ酸25
-235をコードすると分かった。
【０３９６】 これらのrchd534ｃＤＮＡｓが、特異的にfchd540と物理的に相互作用するタン
パク質をコードすることが確認された。単独でGAL4 ＤＮＡ−結合ドメインをコ
ードするか、またはfchd540、rchd534、Drosophila Mad、DPC4およびp53にフレ
ーム内で融合してコードするかのいずれかの酵母発現プラスミドが、MATaのツー
ハイブリッドスクリーニング株HF7cに形質転換された。GAL4転写活性ドメイン(G
AL4 AD)単独をコードする酵母発現プラスミド、およびtchv03a、tchvR4AおよびS
V40に対するGAL4活性ドメイン融合体を、MATαのツーハイブリッドスクリーニン
グ株Y187に形質転換させた。p53およびSV40は、互いに作用し、試験タンパク質
とは作用すべきでない。HF7c形質転換体は、Ｌ−ロイシンを欠く半固形の合成完
全培地上にストラップとして繁殖させた。ストライプの両方のセットを、単独の
富YPADプレートの上にグリッドの形態でレプリカプレートし、反対の交配型のハ
プロイド株を30℃で一晩交配させた。交配プレート上の酵母株を、二倍体につい
て選択するＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレートにレ
プリカプレートし、30℃で一晩インキュベートした。Ｌ−ロイシンおよびＬ−ト
リプトファンを欠く合成完全プレート上の二倍体株を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリ
プトファンおよびＬ−ヒシチジンを欠く合成完全プレートにレプリカプレートし
、HIS3発現およびＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレー
ト上の濾紙をアッセイした。次の日に、濾紙を濾紙ベータ−ガラクトシダーゼア
ッセイにかけて、lacZレセプター遺伝子の発現を測定した。HIS3発現を、30℃で
の成長の３日後に記録した。結果は、以下の表に示される。試験タンパク質の各
組合せの間の物理的相互作用の強さまたは不在が列記される。強い相互作用は、
HIS3およびlacZレポーター遺伝子の両方の活性を起こす相互作用と定義される。
【０３９７】
【表３】 試験されたｃＤＮＡ−GAL4活性化ドメイン融合体 rchd534 tchv03Ａ tchvR4A SV40 GAL4 ADのみ GAL4 ＤＮＡ−結合ドメイン融合体 fchd540 強力 強力 強力 なし なし rchd534 なし なし なし なし なし Dros.MAD なし なし なし なし なし DPC4 なし なし なし なし なし p53 なし なし なし 強力 なし GAL4 ＤＮＡ− なし なし なし なし なし 結合ドメインのみ tchv03AおよびtchvR4A魚タンパク質が、fchd540餌タンパク質と強力に相互作
用し、rchd534、MAD、DPC4、p53、およびGAL4ＤＮＡ結合ドメイン餌タンパク質
とは相互作用しないことが分かった。これらの結果では、rchd534およびfchd540
タンパク質が、互いに強力に相互作用する成果であることを確認される。
【０３９８】 11.3. rchd534およびfchd540機能の別の分析 rchd534／fchd540タンパク質相互作用の重要性は、ヒト細胞および動物モデル
でのそれらの発現および活性を試験することによって確認された。
【０３９９】 11.3.1. 染色体の局在化 他のMAD相同体を含有するヒトゲノムの領域において、rchd534遺伝子は第１５
染色体に局在化し、fchd540遺伝子は第１８染色体に局在化していた。ヒトゲノ
ムのこれらの領域は、いくつかのヒト悪性腫瘍の病原性にも関与してきた。
【０４００】 11.3.2. 組織発現パターン in situハイブリダイゼーション技術を用いて、発現パターンを試験した。rch
d534およびfchd540遺伝子の両方の蛍光標識されたＤＮＡプローブは、ヒト頚動
脈の動脈内膜切断サンプルをプローブするために使用した。rchd534およびfchd5
40の発現は、頚動脈の層表面を覆う内皮細胞に特異的であった。さらに、rchd53
4遺伝子産物に対して作製されたウサギポリクローナル抗血清により、ヒト冠状
動脈などの大きな血管ならびにヒト心筋層内に存在するより小さな血管中に存在
する内皮が顕著に、かつ選択的に染色された。どちらの遺伝子も、平滑筋細胞お
よびマクロファージを含めた動脈組織サンプルに存在する他のいかなる細胞型で
の発現を示すことはなかった。
【０４０１】 特定の刺激に対する応答においても、両遺伝子の発現パターンを調べた。乱流
ずれ応力パラダイムの下ではなく、安定な層流ずれ応力（ＬＳＳ）パラダイムの
下で、またはHUVEC細胞において測定されるサイトカインrhIL-1β、TNFα、IFN
γもしくは活性TGFβによる刺激に対する応答において、両遺伝子は選択的にア
ップレギュレートされる。従って、rchd534およびfchd540遺伝子は、LSS刺激に
対して選択的に応答性であるようであり、非層流流体機械的刺激に対しても、試
験される他の任意の体液刺激に対しても応答性を呈さないことを示している。従
って、これらの２つの遺伝子が、（１）いくつかのヒト悪性腫瘍の病因に関与し
ているヒトゲノムの領域に局在し；（２）アテローム性動脈硬化症のプラークを
含む血管組織においてのみ見出される細胞型において特異的に発現され；（３）
安定な層流ずれ応力心血管疾患例の下でアップレギュレートされ；そして（４）
TGF-βシグナル伝達を特異的に阻害することから、rchd534およびfchd540は、腫
瘍増殖および血管新生を含む線維増殖性および腫瘍形成性障害の治療における治
療介入のための優れたかつ特異的な標的であることが示唆される。
【０４０２】 11.3.3. 細胞局在化 ウシの大動脈内皮細胞（BAEC）でのrchd534およびfchd540タンパク質の細胞の
局在は、TGF-βシグナル伝達経路に含まれる他のタンパク質に関係して試験され
た。全ての試験で、rchd534およびfchd540タンパク質は、細胞質に存在していた
。MADR2は、トランフェクトのみされた場合に細胞質に存在し、活性化TβRIとの
コトランスフェクトの場合またはTGF-βが培養培地に添加された場合には核に存
在した。MADR2とのrchd534またはfchd540のコトランスフェクションは、TGF-β
シグナル伝達に対応して核中でMADR2の局在化を阻止した。
【０４０３】 11.3.4. ヒト細胞でのタンパク質相互作用 上記記載のとおり酵母細胞で観察されたrchd534およびfchd540タンパク質の相
互作用は、哺乳動物の内皮細胞組織培養で試験された。ウシの大動脈の内皮細胞
（BAEC）または293細胞(ヒト胚腎細胞、ATCC受託番号CRL-1573号)のいずれかは
、rchd534およびfchd540タンパク質の両方をコードする構築物でトランスフェク
トし、各々、特異的な免疫沈降法と考えられる別個のフラグ(flag)ペプチドに融
合された。rchd534およびfchd540タンパク質は、293細胞およびBAECの両方から
製造された抽出物中で異種ダイマーとして共免疫沈降することが分かった。rchd
534およびfchd540の共免疫沈降は、これらのタンパク質が心血管疾患に生理学的
に関連するヒト細胞で相互作用することをさらに支持する。
【０４０４】 それら自身と、TGF-βシグナル伝達経路の他のタンパク質メンバー(MADR1、MA
DR2、DPC4、TbR1、TSR1、ActR1b、ALK3、ALK6)と相互作用するrchd534およびfch
d540タンパク質の能力は、この共免疫沈降法を用いて試験された。各遺伝子は、
単独で、および293細胞またはBAECのいずれかで他のTGF-β経路の遺伝子との種
々の組合せで形質移入された。rchd534タンパク質は、293細胞およびBAEC中にホ
モダイマーを形成した。fchd540タンパク質は、293細胞またはBAEC中にホモダイ
マーを形成しなかった。上記記述されたとおり、rchd534およびfchd540タンパク
質は、293細胞およびBAEC中に異種ダイマーを形成した。この相互作用は、同量
のタンパク質に対して293細胞よりBAECで約50倍強い。しかし、rchd534−fchd54
0タンパク質相互作用は、rchd534タンパク質とそれ自身との相互作用より明らか
に貪欲さが低かった。
【０４０５】 rchd534タンパク質は、293細胞およびBAEC中のMADR1、MADR2およびDPC4と相互
作用した。MADR1およびMADR2相互作用の強度は、293細胞およびBAECの間とおよ
そ同じであり、DPC4についてのBAECでよりかなり大きかった。fchd540タンパク
質は、293細胞中のMADR1、MADR2およびDPC4と非常に弱く相互作用した。rchd534
タンパク質は、TβRIおよびActRIの活性形態と強力に相互作用し、293細胞中の
活性化ALK6と弱く相互作用した。fchd540タンパク質は、活性化TβRIおよびALK6
レセプターと強力に相互作用し、293細胞中のTSRI、ALK3およびActRIbの活性化
形態と弱く相互作用した。したがって、rchd534およびfchd540タンパク質の相互
作用に加えて、それ自身とrchd534タンパク質との相互作用は、rchd534タンパク
質およびfchd540タンパク質と上記記載されたTGF-β経路中の他のタンパク質と
の相互作用と同じく、治療的介在のための優れた標的である。
【０４０６】 11.3.5. TGF-βシグナル伝達での発現の効果 TGF-βシグナル伝達経路でのrchd534およびfchd540の両方の効果を、in vitro
で試験した。一次BAECは、レポーター遺伝子に融合されたTGF-β応答性プロモー
ターを含有するp3TP-Luxと称される構築物にトランスフェクトされた(Wranaら、
19944、Nature、370:341-347)。pCI発現ベクター(Promega)中のrchd534遺伝子ま
たはfchd540遺伝子が、MADR1と、または無しで(pCMV5MADR1-フラグ゛、Hoodlessら
、Cell、85:489-500、1996年)またはMADR2(pCMV5MADR2-フラグ、Eppertら、Cell
、86:543-552、1996年)でトランスフェクトされた。TGF-βの応答は、MADR1また
はMADR2によって20倍に誘導された。rchd534またはfchd540のいずれかの共発現
は、この誘導を完全に排除した。したがって、rchd534およびfchd540タンパク質
は、内皮細胞でのMADR1-およびMADR2-媒介TGF-βシグナル伝達を阻害した。この
阻害効果の特異性を確認するために、MAD様シグナル伝達機能を破壊することが
予測され得るショウジョウバエ相同体(Sekelskyら, 1995, Genetics 139:1347-5
8;Raftery,1995, Genetics 139:241-54; Newfeldら,1996,Development 122:2099
-108;Wiersdoffら,1996,Development 122:2153-62)において同定される既知の変
異に基づいて、rchd534またはfchd540の部位特異的突然変異体を構築した。野生
型rchd534およびfchd540とは異なり、これらの変異型タンパク質は、TGF-βに応
答してp3TPプロモーターの活性化を阻害することができなかった。変異型および
野生型タンパク質の発現レベルは似通っており、このことは機能の喪失が二次的
な不安定性によるものではないことを示す。
【０４０７】 興味深いことに、TGFβシグナル伝達において機能するMAD3のC.elegans相同体
であるSmad3は、MH2ドメインにおけるC.elegans MAD2相同体Smad2と90%以上同一
である。このことはまだ直接検討されていないが、おそらく、fchd540遺伝子のC
.elegans相同体Smad7は、TGFβ受容体によるSmad3の会合および活性化を妨げる
、すなわち、Smad3のリン酸化およびTGF-βシグナル伝達経路のタンパク質成分
との会合を妨げるため、その阻害と同様に機能すると考えられる。
【０４０８】 これらの結果は、さらに、rchd534タンパク質またはfchd540タンパク質のいず
れかと、MADR2と、または活性化TβR1との相互作用が、治療的介在についての優
れた標的であることを示す。上に記載されたとおり、rchd534およびfchd540の発
現は、動脈組織内で、内皮細胞に特異性がある。したがって、rchd534およびfch
d540遺伝子は、限定されないが、癌性血管形成、炎症、および線維症を含めた内
皮細胞を含む種々の炎症および線維増殖性疾患で介在するための標的である可能
性がある。
【０４０９】 12. 実施例:RCHD534およびFCHD540発現の阻害のためのアンチセンスおよびリボ
ザイム分子 上記第5.6.1.1節に示した概念は、rchd534またはfchd540遺伝子のような、タ
ーゲット遺伝子の発現を阻害するうえで使用されるオリゴヌクレオチドを設計す
るのに使用できる。
【０４１０】 以下のアンチセンス分子は、rchd534遺伝子の発現を阻害するのに使用できる
：アンチセンス ： ａ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-14から+3に相補的である5'-CATTTCATTT
CATACAA-3' ｂ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-20から+3に相補的である5'-CATTTCATTT
CATACAATATATG-3' ｃ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-26から+3に相補的である5'-CATTTCATTT
CATACAATATATGGCCTTT-3' ｄ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-32から+3に相補的である5'-CATTTCATTT
CATACAATATATGGCCTTTTGTGGC-3' ｅ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-29から+6に相補的である5'-GGACATTTCA
TTTCATACAATATATGGCCTTTTGT-3' ｆ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-29から-1に相補的である5'-TTCATTTCAT
ACAATATATGGCCTTTTGT-3' ｇ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-29から-7に相補的である5'-TCATACAATA
TATGGCCTTTTGT-3' ｈ）図６A-６Dでrchd534のヌクレオチド-29から-13に相補的である5'-AATATATGG
CCTTTTGT-3'
【０４１１】 以下のアンチセンス分子は、fchd540遺伝子の発現を阻害するのに使用できる
： ａ）図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-14から+3に相補的である5'-CATGCGG
GGCGAGGAGG-3' b)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-20から+3に相補的である5'-CATGCGGGG
CGAGGAGGCGAGGA-3' c)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-26から+3に相補的である5'-CATGCGGGG
CGAGGAGGCGAGGAGAAAAG-3' d)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-32から+3に相補的である5'-CATGCGGGG
CGAGGAGGCGAGGAGAAAAGTCGTTT-3' e)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-29から+6に相補的である5'-GAACATGCG
GGGCGAGGAGGCGAGGAGAAAAGTCG-3' f)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-29から-1に相補的である5'-GCGGGGCGA
GGAGGCGAGGAGAAAAGTCG-3' g)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-29から-7に相補的である5'-CGAGGAGGC
GAGGAGAAAAGTCG-3' h)図２Ａ−２Ｅでfchd540のヌクレオチド-29から-13に相補的である5'-GGCGAGGA
GAAAAGTCG-3'
【０４１２】リボザイム ハンマーヘッド・リボザイム分子の中央の触媒部分は、以下の配列から構成さ
れる： 5'-CAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUC-3' ここで、５'−近傍ＣＡ塩基は、標的ｍＲＮＡ中の相補的5'-UG-3'とハイブリダ
イズする。最初の４つの下線付き塩基は、下線付き塩基の第二のセットと塩基対
をなすことによってステムを形成し、それとともに、Ｘ′ｓとして示される介在
塩基は、対でないループを形成する。標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするために
、ハンマーヘッド・リボザイムは、上に示された中央セグメントの各末端に吊下
がる付加塩基を含有する。５'リボザイム吊下げセグメントは、標的ＵＧのすぐ
３'で各々吊下げ配列に相補性がある。そして、３'吊下げセグメントは、標的Ｕ
の上流の２つの塩基を始め、５'向きに拡張する各々吊下げ配列に相補性がある
（効果的に、標的Ｕの上流の第一の塩基を飛ばす）。標的5'-UG-3'部位でのＵの
上流（すなわち、５'に）で第一と第二の塩基の間に切断が生じる。
【０４１３】 以下のリボザイム分子はfchd534遺伝子の発現を阻害するのに使用できる：
ａ）図６Ａ−６Ｄでヌクレオチド716および717の間のfchd534mRNAを切断する5'-
GGUGGAGCCCCAGGGCAUUACCUCAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCGUGGGCAAGGUGGGCACUCAGGUGG
G-3' ｂ）図６Ａ−６Ｄでヌクレオチド1040および1041の間のfchd534mRNAを切断する5
'-GUGUCUCUAUGGGUUUGCCCAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCUCUGGACAUUUCAUUUCAUAC-3' ｃ）図６Ａ−６Ｄでヌクレオチド1421および1422の間を切断する5'-GGCCCUCUCGC
CGUCGGGCUCCUUGCUGAGCAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCGAUGCCGAAGCCGAUCUUGCUGCGCG-3'
【０４１４】 以下のリボザイム分子はrchd540遺伝子の発現を阻害するのに使用できる：
ａ）図２Ａ−２Ｅでヌクレオチド-53および-52の間のrchd540mRNAを切断する5'-
CGUUUGCCUGCUAAGGAGCGAACAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCGAUGUUUCUUUGUGAGUCGGGCGCCG
-3' ｂ）図２Ａ−２Ｅでヌクレオチド-1および+1の間のfchd540mRNAを切断する5'-CG
CCGGACGAGCGCAGAUCGUUUGGUCCUGAACAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCCGGGGCGAGGAGGCGAGG
AGAAAAGUCG-3' ｃ）図２Ａ−２Ｅでヌクレオチド+602および+603の間のfchd540mRNAを切断する5
'-GGAGUAAGGAGGGGGGGGAGACUCUAGUUCGCAAAGCNGNXXXXNCNGAGNAGUCAGUCGGCUAAGGUGA
UGGGGGUUGCAGCACACC-3'
【０４１５】 13. 実施例 fchd540の発現は、膵臓癌における腫瘍形成を増強する 以下に示す結果から、fchd540タンパク質はTGFβ応答を阻害し、細胞増殖の増
加を招くことがわかる。したがって、fchd540またはrchd534等の負の調節タンパ
ク質の活性または発現の阻害は、TGFβ応答の活性化または増強、したがって、
線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患の抑制に有用である。
【０４１６】 以下の結果から、fchd540mRNAレベルは、ヒト膵臓癌で高いことが、正常な膵
臓との比較によってわかる。さらに、in situハイブリダイゼーション実験から
、fchd540は、腫瘍塊内の膵臓癌細胞で過剰発現されることがわかる。全長fchd5
40発現構築物でCOLO-357およびPANC-1ヒト膵臓癌細胞系を安定的にトランスフェ
クトすると、TGFβ応答の完全喪失を招く。トランスフェクトされていない細胞
と違って、fchd540を過剰発現する細胞は、TGFβの存在下で増殖し続けた。
【０４１７】 13.1. 材料と方法 13.1.1. 材料 次の材料を購入した：Irvine Scientific(Santa Ana, California)から、FBS、
DMEM培地およびPRMI培地、トリプシン溶液、ペニシリン−ストレプトマイシン溶
液、およびGeneticin(G418)；New England Nuclear(Boston, Massachusetts)か
ら、Genescreen膜；Boehringer Mannheim(Indianapolis, Illinois)から、制限
酵素、ランダムプライミング標識キット、Genius 3非放射性核酸検出キット、お
よびGenius 4 RNA標識キット；Millipore(Bedford, Massachusetts)から、Immob
ilon P膜；ならびにNeoMarkers(Fremont, California)から、p21Cip1 (AB-3)抗
体；USB(Cleveland, Ohio)から、Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing；Amer
sham(Arlington Heights, Illinois)から、[α-32P]dCTP、[α-35S]dATP、およびH
ybond N+膜；Gibco BRL(Gaithersburg, Maryland)から、Lipofectamine。他の試
薬は全て、Sigma(St. Louis, Missouri)から購入した。PANC-1、MIA PaCa-2、AS
PC-1、CAPAN-1ヒト膵臓細胞系は、ATCC(Rockville, Maryland)から入手した。
【０４１８】 13.1.2. 組織サンプル 正常なヒト膵臓組織サンプル（N=12、男性７例、女性５例、年齢中央値41.8才
、年齢範囲14〜68才）およびヒト膵臓癌組織（N=16、男性１０例、女性６例、年
齢中央値62.6才、年齢範囲53〜83才）を、臓器供与プログラムを通じて、および
手術中の膵臓癌患者から入手した。Union Internationale Contre 1e Cancer(UI
CC)TNM分類によると、６つの腫瘍はステージ１、１つの腫瘍はステージ２、９つ
の腫瘍はステージ３の管腺癌であった。新たに摘出した組織サンプルを、10%ホ
ルムアルデヒド溶液中で12〜24時間固定し、組織学的分析用にパラフィン包埋し
た。さらに、外科的摘出後直ちに組織サンプルを液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出
のために使用するまで、-80℃に維持した。
【０４１９】 13.1.3. RNA抽出およびノーザンブロット分析 １段階酸グアジニウムチオシアナートフェノールクロロホルム法で総RNAを抽
出し、オリゴ-dTセルロースを用いたアフィニティクロマトグラフィで、poly(A)
+RNAを調製した（Baldwin, et al., 1996, Int. J. Cancer 6:283-288）。サイ
ズ分画ＲＮＡをナイロン膜上に電気転写した。ブロットを３２Ｐ標識fchd540 cD
NAプローブとハイブリダイズさせ、-80℃にてKodak Biomax MSフィルムに曝露し
た。１90bpの7S cDNAプローブ、および150bpのβ−アクチンcDNAプローブを使用
して、それぞれ、総RNAの等価ローディングおよびポリ(A)+RNAローディングを確
認した（Baldwin, et al., 1996, Int. J. Cancer 6:283-288、Korc et al., 199
2, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360）。具体的には、正常な膵臓組織６例、お
よび膵臓癌８例からの総RNA(20μg/レーン）を、標識fchd540 cDNAプローブ（50
0,000cpm/ml）を使用したノーザンブロット分析に供した。ローディングおよび
転写の対照として、７ＳリボソームcDNAプローブ（50,000cpm/ml）を使用した。
曝露時間は、fchd540の場合には２日、７Ｓの場合には６時間であった。細胞系
分析の場合、ASPC-1、CAPAN-1、COLO-357、MIA-PaCa-2、PANC-1、およびT3M4膵臓
癌細胞系およびヒト胎盤から単離したポリ(A)+RNA(2μg/レーン）を、３２Ｐ標
識fchd540 cDNAプローブ（500,000cpm/ml）を使用したノーザンブロッティング
で分析した。ローディングおよび転写の対照として、ヒトβ−アクチンcDNAプロ
ーブ（50,000cpm/ml)を使用した。曝露時間は、fchd540の場合には1日、β-アクチンの 場合には2時間であった。COLO-357およびPANC-1膵臓癌細胞の、親クローン、偽ト
ランスフェクトクローン、および上記の4種のfchd540トランスフェクトクローン
を、３２Ｐ標識fchd540 cDNAプローブ（500,000cpm/ml）を使用したノーザンブロ
ット分析に供した。曝露時間は２日であった。レーンの等価ローディングを、Ｒ
ＮＡの臭化エチジウム染色で確認した。
【０４２０】 13.1.4. in situハイブリダイゼーション 組織切片（厚さ４μｍ）を、3-アミノプロピル−メトキシシラン被覆スライド
に載せ、脱パラフィン化し、0.2N HClと共に２３℃にて２０分間インキュベート
し、40μg/mlプロテイナーゼＫと共に３７℃にて１５分間インキュベートした。
次いで、この切片を、４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）中で５分間後固定し、2mg/mlグリシンを含有するPBSと共に短時間、２
回インキュベートし、50%(V/V)ホルムアミド/2×SSC中で、１時間、１回インキ
ュベートしてから、ジゴキシゲニン標識fchd540リボプローブを含有するハイブ
リダイゼーション用緩衝液100μlを用いてハイブリダイゼーションを開始した。
【０４２１】 プローブは、Genius 4 RNA 標識キットを使用して、17または5P6 RNAポリメラ
ーゼによりジゴキシゲニン−UTPで標識した。ハイブリダイゼーションは、湿度
の高いチャンバー内で、42℃にて16時間実施した。次いで、切片を、1%(W/V)ブ
ロッキング試薬と共に23℃にて60分間インキュベートし、Genius 3非放射性核酸
検出キットを使用して、アリカリホスファターゼ結合ポリクローナルヒツジ抗ジ
ゴキシゲニンFabフラグメント抗体の1:2000希釈液と共に23℃にて30分間インキ
ュベートした。この切片を、暗い箱の中で、ニトロブルーテトラゾリウムおよび
Ｘ−リン酸を含有する着色剤溶液と共に２〜３時間インキュベートした後、水性
マウンティング培地に入れた。
【０４２２】 13.1.5. 細胞培養 ヒト膵臓癌細胞を、10%FES、100U/mlペニシリン、および100pg/mlストレプト
マイシンを加えたDMEM(COLO-357、MIA-PaCa-2、PANC-1)またはRPMI(ASPC-1、CAP
AN-1、T3M4)（完全培地）で、普通に増殖させた。TGFβ1の非存在下および存在
下で、無血清培地(0.1%BSA、5μg/mlトランスフェリン、5ng/ml亜セレン酸ナト
リウム、および抗生物質を含有するDMEM)中で細胞をインキュベートし、続いて3
-(4,5-メチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（M
TT、62.5μg/ウェル）を４時間加えることにより、増殖アッセイを実施した(Rai
tano,et al., 1993, J. Biol. Chem. 265: 10466-10472)。膵臓癌細胞の場合、
ＭＴＴアッセイの結果は、血球計を用いた細胞計数および[3H]−チミジン取りこ
みのモニタリングにより得られた結果と相関関係があった(Raitano et al., 199
3, J. Biol. Chem. 265: 10466-10472、Baldwin et al., 1993, Growth Factors,
8:23-34)。二重軟寒天アッセイで、基礎足場非依存性増殖を分析した(Kornmann
et al., 1998, J. Clin. Invest. 101, 344-352)。14日後、コロニーを顕微鏡
で計数し、MTT溶液で12時間染色した。
【０４２３】 13.1.6. ヌードマウスにおける増殖 偽トランスフェクトCOLO-357細胞またはfchd540トランスフェクトCOLO-357細
胞(2×106)を、４〜６週齢の、メス、無胸腺（ヌード）マウスの２つの側部に皮
下注入した。この動物を、６〜12週間にわたって毎週、腫瘍形成についてモニタ
リングした。腫瘍体積を、π／４×腫瘍の幅×高さ×長さとして算出した(Kornm
ann et al., 1998, J. Clin. Invest. 101, 344-352)。
【０４２４】 13.1.7. 恒常性および一過性のトランスフェクション fchd540.pCI.neoをCOLO-357細胞およびPANC-1細胞にリポフェクトアミン法で
トランスフェクトした。コンフルエントに達した後、選択培地(COLO-357およびP
ANC-1細胞の場合、それぞれ、0.4mg/mlおよび1mg/mlのG418を加えた完全培地）
で、細胞を1:10に分配した。２〜４週後、単一クローンを単離した。クローンの
増殖後、クローンからの細胞を、ノーザンブロット解析により、fchd540の発現
についてスクリーニングした。ネオマイシン耐性遺伝子(pRSVneo)を含有する対
照の発現べクターを用いて、親株のCOLO-357細胞およびPANC-1細胞をトランスフ
ェクトし、結果として得られたクローンを偽トランスフェクトクローンと名づけ
た。陽性クローンを、普通に選択培地中で増殖させた。
【０４２５】 一過性のトランスフェクションの場合、24ウェルプレートに、細胞を25,000細
胞／ウェルの密度で一晩プレーティングし、500μl無血清培地に含まれる1.5μl
/ウェルのリポフェクトアミンおよび0.5μgプラスミド／ウェルを使用して、p3T
P-Luxプラスミドで一過性にトランスフェクトした。５時間インキュベートした
後、20%FBSを含有する同量の培地を１２時間加えた。次いで、細胞を完全培地中
で24時間インキュベートし、続いて無血清培地中で12時間インキュベートしてか
ら、TGFβ1を加えた。細胞を、25mM Tris HCl(pH 7.8)、2mM DTT、2mM EGTA、10
% グリセロールおよび1% Triton X-100を含有する溶解緩衝液で可溶化した。20m
M トリシン、1.07mM 重炭酸マグネシウム、2.67 mM硫酸マグネシウム、0.1mM ED
TA、530 μM ATP、470μM ルシフェリン、270μM コエンザイムＡ（ナトリウム
塩）、および33.3mM DTTを含有する基質溶液を加えた後、ルミノメーター（Mono
light 2010B: Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, California）
を用いて10秒間、ルシフェラーゼを解析した。
【０４２６】 13.1.8 イムノブロッティング 細胞を、50mM TRIS、150mM NaCl、1mM EDTAEDTA、1μg/ml ペプスタチンＡ、1
mM フェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)、および1% Triton X-100を含有す
る溶解緩衝液で可溶化した。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS-PAGE）に供し、Immobilon P膜に転写し、指示した抗体と共に90分間イン
キュベートし、マウスIgGまたはウサギIgGに対する二次抗体と共に60分間インキ
ュベートした。増強した化学発光によって可視化した。
【０４２７】 13.1.9. 統計学 統計解析にStudentのｔ検定を使用し、p<0.05を有意性のレベルトとして考え
た。ＭＴＴ細胞増殖アッセイおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの
結果を、別々の少なくとも３回の実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）と
して表した。
【０４２８】 13.2. 結果 13.2.1. ヒト膵臓組織および膵臓癌細胞系におけるfchd540発現 fchd540の発現パターンを試験するために、ノーザンブロット分析を実施して
、正常組織を膵臓癌組織と比較した。ノーザンブロット分析では、12の正常な膵
臓組織サンプル中の３つの組織で、弱い4.4kbのfchd540 mRNA転写物が明らかに
され、16の膵臓癌サンプル中７つのサンプルで、中程度のレベルから高レベルの
、このmRNA部分が明らかにされた。
【０４２９】 膵臓癌細胞系がfchd540 mRNAを発現するかどうかを決定するために、２つの方
法を採用した。第１に、６つの膵臓癌細胞系から単離されたポリ(A)+RNAのノー
ザンブロット分析では、ASPC-1、CAPAN-1、COLO-357、およびPANC-1細胞で、中
程度レベルの、このmRNA部分を示し、MIA-PaCa-2およびT3M4膵臓癌細胞では比較
的低レベルであった。これらの組織におけるfchd540の局在をさらに調べるため
に、ノザンブロットでfchd540を過剰発現した癌サンプルで、in situハイブリダ
イゼーションを実施した。fchd540 mRNAは、腫瘍塊内の癌細胞中に豊富にあり、
関連血管の内皮層にも存在した。センスプローブを用いたin situハイブリダイ
ゼーションで、特異的なシグナルは生じなかった。
【０４３０】 13.2.2. COLO-357およびPANC-1膵臓癌細胞におけるfchd540過剰発現の影響 膵臓癌細胞系におけるfchd540過剰発現の機能的作用を調査するために、全長f
chd540構築物を用いて、COLO-357およびPANC-1を安定にトランスフェクトした。
選択培地で４週間増殖させた後、全体で、２０の独立したCOLO-357クローンおよ
び１０のPANC-1クローンを選択した。次の実験を、各細胞系からの４つのクロー
ンで実施した。これらのクローンは、全RNAのノーザンブロット分析で高いfchd5
40 mRNAレベルを示したため、選択された。
【０４３１】 TGFβ1は、７２時間インキュベートした後、野生型および偽（対照）トランス
フェクトCOLO-357細胞の増殖を阻害し、1nM TGFβ1の濃度で最大効果が生じた(-
41%、p<0.01)。対照的に、同じ条件で、TGFβ1は、fchd540を過剰発現するCOLO-3
57クローンの増殖を阻害しなかった（図７Ａ）。
【０４３２】 TGF-β1は、野生型PANC-1細胞および偽トランスフェクトPACN-1細胞の増殖を
阻害し、1nM TGFβ1の濃度で最大作用が生じた(-29%、p<0.01)。対照的に、同じ
条件で、TGF-β1は、PANC-1クローンを過剰発現するfchd540の増殖を阻害しなか
った（図７Ｂ）。
【０４３３】 野生型および偽トランスフェクトCOLO-357細胞は、２９〜３１時間という指数
倍化時間を示した。fchd540を過剰発現するCOLO-357クローンは、類似した倍化
時間（３０〜３８時間）を示した。親クローン、偽トランスフェクトクローン、
およびfchd540トランスフェクトPANC-1クローンでは、倍化時間に有意差が認め
られなかった（２４〜２６時間）。しかし、野生型および偽トランスフェクトCO
LO-357細胞は、-1.0%というコロニー形成効率を示したが、fchd540トランスフェ
クトクローンは12%〜14%という、有意に(p<0.001)高いコロニー形成効率を示し
た（図８Ａ）。親および野生型PANC-1細胞は、-28%という比較的高いコロニー形
成効率を示し、fchd540トランスフェクトPANC-1クローンで認められたものと有意
な差はなかった（図８Ｂ）。
【０４３４】 fchd540を発現するCOLO-357クローンの高い足場非依存性増殖が、結果としてi
n vivoでの高い腫瘍形成につながるかどうかを調べるために、２×１０６の偽ト
ランスフェクトCOLO-357細胞またはfchd540トランスフェクトCOLO-357細胞を、
無胸腺（ヌード）マウスの各部位に皮下注入し、腫瘍増殖を毎週測定した。fchd
540を発現するCOLO-357クローンは、偽トランスフェクト細胞と比較して、早期
且つ急速な腫瘍増殖を示した（図８Ｃ）。
【０４３５】 総合的に考えると、この実施例で示された結果から、fchd540 mRNAレベルは、
正常な膵臓と比較して、ヒト膵臓癌のかなりの割合で上昇していたことがわかる
。腫瘍塊内の癌細胞で、fchd540の発現が検出された。さらに、培養ヒト膵臓癌
細胞系は、低レベルで発現されるfchd540を示した。
【０４３６】 最後に、２つのTGFβ感受性細胞系におけるfchd540の過剰発現は、結果として
TGFβ応答の完全喪失を招いた。この観察結果から、fchd540の高発現は、膵臓癌
等のTGFβ関連腫瘍形成疾患においてTGFβ応答を阻害でき、したがって、異常な
TGFβシグナル伝達が関与する線維増殖性疾患および腫瘍形成疾患状態に対する
治療介入の特異的標的となる、ことがわかる。
【０４３７】 14．微生物の寄託 以下の微生物は、提示した日に、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)に
寄託され、提示の受託番号が付与された。：微生物 ATCC受託番号 寄託の日付 pFCHD531 69983 1996年2月7日 pFCHD540 69984 1996年2月7日 fchd545 69974 1996年1月5日 が付与された。
【０４３８】 以下の微生物は、提示された日付に、イリノイ州、ペオリアのアグリカルチュ
ラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション(the Agricultural Rese
arch Service Culture Collection)(NRRL)に寄託され、提示の受託番号が付与さ
れた。
【０４３９】微生物 NRRL受託番号 寄託の日付 FCHD534 B-21459 1995年6月6日
【０４４０】 本発明は、ここに記載された特定の具体例によって範囲を限定されず、そのこ
とは、本発明の個々の態様のたんなる例示として示され、機能的に同等な方法お
よび成分は、本発明の範囲内にある。実際、ここで示されそして記載されたもの
に加えて、本発明の種々の変更は、先述の記載および添付の図面から当業者には
明らかである。このような変更は特許請求の範囲に入るものとする。
【０４４１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１A〜１Dは、fchd531遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図２】 図２A〜２Eは、fchd540遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図３】 図３A〜３Cは、fchd545遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図４】 図４A〜４Bは、fchd602遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図５】 図５A〜５Bは、fchd605遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図６】 図６A〜６Dは、rchd534遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ
酸配列である。
【図７】 図７A〜７Bは、fchd540がTGF-β媒介増殖阻害に与える影響を示す。
【図８】 図８A〜８Cは、fchd540でトランスフェクトした細胞系の定着した独立の増殖
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 9/08 9/08 9/10 １０１ 9/10 １０１ 9/12 9/12 9/14 9/14 27/02 27/02 29/00 29/00 35/00 35/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/566 33/566 33/68 33/68 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA40 BB20 CB01 CB17 CB21 CB30 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 FB03 FB04 FB05 FB07 JA01 JA06 4B024 AA01 AA11 BA44 CA04 CA12 GA18 HA14 HA15 4C084 AA13 AA17 MA01 NA14 ZA332 ZA362 ZA392 ZA422 ZA452 ZA512 ZB112 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA33 ZA36 ZA39 ZA42 ZA45 ZA51 ZB11 ZB21 ZB26 【要約の続き】

Claims (53)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 rchd534遺伝子もしくはfchd540遺伝子の発現をモジュレート
    するか、または該遺伝子によりコードされるタンパク質産物の活性をモジュレー
    トする被験物質の能力をアッセイすることを含む、線維増殖性疾患または腫瘍形
    成関連疾患の症状を軽減する能力について被験物質を同定する方法。
  2. 【請求項２】 線維増殖性疾患が糖尿病性網膜症である、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 腫瘍形成関連疾患が腫瘍増殖である、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 腫瘍形成関連疾患が血管形成である、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 腫瘍形成関連疾患が膵臓癌である、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 rchd534遺伝子もしくはfchd540遺伝子の発現、または該遺伝
    子によりコードされるタンパク質産物の活性が低下する、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記遺伝子の発現が、 (a) 細胞サンプルに被験物質を接触させ、 (b) 該細胞サンプルにおいて該遺伝子の発現をアッセイし、 (c) 該物質に接触させたサンプルの遺伝子発現レベルを、対照の細胞サンプル
    の遺伝子発現レベルと比較する、 ことによりアッセイされる、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記物質が前記遺伝子の5’領域に相補的なオリゴヌクレオ
    チドであり、三重らせんの形成により転写をブロックする、請求項７記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 前記物質が前記遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンスま
    たはリボザイム分子である、請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記物質が前記タンパク質産物と結合することによって該
    タンパク質産物の活性をモジュレートする小さい有機または無機分子である、請
    求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質産物と結合することによって該タンパク質
    産物の活性を低下させる、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記物質が前記タンパク質産物と結合することによって該
    タンパク質産物の活性をモジュレートする抗体である、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記物質が前記タンパク質産物と結合することによって該
    タンパク質産物の活性を低下させる、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 細胞におけるTGF-βシグナル伝達を増強する方法であって
    、fchd540遺伝子を発現する細胞に、fchd540遺伝子の発現または該遺伝子により
    コードされるタンパク質産物の活性を低下させる物質を接触させ、それにより該
    細胞におけるTGF-βシグナル伝達を増強させる、ことを含む上記方法。
  15. 【請求項１５】 前記物質がfchd540タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路
    のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 TGF-βシグナル伝達経路のメンバーが活性化TβR1である
    、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記物質がrchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相
    互作用を阻害する、請求項１４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記物質が前記遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンス
    またはリボザイム分子である、請求項１４記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記物質が前記遺伝子の5’領域に相補的であり、三重ら
    せんの形成により転写をブロックする、請求項１４記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記物質が前記タンパク質産物の活性を阻害する抗体であ
    る、請求項１４記載の方法。
  21. 【請求項２１】 線維増殖性疾患または腫瘍形成関連疾患の症状を軽減する
    方法であって、fchd540遺伝子の発現または該遺伝子によりコードされるタンパ
    ク質産物の活性を低下させる物質を、該症状を示す患者に投与することを含む、
    上記方法。
  22. 【請求項２２】 前記物質がfchd540タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路
    のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する、請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 TGF-βシグナル伝達経路のメンバーが活性化TβR1である
    、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記物質がrchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相
    互作用を阻害する、請求項２１記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記物質が前記遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンス
    またはリボザイム分子である、請求項２２記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記物質が前記遺伝子の5’領域に相補的であり、三重ら
    せんの形成により転写をブロックする、請求項２２記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記物質が前記タンパク質産物の活性を阻害する抗体であ
    る、請求項２２記載の方法。
  28. 【請求項２８】 細胞におけるTGF-βシグナル伝達を増強する方法であって
    、rchd534遺伝子を発現する細胞に、rchd534遺伝子の発現または該遺伝子により
    コードされるタンパク質産物の活性を低下させる物質を接触させ、それにより該
    細胞におけるTGF-βシグナル伝達を増強させる、ことを含む上記方法。
  29. 【請求項２９】 前記物質がrchd534タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路
    のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 TGF-βシグナル伝達経路のメンバーが活性化TβR1である
    、請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記物質がrchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相
    互作用を阻害する、請求項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記物質が前記遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンス
    またはリボザイム分子である、請求項２８記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記物質が前記遺伝子の5’領域に相補的であり、三重ら
    せんの形成により転写をブロックする、請求項２８記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記物質が前記タンパク質産物の活性を阻害する抗体であ
    る、請求項２８記載の方法。
  35. 【請求項３５】 線維増殖性疾患または腫瘍形成関連疾患の症状を軽減する
    方法であって、rchd534遺伝子の発現または該遺伝子によりコードされるタンパ
    ク質産物の活性を低下させる物質を、該症状を示す患者に投与することを含む、
    上記方法。
  36. 【請求項３６】 前記物質がrchd534タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路
    のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する、請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 TGF-βシグナル伝達経路のメンバーが活性化TβR1である
    、請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記物質がrchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相
    互作用を阻害する、請求項３５記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記物質が前記遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンス
    またはリボザイム分子である、請求項３５記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記物質が前記遺伝子の5’領域に相補的であり、三重ら
    せんの形成により転写をブロックする、請求項３５記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記物質が前記タンパク質産物の活性を阻害する抗体であ
    る、請求項３５記載の方法。
  42. 【請求項４２】 患者サンプル中に存在するfchd540転写産物またはrchd534
    転写産物のレベルを検出することを含む、線維増殖性疾患または腫瘍形成関連疾
    患の診断方法。
  43. 【請求項４３】 検出されるfchd540またはrchd534転写産物のレベルが対応
    する対照サンプルの該レベルと相違する、請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 検出されるfchd540またはrchd534転写産物のレベルが対応
    する対照サンプルの該レベルより高い、請求項４３記載の方法。
  45. 【請求項４５】 腫瘍形成関連疾患が膵臓癌である、請求項４２記載の方法
    。
  46. 【請求項４６】 患者サンプル中に存在するfchd540またはrchd534のタンパ
    ク質レベルまたはタンパク質活性を検出することを含む、線維増殖性疾患または
    腫瘍形成関連疾患の診断方法。
  47. 【請求項４７】 検出されるfchd540またはrchd534のタンパク質レベルまた
    はタンパク質活性が対応する対照サンプルの該レベルと相違する、請求項４５記
    載の方法。
  48. 【請求項４８】 検出されるfchd540またはrchd534のタンパク質レベルまた
    はタンパク質活性が対応する対照サンプルの該レベルより高い、請求項４６記載
    の方法。
  49. 【請求項４９】 腫瘍形成関連疾患が膵臓癌である、請求項４５記載の方法
    。
  50. 【請求項５０】 患者サンプルにおけるfchd531タンパク質、fchd540タンパ
    ク質またはrchd534タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現を、対照サンプル
    における発現と比較して、アッセイすることを含む、線維増殖性疾患または腫瘍
    形成関連疾患を特徴づける方法。
  51. 【請求項５１】 腫瘍形成関連疾患が膵臓癌である、請求項５１記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 線維増殖性疾患または腫瘍形成関連疾患を治療するための
    臨床試験において化合物の効力をモニタリングする方法であって、患者サンプル
    におけるfchd540タンパク質またはrchd534タンパク質をコードする遺伝子の過剰
    発現を、対照サンプルにおける発現と比較して、アッセイすることを含む、上記
    方法。
  53. 【請求項５３】 腫瘍形成関連疾患が膵臓癌である、請求項５２記載の方法
    。
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