JP2002520066A

JP2002520066A - 固定化微生物によるマンニトールの製造方法

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Publication number: JP2002520066A
Application number: JP2000560278A
Authority: JP
Inventors: オジャモヘイキ; コイビコハンヌ; ヘイキラヘイキ
Original assignee: XYROFIN OSAK YHTIO
Current assignee: XYROFIN OSAK YHTIO
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-06-29
Publication date: 2002-07-09
Also published as: AU4912799A; FI981615A0; FI981615A7; WO2000004181A1; US6602691B1; EP1097237A1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】本発明は、固定化微生物の助力による生変換によるマンニトールの製造、ならびに該変換方法において形成されたマンニトールおよび副産物の使用に関する。前記方法において、マンニトールに変換可能な基質を含む溶液を、粒子中および／または上に固定化された生存可能なマンニトール形成微生物細胞を含む固体担体粒子に接触させるように供給する。連続的な変換段階の間に前記溶液をリコンディショニングし、前記基質の大部分をマンニトールに変換する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、固定化微生物による生変換によるマンニトールの製造、特に生存可能
な固定化マンニトール形成微生物によるマンニトール生成基質の生変換に関する
。本発明はまた、該変換方法において形成されたマンニトールおよび副産物の使
用にも関する。

【０００２】マンニトールは、いくつかの工業分野で広い用途を有する六炭糖アルコールで
ある。食品用途の例は、甘味料、抗凝結および自由流れ剤である。医薬的用途は
、固体および液体に対する賦形剤および希釈剤、浸透利尿剤、ならびに手術にお
ける保護剤である。マンニトールはまた、樹脂および可塑剤を製造するためにも
使用される。

【０００３】低量のマンニトールは、いくつかの果物および野菜に見られる。ある種の藻類
およびキノコ類は非常に高濃度のマンニトールを含む。マンニトールはマンナお
よび海草から回収されている。現在は、フルクトースまたはグルコース／フルク
トース混合物、例えば転化糖の触媒水素添加により、マンニトールが工業的に製
造されている。ラネー−ニッケルが触媒として使用される。この方法の不利な点
は、フルクトースの約半分のみがマンニトールに変換されるということである。
他の半分は、全グルコースと同様にソルビトールとなる。マンニトールはソルビ
トールよりも、はるかに水に不溶性であり、従ってこれら二種の化合物の分離に
は結晶化が使用される。触媒としてラネー−ニッケルを使用しているので、水素
添加される材料は触媒による毒作用を避けるために、完全に純粋でなければなら
ない。

【０００４】マンニトールは、水素添加によりマンノースおよびグルコースからも製造され
得る。いくつかの微生物はマンニトールを生成するものとして公知である。バク
テリアではヘテロ発酵バクテリア、ロイコノストクメセンテロイズ (Leuconos
toc mesenteroides)が最も効果的であるように思われる。Soetaert W., Med. Fa
c. Landbouw. Rijksuniv. Gent, (1990) 55/4:1549-52 には、遊離細胞による上
記発酵法ではフルクトースからのマンニトール収率８０ないし９０％が提供され
ると記載されている。後に、Soetaert W. 等, Agro-Food Industry Hi-Tech, Ja
n/Feb 1995: 41-45 には、突然変異体株を使用した供給バッチ法において、遊離
細胞により９４％までの収率が示されている。この供給バッチ発酵では、細胞成
長を可能にする栄養素を非常に高い濃度で含む培養液において、３．５ｇ／ｌｈ
の平均容積生成力が得られた。このような系における製造に関して、細胞成長は
不可欠である。

【０００５】 Soetaert 等, Bioorganic Chemistry in Healthcare and Technology, 編集者
Pandit U.K. および Alderweireldt F.C., Plenum Press, New York, 1991 で
も、ポリウレタンに固定化された細胞での、連続的バイオリアクターを適用する
ように試されているが、結果は乏しく、フルクトースからのマンニトール収率は
約５０％のみを達成した。上記の１９９５年の文献でSoetaert 等は、これはマ
ンニトールへの変換酵素、フルクトースデヒドロゲナーゼへのフルクトースの親
和性の低さにより起こるものであると説明している。Soetaert によると、収率
の低さは固定化バイオリアクター使用の結果である。

【０００６】 Araya等による欧州特許第０６８３１５２号（１９９１）には、ラクトバシル
ススペシー．(Lactobacillus sp.) Ｂ００１株を使用していた同様の遊離細胞
法が記載されている。これによりフルクトースからのマンニトール収率６０％が
得られる。彼らはまた、培養液からの酢酸および乳酸の分離についても請求して
いる。ヒデユキ等による特開昭６２−２３９９９５号（１９８７）には、マンニトー
ル製造に、例えばラクトバシルスブレビス (Lactobacillus brevis) ＩＦＯ
３９６０株およびエル．メセンテロイズ(L. mesenteroides) ＩＦＯ３４２６
株の遊離細胞が使用される方法が開示されている。

【０００７】 Yun 等, Biotechnol. Lett. (1996), 18: 1145-1150 には、もう一種の乳酸バ
クテリアラクトバシルススペシー． (Lactobacillus sp.) ＫＹ−１０７株の
遊離細胞による発酵マンニトール製造に関するデータがいくつか示されている。
グルコース添加は不必要であり、フルクトースからのマンニトール収率は７１％
である。他の細胞外生成物の形成は示されていない。平均容積生成力は該結果か
ら算出され得、約０．９ｇ／ｌｈである。オニシ等, Biotechnol. Bioeng., (1970), 12: 913-920 には、トルロプシス
ベルサチリス (Trulopsis versatilis) 株の遊離細胞によりグリセロールから
マンニトールを収率５０％で得る方法が記載されている。

【０００８】いくつかの糸状菌類（カビ類）もまたグルコースからマンニトールを生成する
。Hendriksen 等, J. Chem. Tech. Biotechnol., (1988), 43: 223-228 による
と、これらの最良のものはアスペルギルスカンジダス(Aspergillus candidus)
であり、グルコースからのマンニトール収率５０％が得られる。イーストおよび
糸状菌類による生成はバクテリアによるものよりも低い容積生成力を与える。全
レ出入口は遊離細胞によるものである。

【０００９】糖類のマンニトールへの変換に関する従来技術の生命工学的方法は完全に満足
できるものではなく、従って工業的製造は未だ主に水素添加をベースとしている
。遊離のマンニトール形成微生物を使用する生変換は、大スケールの製造に関し
て完全に適当なものではなく、今までのところ、固定化系による系は適当な変換
収率をもたらすものではない。従来技術の系の容積生成力は低く、不経済な作業
を導く。従って、工業的に許容される方法を提供するために、フルクトースおよび他の
基質のマンニトールへの生変換に関して、改良する必要が残っている。

【００１０】従って、本発明の目的は、基質をマンニトールに変換することに関する従来技
術の不利な点を克服すること、およびマンニトールの製造に関して技術的に実行
可能な生命工学的方法を提供することである。また、本発明の目的は、固体担体に固定化された生存可能な微生物により適当
な基質をマンニトールに変換する方法を提供することである。本発明の更なる目的は、収率を高めるために変換の間、溶液がリコンディショ
ニングされる充填されたカラムにおいて、基質をマンニトールに変換する連続的
な方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、マンニトールに変換可能な基質を含む溶液が連続
的にリコンディショニングされ、固定化微生物による変換に関して最適な条件が
もたらされる方法を提供することである。

【００１１】また、本発明の目的は、低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質溶
液の流れにおいて低い落下圧力を有する前記カラムにおいて、マンニトールを製
造する方法を提供することである。また、本発明の目的は、カラムを通して許容され得る流速を有する充填された
カラムを利用する方法を提供することである。また、本発明の目的は、変換のためにグルコースのような補基質を本質的に含
むフルクトース含有溶液からマンニトールを製造することに関する。本発明の目的は、更に、比較的高い容積生成力でマンニトールを製造する生命
工学的方法を提供することである。

【００１２】驚くべきことに、従来信じられてきたことに反して、担体中および／または上
に固定化されている微生物により、マンニトールが有利に製造され得ることが見
出された。本発明は添付された請求項に定義されており、その内容は本文に参考に包含さ
れている。

【００１３】従って本発明は、固定化微生物による生変換によりマンニトールを製造する方
法に関する。前記方法は、マンニトールに変換可能な基質をマンニトールに変換
するために適当な条件下で、前記基質を含む溶液を供給し、粒子中および／また
は上に固定化された生存可能なマンニトール形成微生物細胞を含む固体担体粒子
に接触させること、前記基質の大部分をマンニトールに変換するために、連続的
な変換段階の間に前記溶液をリコンディショニングすること、ならびにマンニト
ールおよび／または変換副産物を回収することの段階からなる。好ましい基質はフルクトースである。好ましい生変換において、溶液はグルコ
ースのような補基質も含む。

【００１４】上記溶液のリコンディショニングは、好ましくは、条件パラメーターの一種も
しくはそれより多くを調整することにより連続的な方法により行われる。連続的
なリコンディショニングは、好ましくは生変換の明確な段階の間に行われる。本発明によると、溶液は、好ましくは固定化微生物のベッドを通して供給され
る。微生物ベッドは充填されたカラムに含まれ得るか、あるいは撹拌されたリア
クター中に配置されても良い。本発明の好ましい態様において、溶液は充填され
たカラムを通して再循環されて、溶液はベッドから排出されるとリコンディショ
ニングされ、次の連続的な生変換のために最適化される。

【００１５】供給溶液は、好ましくは時間および変換により変化する加工パラメーターの調
整により連続的にリコンディショニングされる。本発明によるリコンディショニ
ングは、該方法の変換速度および／または変換収率を改良する。本発明の好ましい態様によって、溶液のｐＨを断続的に調整することにより、
基質溶液は連続的にリコンディショニングされる。好ましくは実際の微生物ベッ
ド以外の所で、ベッドを通して溶液を再循環させることにより、そして再循環の
間にｐＨを調整することにより、ｐＨは調整される。あるいはｐＨは、いくつか
のベッドを直列で、または並列で有する系において、ベッドの間で調整され得る
。ベッドは、好ましくはカラム１本またはそれより多くに含まれる。溶液は、そ
のようなカラムを通して比較的高い流速で供給されて良い。

【００１６】本発明の他の態様において、溶液は、変換における微生物のいくつかにより使
用されるフルクトースのようなマンニトール生成基質、またはグルコースのよう
な補基質の濃度を調整することにより、連続的にリコンディショニングされる。
上記溶液のリコンディショニングは、前記方法を最適条件で連続的に遂行させる
。また、どちらかが低濃度である基質または補基質を有する溶液はリコンディシ
ョニングされて最適条件の溶液とされるので、供給溶液の選択を自由なものとす
る。再循環の間および／またはベッドもしくはカラムの間で供給溶液の温度を連続
的に調整することも有利であることが見出された。溶液の温度は、問題の微生物
の最適温度内である値に調整されるべきである。

【００１７】本発明によって、かなり高い供給速度で進めることが有利であることが見出さ
れ、それは流れに対して少ない抵抗のみを提供する実質的に非圧縮性の担体に固
定化された微生物を有する充填されたカラムの使用により可能である。しかしな
がら、供給速度は、カラムの間で、または例えば１本のカラムから２本へ流れを
分割することにより調整されても良い。好ましくは連続的な方法で、供給溶液における栄養素のリコンディショニング
は本発明による使用法では、一方では変換に必要な基本的栄養素の最適濃度をも
たらし、他方では固定化微生物を、増加した、および供給された栄養素供給によ
り、増加した成長の連続的な相をもたらす条件をそれらに受けさせることにより
、断続的な回復が供給される。

【００１８】前記方法において、いくつかの変換生成物は変換速度の低下を起こしやすい。
溶液は、好ましくは連続的に、例えばろ過、結晶化、クロマトグラフィー、イオ
ン交換、圧力の減少、試薬添加による中性化等のような種々の方法による、その
ような生成物の除去により連続的にリコンディショニングされる。多くの場合、上記に論じられたリコンディショニングの二種もしくはそれより
多くの組み合わせにより、変換に最適な所望の条件が提供される。流れの一部を
リコンディショニング段階を通す方向に導くことも可能であるし、他の供給部分
はコンディショニングを受けなくてもよい。流れは、生変換の間の相において、
種々のリコンディショニング段階の間に分割されてもよい。

【００１９】本発明によると、目的は、コンディショニングされていない状態と比較して、
マンニトールの変換収率を増加させるのに充分な量で前記リコンディショニング
を行うことである。好ましくは、連続的なコンディショニングが行われ、供給フ
ルクトースの少なくとも７０％、好ましくは８０ないし９０％もしくはそれより
多くがマンニトールに変換される。本発明の好ましい態様によると、供給溶液は微生物のベッドを通して再循環さ
れ、系のマンニトール収率および容積生成力を増加させる。供給溶液は、微生物
のベッドのいくつかを通して連続的に供給されてもよい。前記方法は、好ましく
は連続的な変換として、固定化微生物を含む担体で充填されたカラムの１本もし
くはそれより多くにおいて行われる。

【００２０】本発明による固定化系は、高濃度の微生物の使用を可能とし、非常に低い濃度
の栄養素を有する基質を含む単純な溶液の供給および同じ固定化微生物接種材料
による長期にわたる定常的な製造を可能とする。これらの全ては、基質(一般的
にフルクトース)からの高いマンニトール収率をもたらす。５０％以上、および
８０ないし９０％もしくはそれより高い収率が得られる。前記系は非常に高い容
積生成力（約１０ｇ／ｌｈ以上、および３０ないし４０g／lhまで）および一回
の細胞装填による定常的な製造を提供する。粗製変換生成物は基本的にマンニトールおよび乳酸および酢酸のような酸を含
み、粗製生成物に関して細胞分離は必要ではない。従って、前記方法においては
、例外的に純粋な粗製生成物が形成される。マンニトールに変換される基質は、
マンニトール回収段階の後、基質濃度を連続的に増加させ、それにより変換収率
を増加させるために再循環されてよい。補基質も同様に前記方法において再循環
されてもよい。同様に、連続的に変換の無菌状態を向上させるために、変換にお
いて生成された酸部分を回収段階から再循環してよい。

【００２１】回収におけるマンニトール収率は、ほとんどのマンニトールが、母液から分離
された後に結晶後の母液を工程に連続的に戻すことにより増加し得る。従って、
母液に残存するマンニトールは、変換において生成されるマンニトールに添加さ
れるであろう。本方法の実行に有用である担体は、好ましくは非圧縮性材料であるべきである
。それは、多孔性ガラスビーズ、多孔性シリケートビーズ、粒子状活性炭、また
は固体酸性もしくは塩基性イオン交換材料のような不活性材料からなってよい。
特に良好な結果は、実質的に非圧縮性、多孔性表面の粒子状固体材料の形態の弱
塩基性アニオン交換基材により、市販品のスケールで得られた。適当なカチオン
交換体は、ポリスチレンとの凝集により接着結合した塩基性ジエチルアミノエチ
ル（ＤＥＡＥ）変性セルロースのミクロファイバーまたはミクロ粒子からなり、
酸性化ＧＤＣ担体（例えば、Genenocor International Oyにより製造されている
登録商標Spezyme GDC）のような粒子を形成する。強酸または塩基特性を有するイオン交換体は担体材料として不適当である。

【００２２】担体上または中に固定化された微生物が、ペントースリン酸経路を通してのみ
糖を代謝させ、マンニトールデヒドロゲナーゼ活性を示し、マンニトールの他に
主な還元生成物、例えばエタノールを生成せず、そして発酵微生物であることが
好ましい。いくつかのヘテロ発酵乳酸バクテリアが、そのような微生物の例であ
る。適当な微生物については、ロイコノストクシュードメセンテロイズ (Leuc
onostoc pseudomesenteroides)、アスペルギルスカンジダス(Aspergillus can
didus)、ザイゴサッカロマイセスロウクシイ(Zygosaccharomyces rouxii)、カ
ンジダベルサチリス(Candida versatilis)、ラクトバシルスフェルメンタム
(Lactobacillus fermentum)、ラクトバシルスセロビオサス(Lactobacillus ce
llobiosus)、ラクトバシルスブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバシル
スブチネリ(Lactobacillus buchneri)、ロイコノストクメセンテロイズ(Leu
conostoc mesenteroides)およびロイコノストクオエノス(Leucomostoc oenos)
があげられる。好ましい微生物はロイコノストクシュードメセンテロイズ (Le
uconostoc pseudomesenteroides)（ＡＴＣＣ１２２９１）である。しかしながら、本発明はこれらの微生物および同様の活性を有する他の微生物
、ならびにそのような微生物から、例えば組み換え技術により誘導された微生物
を前記方法に使用してもよい。

【００２３】ペントースリン酸経路を通るヘキソース糖の代謝は、ヘキソース１モルに対し
て、二還元当量（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）および１モルのペントース−５−リン酸を生
成する。１モルのペントース−５−リン酸から、乳酸バクテリアにより、１モル
の乳酸および１モルの酢酸が生成される。後者の経路では、還元当量の正味の消
費または生成がない。従って、微生物は余分の還元当量を消費するために、還元
されるべき基質を必要とする。それが、好んでマンニトールに変換される基質で
ある。本方法に使用されるほとんどの微生物は発酵性であり、従って酸素転移を
必要としない。いずれかの同化性ヘキソース糖、またはそのようなヘキソース糖に加水分解可
能なオリゴ−もしくはポリ−サッカリド（例えばスクロース、ラクトース、マル
トース、スターチ、スターチもしくはセルロース加水分解産物、セロビオース、
セルロース）あるいはこれらを含む複合材料を補基質として使用できる。好まし
い基質はマンニトールに変換可能なフルクトースである。いくつかの場合、本発
明に従って、フルクトースと同等の方法で基質としてマンノースが作用し、マン
ノースは供給溶液に含まれてよい。

【００２４】従って、適当な供給溶液はフルクトースおよびグルコースの混合物、転化糖蜜
および／または異性化グルコースを含む。供給溶液中のグルコースは、本方法に
おいて、分離ループまたは同様の装置において、同時に、もしくは別々に、好ま
しくは連続的に酵素的に異性化されてよい。供給溶液は、ビートまたはサトウキ
ビ糖蜜あるいはそれらのフラクションからなってもよい。希薄もしくは濃厚ジュ
ースあるいは、１回目、２回目または３回目の糖結晶化後の、糖製造からの流出
物からなってもよい。実際、物質を含む転化スクロースのいずれも供給材料とし
て使用されてよく、それは次いでリコンディショニングされ、出発材料から最適
なマンニトール収率を得るために適当な溶液を提供する。前記変換方法は、マンニトール、乳酸および酢酸のような酸ならびにいずれか
の未反応成分を含む粗製生成物を生じさせる。必要であるか所望である場合、粗
製生成物は、一つもしくはいくつかの生成物に分離されてよい。これらの製品は
上記の通り、変換工程に再循環されて供給溶液に連続的なリコンディショニング
を提供することができるか、またはそれらは回収されて種々の分離目的のために
使用されてよい。

【００２５】回収段階は一般的に、以下の限定されない操作の一覧から選択された段階の一
種もしくはそれより多くを含む。粗製生成物の濃縮；マンニトールの結晶化；粗製生成物からの種々の生成物のクロマトグラフィーによる分離；それら生成物の濃縮；分離されたマンニトールの結晶化；マンニトール結晶化母液からの生成物の分離；および酢酸および／または乳酸の蒸留。マンニトール分離後の母液には、乳酸および／または酢酸が含まれており、本
発明により、この母液は動物飼料または食品もしくは飼料添加剤、例えば防腐剤
として使用され得る。

【００２６】上述のSoetaert 等（１９９５）の記載では、いくつかのマンニトールデヒド
ロゲナーゼのフルクトースに対する親和性は、やや低いということが開示されて
いる。これは、Ｋｍ値（エル．シュードメセンテロイズ (L. pseudomesenteroid
es)については、フルクトースについて約７ｇ／ｌ）に近いか、それ以下の、減
少された容積生成力をもたらす。いずれのフルクトースも損失させずに、これを
避けるために、本発明は好ましくは粗製生成物に対する、またはマンニトール結
晶化母液に対するクロマトグラフィー分離段階、および変換段階における連続的
なリコンディショニングのための分離されたフルクトースのリサイクルを含む。
この方法は、低い相互親和性を有する酵素および基質の対のいずれに対しても使
用することができる。

【００２７】最適変換条件は使用されている微生物に依存する。特に培養液のｐＨおよび加
工温度は重要なパラメーターであり、好ましくは、その微生物に適する値まで連
続的に調整されるべきである。酸が生成された場合、ｐＨが非常に減少すること
のない方法で補基質消費を調整することにより、ｐＨを調整することができる。
あるいは供給溶液は、相溶性の緩衝剤により緩衝されてよく、またはｐＨは水酸
化ナトリウムのような塩基の数回の添加により調整されてよい。上記溶液がベッ
ド以外の所で循環されている場合、再循環の間に一つのベッドもしくはカラムに
おいて、または二つの連続的なベッドもしくはカラムの間でのどちらかで、塩基
を連続して供給溶液に添加してもよい。ｐＨは、溶液からの酸副産物の連続的除
去によっても調整され得る。

【００２８】変換により一般的に、副産物として二酸化炭素が生成される。二酸化炭素はベ
ッドまたはカラムの上部に自由に上昇され得るか、カラムに圧力をかけることに
より溶液中に残り得る。ＣＯ₂が放出した場合、カラムの流れパターンをＣＯ₂ガ
スが混乱させることを防止するために、カラムは、好ましくは圧力をかけられる
。圧力がカラムにかけられる場合、カラムの間で、または再循環の間で圧力を開
放することにより、供給溶液のｐＨは連続的に調整されることもできる。二酸化
炭素ガスは自由に大気中に漏れるので、これは分解されたカルボン酸の量を減少
する。

【００２９】本発明に関して、使用されている微生物が固体担体中および／または上に固定
化されていることは非常に重要である。Soetaert等（１９９１）は担体としてポ
リウレタンを使用し、失望的な結果を得た。驚くべきことに、本発明に従う操作
を行う場合、固定化細胞により非常に良好な結果を達成することが可能であるこ
とが見出された。固定化微生物細胞のベッドは、供給および流出のための出入口を有するいずれ
かの容器に含まれてよい。ベッドの外側への溶液の循環は、温度調整、および好
ましくは撹拌を可能にし、そして供給、流出およびｐＨ調整剤、栄養素等のよう
な化合物の添加のための出入口を有する。好ましくは容器はカラムである。いく
つかのカラムが直列に、および／または並列に使用されてよい。

【００３０】本発明は、本発明の好ましい態様の参考により、本文に詳細に記載されている
。しかしながらこの記載は、この特定な態様に本発明を限定するようないずれか
の方法に向けられるものではないと理解されるべきである。生物生成は第一に、効率のよい細胞マス生成を可能にする液体培地において成
長する。この接種材料生成相において、充分な栄養素が培地に添加され、適当な
細胞成長が可能となる。固定化に関して、接種材料は製造容器において担体材料のベッドを通して循環
されるか、または担体材料が接種材料に添加され、細胞が材料に接着し、その後
材料が容器に移動される。製造段階において、基質および補基質を含む供給溶液は細胞マス−担体ベッド
を通して再循環されるか、または連続するベッドを通して供給される。

【００３１】製造容器は好ましくは、非圧縮性担体上に固定化された微生物により充填され
たカラムからなる。前記系は再循環系を有する単一のベッドからなるか、または
直列で、もしくは並列で、カラムの２本もしくはそれより多くからなってよい。
カラムは例えば、カラムの間に位置するｐＨ調整化合物、基質および補基質、栄
養素等のための供給出入口を伴って、各々の上に積み上げてもよい。実質的に非圧縮性の担体をカラムに使用する場合、カラムはかなり高くてもよ
く、例えば１ｍもしくはそれより高くても、まだ許容され得るレベルの流速が提
供される。溶液の流れ方向は下方向または上方向のいずれであってもよい。体積流量速度は、好ましくは、生変換における酸の生成が、問題のベッドにお
けるマンニトール生成が禁止されるレベルに達しないような速度に維持される。
最適なマンニトール濃度に達するために、供給は１時間当たり２ないし２０ベッ
ド容積、好ましくは１時間当たり約１０ないし２０ベッド容積の速度で行われる
。

【００３２】溶液のｐＨは連続的に調整され、使用されている特定微生物に対する最適値ま
で供給溶液をリコンディショニングする。例えばｐＨはＮａＯＨ、ＮＨ₄（ＯＨ
）、ＫＯＨ等のような塩基を添加することにより調整され得るが、ｐＨ調整の他
の方法は上記されている。ｐＨは一般的に約４および７の間のレベルまで、多く
の場合、４．５および６．５の間まで、好ましくは約５までリコンディショニン
グされる。溶液は、ベッドにおける生変換段階からｐＨ調整が行われる中間容器に向けら
れてよく、またはｐＨ調整は循環パイプにおいて、もしくは一つのカラムからも
う一つに導かれるパイプにおいて行われてよい。溶液の温度は連続的に調整されてよく、変換に関する最適条件に近いものが提
供される。約２０ないし３５℃、好ましくは２５ないし３０℃の値に溶液の温度
を調整することが有利であると見出された。

【００３３】代表的な基質（フルクトース）濃度は、７ないし２００ｇ／ｌ、好ましくは１
５ないし１６０ｇ／ｌ、最も好ましくは約５０ないし１５０ｇ／ｌであり、相当
する補基質（グルコース）濃度は、４ないし１００ｇ／ｌ、好ましくは８ないし
８０ｇ／ｌ、最も好ましくは約２５ないし７５ｇ／ｌである。フルクトース濃度
が問題の微生物のＫｍ値より低くなるまで減少した場合、変換速度は非常に低下
する。従って、転化相の間に連続的にフルクトースを添加することにより、フル
クトースのレベルを明白にＫｍ値以上にするために、溶液はリコンディショニン
グされるべきである。実際の生変換相の間では休止状態の細胞マスを使うのが有利である。と言うの
は、通常の供給溶液において非常に低い栄養素濃度が要求されるからである。代
表的には０．１ないし４ｇ／ｌの濃度のイースト抽出物および／またはトリプト
ンがベッド以外の所で溶液に連続的に供給される。細胞マスが担体により容器中
に残されており、マンニトール変換相には細胞成長を必要としないため、この低
栄養素レベルが可能である。変換速度はベッド中の活性細胞マスの全量に依存す
る。連続的な低レベルの栄養素添加は、断続的に細胞の微生物活性を回復させる
。

【００３４】変換が進むと、ベッド中の生存可能な細胞の不足により、ベッドの有効性は徐
々に低下する。従って微生物を成長させ、担体における微生物密度を増加させる
ために、増加した量の栄養素を溶液へ好ましく連続的に供給することにより、ベ
ッドにおける細胞マスの回復が行われる。栄養素は一般的にイースト抽出物、ト
リプトン、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、マグネシウムスルフェートおよび／またはマンガンス
ルフェートかならる。好ましくは同じ細胞マスの装填により、製造および回復の交代サイクルが行わ
れる。容積生成力が境界値以下まで減少した場合、供給溶液への栄養素の添加に
より回復相が開始する。容積生成力に関して、より高い境界値に達するまで、連
続的な栄養素添加は維持される。容積生成力は、例えばｐＨ調整剤の消費速度か
ら確立され得る。

【００３５】溶液のリコンディショニングは、前記溶液から固体または液体成分を除去する
ことにより行われてもよい。それらの選択された成分を除去するために、溶液は
、ろ過、沈殿、希釈、メンブレンフィルター、電気透析および分別蒸留等を受け
てよい。担体材料が耐久性および非圧縮性構造であるため、細胞マスが、回復および成
長がもはや充分な変換速度を提供しない段階に達した後でも、再利用することが
できる。特に、上記ＤＥＡＥ変性セルロース／ポリスチレン担体，ＧＤＣは再生
されることが可能である。これは微生物細胞の除去、洗浄および新しい生存可能
な微生物細胞を有する担体の再装填により行われる。

【００３６】所望の生変換相の後、溶液を回収相に持っていく。これはマンニトールに変換
される全ての基質が消費される前に開始されてよい。低い基質濃度により生成力
および／または収率が低下する場合、これは有利である。例えばこれは、エル．
シュードメセンテロイズ (L. pseudomesenteroides)がフルクトースの変換に使
用される場合である。上記消費されない基質の損失を避けるために、フルクトー
スは回収相で分離され、供給溶液をリコンディショニングするために変換段階に
再循環される。他の生物による汚染は、発酵において頻繁に問題となる。乳酸および酢酸の混
合物はほとんどの微生物に対して抑制的である。これは、本発明において、回収
段階において酸を分離すること、およびそれらの部分を変換段階に再循環するこ
とにより、供給溶液の連続的なリコンディショニングを提供するために利用され
得る。

【００３７】回収段階において、マンニトールは公知の技術により粗製生成物から変換段階
後に直接結晶化され得る。複合材料が使用された場合、結晶化の前に色の除去が
必要である。マンニトールは、連続的な生変換の間に、次の変換段階のための供
給溶液をリコンディショニングするために、溶液から結晶化されてもよい。存在する場合、他の糖類は、例えばクロマトグラフィーにより他の成分から分
離され、変換段階に再循環され得る。変換において生成された酸は、結晶化母液からクロマトグラフィーにより、例
えばＮａ型カチオン交換樹脂を使用して、またはイオン交換技術を使用して分離
され得る。あるいは母液は抗微生物剤として使用されてもよく、または連続的な
リコンディショニングに関して上記されたように使用されてもよい。

【００３８】以下に、本発明について、限定されない例により説明する。実施例１カラムリアクターにおける微生物の固定化エル．シュードメセンテロイズ (L. pseudomesenteroides)（ＡＴＣＣ１２
２９１）を貯蔵培養から以下の組成からなる成長培地に接種した。１００ｇ／ｌ
フルクトース、５０ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌイースト抽出物、２ｇ／
ｌトリプトン、２ｇ／ｌＫ₂ＨＰＯ₄、０．０１ｇ／ｌＭｇＳＯ₄、０．０
１ｇ／ｌＭｎＳＯ₄。前記接種材料は一晩成長され、次いで２時間、担体が充填されたカラムを通し
て成長培地を再循環させることにより、細胞マスを殺菌された（７０％エタノー
ル）担体に転移した。該担体は弱塩基性アニオン交換体（Genenocor Internatio
nal Oyにより製造された、ポリスチレンと結合したＤＥＡＥ変性セルロースのミ
クロファイバーから製造された登録商標Spezyme GDC担体）であった。

【００３９】実施例２撹拌リアクターにおける微生物の固定化実施例１と同様の微生物細胞マスを使用した。微生物細胞マスは殺菌された担
体を含むリアクターに添加され、微生物が担体に接着するまで、該混合物を２時
間撹拌した。その後、リアクターは生変換のために準備された。

【００４０】実施例３ｐＨおよび温度の調整による連続的なリコンディショニング実施例１に従って提供されたカラム（ベット容積１リットル）を試験に使用し
た。無菌供給溶液（容積１０リットル）を該カラムを通して再循環させた。供給
溶液は以下の組成からなる。１５０ｇ／ｌフルクトース、５０ｇ／ｌグルコ
ース、１ｇ／ｌイースト抽出物、１ｇ／ｌトリプトン、０．０１ｇ／ｌＭ
ｇＳＯ₄、０．０１ｇ／ｌＭｎＳＯ₄。再循環方向は、カラムの上部から底部で
あった。供給溶液のｐＨおよび温度は、再循環容器において、生変換相の間に連続的に
調整された。温度は約２５℃に調整され、ｐＨは連続的なＮａＯＨ（１６％）の
添加により５．０に調整された。カラム中の供給速度は一定値に維持され、カラム中における約６分間の保持が
提供された。４３時間の全工程時間後、供給溶液の組成は分析され、１２７ｇ／ｌマンニ
トール、３２ｇ／ｌＤ−ラクテート、２２ｇ／ｌアセテート、２ｇ／ｌフ
ルクトースおよび０．３ｇ／ｌグルコースを含むことがわかった。カラム容積
に対する平均容積マンニトール生成速度は３０ｇ／ｌｈであると算出された。フ
ルクトースからのマンニトール収率は約８５％であった。溶液は６０％乾燥物質含有量までエバポレーションされ、溶液を３２℃まで徐
々に冷却することにより、マンニトールを溶液から再結晶させた。

【００４１】実施例４栄養素供給の調整による連続的リコンディショニング１回目の変換溶液を再循環容器からマンニトール回収へ排出された後、実施例
３の再循環されたバッチ法を繰り返した。実施例３で使用されたものと同じ組成
を有する新しい供給溶液で再循環容器は補充された。２回目の変換後の変換溶液は、１回目の工程で得られたものとほとんど異なら
ない組成を有していた。ｐＨを調整するＮａＯＨは消費される速度により測定された変換速度が境界値
以下に減少するまで、同じ方法で供給溶液の新しいバッチを変換した。境界値が１０ｇ／ｌｈとなったら、バッチを３ないし４工程に関して繰り返し
た。その後、カラムの微生物は、１００ｇ／ｌフルクトース、５０ｇ／ｌグ
ルコース、２ｇ／ｌイースト抽出物、２ｇ／ｌトリプトン、２ｇ／ｌＫ₂
ＨＰＯ₄、０．０１ｇ／ｌＭｇＳＯ₄および０．０１ｇ／ｌＭｎＳＯ₄を含む
富栄養素溶液を、カラムを通して、ｐＨ調整ＮａＯＨ消費速度が所望のレベルま
で増加するまで（約３ないし４時間）、循環させることにより回復された。その
後、実施例３による変換のために、カラムを再び使用した。

【００４２】実施例５種々の原料からのマンニトール製造実施例３記載の全工程を使用することにより、種々の原料から、種々の担体材
料を使用して、再循環された、充填されたカラムリアクターにおいてマンニトー
ルを製造した。使用された微生物はエル．シュードメセンテロイズ (L. pseudom
esenteroides)（ＡＴＣＣ１２２９１）であった。全ての担体および原料は加
工条件下でマンニトールを製造した。本試験の原料および担体は以下の通りである。表１

【表１】使用された担体材料は、ＧＤＣ（ＤＥＡＥ）＝登録商標Spezyme GDC、Genenocor International Oyに
より製造された弱塩基性アニオン交換体ＧＤＣ（ＣＯＯ^-）＝Cultor Ltd.による弱酸性カチオン交換体試験製品ノートン触媒＝Norton Chemical Product Corporationからの触媒担体、ＳＡ
５２０３１／８”

【００４３】実施例６種々の担体材料によるマンニトール製造４０ｇ／ｌフルクトース含有ＭＲＳ培養液において担体材料の存在下、培養に
よりエル．シュードメセンテロイズ (L. pseudomesenteroides)は種々の担体材
料に固定化された。担体材料の濃度は４０ｇ／ｌであり、振動フラスコにおける
培養は２５℃で、振動速度１００ｒｐｍで２０時間続けられた。結合した細胞を
有する担体材料は培養液から分離され、カラムに充填された。マンニトールの製造は、カラムを通して１０ｇ／ｌグルコース、３０ｇ／ｌ
フルクトース、２ｇ／ｌＮａ₂ＨＰＯ₄、２ｇ／ｌＮａＨ₂‐シトレートお
よび３ｇ／ｌ酢酸を含む溶液の循環により行われた。ｐＨはＮａＯＨによりｐ
Ｈ５．２まで調整された。３時間循環後に採取された試料からＨＰＬＣによりマ
ンニトールは分析された。担体材料は、登録商標Spezyme GDC、ノートン触媒、ガラスビーズ(Schott bea
ds，SIRAN担体，SIKUG 023/02/B, Schott Engineering)、活性炭（粒子化活性炭
、Chemviron CPG）、Amberlite IRA 93（弱塩基性アニオン交換体、Rohm & Haas
）およびＧＤＣ（ＣＯＯ^-）であった。

【００４４】実施例７種々の固定化微生物によるマンニトール製造実施例６でエル．シュードメセンテロイズ (L. pseudomesenteroides)に関し
て記載されたように、エル．ブレビス(L. brevis)（ＶＴＴ−Ｅ−９１４５８）
をノートン触媒に固定化した。６８時間、振動フラスコにおいて、２８℃で２５０ｒｐｍの振動速度で培養す
ることにより、３０ｇ／ｌスクロースおよび５ｇ／ｌイースト抽出物ならび
に４０ｇ／ｌ登録商標Spezyme GDCを含むCrapek培養液中で、アスペルギルス
カンジダス(Aspergillus candidus)（ＮＲＲＬ３０５）は固定化された。培養
された細菌が固定化された担体材料は、培養液からろ過により収穫した。同様の方法で、YM培養液を使用してザイゴサッカロマイセスロウクシイ(Zyg
osaccharomyces rouxii)（ＡＴＣＣ１２５７２）を登録商標Spezyme GDC上に
固定化し、ATCC培養液466を使用してカンジダベルサチリス(Candida versatil
is)（ＡＴＣＣ２０２２１）および（ＡＴＣＣ２０２２３）をガラスビーズ
上に固定化した。許容され得るレベルにおける短期間のマンニトール製造が、以下の生成培地に
より、固定化材料により認められた。エル．ブレビス(L. brevis)：３０ｇ／ｌフルクトース、１０ｇ／ｌグル
コース、２ｇ／ｌＮａ₂ＨＰＯ；ｐＨ５．２へ連続的に調整エー．カンジダス(A. candidus)：１００ｇ／ｌグルコース、１ｇ／ｌイ
ースト抽出物、０．５ｇ／ｌＮａＮＯ₃；ｐＨ７．３へ連続的に調整ゼット．ロウクシイ(Z. rouxii)：２００ｇ／ｌグルコース、１ｇ／ｌイ
ースト抽出物、０．５ｇ／ｌ尿素；ｐＨ調整なしシー．ベルサチリス(C. versatilis)：２００ｇ／ｌグルコース、１ｇ／ｌイースト抽出物、２ｇ／ｌＫ₂ＨＰＯ₄；ｐＨ５．５へ連続的に調整

【００４５】実施例８マンニトールの結晶化本発明の方法に従って得られた、ろ過したマンニトール溶液を結晶化させた。
乾燥物質を基準として約６３％マンニトールを含む希釈マンニトール溶液はエバ
ポレーションされ、約４８重量％の濃度とされた。得られた溶液は約４５℃の温
度まで冷却され、自発的な結晶化により種付けされる。結晶化されたマンニトー
ルのマスは約１２時間で、約３２℃の温度まで冷却された。結晶は遠心分離によ
り母液から分離され、乾燥された。遠心分離において乾燥物質を基準として約５
０％の洗浄水が使用され、結晶は４０℃でオーブンで乾燥された。マンニトール収率は乾燥物質を基準として約２５％、遠心分離後マンニトール
を基準として約４０％であった。

【００４６】実施例９母液からのマンニトール分離マンニトールは実施例８にしたがって変換溶液から結晶化され、結晶は遠心分
離により母液から分離された。まだ母液に残存しているマンニトールを精製する
ために、溶液のクロマトグラフィー分離を行った。分離はバッチ法で、クロマト
グラフィー分離カラムにおいて行われた。分離カラムは強酸性カチオン交換樹脂（Finex Oy, フィンランドにより製造さ
れたもの）で充填され、浸水された。樹脂の架橋度は６．０％ＤＶＢであり、平
均粒子サイズは約０．３５ｍｍであった。樹脂はＮａＣｌ溶液によりＮａ⁺型に
再生された。分離の前に、供給溶液はろ過され、乾燥物質（ＤＳ）含有量は３０ｇ／１００
ｇに調整された。供給溶液のｐＨは水酸化ナトリウムによりｐＨ５．５まで調整
された。加工温度は８０℃まで調整され、カラム中の展開水の一次流速は約０．
５ｍ／ｈであった。伝導性、ｐＨ、屈折乾燥物質（ＲＤＳ）ならびに残渣および生成フラクション
の組成（ＨＰＬＣによる）を分析した。フラクションおよび供給溶液の組成を表
２に示す。フラクションはＨＰＬＣにより分析された。表２フラクション、供給溶液の組成およびマンニトール収率

【表２】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月２８日（２０００．９．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/18 (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:66）Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/18 (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:72）Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/18 (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:225）Ｃ１２Ｒ 1:225） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヘイキヘイキラフィンランド国，エフアイエヌ− 02320 エスポー，リスティニーメンティ 32 ディー 33 Ｆターム(参考） 2B150 AC01 AC06 AC15 AC16 AC24 AC27 DD26 DD31 4B033 NA01 NA12 NA14 NB13 NB40 NB45 NB68 NC04 ND02 4B035 LE03 LG05 LP42 4B064 AC09 CA02 CA06 CA35 CA40 CB18 CC03 CC07 CD09 CE15 DA10 DA11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マンニトールに変換可能な基質をマンニトールに変換するの
に適当な条件下で、前記基質を含む溶液を供給し、粒子中および／または上に固
定化された生存可能なマンニトール形成微生物細胞を含む固体担体粒子に接触さ
せること、前記基質の大部分をマンニトールに変換するために、連続的な変換段階の間に
前記溶液をリコンディショニングすること、ならびにマンニトールおよび／または変換副産物を回収することを特徴とする、固定化微生物の助力による生変換によりマンニトールを製造する
方法。
【請求項２】前記溶液の前記リコンディショニングが、連続的なｐＨ、温
度、供給速度、基質含有量、補基質含有量、栄養素供給または圧力の調整、変換
生成物または他の固体もしくは液体成分の除去、あるいは前述のいずれかの組み
合わせからなることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】前記リコンディショニングが前記溶液の一部で行われるか、
または前記溶液の種々の部が種々のリコンディショニング段階を受けることを特
徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】前記基質がフルクトースからなることを特徴とする請求項１
ないし３記載の方法。
【請求項５】前記変換が、前記溶液中のフルクトースの少なくとも７０％
、好ましくは８０ないし９０％またはそれより多くがマンニトールに変換される
まで行われることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】前記担体粒子が多孔性、実質的に非圧縮性材料であることを
特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】前記方法が、前記担体により充填されたカラムの１本もしく
はそれより多くにおいて連続的に行われる連続的な変換方法であることを特徴と
する請求項１記載の方法。
【請求項８】前記溶液が前記カラムの１本もしくはそれより多くを通して
再循環されることを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項９】前記溶液が一連の前記カラムを通して連続的に供給されるこ
とを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項１０】前記担体が、多孔性ガラスビーズ、多孔性シリケートビー
ズまたは活性炭のような不活性材料からなることを特徴とする前記請求項のいず
れか一つに記載の方法。
【請求項１１】前記担体が、実質的に非圧縮性の多孔性粒子状固体材料の
形態の弱塩基性アニオン交換基材、好ましくはポリスチレンとの凝集により接着
結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）変性セルロースを含む弱塩基性アニ
オン交換体からなることを特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】前記微生物が、ロイコノストクシュードメセンテロイズ
(Leuconostoc pseudomesenteroides)、アスペルギルスカンジダス(Aspergill
us candidus)、ザイゴサッカロマイセスロウクシイ(Zygosaccharomyces rouxi
i)、カンジダベルサチリス(Candida versatilis)、ラクトバシルスフェルメ
ンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバシルスセロビオサス(Lactobacil
lus cellobiosus)、ラクトバシルスブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクト
バシルスブチネリ(Lactobacillus buchneri)、ロイコノストクメセンテロイ
ズ(Leuconostoc mesenteroides)およびロイコノストクオエノス(Leucomostoc
oenos)からなる群から選択されることを特徴とする前記請求項のいずれか一つに
記載の方法。
【請求項１３】前記微生物がロイコノストクシュードメセンテロイズ (
Leuconostoc pseudomesenteroides)（ＡＴＣＣ１２２９１）であることを特徴
とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】前記リコンディショニングが、前記溶液のｐＨを約４以上
の値まで、好ましくはｐＨ４．５および６．５の間に、最も好ましくは約ｐＨ５
まで調整することからなることを特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の
方法。
【請求項１５】アルカリヒドロキシドまたはアンモニウムヒドロキシドの
ような塩基を添加することにより、あるいは緩衝物質を添加することにより前記
溶液のｐＨが調整されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】変換の間に形成された酸を除去することにより前記溶液の
ｐＨが調整されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】前記溶液の圧力を減少することにより、変換の間に生成さ
れた二酸化炭素の溶解により形成されたカルボン酸を除去することを特徴とする
請求項１６記載の方法。
【請求項１８】前記リコンディショニングが、前記溶液の温度を約２０な
いし３５℃、好ましくは２５ないし３０℃の値まで調整することからなることを
特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】前記リコンディショニングが、前記溶液の体積流量速度を
時間当たり約２ないし２０ベッド容積、好ましくは時間当たり約１０ないし２０
ベッド容積の値まで調整することからなることを特徴とする前記請求項のいずれ
か一つに記載の方法。
【請求項２０】前記リコンディショニングが、前記溶液の基質フルクトー
ス含有量を約７ないし２００ｇ／ｌ、好ましくは約１５ないし１６０ｇ／ｌ、最
も好ましくは約５０ないし１５０ｇ／ｌまで調整することからなることを特徴と
する請求項４記載の方法。
【請求項２１】前記リコンディショニングが、前記溶液の補基質含有量を
約４ないし１００ｇ／ｌ、好ましくは約８ないし８０ｇ／ｌ、最も好ましくは約
２５ないし７５ｇ／ｌまで調整することからなることを特徴とする請求項２０記
載の方法。
【請求項２２】前記リコンディショニングが、固定化微生物細胞の微生物
活性を断続的に回復させるために前記溶液に栄養素を添加することからなること
を特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２３】前記栄養素がイースト抽出物、トリプトン、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 、マグネシウムスルフェート、マンガンスルフェートおよびそれらの混合物から
選択されることを特徴とする請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】前記リコンディショニングが、連続的な変換段階の間にマ
ンニトールを回収することからなることを特徴とする前記請求項のいずれか一つ
に記載の方法。
【請求項２５】前記リコンディショニングが、最終マンニトール回収後に
母液に残存する基質をいずれも前記溶液に戻すことからなることを特徴とする請
求項２４記載の方法。
【請求項２６】前記リコンディショニングが、クロマトグラフィーおよび
／またはイオン交換により前記溶液から酸を回収することからなることを特徴と
する請求項２４記載の方法。
【請求項２７】前記リコンディショニングが、前記母液または前記回収さ
れた酸の少なくとも一部を前記溶液に戻すことからなることを特徴とする請求項
２３または２５記載の方法。
【請求項２８】前記リコンディショニングが、ろ過、沈殿、抽出、メンブ
レンフィルター、電気透析および分別蒸留から選択された方法の一種またはそれ
より多くにより、前記溶液に含まれる固体または液体成分を除去することからな
ることを特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】前記リコンディショニングが、前記変換において１０ｇ／
ｌｈ以上の、好ましくは３０および４０ｇ／ｌｈの間のマンニトールの容積生成
力をもたらすようにモニターされることを特徴とする前記請求項のいずれか一つ
に記載の方法。
【請求項３０】前記カラムにおけるマンニトールの容積生成力が予め決め
られた境界値まで減少するまで、前記溶液が前記カラムを通して再循環させるこ
とを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項３１】前記溶液が補基質としてグルコースのような同化性ヘキソ
ース糖、またはヘキソース糖に加水分解可能なオリゴ−もしくはポリ−サッカリ
ド、あるいはそれらの混合物を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項３２】前記供給溶液がフルクトースおよびグルコースの混合物を
含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】前記供給溶液が異性化グルコース、転化糖蜜、ビートまた
はサトウキビ糖蜜、それらの希薄もしくは濃厚ジュースあるいはフラクションか
らなることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】前記溶液におけるグルコースが、該方法において、同時に
、または別々に、好ましくは連続的に、酵素的に異性化されることを特徴とする
請求項３２記載の方法。
【請求項３５】前記溶液が、マンニトールに変換可能な前記基質としてグ
ルコースまたはマンノースを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３６】前記担体が、微生物細胞の除去、洗浄および新しい生存可
能な微生物細胞による再装填により再生されることを特徴とする前記請求項のい
ずれか一つに記載の方法。
【請求項３７】マンニトールが、最終変換された溶液から結晶化により回
収されることを特徴とする前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３８】マンニトール分離後、母液に含まれる乳酸および／または
酢酸をクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換により回収することを特徴
とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】請求項１ないし３８のいずれか１つに記載の方法により得
られる母液を、食品添加剤、動物飼料または動物飼料添加剤として使用すること
。