JP2002520049A

JP2002520049A - 改良された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー接合体

Info

Publication number: JP2002520049A
Application number: JP2000560236A
Authority: JP
Inventors: バウディツ，ペーター; ムクソルファトゥム，ティネ; アゲルリンオルセン，アルネ; デウセン，ハインツ−ヨセフ; アービーペテルセン，ドルテ
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1998-07-17
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2002-07-09
Also published as: MXPA01000556A; AU770911B2; WO2000004138A1; BR9912158A; CA2333491A1; CN1315997A; EP1098964A1; AU4898399A; KR20010079542A

Abstract

(57)【要約】本発明は、１個以上のポリマーが親ポリペプチドに共有結合された、ポリペプチド−ポリマー共役体に関し、ここで該ポリマーは、ホモポリマー、グラフト、ブロック、交互、又はランダムコポリマーである。本発明は更に、洗剤組成物のような産業用組成物及び製品の洗濯性能を改善するための本発明の共役体を含有する産業用組成物及び製品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野本発明は、ポリマーが、ポリペプチドの表面に結合された、ホモポリマー、グ
ラフトコポリマー、ブロックコポリマー、交互共重合体、又はランダムコポリマ
ーであるポリペプチド−ポリマー接合体に関する。本発明は更に、本発明の接合
体を含有する産業用組成物及び製品、産業用組成物及び製品の洗浄性能を改善す
るための本発明のポリペプチド−ポリマー接合体の使用、並びに最後にポリペプ
チドの洗浄性能の改善に関する。

【０００２】発明の背景洗剤産業において、酵素は、30年以上にわたって洗浄用配合物中で実用化され
ている。このような配合物中で使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、ア
ミラーゼ、セルラーゼ、更には他の酵素、又はそれらの混合物を含む。商業的に
最も重要な酵素はプロテアーゼである。商業的に使用される酵素、例えばプロテアーゼの数の増加は、天然の野生型プ
ロテアーゼのタンパク質操作した変種、例えばDURAZYM（商標）(ノボノルディス
ク社)、RELASE（商標）(ノボノルディスク社)、MAXAPEN（商標）(ギスト-ブロケ
ード社)、PURAFECT（商標）(ゲネンコル・インターナショナル社)がある。

【０００３】しかし、多くの有用な酵素変種が文献に記されているにもかかわらず、多くの
産業用途のためには新規に改善された酵素又は酵素変種が依然必要である。ポリペプチドは、チャレンジの方法によって決まる望ましくない免疫応答、典
型的にはIgG及び／又はIgE応答を惹起する可能性があるので、これを低減する技
術が、最近30年間開発されつづけている。国際公開公報第97/24421号及び国際公開公報第97/24427号は、活性化されたポ
リマー上への共有結合による酵素の固定化について開示している。活性化された
ポリマーを用いる1個以上の酵素の固定化は、それ自身、酵素タンパク質の改善
された抗原性プロフィールを示す。これらの発明者らは、これらの利点が、洗剤
液中の酵素の性能プロフィールに影響を及ぼすことなく構造的に酵素を修飾する
ことによって達成されると述べている。

【０００４】固定化は、浮遊物の形成を避けなければならないにもかかわらず、この方法は
依然、固定化工程の操作及び処理時に、粉塵又は煙霧質を形成するリスクを示し
ている。別の技術は、多くの高分子が問題のポリペプチドに結合されているような結合
技術である。この技術を使用すると、免疫系は、抗体産生に寄与する(ポリペプ
チドの表面上の)エピトープの認識が困難になり、これにより免疫応答が源弱さ
れる。

【０００５】特定の生理的作用をもたらすために人体の循環系に直接導入されるポリペプチ
ド(すなわち医薬品)に関して、代表的な可能性のある免疫応答は、IgG及び／又
はIgM応答であるのに対して、呼吸器系を介して吸入されるポリペプチド(すなわ
ち産業用ポリペプチド)は、潜在的にIgE応答(すなわちアレルギー反応)を惹起す
ることがある。免疫応答の減弱について説明している理論のひとつは、高分子(複数)が、抗体
産生につながる免疫応答に寄与するポリペプチドの表面上のエピトープ(複数)を
遮蔽することである。別の理論又は少なくとも部分的要因は、接合体が重くなれ
ばなるほど、より減弱された免疫応答が得られることである。

【０００６】典型的には、接合体を形成するためにポリペプチドとの結合に使用されるポリ
マーは、ホモポリマー、すなわち、1個の反復単位からなるもの、例えばエチレ
ンオキシド(EO)、ポリエチレングリコール(PEG)、又はプロピレンオキシド(PO)
、ポリプロピレングリコール(PPG)である。デキストランのような糖質も使用さ
れる。米国特許第4,179,337号は、ポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレン
グリコール(PPG)に結合された、酵素及びペプチドホルモンのような非免疫原性
ポリペプチドを開示している。

【０００７】国際公開公報第96/17929号(ノボノルディスク社)は、高分子、特にポリエチレ
ングリコール(PEG)に結合された修飾されたポリペプチド接合体を開示している
。本発明者らは、今回、驚くべきことに、ポリマー−ポリペプチド接合体は、非
修飾ポリペプチドと比べて改善された洗浄性能を有することを発見した。

【０００８】発明の概要本発明の第一の態様は、改善された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー
接合体に関する。本発明者らは、分子量が0.1kDa〜60kDaの範囲のホモポリマーを、分子量が4kD
a〜100kDaである親ポリペプチドに結合すると、該ポリペプチドの洗浄性能が、
親ポリペプチドの洗浄性能と比べて改善されたことを発見した。本発明者らは、更に下記一般式を有する、グラフト、ブロック、交互、又はラ
ンダムコポリマー： EO_xPO_y (I) （式中、x=1〜99%、y=1〜99%及びx+y=100%）を、産業用途で使用される親ポリペ
プチドに共有結合した場合、その洗浄性能が、親ポリペプチドと比較して改善さ
れることを発見した。

【０００９】両方の場合において、呼吸器のアレルギー誘発性も、親酵素と比較して減弱さ
れた。後者の場合、呼吸器のアレルギー誘発性は、PEG又は他のホモポリマーと
結合した対応する接合体と比較しても、更に減弱される。本発明の第二の態様は、本発明の接合体を含有する産業用製品において使用す
るための組成物に関する。第三の本発明の態様は、洗浄性能改善するための接合体の使用に関し、かつ最
後の本発明の態様は、ポリペプチドの洗浄性能を改善する方法に関する。

【００１０】産業用ポリペプチド産業用途に使用されるポリペプチドは、酵素活性及び／又は抗菌活性を有する
ことが多い。産業用ポリペプチドは、(医薬用ポリペプチドとは対照的に)、生体
の循環系に導入されることは意図されていない。従って、産業用の組成物及び／又は製品(下記に定義)、例えば洗浄及び食器洗
い用洗剤のような洗剤、織物を処理するための組成物、並びに化粧品を含む衛生
用品などの有効成分として使用される酵素のような産業用ポリペプチドが、ヒト
又は動物の循環系に直接接触することは恐らくほとんどなく、それはこのような
ポリペプチド(又はこのようなポリペプチドを含有する製品)は血流に注射される
こと(など)ないからである。

【００１１】従って、この産業用ポリペプチドの場合、可能性のあるリスクは、呼吸経路を
介してのポリペプチド吸入の結果としての呼吸器系のアレルギー(すなわちIgE反
応)である。本発明の文脈において、「産業用ポリペプチド」は、ヒト及び／又は動物の体
内循環系に導入されることが意図されていないような、ペプチド、タンパク質及
び／又は酵素を含むポリペプチドと定義される。このようなポリペプチドの例は、以下に定義されるような酵素活性を有するポ
リペプチドを含む。

【００１２】しかし、1種以上のポリマーが酵素に結合される場合、該酵素の性能は、親酵
素と比較してほぼ同じであるか又は低下されるであろう。酵素の触媒性能は、活性部位(複数)での酵素と基質の間の接触に関する多くの
事象により左右される。ポリマーが酵素に結合する際に、ポリマーは通常酵素の
表面にランダムに分布される。更にポリマーは、該酵素の活性部位の近傍の酵素
に結合されることもあり、このことは立体障害又は空間障害を招くであろう。そ
の結果酵素性能は有害な影響を受けることとなるであろう。本発明者らは、驚くべきことに、ポリマーへの接合により、酵素性能が増強さ
れ得ることを発見した。

【００１３】発明の詳細な説明本発明者らは、今回驚くべきことに、ポリペプチドの触媒性能が改善されたポ
リペプチド−ポリマー接合体を提供することに成功した。本発明は、産業用途及び産業用製品中の有効成分としての混合に適したポリペ
プチド−ポリマー接合体に関連している。本発明の接合体は、更に呼吸器のアレ
ルギー誘発性を減弱することもできる。用語「ポリペプチド−ポリマー接合体」とは、本発明の文脈では、1種以上の
ポリマーがポリペプチドに共有結合していることを意味する。

【００１４】用語「減弱されたアレルギー誘発性」とは、本発明の文脈では、アレルギー状
態を惹起する産生されるIgE(ヒトにおいて、及び特定の動物における同等の作用
を有する分子)の量が、本発明の修飾されたポリペプチドを吸入した場合に、対
応する親ポリペプチドと比べて減少されることを意味する。用語「呼吸器アレル
ギー誘発性」を代わりに使用することができる。用語「改善された洗浄性能」と
は、本発明の文脈では、この接合体で洗浄された試験物質のδ反射値(delta ref
lectance value)が、親酵素(非-接合体)で洗浄された試験物質のδ反射値と比べ
て増大することを意味する。

【００１５】用語「改善された洗浄性能」が、δ反射値を得ることができないような、例え
ばスキンケア製品に関連して使用される場合、この用語は、親酵素(非-接合体)
を用いるクレンジング作用と比較してクレンジング作用が改善されたことを意味
する。本発明者らは、親の未修飾のポリペプチドがホモポリマー、グラフト、ブロッ
ク、交互、又はランダムコポリマーに結合される場合、その洗浄性能が改善され
ることを発見した。

【００１６】該ポリペプチドの吸引により惹起される可能性のあるアレルギー反応も、対応
する親の未修飾ポリペプチドと比べて、減弱することができる。ある態様におい
て、本発明は、親ポリペプチドが、分子量100Da〜10,000Daまでの範囲、好まし
くは100Da〜5,000Da、より好ましくは100〜2,000Da、特に100〜1,000Daである高
分子に結合することができるような接合体に関連している。

【００１７】短／軽の高分子は、ポリペプチドの機能活性を阻害する傾向が少ないことが分
かっているので、短／軽高分子を問題のポリペプチドに結合することは利点であ
る。例えば、本発明の実施態様に従い定義された分子量を有する高分子に結合さ
れた酵素の活性部位は、高分子による空間障害があまり顕著でないので、比較的
大／重の高分子に結合した対応する酵素と比べて、基質により容易に接近するこ
とができる。更に、比較的小／軽の高分子を伴うポリペプチド−ポリマー接合体
は、重量が小さいと異なる方向にポリペプチド構造から引っ張られるという事実
によりポリペプチド構造の変形が最小であるので、ポリペプチドに結合した比較
的大／重の高分子を伴う対応する接合体と比べて、安定性が改善される。小さい高分子を使用する別の利点は、ポリマーはキロ単位で販売されるので、
これらは購入が安価であることである。このことは、本発明の接合体の製造コス
トを削減する。更に、複数の反応基を有する活性化されたポリマーへ酵素が複数共有結合的に
付着しているような固定された酵素と比較すると、本発明の接合体は、タンパク
質表面に共有結合的に付着された個々のポリマー分子を有している。従って酵素
の架橋結合が避けられ、このことは、適用媒質中の触媒のより均質かつ増大した
分布につながる。このことは、タンパク質ユニット当たりの本発明の接合体の性
能が、固定された酵素と比べてより良いものであることにつながり得る。

【００１８】ポリマーは、限定するものではないが、主に分子の構造、溶媒(ここでは水)
、温度及び濃度に応じて、異なるコンホメーション／形態をとることができるこ
とは、周知である(S. Forster及びN. Antonietti、Adv. Mater, 10:(3):195-217
(1998))。これらのコンホメーション／形態は、様々な形状のミセル、ラメラ、
規則シリンダー(ordered cylinder)、又は同相構造を含む。水性媒質中のコポリ
マーの分子コンホメーションは、溶媒和されたランダムコイル、延長されたコイ
ル、棒状ポリマー、超コイル、及び小胞などが周知である(水溶性ポリマー、M.
J. Comstock編集、ACSシンポジウムシリーズ、1991年)。

【００１９】従って、いずれかの理論に拘束されるものではないが、ポリペプチド表面に連
結されたグラフト、ブロック、交互、又はランダムコポリマーは、より親水性の
ホモポリマー同様、水中で表面のより良い遮蔽を生じるようなコンホメーション
をとると考えられる。更に分子上構造(supramolecular)の形成に起因した相乗作
用は、ポリペプチド表面の接近しやすさを減少することができる。更に、より親
油性のコポリマーの抗体との増加した反発(PEGホモポリマーと比較して)も役割
を果たすであろう。

【００２０】更に、グラフト、ブロック、交互、又はランダムコポリマーのより強固な構造
(ホモポリマーと比べて)は、抗体について、アレルギー反応の原因であるIgE産
生に寄与するポリペプチド表面のエピトープへの「道を発見すること」(より強
固なポリマー及び採用されたコンホメーションにより)をより困難にする。ポリマーの疎水性も、ポリペプチド−ポリマー接合体の潜在的アレルギー誘発
性に影響をもつと考えられる。ポリマー及び分子構造の適宜選択により、該ポリペプチド表面上のエピトープ
の遮蔽に関して最適な被覆を得ることができる。更に、付着したポリマーの特性
を調節することによって、例えば洗剤のような様々な配合物についての最適化さ
れた特性を得ることができる。

【００２１】別の態様において、本発明は、親ポリペプチドに共有結合した1個以上のポリ
マーを有するポリペプチド−ポリマー接合体に関し、ここで該ポリマーは、下記
一般式を有する： EO_xPO_y (I) （式中、x=1〜99％、y=1〜99％、及びx+y=100％）。このポリマーは、好ましくは一般式：(I)(式中、x=10〜90％、y=10〜90％、及
びx+y=100％)を特徴とする。

【００２２】本発明の好ましい実施態様においてポリマーは、エチレンオキシド単位及びプ
ロピレンオキシド単位で、比(EO単位：PO単位)が10:90、20:80、30:70、40:60、
50:50、60:40、70:30、80:20、及び90:10であるものからなる。好ましい実施態様において該ポリマーは、分子量100〜100,000Da、特に100〜5
0,000Da、とりわけ100〜10,000Daを有する。より好ましい実施態様において該ポリマーは、分子量100〜12,000Da、より好
ましくは300〜3,000Daを有する。本発明の実施態様においてポリマーは、ジブロック、トリブロック、多ブロッ
クポリマーである。一般式(I)は、EO単位及びPO単位が独立して存在するポリマ
ーを含むことが理解されるはずである。

【００２３】アレルギー誘発性の評価アレルギー誘発性は、経気管支的(気管内へ)投与された親ポリペプチドの作用
を、対応する本発明の修飾されたポリペプチドと比較する、吸入試験を基に評価
することができる。ポリペプチドのアレルギー誘発性の評価のためには、多くのin vivo動物モデ
ルが存在する。これらのモデルの一部は、ヒトにおける障害の評価に関する適当
な基本をもたらす。適当なモデルは、モルモットモデル及びマウスモデルを含む
。これらのモデルは、予め感作された動物において誘導された誘発反応の機能と
しての呼吸器系アレルゲンを同定するために検討される。これらのモデルに従い
、疑わしいアレルゲンが動物に経気管支的に導入される。

【００２４】モルモットの適当な系統であるDunkin Hartley系は、ヒトとは異なり、アレル
ギー反応に関連したIgE抗体を産生する。しかしこれらは他の種類の抗体IgG1A及
びIgG1Bを産生し(例えば、Prento, ATLA, 19:8-14 (1991)を参照のこと)、これ
はそれらの、吸引された酵素を含むポリペプチドに対するアレルギー反応に関与
している。従って、Dunkin Hartley動物モデルを使用する場合、IgG1A及びIgG1B
の相対量が、アレルギー誘発レベルの尺度である。

【００２５】酵素のようなポリペプチドに対する経気管支曝露に適当なラット系は、Brown
Norway系である。Brown Norway系ラットは、アレルギー反応としてIgEを産生す
る。モルモット及びマウスにおける呼吸器系アレルゲン評価に関するより詳細につ
いては、Kimberらの、Fundamental and Applied Toxicology、33:1-10 (1996)を
参照のこと。ウサギのような他の動物も同等の試験のために使用することができる。

【００２６】高分子ポリペプチドに結合した高分子は、本発明に従って定義された分子量を有する
いずれか適当な高分子であることができ、これは天然又は合成のホモポリマー、
例えばポリオール(すなわち、ポリ-OH)、ポリアミン(すなわち、ポリ-NH₂)及び
ポリカルボン酸(すなわち、ポリ-COOH)、並びに更にヘテロポリマー、すなわち1
個以上の異なる結合基、例えばヒドロキシル基及びアミン基などを含むポリマー
を含む。

【００２７】適当な高分子の例は、ポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばポリアルキレン
グリコール(PAG)で、ポリエチレングリコール(PEO)、メトキシポリエチレングリ
コール(mPEG)及びポリプロピレングリコールを含むもの、PEG-グリシジルエーテ
ル(Epox-PEG)、PEG-オキシカルボニルイミダゾール(CDI-PEG)、分枝したPEG、星
型PEG、ポリ-ビニルアルコール(PVA)、ポリ-カルボキシレート、ポリ-(ビニルピ
ロリドン)、ポリ-D,L-アミノ酸、ポリエチレン-コ-無水マレイン酸、ポリスチレ
ン-コ-無水マレイン酸、カルボキシメチル-デキストランを含むデキストラン、
ヘパリン、アルブミン相同体、セルロースで、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロース、エチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロースを含むもの、

【００２８】キトサン水解物、ヒドロキシエチル-スターチ及びヒドロキシプロピル-スター
チのようなスターチ、グリコーゲン、アガロース及びそれらの誘導体、グアール
ゴム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲーナン、ペクチン、アルギ
ン酸水解物、生体ポリマー、ステアリン酸塩を含むポリオキシエチレンエステル
、例えばPEG8ステアレート(Myrj 45)、PEG40ステアレート(Myri 52)、PEG50ステ
アレート(Myrj 53)、PEG100ステアレート(Myrj 59)、及びポリオキシエチレン25
プロピレングリコールステアレート、ポリオキシエチレンエーテルで、2エチル
エーテル、2ペンチルエーテル、2セチルエーテル、2ステアリルエーテル、2オレ
イルエーテル、3ヘキシルエーテル、3オクチルエーテル、3 デシルエーテル、3
ラウリルエーテル、3ミリスチルエーテル、3セチルエーテル、3ステアリルエー
テル、4ヘプチルエーテル、4オクチルエーテル、4デシルエーテル、4ラウリルエ
ーテル、

【００２９】 4ミリスチルエーテル、4セチルエーテル、4ステアリルエーテル、5ヘキシルエ
ーテル、5オクチルエーテル、5デシルエーテル、5ラウリルエーテル、5ミリスチ
ルエーテル、5セチルエーテル、5ステアリルエーテル、6デシルエーテル、6ラウ
リルエーテル、6ミリスチルエーテル、6セチルエーテル、6ステアリルエーテル
、7デシルエーテル、7ラウリルエーテル、7ミリスチルエーテル、7ステアリルエ
ーテル、8デシルエーテル、8ラウリルエーテル、8ミリスチルエーテル、8セチル
エーテル、8ステアリルエーテル、9ラウリルエーテル、10ラウリルエーテル、10
トリデシルエーテル、10セチルエーテル、10ステアリルエーテル、10オレイルエ
ーテル、20セチルエーテル、20イソヘキサデシルエーテル、20ステアリルエーテ
ル、20オレイルエーテル、21ステアリルエーテル、23ラウリルエーテル、100ス
テアリルエーテル、及びポリオキシエチレンソルビタンで、モノラウレート、モ
ノオレエート、モノパルミテート、モノステアレート、トリオレエート、トリス
テアレートからなる群より選択される高分子を含む。

【００３０】好ましい高分子は、更に酵素表面上の結合基へのその共有結合に関して比較的
単純な化学を必要とする、ポリエチレングリコール(PEG)のような無毒の高分子
である。一般に認められるポリアルキレンオキシド(PAO)、例えばPEGのようなポリエチ
レンオキシド、特にPEGが好ましい高分子であり、その理由はこれらの高分子は
、デキストラン、プルランなどのような多糖類と比較すると、望ましくない架橋
結合が可能な反応基を殆ど含まないからである。

【００３１】ポリペプチドに結合されたポリマーは、同様に下記一般式を有するグラフト、
ブロック、交互、又はランダムコポリマーであることができる： EO_xPO_y (I) （式中、x=1〜99％、y=1〜99％、及びx+y=100％）。

【００３２】本発明の好ましい実施態様において、ポリマーは、エチレンオキシド単位及び
プロピレンオキシド単位で、比(EO単位：PO単位)が10:90、20:80、30:70、40:60
、50:50、60:40、70:30、80:20又は90:10のものからなる。好ましい実施態様において、該ポリマーは、分子量100〜100,000Da、特に100
〜50,000Da、とりわけ100〜10,000Daを有する。本発明の実施態様において、ポリマーは、ジブロック、トリブロック、多ブロ
ックポリマーである。

【００３３】ポリペプチドの表面に結合して使用することができる具体的なコポリマーの例
は、以下のものである：ポリ(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)；
ポリ(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)モノブチルエーテル；ポリ
(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)モノメチルエーテル。好ましいポリマーは、例えばPEG及びPPGコポリマーのような無毒のポリマーであ
る。酵素表面上の結合基へのその共有結合に関して比較的単純な化学を必要とす
るポリマーが好ましい。

【００３４】ポリペプチドの表面に結合して使用することができる具体的なブロックポリマ
ーの例は、以下のものである：ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-ポリ(エ
チレングリコール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール)；ポリ(エチレングリ
コール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-ポリ(エチレングリコ
ール)；ポリ(プロピレングリコール) -ブロック-ポリ(エチレングリコール) -ブ
ロック-ポリ(プロピレングリコール)モノブチルエーテル；ポリ(エチレングリコ
ール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール) -ブロック-ポリ(エチレングリコ
ール)モノブチルエーテル；ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-ポリ(エチレ
ングリコール) -ブロック-ポリ(プロピレングリコール)モノメチルエーテル；ポ
リ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-ポリ
(エチレングリコール)モノメチルエーテル。

【００３５】好ましいブロックポリマーは、下記一般式を有するブロックポリマーであり：
H(-OCH₂CH₂-)_x[-OCH (CH₃)CH₂-]_y(-OCH₂CH₂-)₂OH、平均分子量(M_n) が1,100であ
りかつエチレングリコール含量が10質量％であるもの、M_n= 1,900及び50質量％
、M_n= 2,000及び10質量％、M_n= 2,800及び10質量％、M_n= 2,800及び15質量％、M _n = 2,900及び40質量％、M_n= 4,400及び30質量％、M_n= 5,800及び30質量％、M_n=
8,400及び80質量％のものである。

【００３６】別の好ましいブロックポリマーは、下記一般式を有するブロックポリマーであ
り：H[-OCH(CH₃)CH₂-]_x(-OCH₂CH₂-)_y[-OCH(CH₃)CH₂-]₂OH、平均分子量(M_n) が2,
000でありかつエチレングリコール含量が50質量％であるもの、M_n= 2,700及び40
質量％、M_n= 3,300及び10質量％であるものである。別の具体的なブロックポリマーはp7120：BASE社(独国)から市販されているPlu
ronics、ユニオンカーバイド社(米国)から市販されているTergitol、フルカ社(
スイス)から市販されているSynperonicである。

【００３７】ポリペプチドの表面に結合して使用することができる具体的なコポリマーの例
は、以下のものである：ポリ(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)、
特にポリ(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)で、平均分子量M_nが2,
500及び75質量％のエチレングリコールのもの、並びに平均分子量M_nが12,000及
び75質量％のエチレングリコールのもの；ポリ(エチレングリコール-コ-プロピ
レングリコール)モノブチルエーテル、特にポリ(エチレングリコール-コ-プロピ
レングリコール)モノブチルエーテルで、平均分子量M_nが970及び50質量％のエチ
レングリコールのもの、平均分子量M_nが1,700及び50質量％のエチレングリコー
ルのもの、並びに平均分子量M_nが3,900及び50質量％のエチレングリコールのも
の；ポリ(エチレングリコール-コ-プロピレングリコール)モノメチルエーテルで
ある。好ましいポリマーは、例えばPEG及びPPGコポリマーで構成された無毒のポリマ
ーである。酵素表面上の結合基へのその共有結合に関して比較的単純な化学を必
要とするポリマーが好ましい。

【００３８】具体的なEO-オリゴマーの例は以下のものである：ジエチレングリコール、ジ
エチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコール、トリエチレ
ングリコールモノメチルエーテル、テトラエチレングリコール、テトラエチレン
グリコールモノメチルエーテル、ペンタエチレングリコール、ペンタエチレング
リコールモノメチルエーテル、ヘキサエチレングリコール、ヘキサエチレングリ
コールモノメチルエーテル、ヘプタエチレングリコール、ヘプタエチレングリコ
ールモノメチルエーテル、又はエチレングリコールの直鎖で非分枝鎖のC2-C14モ
ノアルキルエーテル、及び2〜7個のエチレンオキシド単位を伴うエチレングリコ
ールである。これらのグラフト、ブロック、交互又はランダムコポリマーは星型又は分枝型
であることができる。

【００３９】適当なポリマーの調製親ポリペプチド表面に付着するポリマーは、当該技術分野において公知の常法
を用いて調製することができる。更に様々なポリマーが、BASF社(独国)、ユニオ
ンカーバイド社(米国)、アルドリッチ社、シェアウォーター社、シグマ社(米国)
などの会社から市販されている。

【００４０】ポリマーの活性化問題のポリペプチドと接合されるポリマーが活性でない場合には、適当な技法
を用いてこれを活性化しなければならない。本発明では、ブロック又はコ-ポリ
マーを、リンカーを介してポリペプチドに結合することも意図される。適当なリ
ンカーは、当業者には周知である。高分子の活性化に加えポリペプチド共役の方法及び化学は、文献に詳しく記載
されている。

【００４１】通常使用される不溶性ポリマーの活性化法は、ブロモシアン、過ヨウ素、グル
タルアルデヒド、バイエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カ
ルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基
の活性化を含む(R.F. Taylor, (1991),「タンパク質の固定の基本及び応用(Prot
ein immobilisation Fundamental and applications)」、Mercel Dekker, N.Y.
；S.S. Wong, (1992),「タンパク質共役及び架橋の化学(Chemistry of Protein
Conjugation and Crosslinking)」、CRC Press, Boca Raton；G.T. Hermansonら
、(1993), 「固定アフィニティーリガンド法(Immobilized Affinity Ligand Tec
hniques)」、Academic Press, N.Y.を参照のこと)。

【００４２】これらの方法のいくつかは、不溶性ポリマーの活性化を考慮しているが、例え
ば過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスル
ホン、カルボジイミドなどのように可溶性ポリマーの活性化に適用することもで
きる。ポリマー上のアミノ、ヒドロキシ、チオール、カルボキシ、アルデヒド又
はスルホヒドリルのような官能基及びタンパク質上の選択された結合基は、通常
i)ポリマーの活性化、ii)共役、及びiii)残留活性基の阻害からなる活性化及び
共役の化学を選択する際に考察されなければならない。

【００４３】以下に多くの適当なポリマー活性化法を、簡単に説明する。しかし他の方法も
使用できると理解されるべきである。ポリペプチドの遊離酸基への高分子の結合は、ジイミド、及び例えばアミノ-P
EG.又はヒドラジノ-PEG(Pollakら、J. Am. Chem. Soc.、98:289-291 (1976))、
又はジアゾアセテート／アミド(Wongら、(1992)、「タンパク質接合及び架橋の
化学」、CRC Press)などの助けにより行うことができる。ヒドロキシ基の高分子への結合は、水中で行われなければならないので、概し
てこれは非常に困難である。通常加水分解は、ヒドロキシ基との反応より優性で
ある。

【００４４】遊離のスルフヒドリル基への高分子の結合は、マレイミド又はo-ピリジルジス
ルフィドのような特定の基と反応することができる。更にビニルスルホン (Snow
らの米国特許第5,414,135号(1995))は、スルフヒドリル基を好むが、言及された
他のもののような選択性はない。ポリペプチド鎖中の接近可能なルギニン残基は、2個の隣接するカルボニル基
を含む基により標的とされる。

【００４５】求電子性に活性化されたPEGのリシンアミノ基への結合に関する技術も有用で
ある。通常のアルコールに関する脱離基の多くが、アミン結合を生じる。例えば
、アルキルスルホネート、例としてトレシレート(Nilssonら、(1984)、Methods
in Enzymology、第104巻、Jacoby, W. B.編集、Academic Press、オーランド、5
6-66頁；Nilssonら、(1987)、Methods in Enzymology、第135巻；Mosbach, K.編
集、Academic Press、オーランド、65-79頁；Scouten ら、(1987)、Methods in
Enzymology、第135巻、Mosbach, K.編集、Academic Press、オーランド、79-84
頁；Crosslandら、(1971)、J. Amr. Chem. Soc.、93:4217-4219 (1971))、メシ
レート(Harris、(1985)、前掲；Harrisら、J. Polym. Sci. Polym. Chem, Ed.、
22:341-352 (1984))、トシレートのようなアリールスルホネート、並びにp-ニト
ロベンゼンスルホネートを使用することができる。

【００４６】有機塩化スルホニル、例えば塩化トレシルは、PEGのような多くのポリマー中
のヒドロキシ基を、ポリペプチド中のアミノ基のような求核基と反応した場合に
安定した連結をポリマーとポリペプチドの間に形成することができるような良好
な脱離基に効果的に転換する。高い接合体の収量に加えて、反応条件は一般に緩
やか(変性を避け並びに活性の破壊がほとんどないか又は全く無いために、中性
又はわずかにアルカリ性のpH)であり、かつポリペプチドに対する非破壊的要件
を満足する。

【００４７】トシレートは、メシレートよりもより反応性であるが、不安定であり、PEG、
ジオキサン及びスルホン酸へ分解する(Zalipsky、Bioconjugate Chem.、6:150-1
65 (1995))。エポキシドも、アミン結合の形成に使用することができるが、前述
の基よりもはるかに反応性が低い。

【００４８】ホスゲンによるPEGのクロロギ酸への転換は、リシンへのカルバマト連結を生
じる。このテーマは、N-ヒドロキシスクシンイミドにより(米国特許第5,122,614
号、(1992)；Zalipakyら、Biotechnol. Appl. Biochem.、15:100-114 (1992)；M
onfardiniら、Bioconjugate Chem., 6:62-69 (1995))、イミダゾールにより(All
enら、Carbohydr. Res.、213:309-319 (1991))、p-ニトロフェノール、DMAP(Loo
ze, Y.の欧州特許出願第632 082 A1号、(1993))などにより、塩素を置換する多
くの変種において行うことができる。これらの誘導体は、通常望ましい脱離基と
クロロギ酸の反応により生成することができる。これらの基は全て、ペプチドに
カルバマト連結を生じる。

【００４９】更に、イソシアナート及びイソチオシアナートを用いて、各々、尿素及びチオ
尿素を生じることができる。アミドは、PEG酸から、前述のものと同じ脱離基及び環状イミドトロン(imid t
hrone)を用いて得ることができる(Greenwaldらの米国特許第5,349,001号、(1994
))。これらの化合物の反応性は非常に高いが、しかし迅速に加水分解され得る。無水コハク酸との反応から生成されるPEGスクシネートも使用することができ
る。ここに含まれるエステル基は、より加水分解を受けやすい接合体を生成する
(Zalipskyの米国特許第5,122,614号、(1992))。この基は、N-ヒドロキシスクシ
ンイミドにより活性化される。

【００５０】更に、特定のリンカーを導入することができる。最も古典的なのは、塩化シア
ヌルである(Abuchowskiら、J. Biol. Chem.、252:3578-3581 (1977)；Davisらの
米国特許第4,179,337号、(1979)；Shaferら、J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed.
, 24:375-378 (1986))。更にこのポリマーは、ピリミジン環を介してポリペプチ
ドに結合することができる(米国特許第4,144,128号、米国特許第4,195,128号及
び米国特許第4,298,395号を参照のこと)。

【００５１】 PEGの芳香族アミンへの結合とそれに続くジアゾ化は、非常に反応性のin situ
でペプチドと反応することができるジアゾニウム塩を生じる。アミド連結も、PE
G誘導体のアズラクトンの反応により得ることができ(Greenwald, K. B.の米国特
許第5,321,095号、(1994))、その結果追加のアミド連結を導入する。一部のペプチドは多くのリシンを含有しないので、1個以上のPEGが同じリシン
に付着することは利点となりうる。これは、例えば、1,3-ジアミノ-2-プロパノ
ールを用いて行うことができる。

【００５２】 PEGも、酵素のアミノ基にカルバマト連結により付着することができる(Greenw
aldらの国際公開公報第95/11924号)。リシン残基を同様に主鎖として用いること
ができる。関連する接合体の調製のためのポリマー活性化及びPEG官能基化の一般的概説
は、Zaplisky, S.、Bioconjugate Chem.、6:150-165 (1995)；Hermanson, G.T.
、Academic Press、サンディエゴ、1996；及びS. Herman, G.、Hooftman, E.、S
chacht, Journal of Bioactive and Compatible polymers、第10巻、1995年、14
5-187頁に記されている。

【００５３】結合したブロック又はコ-ポリマー(複数)の位置リシン残基のアミノ基のような全てのイオン化された基は、外見上は、ポリペ
プチド分子の表面にある(例えばThomas B. Creighton、(1993)、「タンパク質」
、W.H. Freeman and Company、ニューヨークを参照のこと)。従って、ポリペプ
チド表面上の容易に接近できる結合基(すなわちアミノ基)の数は、該ポリペプチ
ドの一次構造中のリシン残基の数とN-末端のアミノ基の和に等しい。本発明では、1〜100個のポリマー、好ましくは4〜50個のポリマー、5〜35個の
ポリマーが、問題の親ポリペプチドに結合する。

【００５４】親ポリペプチド本発明の修飾されたポリペプチドは、典型的には分子量4〜100kDa、好ましく
は15〜60kDaの範囲を有する親ポリペプチドを基に、いずれか適当な当該技術分
野において公知の技術を用いて調製することができる。用語「親」ポリペプチドは、いずれか未結合のポリペプチド(すなわち修飾さ
れるべきポリペプチド)を示すことが意図される。このポリペプチドは、好まし
くは、細菌、糸状菌又は酵母起源のような微生物起源であるか、又は植物起源で
あることができる。親ポリペプチドは、天然の(又は野生型)ポリペプチドである
か、又はそれらの変種であることができる。

【００５５】親ポリペプチドを選択する際には、高い結合基数を伴うポリペプチドを使用す
ることは利点である。更に、本発明の好ましい実施態様において、ポリマーは、親ポリペプチドの表
面に広範に分散されている。酵素について、ブロック又はコ-ポリマーが、活性
部位に接近した領域に結合しないことが好ましい。

【００５６】本発明の文脈において、「広範な分散」とは、ポリペプチドの結合基に結合し
た高分子が、ポリペプチドの異なる部位を遮蔽する、好ましくは表面積の全体又
はほぼ全体を遮蔽するように位置し、認識可能な関連するエピトープ(複数)が遮
蔽され、これによりアレルギー性が低い酵素が得られる場合に免疫系の抗体とし
て認識されないことを確実にすることを意味する。このポリペプチドと抗体の間
の相互作用の表面積は、約500Å²(26 x 19Å)程度であると考えられる(Sheriff
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:8075 (1987)を参照のこと)。

【００５７】酵素については、最小の酵素活性の喪失を確実にし、活性部位の十分近傍では
ポリマーに結合しないことが好ましい。概して、ポリマーは、活性部位から5Å
以内、好ましくは10Å以内では付着しないことが好ましい。更に、免疫系により認識可能な公知のエピトープの位置又は該エピトープの近
傍で、ポリマーに結合されたポリペプチドも、本発明の利点とみなされる。エピ
トープ(複数)の位置が不明であるならば、ポリペプチドの表面で利用できる結合
基と同数のポリマーが結合するという利点がある。該結合基は、活性部位から適
当に離れてポリペプチド表面に広範に分布していることが好ましい。

【００５８】前述のポリペプチド表面上の結合したポリマーの分布に関する要求を満たす親
ポリペプチドが、本発明では好ましい。酵素については、活性部位から0〜5Å、好ましくは0〜10Åの距離以内で結合
したポリマーを有さないか又はごくわずかなポリマー(すなわち0〜2個)を有する
酵素が、特に好ましい。

【００５９】酵素活性親酵素は、以下に記す産業用組成物及び製品において使用されることがわかっ
ているいずれかの活性を有することができる。考慮された酵素活性は、ラッカー
ゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)のような酸化還元酵素(E.C. 1、「En
zyme Nomenclature」、(1992)、Academic Press, Inc.)；特にサブチリシンのよ
うなセリンプロテアーゼであるプロテアーゼ、及び脂質分解酵素を含む、加水分
解酵素E.C. 3；トランスグルタミナーゼ(TGases)のような転移酵素(E.C. 2)；プ
ロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)のような異性化酵素(E.C. 5)を含む。

【００６０】親プロテアーゼ親プロテアーゼ(すなわち、国際生化学分子生物学連合(IUBMB)の推奨(1992)に
従い酵素分類番号E.C. 3.4に分類される酵素)は、この群のプロテアーゼを含む
。例として、下記の酵素分類(E.C.)番号で分類されたものから選択されたプロテ
アーゼがある： 3.4.11 (すなわち、いわゆるアミノペプチダーゼ)で、3.4.11.5(プロリルアミ
ノペプチダーゼ)、3.4.11.9(X-プロアミノペプチダーゼ)、3.4.11.10(細菌のロ
イシルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.12(トレモフィリック(tremophilic)アミノ
ペプチダーゼ)、3.4.11.15(リシルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.17(トリプトフ
ァニルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.18(メチオニルアミノペプチダーゼ)を含む
もの；

【００６１】 3.4.21 (すなわち、いわゆるセリンエンドペプチダーゼ)で、3.4.21.1(キモト
リプシン)、3.4.21.4(トリプシン)、3.4.21.19(グルタミルエンドペプチダーゼ)
、 3.4.21.25(ククミシン)、3.4.21.32(ブラキウリン)、3.4.21.48(セレビシン)
及び3.4.21.62(サブチリシン)を含むもの； 3.4.22 (すなわち、いわゆるシステインエンドペプチダーゼ)で、3.4.22.2(パ
パイン)、3.4.22.3(フィカイン)、3.4.22.6(キモパパイン)、3.4.22.7(アスクレ
パイン)、3.4.22.14(アクチニダイン)、3.4.22.30(カリカイン)及び3.4.22.31(
アナナイン)を含むもの；

【００６２】 3.4.23 (すなわち、いわゆるアスパラギン酸エンドペプチダーゼ)で、3.4.23.
1 (ペプシンA)、3.4.23.18(アスペルギオペプシンI)、3.4.23.20(ペニシロペプ
シン)及び3.4.23.25(サッカロペプシン)を含むもの；並びに 3.4.24 (すなわち、いわゆるメタロエンドペプチダーゼ)で、2.4.24.28 (バシ
ロリシン)を含むものである。関連するサブチリシンの例は、サブチリシンBPN'、サブチリシンアミロサッカ
リチカス、サブチリシン168、サブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、サブチ
リシンカールスバーグ、サブチリシンDY、サブチリシン309、サブチリシン147、
テルミターゼ、アクアリシン、バシラスPB92プロテアーゼ、プロテイナーゼK、
プロテアーゼTW7、及びプロテアーゼTW3を含む。

【００６３】このような容易に利用できる市販のプロテアーゼの具体的例は、Esperase（商
標）、Alcalase（商標）、Neutrase（商標）、Durazym（商標）、Savinase（商
標）、Pyrase（商標）、Pancreatic Trypsin NOVO (PTN)、Bio-Feed Pro、Clear
-Lens Pro、Everlase（商標）、Kanase（商標）、Relase（商標）、V8Proteinas
e（商標）（全ての酵素はノボノルディスク社から入手可能）がある。その他の市販のプロテアーゼの例は、ゲネンコル・インターナショナル社から
市販されている、Maxatase（商標）、Maxacal（商標）、Maxapem（商標）、Opti
clean（商標）、Properase（商標）、及びPurafect（商標）がある。

【００６４】更にプロテアーゼ変種が、親プロテアーゼとして考慮されていることも理解さ
れるべきである。このようなプロテアーゼ変種の例は、欧州特許第130,756号(ゲ
ネンテック社)、欧州特許第214,435号(ヘンケル社)、国際公開公報第87/04461号
(アムゲン社)、国際公開公報第87/05050号(ゲネックス社)、欧州特許第251,446
号 (ゲネンコル社)、欧州特許第260,105号(ゲネンコル社)；Thomasらの論文、Na
ture、318:375-376 (1985)；Thomasらの論文、J. Mol. Biol.、193:803-813 (19
87)；Russelらの論文、Nature、328:496-500 (1987)；国際公開公報第88/08028
号(ゲネックス社)、国際公開公報第88/08033号(アムゲン社)、国際公開公報第89
/06279号(ノボノルディスク社)、国際公開公報第91/00345 (ノボノルディスク社
)、欧州特許第525 610号(ソルベイ社)並びに国際公開公報第94/02618号(ギスト
ブロケード社)に示されている。

【００６５】欧州特許第482,879 B1 (塩野義社)に開示されたC-成分も言及している。これらのプロテアーゼ活性は、「Methods of Enzymatic Analysis」、第3版、19
84年、Verlag Chemie、Weinheim、第5巻に説明されているように測定することが
できる。考慮されたタンパク質分解酵素は、前述の特性(すなわち結合基の数、結合基
の位置など)を伴う、酸性アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアー
ゼ、サブチリシンのようなセリンプロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼの群か
ら選択されたプロテアーゼを含む。適当な結合基数を有する適当な親プロテアーゼの具体的例は、下記表１に記さ
れている：

【表１】サブチリシンPD498は、分子量29kDaを有し、かつ配列番号：2に見ることがで
き、酵素表面のポリマー付着のための12個のリシン基及び1個のN-末端アミノ基
を有する。前述のように、好ましい酵素は、表面に広範に分散されたリシンを有
する。PD498は、活性部位から0〜10Åの距離にリシン残基を有さず、このことは
これを修飾された形で特に適したものにしている。更に、このリシン残基は、酵
素表面に広範に分散している(すなわち、活性部位から離れている)。

【００６６】酵素サブチリシンDYは、分子量27kDを有し、かつ酵素表面の12個のアミノ基(
すなわちリシン残基) 及び1個のN-末端アミノ基を有する(配列番号：3を参照の
こと)。親プロテアーゼであるリオンYは、分子量46kDaを有し、かつ酵素表面の14個の
アミノ基(すなわちリシン残基)及び1個のN-末端アミノ基を有する(配列番号：4
を参照のこと)。中性のメタロプロテアーゼであるテルモライシンは、分子量約34kDaを有し、
かつ表面に11個のアミノ基(すなわちリシン残基)及び1個のN-末端アミノ基を有
する(配列番号：5を参照のこと)。

【００６７】親リパーゼ親リパーゼ(すなわち、国際生化学分子生物学連合(IUBMB)の推奨(1992)に従い
酵素分類番号E.C. 3.1.1 (カルボン酸エステル加水分解酵素)に分類される酵素)
は、下記群のリパーゼを含む。例として、下記の酵素分類(E.C.)番号で分類されたものから選択されたリパー
ゼがある： 3.1.1 (すなわち、いわゆるカルボン酸エステル加水分解酵素)で、(3.1.1.3)
トリアシルグリセロールリパーゼ、(3.1.1.4.)ホスホリパーゼA₂を含むもの。リパーゼの例は、下記の微生物に由来するリパーゼを含む。記された特許公開
は、本願明細書に参照として組入れられている：

【００６８】フミコーラ（Humicola）、例えば、フリコーラ・ブレビスポラ（H. brevispor
a）、フミコーラ・ナヌギノサ（H. lanuginosa）、フミコーラ・ブレビス・バラ
ネティー・セリノイデア（H. brevis var. therinoidea）及びフミコーラ・イン
ソレンス（H. insolens）(米国特許第4,810,414号）シュードモナス（Pseudomonas）、例えばシュードモナス・フラギー（Ps. fragi
）、シュードモナス・スツチェリー（Ps. stutzeri）、シュードモナス・セパシ
ア（Ps. cepacia）及びシュードモナス・フルオレセンス（Ps. fluorescens）(
国際公開公報第89/04361号)、又はシュードモナス・プランタリー（Ps. plantar
ii）もしくはシュードモナス・グラディオリー（Ps. gladioli）(米国特許第4,9
50,417号) (Solvay Enzymes))、又はシュードモナス・アルカリゲネス（Ps. alc
aligenes）及びシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ps. pseudoalcalige
nes）(欧州特許第218 272号)、又はシュードモナス・メンドシナ（Pa. mendocin
a）(国際公開公報第88/09367号；米国特許第5,389,536号)

【００６９】フザリウム（Fusarium）、例えばフザリウム・オキシスポルム（F. oxysporum）
（欧州特許第130,064号)又はフザリウム・ソラニ・ピシ（F. solani pisi）(国
際公開公報第90/09446号) ムコール（Mucor）(Rhizomucor（リソムコール）とも称す)、例えばムコール・
ミーヘイ（M. miehei）(欧州特許第238 023号) クロモバクテリウム（Chromobacterium）(特にクロモバクテリウム・ビスコス
ム（C. viscosum)）アスペルギルス（Aspergillus）(特にアスペルギルス・ニガー（A. niger)）キャンディダ（Candida）、例えばキャンディダ・シリンドラセー（C. cylindra
cea）キャンディダ・ルゴサ（C. rugosa）とも称す)又はキャンディダ・アンタ
ルシチカ（C. antarctica）(国際公開公報第88/02775号)又はキャンディダ・ア
ンタルシチカ（C. antarctica）リパーゼAもしくはB (国際公開公報第94/01541
号及び国際公開公報第89/02916号)

【００７０】ゼオトリカム（Geotricum）、例えばゼオトリカム・カンディダム（G. candidum
）(Schimadaら、J. Biochem.、106: 383-388 (1989)) ペニシリウム（Penicillium）、例えばペニシリウム・カメンベルティー（P. ca
membertii）(Yamaguchiら、Gene、103:61-67 (1991)) リゾプス（Rhizopus）、例えばリゾプス・デレマー（R. delemar）(Hassら、Gen
e、109:107-113 (1991))又はリゾプス・ニベラス（R. niveus）(Kugimiyaら、Bi
osci. Biotech. Biochem、56:716-719 (1992))又はリゾプス・オリゼー（R. ory
zae）

【００７１】バシルス（Bacillus）、例えばバシルス・ズブチリス（B. subtilis）(Dartois
ら、Biochemica et Biophysica acta、1131:253-260 (1993))又はバチルス・ス
テアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）(日本国特開昭64/7744992)、
又はB. pumilus (国際公開公報第91/16422号)。容易に入手できる市販のリパーゼの具体的な例は、Lipolase（商標）、Lipola
se（商標）Ultra、Lipozyme（商標）、Palatase（商標）、Novozym（商標）435
、Lecitase（商標）(全てノボノルディスク社から入手できる)を含む。

【００７２】その他のリパーゼの例は、ゲネンコール社のシュードモナス・メンドシアム（
Ps. mendociam）リパーゼである、Lumafast（商標）；ギストブロケード社のシ
ュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ps. pseudoalcaligenes）リパーゼで
ある、Lipomax（商標）；ユニベルバー社のフザリウム・ソラニ（Fusarium sola
ni）リパーゼ(クチナーゼ)；Solvay 酵素のバチルス・スペーシス（Bacillus sp
.）のリパーゼがある。他社のその他のリパーゼも利用できる。

【００７３】更にリパーゼ変種を親酵素とすることも理解される。このような例は、例えば
国際公開公報第93/01285号及び国際公開公報第95/22615号に開示されている。リパーゼの活性は、「Methods of Enzymatic Analysis」、第3版、1984年、Ve
rlag Chemie、Weinheim、第4巻に説明されているように、又はAF 95/5 GB (ノボ
ノルディスク社に請求)に記載されているように、測定することができる。

【００７４】考察された脂質分解酵素は、例えば欧州特許第258 068号及び欧州特許第305 2
16号に開示されているフミコーラ・ランギノサ（Humicola lanuginosa）のリパ
ーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、例えば欧州特許第238
023号に開示されているリゾムコール・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）リパー
ゼ、アブシディア・スペーシス（Absidia sp.）脂質分解酵素(国際公開公報第96
/13578号)、欧州特許第214 761号に開示されているC. AntarcticaリパーゼA又は
BなどのC. antarcticaリパーゼのようなキャンディダ（Candida）リパーゼ、欧
州特許第218 272号に開示されているシュードモナス・アルカリゲネス（P. alca
ligenes）及びシュードモナス・シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligene
s）リパーゼのようなシュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、

【００７５】欧州特許第331 376号に開示されているようなシュードモナス・セパシア（P.
cepacia）リパーゼ、国際公開公報第95/14783号に開示されているようなシュー
ドモナス・スペーシス（Pseudomonas sp.）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リ
パーゼ、例えばバチルス・ズブチリス（B. subtilis）リパーゼ (Dartoisら、Bi
ochemica et Biophysica acta、1131:253-260 (1993))、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス（B. stearothermophilus）リパーゼ(日本国特開昭64/744992号)及
びバチルス・プニルス（B. pumilus）リパーゼ(国際公開公報第91/16422号)があ
る。その他の種類の脂質分解は、例えばフミコーラ・インソレンス（Humicola i
nsolens）に由来し、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）(
国際公開公報第88/09367号)、又はフザリウム・ソラニピシ（Fusarium solani p
isi）(例えば国際公開公報第90/09446号に開示されている)を含む。

【００７６】親酸化還元酵素親酸化還元酵素(すなわち、国際生化学分子生物学連合(IUBMB)の推奨(1992)に
従い酵素分類番号E.C. 1(酸化還元酵素)に分類される酵素)は、下記群の酸化還
元酵素を含む。例として、下記の酵素分類(E.C.)番号で分類されたものから選択された酸化還
元酵素がある：

【００７７】グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼNAD+ (1.1.1.8)、グリセロール-3-リ
ン酸デヒドロゲナーゼNAD(P)⁺ (1.1.1.94)、グリセロール-3-リン酸-1-デヒドロ
ゲナーゼNADP (1.1.1.94)、グルコースオキシダーゼ(1.1.3.4)、ヘキソースオキ
シダーゼ(1.1.3.5)、カテコールオキシダーゼ(1.1.3.14)、ビリルビンオキシダ
ーゼ(1.3.3.5)、アラニンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.1)、グルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ(1.4.1.2)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼNAD(P)⁺ (1.4.1.3)、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼNADP⁺ (1.4.1.4)、L-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(1.4.1.5)
、セリンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.7)、バリンデヒドロゲナーゼNADP⁺ (1.4.1.8)
、

【００７８】ロイシンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.9)、グリシンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.10)
、L-アミノ酸オキシダーゼ(1.4.3.2.)、D-アミノ酸オキシダーゼ(1.4.3.3)、L-
グルタミン酸オキシダーゼ(1.4.3.11)、タンパク質-リシン6-オキシダーゼ(1.4,
3.13)、L-リシンオキシダーゼ(1.4.3.14)、L-アスパラギン酸オキシダーゼ(1.4.
3.16)、D-アミノ-酸デヒドロゲナーゼ(1.4.99.1)、プロテインジスルフィドレダ
クターゼ(1.6.4.4)、チオレドキシンレダクターゼ(1.6.4.5)、プロテインジスル
フィドレダクターゼ(グルタチオン) (1.8.4.2)、ラッカーゼ(1.10.3.2)、カタラ
ーゼ(1.11.1.6)、ペルオキシダーゼ(1.11.1.7)、リポキシゲナーゼ(1.13.11.12)
、スーパーオキシドジスムターゼ(1.15.1.1)がある。

【００７９】前記グルコースオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）に由来する。前記ラッカーゼは、ポリプルス・ピンシリス（Polyporus pinsitus）、ミセリオ
フトラ・テルモフィラ（Myceliophtora thermophila）、コピリヌス・シネレウ
ス（Coprinus cinereus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、リ
ゾクトニア・プラチコラ（Rhizoctonia praticola）、シタリジウム・テノフィ
ルム（Scytalidium therrnophilum）及びルス・ベルニシフェラ（Rhus vernicif
era）に由来する。ビリルビンオキシダーゼは、ミロテセシウム・ベルカリア（Myrothechecium ver
rucaria）に由来することができる。

【００８０】ペルオキシダーゼは、例えばダイズ、西洋ワサビ又はコプリヌス・シネレウス
（Coprinus cinereus）に由来することができる。プロテインジスルフィドレダクターゼは、デンマーク(DK)特許出願第769/93号
、第265/94号及び第264/94号(ノボノルディスクA/S社)のいずれかに開示された
ものであることができ、ウシ起源のプロテインジスクフィドレダクターゼ、アス
ペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（As
pergililus niger）由来のプロテインジスルフィドレダクターゼ、並びに大腸菌
（Escherichia coli）由来のDsbA又はDabCがある。

【００８１】容易に入手できる市販の具体的な例は、Gluzymne（商標）(ノボノルディスク
社から入手される酵素)がある。しかし他社のその他の酸化還元酵素も利用でき
る。更に酸化還元酵素の変種も親酵素とされることが理解される。酸化還元酵素の活性は、「Methods of Enzymatic Analysis」、第3版、1984年
、Verlag Chemie、Weinheim、第3巻に説明されているように測定することができ
る。

【００８２】考慮されたラッカーゼは、ノボノルディスク社の国際公開公報第96/00290号及
び国際公開公報第95/3336号に開示されたラッカーゼを含む。他の酸化還元酵素は、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、ハロペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、及びリポキシゲナ
ーゼを含む。親カルボヒドラーゼ親カルボヒドラーゼは、特に5員環および6員環構造の炭水化物鎖（デンプンな
ど）を分解することができるすべての酵素、すなわち国際生化学分子生物学連合
（IUBMB）勧告（1992年）に基づく国際酵素分類番号E.C. 3.2（グリコシダーゼ
）に該当する酵素と定義されよう。本発明に基づくカルボヒドラーゼには、炭水
化物、たとえば6員環構造のD-グルコースを、たとえば5員環構造のD-フルクトー
スへと異性化することができる酵素も含まれる。例は次の酵素分類（E.C.）番号に該当するものから選択されるカルボヒドラー
ゼなどである：

【００８３】 α-アミラーゼ（3.2.1.1）、β-アミラーゼ（3.2.1.2）、グルカン1,4-α-グ
ルコシダーゼ（3.2.1.3）、セルラーゼ（3.2.1.4）、エンド-1,3(4)-β-グルカ
ナーゼ（3.2.1.6）、エンド-1,4-β-キシラナーゼ（3.2.1.8）、デキストラナー
ゼ（3.2.1.11）、キチナーゼ（3.2. 1.14）、ポリガラクツロナーゼ（3.2.1.15
）、リゾチーム（3.2. 1.17）、β-グルコシダーゼ（3.2.1.21）、α-ガラクト
シダーゼ（3.2.1.22）、β-ガラクトシダーゼ（3.2.1.23）、アミロ-1,6-グルコ
シダーゼ（3.2.1.33）、

【００８４】キシラン1,4-β-キシロシダーゼ（3.2.1.37）、グルカンエンド-1,3-β-D-グ
ルコシダーゼ（3.2.1.39）、α-デキストリンエンド-1,6-グルコシダーゼ（3.2.
1.41）、スクロースα-グルコシダーゼ（3.2.1.48）、グルカンエンド-1,3-α-
グルコシダーゼ（3.2.1.59）、グルカン1,4-β-グルコシダーゼ（3.2.1.74）、
グルカンエンド-1,6-β-グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド-1,5-
α-アラビノシダーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ（3.2.1. 108）、キトナーゼ（3
.2.1.132）およびキシロースイソメラーゼ（5.3.1.5）。

【００８５】関連カルボヒドラーゼの例は、トリコデルマ・ハルジアヌス（Trichoderma ha
rzianum）起源のα-1,3-グルカナーゼ；ペシロミセス（Paecilomyces）属菌株起
源のα-1,6-グルカナーゼ；バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）起源の
β-グルカナーゼ；フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）起源のβ-
グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のβ-グルカ
ナーゼ；トリコデルマ（Trichoderm）属菌株起源のβ-グルカナーゼ；オールス
コビア・キサンチネオリチカ（Oerskovia xanthineolytica）菌株起源のβ-グル
カナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のエキソ-1,4-α
-D-グルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）；バチルス・ズブチリス（Bacillus su
btilis）起源のα-アミラーゼ；

【００８６】バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）起源の
α-アミラーゼ；バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermoph
ilus）起源のα-アミラーゼ；アスペルギルス・オリガー（Aspergillus oryzae
）起源のα-アミラーゼ；非病原性微生物起源のα-アミラーゼ；アスペルギルス
・ニガー（Aspergillus niger）起源のα-ガラクトシダーゼ；フミコーラ・イン
ソレンス（Humicola insolens）起源のペントサナーゼ、キシラナーゼ、セロビ
アーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ；トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderm r
eesei）起源のセルラーゼ；非病原性カビ起源のセルラーゼ；

【００８７】アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）起源のペクチナーゼ、セルラ
ーゼ、アラビナーゼ、ヘミセルラーゼ；ペニシリウム・リカシヌム（Penicilliu
m lilacinum）起源のデキストラナーゼ；非病原性カビ起源のエンドグルカナー
ゼ；バチルス・アシドプリチクス（Bacillus acidopullyticus）起源のプルラナ
ーゼ；クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）起源のβ-ガ
ラクトシダーゼ；トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderm reesei）起源のキシラ
ナーゼなどである。

【００８８】容易に入手できる市販カルボヒドラーゼの具体例はAlpha-Gal（商標）、Bio-F
eed（商標）Alpha、Bio-Feed（商標）Beta、Bio-Feed（商標）Plus、Novozyme（
商標）188、Carezyme（商標）、Celluclast（商標）、Cellusoft（商標）、Cere
myl（商標）、Citrozym（商標）、Denimax（商標）、Dezyme（商標）、Dextrozy
me（商標）、Finizym（商標）、Fungamyl（商標）、Gamanase（商標）、Glucane
x（商標）、Lactozym（商標）、Maltogenase（商標）、Pentopan（商標）、Pect
inex（商標）、Promozyme（商標）、Pulpzyme（商標）、Novamyl（商標）、Term
amyl（商標）、AMG(Amyloglucosidase Novo)、Sweetzyme（商標）、Aquazym（商
標）、Natalase（商標）などである（いずれの酵素もNovo Nordisk A/Sから出て
いる）。他に他企業から出ている酵素もある。

【００８９】カルボヒドラーゼの変異体もまた当然、親酵素として見込まれものとする。カルボヒドラーゼの活性は「酵素分析法」（第3版、1984年、Verlag Chemie社
、Weinheim、Vol. 4）の説明に従って測定することができる。

【００９０】親トランスフェラーゼ親トランスフェラーゼは、IUBMB勧告(1992年)に基づく国際酵素分類E.C. 2に
該当する酵素群に含まれる。親トランスフェラーゼは次の下位群に含まれる任意のトランスフェラーゼとし
てよい：一炭素基を移すトランスフェラーゼ（E.C. 2.1）；アルデヒドまたは残
基を移すトランスフェラーゼ（E.C. 2.2）；アシルトランスフェラーゼ（E.C. 2
.3）；グルコシルトランスフェラーゼ（E.C. 2.4）；メチル基以外のアルキル基
またはアリール基を移すトランスフェラーゼ（E.C. 2.5）；含窒素基を移すトラ
ンスフェラーゼ（E.C.2.6）。

【００９１】好ましい実施態様では、親トランスフェラーゼはトランスグルタミナーゼE.C.
2.3.2.13（タンパク質−グルタミンm-グルタミルトランスフェラーゼ）である
。トランスグルタミナーゼは、ペプチド結合グルタミン残基のγ-カルボキシア
ミド基がアシル供与体として機能するアシル転移反応を触媒することができる酵
素である。各種化合物の第一アミノ基はアシル受容体として機能し、ペプチド結
合したグルタミン酸の一置換型γ-アミドを形成しよう。ペプチド鎖中のリジン
残基のε-アミノ基がアシル受容体として機能するときは、このトランスフェラ
ーゼは分子内／分子間γ-グルタミル-ε-リシル架橋を形成する。

【００９２】トランスグルタミナーゼの例は係属中のデンマーク特許出願第990/94（Novo N
ordisk A/S）で説明されている。親トランスグルタミナーゼはヒト起源、動物（特にウシ亜科の動物）起源また
は微生物起源のものでよい。

【００９３】この種の親トランスグルタミナーゼの例は動物起源のトランスグルタミナーゼ
FXIIIa；フィザルム・ポリセファルム（Physarum polycephalum）起源の微生物
トランスグルタミナーゼ（Klein et al., Journal of Bacteriology, Vol. 174,
p.2599-2605）；ストレプトマイセス・ラベンドラ（Streptomyces lavendulae
）、ストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）（旧名称ストレ
プトマイセス・リバニ（Streptomyces libani））を含むストレプトマイセス（S
treptomyces）属の種やストレプトベルティシリウム・モバランス（Streptovert
icillium mobaraense）、ストレプトベルティシリウム・シンナモニウム（Strep
toverticillium cinnamoneum）、ストレプトベルティシリウム・グリセオカルニ
ウム（Streptoverticillium griseocarneum）を含むストレプトベルティシリウ
ム（Streptoverticillium）属の種に由来するトランスグルタミナーゼ

【００９４】（Motoki et al., US 5,156,956；Andou et al., US 5,252,469；Kaempfer et
al., Journal of General Microbiology, Vol. 137, p.1831-1892；Ochi et al
., International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 44, p.285-292
；Williams et al., Journal of General Microbiology, Vol. 129, p.1743-181
3）などである。

【００９５】トランスフェラーゼの変異体もまた当然、親酵素として見込まれよう。トランスグルタミナーゼの活性は「酵素分析法」（第3版、1984年、Verlag Ch
emie社、Weinheim、Vol. 1-10）の説明に従って測定することができる。適当なトランスフェラーゼはWO 96/06931（Novo Nordisk A/S）およびWO 96/2
2366（Novo Nordisk A/S）で説明されている任意のトランスグルタミナーゼなど
である。

【００９６】親フィターゼ親フィターゼはIUBMB勧告（1992年）に基づく酵素分類番号E.C. 3.1.3に該当
する酵素群に含まれる。フィターゼはフィチン酸塩のイノシトールと無機リンへの分解を触媒する微生
物産生酵素である。

【００９７】フィターゼ産生微生物はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチ
ルス・ナット（Bacillus natto）およびシュードモナス（Pseudomonas）などの
ような細菌；サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）など
のような酵母菌；およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アス
ペルギルス・フエクム（Aspergillus ficuum）、アスペルギルス・アワモリ（As
pergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、ア
スペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）またはアスペルギルス・ニド
ランス（Aspergillus nidulans）、それにアスペルギルス（Aspergillus）属の
その他様々な種を含む菌類などである。

【００９８】親フィターゼの例は、次の酵素分類（E.C.）番号に該当ものから選択されるフ
ィターゼである：3-フィターゼ（3.1.3.8）および6-フィターゼ（3.1.3.26）。フィターゼの活性は「酵素分析法」（第3版、1984年、Verlag Chemie社、Wein
heim、Vol. 1-10）の説明に従って、またはEP-A1-0 420 358の実施例2Aで説明さ
れている方法によって、測定することができる。

【００９９】イソメラーゼ親イソメラーゼはIUBMB勧告（1992年）に基づく酵素分類番号E.C. 5に該当す
る酵素群に含まれる。親イソメラーゼの例はプロテインジスルフィドイソメラーゼである。適当なプ
ロテインジスルフィドイソメラーゼはWO 95/ 01425（Novo Nordisk A/S）で説明
されているPDIsなどであるが、それだけに限らない。

【０１００】工業用組成物本発明はさらなる態様において、洗浄性能を向上させ修飾ポリペプチドから成
る「工業用組成物」に関連する。本発明でいう「工業用組成物」とは、循環系への導入が意図されていない組成
物を意味する。言い換えれば、皮内、静脈内または皮下投与が意図されていない
組成物を意味する。前述のように、工業用途向けの酵素などのようなポリペプチドの主要な問題は
、呼吸器系を通じての吸入、すなわち気管内または鼻腔内接触に起因する呼吸器
系アレルギーの危険を伴う点にある。

【０１０１】「工業用組成物」の例としてはポリペプチド、特に酵素および抗菌ポリペプチ
ドのうち、洗浄用や食器洗い用を含めた洗剤、家財用品、農薬、化粧品や洗面用
品などのようなパーソナルケア製品、口腔用・皮膚用医薬品などのような組成物
または製品、繊維製品の処理／加工に使用される組成物、硬質面清浄用組成物な
どに使用されものがある。本発明で特に見込まれる用途はスキンケア製品と洗剤
である。

【０１０２】スキンケア製品本発明でいう「スキンケア製品」は、肌の洗浄、手入れおよび／または美容に
使用される諸々のパーソナルケア製品、さらには使用時に皮膚または呼吸器系と
接触する可能性のある他の製品、たとえばヘアケア製品などを包摂する。また、
対応する動物用製品も本発明では見込まれる。本発明で見込まれるスキンケア製品の具体例は石けん、化粧品、クレンジング
クリーム、クレンジングローション、クレンジングミルク、クリーム石けん、ホ
ワイトニングパウダー、粉石けん、固形石けん、透明石けん、マニキュア除光液
、シャンプー、バルサム、ヘアリンスなどである。

【０１０３】スキンケアに適した酵素活性本発明のスキンケア組成物は、本発明の高洗浄／清浄作用、低アレルゲン性の
接合体、およびスキンケア組成物に使用されることが知られているその他の成分
から成る。スキンケア製品では次のような多数の酵素活性が利用されることが知られてい
る。

【０１０４】プロテアーゼプロテアーゼはスキンクレンジング製品の有効成分である。プロテアーゼは死
んだ角質皮膚細胞の上層を除去するため、肌が輝き、みずみずしく見える。また
、プロテアーゼには肌のなめらかさを増す働きもある。プロテアーゼは洗面用品や浴用製品、たとえばシャンプー、コンディショナー
、ローション、クリーム、棒状石けん、化粧石けん、液体石けんなどに使用され
る。

【０１０５】リパーゼリパーゼは皮膚の過剰脂質を除去する洗顔製品や抗にきび製品の活性成分とし
て化粧品に、またスキンケア用活性成分としてクリームやローションなどのよう
な浴用製品に、使用することができる。リパーゼはまた洗髪製品（シャンプーなど）に使用すれば、髪の表面から皮脂
や他の脂肪質を効果的に除去することができる。

【０１０６】オキシドレダクターゼパーソナルケア製品用の最も一般的なオキシドレダクターゼは、H₂O₂を確実に
生成させるような基質（グルコースなど）をもつオキシダーゼ（通常はグルコー
スオキシダーゼ）であり、生成する過酸化水素は、たとえばSCN^-またはI^-の抗菌
試薬（SCNO^-またはI₂）へのペルオキシダーゼ（通常はラクトペルオキシダーゼ
）による酸化を起こさせる。この酵素複合体は自然界ではたとえばミルクや唾液
に見られる。

【０１０７】オキシドレダクターゼは商業的には抗菌系としてオーラルケア製品（口内洗浄
剤、歯磨き剤、チューインガム）に使用されており、その場合にはアミログルコ
シダーゼと組み合わせればグルコースを生成させることができる。これらの抗菌
系は保存料として化粧品にも使用されている。オキシドレダクターゼのもう1つの用途は、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
およびラッカーゼを使用する酸化毛髪染剤である。たとえばWO 96/00290またはW
O 95/33836（Novo Nordisk）を参照。皮膚（および髪）の表面で形成されるフリーラジカルは肌の老化（髪の傷み）
に関連することが知られている。

【０１０８】この種のフリーラジカルは、脂肪膜、コラーゲンおよび細胞の破壊へとつなが
る連鎖反応を引き起こす。スーパーオキシドジスムターゼなどのようなフリーラジカル捕捉剤の化粧品へ
の応用は周知のとおりである（R.L. Goldemberg, DCI, Nov.93, p48-52）。プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）もまたオキシドレダクターゼで
あり、髪のウェービング（毛髪のジスルフィド結合の還元と再酸化）や傷んだ髪
の修復（髪の傷みが主に、既存ジスルフィド結合の還元である場合）に利用する
ことができる。

【０１０９】トランスグルタミナーゼヒトの皮膚、髪または爪に適用されるスキンケア組成物であって(a)アミノ官
能基活性成分、(b)活性成分の皮膚、髪または爪への架橋を触媒するトランスグ
ルタミナーゼ、および(c)キャリヤーから成るものは、米国特許第5,490,980で説
明されている。

【０１１０】哺乳類の皮膚、毛髪および爪への適用に適した化粧用組成物であって、(a)そ
の皮膚、毛髪または爪に保護層を与えに足る量の、少なくとも1種類の角質細胞
外膜タンパク質、(b)角質細胞外膜タンパク質と外部に露出した角質細胞タンパ
ク質の間で共有結合を形成するに足る量のトランスグルタミナーゼ、(c)トラン
スグルタミナーゼを活性化するに足る量のカルシウムイオン、および(d)化粧品
用として許容しうる賦形剤から成る組成物において、その組成物が二相から成り
、そのうちの一相には角質細胞外膜タンパク質が、もう一相にはトランスグルタ
ミナーゼがそれぞれ含まれるようにしたものについては、米国特許第5,525,336
を参照。

【０１１１】 JP 3083908は水溶性物質で修飾されたトランスグルタミナーゼを含む化粧品原
料について説明している。この修飾物質は、たとえばポリエチレングリコール、
エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルアルコー
ル、グルコース、スクロース、アルギン酸、カルボキシルセルロース、デンプン
およびヒドロキシプロピルセルロースのうちの1個または複数個である。修飾は
たとえば反応性基の導入と酵素への結合によって行われ、これによって肌にやさ
しい、経時変退色の少ない、また荒れた肌を癒やし保湿し、肌の状態を美しく整
える効果のある原料が得られれる。

【０１１２】本発明のスキンケア製品第3の態様において、本発明は本発明のスキンケア組成物から成るスキンケア
製品に関連する。「スキンケア製品」についてはすでに定義したとおりである。本発明のスキンケア製品は本発明の修飾酵素を有効量含むことになろう。当業
者には周知のかかる有効量はしばしばスキンケア製品の0%超〜5%の範囲内であろ
う。

【０１１３】本発明で見込まれるスキンケア製品は石けん、化粧品、クレンジングクリーム
、クレンジングローション、クレンジングミルク、クリーム石けん、粉石けん、
固形石けん、透明石けん、マニキュア除光液、シャンプー、バルサム、ヘアリン
スなどを含むが、それだけに限らない。

【０１１４】スキンケア製品の一般的な成分配合「スキンケア製品に使用される成分」という用語は、スキンケア製品配合物に
使用されることが知られているすべての成分を包摂する。そうした成分の例はア
ンバック（Wilfried Umbach）編「化粧品と洗面用品(Cosmetics and Toiletries
)」（Ellis Horwood社刊、ロンドン、1991年）およびファルベ（J. Falbe）編「
消費者製品用界面活性剤」（Spring-Verlag社刊、1987年）に求めることができ
る。以下は標準的な成分配合の一例である。これらの例は本発明で見込まれる主要
なスキンケア製品の成分配合の概要を示す。

【０１１５】

【表２】

【０１１６】

【表３】

【０１１７】

【表４】

【０１１８】

【表５】

【０１１９】

【表６】

【０１２０】

【表７】

【０１２１】洗剤本発明の洗剤組成物は、たとえば、洗浄添加剤組成物、汚れた布地の前処理用
組成物およびリンス添加柔軟剤組成物を含む手洗い用および洗浄機用洗剤組成物
、それにバイオフィルム除去や食器洗いなどを含む一般家財硬質面清浄用組成物
として配合することができる。バイオフィルム除去では、アルギン酸リアーゼが好ましい酵素として挙げられ
よう（言及により本書に組み込まれるJP 10127281 A K.K. GUNZEおよびTANABE S
EIYAKU COを参照）。

【０１２２】本発明の洗剤組成物は本発明の接合体と界面活性剤から成る。さらに、ビルダ
ー、もう1種類の酵素、泡止め剤、柔軟剤、色移り防止剤、および洗剤に通常使
用されるその他の成分、たとえば泥粒子懸濁剤、泥粒子剥離剤、蛍光増白剤、研
磨材、殺菌剤、変色防止剤、色素剤、および／またはカプセル化／非カプセル化
香料などを随意に添加してもよい。

【０１２３】本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、棒または粒状などの形態をとる
ことができる。pH（使用濃度の水溶液で測定）は通常、中性またはアルカリ性、
すなわち7〜11の範囲となろう。本発明による粒状組成物は「圧縮形態」に、す
なわち通常の粒状洗剤よりも高密度（550〜950 g/l）に、してもよい。

【０１２４】洗剤組成物に配合される本発明の酵素接合体または随意にもう1つの酵素の、
酵素タンパク質／洗剤組成物配合比率は通常、重量ベースで0.00001〜2%、好ま
しくは0.0001〜1%、より好ましくは0.001〜0.5%、さらに好ましくは0.01〜0.2%
である。しかし、酵素使用量は酵素のアレルゲン性と洗浄性能次第であり、低ア
レルゲン性との関係では使用量を増やすことが、また高洗剤性能との関係では使
用量を減らすことができる。

【０１２５】界面活性剤系界面活性剤系は非イオン、陰イオン、陽イオン、両性および／または双イオン
界面活性剤から成ろう。界面活性剤系は好ましくは陰イオン界面活性剤、または
陰イオンおよび非イオン界面活性剤の混合、たとえば陰イオン界面活性剤50〜10
0%と非イオン界面活性剤0〜50%の混合から成る。洗浄洗剤組成物は以上述べた以
外の非イオンおよび／または陰イオン界面活性剤の他に陽イオン、両性イオン、
双イオンおよび半極性界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤の配合比率は一般に0.1〜0.6 wt%である。以下、界面活性剤の例を
いくつか説明する。

【０１２６】非イオン界面活性剤：この界面活性剤はアルキルフェノールのポリアルキレンオキシド（たとえばポ
リエチレンオキシド）縮合体から成ろう。アルキル基は直鎖または分岐鎖に約6
〜14個の炭素原子を含んでもよい。エチレンオキシドはアルキルフェノール1モ
ル当たり約2〜25モルに等しい量が存在することになろう。この界面活性剤は第一級および第二級脂肪族アルコールの約1〜25モルのエチ
レンオキシドとの縮合産物から成ってもよい。脂肪族アルコールのアルキル鎖は
直鎖でも分岐鎖でもよく、また一般に約8〜22個の炭素原子を含む。

【０１２７】さらに、非イオン界面活性剤はアルキルフェノールのポリエチレンオキシド縮
合体、第一級および第二級脂肪族アルコールの約1〜25モルのエチレンオキシド
との縮合産物、アルキル多糖類、およびそれらの混合物から成ってもよい。最も
好ましいのは、3〜15個のエポキシ基をもつC8-C14アルキルフェノールエトキシ
レート、2〜10個のエトキシ基をもつC8-C18（好ましくは平均C10）アルコールエ
トキシレート、およびそれらの混合物である。

【０１２８】陰イオン界面活性剤：適当な陰イオン界面活性剤は、式RO(A)mSO₃Mで示される水溶性の塩または酸で
あるアルコキシル化硫酸アルキルなどである。式中、Rは非置換型C10-C24アルキ
ル基またはC10-C24アルキル成分をもつヒドロキシアルキル基、好ましくはC12-C
20アルキルまたはヒドロキシアルキル、さらに好ましくはC12-C18アルキルまた
はヒドロキシアルキルであり、Aはエトキシまたはプロポキシ単位であり、mはゼ
ロよりも大きく、一般に約0.5〜6、好ましくは約0.5〜3であり、MはHまたは陽イ
オンであり、この陽イオンはたとえば金属陽イオン（ナトリウム、カリウム、リ
チウム、カルシウム、マグネシウムなど）、アンモニウムまたは置換型アンモニ
ウム陽イオンとすることができる。

【０１２９】ここでは、エトキシル化硫酸アルキルおよびプロポキシル化硫酸アルキルが見
込まれている。置換型アンモニウム陽イオンの具体例はメチル-、ジメチル-、ト
リメチル-アンモニウム陽イオンおよび第四級アンモニウム陽イオンたとえばテ
トラメチルアンモニウム、およびジメチルピペルジニウム陽イオンおよびアルキ
ルアミン誘導体のエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、およびそ
れらの混合物などである。

【０１３０】他の適当な陰イオン界面活性剤は、式ROSO₃Mで示される水溶性の塩または酸で
ある硫酸アルキル界面活性剤などである。式中、Rは好ましくはC10-C24ヒドロカ
ルビル、好ましくはC10-C20アルキル成分をもつアルキルまたはヒドロキシアル
キル、さらに好ましくはC10-C18アルキルまたはヒドロキシアルキルであり、Mは
Hまたは陽イオン、たとえばアルカリ金属陽イオン（ナトリウム、カリウム、リ
チウムなど）またはアンモニウムまたは置換型アンモニウム陽イオンである。

【０１３１】他の陰イオン界面活性剤は石けんの塩（ナトリウム、カリウム、アンモニウム
および置換型アンモニウムの塩、たとえばモノ-、ジ-およびトリ-エタノールア
ミン塩など）、C18-C22の第一級または第二級アルカンスルホン酸塩、C8-C24オ
レフィンスルホン酸塩、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解生成物のスルホン
化によって得られるスルホン化ポリカルボン酸などである。アルキルベンゼンス
ルホン酸塩、特にアルキル基が10〜18個の炭素原子を含む線状（直鎖）アルキル
ベンゼンスルホン酸塩（LAS）が適する。洗浄洗剤組成物は一般にこの種の陰イオン界面活性剤を約1〜40 wt%、好まし
くは約3〜20 wt%含む。

【０１３２】ビルダー系：本発明の組成物はさらにビルダー系を含んでもよい。ここでの使用には任意の
在来ビルダー系、たとえばアルミノケイ酸塩、ケイ酸塩、ポリカルボン酸塩およ
び脂肪酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのような物質、アミノポリホス
ホネートなどのような金属イオン封鎖剤が適する。リン酸塩ビルダーも使用でき
る。

【０１３３】適当なビルダーは無機イオン交換物質、一般に無機水和アルミノケイ酸塩、特
に水和合成ゼオライト、たとえば水和ゼオライトA、X、B、HSまたはMAPなどでも
よい。洗剤用ビルダー塩の組成物中の含有量は一般に5〜80 wt%である。液体洗剤の
場合、好ましいビルダー含有量は5〜30%である。

【０１３４】その他の洗剤用酵素活性：洗剤組成物は、特異活性をもつ本発明の接合体に加えて、さらに他の酵素活性
、たとえばやはり本発明に基づく酵素接合体の形をとる他の酵素活性としてプロ
テアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ
、ハロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例：リガーゼ）などを含めて洗浄およ
び／または布地保存効果を高めるようにしてもよい。見込まれる酵素の具体例は「酵素活性」の項で列挙している。

【０１３５】漂白剤：洗剤組成物（特に粒状洗剤の場合）は漂白剤、たとえば酸素漂白剤やハロゲン
漂白剤を含んでもよい。酸素漂白剤は過ホウ酸塩（PB1またはPB4など）または過
炭酸塩などのような過酸化水素剥離剤でもよいし、過カルボン酸などでもよい。
粒径は400〜800ミクロンであろう。酸素漂泊化合物を加える場合、その含有率は
一般に約1〜24%となろう。

【０１３６】過酸化水素剥離剤は漂泊活性剤、たとえばテトラアセチルエチレンジアミン（
TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（NOBS）、3,5-トリメチル-ヘ
キサノルオキシベンゼンスルホン酸塩（ISONOBS）またはペンタアセチルグルコ
ース（PAG）などと組み合わせて使用してもよい。ハロゲン漂白剤はたとえば次亜ハロゲン酸塩漂白剤でもよい。例としてはトリ
クロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウムおよびカリウム、N-
クロロおよびN-ブロモアルカンスルホンアミドなどがある。これらの物質の添加
量は通常、最終製品の0.5〜10 wt%、好ましくは1〜5 wt%である。

【０１３７】繊維関係の用途：プロテアーゼプロテアーゼは絹の精練とサンドウォッシュに使用される。リパーゼリパーゼは繊維製品の仕上げ時に疎水性エステル（トリグリセリドなど）を含
む脂肪質の除去に使用される。WO 93/13256（Novo Nordisk A/S）などを参照。

【０１３８】オキシドレダクターゼ繊維製品の漂泊洗浄では過剰な過酸化水素の除去にカタラーゼを使用してもよ
い。カルボヒドラーゼセルロース分解酵素は、デニム製品の仕上げに際し局部的な色の濃淡を布地に
もたせるときに広く使用されている（酵素は「ストーンウォッシュ」を容易にす
る）。

【０１３９】また、セルロース分解酵素は生物つや出し法にも使用される。これは糸表面の
特殊なつや出し処理法であり、生地の湿潤性を損なうことなく風合いや見かけを
よくする。生物つや出し効果は、たとえばWO 93/20278の方法を適用することに
よって得られる。

【０１４０】繊維製品の製織時には糸に大きな機械的力が掛かる。破断を防ぐために糸をゼ
ラチン状の物質（糊）で被覆（糊付け）し強化するのが普通である。最も一般的
な糊は天然または改質デンプンである。したがって、この糊を生地から除去（糊
抜き）して初めて均一で丈夫な仕上げが得られる。デンプンまたは改質デンプン
で糊付けした生地の糊抜きにはデンプン分解酵素を使用するとよい。

【０１４１】材料および方法材料酵素： PD498：WO 93 24623に記載のサブチリシン型プロテアーゼ。PD498の配列はSEQ
ID NO. 1および2に記載されている。サブチリシンDY：バチルス（Bacillus）属の変種に由来する配列番号：３記載
のサブチリシン型プロテアーゼ（Betzel et al. (1993), Archives of Biophys
ics, Vol. 302, No. 2, p.499-502）。 Savinase（商標）：サビナーゼの変種R247K（BPNナンバリング法で247位置の
アルギニンをリシンに置き換えたもの）。

【０１４２】ELISA試薬：ワサビ・ペルオキシダーゼで標識したブタ抗ウサギIg（Dako, DK, P217；希釈
比1:1000）。ラット抗マウスIgE（Serotec MCA419；希釈比1:100）。マウス抗ラットIgE（S
erotec MCA193；希釈比1:200）。ビオチンで標識したマウス抗ラットIgG1モノクローナル抗体（Zymed 03-9140
；希釈比1:1000）。ビオチンで標識したラット抗マウスIgG1モノクローナル抗体（Serotec MCA336
B；希釈比1:2000）。ストレプタビジンで標識したワサビ・ペルオキシダーゼ（Kirkegard & Perry
14-30-00；希釈比1:1000）。緩衝液と溶液：

【０１４３】

【表８】次の社内配合率のプロテアーゼ・モデル洗剤‘95：

【０１４４】

【表９】

【０１４５】着色基質： OPD：o-フェニレン-ジアミン（Kementec cat.no. 4260）試験動物：ブラウンノルウェー(BN)ラット（チャドブネズミ）（ドイツ／シャール川産）

【０１４６】機器： XCELII（Novex） ELISAリーダー（UVmax, Molecular Devices） HPLC（Waters） PFLC（Pharmacia） Superdex-75カラム、Mono-Q、Mono-S（Pharmacia, SW） SLT：Fotometer（SLT LabInstruments）サイズ排除クロマトグラフ（Spherogel TSK-G2000, SW）サイズ排除クロマトグラフ（Sperdex 200, Pharmacia, SW） Amicon Cell Filtron Ultrasette＋Omega 10K膜ミニ洗浄ロボット J&M Tidas MMS/16光度計＋CLX 75Wキセノンランプおよび光ファイバー

【０１４７】方法 BNラットの気管内（IT）刺激分子のIT投与には長さ2 1/2”の金属探針が付いた使い捨て注射器を使用する
。この探針をラットの咽頭蓋の下約1 cmから気管に挿入し0.1 mlの分子溶液を点
滴注入する。試験動物は10匹1群構成のブラウンノルウェー（BN）ラット（チャドブネズミ
）である。体重は開始時が200 g強、終了時が約450 gである。

【０１４８】Brown Normay (BN）ラットのIgE抗体相対濃度を求めるためのELISA検定法 3層サンドイッチ構造のELISAを使用して、特異血清IgE抗体の相対濃度を求め
る。（１）ELISAプレートに10 mgマウス抗ラットIgE緩衝液1を塗る（50 μl/ウェ
ル）。一晩、4℃で定温放置する。（２）プレートを空にして、しゃ断緩衝液で少なくとも30分間、室温でしゃ断
する（200 μl/ウェル）。ゆっくりと振盪する。プレートを洗浄緩衝液で3回洗
浄する。

【０１４９】（３）ラットの血清（50 μl/ウェル）を塗って定温放置―無希釈で開始し2倍
希釈で続行―する。一部のウェルは緩衝液4のためだけに空けて（ブランクにし
て）おく。室温で30分間、定温放置する。ゆっくりと振盪する。プレートを洗浄
緩衝液で3回洗浄する。（４）酵素を緩衝液で適当なタンパク質濃度に希釈する。50 μl/ウェルを30
分間、室温で定温放置する。ゆっくりと振盪する。プレートを洗浄緩衝液で3回
洗浄する。

【０１５０】（５）結合抗体の検出を目的に特定のポリクローナル抗酵素抗血清血清（pIg
）を希釈緩衝液で希釈する。50 μl/ウェルを30分間、室温で定温放置する。ゆ
っくりと振盪する。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄する。（６）西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ共役抗pIg抗体を希釈緩衝液で希釈する
。50 μl/ウェルを30分間、室温で定温放置する。ゆっくりと振盪する。プレー
トを洗浄緩衝液で3回洗浄する。

【０１５１】（７）0.6 mg ODP/ml＋0.4 μl H₂O₂/mlを基質緩衝液に混合する。溶液は使用
直前につくる。50 μl/ウェルを10分間、定温放置する。（８）反応を停止させるために、50 μl停止溶液/ウェルを加える。（９）620 nmを基準にして490 nmでプレートを読み取る。データを計算し、Lo
tusで表示する。

【０１５２】分子量の決定タンパク質の電気泳動分離は標準法により、4-20%勾配SDSポリアクリルアミド
ゲル（Novex）を使用して行った。タンパク質は銀色のシミによって検出した。
分子量はNovex社製のMark-12（商標）広範囲分子量標準液の流動性を基準にして
相対的に測定した。

【０１５３】プロテアーゼ活性 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNaによる分析：プロテアーゼはペプチドとp-ニトロアニリンの結合を断ち、吸収波長405 nmの
可視黄色を発する。緩衝液：Britton and Robinson緩衝液pH 8.3など。基質：100 mg suc-AAPF-pNaを1 mlジメチルスルホオキシド（DMSO）に溶解す
る。このうちの100 mlをBritton and Robinson緩衝液で10 mlに希釈する。

【０１５４】分析基質とプロテアーゼ溶液を混合し、405 nmでの吸収能を時間とABS₄₀₅ _nm/分の
関数としてモニターする。温度は制御するのがよい（プロテアーゼ次第で20-50
℃）。これは試料のプロテアーゼ活性の尺度である。

【０１５５】実施例実施例1 ．ポリ(エチレングリコール) -ブロック- ポリ(プロピレングリコール)-ブロック-
ポリ(エチレングリコール) 1.900（50 wt%エチレングリコール）の炭酸N-スクシ
ニミジルによる活性化 ALDRICH社製のポリ(エチレングリコール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコー
ル)-ブロック-ポリ(エチレングリコール)1.900（50 wt%エチレングリコール）を
トルエン（5 ml/g-ポリマー）に溶解した。約20%を常圧で蒸留し、反応物質を共
沸乾燥させた。溶液を20℃に冷却し、ホスゲン溶解トルエン（1.93 M、7 mole/m
ole-ポリマー）を添加した。次いで、混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒と過剰
ホスゲンを減圧除去し中間生成物のビス（クロロホルメート）を油として得た。

【０１５６】トルエン（ドライ4 ml/g-ポリマー）を添加してこの油を再溶解した。N-ヒド
ロキシスクシニミド（NHS）（2.4 mole/mole-ポリマー）を添加し、混合物をア
イスバスで冷却した。トリエチルアミン（2.2 mole/mole-ポリマー）を0℃で滴
下した。塩酸トリエチルアミン（Et₃N.HCl）の沈殿がすぐに観察された。混合物
を室温で一晩撹拌した。混合物をガラスろ過器（G5）でろ過してEt₃N.HClを除去
した。ろ液を減圧下で蒸発乾燥させ97%（mole/ mole）の油を回収した。

【０１５７】 NMR表示：＞90%活性化および＜8 o/o(mole/mole)の非結合NHS。ポリ(エチレン
グリコール)-ブロック-ポリ(プロピレングリコール)-ポリ(エチレングリコール)
1.900ビス（炭酸スクシニミジル）（50 wt%エチレングリコール）の¹H-NMR（40
0 MHz、CDCl₃）δ：1.15 bs（I＝330、PPG中の-CH₃）、2.69 s（I＝1.7、未反応
NHS）、2.83 s（I＝41、スクシニミド）、3.41 m（I＝110、PPG中のCH-CH₂）、3
.55 m（I＝220、PPG中のCH-CH₂）、3.61ｍ（I＝440、主ピーク）4.46 t（I＝19
、PEG中のCH₂-O-CO-）。

【０１５８】実施例2 ．ポリ(エチレングリコール)-コ-(プロピレングリコール)-モノブチルエーテル970
(約50 wt%エチレングリコール)の炭酸N-スクシニミジルによる活性化 ALDRICH社製のポリ(エチレングリコール)-コ-(プロピレングリコール)-モノブ
チルエーテル970(約50 wt%エチレングリコール)をトルエン（4 ml/g-ポリマー）
に溶解した。約25%を常圧で蒸留し反応物質を共沸乾燥させた。溶液を0℃に冷却
し、ホスゲン溶解トルエン（1.93 M、5 mole/mole-ポリマー）を添加した。次い
で、混合液を室温で21時間撹拌した。溶媒と過剰ホスゲンを減圧除去し中間生成
物のクロロホルメートを油として得た。

【０１５９】トルエン（ドライ2 ml/g-ポリマー）を添加してこの油を再溶解した。N-ヒド
ロキシスクシニミド（NHS）（1.2 mole/mole-ポリマー）を室温で添加した。ト
リエチルアミン（1.1 mole/mole-ポリマー）を0℃で滴下した。塩酸トリエチル
アミン（Et₃N.HCl）の沈殿がすぐに観察された。混合物を室温で一晩撹拌した。
混合物をガラスろ過器（G5）でろ過して不溶性のEt₃N.HClを除去した。ろ液を減
圧下で蒸発乾燥させ89%（mole/ mole）の油を回収した。

【０１６０】 NMR表示：＞72%活性化および＜5 o/o(mole/mole)の非結合NHS。¹H-NMR（400 M
Hz、CDCl₃）δ：0.91 t（I＝1000、-CH₃ブチル）、1.15 bs（I＝8744、プロピレ
ングリコール中の-CH₃）、1.39 m（I＝1320、CH₃-CH₂-CH₂-ブチル）、1.55 m（I
＝656、-CH₂-O-ブチル）、2.68 s（I＝60.8、未反応NHS）、2.83 s（I＝963.2、
スクシニミド）、3.40 m（I＝3059、プロピレングリコール中のCH-CH₂）、3.55
m（I＝2678、プロピレングリコール中のCH-CH₂）、3.61ｍ（I＝1764、主ピーク
、エチレングリコール中の-CH₂-CH₂-）、4.46 m（CH₂-O-CO-）。

【０１６１】実施例3 ．mPEG 350の炭酸N-スクシニミジルによる活性化 mPEG 350をトルエン（4 ml/g-mPEG）に溶解した。約20%を常圧で蒸留し、反応
物質を共沸乾燥させた。溶液を20℃に冷却し、ホスゲン溶解トルエン（1.93 M、
1.5 mole/mole-mPEG）を添加した。次いで、混合液を室温で一晩撹拌した。混合
液を減圧下で蒸発させ、中間生成物のクロロホルメートを油として得た。

【０１６２】蒸発処理後に、ジクロロメタンとトルエン（1:2、ドライ4 ml/g-mPEG）を添加
してこの無色油を再溶解した。0℃でN-ヒドロキシスクシニミド（NHS）（1.5 mo
le/mole-mPEG）を固体として添加し、次いでトリエチルアミン（1.1 mole/mole-
mPEG）を添加した。塩酸トリエチルアミン（Et₃N.HCl）の沈殿がすぐに観察され
た。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物をガラスろ過器（G5）でろ過してEt₃N
.HClを除去した。

【０１６３】ろ液を減圧下で蒸発乾燥させ98%（mole/ mole）の油を回収した。NMR表示：85
〜95%活性化および＜10 o/o(mole/mole)のHNEt₃Cl。mPEG 350炭酸スクシニミジ
ルの¹H-NMR（400 MHz、CDCl₃）δ：1.42 t（I＝1.4、HNEt₃Cl中のCH₃）、2.68 s
（I＝3.4、未反応NHS）、2.84 s（I＝6.2、スクシニミド）、3.10 dq（I＝1.0、
HNEt₃Cl中のCH₂）、3.38 s（I＝5.8、OMe中のCH₃）、3.64 bs（I＝50、主ピーク
）、4.47 t（I＝3.0、PEG中のCH₂）。

【０１６４】実施例4 ．PEG 300の炭酸N-スクシニミジルによる活性化 PEG 300をトルエン（13 ml/g-PEG）に溶解した。約25%を常圧で蒸留し、反応
物質を共沸乾燥させた。溶液を20℃に冷却し、ホスゲン溶解トルエン（1.93 M、
3.8 mole/mole-PEG）を添加した。次いで、混合液を室温で20時間撹拌した。混
合液を減圧下で蒸発させ、中間生成物のビス（クロロホルメート）を油として得
た。

【０１６５】蒸発処理後にドライトルエン（10 ml/g-PEG）を添加してこの無色油を再溶解
した。0℃でN-ヒドロキシスクシニミド（NHS）（3.0 mole/mole-PEG）を固体と
して添加し、次いでトリエチルアミン（2.4 mole/mole-PEG）を添加した。塩酸
トリエチルアミン（Et₃N.HCl）の沈殿がすぐに観察された。混合物を室温で一晩
撹拌した。混合物をガラスろ過器（G5）でろ過してEt₃N.HClを除去した。ろ液を
減圧下で蒸発乾燥させ90%（mole/ mole）の油を回収した。

【０１６６】 NMR表示：＞55%活性化および＜5 o/o(mole/mole)のHNEt₃Cl。¹H-NMR（400 MHz
、CDCl₃）δ：1.11 t（I＝1.8、NEt₃中のCH₃）、2.69 s（I＝1.39、未反応NHS）
、2.84 s（I＝20.0、スクシニミド）、3.64 bs（I＝113、主ピーク）、4.44 m（
I＝10.0、PEG中のCH₂）。

【０１６７】実施例5 ．mPEG 550の炭酸N-スクシニミジルによる活性化 mPEG 550をトルエン（9 ml/g-mPEG）に溶解した。約10%を常圧で蒸留し、反応
物質を共沸乾燥させた。溶液を20℃に冷却し、ホスゲン溶解トルエン（1.93 M、
1.5 mole/mole-mPEG）を添加した。次いで、混合液を室温で一晩撹拌した。混合
液を減圧下で蒸発させ、中間生成物のクロロホルメートを油として得た。

【０１６８】蒸発処理後にドライトルエン（4 ml/g-mPEG）とドライジクロロメタン（3 ml/
g-mPEG）を添加してこの無色油を再溶解した。0℃でN-ヒドロキシスクシニミド
（NHS）（1.2 mole/mole-mPEG）を固体として添加し、次いでトリエチルアミン
（1.2 mole/mole-mPEG）を添加した。塩酸トリエチルアミン（Et₃N.HCl）の沈殿
がすぐに観察された。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物をガラスろ過器（G5
）でろ過してEt₃N.HClを除去した。ろ液を減圧下で蒸発乾燥させ89%（mole/ mol
e）の粘稠油を回収した。

【０１６９】 NMR表示：＞77%活性化および＜2 o/o(mole/mole)のHNEt₃Cl。mPEG 550炭酸ス
クシニミジルの¹H-NMR（400 MHz、CDCl₃）δ：1.41 t（I＝4.2、HNEt₃Cl中のCH₃ ）、2.69 s（I＝24.4、未反応NHS）、2.84 s（I＝81、スクシニミド）、3.10 dq
（I＝3.7、HNEt₃Cl中のCH₂）、3.38 s（I＝97、OMe中のCH₃）、3.64 bs（I＝125
0、主ピーク）4.47 m（I＝41、PEG中のCH₂）。

【０１７０】実施例6 ．PD498プロテアーゼの活性化mPEG 350との接合炭酸N-スクシニミジルで活性化したmPEG 350（実施例1により調製）20 mg（≒
200 μl）を添加して最終容量6 mlとした50 mMホウ酸ナトリウム（pH 9.7）中に
62 mgのPD498を定温放置した。反応は周囲温度で磁気撹拌を用いて進めた。反応
時間は2時間であった。反応は、0.5 Mのコハク酸を添加して最終pHを6.0とする
ことによって停止させた。

【０１７１】得られた誘導体の分子量は約33 kDaであり、約11 mole-mPEG /mole-PD498に相
当した。親酵素の場合と比較してペプチド基質（スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニト
ロアニリド）に対する残留活性は100%近かった。

【０１７２】実施例７．活性化したmPEG350とスブチリシンDYプロテアーゼの接合：スブチリシンDYを、実施例２の記載と同じ手順を用いて炭酸Ｎ−スクシンイミ
ジルによりmPEG350と接合させた。当業技術者には明らかなはずだが、前述の開示に照らして本発明の実施におい
ては、多くの改変および修正がその精神あるいは範囲から逸脱することなく可能
である。したがって本発明の範囲は、上記特許請求の範囲により規定された趣旨
に従って解釈させるべきである。

【０１７３】実施例８．活性化したmPEG350とサビナーゼ変異体R247Kの接合：サビナーゼ変異体21mgを、pH9.5の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スク
シンイミジルで活性化させたmPEG350の16mgと共にインキュベートし、反応物の
体積を約2mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを9.0〜9.5の幅
内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間であっ
た。反応は最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。

【０１７４】過剰の試薬は、50mMホウ酸ナトリウム、5mMコハク酸、1mM CaCl₂でpH6.0に平
衡化したSuperdex75 HiLoadカラム（Pharmacia, SW）上でサイズ排除クロマト
グラフィにより除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Al
s-Pro-Phe-p−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１７５】実施例９．活性化したmPEG550とサビナーゼ変異体R247Kの接合サビナーゼ変異体21mgを、pH9.5の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スク
シンイミジルで活性化させたmPEG550の25mgと共にインキュベートし、反応物の
体積を約2mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを9.0〜9.5の幅
内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間であっ
た。反応は最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。

【０１７６】過剰の試薬は、50mMホウ酸ナトリウム、5mMコハク酸、1mM CaCl₂でpH6.0に平
衡化したSuperdex75 HiLoadカラム（Pharmacia, SW）上でサイズ排除クロマト
グラフィにより除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Al
s-Pro-Phe-p−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１７７】実施例１０．活性化したビス−PEG300とサビナーゼ変異体R247Kの接合サビナーゼ変異体21mgを、pH9.5の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スク
シンイミジルで活性化させたビス−PEG300の14mgと共にインキュベートし、反応
物の体積を約2mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを9.0〜9.5
の幅内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間で
あった。反応は最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。

【０１７８】過剰の試薬は、50mMホウ酸ナトリウム、5mMコハク酸、1mM CaCl₂でpH6.0に平
衡化したSuperdex75 HiLoadカラム（Pharmacia, SW）上でサイズ排除クロマト
グラフィにより除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Al
s-Pro-Phe-p−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１７９】実施例１１．活性化したビス−PEG200とサビナーゼの接合サビナーゼ変異体827mgを、pH9の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スクシ
ンイミジルで活性化させたビス−PEG200の420mgと共にインキュベートし、反応
物の体積を約30mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを8.5〜9.
0の幅内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間
であった。反応は最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。

【０１８０】過剰の試薬は、10kDカットオフを有するFiltron-Ultrasetteを用いて限外濾過
により除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Als-Pro-Ph
e-p−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１８１】実施例１２．活性化したビス−PEG300とサビナーゼの接合サビナーゼ変異体827mgを、pH9の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スクシ
ンイミジルで活性化させたビス−PEG300の610mgと共にインキュベートし、反応
物の体積を約30mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを8.5〜9.
0の幅内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間
であった。反応は最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。過
剰の試薬は、10kDカットオフを有するFiltron-Ultrasetteを用いて限外濾過によ
り除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Als-Pro-Phe-p
−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１８２】実施例１３．活性化したビス−PEG600とサビナーゼの接合サビナーゼ変異体827mgを、pH9の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スクシ
ンイミジルで活性化させたビス−PEG600の1000mgと共にインキュベートし、反応
物の体積を約100mlとした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを8.5〜9
.0の幅内に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間
であった。反応は最終pH6.0になるまで１M HClを加えることにより停止した。過
剰の試薬は、10kDカットオフを有するFiltron-Ultrasetteを用いて限外濾過によ
り除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Als-Pro-Phe-p
−ニトロアニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１８３】実施例１４．活性化したPEG1000とサビナーゼの接合サビナーゼ2gを、pH9の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スクシンイミジ
ルで活性化させたPEG1000の2.8ｇと共にインキュベートし、最終体積を約200ml
とした。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを8.5〜9.0の幅内に保ちな
がら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間であった。反応は
最終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。過剰の試薬は、Filtron-Ultrasetteを用いて限外濾過により除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Als-Pro-Phe-p−ニトロア
ニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１８４】実施例１５．活性化したPEG2000とサビナーゼの接合サビナーゼ2gを、pH9の50mMホウ酸ナトリウム中で、炭酸Ｎ−スクシンイミジ
ルで活性化させたPEG2000の7.8gと共にインキュベートし、最終体積を約200mlと
した。反応は、0.5M NaOHを添加することによりpHを8.5〜9.0の幅内に保ちなが
ら磁気撹拌を用いて外界温度で行なった。反応時間は２時間であった。反応は最
終pH6.0になるまで1M HClを加えることにより停止した。過剰の試薬は、Filtron-Ultrasetteを用いて限外濾過により除去した。親酵素と比べて、ペプチド基質（スクシニル−Ala-Als-Pro-Phe-p−ニトロア
ニリド）に対する残留活性はほぼ100％であった。

【０１８５】実施例１６．ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロ
ック−ポリ（エチレングリコール）1900ビス（炭酸スクシンイミジル）（エチレ
ングリコール50重量％）とサビナーゼの接合サビナーゼ148mgを緩衝液3mlに溶かし、0.5N NaOHでpH9.0に調整した。活性化
させたブロックポリマー450mgをこの酵素に加えた。反応混合物を0.5N NaOHによ
りpH9.0に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度でインキュベートした。２時間
後、0.5Mコハク酸によりpH6.0に調整した。反応混合物をSuperdex200カラム上で
ゲル濾過することにより精製した。親酵素と比べてDMCに対する接合体の残留活
性は130％であった。

【０１８６】実施例１７．ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロ
ック−ポリ（エチレングリコール）2900ビス（炭酸スクシンイミジル）（エチレ
ングリコール40重量％）とサビナーゼの接合サビナーゼ148mgを緩衝液3mlに溶かし、0.5N NaOHでpH9.0に調整した。活性化
させたブロックポリマー700mgをこの酵素に加えた。反応混合物を0.5N NaOHによ
りpH9.0に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度でインキュベートした。２時間
後、0.5Mコハク酸によりpH6.5に調整した。反応混合物をSuperdex200カラム上で
ゲル濾過することにより精製した。親酵素と比べてDMCに対する接合体の残留活
性は84％であった。

【０１８７】実施例１８．ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）−ブロ
ック−ポリ（エチレングリコール）8400ビス（炭酸スクシンイミジル）（エチレ
ングリコール80重量％）とサビナーゼの接合サビナーゼ148mgを緩衝液4mlに溶かし、0.5N NaOHでpH9.0に調整した。活性化
させたブロックポリマー2000mgを1mM HClの6mlに溶かし、この酵素に加えた。反
応混合物を0.5N NaOHによりpH9.0に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度でイン
キュベートした。２時間後、0.5Mコハク酸によりpH6.5に調整した。反応混合物
をSuperdex200カラム上でゲル濾過することにより精製した。親酵素と比べてDMC
に対する接合体の残留活性は103％であった。

【０１８８】実施例１９．ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）共重合
ポリ（エチレングリコール）12000ビス（炭酸スクシンイミジル）（エチレング
リコール75重量％）とサビナーゼの接合サビナーゼ148mgを緩衝液4mlに溶かし、0.5N NaOHでpH9.0に調整した。活性化
させたコポリマー2800mgをこの酵素に加えた。反応混合物を0.5N NaOHによりpH9
.0に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度でインキュベートした。２時間後、0.
5Mコハク酸によりpH6.0に調整した。反応混合物をSuperdex200カラム上でゲル濾
過することにより精製した。親酵素と比べてDMCに対する接合体の残留活性は140
％であった。

【０１８９】実施例２０．ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）共重合
ポリ（エチレングリコール）970ビス（炭酸スクシンイミジル）（エチレングリ
コール50重量％）とサビナーゼの接合サビナーゼ148mgを緩衝液4mlに溶かし、0.5N NaOHでpH9.0に調整した。活性化
させたコポリマー340mgをこの酵素に加えた。反応混合物を0.5N NaOHによりpH9.
0に保ちながら磁気撹拌を用いて外界温度でインキュベートした。２時間後、0.5
Mコハク酸によりpH6.0に調整した。反応混合物をSuperdex200カラム上でゲル濾
過することにより精製した。親酵素と比べてDMCに対する接合体の残留活性は124
％であった。

【０１９０】実施例２１．少量のmPEGポリマーのPD498接合体のブラウン・ノルウェイラットによる気管内(
IT)実証実験既知のタンパク質濃度（光学濃度および誘導体に対するアミノ酸配列分析によ
り測定した）を有するPD498試料をタンパク質0.75μg/mlまで希釈した。希釈した試料を個々の免疫感作用に1.5mlのフラクションに等分した。これら
フラクションは使用するまで-20℃の安定条件下で保管した。実験の始めと終わ
りに分析を行なった。各免疫感作および各分析に対しては新しいフラクションが
採られた。

【０１９１】酵素接合体は、上記実施例に記載のように炭酸Ｎ−スクシンイミジルで活性化
したmPEG350、550、750と接合された。対応する親酵素を対比として用いた。下記の試料が試験された。グループ１：PD498（親の未結合酵素−対比用）グループ２：PD498-PEG750 グループ３：PD498-PEG550 グループ４：PD498-PEG350

【０１９２】ラットは毎週15回、0.9％（重量／体積）NaCl溶液100μL（対比グループ）、
または上記のPD498タンパク質希釈溶液100μLにより免疫化した。各グループには10匹のブラウン・ノルウェイラットが含まれる。血液試料（2m
l）は免疫感作１週間後１回おきに、次回の免疫感作の前に眼から収集した。血
清は血液クルーシングおよび遠心分離により得た。

【０１９３】特異的IgEのレベルは、上記ラットのIgEに特定のELIAS検定を用いて決定した
。血清は、未希釈から始めて1/2希釈度で滴定した。光学濃度は492/620nmで測定
した。 ITの実証実験の結果は下記の表に示され、試験の終わりにそれぞれのPD498誘
導体を伴うブラウン・ノルウェイラットで観察された血清100μL当たりの全体の
光学濃度を例示する。 PD498接合体の実証実験の結果を下記の表10に示す。

【０１９４】

【表１０】

【０１９５】括弧内の値は、判定された平均値の標準偏差である。表２から考察されるように、結合した少量のポリマーを伴うPD498接合体と気
管内で触れさせたラットの特異的IgE応答レベルは、親の未変性酵素と気管内で
触れさせているラットと比べて低下する。したがって、アレルゲン性は低減する
。

【０１９６】実施例２２．スブチリシンDY接合体のブラウン・ノルウェイラットによる気管内(IT)実証実験
実施例５に記載のブラウン・ノルウェイラットのIT試験を繰り返し、スブチリ
シンDY-PEG750接合体を対応する親のスブチリシンDY酵素（配列番号：３参照）
と比較した。スブチリシンDY-PEG750実証実験の結果を表11に示す。

【０１９７】

【表１１】括弧内の値は、測定された平均値の標準偏差である。表３から考察されるように、結合した７５０Ｄａポリマーを有するスブチリシ
ンＤＹ接合体と気管内で触れさせたラットの特異的ＩｇＥ応答レベルは、親の未
変性酵素と気管内で触れさせているラットと比べて低下する。したがって、アレルゲン性は低減する。

【０１９８】実施例２３．PD498-PEG接合体を含むスキンケア用調合物本発明の接合体を含む下記のスキンケア用調合物を調製した。

【０１９９】

【表１２】

【０２００】油相および水相を別々に混合し、80℃に加熱した。油相を混合しながらゆっく
り水相に注いだ。混合物を約35℃に冷却し、PD498-SPEG550接合体を加えた。ロ
ーション剤は速やかに冷却された。^* 0.4％クエン酸一水和物、pH5.9に調整。^** 通常、MPGを伴う調合物として供給されるはずであり、水相中のMPGは酵素調
合物中のMPG量に従って調整されるべきである。

【０２０１】

【表１３】

【０２０２】上記順序で成分を混合した。Carbapolの添加前にpHを5.6に調整した。Carbapo
lの添加後に再びpHを調整した。^* 酵素調合物中の量により調整。^** pH5.6。

【０２０３】実施例２４．PEG−サビナーゼおよびEOPO−サビナーゼの洗浄性能

【０２０４】

【表１４】

【０２０５】

【表１５】

【０２０６】

【表１６】

【０２０７】

【表１７】

【０２０８】

【表１８】

【０２０９】

【表１９】

【０２１０】

【表２０】

【０２１１】

【表２１】

【０２１２】洗剤溶液のpHを、HCl/NaOHで10.5に調整した。水の硬度は脱イオン水にCaCl₂
およびMgCl₂を加えることにより調整した（「消費者製品における界面活性剤−
理論、技術、および応用」、Springer Verlag、1986もまた参照されたい）。洗
剤溶液のpHは、HClを加えることによりpH10.5に調整した。市販の粉末洗剤中に存在するプロテアーゼは洗剤溶液を電子レンジで８５℃、
５分間加熱することにより不活性化した。

【０２１３】試験材料の反射率の測定は、CLX 75Wキセノンランプを備えたJ&M Tidas MMS/1
6光度計および繊維光学器械を用いて460nmで行なった。各織物片は、背景として
他の織物片（同一設定のもの）と共に一つづつ測定された。実験データに関して95％の有意差で分散分析およびｔ検定比較（Student-Nwem
an-Keuls）を行なうためにSAS 6.12ソフトウェアを用いた。

【０２１４】いろいろなサビナーゼ（商標）変異体の洗浄性能を△反射率（DR）の値を比較
することにより評価した。すなわちＤＲ＝Ｒ（プロテアーゼ）−Ｒ（ブランク）ＤＲ：△反射率Ｒ（プロテアーゼ）：接合プロテアーゼで洗浄した試験材料の反射率Ｒ（ブランク）：非接合プロテアーゼで洗浄した試験材料の反射率結果：大文字はｔ検定（SNK、α=0.05）に基づく各欄内の統計的群分けを示す。もし
二つが同じ群（同じ文字）であれば、それらは統計的に区別することができない
。

【０２１５】

【表２２】

【０２１６】

【表２３】

【０２１７】

【表２４】

【０２１８】

【表２５】上記の表に示したように、PEGサビナーゼおよびEOPO−サビナーゼの洗浄性能
は、非接合サビナーゼの洗浄性能と比べて向上した。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月６日（２００１．２．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０８Ｌ 89/00 Ｃ０８Ｌ 89/00 Ｃ１１Ｄ 3/37 Ｃ１１Ｄ 3/37 3/386 3/386 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デウセン，ハインツ−ヨセフデンマーク国，デーコー−2860 セボルゥ，モセバンガン 16 (72)発明者ペテルセン，ドルテアービーデンマーク国，デーコー−3460 ビルケレド，ヘストケブバイ 11エー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】改良された洗浄性能を有するポリペプチド−ポリマー接合体
。
【請求項２】前記接合体が低下したアレルゲン性を有する、請求項１に記
載の接合体。
【請求項３】前記ポリペプチドが酵素である、請求項１または２に記載の
接合体。
【請求項４】 0.1kDaから60kDaの範囲の分子量、好ましくは100Daから10,0
00Daの範囲、特に100Daから2,000Daの範囲の分子量を有するホモポリマーに接合
された親ポリペプチドが4kDaと100kDaの間の分子量を有する、前記請求項のいず
れかに記載の接合体。
【請求項５】親ポリペプチド、具体的には酵素が15から60kDaの分子量を
有する、請求項４に記載の接合体。
【請求項６】１から100個の高分子量分子、好ましくは４から50個、特に
５から35個の高分子量分子が親酵素と共有結合により結合している、請求項１〜
５のいずれかに記載の接合体。
【請求項７】前記高分子量分子が天然または合成のホモおよびヘテロポリ
マーを含む群から選択される、請求項１から６に記載の接合体。
【請求項８】前記高分子量分子が分枝PEG、星形PEG，PEGエーテル、およ
びPEGエステルを含む合成の高分子量分子を含む群から選択される、請求項７に
記載の接合体。
【請求項９】高分子材料が100から6,000Da、好ましくは100から2,000Daの
分子量を有するPEG類を含む群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の
接合体。
【請求項１０】高分子量分子が、カルボキシメチルデキストランを含むデ
キストラン類；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセル
ロース類、キトサンの加水分解物；ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロ
ピルデンプンなどのデンプン類；グリコーゲン；アガロース；グアーガム；イヌ
リン；プルラン；キサンタンガム；カラゲニン；ペクチン；およびアルギン酸を
含む天然起源の高分子量分子を含む群から選択される、請求項７に記載の接合体
。
【請求項１１】前記ポリペプチド−ポリマー接合体が、ポリペプチド表面
と結合したグラフト、ブロック、交互、またはランダムコポリマーである、請求
項１〜３に記載の接合体。
【請求項１２】前記ポリペプチド−ポリマー接合体が、親ポリペプチドと
共有結合により結合した１もしくは複数種のポリマーを有する接合体であって、
前記ポリマーが一般式、ＥＯ_xＰＯ_y （Ｉ）をもつことを特徴とし、上式でx=1〜99%、y=1〜99%、x+y=100%である、請求項１
１に記載の接合体。
【請求項１３】前記ポリマーが、100から100,000Daの分子量、好ましくは
100から50,000Da、特に100から10,000Daの分子量を有する、請求項１２に記載の
接合体。
【請求項１４】前記親ポリペプチドが１から100kDaの分子量を有し、とり
わけ酵素が15から60kDaの分子量を有する、請求項１２から１３に記載の接合体
。
【請求項１５】前記ブロックまたはコポリマーが、エチレンオキシド単位
（EO）とプロピレンオキシド単位（PO）を10：90または20：80または30：70また
は40：60または50：50または60：40または70：30または80：20または90：10の中
の範囲にある比率で含有する、請求項１２から１４のいずれかに記載の接合体。
【請求項１６】１から100個の高分子量分子、好ましくは４から50個、特
に５から35個の高分子量分子が親酵素と共有結合により結合している、請求項１
２から１５のいずれかに記載の接合体。
【請求項１７】前記ポリペプチドが細菌、糸状菌、または酵母起源などの
微生物起源、あるいは植物起源である、請求項４から１０または１１から１６の
いずれかに記載の接合体。
【請求項１８】前記ポリペプチドが、スブチリシンおよびメタロプロテア
ーゼなどのセリンプロテアーゼを含むプロテアーゼ；または炭水化物分解酵素；
またはリパーゼ；またはラッカーゼおよびハロペルオキシダーゼなどの酸化還元
酵素；またはスーパーオキシドジスムターゼ；を含む加水分解酵素属の酵素であ
る、請求項１７に記載の接合体。
【請求項１９】前記親プロテアーゼが、PD498、サビナーゼ（商標）、サ
ビナーゼ変異体R247K、プロテイナーゼＫ、サーミターゼ、スブチリシンＤＹ、
ライオンＹ、アルカラーゼ（商標）、プロテイナーゼＴ、およびJA16を含む群か
ら選択される、請求項１８に記載の接合体。
【請求項２０】前記親炭水化物分解酵素が、ノバミル（商標）、フンガミ
ル（商標）、ナタラーゼ（商標）、およびテルマミル（商標）を含む群から選択
される、請求項１８に記載の接合体。
【請求項２１】請求項１から２０に記載の接合体を含む工業用組成物。
【請求項２２】洗浄用洗剤組成物、皿洗い用組成物、または硬質表面クリ
ーニング用組成物などの洗剤である、請求項２１に記載の工業用組成物。
【請求項２３】請求項２１から２２のいずれかに記載の工業用組成物の洗
浄性能を改良するための請求項１〜２０のいずれかに記載の接合体の使用。
【請求項２４】呼吸アレルゲン性を低減させるための請求項２３に記載の
使用。
【請求項２５】請求項４、６〜１０のいずれかに記載のホモポリマーを請
求項４、５、１７〜２０のいずれかに記載の親ポリペプチドと結合させること、
および／または請求項１１、１２、１３、１５、１６のいずれかに記載のブロッ
クまたはコポリマーを請求項１４、１７〜２０のいずれかに記載の親ポリペプチ
ドと結合させることを含む、ポリペプチドの洗浄性能の改良方法。