JP2002518039A

JP2002518039A - プロピオニバクテリウムベクター

Info

Publication number: JP2002518039A
Application number: JP2000556001A
Authority: JP
Inventors: ピーター・ヘンドリク・ポーウェルス; ニコレ・ファン・ルエイク; ヨハネス・ペトルス・マリア・ヨレ; ルドルフ・ヘイスベルトゥス・マリー・ライテン
Original assignee: DSM NV
Current assignee: Koninklijke DSM NV
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2002-06-25
Also published as: SK19892000A3; ID28046A; PL345519A1; HUP0102820A2; NO20006616L; WO1999067356A3; ZA200007786B; HRP20010017A2; HUP0102820A3; IL140461A0; IS5783A; CN1314941A; US6830901B1; BG105078A; CZ20004842A3; AU4615899A; YU82600A; FR2780733A1; TR200100351T2; NO20006616D0

Abstract

(57)【要約】プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacteriumfreudenreichii）ＬＭＧ１６５４５（ＣＢＳ１０１０２２として寄託）から単離したプロピオニバクテリウムの内因性プラスミドを記載し、その配列を提供する。このプラスミドは、組換え蛋白質または酵素産物、例えば、ビタミンＢ１２の製造において、プロピオニバクテリアを形質転換し、相同または異種蛋白質の発現に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、プロピオニバクテリウムの内因性プラスミド、それから由来するベ
クター、および細菌、特に、プロピオニバクテリア中で（異種）蛋白質を発現さ
せるための、これらのベクターの使用に関する。特に、形質転換した細菌は、発
酵により、ビタミンＢ₁₂の製造またはチーズ製造に使用できる。

【０００２】序プロピオニバクテリアは、種々の工業的プロセスにおいて種々の有用な化合物
を製造できるグラム陽性細菌である。例えば、大規模発酵法でビタミンＢ₁₂（コ
バラミン）を製造するためのいくつかのプロピオニバクテリウム種が知られてい
る。他の種は、それらが貢献できるところでチーズ製造のような酪農分野で使用
され、多くの場合、主にチーズの特異的なフレーバーやテクスチャーに関与して
いる。多くのプロピオニバクテリウム種が、生きている生物として食品や動物飼
料に含めるのに安全であると考えられている。プロピオニバクテリウムのバイオテクノロジー的潜在能力を十分に活用するた
め、効率的かつ融通のきく遺伝工学的技術が必要となる。そのような技術は、プ
ロピオニバクテリウム中で異種遺伝子から蛋白質を発現させるのに適したプラス
ミドの入手可能性に依存している。ＥＰ−Ａ−０４００９３１（Nippon Oil）はプロピオニバクテリウム・ペント
サセウム（Propionibacterium pentosaceum）（ＡＴＣＣ４８７５）からの内因
性プラスミド（ｐＴＹ−１）に言及しているが、その配列についての記載がなく
、如何にして異種遺伝子を発現させることができるかの例示がない。ＪＰ０８−５６６７３はビタミンＢ₁₂製造用のプラスミドｐＴＹ−１に言及し
ているが、該プラスミドが自由に複製する染色体外要素として留まることや、プ
ラスミドが形質転換細胞内で安定であることが証明されていない。

【０００３】したがって、本発明は、先行技術におけるベクターよりも、より効率的な、か
つ染色体外に留まることができ、および／または安定なベクターを提供せんとす
るものである。特に、本発明は、プロピオニバクテリウムまたは外来ゲノムフラ
グメントもしくは遺伝子の（プロピオニバクテリウム）宿主株へのクローニング
または発現のための効率的ベクターを提供することを目的としている。これは、
宿主特異性制限酵素を回避でき、それにより宿主が異種ポリヌクレオチドとして
プラスミドを処置することを避けることができる。

【０００４】発明の概要したがって、本発明は、第１の態様において（ａ）配列番号１またはその補体、（ｂ）プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium
freudenreichii）ＣＢＳ１０１０２２の３．６ｋｂプラスミドからの配列、（ｃ）プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium
freudenreichii）ＣＢＳ１０１０２３の３．６ｋｂプラスミドからの配列、ま
たは（ｄ）配列番号２または３のアミノ酸配列、その補体（の少なくとも一部）の
ような本発明のポリペプチドをコードする配列、と選択的にハイブリダイズできる配列を含むポリヌクレオチドを提供する。配列番号１は、本発明者らが見出したプロピオニバクテリウムＬＭＧ１６５４
５の内因性プラスミドのＤＮＡ配列を示す。第１のコード配列はヌクレオチド２
７３からヌクレオチド１１８４までであり、このコード配列の推定アミノ酸配列
を配列番号２として示してある。第２のコード配列はヌクレオチド１１８１から
１４８３までであり、このコード配列の推定アミノ酸配列を配列番号３として示
してある。

【０００５】本発明者らは、プロピオニバクテリウム単離物の大きなコレクションをスクリ
ーニングし、３．６ｋｂのサイズを有する潜在型プラスミドが宿る２つの株を同
定した。これらの株の１つがプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Pr
opionibacterium freudenreichii）ＬＭＧ１６５４５であり、ブタペスト条約の
下、１９９８年６月１９日に、ＣＢＳ１０１０２２の受託番号で、Wateringsewe
g 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, The Nether landsの Gist-brocades B.V.の
名前でOosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Netherlandsの Centr
aalbureau voof Schimmelculture (CBS)に寄託した。他の株は、プロピオニバク
テリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）ＬＭＧ１
６５４６であり、同じ寄託者により、ブタペスト条約の下、１９９８年６月１９
日に、ＣＢＳ１０１０２３の受託番号でＣＢＳに寄託された。ＬＭＧ１６５４５の塩基配列の完全特徴付けおよびコンピューターを介する分
析により、本発明者らは異種ＤＮＡフラグメントの挿入部位を同定できた。これ
らの部位は、プロピオニバクテリウムにおいて、なお自律複製のできるプラスミ
ドの構築を可能とした。驚くべきことに、放線菌であるサッカロポリスポラ・エリスリアエア（Saccha
ropolyspora erythraea）からのエリスロマイシン耐性遺伝子がプロピオニバク
テリウムで効率よく発現され、したがって、形質転換細胞の選択マーカーとして
使用できることを見出した。また、構築したものは、プロピオニバクテリウムおよびイー・コリ（E. coli
）の両方で安定に維持でき、選択できる二官能性ベクターである。これにより、
ベクター構築およびプロピオニバクテリウムにおける相同または異種遺伝子の機
能的発現にイー・コリの使用が可能となる。イー・コリを用いるベクター構築は
比較的容易であり、迅速に行なうことができる。

【０００６】本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プロピオニバクテリウムのような細菌
内で自律複製性または染色体外性でありうる。したがって、本発明の他の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター
を提供する。また、本発明は、ポリペプチドの発現を与える条件下、本発明のベクターで形
質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養することを特徴とする該ポ
リペプチドの製造法を提供する。さらに、本発明は、配列番号２または３の配列、その配列と実質的に相同な配
列またはどちらかの配列のフラグメントを含むポリペプチドあるいは本発明のポ
リヌクレオチドでコードされる蛋白質を提供する。

【０００７】発明の詳細な開示ポリヌクレオチド本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号１の一部、あるいは
この配列またはその一部と相同性の配列と選択的にハイブリダイズすることがで
きうる。本発明のポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウム・フロイデンラ
イシイＣＢＳ１０１０２２またはＣＢＳ１０１０２３の３．６ｋｂプラスミドか
らの配列あるいは、いずれかのプラスミドの配列の一部と選択的にハイブリダイ
ズすることができうる。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
またはいずれかの３．６ｋｂプラスミドの配列、これらの配列のいずれかの一部
、あるいはこれらの配列の補体、またはそれらの一部と選択的にハイブリダイズ
できるヌクレオチドの連続した配列である。本発明のポリヌクレオチドと、配列番号１または３．６ｋｂプラスミドのいず
れかの配列、あるいはポリペプチドをコードする配列またはこれらの配列の一部
は、バックグラウンドより有意に高いレベルでハイブリダイズできる。例えば、
バックグラウンドハイブリダイゼーションは調製物中に他のポリヌクレオチドが
存在することにより起こりうる。本発明のポリヌクレオチドと、配列番号１また
は３．６ｋｇプラスミドのいずれかの配列またはそれらの配列の一部との相互反
応によって生じるシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと、配
列番号１または３．６ｋｂプラスミドのいずれかのコード配列あるいは該ポリペ
プチドをコードする配列またはそれらの一部との相互反応の強度の少なくとも１
０倍、好ましくは少なくとも１００倍である。例えば、相互反応の強度は、例え
ば、³²Ｐでプローブを放射能ラベルすることにより、測定できる。選択的ハイブ
リダイゼーションは、典型的には中程度のストリンジェント（例、約５０℃にお
いて０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）ないし高ス
トリンジェント（同条件、ただし６０℃）な条件を用いて行なう。

【０００８】本発明に包含されるポリペプチドは、一般に、少なくとも２０、好ましくは少
なくとも３０、例えば、少なくとも４０、６０または１００もしくはそれ以上の
連続したヌクレオチド領域にわたって、（配列（ａ）〜（ｂ））に対して）少な
くとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なく
とも９５％、最適には、少なくとも９８％相同とすることができる。上記した相同の程度と最小サイズのいずれかの組み合わせを本発明のポリヌク
レオチドを規定するのに使用でき、よりストリンジェントな組み合わせ（すなわ
ち、より長い領域にわたるより高い相同性）が好ましい。例えば、４０ヌクレオ
チドにわたる少なくとも９０％または９５％の相同と同様に、２５、好ましくは
３０ヌクレオチドにわたる少なくとも８０％または９０％の相同も本発明の１具
体例である。

【０００９】上記した部分は、配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラスミドのコード
配列でよい。配列番号１の他の好ましい部分は、複製開始点、プロモーターまた
はレギュレーター配列、あるいは、プロピオニバクテリウムのような宿主細胞中
での自律複製を生じさせる、または補助することのできる配列である。制限部位ＳａｌＩからＡｌｗＮＩまでのプラスミドの部分がプラスミドの複製
に必要な領域であるらしいことを見出した。プラスミドの他の部分を欠失させて
も、複製に対する悪影響は見られない。したがって、本発明においては、配列（
ｂ）および（ｃ）は、制限部位ＳａｌＩおよびＡｌｗＮＩで輪郭付けられた領域
とすることができる。これは、約１．７ｂの長さである。また、配列（ｂ）また
は（ｃ）は、配列番号１のヌクレオチド１００から１７００、適当には１５０か
ら１５００、有利には２００から１３００、最適には２５０から１２００のよう
なヌクレオチド１から１８００に相当する配列で置き換えることができる。

【００１０】各々、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２でコードされる蛋白質（配列番号２および３）
は両方ともプラスミド複製を助けると考えられる。プラスミドは、内側の鎖をテ
ンプレートとして外側鎖のコピー生成を補助する蛋白質のいずれかにより元の二
本鎖（ｄｓ）ＤＮＡプラスミドを切断する公知のローリング・サークル複製法に
よって複製する。外側リングのコピーを取り出し、末端を結合する。ついで、宿
主は、生成した外側リングをテンプレートとして新しい内側リングを複製する。本発明のコード配列は、例えば、１、２または３〜１０、２５、５０あるいは
１００置換のようなヌクレオチド置換によって修飾することができる。配列（ａ
）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、１以上の挿入または欠失および／またはいず
れかもしくは両方の末端の延長によって代わりに、または付加的に修飾すること
ができる。縮重置換もでき、および／または置換もでき、修飾された配列が翻訳
されると、例えば、後に本発明のポリペプチドに関して説明するように、保存ア
ミノ酸置換をもたらす。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。これらには合成ま
たは修飾ヌクレオチドをその中に含むポリヌクレオチドも包含できる。ポリヌク
レオチドに対する多くの異なったタイプの修飾が公知である。これらにはメチル
ホスホネートおよびホスホロチオエート主鎖、分子の３’および／または５’末
端におけるアクリジンまたはポリリシンの付加が包含される。本発明の目的のた
めに、本明細書に記載するポリヌクレオチドは、当該分野で利用できるいずれの
方法で修飾してもよい。このような修飾は、in vivo活性またはライフスパンの
増強のために行なうことができる。

【００１１】本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プラ
イマー、別（alternative）増幅反応用プライマーのようなプライマー、例えば
、放射能または非放射能ラベルを使用する通常の方法による明示（revealing）
ラベルでラベルされたようなプローブとして使用でき、あるいは該ポリヌクレオ
チドはベクター中に組み込みまたはクローンすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５
、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレ
オチドの長さである。これらは、典型的には、４０、５０、６０、７０、１００
または１５０ヌクレオチドまでの長さである。プローブおよびフラグメントは、
１５０ヌクレオチドより長くすることができ、例えば、２００、３００、５００
、１０００または１５００ヌクレオチドまでの長さでよく、また、配列（ａ）〜
（ｄ）のいずれかよりも、５または１０ヌクレオチドのような数個までのヌクレ
オチド短くすることもできる。ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプライマーのような本発明のポリヌクレオチド
は、組換え、合成で、当該分野で利用できるいずれかの手段により製造できる。
これらはまた、標準的な技術によってクローンすることができる。ポリヌクレオ
チドは、典型的には単離および／または精製した形態で提供される。一般に、プライマーは、所望の核酸配列の１ヌクレオチドを１回づつ製造する
段階法を含む合成手段で製造される。自動化技術を用いてこれを行なうことも、
当該分野では容易に利用できる。

【００１２】より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲクローニ
ング技術を用いて製造できる。これには、配列番号１またはどちらかの３．６ｋ
ｂプラスミドのクローンしたい領域に対する一対のプライマー（例、約１５〜３
０ヌクレオチド）を作成し、プライマーを、プロピオニバクテリウムから得られ
たＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でＰＣＲを行ない、増
幅されたフラグメントを単離し（例、反応混合物をアガロースゲル上で精製する
ことにより）、増幅されたＤＮＡを回収することが含まれる。プライマーは、増
幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクター中にクローンできるように適当な
制限酵素認識部位を含むように設計することができる。本明細書に述べた技術は、当該分野でよく知られている¹⁰。配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラスミドと１００％相同ではないが
、本発明の範囲のポリヌクレオチドは、種々の方法により得ることができる。配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラスミドの相同ポリヌクレオチドは
、例えば、P. freudenreichii、P. jensenii、P. thoenii、P. acidipropionici
のような一連のプロピオニバクテリウムまたは放線菌（Actinomycetes）に属す
る細菌の他の株、あるいは他のグラム陽性細菌またはＧ：Ｃリッチなそのような
細菌から得られたゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得ること
ができる。これらの全ての生物は、本発明で使用するための、相同または異種遺
伝子、プロモーター、エンハンサーまたは宿主細胞の適当な供給源である。かかる相同配列およびそのフラグメントは、一般に、配列番号１またはその補
体あるいはどちらかの３．６ｋｂプラスミドのコード配列と選択的にハイプリダ
イズできる。このような配列は、中ないし高ストリンジェントな条件（例、約５
０℃〜約６０℃において０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナト
リウム）で配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラスミドのコード配列の全
部または一部を含むプローブでプロピオニバクテリウムのＤＮＡライブラリーを
プローブすることにより得ることができる。

【００１３】相同配列は、相同配列中の保存配列を標的とするように設計されたプライマー
を用いる縮重ＲＣＲを用いても得られる。保存配列は、配列番号１またはどちら
かの３、６ｋｂプラスミドの配列と、それらの相同配列とを並べることにより推
定できる。プライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、公知の配列に対する単一
の配列プライマーを用いて配列をクローニングするよりも低いストリンジェント
な条件を用いることができる。別法として、このようなポリヌクレオチドは、配列番号１またはどちらかの３
．６ｋｂプラスミドの配列あるいはそれらの相同配列の部位特異的突然変異誘発
によっても得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現し
ている個々の宿主細胞に優先的なコドンを最適化するためにサイレントコドン変
化が配列に要求される場合に有用でありうる。制限酵素認識部位の導入またはポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質または機能の変化のた
めに、他の配列変化が要望されうる。ポリヌクレオチドの相同性の測定法はよく知られている。例えば、ＵＷＧＣＧ
パッケージは、相同性の計算に使用できる、例えば、そのデフォルト・セッティ
ング⁷に使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している。後に説明する本
発明のポリペプチドについてのアミノ酸相同について、ＢＬＡＳＴ(Basic Local
Alignment Search Tool¹）を使用でき、これは配列の類似性を決定するために
アミノ酸配列（および要すれば塩基配列）のアライメントを作成する。ＢＬＡＳ
Ｔは、かくして、相同配列の正確なマッチまたは同定に使用でき、特に、ギャッ
プを含まないこれらのマッチに有用である。ＢＬＡＳＴ技術はハイスコアリング
・セグメント・ペア（ＨＳＰ）に基づくアルゴリズムを使用する。

【００１４】本発明は、本発明のポリヌクレオチドと、その補体を含む二本鎖ポリヌクレオ
チドも包含する。本発明のポリヌクレオチド（例、プローブまたはプライマー）は明示ラベルを
有することができる。適当なラベルには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのようなラジオアイソ
トープ、酵素ラベルまたはビオチンのような他の蛋白質ラベルが包含される。こ
れらのラベルの検出技術は自体公知である。該ポリヌクレオチド（ラベルされた、または非ラベル）は、試料中の本発明の
別のポリヌクレオチドの検出または配列決定用の核酸をベースとするテストにお
いて使用できる。本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞中で自律複製する、染色体外に留まる
ことのできる配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラスミドの配列の変異体
も包含する。そのような変異体は、プロピオニバクテリウムのような細菌におい
て安定でありうる。一般に、該ポリヌクレオチドは、配列番号１またはどちらかの３．６ｋｂプラ
スミドの複製開始点および／またはコード領域あるいはこれらの配列の相同配列
を含む。本発明のポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウムまたはイー・コ
リのような宿主細胞中で安定であり、５世代以上、例えば、１５世代、好ましく
は３０世代にわたって宿主から失われない。一般に、そのようなポリヌクレオチ
ドは各世代の両嬢細胞に固有なものとなる。該ポリヌクレオチドはプロモーターまたは複製開始点（例、複製蛋白質をコー
ドするいずれかの配列の上流）を有する。

【００１５】本発明のポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウムやイー・コリのような
細菌に、例えば、適当な方法¹¹で形質転換またはトランスフェクトすることがで
きる。細菌には、５〜５００、例えば、１０〜１００のコピー数で存在させるこ
とができる。該ポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウム以外の細菌でも自律複製でき
る。そのような細菌は、イー・コリまたはグラム陽性もしくはＧ：Ｃリッチ細菌
または放線菌の１つである。かかるポリヌクレオチドは、一般に、その細菌中で
ポリヌクレオチドが自律複製できる配列を含んでいる。そのような配列は該細菌
中で複製できるプラスミドから誘導できる。本発明のポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウム中で複製させることに
より製造できる。別法として、イー・コリのような他の細菌中で複製させること
によっても製造できる。該ポリヌクレオチドは、プロピオニバクテリウムの宿主
制限系を回避することができる。

【００１６】ベクター本発明の第２の態様は、第１の態様のポリヌクレオチドを含むベクターに関す
る。該ベクターは、細菌、例えば放線菌（例、プロピオニバクテリウム）または
イー・コリのような宿主細胞において複製可能である。該ベクターは直線状ポリ
ヌクレオチドであるか、より通常は環状ポリヌクレオチドでありうる。該ベクタ
ーは本発明のポリヌクレオチドと他のベクターとのハイブリッドであってもよい
。他のベクターは、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣファミリー、Ｒ１、ＣｏｌＤもし
くはＲＳＦ１０１０のベクターのようなイー・コリベクターあるいはそれらか
らの誘導ベクターであってもよい。

【００１７】本発明のポリヌクレオチドまたはベクターはプラスミドであってもよい。かか
るプラスミドは図１、２ａまたは２ｂと同じ制限酵素地図を有していてもよく、
またはそれらと実質的に類似の制限酵素地図を有していてもよい。

【００１８】該ポリヌクレオチドまたはベクターは１ｋｂ〜２０ｋｂのサイズを有していて
もよく、例えば２〜１０ｋｂであり、３〜７ｋｂが最適である。

【００１９】該ポリヌクレオチドまたはベクターはマルチプルクローニングサイトを有して
いてもよい。このようなクローニングサイトは通常、制限酵素の認識配列を有す
る。該ポリヌクレオチドまたはベクターは配列番号１に示す配列を有していても
よく、および／またＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＡｌｗＮ１、ＢｓｍＩ、ＢｓａＢＩ
、ＢｃｌＩ、ＡｐａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＨｐａＩ、ＰｓｔＩ、Ｓｐ
ｈＩ、ＢａｍＨＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの制限酵素認識
部位を有していてもよい。したがって、該ポリヌクレオチドまたはベクターは、
通常上記図に示す順番でこれらの制限酵素部位の１以上または全てを有していて
もよい。

【００２０】プロピオニバクテリウムまたはイー・コリのような細菌中に存在する場合、本
発明のポリヌクレオチドまたはベクターは該細菌の染色体中に組み込まれないこ
とが好ましい。該ポリヌクレオチドまたはベクターは通常５世代の間取り込まれ
ず、好適には２０〜３０世代の間取り込まれない。

【００２１】該ポリヌクレオチドまたはベクターは宿主細胞内の染色体外にとどまる事がで
き、異種遺伝子（宿主に対して）を含む場合、宿主内でその遺伝子を発現できる
、内因性プロピオニバクテリウムプラスミド由来の自律複製プラスミドであって
もよい。「由来の」なる語は自律複製プラスミドが本発明のポリヌクレオチドと
同じ配列を含むことを意味する。

【００２２】本発明のベクターは選択マーカーを有していてもよい。該選択マーカーはアン
ピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子のような抗生物質耐
性を与えるものであってもよい。該選択マーカーはエリスロマイシン耐性遺伝子
であってもよい。エリスロマイシン耐性遺伝子はサッカロポリスポラ・エリスリ
アエア（Saccharopolyspora erythraea）のような放線菌、例えばサッカロポリ
スポラ・エリスリアエアＮＲＲＬ２３３８由来のものであってもよい。ベクター
中に存在してもよいその他の選択マーカーは、クロラムフェニコール、チオスト
レプトン、ビオマイシン、ネオマイシン、アプラマイシン、ハイグロマイシン、
ブレオマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を与える遺伝子を含む
。

【００２３】ベクターは発現ベクターであってもよく、それゆえ異種遺伝子（宿主細胞中、
例えばプロピオニバクテリウム中、天然には生じないもの）、または宿主細胞（
例、プロピオニバクテリウム）の内因性もしくは同種遺伝子を含んでいてもよい
。発現ベクターにおいて、発現する遺伝子は、宿主細胞中の遺伝子の発現を与え
ることができる調節配列に通常作用可能に連結している。

【００２４】「作用可能に連結」なる用語は、記載した構成要素がそれらを意図する方式で
作用させる関係にある近接した位置をいう。コード配列に「作用可能に連結」し
た調節配列は、調節配列と両立できる条件下でコード配列の発現が達成されるよ
うに連結されている。

【００２５】異種または内因性の遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１〜２００の間また
は１５００〜３５５５の間に挿入されているか、または同種のポリヌクレオチド
中の同等の位置にあってもよい。

【００２６】かかる遺伝子は、延長因子、プロモーター調節配列または要素、および複製蛋
白質等についての同種または内因性の遺伝子を含んでいてもよい。その他の遺伝
子（宿主に対して異種であってよいもの）は栄養因子、免疫モジュレーター、ホ
ルモン、蛋白質および酵素（例、プロテアーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、リ
パーゼ）、テクスチャー剤、フレーバー物質（例、ジアセチル、アセトン）、遺
伝子クラスター、抗微生物剤（例、ナイシン）、食品中（例、ソーセージ、チー
ズ中）での使用のための物質、代謝酵素、ビタミン（例、Ｂ₁₂）、ウロポルフィ
リノーゲン（III）メチルトランスフェラーゼ（ＵＰ III ＭＴ）、ｃｏｂＡ、抗
原（例、ワクチン用）および治療薬をコードまたは生産を補助するものを包含す
る。以下で明らかになるように、宿主は、ポリペプチドだけでなく、広範な物質
を生産でき、これらは目的の生産物であるか、目的の生産物の生産に用いられる
ものであってもよい。

【００２７】異種遺伝子はヒトまたは動物において治療効果を有していてもよい。かかる遺
伝子は抗原、例えば病原性生物由来の、を含んでいてもよい。かかる異種遺伝子
を有する、プロピオニバクテリウムのような宿主は、ワクチンとして、またはワ
クチン中に用いてもよく、病原体に対する防御を与えることができる。異種抗原はエピトープを含む完全な蛋白質かまたは蛋白質の一部であってもよ
い。抗原は細菌、ウイルス、酵母またはカビ由来であってもよい。

【００２８】宿主細胞および発現宿主細胞は本発明の第３の態様を形成し、第１または第２の態様のポリヌクレ
オチドまたはベクターを含有する。該宿主細胞は、例えば放線菌綱の細菌であっ
てもよい。該細菌はプロピオニバクテリウムまたはイー・コリであってもよい。
プロピオニバクテリウムは、Ｐ．フロイデンライシイ（P. freudenreichii）、
Ｐ．ジェンセニイ（P. jensenii）、Ｐ．ソエニイ（P. thoenii）またはＰ．ア
シジオプロピオニシ（P. acidiopropionici）であってもよい。

【００２９】第４の態様において、本発明は第３の態様の宿主細胞の生産方法、すなわち例
えば既知の形質転換技術による、第１または第２の態様のポリヌクレオチドまた
はベクターを用いる宿主細胞の形質転換またはトランスフェクトを含む方法を提
供する。

【００３０】第５の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドの発現が生じる条件下での
宿主細胞の配置（placing）と培養を含む、本発明の宿主細胞中に存在する本発
明のポリヌクレオチドまたはベクターによってコードされるポリペプチドの調製
方法を提供する。

【００３１】したがって、本発明のこの態様は所定の遺伝子によってコードされるポリペプ
チドの調製方法であって、該ポリペプチドの発現、および所望による発現ポリペ
プチドの回収を与える条件下で、該遺伝子を含む発現ベクターで形質転換または
トランスフェクトされた宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。宿主細
胞は放線菌綱に属す、すなわちプロピオニバクテリウムのようなグラム陽性細菌
またはイー・コリであってもよい。プロモーター、翻訳イニシエーター、翻訳タ
ーミネーター、延長因子遺伝子、リボゾーマルＲＮＡ、抗生物質耐性遺伝子、他
のポリヌクレオチドまたはベクターに存在する発現調節シグナルに対する合成プ
ロモーター（例えば、共通配列に基いてデザインされたもの）は、宿主細胞での
発現と両立するものでありうる。かかるプロモーターは宿主細胞の内因性遺伝子
のプロモーターを包含する。

【００３２】培養条件は、宿主に依存して、好気的または嫌気的条件であってもよい。醗酵
プロセスのためには、宿主細胞は嫌気条件下におかれ、その後場合によっては好
気条件下に置かれる。発現ポリペプチドのような生産化合物は、その後例えば宿
主細胞や醗酵培地から回収できる。該発現ポリペプチドは宿主から分泌されても
よい。別法として、該ポリペプチドは宿主細胞から分泌されなくてもよい。この
ような場合、ポリペプチドは宿主細胞表面で発現してもよい。これは、例えば、
ポリペプチドが、ヒトまたは動物において免疫応答が望まれる抗原を含む場合、
望ましいものでありうる。

【００３３】本発明のベクター中に存在してもよい同種遺伝子は、ｃｏｂＡであってもよい
。したがって、このベクターを含む宿主細胞は基質または化合物からビタミンＢ ₁₂ のような化合物を生産できるものであってもよく、または該化合物は酵素の生
産物であってもよい。本発明は詳細には、ＵＰ（III）ＭＴ遺伝子が発現する条
件下でのこのような宿主細胞の培養または醗酵を含む、ビタミンＢ₁₂の製造方法
を提供する。発現酵素は基質がビタミンＢ₁₂に変換される条件下で適切な基質と
接触できる。このことにより、ビタミンＢ₁₂の生産が増加する。

【００３４】治療上記のように、本発明のポリヌクレオチドは治療上の遺伝子である異種遺伝子
を含んでいてもよい。したがって、本発明は、治療によるヒトまたは動物身体の
処置方法における使用のための治療上の遺伝子を含有する本発明のベクターを有
する宿主細胞を包含する。かかる宿主細胞はプロピオニバクテリウムであっても
よい。該宿主細胞は生きていてもよく、死んでいてもよい。

【００３５】医薬上許容されるキャリアーまたは賦形剤と混合することにより、該宿主細胞
を臨床投与用に製剤できる。例えば、それらを局所投与、非経口投与、筋肉内投
与、皮下投与、経口投与または経皮投与用に製剤できる。該宿主細胞を、医薬上
許容され、目的の投与経路に適切な任意のビヒクルと混合してもよい。医薬上許
容される注射用のキャリアーまたは賦形剤は、例えば注射用水または生理食塩水
のような無菌または等張の溶液等であってもよい。

【００３６】宿主細胞の投与量は、種々のパラメーター、特に用いる宿主細胞のタイプ、治
療される患者の年齢、体重および病状；用いられる投与のモード；治療する病状
；ならびに要求される臨床的レジメンに従って、調節してもよい。指標として、
投与される宿主細胞の数は、例えば経口投与では、７０ｋｇのヒト成人について
の投与あたり１０⁷〜１０¹¹宿主細胞である。

【００３７】熟練した実施者はあらゆる特定の患者および状態の最適な投与経路および投与
量を容易に決定できるので、記載した投与経路およぼ投与量は単に指標としての
意図である。

【００３８】ポリペプチド本発明の第６の態様は、配列番号２もしくは３またはこれらの配列のいずれか
に実質的に相同な配列のうちの１つ、もしくはこれらの配列のいずれかのフラグ
メントを含む本発明のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは第１の態様の
ポリヌクレオチドによってコードされるものであってもよい。配列番号２または
３に示す通常天然に生じるアミノ酸配列が好ましい。しかしながら、本発明のポ
リペプチドは天然に生じるポリペプチドの活性を有する上記天然の配列の相同体
、該天然の配列のフラグメントおよびそれらの相同体を包含する。このような活
性の１つは、本発明のポリヌクレオチドの複製に影響を与えるものであってもよ
い。特に、本発明のポリペプチドは：（ａ）配列番号２もしくは３；または（ｂ）プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイまたはその他のプロピオ
ニバクテリウム株のような放線菌由来のそれらの相同体；または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも７０％相同である蛋白質を含んでいてもよい。

【００３９】相同体はプロピオニバクテリウムにおいて天然に生じえ、配列番号２または３
のポリペプチドに実質的に類似の方法で機能できる。かかる相同体は放線菌また
はグラム陽性細菌において生じうる。

【００４０】配列番号２もしくは３の蛋白質またはそれらの相同体に対して少なくとも７０
％相同性の蛋白質またはそれらの相同体は、少なくとも２０の隣接アミノ酸の領
域、好ましくは少なくとも３０の隣接アミノ酸の領域、例えば少なくとも４０、
６０もしくは１００またはそれ以上の隣接アミノ酸の領域にわたって、好ましく
はそれらに対して少なくとも８０または９０％以上、およびさらに好ましくは少
なくとも９５％、９７％または９９％類似である。蛋白質の相同性を測定する方
法は当業者に周知であり、当業者は、この記載において、相同性はアミノ酸同一
性（「厳密な相同性」という場合がある）の基準に基いて計算されることを理解
するだろう。

【００４１】したがって、配列番号２および３ならびに相同体の蛋白質の配列を修飾して本
発明中の他のポリペプチドを与えることができる。

【００４２】例えば、１、２または３から、１０、２０または３０置換までの、アミノ酸置
換をすることができる。修飾ポリペプチドは通常その天然の活性を保持する。例
えば次の表に従って、保存的置換をすることができる。第２カラムの同じブロッ
クおよび好ましくは第３カラムの同じラインのアミノ酸は、相互に置換してもよ
い。

【００４３】

【表１】

【００４４】また、本発明のポリペプチドは上記全長ポリペプチドおよび配列番号２または
３に示す配列のフラグメントを包含する、それらの変種のフラグメントも包含す
る。かかるフラグメントは全長ポリペプチドの天然活性を保持できる。

【００４５】適当なフラグメントは、サイズにおいて少なくとも約５、例えば１０、１２、
１５または２０アミノ酸である。配列番号２および３のポリペプチドフラグメン
トならびにそれらの相同体は保存的置換を包含する１以上（例、２、３、５また
は１０）の置換、欠失または挿入を含んでもよい

【００４６】本発明のポリペプチドは実質的に単離型であってもよい。また本発明のポリペ
プチドは実質的に精製型であってもよく、それは通常、製造物中のポリペプチド
の９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％以上が本発明のポリペプチド
である製造物中のポリペプチドを含む場合である。

【００４７】本発明のポリペプチドを明示ラベルでラベルしてもよい。該明示ラベルはポリ
ペプチド検出可能にする任意の適当なラベルであってもよい。適当なラベルはラ
ジオアイソトープ（例、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ）、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよび
ビオチンのようなリンカーを包含する。

【００４８】産業上の利用この記載から明らかなように、第３の態様の宿主細胞を用いて、組換え蛋白質
を生産するのみならず、無機化学物質のような非蛋白質を包含する目的の他の化
合物、特にビタミンもまた生産することができる。したがって、本発明の第７の
態様は、化合物の生産方法、すなわち目的の化合物が生産される条件下での第３
の宿主細胞を培養または醗酵することを含む方法に関する。この化合物はポリペ
プチド、例えば第６の態様のポリペプチドであってもよいが、発現する遺伝子に
関する上記の化合物の１つであってもよい。無機化合物が遺伝子によって発現し
ないことは明らかだが、それらは酵素によって生産され、またはポリペプチドも
しくは酵素が目的の化合物の生産において宿主細胞を補助する。これらの化合物
は、細胞内で生産した後、例えば宿主細胞の溶解に続いて単離してもよく、また
はそれらが宿主細胞壁を通して、例えば水性溶液等の醗酵培地であってもよい周
囲の培地中へ出てもよい。この方法では、宿主細胞を、細胞と細胞のための栄養
素、例えば同化可能な炭素および／または窒素源、を含む水性培地中で培養する
ことができる。

【００４９】このように生産されたポリペプチドは治療上の用途を有しうる。それらは医薬
または他の薬理学上活性な化合物であってもよく、またはワクチンにおける使用
を見出せる場合、抗原性または免疫原性であってもよい。

【００５０】本発明は、さらに、組換えポリペプチドであるかどうかに関わらず、この方法
によって生産される化合物を包含する。特に企図される化合物は、ビタミンＢ₁₂ （コバラミン）のようなビタミンである。

【００５１】いくつかの場合においては、化合物を醗酵培地または宿主細胞から単離する必
要がない。該宿主細胞自体を特定の適用、例えばソーセージのような食品の製造
、またはチーズの製造において用いてもよよく、または例えば、宿主細胞が動物
によって摂取される化合物を含むような場合、宿主細胞が動物の食餌に含まれて
もよい。したがって、本発明は、チーズおよびソーセージのような食品の生産に
おける、これらの化合物または宿主細胞の使用までにわたる。また、本発明は本
発明によって製造された宿主または化合物を含む食品または動物餌も企図する。

【００５２】本発明の特に好適な具体例においては、宿主細胞をチーズ製造方法に用いるこ
とができ、したがって本発明はさらに、用いられる微生物が本発明の宿主細胞で
あるチーズ製造方法を包含する。該宿主細胞を、乳酸菌のような他の細菌に代え
て、またはこれに加えて用いてもよい。一般的にプロピオン酸菌はチーズ製造方
法、例えば中温性生物（マースダムタイプのチーズ）や好温性生物（エメンター
ル）とともに用いられる。中温性生物および好温性生物の両方がミルクやチーズ
の酸性化の原因となりうる。この方法において、本発明の宿主細胞はチーズだけ
でなく、他の醗酵乳製品（例、ヨーグルト）の生産にも用いることができる。プ
ロピオン酸菌は、乳酸および炭水化物をプロピオン酸、酢酸および二酸化炭素に
変換する能力ゆえにチーズ製造に用いられる。本発明の宿主細胞は、特にそれが
プロピオニバクテリウムである場合、ミルクのバクトフューゲーション（bactof
ugation）を減少または遺漏させうる硝酸塩および塩に対して感受性が低いので
、用いることができる。

【００５３】宿主細胞の醗酵は１または２の相または段階を有しうる。これらは、例えば増
殖相および／または生産相、または嫌気相および／または好気相でありうる。好
ましくは、増殖および／または嫌気相があり、生産相と好気相があることも適当
である（例、下記）。

【００５４】炭素および／または窒素源は、複合のソースまたは個々の化合物であってもよ
い。炭素については、グルコースであることが好ましい。窒素については、適当
なソースは酵素抽出物またはアンモニアもしくはアンモニウムイオンを包含する
。

【００５５】本発明の１態様の好適な特徴および性質は、必要な変更を加えて別の態様にと
っても好適である。

【００５６】図本発明は付属の図によって説明される：図１は本発明の範囲内のベクター、Ｐ．フロイデンライシイＬＭＧ１６５４
５（ＣＢＳ１０１０２２）由来のｐ５４５の制限酵素地図であり；および図２ａおよび２ｂは各々２つのベクターの２つの地図を含み、４ベクター全て
が本発明の範囲内である。以下に、一例として実施例を参照して本発明を説明するが、これに限定するこ
とを意味するものではない。

【００５７】実施例１プロピオニバクテリウム株のスクリーニングプロピオニバクテリウムの７５の非病原性株のコレクションを常在性プラスミ
ドの存在についてスクリーニングした。多くの株はＢＣＣＭ／ＬＭＧカルチャー
コレクション（Ghent、ベルギー）から入手したが、いくつかの株はＡＴＣＣ（R
ockville、Ｍｄ．、ＵＳＡ）またはＤＳＭ（Braunschweig、ドイツ）から入手し
た。小スケールプラスミド単離法を用いてスクリーニングを実施した。最初のバ
クテリアを嫌気的にＭＲＳ培地⁶中、４８時間、３０℃で培養した。

【００５８】ついで、元来はイー・コリ用に開発されたものを一部修飾したプラスミドＤＮ
Ａ単離法により細菌からプラスミドを精製した：５ｍｌの培養物からの細胞を２
５％スクロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８溶液で洗浄し、１０ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム（Boehringer Mannheim）を含有する２５０μｌＴＥＮＳ
（２５％スクロース＋５０ｍＭＮａＣｌ＋５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ＋５
ｍＭＥＤＴＡｐＨ８）に再懸濁し、３７℃で２０〜３０分間インキュベート
した。ついで細菌細胞を５００μｌの０．２ＮＮａＯＨ／１％ＳＤＳ中（
２〜５分間氷上でインキュベーション）で溶菌させた。４００μｌ３ＭＮ
ａＡｃｐＨ４．８の添加後（氷上5分間）、続いてフェノール／クロロホルム
で抽出し、イソプロパノールの添加によりＤＮＡを沈殿させた。

【００５９】１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析し、エチジウムブロマイドに
よって可視化した。ほとんどの株は陰性、すなわちこの分析によって常在性プラ
スミドを存在は明らかにならなかったが、陽性であることが判明した多くの株は
巨大な（≧２０ｋｂ）プラスミドを含有していた。６株で比較的小さいプラスミ
ドが観察された。これらのうち、Ｐ．ジェンセニイＬＭＧ１６４５３、Ｐ．ア
シジプロピオニシＡＴＣＣ４８７５、Ｐ．アシジプロピオニシＬＭＧ１６４
４７および非明確なプロピオニバクテリウム株（ＬＭＧ１６５５０）が６〜１０
ｋｂの範囲のサイズのプラスミドを含有していた。２株（Ｐ．フロイデンライシ
イＬＭＧ１６５４５およびＰ．フロイデンライシイＬＭＧ１６５４６）は２
プラスミドの同じプラスミド特性を示した。一方のプラスミドは大（サイズは未
測定）であり、他方は比較的小さく、より豊富に存在し、サイズは３．６ｋｂで
あった。ＬＭＧ１６５４５およびＬＭＧ１６５４６由来のこれらの３．６ｋｂプ
ラスミドを選択してさらに分析した。

【００６０】実施例２ＬＭＧ１６５４５株およびＬＭＧ１６５４６株由来の常在性プラスミドの分析
３．６ｋｂプラスミドを両株から単離し、さらにＣｓＣｌ−エチジウムブロマ
イド濃度勾配超遠心によって精製した。限定制限酵素地図を両方の調製物から作
成したところ、結局同一であった。３．６ｋｂプラスミドの制限酵素地図を図１
に示す。制限酵素とＴ４リガーゼはニューイングランドバイオラボまたはＧＩＢ
ＣＯＢＲＬから入手した。ＬＭＧ１６５４５株由来の３．６ｋｂプラスミド（以下、ｐ５４５と称する）
を放射活性ラベルし、サザンブロットハイブリダイゼーション実験に用いた。ハ
イブリダイゼーション条件は、０．２×ＳＳＣ、６５℃であった。Ｐ．アシジプ
ロピオニシＡＴＣＣ４８７５由来のプラスミドＤＮＡ抽出物、ｐＴＹ１またはｐ
ＲＧ０１⁸と称される６．６ｋｂプラスミドを含む、が反応しなかったのに対し
、ＬＭＧ１６５４５およびＬＭＧ１６５４６の両方と等しく反応し、これらの株
の密接な関係を支持した。

【００６１】アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）３７３Ａ自動シーケンサ
ーにおいて蛍光色素ラベルしたジデオキシリボヌクレオチドを用いてプラスミド
ｐ５４５のＤＮＡ配列を決定し、配列リストに配列番号１として記載した。Ｅｃ
ｏＲＩで直線化し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｃｒｉｐｔＳＫII＋ＤＮＡ
（Stratagene, La Jolla, Ca., USA）に挿入したプラスミドＤＮＡにおいて配列
分析を実施した。このようにしてＢＬＡＳＴサーチ¹を用いて得られた配列のコ
ンピューター補助分析により、数個のＧＣリッチ生物由来のプラスミドの複製に
関与する蛋白質に対する相同性を明らかにした（例えば、Mycobacterium fortui
tum由来のpAL5000がコードするrepAおよびrepBは、プラスミドｐ５４５からの各
推定複製蛋白質と２８〜３０％の相同性と３４〜３８％の類似性を示した；Cory
nebacterium glutamicum [PIR 受領番号Ｓ32701]由来のpXZ10142はｐ５４５推定
複製蛋白質に対して相同性複製蛋白質をコードするもう１つのプラスミドの例で
ある）。相同性配列を用いたデータベース比較のこれらの結果を実施例７および
８に詳細に示す。

【００６２】実施例３イー・コリ／プロピオニバクテリウムシャトルベクターの構築イー・コリプラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩで消化し、
このようにして生じた比較的小さいフラグメント（測定１．４ｋｂおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む）を合成二本鎖ＤＮＡで置換した。該合成二本鎖Ｄ
ＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩ末端と結合し、多数の特有の制限酵素認識部
位を与えるようにデザインした。

【００６３】 5' - AATTCAAGCTTGTCGACGTTAACCTGCAGGCATGCGGATCCGGTACCGATATCAGATCT - 3'（
配列番号４） 3' - GTTCGAACAGCTGCAATTGGACGTCCGTACGCCTAGGCCATGGCTATAGTCTAGAAGCC - 5'（
配列番号５）

【００６４】この方法で、下記の制限酵素認識部位を与えた：ＥｃｏＲＩ（回復）、ＨｉｎｄIII、ＳａｃＩ、ＨｐａＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ
、ＢａｍＨＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌII（ＡｖａＩは回復せず
）

【００６５】この合成ＤＮＡを巨大フラグメントに連結し、ライゲーション混合物をイー・
コリにトランスフェクトして戻した（Ｔ４リガーゼを用いた）。目的の構成のプ
ラスミドが得られた（ｐＢＲ３２２ΔＩ）。マルチプルクローニングサイトを用
いて選択マーカーをプラスミドｐ５４５ＤＮＡと同様に導入できる。

【００６６】一例として、エリスロマイシン耐性を与えるイー・コリ／プロピオン酸シャト
ルベクターの構築をここに記載のように実施した。

【００６７】サッカロポリスポラ・エリスリアエアＮＲＲＬ２３３８エリスロマイシン生合
成クラスターに由来しエリスロマイシン抵抗性を与える遺伝子を含む１．７ｋｂ
Ａｃｃ６５ＩフラグメントをＡｃｃ６５Ｉ直線化ｐＢＲ３２２ΔＩに挿入した
。ついで、新たに誘導した構築物、ｐＢＲＥＳと称する、をＥｃｏＲＶを用いて
直線化し、ＢｓａＢＩで消化したｐ５４５ＤＮＡに連結した。イー・コリ形質転
換体は、双方向で正しい挿入を有するベクターを含むことが分かった。結果とし
て得られたプラスミドベクターをｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ１およびｐＢＲＥＳＰ３６
Ｂ２（図２ａおよび２ｂ）。

【００６８】推定複製領域の外側に定めた他の制限酵素部位、すなわちＡｌｗＮＩにおける
ｐ５４５ＤＮＡ直線化によってプラスミドベクター構築物も得た。この構築のた
め、ｐＢＲＥＳベクターに適当なクローニング部位を与えなければならなかった
。次の構成の２つの相補的オリゴヌクレオチドからなるアダプターをデザインし
た（配列番号６および７）： 5' GTACCGGCCGCTGCGGCCAAGCTT 3' 5' GATCAAGCTTGGCCGCAGCGGCCG 3'

【００６９】これらのオリゴ体のアニーリングにより、各Ａｃｃ６５ＩおよびＢｇｌII粘着
末端を有する２本鎖ＤＮＡフラグメントを作成した。これはさらに、ＡｌｗＮＩ
消化ｐ５４５プラスミドと両立する内部ＳｆｉＩ制限酵素切断部位を含む。この
アダプターをｐＢＲＥＳのＢｇｌIIおよび近接のＡｃｃ６５Ｉ部位間にクローニ
ングした。このようにして得られたｐＢＲＥＳ−Ｓｆｉベクターを、続いてＳｆ
ｉＩで消化し、ＡｌｗＮＩ消化ｐ５４５に連結した。イー・コリの形質転換によ
り、正しいベクターを有する形質転換体が得られ、これは制限酵素分析によって
確認された。得られたベクターをｐＢＲＥＳＰ３６Ａと称する（図２）。

【００７０】実施例４イー・コリ／プロピオニバクテリウムシャトルベクターを用いたプロピオニバ
クテリウムの形質転換ｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ１を用いたプロピオニバクテリウムフロイデンライシイ
ＡＴＣＣ６２０７株の形質転換を記載する。ＳＬＢ（乳酸ナトリウムブロス¹⁷、３０℃、定常期まで、続いて新鮮なＳＬＢ
で１：５０希釈）中で細菌細胞を培養した。３０℃で約２０時間インキュベーシ
ョン後、細胞（この時点では対数増殖期）を採集し、冷０．５Ｍスクロースで十
分に洗浄した。続いて、０．５Ｍスクロースを含み、１ｍＭ酢酸カリウムで緩衝
した電気泳動緩衝液ｐＨ５．５で１回洗浄し、最終的にこの電気泳動緩衝液中
に元の培養容量の１／１００で再懸濁した。全作業中細胞を氷上に保持した。エレクトロポレーション（ＢＩＯＲＡＤから入手した装置）用に、冷却した１
または２ｍｍエレクトロポレーションキュベット中で８０〜１００μｌの細胞懸
濁液を±１μｇのＤＮＡ（または、より少量）と混合し、電気パルスを与えた。
最適なパルス条件は２００Ω抵抗および２５μＦ容量で２５ｋＶ／ｃｍであるこ
とが分った。しかし、より低い、および高い電圧（１００Ωでも）でも形質転換
体が得られる。

【００７１】パルスの直後、０．５Ｍスクロースを含有する９００μｌの冷ＳＬＢを、パル
スを加えた細胞懸濁液に添加し、続いてこれらを２．５〜３時間、３０℃でイン
キュベーションした後、０．５Ｍスクロースを含有するＳＬＢ／寒天プレートに
適当な希釈物を蒔いた。嫌気性条件下、３０℃で５〜７日のインキュベーション
期間の後、形質転換体が見られた。

【００７２】イー・コリＤＨ５(Promega)から単離したＤＮＡは、μｇＤＮＡあたり２０〜
３０形質転換体の形質転換効率を与えた。ＤＮＡをイー・コリＪＭ１１０（ｄａ
ｍ^-，ｄｃｍ^-株）から単離した場合、１０〜１００倍高い効率が得られた。ＢＩ
ＯＲＡＤの説明書に従ってイー・コリ形質転換を行った。形質転換体は、ＡＴＣＣ６２０７形質転換体について用いられた元のプラスミ
ドＤＮＡと区別できない、信頼性の高いベクターを含有した。このことは、上記
の小スケールプラスミドＤＮＡ単離法によって形質転換体から単離されたプラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によって示された。

【００７３】ベクターは専ら自律複製プラスミドとして示される。全ＤＮＡ単離物を用いた
サザンブロットハイブリダイゼーション¹³は、染色体ＤＮＡがプローブとして用
いたベクターＤＮＡにハイブリダイズしないことを示し、プラスミドＤＮＡの染
色体組込みが起こっていないことを示した。

【００７４】ベクターｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ２およびｐＢＲＥＳＰ３６Ａを用いた形質転換も
成功し、ベクターの機能性はｐ５４５の方向または用いるクローニングサイドに
依存しないことを示した。この場合もベクターの信頼性を確認した。

【００７５】さらに、プロピオニバクテリウム形質転換体から単離したＤＮＡを用いたＰ．
フロイデンライシイＡＴＣＣ６２０７株の形質転換体では、イー・コリＤＨ５か
ら単離したＤＮＡを用いて得られたものと比較して１０⁵〜１０⁶倍大きな形質転
換効率であった。

【００７６】別のＰ．フロイデンライシイの株、ＬＭＧ１６５４５（ｐ５４５プラスミドを
得た株と同じ株）は、ＡＴＣＣ株に匹敵する形質転換効率を与えた。

【００７７】形質転換の結果およびビタミンＢ₁₂生産における影響を、次の表に示す。１０の形質転換体のうち８つが対照株よりも５０％高いビタミンＢ₁₂含量を与
えた。

【００７８】

【表２】

【００７９】実施例５ｃｏｂＡ遺伝子含有プラスミドベクターの構築Ｐ．フロイデンライシイATCC6207株におけるビタミンＢ₁₂（コバラミン）合成
レベルの増加のためのプラスミドベクターの構築および適用サッカロポリスポラ・エリスリアエア^2,3におけるエリスロマイシン耐性を与
える遺伝子のプロモーター領域を次のプライマー（配列番号８および９）を用い
てＰＣＲで生産した。

【００８０】正方向プライマー：（５’−３’） AAACTGCAGCTGCTGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC 逆方向プライマー：（５’−３’） AAACTGCAGCAGCTGGGCAGGCCGCTGGACGGCCTGCCCTCGAGCTCGTCTAGAATGTGCTGCCGATCCTGG
TTGC

【００８１】したがって、生産されたＰＣＲフラグメントは推定プロモーター領域とエリス
ロマイシン耐性遺伝子のコード領域の最初の１９アミノ酸５’末端ＡｌｗＮＩ部
位を含み、正しい転写と翻訳を確実にする。３’末端にＸｂａＩおよびＸｈｏＩ
部位が与えられ（後の段階のｃｏｂＡ遺伝子の挿入のため）、終止配列はエリス
ロマイシン耐性遺伝子およびＡｌｗＮＩの下流にある。

【００８２】ＰＣＲ産物をＡｌｗＮＩによって消化し、ｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ２に連結し、Ａ
ｌｗＮＩで部分消化した。ｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ２に存在する２つのＡｌｗＮＩ部
位のうち、ベクターのｐ５４５特異的部分に存在する一方のみが上記フラグメン
トに対応する。目的の構成を含むイー・コリ形質転換体が得られ、これをｐＢＲ
ＥＳ３６ｐＥｔと称する。このベクターを下記のさらなる構築に用いた。

【００８３】ｃｏｂＡのコード配列、ウロポルフィリノーゲン（uroporphyrinogen）IIIメ
チルトランスフェラーゼを、次のプライマー（配列番号１０および１１）を用い
るＰＣＲによってプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイATCC6207株から
生産した。正方向: (5'- 3') CTAGTCTAGACACCGATGAGGAAACCCGATGA 逆方向: (5'- 3') CCCAAGCTTCTCGAGTCAGTGGTCGCTGGGCGCGCG

【００８４】したがって、増幅したｃｏｂＡ遺伝子はＮ末端コード領域にＸｂａＩ部位を有
し、Ｃ末端コード領域にＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩ部位を有する。このｃｏｂＡ遺伝子の機能性をｐＵＣ１８中のＸｂａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグ
メントとしてのＰＣＲ産物のクローニングおよびその後のイー・コリＪＭ１０９
株の形質転換によって確認した。機能性のｃｏｂＡ遺伝子を有する形質転換体は
ＵＶ光で照らした場合、明るい赤の蛍光を示す。かかる形質転換体から単離した
プラスミドＤＮＡをＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に消化したｐＢＲＥ
ＳＰ３６Ｂ₂に連結した。数個の形質転換体からのＤＮＡおよびイー・コリの形
質転換体に用いられたＤＮＡを、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって分析
した。形質転換体は発現ベクター中に正しい挿入を有することが分った。この新
たなベクターをｐＢＲＥＳ３６ＣＯＢと称する。つづいて、このベクターを上記
の方法に従ってＰ．フロイデンライシイＡＴＣＣ６２０７にトランスフェクトし
た。得られた形質転換体のうちの１０個を分析し、制限酵素消化の分析によって
示されるように、今回も形質転換に用いられた元のベクターから区別できないｐ
ＢＲＥＳ３６ＣＯＢを有することが分った。これらの１０個の形質転換体におい
て、ビタミンＢ₁₂合成レベルを以下のように測定した。

【００８５】プロピオン酸形質転換体１〜１０の凍結培養物、およびベクタープラスミドｐ
ＢＲＥＳＰ３６Ｂ₂のみを有する対照株を５０ｍｌのＢＨＩ（Brain Heart Infus
ion）培地（Difco）が入った１００ｍｌフラスコ中に接種し、振盪せずに２８℃
で７２時間インキュベートした。該前培養物４ｍｌを５００ｍｌ振盪フラスコ中
のディフコ（Difco）酵素抽出物１５ｇ／ｌ、ナラクテート（Nalactate）３
０ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ₄ ０．０１ｇ／ｌ、およびＣ
ｏＣｌ₂ ０．００５ｇ／ｌからなる生産培地２００ｍｌに移し、振盪せずに２
８℃で５６時間インキュベートし、つづいて４８時間、ニューブランスウィック
（New Brunswick）ロータリーシェーカーで２００ｒｐｍにした。

【００８６】ビタミンＢ₁₂力価を既知のＨＰＬＣ法⁵を用いて測定した。１０の形質転換体
のうち９個が対照株よりも約２５％高いビタミンＢ₁₂を示した。

【００８７】実施例６プラスミドの安定性３つのシャトルベクターｐＢＲＥＳＰ３６Ａ、ｐＢＲＥＳＰ３６Ｂ１およびｐ
ＢＲＥＳＰ３６Ｂ２すべてが、各形質転換体の培養の３０世代にわたって安定に
維持された：選択（エリスロマイシン含有）寒天培地および非選択寒天培地にお
ける生存数によって測定されるように、エリスロマイシン耐性の欠落がないこと
が観察された。上記のようにプラスミドＤＮＡ単離と制限酵素マッピングによる
特徴付けによって３０世代後の形質転換体集団におけるプラスミドの構造的安定
性を立証した：基準プラスミドのものと類似の制限フラグメントのみが観察され
た。

【００８８】実施例７第１のオープンリーディングフレームによってコードされる予測ポリペプチド
についてのデータベース配列相同性分析（配列番号２）

【００８９】 MDSFETLFPESWLPRKPLASAEKSGAYRHVTRQRALELPYIEANPLVMQSLVITDRDASDADWAADLAGLPS
PSYVSMNRVTTTGHIVYALKNPVCLTDAARRRPINLLARVEQGLCDVLGGDASYGHRITKNPLSTAHATLWG
PADALYELRALAHTLDEIHALPEAGNPRRNVTRSTVGRNVTLFDTTRMWAYRAVRHSWGGPVAEWEHTVFEH
IHLLNETIIAD

【００９０】上記２２７アミノ酸配列（ＯＲＦ１）を数個の他の蛋白質配列と並べて比較し
た（ターゲット NBRF-PIR, リリース PIR R52.0 1997年３月, カットオフ 45, K
TUP:2）。マイコバクテリウム・ホルツイタム（Mycobacterium fortuitum）プラスミド
ｐＡＬ５，０００（JS0052）由来の蛋白質と、１９４アミノ酸にわたって３
７．１％の一致が見出された（INIT 167,292）。コリネバクテリウム・グルタミ
カム（Corynebacterium glutamicum）（S32701）由来の蛋白質と、１２５アミノ
酸にわたって、３２．０％の一致が見出された(INIT 125, 116)。また、イー・
コリ（SO4455）由来のＣｏｌＥ２蛋白質と、２２１アミノ酸にわたって２９．９
％の一致が見出された。イー・コリ（SO4456）ＣｏｌＥ３蛋白質については、正
確に同数のアミノ酸に渡って同じ一致が見出された。

【００９１】実施例８第２のオープンリーディングフレームによってコードされる予測ポリペプチド
についてのデータベース配列相同性分析（配列番号３）

【００９２】 MTTRERLPRN GYSIAAAAKK LGVSESTVKR WTSEPREEFV ARVAARHARI RELRSEGQSM RAIAAEVGVS VGTVHYALNK NRTDA

【００９３】第２の蛋白質（ＯＲＦ２）もまた、実施例７と同じパラメーターとソフトウエ
アを用い、別の蛋白質と並べて比較した。しかし、この配列は８５アミノ酸の長
さしかない。ＯＲＦ２配列をマイコバクテリウムホルツイタム（S32702）由来の蛋白質と
比較し、７５アミノ酸にわたって５３．３の一致を見出した（INIT 207,207）

【００９４】実施例９プラスミドｐ５４５の機能分析ベクター系をさらに改良するために、元のプラスミドｐ５４５の大きな領域の
欠失を通じて複製と安定性にとって必須のプラスミド機能をより詳細に線引きし
た。その結果物である、より小さなクローニングベクターが、より大きなＤＮＡ
フラグメントのクローニングのためのｐ５４５に基いたベクター系の使用を可能
にするだろう。

【００９５】この目的のため、ベクターｐＢＲＥＳＰ３６Ａ（図２）をＳｓｔIIおよびＢｃ
ｌＩで消化し、１．７ｋｂおよび６．５ｋｂのフラグメントを生じさせた。該１
．７ｋｂフラグメント、実際にはプラスミドｐ５４５の１．６ｋｂＡｌｗＮＩ
−ＢｃｌＩフラグメントを、ＳｓｔIIおよびＢｃｌＩの両立末端ならびに多数の
特徴的な制限酵素認識部位を有する配列番号１２および１３を有する合成二本鎖
ＤＮＡによって置換した。

【００９６】配列番号１２ 5' GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG 3' 配列番号１３ 5' GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC 3'

【００９７】この方法で次の制限酵素認識部位を与えた：ＳｓｔII（回復）、ＢｇｌII、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩ、
（ＢｃｌＩは回復せず）。ライゲーション混合物をイー・コリにトランスフェク
トし、目的の構成のベクターを含有する形質転換体を選択した。該ベクターをｐ
ＢＲＥＳＡΔＳ−Ｂと称する。その後の、このベクターを有するＰ．フロイデン
ライシイＡＴＣＣ６２０７株の形質転換の成功は、ｐ５４５のＡｌｗＮＩおよび
ＢｃｌＩ間の１．６ｋｂ領域がプラスミドの複製に必須ではないことを示した。

【００９８】プラスミドｐ５４５のＳａｌＩおよびＢｃｌＩ間の領域に対応する２４０ｂｐ
の除去によってさらなる欠失体を作成した。これはｐＢＲＥＳＡΔＳ−Ｂの各々
ＳａｌＩ−ＳｓｔＩおよびＳｓｔＩ−ＸｈｏＩの消化、および１．３ｋｂＳａ
ｌＩ−ＳｓｔＩフラグメントおよび６．６ｋｂＳｓｔＩ−ＸｈｏＩフラグメン
トの単離によって行った。該フラグメントを連結し、ライゲーション混合物をＰ
．フロイデンライシイＡＴＣＣ６２０７にトランスフェクトして多数の形質転換
体を得た。新たに誘導した構築物を、ｐＢＲＥＳＡΔＳ−Ｓと称し、単離してそ
の構造を制限酵素マッピングにより確認した。

【００９９】したがって、プラスミドｐ５４５の複製に必須の全情報は、制限部位ＳａｌＩ
およびＡｌｗＮＩによって区切られる１．７ｋｂフラグメントに位置し、ＯＲＦ
１およびＯＲＦ２によってコードされる予測複製蛋白質を含み、１．８ｋｂがプ
ラスミドの複製または安定性を明らかに妨げることなく欠失を受けられるもので
ある。

【０１００】実施例１０コリネバクテリウム（Corynebacterium.）由来のクロラムフェニコール耐性遺
伝子の発現コリネバクテリウム¹⁸由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（cml）はクロ
ラムフェニコール搬出蛋白質をコードするものとして同定されている。この遺伝
子をプロピオニバクテリウム−イー・コリシャトルベクターｐＢＲＥＳＰ３６
Ｂ２に挿入した。このベクターを各々ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII、ならびにＢ
ｇｌIIおよびＨｐａＩで消化した。２．９ｋｂＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIフラグ
メントおよび５．２ｋｂＢｇｌII−ＨｐａＩフラグメントを単離した。ＰｖｕIIおよびＨｉｎｄIIIを用いた消化によって、ｃｍｌ遺伝子、それ自身
のプロモーターを含む、を含有するフラグメントを得、および該遺伝子を含有す
る３．３ｋｂフラグメントを単離した。２つのベクター−特異的フラグメントお
よびｃｍｌフラグメントを連結した：ＰｖｕIIおよびＨｐａＩ末端は平滑であり
、したがってｃｍｌ遺伝子を挿入し、親ベクターのｅｒｍＥ遺伝子を回復させた
。ライゲーション混合物をイー・コリにトランスフェクトし、および正しいｃｍ
ｌ挿入を含むベクターを有する形質転換体を選択した。該ベクターをｐＢＲＥＳ
ＢＣＭと称する。

【０１０１】このベクターを用いたＰ．フロイデンライシイＡＴＣＣ６２０７の形質転換
、および１０μｇ／ｍｌエリスロマイシンまたは５μｇ／ｍｌクロラムフェ
ニコールを含むプレート上での選択により、各々、エリスロマイシンおよびクロ
ラムフェニコール耐性コロニーを得て、エリスロマイシン耐性遺伝子（先にプロ
ピオニバクテリウム−イー・コリシャトルベクターを用いて示した）とは別に
クロラムフェニコール耐性遺伝子もプロピオニバクテリウムで発現されることを
示した。形質転換体は、２０μｇ／ｍｌまでのクロラムフェニコールを含有する
液体培地中で培養できた。

【０１０２】実施例１１Ｐ．アクネス（P. acnes）由来のリパーゼ(gehA)遺伝子の発現本ベクター系を用いる細胞外蛋白質の有効なクローニングおよび発現を説明す
るために、Ｐ．アクネス由来のリパーゼ遺伝子ｇｅｈＡを用いた。ＸｈｏＩフラ
グメント上にｇｅｈＡを有するベクターｐＵＬ６００１をＸｈｏＩで消化し、該
遺伝子を含む２．７５ｋｂフラグメントを単離した。ベクターｐＢＲＥＳＡΔＳ
−Ｂ（実施例９より）をＸｈｏＩで直線化し、ウシ腸ホスファターゼを用いてそ
の末端を脱リン酸化し、セルフライゲーションを防いだ。直線化したベクターお
よびフラグメントを含むｇｅｈＡを連結し、ライゲーション混合物をイー・コリ
へトランスフェクトした。ｐＢＲＥＳＡＬＩＰと称する正しい組換えプラスミド
の存在について制限酵素分析によって形質転換体を分析した。続いて、このプラ
スミドをＰ．フロイデンライシイＡＴＣＣ６２０７株にトランスフェクトした。
リパーゼ発現の増加の指示薬としてトリブチリン（tributyrin）を含有する寒天
プレートを用いて、リパーゼ遺伝子の発現について形質転換体をスクリーニング
した。ｐＢＲＥＳＡＬＩＰを含むＰ．フロイデンライシイ形質転換体は、このア
ッセイにおいて、非形質転換株または親ベクターで形質転換した株と比較してハ
ローの大きさの有意な増加を示した。

【０１０３】引用文献 1. Altschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) 2. Bibbら、Gene 38, 215 (1985) 3. Bibbら、Mol. Microbiol. 14(3), 533 (1984) 4. BirnboimおよびDoly, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979) 5. Blanche, Anal. Biochem. 189, 24 (1990) 6. DeManら、J. Appl. Bacteriol. 36, 130 (1960) 7. Deverauxら、Nucleic Acids Research. 12:387-395 (1984) 8. Labidiら、Plasmid 27, 130 (1992) 9. Rehberger and Glatz, Appl.Environ. Microbiol. 59, 83 (1990) 10. Rossiら、Res. Microbiol. 147, 133 (1996) 11. Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (
1989) 12. Sattlerら、J. Bact. 177, 1564 (1995) 13. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975) 14. StoltおよびStoker, Microbiol. 142, 2795 (1996) 15. Thompsonら、Gene 20, 51 (1982) 16. UchijamaおよびWeisblum, Gene 38, 103 (1985) 17. de Vriesら、J. Gen. Microbiol. 71, 515 (1972) 18. Tauchら、Plasmid 40(2): 126 (1998) 19. Miskinら、Microbiol 143: 1745 (1997)

【０１０４】配列の概要 1. プラスミド LMG 16545 (CBS 101022)のDNA配列, 3.6 kb。 2. ORF1の蛋白質のアミノ酸 (303 残基、塩基 273-1184)。 3. ORF2の蛋白質のアミノ酸 (85 残基、塩基 1181-1438)。 4-13. DNA プライマー/オリゴヌクレオチド

【０１０５】

【配列表】

配列表 (1) 一般的情報: (i) 出願人: (A) 名称: Gist-brocades B.V. (B) 通り: Wateringseweg 1 (C) 市: Delft (E) 国: オランダ (F) 郵便番号 (ZIP): 2611 XT (ii) 発明の名称: プロピオニバクテリウムベクター (iii) 配列の数: 13 (iv) コンピューターの読み取り形式: (A) メディアのタイプ: フロッピーディスク (B) コンピューター: IBM PC 互換 (C) オペレーティングシステム: PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウエア: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

【０１０６】 (2) 配列番号1についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 3555 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 二本鎖 (D) トポロジー: 環状 (ii) 分子型: DNA (ゲノム) (iii) 推測: 否 (iii) アンチセンス: 否 (vi) 元のソース: (A) 生物: プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ (C) 個々の単離体: CBS101022 LMG16545 (ix) 特徴: (A) 名称/キー: CDS (B) 位置: 273..1184 (D) 他の情報: /遺伝子= "ORF1" (ix) 特徴: (A) 名称／キー: CDS (B) 位置: 1181..1438 (D) 他の情報: /遺伝子= "ORF2" (xi) 配列の記載: 配列番号: 1: GTCGACCCTG ACAGCCGGCG AGCAGTTCAG GCGAAGATCG CACAGCTGCG CGAGGAACTA 60 GCCGCAATGC CCGAACACGC CCCAGCCATC CCTTGGAGCA GGTGGCAGCG TCAGGGGAGT 120 CGGGGGATGT TTGGCAGGGG ATGTGGAAAG AGAGTTCGCT TTGCTCACAT GGCTCAACCG 180 GGTAACTAAC TGATATGGGG TCTTCGTCGC CCACTTTGAA CACGCCGAGG AATGGACCAC 240 GCTGAACGTG ACTCGCATGC TTCACTGCAT GT ATG GAT TCG TTC GAG ACG TTG 293 Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu 1 5 TTC CCT GAG AGC TGG CTG CCA CGC AAG CCG CTG GCG TCA GCC GAG AAG 341 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys 10 15 20 TCT GGG GCG TAC CGG CAC GTG ACT CGG CAG AGG GCG CTG GAG CTG CCT 389 Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro 25 30 35 TAC ATC GAA GCG AAC CCG TTG GTC ATG CAG TCC TTG GTC ATC ACC GAT 437 Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp 40 45 50 55 CGA GAT GCT TCG GAT GCT GAC TGG GCC GCA GAC CTC GCT GGG CTG CCT 485 Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro 60 65 70 TCA CCG TCC TAC GTG TCC ATG AAC CGT GTC ACG ACC ACC GGA CAC ATC 533 Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg Val Thr Thr Thr Gly His Ile 75 80 85 GTC TAT GCC TTG AAG AAC CCT GTG TGT CTG ACC GAT GCC GCG CGG CGA 581 Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg 90 95 100 CGG CCT ATC AAC CTG CTC GCC CGC GTC GAG CAG GGC CTA TGC GAC GTT 629 Arg Pro Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val Glu Gln Gly Leu Cys Asp Val 105 110 115 CTC GGC GGC GAT GCA TCC TAC GGG CAC CGG ATC ACA AAG AAC CCG CTC 677 Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu 120 125 130 135 AGC ACC GCC CAT GCG ACC CTC TGG GGC CCC GCA GAC GCG CTC TAC GAG 725 Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu 140 145 150 CTG CGC GCC CTC GCA CAC ACC CTC GAC GAG ATC CAC GCA CTG CCG GAG 773 Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp Glu Ile His Ala Leu Pro Glu 155 160 165 GCA GGG AAC CCG CGT CGC AAC GTC ACC CGA TCA ACG GTC GGC CGC AAC 821 Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn 170 175 180 GTC ACC CTG TTC GAC ACC ACC CGC ATG TGG GCA TAC CGG GCC GTC CGG 869 Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg 185 190 195 CAC TCC TGG GGC GGC CCG GTC GCC GAA TGG GAG CAC ACC GTA TTC GAG 917 His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu Trp Glu His Thr Val Phe Glu 200 205 210 215 CAC ATC CAC CTA CTG AAC GAG ACG ATC ATC GCC GAC GAA TTC GCC ACA 965 His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr 220 225 230 GGC CCC CTC GGC TTG AAC GAA CTT AAG CAC TTA TCT CGA TCC ATT TCC 1013 Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys His Leu Ser Arg Ser Ile Ser 235 240 245 CGA TGG GTC TGG CGC AAC TTC ACC CCC GAA ACC TTC CGC GCA CGC CAG 1061 Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gln 250 255 260 AAA GCG ATC AGC CTC CGT GGA GCA TCC AAA GGC GGC AAA GAA GGC GGC 1109 Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly 265 270 275 CAC AAA GGC GGC ATT GCC AGT GGC GCA TCA CGG CGC GCC CAT ACC CGT 1157 His Lys Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala Ser Arg Arg Ala His Thr Arg 280 285 290 295 CAA CAG TTC TTG GAG GGT CTC TCA TGACCACACG TGAACGTCTC CCCCGCAACG 1211 Gln Gln Phe Leu Glu Gly Leu Ser 300 GCTACAGCAT CGCCGCTGCT GCGAAAAAGC TCGGTGTCTC CGAGTCCACC GTCAAGCGGT 1271 GGACTTCCGA GCCACGCGAG GAGTTCGTGG CCCGCGTTGC CGCACGCCAC GCGCGGATTC 1331 GTGAGCTCCG CTCGGAGGGT CAGAGCATGC GTGCGATTGC TGCCGAGGTC GGGGTTTCCG 1391 TGGGCACCGT GCACTACGCG CTGAACAAGA ATCGAACTGA CGCATGACCG TAACGCCGCA 1451 CGATGAGCAT TTTCTTGATC GTGCACCGCT TGGCACTACG TTCGCGTGCG GTTGCACAGT 1511 GCGCGCCACG TTCTTATCCT GCGGCCATTG TGGCTACAGC CAATGGGGGG CATCAGCAAC 1571 GGACGTTGAA CCCGGTGGGC AAGTGTTACT CAGGGGGACA TGCCCAGTCT GCGGCGCTCG 1631 GATTGACGGT ATGGCAGTCG TGCATGCGGC CCCACCGTCA AACTCATTCA GGTATCAGTG 1691 AGAACCCTCA TGGCACCCCC TCGTGACACG TTCTCGTTGC GATCAGCTGC TGTGCGTGCG 1751 GGCGTGAGCG TTTCTACGCT GCGGCGCAGG AAATCAGAGC TTGAGGCTGC CGGAGCGACG 1811 GTAGACCCGT CCGGTTGGGT GGTGCCACTG CGTGCACTCA AGGTCGTTTT TGGGGTGTCA 1871 GATGAGACCT CGAATGCGCC CGGTCATGAC GCTGAGTTAG TGGCGCAGCT GCGCTCTGAG 1931 AACGAGTTTT TACGGCGTCA GGTCGAGCAG CAGGCGCGCA CGATCGAACG GCAGGCTGAG 1991 GCACACGCGG TGGTCTCAGC GCAGCTCACA CGGGTTGGCC AGCTTGAGGC CGGCGACGCA 2051 GCAGCACCGA CACTGGCACC CGTTGAAAGG CCGGCTCCGC GACGGCGGTG GTGGCAGCGT 2111 CGGTAGCGGT CAGGATCGCT CTGGCGTGAC GAGTGTGTCT GGCAGTGCGA ACAGTTGCTC 2171 GACCAGTGGC AGCAGAAGCG AGATCGCTGC GTGGTGCTGT TCCTCGGTCA GTTCGTCGAG 2231 GACTGGCGGG TCTTGCTGCG TCCAGCCGAT CGCCTCGGCG GCCAAGGTCA GTTCCAAGCT 2291 GTGCCAACGC ACACGCCCCT CGGCTGACAG CTGAGTCTCG AACTGTGCAA CTGGACCGGC 2351 CGGAAGATGC ACGTTGCCGA GGTCGTGAGT GGCCAAGCGC ACGTCAAAGA GTGCTGCTTC 2411 GTAGCCGCGC AGAAATGGCA GTGCTCGGTC GATTCGGATC GGCCTGCCCA GGTACATTCC 2471 GGGCCGCTTG ATGAACGCCT CCGCGTAGAA GCGCACCGTT CTCGGCCCGG CCTCGTGATC 2531 TGTCACTGTG CACGCTCCTC TCGATGGTTC TCGACGCTAC CGGAGACCAC CGACGTTCAT 2591 GCCCAGCGCA GCGACCTGAA AGGACCAAGC CGAGTTAGCC GTGCTAACCG TATAGCTTGC 2651 TCCGTCGCCT CTGAGGGCAA CCACCTGCGC AGCAGGTGGG CGGCAGCCCG CGCGCAAGCG 2711 CCTACCGGGT TTGGGCACAG CCCATAAATC AACGCCTCCG GTGTTGAAGC GATCGTGTGT 2771 CACGATTGCT ATGCTTGCTA CCCCTTCAGG GTTTTCGTAT ACACAAATCA AGTTTTTTCG 2831 TATACGCTAA TGCCATGAGT GAGCATCTAC TGCACGGCAA GCCCGTCACC AACGAGCAGA 2891 TTCAGGCATG GGCAGACGAG GCCGAGGCCG GATACGACCT GCCCAAACTC CCCAAGCCAC 2951 GGCGCGGACG CCCGCCCGTA GGAGACGGTC CGGGCACCGT CGTACCCGTG CGTCTCGACG 3011 CGGCCACCGT TGCCGCTCTC ACAGAACGAG CAACAGCCGA GGGCATCACG AACCGTTCAG 3071 ACGCGATCCG AGCCGCAGTC CACGAGTGGA CACGGGTTGC CTGACCTCCA CGACTCAGCA 3131 CGCAAGCACT ACCAACGAGA CCGGCTCGAC GACACGGCCG TGCTCTACGC GGCCACCCAC 3191 GTTCTCAACT CCCGGCCACT CGACGACGAA GACGACCCGC GCCGCTGGCT CATGATCGGA 3251 ACCGACCCAG CAGGCCGCCT ACTCGAACTC GTCGCACTGA TCTACGACGA CGGCTACGAA 3311 CTGATCATCC ACGCAATGAA AGCCCGCACC CAATACCTCG ACCAGCTCTA ACCAAGAAAG 3371 GAACCTGATG AGCGACCAGC TAGACAGCGA CCGCAACTAC GACCCGATGA TCTTCGACGT 3431 GATGCGCGAG ACCGCGAACC GCGTCGTCGC CACGTACGTT GCATGGGAAG ATGAAGCCGC 3491 TGATCCCCGC GAGGCTGCGC ACTGGCAGGC CGAGCGATTC CGCACCCGGC ACGAGGTGCG 3551 CGCC 3555

【０１０７】 (2) 配列番号2についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 303 アミノ酸 (B) タイプ: アミノ酸 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: 蛋白質 (xi) 配列の記載: 配列番号: 2: Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met 35 40 45 Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala 50 55 60 Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg 65 70 75 80 Val Thr Thr Thr Gly His Ile Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys 85 90 95 Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val 100 105 110 Glu Gln Gly Leu Cys Asp Val Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His 115 120 125 Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly 130 135 140 Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp 145 150 155 160 Glu Ile His Ala Leu Pro Glu Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr 165 170 175 Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met 180 185 190 Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu 195 200 205 Trp Glu His Thr Val Phe Glu His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile 210 215 220 Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys 225 230 235 240 His Leu Ser Arg Ser Ile Ser Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro 245 250 255 Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gln Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser 260 265 270 Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly His Lys Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala 275 280 285 Ser Arg Arg Ala His Thr Arg Gln Gln Phe Leu Glu Gly Leu Ser 290 295 300

【０１０８】 (2) 配列番号3についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 85 アミノ酸 (B) タイプ: アミノ酸 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: 蛋白質 (xi) 配列の記載: 配列番号: 3: Met Thr Thr Arg Glu Arg Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Ser Ile Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Lys Leu Gly Val Ser Glu Ser Thr Val Lys Arg Trp Thr 20 25 30 Ser Glu Pro Arg Glu Glu Phe Val Ala Arg Val Ala Ala Arg His Ala 35 40 45 Arg Ile Arg Glu Leu Arg Ser Glu Gly Gln Ser Met Arg Ala Ile Ala 50 55 60 Ala Glu Val Gly Val Ser Val Gly Thr Val His Tyr Ala Leu Asn Lys 65 70 75 80 Asn Arg Thr Asp Ala 85

【０１０９】 (2) 配列番号4についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 59 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 4: AATTCAAGCT TGTCGACGTT AACCTGCAGG CATGCGGATC CGGTACCGAT ATCAGATCT 59

【０１１０】 (2) 配列番号5についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 59 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 5: CCGAAGATCT GATATCGGTA CCGGATCCGC ATGCCTGCAG GTTAACGTCG ACAAGCTTG 59

【０１１１】 (2) 配列番号6についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 6: GTACCGGCCG CTGCGGCCAA GCTT 24

【０１１２】 (2) 配列番号7についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 7: GATCAAGCTT GGCCGCAGCG GCCG 24

【０１１３】 (2) 配列番号8についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 35 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 8: AAACTGCAGC TGCTGGCTTG CGCCCGATGC TAGTC 35

【０１１４】 (2) 配列番号9についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 76 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 9: AAACTGCAGC AGCTGGGCAG GCCGCTGGAC GGCCTGCCCT CGAGCTCGTC TAGAATGTGC 60 TGCCGATCCT GGTTGC 76

【０１１５】 (2) 配列番号10についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 32 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 10: CTAGTCTAGA CACCGATGAG GAAACCCGAT GA 32

【０１１６】 (2) 配列番号11についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 11: CCCAAGCTTC TCGAGTCAGT GGTCGCTGGG CGCGCG 36

【０１１７】 (2) 配列番号12についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 24 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 12: GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG 24

【０１１８】 (2) 配列番号13についての情報: (i) 配列の特徴: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) タイプ: 核酸 (C) 鎖: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線 (ii) 分子型: DNA (合成) (xi) 配列の記載: 配列番号: 13: GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC 30

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の範囲内のベクター、Ｐ．フロイデンライシイＬＭＧ１
６５４５（ＣＢＳ１０１０２２）由来のｐ５４５の制限酵素地図である。

【図２ａ】２つのベクターの制限酵素地図である。

【図２ｂ】２つのベクターの制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｐ 19/42 Ｃ１２Ｐ 19/42 21/02 Ｃ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヨハネス・ペトルス・マリア・ヨレオランダ、エヌエル−2804ペーアー・ホウダ、ワテライト９番 (72)発明者ルドルフ・ヘイスベルトゥス・マリー・ライテンオランダ、エヌエル−2317カーエル・レイデン、アッカーホールンブルム26番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号１またはその補体、（ｂ）プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium
freudenreichii）ＣＢＳ１０１０２２の３．６ｋｂプラスミドからの配列、（ｃ）プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium
freudenreichii）ＣＢＳ１０１０２３の３．６ｋｂプラスミドからの配列、ま
たは（ｄ）配列番号２または３、それと実質的に相同なアミノ酸配列またはどちら
かの配列のフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列、と選択的にハイブリダイズできる配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】宿主細胞内の染色体外に留まることのできる自律複製するプ
ラスミドであって、内因性プロピオニバクテリウムプラスミドから誘導され、
異種遺伝子を含む場合、宿主内でその遺伝子を発現できるポリヌクレオチド。
【請求項３】宿主細胞内で自律複製をする請求項１記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項４】宿主細胞がプロピオニバクテリウムである請求項３記載のポ
リヌクレオチド。
【請求項５】プロピオニバクテリウムがプロピオニバクテリウム・フロイ
デンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）である請求項４記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項６】プロピオニバクテリウムにおける自律複製に必要な、配列番
号１中の１つ以上の配列と選択的にハイブリダイズできる上記請求項いずれか１
項記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】制限部位ＳａｌＩおよびＡｌｗＮＩで輪郭付けされた配列番
号１の１．７ｋｂフラグメントまたは配列番号１の１〜１７５０ヌクレオチドの
いずれかを含む請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項８】上記請求項いずれか１項のポリヌクレオチドを含むベクター
。
【請求項９】プラスミドである請求項８記載のベクター。
【請求項１０】さらに選択マーカーを含む請求項８または９記載のベクタ
ー。
【請求項１１】イー・コリ（E. coli）中で自律複製できる請求項８〜１
０いずれか１項記載のベクター。
【請求項１２】発現ベクターである請求項８〜１１いずれか１項記載のベ
クター。
【請求項１３】遺伝子の発現を与えることのできる制御配列に作動可能に
結合したプロピオニバクテリウムの内因性遺伝子または異種遺伝子を含む請求項
１２記載のベクター。
【請求項１４】遺伝子がｃｏｂＡ遺伝子である請求項１３記載のベクター
。
【請求項１５】異種遺伝子がヒトまたは動物における治療用のポリペプチ
ドをコードする請求項１３記載のベクター。
【請求項１６】配列番号２または３、それと実質的に相同な配列またはど
ちらかの配列のフラグメントを含むポリペプチドあるいは請求項１〜７いずれか
１項記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項１７】請求項１〜１５いずれか１項記載の異種ポリヌクレオチド
またはベクターを含むか、請求項１３〜１５いずれか１項記載のベクターで形質
転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１８】細菌である請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】プロピオニバクテリウムまたはイー・コリである請求項１
８記載の宿主細胞。
【請求項２０】宿主細胞を請求項１〜１５いずれか１項記載のポリヌクレ
オチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクトすることを特徴とする
請求項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞の製造法。
【請求項２１】ポリペプチドまたは他の化合物の発現可能な条件下、請求
項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞を培養または発酵させることを特徴と
する該ポリペプチドまたは化合物の製造法。
【請求項２２】宿主細胞を好気性または嫌気性条件下で培養する発酵法で
ある請求項２１記載の製造法。
【請求項２３】発現されたポリペプチドまたは産生された化合物を宿主細
胞から回収する請求項２１または２２記載の製造法。
【請求項２４】ポリペプチドが、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼま
たはペプチダーゼあるいは化合物がビタミンＢ₁₂である請求項２３記載の製造法
。
【請求項２５】ポリペプチドが宿主細胞から分泌される請求項２１〜２４
記載の製造法。
【請求項２６】ポリペプチドが宿主細胞の表面で発現され、および／また
はポリペプチドが抗原または免疫原である請求項２５記載の製造法。
【請求項２７】請求項２０〜２６いずれか１項記載の製造法で製造される
ポリペプチドまたは化合物。
【請求項２８】ビタミンＢ₁₂が産生される条件下、請求項１７〜１９いず
れか１項記載の宿主細胞を培養し、要すれば、該ビタミンを単離するビタミンＢ ₁₂ （コバラミン）の製造法。
【請求項２９】請求項２８記載の方法で製造されたビタミンＢ₁₂。
【請求項３０】ヒトまたは動物体の治療処置法に用いる請求項２７記載の
ポリペプチド。
【請求項３１】ヒトまたは動物体の治療処置法または動物飼料に使用する
請求項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項３２】請求項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞または請求
項２７記載のポリペプチドまたは化合物のチーズ製造における使用。
【請求項３３】請求項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞または請求
項２７記載のポリペプチドまたは化合物の食物または動物飼料製造における使用
。
【請求項３４】請求項２７のポリペプチドまたは化合物または請求項１７
〜１９いずれか１項記載の宿主細胞を含む食物。
【請求項３５】ヒトに消費される（例、チーズ、ソーセージ）または動物
に消費されるための請求項３４記載の食物。
【請求項３６】請求項１７〜１９いずれか１項記載の宿主細胞を使用する
ことを特徴とするチーズまたは他の発酵酪農製品の製造法。
【請求項３７】宿主細胞を乳酸菌の代わり、またはそれに加えて使用する
請求項３６記載の製造法。
【請求項３８】宿主細胞がプロピオニバクテリウム細胞である請求項３６
または３７記載の製造法。