JP2002518020A - プロテアソーム活性 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、プロテアソーム活性の調整および／または調節に関する。本発明は、プロテアソームによる特定mRNAの破壊の速度を調整することにより、ウイルス複製および発病を抑制する化合物を特定する分析法、ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質の核酸分解酵素抑制機能の抑制物質を特定する分析法、および、バクテリア性もしくはウイルス感染の被害に対する抵抗力を生成する方法を提供する。本発明は、各分析法、該各分析法を実施するキット、上記各分析法により特定された各化合物ならびに上記各化合物をコード化するアミノ酸配列およびそれらから誘導された各薬用組成物を提供する。法的に許容される場合に本発明はまた、プロテアソーム活性の調整／調節に基づく治療方法も提供する。
Description
【０００１】 プロテアソームの基礎知識 我々は僅か数ヶ月前の我々でないことは自明の理である。これは、我々の身体
の細胞の殆どは寿命が比較的に短いからであり、我々の身体は、既存の細胞が老
化して死ぬと新たな細胞を作り出す。細胞が「誕生」するプロセスは次第に明ら
かとなっている。等しく根本的であるが、細胞の衰弱および死滅のプロセスはよ
く理解されていない。各細胞は器官全体よりも速く交代することから、各細胞構
成要素は細胞自体よりも速く交代する。成熟細胞において、タンパク質が合成さ
れる速度は、それらが分解する速度(タンパク質分解)と一致する。この様に合成
および分解が同時に組合されることから、各細胞は周囲状況の変化に対応し得る
。
の細胞の殆どは寿命が比較的に短いからであり、我々の身体は、既存の細胞が老
化して死ぬと新たな細胞を作り出す。細胞が「誕生」するプロセスは次第に明ら
かとなっている。等しく根本的であるが、細胞の衰弱および死滅のプロセスはよ
く理解されていない。各細胞は器官全体よりも速く交代することから、各細胞構
成要素は細胞自体よりも速く交代する。成熟細胞において、タンパク質が合成さ
れる速度は、それらが分解する速度(タンパク質分解)と一致する。この様に合成
および分解が同時に組合されることから、各細胞は周囲状況の変化に対応し得る
。
【０００２】 タンパク質分解システムは、特異的なタンパク質の濃度およびそれらの付随活
性を減少する。このプロセスの特異性は、巨大なマルチ・サブユニット細胞質ゾ
ル複合体、すなわちプロテアソームにより仲介される高度に選択的なメカニズム
により達成される[文献1]。プロテアソームはまたリボ核酸を分解し得ると共に
、特にウイルス性のサイトカインmRNAに対して有効である。
性を減少する。このプロセスの特異性は、巨大なマルチ・サブユニット細胞質ゾ
ル複合体、すなわちプロテアソームにより仲介される高度に選択的なメカニズム
により達成される[文献1]。プロテアソームはまたリボ核酸を分解し得ると共に
、特にウイルス性のサイトカインmRNAに対して有効である。
【０００３】 細胞の交代を制御せんとするこれまでの殆どの試行は細胞周期の合成側が中心
であり、分解は相対的に制御不能であり特異性を欠くものと仮定されていた。し
かし最近の研究によると、そうではないことが明らかとなり、且つ、プロテアソ
ームはその複雑な調節(regulation)より、多数の明確な臨床状態における化学療
法に対する重要な可能性のあるターゲットであることが示された。
であり、分解は相対的に制御不能であり特異性を欠くものと仮定されていた。し
かし最近の研究によると、そうではないことが明らかとなり、且つ、プロテアソ
ームはその複雑な調節(regulation)より、多数の明確な臨床状態における化学療
法に対する重要な可能性のあるターゲットであることが示された。
【０００４】 プロテアソームの構造および機能 細胞における主要なタンパク質分解活性は26Sプロテアソームすなわち重要な
調節性プロテアーゼであり、これは、細胞周期[文献3]、アポトーシス[文献4]、
腫瘍タンパク質分解[文献5]、遺伝子発現[文献6]、炎症性反応[文献6]および大
量のタンパク質分解[文献7]などの種々の生理学的プロセスを制御するものであ
る。プロテアソームは触媒的コア(20S)から成るが、該コアに対しては調節性複
合体[文献8]が結合する。ヒト(human)では、円筒状の触媒的コアは、一般構造α 1-7 β1-7β1-7α1-7を有する４個の7員環の積層物を形成すべく組立てられた７
個の異なるα型および７個の異なるβ型のサブユニットの各々の二つの複製物で
ある28個のサブユニットから成る。この積層物は、タンパク質分解トレオニン残
基が入る内部チャンバを含んでいる。上記プロテアソーム複合体に対しては、各
々が6個のATPアーゼおよび少なくとも9個の他のサブユニットを含む複数の調節
性複合体(19S)が結合する。上記プロテアソームがMHCクラスI提示のために抗原
を断片化するとき、19S調節因子[文献9]に対して11S調節性複合体が置換する。
重要な点として、種々の生理学的刺激(例えば、インターフェロン−γへの暴露)
に応じて両コアおよび調節性サブユニットの選択的な交換も生ずる[文献4,10,11
]。
調節性プロテアーゼであり、これは、細胞周期[文献3]、アポトーシス[文献4]、
腫瘍タンパク質分解[文献5]、遺伝子発現[文献6]、炎症性反応[文献6]および大
量のタンパク質分解[文献7]などの種々の生理学的プロセスを制御するものであ
る。プロテアソームは触媒的コア(20S)から成るが、該コアに対しては調節性複
合体[文献8]が結合する。ヒト(human)では、円筒状の触媒的コアは、一般構造α 1-7 β1-7β1-7α1-7を有する４個の7員環の積層物を形成すべく組立てられた７
個の異なるα型および７個の異なるβ型のサブユニットの各々の二つの複製物で
ある28個のサブユニットから成る。この積層物は、タンパク質分解トレオニン残
基が入る内部チャンバを含んでいる。上記プロテアソーム複合体に対しては、各
々が6個のATPアーゼおよび少なくとも9個の他のサブユニットを含む複数の調節
性複合体(19S)が結合する。上記プロテアソームがMHCクラスI提示のために抗原
を断片化するとき、19S調節因子[文献9]に対して11S調節性複合体が置換する。
重要な点として、種々の生理学的刺激(例えば、インターフェロン−γへの暴露)
に応じて両コアおよび調節性サブユニットの選択的な交換も生ずる[文献4,10,11
]。
【０００５】 プロテアソーム周期 プロテアソームの種々の機能は、キモトリプシン様、トリプシン様およびペプ
チジルグルタミルペプチド加水分解の活性を含む多数の触媒部位に依存する。但
し他のタンパク質分解システムとは異なり、これらのプロテアソーム活性はエネ
ルギー依存性である。
チジルグルタミルペプチド加水分解の活性を含む多数の触媒部位に依存する。但
し他のタンパク質分解システムとは異なり、これらのプロテアソーム活性はエネ
ルギー依存性である。
【０００６】 ユビキチンは、76個のアミノ酸残基から成るタンパク質である。その機能は、
26Sプロテアソームにより分解されるべきタンパク質の「タグ」としてのもので
ある。この「タグ付け」は、上記タンパク質に対してユビキチンが多数の鎖で共
有結合する段階を含む。ユビキチンは先ずユビキチン活性化酵素(E1)により活性
化される。次にユビキチン複合酵素(E2)はユビキチン・タンパク質リガーゼ(E3)
の助けを受け、数個(4〜12個)のユビキチンを順次に標的タンパク質内のリジン
残基へと結合させ、多ユビキチン(multi-ubiquitin)鎖を形成する[文献12]。
26Sプロテアソームにより分解されるべきタンパク質の「タグ」としてのもので
ある。この「タグ付け」は、上記タンパク質に対してユビキチンが多数の鎖で共
有結合する段階を含む。ユビキチンは先ずユビキチン活性化酵素(E1)により活性
化される。次にユビキチン複合酵素(E2)はユビキチン・タンパク質リガーゼ(E3)
の助けを受け、数個(4〜12個)のユビキチンを順次に標的タンパク質内のリジン
残基へと結合させ、多ユビキチン(multi-ubiquitin)鎖を形成する[文献12]。
【０００７】 多ユビキチン化(ubiquitinylated)タンパク質は先ず、19S調節因子のサブユニ
ットにより認識され[文献13]、該調節因子は20S円筒コア内のプロセシングのた
めに上記タンパク質鎖を提示する。他の19S調節因子サブユニットは、非−ユビ
キチン化タンパク質を認識し得る。ユビキチン化タンパク質および非−ユビキチ
ン化タンパク質は、19S調節因子のシャペロン機能を要する複雑なプロセスによ
り拡開されなければ、20S粒子のタンパク質分解チャンバ内には進入できない[文
献14]。拡開および分解に付随して多ユビキチン鎖は、プロテアソーム関連ユビ
キチン・カルボキシ末端加水分解酵素(UCH)により標的タンパク質から除去され
、ユビキチンは再循環される[文献15]。
ットにより認識され[文献13]、該調節因子は20S円筒コア内のプロセシングのた
めに上記タンパク質鎖を提示する。他の19S調節因子サブユニットは、非−ユビ
キチン化タンパク質を認識し得る。ユビキチン化タンパク質および非−ユビキチ
ン化タンパク質は、19S調節因子のシャペロン機能を要する複雑なプロセスによ
り拡開されなければ、20S粒子のタンパク質分解チャンバ内には進入できない[文
献14]。拡開および分解に付随して多ユビキチン鎖は、プロテアソーム関連ユビ
キチン・カルボキシ末端加水分解酵素(UCH)により標的タンパク質から除去され
、ユビキチンは再循環される[文献15]。
【０００８】 各UCHはユビキチン特異システインプロテアーゼの多数系の要素であるが、そ
の多くは細胞質ゾル内で自由である[文献16]。各タンパク質は、E3および細胞質
ゾルUCHにより制御される配列を変えるプロセスにおいて連続的にユビキチン化
および脱ユビキチン化される。検査プロセスで不首尾となった多ユビキチン化タ
ンパク質、および、酸化損傷されたタンパク質もしくはウイルス起源のタンパク
質などの残存多ユビキチン化タンパク質は26Sプロテアソームにより分解される
。この分解プロセスは、大きな(130〜250kda)細胞質ゾル調節性タンパク質によ
り活性化または抑制される[文献17]。 要約すると： プロテアソームは、細胞内タンパク質類を選択的に分解することにより、細胞
過程の制御において重要な役割を演ずる巨大な多ユニット・プロテアーゼ複合体
である。
の多くは細胞質ゾル内で自由である[文献16]。各タンパク質は、E3および細胞質
ゾルUCHにより制御される配列を変えるプロセスにおいて連続的にユビキチン化
および脱ユビキチン化される。検査プロセスで不首尾となった多ユビキチン化タ
ンパク質、および、酸化損傷されたタンパク質もしくはウイルス起源のタンパク
質などの残存多ユビキチン化タンパク質は26Sプロテアソームにより分解される
。この分解プロセスは、大きな(130〜250kda)細胞質ゾル調節性タンパク質によ
り活性化または抑制される[文献17]。 要約すると： プロテアソームは、細胞内タンパク質類を選択的に分解することにより、細胞
過程の制御において重要な役割を演ずる巨大な多ユニット・プロテアーゼ複合体
である。
【０００９】 これらのプロテアーゼにより除去されるタンパク質の殆どは、破壊の為にユビ
キチン化によりタグ付けされる。 タグ付けされたタンパク質は、19Sプロテアソーム調節因子内の要素により認
識され、拡開され、脱ユビキチン化されると共に、タンパク質分解機能の配列に
よる部分的もしくは完全な加水分解の為に20Sプロテアソーム・コア複合体の内
部チャンバへと移動される。
キチン化によりタグ付けされる。 タグ付けされたタンパク質は、19Sプロテアソーム調節因子内の要素により認
識され、拡開され、脱ユビキチン化されると共に、タンパク質分解機能の配列に
よる部分的もしくは完全な加水分解の為に20Sプロテアソーム・コア複合体の内
部チャンバへと移動される。
【００１０】 上記プロセスは、細胞質ゾル調節因子による更なる制御を受けることもある。 治療のターゲットとしてのプロテアソーム プロテアソームがタンパク質交代メカニズムの汎用構成要素であるとき、プロ
テアソーム活性の抑制物質(inhibitor)はそれらの作用において選択的だろうか
？ 斯かる選択性は慢性関節リウマチの動物モデルにおいて示されており、この場
合、良好な経口効力および長い半衰期を有するが比較的に非特異的であるセリン
・プロテアーゼ抑制物質である化合物であるボロン酸エステルMG341は、30日期
間に亙る臨床症状から実質的に完全な寛解を生成した[文献18]。同一の化合物は
また、アレルギー皮膚反応のモデルにおいても有効であった[文献18]。故に、よ
り特異的な機能を有するプロテアソーム標的に向けられた化合物は特に、ひとつ
の組織と他の組織とでは複合体の形成は定性的かつ定量的に異なるという最近の
認識により、等しくまたは更に選択的であると期待するのが論理的である。
テアソーム活性の抑制物質(inhibitor)はそれらの作用において選択的だろうか
？ 斯かる選択性は慢性関節リウマチの動物モデルにおいて示されており、この場
合、良好な経口効力および長い半衰期を有するが比較的に非特異的であるセリン
・プロテアーゼ抑制物質である化合物であるボロン酸エステルMG341は、30日期
間に亙る臨床症状から実質的に完全な寛解を生成した[文献18]。同一の化合物は
また、アレルギー皮膚反応のモデルにおいても有効であった[文献18]。故に、よ
り特異的な機能を有するプロテアソーム標的に向けられた化合物は特に、ひとつ
の組織と他の組織とでは複合体の形成は定性的かつ定量的に異なるという最近の
認識により、等しくまたは更に選択的であると期待するのが論理的である。
【００１１】 タンパク質NF-κBの活性形態は免疫および炎症反応に関与する多数の遺伝子の
発現に対して必要とされ、これらの遺伝子は、炎症性かつ走化性サイトカイン、
造血成長因子、細胞接着分子、抗体、クラスI MHC分子、および、サイトカイン
受容体、並びに、重要な酵素である窒素酸化物合成酵素およびシクロオキシゲナ
ーゼ-2をコード化する。NF-κBは細胞質ゾル内において通常は不活性であるが、
NF-κBは、ウイルス、バクテリア、放射、酸化剤および炎症によるサイトカイン
などの種々の病原性刺激に応じたプロテアソーム系路により活性化される。故に
この特異的プロテアソーム機能に向けられた抑制物質は、慢性関節リウマチ、炎
症性腸疾患および喘息などの広範な炎症性およびアレルギー疾患において療法的
利益を提供するはずである。
発現に対して必要とされ、これらの遺伝子は、炎症性かつ走化性サイトカイン、
造血成長因子、細胞接着分子、抗体、クラスI MHC分子、および、サイトカイン
受容体、並びに、重要な酵素である窒素酸化物合成酵素およびシクロオキシゲナ
ーゼ-2をコード化する。NF-κBは細胞質ゾル内において通常は不活性であるが、
NF-κBは、ウイルス、バクテリア、放射、酸化剤および炎症によるサイトカイン
などの種々の病原性刺激に応じたプロテアソーム系路により活性化される。故に
この特異的プロテアソーム機能に向けられた抑制物質は、慢性関節リウマチ、炎
症性腸疾患および喘息などの広範な炎症性およびアレルギー疾患において療法的
利益を提供するはずである。
【００１２】 細胞免疫系は本来、外来性タンパク質から身体を防御すべく作用する。この攻
撃的反応は、移植された組織が拒絶される大きな理由である。それはまた、自己
免疫疾患(多発性硬化症、狼瘡赤血球症など)における「自己」タンパク質により
不適切に誘発される。この反応は、認識されないタンパク質が20S／11Sプロテア
ソーム複合体により短い抗原性ペプチド断片へと分解されると共に、これらの断
片が殆ど遍在するMHC-I抗原により細胞表面に提示されることにより、開始され
る。故に、これらの抗原の形成に対する抑制物質は、組織移植において、且つ、
自己免疫性状態の療法において有用であろう。
撃的反応は、移植された組織が拒絶される大きな理由である。それはまた、自己
免疫疾患(多発性硬化症、狼瘡赤血球症など)における「自己」タンパク質により
不適切に誘発される。この反応は、認識されないタンパク質が20S／11Sプロテア
ソーム複合体により短い抗原性ペプチド断片へと分解されると共に、これらの断
片が殆ど遍在するMHC-I抗原により細胞表面に提示されることにより、開始され
る。故に、これらの抗原の形成に対する抑制物質は、組織移植において、且つ、
自己免疫性状態の療法において有用であろう。
【００１３】 細胞分裂における反応の周期は、サイクリン依存タンパク質キナーゼにより制
御される。細胞周期の種々の段階の間における特定キナーゼ複合体の活性は、細
胞内における特異的タンパク質の量により調節されるが、この量は、合成および
プロテアソーム依存分解の間のバランスにより制御される[文献19]。超増殖して
いる細胞においてプロテアソームの触媒的機能を抑制すると、細胞成長の停止に
繋がると共に、アポトーシスを誘起することもある。故に、種々の癌、および、
乾癬および再狭窄などの非悪性の超増殖状態の療法においては適切な抑制物質が
実効性を有し得ると期待するのは合理的である。
御される。細胞周期の種々の段階の間における特定キナーゼ複合体の活性は、細
胞内における特異的タンパク質の量により調節されるが、この量は、合成および
プロテアソーム依存分解の間のバランスにより制御される[文献19]。超増殖して
いる細胞においてプロテアソームの触媒的機能を抑制すると、細胞成長の停止に
繋がると共に、アポトーシスを誘起することもある。故に、種々の癌、および、
乾癬および再狭窄などの非悪性の超増殖状態の療法においては適切な抑制物質が
実効性を有し得ると期待するのは合理的である。
【００１４】 プロテアソーム抑制物質 以前において殆どは実験系で知られてタンパク質分解活性を抑制すべく使用さ
れた化合物としては、ペプチド・アルデヒド、ボロン酸エステル、ラクタシスチ
ンおよび([文献20]で検討された)関連化合物が挙げられる。これまでの化合物は
薬物速度論的特性が乏しくまたは特異性が低かったので、有力な治療薬としては
見込みが低かった。天然のラクタシスチンは更に興味深いが、一般的であると共
に不可逆な抑制物質である。これらの化合物は、化合物活性の最小限の判別評価
である、単離された20Sプロテアソーム・サブユニット(proteasomal subunit)の
タンパク質分解機能を抑制する能力により識別されたものである。
れた化合物としては、ペプチド・アルデヒド、ボロン酸エステル、ラクタシスチ
ンおよび([文献20]で検討された)関連化合物が挙げられる。これまでの化合物は
薬物速度論的特性が乏しくまたは特異性が低かったので、有力な治療薬としては
見込みが低かった。天然のラクタシスチンは更に興味深いが、一般的であると共
に不可逆な抑制物質である。これらの化合物は、化合物活性の最小限の判別評価
である、単離された20Sプロテアソーム・サブユニット(proteasomal subunit)の
タンパク質分解機能を抑制する能力により識別されたものである。
【００１５】 より最近に開発された抑制物質は、インダノン含有ペプチド[文献21]、グリオ
キサール[文献22]、および更なるボロン酸[文献23]である。 20Sプロテアソーム、20S+19S(26S)複合体、11S(PA28)複合体、MHCクラスI、細
胞分裂および一般的細胞タンパク質分解の間における関係は良好に確立されてい
る。プロテアソームの複合体およびRNAの間の関係は、非特異的であると見做さ
れることが多い。しかし乍ら、20Sプロテアソームは小さなRNAを含んでおり[文
献24、25]、タンパク質合成を阻害する[文献26、27]。最近の研究によれば、プ
ロテアソームはRNAを選択的に分解するエンドヌクレアーゼ活性を含むことが示
された[文献28]。この選択性は、AUリッチ要素を有するRNAに対して発現される[
文献29]。斯かる配列は、レトロウイルスRNA内に見られる。核酸分解酵素の活性
には、20Sプロテアソーム中のサブユニットζ(ゼータ)およびι(イオタ)が関連
する[文献2]。
キサール[文献22]、および更なるボロン酸[文献23]である。 20Sプロテアソーム、20S+19S(26S)複合体、11S(PA28)複合体、MHCクラスI、細
胞分裂および一般的細胞タンパク質分解の間における関係は良好に確立されてい
る。プロテアソームの複合体およびRNAの間の関係は、非特異的であると見做さ
れることが多い。しかし乍ら、20Sプロテアソームは小さなRNAを含んでおり[文
献24、25]、タンパク質合成を阻害する[文献26、27]。最近の研究によれば、プ
ロテアソームはRNAを選択的に分解するエンドヌクレアーゼ活性を含むことが示
された[文献28]。この選択性は、AUリッチ要素を有するRNAに対して発現される[
文献29]。斯かる配列は、レトロウイルスRNA内に見られる。核酸分解酵素の活性
には、20Sプロテアソーム中のサブユニットζ(ゼータ)およびι(イオタ)が関連
する[文献2]。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】 プロテアソームは、生体内で必須の抗ウィルス性役割を有している。感染され
た細胞内で合成されたウイルスタンパク質はプロテアソームにより部分的に分解
される[文献1-3]。その様に生成されたペプチドはMHCクラスI分子に結合される
と共に細胞表面に提示され、そこでそれらは細胞傷害Tリンパ球により認識され
る。ウイルスは、このプロセスに打ち勝ち得るメカニズムを発展させた[文献4]
。
た細胞内で合成されたウイルスタンパク質はプロテアソームにより部分的に分解
される[文献1-3]。その様に生成されたペプチドはMHCクラスI分子に結合される
と共に細胞表面に提示され、そこでそれらは細胞傷害Tリンパ球により認識され
る。ウイルスは、このプロセスに打ち勝ち得るメカニズムを発展させた[文献4]
。
【００１９】 HIV RNAは、プロテアソーム機能を阻害する多数のタンパク質をコード化する
。VpuおよびEnvは協働して、ヘルパーT細胞の適切な機能に対して重要な、CD4の
プロテアソーム仲介分解を増加させる[文献5]。NefはB−サブユニットHsN3に結
合する[文献6]が、この結合の機能は依然として未知である。このサブユニット
はまた、HTLVによりコード化されたタンパク質であるTax-Iに対する結合部位で
もある[文献7]。
。VpuおよびEnvは協働して、ヘルパーT細胞の適切な機能に対して重要な、CD4の
プロテアソーム仲介分解を増加させる[文献5]。NefはB−サブユニットHsN3に結
合する[文献6]が、この結合の機能は依然として未知である。このサブユニット
はまた、HTLVによりコード化されたタンパク質であるTax-Iに対する結合部位で
もある[文献7]。
【００２０】 未熟細胞におけるウイルスタンパク質はプロテアソームにより分解され、おそ
らくはユビキチン化(ubiquitinylation)無しで20S複合体のみによって分解され
る。もしこの分解が抑制物質により阻止されたなら、p24 Gagタンパク質は細胞
質内で蓄積すると共に更なるプロウイルス性DNAが合成される[文献8]。Tatは20S
プロテアソームに結合し、タンパク質分解活性を強く抑制すると共に、20S−11S
複合体の形成も阻止する[文献9]。
らくはユビキチン化(ubiquitinylation)無しで20S複合体のみによって分解され
る。もしこの分解が抑制物質により阻止されたなら、p24 Gagタンパク質は細胞
質内で蓄積すると共に更なるプロウイルス性DNAが合成される[文献8]。Tatは20S
プロテアソームに結合し、タンパク質分解活性を強く抑制すると共に、20S−11S
複合体の形成も阻止する[文献9]。
【００２１】 故に生体内では、新たな合成の結果として、または、RGD領域の配列における
存在により促進されて細胞表面タンパク質に対する結合およびそれによる細胞進
入を許容するプロセスである近傍感染細胞からの移動の結果として、未熟細胞中
にTatが生ずる。Tatは、ウイルスRNAのTARに結合し、プロテアソームのエンドヌ
クレアーゼによる分解から該RNAを保護し、且つ、効果的な転写を許容する。こ
れに加え、Tatはプロテアソームに結合してウイルスタンパク質のタンパク質分
解破壊を阻止することにより、細胞表面におけるウイルス抗原の提示を阻止する
。故に、プロテアソームに対するTatの結合もしくは引き続くTat関連事象を抑制
すれば、プロテアソームは、必須ウイルスタンパク質を分解し得ると共に、これ
らに由来するペプチドを、細胞障害性リンパ球による細胞破壊の為にMHCクラスI
分子上に提示し得る。
存在により促進されて細胞表面タンパク質に対する結合およびそれによる細胞進
入を許容するプロセスである近傍感染細胞からの移動の結果として、未熟細胞中
にTatが生ずる。Tatは、ウイルスRNAのTARに結合し、プロテアソームのエンドヌ
クレアーゼによる分解から該RNAを保護し、且つ、効果的な転写を許容する。こ
れに加え、Tatはプロテアソームに結合してウイルスタンパク質のタンパク質分
解破壊を阻止することにより、細胞表面におけるウイルス抗原の提示を阻止する
。故に、プロテアソームに対するTatの結合もしくは引き続くTat関連事象を抑制
すれば、プロテアソームは、必須ウイルスタンパク質を分解し得ると共に、これ
らに由来するペプチドを、細胞障害性リンパ球による細胞破壊の為にMHCクラスI
分子上に提示し得る。
【００２２】 HTLV-I Taxタンパク質は、HsN3サブユニットと会合する。Taxは次に(Taxもま
た結合する)IκBを処理する足場として作用し得ることから、該ウイルスによりN
F-κBが活性化されるメカニズムの駆動体となり得る[文献7]。B型肝炎ウイルスX
タンパク質すなわちHBXはサブユニットXAPC7に結合すると共に、この相互作用は
生体内でのHBX仲介トランスアクチベーションに対して重要である。更に、ヒト
の乳頭腫ウイルスE7腫瘍性タンパク質は、網膜胚種細胞腫腫瘍抑圧遺伝子タンパ
ク質すなわちRb、および、プロテアソームの19S調節因子のサブユニットであるS
4 ATPアーゼの両者に対して結合し、この結合はプロテアソームによるRbのタン
パク質分解に結び付けられる[文献11]。別の19S ATPアーゼすなわちSUGI(S8)は
、特異的mRNA配列により刺激される[文献12]。プロテアーゼ機能に影響するこれ
らのウイルスタンパク質の配列の典型例は、表１中に例示される。(配列番号1、
2、3)。
た結合する)IκBを処理する足場として作用し得ることから、該ウイルスによりN
F-κBが活性化されるメカニズムの駆動体となり得る[文献7]。B型肝炎ウイルスX
タンパク質すなわちHBXはサブユニットXAPC7に結合すると共に、この相互作用は
生体内でのHBX仲介トランスアクチベーションに対して重要である。更に、ヒト
の乳頭腫ウイルスE7腫瘍性タンパク質は、網膜胚種細胞腫腫瘍抑圧遺伝子タンパ
ク質すなわちRb、および、プロテアソームの19S調節因子のサブユニットであるS
4 ATPアーゼの両者に対して結合し、この結合はプロテアソームによるRbのタン
パク質分解に結び付けられる[文献11]。別の19S ATPアーゼすなわちSUGI(S8)は
、特異的mRNA配列により刺激される[文献12]。プロテアーゼ機能に影響するこれ
らのウイルスタンパク質の配列の典型例は、表１中に例示される。(配列番号1、
2、3)。
【００２３】
【表３】
【００２４】 ウイルス複製および発病の抑制 第1の側面において、本発明は、当該種類のウイルスのゲノムが、プロテアソ
ームに結合するタンパク質もしくは核酸をコード化し、または、細胞監視におけ
るプロテアソームの機能が阻害されるようにプロテアソームに対して宿主タンパ
ク質もしくは核酸の結合を引き起こす、という種類のウイルスによる生細胞の感
染に引き続くウイルス複製および発病を抑制する化合物を特定することを企図す
る。本発明は、プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有す
るか、または19Sおよび11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、ウイルス遺伝
子生成物と、蛍光、光吸収、ルミネセンス、放射能もしくは他の物理的パラメー
タによりタンパク質分解活性を検出するタンパク質基質もしくはペプチド基質と
を含む分析法(assay)から成る。代替的に上記分析法は、ウイルスのリボ核酸も
しくはデオキシリボ核酸、または、プロテアソーム・サブユニットもしくはプロ
テアソーム・サブユニットに結合する他の宿主タンパク質により認識される配列
を含有するオリゴヌクレオチド、を含み得るものであり、核酸分解酵素活性(nuc
lease activity)は、分光測光、蛍光測光、放射測定もしくは化学発光により測
定される。両タイプの分析法は更に、プロテアソームのタンパク質分解活性もし
くは核酸分解酵素活性が調整されるように、ウイルスによりコード化されたタン
パク質もしくは核酸に結合する宿主タンパク質を含み得る。
ームに結合するタンパク質もしくは核酸をコード化し、または、細胞監視におけ
るプロテアソームの機能が阻害されるようにプロテアソームに対して宿主タンパ
ク質もしくは核酸の結合を引き起こす、という種類のウイルスによる生細胞の感
染に引き続くウイルス複製および発病を抑制する化合物を特定することを企図す
る。本発明は、プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有す
るか、または19Sおよび11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、ウイルス遺伝
子生成物と、蛍光、光吸収、ルミネセンス、放射能もしくは他の物理的パラメー
タによりタンパク質分解活性を検出するタンパク質基質もしくはペプチド基質と
を含む分析法(assay)から成る。代替的に上記分析法は、ウイルスのリボ核酸も
しくはデオキシリボ核酸、または、プロテアソーム・サブユニットもしくはプロ
テアソーム・サブユニットに結合する他の宿主タンパク質により認識される配列
を含有するオリゴヌクレオチド、を含み得るものであり、核酸分解酵素活性(nuc
lease activity)は、分光測光、蛍光測光、放射測定もしくは化学発光により測
定される。両タイプの分析法は更に、プロテアソームのタンパク質分解活性もし
くは核酸分解酵素活性が調整されるように、ウイルスによりコード化されたタン
パク質もしくは核酸に結合する宿主タンパク質を含み得る。
【００２５】 ウイルス感染により誘起されたウイルス成分または分子のプロテアソーム分解
を増加する効果を有する化合物は、ウイルス疾患の療法において有用たり得る。 感染患者におけるウイルス疾患の療法において有用であると共に、上記分析法
もしくはキットを使用することにより得られた、または得ることができる抑制化
合物、抑制アミノ酸配列、および、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的(petidomi
metic)に関わらず)それらから誘導される薬用組成物もまた、本発明の一部を構
成すると見做される。法的に許容される場合に本発明はまた、本発明の上記分析
法により得られた抑制物質を投与することにより感染患者のウイルス疾患を治療
する方法も提供する。
を増加する効果を有する化合物は、ウイルス疾患の療法において有用たり得る。 感染患者におけるウイルス疾患の療法において有用であると共に、上記分析法
もしくはキットを使用することにより得られた、または得ることができる抑制化
合物、抑制アミノ酸配列、および、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的(petidomi
metic)に関わらず)それらから誘導される薬用組成物もまた、本発明の一部を構
成すると見做される。法的に許容される場合に本発明はまた、本発明の上記分析
法により得られた抑制物質を投与することにより感染患者のウイルス疾患を治療
する方法も提供する。
【００２６】 実施例 B型肝炎ウイルスXタンパク質によるプロテアソーム核酸分解酵素活性の阻害を 抑制する化合物の識別、およびその効果の定量の為の分析法 基質被覆プレートの調製 ストレプトアビジンにより被覆されたマルチウェル(例えばプレート毎に96個
または384個のウェル)の黒色プレート(例えば、Pierceからの5 ref.15117のパッ
ケージである、Reactibind(登録商標)Neutravidin(登録商標)で被覆されたポリ
スチレン・プレート)が4℃にて保存乾燥する。
または384個のウェル)の黒色プレート(例えば、Pierceからの5 ref.15117のパッ
ケージである、Reactibind(登録商標)Neutravidin(登録商標)で被覆されたポリ
スチレン・プレート)が4℃にて保存乾燥する。
【００２７】 使用の前に、各ウェルを200μlの洗浄用緩衝液(25mMのTrisHCl、および、150m
MのNaCl、0.05％(v/v)のTween(登録商標)20、pH7.6)により３回濯ぐ。 各ウェルに対しては、(ひとつ以上のAUUUA配列を含むと共に、5'端にてはフル
オレセインにより且つ3'端にてはビオチンによりタグ付けされた31-merオリゴリ
ボヌクレオチドを25pmol含む)100μlの基質溶液(substrate solution)を添加す
る。各プレートを次に、室温にて16時間温置後、200μlの洗浄用緩衝液により洗
浄する。
MのNaCl、0.05％(v/v)のTween(登録商標)20、pH7.6)により３回濯ぐ。 各ウェルに対しては、(ひとつ以上のAUUUA配列を含むと共に、5'端にてはフル
オレセインにより且つ3'端にてはビオチンによりタグ付けされた31-merオリゴリ
ボヌクレオチドを25pmol含む)100μlの基質溶液(substrate solution)を添加す
る。各プレートを次に、室温にて16時間温置後、200μlの洗浄用緩衝液により洗
浄する。
【００２８】 各ウェルを、200μlのTBK160緩衝液(20mMのTrisHCl、160mMのKCl、5mMのMgCl2 、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)で一度洗浄する。 次に(試験されるべき化合物もしくは等価のビークルを含む)50μlのTBK160を
各ウェルに添加した。この段階において、各プレートは分析溶液(assay solutio
n)により温置する準備ができる。
各ウェルに添加した。この段階において、各プレートは分析溶液(assay solutio
n)により温置する準備ができる。
【００２９】 プロテアソーム溶液 20Sプロテアソームを標準的方法により精製し、4°にてTBK600(保存剤として5
mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mMのジチオ
トレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、5mMのMgC
l2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度をTBK160の濃度
とする。
mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mMのジチオ
トレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、5mMのMgC
l2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度をTBK160の濃度
とする。
【００３０】 HBV Xタンパク質溶液 HBV Xタンパク質遺伝子および適切な発現ベクターを含む大腸菌の抽出物から
の精製によりHBV Xタンパク質を得た。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウ
ム、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存した
。
の精製によりHBV Xタンパク質を得た。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウ
ム、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存した
。
【００３１】 プレインキュベーション プロテアソームと、上記HBV Xタンパク質の溶液とが混合して、得られた混合
物の50μlが1pmolのプロテアソーム・タンパク質と2pmolのHBV Xタンパク質とを
含むように、37°で20分間温置する。 核酸分解酵素の分析 各ウェルには、50μlのプロテアソーム／HBV Xタンパク質混合溶液を添加した
。次に各プレートは、37°で更に20分間温置した後、200μlのTBK160で３回洗浄
した。各ウェルに対して次に50μlのTBK160を添加し、適切なデータ処理システ
ムによりLabsystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。
物の50μlが1pmolのプロテアソーム・タンパク質と2pmolのHBV Xタンパク質とを
含むように、37°で20分間温置する。 核酸分解酵素の分析 各ウェルには、50μlのプロテアソーム／HBV Xタンパク質混合溶液を添加した
。次に各プレートは、37°で更に20分間温置した後、200μlのTBK160で３回洗浄
した。各ウェルに対して次に50μlのTBK160を添加し、適切なデータ処理システ
ムによりLabsystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。
【００３２】 対照分析 プロテアソームRNアーゼ活性に対する対照ウェルは上記と同一物を含むが、HB
V Xタンパク質は含まない。HBV Xタンパク質のRNアーゼ活性に対する対照物は、
プロテアソーム・タンパク質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 緩衝液のみと温置された標識化プレートはすべてのフルオレセイン由来蛍光を
維持し、読取値は大きいだろう。プロテアソームのみでは、ヌクレオチドの開裂
が生じ且つ読取値は低い、と言うのも、フルオレセインは洗浄用緩衝液により可
溶化されて除去されるからである。HBV Xタンパク質が存在すると開裂は抑制さ
れることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも大きいだろう。
HBV Xタンパク質の影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である
。
V Xタンパク質は含まない。HBV Xタンパク質のRNアーゼ活性に対する対照物は、
プロテアソーム・タンパク質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 緩衝液のみと温置された標識化プレートはすべてのフルオレセイン由来蛍光を
維持し、読取値は大きいだろう。プロテアソームのみでは、ヌクレオチドの開裂
が生じ且つ読取値は低い、と言うのも、フルオレセインは洗浄用緩衝液により可
溶化されて除去されるからである。HBV Xタンパク質が存在すると開裂は抑制さ
れることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも大きいだろう。
HBV Xタンパク質の影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である
。
【００３３】 B型肝炎ウイルスXタンパク質によるプロテアソーム・プロテアーゼ活性の阻害 を抑制する化合物の識別、およびその効果の定量の為の分析法 プレートの調製 標準的なマルチウェル(プレート毎に96個または384個の凹所)を使用する。各
ウェルには、試験されるべき化合物または等価のビークルを含む50μlの緩衝液(
30mMのTrisHCl、10mMのKCl、5mMのMgCl2、0.5mMのジチオトレイトール、pH7.8)
を添加する。この段階において、各プレートは分析溶液により温置する準備がで
きる。
ウェルには、試験されるべき化合物または等価のビークルを含む50μlの緩衝液(
30mMのTrisHCl、10mMのKCl、5mMのMgCl2、0.5mMのジチオトレイトール、pH7.8)
を添加する。この段階において、各プレートは分析溶液により温置する準備がで
きる。
【００３４】 プロテアソーム溶液 20Sプロテアソームを標準的方法により精製し、4°にてTBK600(保存剤として5
mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mMのジチオ
トレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、5mMのMgC
l2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度をTBK160の濃度
にする。
mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mMのジチオ
トレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、5mMのMgC
l2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度をTBK160の濃度
にする。
【００３５】 HBV Xタンパク質溶液 HBV Xタンパク質遺伝子および適切な発現ベクターを含む大腸菌の抽出物から
の精製によりHBV Xタンパク質を得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウ
ム、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する
。
の精製によりHBV Xタンパク質を得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウ
ム、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する
。
【００３６】 プレインキュベーション プロテアソームと、上記HBV Xタンパク質の溶液とを混合し、得られる混合物
の50μlが1pmolのプロテアソーム・タンパク質と2pmolのHBV Xタンパク質とを含
むように、37°で20分間温置する。 プロテアーゼ分析 各ウェルに対して50μlのプロテアソーム／HBV Xタンパク質混合溶液を添加し
、その後に10μlの0.11mMの蛍光基質(サクシニル-Leu-Leu-Val-Tyr-7-アミノ-4-
メチルクマリン、SucLLVY-AMC)を添加する。各プレートを37°で更に30分間温置
し、次に、200μlの停止緩衝液(0.1Mのクロロ酢酸、0.13Mの酢酸ナトリウム、0.
1Mの酢酸、pH4.3)により反応を停止する。適切なデータ処理システムによりLabs
ystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。結果は、アミノメチ
ルクマリンの標準溶液に関して定量する。
の50μlが1pmolのプロテアソーム・タンパク質と2pmolのHBV Xタンパク質とを含
むように、37°で20分間温置する。 プロテアーゼ分析 各ウェルに対して50μlのプロテアソーム／HBV Xタンパク質混合溶液を添加し
、その後に10μlの0.11mMの蛍光基質(サクシニル-Leu-Leu-Val-Tyr-7-アミノ-4-
メチルクマリン、SucLLVY-AMC)を添加する。各プレートを37°で更に30分間温置
し、次に、200μlの停止緩衝液(0.1Mのクロロ酢酸、0.13Mの酢酸ナトリウム、0.
1Mの酢酸、pH4.3)により反応を停止する。適切なデータ処理システムによりLabs
ystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。結果は、アミノメチ
ルクマリンの標準溶液に関して定量する。
【００３７】 対照分析 プロテアソーム・プロテアーゼ活性(proteasomal protease activity)に対す
る対照ウェルは上記と同一物を含むが、HBV Xタンパク質は含まない。HBV Xタン
パク質のプロテアーゼ活性(protease activity)に対する対照物は、プロテアソ
ーム・タンパク質以外は上記と同一物を含む。
る対照ウェルは上記と同一物を含むが、HBV Xタンパク質は含まない。HBV Xタン
パク質のプロテアーゼ活性(protease activity)に対する対照物は、プロテアソ
ーム・タンパク質以外は上記と同一物を含む。
【００３８】 分析法の原理 基質ペプチドの開裂の後にのみ蛍光物質が放出される。緩衝液のみにより温置
された各プレートは、加水分解を殆どもしくは全く示さず、読取値は低いだろう
。プロテアソームのみでは基質の開裂が生じ、読取値は高い。HBV Xタンパク質
が存在すると開裂は抑制されることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質
のみよりも低いだろう。HBV Xタンパク質の影響が克服される度合は、試験化合
物の有効性の尺度である。
された各プレートは、加水分解を殆どもしくは全く示さず、読取値は低いだろう
。プロテアソームのみでは基質の開裂が生じ、読取値は高い。HBV Xタンパク質
が存在すると開裂は抑制されることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質
のみよりも低いだろう。HBV Xタンパク質の影響が克服される度合は、試験化合
物の有効性の尺度である。
【００３９】 本発明の第3および第4の側面に関して以下に記述される本発明の各実施例も参
照されたい。これらの各実施例は、ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質の核酸
分解酵素抑制機能の阻止と、ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質のプロテアー
ゼ抑制機能の阻止とを示している。
照されたい。これらの各実施例は、ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質の核酸
分解酵素抑制機能の阻止と、ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質のプロテアー
ゼ抑制機能の阻止とを示している。
【００４０】
【表４】
【００４１】 第2の側面において本発明は、プロテアソームによる特定の伝令リボ核酸の破
壊の速度を調整することにより、サイトカイン、リンパ球および他の調節タンパ
ク質の濃度を変更する化合物を特定する方法に関する。 内皮細胞付着因子−内皮白血球付着分子-1(E-セレクチン)、血管細胞付着分子
-1(VCAM-1)および細胞内付着分子-1(ICAM-1)−の増加は、乏血、再潅流負傷、喘
息、移植、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化などの
一連の一般的な炎症疾患において重要である。これらの疾患は、タンパク質NFκ
Bによる特定遺伝子の転写の刺激の結果である。NFκBは細胞質ゾル内において調
節タンパク質IκBとの不活性複合体として生じると共に、IκBのプロテアソーム
分解の後で核内へと通過する。IκBは、細胞外サイトカインにより刺激された２
個の特定のセリン残基のリン酸化の後で分解されるべくユビキチン化によりタグ
付けされる。循環サイトカインの濃度は、起点細胞における特異的伝令RNAの量
により決定される。このmRNAのプロテアソーム分解が増加すると、血液中のサイ
トカイン濃度が減少することから、遊離NFκBおよび細胞付着タンパク質の発現
が減少する。故に、プロテアソーム核酸分解酵素活性を調整する化合物は炎症疾
患の療法において有用であり得る。
壊の速度を調整することにより、サイトカイン、リンパ球および他の調節タンパ
ク質の濃度を変更する化合物を特定する方法に関する。 内皮細胞付着因子−内皮白血球付着分子-1(E-セレクチン)、血管細胞付着分子
-1(VCAM-1)および細胞内付着分子-1(ICAM-1)−の増加は、乏血、再潅流負傷、喘
息、移植、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化などの
一連の一般的な炎症疾患において重要である。これらの疾患は、タンパク質NFκ
Bによる特定遺伝子の転写の刺激の結果である。NFκBは細胞質ゾル内において調
節タンパク質IκBとの不活性複合体として生じると共に、IκBのプロテアソーム
分解の後で核内へと通過する。IκBは、細胞外サイトカインにより刺激された２
個の特定のセリン残基のリン酸化の後で分解されるべくユビキチン化によりタグ
付けされる。循環サイトカインの濃度は、起点細胞における特異的伝令RNAの量
により決定される。このmRNAのプロテアソーム分解が増加すると、血液中のサイ
トカイン濃度が減少することから、遊離NFκBおよび細胞付着タンパク質の発現
が減少する。故に、プロテアソーム核酸分解酵素活性を調整する化合物は炎症疾
患の療法において有用であり得る。
【００４２】 プロテアソームは、RNA基質に対して特異性を有するエンドヌクレアーゼ活性
を示す[文献1]。これは今や特徴付けされており[文献2]−プロテアソームRNアー
ゼは、mRNAの3'-UTRにおいて２個以上のAUUUA配列[配列番号4]を含むAUリッチ要
素に対して高度に有効である。AUUUAマルティマーは、サイトカインmRNAの安定
性および翻訳効率を減少する上で必須の役割を有している[文献3]。マルティマ
ーAUUUAの挿入は、β-グロビンmRNAを不安定化し[文献4-6]、インターフェロン-
βmRNAの交代のグルココルチコイド刺激に対して必須であり[文献7]、且つ、TNF
α-mRNAの翻訳の抑制に関与する。
を示す[文献1]。これは今や特徴付けされており[文献2]−プロテアソームRNアー
ゼは、mRNAの3'-UTRにおいて２個以上のAUUUA配列[配列番号4]を含むAUリッチ要
素に対して高度に有効である。AUUUAマルティマーは、サイトカインmRNAの安定
性および翻訳効率を減少する上で必須の役割を有している[文献3]。マルティマ
ーAUUUAの挿入は、β-グロビンmRNAを不安定化し[文献4-6]、インターフェロン-
βmRNAの交代のグルココルチコイド刺激に対して必須であり[文献7]、且つ、TNF
α-mRNAの翻訳の抑制に関与する。
【００４３】 TNFαは、(これもまた本質的にリン酸化された)IκB-αの２個の特定のセリン
のリン酸化を誘起する。このリン酸化を抑制すれば消炎性となる、と言うのも、
付着分子の発現を増加する為に必要な因子であるNFκBはそれとIκB-αとの複合
体から放出されないからである[文献9]。合成付着分子に対するそれの効果に加
え、NFκBはIL-1、IL-6及びTNF-αの発現に影響する[文献10]。サイトカインは
反応性酸素種の生成も増加し[文献11,12]、これはNFκBの重要な調節因子であり
得る[文献13において吟味された]。サイトカインにより誘起されたIκB-αのリ
ン酸化を抑制する多くの抗酸化物質により裏付けられた[文献10、11、14-17]。
のリン酸化を誘起する。このリン酸化を抑制すれば消炎性となる、と言うのも、
付着分子の発現を増加する為に必要な因子であるNFκBはそれとIκB-αとの複合
体から放出されないからである[文献9]。合成付着分子に対するそれの効果に加
え、NFκBはIL-1、IL-6及びTNF-αの発現に影響する[文献10]。サイトカインは
反応性酸素種の生成も増加し[文献11,12]、これはNFκBの重要な調節因子であり
得る[文献13において吟味された]。サイトカインにより誘起されたIκB-αのリ
ン酸化を抑制する多くの抗酸化物質により裏付けられた[文献10、11、14-17]。
【００４４】 プロテアソームによるmRNAの破壊 サイトカインの伝令RNAは、当該mRNAのUTR内に数個のAUUUA配列を有する他のm
RNAの大部分と異なる。この配列は、20Sプロテアソームにより認識される。これ
により、各mRNAの全体集団に影響せずに特定量の特定のmRNAを変化せしめる化合
物を識別する新規な方法が開発され得る。
RNAの大部分と異なる。この配列は、20Sプロテアソームにより認識される。これ
により、各mRNAの全体集団に影響せずに特定量の特定のmRNAを変化せしめる化合
物を識別する新規な方法が開発され得る。
【００４５】 本発明は、プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有する
／有しない、20Sプロテアソーム)と、合成オリゴヌクレオチドであって、一個以
上のAUUUA認識配列を含む3'領域を備えると共に、20Sプロテアソームのまたは19
Sもしくは11S複合体のサブユニットの一個以上に結合することにより核酸分解酵
素活性を調節する特異的タンパク質を有し／有しない合成オリゴヌクレオチドと
、を含む分析法から成る。核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光、放射測定
もしくは化学発光により測定される。
／有しない、20Sプロテアソーム)と、合成オリゴヌクレオチドであって、一個以
上のAUUUA認識配列を含む3'領域を備えると共に、20Sプロテアソームのまたは19
Sもしくは11S複合体のサブユニットの一個以上に結合することにより核酸分解酵
素活性を調節する特異的タンパク質を有し／有しない合成オリゴヌクレオチドと
、を含む分析法から成る。核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光、放射測定
もしくは化学発光により測定される。
【００４６】 化合物は、プロテアソーム・エンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの
開裂の速度の変化により識別される。これは、上記化合物が、オリゴヌクレオチ
ドにおける単一のもしくは複数のAUUUA配列に対し、20Sプロテアソームの一個以
上または19Sもしくは11S複合体の一個以上に対し、或いは、調節タンパク質に対
して、結合するからである。
開裂の速度の変化により識別される。これは、上記化合物が、オリゴヌクレオチ
ドにおける単一のもしくは複数のAUUUA配列に対し、20Sプロテアソームの一個以
上または19Sもしくは11S複合体の一個以上に対し、或いは、調節タンパク質に対
して、結合するからである。
【００４７】 炎症疾患の治療に有用であると共に、上記分析法もしくはキットを使用して得
られたもしくは得ることができる化合物、アミノ酸配列、および、(ペプチド的
もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成物もまた、本
発明の一部を構成すると見做される。 法的に許容される場合に本発明はまた、本発明の上記分析法により得られた化
合物を投与することにより炎症疾患を有する患者を治療する方法も提供する。
られたもしくは得ることができる化合物、アミノ酸配列、および、(ペプチド的
もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成物もまた、本
発明の一部を構成すると見做される。 法的に許容される場合に本発明はまた、本発明の上記分析法により得られた化
合物を投与することにより炎症疾患を有する患者を治療する方法も提供する。
【００４８】
【表５】
【００４９】
【表６】
【００５０】 ヒト免疫不全ウィルス(HIV)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質であ
る。AIDSの感染者は、非感染生体群においては通常は容易に耐性がある日和見性
生体に感染することにより死亡するのが常である。西側世界においてAIDSは現在
、ヌクレオシド逆転写酵素抑制物質、非ヌクレオシド逆転写酵素抑制物質および
プロテアーゼ抑制物質(protease inhibitor)という「三重療法(triple therapy)
」により治療されている。この三重療法は、急速に変異することから単一療法に
耐性を有するというウイルスの顕著な能力の故に開発された。西側において疾患
は三重療法により抑制されているのは確かだが、これは一時的に幸福な期間であ
ることがやがて明らかとなり、耐性と長期的副作用の増大とにより他の手法に基
づく療法が必要になると予測するのが合理的である。同性愛者および異性愛者の
集団のいずれにおいても、特にアフリカおよび東南アジアにおいてAIDSが広がり
続けていることもまた、新規な療法に対する主要で緊急的な理由である。
る。AIDSの感染者は、非感染生体群においては通常は容易に耐性がある日和見性
生体に感染することにより死亡するのが常である。西側世界においてAIDSは現在
、ヌクレオシド逆転写酵素抑制物質、非ヌクレオシド逆転写酵素抑制物質および
プロテアーゼ抑制物質(protease inhibitor)という「三重療法(triple therapy)
」により治療されている。この三重療法は、急速に変異することから単一療法に
耐性を有するというウイルスの顕著な能力の故に開発された。西側において疾患
は三重療法により抑制されているのは確かだが、これは一時的に幸福な期間であ
ることがやがて明らかとなり、耐性と長期的副作用の増大とにより他の手法に基
づく療法が必要になると予測するのが合理的である。同性愛者および異性愛者の
集団のいずれにおいても、特にアフリカおよび東南アジアにおいてAIDSが広がり
続けていることもまた、新規な療法に対する主要で緊急的な理由である。
【００５１】 HIV RNAは、抗ウィルス化学療法のターゲットであるタンパク質を殆どコード
化しない。今日まで、薬剤開発に対しては逆転写酵素およびアスパルチル・プロ
テアーゼが関心の的であった。86個のアミノ酸から成ると共に宿主細胞内におけ
るウイルス複製に対して決定的であるタンパク質Tatは抑制に対する魅力的な目
標であるが、これに対する研究は進んでいない、と言うのも、信頼性のある高ス
ループットの分析法が無かったからである。幾つかの化合物は開発されたが診療
医までは進展せず、その大きな理由は、それらがペプチド的であり生物学的利用
能および薬物速度論的特性が乏しいからである。これらはまた、ウイルスRNAのT
AR(トランスアクチベーション反応領域(transactivation response region))に
対するTatの直接的相互作用に頼る分析技術を使用して開発された。
化しない。今日まで、薬剤開発に対しては逆転写酵素およびアスパルチル・プロ
テアーゼが関心の的であった。86個のアミノ酸から成ると共に宿主細胞内におけ
るウイルス複製に対して決定的であるタンパク質Tatは抑制に対する魅力的な目
標であるが、これに対する研究は進んでいない、と言うのも、信頼性のある高ス
ループットの分析法が無かったからである。幾つかの化合物は開発されたが診療
医までは進展せず、その大きな理由は、それらがペプチド的であり生物学的利用
能および薬物速度論的特性が乏しいからである。これらはまた、ウイルスRNAのT
AR(トランスアクチベーション反応領域(transactivation response region))に
対するTatの直接的相互作用に頼る分析技術を使用して開発された。
【００５２】 ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質の核酸分解酵素抑制機能の阻止 ウイルスRNAのTAR領域に結合することに加え、Tatはプロテアソームの20Sおよ
び19S成分のサブユニットに結合する。この結合により、プロテアソーム・エン
ドヌクレアーゼ活性が抑制されることから、ウイルスの転写および複製が許容さ
れる。本発明者等は、RNAとプロテアソームの複合体との両者に対するTatの作用
を阻止する化合物の識別を許容する分析法を開発した。これまでの分析系はプロ
テアソームまたはその成分を一切含まなかったので、プロテアソームに対する結
合を検出し得なかった。本発明の新規な分析法は、HIV感染患者におけるAIDSの
治療において有用である新規な化合物を特定すべく使用される。
び19S成分のサブユニットに結合する。この結合により、プロテアソーム・エン
ドヌクレアーゼ活性が抑制されることから、ウイルスの転写および複製が許容さ
れる。本発明者等は、RNAとプロテアソームの複合体との両者に対するTatの作用
を阻止する化合物の識別を許容する分析法を開発した。これまでの分析系はプロ
テアソームまたはその成分を一切含まなかったので、プロテアソームに対する結
合を検出し得なかった。本発明の新規な分析法は、HIV感染患者におけるAIDSの
治療において有用である新規な化合物を特定すべく使用される。
【００５３】 第3の側面において本発明は、２個以上のAUUUA配列の上流におけるTAR配列を
備えた合成オリゴヌクレオチドと、核酸分解酵素活性を有すると共に20S、19Sお
よび11S成分のいずれかもしくは全てを備えたプロテアソームの調製物(preparat
ion)と、HIV Tat、または、HIV Tatのアミノ酸48〜57の配列および／又は20S、1
9Sもしくは11Sのプロテアソームの複合体への結合に関与する配列を含むポリペ
プチドとから成る分析法を提供する。核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光
、放射測定または化学発光により測定される。
備えた合成オリゴヌクレオチドと、核酸分解酵素活性を有すると共に20S、19Sお
よび11S成分のいずれかもしくは全てを備えたプロテアソームの調製物(preparat
ion)と、HIV Tat、または、HIV Tatのアミノ酸48〜57の配列および／又は20S、1
9Sもしくは11Sのプロテアソームの複合体への結合に関与する配列を含むポリペ
プチドとから成る分析法を提供する。核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光
、放射測定または化学発光により測定される。
【００５４】 核酸分解酵素活性は、添加されたオリゴヌクレオチドのTARに対して、または
、20S、19Sもしくは11Sプロテアソームの複合体の一個以上のサブユニットに対
して結合するTatもしくはポリペプチドが存在すると減少する。Tatに対して、添
加されたポリペプチドに対して、添加されたオリゴヌクレオチドに対して、また
は、プロテアソーム・サブユニットに対して、結合することにより上記分析系に
おける核酸分解酵素活性が増加する如く核酸分解酵素活性の抑制を仲介する化合
物はTat抑制物質として特定されると共に感染細胞におけるHIVの複製を阻止する
。斯かる化合物は、HIV感染の治療において有用であり得る。
、20S、19Sもしくは11Sプロテアソームの複合体の一個以上のサブユニットに対
して結合するTatもしくはポリペプチドが存在すると減少する。Tatに対して、添
加されたポリペプチドに対して、添加されたオリゴヌクレオチドに対して、また
は、プロテアソーム・サブユニットに対して、結合することにより上記分析系に
おける核酸分解酵素活性が増加する如く核酸分解酵素活性の抑制を仲介する化合
物はTat抑制物質として特定されると共に感染細胞におけるHIVの複製を阻止する
。斯かる化合物は、HIV感染の治療において有用であり得る。
【００５５】 本発明はまた、Tat抑制物質を特定する分析法を実施する上で必要な上記成分
を備えたキットも提供する。本発明はまた、上記分析法もしくはキットを使用す
ることにより一種類以上のTat抑制物質を特定する方法も提供する。HIV感染患者
におけるAIDSの治療に有用であると共に該方法、分析法またはキットを使用して
得られたもしくは得ることができるTat抑制物質化合物、抑制的アミノ酸配列、
および、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬
用組成物もまた、本発明の一部を形成するものと見做される。法的に許容される
場合に本発明はまた、Tat抑制物質を投与することによりHIV感染患者のAIDSを治
療する方法も提供する。
を備えたキットも提供する。本発明はまた、上記分析法もしくはキットを使用す
ることにより一種類以上のTat抑制物質を特定する方法も提供する。HIV感染患者
におけるAIDSの治療に有用であると共に該方法、分析法またはキットを使用して
得られたもしくは得ることができるTat抑制物質化合物、抑制的アミノ酸配列、
および、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬
用組成物もまた、本発明の一部を形成するものと見做される。法的に許容される
場合に本発明はまた、Tat抑制物質を投与することによりHIV感染患者のAIDSを治
療する方法も提供する。
【００５６】 実施例 総括的実施例 プロテアソーム核酸分解酵素活性のHIV Tat抑制を阻止する化合物の効果を検
出して定量する分析法 通常の大規模分析に適した各プレートのウェル(96、384、1512個のウェルを有
するプレートなど)に、ストレプトアビジンを塗付する。3'端にビオチンを且つ5
'端にフルオレセインを有すべく改変された合成オリゴヌクレオチド(例えば、TA
RAU4として公知の配列番号5、5'CUGGUUAGACCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCUAACUA
GAGGAUGCAUUUAUUUAUUAUUUUAGCG3')を、HIV Tatおよび試験される化合物と共に添
加する。オリゴヌクレオチドが各ウェルに結合すると共に洗浄の後でも残存する
ように、ビオチンをストレプトアビジンに結合させる。ヒトの脾臓から単離され
た20Sプロテアソームの調製物を添加することにより、反応を開始する。所定時
間後、各派プレートを洗浄する。核酸分解酵素活性は基質オリゴヌクレオチドを
開裂し、蛍光ラベル(fluorescent label)は培地内へと放出されて洗浄により除
去される。故にTatが存在しないと、プロテアソームはオリゴヌクレオチドを分
解し、洗浄の後においても各ウェルに結合して検出される蛍光は殆ど無い。Tat
が存在すると、核酸分解酵素活性が抑制され、洗浄の後でも多くの蛍光が各ウェ
ル内に残存する。故に、Tatの影響を抑制する化合物は、プロテアソームおよびT
atを含む分析法において洗浄後にウェル内に残される蛍光の減少により検出され
る。
出して定量する分析法 通常の大規模分析に適した各プレートのウェル(96、384、1512個のウェルを有
するプレートなど)に、ストレプトアビジンを塗付する。3'端にビオチンを且つ5
'端にフルオレセインを有すべく改変された合成オリゴヌクレオチド(例えば、TA
RAU4として公知の配列番号5、5'CUGGUUAGACCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCUAACUA
GAGGAUGCAUUUAUUUAUUAUUUUAGCG3')を、HIV Tatおよび試験される化合物と共に添
加する。オリゴヌクレオチドが各ウェルに結合すると共に洗浄の後でも残存する
ように、ビオチンをストレプトアビジンに結合させる。ヒトの脾臓から単離され
た20Sプロテアソームの調製物を添加することにより、反応を開始する。所定時
間後、各派プレートを洗浄する。核酸分解酵素活性は基質オリゴヌクレオチドを
開裂し、蛍光ラベル(fluorescent label)は培地内へと放出されて洗浄により除
去される。故にTatが存在しないと、プロテアソームはオリゴヌクレオチドを分
解し、洗浄の後においても各ウェルに結合して検出される蛍光は殆ど無い。Tat
が存在すると、核酸分解酵素活性が抑制され、洗浄の後でも多くの蛍光が各ウェ
ル内に残存する。故に、Tatの影響を抑制する化合物は、プロテアソームおよびT
atを含む分析法において洗浄後にウェル内に残される蛍光の減少により検出され
る。
【００５７】 特定の実施例 基質により被覆されたプレートの調製 基質被覆プレートの調製 ストレプトアビジンにより被覆されたマルチウェル(例えばプレート毎に96個
または384個のウェル)の黒色プレート(例えば、Pierceからの5 ref.15117のパッ
ケージである、Reactibind(登録商標)Neutravidin(登録商標)で被覆されたポリ
スチレン・プレート)を4℃で保存し、乾燥された。
または384個のウェル)の黒色プレート(例えば、Pierceからの5 ref.15117のパッ
ケージである、Reactibind(登録商標)Neutravidin(登録商標)で被覆されたポリ
スチレン・プレート)を4℃で保存し、乾燥された。
【００５８】 使用の前に、各ウェルを200mlの洗浄用緩衝液(25mMのTrisHCl、および、150mM
のNaCl、0.05％(v/v)のTween(登録商標)20、pH7.6)により３回濯ぐ。 各ウェルに対しては、(ひとつ以上のAUUUA配列を含むと共に、5'端にてはフル
オレセインにより且つ3'端にてはビオチンによりタグ付けされた31-merオリゴリ
ボヌクレオチドを25pmol含む)100μlの基質溶液を添加する。各プレートを室温
にて16時間温置し、次に、200μlの洗浄用緩衝液により洗浄する。
のNaCl、0.05％(v/v)のTween(登録商標)20、pH7.6)により３回濯ぐ。 各ウェルに対しては、(ひとつ以上のAUUUA配列を含むと共に、5'端にてはフル
オレセインにより且つ3'端にてはビオチンによりタグ付けされた31-merオリゴリ
ボヌクレオチドを25pmol含む)100μlの基質溶液を添加する。各プレートを室温
にて16時間温置し、次に、200μlの洗浄用緩衝液により洗浄する。
【００５９】 各ウェルを、200μlのTBK160緩衝液(20mMのTrisHCl、160mMのKCl、5mMのMgCl2 、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)で一度洗浄する。 次に(試験されるべき化合物もしくは等価のビークルを含む)50μlのTBK160を
各ウェルに添加する。この段階において、各プレートは分析溶液(assay solutio
n)により温置される準備ができる。
各ウェルに添加する。この段階において、各プレートは分析溶液(assay solutio
n)により温置される準備ができる。
【００６０】 プロテアソーム溶液 20Sプロテアソームを標準的方法により精製すると共に4°にてTBK600(保存剤
として5mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mM
のジチオトレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、
5mMのMgCl2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)で希釈し、最終濃度をTBK160の
濃度とする。
として5mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mM
のジチオトレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、
5mMのMgCl2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)で希釈し、最終濃度をTBK160の
濃度とする。
【００６１】 Tat溶液 Tat遺伝子および適切な発現ベクターを含む大腸菌の抽出物からの精製によりT
atを得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウム、100mMのNaCl、1mMのEDTA
、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する。 プレインキュベーション プロテアソームおよびTatの溶液を混合し、得られた混合物の50μlが1pmolの
プロテアソーム・タンパク質と2pmolのTatとを含むように、37°で20分間温置す
る。
atを得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウム、100mMのNaCl、1mMのEDTA
、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する。 プレインキュベーション プロテアソームおよびTatの溶液を混合し、得られた混合物の50μlが1pmolの
プロテアソーム・タンパク質と2pmolのTatとを含むように、37°で20分間温置す
る。
【００６２】 核酸分解酵素の分析 各ウェルには、50μlのプロテアソーム／TAT混合溶液を添加する。次に37°で
更に20分間温置し、各プレートを、その後200μlのTBK160で３回洗浄する。各ウ
ェルに対して次に50μlのTBK160を添加すると共に、適切なデータ処理システム
によりLabsystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光が測定する。
更に20分間温置し、各プレートを、その後200μlのTBK160で３回洗浄する。各ウ
ェルに対して次に50μlのTBK160を添加すると共に、適切なデータ処理システム
によりLabsystems Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光が測定する。
【００６３】 対照分析 プロテアソームRNアーゼ活性に対する対照ウェルは上記と同一物を含むが、TA
Tを含まない。TATのRNアーゼ活性に対する対照物は、プロテアソーム・タンパク
質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 緩衝液のみにより温置された標識化プレートは、すべてのフルオレセイン由来
の蛍光を維持し、読取値は大きいだろう。プロテアソームのみでは、ヌクレオチ
ドの開裂が生じ且つ読取値は低かった、と言うのも、フルオレセインは洗浄用緩
衝液により可溶化されて除去されるからである。TATが存在すると開裂は抑制さ
れることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも大きいだろう。
TATの影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である。
Tを含まない。TATのRNアーゼ活性に対する対照物は、プロテアソーム・タンパク
質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 緩衝液のみにより温置された標識化プレートは、すべてのフルオレセイン由来
の蛍光を維持し、読取値は大きいだろう。プロテアソームのみでは、ヌクレオチ
ドの開裂が生じ且つ読取値は低かった、と言うのも、フルオレセインは洗浄用緩
衝液により可溶化されて除去されるからである。TATが存在すると開裂は抑制さ
れることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも大きいだろう。
TATの影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である。
【００６４】 遍在する細胞小器官(organelle)であるプロテアソームは、生体内で必須抗ウ
ィルス性役割を有している。感染された細胞内で合成されたウイルスタンパク質
はプロテアソームにより部分的に分解される[文献30、31、32]。その様に生成さ
れたペプチドはMHCクラスI分子に結合されると共に細胞表面に提示され、そこで
それらは細胞傷害Tリンパ球により認識される。ウイルスは、このプロセスに打
ち勝ち得るメカニズムを発展させた[文献33]。
ィルス性役割を有している。感染された細胞内で合成されたウイルスタンパク質
はプロテアソームにより部分的に分解される[文献30、31、32]。その様に生成さ
れたペプチドはMHCクラスI分子に結合されると共に細胞表面に提示され、そこで
それらは細胞傷害Tリンパ球により認識される。ウイルスは、このプロセスに打
ち勝ち得るメカニズムを発展させた[文献33]。
【００６５】 HIV RNAは、プロテアソーム機能を阻害する多数のタンパク質をコード化する
。VpuおよびEnvは協働して、ヘルパーT細胞の適切な機能に対して重要な、CD4の
プロテアソーム仲介分解を増加する[文献34]。NefはB−サブユニットHsN3に結合
する[文献35]が、この結合の機能は依然として未知である。このサブユニットは
また、HTLVによりコード化されたタンパク質であるTax-Iに対する結合部位でも
ある[文献36]。
。VpuおよびEnvは協働して、ヘルパーT細胞の適切な機能に対して重要な、CD4の
プロテアソーム仲介分解を増加する[文献34]。NefはB−サブユニットHsN3に結合
する[文献35]が、この結合の機能は依然として未知である。このサブユニットは
また、HTLVによりコード化されたタンパク質であるTax-Iに対する結合部位でも
ある[文献36]。
【００６６】 未熟細胞におけるウイルスタンパク質はプロテアソームにより分解され、おそ
らくはユビキチン化無しで20S複合体によって分解される。もしこの分解が抑制
物質により阻止されたなら、p24 Gagタンパク質は細胞質内で蓄積すると共に更
なるプロウイルス性DNAが合成される[文献37]。Tatは20Sプロテアソームに結合
し、タンパク質分解活性を強く抑制すると共に、20S−11S複合体の形成も阻止す
る[文献38]。
らくはユビキチン化無しで20S複合体によって分解される。もしこの分解が抑制
物質により阻止されたなら、p24 Gagタンパク質は細胞質内で蓄積すると共に更
なるプロウイルス性DNAが合成される[文献37]。Tatは20Sプロテアソームに結合
し、タンパク質分解活性を強く抑制すると共に、20S−11S複合体の形成も阻止す
る[文献38]。
【００６７】 故に生体内では、新たな合成の結果として、または、RGD領域の配列における
存在により促進されて細胞表面タンパク質に対する結合およびそれによる細胞進
入を許容するプロセスである近傍感染細胞からの移動の結果として、未熟細胞中
にTatが生ずる。Tatは、ウイルスRNAのTARに結合し、プロテアソームのエンドヌ
クレアーゼによる分解から該RNAを保護し、且つ、効果的な転写を許容する。こ
れに加え、Tatはプロテアソームに結合してウイルスタンパク質のタンパク質分
解破壊を阻止することにより、細胞表面におけるウイルス抗原の提示を阻止する
。故に、プロテアソームに対するTatの結合もしくは引き続くTat関連事象を抑制
すれば、プロテアソームは、必須のウイルスタンパク質を分解し得ると共に、こ
れらに由来するペプチドを、細胞障害性リンパ球による細胞破壊の為にMHCクラ
スI分子上に提示し得る。
存在により促進されて細胞表面タンパク質に対する結合およびそれによる細胞進
入を許容するプロセスである近傍感染細胞からの移動の結果として、未熟細胞中
にTatが生ずる。Tatは、ウイルスRNAのTARに結合し、プロテアソームのエンドヌ
クレアーゼによる分解から該RNAを保護し、且つ、効果的な転写を許容する。こ
れに加え、Tatはプロテアソームに結合してウイルスタンパク質のタンパク質分
解破壊を阻止することにより、細胞表面におけるウイルス抗原の提示を阻止する
。故に、プロテアソームに対するTatの結合もしくは引き続くTat関連事象を抑制
すれば、プロテアソームは、必須のウイルスタンパク質を分解し得ると共に、こ
れらに由来するペプチドを、細胞障害性リンパ球による細胞破壊の為にMHCクラ
スI分子上に提示し得る。
【００６８】 ヒト免疫不全ウィルスTATタンパク質のプロテアーゼ抑制機能の阻止 HIVタンパク質Tatは、プロテアソームの20Sおよび19S成分のサブユニットに結
合する。この結合によりプロテアソームのプロテアーゼ活性は抑制される。その
様にすることでTatは、ウイルスの転写および複製に必要なウイルスタンパク質
の量を維持すると共に、ウイルス的に誘導されたペプチドを免疫系に対して提示
するのを減少させるのを促進する。Tat機能に影響する化合物を特定する為のこ
れまでの分析系は、ウイルスRNAのTARに対するTatの結合に基づくと共に、プロ
テアソームまたはその成分を一切含まなかった。故に斯かるシステムは、プロテ
アソームに対する結合を検出し得なかった。
合する。この結合によりプロテアソームのプロテアーゼ活性は抑制される。その
様にすることでTatは、ウイルスの転写および複製に必要なウイルスタンパク質
の量を維持すると共に、ウイルス的に誘導されたペプチドを免疫系に対して提示
するのを減少させるのを促進する。Tat機能に影響する化合物を特定する為のこ
れまでの分析系は、ウイルスRNAのTARに対するTatの結合に基づくと共に、プロ
テアソームまたはその成分を一切含まなかった。故に斯かるシステムは、プロテ
アソームに対する結合を検出し得なかった。
【００６９】 第4の側面において本発明は、HIV Tatタンパク質によるプロテアソーム機能の
抑制を阻止する化合物の特定を許容する分析方法から成る。上記分析法は、プロ
テアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するか、または19Sおよ
び11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、Tatタンパク質(または、プロテア
ソームのサブユニットと相互作用するタンパク質の領域を含むTatの部分的配列)
と、蛍光、光吸収、ルミネセンス、放射能もしくは他の物理的パラメータにより
タンパク質分解活性を検出するに適したタンパク質もしくはペプチド基質とを含
む。
抑制を阻止する化合物の特定を許容する分析方法から成る。上記分析法は、プロ
テアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するか、または19Sおよ
び11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、Tatタンパク質(または、プロテア
ソームのサブユニットと相互作用するタンパク質の領域を含むTatの部分的配列)
と、蛍光、光吸収、ルミネセンス、放射能もしくは他の物理的パラメータにより
タンパク質分解活性を検出するに適したタンパク質もしくはペプチド基質とを含
む。
【００７０】 プロテアーゼ活性は、Tatの存在、または、プロテアソーム系の20Sもしくは19
S成分に対するTat結合部位に結合するペプチドの存在、により減少される。上記
分析系においてプロテアーゼ活性を増大すべく、Tatに対し、または、プロテア
ーゼ活性の抑制を仲介するプロテアソームのサブユニットに対して結合する化合
物は、Tat抑制物質として特定されると共に感染細胞におけるHIVの複製を阻止す
る。斯かる新規な分析法は、感染患者におけるAIDS治療に有用な化合物を特定す
べく使用される。
S成分に対するTat結合部位に結合するペプチドの存在、により減少される。上記
分析系においてプロテアーゼ活性を増大すべく、Tatに対し、または、プロテア
ーゼ活性の抑制を仲介するプロテアソームのサブユニットに対して結合する化合
物は、Tat抑制物質として特定されると共に感染細胞におけるHIVの複製を阻止す
る。斯かる新規な分析法は、感染患者におけるAIDS治療に有用な化合物を特定す
べく使用される。
【００７１】 本発明はまた、Tat抑制物質を特定する分析法を実施する上で必要な上記成分
を備えたキットも提供する。本発明はまた、上記分析法もしくはキットを使用す
ることにより一種類以上のTat抑制物質を特定する方法も提供する。HIV感染患者
におけるAIDSの治療に有用であると共に該方法、分析法またはキットを使用して
得られたか、または得ることができるTat抑制化合物、抑制アミノ酸配列および
、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成
物もまた、本発明の一部を形成するものと見做される。法的に許容される場合に
本発明はまた、本発明により得られたTat抑制物質を投与することによりHIV感染
患者のAIDSを治療する方法も提供する。
を備えたキットも提供する。本発明はまた、上記分析法もしくはキットを使用す
ることにより一種類以上のTat抑制物質を特定する方法も提供する。HIV感染患者
におけるAIDSの治療に有用であると共に該方法、分析法またはキットを使用して
得られたか、または得ることができるTat抑制化合物、抑制アミノ酸配列および
、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成
物もまた、本発明の一部を形成するものと見做される。法的に許容される場合に
本発明はまた、本発明により得られたTat抑制物質を投与することによりHIV感染
患者のAIDSを治療する方法も提供する。
【００７２】 HIV-Tatによるプロテアソーム・プロテアーゼ活性の阻害を抑制する化合物の
識別、およびその効果の定量の為の分析法 プレートの調製 標準的なマルチウェル(プレート毎に96個または384個のウェル)が使用された
。各ウェルには、試験されるべき化合物もしくは等価のビークルを含む50μlの
緩衝液(30mMのTrisHCl、10mMのKCl、5mMのMgCl2、0.5mMのジチオトレイトール、
pH7.8)を添加する。この段階において、各プレートは分析溶液により温置される
準備ができる。
識別、およびその効果の定量の為の分析法 プレートの調製 標準的なマルチウェル(プレート毎に96個または384個のウェル)が使用された
。各ウェルには、試験されるべき化合物もしくは等価のビークルを含む50μlの
緩衝液(30mMのTrisHCl、10mMのKCl、5mMのMgCl2、0.5mMのジチオトレイトール、
pH7.8)を添加する。この段階において、各プレートは分析溶液により温置される
準備ができる。
【００７３】 プロテアソーム溶液 20Sプロテアソームを標準的方法により精製すると共に4°にてTBK600(保存剤
として5mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mM
のジチオトレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、
5mMのMgCl2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度はTBK16
0の濃度とする。
として5mMのNaN3が添加された、20mMのTrisHCl、600mMのKCl、5mMのMgCl2、3mM
のジチオトレイトール、pH7.4)内で保存する。この溶液をTBK0(20mMのTrisHCl、
5mMのMgCl2、3mMのジチオトレイトール、pH7.4)により希釈し、最終濃度はTBK16
0の濃度とする。
【００７４】 Tat溶液 Tat遺伝子および適切な発現ベクターを含む大腸菌の抽出物からの精製によりT
atを得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウム、100mMのNaCl、1mMのEDTA
、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する。 プレインキュベーション プロテアソームおよびTatの溶液を混合し、得られた混合物の50μlが1pmolの
プロテアソーム・タンパク質と2pmolのTatとを含むように、37°で20分間温置す
る。
atを得る。それを、PsP緩衝液(50mMの燐酸ナトリウム、100mMのNaCl、1mMのEDTA
、1mMのジチオトレイトール、pH7.0)内に保存する。 プレインキュベーション プロテアソームおよびTatの溶液を混合し、得られた混合物の50μlが1pmolの
プロテアソーム・タンパク質と2pmolのTatとを含むように、37°で20分間温置す
る。
【００７５】 プロテアーゼ分析 各ウェルに対して50μlのプロテアソーム／Tat混合溶液を添加し、その後に10
μlの0.11mMの蛍光基質(サクシニル-Leu-Leu-Val-Tyr-7-アミノ-4-メチルクマリ
ン、SucLLVY-AMC)が続いた。各プレートを次に、37°で更に30分間温置し、その
後200μlの停止緩衝液(0.1Mのクロロ酢酸、0.13Mの酢酸ナトリウム、0.1Mの酢酸
、pH4.3)により反応を停止させた。適切なデータ処理システムによりLabsystems
Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。結果は、アミノメチルクマ
リンの標準溶液に関して定量する。
μlの0.11mMの蛍光基質(サクシニル-Leu-Leu-Val-Tyr-7-アミノ-4-メチルクマリ
ン、SucLLVY-AMC)が続いた。各プレートを次に、37°で更に30分間温置し、その
後200μlの停止緩衝液(0.1Mのクロロ酢酸、0.13Mの酢酸ナトリウム、0.1Mの酢酸
、pH4.3)により反応を停止させた。適切なデータ処理システムによりLabsystems
Fluoroscan Ascent FL螢光計内で蛍光を測定する。結果は、アミノメチルクマ
リンの標準溶液に関して定量する。
【００７６】 対照分析 プロテアソームのプロテアーゼ活性に対する対照ウェルは上記と同一物を含む
が、TATは含まない。TATのプロテアーゼ活性に対する対照物は、プロテアソーム
・タンパク質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 基質ペプチドの開裂の後にのみ蛍光物質が放出された。緩衝液のみにより温置
された各プレートは、加水分解を殆どもしくは全く示さず、読取値は低いだろう
。プロテアソームのみでは基質の開裂が生じ、読取値は高い。Tatが存在すると
開裂は抑制されることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも低
いだろう。Tatの影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である。
が、TATは含まない。TATのプロテアーゼ活性に対する対照物は、プロテアソーム
・タンパク質以外は上記と同一物を含む。 分析法の原理 基質ペプチドの開裂の後にのみ蛍光物質が放出された。緩衝液のみにより温置
された各プレートは、加水分解を殆どもしくは全く示さず、読取値は低いだろう
。プロテアソームのみでは基質の開裂が生じ、読取値は高い。Tatが存在すると
開裂は抑制されることから、読取値はプロテアソーム・タンパク質のみよりも低
いだろう。Tatの影響が克服される度合は、試験化合物の有効性の尺度である。
【００７７】
【表７】
【００７８】 植物および人間以外の動物のバクテリア性並びにウイルス性の疾患は大きな経
済的負担の原因である。作物は発芽せず且つ繁茂しないこともあり、且つ、斯か
る感染によれば市場までの輸送の間における保存または最終消費者が制限を受け
ることも多い。園芸では更に、斯かる病害は斑点および奇形成長の原因となり得
る。食肉製品に対して課された現在の厳しい基準によれば、関与動物は屠殺時点
で非感染であることが要求される。農業的に重要な幼若動物の体重増加もまた、
感染疾患により相当に低下されることがある。特に一般種の耐性が高まれば、こ
れらの不経済な感染の防止を促進し得る。
済的負担の原因である。作物は発芽せず且つ繁茂しないこともあり、且つ、斯か
る感染によれば市場までの輸送の間における保存または最終消費者が制限を受け
ることも多い。園芸では更に、斯かる病害は斑点および奇形成長の原因となり得
る。食肉製品に対して課された現在の厳しい基準によれば、関与動物は屠殺時点
で非感染であることが要求される。農業的に重要な幼若動物の体重増加もまた、
感染疾患により相当に低下されることがある。特に一般種の耐性が高まれば、こ
れらの不経済な感染の防止を促進し得る。
【００７９】 プロテアソームは、RNA基質に対して特異性を有するエンドヌクレアーゼ活性
を示すべく遍在する小器官である[文献1]。これは今や特定されており[文献2]−
プロテアソームは、mRNAのUTRにおいて2個以上のAUUUA反復を含むAUリッチ素を
備えた配列を不安定化すると共に、Wennborg等により報告されたRNアーゼEのよ
うな活性と同一であり得る[文献3]。AUリッチ要素は、RNAおよびDNAウイルスの
両方のmRNA内に見られると共に、RNアーゼ攻撃に敏感な領域である。斯かる配列
は真核性mRNAでは希である[文献2,3]。
を示すべく遍在する小器官である[文献1]。これは今や特定されており[文献2]−
プロテアソームは、mRNAのUTRにおいて2個以上のAUUUA反復を含むAUリッチ素を
備えた配列を不安定化すると共に、Wennborg等により報告されたRNアーゼEのよ
うな活性と同一であり得る[文献3]。AUリッチ要素は、RNAおよびDNAウイルスの
両方のmRNA内に見られると共に、RNアーゼ攻撃に敏感な領域である。斯かる配列
は真核性mRNAでは希である[文献2,3]。
【００８０】 プロテアソームのエンドヌクレアーゼ活性には、２種類のα型サブユニット、
ゼータおよびイオタが関連し、これらの内のゼータの活性が大きい[文献5]。可
溶である精製済ゼータ・サブユニットはエンドヌクレアーゼ活性と、AUリッチ配
列に対する選択性を保持する。それは、タバコモザイクウイルス(TMV)からのRNA
を分解するが、5SリボソームのRNAもしくはグロビンmRNAは分解しない[文献1]。
プロテアソームのゼータ・サブユニットの典型的な配列は表２に例示されている
。
ゼータおよびイオタが関連し、これらの内のゼータの活性が大きい[文献5]。可
溶である精製済ゼータ・サブユニットはエンドヌクレアーゼ活性と、AUリッチ配
列に対する選択性を保持する。それは、タバコモザイクウイルス(TMV)からのRNA
を分解するが、5SリボソームのRNAもしくはグロビンmRNAは分解しない[文献1]。
プロテアソームのゼータ・サブユニットの典型的な配列は表２に例示されている
。
【００８１】
【表８】
【００８２】 バクテリア性もしくはウイルス性の感染被害に対する抵抗力の生成 第5の側面において本発明は、(例えば[文献6]における植物などでの)宿主ゲノ
ム内への、プロテアソーム・ゼータ・サブユニットに対する遺伝子のトランスフ
ェクションと、一般的であり得る特定プロモータの制御下における上記遺伝子の
発現([文献7]参照)、または、外因性化合物の添加により誘導可能な上記遺伝子
の発現([文献8]参照)とから成る。このプロモータが活性化されたとき、ゼータ
・サブユニットが細胞質内で合成され、認識および開裂部位(AUリッチ)配列を含
むウイルス性およびバクテリア性RNAを破壊することから、感染の結末に対する
抵抗力が生成され、原因生物体が蔓延するのが防止される。
ム内への、プロテアソーム・ゼータ・サブユニットに対する遺伝子のトランスフ
ェクションと、一般的であり得る特定プロモータの制御下における上記遺伝子の
発現([文献7]参照)、または、外因性化合物の添加により誘導可能な上記遺伝子
の発現([文献8]参照)とから成る。このプロモータが活性化されたとき、ゼータ
・サブユニットが細胞質内で合成され、認識および開裂部位(AUリッチ)配列を含
むウイルス性およびバクテリア性RNAを破壊することから、感染の結末に対する
抵抗力が生成され、原因生物体が蔓延するのが防止される。
【００８３】
【表９】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１９日（２０００．８．１９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 37/04 31/18 43/00 １１１ 37/04 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 43/00 １１１ 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/70 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ９８１２７５８．２ (32)優先日 平成10年６月13日(1998．6．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８１２７５９．０ (32)優先日 平成10年６月13日(1998．6．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８１２７６０．８ (32)優先日 平成10年６月13日(1998．6．13) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 クレッツェル，ペーター−ミヒャエル ドイツ連邦共和国，デー−12557 ベルリ ン，オステンドルフ シュトラーセ 15 (72)発明者 ジャルーズ，アンヌ−ソフィー フランス国，エフ−63670 オルセ，ラ ポムレーヌ，11 (72)発明者 ゴーティエ，カリーヌ フランス国，エフ−63430 ポン デュ シャトー，シュマン ドゥ ラ キュアル トゥ，７ (72)発明者 バダウイー，サルーア フランス国，エフ−63000 クレルモン− フェラン，リュ デュ ポール，65 (72)発明者 ムーズヤール，セ フランス国，エフ−63000 クレルモン− フェラン，リュ ドゥ ワイリー，49 (72)発明者 ニコラ，パウル フランス国，エフ−63122 オシィラ，ア ブニュ ドゥ フォンティンベール ７ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 BA14 CA12 DA01 EA04 FA02 FA11 GA11 HA08 4B063 QA01 QA05 QQ10 QQ20 QQ34 QQ36 QR14 QR16 QR32 QR48 QR51 QS36 QX02 QX07 4C084 AA02 AA13 AA16 NA14 ZB071 ZB072 ZB111 ZB112 ZB331 ZB332 ZC551 ZC552
Claims (36)
- 【請求項１】 ウイルス成分またはウイルス感染により誘起された分子に対
してプロテアソームが行う分解を増加することによりウイルス複製および発病を
抑制する化合物を特定する分析法であって、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)、ウイルス遺伝子生成物およびタ
ンパク質基質もしくはペプチド基質と化合物とを反応させる段階と、 プロテアーゼ活性を測定する段階と、 当該分析系のプロテアーゼ活性が増大されたならば、上記化合物を抑制物質と
して特定する段階を含む分析法。 - 【請求項２】 ウイルス成分またはウイルス感染により誘起された分子に対
してプロテアソームが行う分解を増加することによりウイルス複製および発病を
抑制する化合物を特定する分析法であって、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)および、ウイルスのリボ核酸もし
くはデオキシリボ核酸またはプロテアソーム・サブユニットによりもしくはプロ
テアソーム・サブユニットに結合する他の宿主タンパク質により認識される配列
を含有するオリゴヌクレオチドと化合物とを反応させる段階と、 核酸分解酵素活性を測定する段階と、 当該分析系の核酸分解酵素活性が増大されたならば、上記化合物を抑制物質と
して特定する段階を含む分析法。 - 【請求項３】 プロテアソームのタンパク質分解活性もしくは核酸分解酵素
活性が調整されるように、ウイルスによりコード化されたタンパク質もしくは核
酸を結合する宿主タンパク質を更に含む、請求項１または２に記載の分析法。 - 【請求項４】 活性が、分光測光、蛍光測光、放射測定もしくは化学発光に
より測定される、請求項１、２または３に記載の分析法。 - 【請求項５】 ウイルス抑制物質を特定する分析法を実施する為の、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、 ウイルス遺伝子生成物と、 タンパク質基質もしくはペプチド基質と、 を備えるキット。 - 【請求項６】 ウイルス抑制物質を特定する分析法を実施する為の、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)、および、 ウイルスのリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸、または、 プロテアソーム・サブユニットによりもしくはプロテアソーム・サブユニット
に結合する他の宿主タンパク質により認識される配列を含有するオリゴヌクレオ
チド、 を備えるキット。 - 【請求項７】 感染患者におけるウイルス疾患の療法において有用であると
共に、先行請求項のいずれかに記載の分析法もしくはキットを使用して得られた
もしくは得ることができる抑制化合物、抑制アミノ酸配列および(ペプチド的も
しくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成物。 - 【請求項８】 請求項１、２または３に記載の分析法により得られた抑制物
質を投与することにより感染患者のウイルス疾患を治療する方法。 - 【請求項９】 プロテアソームによる特異的伝令リボ核酸の破壊の速度を調
整することにより、サイトカイン、リンパ球および他の調節タンパク質の濃度を
変更する化合物を特定する分析法であって、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、一個以上のAUUUA[配列番号4]
認識配列を含む3'領域を備えた合成オリゴヌクレオチドとを、20Sプロテアソー
ムのサブユニットの又は19Sもしくは11S複合体のサブユニットの一個以上に結合
することにより核酸分解酵素活性を調節する特異的タンパク質と共に又は該特異
的タンパク質無しで、化合物とを反応させる段階と、 核酸分解酵素活性を測定する段階と、 プロテアソーム・エンドヌクレアーゼによる、オリゴヌクレオチドの開裂の速
度における一切の変化を特定する段階と、 を備えて成る、分析法。 - 【請求項１０】 前記化合物は、前記オリゴヌクレオチド中の一個以上のAU
UUA配列に対し、20Sプロテアソームの一個以上または19Sもしくは11S複合体の一
個以上に対し、或いは、調節タンパク質に対して結合するものである、請求項９
記載の分析法。 - 【請求項１１】 前記核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光、放射測定
もしくは化学発光により測定される、請求項９または１０に記載の分析法。 - 【請求項１２】 プロテアソームによる特異的伝令リボ核酸の破壊の速度を
調整することにより、サイトカイン、リンパ球および他の調節タンパク質の濃度
を変更する化合物を特定する分析法を実施する為の、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有する、または19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、 一個以上のAUUUA認識配列を含む3'領域を備える合成オリゴヌクレオチドとを
備え、20Sプロテアソームのサブユニットの又は19Sもしくは11S複合体のサブユ
ニットの一個以上に結合することにより核酸分解酵素活性を調節する特定タンパ
ク質を含み又は該特定タンパク質を含まない、 キット。 - 【請求項１３】 炎症疾患の療法において有用であると共に、先行請求項の
いずれかに記載の分析法を使用して得られたもしくは得ることができる化合物、
アミノ酸配列、および、(ペプチド的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらか
ら誘導される薬用組成物。 - 【請求項１４】 請求項９、１０または１１に記載の分析法により得られた
化合物を投与することにより炎症疾患の患者を治療する方法。 - 【請求項１５】 HIV Tatタンパク質の機能を抑制する化合物を特定する分
析法であって、 一個以上の核酸分解酵素AUUUA認識配列の上流におけるTAR配列を備えた合成オ
リゴヌクレオチドと、核酸分解酵素活性を有すると共に20S、19Sおよび11S成分
のいずれかもしくは全てを備えたプロテアソームの調製物と、HIV Tat、または
、HIV Tatのアミノ酸48〜57の配列および／又は20S、19Sもしくは11Sのプロテア
ソームの複合体への結合に関与する配列を含むポリペプチドと、化合物とを反応
させる段階と、 核酸分解酵素活性を測定する段階と、 上記分析系の核酸分解酵素活性が増大されたならば、上記化合物を抑制物質と
して特定する段階とを含む分析法。 - 【請求項１６】 前記分析系における核酸分解酵素活性が増大するように、
前記化合物は、Tatに対し、添加されたポリペプチドに対し、添加されたオリゴ
ヌクレオチドに対し、または、核酸分解酵素活性の抑制を仲介するプロテアソー
ム・サブユニットに対し、結合する、請求項１５記載の分析法。 - 【請求項１７】 前記核酸分解酵素活性は、分光測光、蛍光測光、放射測定
もしくは化学発光により測定される、請求項１５または１６に記載の分析法。 - 【請求項１８】 Tat抑制物質を特定する分析法を実施する為の、 二個以上のAUUUA配列の上流におけるTAR配列を備えた合成オリゴヌクレオチド
と、 核酸分解酵素活性を有すると共に20S、19Sおよび11S成分のいずれかもしくは
全てを備えたプロテアソームの培養物と、 HIV Tat、または、HIV Tatのアミノ酸48〜57の配列および／又は20S、19Sもし
くは11Sのプロテアソームの複合体への結合に関与する配列を含むポリペプチド
と を含むキット。 - 【請求項１９】 HIV感染患者のAIDSの治療に有用であると共に、先行請求
項のいずれかに記載の分析法もしくはキットを使用して得られたもしくは得るこ
とができるTat抑制化合物、抑制アミノ酸配列、および、(ペプチド的もしくは擬
ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成物。 - 【請求項２０】 請求項１５、１６または１７に記載の分析法により得られ
たTat抑制物質を投与することによりHIV感染患者のAIDSを治療する方法。 - 【請求項２１】 請求項１５乃至１８のいずれかに記載の分析法もしくはキ
ットで使用される合成オリゴヌクレオチドTARAU4(配列番号1)。 - 【請求項２２】 HIV Tatタンパク質の機能を抑制する化合物を特定する方
法であって、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)と、Tatタンパク質(もしくは、Tat
の内で、プロテアソーム・サブユニットと相互作用するタンパク質の領域を含む
部分的配列)と、タンパク質もしくはペプチド基質と、化合物とを反応させる段
階と、 プロテアーゼ活性を測定する段階と、 当該分析系のプロテアーゼ活性が増大されたならば、上記化合物を抑制物質と
して特定する段階とを含む分析法。 - 【請求項２３】 前記化合物はTatもしくはプロテアソーム・サブユニット
に結合することにより、前記分析系におけるプロテアーゼ活性が増大されるよう
に、プロテアーゼ活性の抑制を仲介する、請求項２２記載の分析法。 - 【請求項２４】 タンパク質分解活性は、蛍光、光吸収、ルミネセンスもし
くは放射能により測定される、請求項２２または２３に記載の分析法。 - 【請求項２５】 Tat抑制物質を特定する分析法を実施する為の、 プロテアソーム・タンパク質(19Sおよび11S複合体を別個に有するかまたは19S
および11S複合体無しの、20Sプロテアソーム)、 Tatタンパク質(もしくは、Tatの内で、プロテアソーム・サブユニットと相互
作用するタンパク質の領域を含む部分的配列)、および、 タンパク質基質もしくはペプチド基質と、 を備えるキット。 - 【請求項２６】 HIV感染患者におけるAIDSの療法において有用であると共
に、先行請求項のいずれかに記載の分析法もしくはキットを使用して得られたも
しくは得ることができるTat抑制化合物、抑制アミノ酸配列、および、(ペプチド
的もしくは擬ペプチド的に関わらず)それらから誘導される薬用組成物。 - 【請求項２７】 請求項２２、２３または２４に記載の分析法により得られ
たTat抑制物質を投与することによりHIV感染患者のAIDSを治療する方法。 - 【請求項２８】 ヒト以外の宿主ゲノム内への、プロテアソーム・ゼータ・
サブユニットに対する遺伝子のトランスフェクションと、特定のプロモータの制
御下における上記遺伝子の発現と、から成り、これにより、上記プロモータが活
性化されたとき、ゼータ・サブユニットが細胞質内で合成され、認識および開裂
部位(AUUUA)配列を含むウイルス性またはバクテリア性RNAを破壊する、 宿主に対するバクテリア性またはウイルス性感染の損傷効果に対する抵抗力を
生成する方法。 - 【請求項２９】 前記プロモータは少なくとも一種の内因性化合物の添加に
より誘導可能である、請求項２８記載の方法。 - 【請求項３０】 前記宿主が植物である、請求項２８または２９に記載の方
法。 - 【請求項３１】 プロテアソーム・ゼータ・サブユニット[配列番号6]をコ
ードする単離DNAセグメント。 - 【請求項３２】 請求項３１の単離DNAセグメントと共に、該DNAの発現を制
御する特定のプロモータを含む、ベクター。 - 【請求項３３】 請求項３２の前記ベクターにより形質転換されたヒト以外
の宿主細胞。 - 【請求項３４】 プロテアソーム・ゼータ・サブユニットをコードする導入
遺伝子を自身のゲノム内に担持する植物。 - 【請求項３５】 請求項７、１３、１９および２６のいずれかに記載の、化
合物もしくは化合物の前駆体をコードする単離DNAセグメント。 - 【請求項３６】 請求項３５の単離DNAセグメントと共に、該DNAの発現を制
御する特定のプロモータを含む、ベクター。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9812757.4 | 1998-06-13 | ||
| GBGB9812756.6A GB9812756D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-06-13 | Assay procedure for identifying inhibitors of the nuclease-inhibitory function of the human immunodeficiency virus tat protein |
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