JP2002518011A - 殺菌性／透過性増加タンパク質（ｂｐｉ）欠失アナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 成熟ヒトＢＰＩのアミノ酸残基（１０〜１９３）からなる新規なＢＰＩ欠失アナログが提供される。ここで、ＢＰＩアミノ酸の（１３２）位のシステイン残基は、別のアミノ酸によって置換される。これらのアナログを含む融合タンパク質もまた提供され、これらの産物をコードするポリヌクレオチド、これらの組換え産生のための材料および方法、これらの産物の組成物および医薬、ならびにこれらの産物の治療的使用も同様に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は、改善された安定性および均質性、ならびに増強されたインビボでの
活性によって特徴付けられる、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）の新規
な生物学的に活性な欠失アナログの調製物、およびこれを含む薬学的組成物を提
供する。

【０００２】 ＢＰＩは、哺乳動物多形核白血球（ＰＭＮまたは好中球）（これは、侵襲性微
生物に対する防御に必須である血球である）の顆粒から単離されたタンパク質で
ある。ＢＰＩは、リポポリサッカリドに結合することが公知であり、リポポリサ
ッカリドは、敗血症ショックを導き得る強力な炎症性応答を刺激するグラム陰性
細菌の外膜の主要成分である。ヒトＢＰＩタンパク質は、イオン交換クロマトグ
ラフィー［Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１１０００（
１９７９）］またはＥ．ｃｏｌｉアフィニティークロマトグラフィー［Ｗｅｉｓ
ｓら、Ｂｌｏｏｄ，６９：６５２（１９８７）]のいずれかと組合せた酸抽出に
よって、ＰＭＮから単離されている。このような様式から得られたＢＰＩは、本
明細書中で天然のＢＰＩと称され、そしてグラム陰性細菌の広範なスペクトルに
対して強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトＢＰＩの分子量は、約
５５，０００ダルトン（５５ｋＤ）である。ヒトＢＰＩタンパク質全体のアミノ
酸配列およびこのタンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列は、Ｇｒａｙら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５０５（１９８９）（本明細書中で参考と
して援用される）の図１に報告されている。このＧｒａｙらのアミノ酸配列は、
本明細書中で配列番号１と示される。米国特許第５，１９８，５４１号（この開
示は本明細書中で参考として援用される）は、組換えＢＰＩホロタンパク質（ｒ
ＢＰＩと称する）およびＢＰＩの組換えフラグメントを含むＢＰＩタンパク質を
コードする組換え遺伝子、およびその発現方法を開示する。

【０００３】 約２５ｋＤの分子量を有するＢＰＩのタンパク質分解性Ｎ末端フラグメントは
、交互の疎水性領域および親水性領域を含み、両親媒性の性質を有する。ヒトＢ
ＰＩのこのＮ末端フラグメントは、天然由来の５５ｋＤヒトＢＰＩホロタンパク
質の抗菌活性を有する［Ｏｏｉら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１４８９
１−１４８９４（１９８７）］。このＮ末端部分とは対照的に、単離されたヒト
ＢＰＩタンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してわずかに検出可能な
抗菌活性を示すのみである［Ｏｏｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：６４９
（１９９１）］。約２３ｋＤのＮ末端ＢＰＩフラグメント（「ｒＢＰＩ₂₃」と称
する）は、組換え手段によって産生されており、そしてまたグラム陰性生物に対
する抗菌活性を保持する［Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．
Ｉｍｍｕｎ．６０：４７５４−４７６１（１９９２）］。ＢＰＩのＮ末端アナロ
グであるｒＢＰＩ₂₁は、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ，８：２８−４０（１９９６）に記載のように産
生されている。

【０００４】 ＢＰＩの殺菌効果は、例えば、ＥｌｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓ、Ｉｎｆｌａ
ｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ、Ｇａｌｌｉｎら編、第３０章 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｌｔｄ．（１９９２）において、グラム陰性種に高度に特異的であること
が報告されている。これは、標的細胞の特異性が、グラム陰性生物の外膜（すな
わち、エンベロープ）に特有であるリポポリサッカリド（ＬＰＳ）に対する、Ｂ
ＰＩの強力な誘引性の結果であると考えられることを報告した。ＢＰＩは、他の
微生物（酵母を含む）および高等真核生物細胞に非毒性であると一般に考えられ
ていたが、最近、以下に議論するように、ＢＰＩタンパク質産物が、グラム陽性
細菌、マイコプラズマ、マイコバクテリア、真菌、原生動物、およびクラミジア
に対して活性を示すことが発見されている。

【０００５】 ＢＰＩがグラム陰性細菌を殺傷する正確な機構は、まだ完全に解明されていな
いが、ＢＰＩが、第一にその細菌の表面に、カチオン性ＢＰＩタンパク質とＬＰ
Ｓの負に荷電した部位との間の静電気的相互作用および疎水的相互作用を介して
結合するはずであると考えられている。ＬＰＳは、それが刺激する強力な炎症性
応答（すなわち、最終的に不可逆的な内毒素性ショックを生じ得る、宿主炎症性
細胞による媒介物の放出）に起因して、「内毒素」と呼ばれている。ＢＰＩは、
ＬＰＳの最も毒性でかつ最も生物学的に活性な成分であると報告されている、リ
ピドＡに結合する。

【０００６】 感受性のグラム陰性細菌において、ＢＰＩ結合は、ＬＰＳ構造を破壊して、こ
のことが、リン脂質およびペプチドグリカンを分解する細菌性酵素の活性化を導
き、その細胞の外膜の透過性を変更し、そして最終的に細胞死を導く事象を開始
すると考えられる［ＥｌｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓ（１９９２）前出］。ＢＰ
Ｉは、２段階において作用すると考えられる。第一は、致死下段階であり、これ
は、中程度の増殖阻止、外膜の透過化、ならびにリン脂質およびペプチドグリカ
ンを加水分解する細菌性酵素の選択的活性化によって特徴付けられる。この段階
の細菌は、血清アルブミン補充培地中の増殖によってレスキューされ得る［Ｍａ
ｎｎｉｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８５：８５３−８６０（１９９
０）］。第二段階は、血清アルブミンによってレスキューされ得ず、細菌のＢＰ
Ｉへ長期間の曝露後に起こり、そして広範な生理学的および構造的変化（内部細
胞質膜に対する明らかな損傷を含む）によって特徴付けられる増殖阻害によって
定義される。

【０００７】 ＢＰＩのＬＰＳへの最初の結合は、おそらく、Ｍｇ⁺⁺およびＣａ⁺⁺の結合を介
して外膜を正常に安定化するＬＰＳのアニオン基への結合から生じる組織的変化
を導く。グラム陰性細菌の外膜へのＢＰＩの結合は、アクチノマイシンＤのよう
な疎水性薬剤に対する、外膜の迅速な透過化を生じる。ＢＰＩの結合および引き
続くグラム陰性細菌の殺傷は、ＬＰＳ多糖鎖の長さに、少なくとも一部依存し、
ここで、長いＯ鎖を有する「スムーズ（ｓｍｏｏｔｈ）」な生物体は、短いＯ鎖
を有する「ラフ（ｒｏｕｇｈ）」な生物体よりもＢＰＩの殺菌効果により耐性で
ある［Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６５：６１９−６２８（１
９８０）］。このＢＰＩ作用の第一段階である、グラム陰性の外エンベロープの
透過化は、ＢＰＩの解離に対して可逆的であり、この解離は、高濃度の二価のカ
チオンおよび新しいＬＰＳの合成を必要とするプロセスである［Ｗｅｉｓｓら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３１０９−３１１５（１９８４）］。しかし、グ
ラム陰性細菌の生存能力の損失は、エンベロープの完全性を回復するプロセスに
よって逆転されず、このことは、殺菌作用が標的生物中に誘導されそして細胞質
膜に位置され得る、さらなる損傷によって媒介されることを示唆する（Ｍａｎｎ
ｉｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６：６３１−６４１（１９９０））
。この可能性の特定の研究は、モル濃度標準のＢＰＩが、少なくともポリミキシ
ンＢと同様の細胞質膜小胞の機能の抑制性であることを示すが（Ｉｎ’ｔ Ｖｅ
ｌｄら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５６：１２０３−１
２０８（１９８８））、正確な機構およびこのような小胞のインタクトな生物の
研究との関連性は未だ解明されていない。

【０００８】 ＢＰＩタンパク質産物（天然に産生されたＢＰＩタンパク質および組換え的に
産生されたＢＰＩタンパク質；ＢＰＩタンパク質の天然、合成および組換えの生
物学的に活性なポリペプチドフラグメント；ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性
なポリペプチド改変体（ハイブリッド融合タンパク質および二量体を含む）また
はそのフラグメント；ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドアナロ
グ（システイン置換型アナログを含む）あるいはそのフラグメントまたは改変体
；およびＢＰＩ由来のペプチドを含み）は、種々の有利な活性を有することが実
証されている。ＢＰＩタンパク質産物は、グラム陰性細菌に殺菌性であることが
公知である（米国特許第５，１９８，５４１号および同第５，５２３，２８８号
（両者は本明細書中に参考として援用される）に記載される）。ＢＰＩタンパク
質産物はまた、グラム陰性細菌感染の際の抗生物質治療の効果を増強することが
公知である（米国特許第５，５２３，２８８号および対応する国際公開番号ＷＯ
９５／０８３４４（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２２５）（これらは、本明細書中に
参考として援用される）に記載される）。ＢＰＩタンパク質産物はまた、グラム
陽性細菌およびマイコプラズマに殺菌性であり、そしてグラム陽性細菌感染の際
の抗生物質の効果を増強することが公知である（米国特許第５，５７８，５７２
号および対応する国際公開番号ＷＯ９５／１９１８０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００
６５６）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される）。Ｂ
ＰＩタンパク質産物はさらに、抗真菌活性を示すこと、および他の抗真菌剤の活
性を増強することが公知である（米国特許第５，６２７，１５３号および対応す
る国際公開番号ＷＯ９５／１９１７９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００４９８）に記載
され、そしてさらに抗真菌ペプチドについては、共有に係る、同時係属米国特許
出願第０８／６２１，２５９号（１９９６年３月２１提出）（これは、米国特許
第出願０８／５０４，８４１号（１９９４年７月２０日提出）ならびに対応する
国際特許番号ＷＯ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）およびＷ
Ｏ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）の一部継続出願である）
（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載される）。ＢＰＩ
タンパク質産物はさらに、抗原生生物活性を示すことが公知である（米国特許第
５，６４６，１１４号および対応する国際公開番号ＷＯ９６／０１６４７（ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９５／０８６２４）（これら全ては、本明細書中に参考として援用され
る）に記載される）。ＢＰＩタンパク質産物はさらに、抗クラミジア活性を示す
ことが公知である（共有に係る、同時係属米国特許出願第０８／６９４，８４３
号（１９９６年８月９提出）および対応する国際特許番号ＷＯ９８／０６４１５
（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３８１０）（これら全ては、本明細書中に参考として援
用される）に記載される）。最後に、ＢＰＩタンパク質産物は、抗マイコバクテ
リア活性を示すことが公知である（これは、共有に係る、同時係属米国特許出願
第０８／６２６，６４６号（１９９６年４月１提出）に記載され、これはまた、
米国特許出願第０８／２８５，８０３号（１９９４年８月１４日提出）の継続出
願であり、これはまた、米国特許出願第０８／０３１，１４５号（１９９３年３
月１２日提出）、ならびに対応する国際特許番号ＷＯ９４／２０１２９（ＰＣＴ
／ＵＳ９４／０２４６３）の一部継続出願である（これら全ては、本明細書中に
参考として援用される））。

【０００９】 循環中に内毒素を有するヒトにおけるＢＰＩタンパク質産物の効果（ＴＮＦ、
ＩＬ−６および内毒素に対する効果を含む）は、米国特許第５，６４３，８７５
号および同第５，７５３，６２０号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９５／１
９７８４（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１１５１）（これら全ては、本明細書中に参考
として援用される）に記載される。

【００１０】 ＢＰＩタンパク質産物はまた、例えば、以下の特定の疾患状態の処置に有用で
あることが公知である；ヒトにおける髄膜炎菌血症（共有に係る、同時係属米国
特許出願第０８／６４４，２８７号（１９９６年５月１０提出）および対応する
国際公開番号ＷＯ９７／４２９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８０１６）（これら
全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載される）、ヒトにおける出
血性外傷（共有に係る、同時係属米国特許出願第０８／８６２，７８５号（１９
９６年５月１０提出）（米国特許出願第０８／６５２，２９２号（１９９６年５
月２３日提出）（現在の米国特許第５，７５６，４６４号）の一部継続出願）お
よび対応する国際公開番号ＷＯ９７／４４０５６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８９４
１）（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載される）、熱
傷（米国特許第５，４９４，８９６および対応する国際公開番号ＷＯ９６／３０
０３７（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２３４９）（両者は、本明細書中に参考として援
用される）に記載される）、虚血／再灌流障害（米国特許第５，５７８，５６８
号（本明細書中に参考として援用される）に記載される）、および肝臓切除（こ
れは、共有に係る、同時係属米国特許出願第０８／５８２，２３０号（１９９８
年３月１６提出）に記載され、これは、同番号（１９９６年１月３日提出）の継
続出願であり、これはまた、米国特許第出願０８／３１８，３５７号（１９９４
年１０月５日提出）の継続出願であり、これはまた、米国特許出願第０８／１３
２，５１０号（１９９３年１０月５日提出）、ならびに対応する国際特許番号Ｗ
Ｏ９５／１０２９７（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４０４）の一部継続出願である（
これら全ては、本明細書中に参考として援用される））。

【００１１】 ＢＰＩタンパク質産物はまた、外因性ヘパリンの抗凝固活性を中和することが
また公知であり（米国特許第５，３４８，９４２号（本明細書中に参考として援
用される）に記載される）、および慢性炎症性疾患（例えば、慢性関節リウマチ
および反応性関節炎）の処置（米国特許第５，６３９，７２７号（本明細書中に
参考として援用される）に記載される）、ならびに親脈管形成の阻害および親脈
管形成関連障害（悪性腫瘍、眼の網膜症および子宮内膜症を含む）の処置に（共
有に係る、同時係属米国特許出願第０８／４３５，８５５号、同第０８／４６６
，６２４号および同第０８／６６，８２６号、ならびに対応する国際公開番号Ｗ
Ｏ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）（これら全ては、本明細
書中に参考として援用される）に記載される）に有用であることが公知である。

【００１２】 ＢＰＩタンパク質産物はまた、抗トロンビン法での使用について公知である（
米国特許第５，７４１，７７９号および対応する国際公開番号ＷＯ９７／４２９
６７（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８０１７）（これら全ては、本明細書中に参考とし
て援用される）に記載される）。

【００１３】 米国特許第５，４２０，０１９号および同第５，６７４，８３４号ならびに対
応する国際公開番号ＷＯ９４／１８３２３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３５）（
これら全ては、本明細書中に参考として援用される）は、アミノ酸１３２位また
は１３５位のシステイン残基の別のアミノ酸による置換が、この生じたＢＰＩポ
リペプチドに二量体化およびシステイン付加物形成に対する抵抗性を与えること
を開示する。これらは、Ｎ末端ＢＰＩフラグメントをＢＰＩアミノ酸残基１９３
で終結させることによって、カルボキシ末端異質性が減少された発現産物を生じ
ることもまた開示する。

【００１４】 成熟ＢＰＩのアミノ酸残基１〜１９３をコードするＤＮＡのインビトロ転写／
翻訳産物（ＢＰＩ_1-193）およびアミノ酸残基１３〜１９３をコードするＤＮＡ
のインビトロ転写／翻訳産物（ＢＰＩ_13-193）が、固定されたＬＰＳに対する同
様のＬＰＳ依存性の結合を示すという、ＣａｐｏｄｉｃｉおよびＷｅｉｓｓ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：４７８９−４７９６（１９９６）での報告は興味
深い。

【００１５】 改善された生物学的に活性なＢＰＩタンパク質調製物、特に安定性、均質性お
よび／またはインビボでの生物学的活性が増強されたＢＰＩタンパク質調製物に
ついての、当該分野における必要性が存在し続ける。

【００１６】 （発明の要旨） 本発明は、改善された安定性および均質性（例えば、組換え産物の二量体化お
よびシステイン付加物形成に対する抵抗性、ならびに組換え産物のアミノ末端お
よびカルボキシ末端の減少された異質性を含む）、ならびに増強されたインビボ
での生物学的活性（治療的および診断的使用にそれを高度に適切にさせる特性）
によって特徴付けられる、新規な生物学的に活性なＢＰＩ欠失アナログおよびそ
の調製物を提供する。新規なＢＰＩ欠失アナログは、成熟ヒトＢＰＩ（配列番号
２）のアミノ酸残基１０〜１９３をコードするＤＮＡの発現産物であり、ここで
、１３２位のシステイン残基は、異なるアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸（
例えば、セリンまたはアラニン）で置換されている。好ましい実施態様（「ｒＢ
ＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ」または「ｒＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａ^{13 2} 」と称される）において、１３２位のシステインがアラニンで置換されること
を示す。

【００１７】 本発明はさらに、これらのＢＰＩタンパク質産物をコードする新規な精製およ
び単離されたポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；これらの
組換え産生のための材料および方法（ベクターおよびそのＤＮＡを含む宿主細胞
）；これらのＢＰＩタンパク質産物を含む改善された安定な薬学的組成物；なら
びにこれらの組成物の単独または他の治療剤との同時投与のいずれかを用いる改
善された処置方法を提供する。ＢＰＩタンパク質産物の投与によって利益を受け
る被験体を処置するための医薬の製造における、本発明のＢＰＩ欠失アナログの
使用もまた意図される。

【００１８】 本発明の多くのさらなる局面および利点は、以下の発明の詳細な説明（本発明
の好ましい実施態様を記載する）を考慮して、当業者に明らかになる。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 本発明は、成熟ヒトＢＰＩ（配列番号２に示される）のアミノ酸残基１０〜１
９３からなる新規なＢＰＩ欠失アナログを提供し、ここで、ＢＰＩのアミノ酸１
３２位のシステイン残基は、別のアミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸（例えば
、セリンまたはアラニン）で置換される。１３２位のシステインがアラニンで置
換される好ましい実施態様は、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡまたはｒＢ
ＰＩ（１０−１９３）ａｌａ¹³²と称されている。

【００２０】 ＢＰＩタンパク質産物ｒＢＰＩ₂₁は、成熟ヒトＢＰＩのアミノ酸残基１〜１９
３をコードするＤＮＡの発現産物であり、ここで、残基番号１３２のシステイン
はアラニンで置換される（米国特許第５，４２０，０１９号に記載される）。よ
り高い細胞密度およびより高いｒＢＰＩ₂₁力価を達成する組換え方法によりｒＢ
ＰＩ₂₁を産生するために使用される発酵工程における変化は、その精製産物のア
ミノ末端の異質性の見かけの増加を生じた。いくつかの発酵工程において、約２
０％までの精製産物が、コードされるアミノ酸１−１９３よりもむしろ、ＢＰＩ
のアミノ酸１０−１９３を有する種であることが観察された。発酵工程の過程に
わたる５００リットル発酵槽サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、この１０−１
９３の種が、この工程の最後の２〜３日に現れ、収集日に最大量を生じることを
示した。さらなる研究によって、ｒＢＰＩ₂₁のＣＨＯ−Ｋ１細胞ホモジネートと
のインキュベーションは、消化産物を生じることが明らかにされ、このことは、
細胞に付随するプロテアーゼ活性が関与されることを示唆する。制御された様式
でプロテアーゼ活性を刺激するために、ｒＢＰＩ₂₁を、アミノペプチダーゼＭと
エラスターゼと共にインキュベートした。ｒＢＰＩ₂₁はアミノペプチダーゼＭ消
化に耐性であったが、エラスターゼは、ｒＢＰＩ₂₁を４０％のＢＰＩ（８−１９
３）および６０％のＢＰＩ（１０−１９３）に迅速に変換した。

【００２１】 本明細書中に記載されるように、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａの安定
な均質な調製物を、タンパク質分解的にまたは組換え方法によって産生した。タ
ンパク質を精製し、そして生物学的活性について試験した。ｒＢＰＩ（１０−１
９３）Ｃ１３２ＡをｒＢＰＩ₂₁と比較するために、いくつかのインビトロの生物
学的アッセイ、２つの異なる動物の有効性モデルにおいて、および薬物動態学的
および毒性学的研究において、実験を行った。実施例５〜７に記載のように、ｒ
ＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｊ５での放射状拡散殺菌アッセイおよびブロス微量希釈殺菌アッ
セイ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＬ型での放射状拡散アッ
セイ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳでの競合結合アッセイ、およびＲＡＷおよび
ＴＨＰ１細胞でのＬＰＳ中和アッセイにおいて比較した場合、同様のインビトロ
活性を有した。実施例５において記載されるさらなる実験は、ｒＢＰＩ（１０−
１９３）Ｃ１３２Ａは、速度比濁分析を用いたＬＰＳ結合アッセイにおいて、ｒ
ＢＰＩ₂₁より約２倍強力であるようである。実施例８に記載されるように、精製
ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁は、３日間、１２０ｍｇ
／ｋｇ／日までの用量で、ラットにおいてＧＬＰ毒性学的研究における同様の毒
性プロフィールを有し、そして２ｍｇ／ｋｇの用量で、ラットにおいて同様の薬
物動態を有した。実施例８に記載の実験はまた、マウス内毒素チャレンジモデル
において、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａが、この２つの研究においてｒ
ＢＰＩ₂₁より少なくとも２倍強力であるようであるが、致死性菌血症のマウスモ
デルにおいては、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁は、同
様に強力であることを示した。意識のあるラットにおけるさらなるインビボ実験
において、４０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ用量の注入されたｒＢＰＩ₂₁は
、ビヒクルコントロールと比べて血圧の有意な一過的低下を引き起こしたが、同
用量のｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａは、コントロールと比べて血圧の統
計的に有意な一過的低下を生じなかった。従って、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ
１３２Ａの注入は、ｒＢＰＩ₂₁の注入と比較して、血圧における有害な効果の減
少を提供するようである。

【００２２】 本発明はさらに、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａの少なくとも１つの他
のポリペプチドの少なくとも一部との融合体を意図する。このようなハイブリッ
ド融合タンパク質の例は、米国特許第５，６４３，５７０号および対応する国際
公開番号ＷＯ９３／２３４３４（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５４）（これらは、
本明細書中に参考として援用される）に記載され、そしてこれらは、アミノ末端
側で、ＢＰＩタンパク質または生物学的に活性なそのフラグメント、ならびにカ
ルボキシ末端側で、免疫グロブリン重鎖の少なくとも１つの定常ドメインまたは
その対立遺伝子改変体を含む、ハイブリッド融合タンパク質を含む。

【００２３】 本発明は、さらに、以下を意図する：本発明の新規のＢＰＩ欠失アナログまた
は融合タンパク質をコードする精製されそして単離されたポリヌクレオチド配列
（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；好ましくは、内因性または異種の発現制御配
列に作動可能に連結されている、このようなポリヌクレオチドを含有する発現ベ
クター；本発明のＤＮＡまたはベクターで安定にトランスフェクトまたは形質転
換された原核生物または真核生物の宿主細胞；および本発明の新規の欠失アナロ
グＢＰＩタンパク質産物の組換え産生のための方法（例えば、宿主細胞が適切な
栄養培地中で増殖され、そして欠失アナログＢＰＩタンパク質産物が細胞または
培地から単離される方法）。このようなポリヌクレオチド配列またはベクターは
、必要に応じて２７アミノ酸のＢＰＩリーダー配列およびマウス軽鎖ポリアデニ
ル化シグナルをコードし得る。

【００２４】 本発明の組換え的に産生された新規のＢＰＩ欠失アナログは、米国特許第５，
４３９，８０７号および対応する国際公開番号ＷＯ９３／２３５４０（ＰＣＴ／
ＵＳ９３／０４７５２）（それらは、すべて参考として本明細書に援用される）
に記載される方法に従って生成され得る。米国特許第５，４３９，８０７号は、
培養中の遺伝的にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞において発現されそ
して分泌された組換えＢＰＩタンパク質産物の精製の方法を開示し、そして安定
で均一な薬学的調製物への組み込みに適切な大量の組換えＢＰＩ産物を生成し得
る方法を開示する。

【００２５】 本発明はさらに、新規なＢＰＩ欠失アナログを含む改善された安定な薬学的組
成物、およびこれらの組成物を（単独でまたは他の治療薬と同時投与するかのい
ずれかで）用いる改善された処置方法を提供する。このような組成物が、前出で
考察されたものを含むＢＰＩタンパク質産物に公知の任意の治療的使用において
利用され得ることが意図される。

【００２６】 ＢＰＩ欠失アナログを含む、ＢＰＩタンパク質産物の投与は一般的に、ＢＰＩ
タンパク質産物および薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバントまたはキャリア
を含む薬学的組成物で好ましくは達成される。このＢＰＩタンパク質産物は、公
知の界面活性剤、他の化学療法剤またはさらなる公知の抗クラミジア剤を含まな
いか、またはそれらと組み合わせて投与され得る。ＢＰＩタンパク質産物を含む
安定な薬学的組成物（例えば、ｒＢＰＩ₂₃）は、０．１重量％のポロキサマー１
８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）
および０．００２重量％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０，ＩＣＩ Ａ
ｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ ｏｒ ＪＴ Ｂａｋ
ｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）を含有するクエン酸緩衝化生理食塩水
（５または２０ｍＭ クエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）中に１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含む。ＢＰＩタンパク質産物を含む別
の安定な薬学的組成物（例えば、ｒＢＰＩ₂₁）は、５ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ポロキサマー１８８および０．００２％ポリソルベート８
０中に２ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含む。このような好ましい
組み合わせは、米国特許第５，４８８，０３４号および同第５，６９６，０９０
号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ９４／１７８１９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０
１２３９）において記載される。これらの全ての開示は本明細書において参考と
して援用される。１９９６年１月１２日出願の米国出願番号第０８／５８６，１
３３号（これは順番に、１９９５年９月１９日出願の米国出願番号第０８／５３
０，５９９号の一部継続出願であり（これは順番に、１９９５年１月１３日出願
、米国特許出願番号第０８／３７２，１０４号の一部継続出願である））ならび
に対応する国際公開番号ＷＯ９６／２１４３６（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１０９５
）（これらの全ては本明細書において参考として援用される）に記載されるよう
に、増強された活性を有するＢＰＩタンパク質産物の他のポロキサマー処方物が
、利用され得る。

【００２７】 ＢＰＩタンパク質産物を含む治療的組成物は、全身的にまたは局所的に投与さ
れ得る。投与の全身的経路は、経口経路および非経口経路を含み、これには、以
下が挙げられる：静脈内、筋肉内または皮下注射（長期放出のための貯蔵物（ｄ
ｅｐｏｔ）に含まれる）、眼内および眼球後、クモ膜下腔、腹腔内（例えば、腹
腔内洗浄による）、肺内（粉末薬剤、またはエアロゾル化または噴霧化した薬液
を用いて）、または経皮。改善されたエアロゾル化された処方物は、１９９７年
１０月３１日出願の共有に係る同時係属の米国出願番号第０８／９６２，２１７
号および対応する国際公開番号ＷＯ９８／１９６９４号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１
９８５０）（これら両方は、本明細書において参考として援用される）に記載さ
れている。

【００２８】 非経口的に投与された場合、ＢＰＩタンパク質産物組成物は、一般に、１日あ
たり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、好ましくは、１日あたり
０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、より好ましくは、１〜２０
ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で、および最も好ましくは２〜１０ｍｇ／ｋｇ／日
の範囲の用量で注射される。この処置は、例えば、１〜３日間に、１日あたり、
同じ用量、低下した用量または増加した用量で、そしてさらに処置する医師によ
り決定されるように、持続注入または間欠的な注射もしくは注入により継続され
得る。静脈内に投与される場合、ＢＰＩタンパク質産物は、好ましくは初回の短
時間注入、続いての持続注入により投与される。好ましい静脈内レジメンは、Ｂ
ＰＩタンパク質産物の１〜２０ｍｇ／ｋｇの短時間静脈内注入、それに続いて１
〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量での持続静脈内注入（１週間まで継続する）である
。特に好ましい静脈内投与レジメンは、１〜４ｍｇ／ｋｇの初回短時間静脈内注
入、それに続いて１〜４ｍｇ／ｋｇ／日の用量での持続静脈内注入（７２時間ま
で継続する）である。

【００２９】 局所経路としては、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、クリーム、ゼリー、点眼剤または
軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）（すべて、本明細書において参考として援用される、
１９９５年１１月１４日出願の共有に係る同時係属米国出願番号第０８／５５７
，２８９号および米国特許第５，６８６，４１４号ならびに対応する国際公開番
号ＷＯ９７／１７９９０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８６３２）およびＷＯ９７／１
７９８９（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８４１６）に記載されている）、点耳剤（ｅａ
ｒ ｄｒｏｐ）、坐剤、洗浄液（例えば、創傷の洗浄液）または医療用シャンプ
ーの形態の投与が挙げられる。例えば、滴下形態の局所投与については、約１０
〜２００μＬのＢＰＩタンパク質産物組成物が、処置する医師により決定される
場合、１日あたり１回以上適用され得る。

【００３０】 当業者は、個々の患者の良好な医療の実施および臨床状態により決定されるよ
うに、ＢＰＩタンパク質産物を含む治療的組成物のための有効用量および投与レ
ジメンを容易に最適化し得る。

【００３１】 本発明の他の局面および利点は、以下の例示的実施例の考慮に基づき理解され
る。実施例１は、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａをコードする発現ベクタ
ーｐＩＮＧ１７４２の構築を扱う。実施例２は、ｐＩＮＧ１７４２でのＣＨＯ細
胞の形質転換、およびｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを分泌する最高の産
生クローンの選択を扱う。実施例３は、２Ｌおよび５００Ｌの発酵槽におけるｒ
ＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａの産生および精製を扱う。実施例４は、ｒＢ
ＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の生化学的特徴づけを扱う。
実施例５、６および７はそれぞれ、ｒＢＰＩ₂₁と比較したｒＢＰＩ（１０−１９
３）Ｃ１３２Ａの、競合結合アッセイおよび比濁分析を用いる複合体形成の速度
を測定するアッセイにおけるインビトロＬＰＳ結合活性、殺菌活性ならびにＬＰ
Ｓ中和活性を扱う。実施例８は、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａのインビ
ボ活性を扱う。

【００３２】 （実施例１） （発現ベクターｐＩＮＧ１７４２の構築） ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ発現ベクターであるｐＩＮＧ１７４２を
、以下のように構築した。発現ベクターｐＩＮＧ４１５５を、ｐＩＮＧ３１７４
由来のｎｅｏ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＢｓａＩフラグメントと、ｐＩＮＧ
４１４４由来のＣＭＶプロモーターおよびｒＢＰＩ₂₁遺伝子を含有するＢｓａＩ
−ＸｈｏＩフラグメントならびにｐＩＮＧ４５３７由来のマウス（κ）軽鎖３’
非翻訳領域を含有するＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを連結することにより
初めに構築した（ｐＩＮＧ３１７４、ｐＩＮＧ４１４４およびｐＩＮＧ４５３７
は、参考として援用される米国特許第５，４２０，０１９号に記載される）。得
られたｐＩＮＧ４１５５ベクターは、ヒトＩｇＧエンハンサー（ヒトＣＭＶプロ
モーターおよびマウス（κ）軽鎖３’非翻訳領域）に融合したｒＢＰＩ₂₁をコー
ドする遺伝子を含む。これはまた、抗生物質Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（
Ｇ４１８）に対して耐性のトランスフェクト体の選択のために、ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子を含む。

【００３３】 ベクターｐＩＮＧ１７３２を、ヒトＩｇエンハンサーを含有するｐＩＮＧ４１
５５の０．７ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを欠失させ
ることにより作製した。次いで、ｒＢＰＩ₂₁の成熟部分の１〜９のアミノ酸をコ
ードする２７ヌクレオチドを、以下のプライマーを用いる重複ＰＣＲ変異誘発に
よりｐＩＮＧ１７３２から欠失させた： プライマー１：５’−ＣＴＧＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配
列番号３） プライマー２：５’−ＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣ
ＡＣＧＧＣＧＧ−３’（配列番号４） プライマー３：５’−ＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧ
ＣＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号５） プライマー４：５’−ＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号
６） 重複する相補的プライマー２および３は、１〜９のアミノ酸をコードするヌクレ
オチドの２７ｂｐの欠失を組み込んでおり、一方、プライマー１および４は、そ
れぞれ、ｐＩＮＧ１７３２における特有のＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位の
すぐ上流および下流のヌクレオチドをコードした。まず、フラグメントを、オリ
ゴヌクレオチドプライマー１および３、ならびにプライマー２および４の組み合
わせを用いて、ＰＣＲ増幅により得た。これらの個々のフラグメントを得た後、
それらをプライマー１および４を用いてアニーリングさせ、伸長させ、そして再
増幅した。次いで、この増幅されたフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化し、そしてプラスミドｐＩＮＧ１７４２を生成するためにＳａｌＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ消化のｐＩＮＧ１７３２にクローニングした。

【００３４】 ＰＣＲの間に変異が生じなかったことを確認するために、ｐＩＮＧ１７４２由
来のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ領域を配列決定した。ＢＰＩの成熟コード領域に変化
を観察しなかった。しかし、成熟タンパク質配列の開始からアミノ酸−６位で、
ＴｈｒのＡｌａへの転換を生じた、２塩基対の変化（ＡＣＣ−＞ＧＣＴ）を、シ
グナル配列をコードするＤＮＡに見出した。

【００３５】 （実施例２） （ｐＩＮＧ１７４２を用いるＣＨＯ細胞の形質転換） ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号ＣＣＬ６１）を、以下のように、無血清Ｅｘ
−Ｃｅｌｌ ３０１培地での増殖に適合させた。ハム（Ｈａｍ）のＦ１２培地中
で増殖したＣＨＯ−Ｋ１細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、そしてＥｘ−Ｃ
ｅｌｌ ３０１培地に再懸濁した。細胞を１００ｒｐｍで１２５ｍｌフラスコ中
で増殖させ、そして２〜３日ごとに、１２５ｍｌフラスコか２５０ｍｌフラスコ
のいずれかに継代した。

【００３６】 これらのＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１適合ＣＨＯ細胞をｐＩＮＧ１７４２を用いて
エレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクションの
前に、ｐＩＮＧ１７４２を、プラスミドを線状化するＮｏｔＩで消化した。４８
時間の回復後、細胞を、０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ
３０１培地を含有する９６ウェルプレートに約１０⁴細胞／ウェルでプレーティ
ングした。ほぼ２週間で、単一のコロニーを含有する約２５０ウェルからの上清
を、抗ＢＰＩモノクローナル抗体を用いてＢＰＩ反応性タンパク質の存在につい
てＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。

【００３７】 最高の発現レベルを有する１５のクローンをＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０１培地を含
有する２４ウェルプレートに移した。生産力についてスクリーニングするため、
この細胞を２％ＦＢＳおよび４０μＬの無菌Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを補
充したＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を含有する２４ウェルプレートにおいて１０日間、増
殖させた。その後、このビーズを除き、低塩緩衝液（１０ｍＭ 酢酸ナトリウム
ｐＨ４．０中、０．１Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄し、そして同じ緩衝液中の１．５
Ｍ ＮａＣｌを用いてＢＰＩを溶出した。分泌されたｒＢＰＩ（１０−１９３）
Ｃ１３２ＡのレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。１２％非還元ＳＤＳゲル上で
実行した溶出物のウエスタンブロット分析は、ｒＢＰＩ₂₁よりわずかに速く移動
した顕著なバンドを表した。

【００３８】 上位８つの産生体を無菌の１２５ｍＬエーレンマイアーフラスコに移し、そし
てＥｘ−Ｃｅｌｌ培地中で増殖させた。これらの細胞を、２％ＦＢＳおよび１％
（Ｖ／Ｖ）無菌Ｓ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ ３０
１培地を含有するフラスコにおいて、それらの細胞の増殖によって生産力につい
て再度評価した。ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを、培養培地に組み込ま
れたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズから溶出し、そしてｒＢＰＩ（１０−１９３
）Ｃ１３２ＡのレベルをＨＰＬＣにより決定した。なかでも最高の産生体であっ
たクローン１３９をさらなる増殖および産物生産のために選択した。

【００３９】 （実施例３） （ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａの産生および精製） 大量のｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを、２リットルの研究用発酵槽（
Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ，Ｓｔ．Ｇｅｒｍａｉｎ ｅｎ Ｌａｙｅ，Ｆｒａｎｃｅ
）中で、次いで５００リットルのＡＢＥＣ発酵槽（ＡＢＥＣ、Ａｌｌｅｎｔｏｗ
ｎ，ＰＡ）中でクローン１３９細胞を増殖させることにより、特徴づけのために
産生した。２リットルの発酵槽から得られたタンパク質産物を、以下に記載のイ
ンビトロ研究のために用い、一方、５００リットルの発酵槽から得られた産物を
動物の毒性学研究および効力研究のために用いた。

【００４０】 （Ａ．２リットル発酵槽での増殖） クローン１３９細胞を、約２×１０⁵細胞／ｍＬで、２Ｌのバイオリアクター
に接種するのに十分な容量および細胞密度が得られるまで、１％ＦＢＳを補充さ
れたＥｘ−Ｃｅｌｌ培地を含有する漸増容量のスピナーフラスコに継代した。細
胞を、１％ＦＢＳを補充した３つの２リットル発酵槽のＥｘ−Ｃｅｌｌ培地で、
５〜１０％で維持した溶存酸素、３７℃、ｐＨ７．２、１５０ｒｐｍで、増殖さ
せた。大量の無菌ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎ
ｄ Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を１．５％（Ｖ／Ｖ）で添加
した。最初のグルコースレベルは約３．５ｇ／Ｌであり、そしてグルコースを実
行の経過中、毎日３ｇ／Ｌに変動（ｐｕｌｓｅ）させた。発酵を２３８時間で終
了し、このとき、細胞の生存度は、６３％、８０％および８４％であった。

【００４１】 発酵後、それぞれの発酵槽からビーズを収集し、沈殿させ、そして１０ｍＭの
リン酸ナトリウム／０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で数回洗浄し、ビーズか
ら細胞成分および弱く結合した不純物を除去した。洗浄したビーズをカラムに詰
め、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗浄し
、そして０．８Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ グリシンを含有する同じ緩衝液で溶出し
た。次いで、この溶出物を３用量の注射用滅菌水（ＷＦＩ）で希釈し、ＣＭ−ｓ
ｅｐｈｅｒｏｄｅｘカラム（Ｓｅｐｒａｃｏｒ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ
）上にロードし、そして１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．０、その後２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
、その後２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０で洗浄し
、そしてサンプルを同じ緩衝液中、１．０Ｍ ＮａＣｌで溶出させた。１０，０
００ＭＷカットオフのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）での濃縮後、ＣＭカラムからの溶出物を、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１
００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ）上にロードした。２
８０ｎｍでの吸光度により同定されたｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを含
有する画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルターで１．９ｍｇ／ｍＬに濃縮し、
そして０．００２％のポリソルベート８０（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓｂｕｒｇ，ＮＪ）、０．２％ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６
８、ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）を用いて処方した。最終調製物を
０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。

【００４２】 （Ｂ．５００リットル発酵槽中の増殖） クローン１３９細胞を、３５ＬのＢｅｌｌｃｏスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃ
ｏ Ｇｌａｓｓ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）へ接種物を提供するため、漸増する
容積の一連のスピナーフラスコ中で、１％ＦＢＳを含有するフェチュイン（ｆｅ
ｔｕｉｎ）を含まないＥｘ−Ｃｅｌｌ培地において継代し、次にこれは５００リ
ットルのＡＢＥＣ発酵槽への接種物を提供した。細胞をフェチュインを含まない
が１％ＦＢＳ、さらなるグルコース（１０ｇ／Ｌに）およびグルタミン（１０ｍ
Ｍに）を補充した完全Ｅｘ−Ｃｅｌｌ培地中で増殖させた。この発酵槽を実行中
、添加された１つの０．５％Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ ＲＬ補充パルスおよび１つの
グルコース／グルタミンパルスを用いる、流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）様式で作
動した。５〜６リットルの大ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを、５００リット
ル発酵槽が接種された２４時間後に添加した。このｐＨを１０％の重炭酸ナトリ
ウムを用いて手動で、ｐＨ７．０に制御し、酸素を５％に、そして温度を３７℃
に制御した。撹拌を、２つの３枚羽根（ｔｈｒｅｅ−ｂｌａｄｅ ｐａｄｄｌｅ
ｉｍｐｅｌｌｅｒｓ）で２５ｒｐｍに維持した。発酵の運転を１８４時間で終
了し、このとき、細胞の生存度は９０％であった。

【００４３】 ２リットルの発酵槽について上記したように、このビーズを発酵後、沈殿させ
、次いで、低塩（０．１Ｍ）のリン酸緩衝液で数回洗浄した。この精製の工程は
、ｐＨ３．０のウイルス不活化工程がＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズからの溶出
後に含まれ、そして第２のＣＭ−ｓｐｈｅｒｏｄｅｘカラムが濃縮工程として含
まれたこと以外は、２リットルのサンプルについて上記された工程と類似であっ
た。第２のＣＭカラムについて、溶出物を３用量のＷＦＩで希釈し、ｐＨを５．
０に調節し、カラムを平衡化して、そして２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．３Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で洗浄し、そしてサンプルを同じ緩衝液中、１．０Ｍ
ＮａＣｌで溶出した。ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを、Ｓｅｐｈａｃｒ
ｙｌ Ｓ−１００カラムから、５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ５．０中に溶出し、２ｍｇ／ｍＬに調節し、そして０．２μｍフィル
ターを通して濾過した。次いで、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａを０．０
０２％のポリソルベート８０、０．２％ポロキサマー１８８（滅菌濾過）を用い
て処方し、そして１０ｍＬのＩ型ガラス血清バイアルに充填した。

【００４４】 （実施例４） （ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａの生化学的特徴づけ） （Ａ．２リットル発酵槽由来のタンパク質） 実施例３由来の精製されたｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ産物は、ｒＢ
ＰＩ₂₁からの９つのＮ末端アミノ酸の欠失と一致して、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で、ｒＢＰＩ₂₁バンドよりも、わずかに
速く移動した単一のバンドであることが観察された。配列分析は、ｒＢＰＩ（１
０−１９３）Ｃ１３２Ａが、ＳＱＫＧＬＤＹＡＳＱＱＧＴＡＡＬＱＫＥＬの推定
Ｎ末端配列を含んだことを実証した。質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）において、２つ
の成分を観察した。１つは２０，４７０ダルトンの質量を有し、これは、ｒＢＰ
Ｉ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａについての２０，４７２ダルトンの推定質量と一
致した。そして２番目は、２０，２５５ダルトンの質量を有し、これは、ｒＢＰ
Ｉ（１０−１９１）の２０，２５８ダルトンの推定質量と一致した。ｒＢＰＩ（
１０−１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の両方のイオン交換ＨＰＬＣのプロ
フィール（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｏｄｅｌ １０５０，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、類似の保持時間で単一のピークを示した。

【００４５】 （Ｂ．５００−リットル発酵槽由来のタンパク質） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａは、ｒＢＰＩ₂₁ バンドよりも、わずかに速く移動した単一のバンドであった。質量分析において
、２０，４７１ダルトンの質量を有する主要な成分（これは、ｒＢＰＩ（１０−
１９３）Ｃ１３２Ａについての２０，４７４ダルトンの推定質量と一致する）な
らびに２０，６６８ダルトンの質量（これは、Ｎ−アセチルヘキソサミン（推定
質量２０，６７７ダルトン）の付加と一致する）および２０，８４３ダルトンの
質量（これは、Ｎ−アセチルヘキソサミンおよびヘキソース（推定質量２０，８
３９ダルトン）の付加と一致する）を有する２つのわずかな成分が存在した。Ｎ
−アセチルヘキソサミンを付加された類似の成分は、ｒＢＰＩ₂₁の産生の間に慣
用的に観察される。

【００４６】 逆相ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）において、ｒＢ
ＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の両方は、１つの主要なピー
クおよび１つの小さなピークとして溶出した。しかし、ｒＢＰＩ（１０〜１９３
）Ｃ１３２Ａピークは、コントロールにおいて対応するｒＢＰＩ₂₁ピークよりも
わずかに早く溶出した。ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａプロフィールにお
ける小さなピークは、質量分析において同定されたグリコシル形態を最も示すよ
うである。ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の両方のイオ
ン交換ＨＰＬＣプロフィールは、同様の保持時間で単一のピークを示した。

【００４７】 トリプシンマッピング分析を、従来の方法に従って実行した。アセトンで沈殿
したｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを、まずジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）続いてヨードアセトアミド、次いでトリプシンで処理した。
トリプシン処理した産物を、Ｃ１８カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈ
ｅｒｅ）を備えるＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ １２６）によって分
析した。ｒＢＰＩ₂₁において、リーダー配列の不正確な切断から生じる２つのＮ
末端トリプシンフラグメント（Ｔ１およびＡｌａ−Ｔ１）が存在した。推定され
るように、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａのトリプシンマップは、Ｎ末端
フラグメントを欠いていることを除いてｒＢＰＩ₂₁と類似した。

【００４８】 （実施例５） （ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡのインビトロでのＬＰＳ結合活性） （Ａ．競合結合アッセイにおいて） ＬＰＳへの結合に対して標識ｒＢＰＩ₂₁と競合する、実施例３Ａに従って産生
された精製ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁１の能力を、
競合結合アッセイにおいて評価した。簡潔には、固定した濃度（０．５ｎＭ）の ¹²⁵ Ｉ標識したｒＢＰＩ₂₁を、ＨＥＰＥＳ緩衝液およびウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を含
むＤＭＥＭにおいて５μＭ〜０．０１ｎＭの範囲の希釈にて、標識していないｒ
ＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａと混合し、そしてこの混合
物の１００μｌを、２．５μｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で予めコートしたＩｍｍｕｌｏｎ−
ＩＩプレートウェルに添加した。このプレートを、４℃にて５時間インキュベー
トし、そしてＤＭＥＭ培地で３回洗浄した。７５μＬの０．１Ｎ ＮａＯＨを添
加し、そして結合した¹²⁵Ｉ−ｒＢＰＩ₂₁を取り出し、そして計数した。この結
果は、両方のタンパク質が放射標識したｒＢＰＩ₂₁と同様に競合したことを実証
した。

【００４９】 （Ｂ．複合体形成の速度を測定するアッセイにおいて） ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡのＬＰＳ結合活性を、速度比濁法を使用
してｒＢＰＩ₂₁と比較した。ＬＰＳに対して結合するｒＢＰＩ₂₁を評価するため
のこのアプローチは、溶液中のＬＰＳ−ＢＰＩタンパク質産物複合体形成の結果
としての光散乱の増大速度を測定する。全ての実験を、サンプルを自動的に混合
し、光散乱を測定し、そして速度の計算を実行する、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｒｒａ
ｙ ３６０ Ｒａｔｅ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒを用いて実行した。

【００５０】 このアプローチを使用する先行する実験は、最適なＬＰＳ種およびＬＰＳ濃度
、アッセイの特異性、アッセイの再現性および殺菌アッセイに対するアッセイの
結果の相関性を試験した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳおよびリピドＡは、ｒＢ
ＰＩ₂₁と複合体を形成し、これは、比濁計において測定され得たが、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳは、測定可能な複合体を形成しなかったことが観察
された。これらの研究の結果に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳを、ＬＰ
Ｓロットに依存して４９．４〜６１．７μｇ／ｍｌの濃度（フローセルにおいて
）にて、５〜３０μｇ／ｍｌのｒＢＰＩ₂₁濃度（フローセルにおいて）と組み合
わせて、使用のために選択した。各ＬＰＳロットについて決定されなければなら
ない最適なｒＢＰＩ₂₁濃度範囲は、約１５〜２５μｇ／ｍｌであり、この濃度は
、曲線の最も直線の部分を示す。凝集速度（ＲＴ）値についての最適な範囲は、
７００〜２０００であった。ｒＢＰＩ₂₁のより低い濃度を、処方物の緩衝液がＰ
ＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３を含むように変えた場合、またはＮａＣｌ濃度を増大
させた場合に、同じ凝集速度の値を達成するために必要とした。ＬＰＳに結合す
る組換えリポポリサッカリド結合タンパク質（ｒＬＢＰ₅₀）、またはＢＰＩタン
パク質産物に結合するヘパリンのいずれかの添加は、ｒＢＰＩ₂₁−ＬＰＳ凝集体
の形成を阻害した。このことは、この相互作用の特異性を実証する。アッセイの
再現性を、ＢＰＩの複数のロットを試験することおよび複数の時間でｒＢＰＩ₂₁ の同じロットを試験することによって確認した。４５℃での１週間の処理によっ
て部分的に不活性化されたｒＢＰＩ₂₁サンプルの比濁分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
５細胞を用いるブロスマイクロ希釈（ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ
）殺菌アッセイからの比濁分析と十分に相関した。

【００５１】 ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡとｒＢＰＩ₂₁とを比較する比濁実験を、
以下のように実行した。超音波破砕したＬＰＳ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓからのＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳロット番号３０１１９Ｂ）およびｒＢ
ＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡまたはｒＢＰＩ₂₁のいずれか（これらの両方は
、０．２％ ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８（ポロキサマー １８８）、０．００２
％ ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート８０）、５ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ５．
０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に処方された）を、Ｂｅｃｋｍａｎにより供給され
るＰＢＳ緩衝液（ＰＥＧを補充）中に直接希釈した。ＬＰＳ濃度を固定し、一方
、ＢＰＩタンパク質産物濃度を各々の実験において変動させた。２つの濃度のＬ
ＰＳ（２４．７および４９．４μｇ／ｍｌ ＬＰＳ）を試験した。各反応を、フ
ローセルへの６００μｌのＰＢＳ−ＰＥＧ緩衝液の添加、続いて４２μｌのＢＰ
Ｉタンパク質産物の希釈によって開始した。ベースラインを確立した後に、４２
μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳ溶液を添加した。最後の成分の添加の後に、
比濁計は、光散乱の程度に基づいて、複合体形成の速度を測定する。このデータ
を、所定のＢＰＩタンパク質産物の濃度を含む各試験サンプルに対するＲＴ値を
、標準物に対応するＲＴ値により除算して、コントロール値パーセントを生成す
ることによって分析した。試験した各ＢＰＩタンパク質産物の濃度について、最
大凝集速度を決定し、そして曲線を生成した。最大値の左に対する点（等価性の
点）のみを、種々のＢＰＩタンパク質産物のサンプルの比較分析に使用した。サ
ンプルの相対活性を、曲線の直線領域における試験および標準物のロットについ
てのＲＴ値を比較することによって測定し得る。二地点間（ｐｏｉｎｔ ｔｏ
ｐｏｉｎｔ）のアプローチまたはカーブフィットアプローチのいずれかを使用し
得る。

【００５２】 精製ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａおよび精製ｒＢＰＩ₂₁（これは、約
７．８％のｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを含む）の試験に加えて、これ
らのタンパク質の等量混合物および１６％ ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２
Ａを含むｒＢＰＩ₂₁調製物を（４９．４μｇ／ｍｌのＬＰＳ単独にて）評価した
。この結果は、４９．４μｇ／ｍｌのＬＰＳで、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１
３２Ａがおよそ２５％のより低い濃度での、ｒＢＰＩ₂₁の凝集速度と同様の凝集
速度を達成したことを実証した。ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａはまた、
２４．７および４９．４μｇ／ｍｌの両方のＬＰＳにて、ｒＢＰＩ₂₁の最大凝集
速度よりも速い最大凝集速度を達成した。２つの分子の等量の混合は、ｒＢＰＩ ₂₁ とｒＢＰＩ（１０〜１９３）との間を移動する曲線を生じ、一方７．８％およ
び１６％の１０〜１９３を有するｒＢＰＩ₂₁のロットは、互いに同一の様式にお
いて挙動した。二地点間の分析の結果（４９．４μｇ／ｍｌでのＬＰＳ）は、ｒ
ＢＰＩ（１０〜１９３）がこのアッセイにおいてｒＢＰＩ₂₁のおよそ２倍の強度
であったことを示した。

【００５３】 （実施例６） （ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａのインビトロ殺菌活性） 本実施例における全てのアッセイを、実施例３Ａに従って２リットルの発酵槽
にて生成されたｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いて実施した。

【００５４】 （Ａ．放射状拡散（Ｒａｄｉａｌ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）アッセイにおけるＥ
．ｃｏｌｉに対する効果） この放射状拡散アッセイは、精製ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａおよび
精製ｒＢＰＩ₂₁のＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５（これは、スムース（ｓｍｏｏｔｈ）株Ｅ
．ｃｏｌｉ ０１１Ｂ４のＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼの「ラフ（
ｒｏｕｇｈ）」変異体である）に対する殺菌効果を比較した。そしてｒＢＰＩ₂₁ に比較的感受性である。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５細胞（Ｍａｎｎｉｏｎら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８５：８５３〜８６０（１９９０）；Ｌｉｓｔ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）を、対
数増殖期まで増殖させ、遠心分離し、そして１０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ
７．４）にて２回洗浄し、そして３％ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒ
ｏｔｈ（ＴＳＢ、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍ
Ｉ）、１０ｍＭ リン酸ナトリウムを補充した融解アガロースにおよそ１×１０ ⁶ ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度で添加した。３ｍｍの直径のウェルを、固めたアガロ
ースにおいて調製し、そして５μＬの段階的に希釈したｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰ
Ｉ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを、このウェルに添加した。このプレートを、３
７℃で３時間インキュベートし、拡散を生じさせ、次いで６％ＴＳＢを含む融解
アガロースの覆いを添加した。このプレートを３７℃で一晩インキュベートし、
阻害の正味の領域を、濃度に対してプロットした。この結果は、ｒＢＰＩ（１０
〜１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁がこのアッセイにおいて同様の様式にて
挙動したことを示した。

【００５５】 （Ｂ．放射状拡散アッセイにおけるＳ．Ａｕｒｅｕｓ Ｌ型に対する効果） この放射状拡散アッセイは、細胞壁を有さないＬ型として増殖されたグラム陽
性細菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する、精製ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａと
ｒＢＰＩ₂₁の殺菌効果を比較した。米国特許第５，５７８，５７２号（本明細書
中に参考として援用される）に記載されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｌ型細胞
を、３．５％ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂および１０００Ｕ／ｍＬペニシ
リンＧを補充した心臓注入（ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ＨＩ）ブロスに
おいてｌｏｇ相まで増殖させた。この細胞をＮａＣｌ補充したＨＩ培地を含む融
解０．８％アガロースにおいておよそ５×１０⁴または５×１０⁵細胞／ｍＬのい
ずれかに希釈し、そして８ｍＬのこの細胞アガロース懸濁液を、１０ｃｍプレー
トに注いだ。３ｍｍの直径のウェルを準備し、そして５μＬの段階的に希釈した
ｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａをこのウェルに添加した
。このプレートを３７℃で２４時間インキュベートし、そして阻害の正味の領域
を濃度に対してプロットした。この結果は、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜
１９３）Ｃ１３２Ａの両方が、このアッセイにおいて同様の様式で約５×１０⁴
または５×１０⁵の細胞密度にて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｌ型の増殖を阻害したこ
とを実証した。

【００５６】 （Ｃ．ブロス微量希釈（ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）アッセイにおけるＥ．
ｃｏｌｉ Ｊ５に対する効果） このブロス微量希釈アッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５に対する、精製ｒＢＰＩ
（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の殺菌効果を比較した。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｊ５細胞をトリプトン酵母抽出物（ＴＹＥ）ブロスにおいて一晩増殖させ
、次いでＨｏｒｗｉｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：５２２〜５２
７（１９９５）において以前に記載されたようにＴＥＡ培地において対数期にし
た。この細胞を、心臓注入（ＨＩ）ブロスにおいておよそ１×１０⁴または１×
１０⁵の細胞／ｍＬで接種し、そして９５μＬを９６ウェルプレートに添加した
。処方物の緩衝液において調製した、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａまた
はｒＢＰＩ₂₁の５μＬの種々の希釈物を各々のウェルに添加し、そしてこのプレ
ートを、３７℃で２４時間インキュベートした。この結果は、ｒＢＰＩ（１０〜
１９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁がこれらのアッセイにおいて同様の活性を
有することを実証した。

【００５７】 （実施例７） （ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡのインビトロでのＬＰＳ中和活性） 本実施例のＡ項におけるアッセイを、実施例３Ａに従って２リットルの発酵槽
において産生されたｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いて実施し、一方
、本実施例のＢ項におけるアッセイを、実施例３Ｂに従って５００リットルの発
酵槽において産生されたｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いて実施した
。

【００５８】 （Ａ．ＲＡＷ細胞増殖アッセイにおける活性） ＲＡＷ細胞増殖アッセイを使用して、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９
３）Ｃ１３２ＡのインビトロでのＬＰＳ中和活性を比較した。このアッセイにお
いて、ＬＰＳは、ＲＡＷ細胞の増殖を阻害し、そしてｒＢＰＩ₂₁は、ＬＰＳのこ
の効果を中和する。

【００５９】 １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニ
シリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、０．０
７５％ 重炭酸ナトリウム、０．１５Ｍ ２−メルカプトエタノールおよび１０
％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で補充したＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で維持したマウスＲＡＷ２６４．７細胞（Ａ
ＴＣＣ受託番号Ｔ１Ｂ７１）を、アッセイの前に２４時間、５０Ｕ／ｍＬの組換
えマウスγ−インターフェロン（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）
の存在下でのインキュベーションによってまず誘導した。次いで、誘導した細胞
を、機械的に収集し、そして４℃で５００×ｇにて遠心分離し、次いで５０ｍＬ
のＲＰＭＩ１６４０培地（補充なし）中に再懸濁し、再度遠心分離し、そして再
度、ＲＰＭＩ１６４０（補充なし）に再懸濁した。この細胞を計数し、細胞の濃
度を２×１０⁵細胞／ｍＬに調整し、そして１００μＬのアリコートを９６ウェ
ルプレートの各ウェルに添加した。

【００６０】 次いで、細胞をＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１１３ ＬＰＳ（コントロール標準物、Ａｓ
ｓｏｃ．ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄｅ、Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ、ＭＡ）とともに約
１５時間インキュベートし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地において１ｎ
ｇ／ｍＬの濃度にて１００μＬ／ウェルのアリコートで添加した（この濃度は、
ＬＰＳ濃度を５０ｐｇ／ｍＬと１００ｎｇ／ｍＬの間で変動させた力価実験の結
果である）。このインキュベーションを、２５ｎｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬとの
間の種々の濃度におけるｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ
の非存在または存在下で実行した。１３２位のシステインをアラニンに置換され
たｒＢＰＩ（１０〜１９３）である組換えヒトｒＢＰＩ₂₁（ｒＢＰＩ₂₁Δｃｙｓ
とも呼ばれる）（共有に係る米国特許第５．４２０．０１９号を参照のこと）を
、１μｇ／ｍＬの濃度にて陽性コントロールとして使用した。細胞増殖をアッセ
イの開始時間の５時間後に１μＣｉ／ウェルの［³Ｈ］−チミジンの添加によっ
て定量的に測定した。１５時間のインキュベーションの後に、標識した細胞を、
細胞回収器（Ｉｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＮＢ−３８４、Ｓａｍ
ｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）を用いてガラスファイバーフィルター上に
回収した。ＲＡＷ２６７．４細胞増殖のＬＰＳ媒介性阻害は、血清の成分として
かまたは組換えＬＢＰ（１μｇ／ｍＬの濃度にて）としてのいずれかで反応混合
物に添加した場合、ＬＢＰの存在に依存する。

【００６１】 これらの実験において、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２
Ａの両方は、ＲＡＷ細胞増殖のＬＰＳ媒介性阻害を同様に阻害した。

【００６２】 （Ｂ．ＴＮＦ阻害アッセイにおける活性） 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害アッセイを使用して、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ
（１０〜１９３）Ｃ１３２ＡのインビトロでのＬＰＳ中和活性を比較した。この
アッセイにおいて、精製ＬＢＰ（またはＬＢＰを含む血清）と組み合わせたＬＰ
Ｓは、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）によるＴＮＦ合成を刺激し、そしてｒ
ＢＰＩ₂₁は、ＬＰＳのこの効果を中和する。

【００６３】 ＴＨＰ．１細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−２０２）を、１０％ ＦＢＳを含
むＲＰＭＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で維持し
、そしてＣＤ１４発現を誘導するためのＬＰＳでの処理の前に、１０％ ＦＢＳ
および５０ｎｇ／ｍｌの１，２５ジヒドロキシビタミンＤ（ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅ
ｔｉｎｇ、ＰＡ）を含むＲＰＭＩ中で３日間培養した。ＬＰＳを用いて誘導する
前に、細胞をＲＰＭＩで３回洗浄し、そして１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中ま
たは血清を含まない培地（１％ ＨＢ１０１（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ）中のいずれかにおいて
懸濁させた。ＴＮＦの発現を、９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりお
よそ５×１０⁴細胞で、１ｎｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１２８ ＬＰＳ（Ｓｉ
ｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて誘導した。プレートを、３７℃で５
％ＣＯ₂にて３時間インキュベートし、次いで上清の液体のアリコートを取り出
し、そしてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６^TMＡＱ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ＷＥＨＩ１６４毒性アッセイによりＴＮＦに
ついてアッセイして、細胞の生存度をモニターした。組換えヒトＴＮＦα（Ｇｅ
ｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、陽性標
準物として使用した。ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの
両方は、ＴＮＦ合成のＬＰＳ誘導性刺激を同様に阻害した。

【００６４】 （実施例８） （ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａのインビボでの生物学的活性） 以下に記載されたインビボでのアッセイを、実施例３Ｂに従って５００リット
ルの発酵槽において生成された精製ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを使用
して実行した。

【００６５】 （Ａ．ラットにおける毒性研究） ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの毒性プロフィールを
、ラットにおいて比較した。この研究において、６匹の雄性および６匹の雌性Ｓ
ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの群は、ビヒクルコントロール（処方物の緩
衝液）、ｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａのいずれかの低
用量（５０ｍｇ／ｋｇ／日）または高用量（１２０ｍｇ／ｋｇ／日）をのいずれ
かを受けた。用量を、４．２ｍＬ／ｋｇ／時間（１００ｍＬ／ｋｇ／日）の注入
速度にて連続して３日間、留置大腿カテーテルを介する連続静脈注入によって投
与した。臨床観察を、少なくとも１日２回記録し、体重を毎日記録した。血液サ
ンプルおよび尿サンプルを、血液学的な評価、臨床化学評価および尿分析評価に
ついて終了時の近くで収集した。終了時に、器官を秤量し、そして組織を組織病
理学的試験によって収集した。死亡または有意な被験物質の関連効果は、存在し
なかった。このデータは、連続注入によって与えられた場合に、ｒＢＰＩ₂₁およ
びｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａについて同様の毒性プロフィールを示し
た。

【００６６】 （Ｂ．薬物動態） ２ｍｇ／ｋｇでのｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの薬
物動態を、ラットにおいて調査した。ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３
）Ｃ１３２Ａの血漿クリアランスを、３指数関数的薬物動態素因関数（ｔｒｉ−
ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｉｓｐｏｓｉｔ
ｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって十分に記載した。ｒＢＰＩ産物の間の薬物
動態パラメーターにおける統計学的な差異を、決定しなかった（ノンパラメトリ
ックＷｉｃｏｘｏｎランク試験、ｐ＜０．０５）。投与した薬物のほとんど（＞
９６％）を、０．２〜０．４分のα相半減期（α ｐｈａｓｅ ｈａｌｆ−ｌｉ
ｆｅ）および３．９〜４．３分のβ半減期で消失し、一方、残りは、２７〜３３
分の半減期でγ相の間に消失した。中央コンパートメント（Ｖｃ）の分布容積は
、４１〜４５ｍＬ／ｋｇであり、そしてクリアランス速度（ＣＬ）は、２４〜３
０ｍＬ／分／ｋｇであった。定常状態の分布容積が１５２〜１８４ｍＬ／ｋｇで
あったことを示す。

【００６７】 （Ｃ．マウスの内毒素チャレンジにおける効力） ２つの別々の研究を、Ａｍｍｏｎｓら「Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅｐｓ
ｉｓ」ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＲｙａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）、５５〜６９頁に一般に従う、致死的な内毒素血症の
マウスモデルにおいて、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ
の相対効力を試験するために実施した。両方の研究において、各々の処理群およ
びコントロール群において１４匹のマウスが存在した。第１の研究において、Ｃ
Ｄ１マウスを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４由来の２５ｍｇ／ｋｇのリポポリ
サッカリド（ＬＰＳ）を用いて静脈内にチャレンジした。チャレンジの直後に、
このマウスを、１５、２０、２５および３０ｍｇ／ｋｇの用量にてｒＢＰＩ₂₁ま
たはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いてか、またはコントロールビヒ
クル（処方物の緩衝液のみ）を用いて静脈内処理した。死亡数を、７日間一日当
たり２回記録した。

【００６８】 以下の表１において示される、第１の研究からの結果は、ｒＢＰＩ（１０〜１
９３）Ｃ１３２ＡおよびｒＢＰＩ₂₁の両方での処置がビヒクルコントロールと比
較して生存を有意に増大させたことを示す。さらに、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）
Ｃ１３２Ａは、ｒＢＰＩ₂₁よりも少なくとも２倍より強力であり、同様の生存の
有益性が、ｒＢＰＩ₂₁と比較して２倍のより低い用量のｒＢＰＩ（１０〜１９３
）Ｃ１３２Ａでみられた。

【００６９】

【表１】 第２の研究において、より広範な範囲のｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ
用量（５、１０、１５、２０、２５、３０ｍｇ／ｋｇ）を研究した。以下の表２
に示される結果は、ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの両
方が、第１の研究におけるように、コントロールに対して有意な生存の有益性を
提供したが、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａが少なくとも２倍より強力で
あり、このことは２倍のより低い用量でｒＢＰＩ₂₁と同様の効力を達成すること
を確認する。

【００７０】

【表２】 （Ｄ．致死的な菌血症のマウスモデルにおける効力） ２つの別々の研究を、致死的な菌血症のマウスモデルにおいて、ｒＢＰＩ₂₁お
よびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの相対効力を試験するために実施した
。両方の研究において、１つの処置群当たり２０匹のマウスが存在した。第１の
研究において、ＣＤ１マウスを、６．８×１０⁷コロニー形成単位（ＣＦＵ）の
静脈内に投与されたＥ．ｃｏｌｉ ０７：Ｋ１を用いてチャレンジした。このチ
ャレンジの直後に、このマウスを、１０、２０および３０ｍｇ／ｋｇの用量にて
ｒＢＰＩ₂₁またはｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いてか、あるいはコ
ントロールビヒクル（処方物の緩衝液のみ）を用いて静脈内処置した。死亡率を
、７日間の間一日当たり２回記録した。

【００７１】 以下の表３に示されるように、第１の研究からの結果は、１０および３０ｍｇ
／ｋｇのｒＢＰＩ₂₁で処置した群に対して、生存を有意に増大したこと（ｐ＜０
．０５ 対 コントロール）を実証する。生存における同様の有意な増大は、ｒ
ＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ 対 コントロールで観察されず、一方、ｒ
ＢＰＩ₂₁とｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａ（この研究において処置された
群）との間の生存の有益性における有意差が存在しなかった。

【００７２】

【表３】 このモデルにおけるｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの
効果をより十分に特徴付けるために、より広範な範囲の用量を研究する第２の研
究を、実施した。この研究において、ＣＤ１マウスを、２．５７×１０⁸コロニ
ー形成単位（ＣＦＵ）の静脈内に投与したＥ．ｃｏｌｉ Ｏ７：Ｋ１を用いてチ
ャレンジした。チャレンジの直後に、このマウスを、１．０、３．０、１０およ
び３０ｍｇ／ｋｇのｒＢＰＩ₂₁および０．３、１．０、３．０、１０および３０
ｍｇ／ｋｇのｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを用いて静脈内に処置した。
以下の表４に示される結果は、両方のタンパク質が防御を提供し、そして任意の
用量にて２つの改変体の防御効果において有意差が存在しなかったことを示す。

【００７３】

【表４】 （Ｅ．意識のある（ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ）ラットにおける心血管効果） 一連の実験を、ラットにおける血圧に対するｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０
〜１９３）Ｃ１３２Ａの相対効果を決定するために実施した。各々のラットを、
ケタミン（Ｆｏｒｔ ｄｏｄｇｅ Ｌａｂｓ、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ、ＩＡ）お
よびＲｏｍｐｕｍ（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、
ＫＳ）の混合物を用いて麻酔した。次いで、カテーテルを右頸動脈に配置し、そ
して血圧を記録するために圧力変換器に接続した。第２のカテーテルを、右頸静
脈に配置し、ｒＢＰＩまたはビヒクルを注射した。次いで、ラットを、実験が始
まる前に回復させた。ラットが機敏で動きやすい場合かつ血圧が正常範囲内で安
定した場合に、実験を開始した。次いで、ｒＢＰＩ₂₁、ｒＢＰＩ（１０〜１９３
）Ｃ１３２Ａまたはコントロールビヒクル（処方物の緩衝液）を、１５秒にわた
ってボーラスとして注射し、そして平均動脈血圧（ｍｍＨｇ）を、次の６０分に
わたって記録した。

【００７４】 予備実験において、２０および３０ｍｇ／ｋｇの用量のｒＢＰＩ₂₁は、ビヒク
ルに対して血圧に有意な効果が無いが、４０ｍｇ／ｋｇの用量は、５分以内に明
白である血圧における有意な減少を生じたことが決定された。この低血圧応答は
、注射の１５分後（血圧が４８±１２ｍｍＨｇ（平均±ＳＥ；ｐ＞０．０５）に
減少した時）に最大であった。６０分後に、ｒＢＰＩ₂₁で処置した動物の血圧は
、回復し、そしてビヒクルで処置した動物の血圧と有意に異ならなかった。

【００７５】 ｒＢＰＩ₂₁およびｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａの効果を比較するため
に、５匹のラットの群に、４０ｍｇ／ｋｇの各々の薬物の物質またはビヒクルコ
ントロールを与え、そして血圧応答を、曲線下の面積（ＡＵＣ）として分析した
。図１は、以前に観察されたように、ｒＢＰＩ₂₁がビヒクルコントロールに対す
るＡＵＣの上昇により示される血圧の低下における有意な低下を生じたことを示
す。比較によって、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａは、ビヒクルコントロ
ールと比較して、血圧に対して有意な効果を有さなかった。５０ｍｇ／ｋｇの用
量のｒＢＰＩ₂₁（Ｎ＝４匹のラット）は、図１におけるＡＵＣのさらなる増大に
より示されるように、４０ｍｇ／ｋｇ用量のｒＢＰＩ₂₁よりもさらに大きい低血
圧性効果を有した。このより高い用量において、血圧におけるいくらかの減少は
また、ｒＢＰＩ（１０〜１９３）Ｃ１３２Ａを投与されたラット（Ｎ＝３）にお
いて生じたが、この効果は、ビヒクルコントロールと比較して有意ではなかった
。

【００７６】 上記の発明の多くの改変およびバリエーションが、当業者により生じることが
予測される。従って、添付した特許請求の範囲において表されるように、このよ
うな限定のみが、本明細書中において提出されるはずである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２ＡまたはｒＢＰＩ₂₁のいずれの投
与後に生じる曲線下面積（ＡＵＣ）として測定された、血圧の上昇を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 キャロル， フィッツヒュー スティーブ ン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94596， ウォルナット クリーク， ミルトン アベニュー 1308 (72)発明者 バーク， デイビッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94618， オークランド， チャボリン テラス 5957 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA04 GA14 HA12 4B064 AG30 CA10 CA19 CC24 CE06 CE09 DA01 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA03 CA24 CA44 4C084 AA02 BA22 NA14 ZB351 ZB352 ZB381 ZB382 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA83 EA22 EA28 EA29 FA74 GA10

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成熟ヒトＢＰＩのアミノ酸残基１０〜１９３からなり、ここ
   で、１３２位のシステイン残基は、異なるアミノ酸残基で置換されている、殺菌
   性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）欠失アナログ。
2. 【請求項２】 前記システイン残基を置換する前記アミノ酸が、アラニンお
   よびセリンからなる群より選択される非極性アミノ酸である、請求項１に記載の
   ＢＰＩ欠失アナログ。
3. 【請求項３】 前記１３２位のシステイン残基が、アラニンで置換される、
   請求項１に記載のＢＰＩ欠失アナログ。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のＢＰＩ欠失アナログをコードするポリヌク
   レオチド。
5. 【請求項５】 請求項３に記載のＢＰＩ欠失アナログをコードするポリヌク
   レオチド。
6. 【請求項６】 ＢＰＩの２７アミノ酸のリーダー配列をさらに含む、請求項
   ４に記載のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ＤＮＡである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
9. 【請求項９】 宿主細胞において前記ポリペプチド欠失アナログの発現を可
   能にする様式で、請求項７に記載のＤＮＡによって安定に形質転換またはトラン
   スフェクトされた宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９に従う、真核生物宿主細胞。
11. 【請求項１１】 ＣＨＯ細胞である、請求項１０の宿主細胞。
12. 【請求項１２】 ＢＰＩ欠失アナログポリペプチドを産生するための方法で
    あって、該方法は、請求項９に記載の宿主細胞を適切な培養培地中で増殖させる
    工程、および該宿主細胞または該培養培地から該ポリペプチドを単離する工程を
    包含する、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法のポリペプチド産物。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のＢＰＩ欠失アナログおよび薬学的に受容
    可能な賦形薬、アジュバント、またはキャリアを含む組成物。
15. 【請求項１５】 請求項３に記載のＢＰＩ欠失アナログおよび薬学的に受容
    可能な賦形薬、アジュバント、またはキャリアを含む組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１３に記載のＢＰＩ欠失アナログおよび薬学的に受
    容可能な賦形薬、アジュバント、またはキャリアを含む組成物。
17. 【請求項１７】 被験体にＢＰＩタンパク質産物を投与する改善された方法
    であって、該方法は、該被験体に請求項１４に記載の組成物を投与する工程を包
    含する、方法。
18. 【請求項１８】 被験体にＢＰＩタンパク質産物を投与する改善された方法
    であって、該方法は、該被験体に請求項１５に記載の組成物を投与する工程を包
    含する、方法。
19. 【請求項１９】 被験体にＢＰＩタンパク質産物を投与する改善された方法
    であって、該方法は、該被験体に請求項１６に記載の組成物を投与する工程を包
    含する、方法。