JP2002518065A - Ｈｉｖプロテアーゼ遺伝子における薬剤により選択された変異の検出方法 - Google Patents
Ｈｉｖプロテアーゼ遺伝子における薬剤により選択された変異の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子における薬剤により選択された変異の迅速かつ信頼性の高い検出方法であって、逆ハイブリダイゼーションアッセイにおいて一緒になって機能するように最適化された特定のプローブのセットを用いて薬剤耐性に関与するコドンの範囲を同時に特徴づける方法に関する。より詳細には、本発明は、生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する感受性を決定する方法に関し、該方法は、ａ）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し、ｂ）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーペアーを用いてＨＩＶのプロテアーゼ遺伝子の関連部分を増幅し、ｃ）工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を下記プローブの少なくとも１つ：コドン３０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、コドン４６および／または４８を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、コドン５０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、コドン５４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、コドン８２および／または８４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、コドン９０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、あるいは上記プローブの相補物にハイブリダイゼーションさせ、さらに上記プローブは図１に示す標的配列のいずれかに、または上記標的配列の相補物に特異的にハイブリダイゼーションするという点でさらに特徴づけられるものであり、ｄ）工程ｃ）で得た結果から、薬剤耐性を生じさせる変異が該標的配列のいずれかに存在するか否かを推定することを含む。
Description
【０００１】 本発明は、ＨＩＶの診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＨＩＶ感
染を治療するために使用される抗ウイルス剤に対するＨＩＶの感受性の診断の分
野に関する。 本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子における薬剤により選択された変異の迅
速かつ信頼性の高い検出方法であって、逆ハイブリダイゼーションアッセイにお
いて一緒になって機能するように最適化された特定のプローブのセットを用いて
薬剤耐性に関与する一定範囲のコドンを同時に特徴づける方法に関する。
染を治療するために使用される抗ウイルス剤に対するＨＩＶの感受性の診断の分
野に関する。 本発明は、ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子における薬剤により選択された変異の迅
速かつ信頼性の高い検出方法であって、逆ハイブリダイゼーションアッセイにお
いて一緒になって機能するように最適化された特定のプローブのセットを用いて
薬剤耐性に関与する一定範囲のコドンを同時に特徴づける方法に関する。
【０００２】 ２．発明の背景 ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関す
る伝染性病原体である。他のレトロウイルスと同様に、ＨＩＶは、ウイルスポリ
ペプチドをその機能的形態に配列することにより新たに産生されたウイルス粒子
の成熟を媒介するアスパラギン酸プロテアーゼをコードしている（Hunterら）。
ＨＩＶプロテアーゼは２個の同一サブユニットからなる２量体分子であり、各サ
ブユニットが触媒アスパラギン酸残基に寄与している（Naviaら、Whodawerら、M
eekら）。この酵素を阻害すると、新たなウイルス複製サイクルを確立できない
非感染性ウイルス粒子が生じる（Kohlら、Pengら）。 最初は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤を開発する試みは天然基質を模倣し
たペプチド基質の設計に基づいていた。より最近になって、酵素の３次元構造の
利用可能性により、コンピューターモデリングを用いてプロテアーゼ阻害剤（Ｐ
Ｉ）を合理的に設計できるようになった（Huffら、Whodawerら）。部分的にペプ
チド性であるかまたは全体として非ペプチド性の多くの第２世代のＰＩが、細胞
培養において特に強力な抗ウイルス効果を示すことがわかった。種々のプロテア
ーゼ阻害剤とヌクレオシドおよび非ヌクレオシドＲＴ阻害剤との組み合わせもま
たインビトロにおいて広く研究されている。いずれの場合にも、その組み合わせ
は少なくとも相加的であり、通常は相乗的である。
る伝染性病原体である。他のレトロウイルスと同様に、ＨＩＶは、ウイルスポリ
ペプチドをその機能的形態に配列することにより新たに産生されたウイルス粒子
の成熟を媒介するアスパラギン酸プロテアーゼをコードしている（Hunterら）。
ＨＩＶプロテアーゼは２個の同一サブユニットからなる２量体分子であり、各サ
ブユニットが触媒アスパラギン酸残基に寄与している（Naviaら、Whodawerら、M
eekら）。この酵素を阻害すると、新たなウイルス複製サイクルを確立できない
非感染性ウイルス粒子が生じる（Kohlら、Pengら）。 最初は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤を開発する試みは天然基質を模倣し
たペプチド基質の設計に基づいていた。より最近になって、酵素の３次元構造の
利用可能性により、コンピューターモデリングを用いてプロテアーゼ阻害剤（Ｐ
Ｉ）を合理的に設計できるようになった（Huffら、Whodawerら）。部分的にペプ
チド性であるかまたは全体として非ペプチド性の多くの第２世代のＰＩが、細胞
培養において特に強力な抗ウイルス効果を示すことがわかった。種々のプロテア
ーゼ阻害剤とヌクレオシドおよび非ヌクレオシドＲＴ阻害剤との組み合わせもま
たインビトロにおいて広く研究されている。いずれの場合にも、その組み合わせ
は少なくとも相加的であり、通常は相乗的である。
【０００３】 最近開発された多くのＨＩＶ−１ ＰＩの抗ウイルス能にもかかわらず、これ
らの化合物に対する感受性を低下させたウイルスの出現が、細胞培養および治療
患者において記載されており、ウイルスは感受性の低下によって抗ウイルス剤の
阻害効果から逃れている（Condraら）。耐性変種の出現はウイルス集団に適用さ
れる選択圧に依存する。比較的効果の小さい薬剤の場合には選択圧は低い。なぜ
なら、野生型ウイルスおよび変種の複製がいずれも持続しうるからである。より
効果の大きい薬剤が耐性変種以外のウイルスの複製を抑制する場合には、その変
種が選択されるであろう。ＰＩによる選択により得られるウイルス変種は、結果
的に生じたプロテアーゼコーディング配列中のいくつかの異なった変異を有して
いる。これらのクラスターの多くは酵素活性部位に出現するが、離れた部位にも
見出される。このことは活性部位の１次構造の変化に対するコンホーメーション
的適応を示唆するものであり、この点において、ＰＩに対する耐性を高める特定
の変異はプロテアーゼ活性およびウイルス複製を減少させる。
らの化合物に対する感受性を低下させたウイルスの出現が、細胞培養および治療
患者において記載されており、ウイルスは感受性の低下によって抗ウイルス剤の
阻害効果から逃れている（Condraら）。耐性変種の出現はウイルス集団に適用さ
れる選択圧に依存する。比較的効果の小さい薬剤の場合には選択圧は低い。なぜ
なら、野生型ウイルスおよび変種の複製がいずれも持続しうるからである。より
効果の大きい薬剤が耐性変種以外のウイルスの複製を抑制する場合には、その変
種が選択されるであろう。ＰＩによる選択により得られるウイルス変種は、結果
的に生じたプロテアーゼコーディング配列中のいくつかの異なった変異を有して
いる。これらのクラスターの多くは酵素活性部位に出現するが、離れた部位にも
見出される。このことは活性部位の１次構造の変化に対するコンホーメーション
的適応を示唆するものであり、この点において、ＰＩに対する耐性を高める特定
の変異はプロテアーゼ活性およびウイルス複製を減少させる。
【０００４】 ＰＩのなかでも、リトナビル（A-75925;ABT-538）、ネルフィナビル（AG-1343
）、インジナビル（MK-639;L735;L524）およびサキナビル（Ro 31-8959）は食品
医薬品局により承認され、現在ＨＩＶ感染患者に関する臨床試験中である。ＶＸ
−４８７（141W94）抗ウイルス化合物はまだ承認されていない。上記化合物に関
して選択され、耐性を除々に高める最も重要な変異はアミノ酸（ａａ）位置３０
（ＤからＮ）、４６（ＭからＩ）、４８（ＧからＶ）、５０（ＩからＶ）、５４
（ＩからＡ、ＩからＶ）、８２（ＶからＡまたはＦまたはＩまたはＴ）、８４（
ＩからＶ）および９０（ＬからＭ）において見出される。上記化合物に対する薬
剤耐性に関連した他の変異が記載されている（Schinaziら）。通常、アミノ酸位
置９０および／または４８に変異を有するサキナビル耐性変種はサキナビルのみ
での治療を１年行った後に４５％の患者において出現する。高用量のサキナビル
の場合にはあまり頻繁に耐性が生じない。インジナビルおよびリトナビルに対す
る耐性には複数の変異が必要であり、通常には、３部位よりも多く１１部位まで
であり、より多くのアミノ酸置換が高レベルの耐性を付与する。通常には、耐性
単離体はコドン８２、８４または９０に変異を有する。リトナビルの場合には、
大部分の患者においてコドン８２における変異が最初に出現する。サキナビルに
耐性のある変異ウイルス粒子はインジナビルまたはリトナビルに対しては交差耐
性を示さず、一般的には、インジナビル耐性単離体はリトナビル耐性であり、そ
の逆も成り立つ。通常には、インジナビルまたはリトナビルいずれかに対する耐
性はサキナビルに対する交差耐性を生じる。インジナビル耐性単離体の約３分の
１はネルフィナビルに対しても交差耐性を示す。
）、インジナビル（MK-639;L735;L524）およびサキナビル（Ro 31-8959）は食品
医薬品局により承認され、現在ＨＩＶ感染患者に関する臨床試験中である。ＶＸ
−４８７（141W94）抗ウイルス化合物はまだ承認されていない。上記化合物に関
して選択され、耐性を除々に高める最も重要な変異はアミノ酸（ａａ）位置３０
（ＤからＮ）、４６（ＭからＩ）、４８（ＧからＶ）、５０（ＩからＶ）、５４
（ＩからＡ、ＩからＶ）、８２（ＶからＡまたはＦまたはＩまたはＴ）、８４（
ＩからＶ）および９０（ＬからＭ）において見出される。上記化合物に対する薬
剤耐性に関連した他の変異が記載されている（Schinaziら）。通常、アミノ酸位
置９０および／または４８に変異を有するサキナビル耐性変種はサキナビルのみ
での治療を１年行った後に４５％の患者において出現する。高用量のサキナビル
の場合にはあまり頻繁に耐性が生じない。インジナビルおよびリトナビルに対す
る耐性には複数の変異が必要であり、通常には、３部位よりも多く１１部位まで
であり、より多くのアミノ酸置換が高レベルの耐性を付与する。通常には、耐性
単離体はコドン８２、８４または９０に変異を有する。リトナビルの場合には、
大部分の患者においてコドン８２における変異が最初に出現する。サキナビルに
耐性のある変異ウイルス粒子はインジナビルまたはリトナビルに対しては交差耐
性を示さず、一般的には、インジナビル耐性単離体はリトナビル耐性であり、そ
の逆も成り立つ。通常には、インジナビルまたはリトナビルいずれかに対する耐
性はサキナビルに対する交差耐性を生じる。インジナビル耐性単離体の約３分の
１はネルフィナビルに対しても交差耐性を示す。
【０００５】 有効な抗ウイルス治療規則は現在まったく明らかでない。ＨＩＶプロテアーゼ
阻害剤に対する感受性の低下パターンが、ＰＩ存在下でウイルスを培養すること
によりインビトロにおいて調べられた。しかしながら、これらのデータは、ＰＩ
を投与される患者において実際にみられるアミノ酸変化のパターンを完全に予想
するものではなかった。耐性および交差耐性パターンに関する知識は、最適な薬
剤の組み合わせの選択ならびに重複しない耐性パターンを有する配列の選択を容
易にするはずである。これにより、患者において交差耐性ウイルス株の出現が遅
延され、有効な抗ウイルス活性の持続期間が延長されるであろう。それゆえ、こ
れらの変異イベントを検出して、ＨＩＶの耐性についてより良い洞察を与えるた
めの方法および系が必要である。さらに、慣用的な細胞培養選択法よりも時間の
効率が良く、経済的な方法での抗ウイルス治療にとり重要なデータを提供しうる
方法および系が必要である。
阻害剤に対する感受性の低下パターンが、ＰＩ存在下でウイルスを培養すること
によりインビトロにおいて調べられた。しかしながら、これらのデータは、ＰＩ
を投与される患者において実際にみられるアミノ酸変化のパターンを完全に予想
するものではなかった。耐性および交差耐性パターンに関する知識は、最適な薬
剤の組み合わせの選択ならびに重複しない耐性パターンを有する配列の選択を容
易にするはずである。これにより、患者において交差耐性ウイルス株の出現が遅
延され、有効な抗ウイルス活性の持続期間が延長されるであろう。それゆえ、こ
れらの変異イベントを検出して、ＨＩＶの耐性についてより良い洞察を与えるた
めの方法および系が必要である。さらに、慣用的な細胞培養選択法よりも時間の
効率が良く、経済的な方法での抗ウイルス治療にとり重要なデータを提供しうる
方法および系が必要である。
【０００６】 ３．発明の目的 生物学的試料中に存在するＨＩＶレトロウイルスのごとき、プロテアーゼ遺伝
子を含むウイルスの抗ウイルス剤耐性を決定するための迅速で信頼性の高い方法
を開発することが本発明の１の目的である。 より詳細には、単一実験において、抗ウイルス剤耐性に関与する異なったＨＩ
Ｖプロテアーゼ遺伝子の野生型および変異コドンの検出を可能にする遺伝子型決
定アッセイを提供することが本発明の１の目的である。
子を含むウイルスの抗ウイルス剤耐性を決定するための迅速で信頼性の高い方法
を開発することが本発明の１の目的である。 より詳細には、単一実験において、抗ウイルス剤耐性に関与する異なったＨＩ
Ｖプロテアーゼ遺伝子の野生型および変異コドンの検出を可能にする遺伝子型決
定アッセイを提供することが本発明の１の目的である。
【０００７】 目的コドンにおけるヌクレオチド配列および／または目的コドンにおけるアミ
ノ酸および／または抗ウイルス剤により選択されるスペクトルの推定を可能にし
、可能ならば関与する単離体のＨＩＶタイプまたはサブタイプを推定することを
可能にする、ＨＩＶプロテアーゼの遺伝子型決定アッセイまたは遺伝子型決定方
法を提供することも本発明の１の目的である。 より詳細には、単一の実験において、野生型および変異コドンを示す異なった
ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子の遺伝子多型性の検出を可能にする、遺伝子型決定ア
ッセイを提供することが本発明の１の目的である。
ノ酸および／または抗ウイルス剤により選択されるスペクトルの推定を可能にし
、可能ならば関与する単離体のＨＩＶタイプまたはサブタイプを推定することを
可能にする、ＨＩＶプロテアーゼの遺伝子型決定アッセイまたは遺伝子型決定方
法を提供することも本発明の１の目的である。 より詳細には、単一の実験において、野生型および変異コドンを示す異なった
ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子の遺伝子多型性の検出を可能にする、遺伝子型決定ア
ッセイを提供することが本発明の１の目的である。
【０００８】 野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、リトナビル（A-75925;ABT-538）、ネルフ
ィナビル（AG-1343）、インジナビル（MK-639;L735;L524）およびサキナビル（R
o 31-8959）およびＶＸ−４７８（141W94）または他の抗ウイルス剤（Shinaziら
）のごとき１またはそれ以上の抗ウイルス剤に対する耐性を付与する変異または
多型性ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特別なプローブを選択
することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、リトナビル（A-75925;ABT-
538）に対する耐性を付与する変異または多型性ＨＩＶプロテアーゼ配列から識
別することのできる特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的で
ある。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、ネルフィナビル（AG-1343
）に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのでき
る特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、インジナビル（MK-639;L73
5;L524）に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別すること
のできる特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、サキナビル（Ro 31-8959）
に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる
特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、ＶＸ−４７８（141W94）に
対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特
別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤に対する交差耐性を決定および／または推定するこ
とができる特別なプローブを選択することも本発明の１の目的である。
ィナビル（AG-1343）、インジナビル（MK-639;L735;L524）およびサキナビル（R
o 31-8959）およびＶＸ−４７８（141W94）または他の抗ウイルス剤（Shinaziら
）のごとき１またはそれ以上の抗ウイルス剤に対する耐性を付与する変異または
多型性ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特別なプローブを選択
することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、リトナビル（A-75925;ABT-
538）に対する耐性を付与する変異または多型性ＨＩＶプロテアーゼ配列から識
別することのできる特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的で
ある。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、ネルフィナビル（AG-1343
）に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのでき
る特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、インジナビル（MK-639;L73
5;L524）に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別すること
のできる特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、サキナビル（Ro 31-8959）
に対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる
特別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、ＶＸ−４７８（141W94）に
対する耐性を付与する変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特
別なプローブを選択することが本発明のもう１つの目的である。 ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤に対する交差耐性を決定および／または推定するこ
とができる特別なプローブを選択することも本発明の１の目的である。
【０００９】 より詳細には、野生型ＨＩＶプロテアーゼを、ウイルスプロテアーゼ遺伝子の
アミノ酸位置３０（ＤからＮ）、４６（ＭからＩ）、４８（ＧからＶ）、５０（
ＩからＶ）、５４（ＩからＡ、ＩからＶ）、８２（ＶからＡまたはＦまたはＩま
たはＴ）、８４（ＩからＶ）および９０（ＬからＭ）の少なくとも１つのアミノ
酸位置を含む変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特別なプロ
ーブを選択することが本発明の１の目的である。 特に、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、上記抗ウイルス剤のいずれかに対す
る耐性を付与する変異から識別することのできる特別なプローブのセットであっ
て、逆ハイブリダイゼーションアッセイに使用されるプローブのセットを選択す
ることが本発明の１の目的である。 さらに、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、上記抗ウイルス剤のいずれかに対
する耐性を付与する変異から識別することのできる別のプローブのセットであっ
て、生物学的試料中のＨＩＶ単離体のタイプまたはサブタイプを同定することが
でき、それらすべてが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において使用
できるプローブのセットを提供することが本発明の１の目的である。
アミノ酸位置３０（ＤからＮ）、４６（ＭからＩ）、４８（ＧからＶ）、５０（
ＩからＶ）、５４（ＩからＡ、ＩからＶ）、８２（ＶからＡまたはＦまたはＩま
たはＴ）、８４（ＩからＶ）および９０（ＬからＭ）の少なくとも１つのアミノ
酸位置を含む変異ＨＩＶプロテアーゼ配列から識別することのできる特別なプロ
ーブを選択することが本発明の１の目的である。 特に、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、上記抗ウイルス剤のいずれかに対す
る耐性を付与する変異から識別することのできる特別なプローブのセットであっ
て、逆ハイブリダイゼーションアッセイに使用されるプローブのセットを選択す
ることが本発明の１の目的である。 さらに、野生型ＨＩＶプロテアーゼ配列を、上記抗ウイルス剤のいずれかに対
する耐性を付与する変異から識別することのできる別のプローブのセットであっ
て、生物学的試料中のＨＩＶ単離体のタイプまたはサブタイプを同定することが
でき、それらすべてが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において使用
できるプローブのセットを提供することが本発明の１の目的である。
【００１０】 目的の抗ウイルス剤耐性の特性を決定する遺伝子フラグメントの増幅を可能に
するプライマーを選択することも本発明の目的である。 抗ウイルス剤に対する交差耐性を生じさせる変異ＨＩＶプロテアーゼ配列を同
定することのできる特別なプローブを選択することも本発明の目的である。 本発明は、かかる遺伝子型決定アッセイを開発するのに有用な上記プローブを
含む診断キットも目的とする。 本発明は、かかる遺伝子型決定アッセイを開発するに有用な上記プライマーを
含む診断キットも目的とする。
するプライマーを選択することも本発明の目的である。 抗ウイルス剤に対する交差耐性を生じさせる変異ＨＩＶプロテアーゼ配列を同
定することのできる特別なプローブを選択することも本発明の目的である。 本発明は、かかる遺伝子型決定アッセイを開発するのに有用な上記プローブを
含む診断キットも目的とする。 本発明は、かかる遺伝子型決定アッセイを開発するに有用な上記プライマーを
含む診断キットも目的とする。
【００１１】 ４．発明の詳細な説明 本発明のすべての目的は以下の個々の具体例に合致するものである。 １の具体例によれば、本発明は、生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイル
ス剤に対する感受性を決定する方法に関し、該方法は、 ａ）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し、 ｂ）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーペアーを用いてＨＩＶの
プロテアーゼ遺伝子の関連部分を増幅し、 ｃ）工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を下記プローブの少なくとも１つ： コドン３０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン４６および／または４８を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン５０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン５４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン８２および／または８４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン９０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 あるいは上記プローブの相補物 にハイブリダイゼーションさせ、 さらに上記プローブは図１に示す標的配列のいずれかに、または上記標的配列
の相補物に特異的にハイブリダイゼーションするという点でさらに特徴づけられ
るものであり、 ｄ）工程ｃ）で得た結果から、薬剤耐性を生じさせる変異が該標的配列のいず
れかに存在するか否かを推定する ことを含む。
ス剤に対する感受性を決定する方法に関し、該方法は、 ａ）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し、 ｂ）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーペアーを用いてＨＩＶの
プロテアーゼ遺伝子の関連部分を増幅し、 ｃ）工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を下記プローブの少なくとも１つ： コドン３０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン４６および／または４８を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン５０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン５４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン８２および／または８４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン９０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 あるいは上記プローブの相補物 にハイブリダイゼーションさせ、 さらに上記プローブは図１に示す標的配列のいずれかに、または上記標的配列
の相補物に特異的にハイブリダイゼーションするという点でさらに特徴づけられ
るものであり、 ｄ）工程ｃ）で得た結果から、薬剤耐性を生じさせる変異が該標的配列のいず
れかに存在するか否かを推定する ことを含む。
【００１２】 ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸の番号付けは文献
において広く受け入れられているものである。位置４８または５０に変化を生じ
させる変異は、サキナビルに対する耐性を付与することが知られている（Erlebe
ら；Tisdaleら）。コドン４６または５４または８２または８４におけるアミノ
酸変化はリトナビルおよびインジナビルに対する耐性を生じさせる（Kempfら；A
miniら；Condraら）。位置３０および４６におけるアミノ酸変化はネルフィナビ
ルに対する耐性を生じさせ（Patickら）、位置５０におけるアミノ酸変化はＶＸ
−４８７に対する耐性を付与する（Raoら）。それゆえ、上記方法は、ＨＩＶ株
が上記薬剤に対して感受性であるか耐性であるかを決定することを可能にする。
この方法を用いて、例えば、治療を開始する前に上記薬剤のいずれかに対する耐
性を付与する変異に関してスクリーニングすることができる。またこの方法を用
いて、治療過程において生じうる変異をスクリーニングしてもよい（すなわち、
薬剤治療のモニタリング）。この方法を用いて上記薬剤以外の薬剤に対する耐性
を決定してもよいことは明らかであるが、これらの他の薬剤に対する耐性が、こ
の方法を用いることにより検出できる変異にリンクしていることが条件となる。
この方法を多型性ヌクレオチドの特異的検出に使用してもよい。上に示したよう
に上記プローブが関連多型性ヌクレオチドの特異的検出を可能にする限り、上記
プローブは、図１、表２および表３に示す標的配列と一部においてのみ重複しう
ることが理解されよう。図１、表２および表３の配列はプロテアーゼ遺伝子を含
むポリ核酸フラグメントに由来したものである。ＰＣＲ増幅によりこれらのフラ
グメントを得て、クローニングベクター中に挿入し、実施例１に記載のごとく配
列を分析した。いくつかのポリ核酸フラグメントが、これまで開示されていなか
った配列中に多型性であるヌクレオチドを含んでいたことに注意すべきである。
これらの新規多型性ヌクレオチド配列を下表４に示す。 表４：多型性ヌクレオチド配列 51 52 53 54 55 56 57 58 コドン位置 gga ggt ttt atc aaa gta aga cag コンセンサス配列 GGA GGT TTT ATC AAA GTC AGA CAA 配列番号：478 GGA GGT TTC ATT AAG GTA AAA CAG 配列番号：479 GGA GGT TTT ATT AAG GTA AGA CAG 配列番号：480 GGA GGT TTT ATT AAA GTA AGA CAA 配列番号：481 GGA GGC TTT ATC AAA GTA AGA CAA 配列番号：482 GGA GGT TTT ATC AAA GTC AGA CAA 配列番号：483 78 79 80 81 82 83 84 85 コドン位置 gga cct aca cct gtc aac ata att gg コンセンサス配列 GGA CCT ACA CCG GTC AAC ATA ATT GG 配列番号：484 GGA CCT ACA CCT GCC AAT ATA ATT GG 配列番号：485 GGA CCT ACG CCC TTC AAC ATA ATT GG 配列番号：486 GGA CCG ACA CCT GTC ACC ATA ATT GG 配列番号：487 GGA CCT ATA CCT GTC AAC ATA ATT GG 配列番号：488 87 88 89 90 91 92 93 94 コドン位置 a aga aat ctg ttg act cag att ggc コンセサス配列 A AAA AAT CTG ATG ACT CAG ATT GGC 配列番号：489 A AGA ACT CTG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：490 A AGA AAT ATG ATG ACC CAG CTT GGC 配列番号：491 A AGA AAT ATA ATG ACT CAG CTT GGA 配列番号：492 A AGA AAT CTG CTG ACT CAG ATT GGG 配列番号：493 A AGA AAT CTG TTG ACA CAG CTT GGC 配列番号：494 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGT 配列番号：495 A AGA AAT TTG TTG ACT CAG ATT GGG 配列番号：496 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGT 配列番号：497 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：498 A AGA AAT CTG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：499 A AGA AAC CTG TTG ACT CAA CTT GGT 配列番号：500
において広く受け入れられているものである。位置４８または５０に変化を生じ
させる変異は、サキナビルに対する耐性を付与することが知られている（Erlebe
ら；Tisdaleら）。コドン４６または５４または８２または８４におけるアミノ
酸変化はリトナビルおよびインジナビルに対する耐性を生じさせる（Kempfら；A
miniら；Condraら）。位置３０および４６におけるアミノ酸変化はネルフィナビ
ルに対する耐性を生じさせ（Patickら）、位置５０におけるアミノ酸変化はＶＸ
−４８７に対する耐性を付与する（Raoら）。それゆえ、上記方法は、ＨＩＶ株
が上記薬剤に対して感受性であるか耐性であるかを決定することを可能にする。
この方法を用いて、例えば、治療を開始する前に上記薬剤のいずれかに対する耐
性を付与する変異に関してスクリーニングすることができる。またこの方法を用
いて、治療過程において生じうる変異をスクリーニングしてもよい（すなわち、
薬剤治療のモニタリング）。この方法を用いて上記薬剤以外の薬剤に対する耐性
を決定してもよいことは明らかであるが、これらの他の薬剤に対する耐性が、こ
の方法を用いることにより検出できる変異にリンクしていることが条件となる。
この方法を多型性ヌクレオチドの特異的検出に使用してもよい。上に示したよう
に上記プローブが関連多型性ヌクレオチドの特異的検出を可能にする限り、上記
プローブは、図１、表２および表３に示す標的配列と一部においてのみ重複しう
ることが理解されよう。図１、表２および表３の配列はプロテアーゼ遺伝子を含
むポリ核酸フラグメントに由来したものである。ＰＣＲ増幅によりこれらのフラ
グメントを得て、クローニングベクター中に挿入し、実施例１に記載のごとく配
列を分析した。いくつかのポリ核酸フラグメントが、これまで開示されていなか
った配列中に多型性であるヌクレオチドを含んでいたことに注意すべきである。
これらの新規多型性ヌクレオチド配列を下表４に示す。 表４：多型性ヌクレオチド配列 51 52 53 54 55 56 57 58 コドン位置 gga ggt ttt atc aaa gta aga cag コンセンサス配列 GGA GGT TTT ATC AAA GTC AGA CAA 配列番号：478 GGA GGT TTC ATT AAG GTA AAA CAG 配列番号：479 GGA GGT TTT ATT AAG GTA AGA CAG 配列番号：480 GGA GGT TTT ATT AAA GTA AGA CAA 配列番号：481 GGA GGC TTT ATC AAA GTA AGA CAA 配列番号：482 GGA GGT TTT ATC AAA GTC AGA CAA 配列番号：483 78 79 80 81 82 83 84 85 コドン位置 gga cct aca cct gtc aac ata att gg コンセンサス配列 GGA CCT ACA CCG GTC AAC ATA ATT GG 配列番号：484 GGA CCT ACA CCT GCC AAT ATA ATT GG 配列番号：485 GGA CCT ACG CCC TTC AAC ATA ATT GG 配列番号：486 GGA CCG ACA CCT GTC ACC ATA ATT GG 配列番号：487 GGA CCT ATA CCT GTC AAC ATA ATT GG 配列番号：488 87 88 89 90 91 92 93 94 コドン位置 a aga aat ctg ttg act cag att ggc コンセサス配列 A AAA AAT CTG ATG ACT CAG ATT GGC 配列番号：489 A AGA ACT CTG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：490 A AGA AAT ATG ATG ACC CAG CTT GGC 配列番号：491 A AGA AAT ATA ATG ACT CAG CTT GGA 配列番号：492 A AGA AAT CTG CTG ACT CAG ATT GGG 配列番号：493 A AGA AAT CTG TTG ACA CAG CTT GGC 配列番号：494 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGT 配列番号：495 A AGA AAT TTG TTG ACT CAG ATT GGG 配列番号：496 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGT 配列番号：497 A AGA AAT ATG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：498 A AGA AAT CTG TTG ACT CAG CTT GGA 配列番号：499 A AGA AAC CTG TTG ACT CAA CTT GGT 配列番号：500
【００１３】 よって、本発明は、これらの新規配列、またはそれらのフラグメントに関する
ものであり、該フラグメントは少なくとも１０個、好ましくは１５個、さらによ
り好ましくは２０個の連続したヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１つの多
型性ヌクレオチドを含む。これらの新たな多型性ヌクレオチドは上記配列とは異
なった別の配列を生じさせる可能性があることがさらに理解されよう。例えば、
コドン５５の３番目の位置のＧは、コドン５４の３番目の位置のＴと組合わせて
配列番号：４７８において示されるが、コドン５５の３番目の位置のＧは野生型
配列中にも存在するとも考えられる。上記説明は上記標的配列の相補物にもあて
はまることも理解されよう。この適用を図１にも示す。
ものであり、該フラグメントは少なくとも１０個、好ましくは１５個、さらによ
り好ましくは２０個の連続したヌクレオチドを含み、さらに少なくとも１つの多
型性ヌクレオチドを含む。これらの新たな多型性ヌクレオチドは上記配列とは異
なった別の配列を生じさせる可能性があることがさらに理解されよう。例えば、
コドン５５の３番目の位置のＧは、コドン５４の３番目の位置のＴと組合わせて
配列番号：４７８において示されるが、コドン５５の３番目の位置のＧは野生型
配列中にも存在するとも考えられる。上記説明は上記標的配列の相補物にもあて
はまることも理解されよう。この適用を図１にも示す。
【００１４】 好ましい具体例によれば、本発明は、生成したハイブリッドの検出を可能にす
る適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において上記プローブがそれ
らの個々の標的領域に同時にハイブリダイゼーションできるという点でさらに特
徴づけられる上記方法に関する。
る適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において上記プローブがそれ
らの個々の標的領域に同時にハイブリダイゼーションできるという点でさらに特
徴づけられる上記方法に関する。
【００１５】 好ましい具体例によれば、所望のハイブリダイゼーション結果が得られるよう
に慎重に設計された少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましく
は少なくとも４個、最も好ましくは少なくとも５個のプローブを用いて工程ｃを
行う。一般的には、この方法により検出できる変異の有無に依存した目的のため
に、例えば遺伝子型決定のためにこの方法を用いてもよい。表１のプローブは、
実施例２および３に記載されたＬｉＰＡアッセイ（下記参照）において使用され
た場合に特異的なハイブリダイゼーション結果を生じさせるように最適化されて
いる。よって、これらのプローブは、ハイブリッドの検出を可能にする同一のハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件下においてそれらの個々の標的領域に同時
にハイブリダイゼーションするようにも最適化されている。コドン３０、４６／
４８、５０、５４および８２／８４のそれぞれに対するプローブのセットを、実
施例２および３に記載したように実験的に試験した。種々の地域から得た８５６
個の試料と、表１に示した当該セットとの反応性を評価した。コドン３０、４６
／４８、５０、５４および８２／８４に対するプローブのセットは、それぞれ試
験試料の９８．９％、９９．６％、９８．５％、９９．２％、９５．４％および
９７．２％と反応した。よって、本発明は、表１および表７に示す、コドン３０
、４６／４８、５０、５４、８２／８４および９０に対するプローブのセットに
も関する。
に慎重に設計された少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましく
は少なくとも４個、最も好ましくは少なくとも５個のプローブを用いて工程ｃを
行う。一般的には、この方法により検出できる変異の有無に依存した目的のため
に、例えば遺伝子型決定のためにこの方法を用いてもよい。表１のプローブは、
実施例２および３に記載されたＬｉＰＡアッセイ（下記参照）において使用され
た場合に特異的なハイブリダイゼーション結果を生じさせるように最適化されて
いる。よって、これらのプローブは、ハイブリッドの検出を可能にする同一のハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件下においてそれらの個々の標的領域に同時
にハイブリダイゼーションするようにも最適化されている。コドン３０、４６／
４８、５０、５４および８２／８４のそれぞれに対するプローブのセットを、実
施例２および３に記載したように実験的に試験した。種々の地域から得た８５６
個の試料と、表１に示した当該セットとの反応性を評価した。コドン３０、４６
／４８、５０、５４および８２／８４に対するプローブのセットは、それぞれ試
験試料の９８．９％、９９．６％、９８．５％、９９．２％、９５．４％および
９７．２％と反応した。よって、本発明は、表１および表７に示す、コドン３０
、４６／４８、５０、５４、８２／８４および９０に対するプローブのセットに
も関する。
【００１６】 もう１つのさらに好ましい具体例によれば、本発明は、 工程ｂ）が、ヌクレオチド位置２１０とヌクレオチド位置２６０（コドン８７
）との間、より好ましくはヌクレオチド位置２２０とヌクレオチド位置２６０（
コドン８７）との間、より好ましくはヌクレオチド位置２３０とヌクレオチド位
置２６０（コドン８７）との間、さらにより好ましくはヌクレオチド位置２４１
からヌクレオチド位置２６０（コドン８７）までの間に位置する標的配列に特異
的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個の５’プライマーを少なくとも
１個の適当な３’プライマーと組み合わせて用いてプロテアーゼ遺伝子のフラグ
メントを増幅することを含み、 工程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン９０を含む標的配列に
特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個のプローブとハイブリダイ
ゼーションさせることを含む という点でさらに特徴づけられる上記方法に関する。
）との間、より好ましくはヌクレオチド位置２２０とヌクレオチド位置２６０（
コドン８７）との間、より好ましくはヌクレオチド位置２３０とヌクレオチド位
置２６０（コドン８７）との間、さらにより好ましくはヌクレオチド位置２４１
からヌクレオチド位置２６０（コドン８７）までの間に位置する標的配列に特異
的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個の５’プライマーを少なくとも
１個の適当な３’プライマーと組み合わせて用いてプロテアーゼ遺伝子のフラグ
メントを増幅することを含み、 工程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン９０を含む標的配列に
特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個のプローブとハイブリダイ
ゼーションさせることを含む という点でさらに特徴づけられる上記方法に関する。
【００１７】 さらに好ましい具体例によれば、本発明は、 工程ｂ）が、ヌクレオチド位置２５３（コドン８５）とヌクレオチド位置３０
０との間、より好ましくはヌクレオチド位置２５３（コドン８５）とヌクレオチ
ド位置２９０との間、より好ましくはヌクレオチド位置２５３（コドン８５）と
ヌクレオチド位置２８０との間、さらにより好ましくはヌクレオチド位置２５３
（コドン８５）からヌクレオチド位置２７３（コドン９１）までの間に位置する
標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個の３’プライマ
ーを少なくとも１個の適当な５’プライマーと組み合わせて用いてプロテアーゼ
遺伝子のフラグメントを増幅することを含み、 工程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン３０、４６、４８、５
０、５２、５４、８２および８４のいずれかを含む標的配列に特異的にハイブリ
ダイゼーションする少なくとも１個のプローブとハイブリダイゼーションさせる
ことを含む という点でさらに特徴づけられる上記方法に関する。
０との間、より好ましくはヌクレオチド位置２５３（コドン８５）とヌクレオチ
ド位置２９０との間、より好ましくはヌクレオチド位置２５３（コドン８５）と
ヌクレオチド位置２８０との間、さらにより好ましくはヌクレオチド位置２５３
（コドン８５）からヌクレオチド位置２７３（コドン９１）までの間に位置する
標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１個の３’プライマ
ーを少なくとも１個の適当な５’プライマーと組み合わせて用いてプロテアーゼ
遺伝子のフラグメントを増幅することを含み、 工程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン３０、４６、４８、５
０、５２、５４、８２および８４のいずれかを含む標的配列に特異的にハイブリ
ダイゼーションする少なくとも１個のプローブとハイブリダイゼーションさせる
ことを含む という点でさらに特徴づけられる上記方法に関する。
【００１８】 意外なことに、上記のヌクレオチドコドンのすべてを含む増幅された核酸フラ
グメントは、コドン８２、８４または９０を含むプローブと最適にはハイブリダ
イゼーションしないことを見出した。一方、短いフラグメント、例えば、配列番
号：５および４にそれぞれ示されるプライマーＰｒｏｔ４１ｂｉｏおよびＰｒｏ
ｔ６ｂｉｏを用いることにより増幅されるフラグメントは、コドン９０を含むプ
ローブにより良くハイブリダイゼーションする。プライマーＰｒｏｔ４１ｂｉｏ
と、プライマーＰｒｏｔ６ａｂｉｏ、Ｐｒｏｔ６ｂｂｉｏ、Ｐｒｏｔ６ｃｂｉｏ
およびＰｒｏｔ６ｄｂｉｏとを組み合わせてフラグメントが増幅された場合にも
、より良いハイブリダイゼーションが得られる。よって、本発明は、５’プライ
マーが配列番号：５であり、少なくとも１個の３’プライマーが配列番号：４、
配列番号：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８および配列番号：５０
９から選択されるという点でさらに特徴づけられる上記方法にも関する。同様に
、もう１つの短いフラグメント、例えば、配列番号：３および配列番号：６にそ
れぞれ示されるプライマーＰｒｏｔ２ｂｉｏおよびＰｒｏｔ３１ｂｉｏを用いる
ことにより増幅されるフラグメントは、コドン８２および／または８４を含むプ
ローブにより良くハイブリダイゼーションすることがわかった。それゆえ、本発
明は、５’プライマーが配列番号：５であり、少なくとも１個の３’プライマー
が配列番号：４、配列番号：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８およ
び配列番号：５０９から選択されるという点でさらに特徴づけられる上記方法に
も関する。
グメントは、コドン８２、８４または９０を含むプローブと最適にはハイブリダ
イゼーションしないことを見出した。一方、短いフラグメント、例えば、配列番
号：５および４にそれぞれ示されるプライマーＰｒｏｔ４１ｂｉｏおよびＰｒｏ
ｔ６ｂｉｏを用いることにより増幅されるフラグメントは、コドン９０を含むプ
ローブにより良くハイブリダイゼーションする。プライマーＰｒｏｔ４１ｂｉｏ
と、プライマーＰｒｏｔ６ａｂｉｏ、Ｐｒｏｔ６ｂｂｉｏ、Ｐｒｏｔ６ｃｂｉｏ
およびＰｒｏｔ６ｄｂｉｏとを組み合わせてフラグメントが増幅された場合にも
、より良いハイブリダイゼーションが得られる。よって、本発明は、５’プライ
マーが配列番号：５であり、少なくとも１個の３’プライマーが配列番号：４、
配列番号：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８および配列番号：５０
９から選択されるという点でさらに特徴づけられる上記方法にも関する。同様に
、もう１つの短いフラグメント、例えば、配列番号：３および配列番号：６にそ
れぞれ示されるプライマーＰｒｏｔ２ｂｉｏおよびＰｒｏｔ３１ｂｉｏを用いる
ことにより増幅されるフラグメントは、コドン８２および／または８４を含むプ
ローブにより良くハイブリダイゼーションすることがわかった。それゆえ、本発
明は、５’プライマーが配列番号：５であり、少なくとも１個の３’プライマー
が配列番号：４、配列番号：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８およ
び配列番号：５０９から選択されるという点でさらに特徴づけられる上記方法に
も関する。
【００１９】 実施例１で述べるようにして増幅プライマーの新たなセットを選択した。よっ
て、本発明は、プライマー：ｐｒｏｔ１６（配列番号：５０１）、ｐｒｏｔ５（
配列番号：５０２）、ｐｒｏｔ２ａｂｉｏ（配列番号：５０３）、ｐｒｏｔ２ｂ
ｂｉｏ（配列番号：５０４）、ｐｒｏｔ３１ｂｉｏ（配列番号：６）、ｐｒｏｔ
４１ｂｉｏ（配列番号：５０５）、ｐｒｏｔ６ａ（配列番号：５０６）、ｐｒｏ
ｔ６ｂ（配列番号：５０７）、ｐｒｏｔ６ｃ（配列番号：５０８）およびｐｒｏ
ｔ６ｄ（配列番号：５０９）にも関する。これらのプライマーの多くは化学修飾
（ビオチン化）されているが、化学修飾されていないものもある。本発明は、上
記プライマー、未修飾ヌクレオチドを含むプライマー、または修飾ヌクレオチド
を含むプライマーのいずれにも関する。
て、本発明は、プライマー：ｐｒｏｔ１６（配列番号：５０１）、ｐｒｏｔ５（
配列番号：５０２）、ｐｒｏｔ２ａｂｉｏ（配列番号：５０３）、ｐｒｏｔ２ｂ
ｂｉｏ（配列番号：５０４）、ｐｒｏｔ３１ｂｉｏ（配列番号：６）、ｐｒｏｔ
４１ｂｉｏ（配列番号：５０５）、ｐｒｏｔ６ａ（配列番号：５０６）、ｐｒｏ
ｔ６ｂ（配列番号：５０７）、ｐｒｏｔ６ｃ（配列番号：５０８）およびｐｒｏ
ｔ６ｄ（配列番号：５０９）にも関する。これらのプライマーの多くは化学修飾
（ビオチン化）されているが、化学修飾されていないものもある。本発明は、上
記プライマー、未修飾ヌクレオチドを含むプライマー、または修飾ヌクレオチド
を含むプライマーのいずれにも関する。
【００２０】 本発明の配列特異的ハイブリダイゼーション法を行うために異なる方法を適用
することができる。これらの方法は、増幅されたＨＩＶポリ核酸を固体支持体上
に固定化し、次いで、標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを行うことを含んでいてもよい。前以て増幅することなくＨＩＶポリ核酸を
固体支持体上に固定化し、次いで、ハイブリダイゼーションに供してもよい。別
法として、プローブを固体支持体上に固定化してもよく、好ましくは増幅後に標
識ＨＩＶポリ核酸とのハイブリダイゼーションを行ってもよい。この方法は逆ハ
イブリダイゼーションと呼ばれる。慣用的な逆ハイブリダイゼーション法はライ
ンプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）である。このアッセイは、固体支持片上に平行
線状に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる（Stuyverら，１９９
３年）。上記方法に基づく他のいずれの方法の本発明により包含されることが理
解されよう。
することができる。これらの方法は、増幅されたＨＩＶポリ核酸を固体支持体上
に固定化し、次いで、標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを行うことを含んでいてもよい。前以て増幅することなくＨＩＶポリ核酸を
固体支持体上に固定化し、次いで、ハイブリダイゼーションに供してもよい。別
法として、プローブを固体支持体上に固定化してもよく、好ましくは増幅後に標
識ＨＩＶポリ核酸とのハイブリダイゼーションを行ってもよい。この方法は逆ハ
イブリダイゼーションと呼ばれる。慣用的な逆ハイブリダイゼーション法はライ
ンプローブアッセイ（ＬｉＰＡ）である。このアッセイは、固体支持片上に平行
線状に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる（Stuyverら，１９９
３年）。上記方法に基づく他のいずれの方法の本発明により包含されることが理
解されよう。
【００２１】 もう１つの好ましい具体例によれば、本発明は、いずれかの上記プローブおよ
び／またはいずれかの上記プライマーに関し、該プライマーおよびプローブは、
試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する感受性を決定するための方法に
使用されるように設計される。さらなる好ましい具体例によれば、本発明は、配
列番号：７から配列番号：４７７まで、および配列番号：５１０から配列番号：
５１９までのプローブ、より好ましくは表１および表７に示す配列番号のプロー
ブ、ならびに配列番号：３、４、５および６、５０１、５０２、５０３、５０４
、５０５、５０６、５０７、５０８および５０９のプライマーに関する。当業者
は、それらの末端における１個またはそれ以上のヌクレオチドのフラクションま
たは欠失を上記プローブおよびプライマーに適用してもよいことを認識するであ
ろう。増幅またはハイブリダイゼーションの条件が変更される場合、あるいはＮ
ＡＳＢＡシステムの場合のように増幅された材料がＤＮＡでなくＲＮＡである場
合に、かかる適用が必要であるかもしれない。
び／またはいずれかの上記プライマーに関し、該プライマーおよびプローブは、
試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する感受性を決定するための方法に
使用されるように設計される。さらなる好ましい具体例によれば、本発明は、配
列番号：７から配列番号：４７７まで、および配列番号：５１０から配列番号：
５１９までのプローブ、より好ましくは表１および表７に示す配列番号のプロー
ブ、ならびに配列番号：３、４、５および６、５０１、５０２、５０３、５０４
、５０５、５０６、５０７、５０８および５０９のプライマーに関する。当業者
は、それらの末端における１個またはそれ以上のヌクレオチドのフラクションま
たは欠失を上記プローブおよびプライマーに適用してもよいことを認識するであ
ろう。増幅またはハイブリダイゼーションの条件が変更される場合、あるいはＮ
ＡＳＢＡシステムの場合のように増幅された材料がＤＮＡでなくＲＮＡである場
合に、かかる適用が必要であるかもしれない。
【００２２】 もう１つの好ましい具体例によれば、本発明は、生物学的試料中のＨＩＶウイ
ルスの抗ウイルス剤に対する感受性を決定するための方法を可能にする診断キッ
トに関し、該キットは： ａ）適当な場合には、該試料に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮する
ための手段； ｂ）適当な場合には、請求項４ないし６のいずれかに記載の少なくとも１個の
プライマー； ｃ）請求項１ないし３のいずれかに記載の少なくとも１個のプローブであって
、可能ならば固体支持体に固定化されたもの； ｄ）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを作成するに必
要な成分； ｅ）洗浄溶液、または該溶液を作成するに必要な成分； ｆ）適当な場合には、行ったハイブリダイゼーションにより得られたハイブリ
ッドを検出するための手段； ｈ）適当な場合には、該プローブを固体支持体に結合させるための手段 を含む。
ルスの抗ウイルス剤に対する感受性を決定するための方法を可能にする診断キッ
トに関し、該キットは： ａ）適当な場合には、該試料に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮する
ための手段； ｂ）適当な場合には、請求項４ないし６のいずれかに記載の少なくとも１個の
プライマー； ｃ）請求項１ないし３のいずれかに記載の少なくとも１個のプローブであって
、可能ならば固体支持体に固定化されたもの； ｄ）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを作成するに必
要な成分； ｅ）洗浄溶液、または該溶液を作成するに必要な成分； ｆ）適当な場合には、行ったハイブリダイゼーションにより得られたハイブリ
ッドを検出するための手段； ｈ）適当な場合には、該プローブを固体支持体に結合させるための手段 を含む。
【００２３】 定義 下記の定義は本発明にて用いられる用語および表現を説明することに役立つ。 用語「抗ウイルス剤」は、特に、抗ウイルス性プロテアーゼ阻害剤をいう。か
かる抗ウイルス剤ならびにそれらがＨＩＶプロテアーゼ遺伝子中に生じさせうる
変異の例はShinaziらの１９９７年の文献に開示されている。後者の２つの文献
の内容は本発明の一部を形成するものとみなす。本発明において最も重要な抗ウ
イルス剤は表１ないし２に開示されている。 分析されるべき試料中の標的材料はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、例えば
、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはそれらの増幅さ
れたバージョンであってもよい。これらの分子はポリ核酸とも呼ばれる。 本発明の方法において、ＨＩＶ試料から得たゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子を
用いることが可能である。
かる抗ウイルス剤ならびにそれらがＨＩＶプロテアーゼ遺伝子中に生じさせうる
変異の例はShinaziらの１９９７年の文献に開示されている。後者の２つの文献
の内容は本発明の一部を形成するものとみなす。本発明において最も重要な抗ウ
イルス剤は表１ないし２に開示されている。 分析されるべき試料中の標的材料はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、例えば
、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはそれらの増幅さ
れたバージョンであってもよい。これらの分子はポリ核酸とも呼ばれる。 本発明の方法において、ＨＩＶ試料から得たゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ分子を
用いることが可能である。
【００２４】 よく知られた抽出および精製法を、試料からのＲＮＡまたはＤＮＡの単離に利
用できる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd E
dition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。 用語「プローブ」は、検出されるべき標的配列に対して相補的な配列を有する
、１本鎖配列に特異的なオリゴヌクレオチドをいう。 本発明の用語「標的配列」は、本発明のプローブにより特異的に検出されるべ
きプロテアーゼ遺伝子の野生型配列、または１またはそれ以上の多型性ヌクレオ
チドを含む配列をいう。このヌクレオチド配列は１個または数個のヌクレオチド
変化を含んでいてもよい。標的配列は、単一のヌクレオチド位置、コドン位置、
アミノ酸をコードするヌクレオチド、または上記ヌクレオチド位置をまたぐ配列
をいうこともある。本発明において、該標的配列は、しばしば、１カ所またはそ
れ以上の可変ヌクレオチド位置を含む。 用語「多型性ヌクレオチド」は、特定のＨＩＶウイルスのプロテアーゼ遺伝子
中のヌクレオチドであって、少なくとも１種の他のＨＩＶウイルス中の対応位置
におけるヌクレオチドとは異なっているヌクレオチドをいう。多型性ヌクレオチ
ドは薬剤耐性を生じさせるものであってもよく、そうでなくてもよい。いくつか
の場合には上記標的配列の相補物も適当な標的配列であることが理解されよう。
本発明で定義する標的配列は、標的領域に特異的にハイブリダイゼーションする
ように設計されたプローブの中央部分に相補的であるべき配列を提供する。 用語「相補的」は、１本鎖プローブの配列が１本鎖標的の配列に対して正確に
（逆）相補物であることを意味し、該標的は、検出されるべき変異が存在する配
列であると定義される。 ＨＩＶポリ核酸の標的配列に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーショ
ン」は、使用する実験条件下において該プローブがこの領域の部分または全領域
と２本鎖を形成し、それらの条件下において該プローブが、分析されるべき試料
中に存在するポリ核酸の他の領域とは２本鎖を形成しないことを意味する。
用できる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd E
dition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。 用語「プローブ」は、検出されるべき標的配列に対して相補的な配列を有する
、１本鎖配列に特異的なオリゴヌクレオチドをいう。 本発明の用語「標的配列」は、本発明のプローブにより特異的に検出されるべ
きプロテアーゼ遺伝子の野生型配列、または１またはそれ以上の多型性ヌクレオ
チドを含む配列をいう。このヌクレオチド配列は１個または数個のヌクレオチド
変化を含んでいてもよい。標的配列は、単一のヌクレオチド位置、コドン位置、
アミノ酸をコードするヌクレオチド、または上記ヌクレオチド位置をまたぐ配列
をいうこともある。本発明において、該標的配列は、しばしば、１カ所またはそ
れ以上の可変ヌクレオチド位置を含む。 用語「多型性ヌクレオチド」は、特定のＨＩＶウイルスのプロテアーゼ遺伝子
中のヌクレオチドであって、少なくとも１種の他のＨＩＶウイルス中の対応位置
におけるヌクレオチドとは異なっているヌクレオチドをいう。多型性ヌクレオチ
ドは薬剤耐性を生じさせるものであってもよく、そうでなくてもよい。いくつか
の場合には上記標的配列の相補物も適当な標的配列であることが理解されよう。
本発明で定義する標的配列は、標的領域に特異的にハイブリダイゼーションする
ように設計されたプローブの中央部分に相補的であるべき配列を提供する。 用語「相補的」は、１本鎖プローブの配列が１本鎖標的の配列に対して正確に
（逆）相補物であることを意味し、該標的は、検出されるべき変異が存在する配
列であると定義される。 ＨＩＶポリ核酸の標的配列に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーショ
ン」は、使用する実験条件下において該プローブがこの領域の部分または全領域
と２本鎖を形成し、それらの条件下において該プローブが、分析されるべき試料
中に存在するポリ核酸の他の領域とは２本鎖を形成しないことを意味する。
【００２５】 本願発明は、単一の塩基対ミスマッチを検出する必要があるので、理論的には
正確に相補的な配列のハイブリダイゼーションのみが可能な非常にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件が必要となる。しかしながら、プローブの長
さにおけるバリエーションが可能であり（下記参照）、プローブの中央部分がそ
のハイブリダイゼーション特性に必須なので、長いプローブ配列を用いる場合に
は、標的配列からのプローブ配列の逸脱がプローブの頭部および尾部にあっても
よい。これらの変種は当該分野の通常の知識から考えつくことができるが、それ
らが正確に相補的なプローブと同等なハイブリダイゼーション特性を示すかどう
かをチェックするために、常に実験的に評価されるべきである。 好ましくは、本発明のプローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり、
より好ましくは約１０ないし２５ヌクレオチドの長さである。特に好ましいプロ
ーブの長さは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを包含する。本発明に使
用するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびイノ
シンのごとき修飾ヌクレオチド、あるいは本質的にハイブリダイゼーション特性
を変化させない修飾基を含むヌクレオチドであってもよい。
正確に相補的な配列のハイブリダイゼーションのみが可能な非常にストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件が必要となる。しかしながら、プローブの長
さにおけるバリエーションが可能であり（下記参照）、プローブの中央部分がそ
のハイブリダイゼーション特性に必須なので、長いプローブ配列を用いる場合に
は、標的配列からのプローブ配列の逸脱がプローブの頭部および尾部にあっても
よい。これらの変種は当該分野の通常の知識から考えつくことができるが、それ
らが正確に相補的なプローブと同等なハイブリダイゼーション特性を示すかどう
かをチェックするために、常に実験的に評価されるべきである。 好ましくは、本発明のプローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり、
より好ましくは約１０ないし２５ヌクレオチドの長さである。特に好ましいプロ
ーブの長さは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを包含する。本発明に使
用するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびイノ
シンのごとき修飾ヌクレオチド、あるいは本質的にハイブリダイゼーション特性
を変化させない修飾基を含むヌクレオチドであってもよい。
【００２６】 本明細書全体にわたってプローブ配列を１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとし
て、５’から３’末端へと示す。以下に示すプローブをそのまま、あるいはそれ
らの相補的形態で、あるいはそれらのＲＮＡの形態で（ＴのかわりにＵを用いる
）用いることができるということは当業者に明らかある。 対応ヌクレオチド配列を含有するインサートを含む組み換えプラスミドをクロ
ーニングし、必要ならば十分なヌクレアーゼを用いてクローン化プラスミドから
対応配列を開裂して取り、次いで、例えば分子量による分画によりそれらを回収
することにより、本発明のプローブを調製することができる。本発明のプローブ
を、例えば、慣用的なホスホ−トリエステル法により化学合成してもよい。
て、５’から３’末端へと示す。以下に示すプローブをそのまま、あるいはそれ
らの相補的形態で、あるいはそれらのＲＮＡの形態で（ＴのかわりにＵを用いる
）用いることができるということは当業者に明らかある。 対応ヌクレオチド配列を含有するインサートを含む組み換えプラスミドをクロ
ーニングし、必要ならば十分なヌクレアーゼを用いてクローン化プラスミドから
対応配列を開裂して取り、次いで、例えば分子量による分画によりそれらを回収
することにより、本発明のプローブを調製することができる。本発明のプローブ
を、例えば、慣用的なホスホ−トリエステル法により化学合成してもよい。
【００２７】 用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブをカップリングすること
のできる基材をいうが、オリゴヌクレオチドがそのハイブリダイゼーション特性
を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルは低いままである
ことが条件となる。通常には、固体基材はマイクロタイタープレート、膜（例え
ば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）またはチップで
あろう。膜への適用または固定化前に、固定化を容易にし、あるいはハイブリダ
イゼーション効率を改善するように核酸プローブを修飾することが都合良いかも
しれない。かかる修飾は、ホモポリマーテイリング（homopolymer tailing）、
脂肪族基、ＮＨ2基、ＳＨ基、カルボキシル基のごとき異なる反応性基とのカッ
プリング、あるいはビオチン、ハプテンまたは蛋白とのカップリングを包含しう
る。 用語「標識」は、標識された核酸の使用をいう。Saikiら（１９８８）またはB
ejら（１９９０）により説明されているように増幅のポリマー化工程の間に取り
込まれる標識ヌクレオチドを使用することにより、あるいは標識プライマーの使
用により、あるいは当業者に知られた他の方法により標識化を行うことができる
。標識の性質はアイソトープ的（32Ｓ、35Ｓ等）または非アイソトープ的（ビオ
チン、ジゴキシゲニン等）であってよい。
のできる基材をいうが、オリゴヌクレオチドがそのハイブリダイゼーション特性
を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルは低いままである
ことが条件となる。通常には、固体基材はマイクロタイタープレート、膜（例え
ば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）またはチップで
あろう。膜への適用または固定化前に、固定化を容易にし、あるいはハイブリダ
イゼーション効率を改善するように核酸プローブを修飾することが都合良いかも
しれない。かかる修飾は、ホモポリマーテイリング（homopolymer tailing）、
脂肪族基、ＮＨ2基、ＳＨ基、カルボキシル基のごとき異なる反応性基とのカッ
プリング、あるいはビオチン、ハプテンまたは蛋白とのカップリングを包含しう
る。 用語「標識」は、標識された核酸の使用をいう。Saikiら（１９８８）またはB
ejら（１９９０）により説明されているように増幅のポリマー化工程の間に取り
込まれる標識ヌクレオチドを使用することにより、あるいは標識プライマーの使
用により、あるいは当業者に知られた他の方法により標識化を行うことができる
。標識の性質はアイソトープ的（32Ｓ、35Ｓ等）または非アイソトープ的（ビオ
チン、ジゴキシゲニン等）であってよい。
【００２８】 用語「プライマー」は、プラーマー伸長生成物合成の開始点として作用しうる
１本鎖オリゴヌクレオチド配列であって、コピーされるべき核酸鎖に対して相補
的なものをいう。プライマーの長さおよび配列は、伸長生成物の合成を開始しう
るようなものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレ
オチドの長さである。個々の長さおよび配列は必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の
複雑性ならびに温度およびイオン強度のごときプライマー使用条件に依存するで
あろう。 用語「プライマーペアー」は、少なくとも１個の５’プライマーおよび１個の
３’プライマーを含むプライマーのセットをいう。プライマーペアーは２個より
も多いプライマーからなっていてもよく、プライマーの数の複雑性はハイブリダ
イゼーション条件、増幅されるべき領域中の配列の可変度および検出されるべき
標的配列に依存するであろう。
１本鎖オリゴヌクレオチド配列であって、コピーされるべき核酸鎖に対して相補
的なものをいう。プライマーの長さおよび配列は、伸長生成物の合成を開始しう
るようなものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレ
オチドの長さである。個々の長さおよび配列は必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の
複雑性ならびに温度およびイオン強度のごときプライマー使用条件に依存するで
あろう。 用語「プライマーペアー」は、少なくとも１個の５’プライマーおよび１個の
３’プライマーを含むプライマーのセットをいう。プライマーペアーは２個より
も多いプライマーからなっていてもよく、プライマーの数の複雑性はハイブリダ
イゼーション条件、増幅されるべき領域中の配列の可変度および検出されるべき
標的配列に依存するであろう。
【００２９】 正しい増幅を保証するために、増幅プライマーが対応鋳型配列と正確に合致す
る必要はないという事実は文献に十分に示されている（Kwok et al., 1990）。 使用する増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saikiら、１９８８年）
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Landgrenら、１９８８年；WuおよびWallace，１
９８９年；Barany，１９９１年）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；Guatel
liら、１９９０年；Compton，１９９１年）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；Kwo
hら、１９８９年）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Duck，１９９０年）またはＱβレプ
リカーゼによる増幅（Lomeliら、１９８９年）または当該分野で知られた他の適
応な核酸分子増幅法のいずれであってもよい。 プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはホスホロチ
エート（Matsukuraら、１９８７年）、アルキルホスホロチエート（Millerら、
１９７９年）またはペプチド核酸（Nielsenら、１９９１年；Nielsenら，１９９
３年）のごときヌクレオチドアナログを含んでいてもよく、あるいはインターカ
レーション剤（Asselineら、１９８４年）を含んでいてもよい。 本発明の元のＤＮＡ配列中に導入される他の大部分の変化または修飾に関して
は、オリゴヌクレオチドを用いて必要な特異性および感度を得るべき条件に関し
てこれらの変化を適合させる必要がある。しかしながら、ハイブリダイゼーショ
ンの最終結果は未修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と同じであるこ
とが必須である。 ハイブリダイゼーション反応速度、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレ
オチド分子の生物学的安定性等のごとき特性に積極的な影響を与えるためには、
これらの修飾の導入が有利でありうる。
る必要はないという事実は文献に十分に示されている（Kwok et al., 1990）。 使用する増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saikiら、１９８８年）
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Landgrenら、１９８８年；WuおよびWallace，１
９８９年；Barany，１９９１年）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；Guatel
liら、１９９０年；Compton，１９９１年）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；Kwo
hら、１９８９年）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Duck，１９９０年）またはＱβレプ
リカーゼによる増幅（Lomeliら、１９８９年）または当該分野で知られた他の適
応な核酸分子増幅法のいずれであってもよい。 プライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはホスホロチ
エート（Matsukuraら、１９８７年）、アルキルホスホロチエート（Millerら、
１９７９年）またはペプチド核酸（Nielsenら、１９９１年；Nielsenら，１９９
３年）のごときヌクレオチドアナログを含んでいてもよく、あるいはインターカ
レーション剤（Asselineら、１９８４年）を含んでいてもよい。 本発明の元のＤＮＡ配列中に導入される他の大部分の変化または修飾に関して
は、オリゴヌクレオチドを用いて必要な特異性および感度を得るべき条件に関し
てこれらの変化を適合させる必要がある。しかしながら、ハイブリダイゼーショ
ンの最終結果は未修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と同じであるこ
とが必須である。 ハイブリダイゼーション反応速度、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレ
オチド分子の生物学的安定性等のごとき特性に積極的な影響を与えるためには、
これらの修飾の導入が有利でありうる。
【００３０】 「試料」は、感染したヒト（または動物）から直接的に、あるいは培養（豊富
化）後に得られる生物学的材料をいう。生物学的材料は、例えば、あらゆる種類
の痰、気管支洗浄物、血液、皮膚組織、生検物、精子、リンパ球血液培養物、コ
ロニー、液体培養物、糞試料、尿等であってもよい。 本発明のプローブのセットは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上のプ
ローブを含むであろう。該プローブを、固体基材上の２またはそれ以上の既知の
異なった位置に適用してもよい。２個またはそれ以上のプローブを該固体支持体
上の１の同じ位置に適用することが好ましいことがよくある。 所望特性を有するプローブの設計のためには、以下の当業者に知られた有用な
指針を適用することができる。 本明細書に記載されたようなハイブリダイゼーション反応の程度および特異性
は多くの要因により影響を受けるので、標的に対する完全な相補性があろうとな
かろうと、これらの要因の１つまたはそれ以上の取り扱いは、個々のプローブの
正確な感度および特異性を決定するであろう。本明細書に記載された種々のアッ
セイ条件の重要性および影響は当業者に知られている。 ［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性を選択して、アッセイ条件に適
合させるべきである。このことは、長いＡＴ豊富配列を避けることにより、ハイ
ブリッドをＧＣ塩基対で終わらせることにより、そして適切なＴｍを有するプロ
ーブを設計することにより行うことができる。長さおよびＧＣ含量％がＴｍを最
終的なアッセイを行う温度よりも約２〜１０℃高めるようにプローブの開始点お
よび終点を選択すべきである。プローブの塩基組成は重要である。なぜなら、さ
らなる水素結合のためにＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対と比べて非常に高い熱安定
性を示すからである。よって、高いＧ−Ｃ含量の相補的核酸を用いるハイブリダ
イゼーションは高温でも安定であろう。 プローブを使用するイオン強度およびインキュベーション温度もまた、プロー
ブ設計の際に考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増大するにつれハイ
ブリダイゼーションが増加し、イオン強度が増大するにつれハイブリッドの熱安
定性が大きくなることが知られている。一方、水素結合を破壊するホルムアミド
、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールのごとき化学試薬はハイブリダイゼーション
のストリンジェンシーを増大させるであろう。かかる試薬による水素結合の脱安
定化はＴｍを大幅に低下させる可能性がある。一般的に、約１０〜５０塩基の長
さの合成オリゴヌクレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは、２本鎖
の融解温度よりも約５℃低い温度で起こる。最適温度以下でのインキュベーショ
ンはミズマッチ塩基配列をハイブリダイゼーションさせ、それゆえ、特異性を低
下させる可能性がある。 高ストリンジェンシー条件下でのみハイブリダイゼーションするプローブを得
ることが望ましい。高ストリンジェンシー条件下においては、高い相補性の核酸
ハイブリッドのみが形成され；十分な程度の相補性を有しないハイブリッドは形
成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイ
ブリッドを形成する２つの核酸鎖の間の相補性を決定する。標的核酸と形成され
たハイブリッドと、非標的核酸と形成されたハイブリッドとの間の安定性の相違
が最大となるようにストリンジェンシーの程度が選択される。本発明の場合、１
個の塩基対の変化が検出される必要があり、非常に高いストリンジェンシーの条
件が必要となる。 標的核酸配列の長さ、プローブ配列の長さも重要である。いくつかの場合、所
望ハイブリダイゼーション特性を有するプローブが得られる、位置および長さが
異なる特定領域由来の数個の配列が存在するかもしれない。他の場合、１の配列
が、１個の塩基のみ異なる別の配列よりも有意に良好であるかもしれない。完全
には相補的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、通常
には、完全に相補的な塩基配列の最長の鎖が主にハイブリッドの安定性を決定す
るであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いて
もよく、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブは約５ないし５０（より
詳細には１０〜２５）塩基の長さであり、標的核酸配列に対して完全に相補的な
配列の十分な長さの鎖を有している。 ハイブリダイゼーションを妨げる強力な内部構造を形成することが知られてい
る標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、過度の自己
相補性を有するプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダ
イゼーションは、相補的核酸を有する２つの１本鎖の会合であって、水素結合し
た２本鎖を形成するものである。２つの鎖のうち１つが全体的または部分的にハ
イブリッド中に含まれている場合、それは新たなハイブリッドの形成にあまり関
与することができないということが示されている。十分な自己相補性がある場合
には、あるタイプのプローブ分子において分子内および分子間ハイブリッドが形
成される可能性がある。注意深いプローブ設計によってかかる構造を避けること
ができる。目的配列の大部分が１本鎖となるようにプローブを設計することによ
って、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大幅に増大させてもよい。こ
のタイプの相互作用を検索するためのコンピュータープログラムが利用可能であ
る。しかしながら、ある場合には、このタイプの相互作用を回避することが可能
でないかもしれない。
化）後に得られる生物学的材料をいう。生物学的材料は、例えば、あらゆる種類
の痰、気管支洗浄物、血液、皮膚組織、生検物、精子、リンパ球血液培養物、コ
ロニー、液体培養物、糞試料、尿等であってもよい。 本発明のプローブのセットは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、
２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上のプ
ローブを含むであろう。該プローブを、固体基材上の２またはそれ以上の既知の
異なった位置に適用してもよい。２個またはそれ以上のプローブを該固体支持体
上の１の同じ位置に適用することが好ましいことがよくある。 所望特性を有するプローブの設計のためには、以下の当業者に知られた有用な
指針を適用することができる。 本明細書に記載されたようなハイブリダイゼーション反応の程度および特異性
は多くの要因により影響を受けるので、標的に対する完全な相補性があろうとな
かろうと、これらの要因の１つまたはそれ以上の取り扱いは、個々のプローブの
正確な感度および特異性を決定するであろう。本明細書に記載された種々のアッ
セイ条件の重要性および影響は当業者に知られている。 ［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性を選択して、アッセイ条件に適
合させるべきである。このことは、長いＡＴ豊富配列を避けることにより、ハイ
ブリッドをＧＣ塩基対で終わらせることにより、そして適切なＴｍを有するプロ
ーブを設計することにより行うことができる。長さおよびＧＣ含量％がＴｍを最
終的なアッセイを行う温度よりも約２〜１０℃高めるようにプローブの開始点お
よび終点を選択すべきである。プローブの塩基組成は重要である。なぜなら、さ
らなる水素結合のためにＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対と比べて非常に高い熱安定
性を示すからである。よって、高いＧ−Ｃ含量の相補的核酸を用いるハイブリダ
イゼーションは高温でも安定であろう。 プローブを使用するイオン強度およびインキュベーション温度もまた、プロー
ブ設計の際に考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増大するにつれハイ
ブリダイゼーションが増加し、イオン強度が増大するにつれハイブリッドの熱安
定性が大きくなることが知られている。一方、水素結合を破壊するホルムアミド
、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールのごとき化学試薬はハイブリダイゼーション
のストリンジェンシーを増大させるであろう。かかる試薬による水素結合の脱安
定化はＴｍを大幅に低下させる可能性がある。一般的に、約１０〜５０塩基の長
さの合成オリゴヌクレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは、２本鎖
の融解温度よりも約５℃低い温度で起こる。最適温度以下でのインキュベーショ
ンはミズマッチ塩基配列をハイブリダイゼーションさせ、それゆえ、特異性を低
下させる可能性がある。 高ストリンジェンシー条件下でのみハイブリダイゼーションするプローブを得
ることが望ましい。高ストリンジェンシー条件下においては、高い相補性の核酸
ハイブリッドのみが形成され；十分な程度の相補性を有しないハイブリッドは形
成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイ
ブリッドを形成する２つの核酸鎖の間の相補性を決定する。標的核酸と形成され
たハイブリッドと、非標的核酸と形成されたハイブリッドとの間の安定性の相違
が最大となるようにストリンジェンシーの程度が選択される。本発明の場合、１
個の塩基対の変化が検出される必要があり、非常に高いストリンジェンシーの条
件が必要となる。 標的核酸配列の長さ、プローブ配列の長さも重要である。いくつかの場合、所
望ハイブリダイゼーション特性を有するプローブが得られる、位置および長さが
異なる特定領域由来の数個の配列が存在するかもしれない。他の場合、１の配列
が、１個の塩基のみ異なる別の配列よりも有意に良好であるかもしれない。完全
には相補的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、通常
には、完全に相補的な塩基配列の最長の鎖が主にハイブリッドの安定性を決定す
るであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いて
もよく、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブは約５ないし５０（より
詳細には１０〜２５）塩基の長さであり、標的核酸配列に対して完全に相補的な
配列の十分な長さの鎖を有している。 ハイブリダイゼーションを妨げる強力な内部構造を形成することが知られてい
る標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、過度の自己
相補性を有するプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダ
イゼーションは、相補的核酸を有する２つの１本鎖の会合であって、水素結合し
た２本鎖を形成するものである。２つの鎖のうち１つが全体的または部分的にハ
イブリッド中に含まれている場合、それは新たなハイブリッドの形成にあまり関
与することができないということが示されている。十分な自己相補性がある場合
には、あるタイプのプローブ分子において分子内および分子間ハイブリッドが形
成される可能性がある。注意深いプローブ設計によってかかる構造を避けること
ができる。目的配列の大部分が１本鎖となるようにプローブを設計することによ
って、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大幅に増大させてもよい。こ
のタイプの相互作用を検索するためのコンピュータープログラムが利用可能であ
る。しかしながら、ある場合には、このタイプの相互作用を回避することが可能
でないかもしれない。
【００３１】 標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は実施例の材料および方法の
セクションに開示されている。他の条件は、例えば、５０℃における３Ｘ ＳＳ
Ｃ（ナトリウムセイラインシトレート）、２０％脱イオンＦＡ（ホルムアミド）
である。 他の溶液（ＳＳＰＥ（ナトリウムセイラインホスフェートＥＤＴＡ）、ＴＭＡ
Ｃｌ（テトラメチルアンモニウムクロリド）等）および温度を用いることもでき
るが、プローブの特異性および感度が維持されることが条件となる。必要ならば
、プローブの長さまたは配列のわずかな修飾を行って、一定環境において必要な
特異性および感度を維持しなければならない。 選択した標識（例えば、ビオチン）でプライマーを標識してもよい。異なるプ
ライマーによる標的増幅系を用いてもよく、好ましくは実施例に示すようなＰＣ
Ｒ増幅を用いてもよい。単一ラウンドまたはネステッドＰＣＲを用いてもよい。 用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、適当なストリンジェンシーの
条件下において、プローブと、試料中に存在するポリ核酸、または増幅生成物と
の間にハイブリダイゼーションを生じさせることのできるバッファーを意味する
。 用語「洗浄溶液」は、適当なストリンジェンシーの条件下で形成されたハイブ
リッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。 下記実施例は本発明の例示説明にのみ役立つ。これらの実施例は本発明の範囲
を何ら限定するもではない。
セクションに開示されている。他の条件は、例えば、５０℃における３Ｘ ＳＳ
Ｃ（ナトリウムセイラインシトレート）、２０％脱イオンＦＡ（ホルムアミド）
である。 他の溶液（ＳＳＰＥ（ナトリウムセイラインホスフェートＥＤＴＡ）、ＴＭＡ
Ｃｌ（テトラメチルアンモニウムクロリド）等）および温度を用いることもでき
るが、プローブの特異性および感度が維持されることが条件となる。必要ならば
、プローブの長さまたは配列のわずかな修飾を行って、一定環境において必要な
特異性および感度を維持しなければならない。 選択した標識（例えば、ビオチン）でプライマーを標識してもよい。異なるプ
ライマーによる標的増幅系を用いてもよく、好ましくは実施例に示すようなＰＣ
Ｒ増幅を用いてもよい。単一ラウンドまたはネステッドＰＣＲを用いてもよい。 用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、適当なストリンジェンシーの
条件下において、プローブと、試料中に存在するポリ核酸、または増幅生成物と
の間にハイブリダイゼーションを生じさせることのできるバッファーを意味する
。 用語「洗浄溶液」は、適当なストリンジェンシーの条件下で形成されたハイブ
リッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。 下記実施例は本発明の例示説明にのみ役立つ。これらの実施例は本発明の範囲
を何ら限定するもではない。
【００３２】 表の説明 表１：ＨＩＶプロテアーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブならびにＨＩ
Ｖ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁に観
察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を左欄
に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に示す
。 表２：プロテアーゼ阻害剤。 表３：ＨＩＶプロテアーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブならびにＨＩ
Ｖ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁に観
察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を左欄
に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に示す
。維持されたプローブを表１に示す。 表４：多型性ヌクレオチド配列。 表５：ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたＨＩＶ−１プロテー
アゼ野生型および薬剤選択変異体プローブの、遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株との反
応性％。 表６：ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたＨＩＶ−１プロテー
アーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブの、異なる地域からの試料との反応
性％。 表７：ＨＩＶ−１プロテアーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブならびに
ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁
に観察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を
左欄に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に
示す。
Ｖ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁に観
察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を左欄
に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に示す
。 表２：プロテアーゼ阻害剤。 表３：ＨＩＶプロテアーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブならびにＨＩ
Ｖ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁に観
察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を左欄
に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に示す
。維持されたプローブを表１に示す。 表４：多型性ヌクレオチド配列。 表５：ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたＨＩＶ−１プロテー
アゼ野生型および薬剤選択変異体プローブの、遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株との反
応性％。 表６：ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたＨＩＶ−１プロテー
アーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブの、異なる地域からの試料との反応
性％。 表７：ＨＩＶ−１プロテアーゼ野生型および薬剤選択変異体プローブならびに
ＨＩＶ−１プロテアーゼＬｉＰＡ片上に適用されたそれらの対応配列。最も頻繁
に観察された野生型配列を最上行に示す。選択モチーフに対応するプローブ名を
左欄に示し、片上に適用された各プローブの関連部分をコンセンサス配列の下に
示す。
【００３３】 実施例実施例１： 血漿試料の選択、ＰＣＲ増幅およびＰＣＲ生成物のクローニング 血漿試料（ｎ＝５５７）をＨＩＶ−１型感染患者から取り、使用するまで−２
０℃で保存した。無治療および薬剤治療患者から血漿試料を得た。薬剤はリトナ
ビル、インジナビルおよびサキナビルを包含した。ヨーロッパ（ベルギー、ルク
センブルグ、フランス、スペインおよび英国）、アメリカ合衆国およびブラジル
に在住している患者から血清試料を集めた。 グアニジニウム−フェノール法を用いてこれらの試料からＨＩＶ ＲＮＡを調
製した。室温において５０μｌの血漿を１５０μｌのTrizolRLS試薬（Life Tech
nologies, Gent, Belgium）と混合した（体積比：試料１単位／Trizol３単位）
。ピペットに数回出し入れすることにより注意深く融解および変性させ、次いで
、室温で少なくとも５分間のインキュベーション工程を行った。４０μｌのＣＨ
Ｃｌ3を添加し、混合物を少なくとも１５秒間手で激しく振盪し、室温で１５分
インキュベーションした。試料を４℃において最大１２０００ｇで１５分遠心分
離し、無色水相を集め、１００μｌのイソプロパノールと混合した。微量のウイ
ルスＲＮＡを可視化するために、１μｇ／μｌのデキストランＴ５００（Pharma
cia）を２０μｌ添加し、混合し、室温で１０分放置した。４℃似おいて「最大
１２０００ｇで１０分遠心分離して吸引した後、ＲＮＡペレットを２００μｌの
エタノールで洗浄し、ボルテックスで混合し、４℃において７５００ｇで５分間
遠心分離することにより集めた。最後に、ＲＮＡペレットを短時間風乾し、−２
０℃で保存した。別法として、High Pure Nucleic Acis Kit（Boehringer Mannh
eim）を用いて試料からＲＮＡを抽出した。 ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を行うために、ＤＰＥＣ処理水またはＨＰＬＣ
グレードの水中に調製した１５μｌのランダムプライマー（２０ｎｇ／μｌ，ｐ
ｄＮ6，Pharmacia）中にＲＮＡペレットを溶解した。７０℃で１０分間変性させ
た後、４μｌの５ｘＡＭＶ−ＲＴバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＤＴＴ）、０．
４μｌの２５ｍＭ ｄＸＴＰｓ、０．２μｌまたは２５ＵのRibonuclease Inhibi
tor（HPRI, Amersham）および０．３μｌまたは８ＵのＡＭＶ−ＲＴ（Stratagen
e）からなる５μｌのｃＤＮＡミックスを添加した。４２℃で９０分インキュベ
ーションしている間にｃＤＮＡ合成が起こった。次いで、下記反応混合物を用い
てＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子を増幅した：５μｌ ｃＤＮＡ、４．５μｌ １
０ｘＴａｑバッファー、０．３μｌ ２５ｍＭ ｄＸＴＰｓ、１μｌ（１０ｐｍｏ
ｌ）の各ＰＣＲプライマー、３８μｌ Ｈ2Ｏ、および０．２μｌ（１Ｕ）のＴａ
ｑ。別法としてTiton One Tube RT-PCRシステム（Boehringer Mannheim）を用い
てＲＴ−ＰＣＲを行った。 サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびＶＸ−４７８
に対する耐性に関与するコドン位置は記載されており（Shinaziら）、ＰＣＲ増
幅プライマーをこれらの領域の外側で選択した。プライマー設計はＨＩＶ−１の
公表配列（主に遺伝子型Ｂ）（Myersら）に基づいて行い、異なるＨＩＶ−１間
でヌクレオチド保存程度が高い領域に位置するものとした。最終的な増幅領域は
ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子のコドン９からコドン９９までをカバーしていた
。増幅用プライマーは下記配列を有していた：外側のセンスプライマーＰｒ１６
：5' bio-CAGAGCCAACAGCCCCACCAG3' (配列番号：１)；ネステッドセンスプライ
マーＰｒｏｔ２ｂｉｏ：5' CCT CAR ATC ACT CTT TGG CAA CG 3' (配列番号：３
)；ネステッドアンチセンスプライマーＰｒｏｔ６ｂｉｏ：3' TAA TCR GGA TAA
CTY TGA CAT GGT C 5' (配列番号：４)；および外側のアンチセンスプライマー
ＲＴ１２：5' bioATCAGGATGGAGTTCATAACCCATCCA3' (配列番号：２)。５７℃でア
ニーリングを行い、７２℃で伸長を行い、９４℃で変性を行った。サイクルの各
工程は１分間とし、外側のＰＣＲを４０サイクル、ネステッドラウンドを３５ラ
ウンド行った。ネステッドラウンドＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分析し、明
確に見える唯一の増幅生成物をＬｉＰＡ法に使用した。HIV MonitorTMテスト（R
oche, Brussels, Belgium）を用いてウイルスＲＮＡの定量を行った。その後、
増幅用の新たなプライマーセットを選択した。ＨＩＶプロテアーゼコドン３０〜
８４を増幅するために：外側のセンスプライマーｐｒｏｔ１６：5-CAGAGCCAACAG
CCCCACCAG-3' (配列番号：５０１)外側のアンチセンスプライマーｐｒｏｔ５：5
'-TTTTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTT-3' (配列番号：５０２)を用いた。外側のＰＣＲ
については５０℃でアニーリングを行い、６８℃で伸長を行い、９４℃で変性を
行うサイクルを３５回行った。ネステッドＰＣＲについては、下記プライマーを
用いて、４５℃でアニーリング、９４℃で変性、９２℃で伸長を行った：ネステ
ッドセンスプライマーｐｒｏｔ２ａ−ｂｉｏ：5'-bio-CCTCAAATCACTCTTTGGCAACG
-3' (配列番号：５０３)およびｐｒｏｔ２ｂ−ｂｉｏ：5'-bio-CCTCAGATCACTCTT
TGGCAACG-3' (配列番号：５０４)、ならびにネステッドアンチセンスプライマー
ｐｒｏｔ３１−ｂｉｏ：5'-bio-AGTCAACAGATTTCTTCCAAT-3' (配列番号：６)。Ｈ
ＩＶプロテアーゼコドン９０を増幅するために、外側のＰＣＲをＨＩＶプロテア
ーゼコドン３０〜８４に特化させた。ネステッドＰＣＲを行うために、ネステッ
ドセンスプライマーｐｒｏｔ４１−ｂｉｏ：5'-bio-CCTGTCAACATAATTGCAAG-3' (
配列番号：５０５)およびネステッドアンチセンスプライマーｐｒｏｔ６ａ：5'-
bio-CTGGTACAGTTTCAATAGGGCTAAT-3' (配列番号：５０６)、ｐｒｏｔ６ｂ：5'-bi
o-CTGGTACAGTTTCAATAGGACTAAT-3' (配列番号：５０７)、ｐｒｏｔ６ｃ：5'-bio-
CTGGTACAGTCTCAATAGGACTAAT-3' (配列番号：５０８)、ｐｒｏｔ６ｄ：5'-bio-CT
GGTACAGTCTCAATAGGGCTAAT-3' (配列番号：５０９)を用いた。ネステッドＰＣＲ
のためのアニーリング温度は４５℃であった。ｐＧＥＭ−Ｔベクター中に連結さ
れた１３０１ｂｐのＨＩＶフラグメントを含むプラスミド上でプライマーを調べ
た。該フラグメントはプロテアーゼ、逆転写酵素ならびに第１および第２ラウン
ドのＰＣＲのプライマー部位を含む。ＳａｃＩでの消化によりプラスミドを直鎖
状にした。 選択されたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭＴベクター（Promega）の前処理された
ＥｃｏＲＶ部位中に組み込んだ。α−コンプレメンテーションおよび制限フラグ
メント長さの分析を行った後、組み換えクローンを選択した。時々、増幅プライ
マーを用いて色素−ターミネーター法（Applied Biosystems）でビオチン化フラ
グメントを直接配列決定した。別法として、ビオチン基がそれぞれＴ７−および
ＳＰ６−プライマー配列に置き換えられているネステッドプライマーのアナログ
を用いてネステッドＰＣＲを行った。次いで、これらのアンプリコンをＳＰ６−
およびＴ７−色素−プライマー法で配列決定した。
０℃で保存した。無治療および薬剤治療患者から血漿試料を得た。薬剤はリトナ
ビル、インジナビルおよびサキナビルを包含した。ヨーロッパ（ベルギー、ルク
センブルグ、フランス、スペインおよび英国）、アメリカ合衆国およびブラジル
に在住している患者から血清試料を集めた。 グアニジニウム−フェノール法を用いてこれらの試料からＨＩＶ ＲＮＡを調
製した。室温において５０μｌの血漿を１５０μｌのTrizolRLS試薬（Life Tech
nologies, Gent, Belgium）と混合した（体積比：試料１単位／Trizol３単位）
。ピペットに数回出し入れすることにより注意深く融解および変性させ、次いで
、室温で少なくとも５分間のインキュベーション工程を行った。４０μｌのＣＨ
Ｃｌ3を添加し、混合物を少なくとも１５秒間手で激しく振盪し、室温で１５分
インキュベーションした。試料を４℃において最大１２０００ｇで１５分遠心分
離し、無色水相を集め、１００μｌのイソプロパノールと混合した。微量のウイ
ルスＲＮＡを可視化するために、１μｇ／μｌのデキストランＴ５００（Pharma
cia）を２０μｌ添加し、混合し、室温で１０分放置した。４℃似おいて「最大
１２０００ｇで１０分遠心分離して吸引した後、ＲＮＡペレットを２００μｌの
エタノールで洗浄し、ボルテックスで混合し、４℃において７５００ｇで５分間
遠心分離することにより集めた。最後に、ＲＮＡペレットを短時間風乾し、−２
０℃で保存した。別法として、High Pure Nucleic Acis Kit（Boehringer Mannh
eim）を用いて試料からＲＮＡを抽出した。 ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を行うために、ＤＰＥＣ処理水またはＨＰＬＣ
グレードの水中に調製した１５μｌのランダムプライマー（２０ｎｇ／μｌ，ｐ
ｄＮ6，Pharmacia）中にＲＮＡペレットを溶解した。７０℃で１０分間変性させ
た後、４μｌの５ｘＡＭＶ−ＲＴバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＤＴＴ）、０．
４μｌの２５ｍＭ ｄＸＴＰｓ、０．２μｌまたは２５ＵのRibonuclease Inhibi
tor（HPRI, Amersham）および０．３μｌまたは８ＵのＡＭＶ−ＲＴ（Stratagen
e）からなる５μｌのｃＤＮＡミックスを添加した。４２℃で９０分インキュベ
ーションしている間にｃＤＮＡ合成が起こった。次いで、下記反応混合物を用い
てＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子を増幅した：５μｌ ｃＤＮＡ、４．５μｌ １
０ｘＴａｑバッファー、０．３μｌ ２５ｍＭ ｄＸＴＰｓ、１μｌ（１０ｐｍｏ
ｌ）の各ＰＣＲプライマー、３８μｌ Ｈ2Ｏ、および０．２μｌ（１Ｕ）のＴａ
ｑ。別法としてTiton One Tube RT-PCRシステム（Boehringer Mannheim）を用い
てＲＴ−ＰＣＲを行った。 サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびＶＸ−４７８
に対する耐性に関与するコドン位置は記載されており（Shinaziら）、ＰＣＲ増
幅プライマーをこれらの領域の外側で選択した。プライマー設計はＨＩＶ−１の
公表配列（主に遺伝子型Ｂ）（Myersら）に基づいて行い、異なるＨＩＶ−１間
でヌクレオチド保存程度が高い領域に位置するものとした。最終的な増幅領域は
ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子のコドン９からコドン９９までをカバーしていた
。増幅用プライマーは下記配列を有していた：外側のセンスプライマーＰｒ１６
：5' bio-CAGAGCCAACAGCCCCACCAG3' (配列番号：１)；ネステッドセンスプライ
マーＰｒｏｔ２ｂｉｏ：5' CCT CAR ATC ACT CTT TGG CAA CG 3' (配列番号：３
)；ネステッドアンチセンスプライマーＰｒｏｔ６ｂｉｏ：3' TAA TCR GGA TAA
CTY TGA CAT GGT C 5' (配列番号：４)；および外側のアンチセンスプライマー
ＲＴ１２：5' bioATCAGGATGGAGTTCATAACCCATCCA3' (配列番号：２)。５７℃でア
ニーリングを行い、７２℃で伸長を行い、９４℃で変性を行った。サイクルの各
工程は１分間とし、外側のＰＣＲを４０サイクル、ネステッドラウンドを３５ラ
ウンド行った。ネステッドラウンドＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分析し、明
確に見える唯一の増幅生成物をＬｉＰＡ法に使用した。HIV MonitorTMテスト（R
oche, Brussels, Belgium）を用いてウイルスＲＮＡの定量を行った。その後、
増幅用の新たなプライマーセットを選択した。ＨＩＶプロテアーゼコドン３０〜
８４を増幅するために：外側のセンスプライマーｐｒｏｔ１６：5-CAGAGCCAACAG
CCCCACCAG-3' (配列番号：５０１)外側のアンチセンスプライマーｐｒｏｔ５：5
'-TTTTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTT-3' (配列番号：５０２)を用いた。外側のＰＣＲ
については５０℃でアニーリングを行い、６８℃で伸長を行い、９４℃で変性を
行うサイクルを３５回行った。ネステッドＰＣＲについては、下記プライマーを
用いて、４５℃でアニーリング、９４℃で変性、９２℃で伸長を行った：ネステ
ッドセンスプライマーｐｒｏｔ２ａ−ｂｉｏ：5'-bio-CCTCAAATCACTCTTTGGCAACG
-3' (配列番号：５０３)およびｐｒｏｔ２ｂ−ｂｉｏ：5'-bio-CCTCAGATCACTCTT
TGGCAACG-3' (配列番号：５０４)、ならびにネステッドアンチセンスプライマー
ｐｒｏｔ３１−ｂｉｏ：5'-bio-AGTCAACAGATTTCTTCCAAT-3' (配列番号：６)。Ｈ
ＩＶプロテアーゼコドン９０を増幅するために、外側のＰＣＲをＨＩＶプロテア
ーゼコドン３０〜８４に特化させた。ネステッドＰＣＲを行うために、ネステッ
ドセンスプライマーｐｒｏｔ４１−ｂｉｏ：5'-bio-CCTGTCAACATAATTGCAAG-3' (
配列番号：５０５)およびネステッドアンチセンスプライマーｐｒｏｔ６ａ：5'-
bio-CTGGTACAGTTTCAATAGGGCTAAT-3' (配列番号：５０６)、ｐｒｏｔ６ｂ：5'-bi
o-CTGGTACAGTTTCAATAGGACTAAT-3' (配列番号：５０７)、ｐｒｏｔ６ｃ：5'-bio-
CTGGTACAGTCTCAATAGGACTAAT-3' (配列番号：５０８)、ｐｒｏｔ６ｄ：5'-bio-CT
GGTACAGTCTCAATAGGGCTAAT-3' (配列番号：５０９)を用いた。ネステッドＰＣＲ
のためのアニーリング温度は４５℃であった。ｐＧＥＭ−Ｔベクター中に連結さ
れた１３０１ｂｐのＨＩＶフラグメントを含むプラスミド上でプライマーを調べ
た。該フラグメントはプロテアーゼ、逆転写酵素ならびに第１および第２ラウン
ドのＰＣＲのプライマー部位を含む。ＳａｃＩでの消化によりプラスミドを直鎖
状にした。 選択されたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭＴベクター（Promega）の前処理された
ＥｃｏＲＶ部位中に組み込んだ。α−コンプレメンテーションおよび制限フラグ
メント長さの分析を行った後、組み換えクローンを選択した。時々、増幅プライ
マーを用いて色素−ターミネーター法（Applied Biosystems）でビオチン化フラ
グメントを直接配列決定した。別法として、ビオチン基がそれぞれＴ７−および
ＳＰ６−プライマー配列に置き換えられているネステッドプライマーのアナログ
を用いてネステッドＰＣＲを行った。次いで、これらのアンプリコンをＳＰ６−
およびＴ７−色素−プライマー法で配列決定した。
【００３４】実施例２： リファレンスパネルの選択 サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびＶＸ−４７８
に対する耐性に関与するコドン位置は記載されている（Shinaziら，１９９７年
）。記載されたプロテアーゼ阻害剤に対する耐性を付与する重要なコドン位置に
おける異なった遺伝学的モチーフを含んでいるウイルスプロテアーゼ遺伝子をプ
ラスミド中に組み込むことが目的であった。 ＰＣＲフラグメントの直接配列決定により得られた３１２個のプロテアーゼ遺
伝子配列を注意深く分析した後、異なった標的多型性を含み、変異を保持してい
る４７個のＰＣＲフラグメントを選択し、記載されたクローニング法を用いてプ
ラスミド中に組み込んだ。無治療または薬剤治療されたヨーロッパ、ブラジルま
たはアメリカ合衆国の患者から得た試料の選択を行った。これらの４７個の組み
換えプラスミドをリファレンスパネルとして用い、パネルの両方の鎖について配
列決定し、このパネルに由来するビオチン化ＰＣＲ生成物を用いて、特異性およ
び感度に関してプローブを最適化した。 ４７個の試料からなるこのパネルはこの時点における典型的なクローン選択物
であるが、この選択はウイルスの可変性についての一時的な特徴を示すものにす
ぎず、このパネルを更新していくことが必要であるということを述べておくこと
が重要である。このことは、ウイルスの新たな変種の進行中のスクリーニング、
およびこれらの新たなモチーフの組み換えクローニングを包含する。 プローブ選択およびＬｉＰＡ試験 リファレンスパネル中のすべての異なる遺伝学的モチーフをカバーするために
、全部で４７１このプローブを設計した（コドン３０：４０個のプローブ；コド
ン４６／４８：７２個のプローブ；コドン５０：５５個のプローブ；コドン５４
：５４個のプローブ；コドン８２／８４：１３０個のプローブ；コドン９０：１
２０個のプローブ）。表３は、異なるコドン位置に関して選択された異なるプロ
ーブを示す。 （Ｇ＋Ｃ）含量％、プローブ長さ、バッファー成分の最終濃度、およびハイブ
リダイゼーション温度（Stuyverら、１９９７年）を注意深く考慮した同じハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件下ですべてのプローブを特異的に反応させる
ことが目的であった。それゆえ、標準的反応条件においてＴｄＴ（Pharmacia）
を用いて酵素的にポリＴテイルを付してプローブを提供し、沈殿法により精製し
た。３’Ｔ−末端配列を付した限られた数のプローブに関しては、プローブ配列
とポリＴテイルとの間にさらにＧを付加して、ハイブリダイゼーション部分を特
定のプローブ配列に限定し、テイル配列とのハイブリダイゼーションを排除した
。プローブのペレットを標準的なセイラインシトレート（ＳＳＣ）バッファーに
溶解し、膜片上に横並びの平行線として適用した。増幅に関する対照線（プロー
ブ 5' TAGGGGGAATTGGAGGTTTTAG 3 '、ＨＩＶプロテアーゼａａ４７からａａ５４
まで）および抱合体インキュベーションに関する対照線（ビオチン化ＤＮＡ）を
並べて適用した。ベイキング（baking）によりプローブを膜上に固定化し、Ｌｉ
ＰＡ片とも呼ばれる４ｍｍの片に膜をスライスした。 増幅プライマーの選択およびＰＣＲ増幅は実施例１に記載したのと同じであっ
た。４７１個の候補プローブから特異的に反応するプローブを選択するために、
リファレンスパネル由来のビオチン化ＰＣＲフラグメントを用いてＬｉＰＡ試験
を行った。ＬｉＰＡ試験を行うために、同量（１０μｌ）のビオチン化増幅プロ
ーブおよび変性混合物（０．４Ｎ ＮａＯＨ／０．１％ ＳＤＳ）を混合し、次い
で、室温で５分間インキュベーションした。この変性工程後、２ｍｌのハイブリ
ダイゼーションバッファー（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５）を膜片とともに添加し、３９℃で３０分ハイブリダイゼーション
を行った。次いで、ハイブリダイゼーション混合物をストリンジェントな洗浄バ
ッファー（ハイブリダイゼーションバッファーと同じ組成）に置換し、最初は室
温で５分、次いで、３９℃でさらに２５分間ストリンジェントな洗浄を行った。
次いで、バッファーをストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ抱合体のイ
ンキュベーションに適したものに置き換えた。室温で３０分インキュベーション
後、抱合体をすすいで、アルカリ性ホスファターゼ用基質ニトロ−ブルー−テト
ラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートに置き
換えた。室温で３０分インキュベーション後、ハイブリダイゼーションしたプロ
ーブが所定位置にて茶紫色沈殿となって可視化された。 ４７１個のプローブを注意深く分析した後、ａａ．３０、４６、４８、５０、
５４、８２、８４、および９０付近の自然発生的および薬剤選択による変化をカ
バーする、最も特異的かつ高感度のプローブ（ｎ＝４６）を最終的に選択した。
図２は、最終的に選択されたプローブのリファレンスパネルとの反応性を示す。
に対する耐性に関与するコドン位置は記載されている（Shinaziら，１９９７年
）。記載されたプロテアーゼ阻害剤に対する耐性を付与する重要なコドン位置に
おける異なった遺伝学的モチーフを含んでいるウイルスプロテアーゼ遺伝子をプ
ラスミド中に組み込むことが目的であった。 ＰＣＲフラグメントの直接配列決定により得られた３１２個のプロテアーゼ遺
伝子配列を注意深く分析した後、異なった標的多型性を含み、変異を保持してい
る４７個のＰＣＲフラグメントを選択し、記載されたクローニング法を用いてプ
ラスミド中に組み込んだ。無治療または薬剤治療されたヨーロッパ、ブラジルま
たはアメリカ合衆国の患者から得た試料の選択を行った。これらの４７個の組み
換えプラスミドをリファレンスパネルとして用い、パネルの両方の鎖について配
列決定し、このパネルに由来するビオチン化ＰＣＲ生成物を用いて、特異性およ
び感度に関してプローブを最適化した。 ４７個の試料からなるこのパネルはこの時点における典型的なクローン選択物
であるが、この選択はウイルスの可変性についての一時的な特徴を示すものにす
ぎず、このパネルを更新していくことが必要であるということを述べておくこと
が重要である。このことは、ウイルスの新たな変種の進行中のスクリーニング、
およびこれらの新たなモチーフの組み換えクローニングを包含する。 プローブ選択およびＬｉＰＡ試験 リファレンスパネル中のすべての異なる遺伝学的モチーフをカバーするために
、全部で４７１このプローブを設計した（コドン３０：４０個のプローブ；コド
ン４６／４８：７２個のプローブ；コドン５０：５５個のプローブ；コドン５４
：５４個のプローブ；コドン８２／８４：１３０個のプローブ；コドン９０：１
２０個のプローブ）。表３は、異なるコドン位置に関して選択された異なるプロ
ーブを示す。 （Ｇ＋Ｃ）含量％、プローブ長さ、バッファー成分の最終濃度、およびハイブ
リダイゼーション温度（Stuyverら、１９９７年）を注意深く考慮した同じハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄条件下ですべてのプローブを特異的に反応させる
ことが目的であった。それゆえ、標準的反応条件においてＴｄＴ（Pharmacia）
を用いて酵素的にポリＴテイルを付してプローブを提供し、沈殿法により精製し
た。３’Ｔ−末端配列を付した限られた数のプローブに関しては、プローブ配列
とポリＴテイルとの間にさらにＧを付加して、ハイブリダイゼーション部分を特
定のプローブ配列に限定し、テイル配列とのハイブリダイゼーションを排除した
。プローブのペレットを標準的なセイラインシトレート（ＳＳＣ）バッファーに
溶解し、膜片上に横並びの平行線として適用した。増幅に関する対照線（プロー
ブ 5' TAGGGGGAATTGGAGGTTTTAG 3 '、ＨＩＶプロテアーゼａａ４７からａａ５４
まで）および抱合体インキュベーションに関する対照線（ビオチン化ＤＮＡ）を
並べて適用した。ベイキング（baking）によりプローブを膜上に固定化し、Ｌｉ
ＰＡ片とも呼ばれる４ｍｍの片に膜をスライスした。 増幅プライマーの選択およびＰＣＲ増幅は実施例１に記載したのと同じであっ
た。４７１個の候補プローブから特異的に反応するプローブを選択するために、
リファレンスパネル由来のビオチン化ＰＣＲフラグメントを用いてＬｉＰＡ試験
を行った。ＬｉＰＡ試験を行うために、同量（１０μｌ）のビオチン化増幅プロ
ーブおよび変性混合物（０．４Ｎ ＮａＯＨ／０．１％ ＳＤＳ）を混合し、次い
で、室温で５分間インキュベーションした。この変性工程後、２ｍｌのハイブリ
ダイゼーションバッファー（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５）を膜片とともに添加し、３９℃で３０分ハイブリダイゼーション
を行った。次いで、ハイブリダイゼーション混合物をストリンジェントな洗浄バ
ッファー（ハイブリダイゼーションバッファーと同じ組成）に置換し、最初は室
温で５分、次いで、３９℃でさらに２５分間ストリンジェントな洗浄を行った。
次いで、バッファーをストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ抱合体のイ
ンキュベーションに適したものに置き換えた。室温で３０分インキュベーション
後、抱合体をすすいで、アルカリ性ホスファターゼ用基質ニトロ−ブルー−テト
ラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートに置き
換えた。室温で３０分インキュベーション後、ハイブリダイゼーションしたプロ
ーブが所定位置にて茶紫色沈殿となって可視化された。 ４７１個のプローブを注意深く分析した後、ａａ．３０、４６、４８、５０、
５４、８２、８４、および９０付近の自然発生的および薬剤選択による変化をカ
バーする、最も特異的かつ高感度のプローブ（ｎ＝４６）を最終的に選択した。
図２は、最終的に選択されたプローブのリファレンスパネルとの反応性を示す。
【００３５】実施例３： 臨床試料に関するＬｉＰＡ試験 この４６個の特異的プローブ選択物に関して全部で８５６個の試料を試験した
。これらの地理的に異なる起源の試料は、アメリカ合衆国３５９個；フランス１
５４個；英国３６個；ブラジル５８個；スペイン３５個；ベルギー１９９個；ル
クセンブルグ１５個であった。 この集団から、全部で１４４個の試料を配列決定し、遺伝子型Ｂ試料（９４個
）を非Ｂ試料（５０個）から分けた。これらの遺伝子型を決定された試料をＬｉ
ＰＡで分析した後、選択プローブに対する遺伝子型の反応性を評価した。図４Ａ
から図４Ｆまでは、異なるコドン位置および遺伝子型Ｂ群対非Ｂ群に関する結果
を示す。これらの表から、異なるプローブにおける特異的反応性に関し、異なる
コドン位置に対する配列の使用においてほとんど差がないことが明らかである。 次いで、８５６個の試料全部のコレクションを、利用可能な４６個のプローブ
に関して試験した。異なるプローブに対するこれらの反応性および地域の相違に
つき吟味した後、図５Ａから５Ｆに示す特徴を得た。さらにここで、異なるコド
ン位置において使用される配列の大部分が、いくつかの非常に豊富な野生型モチ
ーフに限定されている。これらの試料の大部分はプロテアーゼ阻害剤での治療を
受けていなかった患者から得たものであり、それゆえ、反応物の大部分が野生型
モチーフ中に見られるものであることを述べておくことが重要である。それにも
かかわらず、変異体モチーフ中のいくつかのコドン位置における可変性が相当な
ものであり、さらに、激しい治療を受けた患者についての継続的な更新が必要で
あるということが、いくつかのコドン位置から明らかである。もう１つの問題は
二重ブランク反応物の量であり、このアプローチにおいて世界的に見て５％まで
である。いくつかのコドン位置についていくつかの国においていくつかのピーク
値があり、例えば、ブラジルにおいてコドン８２／８５について１３．８％であ
り、ベルギーにおいてコドン９０について１８．１％である。 継続的な更新はさらなるプローブの選択を可能にした。この新しい片の様子を
表７に示す。
。これらの地理的に異なる起源の試料は、アメリカ合衆国３５９個；フランス１
５４個；英国３６個；ブラジル５８個；スペイン３５個；ベルギー１９９個；ル
クセンブルグ１５個であった。 この集団から、全部で１４４個の試料を配列決定し、遺伝子型Ｂ試料（９４個
）を非Ｂ試料（５０個）から分けた。これらの遺伝子型を決定された試料をＬｉ
ＰＡで分析した後、選択プローブに対する遺伝子型の反応性を評価した。図４Ａ
から図４Ｆまでは、異なるコドン位置および遺伝子型Ｂ群対非Ｂ群に関する結果
を示す。これらの表から、異なるプローブにおける特異的反応性に関し、異なる
コドン位置に対する配列の使用においてほとんど差がないことが明らかである。 次いで、８５６個の試料全部のコレクションを、利用可能な４６個のプローブ
に関して試験した。異なるプローブに対するこれらの反応性および地域の相違に
つき吟味した後、図５Ａから５Ｆに示す特徴を得た。さらにここで、異なるコド
ン位置において使用される配列の大部分が、いくつかの非常に豊富な野生型モチ
ーフに限定されている。これらの試料の大部分はプロテアーゼ阻害剤での治療を
受けていなかった患者から得たものであり、それゆえ、反応物の大部分が野生型
モチーフ中に見られるものであることを述べておくことが重要である。それにも
かかわらず、変異体モチーフ中のいくつかのコドン位置における可変性が相当な
ものであり、さらに、激しい治療を受けた患者についての継続的な更新が必要で
あるということが、いくつかのコドン位置から明らかである。もう１つの問題は
二重ブランク反応物の量であり、このアプローチにおいて世界的に見て５％まで
である。いくつかのコドン位置についていくつかの国においていくつかのピーク
値があり、例えば、ブラジルにおいてコドン８２／８５について１３．８％であ
り、ベルギーにおいてコドン９０について１８．１％である。 継続的な更新はさらなるプローブの選択を可能にした。この新しい片の様子を
表７に示す。
【００３６】 文献 Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984) Nucleic aci
d-binding molecules with high affinity and base sequence specificity : i
ntercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81(11):3297-301. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned t
hermostable ligase. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 189-193. Bej A, Mahbubani M, Miller R, Di Cesare J, Haff L, Atlas R. Mutiplex PCR
amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial
pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 1990; 4:353-365. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 1991; 350:
91-92. Condra et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to m
ultiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. Condra et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to m
ultiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. Duck P. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotide
s. Biotechniques 1990; 9: 142-147. Eberle et al. 1995. Resistance of HIV type 1 to proteinase inhibitor R
o 31-8959. AIDS Research and Human Retroviruses 11: 671-676. Emini et al. 1994. Phenotypic and genotypic characterization of HIV-1
variants selected during treatment with the protease inhibitor L-735, L-
524. Third International Workshop on HIV Drug Resistance, Kauai, Hawaii
, USA. Guatelli J, Whitfield K, Kwoh D, Barringer K, Richman D, Gengeras T. Iso
thermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reacti
on modeled after retroviral replication. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87
: 1874-1878. Huff et al. 1991. HIV protease: a novel chemotherapeutic target for AI
DS. J. Med. Chem. 34: 2305-2314. Hunter et al. 1994. Macromolecular interactions in the assembly of HIV
and other retroviruses. Seminars in Virology 5: 71-83. Kempf et al. 1994. Pharmacokinetic and in vitro selection studies with
ABT-538, a potent inhibitor of HIV protease with high oral bioavailabil
ity. 34th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemother
apy, Orlando, Fl, USA. Kohl et al. 1988. Active human immunodeficiency virus protease is requ
ired for viral infectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 4686-4690. Kwok S, Kellogg D, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sinisky J.
Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction:
Human immunodeficiency views type 1 model studies. Nucl. Acids Res. 1990
; 18: 999. Landgren U, Kaiser R, Sanders J, Hood L. A ligase-mediated gene detectio
n technique. Science 1988; 241:1077-1080. Lomeli H, Tyagi S, Printchard C, Lisardi P, Kramer F. Quantitative assay
s based on the use of replicatable hybridization probes. Clin Chem 1989;
35: 1826-1831. Matsukura M, Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohen J, Broder S (
1987) Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : inhibitors of
replication and cytopathic effects of human immunodeficiency virus. Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 84(21):7706-10. Meek et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 1841-1845. Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Nonionic n
ucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucl
eoside methylphosphonates. Biochemistry 18(23):5134-43. Myers et al. 1996. Human retroviruses and AIDS 1996. Los Alamos Labora
tory, Los Alamos, N.M. Navia et al. 1989. Three-dimensional structure of aspartyl protease fr
om human immunodeficiency virus HIV-1. Nature 337: 615-620. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Sequence specific inhibit
ion of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. Nucleic-Acids-Res. 21(2):
197-200. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1991) Sequence-selective recogn
ition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide
. Science 254(5037):1497-500. Patick et al. 1996. Antiviral and resistance studies of AG1343, an ora
lly bioavailable inhibitor of human immunodeficiency virus protease. An
timicrobial Agents and Chemotherapy 40: 292-297; 40: 1575 (erratum). Peng et al. 1989. Role of human immunodeficiency virus type 1-specific
protease in core protein maturation and viral infectivity. J. Virol. 6
3: 2550-2556. Rao et al. 1996. Structural and modeling analysis of the basis of vira
l resistance to VX-478. Fifth International Workshop on HIV Drug Resist
ance, Whistler, Canada, abstract No: 22. Saiki R, Walsh P, Levenson C, Erlich H. Genetic analysis of amplified DN
A with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes Proc Natl A
cad Sci USA 1989; 86:6230-6234. Schmit et al. 1996. Resistance-related mutations in the HIV-1 protease
gene of patients treated for 1 year with the protease inhibitor ritonav
ir (ABT-538). AIDS 10: 995-999. Shinazi et al. 1997. Mutations in retroviral genes associated with dr
ug resistance. International Antiviral News 5: 129-142. Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al. Typing of hepatitis C virus isolat
es and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen
. Virol. 1993; 74: 1093-1102. Tisdale et al. 1994. Comprehensive analysis of HIV-1 variants individu
ally selected for resistance to six HIV protease inhibitors. Third Inter
national Workshop on HIV Drug Resistance, Kauai, Hawaii, USA. Wlodawer et al. 1993. Structure-based inhibitors of HIV-1 protease. A
nnu. Rev. Biochem. 62:543-585. Wlodawer et al. 1989. Science 245: 616-621. Wu D, Wallace B. The ligation amplification reaction (LAR) - amplificati
on of specific DNA sequences using sequential rounds of template-depende
nt ligation. Genomics 1989; 4:560-569.
d-binding molecules with high affinity and base sequence specificity : i
ntercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 81(11):3297-301. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned t
hermostable ligase. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 189-193. Bej A, Mahbubani M, Miller R, Di Cesare J, Haff L, Atlas R. Mutiplex PCR
amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial
pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 1990; 4:353-365. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 1991; 350:
91-92. Condra et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to m
ultiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. Condra et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to m
ultiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. Duck P. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotide
s. Biotechniques 1990; 9: 142-147. Eberle et al. 1995. Resistance of HIV type 1 to proteinase inhibitor R
o 31-8959. AIDS Research and Human Retroviruses 11: 671-676. Emini et al. 1994. Phenotypic and genotypic characterization of HIV-1
variants selected during treatment with the protease inhibitor L-735, L-
524. Third International Workshop on HIV Drug Resistance, Kauai, Hawaii
, USA. Guatelli J, Whitfield K, Kwoh D, Barringer K, Richman D, Gengeras T. Iso
thermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reacti
on modeled after retroviral replication. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87
: 1874-1878. Huff et al. 1991. HIV protease: a novel chemotherapeutic target for AI
DS. J. Med. Chem. 34: 2305-2314. Hunter et al. 1994. Macromolecular interactions in the assembly of HIV
and other retroviruses. Seminars in Virology 5: 71-83. Kempf et al. 1994. Pharmacokinetic and in vitro selection studies with
ABT-538, a potent inhibitor of HIV protease with high oral bioavailabil
ity. 34th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemother
apy, Orlando, Fl, USA. Kohl et al. 1988. Active human immunodeficiency virus protease is requ
ired for viral infectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 4686-4690. Kwok S, Kellogg D, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sinisky J.
Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction:
Human immunodeficiency views type 1 model studies. Nucl. Acids Res. 1990
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1987) Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : inhibitors of
replication and cytopathic effects of human immunodeficiency virus. Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 84(21):7706-10. Meek et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 1841-1845. Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Nonionic n
ucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucl
eoside methylphosphonates. Biochemistry 18(23):5134-43. Myers et al. 1996. Human retroviruses and AIDS 1996. Los Alamos Labora
tory, Los Alamos, N.M. Navia et al. 1989. Three-dimensional structure of aspartyl protease fr
om human immunodeficiency virus HIV-1. Nature 337: 615-620. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Sequence specific inhibit
ion of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. Nucleic-Acids-Res. 21(2):
197-200. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1991) Sequence-selective recogn
ition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide
. Science 254(5037):1497-500. Patick et al. 1996. Antiviral and resistance studies of AG1343, an ora
lly bioavailable inhibitor of human immunodeficiency virus protease. An
timicrobial Agents and Chemotherapy 40: 292-297; 40: 1575 (erratum). Peng et al. 1989. Role of human immunodeficiency virus type 1-specific
protease in core protein maturation and viral infectivity. J. Virol. 6
3: 2550-2556. Rao et al. 1996. Structural and modeling analysis of the basis of vira
l resistance to VX-478. Fifth International Workshop on HIV Drug Resist
ance, Whistler, Canada, abstract No: 22. Saiki R, Walsh P, Levenson C, Erlich H. Genetic analysis of amplified DN
A with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes Proc Natl A
cad Sci USA 1989; 86:6230-6234. Schmit et al. 1996. Resistance-related mutations in the HIV-1 protease
gene of patients treated for 1 year with the protease inhibitor ritonav
ir (ABT-538). AIDS 10: 995-999. Shinazi et al. 1997. Mutations in retroviral genes associated with dr
ug resistance. International Antiviral News 5: 129-142. Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al. Typing of hepatitis C virus isolat
es and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen
. Virol. 1993; 74: 1093-1102. Tisdale et al. 1994. Comprehensive analysis of HIV-1 variants individu
ally selected for resistance to six HIV protease inhibitors. Third Inter
national Workshop on HIV Drug Resistance, Kauai, Hawaii, USA. Wlodawer et al. 1993. Structure-based inhibitors of HIV-1 protease. A
nnu. Rev. Biochem. 62:543-585. Wlodawer et al. 1989. Science 245: 616-621. Wu D, Wallace B. The ligation amplification reaction (LAR) - amplificati
on of specific DNA sequences using sequential rounds of template-depende
nt ligation. Genomics 1989; 4:560-569.
【００３７】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【図１】 ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子のコドン３０、４６、４８、５０
、５４、８２、８４および９０付近の、天然および薬剤選択した変異。最も頻繁
に観察される野生型配列を一番上に示す。自然発生的変異を下に示し、それらは
互いに独立して生じる。薬剤選択による変異を太字で示す。
、５４、８２、８４および９０付近の、天然および薬剤選択した変異。最も頻繁
に観察される野生型配列を一番上に示す。自然発生的変異を下に示し、それらは
互いに独立して生じる。薬剤選択による変異を太字で示す。
【図２Ａ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン３
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン３０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン３０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図２Ｂ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン４
６および４８に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン
４６および４８に対するプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブ
の膜片上での位置を各パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に
示し、表１にも示す。リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメント
とともに各片をインキュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１
に示す。いくつかのプローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利
用可能であるが、それぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。
プローブ反応性から誘導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
６および４８に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン
４６および４８に対するプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブ
の膜片上での位置を各パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に
示し、表１にも示す。リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメント
とともに各片をインキュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１
に示す。いくつかのプローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利
用可能であるが、それぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。
プローブ反応性から誘導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図２Ｃ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン５
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン５０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン５０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図２Ｄ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン５
４に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン５４に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
４に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン５４に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図２Ｅ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン９
２および８４に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン
８２および８４に対するプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブ
の膜片上での位置を各パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に
示し、表１にも示す。リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメント
とともに各片をインキュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１
に示す。いくつかのプローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利
用可能であるが、それぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。
プローブ反応性から誘導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
２および８４に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン
８２および８４に対するプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブ
の膜片上での位置を各パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に
示し、表１にも示す。リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメント
とともに各片をインキュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１
に示す。いくつかのプローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利
用可能であるが、それぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。
プローブ反応性から誘導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図２Ｆ】 リファレンス材料とともにＬｉＰａ上に固定化されたコドン９
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン９０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
０に対する選択したプローブの反応性。ボックス表面の情報はコドン９０に対す
るプローブについての議論とは関係ない。各選択プローブの膜片上での位置を各
パネルの左に示す。選択プローブの関連部分の配列を左に示し、表１にも示す。
リファレンスパネルからのビオチン化ＰＣＲフラグメントとともに各片をインキ
ュベーションする。リファレンスパネルの受託番号を表１に示す。いくつかのプ
ローブについては、複数のリファレンスパネルの候補が利用可能であるが、それ
ぞれ関連受託番号を１つだけ用いる。＊：偽陽性反応物。プローブ反応性から誘
導された関連コドンのアミノ酸を片の下に示す。
【図３】 ＨＩＶ−１プロテアーゼ増幅プライマーの配列および位置。コド
ン３０、４６、４８、５０、５４、８２および８４に関連する抗ウイルス剤に対
する感受性を調べるために選択されたプローブとの反応性を得る目的で、ネステ
ッド増幅プライマーｐｒｏｔ２ｂｉｏ（５’プライマー）およびＰｒｏｔ３１ｂ
ｉｏ（３’プライマー）を設計した。コドン９０に関連する抗ウイルス剤に対す
る感受性を調べるために選択されたプローブとの反応性を得る目的で、ネステッ
ド増幅プライマーｐｒｏｔ４１ｂｉｏ（５’プライマー）およびＰｒｏｔ６ｂｉ
ｏ（３’プライマー）を設計した。
ン３０、４６、４８、５０、５４、８２および８４に関連する抗ウイルス剤に対
する感受性を調べるために選択されたプローブとの反応性を得る目的で、ネステ
ッド増幅プライマーｐｒｏｔ２ｂｉｏ（５’プライマー）およびＰｒｏｔ３１ｂ
ｉｏ（３’プライマー）を設計した。コドン９０に関連する抗ウイルス剤に対す
る感受性を調べるために選択されたプローブとの反応性を得る目的で、ネステッ
ド増幅プライマーｐｒｏｔ４１ｂｉｏ（５’プライマー）およびＰｒｏｔ６ｂｉ
ｏ（３’プライマー）を設計した。
【図４Ａ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン３
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン３
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
【図４Ｂ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン４
６／４８に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表
５に示されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示
す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン４
６／４８に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表
５に示されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示
す。
【図４Ｃ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン５
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン５
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
【図４Ｄ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン５
４に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン５
４に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
【図４Ｅ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン８
２／８４に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表
５に示されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示
す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン８
２／８４に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表
５に示されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示
す。
【図４Ｆ】 ３１２個のプロテアーゼ配列に関する系統分類分析により遺伝
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン９
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
子型Ｂ株を非Ｂ株から区別することが可能となった。遺伝子型Ｂ株および非Ｂ株
のビオチン化ＰＣＲフラグメントとともにＬｉＰａ片上に固定化されたコドン９
０に対する選択プローブの反応性を示し、その正確なパーセンテージは表５に示
されている。プローブを下に示す。プローブの関連部分の配列を表１に示す。
【図５Ａ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置３０におけ
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
【図５Ｂ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置４６／４８
における異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されてい
る。プローブを下に示す。
における異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されてい
る。プローブを下に示す。
【図５Ｃ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置５０におけ
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
【図５Ｄ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置５４におけ
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
【図５Ｅ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置８２／８４
における異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されてい
る。プローブを下に示す。
における異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されてい
る。プローブを下に示す。
【図５Ｆ】 地理的に異なる８５６個の試料ならびにコドン位置９０におけ
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
る異なるプローブとの反応性。正確なパーセンテージは表６に示されている。プ
ローブを下に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ
Claims (12)
- 【請求項１】 生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する感
受性を決定する方法であって、 ａ）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し、 ｂ）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーペアーを用いてＨＩＶの
プロテアーゼ遺伝子の関連部分を増幅し、 ｃ）工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を下記プローブの少なくとも１つ： コドン３０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン４６および／または４８を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン５０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン５４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 コドン８２および／または８４を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーシ
ョンするプローブ、 コドン９０を含む標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブ、 あるいは上記プローブの相補物 にハイブリダイゼーションさせ、 さらに上記プローブは図１に示す標的配列のいずれかに、または上記標的配列
の相補物に特異的にハイブリダイゼーションするという点でさらに特徴づけられ
るものであり、 ｄ）工程ｃ）で得た結果から、薬剤耐性を生じさせる変異が該標的配列のいず
れかに存在するか否かを推定する ことを含む方法。 - 【請求項２】 工程ａ）またはｂ）の該ポリ核酸が、少なくとも２つの該プ
ローブまたは該プローブの相補物とハイブリダイゼーションするという点でさら
に特徴づけられる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該プローブが下記リスト： 配列番号：７から配列番号：４７７まで、配列番号：５１０から配列番号：５１
９まで、あるいは上記プローブの相補物 から選択されるという点でさらに特徴づけられる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 該プライマーペアーが下記のプライマー： 配列番号：３、配列番号：５０３、配列番号：５０４、配列番号：４、配列番号
：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８および配列番号：５０９ から選択されるという点でさらに特徴づけられる請求項１ないし３のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項５】 工程ｂ）が、プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド位置２１０
から２６０までにおいて存在する標的配列に特異的にハイブリダイゼーションす
る少なくとも１個の５’プライマーを少なくとも１個の適当な３’プライマーと
組み合わせて用いてプロテアーゼ遺伝子のフラグメントを増幅することを含み、
工程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン９０を含む標的配列また
はその相補物に特異的にハイブリダイゼーションさせることを含むという点でさ
らに特徴づけられる請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 工程ｂ）が、ヌクレオチド位置２５３（コドン８５）から位
置３００までにおいて存在する標的配列に特異的にハイブリダイゼーションする
少なくとも１個の３’プライマーを少なくとも１個の適当な５’プライマーと組
み合わせて用いてプロテアーゼ遺伝子のフラグメントを増幅することを含み、工
程ｃ）が、工程ａ）またはｂ）のポリ核酸を、コドン３０、４６、４８、５０、
５２、５４、８２および８４のいずれかを含む標的配列またはその相補物に特異
的にハイブリダイゼーションさせることを含むという点でさらに特徴づけられる
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 ５’プライマーが配列番号：５であり、３’プライマーが下
記配列： 配列番号：４、配列番号：５０６、配列番号：５０７、配列番号：５０８および
配列番号：５０９ から選択される１個のプライマーまたはプライマーの組み合わせであるという点
でさらに特徴づけられる請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 ５’プライマーが下記配列： 配列番号：３、配列番号：５０３、配列番号：５０４ から選択される１個のプライマーまたはプライマーの組み合わせであり、３’プ
ライマーが配列番号：６であるという点でさらに特徴づけられる請求項６記載の
方法。 - 【請求項９】 生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する感
受性を決定する方法において使用される、請求項１ないし３のいずれかにおいて
定義されたプローブ。 - 【請求項１０】 下記配列番号： 配列番号：４７８、配列番号：４７９、配列番号：４８０、配列番号：４８１、
配列番号：４８２、配列番号：４８３、配列番号：４８４、配列番号：４８５、
配列番号：４８６、配列番号：４８７、配列番号：４８８、配列番号：４８９、
配列番号：４９０、配列番号：４９１、配列番号：４９２、配列番号：４９３、
配列番号：４９４、配列番号：４９５、配列番号：４９６、配列番号：４９７、
配列番号：４９８、配列番号：４９９および配列番号：５００ のいずれかにより表されるヌクレオチド配列を含む核酸；または少なくとも２個
の連続したヌクレオチドからなり、少なくとも１個の多型性ヌクレオチドを含む
そのフラグメント。 - 【請求項１１】 生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する
感受性を決定する方法において使用される、請求項４ないし８のいずれかにおい
て定義されたプライマー。 - 【請求項１２】 生物学的試料中のＨＩＶウイルスの抗ウイルス剤に対する
感受性を決定する方法を可能にする診断キットであって、 ａ）適当な場合には、該試料に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮する
ための手段； ｂ）適当な場合には、請求項４ないし６のいずれかに記載の少なくとも１個の
プライマー； ｃ）請求項１ないし３にいずれかに記載の少なくとも１個のプローブであって
、可能ならば固体支持体に固定化されたもの； ｄ）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを作成するに必
要な成分； ｅ）洗浄溶液、または該溶液を作成するに必要な成分； ｆ）適当な場合には、行ったハイブリダイゼーションにより得られたハイブリ
ッドを検出するための手段； ｈ）適当な場合には、該プローブを固体支持体に結合させるための手段 を含むキット。
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