JP2002514075A

JP2002514075A - 癌胎児性抗原を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用方法

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Publication number: JP2002514075A
Application number: JP53869798A
Authority: JP
Inventors: ジー．ランパルスキ，ヘンリー; アール．ヘンダーソン，ダニエル; アール．シュア，エリック
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレイティド
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2002-05-14
Also published as: WO1998039467A2; WO1998039467A3; US20030026792A1

Abstract

(57)【要約】癌胎児性抗原（CEA）を発現する細胞に特異的な複製-コンピテントアデノウイルスベクター、およびこのようなウイルスの使用方法が提供される。これらのウイルスは、CEA転写調節エレメント（CEA-TRE）の制御下のアデノウイルス遺伝子を含む。この遺伝子は、例えば、ウイルス複製またはアデノウイルス死タンパク質遺伝子（ADP）に必要な遺伝子であり得る。このウイルスはまた、CEA-TREが機能することを許容し得る細胞に特異的な別の転写調節エレメント（例えば、CEA-TREの改変体）の制御下の、少なくとも１つの他のアデノウイルス遺伝子を含む。CEA発現に依存する転写開始調節を提供することによって、ウイルス複製は、CEA-TREを機能させる標的細胞（例えば、CEA発現細胞、特にCEAを発現し得る癌細胞）に制限され得る。本発明のアデノウイルスは、CEA-TREの転写制御下のレポーター遺伝子のような異種遺伝子をさらに含み得る。アデノウイルスベクターは、CEA-TREを機能させる細胞の存在について、サンプルを検出およびモニターするため、ならびにCEA-TREを機能させる悪性細胞を選択的に殺傷するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】癌胎児性抗原を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用方法関連出願の相互参照本願は、米国分割特許出願番号第60/039,763号（1997年３月３日出願）の権利を請求する。連邦政府の助成による研究の下になされた発明に対する権利の声明（適用なし）技術分野本発明は、アデノウイルスベクター、特に複製コンピテントなアデノウイルスを用いる細胞トランスフェクション、およびそれらの使用方法に関する。より詳細には、本発明は、癌胎児性抗原転写調節エレメント（CEA-TRE）の使用を介する、癌胎児性抗原（CEA）を発現し得る細胞、特にCEA関連腫瘍細胞における、アデノウイルスベクターの細胞特異的複製に関する。発明の背景広範な医学的研究および多数の進歩にもかかわらず、癌は、米国において第２の死因を維持している。結腸直腸癌は、第３の最も一般的な癌であり、そして癌による死亡の第２の死因である。肺癌は、最も難治性の固形腫瘍の１つである。なぜなら、手術不可能な症例が60％まであり、そして５年の生存率が、わずか13 ％であるからである。特に、腺癌（全肺癌の症例の約1/2を含む）は、ほとんど化学-放射線耐性である。胃癌は、東アジア（日本および韓国を含む）において、癌の最も蔓延した形態の１つである。広範な外科手術が、化学療法および免疫療法と組み合わせられているが、胃癌の死亡率は依然として高く、これは、癌性腹膜炎および進行期の肝臓転移に起因する。膵臓癌は、実際、常に致死的である。従って、これらの癌を有する多くの患者の現在の処置の見込みは満足されるものではなく、そして予後は不良である。特に興味があるのは、特に、例えば肝臓癌のような首尾よく処置するのが困難な癌における癌治療のより特異的な標的化形態の開発である。従来の癌治療（これは、比較的非特異的およびしばしば深刻な毒性を生じる）と対照的に、より特異的な処置様式は、選択的に悪性細胞を阻害または殺傷するが、健常細胞にはインタンクトを維持することを試みる。これらの癌腫瘍のような癌のための１つの可能性のある処置アプローチは、遺伝子治療であり、それにより、目的の遺伝子が、悪性細胞に導入される。Boulik as（1997）Anticancer Res．17:1471-1505。目的の遺伝子は、別の化合物での処置に基づいて毒性物質に変換するタンパク質、またはプロドラッグを活性薬物に変換する酵素をコードし得る。例えば、チミジンキナーゼをコードする単純ヘルペス遺伝子（HSV-tk）の導入は、細胞にガンシクロビル（GCV）に対して条件つき感受性を付与する。Zjilstaら、（1989）Nature 342:435；Mansourら、（1988 ）Nature 336:348；Johnsonら、（1989）Science 245:1234；Adairら、（1989） Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4574；およびCapecchi（1989）Science 244:1288。あるいは、目的の遺伝子は、ジフテリア毒素(DT)のような直接毒性である化合物をコードし得る。癌細胞に特異性を付与するこれらの処置のために、目的の遺伝子は、癌細胞において作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を特異的に（すなわち、優先的に）増加する、転写調節エレメントの制御下に存在し得る。細胞特異的または組織特異的発現は、細胞特異的エンハンサーおよび／またはプロモーターを用いることによって達成され得る。一般的には、Huberら、（1995 ）Adv.Drug Delivery Rev．17:279-292を参照のこと。種々のウイルスおよび非ウイルス（例えば、リポソーム）ビヒクル、またはベクターが、これらの遺伝子を移入するために開発されている。ウイルスの中で、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、シンドビスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルスは、遺伝子移入において、多くの現在の研究の焦点であるレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターとともに使用することが提唱されている。VermaおよびSomila（1997）Nature 389: 239 -242。アデノウイルスは、最も容易に産生および精製され、一方、レトロウイルスは、産生および精製に対して不安定であり困難であり、そして宿主ゲノムに組込まれ得、危険な変異の可能性を惹起する。さらに、アデノウイルスは、形質導入の高効率に影響する利点を有し、そして効率的な細胞形質導入のための細胞増殖を必要としない。アデノウイルスおよびアデノウイルスベクター系の開発に関する一般的な参考文献については、Grahamら、（1973）Virology 52:456-467；T akiffら、（1981）Lancet 11:832-834；Berknerら、（1983）Nucleic Acid Rese arch 11:6003-6020；Graham（1984）EMBO J 3:2917-2922；Betteら、（1993）J. Virology 67:5911-5921；およびBettら、（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:8 802-8806を参照のこと。遺伝子移入ビヒクルとして使用される場合、アデノウイルスベクターは、しばしば、複製欠損であるように設計され、従って目的の標的細胞における複製を損なうように意識的に操作される。これらのビヒクルにおいて、初期アデノウイルス遺伝子産物E1Aおよび／またはE1Bは欠失され、そしてパッケージング細胞株29 3によってトランスで提供される。Grahamら、（1987）J.Gen.Virol 36:59-72；G raham（1977）J.Genetoc Virology 68:937-940。形質導入される遺伝子は、一般的に、ウイルスゲノムの欠失されたE1Aおよび／またはE1B領域において、アデノウイルスに挿入される。Bettら、（1994）。遺伝子の効率的な形質導入のためのビヒクルとしての複製欠損アデノウイルスベクターは、特に、以下に記載されている：Stratford-Perricaudet（1990）Human Gene Therapy 1:241-256；Rosenfe ld（1991）Science 252:431-434；Wangら、（1991）Adv.Exp.Med.Biol．309:61- 66；Jaffeら、（1992）Nat.Gent．1:372-378；Quantinら、（1992）Proc.Natl.A cad.Sci.USA 89:2581-2584；Rosenfeldら、（1992）Cell 68:143-155；Stratfor d-Perricaudetら、（1992）J.Clin.Invest．90:626-630；Le Gal Le Salleら、（1993）Science 259:988-990 Mastrangeliら、（1993）J.Clin.Invest．91:225 -234；Ragotら、（1993）Nature 361:647-650；Hayaskiら、（1994）J.Biol.Che m．269:23872-23875；およびBettら、（1994）。遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの開発において実際に考慮されない焦点は、単に目的の遺伝子を導入するためのビヒクルとしてであり、それ自身におけるエフェクターとしてではない、アデノウイルスの使用である。アデノウイルスの複製は、所望でない結果として観察されており、これは宿主免疫応答に大きく起因する。複製欠損アデノウイルスによる癌の処置において、宿主免疫応答は、２つのレベルで反復用量の持続期間を制限する。第１に、アデノウイルス送達ビヒクル自身のキャプシドタンパク質は、それ自体免疫原生である。第２に、ウイルス後期遺伝子は、形質導入された細胞において頻繁に発現されて、細胞性免疫を誘発する。従って、サイトカイン、腫瘍抑制遺伝子、リボザイム、自殺遺伝子、またはプロドラッグを活性な薬物に変換する遺伝子を反復投与する能力は、遺伝子移入ビヒクルおよび移入ビヒクルのウイルス遺伝子産物の両方の免疫原生、ならびに遺伝子発現の一過性の性質によって制限されている。ベクターに対する特定の免疫学的応答がさらなる処置を妨害する前に、最少数の投与において全ての癌細胞を本質的に誘発し得るベクター構築物が必要である。研究の完全に別なかつ関連しない領域は、組織特異的転写調節タンパク質の説明に関する。癌胎児性抗原（CEA）癌胎児性抗原（CEA）は、消化管の内皮由来新生物（例えば、結腸直腸、胃腸（胃）、および膵臓癌）ならびに乳癌および肺癌のような他の腺癌に存在する18 0キロダルトン（kDa）のグリコシル化腫瘍関連抗原である。CEAは、臨床目的である。なぜなら、循環するCEAは、CEAポジティブ腫瘍を有する大部分の患者において検出され得るからである。肺癌において、全症例の約50％は、腺癌においてしばしば検出される高濃度のCEA（20ng/mlを超える）を伴う循環するCEAを有する。胃癌の約50％の患者は、CEAに対して血清学的にポジティブである。ヒトCEA遺伝子の5'上流隣接配列が単離されており、そして特徴付けられている。Willcocksら、（1990）Genomics 8:492-500；Richardsら、（1993）DNA Seq ．4:185-196；Richardsら、（1995）Human Gene Ther．6:881-893；Hauckら、（ 1995）J.Biol.Chem．270:3602-3610；WO/95/14100。CEAプロモーターは、細胞特異的活性を付与することが示されている。Schreweら、（1990）Mol.Cell.Biol.1 0:2738-2748。さらに、細胞特異的エンハンサーが見出されている。WO/95/141 00。エンハンサーは、遺伝子発現の細胞特異性の決定に主要な役割を果たすことが公知である、シス活性転写調節エレメントである。このエンハンサーはまた、代表的には、そのそれぞれの遺伝子に関連する配向および位置の長い距離にわたっておよび比較的独立して、転写を増強する能力によって特徴付けられる。プロモーターは、転写開始部位のすぐ5'（上流）に位置し、そして一般的には、TATA ボックスと称されるATリッチ領域を含む。 CEA関連癌を処置するために細胞特異的CEAプロモーター／エンハンサーを用いる遺伝子治療のためのいくつかのアプローチが記載されている。Richardsら（19 95）は、安定な細胞株の産生を報告し、ここでCEA転写調節配列は、結腸直腸癌においてシトシンデアミナーゼ（CD）の発現を調節するのに使用された。CEA-CD 遺伝子を含むマウス異種移植片の5-FCでの処置は、インビボで有意な腫瘍効果を生じた。CEAポジティブ腫瘍の腫瘍特異的自殺遺伝子治療のためのCEA/CDキメラ遺伝子は、特許出願WO 95/14100に記載される。Osakoら（1994）は、アデノウイルス媒介性プロドラッグ遺伝子治療を記載し、ここでCAEプロモーターは、CEA産生ヒト肺癌細胞に対してHSV-tk発現を制限するために使用され、ヌクレオチドアナログGCVに対してそれらを感受性にした。Cancer Res．54:5258-5261。同様に、Tanakaら（1996）は、CEAプロモーターを用いて、HSV-tkの選択的発現を駆動することを記載し、これは胃癌細胞に対してGCV感受性を付与した。Cancer Res. 56：1341-1345。これらの刊行物の全てにおいて、アデノウイルス構築物は複製欠損であり、そして実験アプローチにおける全体の焦点は、CEA5'上流転写調節領域を用いて、非アデノウイルス遺伝子の発現を制御することである。複製欠損アデノウイルスは、選択的増殖阻害に影響する試薬自身としてではなく、治療用遺伝子送達ビヒクルとしてみなされる。消化管の癌は、しばしば、標準的な治療によっては治癒可能ではない。従って、これらの疾患のための新たな治療用アプローチを開発することが重要である。本発明は、CEA産生細胞における複製に特異的なアデノウイルスベクターを提供することによって、この必要性取り組む。本明細書中に引用される全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。発明の要旨１つの実施態様において、本発明は、癌胎児性抗原転写調節エレメント(CEA-T RE)転写制御下のアデノウイルス遺伝子を含む、アデノウイルスベクターを提供する。CEA-TREは、CEAを発現させ得るまたはCEA-TRE媒介性転写を可能にする細胞に特異的な遺伝子発現を媒介し得る。CEA-TREは、CEA-TREがCEAを発現させ得る細胞に特異的な遺伝子発現を媒介し得るのであれば、癌胎児性抗原遺伝子に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。１つの実施態様において、CEA-TREは、癌胎児性抗原遺伝子に由来するプロモーターを含む。１つの実施態様において、CEA-TREは、癌胎児性抗原遺伝子に由来するエンハンサーを含む。１つの実施態様において、CEA-TREは、癌胎児性抗原遺伝子に由来するプロモーターおよび癌胎児性抗原遺伝子に由来するエンハンサーを含む。特定の実施態様において、本発明は、CEA-TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクター遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。１つの実施態様において、CEA-TREはヒトである。１つの実施態様において、CEA-TREは、CEA特異的プロモーターおよびエンハンサーを含む。１つの実施態様において、CEA-TREは、約0.5kbプロモーターセグメントを含む（転写開始に対して約-402〜約+69、配列番号１）。これは、CEA-TREを機能させる細胞（たとえば、CEA産生細胞）に特異的である。従って、本発明はまた、CEA -TREが配列番号１を含むアデノウイルスベクターを含む。別の実施態様において、CEA-TREは、約-299〜約+69の配列を含む（配列番号１のヌクレオチド約104〜約４72）。別の実施態様において、CEA-TREは、約-90〜約+69の配列を含む（配列番号１のヌクレオチド約313〜約472）。種々の実施態様において、アデノウイルスベクターは、上述の配列のいずれかを含み、そして転写開始に対して約-14k b〜約-10.6kb、約-13.6kb〜約-10.6kb、約-13.6kb〜約10.6kb、または-6.1kb〜約-3.8kbの領域をさらに含む。いくつかの実施態様において、CEA-TREの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、細胞傷害性に（直接または間接に）寄与する（例えば、ウイルス複製に必須の遺伝子）。１つの実施態様において、複製遺伝子は、初期遺伝子である。別の実施態様において、初期遺伝子は、E1Aである。別の実施態様において、初期遺伝子は、E1Bである。なお別の実施態様において、E1AおよびE1Bの両方はCEA -TREの転写制御下にある。他の実施態様において、複製に必須のアデノウイルス遺伝子は後期遺伝子である。種々の実施態様において、さらなる後期遺伝子は、 L1、L2、L3、L4、またはL5である。別の実施態様において、CEA-TREの制御下にあるアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルス死タンパク質（ADP）である。別の実施態様において、CEA-TREの転写制御下にあるアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスは、CEA-TREの機能を生じさせる細胞に特異的な少なくとも１つの他の転写エレメントの転写制御下にある少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子を含む。１つの実施態様において、CEA発現細胞に特異的な少なくとも１つの他の転写エレメントは、CEA-TREの別のコピーである。１つの実施態様において、CEA発現細胞に特異的な少なくとも１つの他の転写エレメントは、第1のCEA-TREとは異なるCEA-TREの改変体である。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、CEA-TREの転写制御下にある異種遺伝子をさらに含み得る。１つの実施態様において、異種遺伝子は、レポーター遺伝子である。１つの実施態様において、異種遺伝子は、細胞生存に条件付きで必要とされる。１つの実施態様において、組成物は、本明細書中に記載の任意のアデノウイルスを含む。１つの実施態様において、この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。別の局面において、本発明は、本明細書中に開示の有効量のアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、マスクされたアデノウイルスを作るための親水性ポリマー（「マスキング剤(masklngagent)」）と複合体化されたアデノウイルスベクター（単数または複数）を提供する。親水性ポリマーは、アデノウイルスのキャプシドタンパク質（特に、ヘキソンおよび線維タンパク質）に（共有結合的または非共有結合的に）結合される。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、マスクされたアデノウイルスベクターを作るためのマスキング剤と複合体化される。さらなる好ましい実施態様において、マスキング剤は、本発明のアデノウイルスベクターに共有結合される、ポリエチレングリコール（PEG）である。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含むキットを提供する。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の任意のアデノウイルスベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。別の実施態様において、個体においてCEA関連腫瘍を処置する方法が提供され、この方法は、有効量のアデノウイルスベクターを個体に投与する工程を含み、ここでアデノウイルス遺伝子は、CEA-TREの転写制御下にある。１つの実施において、CEA関連腫瘍は、CEAを発現し得る細胞を含む。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子は、ウイルス複製に必須である。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子はE1Aである。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子はE1Bである。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子は後期遺伝子である。１つの実施態様において、アデノウイルス遺伝子はADPである。１つの実施態様において、CEA-TREは、CEA遺伝子に由来するエンハンサーを含む。１つの実施態様において、CEA-TREは、CEA遺伝子に由来するプロモーターを含む。１つの実施態様において、CEA-TREは、CEA遺伝子に由来するプロモーターおよびCEA 遺伝子に由来するエンハンサーを含む。１つの実施態様において、アデノウイルスは、少なくとも１つのさらなるCEA-TREの転写制御下にある少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子をさらに含む。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるCEA-TREは、第１のCEA-TREとは異なる。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子は、ウイルス複製に必須である。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。１つの実施態様において、少なくともさらなるアデノウイルス遺伝子は初期遺伝子である。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子はE1Aである。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス初期遺伝子はE1Bである。１つの実施態様において、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子は後期遺伝子である。種々の実施態様において、後期遺伝子は、L1、L2、L3、L4、またはL5であり得る。１つの実施態様において、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子はADPである。本発明の別の実施態様は、CEA-TREを機能させる哺乳動物細胞において優先的に複製するアデノウイルスである。別の局面において、CEA-TREを機能させる細胞に特異的なアデノウイルスを増殖させるための方法が提供される。この方法は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターをCEA-TREを機能させる細胞と合わせ、それによってアデノウイルスが増殖される工程を包含する。別の局面において、生物学的サンプルにおいてCEA-TREを機能させる細胞を検出するための方法が提供される。この方法は、生物学的サンプルを本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと、CEA-TREを機能させる細胞においてCEA-TREを機能させる条件下で接触させる工程；およびCEA-TREが、生物学的サンプルにおいて遺伝子発現を媒介するかどうかを決定する工程であって、ここでCEA-TRE媒介性遺伝子発現が、CEA-TREを機能させる細胞の存在を示す、工程を包含する。１つの実施態様において、生物学的サンプルにおいてCEA-TREを機能させる細胞を検出するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：生物学的サンプルを、CEA-TREの転写制御下にある遺伝子を含むアデノウイルスと、CEA-TREを機能させる細胞におけるCEA-TRE媒介性遺伝子発現に適切な条件下で接触させる工程；およびCEA-TREが生物学的サンプルにおいて遺伝子発現を媒介するかどうか決定する工程であって、ここでCEA-TRE媒介性遺伝子発現は、CEA-T REを機能させる細胞の存在を示す。１つの実施態様において、遺伝子は、異種（非アデノウイルス）遺伝子である。１つの実施態様において、遺伝子はレポーター遺伝子であり、そしてレポーター遺伝子の産物の産生が検出される。別の局面において、選択的細胞傷害性を標的細胞に与えるための方法が提供され、この方法は、CEA-TREを機能させる細胞を本明細書に記載される任意のアデノウイルスベクターと接触させる工程であって、ここでアデノウイルスが細胞に侵入する工程を包含する。１つの実施態様において、CEA-TRE転写制御下にある異種遺伝子をさらに含むアデノウイルスが提供される。１つの実施熊様において、異種遺伝子はレポーター遺伝子である。１つの実施態様において、異種遺伝子は、細胞生存に条件付きで必要とされる。１つの実施態様において、サンプルにおいてCEA-TREを機能させる細胞を検出するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：生物学的サンプルを、CEA-TREの転写制御下にある異種遺伝子を含むアデノウイルスベクターと、CEA-TREを機能させる細胞におけるCEA-TRE媒介性遺伝子発現に適切な条件下で接触させる工程；およびCEA-TREが生物学的サンプルにおいて遺伝子発現を媒介するかどうかを決定する工程であって、ここでCEA-TRE媒介性遺伝子発現は、CEAを機能させる細胞の存在の指標である。１つの実施態様において、標的細胞の遺伝子型を改変するための方法が提供され、この方法は、CEA-TREを機能させる細胞を、本明細書中に記載の任意のアデノウイルスベクターと接触させる工程であって、ここでベクターが細胞に侵入する工程を包含する。１つの実施態様において、選択的細胞傷害性を標的細胞に与えるための方法が提供され、この方法は、CEA-TREを機能させる細胞を本明細書に記載される任意のアデノウイルスベクターと接触させる工程であって、ここでベクターが細胞に侵入する工程を包含する。図面の簡単な説明図１は、ヒトCEA遺伝子の5'隣接領域の制限マップを示す。図２は、CEAの5'隣接領域のヌクレオチド配列（約+537まで）を示す。図３は、実施例１に記載されるような種々のアデノウイルスベクター構築物を示す模式図である。図４は、E1AおよびE1BがCEA-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターの模式図であり、E1AおよびE1Bは反対方向である。図5AおよびＢは、Adへの挿入のためのアデノウイルス死タンパク質（ADP）の模式図である。図5Aの下の矢印はプライマーの位置を示す。図5Bは、Yリーダー配列およびADPコード配列を含むアニールされたフラグメントを示す。図６は、コントロールCN702（黒丸）、Rec 700（黒三角）、および偽感染（X）と比較して、アデノウイルス死タンパク質（ADP）、CN751（黒四角）のコード配列を含むアデノウイルスベクターの細胞傷害性を示すグラフである。図７は、CN751（黒四角）およびCN702（黒丸）の細胞外ウイルスの収量を比較するグラフである。図８は、CN751（「H」）、CN702（「J」）、または緩衝液（「B」）でチャレンジした、LNCaP腫瘍異種移植片を有するマウスにおける腫瘍容量の比較を示すグラフである。図９は、アデノウイルスの共有結合性PEG化（pegylation）方法を示す模式図である。この方法において、スクシンイミジルスクシンアミドはアデノウイルスヘメトキシ-PEGを共有結合するために使用される。PEG化されたアデノウイルスは、イオン交換クロマトグラフィーによって反応成分から分離される。図10は、PEG化されたアデノウイルスタンパク質の、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（移動シフト）のハーフトーン再生を示す。レーン１および２はPEG化されていないCN706（コントロール）であり、レーン３〜６は、種々のpHおよび温度条件下でのCN706PEG化である（レーン３、pH7.6、室温（RT）；レーン４、pH7.6、４℃；レーン５、pH8.2、RT；レーン６、pH8.2、４℃）。図11は、コントロールアデノウイルスCN706と混合された、PEG化されたアデノウイルス（PEG-706）のイオン交換クロマトグラフィー分析のクロマトグラフである。発明を実施するための様式本発明者らは、癌胎児性抗原転写調節エレメント（CEA-TRE）を含む複製コンピテントアデノウイルスベクターを発見し、そして構築した。このアデノウイルスベクターは、癌胎児性抗原（CEA）を発現し得る細胞中で優先的に複製し得、そしてこれらのアデノウイルスベクターを使用する方法を開発した。本発明のアデノウイルスベクターは、CEA-TREの転写制御下に、少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子を含む。アデノウイルス遺伝子は、例えば、アデノウイルス複製に必要な遺伝子のような細胞傷害性（直接的または間接的）に寄与する遺伝子であり得る。この複製遺伝子は、好ましくは少なくとも１つの初期遺伝子である。あるいは、CEA-TREの制御下のアデノウイルス遺伝子には、アデノウイルス死タンパク質（ADP）遺伝子であり得る。あるいは、CEA-TREの制御下のアデノウイルス遺伝子は、後期複製遺伝子であり得る。アデノウイルスは、必要に応じて、CEA- TREとは異なる別のTREの制御下でアデノウイルス遺伝子またはトランスジーンのような、少なくとも１つの他の遺伝子を含み得る。複製に必要とされる少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子の細胞特異性転写を提供することにより、本発明は、選択的複製に起因する特異的な細胞傷害性効果のために使用され得るアデノウイルスベクターを提供する。選択的複製は、標的化細胞の殺傷が所望される癌の状況において、特に有用である。本発明のアデノウイルスベクターは、結腸直腸癌のようなCEA関連腫瘍の処置に有用である。ベクターはまた、例えば、適切な生物学的（例えば、臨床的な）サンプルにおいてCEA-TREを機能させる細胞の存在を検出するために有用であり得る。さらに、アデノウイルスベクターは、CE A-TREを使用することによって、標的細胞中で、１つ以上の目的のタンパク質を必要に応じて選択的に産生し得る。本発明者らは、本発明のアデノウイルスベタターが、CEA発現（すなわち、有意により高い収量で）細胞のような、CEA-TREを機能させる細胞中で優先的に複製することを見い出した。この複製の優先性は、CEA-TREを機能させる細胞中での複製レベル（すなわち、力価）を、CEA-TREを機能させない細胞中の複製のレベルと比較することによって示される。複製の優先性は、本発明のアデノウイルスベクターが野生型細胞よりもCEA-TREを機能させない細胞中において、有意により低い速度で実際に複製する場合、さらにより有意である。CEAを機能させる細胞型の力価と、CEA-TREを機能させない細胞型の力価との比較により、全体の複製の優先性が、CEA-TREを機能させない細胞における複製ならびにCEA-TREを機能させる細胞における複製の減少に起因して増強されるという重要な示唆を提供する。従って、本発明は、アデノウイルスベクターの所望でない局面と考えられている事柄、すなわち、その複製および可能性のある附随した免疫原性、の利点を使用および有する。ランナウェイ（runaway）感染は、細胞特異的な、ウイルス複製の必要性に起因して予防される。任意の特定の理論に拘束されることを望まずに、本発明者らは、アデノウイルスタンパク質の産生は、全身的におよび /またはアデノウイルスタンパク質を産生する標的細胞に対し特異的にのいずれかで、免疫系を活性化および/または刺激するように作用し得ることに留意する。これは、患者がしばしば中程度〜重篤度に免疫寛容性状態である癌の状況において重要な考慮事項であり得る。一般技術本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の技術範囲内にある。このような技術は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第２版（Sambrookら、1989）；「Oligonucleotide Synthesis」(M.J ．Gait編、1984);「Animal Cell Culture」(R．I．Freshney編、1987;「Methods in Enzymology」(Academic Press，Inc.)；「Handbook of Experimental Immun ology」(D．M．Wei & C．C．Blackwell編）；「Gene Transfer Vectors for Mam malian Cells」(J.M．Miller & M.P．Calos編、1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M．Ausubelら、1987)；「PCR:The Polymerase Chain R eaction」(Mullisら編、1994)；および「Current Protocols in Immunology」(J .E．Coliganら編、1991)のような文献において十分に説明される。アデノウイルスに関連した技術については、特に、FelgnerおよびRingold（19 89）Nature 337:387-388；BerknerおよびSharp（1983）Nucl．Acids Res．11:60 03-6020;Graham（1984）EMBO J．3:2917-2922;Bettら(1993)J．Virology 67:591 1-5921;およびBettら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9:8802-8806を参照のこと。定義本明細書中で使用する場合、「癌胎児性抗原転写応答エレメント」、または「 CEA-TRE」は、CEA-TREを機能させる宿主細胞（例えば、CEA発現細胞）において作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の転写を増加するポリヌクレオチド配列（好ましくはDNA配列）である。CEA-TREは、転写因子および/またはCEA 産生細胞に関連する補因子に応答し、そして少なくともCEAプロモーターよび/またはエンハンサーの部分を含む。CEA-TREはまた、他の転写制御配列（好ましくはCEAエンハンサー）のような他の配列を含み得る。方法は、本明細書中でCEA-T RE活性の測定について記載され、従って、所定の細胞がCEA-TREを機能することを許容するか否かの決定について記載される。本明細書中に、より詳細に記載されるように、CEA-TREは、CEAプロモーター； CEAエンハンサー;CEA発現細胞中で特異的に転写を媒介し得るCEAプロモーターおよび/またはエンハンサーの任意の転写調節エレメント；CEAプロモーターおよび CEAエンハンサー；CEAプロモーターおよび異種（非CEA）エンハンサー；異種プロモーターおよびCEAエンハンサー；ならびに上記の多量体を含むが、これらに限定されない、任意の数の配置を含み得る。CEA-TREのプロモーターおよびエンハンサーは、所望のCEA細胞特異的転写活性が得られる限り、目的のコード配列から任意の方向および/または距離であり得る。転写活性は、当該分野で公知の多数の様式で測定され得る（そして下記により詳細に記載する）が、一般的には、CEA-TRE制御下の（すなわち、作動可能に連結された）コード配列のタンパク質産物の検出および/または定量によって測定される。本明細書中で考察する場合、CEA-TREは多様な長さであり得、そして多様な配列組成物であり得る。「転写活性」または「転写の増加」によって、転写は、標的細胞（すなわち、CEA-TR Eを機能させる細胞）における基底レベルを超えて、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100 倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400 〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍増加する。基底レベルは一般には、CEA-TREを機能させない細胞中の活性レベル（もしあるとすれば）、またはCEA-TREを機能させる細胞中で試験した場合、CEA-TREを欠如するレポーター構築物の活性レベル（もしあるとすれば）である。 CEA-TREの「機能的に保存された」改変体は、別のCEA-TREとは異なるが、なお作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を増加する能力（特に細胞特異的転写活性）を保持するCEA-TREである。CEA-TREにおける差異は、例えば、１つまたは複数の塩基変異、塩基の付加、欠失、挿入および/または塩基の改変から生じる線状配列における差異に起因し得る。差異はまた、糖、および/またはCEA-T REの塩基間の連結における変化から生じ得る。本明細書中で使用する場合、「CEA-TREを機能させる細胞における発現」「CE Ａを発現し得る細胞に特異的な発現」などは、全ての転写因子および/またはCEA -TREからの転写を媒介する（しかし、他の細胞においてはより低い程度で）ために、必要とされる補因子を含む細胞中で主に生じる遺伝子発現を示す。これらの用語（ならびに、用語「転写活性化」または「増加した転写」）は、この遺伝子発現が、CEA-TREを機能させる細胞において、またはCEAの発現に必要な遺伝子産物を発現する細胞において、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍多いことを示す。発現レベルを測定する方法（相対的または絶対的のいずれであろうと）は当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載される。CEA-TREを機能させる細胞に特異的な遺伝子発現を示す遺伝子には、CEA-TREからの．転写に必要な因子を含むが、これに限定されない。このような因子は、結腸癌組織細胞、異常陰窩病巣（aberrant crypt foci）、および他のCEA産生細胞またはCEA関連腫瘍細胞（例えば、SW403、SW1463、SW837 、NCIH508、LoVo、MKN1、MKN28、MKN45、およびA549）のようなCEA産生細胞によって代表的に産生される。「別のCEA-TREとは異なるCEA-TRE」は、２つのCEA-TREが、ヌクレオチド配列非類似性を有することを示す。「アデノウイルスベクター」または「アデノウイルス性ベクター」（互換的に使用される）は、当該分野で周知の用語であり、一般的に、アデノウイルスゲノムのすべてまたは一部を含むポリヌクレオチド（本明細書で定義する）を含有する。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたCEA-TREを含む。この作動可能に連結されたポリヌクレオチドは、アデノウイルス性または異種性であり得る、本発明のアデノウイルスベクター構築物は、いくつかの形態のいずれかであり得る。裸のDNA、アデノウイルスコート中でカプセル化されたDNA、別のウイルス性またはウイルス様形態（例えば、単純ヘルペスウイルスおよびAAV）にパッケージされたDNA、リポソームにカプセル化されたDNA、ポリリジンと複合体形成したDNA、合成ポリカチオン分子と複合体形成したDNA、トランスフェリンと結合したDNA、および免疫学的に分子を「マスク」する、および／または半減期を増加させるためにPEGのような化合物で複合体形成したDNA、および非ウイルスタンパク質と結合したDNAが含まれるがこれらに限定されない。好ましくはポリヌクレオチドはDNAである。本明細書で使用するように、「DNA」は、塩基A、T、C、およびGを含むだけではなく、それらの類似体のいずれか、または、これらの塩基の改変形態、（例えば、メチル化ヌクレオチド、荷電しない連結およびチオエートのようなヌクレオチド間の改変、糖類似体の使用、ならびに改変されたおよび／またはポリアミドのような代替の骨格構造）もまた含む。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターは宿主細胞内において複製コンピテントである。用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用するように、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかをいう。従って、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖DNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖類およびリン酸基（代表的にはRNAまたはDNAにおいて見い出され得るように）、あるいは改変されまたは置換された糖類またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチド骨格は、ホスホロアミデートのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従ってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（P-NH₂）または混合したホスホロアミデートホスホジエステルオリゴマーであり得る。Peyrottesら（1996）N ucleic Acids Res．24:1841-8；Chaturvediら（1996）Nucleic Acid Res．24:23 18-23；Schultzら（1996）Nucleic Acid Res．24:2966-73。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル結合の代わりに使用され得る。Braunら（1988）J. Immunol．141:2084-9；Latimerら（1995）Mol．Immunol．32:1057-1064。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から、相補鎖の合成および適切な条件下での鎖のアニーリングによって、または適切なプライマーを用いて、DNAポリメラーゼを使用した新規な相補鎖の合成のいずれかによって、得られ得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子あるいは遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド、およびヌクレオチド類似物、ウラシル、他の糖類、およびフルオロリボースおよびチオエートのような結合基、ならびにヌクレオチド分岐）を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識成分との結合によってさらに改変され得る。この定義に含まれる他のタイプの改変には、キャップ、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似物による置換、およびタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体にポリヌクレオチドを結合させる手段の導入が挙げられる。当業者は、点変異および欠失が、配列の、転写を増加させる能力を変化させることなく、本明細書中に開示されるCER-TREのためになされ得ることを理解する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはDNAである。本明細書中に記載される場合、「DNA」は、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧを含むだけでなく、それらの任意のアナログまたはこれらの塩基の改変形態（例えば、メチル化ヌクレオチド、非荷電結合およびチオエートのようなヌクレオチド間改変、糖アナログの使用、ならびに改変されたおよび/または別の骨格構造（例えば、ポリアミド））もまた含む。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、特定のパーセント（例えば、80%、85%、90%、または95%）の「配列同一性」を、別の配列に対して有し、これは整列させた場合、塩基のパーセントが２つの配列の比較において同一であることを意味する。この整列およびパーセント相同性、または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウエアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら、編、1987）補遺30、7.7.18節、表7.7.1に記載のそれを使用して決定され得る。好ましい整列プログラムは、ALIGN Plus（Scientific and Educational Software，Pennsylvanla）である。「転写制御下にある」は、当該分野でよく理解されている用語であり、そしてポリヌクレオチド配列（通常DNA配列）転写が、転写の開始または促進に寄与するエレメントに対して作動可能に連結されることに依存することを示す。本発明細書中に定義するように、「作動可能に連結された」とは、エレメントが機能可能な配置にある、近位をいう。本明細書で使用される「細胞傷害性」は、当該分野でよく理解されている用語であり、そして１つ以上の細胞の通常の生化学的または生物学的機能が異常で損なわれる（すなわち、阻害されるかまたは上昇する）状態をいう。これらの活性は、代謝；細胞複製；DNA複製；転写；翻訳；および分子の取り込みを含むがこれらに限定されない。「細胞傷害性」は、細胞死および／または細胞溶解を含む。細胞傷害性を示すアッセイは当該分野に公知であり、例えば、色素排除、³Hチミジン取り込み、およびプラークアッセイを含む。本明細書で使用される用語「選択的細胞傷害性」は、CEA-TREが機能することを可能にしない細胞にアデノウイルスによって与えられる細胞傷害性と比較した場合の、本発明のアデノウイルスベクターによってCEA-TREを機能させる細胞に与えられる細胞傷害性をいう。このような細胞傷害性は、例えば、プラークアッセイ、標的細胞を含む腫瘍のサイズの減少または安定化、あるいは腫瘍細胞に特徴的なマーカーまたは組織特異的なマーカー（例えば、CEAまたはPSAのような癌マーカー）の血清レベルの減少または安定化によって測定され得る。「複製」および「増殖」は、互換的に使用され、そして本発明のアデノウイルスベクターの再生または増殖する能力をいう。この用語は当該分野でよく理解されている。本発明の目的のために、複製はアデノウイルスタンパク質の生成を含み、そして一般的にアデノウイルスの複製を指向する。複製は、バーストアッセイまたはプラークアッセイのような、当該分野における標準的な、および本明細書に記載されるアッセイを使用して測定され得る。「複製」および「増殖」は、ウイルス製造のプロセスに直接的または間接的に関与する任意の活性（遺伝子発現；ウイルスタンパク質、核酸または他の成分の生成；ウイルス成分の完全ウイルスへのパッケージング；および細胞溶解を含むが、これらに限定されない）を含む。「異種遺伝子」または「トランスジーン」は、野性型アデノウイルスに存在しない任意の遺伝子である。好ましくは、トランスジーンはまた、アデノウイルスベクターによる導入前に標的細胞で発現されないか、または存在しない。好ましいトランスジーンの例は、以下に提供される。「異種」プロモーターまたはエンハンサーは、CEA5'隣接配列に関連していないか、または由来でないものである。異種プロモーターまたはエンハンサーの例は、アルブミンプロモーターまたはエンハンサーならびに、SV40由来のような、他のウイルスプロモーターおよびエンハンサーである。「内在性」プロモーター、エンハンサー、またはTREは、アデノウイルスに対してネイティブか、またはアデノウイルス由来である。「宿主細胞」は、本発明の任意のベクターのレシピエントであり得るか、レシピエントである、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、もともとの親細胞と、自然に、偶然に、または故意の変異および／または変化によって、完全に同一（形態学的にまたは全 DNA相補性において）である必要性はなくてもよい。宿主細胞は、インビボにおいて、本発明のベクターによってトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。「標的細胞」は、CEA-TREを機能させる任意の細胞である。好ましくは、標的細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはCEA-TREを機能させる細胞、より好ましくは、CEA-TREを機能させるヒト細胞（例えば、CEAを発現する細胞）である。本明細書で使用される「新生物細胞」および「新生物形成」は、比較的自律的な増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の有意な欠失により特徴付けられる、異常な増殖表現型を示す細胞をいう。新生物細胞は、良性または悪性であり得る。「CEA-TREを機能させる細胞」「CEAを発現し得る細胞」などは、CEA-TREが、例えば、レポーター遺伝子に作動可能に連結された場合、CEA-TREに連結されない場合の同じレポーター遺伝子の発現と比較した場合、レポーター遺伝子の発現を、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、好ましくは少なくとも約 10倍、より好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍、より好ましくは少なくとも約100倍、より好ましくは少なくとも約200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜500倍、さらにより好ましくは少なくとも約10 00倍増加させる細胞である。発現レベルを測定する方法（相対的または絶対的）は当該分野で公知であり、そして本明細書中に記載される。対照的に、CEA-TRE を機能させない細胞は、検出可能なレベルのCEAを産生することが公知でないかまたは産生し得ない細胞を示す。しかし、より高感度な検出方法が開発され、これらの細胞のいくつかまたは全てが、これまでのところ、検出不可能な低いレベルのCEA形態または不安定なCEA形態であるものを産生することが見出され得る。 CEA-TREを機能させない細胞は、一般的には、CEA-TRE媒介遺伝子発現を媒介し得ないかまたはほとんど媒介し得ず、これには、LNCaP、HBL-100、HLF、HLE、3T3 、Hep3B、HuH7、CADO-LC9、およびHeLa細胞が含まれる「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプルタイプを包含し、そして診断的またはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、血液および生物学的起源の他の液体サンプル、生検サンプルのような固形組織サンプル、または組織培養物もしくはそれに由来する細胞、およびその子孫を包含する。この定義はまた、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドのような特定の成分を豊富にすることといった、入手後に任意の方法で操作したサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」は、臨床サンプルを含み、また、培養中の細胞、細胞懸濁液、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織サンプルを含む。「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定されない。「有効量」は、有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすに十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、反転、低速化または遅延するのに十分な量である。本明細書で使用される「処置」は、有益なまたは所望の臨床的な結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床的な結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定化状態（すなわち、悪化しない）、疾患の拡散（すなわち、転移）の妨害、疾患の進行の遅延または低速化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと全体的であろうと）を含むがこれらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予測される生存時間と比較して生存時間を長くすることを意味し得る。「マスクされたアデノウイルス」は、親水性ポリマー（「マスキング剤」）と複合体化したアデノウイルスである。アデノウイルスは、天然に存在するアデノウイルスの単離物、または本願に開示されるベクターのような、操作されたアデノウイルスベクターを含む任意のアデノウイルスであり得る。マスキング剤は、好ましくは低免疫原性のものである。受容可能な親水性ポリマーの例として：ポリエチレン／ポリプロピレンコポリマー、ポリアクリル酸アナログ、セルロースのような糖ポリマー、ポリホルムアルデヒド、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリエチレングリコール（PEG）などが挙げられる。親水性ポリマーは、ウイルスのキャプシドタンパク質、特にヘキソンおよびファイバーキャプシドタンパク質と共有結合または非共有結合により複合体化され得る。好ましい親水性ポリマーは、PEGであり、そして好ましいマスクされたアデノウイルスは、アデノウイルスに共有結合したPEGである（「共有結合的にPEG化されたアデノウイルス」）。疾患を「緩和する」とは、本発明のアデノウイルスベクターを投与していない場合と比較して、疾患状態の程度および／もしくは所望でない臨床的な症状発現が軽減する、ならびに／または進行の時間経過が低速化かもしくは長くなることを意味する。 CEA-TREを機能させる細胞に対する複製特異性を有するアデノウイルスベクター本発明はまた、CEA-TREの転写制御下でアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクター構築物を提供する。好ましくはアデノウイルス遺伝子は、細胞傷害（直接的および／または間接的のいずれにせよ）に寄与するものであり、より好ましくは、細胞死に寄与するか、または細胞死を引き起こすものであり、そしてさらにより好ましくは、CEA-TREの転写制御下のアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルス複製に必須である遺伝子である。細胞傷害に寄与するアデノウイルス遺伝子の例は、アデノウイルス死タンパク質（ADP）を含むが、これに限定されない。アデノウイルスベクターが、CEA-TREを機能させる標的細胞における、増殖に対して選択的に（すなわち、優先的に）複製コンピテントである場合、これらの細胞は、アデノウイルス増殖の際に優先的に殺傷される。アデノウイルスベクターと、CEA産生悪性細胞および正常細胞の混合物とを、例えば、インビトロまたはインビボで組み合わせることによって、アデノウイルスベクターは標的悪性細胞において優先的に複製する。一旦標的細胞が選択的細胞傷害性および／または細胞溶解性複製に起因して破壊されると、アデノウイルスベクター複製は有意に減少し、従って、ランナウェイ（runaway）感染および所望でないバイスタンダー（bystander）効果の可能性は減少する。インビトロ培養物は、標的細胞（例えば、CEA産生性新生物細胞）の発生（すなわち、存在）および／または再発について、混合物（例えば、生検または他の適切な生物学的サンプルなど）を継続的にモニターするために保持され得る。細胞傷害性をさらに保証するために、細胞傷害効果を有する１つ以上のトランスジーンもまた存在し得、そして選択的転写制御下にあり得る。この実施態様において、標的細胞が破壊されるという、より高度な確信を与え得る。さらに、またはその代わりに、細胞傷害性および／または細胞死に寄与するアデノウイルス遺伝子（例えばADP）は、選択的転写制御から自由であるか、または選択的転写制御下のいずれかで、アデノウイルスベクターに含まれ得る。本発明で使用されるCEA-TREは、哺乳動物細胞（ヒト、ラットおよびマウスを含むがこれらに限定されない）由来である。好ましくは、CEA-TREは、ヒト性である。CEA配列のクローニングおよび特徴付けは、文献中に記載され、従って本発明の実施について利用可能にされ、そして本明細書で詳細に記載される必要はない。５’CEA隣接領域（プロモーター、推定サイレンサー、およびエンハンサーエレメントを含む）の全体は、転写開始部位から上流の約14.5kb内に含まれるようであり、そして図２に図示される。Richardsら、(1995);WO/95/14100。Schr eweら、（1990）は、遺伝子の５’隣接領域における424bpフラグメント（翻訳開始部位の上流の最初の424ヌクレオチド）が、CEA産生細胞中では非産生HeLa細胞中よりも高いプロモーター活性を有することを示した。Richardsら(1995)による CEA遺伝子の５’隣接領域のさらなる特徴付けは、約-13.6kb〜約-10.7kb、または約-6.1kb〜-4.0kbの２つの上流領域が、多量体化されたプロモーターに作動可能に連結される場合、CEA産生LoVo細胞およびSW1463細胞において、レポーター構築物の高レベル発現および選択的発現を生じる。Richardsら、(1995)はまた、発現に必須な約-41〜-18の領域とともに、このプロモーターを転写開始部位に対して約-90位および約+69位に位置付けた。WO95/14100は、細胞特異的活性を付与する一連の５’隣接CEAフラグメントを記載し、これは、本明細書中でエンハンサーまたはCEA-TREエンハンサー（例えば、約-299〜約+69位；約-90〜+69位；約 -14.5〜-10.6位；約-13.6〜約-10.6位、約-6.1〜約-3.8位）と定義される。以下の領域の組合せは、CEA-TREの例（図２に従う番号づけ）である：(ａ)約-299〜約+69位；（ｂ）約-1664〜約+69位；（ｃ）約-14462〜約-10691位および約-299 位〜約+69位；（ｄ）約-89〜約-40位および約-90〜約+69位；（ｅ）[3×（約-89 〜約-40位）]および約-90〜約+69位；（ｆ）約-3919〜約-6071位および約-299〜約+69位；（ｇ）約-6071〜約-3919位および約-299〜約+69位；（ｈ）約-13579〜約-10691位および-89〜約-40位および約-90〜約+69位；（ｉ）約-10691〜約-135 79位および約-89〜約-40位および-90〜約+69位；（ｊ）約-14500〜約-10600位および-6100〜約-3900および約-299〜+69位；（ｋ）約-13600〜約-10600位および約-6100〜約-3900位および約-299〜約+69位；（ｌ）約-3900〜約-6100および[4 ×（約-90〜約+69位）]；（ｍ）約-13600〜約-10600位および[4×（約-90〜約+6 9位）]。従って、上記の任意のCEA-TREは、必須の所望される機能がアデノウイルスベクター中で示される限り、本発明で使用され得る。１つの実施態様において、CEA-TREは約0.5kbのプロモーター（約-402〜約+69 位、配列番号１）を含み、これはCEA産生細胞に対して特異的である。従って、本発明はまた、アデノウイルスベクターを含み、ここで、CEA-TREは配列番号１を含む。 CEA-TREはまた多量体を含み得る。例えば、CEA-TREは少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個のCEAプロモーターフラグメント（例えば、Schreweらに記載される440bpのフラグメント）の縦列シリーズを含み得る。あるいは、CEA-TREは１個以上のCEAプロモーターを１個以上のCEAエンハンサーと一緒に有し得る。本発明のCEA-TREは、サイレンサーを欠失しても、または欠失しなくてもよい。サイレンサー（すなわち、ネガティブ調節エレメント）の存在は、非許容（すなわち、非CEA産生）細胞における転写（および従って複製）の遮断において補助し得る。従って、サイレンサーの存在は、非標的細胞におけるアデノウイルスベクターの複製をより有効に阻止することにより、増強された細胞特異的な複製を付与し得る。あるいは、サイレンサーの欠失は、標的細胞において複製をもたらす際に補助し得、従って、標的細胞におけるより有効な複製に起因して、増強された細胞特異的な複製を付与する。Hauckら（1995）は、全ての活性を抑制した約-1098位と約-403位との間の領域を記載している。J.Biol.Chem.270:3602-36 10。当業者によって容易に理解されるように、CEA-TREは、ポリヌクレオチド配列であり、そして、それ自体種々の配列順列にわたって機能を示し得る。ヌクレオチド置換、付加、および欠失の方法は、当該分野で公知であり、そして容易に利用可能な機能的アッセイ（例えば、CATまたはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ）により、当業者は、配列改変体が必須の細胞特異的転写機能を示すか否かを決定することが可能になる。それ故に、本発明はまた、機能的に維持された本明細書中に記載されたCEA-TRE核酸配列改変体を含むアデノウイルスベクターを含み、これは核酸の置換、付加、および／または欠失を含む。特定の塩基改変が、増強された発現レベルまたは細胞特異性を生じることもあり得る。増強された発現レベルの達成は、より攻撃性の形態のCEA関連腫瘍の症例において、またはより迅速なおよび／または攻撃性のパターンの細胞殺傷性が保証される場合（例えば、個体の免疫寛容性状態に起因して）において特に所望され得る。種々の複製コンピテントなアデノウイルスベクターは、本発明に従って作製され得、このベクターにおいて、単一または複数のアデノウイルス遺伝子が、CEA- TREの制御下にある。例えば、CEA-TREは、複製遺伝子（例えば、初期遺伝子(例えば、E1AもしくはE 1B)または後期遺伝子（例えば、L1、L2、L3、L4、もしくはL5）のすぐ上流に、かつ作動可能に連結されてアデノウイルスに導入され得る。必要に応じて、複製遺伝子の内在性アデノウイルスプロモーターが欠失され、CEA-TREの転写制御下にのみ配置される。あるいは、CEA-TREはADP（アデノウイルス死タンパク質）遺伝子のすぐ上流に配置され、そして作動可能に連結される。種々の他の複製コンピテントのアデノウイルスベクターは、本発明に従って作製され、このベクターにおいてCEA-TREの制御下にアデノウイルス遺伝子を有することに加えて、少なくとも１つのさらなる遺伝子が少なくとも１つのさらなる異種（非アデノウイルス）TREの制御下にある。このさらなるTREは、細胞特異的、組織特異的および／または癌特異的TREであり得る。このさらなるTREは別のCE A-TREであり得る。必要に応じて、さらなるCEA-TREは第一のものと異なる。このようにして、例えば、介在性配列の同時欠失を伴う相同組換えの可能性は、回避され得る。第一およびさらなるCEA-TREは、例えば、必須領域または非必須領域において配列が異なり得る。例えば、第一のCEA-TREは、CEAエンハンサーおよび非CEAプロモーターを含み得、さらなるCEA-TREは非CEAエンハンサーおよびCEAプロモーターを含み得る。あるいは、プロモーターおよび／またはエンハンサーの必須領域は両方が介在する非必須領域は異なるが、同一であり得る。１つの実施態様において、１つのCEA-TREが１個の遺伝子の転写を媒介し、そして少なくとも１つの他のCEA-TREが別の遺伝子の転写を媒介する場合、遺伝子の配向性は、縦列ではなく、分岐性であるかまたは収束性である。このようにして、CEA-TRE 間の任意の組換えは、介在配列の欠失を生じるわけではなさそうである。いくつかの実施態様において、本発明は第二のCEA-TREの転写制御下にあるさらなるアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。転写制御下のさらなるアデノウイルス遺伝子の例は、ADP（上記に記載）および複製に必要な遺伝子（例えば、初期遺伝子）である。例えば、アデノウイルスベクターは、第一のCEA-TREが１個の初期遺伝子（例えば、E1AまたはE1B）の転写を調節し、そして第二のCEA-TREが別の初期遺伝子の転写を調節するように構築され得る。これらの多重構築物は、複製に対する細胞特異性の１つよりも多い供給源を提供する点においてより望ましくあり得る。例えば、CEA-TREはアデノウイルスベクター中に、E1Aのような初期遺伝子のすぐ上流にそして作動可能に連結されるように導入され得、そして異なる配列を有する少なくとも１つの他のCEA-TREは、E1Bのような別の初期遺伝子のすぐ上流にそして作動可能に連結されるように導入され得る。種々の他の複製コンピテントなアデノウイルスベクターが、単一なまたは多重のアデノウイルス遺伝子をCEA-TRE制御下に有することに加え、レポーター遺伝子もまたCEA-TREの制御下であるように、本発明に従って作製され得る。例えば、CEA-TREは、E1AまたはE1Bのような初期遺伝子のすぐ上流にかつ作動可能に連結されるようにアデノウイルスベクター中に導入され得、そしてこの構築物はまた、レポーター遺伝子の発現を駆動する少なくとも１つの他のCEA-TRE を含み得る。このレポーター遺伝子は、レポータータンパク質（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク質、および西洋ワサビペルオキシダーゼを含むがそれに限られない）をコードし得る。生物サンプル中の推定癌細胞検出のために、生物学的サンプルは改変されたアデノウイルスで処理され得、このウイルスにはレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がCEA-TREの制御下にある。CEA-TREは、CEA-TREを機能させる細胞中で転写的に活性であり、そしてルシフェラーゼが生成される。この生成物はCEA生成細胞（例えば、ヒト宿主または生物学的サンプル中の腫瘍細胞）の検出を可能にする。あるいは、生存について条件的に要求される生成物をコードする遺伝子（例えば、抗生物質耐性マーカー）がCEA-TREの転写制御下にあるアデノウイルスが構築され得る。このアデノウイルスが生物学的サンプルに導入される場合、CEAを生成する細胞は抗生物質耐性になる。次いで、抗生物質を培地中に導入して、非CEA産生細胞（すなわち、非癌性）を殺傷し得る。 CEA-TRE活性を決定し得る方法の例として、ポリヌクレオチド配列または１揃いのこのような配列は、当該分野で公知の方法（例えば、化学合成、部位特異的変異誘発、PCR、および／または組換え方法）を使用して産生され得る。試験される配列は、適切なレポーター遺伝子を含むベクター中に挿入され、これは以下を含むがこれらに限定されない：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ（lacZ遺伝子によりコードされる）、ルシフェラーゼ（luc遺伝子によりコードされる）、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ。このようなベクターおよびアッセイは、とりわけ商業的供給原より容易に入手可能である。従って、構築されたプラスミドは、当該分野で公知のトランスフェクション法（例えば、リン酸カルシウム沈澱法、エレクトロポレーション、リポソーム（リポフェクチン）およびDEAEデキストラン）を使用する推定CEA-TREにより制御されるようなレポーター遺伝子の発現について試験するのに適切な宿主細胞中にトランスフェクトされる。適切な宿主細胞は、CEAを産生する任意の細胞型を含み、これは以下を含むがこれらに限定されない：SW403、SW1463、SW837、NCIH508、LoVo、MKN1、MKN 28、MKN45、およびA549。非CEA産生細胞（例えば、LNCap、HBL-100、HLF、HLE、 3T3、Hep3B、HuH7、CADO-LC9およびHeLa）はコントロールとして使用される。結果は標準的アッセイを使用してレポーター遺伝子の発現レベルを計測することにより入手される。CEA産生細胞とコントロールの間の発現の比較は、転写活性の存在または非存在を示す。「転写活性化」または「発現の増加」により、転写が、標的細胞（すなわち、 CEA-TRE産生細胞）において、少なくとも約２倍に、好ましくは少なくとも約５倍に、好ましくは少なくとも約10倍に、より好ましくは少なくとも約20倍に、より好ましくは少なくとも約50倍に、より好ましくは少なくとも約100倍に、より好ましくは少なくとも約200倍に、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約 500倍に、さらにより好ましくは少なくとも約1000倍に、基底レベルを超えて増加することが意図される。種々のCEA-TRE間の比較は、１つのCEA産生細胞株中での発現レベルを測定し、そして比較することにより、評価され得る。CEA-TREの絶対的転写活性は、いくつかの因子（例えば、標的細胞の性質、CEA-TREの送達様態および形態、ならびに選択的に、転写が活性化されるコード配列）に依存することが理解される。種々の用いられるプラスミドサイズについて補正するために、活性はトランスフェクトしたプラスミド１モルあたりの相対活性として表され得る。あるいは、転写（すなわち、mRNA）のレベルは、標準的なノーザン分析およびハイブリダイゼーション技術を用いて測定され得る。トランスフェクションのレベル（すなわち、トランスフェクション効率）は、CMV前初期プロモーターのような異なるTREの制御下の異なるレポーター遺伝子をコードするプラスミドの同時トランスフェクションにより測定される。この分析はまた、ネガティブの調節領域すなわちサイレンサーを示し得る。あるいは、推定のCEA-TREは、CEA-TREを機能させる細胞についてアデノウイルス性複製の選択を授与するその能力について評価され得る。このアッセイのために、推定のCEA-TREに作動可能に連結された、複製に必須のアデノウイルス遺伝子を含む構築物は、CEAを発現する細胞中にトランスフェクトされる。これらの細胞でのウイルス性複製は、例えば、これらの細胞での野生型アデノウイルスによるウイルス性複製および／またはCEAを発現しない細胞中の構築物によるウイルス性複製について比較される。この種のアッセイのより詳細な記載は、実施例２にある。本発明を実施するために、最大の活性を有する、または最小のサイズを有する CEA-TREを使用する必要はないことが理解される。特に、活性の必要な程度は、予測される使用と所望の結果により決定される。例えば、本発明のアデノウイルスベクターがCEA産生活性について細胞をモニターするために用いられる場合、C EA-TREによる応答性の最大限未満の程度が、そのような細胞の存在を定量的に示すのに十分であることを可能にする。同様に、疾患状態の処置または緩和のために使用される場合、例えばCEA産生細胞が特に病原性でなく、そして／または疾患の程度が比較的限定されている場合、最大限未満の応答性は所望の結果としては十分であり得る。 CEA-TREのサイズは、部分的にアデノウイルスベクターの容量によって決まり、次にベクターの意図される形態（下記を参照のこと）に依存する。一般的に、最小のサイズは好ましい。なぜなら、これは、所望され得る他の配列（例えば、トランスジーン（下記）またはさらなる調節配列）の挿入のための潜在的な空間を提供するからである。しかし、さらなる配列が意図されない場合、または、例えば、アデノウイルスベクターが維持され、任意のウイルスパッケージングの制約なしに送達される場合、生じるアデノウイルスベクターが複製コンピテントにされる限り、より大きなCEA-TREが用いられ得る。アデノウイルス配列が欠失していない場合、アデノウイルスベクターは、ゲノムサイズの合計約5%まで、すなわち約.8kbまでの、余分な配列とともにパッケージングされ得る。非必須配列が、アデノウイルスゲノムより除去される場合、さらなる4.6kbのインサートが許容的であり得る（すなわち、全長約1.8kbプラス4. 6kbの約6.4kb）。欠失され得る非必須アデノウイルス配列の例は、E3およびE4（ E4 ORF6が維持される限り）である。好ましくは、CEA-TREは、約160bp（図２の約-90〜+69位）のみの領域が機能的であることが示されているので、約2.5kbのポリヌクレオチド配列を含み、より好ましくは約1kb、より好ましくは約0.8kb、なおより好ましくは約0.5kbまたはより小さいポリヌクレオチド配列を含む。非特異的複製を最小化するために、内在性（すなわち、アデノウイルス）TRE は、好ましく除去されるべきである。これはまた、アデノウイルスベクターにおいてさらにインサートのための空間を提供し、これは、アデノウイルスベクターがウイルスとしてパッケージング（下記を参照のこと）される場合、特に重要であり得る。さらにより重要には、内在性TREの欠失は組換え事象の可能性を防ぎ、それにより、CEA-TREは除去され、そして内在性TREがそのそれぞれのアデノウイルスのコード配列を転写制御を担う（従って、非特異的複製を可能とする）。１つの実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルス遺伝子の内在性転写制御配列が欠失し、CEA-TREで置換されるように構築される。しかし、十分な細胞特異的複製の優先性が保存される場合、内在性TREはまた、アデノウイルスベクター中に維持され得る。これらの実施態様は、内在性TRF に加えて、CEA-TRE、好ましくは内在性TREと複製遺伝子コードセグメントとの間に介在するCEA-TREを提供することにより、構築され得る。必要とされる細胞特異的複製の優先性は、CEA-TREを機能させる細胞でのアデノウイルスベクターの複製を非CEA産生細胞での複製とを比較するアッセイを行うことにより、示される。一般的に、複製は少なくとも２倍の差異が好ましく、より好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも10倍、より好ましくは少なくとも50倍、さらにより好ましくは少なくとも100倍に、なおより好ましくは少なくとも200倍、さらにより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍、なおより好ましくは少なくとも 1000倍である。許容される差異は、経験的に決定され（例えば、ノーザンアッセイまたは他の当該分野で公知のアッセイまたは実施例の節に記載のアッセイを用いて）、そしてアデノウイルスベクターの予想される使用および／または所望の結果に依存する。適切な標的細胞は、CEA-TREを機能させる任意の細胞型（例えば、CEAを、発現するか、または産生するか、または発現し得るかもしくは産生し得る細胞）である。特に好ましいのは、CEA関連腫瘍（癌）細胞であり、結腸直腸、胃、膵臓、肺および胸部の細胞ならびに前述の任意の転移物を含むがこれらに限定されない。CEA産生は、当該分野で標準のアッセイ（例えば、CEAタンパク質産生のレベルを決定するための、RIA、ELISA、もしくはウエスタンブロット（免疫アッセイ）、またはCEA mRNA産生のレベルを決定するノーザンブロット）を用いて測定され得る。あるいは、このような細胞は、CEA-TREを転写的に活性化する（すなわち、CEA-TREを機能させる）能力により、同定および／または特徴づけられ得る。任意の種々の血清型のアデノウイルス（例えば、Ad2、Ad5、Ad12、およびAd40 ）が用いられ得る。例示の目的で、血清型アデノウイルス5(Ad5)を、本明細書中で示する。いくつかの実施態様において、CEA-TREは、増殖に必須なアデノウイルス遺伝子とともに用いられ、その結果複製コンピテンスは、CEA-TREを機能させる標的細胞で、優先的に達成可能である。好ましくは、遺伝子は初期遺伝子（例えば、 E1A、E1B、E2、またはE4）である。（E3は、ウイルス複製に必須ではない。）より好ましくは、CEA-TRE制御下の初期遺伝子は、E1Aおよび／またはE1Bである。１つより多い初期遺伝子は、CEA-TREの制御下に配置され得る。実施例１（図３）は、このような構築物のより詳細な記載を提供する。 E1A遺伝子は、ウイルス感染の直後（0〜2時間）であって、そして任意の他のウイルス遺伝子の前に、発現する。E1Aタンパク質は、トランス作用性ポジティブ作動性転写調節因子として作用し、そして他の初期ウイルス遺伝子E1B、E2、E 3、E4、およびプロモーター近位の主要後期遺伝子の発現に必要である。命名法にもかかわらず、主要後期プロモーターにより作動されるプロモーター近位の遺伝子は、Ad5感染後の初期の間に発現する。Flint(1982)Biochem．Biophys．Acta 651:175-208;Flint(1986)Advances Virus Research 31:169-228;Grand(1987)Bi ochem.J.241:25-38。機能的E1A遺伝子の非存在下では、ウイルス感染は進行しない。なぜならウイルス性DNA複製に必要な遺伝子産物が生成されないからである。Nevins(1989)Adv.Virus Res.31:35-81。Ad5 E1Aの転写開始部位は498位であり、そしてE1Aタンパク質のATG開始部位はウイルスゲノムにおいてヌクレオチド56 0位である。 E1Bタンパク質は、トランスで機能し、そして後期mRNAの核から細胞質への輸送に必要である。E1B発現の欠損は、後期ウイルスタンパク質の発現不良、および宿主細胞タンパク質合成の遮断不能を生じる。EIBプロモーターは、Ad40とAd5 の宿主範囲の差を定義するエレメントとして、関係し；臨床的には、Ad40はエンテロウイルスであり、一方Ad5は急性結膜炎を生じる。Bailey,Mackayら、（1993 ）Virology 193:631;Baileyら、（1994）Virology 202:695-706。E1Bタンパク質はまた、宿主細胞周期によってウイルス複製に負わされる制限を克服し、そしてまたE1Aによるアポトーシスの効果を減少するのにも必要である。Goodrumら、（ 1997）J.Virology 71:548-561。Ad5のE1Bプロモーターは、１つのSp1高親和性認識部位とTATAボックスとを含有する。アデノウイルスのE2領域は、アデノウイルスゲノムの複製に関係するタンパク質（72-kDa DNA結合タンパク質、80-kDa前駆体末端タンパク質およびウイルスDN Aポリメラーゼを含む）をコードする。Ad5のE2領域は、２つのプロモーター(E2 初期およびE2後期と名付けられ、それぞれ76.0および72.0マップ単位に位置する）から右向き方向に転写される。E2後期プロモーターは、感染の後期段階の間で一過的に活性であり、そしてE1Aトランス活性化タンパク質に依存しないが、E2 初期プロモーターは、ウイルス複製の初期の間、重要である。 E2初期プロモーター(Ad5において、27050〜27150に位置する）は、主要なおよびマイナーな（minor）転写の開始部位（後者はE2転写物の約5%を占める）、２つの非正準（non-canonical）TATAボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位よりなる。 E2プロモーター構築の詳細な総説のために、Swaminathanら、Curr．Topics in Micro．and Imm.(1995)199第３部:177-194を参照のこと。 E2後期プロモーターは、対向鎖にコードされる遺伝子のコード配列と重なり、従って遺伝子操作には従わない。しかし、E2初期プロモーターは、対向鎖の33kD aタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重なる。特に、SpeI制限部位（Ad5 27082位）は、上記33kDaタンパク質の終結コドンの一部であり、主要E2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を、上流の転写因子結合部位E2FおよびA TFから都合よく分離する。従って、SpeI末端を有するCEA-TREの、１本鎖中のSpe I部位への挿入は、Ad5の内在性E2初期プロモーターを破壊し、E2転写物のAR制限化発現を可能にするべきである。 E4遺伝子は、多くの転写産物を産生する。E4領域は、ウイルスゲノムDNA複製の刺激および後期遺伝子発現の刺激を担う２つのポリペプチドをコードする。オープンリーディングフレーム（ORF）3および6のタンパク質産物は、ともにE1Bからの55-kDaタンパク質、ならびにE2F-1およびDP-1のへヘロ２量体と結合することにより、これらの機能を行い得る。ORF6タンパク質は、活性のためにE1B 55-k Daタンパク質との相互作用を必要とし、一方、ORF3タンパク質は必要としない。 ORF3およびORF6からの機能的タンパタ質の非存在下において、プラークは、野生型ウイルスの場合の10^-6未満の効率で産生される。CEA産生細胞にウイルス複製をさらに制限するために、E4 ORF1〜3は、除去され、ウイルスDNA複製および後期遺伝子合成をE4ORF6タンパク質に依存性して行い得る。そのようなベクターを、E1B領域がCEA-TREにより調節される配列と組み合わせることより、E1B機能およびE4機能の両方がCEA-TRE作動性E1Bに依存するウイルスを得ることができる。本発明と関連する主要後期遺伝子は、L1、L2、L3、L4、およびL5であり、これらはAd5ウイルスビリオンのタンパク質をコードする。すべてのこれらの遺伝子（代表的には構造タンパク質をコードする）は、おそらくアデノウイルス複製に必要である。後期遺伝子は全て、主要後期プロモーター（MLP）の制御下にあり、Ad5において約+5986〜約+6048に位置する。１つの実施態様において、E1A遺伝子またはE1B遺伝子のような初期遺伝子は、 CEA-TREの制御下にある。１つの実施態様において、E1AおよびE1Bは、以下の構築物を作製することにより、１つ以上のCEA-TREの制御下にある。E1Aのコード領域からE1Bプロモーターを含むフラグメントは、Adゲノムから切り出され、そして反対方向に再挿入される（図４）。この配置において、E1AプロモーターおよびE1Bプロモーターは、互いに隣どうしであり、続いて反対方向のE1A（その結果、E1Aプロモーターまたは E1Bプロモーターは、どちらもE1Aに作動可能に連結されない）、続いてE1Aに対して反対方向のE1Bである。CEA-TREは、E1Aコード領域とE1Bコード領域との間に挿入され得（これらは反対方向である）、その結果、これらの領域は、TREの制御下にある。適切なプロモーター配列は、図４に示されるようなE1AおよびE1Bの領域に対して近位に挿入される。従って、CEA-TREはE1AおよびE1Bの両方を駆動し得る。このような配置は、例えば、２つのCEA-TREがインタクトな（天然の）A dゲノム（E1AおよびE1Bのコード領域の各々１つの5'）に挿入された場合に生じ得る、可能性のあるループアウト（loop-out）事象を阻止し得る。E1AとE1Bとの間のポリクロ−ニング部位の導入により、他の型のTRE（例えば、癌胎児性抗原T RE（CEA-TRE）；ムチンTRE（MU-TRE）；または他の細胞特異的調節エレメント、好ましくは新生物のような疾患状態に関連するエレメント）が挿入され得る。従って、この構築物は、細胞特異的、時間的（temporal）またはアデノウイルス遺伝子E1AおよびE1Bを制御する他の手段についての一般的な使用を見出し得る。これにより、選択された転写パラメーターに依存するアデノウイルス複製を行うための簡便かつ強力な方法が提供される。 CEA-TREを機能させる細胞における優先的な複製コンピテントによって選択的細胞傷害性および／または細胞溶解活性を与えることに加え、本発明のアデノウイルスベクターは、さらにCEA-TRE制御下の異種遺伝子（トランスジーン）を含み得る。このようにして、種々の遺伝的能力は、CEA-TREを機能させる標的細胞、特にCEA関連腫瘍細胞（例えば、CEA関連癌細胞）へ導入され得る。例えば、CE A産生標的細胞の比較的抵抗性の性質または特定の攻撃性のために、例えば、特定の例において、細胞傷害性活性の程度および／または割合を増強することが所望され得る。これは、例えば、HSV-tkおよびシトシンデアミナーゼ（cd）（これは細胞の5-フルオロシトシン（5-FC）の化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）への代謝を可能にさせる）の細胞特異的発現と細胞特異的複製的細胞傷害活性とを共役させることにより達成され得る。これらの型のトランスジーンの使用もまた、バイスタンダー（bystander）効果を付与し得る。アデノウイルスベクターを介し導入され得る他の所望のトランスジーンとしては、細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ジフテリア毒素のＡ鎖、リシンまたはアブリン［Palmiterら、（1987）Cell 50:435;Maxwellら、（198 7）Mol．Cell．Biol．7:1576;Behringerら、（1988）Genes Dev．2:453;Messing ら、（1992）Neuron 8:507;Piatakら、（1988）J．Biol．Chem．263:4937;Lamb ら、（1985）Eur．J．Biochem．148:265;Frankelら、（1989）Mol．Cell．Biol ．9:415］）、アポトーシスを開始し得る因子をコードする遺伝子、アンチセンス転写物またはリボザイムをコードする配列（他の可能性の中で、増殖に必須のタンパク質（例えば、構造タンパク質、または転写因子）をコードするmRNAに指向され得る）、ウイルスタンパク質または他の病原性タンパク質（病原体は細胞内で増殖する）、ヌクレアーゼ（例えば、RNaseA）またはプロテアーゼ（例えば、アウシン（awsin）、パパイン、プロテイナーセＫ、カルボキシペプチダーセなど）の操作された細胞質の改変体をコードする遺伝子、あるいはFas遺伝子をコードする遺伝子などが挙げられる。目的の他の遺伝子は、サイトカイン、抗原、膜貫通タンパク質など（例えば、IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、GM-CSF、G-CSF、 M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、TGF-α、TGF-β、NGFなど）が挙げられる。正のエフェクター遺伝子は、複製を原因とする細胞傷害性活性の前の初期に用いられ得る。いくつかの実施態様において、E3領域内にコードされるアデノウイルス死誘導タンパク質（ADP）は、アデノウイルスベクターに維持される（すなわち含まれる）。主要後期プロモーター（MLP）制御下のADP遺伝子は、宿主細胞の溶解を促進するのに重要なタンパク質（ADP）をコードするようである。Tollefsonら、（ 1996）J.Virol．70(4):2296;Tollefsonら、（1992）J.Virol．66(6):3633。従って、ADP遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターをより強力にし、より効率的な処置および／またはより低い用量要求性を可能とする。従って、本発明は、ADPをコードするポリヌクレオチド配列を含有するアデノウイルスベクターを提供する。ADPをコードするDNA配列およびADPのアミノ酸配列を配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示した。手短に言えば、ADPをコードする配列は、好ましくは、PCRのような当該分野で公知である技術を用いてAd2から得られる（なぜなら、Ad2は、ADPがより十分に特徴づけられた株であるからである）。好ましくは、Ｙリーダー（後期遺伝子の正確な発現に重要な配列）はまた、得られ、そしてADPコード配列と連結される。次に、ADPコード配列（Ｙリーダーとともに、またはＹリーダーなしで）は、アデノウイルスゲノム中（例えば、E3領域（ここでADPコード配列は、MLPまたはE3プロモーターにより駆動される））に導入され得る。ADPコード配列はまた、E4領域のようなアデノウイルスゲノムの他の部位に挿入され得る。あるいは、ADPコード配列は、異種プロモーター（エンハンサーとともにまたはエンハンサーなしで）に作動可能に連結され得ている。これらには、別のウイルス性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、AFP（αフェトタンパク質）、癌胎児抗原（CEA）、ムチンおよびラットプロバシン（probasin）が挙げられるが、これらに限定されない。実施例５は、ADPのコード配列がAd5のE3領域に挿入されたADP構築物の記載を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、第２のCEA-TREの転写制御下にさらなるアデノウイル遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを提供する。転写制御下のさらなるアデノウイル遺伝子の例は、ADP（上記に討論した）および初期遺伝子のように複製に必要な遺伝子である。例えば、アデノウイルベクターは第１のCEA-TREが１つの初期遺伝子（例えば、E1AまたはE1B）の転写を調節し、そして第２のCEA-TREが別の初期遺伝子の転写を調節するように構築され得る。これらの複数の構築物は、複製に関して１つより多い供給源の細胞特異性を提供し得る点で、より所望され得る。アデノウイルスベクターは、種々の形態で用いられ得、これには裸のポリヌクレオチド（通常DNA）構築物を含むがこれに限定されない。あるいは、アデノウイルスベクターは、細胞内への侵入を容易にする薬剤（例えば、カチオン性リポソームまたはポリリジンのような他のカチオン性の化合物）と複合体をなすポリヌクレオチド構築物；感染性アデノウイルス粒子にパッケージングされるポリヌクレオチド構築物（これはアデノウイルスベクターをより免疫原性にし得る）； HSVまたはAAVのような他の特定のウイルス形態にパッケージングされるポリヌクレオチド構築物；免疫応答を増強または減衰させる薬剤（例えば、PEG）との複合体をなすポリヌクレオチド構築物；インビボトランスフェクションを容易にする薬剤（例えば、DOTMA^TM、DOTAP^TM、およびポリアミン）との複合体をなすポリヌクレオチド構築物を含有し得る。従って、本発明はまた、CEA産生細胞において、優先的に複製し得るアデノウイルスを提供する。「優先的に複製する」は、アデノウイルスが、非CEA産生細胞よりもCEA産生細胞において、より複製することを意味する。好ましくは、アデノウイルスは、非CEA産生細胞よりもCEA産生細胞において、有意に高い割合で複製し、好ましくは、少なくとも約２倍高い、好ましくは少なくとも約５倍高い、より好ましくは少なくとも約10倍高い、なおより好ましくは少なくとも約50倍高い、さらにより好ましくは少なくとも約100倍高い、なおより好ましくは少なくとも約400倍〜約500倍高い、なおより好ましくは少なくとも約1000倍高い、最も好ましくは少なくとも１×10⁶倍高い割合で複製する。最も好ましくは、アデノウイルスは、CEA産生細胞においてのみ複製する（すなわち、非CEA産生細胞において、複製しないか、または非常に低いレベルで複製する）。アデノウイルスポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターがアデノウイルス全体（キャプシドを含む）にパッケージングされる場合、アデノウイルス自体はまた、標的化をさらに増強するために選択され得る。例えば、アデノウイルス線維（fiber）は、向性（tropism）において補助する細胞レセプターとの最初の接触を媒介する。Ambergら、(1997)Virol.227:239-244を参照のこと。特定のアデノウイルス亜属の血清型（serotype）が、標的細胞型に対する向性および／または非標的細胞型に対する低下された親和性を表す場合、このような亜属(sub genusまたはsubgenera)が、細胞特異的な細胞傷害性および／または細胞溶解性をさらに増加させるために使用され得る。アデノウイルスベクターは、種々の様式で標的細胞に送達され得、リポソーム、当該分野に周知の一般的なトランスフェクション方法（例えば、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、直接注入、および静脈内注入）を含むが、これらに限定されない。送達の手段は、特定のアデノウイルスベクター（その形態を含む）ならびに標的細胞の型および位置（すなわち、細胞がインビトロかインビボか否か）に大部分を依存する。パッケージされたアデノウイルスにおいて使用される場合、アデノウイルスベクターは、約10⁴〜約10¹⁴の用量で、適切な生理学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得る。感染の多重性は、一般には、約0.001〜100の範囲にある。ポリヌクレオチド構築物（すなわち、ウイルスとしてパッケージされていない）として投与される場合、約0.01μg〜1000μgのアデノウイルスベクターが投与され得る。アデノウイルスベクターは、意図された使用および宿主の潜在的な免疫応答に依存して１回以上投与され得るか、または複数の同時注射によって投与され得る。免疫応答が所望でない場合、免疫応答は種々の免疫抑制剤を使用することによって減少され得、その結果強力な免疫応答なしに繰り返し投与が可能である。HSVのような別のウイルス形態としてパッケージされる場合、投与されるべき量は、その特定のウイルスに関する標準的な知識（例えば、刊行された文献から容易に得られる知識）に基づき、そして経験的に決定され得る。いくつかの実施態様において、アデノウイルスベタターは、親水性ポリマーに複合体化されてマスクされたアデノウイルスを作製する。親水性ポリマーはアデノウイルスのキャプシドタンパク質（特にヘキソンおよび線維タンパク質）に結合（共有結合または非共有結合）される。好ましい実施態様において、本発明のアデノウイルスベクターはマスキング剤剤と複合体化され、マスクされたアデノウイルスベクターを作製する。マスクされたアデノウイルスは、（a）アデノウイルス中和抗体または循環のオプソニンに対する、アデノウイルス表面のマスキング、および（b）体内の非特異的クリアランス機構（すなわち、マクロファージなど）の減少によるアデノウイルス粒子の全身循環時間の増加に起因して有利であり得る。インビボの状況において、マスクされたアデノウイルスの全身送達は、ウイルス粒子のより長い循環、より少ない免疫原性、ならびに肝臓および膵臓による減少したクリアランスとともに、増加した生体内分布を生じる。さらなる研究において、親水性ポリマー（特にPEG）によるタンパク質および脂質の改変を行ったが、本発明者らは、アデノウイルスまたはアデノウイルス構築物との組合せにおけるマスキング剤の任意の他の使用には気付いていない。従って、本発明は、マスキング剤と複合体化されたアデノウイルスを提供する。好ましくは、マスキング剤はPEGである。マスクされたアデノウイルスの作製の１つの方法の概要を図９に示す（実施例７もまた参照のこと）。好ましい実施態様は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含むマスクされたアデノウイルスであり、これは、本明細書中に記載のアデノウイルスを含むペジル化されたアデノウイルスを含むより好ましい実施態様を伴う。本発明はまた、これらのマスクされたアデノウイルスを作製するためおよび使用するための方法を提供し、これらは本明細書中の記載から明らかである。マスキング剤は、所望の複合体および必要な機能が得られる限り、種々の分子量であり得る。市販の供給源から得られるほとんどのマスキング剤は、標準分子量に関連して通常多分散である（すなわち、マスキング剤は、みかけの分子量周辺の分子量の分布で供給される）。本発明に従うアデノウイルスのマスキングに有用なマスキング剤は、約2000〜約50,000；好ましくは約2500〜約30,000;好ましくは約3000〜約25,000；より好ましくは約5000〜約20,000のみかけの重量を有し得る。好ましくは、みかけの分子量は、約20,000未満、より好ましくは約10,0 00未満、より好ましくは約7500未満、より好ましくは約5000未満である。好ましくは、マスキング剤は、約5000Da未満のみかけの分子量を有するPEGである。種々の重量のマスキング剤の混合物もまた含まれる。マスキングは、共有結合または非共有結合であり得る。非共有結合の場合、結合は、静電的、疎水性、または親和性相互作用を介し得る。非共有結合のために使用されるマスキング剤は、改変されたマスキング剤であり得る（すなわち、マスキング剤は、通常マスキング剤にはみられない特定の化学部分を含むように、合成または改変されている）。アデノウイルスベクターへの静電結合に有用なマスキング剤は、静電的相互作用によってアデノウイルス表面に結合する荷電した部分を含む、またはこれを含むように改変されたかもしくは合成された、マスキング剤である。負に荷電したマスキング剤には、リン酸基、硫酸基、カルボキシ基などを含むマスキング剤が含まれる。４荷のアミン基は、アデノウイルスへのマスキング剤の静電的、非共有結合の正に荷電した部分として有用である。脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンなど）のような疎水性基および他の疎水性基（例えば、フェニル基または長いアルキル鎖）を含む、またはこれらを含むように改変されたかもしくは合成されたマスキング剤は、ウイルス上の安定な疎水性領域との疎水性相互作用によりアデノウイルスベクターと複合体化され得る。親和性マスキング剤は、アデノウイルスに結合する任意の小分子、ペプチド、またはタンパク質を使用して作製され得る。親和性および疎水性部分は、当該分野で公知の任意の方法によって、好ましくは化学架橋剤を用いた化学的な架橋によってマスキング剤に結合され得る。マスキング剤が共有結合される場合、化学架橋剤は好ましくはアデノウイルスにマスキング剤を共有結合するために使用される。架橋剤は、共有結合を作製し得るか、またはマスキング剤とアデノウイルスとの間を架橋する、任意の架橋剤であり得る。アデノウイルス、マスキング剤、および別々の架橋分子が反応される直接架橋は、マスキング剤とタンパク質との間の架橋を作製する当該分野で公知の任意の化学架橋剤を使用して、共有結合的にマスクされたアデノウイルスを作製するために使用され得る。マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかは、架橋反応の前に改変され得、その結果、化学架橋剤は２つの分子と反応する（例えば、マスキング剤は、アミン基を添加するために改変され得、マスキング剤はアミンと反応する架橋剤によってアデノウイルスと架橋し得る）。好ましくは、マスキング剤またはアデノウイルスのいずれかは、架橋剤との反応によってまず活性化される。未反応の架橋剤を、次いで、マスキング剤またはアデノウイルスから除去する。活性化反応は、好ましくは、マスキング剤分子あたり１または２分子の架橋剤、より好ましくはマスキング剤分子あたり１つの架橋剤分子を生じる。活性化マスキング剤またはアデノウイルスは、次いでアデノウイルス（マスキング剤が活性化される場合）またはマスキング剤（アデノウイルスが活性化される場合）と、マスクされたアデノウイルスを形成する適切な反応条件下で混合される。好ましくは、マスキング剤は活性化され、次いでアデノウイルスと反応される。好ましいマスキング剤はPEGである。好ましくは活性化されたPEGには、末端アミンPEG、PEGアミノ酸エステル、PEGヒドラジンヒドロクロリド、チオールPEGなどのような核親和性架橋PEG；スクシネートPEG、カルボキシメチル化PEG、PEGプロピオネート、およびPEGアミノ酸を含むカルボキシルPEG；PEGマレイミド、P EGオルトピリジルジスルフィドなどのようなスルフヒドリル選択性PEG；アミンおよび酸PEG、NHSマレイミドPEGおよびNHSビニルスルホンPEGを含むヘテロ機能性PEG；PEGシラン；ビオチンPEG；アリルPEG、PEGアクリレート、PEGメタクリレートなどのようなPEGのビニル誘導体；およびPEGスクシンイミジルスクシネート、PEGスクシンイミジルスクシンアミド、PEGスクシンイミジルプロプリオネート、カルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル、PEG2-NHS、アミノ酸PEG のスクシンイミジルエステル、ペンダント改変PEGNHSエステル（例えば、Innoph ase，Inc.から入手可能なもの）、PEGグリシジルエーテル（エポキシド）、PEG オキシカルボニルイミダゾール、PEGニトロフェニルカルボネート、PEGトリクロロフェニルカルボネート、PEGトレスレート、PEGアルデヒド、PEGイソシアネート、PEGアリルエーテルおよび無水マレイン酸のコポリマー、PEGビニルスルホンのような求電子活性のPEG、ならびに当業者に明らかな他の活性化PEGを含むが、これらに限定されない。活性化PEGは、好ましくはPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドまたはPEGスクシンイミジルスクシネート、より好ましくは、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミドである。本発明はまた、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含む（すなわち、これで形質転換された）宿主を提供する。宿主細胞内で維持されるのに必要な配列（例えば、適切な複製起点）が存在する限り、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方が使用され得る。簡便さのために、選択マーカーもまた提供される。宿主系は当該分野で公知であり、そして本明細書中で詳細に記載される必要はない。原核生物宿主細胞には、E．coli、B．subtilis、およびマイコバクテリアのような細菌細胞が含まれる。真核生物宿主細胞には、酵母、昆虫、鳥類、植物、C．elegans（または線虫）、および哺乳動物宿主細胞がある。真菌（酵母を含む）宿主細胞の例は、S．Cerevisiae、Kluyveromyces lactis(K．lactis) 、Candida種（C．albicansおよびC．glabrataを含む）、Aspergillus nidulans 、Schizosaccharomyces pombe(S．pombe)、Pichia pastoris、およびYarrowia l ipolyticaがある。哺乳動物細胞の例には、COS細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児腎（HEK）細胞、およびアフリカ緑ザル細胞がある。Xenopus laevis卵母細胞または両生類起源の他の細胞もまた使用され得る。適切な宿主細胞はまた、CEAまたはCEA-TRE（このタンパク質は天然または組換え的に産生される）を活性化することが公知である任意のタンパク質を産生する細胞のような、CEA-TREを機能させる任意の細胞を含む。本発明はまた、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含有する薬学的な組成物を含む組成物を含む。このような組成物は、例えば、個体中の細胞殺傷の導入および/または効果の程度を測定する場合、インビボでの投与に有用である。好ましくは、これらの組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む。これらの組成物は薬学的に受容可能な賦形剤中に有効量の本発明のアデノウイルスベクターを含み得、単位投薬形態、滅菌非経口溶液または懸濁物、滅菌非経口でない溶液または経口溶液または懸濁物、水中油または油中水のエマルジョンなどにおいて、個体への全身投与に適切である。非経口および非経口でない薬物送達のための処方は当該分野で公知であり、そしてRemington's Pharmaceutical S ciences，第18版、Mack Publishing(1990)に示される。組成物もまた、本発明のアデノウイルスベクター（アデノウイルスのようなウイルスとしてパッケージされたものを含む）の、凍結乾燥化形態および/または再構成形態を含む。本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットを含む。これらのキットは、診断および/またはモニタリング目的（好ましくは、モニタリング）に使用され得る。これらのキットを使用する手順は、臨床研究室、実験研究室、医師、または私立の個別機関によって行われ得る。本発明に含まれるキットは、好適な生物学的サンプル中のCEA産生細胞（例えば、生検片）の存在の検出を可能にする。本発明のキットは、適切なパッケージングにおける、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターを含む。キットは、必要に応じて、手順に有用なさらなる成分（緩衝液、開発試薬、標識、反応面（surface）、検出手段、コントロールサンプル、説明書、および解釈上の説明書（interpretive information）を含むが、これらに限定されない）を提供し得る。本発明のアデノウイルスベクターの調製本発明のアデノウイルスベクターは、当該分野で標準の組換え技術を使用して調製され得る。一般には、CEA-TREを目的のアデノウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス複製遺伝子、より好ましくは１つ以上の初期複製遺伝子（後期遺伝子も使用され得るが）の5'に挿入する。CEA-TREは、オリゴヌクレオチド合成（配列が公知であれば）または組換え法（例えば、PCRおよび／または制限酵素）を使用して調製され得る。天然のアデノDNA配列またはPCRもしくは部位特異的変異誘発のような方法によって導入されたかのいずれかにおける便利な制限部位は、CEA-TREの挿入部位を提供する。従って、CEA-TREをアニーリング（すなわち、挿入）するための便利な制限酵素部位は、PCRのような標準的な組換え法を使用してCEA-TREの5'および3'末端上に操作され得る。本発明のアデノウイルスベクターを作製するために使用されるポリヌクレオチドは、化学合成組換え法のような当該分野で標準な方法を使用して得られ得るか、および/または生物学的供給源から得られ得る。 CEA-TREの制御下の所望のエレメント（すなわち、EIA）とともに、全ての複製に必要なエレメントを含むアデノウイルスベクターは、２つのプラスミド（一方はアデノウイルスの左腕部分を提供し、他方のプラスミドは右腕領域を提供し、一方または両方ともCEA-TREの制御下の少なくとも１つのアデノウイルス遺伝子を含む）の相同組換えまたはインビトロ連結によって簡便に調製される。相同組換えを使用する場合、２つのプラスミドは少なくとも約500bpの配列重複を共有するべきである。各プラスミドは、所望である場合、独立して操作され得、続いてコンピテント宿主へ同時トランスフェクトされ得、適切な遺伝子の補足、またはアデノウイルスの増殖のためのCEA-TREからの転写開始のための適切な転写因子を提供する。プラスミドは一般に、カチオン性リポソームのような適切な導入手段を使用して、293細胞のような適切な宿主細胞に導入される。あるいは、アデノウイルスゲノムの右腕または左腕部分のインビトロ連結を使用し、アデノウイルスゲノムの全ての複製必須部分を含む組換えアデノウイルス誘導体を構築し得る。Berknerら、（1983）Nucleic Acid Reserach 11:6003-6020；Bridgeら、（1989）J．Virol．63:631-638。簡便のために、アデノウイルスの必要な部分を提供するプラスミドは入手可能である。プラスミドpXC.1(McKinnon（1982）Gene19:33-42)は、Ad5の野生型左腕末端を含む。pBHG10（Bettら、(1994);Microbix Biosystems Inc.，Toronto）は、E3に欠失を有するAd5の右腕末端を提供する。E3における欠失は、ウイルスに、内在性エンハンサー／プロモーターを欠失することなく3kb CEA-TREを挿入する場所を提供する。E3の遺伝子は、E4から反対の鎖（r鎖）に位置する。pBHG1 1は、さらにより長いE3欠失（さらに0.3kbが欠失されている）を提供する。Bett ら、(1994)。初期遺伝子の操作のために、ウイルスゲノムにおいて、Ad5 E1Aの転写開始部位は498位であり、そしてE1AコードセグメントのATG開始部位は560位である。この領域は、CEA-TREの挿入に使用され得る。制限部位は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用することによって導入され得、使用されるプライマーは、Ad5ゲノムに制限され得るか、またはAd5ゲノムDNAを保有するプラスミドの部分に含まれ得る。例えば、pBR322が使用される場合、プライマーはpBR322骨格中のEcoRI部位を使用し得、そしてXbaI部位はAd5のヌクレオチド1339位にある。領域の中心での重複プライマーが、独特な制限部位を生じる30配列の変化を導入する場合、 PCRを２工程で実施することによって、その部位にCEA-TREの挿入を提供し得る。実施例１は、E1AがCEA-TREの制御下にあるアデノウイルスベクターのより詳細な記載を提供する。類似のストラテジーが、E1Bを調節するためのCEA-TREエレメントの挿入のために使用され得る。Ad5のE1Bプロモーターは、Sp1の単一な高親和性認識部位およびTATAボックスからなる。この領域は、Ad5ヌクレオチド1636位〜1701位に及ぶ。この領域におけるCEA-TREの挿入によって、E1B遺伝子の細胞特異的転写を提供し得る。E1Aを調節する細胞特異的応答エレメントで改変された左腕領域を、E1B を調節するためのCEA-TREを導入するためのテンプレートとして使用することによって、得られたアデノウイルスベクターは、E1AおよびE1Bの両方の発現のための細胞特異的転写因子に依存する。実施例１は、このような構築物が調製され得る方法のより詳細な説明を提供する。同様に、CEA-TREはE2遺伝子の上流に挿入され、その発現を細胞特異的にさせる。E2初期プロモーターは、27050-27150からのAd5にマッピングし、主要なおよびマイナーな転写開始部位（後者はE2転写物の約５％を占める）、２つの非カチオン性TATAボックス、２つのE2F転写因子結合部位、およびATF転写因子結合部位からなる（E2プロモーター構築の詳細な概説には、Swaminathanら、Curr．Topic s in Micro．and Imm．（1995）199(パート3):177-194を参照のこと）。対向鎖（counterstrand）によってコードされる遺伝子のコード配列と重複するE2後期プロモーターは、それゆえ、遺伝子操作の影響を受けない。しかし、E2 初期プロモーターは、対向鎖における33kDタンパク質をコードする配列と数塩基対のみ重複する。特に、SpeI制限部位（Ad5 27082位）は、上記の33kDタンパク質の終止コドンの部分であり、そして上流の転写因子結合部位E2FおよびATFから、主要なE2初期転写開始部位およびTATA結合タンパク質部位を簡便に分離する。それゆえ、SpeI末端を有するCEA-TREの、1-鎖におけるSpeI部位への挿入は、Ad5 の内在性E2初期プロモーターを破壊し、そしてE2転写のCEA制限された発現を可能にするべきである。 E4については、アデノウイルスゲノムの右腕部分を使用しなければならない。 E4転写開始部位は、主にヌクレオチド約35605位であり、TATAボックスはヌクレオチド約35631位であり、そしてORFIの第１のAUG/CUGはヌクレオチド約35532位である。Virtanenら、（1984）J．Virol．51:822-831。他の遺伝子について任意の上記のストラテジーを使用して、CEA-TREは、転写開始部位から上流に導入され得る。E4領域に挿入されたCEA-TREを有する全長アデノウイルスの構築物について、同時トランスフェクションおよび相同組換えは、これらのタンパタ質の合成における欠損を補充するためにE4タンパク質をトランスで提供するW162細胞において行う（Weinbergら、（1983）Proc．Natl．Acad．Sci．80:5383-5386）。アデノウイルスポリヌクレオチドをアデノウイルス粒子にパッケージングする方法は当該分野で公知であり、そして実施例に記載される。マスクされたアデノウイルスの調製方法は、マスキング剤および結合様式（共有または非共有）によって変化する。非共有結合的に結合したマスキング剤を有するマスクされたアデノウイルスは、十分におよび密接に、アデノウイルスおよびマスキング剤を混合することによって調製される。共有架橋剤は、架橋試薬に適切な条件下で反応成分を混合することによって達成される。化学的架橋プロトコルは当該分野で周知である。任意の所定の化学架橋剤のための正確な反応条件は、架橋剤の化学ならびにPEGおよびアデノウイルスに対する改変（あるとすれば）に従って、当業者に明らかなように、変更される。マスキング剤がPEGである場合、アデノウイルスとPEGとのモル比は、好ましくは１:１×10⁶と１:１×10⁷ との間、より好ましくは約１：４×10⁶である。好ましい活性化PEGであるPEG-N HS-スクシンアミドについては、活性化PEGは、好ましくは架橋反応中、0.5と５m Mとの間、より好ましくは約２mMである。好ましくは架橋反応中のアデノウイルスは、10⁶と10¹²との間であり、より好ましくは約５×10⁹である。好ましい活性化PEGの使用には、架橋反応のpHは好ましくは約７と９との間、より好ましくは約7.5と８との間であり、そして反応は好ましくは10〜30分間、約４℃〜室温（約20℃）の範囲の温度で行われる。架橋反応に続いて、マスクされたアデノウイルスは反応成分から分離される。分離は当業者に公知の任意の方法によって達成され得、これには、クロマトグラフィー法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、電気泳動法、またはフィルター法（例えば、透析、ダイアフィルトレーション、または限外濾過）が含まれる。本発明のアデノウイルスベクターを使用する方法本発明のベクターは、種々の広範な目的のために使用され得、これは所望または意図される結果とともに変更される。従って、本発明は、上記のアデノウイルスベクターを使用する方法を包含する。１つの実施態様において、CEA-TREを機能させる細胞（好ましくは、CEAを発現する細胞）において選択的な細胞傷害性を与えるための方法が提供され、これは細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程を包含する。細胞傷害性は、当該分野における標準アッセイ（例えば、色素排除、³H-チミジン取込み、および/または溶解）を使用して測定され得る。別の実施態様において、CEA-TREを機能させる細胞（好ましくはCEAを発現する哺乳動物細胞）に特異的なアデノウイルスを増殖するための方法を提供する。これらの方法は、アデノウイルスベクターを細胞と組み合わせる工程（それによって上記のアデノウイルスは増殖する）を包含する。別の実施態様は、細胞混合物中でCEA-TREを機能させる細胞を殺傷する方法を提供し、これは、細胞混合物を本発明のアデノウイルスベクターと組合わせる工程を包含する。細胞混合物は、一般には、正常細胞とCEA-TREを機能させる癌細胞との混合物であり、そしてインビボ混合物またはインビトロ混合物であり得る。本発明はまた、生物学的サンプル中でCEAを発現し得る細胞のような、CEA-TRE を機能させる細胞を検出するための方法を含む。これらの方法は、実験または臨床のいずれかの設定において、個体（すなわち、哺乳動物）の臨床的および/または生理学的状態のモニタリングに特に有用である。１つの方法において、生物学的サンプルの細胞はアデノウイルスベクターと接触され、そしてアデノウイルスベクターの複製が検出される。あるいは、サンプルは、レポーター遺伝子がCE A-TREの制御下にあるアデノウイルスと接触され得る。このようなアデノウイルスが生物学的サンプルに導入されるような場合、レポーター遺伝子の発現は、CE A-TREを機能させる細胞の存在を示す。あるいは、アデノウイルスは、条件的に細胞生存に必要とされる遺伝子がCEA-TREの制御下に配置されるように構築され得る。この遺伝子は、例えば、抗生物質耐性をコードし得る。後に、生物学的サンプルは抗生物質で処理される。抗生物質耐性を発現する生存細胞の存在は、CE A-TREが機能し得る細胞の存在を示す。適切な生物学的サンプルは、CEA-TREを機能させる細胞（例えば、CEA産生細胞）であり得るかまたは、存在すると予測されるサンプルである。一般には、哺乳動物において、適切な臨床サンプルは、CE A-TREを機能させる癌細胞（例えば、結腸直腸癌細胞）が存在すると予測されるサンプルである。このような細胞は、例えば、針生検または他の外科的手順によって得られ得る。接触されるべき細胞は、選択性富化および/または可溶化のようなアッセイ条件を促進するために処理され得る。これらの方法において、CEA- TREを機能させる細胞は、当該分野において標準である、アデノウイルスの増殖を検出するインビトロアッセイを使用して検出され得る。このような標準アッセイの例には、バースト（burst）アッセイ（これはウイルス産生を測定する）およびプラークアッセイ（これは細胞当たりの感染した粒子を測定する）が含まれるが、これらに限定されない。また、増殖はまた、特異的なアデノウイルスDNA 複製を測定することによって検出され得、これもまた、標準アッセイである。本発明はまた、標的細胞の遺伝子型を改変する方法を提供し、これは、標的細胞を本明細書中に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程（ここで、アデノウイルスベクターは細胞に侵入する）を包含する。本発明はさらに、腫瘍細胞（好ましくはCEA-TREを機能させる腫瘍細胞）増殖を抑制する方法を提供し、これは、腫瘍細胞を本発明のアデノウイルスベクターと接触させ、その結果アデノウイルスベクターは腫瘍細胞に侵入し、そして腫瘍細胞についての選択的な細胞傷害性を示す工程を包含する。本明細書中で使用されるように、「腫瘍細胞」および「腫瘍」は、比較的自律的な増殖を表す細胞をいい、その結果その細胞は、細胞増殖制御の有意な喪失により特徴付けられる異常増殖表現型を表す。腫瘍細胞増殖は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得、これは、腫瘍サイズを測定する工程、³H-チミジン取込みアッセイを使用して腫瘍細胞が増殖するか否かを決定する工程、または腫瘍細胞を計数する工程を包含するが、これらに限定されない。「抑制した」腫瘍細胞増殖は、任意のまたは全ての以下の状況を意味する：遅鈍した腫瘍増殖、遅延した腫瘍増殖、および停止した腫瘍増殖、ならびに腫瘍萎縮。「抑制した」腫瘍増殖は、本明細書中に記載のアデノウイルスベクターとの接触（すなわち、アデノウイルスベクターによるトランスフェクション）なしの増殖と比較した場合、縮小した（curt ail）増殖状態を示す。本発明はまた、個体における腫瘍細胞マーカーのレベルを低下させる方法を提供し、これは、本発明のアデノウイルスベクターを個体に投与する工程を包含する。ここで、アデノウイルスベクターは、CEA-TREを機能させる細胞に対して選択的に細胞傷害性である。腫瘍細胞マーカーは、PSA、hK2、および癌胎児性抗原（CEA）を含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞マーカーのレベルを測定する方法は当業者に公知であり、そして酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）のような、腫瘍細胞マーカーに特異的な抗体を使用する免疫学的アッセイを含むが、これに限定されない。一般には、生物学的サンプルは試験される個体から得られ、そしてELISAのような適切なアッセイを生物学的サンプルにおいて行う。本発明はまた、本明細書中に記載の有効量のアデノウイルスベクターが個体に投与される処置方法を提供する。アデノウイルスベクターを使用する処置は、上記のようなCEA関連腫瘍（例えば、肝細胞性癌）を有する個体において示される。切除された疾患を有する個体およびCEA関連腫瘍の家族歴を有する個体のような、CEA関連腫瘍（単一の細胞を含む）を発症する危険性があると考えられる個体もまた示される。本発明のアデノウイルスベクターの投与の適性の決定は、とりわけ、評価可能な血清学的示唆および組織生検の組織学的試験のような臨床パラメーターに依存する。一般には、薬学的に受容可能な賦形剤においてアデノウイルスベクターを含む薬学的な組成物が投与される。薬学的な組成物は、上で記載される。投与されるべきアデノウイルスベクターの量は、投与経路、個体の状態、疾患の病原（aggressiveness）度、使用される特定のCEA-TRE、および特定のベクター構築物（すなわち、アデノウイルス遺伝子がCEA-TREの制御下である）のようないくつかの因子に依存する。パッケージングされたアデノウイルスとして投与される場合、約10⁴〜約10¹⁴ 、好ましくは約10⁴〜約10¹²、より好ましくは約10⁴〜約10¹⁰である。ポリヌクレオチド構築物（すなわち、ウイルスとしてパッケージングされない）として投与される場合、約0.01μg〜約100μg、好ましくは0.1μg〜約500μg、より好ましくは約0.5μg〜約200μgが投与され得る。１つより多いアデノウイルスベクターが投与される場合、同時または連続的のいずれかである。投与は代表的には、いかなる応答をモニタリングしている場合にも、定期的に行う。投与は、例えば、腫瘍内、静脈内、または腹腔内で与えられ得る。本発明のアデノウイルスベクターは、単独、または所望の目的を促進する他の活性化剤（例えば、化学治療剤）と組合わせて使用され得る。以下の実施例は、例示の目的で、しかし本発明を制限することなく提供される。実施例実施例１ E1A および／またはE1Bの転写を駆動するCEA-TREを含むアデノウイルスベクター 1.A. 癌胎児性抗原の転写応答エレメント（CEA-TRE）癌胎児性抗原の転写応答エレメント（CEA-TRE）（転写開始に対して約-402〜約+69bp）（配列番号１）を、以下のプライマーを用いて、ヒトゲノムDNAからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した： 5’ATT ACC GGT AGC CAC CAC CCA GTG AG 3’（39.174B、上方のプライマー）（配列番号９）および 5’TAG ACC GGT GCT TGA GTT CCA GGA AC 3’（39.174D）（配列番号10）。独特の制限部位AgIを、PCR増幅産物での末端のプライマー対により導入した。 CEA-TREPCRフラグメントを、EcoRVで線状化されたpGEM-Tベクター（Promega）に連結した。連結混合物をE.coli DH5α細胞に形質転換した。所望のクローン（ CEA-TREフラグメントを有する）を得、そしてCN265と命名した。 1.B. CEA-TREの転写制御下での１または２つのアデノウイルス遺伝子を含むC EA-TREアデノウイルスの構築以下の３つの複製コンピテント（CEA細胞特異的アデノウイルス）を作製した： E1A遺伝子の発現を駆動するCEA-TREを含むをCN741、 E1AおよびE1B遺伝子の発現を駆動する２つのCEA-TREを含むをCN742；および E1B発現を駆動するCEA-TREを含むCN743。ウイルスを293細胞において相同組換えにより作製し、そしてプラーク精製によりクローニングした。ゲノムDNAの構造をPCRにより分析し、そして挿入した配列とAdゲノム配列との間の連結部を配列決定し、ウイルスが所望の構造を含むことを確認した。 1.B.1. CEA-TRE駆動されたE1Aアデノウイルスプラスミド（CN741）簡潔には、CEA-TREフラグメントをCN124（以下に記載）に挿入し、CN266を作製した。これは、アデノウイルスE1A遺伝子の発現を制御するCEA-TREを有するアデノウイルスの左腕末端を含む。CN266をアデノウイルスの右腕部分を有するプラスミドで組換え、CN741を作製した。これはCER-TRE配列がアデノウイルス遺伝子E1Aの発現を制御する全長アデノウイルスである。より詳細には、CEA-TRE配列を、PinAIを用いた消化によりCN265から切り出した（実施例1.A.に記載）。 CN124は、構築物pXC.1の誘導体であり、ヌクレオチド22位〜5790位の野生型（ wt）Ad5の左腕末端を含み、E1AおよびE1Bの両方を含む[Mckinnon(1982)Gene 19: 33-42]。プラスミドpXC.1をMicrobix Biosystems Inc．(Toronto)から購入した。本発明者らは、オリゴ特異的変異誘発および続くPCRにより、AgI部位（12bp5' ）をE1A開始コドン（Ad5ヌクレオチド47位）に導入した。これを達成するために、pXC.1を以下のプライマーを用いて、PCR増幅した： 15.134A、5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA（配列番号２）（EcoRI部位を含む）、および 15.134B、5'-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA（配列番号３）（AgeI部位を導入するためにさらにAを含む）。これにより、pBR322骨格におけるEcoRI部位からAd5ヌクレオチド560位までのセグメントを作製した。 Adヌクレオチド541位からAdヌクレオチド1339位のXbaI部位までのpXC.1の第２のセグメントを以下のプライマーを用いて増幅した。 15.133B、5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG（配列番号４）（XbaI部位を含む）、および 15.134A、5'-TCCGACACCGGTGACTGAAA（配列番号５）（AgeI部位を導入するためにさらにTを含む）。これら２つのPCR増幅DNAセグメントを混合し、そしてプライマー15.133Aおよびプライマー15.133Bを用いて増幅し、pXC.1のEcoRI部位からXbaI部位までのDNA セグメントを作製した。このDNAセグメントは、Ad配列の最も左の1317塩基を包含し、そしてAdヌクレオチド547位でAgeI部位を含む。このDNAセグメントを使用してpXC.1に対応するセグメントを置換し、CN95を作製した。 EagI部位を、E1B開始部位の上流に、上記のようにオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によってAd5ヌクレオチド1682位でG残基を挿入することによって作製した。CEA-TREの、EagI部位での挿入を単純化するために、CN95における内在性Eag I部位を、EagIでの消化によって除去し、リョクトウヌクレアーゼで処理し、そして再連結してCN114を構築した。以下のプライマーを使用して、1682とAd5ヌクレオチド2048位におけるKpnI部位との間のセグメントを増幅した： 15.133A、5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA（配列番号２）（EcoRI部位を含む）、および 9.4、5'-GCCCACGGCCGCATTATATAC（配列番号６）（EagI部位を含む）、 9.3、5'-GTATATAATGCGGCCGTGGGC（配列番号７）（余分のGならびにEagI部位を含む）、および 24.020、5'−CCAGAAAATCCAGCAGGTACC（配列番号８）（KpnI部位を含む）。プライマー15.133Aおよび24.020を用いた２つのセグメントの同時増幅によってAd5ヌクレオチド1682位でのEagIを有するフラグメント（これは、pXC.1において対応するEcoRI/KpnI部位を置換してCN124を構築するのに使用した）を得た。 CN265（上記を参照のこと）からPinAIでの消化によって切り出したCEA-TREフラグメントを同様に消化したCN124（これは、アデノウイルスの左腕末端を含む）に連結して、CN266を作製した。CN266は、アデノウイルスの左腕部分を含むベクターであり、ここで、CEA-TREがE1Aの上流に挿入され、そしてE1Aの発現を制御する。 CN741と称する全長CEA-E1AウイルスをCN266およびBHG11の相同組換えによって構築した。これは、アデノウイルス5の右腕側を含む。手短には、プラスミドCN2 66をPvuIで消化し；BHG11をClaIで消化した。等量（５μg）の線状に切断したプラスミド各々を293細胞に4倍過剰のカチオン性リポソーム(例えば、LipofectinD OTAP/DOPE(1:1))を用いてトランスフェクトした。293は、ヒト胚腎臓細胞株であり、これは、Ad5のE1AおよびE1B遺伝子を効率よく発現し、そしてアデノウイルスDNAでの高いトランスフェクション効率を示す。感染８日後、ウイルスプラークが細胞単層に観察され；細胞／ウイルスを採取し、凍結融解を３回行い、遠心分離して、細胞細片をペレット化し、そして上清を収集した。CN741を３回プラーク精製した。トランスフェクションの別のプロトコルにおいて、合わされるべきプラスミドを、４倍過剰のカチオン性リポソーム(例えば、Lipofectin DOTMA：DOPE、Life Technologies)を用いて、２つのプラスミドを合わせ、次いで、プラスミドDNA溶液（血清も他の添加物も含まない200μlの最小必須培地中に10μgの各プラスミド）を、200μlの同じ緩衝液中に4倍過剰のリポソームと混合することによって、293細胞に同時トランスフェクトする。次いで、DNA−脂質複合体を、細胞の上に置き、そして37℃、５％CO₂で16時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を、10％ウシ胎仔血清を含むMEMに変え、そして細胞を37℃、５％CO₂ 。で２週間２回の培地交換を行いながらさらにインキュベートした。今回の最後に、細胞および培地をチューブに移し、凍結融解を３回行い、そして溶解物を使用して293細胞を適切な希釈で感染して個々のウイルスをプラークとして検出した。得られたプラークを、２回プラーク精製し、そしてウイルスを所望の配列の存在について、PCRおよびときにDNA配列決定によって特徴付けした。さらなる実験法のためには、ウイルスを塩化セシウム勾配遠心分離によって大規模で調製する。 CN741のいくつかのクローン、CEA-TREがE1A発現を制御する全長アデノウイルスは、PCR、サザンブロット、およびプラークアッセイにより、特異性を特徴付けた。１．PCR：プライマーを使用して、アデノウイルスのE1A領域のCEAインサートの上流（プライマー39.141C：5'-ATT TGT CTA GGG CCG GGA CTT 3'）、およびE1 B領域の3'末端の下流（プライマー39.141H：5'-CGC GCG CAA AAC CCC TAA ATA A AG 3'）で開始するCN741のクローンの領域を増幅した。増幅したフラグメントは 4249bpである。以下のクローンはPCRによってポジティブと試験した：46.130.7. 4、46.130.8.3、46.130.9.1.1、46.130.9.2.1、46.130.9.3.1、および46.130.9. ４.1. ２．サザンブロット：CN741のポジティブクローンを、サザンブロットによってさらに特徴付けた。CN741クローンのウイルスDNAを、以下の酵素によって消化した：ScaI、AflII，およびAflII/XbaI。ウイルスDNAを、ランダムプライムした E1Aのフラグメントで調査した。正しいフラグメントは以下のとおりであった；S caI消化物、926および5645bp；AflII消化物、4011bp；ならびにAflII/Xbai消化物、1817bp。各ポジティブクローンは、正しいフラグメントパターンを示した。３．プラークアッセイ：プラークアッセイは実施例２に記載される。これらのアッセイは、CEA-TREがE1A発現を制御する全長アデノウイルスである CN741の同一性を確認した。 1.B.2. CEA-TRE駆動性E1Bアデノウイルスプラスミド（CN743）手短には、CEA-TREフラグメントをCN124（上記に記載される）に挿入してCN29 0を作製した。これは、アデノウイルスE1B遺伝子の発現を制御するCEA-TREを有するアデノウイルスの左腕末端を含む。CN290をアデノウイルスの右腕部分を有するプラスミドと組換えてCN743を作製した。これは、CEA-TREがアデノウイルス遺伝子E1Bの発現を制御する、全長アデノウイルスである。より詳細には、CEA-TREを、CN284（下記に記載される）からのEagIフラグメントとして得た。このフラグメントをゲル電気泳動によって単離し、そしてEagIで同様に切断されたCN124に挿入した。上記にまた記載されるCN124は、アデノウイルス5の左腕部分を、E1B開始部位の上流における人工のEagI部位とともに含む。得られたクローン（CN290と称する）は、アデノウイルスの左腕部分においてE1B の上流に挿入されたCEA-TREを有する。CN290の同一性を、制限消化（ScaI：2937 、および7406bp；SmaI：180、783、2628、および6752bp）によって確認した。 CN743を、E1Bを産生する293細胞をCN285およびBHG11で同時トランスフェクトすることによる相同組換えにより作製した。これは、Ad5のwt右腕部分を有する。従って、CN743は、CEA-TREの制御下に遺伝子E1Bを有する全長アデノウイルスゲノムである。 1.C. CEA-TREによって２つのアデノウイルス遺伝子の発現の各々が制御される、アデノウイルスベクター（CN742）の構築手短には、CEA-TREフラグメントを、構築物CN266（これは、すでに、E1Aの上流に挿入されたCEA-TREフラグメントを有した）においてE1B遺伝子の上流に挿入した。得られたプラスミドをCN285と称し、そしてアデノウイルスの左腕の部分を、E1AおよびE1Bの発現を駆動するCEA-TREの別個のコピーとともに含んだ。CN2 85をアデノウイルスの右腕部分と組換えてCN742を作製した。これは、E1Aおよび E1Bの両方の発現がCEA-TREによって制御される全長アデノウイルスである。より詳細には、CN285を、以下のプライマーを使用するPCRによってE1A領域に挿入されたCEA-TRE(例えば、CN266)を増幅することによって構築した： 5'-TAA CGG CCG AGC CAC CAC CCA 3'(39.180A、上方プライマー)（配列番号11 ）および 5'-TAT CGG CCG GCT TGA GTT CCA GG 3'（39.180B、下方プライマー）（配列番号12）。独特の制限部位EagIをプライマー対によってPCR増幅産物の末端に導入した。PCR産物をpGEM-T Vector(Promega)に連結し、そして得られたプラスミドをCN284と称した。 EagI CEA-TREフラグメントをCN284から切り出し、そしてゲル電気泳動によって単離した。CEA-TREフラグメントを、CN266（これは、EagIで切断した）に連結した。CN266（上記に記載される）は、CEA-TREがE1Aの発現を制御する、アデノウイルスの左腕部分である。得られたクローンを、制限消化（ScaI：1682、1732 、および7406bp；SmaI：783、899、2628、および6330bp）によって確認した。クローンをCN285と称し、これは、E1AおよびE1Bの両方が別個のCEA-TREの制御下にあるアデノウイルスの左腕部分を示す。 CN742を、CN285およびBHG11で293細胞を同時トランスフェクトすることによる相同組換えにより作製した。これは、アデノウイルスのwt右腕部分を有する。従って、構築物CN742は、CEA-TREの制御下に遺伝子E1AおよびE1Bの両方を有する全長アデノウイルスゲノムである。まとめると、１つまたは２つのアデノウイルス初期遺伝子がCEA-TREの転写制御下にある全長アデノウイルスを構築した。表１は、所望の特徴を有する組換えAd5を作製するために使用した右端Ad5プラスミドおよび左端Ad5プラスミドの組み合わせを列挙する。表１．CEA-TREを含むアデノウイルスベクター実施例２インビトロでのウイルス増殖の比較試験 CM741、CN742および/またはCN743（１つまたは２つの初期遺伝子がCEA-TREの制御下にある全長アデノウイルス）の増殖選択性を、単一の感染粒子が多数回の感染および複製によって可視プラークを生成するプラークアッセイにおいて分析する。ウイルスストックを、等価なpfu/mlへと希釈し、次いで、これを使用して細胞の単層に1時間感染させた。CEA-TREを機能させる細胞、およびCEA-TREを機能させない細胞において基準化した力価の比較によって、複製優先度が示される。この研究のために選択された細胞は、CEA-TREを機能させる細胞（例えば、NCI H508、LoVo、SW1463、MKN1、MKN28、MKN45）、およびこのように機能させない細胞（例えば、HuH7またはHeLa）である。次いで、接種材料（inoculum）を除去し、そして細胞を、培地を含む半固体の寒天に重層し、そして37℃で１週間インキュベートした。次いで、単層におけるプラークを計数し、そして感染ウイルスの種々の細胞に対する力価を算出する。データを、293細胞に対するCN702(野生型）の力価に対して基準化する全長アデノウイルスCN741（ここで、E1Aの転写がCEA-TREの制御下にある）をこのように試験した。クローン46.130.8.3を使用し、そしてCN702（wtアデノウイルス）はコントロールであった。細胞株上に観察されたプラークをコントロールの293細胞に対する感染性に対して基準化した。CN741およびCN702の基準化したプラークの比を比較して、細胞型におけるプラーク優先度を評価した。表２は、プラークアッセイの結果を示す。試験した細胞は、293（CEA欠失）、LoVo（CE A産生性）、OVCAR（CEA欠失）、HBL100（CEA欠失）、およびHepG2（CEA産生性）であった。本発明者らは、OVCARおよびHBL100細胞が、Genzymeから購入したキットを用いて標準的なプロトコルを使用したELISAによって検出可能なレベルのCEA を発現しないことを見い出した。しかし、本発明者らはまた、HepG2細胞がELISA 試験において検出可能なCEAを生成しないことも見い出したが、Zhaiら、[(1990) Gastroenter.98:470-7]は、HepG2細胞が確かにCEAを生成することを示している。なぜなら、PAPおよびアビジン−ビオチン技術によって検出可能であるからである。表２ヒト細胞株に対するCN741（CEA-EIA）のプラークアッセイ結果表２におけるプラークアッセイの結果は、CN741の増殖パターンがCEA-TREの導入によって変化したことを示す。各細胞株において、CN741ウイルスの増殖は、野生型アデノウイルスCN702と比較して減少している。CEA良く発現する(profici ent)細胞株LoVoおよびHepG2におけるCN741/CN702比は同様であった。重要なことに、CEA欠失細胞株HBL100細胞において複製するCN741の能力は、4分の1に減少した。これらのデータは、CN741が、CEA良く発現する細胞（LoVoおよびHepG2）において、CEA欠失細胞（HBL100）におけるより大きな能力（すなわち、複製についてより大きな特異性）を有することを示すようである。興味深いことに、CN741/CN702比は、CEA産生細胞における比と、OVCAR（CEA欠失）において同様であった。これは、OVCAR（CEA欠失）におけるwtウイルスに比較して、CEA-E1Aアデノウイルスの複製がCEA産生細胞の複製と同様であることを示唆する。この知見についていくつかの説明が可能である。上記のように、HepG 2は、CEA欠失であることがCEA ELISAアッセイによって決定されたが、PAPおよびアビジンビオチン技術によってはCEAが良く発現することが明らかにされたことに注記されたい。ELISA方法は、OVCARに存在する低レベルのCEAを検出するのには同様に不十分であり得る。あるいは、OVCAR細胞もまた、CEAを生成するが、タンパク質の発現が一過的過ぎるかまたはELISAによって検出可能となるにはあまりに迅速に分解するが、なお、なぜかCEA-TREの転写およびCN741の複製の活性化を可能にし得るという可能性もある。実施例３ Lovo 腫瘍異種移植片に対するアデノウイルスベクターの細胞傷害能力の試験 CEA特異的なアデノウイルスベクターの開発における特に有用な目的は、CEA産生性腫瘍（例えば、肝細胞癌）を有する患者を処置することである。可能性の初期指標は、Balb/c nu/nuマウスにおいて皮下で増殖させたLovo腫瘍異種移植片に対する細胞傷害活性についてベクターを試験することである。マウスに、PBS中の１×10⁷LoVo癌細胞を皮下注射して与える。腫瘍細胞を、標準的なアッセイ（例えば、ELISA）を用いて、血清中のCEAについてアッセイすることによってCEA 産生について試験し得る。この実験について、試験アデノウイルスベクターを、マウスに、0.1mlのPBSおよび10％のグリセロール中の約10⁸pfuのウイルス（パッケージングされたウイルスとして投与される場合）の、直接腫瘍内、静脈内、または腹腔内注射、あるいは尾部静脈を介して静脈内のいずれかによって導入する。ポリヌクレオチド構築物（すなわち、ウイルスにパッケージングされていない）として投与される場合、0.1μg〜100μgまたはそれを超えて投与され得る。腫瘍サイズを測定し、そしていくつかの実験において血液サンプルを毎週採取する。腫瘍サイズおよび血清 CEAレベルに対するアデノウイルスベクター（例えば、CN733）の腫瘍内注射の効果を偽処置と比較する。本明細書中で記載するウイルスに基づく治療は、病変内（すなわち、直接注射）に与えられる可能性が高いが、アデノウイルスベクターの静脈内（IV）投与が腫瘍増殖に影響を与え得るか否かを決定することもまた所望される。その場合、ウイルスが直接注射では届かない転移性腫瘍沈着物（deposit）を処置するに使用され得ることが考えられる。この実験について、LoVo腫瘍を有する、３〜５匹のマウスの群に10⁸pfuのアデノウイルスベクターの尾部静脈注射によって、またはネガティブコントロールとしてウイルスを保有するのに使用された緩衝液を接種する。腫瘍サイズおよび血清CEAレベルに対するアデノウイルスベクターのIV 注射の効果を偽処置と比較する。実施例４レポーター遺伝子構築物を用いるCEA-TREの試験 CRE-TREを、レポーター遺伝子アッセイにおいて試験し得る。手短には、レポーター遺伝子がCEA-TREの転写制御下にあるアデノウイルスベクターを構築する。レポーター遺伝子は、上記に開示されており、そしてアデノウイルス中に挿入され得、そしてCEA-TREの制御下に配置され得る。このような構築のための方法は、当該分野で公知であるか、または本明細書中で開示されている。試験されるCEA-TREは、CEA-TRE活性において重要であることが公知である結合部位内に欠失または挿入のような変異、あるいはこれらの部位自体における塩基置換を有し得る。例えば、細胞をカチオン性脂質（すなわち、リポフェクチン）を使用してレポーター遺伝子構築物で形質転換する。培養のおよそ48時間後、細胞をレポーター遺伝子活性についてアッセイする。CEA-TREを欠損したプラスミドは、ネガティブコントロールとして作用する。レポーター遺伝子発現を制御する非細胞特異性プロモーター（例えば、CMV）を有するアデノウイルスをコントロールとして使用した、そのCEA生成細胞および非CEA生成細胞のレポーター遺伝子活性の比較は、細胞特異的発現の仲介における推定上のCEA-TREの効力を示し得る。４．Ａ．ルシフェラーゼのCEA-TRE制御発現レポーター遺伝子、ルシフェラーゼがCEA-TREの転写制御下に配置されたプラスミドを構築した。この構築物は、CEA-TREを機能させる細胞中のレポーターの細胞特異的転写を媒介することが見出された。 CEA-TREを、CN266(上記)由来のPinAIで切り取り、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメントで末端を埋め、そしてpGL3-lucルシフェラーゼプラスミド(Promega) に平滑末端に連結し、これをSmaIで消化した。ポジティブ配向性（+CEA-luc）およびネガティブ配向性(-CEA-luc)の両方のクローンを得た。最初のものについては、CEA-TREをルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結し；二番目のものについては、CEA-TREは存在するがルシフェラーゼ遺伝子に作動可能に連結されていない。 CEA-ルシフェラーゼ構築物をCEA生成細胞(LoVo)、およびCEA欠乏細胞(293)ヘリポフェクチンでトランスフェクトする。各細胞株におけるルシフェラーゼ発現を、標準的プロトコルに記載のように測定した。各細胞株のトランスフェクション効率を、CMV-β-Gal構築物に同時トランスフェクションし、そしてβガラクトシダーゼ活性を測定することにより決定した。293細胞は、産生されたβガラクトシダーゼの比較に基づき、LoVo細胞と比較して２倍高いトランスフェクション効率を示した。この因子を、細胞株間でCEA-ルシフェラーゼ構築物についてトランスフェクション効率を正規化するために使用する。表３ヒト細胞へのCEA-TREルシフェラーゼプラスミドのトランスフェクション表３に示されるように、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のCEA-TRE駆動発現のポジティブ配向を有するプラスミドは、LoVo細胞において、293細胞に対して７倍のルシフェラーゼ発現の増加を示した。さらに、CEA-TREは存在するがルシフェラーゼの発現を駆動しないプラスミドは、ルシフェラーゼ発現の規定レベルのみを示した。この実験において使用されるCEA-TREは、構築物CN741において使用されるものと同一であり、これは上記に記載のように、293細胞およびHBL-100細胞と比較した場合、プラークアッセイにおける特異性において４倍の増加を示した。それゆえ、本実施例および実施例２で示されるデータは、CEA-TREが、CEA-TRE を機能させる細胞（例えば、CEA発現細胞）に対し特異的なアデノウイルス複製の転写および制御を媒介し得ることを示す。実施例５ CEA-TRE の制御下でのアデノウイルス死タンパク質(ADP)のについてのコード領域を含むアデノウイルスベクターの構築 ADP遺伝子がCEA-TREの制御下にあるアデノウイルスを以下に記載のように構築し得る。ADPはE3領域内部にコードされ、そして天然には主要後期プロモーター（MLP）の制御下にある。この遺伝子は宿主細胞溶解の促進に重要であるタンパク質(ADP)をコードしているようである。Tollefsonら、（1996）J.Vlrol.70(4): 2296;Tollefsonら、（1992）J.Vlrol.66(6):3633。従って、ADP遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターをより潜在的にさせ、可能な限りより効果的な処理そして／または低用量の要求性がなされる。 Ad2由来のADPコード配列を、以下のようにE3領域（これは構築物中でしばしば欠失される；実施例１を参照のこと）中にAd5に導入し得る。 ADPカセットをオーバーラップPCRを使用して構築する。いくつかの後期遺伝子の発現を訂正するために重要であるYリーダーを、以下のプライマーを使用してP CR増幅した：５’GCCTTAATTAAAAGCAAACCTCACCTCCG...Ad 228287bp(37.124.1)(配列番号13)；および５’GTGGAACAAAAGGTGATTAAAAAATCCCAG...Ad 228622bp(37.146.1)（配列番号14）。 ADPコード領域は、以下のプライマーを使用してPCR増幅した。５’CACCTTTTGTTCCACCGCTCTGCTTATTAC...Ad2 29195bp(37.124.3)(配列番号15)および５’GGCTTAATTAACTGTGAAAGGTGGGAGC...Ad2 29872bp(37.124.4)(配列番号16)。二つのフラグメントをアニールし、そしてオーバーラップ生成物をプライマー 37.124.1および37.124.4を使用してPCR増幅した。生成物の末端をKlenowフラグメントでポリッシュ（polish）し、そしてBamHI切断pGEM-72(+)(Promega,Madiso n,WI)に連結し、CN241を生成する。ADPカセットを、PacI制限エンドヌクレアーゼでCN241を消化することにより切り取り、そして２つのベクター、CN247および CN248と連結し、プラスミドCN252およびCN270をそれぞれ生成する。 CN247はE3領域に独特のPacI部位を含み、そして以下のように構築した。全長A d5ゲノム、TG3602(Transgene,France)を含むプラスミドをBamHIで消化し、そして再び連結してCN221を得る。このプラスミドの骨格（Ad5配列の外側）は、さらに操作し得るために除去されることが必要とされるPacI部位を含んでいた。これは、PacIでのCN221の消化によりなされ、そしてT4 DNAポリメラーゼで末端をポリッシュし、CN246を得た。インタクトなE3領域を除去するために、CN246をAscI およびAvrIIlで消化した。このフラグメントを、BHG11由来の同様な切断フラグメントに置き換えた。得られたプラスミド、CN247はE3領域を欠き、そしてADPカセットフラグメントの挿入に適切なPacI部位を有する（上記に記載）。ADPカセットを有するCN247の連結はCN252を生成した。 CN248（E4領域において欠失／置換をも含むAdへのADPカセットの導入を可能にする構築物）を以下のように作製した。E4領域を、E3領域に独特のEcpRI部位由来の右側末端のAd5配列を含む構築物であるCN108の、AvrIIおよびAfIIIでの消化により欠失させた。ウイルス複製に必要とされるE4 ORFであるORF6のみを、プライマーを使用してORFをPCR増幅することにより再導入した。得られたプラスミドはCN203である。CN203をEcoRIで消化し、そしてシャトルプラスミドであるCN209に連結し、CN208を生成する。最終クローニング工程では、CN208をAscIおよびAvrIIで消化し、そしてADPカセットを有する同様に切断したE4欠失体／置換体に連結する。従って、CN252およびCN270の両方は、ADPを含み、そしてE3遺伝子を欠失するアデノウイルス誘導体である。さらに、CN270は前述したようにE4領域中の幾つかの配列を欠失する。全長アデノウイルスベクターは、（１）BamHIで消化された適切に調製されたウイルスDNAおよび（２）同様にBamHIで消化されたCN252またはCN257のインビトロ連結を介して得られる。連結産物は293細胞をトランスフェクトするために使用される。プラークアッセイを上記のように実施する。 CN252およびCN270はまた、CEA-TREフラグメントの挿入により改変され得、CEA -TREの制御下にADP遺伝子を配置する。実施例６アデノウイルス死タンパク遺伝子を含む、 E3 欠失アデノウイルスCN751の特徴付けアデノウイルス死タンパク質を含むアデノウイルスCN751を、そのような構築物が細胞傷害性についてより効果的であり得るか否かを試験するために構築した。感染後期に高レベルで発現される、11.6kDa Asn‐グリコシル化内在性膜ペプチドである、アデノウイルス死タンパク質(ADP)は、感染した細胞の核膜に移動し、そして宿主の効率的な溶解に作用する。アデノウイルス5(Ad5)Ｅ３領域は、 adp遺伝子を発現する。 CN751の構築 CN751を、２つの部分に分けて構築した。第一に、21562bpのBamHI部位から3' 側にAd5配列を含むE3欠失プラットフォームプラスミドを生成した。本プラスミドのE3領域の残りの部分中にAd2 adpを操作して、CN252を生成した。（本クローニングは先に記載している）。第二の部分を構築するために、CN751に必要な5'A d5配列を、精製したCN702 DNAをEcoRIで消化する工程、およびゲル抽出によって左腕のフラグメントを単離する工程により得た。CN252をEcoRIで消化した後、CN 702の左腕のフラグメントおよびCN252を連結した。293細胞を、リポフェクショントランスフェクションによってこの連結混合物でトランスフェクトし、そして 37℃でインキュベートした。10日後、細胞を収集し、冷凍-解凍を３回繰り返し、そして上清を293単層上にプラーク形成させた。個々のプラークを採取し、そして293細胞の単層を感染させ、試験するに十分なウイルスを増殖させるために使用した。数日後、プレート溶解物をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイを使用してスクリーニングして、候補ウイルスを検出した。陽性を示すプラークのうちの一つを、CN751と命名した。 CN751の構造的特徴付け CN751の構造を、２つの方法により確認した。第一に、プライマー37.124.1（5 ’gccttaattaaaagcaaacctcacctccg Ad2 28287bp）、および37.124.4（5’ggctta attaactgtgaaaggtgggctgc Ad2 29872bp）を、adpカセットの存在を検出するために、PCRにより候補ウイルスをスクリーニングするために使用した。CN751は、予測した産物(1065bp)と一致する伸長フラグメントを産生した。第二に、CN751をサザンブロットにより分析した。ウイルスDNAを精製し、PacI、SacIおよびAccI/ XhoIで消化し、そしてADPコード領域に相同な配列でプローブした。CN751の構造は予測したパターンと合致した。 CN751のインビトロでの特徴付け CN751の細胞傷害性およびウイルス収量を試験するために２つの実験を実施した。第一の研究において、数田こわたり上清中のサイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の蓄積を測定することにより、LNCaP細胞におけるCN751の細胞傷害性を評価した。細胞外LDHのレベルは、細胞溶解の程度と相関する。健常な細胞は、（もしあったとしても）ごくわずかしか酵素を放出しないが、死細胞は大量に放出する。LDHは、単純なプロトコルによって容易に検出され得る安定なタンパク質であるので、マーカーとして選択された。CN751の細胞死を引き起こす能力を、ADP遺伝子を欠くベクターであるCN702、およびADP遺伝子を含むベクターであるRec700の能力と比較した。 LNCaP細胞の単層を、１のMOIで、CN702、Rec700（adp＋コントロール）、またはCN751のいずれかに感染させ、次いで96ウェル皿に播種した。サンプルを感染後１日目から感染後５日目まで、１日に１度収集し、そしてPromegaのCytotox 9 6キットを使用してスコア付けした。このアッセイは、テトラゾリウム塩を、490 nmでプレートリーダー内で決定され得る赤色のホルマザン産物に変換する共役酵素反応を使用する。サンプルの吸光度が、感染細胞から放出されるLDHのレベルに対応するので、サンプルの吸光度が時間とともにどのように変化するかのプロットは、試験したウイルスが、細胞溶解をどれほど効率的に誘導するかを説明する（図6）。各データ点は、16の別々のサンプルの平均を示す。結果は、CN751が、adp-コントロールであるCN702よりも高い効率で、そしてadp＋コントロールであるRec700と同様に細胞を殺傷することを示唆する。CN751で感染したウェル中において、上清中のLDHの濃度は、２日目から急激に増加し、そして４日目に最大に達する。対照的に、CN702感染細胞の上清中のLDH濃度は、２日目にゆるやかに上昇し始め、そして実験終了まで継続する。意義深いことに、３日目でのCN751感染細胞から放出されるLDHの量は、CN702感染細胞から放出される量の２倍である。要約すると、ウイルス収量データは、ADP遺伝子を有するアデノウイルスベクターがより多くのウイルスを放出することを示す。 ADベクターでは、細胞を効率よく殺傷することだけが重要なのではなく、Adベクターはまた、他の癌細胞に感染し得る子孫を散布(shed)し得なくてはならない。大量のウイルスを散布し得るウイルスベクターは、少量のみを散布するものよりも優れた治療剤であり得る。CN751が感染細胞からの子孫の効率的放出を誘導し得るか否かを評価するために、ウイルス収量アッセイを行った。A549細胞を５のMOIで感染させた。感染後の種々の時間に上清を収集し、そしてウイルス収量を決定するために、293細胞上で力価測定を行った(図７)。データは、CN751で感染した細胞はCN702で感染した細胞より高い効率でウイルスを散布することを示唆する。感染の48時間後、CN751感染細胞は、CN702感染細胞より10倍多いウイルスを放出した。感染の72時間後では、CN751感染細胞は、40倍多いウイルスを放出した。データは、ADP遺伝子を有するアデノウイルスベクターが、ADP遺伝子を欠損するアデノウイルスベクターよりも高い効率で細胞を殺傷することを証明する。 CN751のインビボでの特徴付け LNCaPヌードマウス異種移植片を、ADP遺伝子を含むベクターであるCN751、またはこの遺伝子を欠損するベクターであるCN702のいずれかの、単一の腫瘍内用量（１×10⁴粒子/mm³腫瘍）で攻撃した。腫瘍の第三の群を、緩衝液のみで処置した。腫瘍を６週間、毎週モニターし、そしてその相対容積を時間に対してグラフ化した。結果を図８に示す。誤差のバーは、各サンプル群の標準誤差を示す。 CN751処置動物（ｎ＝14）およびCN702処置動物（ｎ＝14）の開始時平均腫瘍容積は320mm³であり、そして緩衝液処置した動物（ｎ＝８）は343mm³であった。データは、CN751がCN702より高い効率で腫瘍細胞を殺傷することを示唆する。平均的に、 CN751で攻撃された腫瘍は、実験過程を通して同じサイズのままであったが、14 個の内の９個(64％)の腫瘍が後退した。CN702処理動物の腫瘍はサイズが２倍になった。緩衝液処置腫瘍は、開始時容積の約５倍に増殖した。スチューデントT 検定は、CN751処置腫瘍とCN702処置腫瘍との間の腫瘍サイズの差異が、７日目（ｐ＝0.016）から実験終了（ｐ＝0.003）まで、統計的に有意であったことを示す。実施例７：共有結合的にPEG化(pegylated)したアデノウイルスの調製 PEGとアデノウイルスを複合体化することにより、アデノウイルスの表面キャプシドを改変するために一連の実験を行った。アデノウイルス表面のPEG複合体化マスキングの目的は以下の通りである：1)循環内のアデノウイルス中和抗体またはオプソニン(opsinin)、および2)身体内の非特異的クリアランス機構（すなわち、マクロファージ等）の減少によるアデノウイルス粒子の体循環時間の増加。野生型アデノウイルスCN706の表面キャプシドを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルスクシンアミド(NHS)を使用して、ヘキソンおよび線維タンパク質へのPEG の共有結合を介して改変した。PEG（Shearwater Polymers，Inc.）は、5000Daという名目上の分子量を有した。活性化PEG（約２mM）を、tris-HCI緩衝液中で５ ×10⁹粒子/mlアデノウイルスと反応させた（ウイルス粒子のPEGに対するおよそのモル比は、1:4×10⁶であった）。pH、温度、および反応時間の種々の組み合わせを使用した。反応後、未反応の活性化PEG、未反応のアデノウイルス、およびP EG化アデノウイルスを、pH8.0の50mM tris中で０から1.5MのNaCl勾配をかけて、 Q Sepharose XL(Pharmacia)での陰イオン交換クロマトグラフイーにより分離した。勾配を10カラム容積にわたってかけた。 PEG‐CN706の特徴付け CN706のPEG化をSDS‐PAGEにより検証した。図10は、CN706のPEG化およびPEG化タンパク質の移動度のシフトを図示する。レーン１および２は、非PEG化CN706（コントロール）であり、レーン３〜６はいくつかのpHおよび温度条件下でのPEG 化CN706である。レーン３〜６は、CN706のヘキソンタンパク質の上部の第二バンド（PEG化ヘキソンの可能性が最も高い）の出現、および線維タンパク質バンドの欠失を示す。PEG-ヘキソンタンパク質に対応するバンドを除いてはウイルスと関連するさらなるバンドは存在しないため、PEG化線維タンパクは、SDSゲル上の非PEG化タンパク質の内の一つの下にあると想定される。図11は、CN706の表面特性における変化を示すイオン交換クロマトグラムである。CN706のPEG化は、ウイルスを捕獲するために使用されるＱ Sepharose樹脂からのより早い溶出を生じる。この結果は、PEGがウイルスの電荷を外見上より中性にし、従ってイオン交換マトリクスに対する結合能力を低下させることに起因する可能性が最も高い。CN706のPEG化は異なる百分率で起こるので、ウイルスのクロマトグラムの幅の広がりが予測される。 PEG化CN706の感染性を、293細胞上のインビトロプラークアッセイにおいて評価した。表４は、CN706と比較した場合、PEG-CN706のプラーク形成効率が５分の１〜10分の１に低下することを示す。これは、ウイルス細胞をマスクするPEG化が、ウイルス粒子の認識およびエンドサイトーシスを減少させることに起因する可能性が最も高い。表４：CN706およびPEG‐CN706のプラーク形成効率の比較前述の発明は、理解を明確にする目的で例示および実施例によりいくぶん詳細に説明されたが、特定の変更および改変が実施され得ることは当業者に明らかである。従って、説明および実施例は、添付の請求の範囲により記載される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シュア，エリックアール. アメリカ合衆国カリフォルニア 95014, クパーティノ，スティーブンスクリークブールバードナンバー305 20350

Claims

【特許請求の範囲】１．癌胎児性抗原転写調節エレメント（CEA-TRE）の転写制御下のアデノウイルス遺伝子を含む、アデノウイルスベクター。２．前記アデノウイルス遺伝子がウイルス複製に必須である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。３．前記アデノウイルス遺伝子が初期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。４．前記アデノウイルス遺伝子が後期遺伝子である、請求項２に記載のアデノウイルス。５．前記アデノウイルス初期遺伝子がE1Aである、請求項３に記載のアデノウイルスベクター、６．前記アデノウイルス初期遺伝子がE1Bである、請求項３に記載のアデノウイルスベクター。７．前記アデノウイルス遺伝子がアデノウイルス死タンパク質遺伝子（ADP）である、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。８．前記CEA-TREが癌胎児性抗原遺伝子由来のエンハンサーを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。９．前記CEA-TREが癌胎児性抗原遺伝子由来のプロモーターを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１０．前記CEA-TREが癌胎児性抗原遺伝子由来のプロモーターおよび癌胎児性抗原遺伝子由来のエンハンサーを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１１．前記CEA-TREが配列番号１の約313〜約472のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１２．前記CEA-TREが配列番号１の約104〜約472のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１３．前記CEA-TREが配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１４．請求項１に記載のアデノウイルスを含む、組成物。１５．薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。１６．少なくとも１つのさらなるCEA-TREの転写制御下にある、少なくとも１つのさらなるアデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。１７．請求項１６に記載のアデノウイルスを含む、組成物。１８．薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。１９．癌胎児性抗原転写調節エレメント（CEA-TRE）の転写制御下にある異種遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。２０．前記異種遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１９に記載のベクター。２１．前記異種遺伝子が条件的に細胞生存に必要とされる、請求項１９に記載のベクター。２２．請求項１に記載のアデノウイルスベクタで形質転換された、宿主細胞。２３．請求項１６に記載のアデノウイルスベクターで形質転換された、宿主細胞。２４．CEA-TREが生物学的サンプル中で機能することを許容する細胞を検出する方法であって、該方法は： CEA-TREを機能させる細胞において、CEA-TRE媒介性遺伝子発現に適切な条件下で、生物学的サンプルを、請求項１に記載のアデノウイルスベクターと接触させる工程；および CEA-TREが該生物学的サンプル中で遺伝子発現を媒介するか否かを決定する工程、を包含し、ここで、CEA-TRE媒介性遺伝子発現はCEA-TREを機能させる細胞の存在の指標である、方法。２５．CEA-TREを機能させる細胞に特異的なアデノウイルスの増殖方法であって、該方法は、請求項１に記載のアデノウイルスを、CEA-TREを機能させる細胞と合わせ、それによって、該アデノウイルスが増殖される工程を包含する、方法。２６．CEA-TREを機能させる細胞に特異的なアデノウイルスを増殖する方法であって、該方法は、請求項１６に記載のアデノウイルスを、CEA-TREを機能させる細胞と合わせ、これによって、該アデノウイルスが増殖される工程を包含する、方法。２７．標的細胞の遺伝子型を改変するための方法であって、該方法は、CEA-TRE を機能させる細胞と、請求項１に記載のアデノウイルスベクターとを接触させる工程であって、該ベクターを該細胞に侵入させる工程を包含する、方法。２８．標的細胞の遺伝子型を改変するための方法であって、該方法は、CEA-TRE を機能させる細胞と、請求項１６に記載のアデノウイルスベクターとを接触させる工程であって、該ベクターを該細胞に侵入させる工程を包含する、方法。２９．標的細胞に選択的な細胞傷害性を与えるための方法であって、該方法は、 CEA-TREを機能させる細胞と、請求項１に記載のアデノウイルスベクターとを接触させる工程であって、該ベクターは該細胞に侵入する工程を包含する、方法。３０．標的細胞に選択的な傷害性を与えるための方法であって、該方法は、CEA- TREを機能させる細胞と、請求項１６に記載のアデノウイルスベクターとを接触させる工程であって、該ベクターは該細胞に侵入する工程を包含する、方法。３１．個体においてCEA関連腫瘍を処置する方法であって、請求項２に記載の有効量のアデノウイルスベクターを該個体に投与する工程を包含する、方法。３２．前記アデノウイルス遺伝子が初期遺伝子である、請求項３１に記載の方法。３３．前記アデノウイルスがマスキング剤と複合体化される、請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルス。３４．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項３３に記載のアデノウイルス。３５．前記PEGが約2500と約30,000との間の分子量のPEGである、請求項３４に記載のアデノウイルス。３６．前記PEGが約3000と約20,000との間の分子量のPEGである、請求項３５に記載のアデノウイルス。３７．前記PEGが約5000と約10,000との間の分子量のPEGである、請求項３６に記載のアデノウイルス。３８．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合する、請求項３４に記載のアデノウイルス。３９．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合する、請求項３４に記載のアデノウイルス。４０．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合する、請求項３８に記載のアデノウイルス。４１．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項４０に記載のアデノウイルス。４２．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項４１に記載のアデノウイルス。４３．マスクされたアデノウイルスを作製する方法であって、マスキング剤をアデノウイルスに共有結合させ、ここで該マスキング剤は約2500と約20,000との間の分子量を有し、それによりマスクされたアデノウイルスを生成する工程を包含する、方法。４４．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項４４に記載の方法。４５．マスキング剤と複合体化された、アデノウイルス。４６．前記マスキング剤がポリエチレングリコール（PEG）である、請求項４５に記載のアデノウイルス。４７．前記PEGが約2500と約30,000との間の分子量のPEGである、請求項４６に記載のアデノウイルス。４８．前記PEGが約3000と約20,000との間の分子量のPEGである、請求項４６に記載のアデノウイルス。４９．前記PEGが約5000と約10,000との間の分子量のPEGである、請求項４６に記載のアデノウイルス。５０．前記PEGが前記アデノウイルスに共有結合する、請求項４６に記載のアデノウイルス。５１．前記PEGが前記アデノウイルスに非共有結合する、請求項４６に記載のアデノウイルス。５２．前記PEGが、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルを使用することにより共有結合される、請求項５０に記載のアデノウイルス。５３．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルが、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルスクシンアミド、およびスクシンイミジルプロピオネートからなる群より選択される、請求項５２に記載のアデノウイルス。５４．前記N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)活性エステルがスクシンイミジルスクシネートである、請求項５３に記載のアデノウイルス。