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JP2002513274A - Unique sequence of Kaposi's sarcoma-associated virus and its use - Google Patents

Unique sequence of Kaposi's sarcoma-associated virus and its use

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Publication number
JP2002513274A
JP2002513274A JP50910598A JP50910598A JP2002513274A JP 2002513274 A JP2002513274 A JP 2002513274A JP 50910598 A JP50910598 A JP 50910598A JP 50910598 A JP50910598 A JP 50910598A JP 2002513274 A JP2002513274 A JP 2002513274A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
kshv
polypeptide
sarcoma
kaposi
Prior art date
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Pending
Application number
JP50910598A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
チャング、ユアン
ボーエンツキー、ロイ・エー
ラッソ、ジェイムズ・ジェイ
エデルマン、イジドーア・エス
ムーア、パトリック・エス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Columbia University in the City of New York
Original Assignee
Columbia University in the City of New York
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Publication date
Priority claimed from US08/686,243 external-priority patent/US5863787A/en
Priority claimed from US08/687,253 external-priority patent/US5854418A/en
Priority claimed from US08/686,350 external-priority patent/US5831064A/en
Priority claimed from US08/686,349 external-priority patent/US5861500A/en
Priority claimed from US08/708,678 external-priority patent/US5859225A/en
Priority claimed from US08/728,323 external-priority patent/US5948676A/en
Priority claimed from US08/747,887 external-priority patent/US5853734A/en
Priority claimed from US08/748,640 external-priority patent/US5854398A/en
Priority claimed from US08/757,669 external-priority patent/US6183751B1/en
Application filed by Columbia University in the City of New York filed Critical Columbia University in the City of New York
Publication of JP2002513274A publication Critical patent/JP2002513274A/en
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は、KSHVの単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、このペプチドに対して特異的な抗体を提供する。アンチセンスで且つトリプレックスのオリゴヌクレオチド分子もまた提供される。本発明は、カポシ肉腫（ＫＳ）のためのワクチンを提要する。本発明は、ＫＳに関して対象を予防接種し、予防し、診断し、治療する方法と、カポシ肉腫関連ＤＮＡウイルスの細胞内での発現を検出する方法とを提供する。   (57) [Summary] The present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) polypeptide. The present invention provides an isolated polypeptide of KSHV. The present invention provides antibodies specific for this peptide. Antisense and triplex oligonucleotide molecules are also provided. The present invention provides a vaccine for Kaposi's sarcoma (KS). The present invention provides methods of vaccinating, preventing, diagnosing, and treating subjects for KS, and detecting intracellular expression of a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus.

Description

【発明の詳細な説明】 カポジ肉腫関連ウイルスのユニークな配列およびその使用 本明細書に開示される発明は、疾病管理・防止センターからの共同研究協定CC U210852および保険社会福祉省の国立衛生研究所、国立癌研究所承認CA67391の下 で、政府の援助を受けてなされたものである。従って、米国政府は本発明におい て一定の権利を有する。 本願の全体を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字によって参照され る。これらの刊行物に関する完全な書誌的引用は、発明の詳細な記載の末尾に掲 載してある。本明細書に引用される全ての刊行物の開示は、本発明が属する技術 の状況を更に十分に記載するために、全体として本明細書の一部をなす参照とし て本願に組み込まれる。 〔発明の背景〕 カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、カポジ肉腫（ＫＳ）を引き 起こすと考えられる新たなヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶＳ）である。 カポジ肉腫は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者に生じる最も一般的 な腫瘍である。ＡＩＤＳ患者のおよそ15〜20％において、免疫適格者には希にし か生じないこの腫瘍が発生する。疫学的証拠は、ＡＩＤＳ関連のＫＳ（ＡＩＤＳ −ＫＳ）が感染性の病因を有していることを示す。ゲイやバイセクシャルのＡＩ ＤＳ患者は、血友病のＡＩＤＳ患者に比較して略20倍もＫＳを発生し易く、ＫＳ はＡＩＤＳに罹ったゲイ男性の間の特異的な性習慣と関連していると考えられる 。ＫＳは、異性間性交渉若しくは非経腸的ＨＩＶ感染によって感染した成人ＡＩ ＤＳ患者の間、または垂直ＨＩＶ感染によって感染した小児ＡＩＤＳ患者の間で は希である。これまでにＫＳを引き起こす疑いがある病原体としては、Ｂ型肝炎 ウイルス、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ） 、６型ヒトヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびマイコプ ラズマ・ペネトランス(Mycoplasma penetrans)が挙げられる。また、亜硝酸塩吸 収剤のごとき非感染性環境物質も、ＫＳ腫瘍形成における役割を果たすと提 案されてきた。しかしながら、これら何れの病原体についても、ＡＩＤＳ−ＫＳ との間の病因論的関連性は示されていない。 〔発明の要約〕 本発明は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）ポリペプチドをコー ドする単離された核酸分子を提供する。本発明はＫＳＨＶの単離されたポリペプ チド分子を提供する。本発明は、該ポリペプチドに対して特異的な抗体を提供す る。また、アンチセンスおよびトリプレックスオリゴヌクレオチド分子も提供さ れる。本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）に対するワクチンを提供する。本発明はＫ Ｓを持つ患者のワクチン接種、予防、診断および治療の方法、並びに細胞におけ るカポジ肉腫関連ＤＮＡウイルスの発現を検出する方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図 １： ＫＳＨＶゲノムにおける未記録の長い特異的領域（ＬＵＲ）および末端反復（ ＴＲ）。ＬＵＲ中、同定されたＯＲＦｓの方向は矢印の方向で示され、紺青色で 示されたＨＶＳに類似したＰＲＦｓと、淡青色で示された類似しないＯＲＦｓと を有する。非保存ブロック間領域（文字入りの）を伴う保存されたヘルペスウイ ルス遺伝子の７つのブロック（番号を付したもの）がキロ塩基マーカーの下に示 されているが、このブロックのナンバリング方式はＣｈｅｅ(Cheeら，1990，Cur r．Topics Microbiol．Tmmunol．154，125-169)による元の記載とは異なってい る。ＫＳＨＶゲノムをマッピングするために用いられる重複コスミド（Ｚプレフ ィックス）およびλ（Ｌプレフィックス）クローンが、ＫＳ病変部由来のＫＳ５ λファージクローンと比較され、下に示される。具体的に指定されていない特徴 および推定コーディング領域は、ＯＲＦマップの上に示されている。反復領域は 白線で示される（ｆｒｎｋ、ｖｎｃｔ、ｗａｋａ／ｊｗｋａ、ｚｐｐａ、ｍｏｉ 、ｍｄｓｋ）。推定コーディング領域および他の特徴（実験の詳細の部第１章を 参照のこと）はＯＲＦｓとして明示されないが、実線で示される。 図２Ａ−２Ｄ （図２Ａ）：Ｇ＋Ｃの高含量を示す末端反復単位（ＴＲ）の配列（配列番号： １６）。保存されたヘルペスウイルスｐａｃ１部位との類似性の高い配列が、イ タリック体で表示された特異的ｐａｃ１およびｐａｃ２配列との類似性の低い部 位と共に、下線で示されている。（図２Ｂ）：ＴＲ配列内で１回切断するＮｄｅ ＩＩを用いて消化し、次いでTR配列を含むプラスミドをプローブに用いて検出し た、ＢＣ−１（レーン１）、ＢＣＰ−１（レーン２）およびＫＳ病変部（レーン ３）由来ＤＮＡのサザンブロット。０．８ｋｂの強いハイブリダイゼーションバ ンドは、ＮｄｅＩＩで消化した単一ユニットＴＲの多重コピーを示す（図２Ｃ） 。ＢＣＰ−１およびＢＣ−１細胞株におけるＫＳＨＶのゲノム構造の模式図（図 ２Ｃ）は、（図２Ｂ）および（図２Ｄ）で示されたデータに一致する。Ｔａｑｌ （Ｔ）部位はＴＲ領域に隣接し、ＮｄｅＩＩ（Ｎ）部位はＴＲ内にある。下のケ ースのｔｒは、特異的領域の右末端で欠失切断されたＴＲユニットをいう。ＤＲ は、ＴＲ内に埋め込まれたＬＵＲの重複領域を示す。（図２Ｄ）：ＴＲ内で切断 しないＴａｑ Ｉで消化したＢＣ−１（レーン１）、ＢＣＲ−１（レーン２）、 ＫＳ病変部（レーン）およびＨＢＲ−６（レーン４）に由来するＤＮＡの、ＴＲ プローブとのサザンブロットハイブリダイゼーション。ＢＣ−１（レーン１）お よびＨＢＲ−６（レーン４）の双方に由来するＴａｑ−１消化ＤＮＡは、同様の ＴＲハイブリダイゼーションパターンを示しており、このことはＴＲ領域への特 異的配列の挿入が同一であることを示唆している（この配列決定研究が証明して いるのは、ＬＵＲの複製部分である：実験の詳細の部を参照のこと）。ＢＣＰ− １ＴＲハイブリダイゼーション（レーン２）は、溶菌複製に起因して、この細胞 株内における可変ＴＲ領域長を有するウイルス集団に一致したラダリングを示す 。ＫＳ病変部ＤＮＡ（レーン３）にＴＲラダリングが見られないことは、クロー ン性ウイルスの集団が腫瘍内に存在することを示唆する。 図３Ａ−３Ｃ： 対応のヒト細胞シグナリング経路ポリペプチド配列に対する、ＫＳＨＶがコー ドするポリペプチド配列のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ整列。図３Ａ：２種のＫＳＨＶＭ ＩＰ様ポリペプチド（ｖＭＩＰ−ＩおよびｖＭＩＰ−ＩＩ）を、ヒトＭＩＰ−１ α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳと比較している。ｖＭＩＰ−Ｉに対する アミノ酸の一致が黒色反転の陰付けによって示され、ｖＭＩＰ−ＩＩ単独に対す るアミノ酸の一致が灰色反転の陰付けにより示され、またＣ−Ｃ二量体モチーフ がイタリックで表示されている。両方のＫＳＨＶ ＭＩＰ遺伝子は、比較的保存 程度が低い１９残基のＮ−末端疎水性分泌リーダー配列をコードする（ｖＭＩＰ −Ｉもまた、ケモカインジシステインモチーフとの類似性を持たない疎水性リー ダー配列中に第二のＣ-Ｃ二量体を持つ）。ｖＭＩＰ−Ｉに対する可能性あるＯ −結合グリコシル化部位（ギャップ部位２２および２３）はｖＭＩＰ−ＩＩ内に は存在せず、これはｖＭＩＰ−Ｉには見られない可能な推定セリングリコシル化 部位（５１位）を一つしか持たない。図３Ｂ：ヒトＩＬ−６に対するＫＳＨＶ ｖＩＬ−６の整列比較。図３Ｃ−１および３Ｃ−２：イタリック体のＩＣＳＢＰ およびＩＳＧＦ３について、推定ＩＣＳ結合トリプトファン（Ｗ）を伴うヒトＩ ＣＳＢＰおよびＩＳＧＦ３に対するＫＳＨＶ ｖＩＲＦポリペプチドの整列比較 。 図４Ａ−４Ｆ ＴＰＡとの４８時間のインキュベーションを伴った、または伴わないＢＣＰ− １およびＢＣ−１細胞から抽出された全ＲＮＡ、およびＴＰＡインキュベーショ ン後の対照Ｐ３ＨＲ１細胞から抽出された全ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼー ション。４種全ての遺伝子（図４Ａ、ｖＭＩＰ−Ｉ；図４Ｂ、ｖＭＩＰ−ＩＩ； 図４Ｃ、ｖ１Ｌ−６；図４Ｄ、ｖＩＲＦ）はＴＰＡ誘導性であるが構成的であり 、ｖＩＬ−６（図４Ｃ）およびｖＩＲＦ（図４Ｄ）の発現が誘導されないことは また、ＢＣＰ−１およびＢＣ−１に対して、またＢＣＰ−１に対するｖＭＩＰ− １についても明白である（図４Ａ）。ヒトβ−アクチンプローブとの典型的ハイ ブリダイゼーション（図４Ｅ−４Ｆ）は、細胞調製物についての比較可能なＲＮ Ａ負荷を示す。 図５Ａ−５Ｂ： 図５Ａ。ＴＰＡ誘導を用いまたは用いないＢＣＰ−１、ＢＣ−１、Ｐ３ＨＲ１ 細胞株の細胞ライゼート（レーン１−６）、１μｇヒトｒＩＬ−６（レーン７） 、並びに濃縮ＣＯＳ７ ｒｖＬＩ−６および６−ＬＩＶ上清（レーン８−９）に 対する、ｖＩＬ−６のアミノ酸配列、即ちＴＨＹＳＰＰＫＦＤＲ（配列番号：２ ）およびＰＤＶＴＰＤＶＨＤＲ（配列番号：３）から作製されたウサギ抗ペプチ ド 抗体のイムノブロット。抗ｖＩＬ−６抗体は、組換え体の上清および細胞株の双 方において、ウイルス性ＩＬ−６ポリペプチドを特異的に認識するが、ヒトＩＬ −６は認識しない。ＢＣＰ−１細胞株は低レベルのｖＬＩ−６を構成的に発現す るのに対して、ポリペプチド発現はＢＣ−１（ＫＳＨＶおよびＥＢＶ同時感染） およびＢＣＰ−１（ＫＳＨＶ単独感染）の双方についてＴＰＡ処理の際に増加し 、このことは溶菌相発現であることを示す。免疫感作させたウサギ由来の前免疫 血清は、イムノブロッティングに際して何れの調製物とも反応しなかった。図５ Ｂ：抗ｈｕＩＬ−６モノクローナル抗体は、細胞に結合したｖＩＬ−６または組 換えｖＩＬ−６調製物とは交差反応しない。 図 ６ ｒｈｕＩＬ−６の連続希釈液（黒四角）、並びにｒｖＩＬ−６（黒丸）および ｒ６−ＬＩｖ（白抜き四角）のＣＯＳ７上清または対照ＬａｃＺ（白抜き丸）ｐ ＭＥＴ７トランスフェクションを用いた、ＩＬ−６依存Ｂ９マウスプラスマ細胞 腫細胞3Ｈ−チミジン取り込みに関する用量反応曲線。このトランスフェクショ ンロット由来の未希釈ｒｖＩＬ−６上清は、ｈｕＩＬ−６＞０．０２ｎｇ／ｍｌ と同様のＢ９増殖活性を示すのに対して、逆構築体（ｒ６−ＬＩｖ）およびＬａ ｃＺ対照は、Ｂ９を誘導する能力の増大を示さない。１：１よりも高い希釈率で 濃縮された上清は、ＣＯＳ７コンディショニング因子の濃縮に起因して、増大し た活性を有する可能性がある。 図７Ａ−７Ｆ： ヘマトキシリン対比染色（青）を伴って、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン−ペル オキシダーゼ複合体（褐色）を用いた、１００倍での局在化されたウサギ抗ｖＩ Ｌ−６ペプチド抗体活性は、ＫＳＨＶ感染した細胞株と組織の双方においてｖＩ Ｌ−６の産生を示している。ＫＳＨＶ感染細胞株ＢＣＰ−１（図７Ａ）は顕著な 細胞質ｖＩＬ−６の局在化を示すが、対照ＥＢＶ感染細胞株Ｐ３ＨＲ１（図７Ｂ ）はこのような局在化を示さない。（図７Ｃ）：ＡＩＤＳ−ＫＳ病変部由来の紡 錘体形成細胞におけるｖＩＬ−６の細胞質局在化。８種類のＫＳ病変部のうちの １つだけが、容易に確認できる細胞の副次集団のｖＩＬ−６染色を有していた。 これに対し、非ＡＩＤＳであるＥＢＶ陰性ＰＥＬ由来のペレット状リンパ腫細胞 の大多数は、強いｖＩＬ−６染色を有していた（図７Ｄ）。対照血管肉腫（図７ Ｄ）または多発性ミエローマ組織（図７Ｆ）では免疫染色は見られない。 図８Ａ−８Ｄ： 抗ｖＩＬ−６および細胞表面抗体の二重抗体標識。ｖＩＬ−６を用いたＣＤ34 およびＣＤ20双方の同時局在化の例が、ＫＳ病変部で認められた。図８Ａ：ＣＤ 34（赤色）およびｖＩＬ−６は、ＫＳ紡錘体細胞（矢印）に局在化する（青色） 。紫色の着色は重なったクロマゲン染色（１００倍）によるものである。図８Ｂ ：カポジ肉腫細胞を発現するｖＩＬ−６（赤色）に対する、ＣＤ45共通白血球抗 体染色（青色、矢印）（１００倍）。図８Ｃ：ＫＳに罹患した患者由来のリンパ 節において、多くのｖＩＬ−６産生造血細胞（赤色）を示す低倍率写真（２０倍 ）。矢印は最も顕著な染色細胞だけを示す。核はヘマトキシリンで対比染色した 。図８Ｄ：ＡＩＤＳ−ＫＳ患者のリンパ節における、ｖＩＬ−６を用いたＣＤ20 の同時局在化（褐色、矢印）（１００倍）。図９ ｖＭＩＰ−Ｉの存在または不在下における、原発性のＮＳＩ ＳＦ１６２株な らびにＭ２３ ＨＩＶ−１株およびＨＩＶ−２株ＲＯＤ／ＢによるＣＣＣ／ＣＤ ４細胞感染の定量。ＣＣＣ／ＣＤ４細胞は、ＣＣＲ５単独、ＣＣＲ５およびエン プティーｐＭＥＴ７ベクター、ＣＣＲ５プラスｐＭＥＴ７ベクター中のｖＭＩＰ −Ｉ、またはＣＣＲ５プラス逆配向Ｉ−ＰＩＭｖで一時的に同時トランスフェク トされた。各々のレトロウイルスと共に72時間インキュベーションしたの結果が 、ＣＣＲ５単独でトランスフェクトされた細胞に対する病巣形成単位のパーセン テージとして表示される。順配向のｖＭＩＰ−Ｉ構築体は、ＮＳＩ ＨＩＶ−１ の増殖を阻害したが、ＨＩＶ−２の増殖は阻害せず、これに対して逆配向のＩ− ＰＩＭｖ構築体は何れのレトロウイルスの増殖に対しても効果をもたなかった。 〔発明の詳細な説明〕定義 本明細書の全体を通して、特定のヌクレオチドを示すために以下の標準的な略 語を用いる： Ｃ＝シトシン Ａ＝アデノシン Ｔ＝チミジン Ｇ＝グアノシン 本明細書で用いる場合、「核酸」とは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤ ＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＤＮＡまたはＲＮＡの何れ かをいう。本明細書で用る場合、「ゲノムの」とは、単離された核酸分子のコー ディング領域および非コーディング領域の双方を意味する。「核酸配列」とは、 ５’末端から３’末端へ読みとられるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボ ヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーをいう。それは自己複製プラス ミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーと、非機能的なＤＮＡまたはＲＮＡ との双方を含む。 本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」とは、核酸によってコードされ る完全長の遺伝子産物またはその一部の何れかをいう。かくして、「ポリペプチ ド」には完全長の蛋白質だけでなく、長さが５０アミノ酸残基未満の短いペプチ ドを含む部分長の断片も含まれる。 「ＳＳＣ」の用語は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭクエン酸ナト リウムのクエン酸塩−食塩水溶液をいう。溶液は、しばしばこの濃度の倍数また は分数として表される。例えば、６ＸＳＳＣは、この６倍の塩化ナトリウム濃度 およびクエン酸ナトリウム濃度、すなわち０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび１２０ ｍＭクエン酸ナトリウムを有する溶液をいう。０．２ＸＳＳＣは、０．２倍ＳＳ Ｃ濃度の溶液、すなわち０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび４ｍＭクエン酸ナトリ ウムをいう。 「選択的にハイブリダイズする」および「特異的ハイブリダイゼーション」の 語句は、標的配列が全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの調製物中に存在する場合に、核 酸プローブが特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズすること、二 重らせんを形成すること、または結合することをいう。選択的にハイブリダイズ するとは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件下で、非標的 配列とは違った様式で、プローブが検出可能な様式で所与の標的と結合すること を意味する。 「相補的」核酸配列または「標的」核酸配列とは、核酸プローブに選択的にハ イブリダイズする核酸配列をいう。好ましいアニーリング条件は、例えば、プロ ーブの長さ、塩基組成、並びにプローブのミスマッチの数およびその位置に依存 し、ほとんどの場合経験的に決定される。核酸プローブ設計およびアニーリング 条件の考察に関しては、例えば、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Labo ratory Manual（第２版），Cold Spring Harbor Laboratory，Vols．1-3または ，Ausubel，F.ら(1987)Current Protocols in Nlolecular Biology，New Yorkを 参照されたい。 「コードする核酸分子」とは、特定のポリペプチドの発現を指令する核酸分子 をいう。該核酸分子の配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、相補的ＤＮ Ａ鎖、および蛋白質に翻訳されるＲＮＡ配列が含まれる。該核酸分子には、完全 長の核酸配列並びに非完全長の配列の双方が含まれる。さらに、該配列は天然の 配列または複数配列の縮重コドン（これは特定の宿主細胞におけるコドン選択を 与えるために導入され得る）を含むことが理解される。 核酸プローブが問題の標的微生物に対して「特異的」であるというのは、検出 されたときに、その標的微生物が、蛋白質および他の生物的物質の不均一な集団 の存在下で、該微生物の存在の決定因子である核酸配列を含む場合である。特異 的核酸プローブは、当該微生物の決定因子である配列の一部に対してターゲッテ ィングされ、他の配列、特に病原体を検出すべき宿主の配列とはハイブリダイズ しないであろう。 「発現カセット」とは、かかる配列と適合し得る宿主において、構造遺伝子の 発現に影響を与えることができる核酸配列をいう。かかるカセットは、少なくと もプロモーターおよび所望により転写終結シグナルを含む。また、発現を生じる のに必要な、または発現を補助する付加的因子もまた、本明細書に記載したごと くに使用してよい。 「作動可能に連結する」とは、本明細書で用いる場合、そのプロモーターがＤ ＮＡ配列の転写を仲介するように、ＤＮＡ配列から上流にプロモーターを連結す ることをいう。 「ベクター」とは、ウイルス性の発現系、および自律的な自己複形の環状ＤＮ Ａ（プラスミド）をいい、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方を含む 。組換え微生物または組換え細胞培養体が「発現ベクター」を宿していると記載 されている場合、これは染色体外の環状ＤＮＡおよび宿主染色体に組み込またＤ ＮＡの双方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、該ベクターは 、自律的構造として有糸分裂中に細胞によって安定して複製されてもよく、また は宿主のゲノム内に組み込まれてもい。 「プラスミド」とは、細胞内で複製可能な自律的な環状ＤＮＡ分子をいい、発 現型および非発現型の双方を含む。組換え微生物または組換え細胞培養体が「発 現プラスミド」を宿していると記載されている場合、これは宿主の染色体に組み 込まれた潜在的ウイルスＤＮＡを含む。プラスミドが宿主細胞によって維持され る場合、該プラスミドは、自律的構造として有糸分裂中に細胞によって安定して 複製されてもよく、または宿主のゲノム内に組み込まれてもよい。 「組換え蛋白質」または「組換えにより産生された蛋白質」とは、非天然細胞 を用いて産生されたポリペプチドをいう。該細胞は適切な核酸配列の組み込みに より遺伝的に改変されているので、該蛋白質を産生する。 ２以上の核酸分子配列関係を記載するために、以下の用語が用いられる：「対 照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合（％）」 および「実質的同一性」。「対照配列」は、配列比較のための基礎として用いら れる定義された配列であり、対照配列はより大きな配列のサブセット、例えば配 列一覧表の中に与えられた完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントであっ てもよいし、または完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列から構成されていてもよ い。 比較ウインドウの配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman(1981)Adv．Appl ．Math．2:482のアルゴリズムよって、NeedlemanおよびWunsch(1970)J．Mol．Bi ol．48:443のアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman(1988)Proc．Natl．A cad．Sci．85.2444の類似性のための検索方法、またはこれらのアルゴリズムの コンピュータ化装置(GAP，BESTFITPackage Release 8.0，Genetics Computer Gr oup，575 Science Dr.，Madison，WI)によって行われる。 ポリペプチドに対して適用される場合、「実質的同一性」または「実質的配列 の同一性」とは、２つのペプチド配列が、デフォールトギャッブを用いたＧＡＰ またはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適に整列された場合に、少なくとも９０％の 配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、さらに好ましくは少な くとも９９％を超える配列同一性を共有することを意味する。 「アミノ酸の同一性の割合（％）」または「アミノ酸配列の同一性の割合（％ ）」とは、最適に整列された場合に、ほぼ示された割合（％）の同一のアミノ酸 を有する２つのポリペプチドのアミノ酸の類似性をいう。例えば、「９５％のア ミノ酸の同一性」とは、最適に整列された場合に、９５％のアミノ酸の同一性を 持つ２つのポリペプチドのアミノ酸の類似をいう。同一でない残基の位置は、保 存性アミノ酸置換基によって異なることが望ましい。例えば、電荷や極性のごと き類似の化学的特性を持つアミノ酸の置換基は、恐らく蛋白質の特性に影響を与 えないであろう。その例としては、アスパラギンに対するグルタミン、またはア スパラギン酸に対するグルタミン酸が挙げられる。 「実質的に精製された」または「単離された」とは、ヘルペスウイルスポリペ プチドに関していう場合、他の細胞内成分を実質的に含まない化学組成物を意味 する。それは乾燥物または水溶液の何れであってもよいが、均一な状態であるこ とが好ましい。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動もしくは高速液体クロマトグラフィーのごとき分析化学的技術を用いて求め られる。調製物に存在する優勢種である蛋白質は、実質的に精製されている。一 般的に、実質的に精製されまたは単離された蛋白質は、その調製物中に存在する 全てのマクロ分子種の８０％以上を含むであろう。該蛋白質が９５％以上になる まで精製されるのがより好ましく、他の高分子種が常法により検出されない、実 質的に均一な状態にまで精製されるのが最も好ましい。 「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性の」とは、ポリペプ チドに関していう場合、ポリペプチドおよびＫＳＨＶ以外のウイルスを含む他の 生物製剤の不均一な集団の存在下において、本発明のＫＳＨＶポリペプチドが存 在することを決定付ける結合反応をいう。かくして、指定されたイムノアッセイ 条件の下で、同定された抗体はＫＳＨＶ抗原に結合し、また試料中に存在する他 の抗原とは有意な量では結合しない。 かかる条件下における抗体との「特異的結合」には、特定の抗原に対する特異 性について選択された抗体が要求されると考えられる。例えば、本明細書で記載 されたＫＳＨＶ抗原に対して作出された抗体を選択して、ＫＳＨＶポリペプチド との特異的な免疫反応性を有し、他のポリペプチドとは免疫反応性をもたない抗 体を得ることができる。 本明細書で用いられる場合、「生物学的試料」とは、生命のある生物または死 亡した生物に由来する如何なる試料をもいう。生物学的試料の例としては、体液 および組織標本が挙げられる。 特定の配列リストに言及する場合、かかる言及は、当該リストに実質的に相当 する配列（少数の配列決定エラー、単一の塩基の変化、欠失、置換などに関する 許容をも含む）およびその相補体を含み、かかる配列変化は、関連の配列リスト が関与する病原微生物または疾病マーカーの核酸配列に相当することを、当業者 は容易に理解するであろうし、これは本明細書の意図するところである。 Ｉ．ＫＳＨＶ由来の核酸分子 本発明はカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Kaposi's sarcoma-associated he rpesvirus；ＫＳＨＶ）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供す る。 １つの態様において、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分子 は、ジーンバンク受付番号(Genebank Accession Number)Ｕ７５６９８に示され るごとき核酸配列を有し、その開始コドンおよび停止コドンは表１に示される。 もう１つの態様において、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分 子は、ジーンバンク受付番号Ｕ７５６９８に示される核酸配列の翻訳によって定 義されたアミノ酸配列を有し、その開始コドンおよび停止コドンは表１に示され る。 １つの態様において、ＫＳＨＶポリペプチドについて単離された核酸分子は、 ＡＴＧ開始コドンの上流に、ジーンバンク受付番号Ｕ７５６９８に示されるごと き５’非翻訳配列を有する。もう１つの態様において、ＫＳＨＶポリペプチドに ついて単離された核酸分子は、停止コドンの下流に、ジーンバンク受付番号Ｕ７ ５６９８に示されるごとき３’非翻訳配列を有する。 １つの態様において、単離された核酸分子はゲノムＤＮＡである。もう１つの 態様において、単離された核酸分子はｃＤＮＡである。またもう１つの態様にお いて、ＲＮＡは該単離された核酸分子に由来するか、または該単離された核酸分 子とハイブリダイズする能力を有する。 さらに、前記核酸分子は、限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキ ンリンパ腫、リンパ性白血病、リンパ肉腫、脾腫、細網肉腫、セザリー症候群、 菌状息肉腫、中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連中枢神経系リンパ腫、移植後リ ンパ組織増殖性障害、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ組織増殖性障害と 関連していると考えられる。リンパ組織増殖性障害は、リンパ節、リンパ球様組 織および他の器官に含まれるリンパ球の制御されないクローン性またはポリクロ ーン性の増殖として特徴付けられる。 Ａ．ＫＳＨＶの単離および増殖 ＫＳＨＶはイン・ビトロで増殖できる。例えば、ヘルペスウイルスを増殖させ る方法が文献（Ablashiら，in Virology 184，545-552）に記載されている。概 略を説明すれば、ＰＨＡに刺激される臍帯血球細胞、マクロファージ、神経細胞 または神経膠細胞株を、脳脊髄液、血漿、抹消血液白血球、またはウイルス感染 細胞もしくは精製ウイルスを始めとする組織抽出物と共に培養する。感染に先立 ち、該受容細胞を５μｇ／ｍｌポリブレン(polybrene)を用いて３７℃で２時間 処理する。形態的変化を示すと共に、ウイルス抗原に対し陽性になることによっ て、感染細胞が確認される。 ＫＳＨＶを単離するには、該ウイルスを遠心分離により細胞培養液から直接回 収されるか、或いは、感染細胞を回収し、ホモジナイズするかまたは溶菌し、次 いでウイルスを細胞残渣から単離し、標準法である等密度帯ショ糖密度勾配遠心 分離により精製される。 当業者は、以下のプロトコールを用いてＫＳＨＶを単離し、次いで増殖させて もよい。ＫＳＨＶに感染したＢリンパ系細胞株（例えば、ＲＣＣ−１、ＨＢＬ− ６またはＢＣＢＬ−１）長期樹立は、体腔ベースのリンパ腫および標準法を用い て達成される(Glick，1980，Fundamentals of Human Lymphoid Culture，Marcel Dekker，New York;Knowlesら，1989，Blood 73，792-798;Metcalf，1984，Clon al Culture of Hematopoetic Cells;Techniques and Applications,Elsevier，N ew York）。 感染した生細胞を含む新鮮リンパ腫組織を濾過して、単一細胞懸濁物を樹立す る。フィコール−プラーク遠心分離により細胞を分離し、次いでリンパ球層を取 り出す。次いで該リンパ球を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ1640のご とき標準リンパ球組織培養培地へ、１×１０ε細胞／ｍｌを超える密度で移す。 ＫＳＨＶを含んだ不死化したリンパ球は培地中で無期限に増殖するが、非不死化 細胞は長期の培養過程の間に死滅する。 さらに、ＫＳＨＶは、感染維持細胞株に由来するウイルスを１×１０6細胞／ ｍｌを超える密度で含む培地上清を除去することにより、新規の細胞株で増殖さ せてもよい。培地を２０００ｘｇで１０分間遠心分離し、次いで０．４５μフィ ルターを通して濾過して細胞を取り出す。培地を１：１容量で適用して、細胞を ４８時間で１×１０6細胞／ｍｌを超える密度で増殖する。細胞を洗浄し、ペレ ット状にして新鮮培地に移し、次いで１４日後にＫＳＨＶについて試験を行う。 ＫＳＨＶは以下の方法を用いて細胞株から単離してよい。感染細胞株を低浸透 圧ショックまたはドーンス均質化(Dounce homogenization)のごとき標準法を用 いて、或いは少容量（３ｍｌ未満）での解凍・冷凍反復サイクルを用いて溶菌さ せ、次いで２０００ｘｇで１０分間遠心分離してペレット状にする。上清を取り 出し、次いで１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、核およびオルガネラを 除去する。得られた低速での細胞フリー上清を０．４５μフィルターを通して濾 過し、次いで１００，０００ｘｇで１時間遠心分離してウイルスをペレット状に する。次いで、該ウイルスを洗浄し、再度ペレット状にする。標準法（例えば、 フェノール／クロロホルム）によって該ウイルスペレットからＤＮＡを抽出し、 次いで前記した特異的プローブを用いてサザンブロッティングおよび／またはＰ ＣＲによりＫＳＨＶの存在について試験する。 結合している全ビリオンについては、低速での細胞フリー上清が７％ＰＥＧ− ８０００を含むように調整する。ＰＥＧ−上清を、１０，０００ｘｇで３０分回 転させる。上清を流し出し、次いでペレットを回収し、少容量（１−２ｍｌ）の ウイルス緩衝液（ＶＢ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス、ｐＨ７．５） 中に再懸濁させる。ＶＢで作製した１０−１５％のショ糖密度勾配中において、 ２５，０００ｒｐｍでの遠心分離によりビリオンを単離する。標準法（例えば、 フラクショネーターを用いる）によって勾配の画分を得、次いで特異的ハイブリ ダイゼーションプローブを用いてドット・ブロッティングによって各画分を試験 し、精製ウイルスを含有する勾配画分を求める（該画分の調製はウイルスの存在 を検出するため、すなわち標準的ＤＮＡ抽出のために必要である）。 ＫＳＨＶゲノムを単離する方法は、Pellicerら，1978，Cell 14，133-141並び にGibsonおよびRoizmann，1972，J．Virol．10，1044-57に基づく。 ＫＳＨＶゲノムを単離する最終的な方法は、クランプ均一電場（ＣＨＥＦ）ゲ ル電気泳動である。アガロースプラグは、ＲＳＨＶで感染させた細胞を１％ＬＭ Ｐアガロース(Biorad)および０．９％ＮａＣｌ中に４２℃で再懸濁させて、最終 濃度を２．５ｘ１０7細胞／ｍｌとすることによって調製する。固化したアガロ ースプラグを溶菌緩衝液（０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１％ サルコシル、 プロテナーゼＫで最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）に移し、次いで２４時間インキュベー トする。約１０7個の細胞を各々のレーンに充填する。CHEF Mapper XAパルス電 場電気泳動装置(Biorad)上で、泳動時間を２８時間とし、６．０Ｖ／ｃｍの勾配 でゲルを泳動させ、サザンブロッティングを行い、ＫＳ６３１Ｂａｍ、ＫＳ３３ ０ＢａｍおよびＥＢＶ末端反復配列とハイブリダイズさせる。 ＫＳＨＶで感染させた新規な細胞株を作製するために、既に感染した細胞を、 ０．４５μフィルターで単離したＲａｊｉ細胞株と共に培養する。次いで、約１ −２ｘ１０6個の既に感染したＢＣＢＬ−１細胞および２ｘ１０6個のＲａｊｉ細 胞を、ＲＰＭＩ単独を補足した培地の中で、または２０ｎｇ／ｍｌ １２−Ｏ− テトラデカノールフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）と共に２−２０日 間培養する。２−２０日の共培養後、Ｒａｊｉ細胞を除去し、洗浄し、次いでＲ ＰＭＩ １６４０を補充した培地に移す。２０ｎｇ／ｍｌ ＴＰＡ中でＢＣＢＬ −１と共に２日間培養したＲａｊｉ培養物は生存し、１０週間を超える連続懸濁 培養でも維持される。ＲＣＣ−１(Raji Co-Culture，No.1)と名づけられたこの 細胞株は、複数回経過した後も、ＫＳＨＶ配列に関してＦＣＲ陽性のままである 。ＲＣＣ−１細胞は、ＫＳＨＶの溶菌増殖を暗示する急速な細胞分解を周期的に 行う。かくして、ＲＣＣ−１はＫＳＨＶで新たに感染したＲａｊｉ細胞株である 。 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、Ｒ ＣＣ−１およびＲＣＣ−１2F5を、１９９４年１０月１９日に、American Type C ulture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Marvland 20852 U.S.A のthe Patent Culture Depositoryに、各々ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１１７３４ およびＣＲＬ１１７３５として寄託した。特許手続上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約に従って、ＨＢＬ−６を（ＢＨＬ−６として）１９９ ４年１１月１８日に、アメリカン・タイプ・アンド・カルチャー・コレクション （American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Mar yland 20852 U.S.Aのthe Patent Culture Depository）に、ＡＴＣＣ受付番号Ｎ ｏ．ＣＲＬ１１７６２として寄託した。 Ｂ．ＫＳＨＶのハイブリダイゼーションプローブ 本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ75698、Ｕ75699、Ｕ75700で示されるご とき、単離した核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも １４個のヌクレオチドを有する核酸分子を提供する。 １つの態様において、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ75698で示される核酸分子は 、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする長い特異的領域（ＬＵＲ）を含む。もう１ つの態様において、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｕ75699で示される核酸分子は、プ ロトタイプ末端反復（ＴＲ）を含む。もう１つの態様において、ＧｅｎＢａｎｋ 受付番号Ｕ75700で示される核酸分子は、不完全末端反復（ＩＴＲ）を含む。 １つの態様において、該分子は８個〜３６個のヌクレオチドである。もう１つ の態様において、該分子は１２個〜２５個のヌクレオチドである。もう１つの態 様において、該分子は１４個のヌクレオチドである。 １つの態様において、該分子はＤＮＡである。もう１つの態様において、該分 子はＲＮＡである。 １つの態様において、該ＴＲ分子は、ＤＮＡの複製およびパッケージングに必 要なシス活性要素を含む。もう１つの態様において、該ＴＲ分子は遺伝子クロー ニングベクター中に含まれる。もう１つの態様において、該ＴＲ分子は遺伝子治 療ベクター中に含まれる。もう１つの態様において、該遺伝子治療ベクターはリ ンパ系細胞中で発現する。もう１つの態様において、該ＴＲは腫瘍のクローン性 を決定するための分子マーカーを含む。もう１つの態様において、該マーカーは 、診断上の分析において腫瘍の本来的ヒストリー(natural history)の決定的な 特徴を提供する。 本発明は、８０１ｂｐ ＫＳＨＶ ＴＲもしくはその一部を含むプラスミドまた は他の自己複製可能なＤＮＡ分子を含むＢ−リンパ栄養性ＤＮＡベクターを提供 する。 高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、規定したイオン強度 およびｐＨでの特異的配列のための熱融点（Ｔm）よりも約５℃低く選択されて いる。該Ｔmは、塩濃度の５０％がｐＨ７で少なくとも約０．０２モル（規定し たイオン強度およびｐＨ下での）であり、且つ少なくとも約６０℃の温度である 。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに著しく影響を及ぼし得る他の 因子として、特に、塩基組成および相補鎖のサイズ、有機溶媒の存在、すなわち 、塩またはホルムアミドの濃度、および塩基のミスマッチの程度が挙げられ、こ れらパラメーターの組み合わせの方が、何れか１つの絶対値よりも重要である。 例えば、６Ｘ ＳＳＣ溶液中において約６８℃で一晩ハイブリダイズさせ、室温 にて６Ｘ ＳＳＣ溶液で洗浄し、次いで約６８℃で０．６Ｘ ＳＳＣ溶液中で洗浄 することによって、高ストリンジェンシーを達成することができる。 中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、例えば、１）フ ィルタープレハイブリダイゼーションを行い、３Ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミ ド、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ ７．５）、５Ｘ デンハルト溶液の溶液を用 いてハイブリダイズさせ；２）３７℃で４時間のプレハイブリダイゼーションを 行い；３）３７℃において、全体で３，０００，０００ｃｐｍに等しい量の標識 プローブを用いて１６時間のハイブリダイゼーションを行い；４）ＳＳＣおよび ０．１％ ＳＤＳ溶液で洗浄し；５）室温で１分の洗浄を４回行い、６０℃で 夫々３０分間４Ｘ ＳＳＣ中で洗浄し；次いで６）乾燥およびフィルムに感光さ せることによって達成することができる。 核酸プローブ技術は当業者に周知であり、当業者は、かかるプローブの長さが 著しく変化することができ、また該プローブの検出を容易にするために放射性同 位体または蛍光染料のごとき検出可能な標識でラベルし得ることを容易に理解す ろであろう。ＤＮＡプローブ分子は、ＤＮＡウイルスの単離した完全長または断 片の核酸分子を有するＤＮＡ分子を、プラスミドまたはバクテリオファージのご とき適切なベクターに挿入し、次いで適切な細菌性宿主細胞へ形質転換させ、形 質転換した細菌性宿主細胞中で複製させ、当該分野において公知の方法を用いて 該ＤＮＡプローブを回収することによって生産すればよい。別法として、ＤＮＡ 合成装置により化学的にプローブを作製してもよい。 ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のごときバクテリオファージプロ モーターの下流に、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の全長または断片を挿 入することによって作製すればよい。標識したヌクレオチドを、適切なＲＮＡポ リメラーゼの存在下で、ＤＮＡウイルスの単離した核酸分子を線状化したものま たはその断片（上流にプロモーターを含む）と共にインキュベートすることによ り、多量のＲＮＡプローブを作製してもよい。 本明細書で定義したように、核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡ断片であって よい。ＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドＤＮＡを消化することによって、また はＰＣＲの使用によって調製してもよく、あるいは文献（BeaudageおよびCarrut hers，1981，Tetrahedron Lett．72，1859-1862）に記載されたホスホルアミダ イト法、または文献（Metteucciら、1981，Am．Chem．Soc．103:3185）に従うト リエステル法の何れかによって合成してもよい。次いで、所望により、適切な条 件下で化学的に合成された一本鎖と共にアニーリングすることにより、または適 切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成すること により、二本鎖断片を得てもよい。核酸プローブの特異的な配列が与えられた場 合、その相補鎖断片も決定され、本発明に含まれることが理解される。該相補鎖 は、標的が二本鎖核酸である状況の下で、同様に十分に作用すると考えられる。 核酸プローブを使用のために特定の配列が同定されれば、長さが２５塩 基対（ｂｐ）以上であるような、配列表記載の配列のサブ配列もまたプローブと しての使用に関して含まれることが理解される。 また、本発明の核酸分子には、１個以上のアミノ酸残基の同定または位置決定 の点からみて、天然に存在する形態とは異なる抗原性ポリペプチドのポリペプチ ド類縁体、断片または誘導体（ポリペプチドに対して指定した全部より少ない残 基を含む欠失類縁体、指定した１個以上の残基が他の残基によって置換されてい る置換類縁体および１個以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中央部 分に付加された付加類縁体）であって、かつ天然に存在する形態における性質の 幾つかまたは全てを共有している類縁体をコードする分子も含まれる。これらの 分子には、選択された非哺乳類宿主による発現のための「好ましい」コドンの組 み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の提供；および容易に発現 するベクターの構築を容易にするための、開始部の追加ＤＮＡ配列、末端部の追 加ＤＮＡ配列または中間部の追加ＤＮＡ配列の提供が含まれる。 Ｃ．ＫＳＨＶのポリペプチドおよびそれに対する抗体（Ａｂ’ｓ） 本発明は、単離したＫＳＨＶポリペプチド、即ち、表１および以下に列記した ポリペプチドを提供する。 本発明は、ウイルスのマクロファージ炎症性蛋白質III（ｖＭＩＰ−III）を構 成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、ｖＭ ＩＰ−IIIはオーファンサイトカイン(orphan cytokine)を構成する。もう１つの 態様において、ｖＭＩＰ−IIIはヌクレオチド２２，５２９−２２，１８５によ ってコードされる。もう１つの態様において、ｖＭＩＰ-IIIは抗炎症薬を構成す る。好ましい態様において、該薬剤は自己免疫障害の治療に有用である。最も好 ましい態様において、該薬剤は慢性関節リウマチの治療に有用である。 本発明は、ＯＲＦ２によってコードされるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ Ｒ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様におい て、ＤＨＦＲはＫＳＨＶヌクレオチド合成に関与する。もう１つの態様において 、ＤＨＦＲはウイルスの複製に必須な酵素（即ち、その阻害はウイルスの産生を 妨げる）を構成する。もう１つの態様において、ＤＨＦＲはサブユニットワクチ ン を構成する。もう１つの態様において、ＤＨＦＲは免疫学的分析のための抗原を 構成する。 もう１つの態様において、ＤＨＦＲは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する 。 もう１つの態様において、ＫＳＨＶ ＤＨＦＲは、細菌性ＤＨＦＲを阻害する ことが知られているサルファ剤によって阻害される。好ましい態様において、Ｋ ＳＨＶ ＤＨＦＲは、哺乳類のＤＨＦＲを阻害することが知られているメトトレ キセートまたはその誘導体によって阻害される。もう１つの態様において、該サ ルファ剤、メトトレキセートまたはその誘導体は、ＫＳＨＶの阻害について、ヒ トヘルペスウイルスに選択的である。 本発明は、ＯＲＦ７０によってコードされるチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を 含む、単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、ＴＳ は、ＫＳＨＶヌクレオチド代謝に関与する。もう１つの態様において、ＴＳは、 ウイルスの複製に必須な酵素（即ち、その阻害はウイルスの産生を妨げる）を構 成する。もう１つの態様において、ＴＳはサブユニットワクチンを構成する。も う１つの態様において、ＴＳは免疫学的分析のための抗原を構成する。 本発明は、ＯＲＦ９によってコードされるＤＮＡポリメラーゼを構成する単離 されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、ＤＮＡポリメラ ーゼはウイルスの複製に必須のな酵素（即ち、その阻害はウイルスの産生を妨げ る）を構成する。もう１つの態様において、ＤＮＡポリメラーゼはサブユニット ワクチンを構成する。もう１つの態様において、ＤＮＡポリメラーゼは免疫学的 分析のための抗原を構成する。 本発明は、ＯＲＦ３７によってコードされるアルカリエキソヌクレアーゼを構 成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、アル カリエキソヌクレアーゼは、ＫＳＨＶ ＤＮＡをウイルス粒子中にパッケージン グする。もう１つの態様において、アルカリエキソヌクレアーゼは、ウイルスの 複製に必須の酵素（即ち、その阻害はウイルスの産生を妨げる）を構成する。も う１つの態様において、アルカリエキソヌクレアーゼはサブユニットワクチンを 構成する。もう１つの態様において、アルカリエキソヌクレアーゼは免疫学的分 析のための抗原を構成する。 本発明は、各々ＯＲＦ４０、４１および４４によってコードされるヘリカーゼ ープライマーゼ、サブユニット１、２および３を含む、単離されたＫＳＨＶポリ ペプチドを提供する。１つの態様において、ヘリカーゼープライマーゼはウイル スのＤＮＡ複製に必須な酵素活性を有する。もう１つの態様において、ヘリカー ゼ−プライマーゼはヌクレオチド類縁体によって阻害される。もう１つの態様に おいて、ヘリカーゼ−プライマーゼは公知の抗ウイルス剤によって阻害される。 もう１つの態様において、ヘリカーゼ−プライマーゼの阻害はＫＳＨＶ複製を妨 げる。 本発明は、ＯＲＦ４６によってコードされるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ ＵＴＤＧ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様 において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ複製の間にＫＳＨＶのＤＮ Ａ修復に必須な酵素を構成する。もう１つの態様において、ウラシルＤＮＡグリ コシラーゼは公知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１つの態様において 、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼはサブユニットワクチンを構成する。もう１つ の態様において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは免疫学的分析のための抗原を 構成する。 本発明は、ＯＲＦ０６によってコードされる一本鎖ＤＮＡ結合性蛋白質（ＳＳ ＢＰ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様にお いて、ＳＳＢＰは、ＫＳＨＶのＤＮＡ複製に必須な酵素を構成する。もう１つの 態様において、ＳＳＢＰは公知の抗ウイルス剤によって阻害される。もう１つの 態様において、ＳＳＢＰはＤＮＡ増幅のための従来のＰＣＲ法におけるごときポ リメラーゼ反応のプロセシビティーを増強させる。 本発明は、ＯＲＦ３６によってコードされるウイルス性蛋白質キナーゼを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。もう１つの態様において、ウ イルス性蛋白質キナーゼは免疫学的分析のための抗原を構成する。もう１つの態 様において、ウイルス性蛋白質キナーゼはサブユニットワクチンを構成する。 本発明は、ＯＲＦ５０によってコードされる溶菌サイクルトランスアクチベー ター蛋白質（ＬＣＴＰ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する 。１つの態様において、ＬＣＴＰは生産的感染を潜伏状態から活性化するために 必 要とされる。もう１つの態様において、ＬＣＴＰは公知の抗ウイルス剤によって 阻害される。もう１つの態様において、ＬＣＴＰ発現の防止は、複製できない潜 伏状態にウイルスを維持する。 本発明は、リボヌクレオチドレダクターゼ（即ち、その小サブユニットおよび 大サブユニットが各々ＯＲＦ６０およびＯＲＦ６１によってコードされる２つの サブユニット酵素）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。も う１つの態様において、リボヌクレオチドレダクターゼは、ＤＮＡを複製するた めに、リボヌクレオチドのデオキシリボヌクレイチドへの変換を触媒する。もう １つの態様において、リボヌクレオチドレダクターゼは、細胞性リボヌクレオチ ドレダクターゼを発現しない最終分化された細胞において、公知の抗ウイルス剤 によって阻害される。もう１つの態様において、リボヌクレオチドレダクターゼ は免疫学的分析のための抗原を構成する。もう１つの態様において、リボヌクレ オチドレダクターゼはサブユニットワクチンを構成する。もう１つの態様におい て、リボヌクレオチドレダクターゼは、不死化された細胞株の樹立のための形質 転換剤を構成する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１によってコードされる蛋白質を含む単離したＫＳＨＶ ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４によってコードされる補体結合性蛋白質（ｖ−ＣＢＰ；Ｃ ＣＰ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７によってコードされる輸送蛋白質を構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ８によってコードされる糖蛋白質Ｂを構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１０によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１１によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ２によってコードされるウイルス性インターロイキン６ （ｖＩＬ−６）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの 態様において、ｖＩＬ−６を選択的に認識する抗体はリンパ腫間での識別を可能 にする。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ３によってコードされるＢＨＶ４−ＩＥ１ Ｉを構成す る単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ４によってコードされるｖＭＩＰ−ＩＩを構成する単離 されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、ｖＭＩＰ−ＩＩ は抗炎症薬を構成する。好ましい態様において、該薬剤は自己免疫障害の治療に 有用である。最も好ましい態様において、該薬剤は慢性関節リウマチの治療に有 用である。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ５によってコードされるＢＨＶ４−ＩＥ１ ＩＩを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ６によってコードされるｖＭＩＰ−Ｉを構成する単離さ れたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。１つの態様において、ｖＭＩＰ−Ｉは抗 炎症薬を含む。好ましい態様において、該薬剤は自己免疫障害の治療に有用であ る。最も好ましい態様において、該薬剤は慢性関節リウマチの治療に有用である 。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ７によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１６によってコードされるＢｃｌ−２を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１７によってコードされるキャプシッド蛋白質１を構成する 単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１８によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ１９によってコードされる外被蛋白質Ｉを構成する単離され たＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２０によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２１によってコードされるチミジンキナーゼを構成する単離 されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２２によってコードされる糖蛋白質Ｈを構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 １つの態様において、ＯＲＦ２３によってコードされる蛋白質を構成する単離 されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２４によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２５によってコードされる主要キャプシッド蛋白質を構成す る単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２６によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＩを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２７によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２８によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２９ｂによってコードされるパッケージング蛋白質ＩＩを構 成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３０によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３１によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３２によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３３によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ２９ａによってコードされるパッケージング蛋白質Ｉを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３４によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３５によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３８によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ３９によってコードされる糖蛋白質Ｍを構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４２によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４３によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＩＩを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４５によってコードされるビリオンアッセンブリー蛋白質を 構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４７によってコードされる糖蛋白質Ｌを構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４８によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ４９によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ８によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５２によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５３によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５４によってコードされるｄＵＴＰアーゼを構成する単離さ れたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５５によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５６によってコードされるＤＮＡ複製蛋白質Ｉを構成する単 離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５７によってコードされる初期蛋白質ＩＩ（ＬＥＰ−II）を 構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ９によってコードされるウイルス性インターフェロン調 節因子１（ｖＩＲＦ１；ＩＣＳＢＰ）を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチ ドを提供する。１つの態様において、ｖＩＲＦ１は形質転換性ポリペプチドであ る。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１０によってコードされる蛋白質を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１１によってコードされる蛋白質を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５８によってコードされるリン酸蛋白質を構成する単離され たＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ５９によってコードされるＤＮＡ複製蛋白質ＩＩを構成する 単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６２によってコードされるアッセンブリー／ＤＮＡ成熟蛋白 質を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６３によってコードされる外被蛋白質ＩＩを構成する単離さ れたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６４によってコードされる外被蛋白質ＩＩＩを構成する単離 されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６５によってコードされるキャプシッド蛋白質ＩＶを構成す る単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６６によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６７によってコードされる外被蛋白質ＩＶを構成する単離さ れたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６８によってコードされる糖蛋白質を構成する単離されたＫ ＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ６９によってコードされる蛋白質を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１２によってコードされるカポジンを構成する単離され たＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１３によってコードされる蛋白質を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７２によってコードされるサイクリンＤを構成する単離され たＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７３によってコードされる前初期蛋白質（ＩＥＰ）を構成す る単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１４によってコードされるＯＸ−２を構成する単離され たＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７４によってコードされるＧ−蛋白質を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ７５によってコードされる外被蛋白質／ＦＧＡＲＡＴを構成 する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ＯＲＦ Ｋ１５によってコードされる蛋白質を構成する単離された ＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド８８，９１０−８８，４１０によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子２（ｖＩＲＦ２）を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９０，５４１−８９，６００によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子３（ｖＩＲＦ３）を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９４，１２７−９３，６３６によってコードされるウ イルス性インターフェロン調節因子４（ｖＩＲＦ４）を構成する単離されたＫＳ ＨＶポリペプチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチド９０，１７３−９０，６４３によってコードされる分 泌性糖蛋白質Ｘ（ｇＸ）の前駆物質を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチド を提供する。 本発明は、ヌクレオチド２８，６６１−２９，７４１によってコードされる蛋 白質Ｔ１．１を構成する単離されたＫＳＨＶポリペプチドを提供する。 さらに、単離した核酸分子を第二の核酸分子に連結し、適切な宿主内で発現さ せることにより、単離されたポリペプチドを第二のポリペプチドと連結させて融 合蛋白質を形成してもよい。１つの態様において、第二の核酸分子はβ−ガラク トシダーゼをコードする。融合蛋白質を形成するために用いられる他の核酸分子 は当業者に公知である。 本発明は単離した核酸分子によってコードされるポリペプチドに特異的に結合 する抗体を提供する。１つの態様において、該抗体はモノクローナル抗体である 。もう１つの態様において、該抗体はＫＳＨＶポリペプチドのエピトープを認識 する。もう１つの態様において、該抗体はＫＳＨＶポリペプチドの１以上のエピ トープを認識する。もう１つの態様において、該抗体は抗イディオタイプ抗体で ある。 抗体、ポリペプチドまたは単離された核酸分子は、限定されるものではないが 、放射性標識、または比色定量性マーカー、ルミネセンスマーカー、または蛍光 マーカー、もしくは金を始めとする検出可能なマーカーで標識してもよい。放射 性標識としては、限定されるものではないが、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、3 6 Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、59Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、135Ｉおよび136Ｒｅが 挙げられる。蛍光マーカーとしては、限定されるものではないが、フルオレセイ ン、ローダミンおよびオーラミンが挙げられる。比色定量マーカーとしては、限 定されるものではないが、ビオチンおよびジゴキシゲニンが挙げられる。ポリク ローナル抗体またはモノクローナル抗体を生産する方法は、当業者に公知である 。 さらに、該抗体、ポリペプチドまたは核酸分子は、アルカリ性ホスファターゼ またはセイヨウワサビペルオキシダーゼのごとき酵素と結合させた二次抗体によ って検出してもよい。使用されてよい他の酵素は当業者には十分公知である。 本発明は、適切な条件の下で、ポリペプチドを産生させ、次いで、こうして産 生されたポリペプチドを回収する、宿主ベクター系を増殖させることを特徴とす る、単離した核酸分子によりコードされたポリペプチドを生産する方法を提供す る。適切な宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫および哺乳類細 胞が挙げられる。ポリペプチドを生産し、次いでポリペプチドを回収するための 宿主ベクター系は当業者に十分公知であり、限定されるものではないが、リポフ ェクチン(Gibco-BRD)またはリン酸カルシウム沈殿、もしくは細胞内へのベクタ ー導入を達成するための他の方法によって、哺乳類発現ベクターでトランスフェ クトされたイー・コリ(E．coli)およびｐＭＡＬ(New England Biolabs)、Ｓｆ９ 昆虫細胞バキュロウイルス発現系、および哺乳類発現ベクター（例えば、ＨｅＬ ａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＨＥＫ２９３）が挙げられる。当業者ならば 、ＫＳＨＶポリペプチドの発現のために利用できる多くの発現系をよく知ってい る。 本発明は、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子によってコードされるポリペ ブチド上の特異的領域を選択して抗体を作製する方法を提供する。アミノ酸配列 を当業者に周知の方法によって分析して、それらが、それらによって形成される ポリペプチド中の疎水性領域または親水性領域を発生するかどうかを決定しても よい。細胞膜ポリペプチドの場合、疎水性領域は細胞膜の脂質二重層に挿入され るポリペプチドの一部を形成するのに対して、親水性領域は細胞表面上、即ち水 性環境中に位置する。通常、親水性領域は疎水性領域より免疫原性が高いと考え られている。従って、親水性アミノ酸配列を選択し、ＤＮＡウイルスをコードす る単離された核酸分子によってコードされるポリペプチドに対して特異的な抗体 を作製するために用いてよい。選択された抗体は、商業的に入手可能な機械を用 いて調製してよい。別法として、核酸をクローン化して発現させ、得られたポリ ペプチドを回収して免疫原として用いてもよい 選択したＫＳＨＶポリペプチドを用いて動物を免疫感作させることにより、該 ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を生産してもよい。モノクローナル抗 体はハイブリドーマ技術を用い、さらに以下に記載されるごとくに、免疫感作さ せた動物由来の抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させ、次いでその結果得 られた所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択することにより調製す る。 ＩＩ．イムノアッセイ ＫＳＨＶポリペプチド抗原に対して作製した抗体を、前記したようにして、当 該技術分野において十分公知である従来の標識技術を利用して、検出可能なよう に標識してよい。 さらに、標識として酵素を用いてもよい。適切な酵素としては、アルカリ性ホ スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロ ゲナーゼ、マレエートデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。 酵素イムノアッセイの２つの主要なタイプは、酵素結合イムノソルベント検定法 （ＥＬＩＳＡ）、および均一酵素イムノアッセイであり、これはまた酵素増幅免 疫測定法(ＥＭＩＴ，Syva Corporation，Palo Alto，CA)として公知である。Ｅ ＬＩＳＡ系においては、例えば固相に結合させた抗体の使用によって分離が達成 され得る。ＥＭＩＴ系は、トレーサー抗体複合体中での酵素の失活に依存し、か くして活性は分離工程を必要とせずに測定される。 さらに、標識として化学発光化合物を用いてもよい。典型的な化学発光化合物 としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミ ダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサレートエステルが挙げられる。同様 に、生物発光化合物がラベリングに用いられてもよく、該生物発光化合物として はルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが挙げられる。 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の記載は、文献（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology（1978）North Holland Publishing Comp any，New York）の中に見られ、特にT．Chardによる「ラジオイムノアッセイお よび関連技術への序論（An Introduction to Radioimmune Assay and Related T echniques）」という標題の章で述べられている。種々のタイプの一般的な免疫 定量法の記載を、以下の米国特許第4,376,110号(Davidら)または第4,098,876号( Piasio)中に見つけることができる。 Ａ．ＫＳＨＶポリペプチド抗原に関するアッセイ ウイルス、その成分、またはそれに対する抗体を検出するためには、イムノア ッセイを用いることができる。適用できる技術の全般的な総論としては、Harlow およびLane（1988）Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pu blication，New Yorkがある。 １つの態様において、ＫＳＨＶポリペプチド抗原に対する抗体を用いることが できる。便宜には、抗体を生産するために、標的となるポリペプチドを発現させ て精製する。該生成物を、抗体を産生する能力を持つ哺乳類に注入する。該遺伝 子産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクコーナル抗体（組換え抗体を 含む）の何れがを種々のイムノアッセイに用いることができる。かがるアッセイ としては、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、 ＥＬＩＳＡ、間接免疫蛍光法などが挙げられる。競合イムノアッセイについては 、HarlowおよびLaneの５６７−５７３ページおよび５８４−５８９ページを参照 のこと。 モノクローナル抗体または組換え抗体は、当業者にとってはよく知られた技術 によって得ることができる。便宜には、所望の抗原で免疫感作させた動物由来の 脾臓細胞または他のリンパ細胞を、通常、ミエローマ細胞と融合させることによ って不死化させる(KohlerおよびMilstain，1976，Eur．J．Immunol．6，511-519 参照)。不死化の別法としては、エプスタイン・バールウイルス、癌遺伝子、ま たはレトコウイルスでの形質転換、あるいは当該技術分野において十分公知の池 の方法がある。単一の不死化細胞に由来するコロニー形成を、抗原に対して所望 の特異性および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングし、かかる細 胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹膜腔に注 射することを始めとする種々の技術によって増大させてもよい。また、組換えフ ァージ抗体発現系を用いるより新しい技術も、モノクローナル抗体を作製するた めに用いることができる。例えば、McCaffartvら，（1990）Nature 348，552;Ho ogenboomら，（1991）Nuc．Acids Res．19，4133；およびMarksら，（1991）J． Mol Biol，222，581-597を参照されたい。 ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）Ｉの分子と結合した自然にプロセッシン グを受けたペプチドを同定する方法を用いることができる。Falkら，1991， Nature 351，290および１９９２年１１月２６日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９ ２／２１０３３を参照されたい。典型的には、これらの方法としては、適切な細 胞または細胞株からの免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーによる 、ＭＨＣクラスＩ分子の単離が挙げられる。他の方法としては、Ｂ型細胞のクラ スＩ分子から溶出したペプチドの公知の自動配列決定による種々のＨＰＬＣ画分 における、さらに大量のペプチドの直接アミノ酸配列決定（Jardetzkeyら，1991 ，Nature 353，326）、および質量分析法によるヒトＭＨＣクラスＩ分子（即ち 、ＨＬＡ−Ａ２．１型）の直接アミノ酸配列決定(Huntら，1991，Eur．J.Immuno l．21，2963-2970)が挙げられる。ＭＨＣクラスＩ中で自然にプロセッシングを 受けたペプチドの同定に関する全般的な総論として、RotzschkeおよびFalk，199 1，Tmmunol．Today 12，447もまた参照されたい．さらに、Marloesら，1991，Eu r．J．Immunol．21，2963-2970は、イン・ビトロにおいて、可能なウイルス免疫 原性ペプチドの同定のためにクラスＩ結合モチーフをどのように適用できるかを 記載している。 組換え技術によって生産された、本明細書に記載のポリペプチドは、当業者に 周知の標準技術によって精製することができる。組換えによって生産されたウイ ルスのポリペプチドは、直接発現させることができるか、または融合蛋白質とし て発現させることができる。次いで該蛋白質を細胞溶菌（例えば音波処理）およ びアフィニティークロマトグラフィーの併用によって精製する。融合産物につい ては、その後の適切な蛋白質分解酵素で該融合蛋白質を消化することにより、所 望のペプチドを放出させる。 硫酸アンモニウムのごとき物質での選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、 免疫精製法、および他の方法を始めとする当該技術分野において周知の標準技術 によって、該ポリペプチドを実質的に純粋な純度にまで精製することができる。 例えば、Scopes，1982，Protein Purification:Principles and Practice，Spri nger-Verlag，New Yorkを参照されたい。 Ｂ．ＫＳＨＶポリペプチドに特異的に結合する抗体のアッセイ ＫＳＨＶのポリペプチド抗原と反応性のある抗体は、抗原の測定について前記 した方法と同様の、種々のイムノアッセイ法によっても測定することができる。 イムノアッセイ技術による抗体の測定に応用できる免疫学的およびイムノアッセ イ上の総論としては、Basic and Clinical Immunology，第７版、StitesおよびT err.編、およびHarlowおよびLane，1988，Antibodies，A Laboratory Manural， Cold Spring Harbor，New Yorkを参照されたい。 手短に言うと、ＫＳＨＶのポリペプチド抗原と反応性のある抗体を測定するイ ムノアッセイは、競合または非競合結合アッセイの何れであってもよい。競合結 合アッセイでは、試料被験体は、固体表面に結合した捕捉剤上の特異的結合部位 について、標識被験体と競合する。好ましくは、該捕捉剤は、前記したようにし て生産された精製組換えヒトヘルペスウイルスポリペプチドである。また、単離 されるか、または部分的に精製された天然に生じるポリペプチドを始めとする、 ヒトヘルペスウイルスポリペプチドの他の供給源も用いてよい。 非競合アッセイは、典型的には、試料被験体が２つの被験体特異的な結合性試 薬の間に結合されるサンドイッチアッセイである。該結合性試薬の１つを捕捉剤 として用いて、固体表面に結合させる。第２の結合性試薬は標識して、肉眼また は機械的手段により、結果として生じた複合体を測定または検出するために用い る。捕捉剤および標識された結合性試薬の多くの組み合わせを用いることができ る。また、種々の異なるイムノアッセイ形式、分離技術および標識も、ＫＳＨＶ ポリペプチド抗原の測定に関して前記したものと同様に用いることができる。 血球凝集反応阻害（ＨＩ）および補体結合（ＣＦ）は、ウイルスまたはウイル スの抗原に対する抗体の存在について試験することによって、ヒトヘルペスウイ ルスへの感染を検出するのに用いることができる２つの実験室的試験である。 特異的なウイルス変異体に対する抗体を検出したければ、血清学的方法も有用 であり得る。例えば、患者の血清の分折による新たな製剤に対して、ワクチンの 受容者がいかに首尾よく反応したかを見たい場合があるであろう。 ＩＩＡ．ベクター、細胞株および形質転換哺乳類 本発明は、ＫＳＨＶポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む複製 可能なベクターを提供する。該ベクターとしては、限定されるものではないが、 該単離された核酸分子を含むプラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工 染色体（ＹＡＣ）が含まれる。 該ベクターを得るためには、例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡの双方 を制限酵素に曝して、塩基が相互に対合する両分子に相補的末端作り出し、次い でＤＮＡリガーゼで共に連結させることができる。別法としては、リンカーを該 ベクターＤＮＡ中の制限部位に相当する挿入ＤＮＡと連結させ、次いでその部位 で切断する制限酵素で消化する。他の方法も利用でき、当業者には周知である。 本発明は、該ベクターを含む宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞としては、 限定されるものではないが、（大腸菌(E.coli)のごとき）細閑、酵母、糸状菌、 植物、昆虫および哺乳類細胞が挙げられる。適切な動物細胞としては、限定され るものではないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞およ び種々の主要な哺乳類細胞が挙げられる。 本発明は、胎児の段階で哺乳類に導入された該単離された核酸分子を含む、形 質転換非ヒト哺乳類を提供する。形質転換非ヒト哺乳類を作出する方法は、当該 技術分野において公知である。 ＩＩＩ．ＫＳに関する診断アッセイ 本発明は、生物学的試料（例えば、皮膚試料または他の冒された組織）中にお けるＫＳＨＶの存在を検出するための診断試験キットであって、ＫＳＨＶポリペ プチドにのための特異的な核酸配列を含む容器および試験を実施するための使用 説明書から構成される診断試薬キットを包含する。かかる配列の何れが１つに対 する核酸プライマーを含む容器が所望により含まれる。 本発明はさらに、生物学的試料（例えば、血清または固体組織試料）中におけ るＫＳＨＶの存在を検出するための診断試験キットであって、ＫＳＨＶポリペプ チドに対する抗体を含む容器、および試験を実施するための使用説明書から構成 される診断試薬キットを包含する。別法としては、ヘルペスウイルスから誘導し た不活性化ウイルス粒子またはポリペプチドを、診断試験キットで用いて、ＫＳ ＨＶポリペプチドに対して特異的な抗体を検出してもよい。 Ａ．核酸アッセイ 本発明は、（ａ）患者の腫瘍病変部または適切な体液から核酸分子を得ること と、（ｂ）ハイブリダイズ条件下において、該核酸分子を、ＫＳＨＶの単離した 核酸分子と特異的にハイブリダイズする能力を持つ少なくとも１５ヌクレオチド の標識核酸分子と接触させることと、（ｃ）その存在が患者におけるカポジ肉腫 を示唆するハイブリダイズした核酸分子の存在を決定することにより、患者にお いてカポジ肉腫を診断することとを具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方 法を提供する。 １つの態様において、該腫瘍病変部由来の核酸分子を、工程（ｂ）以前に増幅 させる。もう１つの態様では、該核酸分子を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を使用する。核酸分子を増幅する方法は当業者に公知である。 当業者ならば、患者においてカポジ肉腫を診断するための適切な核酸試料を得 ることができるであろう。前記した方法によって得られたＤＮＡ試料を、分析の 前に、当該技術分野において周知の制限酵素により切断してもよい。 前記した方法では、ポリアクリルアミドゲルによって達成されるサイズ分画が 使用されてもよい。１つの態様において、該サイズ分画は、アガローズゲルによ って達成される。さらに、ハイブリダイゼーション工程の前に、固体マトリック スへの核酸断片の転写を行ってもよい。かかる固体マトリックスの１つの例は、 ニトロセルロース紙である。 本発明は、細胞由来のｍＲＮＡを得、該ｍＲＮＡをハイブリダイズ条件の下で ＫＳＨＶの標識核酸分子と接触させ、該分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存 在を決定し、それによって該ＫＳＨＶ遺伝子の発現を検出することを特徴とする 、細胞中におけるＫＳＨＶ遺伝子の発現の検出方法を提供する。１つの態様にお いて、ｃＤＮＡは該細胞から得られたｍＲＮＡから調製され、ＫＳＨＶ発現の検 出に用いられる。 ハイブリダイゼーションアッセイを実施するために許容される方法は公知であ り、該技術の全般的な総論は、Nucleic Acid Hybridization:A Practical Appro ach(1985)HamcsおよびHiggins編,IRL Press:Hybridization of Nucleic Acids I mmobilized on Solid Supports,MeinkothおよびWahl；Analytical Biochemistry (1984)238,267-284およびInnisら,PCR Protocols(1990)Academic Press,San Die goの総説から得られる。 ＫＳの核酸ハイブリダイゼーション診断アッセイには、標的特異的プローブを 用いてもよい。該プローブは、注目する標的に対して特異的または相補的である 。正確な対立遺伝子を区別するためには、該プローブは約１４ヌクレオチドの長 さであるべきであり、好ましくは約２０−３０ヌクレオチドであるべきである。 ＫＳＨＶをさらに普遍的に検出するためには、核酸プローブは約５０〜１０００ ヌクレオチドであり、最も好ましくは約２００〜４００ヌクレオチドである。 特異的核酸プローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはそれら の類縁体であり得る。該プローブは、一本または二本鎖核酸分子であってよい。 本発明のプローブを、当該技術分野で周知の方法を用いて、酵素的に（例えば、 ニックトランスレーション、プライマー伸長、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応他 ）または化学的に（例えば、BeaucageおよびCarruthersまたはMatteucciら，前 記によって記載された方法によって）合成してもよい。 該プローブは、試料中にその標的核酸を有する安定な二重螺旋を形成すること ができる十分な長さ、すなわち、少なくとも１４ヌクレオチドでなければならず 、さらに長くてもよい（例えば、少なくとも約５０または１００塩基の長さ）。 しばしば該プローブは、約１００塩基の長さよりも長くなってもよい。例えば、 標識ヌクレオチドの存在下でのＤＮＡのニックトランスレーションによってプロ ーブを調製する場合には、平均プローブ長は約１００−６００塩基であってよい 。 核酸プローブ設計およびアニーリング条件についての考察に関しては、例えば 、Ausubelら，前記；BergerおよびKimmel編、Methods in Enzymology 152巻、(1 987)Academic Press,New York；またはHybridization with Nucleic Acid Probe s,pp.495-524,(1993)Elsevier,Amsterdamを参照のこと。 通常、該プローブの少なくとも一部は、標的核酸とかなりの配列同一性を有し ていると考えられる。特異的ハイブリダイゼーションに必要な配列同一性の程度 は、該プローブの長さおよびハイブリダイゼーション条件にもよるが、通常、該 プローブは標的核酸と少なくとも７０％の同一性を有し、さらに通常は少なくと も８０％の同一性を有し、なおさらに通常は少なくとも９０％の同一性を有し、 最も通常は少なくとも９５％または１００％の同一性を有する。 以下のストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、特異 的でないプローブから特異的なプローブ（例えば、蛍光標識した核酸プローブ） を区別するのに十分であろう：変性プローブ、５０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳ Ｃ、および０．１％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランを含む溶液中、３７℃にて１２ 時間、該プローブを試料とインキュベーションし、次いで５分間７０℃にて１Ｘ ＳＳＣで、５分間３７℃にて２Ｘ ＳＳＣで、５分間室温にて０．２Ｘ ＳＳ Ｃで、次いで５分間室温にてＨ2Ｏで洗浄する。核酸ハイブリダイゼーション（ すなわち、ｉｎ ｓｉｔｕサザン、またはノーザン）においては、ハイブリダイ ゼーションまたは洗浄溶液中に洗浄剤（例えば、硫酸ドデシルナトリウム）、キ レート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）または他の試薬（例えば、緩衝液、デンハート 溶液、硫酸デキストラン）を含むことがしばしば有利であることを、当業者は承 知している。特異性を評価するために、プローブをＫＳＨＶを含む宿主細胞上で 試験して、非ＫＳＨＶウイルスを含む細胞から得られた結果と比較することがで きる。 プローブがＫＳＨＶ核酸分子に対して特異的であるかどうかを決定するための 従来法が、ウイルスから調製したＤＮＡを用いサザンブロット（またはドットブ ロット）を利用することは、当業者にとっては明白であろう。手短に言えば、標 的に対して特異的なプローブを同定するために、ＤＮＡをウイルスから単離する 。試験ＤＮＡ（ウイルス性または細胞性の何れか）を、固体（例えば、帯電した ナイロン）マトリックスに転写する。プローブは定法により標識する。以下の変 性および／またはプレハイブリダイゼーション工程は当該技術分野で公知であり 、該プローブを、先に定義したごときストリンジェント条件下で固定化したＤＮ Ａにハイブリダイズさせる。 さらには、プローブの特異性を決定する際に、またＫＳＨＶの検出に本発明の 方法を使用する際に、一定量のバックグラウンドシグナルは典型的であり、当業 者は特異的シグナルと容易に区別できると思われる。バックグラウンドの２倍の シグナルであれば許容される。 ＫＳＨＶポリペプチドを検出する好ましい方法は、ＰＣＲおよび／またはドッ トブロットハイブリダイゼーションを使用することである。ＫＳについての検出 または予後、もしくは危険性評価のためにＫＳＨＶの存在または不在を試験する 他の方法としては、全て当業者に周知である、サザントランスファー、溶液ハイ ブリダイゼーションまたは非放射性検出系が挙げられる。プローブを用いてハイ ブリダイゼーションを行う。ハイブリダイズした部分の視覚化することによって 、原因となる試薬の存在または不在を定性的に決定が可能になる。 同様に、ノーザントランスファーまたは逆転写酵素ＰＣＲを、試料中のＫＳＨ ＶメッセンジャーＲＮＡの検出に用いてもよい。これらの方法もまた当該技術分 野においては十分に知られたものである。Sambrookら,(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual(第２版),Cold Spring Harbor Laboratory，第1-3巻を参 照。 ヒトヘルペスウイルスの存在を決定するための代替手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハ ィブリダイゼーションであり、さらに最近ではｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖 反応である。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲは、Ncuvoら(1993)American Journal of Sur ginal Pathology 17(7),683-690中のＰＣＲ増幅したＣ型肝炎ＤＮＡの細胞間局 在、Bagasraら,(1992)New England Journal of Medicine 326(21),1385-1391中 のｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲによる単核細胞中のＨＩＶ−１プロウイルスの検出、お よびHenifordら,(1993)Nuclcie Acids Research 21,3159-3166中のｉｎ ｓｉｔ ｕ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって実証された細胞のＥＧＦ受容体ｍＲ ＮＡ発現の変化に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッ セイは周知であり、一般には、Methods Enzymol.第152巻、(1987)BergerおよびK immel編,Academic Press,New Yorkに記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダ イゼーションにおいて、細胞は固形支持体、典型的にはスライドグラスに固定さ れる。次いで該細胞を適度な温度にてハイブリダイゼーション溶液に接触させて 、標識した標的特異的プローブをアニーリングさせる。該プローブは好ましくは 放射性同位体または蛍光性リポーターで標識される。 また、前記したプローブはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、 または遺伝子を発現する組織の場所を特定するために、あるいは種々の生物学的 組織中の遺伝子またはそのｍＲＮＡの存在に関する他のハイブリダイゼーション アッセイのために有用である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ポリ ペプチド抗原の発現または自然条件、変性条件によらない鋭敏な位置決定方法で ある。 また、ＫＳＨＶファージミドまたはプラスミドから作製した合成オリゴヌクレ オチド（オリゴ）プローブおよびリボプローブも提供される。組織切片で成功し たハイブリダイゼーション条件は、１つのプローブからもう１つのプローブへ容 易に転移する。商業的に合成したオリゴヌクレオチドプローブは、同定された遺 伝子のヌクレオチド配列を用いて調製されている。これらのプローブは、長さ（ ４５−６５量体）、高Ｇ−Ｃ含量（５０−７０％）に関して選択され、Ｇｅｎ Ｂａｎｋにおける他のウイルス配列に対する特異性についてスクリーニングされ る。 オリゴは、１ｘ１０10ｄｐｍ／μｇの範囲の比活性にまで、末端デオキシヌク レオチジルトランスフェラーゼを用いて、［α−35Ｓ］ｄＡＴＰで３’末端を標 識されている。取り込まれていない標識ヌクレオチドを、オリゴプローブから、 ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムを通す遠心分離によって、またはＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラムからの溶出によって除去する。 ＯＣＴ化合物中に包埋されたＫＳ組織およびドライアイスで冷却した冷凍イソ ペンタン中の凍結材料を６μｍ間隔に切断し、３−アミノプロピルトリエトキシ ランで処理したスライド上で解凍させて風乾させる。次いで該スライドを新たに 調製した４％パラホルムアルデヒド中で固定させ、水中で洗浄する。また、ホル マリンで固定し、パラフィンに包埋したＫＳ組織を６μｍで切断し、スライドグ ラス上で焼き付けたものも用いることができる。次いで、これらの薄片をキシレ ン中で脱パラフィン化して徐々に変化させたアルコールで水和させる。３７℃で ３０分間２０ｍＭトリスｐＨ７．５、０．０２％デンハート溶液、１０％硫酸デ キストラン中でプレハイブリダイゼーションし、続いて４２℃にて、５０％ホル ムアミド（ｖ／ｖ）、１０％硫酸デキストラン（ｗ／ｖ）、２０ｍＭリン酸ナト リウム（ｐＨ７．４）、３ｘ ＳＳＣ、１ｘデンハート溶液、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、１２５μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよびオリゴプローブ（１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）の溶液中で一晩ハイブリダイゼーションを行う。該スライドを、 室温で各々１５分間３ｘＳＳＣで２回、１ｘＳＳＣで２回洗浄し、オートラジオ グラフィーによって可視化する。便宜には、切片を０．３Ｍ酢酸アンモニウムを 含む徐々に変化させたアルコールで脱水して風乾する。該スライドをコダックＮ ＴＢ２エマルジョン中に浸漬し、数日間〜数週間感光させ、現像し、ヘマトキシ リンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色する。 当業者に周知の別法としての免疫組織化学的プロトコールを用いてもよい。 Ｂ．免疫学的アッセイ 本発明は、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）患者の適 切な体液を、ＫＳＨＶポリペプチドを認識する抗体が既に結合されている支持体 に接触させて、前記抗体を特異的なＫＳＨＶポリペプチド抗原に結合させること と、（ｃ）該支持体から結合していない体液を除去することと、次いで（ｄ）前 記抗原が結合している前記抗体のレベルを測定し、それによってカポジ肉腫を診 断することとを具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方法を提供する。 本発明は、（ａ）患者から適切な体液サンプルを得ることと、（ｂ）患者の適 切な体液を、ＫＳＨＶポリペプチド抗原が既に結合されている支持体に接触させ て、前記抗原に特異的カポジ肉腫抗体を結合させることと、（ｃ）該支持体から 結合していない体液を除去することと、次いで（ｄ）前記カポジ肉腫抗体が結合 している前記抗原のレベルを測定し、それによってカポジ肉腫を診断することと を具備した、患者におけるカポジ肉腫の診断方法を提供する。 適切な体液サンプルは、カポジ肉腫抗体、抗原またはその断片を含む何れの体 液サンプルでもよい。適切な体液サンプルとしては、限定されるものではないが 、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、尿、漏出液、または滲出液が挙げられる。 好ましい態様において、適切な体液サンプルは血清または血漿である。さらに、 該サンプルは骨髄由来の細胞、または細胞培養由来の上清であってもよい。患者 がら適切な体液サンプルを得る方法は、当業者には公知である。抗体または抗原 のレベルを測定する方法としては、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、Ｉ ＦＡ、およびウェスタンブロッティングが挙げられる。他の方法も当業者には公 知である。さらに、ＫＳＨＶに感染した患者は、前記した方法を用いて、感染し たものと診断され得る。 ＫＳＨＶの検出およびウイルス関連のＫＳの検出は、本質的には同一の方法で ある。基本原理は、正常なヒト細胞またはその周囲において他のポリペプチドま たは核酸にではなく、ウイルスに結合する特異的なリガンドを用いてウイルスを 検出することである。該リガンドは、核酸分子、ポリペプチドまたは抗体であり 得る。該リガンドは、天然に存在するもの、もしくは非天然ヌクレオチド塩基を 有する核酸のような遺伝的にまたは物理的に改変されたもの、あるいは抗体誘導 体、すなわちＦａｂまたはキメラ抗体であり得る。また、患者の血清中に存在す るウイルスに対する抗体の検出に関する血清学的試験も、本明細書において記載 したようにして、抗原としてＫＳＨＶポリペプチドを用いることにより行えばよ い。 サンプルは、ＫＳに罹患した患者から、またはＡＩＤＳ患者のごときＫＳのお それがある患者から採取され得る。典型的には、該サンプルは、血液（細胞、血 清および／または血漿）から、または皮膚病変部のごとき固体組織試料から採取 される。ＫＳの最も正確な診断は、該ウイルスの力価の上昇が、血液中または関 連病巣の中で検出された場合になされる。また、該ウイルスに対する抗体が検出 された場合およびＫＳに関する他の診断因子が存在する場合、ＫＳであることが 指摘され得る。 ＫＳの診断アッセイにおいて使用するための本発明の免疫試薬についてのさら なる詳細は、前記イムノアッセイを参照されたい。 ＩＶ．ヒトヘルペスウイルスに誘発されたＫＳの治療 本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の患者の治療方法であって、ＫＳの患者に対し て、医薬上許容される担体中に含まれる医薬的有効量の抗ウイルス剤を投与する ことを具備し、該抗ウイルス剤はＫＳの患者を治療するのに有効であるような方 法を提供する。 さらに、本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の予防または治療方法であって、ＫＳ のおそれがある患者に対して、医薬上許容される担体中に含まれるＫＳＨＶ結合 性抗体を投与することによる方法を提供する。 本発明は、カポジ肉腫（ＫＳ）の患者の治療方法であって、該患者に対して、 アンチセンス分子が選択的に患者のＫＳ腫瘍細胞に入り込むような条件下で、Ｋ ＳＨＶの単離されたＤＮＡ分子にハイブリダイズできる有効量のアンチセンス分 子を投与して、該患者を治療することを具備した方法を提供する。 Ａ．核酸治療剤 本発明は、ＫＳＨＶの単離された核酸分子とハイブリダイズすることができる アンチセンス分子を提供する。１つの態様において、該アンチセンス分子はＤＮ Ａである。もう１つの態様において、該アンチセンス分子はＲＮＡである。もう １つの態様において、該アンチセンス分子は核酸誘導体（例えば、蛋白質骨格を 持ったＤＮＡまたはＲＮＡ）である。 本発明は、それぞれアンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスキングするか、または リボザイムでそれを切断するかの何れかによって、ポリペプチドの発現を阻害す るために用いることができるような、アンチセンス核酸類およびリボザイム類の 調製へと拡張される。 本発明は、ＫＳＨＶの単離された核酸分子に結合することによって、ＫＳに罹 患した患者でヘルペスウイルスの活性を阻害することができる、阻害性核酸治療 剤を提供する。阻害性核酸は、相補的核酸配列に特異的に結合することができる １本鎖の核酸であってよい。適当な標的配列に結合することによって、ＲＮＡ− ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんまたは三重らせんが 形成される。これらの核酸は通常、遺伝子のセンス鎖すなわちコーディング鎖に 対して相補性を持つので、しばしば「アンチセンス」と呼ばれるが、最近「セン ス」核酸の使用に関する試みも開発されてきた。本発明で用いる場合、「阻害性 核酸」とは、「センス」核酸および「アンチセンス」核酸の双方をいう。 標的核酸に結合することによって、該阻害性核酸は、標的核酸の機能を阻害す ることができる。このことは、例えば、ＤＮＡ転写、プロセッシング、またはｍ ＲＮＡへのポリ（Ａ）付加、ＤＮＡ複製、翻訳を阻害すること、或いはＲＮＡ変 成を誘導するような細胞の阻害性機構を誘導することの結果であり得る。従って 阻害性核酸法は、ヘルペスウイルス遺伝子の発現を修正する多くの異なる試みを 包含する。これら異なるタイプの阻害性核酸技術は、Heleneおよび Toulme(1990)Biochim.Biophys.Acta.1049,99-125に記載されており、以降この文 献を「HeleneおよびToulmeto」という。 簡略に説明すれば、阻害性核酸治療の試みは、ＤＮＡ配列を標的とするもの、 ＲＮＡ配列を標的とするもの、および標的核酸の切断、または化学的修飾を引き 起こすものに大別できる。 ＤＮＡを標的とする試みは幾つかのカテゴリーに分けられる。核酸を二重らせ んＤＮＡの主溝に結合するように設計して、三重螺旋構造、すなわち「トリプレ ックス」構造を形成することができる。別法としては、複製または転写の間に、 二重らせんＤＮＡの開裂の結果得られる１本鎖ＤＮＡの領域に結合するように該 阻害性核酸を設計する。 より一般的には、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に結合するように、阻害性核 酸を設計する。阻害性核酸を用いて、前ｍＲＮＡの成熟を阻害する。ＲＮＡプロ セッシング、スプライシングまたは翻訳を阻害するように、阻害性核酸を設計し てもよい。 該阻害性核酸はｍＲＮＡを標的とすることができる。このアプローチでは、該 阻害性核酸を、コードされた蛋白質の翻訳を特異的に阻害するように設計する。 このアプローチを用いれば、該阻害性核酸を用いて、決定的な蛋白質をコードす るｍＲＮＡの翻訳の阻害により、特定の細胞の機能を選択的に抑制することがで きる。例えば、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの領域に対して相補性を持つ阻害性核酸は 、ｃ−ｍｙｃ前癌遺伝子を過剰発現するヒト前骨髄白血病細胞株、ＨＬ６０での ｃ−ｍｙｃ蛋白質の発現を阻害する。Wickstromら(1988)PNAS85,1028-1032およ びHarel-Bellanら(1988)Exp.Med.168,2309-2318参照。HeleneおよびToulmetoに 記載されたように、ｍＲＮＡを標的とする阻害性核酸は、幾つかの異なるメカニ ズムにより作用して、コードされる蛋白質の翻訳を阻害することが示されている 。 また細胞に導入される阻害性核酸も、HeleneおよびToulmetoに記載されたよう に、遺伝子またはｍＲＮＡの「センス」鎖を包含し、ｍＲＮＡの翻訳に関与する 酵素または結合性蛋白質をトラップし、またはこれと競合することができる。 最後に、該阻害性核酸を用いて、標的遺伝子またはｍＲＮＡの化学的不活性化 または切断を誘導することができる。化学的不活性化は、細胞内で阻害性核酸と 標的核酸との間の架橋を誘導することにより引き起こすことができる。また、適 切に誘導された阻害性核酸により誘導される、標的核酸他の化学的修飾が用いら れてもよい。 標的核酸の切断、およびそれゆえの不活性化は、阻害性核酸に、活性化して切 断反応を誘導することができる置換基を付加することにより果たすことができる 。該置換基は、化学的切断または酵素的切断の何れかに影響するものであってよ い。別法として、切断はリボザイムまたは触媒性ＲＮＡの使用によって誘導され る。このアプローチでは、該阻害性核酸は、天然に存在するＲＮＡ（リボザイム ）または触媒活性を有する合成核酸の何れかから構成されるであろう。 これら細胞の表面上の受容体に結合するターゲッティング部分との結合による 、免疫系の特異的細胞に対する阻害性核酸のターゲッティングは、前記阻害性核 酸治療のあらゆる形態に用いることができる。本発明は、前記したような、また HeleneおよびToulmetoに記載されたような阻害性核酸治療のあらゆる形態を包含 する。 抗ヘルペスウイルス阻害性核酸の例は、ＣＭＶに対する活性を有するＩＳＩＳ ２９２２(ISIS Pharmaceuticals)である（Biotechnology News 14:5参照）。 阻害性核酸治療に付随する問題は、イン・ビボ標的細胞への阻害性核酸の効果 的な送達とそれに続く細胞による該阻害性核酸の取り込みである。これは、該阻 害性核酸を標的部分と結合して、標的感染細胞の表面上の特異的受容体と結合す る複合体を形成することにより達成でき、それは結合後に取り込まれる。 Ｂ．抗ウイルス剤 抗ウイルス剤と連続処理の併用は、ヘルペスウイルス感染症の治療に有用であ り、また、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療にも有用であると考えられる。例 えば、Snoeckら(1992)Eur.J.Clin.Micro.Infect.Dis.11,1144-1155は、抗ヘルペ ス剤を併用した場合（例えばジドブジン［３’−アジド−３’−デオキシチミジ ン、ＡＺＴ］とＨＰＭＰＣ、ガンシクロビル、フォスカーネットまたはアンサイ クロバーとの組み合わせ、もしくはＨＰＭＰＣの他の抗ウイルス剤との組み合わ せ）、ＣＭＶに対する付加的または相乗的効果を見出した。同様にサイトメガロ ウイルス・レチニティス(retinitis)の治療では、ガンシクロビルでの誘導、そ れに続くフォーカネットでの維持が、効率を最大化し、一方で各々単独の処理の 有害な副作用を最小化する方法として示されて来た。アシクロビルおよび、例え ば、２−アセチルピリジン−５−（（２−ピリジルアミノ）チオカルボニル）− チオカルボノヒドラゾンを含む抗疱疹性組成物が、米国特許第５，１７５，１６ ５（Burroughs Welcom Co.へ譲渡）に記載されている。抗疱疹性医薬におけるＴ Ｓ−インヒビターとウイルス性ＴＫ−インヒビターの併用については、Stiching Rega VZWに譲渡された米国特許第５，１３７，７２４号に記載されている。Ｈ ＰＭＰＣとＡＺＴの特定の併用割合を用いたＥＢＶ増殖における相乗的阻害効果 については、Linら(1991)Antimicrob Agents Chemother 35:2440-3によって報告 されている。 米国特許第５，１６４，３９５号および第５，０２１，４３７号(Blumenkopf; Burroughs Wellcome)は、アシクロビルとの併用するアセチルピリジン誘導体の 使用を含む、ヘルペス感染症の治療ためのリボヌクレオチドレダクターゼインヒ ビター（アセチルピリジン誘導体）の使用について記載している。米国特許第５ ，１３７，７２４号(Balzariら(1990)Mol.Pharm.37,402-7)は、ウイルス性チミ ジンキナーゼ阻害活性を有する化合物と併用するチミジレートシンターゼインヒ ビター（例えば、５−フルオロ−ウラシルおよび５−フルオロ−２’−デオキシ ウリジン）の使用について記載している。 新しく同定されたＫＳのための病因薬剤の発見に伴い、ヘルペスウイルス関連 ＫＳの症状を緩和するまたは防護する効果的な治療上または予防上のプロトコー ルが確立できた。該疾病のウイルス特性により、抗ウイルス剤は本明細書で、イ ンターフェロン、核酸類縁体、リバピリン、アマンタジン、およびホスホノ酢酸 のピロリン酸塩類縁体（フォスカーネット）(Gorbachら,1992,Infectious Disea se Ch.35,289,W.B.Saunders,Philadelphia,Pennsylvania)など、治療のための適 用を持つ。また、免疫療法も本明細書に記載される疾病薬によって引き起こされ た症状を管理し、緩和する多くの場合で効果的であると考えられる。抗ウイルス 剤としては、ウイルスの増殖またはウイルス力価に直接強い影響を与えない与 えない薬剤を除き、ウイルス産物に直接結合して疾病の進行を阻害する薬剤また は組成物を含む。抗ウイルス剤としては、ウイルス力価に直接影響を及ぼさない か、またはウイルス産物と結合しない免疫調節剤は含まれない。抗ウイルス剤が ウイルスを不活性化するか、またはそうでなくともその感染性や増殖を阻害する か、またはＫＳの症状を緩和するならば効果的である。 ウイルス誘発性ＫＳを治療するために有用であると考えられる抗ヘルペスウイ ルス剤は、それらの推定される作用様式に基づいて、広範なクラスに分類される 。これらのクラスは、（１）ウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害により、（２） 他のウイルス酵素および蛋白質をターゲッティングすることにより、（３）種々 雑多なまたは不完全な理解しかされていない機構により、または（４）標的核酸 を結合させることにより（すなわち、前記阻害性核酸療法）作用して、相乗的ま たは付加的効果もしくは他の利点を達成する薬剤を含む。 それらの確認された作用機構により、抗ウイルス剤を分類するのが都合がよい が、本出願者らは、抗ウイルス作用の何れか特定の機構によって拘束されること を意図しない。さらに、当業者ならば、薬剤がウイルス中のまたはウイルス感染 細胞中の１を超える標的上で、もしくは１を超える機構を介して作用してもよい ことを理解するであろう。 ｉ）ＤＮＡポリメラーゼのインヒビター 臨床用途または今日の開発における多くの抗ヘルペスウイルス剤は、ウイル スＤＮＡ複製の阻害を介して、特にウイルスＯＮＡポリメラーゼの阻害を介して 作用すると確信されている核酸類縁体である。これらの核酸類縁体は、ウイルス ＤＮＡポリメラーゼに対する二者択一の基質として、もしくはＤＮＡポリメラー ゼ基質の競合インヒビターとして作用する。通常、これらの薬剤は、もし１つが 存在すれば、ウイルス性チミジンキナーゼ（ＴＫ）によって優先的にリン酸化さ れ、および／または細胞性ＤＮＡポリメラーゼに対するよりもウイルス性ＤＮＡ ぽリメラーゼに対して更に高い親和性を有し、その結果、選択的抗ウイルス活性 が生じることとなる。ヌクレオチド類縁体が該ウイルス性ＤＮＡに組み込まれる と、ウイルス活性または再生産が様々な様式で影響され得る。例えば、該類縁体 は鎖のターミネーターとして作用し、不安定性（例えば、切断に対する感受性） を増強し、および／または置換されたＤＮＡの転写または複製にための鋳型とし て作用する能力を修復する（例えば、前記のBalzariniら参照）。 ヘルペスウイルス感染症の治療に有用な多くの薬剤、多くの試薬が、宿主、宿 主細胞、またはウイルス感染宿主細胞代謝酵素によって修飾される（すなわち、 「活性化される」）ようなことは当業者ならば公知であろう。例えば、アシクロ ビルは、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（もし存在すれば）によって行われ る第一のリン酸化で、その活性型へと三リン化される。他の例としては、３段階 代謝経路で報告された化合物ＨＯＥ６０２のガンシクロビルへの変換(Winklerら ，1990,Antiviral Research 14,61-74)、およびガンシクロビルの、例えばＣＭ Ｖヌクレオチドキナーゼによる、その活性型へのリン酸化が挙げられる。ウイル スの特異的代謝能が特異的薬剤に対するそのウイルス感受性に影響を与えること ができ、また抗ウイルス剤の選択における一要因となることは、当業者にとって は明らかであろう。特定の抗ヘルペスウイルス剤の作用機能については、De Cle req(1993,Antimicrobial Chemotherapy 32,Suppl.A,121-132)、並びに前記およ び後記に引用される他の参照文献で考察されている。 ウイルス誘発性ＫＳを治療するために適した抗ヘルペスウイルス薬物療法とし ては、限定されるものではないが、非環式ホスホン酸ヌクレオシド類縁体（例え ば、ホスホニル−メトキシアルキルプリンおよび−ピリミジン類）および環式ヌ クレオシド類縁体を始めとするヌクレオシド類縁体が挙げられる。これらには、 ビダラビン（９−β−アラビノフラノシルアデニン；アデニンアラビノ、ａｒａ −Ａ、Ｖｉｒａ−Ａ、パーク−ダビス(Park-Davis)；１−β−Ｄ−アラビノフラ ノシルウラシル（ａｒａ−Ｕ）；１−β−Ｄ−アラビノフラノース−シトシン（ ａｒａ−Ｃ）；ＨＰＭＰＣ[（Ｓ）−１−[３−ヒドロキシ−２−（ホスホニルメ トキシ）プロピル］シトシン（例えば、ＧＳ５０４、Gilead Science)]およびそ の環状型（ｃＨＰＭＰＣ）；（Ｓ）−ＨＰＭＰＤＡＰ[（Ｓ）−９−（３−ヒド ロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピル）−２，６−ジアミノプリン]；ＰＭ ＥＤＡＰ[９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−２，６−ジアミノプリン] ；ＨＯＥ６０２[２−アミノ−９−（１，３−ビス（イソプロポキシ）−２−プ ロポキシメチル）プリン];ＰＭＥＡ[９−（２−ヒスホニルメトキシエチル） アデニン];ブロモビニル−デオキシウリジン(BurnsおよびStandford,1990,J.Inf ect.Dis.162:634-7);１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモ ビニル）−ウリジンまたは−２’−デオキシウリジン；ＢＶａｒａＵ（１−β− Ｄ−アラビノフラノシル−Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−ウラシル、ブロババ ー、Bristol Myers Squibb,Yamsa Shoyu）；ＢＶＤＵ[（Ｅ）−５−（２−ブロ モビニル）−２’−デオキシウリジン、ブリブジン、例えば、Helpin]およびそ の炭素環式類縁体（そこで糖部分がシクコペンタン環で置換されている）；ＩＶ ＤＵ[（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン]およびその 炭素環式類縁体、Ｃ−ＩＶＤＵ（Balzariniら,前記）；および２’−デオキシウ リジンの５−メルクチチオ類縁体(HollidayおよびWilliams,1992,Antimicrob.Ag ents Chemother.36,1935);アンシクロバー[９−（[２−ヒドロキシエトキシ]メ チル）グアニン；例えば、ゾビラックス(Zovirax)(Burroughs Wellcome)];ペン シクロバー（９−[４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ブチル]−グアニ ン）；ガンシクロビル[（９−[１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル] −グアニン）例えば、シメベン(Cymevene)、シトベン(Syntex)、ＤＨＰＧ(Stals ら,1993,Antimicrobial Agents Chemother.37,218-223；ガンシクロビルのイソ プロピルエーテル誘導体（例えば、Winkelmannら,1988,Drug Res.38,1545-1548 ）；シガロバー；ファムシクロバー[２−アミノ−９−（４−アセトキシ−３− （アセトキシメチノレ）ブト−１−イル）プリン(Smithkline Beecham)];バラシ クロバー(Burroughs Wellcome);デスシクロバー[（２−アミノ−９−（２−エト キシメチル）プリン）]および２−アミノ−９−（２−ヒドロキシエトキシメチ ル）９Ｈ−プリン、アシクロビルの前駆薬剤];ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキシ グアノシン）；およびシクロブタン環で置換されたペンタフラノシル環を有する プリンヌクレオシド（例えば、シクロブト Ａ[(＋−）−９−[１β、２α、３ β）−２，３−ビス（ヒドロキシメチル）−１−シクロブチル]アデニン]、シク ロブト−Ｇ[(＋−)−９−[１β、２α、３β）−２，３−ビス（ヒドロキシメチ ル）−１−シクロブチル]グアニン]、ＢＨＣＧ[（Ｒ）−（１α、２β、１α） −９−（２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル]グアニン]、およびラ セミＢＨＣＧの活性型異性体、配列３４，５１４[１Ｒ−１α、２β、３α）− ２−ア ミノ−９−[２，３−ビス（ヒドロキシメチル）シクロブチル]−６Ｈ−プリン− ６−オン]（Braitmanら,1991,Antimicrob.AgentsおよびChemotherapy 35,1464-1 468参照）を始めとするヌクレオシド類縁体が挙げられる。これら抗ヘルペスウ イルス剤のあるものについては、Gorachら,1992,Infectious Disease Ch.35,289 ,W.B.Saunders,Philadelphia;Saundersら，1990,J.Acqulr.Immune Defic.Syndr. 3,571;Yamanakaら,1991,Mol.Pharmacol.40,446;およびGreenspanら,1990,J.Acqu ir.Immune Defic.Syndr.3,571に考察されている。 トリシリビン(triciribine)およびトリシリビン−リン酸は、ヘルペスウイル スに対する強力な阻害剤であり(Iekesら,1994,Antiviral Research 23,Scventh International Conf.on Antiviral Research,Abstract No.122,Supp.1.)、ＨＩ Ｖ−１およびＨＩＶ−２(Kuceraら,1993,AIDS Res.Human Retroviruses 9,307-3 14)、またＫＳを治療するために用いられ得る核酸類縁体である。これらの薬剤 のためのプロトコールを例示すれば、一週間に一度、約０．３５ｍｇ／ｍ2（０ ．７ｍｇ／ｋｇ）、または少なくとも２用量につき１週間おきの静脈注射であり 、８週間に４回を超えることが好ましい。 アシクロビルおよびガンシクロビルは、臨床環境で許容されるそれらの用途の ゆえに注目される。アシクロビル、すなわちグアニンの非環式類縁体は、ヘルペ スウイルスチミジンキナーゼによりリン酸化され、次いで、更にリン酸化を受け て、ウイルス複製中にウイルス性ＤＮＡポリメラーゼによりチェーンターミネー ターとして組み込まれる。それは広範なヘルペスウイルス、単純ヘルペス１型お よび２型、帯状ヘルペスウイルス、サイトメガコウイルスおよびエプスタイン・ バールウイルスに対する治療活性を有し、ヘルペス脳炎、新生児ヘルペスウイル ス感染症、免疫無防備状態の宿主の水痘、帯状ヘルペス再発、ＣＭＶ網膜炎、Ｅ ＢＶ感染症、慢性疲労症候群、およびＡＩＤＳ患者の毛の白斑症のごとき疾病の 治療に用いられる。静脈投与量または経口投与量を例示すれば、７日間８時間お きの２５０ｍｇ／ｋｇ／ｍ2体表面積、または再発を抑制するためには、１日２ 回の２００−４００ｍｇ静脈注射の継続投与もしくは経口投与である。ガンシク ロビルはアシクロビルより、あるヘルペスウイルスに対する活性がより高いこと が示されてきた。例えば、OrenおよびSoble,1991,Clinlcal Infectious Disease s 14, 741-6参照。ガンシクロビルに関する治療プロトコールは、５ｍｇ／ｋｇ１日２ 回の静脈注射、または２．５ｍｇ／ｋｇ１０−１４日間１日３回である。継続投 与量は５−７日間に５−６ｍｇ／ｋｇである。 またＨＰＭＰＣも注目される。ＨＰＭＰＣは、動物モデルの種々のＨＳＶ−１ 、ＨＳＶ−２、ＴＫ−ＨＳＶ、ＶＺＶまたはＣＭＶ感染症の化学療法および予防 にけるアシクロビルまたはガンシクロビル何れかよりも活性が高いと報告されて いる（De Clereq、前記）。 ＢＶａｒａＵのごときヌクレオシド類縁体は、動物の脳炎モデルにおけるアシ クロビルよりも高い活性を有するＨＳＶ−１、ＥＢＶおよびＶＺＶの効力あるイ ンヒビターである。ＦＩＡＣ（フルロイドアラビノシルシトシン）およびその関 連フルロエチルおよびヨウ素化合物（例えば、ＦＥＡＵ、ＦＩＡＵ）は、ヘルペ スウイルスに対する効力ある選択的活性を有し、またＨＰＭＰＡ（（Ｓ）−１− （[３−ヒドロキシ−２−ホスホリルメトキシ]プロピル）アデニン）は、アンサ イクロバーまたはガンシクロビルよりＨＳＶおよびＣＭＶに対してより効力があ ることが示されており、ＫＳが進行した場合には群を抜いている。クラドリビン （２−クロロデオキシアデノシン）は、高度に特異的な抗リンパ球剤（すなわち 、免疫抑制薬）として知られているもう１つのヌクレオシド類縁体である。 他の有用な抗ウイルス剤としては、５−チエン−２−イル−２’−デオキシウ リジン誘導体、例えば、ＢＴＤＵ[５−５（５−ブロモチエン−２−イル）−２ ’−デオキシウリジン]およびＣＴＤＵ[ｂ−（５−クロロチエン−２−イル）− ２’−デオキシウリジン];およびＯＸＴ−Ａ[９−（２−デオキシ−２−ヒドロ キシメチル−β−Ｄ−エリトロ−オキセタノシル）アデニン]およびＯＸＴ−Ｇ[ ９−(２−デオキシ−２−ヒドロキシメチル）−β−Ｄ−エリトロ−オキセタノ シル）グアニン]が挙げられる。ＯＸＴ−ＧはウイルスのＤＮＡ合成を阻害する ことによって作用すると信じられているが、その作用機構はまだ解明されていな い。これらおよび他の化合物は、Andreiら,1992,Eur.J.Clin.Microbiol.Infect. Dis.11,143-51に記載されている。ヘルペスウイルス感染症を治療するのに有用 なさらなる抗ウイルス性プリン誘導体は、米国特許第５，１０８，９９４号（Be echam Group P.L.C.へ譲渡）に開示されている。６−メトキシプリンアラ ビノシド（ａｒａ−Ｍ；Burroughs Wellcome）は、帯状ヘルペスウイルスの効力 あるインヒビターであり、ＫＳの治療に有用であると考えられる。 或る主のチミジン類縁体［例えばヨードキシウリジン（５−ヨード−２’−デ オキシウリジン）およびトリフルオロチミジン］は、抗ウイルス活性を有してい るが、その全身毒性のために、殆どは、基質角膜炎(stromal keratitis)および 子宮炎を含む局部的ヘルペスウイルス感染について使用されており、他のオプシ ョンが禁止されない限り、ここでは好ましいものではない。 抗ヘルペスウイルス活性が立証されている他の有用な抗ウイルス剤には、ホス カネットナトリウム（ホスホノ蟻酸三ナトリウム、ＰＦＡ、ホスカルビル(Astra )）およびホスホノ酢酸（ＰＡＡ）が含まれる。ホスカネットは、ＤＮＡポリメ ラーゼのリン酸結合部位を競争的にブロックすることによって作用する、無機ピ ロリン酸類縁体である。これらの物質は、ウイルスチミジンキナーゼによるプロ セッシングを伴うことなく、ＤＮＡポリメラーゼを直接ブロックする。ホスカネ ットはＰＡＡよりも毒性が低いことが報告されている。 ｉｉ）他の抗ウイルス剤 出願人らは、特定の抗ウイルス作用機構により拘泥するつもりもないが、上 記の抗ウイルス剤はウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害を介して作用すると確信 している。しかしながら、ウイルスの複製には、ウイルス核酸の複製だけでなく 、ウイルス蛋白質および他の必須成分の産生も必要である。従って、本発明は、 ＤＮＡポリメラーゼ以外のウイルス蛋白質を標的とすることによるウイルス増殖 の阻害によって（例えば、それらの合成または活性化の阻害、もしくは合成後の ウイルス蛋白質の破壊により）ＫＳの治療を行おうとするものである。例えば、 ウイルスのセリンプロテアーゼ（ウイルスキャプシドの発達に重要であるもの） を阻害する薬剤の投与が、ウイルス誘発性ＫＳの治療に有用であろう。 標的となる他のウイルス酵素標としては、ＯＭＰデカルボキシラーゼインヒビ ター（例えば、パラゾフリンの標的）、ＣＴＰシンセターゼインヒビター（例え ば、シクロペンテニルシトシンの標的）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ、リボヌクレ オチドレダクターゼ（例えば、米国特許第5,110,799号(Tolmanら,Merck)に記載 されたごときカルボキシル含有Ｎ−アルキルジペプチドの標的）、チミジンキナ ーゼ（例えば、米国特許第4,863,927号および第4,782,062号(Tolmanら,Merck)に 記載されたごとき１−[２−（ヒドロキシメチル）シクロアルキルメチル]−５− 置換−ウラシルおよび−グアニンの標的）、並びに他の酵素が挙げられる。この 他にも、抗ウイルス剤に対する標的としての役割を果たし得る同定されたウイル ス蛋白質、および未だ発見されていないウイルス蛋白質があることは、当業者に は明白であろう。 クタプレシン(Kutapressin)は、２５ｍｇ／ｍｌの注射可能な形態で、ワシン トン州ミルウォーキーのSehwarz Parmaから入手可能な肝臓誘導体である。ヘル ペスウイルスに対する推奨投与量は、１５０ポンドの平均的な成人に対し、１日 当たり２００〜２５ｍｇ／ｍｌである。 メリーランド州ロックビルのHEM Pharmaceuticalsから入手したアンプリケン( Ampligcn)として知られる許容抗ウイルス剤、ポリ（Ｉ）ポリ（Ｃ12Ｕ）は、ヘ ルペスウイルスを阻害することが知られており、ＫＳを治療するために適切なも う１つの抗ウイルス剤である。静脈注射が好ましい投与経路である。平均１５０ ボンドの成人に対して約１００〜６００ｍｇ／ｍ2の投与量が、１週間に２〜３ 回投与される。１週間に少なくとも２００ｍｇ／ｍ2投与することが最良である 。 ヘルペスウイルス（例えば、帯状ヘルペスおよび単純ヘルペス）に対して活性 を示し、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療に有用であろうことが報告された他 の抗ウイルス剤としては、マッピシンケトン(mappicine keton)(Smith Kline Be echam);帯状ヘルペスに対する化合物A,79296およびA,73209(Abbott);および化合 物８８２Ｃ８７(Burroughs Wellcome)が挙げられる（１９９３年５月１７日、Th e Pink Sheet 55(20)参照）。 インターフェロンは、ヘルペスウイルス類の複製を阻害することが知られてい る。OrenおよびSoble前記参照。インターフェロンには公知の毒性問題があるが 、インターフェロンの抗ウイルス特性を保持し且つ副作用は軽減される第二世代 のインターフェロンが間もなく利用できるようになるであろうと期待される。 また、ヘルペスウイルス再活性化剤を投与して潜伏ウイルスの再活性化を誘導 することにより、ヘルペスウイルス誘発性ＫＳを治療し得るということも考えら れる。該再活性化は、抗ヘルペスウイルス剤の同時投与または逐次投与と併用さ れることが好ましい。短期間にわたる制御された再活性化、または抗ウイルス剤 の存在下での再活性化は、特定のヘルペスウイルス感染症の悪影響を最小限にす ると信じられている（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０４６８３に記載されたご とくに）。再活性化剤としては、エストロゲン、ホルボールエステル、フォルス コリンおよびβ−アドレナリン阻害剤が挙げられる。 ヘルペスウイルス感染症の治療およびヘルペスウイルス誘発性ＫＳの治療に有 用な薬剤は、多数の米国特許に記載されている。例えば、ガンシクロビルは、米 国特許第4,355,032号および第4,603,219号に記載のタイプの抗ウイルス性グアニ ン非環式ヌクレオチドの例である。 アシクロビルは、９−（２−ヒドロキシエチルメチル）アデニンを始めとする 、米国特許第4,287,188号および第4,199,574号に記載の抗ウイルス性プリン誘導 体類の例である。 ブリブジンは、米国特許第4,424,211号に記載のタイプの抗ウイルス性デオキ シウリジン誘導体の例である。 ビダラビンは、英国特許第1,159,290号に記載のタイプの抗ウイルス性プリン ヌクレオシドの例である。 ブロバビールは、米国特許第4,542,210号および第4,386,076号に記載のタイプ の抗ウイルス性デオキシウリジン誘導体の例である。 ＢＨＣＧは、米国特許第5,153,352号、第5,034,394号および第5,126,345号に 記載のタイプの抗ウイルス性炭素環式ヌクレオシド類縁体の例である。 ＨＰＭＰＣは、米国特許第5,142,051号に記載のタイプの抗ウイルス性ホスホ ニルメトキシアルキル誘導体の例である。 ＣＤＧ（炭素環式２’−デオキシグアノシン）は、米国特許第4,543,255号、 第4,855,466号および第4,894,458号に記載のタイプの抗ウイルス性炭素環式ヌク レオシド類縁体の例である。 ホスカネットは米国特許第4,339,445号に記載されている。 トリフルリジンおよびその関連リボヌクレオシドは、米国特許第3,201,387号 に記載されている。 米国特許第5,321,030号(Kaddurah-Daoukら,Amira)は、抗ヘルペスウイルス剤 としてのクレアチン類縁体の使用について記載している。米国特許第5,306,722 号(Kimら,Bristol-Meyers Squibb)は、ＨＳＶ感染症を治療するために、またヘ ルペスチミジンキナーゼを阻害するために有用なチミジンキナーゼインヒビター について記載している。他の抗ヘルペスウイルス組成物は、米国特許第5,286,64 9号、第5、098、708号(Konishiら,Bristol-Meyers Squibb)および第5,175,165号 (Blumenkopfら,Burroughs Wellcome)に記載されている。米国特許第4,880,820号 (Ashtonら,Merk)は、抗ヘルペスウイルス剤（Ｓ）−９−（２，３−ジヒドロキ シ−１−プロポキシメチル）グアニンについて記載している。 米国特許第4,708,935号(Suhadolnikら,Research Corporation)は、ＨＳＶおよ びＥＢＶを阻害するのに効果的な３’−デオキシアデノシン化合物について記載 している。米国特許第4,386,076号(Machidaら,Yamasa Shoyu株式会社)は、抗ヘ ルペスウイルス剤としての（Ｅ）−５−（２−ハロゲノビニル）−アラビノフラ ノシルウラシルの使用について記載している。米国特許第4,340,599号(Liebら,B ayer Aktiengesellschaft)は、抗ヘルペス剤として有用なホスホノヒドロキシ酢 酸 誘導体について記載している。米国特許第4,093,715号および第4,093,716号(Lin ら,Rescarch Corporation)は、単純ヘルペスウイルスの効力あるインヒビターと して５’−アミノ−５’−デオキシチミジンおよび５−ヨード−５’−アミノ− ２’，５’−ジデオキシシチジンについて記載している。米国特許第4,069,382 号(Bakerら,Parke,Davis & Company)は、抗ウイルス剤として有用な９−（５− Ｏ−アシル−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン化合物について記載し ている。米国特許第3,927,216号(Witkowskiら）は、ヘルペスウイルス感染症を 治療するための１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミドおよび１，２ ，４−トリアゾール−３−チオカルボキシアミドの使用について記載している。 米国特許第5,179,093号(Afonsoら,Schering)は、単純ヘルペスウイルス１型およ び２型、サイトメガロウイルス並びにエプスイン・バールウイルスに対するキノ リン−２，４−ジオン誘導体活性化剤について記載している。 ｉｉｉ）投与法 本明細書で治療される対象または使用され得るその組織は、哺乳類であって もよく、さらに例示すれば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、サルまたは齧歯 類であってよい。好ましい態様において、対象はヒトである。 組成物は、投与処方に適合する様式で、かつ医薬上有効な量で投与される。投 与に必要な有効成分の正確な量は臨床医の判断に依存し、また各患者に固有なも のである。 また、初期投与および追加投与のための適切な治療プリグラムも異なり得るが 、初期投与に続く、逐次注射またはその他の投与法による１時間以上の間隔での 反復投与が典型的である。 本明細書で用いられる投与法とは、患者に投与する方法を意味する。かかる方 法は当業者に公知であり、限定されるものではないが、局所、非経腸、経口、静 脈内、筋肉内、皮下、またはエアゾールによる投与が挙げられる。該薬剤の投与 は、患者内の該医薬が、カポジ肉腫に罹患した患者またはＤＮＡウイルス関連カ ポジ肉腫に感染した患者を治療するのに効果的であるように、持続的または断続 的に行うことができる。 ヘルペスウイルス誘発ＫＳを治療するための抗ウイルス性組成物は、好ましく は経口、静脈内または非経腸投与および他の全身投与形態を介してヒト患者に投 与される。当業者は、医師により使用される個々の組成物に適した投与プロトコ ールを理解するであろう。 本発明の医薬処方または医薬組成物は固形、半固形、または例えば、懸濁液、 エアゾールなどのごとき液体の投与形態であってよい。好ましくは、該組成物は 、正確な投与量の一回投与に適した単位投与形態で投与される。また該組成物は 、所望の処方により、動物またはヒト投与のための医薬組成物を処方するために 一般的に使用される賦形剤として定義される医薬上許容される無毒の担体または 希釈剤をも含む。希釈剤は、該組成物の生物学的活性に影響を及ぼさないように 選択される。かかる希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デ キストラン溶液、およびハンクス液が挙げられる。さらに、該医薬組成物または 医薬処方はまた、他の担体、アジュバント；または無毒の、非治療学上の、非免 疫原性の安定剤などをも含む。かかる希釈剤または担体の有効量は、成分の溶解 性または生物学的活性などの点で、医薬上許容される処方を得るために有効な量 のことである。 Ｖ．治療への免疫学的アプローチ 新規なヒトヘルペスウイルスとして、ヒトにおけるＫＳの主要な病因物質を同 定したので、ウイルス感染組織の存在から生じる免疫学的機能不全を調節し得る 免疫抑制療法が提供される。特に、該ウイルス感染細胞の免疫学的な攻撃を阻止 する薬剤は、ＫＳの症状を改善し、および／または疾病の進展を軽減すると考え られる。かかる療法には、ウイルス感染細胞の免疫系ターゲッティングを妨げる 抗体が含まれる。かかる薬剤は、サイトカイン類（ウイルスの感染に応答する免 疫系をアップレギュレートする）に結合する抗体を含む。 該抗体は、単独で患者に投与してもよく、または２つ以上の抗体、他の治療剤 および組成物など（例えば免疫抑制剤、増強剤および副作用緩和剤が含まれるが 、これらに限定されない）を含む混合物として患者に投与してよもい。特に注目 すべきは、宿主のアレルギー反応を抑制するのに有用な免疫抑制剤である。興味 深 い免疫抑制剤としては、プレドニゾン、プレドニゾロン、デカドロン(DECADRON) (Merck,Sharp & Dohme,West Point,PA)、シクロホスファミド、シクロスポリン 、６−メルカプトブリン、メソトレキセート、アザチオプリンおよび静脈注射用 ガンマグロブリンまたはそれらの併用が挙げられる。注目べき増強剤として、モ ネンシン、塩化アンモニウムおよびクロロキニーネが挙げられる。これらの薬剤 の全てを、Physician Desk Reference，第41版、(1987),発行者Edward R,Barnha rt,New Jerseyに開示されたような、一般に効能があると認められている投与量 範囲で投与する。 予めヒトヘルペスウイルスまたは関連ウイルスに感染させたヒト由来の免疫グ ロブリンは、標準技術を用いて得ることができる。抗体の適切な力価はこの療法 に関して公知であり、ＫＳの治療に容易に適応される。免疫グロブリンを、非経 腸的注射または硬膜下腔内シャントによって投与することができる。手短に言う と、免疫グロブリン製剤は、ＫＳ関連ヒトヘルペスウイルスに対する抗体につい てスクリーニングされた個々の供与者から得ることができ、高力価の供与者由来 の血漿がプールすればよい。或いは、供与者由来の血漿をプールし、次いで本発 明のヒトヘルペスウイルスに対する抗体について試験して、高力価のプールをＫ Ｓ患者に使用するために選択する。 抗体を、注射可能な製剤に処方することができる。非経腸的処方は公知であり 、本発明における使用に適しており、筋肉内または静脈内投与が好ましい。治療 的に有効な量の抗体またはイムノトキシンを含む処方は、無菌の溶液、懸濁液ま たは凍結乾燥形態の何れかであり、所望により安定剤または賦形剤を含有するこ とができる。凍結乾燥した組成物は、宿主体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍ ｇ／ｋｇの適当なレベルで、適切な希釈剤、例えば注射用水、食塩水、０．３％ グリシンなどを用いて再構成される。典型的には、該抗体またはイムノトキシン を含む医薬組成物は、治療する哺乳類の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ までの範囲内の治療上有効な投与量で投与されるであろう。抗体またはイムノト キシンを含む医薬組成物の治療上好ましい有効量は、治療すべき哺乳類について 約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、これらは患 者 の投与量を逐次増加させる治療プログラムに従って、毎日それぞれ１時間以上に わたる静脈内点滴で、数日〜２週間にわたって投与されると考えられる。 抗体は、筋肉内注射、皮下注射もしくは腹膜内注射によって全身に投与しても よく、またはＫＳ病変部に直接注射してもよい。投与量は、使用する抗体または イムノトキシンの性質（例えばその活性および生物学的半減期）、処方の抗体濃 度、投与の部位および速度、関係する患者の臨床的トレランス、患者を苦しめて いる病気などに依存し、これらは医師の技量の範囲内である。 本発明の抗体は、溶液として投与され得る。該溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５ の範囲であるべきであり、好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。該抗体または その誘導体は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌま たはクエン酸塩などのような、医薬上許容される適切な緩衝剤を有する溶液であ るべきである。緩衝剤の濃度は、１〜１００ｍＭの範囲であるべきである。また 、抗体の溶液は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム等の塩を、５０〜１５０ｍ Ｍの濃度で含んでもよい。また、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミ ンまたはプロタミン塩のような有効量の安定剤を含んでもよく、これらは抗体ま たはイムノトキシンを含む溶液、または該溶液を調製するための組成物に添加し てもよい。 抗体の全身投与には静脈内点滴も許容され得るが、一般には、毎日の筋肉注射 によって行われる。また、投与は鼻腔内のまたは他の非経腸的経路によって行わ れてもよい。また、抗体またはイムノトキシンは、血液に含まれる特定の組織中 に置かれたミクロスフェア、リポソームまたは他の微粒子デリバリー系を介して 投与されてもよい。 治療上の適用において、本発明に従って用いられる化合物の投与量は、化合物 の種類および治療する条件によって異なる。受容患者の年齢、体重、および臨床 的症状、並びにその治療剤を投じる臨床医または開業医の経験および判断が、投 与量の選択に影響を与える因子に含まれる。例えば、免疫グロブリンの投与量は 、ポリクローナル抗体では１日当たり約０．１ミリグラム／ｋｇ体重〜１日当た り約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、モノクローナル抗体ではその量の約５％ 〜約２０％の範囲である得る。かかる場合には、該免疫グロブリンを静脈内点滴 と して毎日１回投与してよい。好ましくは、治療結果が達成されるまで、または副 作用によって治療の中止がやむなく正当化されるまで、投薬を毎日繰り返す。一 般に、該投与量は、患者にとって許容されない毒性を生じることなく、ＫＳの症 状または徴候を治療または改善するのに十分であるはずである。 該化合物の有効量とは、症状の主観的軽減、あるいは臨床医または他の資格あ る観観察者が気付く客観的に決定される改善の何れかを提供するような量である 。この投与量範囲は、使用する化合物、投与経路および特定の化合物の効力にに 応じて変化し得る。 ＶＩ．ＫＳのためのワクチンおよび予防 本発明は、ＫＳ予防用のワクチンとして用いるのに適した物質およびそれらの 投与方法を提供する。該ワクチンはＫＳＨＶに対して向けられるものであり、最 も好ましくは、ＫＳＨＶから得られた抗原を含んでいる。１つの態様において、 該ワクチンは弱毒したＫＳＨＶを含む。もう１つの態様において、該ワクチンは 殺したＫＳＨＶを含有する。もう１つの態様において、該ワクチンはＫＳＨＶポ リペプチドをコードする核酸ベクターを含有する。もう１つの態様において、該 ワクチンはＫＳＨＶポリペプチドを含むサブユニットワクチンである。 本発明は、ゲノムから欠失したＫＳＨＶポリペプチドをコードする遺伝子をも った組換えＫＳＨＶウイルスを提供する。該組換えウイルスは、ＫＳＨＶ感染を 予防するための弱毒ワクチンとして有用である。 本発明は、患者にカポジ肉腫に対する予防注射をする方法であって、単離した ＤＮＡ分子によりコードされる有効量のペプチドまたはポリペプチド、および適 切な許容される担体を患者に投与し、それによって患者に予防接種することを特 徴とする方法を提供する。１つの態様においては、裸のＤＮＡが、カポジ肉腫に 対する予防接種的有効量で患者に投与される。 本発明は、ＫＳＨＶによって引き起こされた疾病に対して患者を免疫感作する 方法であって、有効免疫感作量の単離ヘルペスウイルスサブユニットワクチンを 、患者に投与することを具備する方法を提供する。 Ａ．ワクチン ワクチンは、抗原として、上記で述べた合成ペプチドまたは組換えにより生産 されたポリペプチドを用いて作製することができる。典型的には、ワクチンは約 １〜５０マイクログラムの抗原を含む。さらに好ましくは、ポリペプチドの量は 約１５〜約４５マイクログラムである。典型的には、該ワクチンは、投与量が約 ０．５ミリリットルを含むように処方される。該ワクチンは、当該技術分野にお いて公知の何れの経路によって投与されてもよい。好ましくは、経路は非経腸的 である。さらに好ましくは、皮下または筋肉内投与である。 特にワクチンの技術に関するものとして、抗原の有効性を増強するための多く の戦略が存在する。例えば、ペプチドの環化または円形化は、ペプチドの抗原能 力および免疫原性能力を増加させることができる。米国特許第5,001,049号を参 照されたい。さらに一般的には、抗原を適切な担体、通常は蛋白質分子に結合さ せることができる。この方法はいくつかの側面を有する。それによって、ペプチ ドのような抗原の多重コピーを、単一のより大きい担体分子に共役させることが できる。さらに、該担体は、該抗原の輸送、結合、吸収または転移を促進する性 質を有し得る。 皮下注射のごとき非経腸的投与のための適切な担体の例としては、破傷風トキ ソイド、ジフテリアトキソイド、血清アルブミン、およびヤツメウナギ、または カサガイ、ヘモシアニンである。なぜならば、それらは得られた複合体に対して 最小の遣伝制限しか与えないからである。これらの普遍的な担体を含む複合体は 、非常に異なる遺伝子セットを有する個体において、Ｔ細胞クローンのアクチベ ーターとして作用することができる。 ペプチドと担体との間の結合は、当該技術分野において公知の方法の１つを用 いて達成できる。例示すれば、この結合では、例えば、MeansおよびFeeney,“蛋 白質改変技術の最近の総論”Bioconjugate Chem.1,2-12(1990)によって詳述され ているように、結合剤として二官能性架橋剤を用いることができる。 多数のヘルペスウイルスに対するワクチンが、首尾よく開発されている。生き た弱毒Ｏｋａ株を用いる水痘帯状ヘルペスウイルスに対するワクチンは、大人に おける水痘帯状ヘルペスの予防、並びに免疫無防備状態の子供および正常な子供 の双方における水疱瘡を予防するのに有効である（Hardy,I.ら,1990,Inf.Dis. Clin．N.Amer.4，159;Hardy,I.ら,1991,New Engl.J.Med.325,1545;Levin,M.J.19 92,J.Inf.Dis.166,253;Gershon,A.A.,1992,J.Inf.Des.166(増補),563）。また、 単純ヘルペス１型および２型は、主要な疾病に対する防護にいくらか成功して市 販されているが、知覚神経節における潜伏感染の確立を予防することにおいては あまり成功していない(Roizman,B.,1991,Rev.Inf.Disease 13(増補11),S892;Ski nner,G.R.ら,1992,Med.Microbiol.Immunol.180,305)。 ＫＳＨＶに対するワクチンは、ＫＳＨＶ包膜糖蛋白質から作製できる。これら のポリペプチドを精製して、予防接種に用いることができる(Lasky,L.A.,1990,J .Med.Virol.31,59)。ヒトヘルペスウイルスに感染した細胞由来のＭＨＣ−結合 ペプチドを、Marloesら,1991,Eur.J.Immunol.21,2963-2970の方法によって、ワ クチン候補として同定することができる。 ＫＳＨＶ抗原を、種々の溶液および当該技術分野において公知の他の化合物と 結合または混合してもよい。例えば、種々のアジュバントまたは免疫希釈剤を含 むか、または含まない水、食塩水、または緩衝化した伝達体の形で、それを投与 してもよい。かかるアジュバントまたは薬剤の例としては、水酸化アルミニウム 、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（アルム）、硫酸ベリリウム 、シリカ、カオリン、炭素、油中水ニマルジョン、水中油エマルジョン、ムラミ ルジペプチド、バクテリアエンドトキシン、脂質Ｘ、コリネバクテリウム・パル ブム(Corynebacterium parvum)（プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionib acterium acncs)）、ボルデテラ・ペルトゥシス(Bordetella pertussis)、ポリ リボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リソレシチン、ビタミン Ａ、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロック 共重合体類または他の合成アジュバントが挙げられる。かかるアジュバントは、 種々の供給源、例えば、Merck Adjuvant 65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N. J.)またはフロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Labo ratories,Detroit,Michlgan)から商業的に入手できる。他の適切なアジュバント は、アンフィゲン(Amphigen)（水中油）、アルヒドロゲル(Alhydrogel)（水酸化 アルミニウム）、またはアンフィゲンおよびアルヒドロゲルの混合物である。ア ルミニウムだけがヒトへの使用を認可されている。 抗原およびアジュバントの割合は、双方が有効量で存在する限りにおいて広範 囲にわたって変化し得る。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物の約 ０．５％（Ａｌ2Ｏ3基準）の量で存在し得る。投与量当たりを基準として、該抗 原の量は、患者当たり約０．１μｇ〜約１００μｇの蛋白質の範囲であり得る。 好ましい範囲は、投与量当たり約１μｇ〜約５０μｇである。さらに好ましい範 囲は、約１５μｇ〜約４５μｇである。適切な投与量は、約０．５ｍｌである。 従って、筋肉内注射のための投与量は、例えば、０．５％水酸化アルミニウムを 有する混合物中に４５μｇの抗原を含む０．５ｍｌで構成される。処方した後、 該ワクチンを滅菌容器に入れ、次いで封じて、低温（例えば４℃）で保存するか 、または凍結乾燥させてもよい。凍結乾燥により、安定化された形態で長期の保 存が可能になる。 経口または非経腸（例えば、皮下または筋肉内）注射を含む、ワクチンの投与 に関する何れかの従来法で該ワクチンを投与すればよい。筋肉内投与が好ましい 。治療は、ワクチンの単回投与または一定期間にわたる複数回の投与から構成さ れる。その投与量は、耐用期間の最初の８か月内にヒト患者に与えられるのが好 ましい。本発明の抗原は、インフルエンザＡ型抗原のごときインフルエンザ抗原 を含む化合物の適切な投与量と併用することができる。また、該抗原は、経口投 与に適応可能な組換えソクチンの成分ともなり得る。 本発明のワクチンを、他の疾患のためのワクチンと組み合わせて、多価ワクチ ンを作製してもよい。医薬上有効量の該抗原は、蛋白質のごとき医薬上許容され る担体、または哺乳類、特にヒトのワクチン注射に有用な希釈剤と共に用いるこ とができる。他のワクチンは、当業者に周知の方法に従って調製されてよい。 有効な免疫保護をもたらすためには、哺乳類を適切なエピトープに曝すだけで よいことを、当業者ならば容易に認識できる。該エピトープは、典型的には全蛋 白質のごく一部であるアミノ酸のセグメントである。遺伝子組換えを用いる場合 、天然の蛋白質の一次構造を変化させて、天然に存在するエピトープと同一また は実質的には同様の（免疫学的に同等である）エピトープを含む誘導体を作出す るのが通常である。かかる誘導体は、ペプチド断片、アミノ酸置換、アミノ酸欠 失およびヒトヘルペスウイルス由来のウイルスポリペプチドのアミノ酸配列のア ミ ノ酸付加を含んでもよい。例えば、あるアミノ酸残基が蛋白質の生物学的活性に 対して不適切に影響することなく、同様の大きさおよび極性のアミノ酸で置換さ れてもよいことは、当該蛋白質技術においては公知である。該ヒトヘルペスウイ ルスポリペプチドは重要な三次構造を有し、該エピトープは通常コンホメーショ ンを有する。従って、改変は一般的に、保護免疫応答を生じるコンホメーション を保持すべきである。 Ｂ．抗体予防法 治療的な静脈内のポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、周産期水痘お よびＣＭＶを含むヘルペスウイルス疾病の受動的な免疫療法の形態として用いら れてきた。従前に該ヒトヘルペスウイルスに感染し、該ウイルスに対して適切な 高力価の抗体を有するヒト由来免疫グロブリンは、抗ウイルス剤（例えば、ガン シクロビル）と組み合わせて、または現在ＫＳの治療法として評価されている免 疫応答を調節することを目的とした他の形態の免疫療法（即ち、共重合体−１、 抗イディオタイプモノクローナル抗体、Ｔ細胞“ワクチン”を用いた治療）と組 み合わせて与えることができる。ヒトヘルペスウイルスに対する抗体を、本明細 書中に記載したようにして、患者に投与することができる。該ヒトヘルペスウイ ルスに感染した細胞上に発現したエピトープに対して特異的な抗体が好ましく、 これは上述したようにして得ることができる。 ポリペプチド、その類縁体または活性断片を、中和した医薬上許容される塩の 形態として治療組成物に処方することができる。医薬上許容される塩としては、 酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基で形成した）が挙げられ 、これらは、例えば塩酸またはリン酸のごとき無機酸、または酢酸、シュウ酸、 酒石酸、マンデル酸などのごとき有機酸で形成されている。また、遊離カルボキ シル基から形成された塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル シウム、または水酸化第二鉄のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、ト リメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの ごとき有機塩基から誘導することができる。 Ｃ．治療上の効能のモニター 本発明は、（ａ）カポジ肉腫に罹患した患者由来の第一のサンプル中における 単離された核酸分子の存在を測定し、（ｂ）治療的量の薬剤を該患者に投与して 、該薬剤をサンプル中の細胞に接触させ、（ｃ）適切な時間の後に、治療した患 者由来の第二のサンプル中における単離された核酸分子の量を測定し、次いで（ ｄ）前記第一のサンプル中で測定した単離された核酸分子の量と前記第二のサン プル中で測定した量とを比較し（その差は該薬剤の効果を示す）、それによって カポジ肉腫の治療における治療効力をモニターすることを特徴とする、カポジ肉 腫の治療における治療効能のモニター方法を提供する。本明細書中で定義され“ 量”は、ウイルスの量またはコピー数である。ウイルスの量またはコピー数を決 定する方法は、当業者に公知である。 ＶＩＩ．ＫＳの症状を緩和する医薬に関するスクリーニングアッセイ ＫＳの原因または進行に関与する物質が同定および記載されたから、該物質の 生物学的活性を阻害する可能性のある医薬の同定に向けられたアッセイが可能で ある。本発明においては、薬剤が本明細書に記載したウイルスに対して活性を有 するかどうかを決定するためのＫＳ薬剤スクリーニングアッセイが考慮される。 かかるアッセイは、ＫＳ治療のための使用について評価すべき化合物を、ＫＳ関 連ヒトヘルペスウイルスポリペプチドまたはペプチドを発現する細胞と共にイン キュベートすることと、その結果から、このような病原物質(agent)の活性に対 する前記化合物の効果を測定することとを具備する。該ウイルスが適切な培養細 胞中において維持されるイン・ビトロアッセイが好ましいが、イン・ビボでの動 物モデルもまた効果的である。 注目する物質またはかかる物質由来のペプチドに対して活性を有する化合物が 、イン・ビトロ並びにイン・ビボアッセイ系においてスクリーニングできる。イ ン・ビトロアッセイとしては、ヌクレオチド類縁体、チェーンターミネーター、 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびランダムポリペプチドを始めとする、濃 度を変化させたウイルス複製を標的とする化合物の存在下において、末梢血液の 白血球またはＭＴ−４のような感受性Ｔ細胞株を、注目する病原物質で感染させ ることが挙げられる（Asadaら,1989,J.Clin.Microbiol,27,2204;Kikutaら,1989, Lancet Oct.7,861）。感染した培養物またはそれらの上清を、定量的ＰＣＲによ って、ドットブロットアッセイによって、または免疫学的方法を用いることによ って、ウイルスゲノムの存在を始めとするウイルスの総量についてアッセイする ことができる。例えば、感受性細胞の培養物を、種々の濃度の薬剤の存在下でＫ ＳＨＶに感染させ、数日後にスライドに固定し、ウイルスポリペプチドに対する モノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光法によって、ウイルス抗原を試験する ことができよう（Kikutaら,前記）。別法として、化学的に接着させたＭＴ−４ 細胞単一層を、病巣の縮小を調べるための間接免疫蛍光抗体染色を用いた感染性 病原物質アッセイに使用することができる(Higashiら,1989,J.Clin.Micro.27,22 04)。 イン・ビトロアッセイにおける全細胞の代わりに、宿主細胞から単離するか、 または組換え技術によって生産した精製ＫＳＨＶ酵素を、酵素活性に関して可能 性のある薬剤の効果を測定する合理的薬剤設計のための目標として用いることが できる。この試みに従うＫＳＨＶ酵素としては、デヒドロホレートレダクターゼ （ＤＨＦＲ）、チミジレートシンターゼ（ＴＳ）、チミジンキナーゼまたはＤＮ Ａポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。酵素活性の 測定は該物質自体に対する効果を示す。 ヘルペスウイルス産物を用いた薬剤スクリーニングは公知であり、ＥＰ０５１ ４８３０（ヘルペスブロテアーゼ）およびＷＯ９４／０４９２０（ＵL１３遺伝 子産物）に従前に記載されている。 本発明は、抗ＫＳ化学療法剤をスクリーニングするアッセイを提供する。感染 細胞を、ＫＳに対して化学治療の可能性がある化学薬剤（例えば非環式−グアノ ジン）の存在下でインキュベートすることができる。次いで、数日後、該細胞中 のウイルスのレベルを、抗原についての免疫蛍光アッセイ、ウイルスゲノムＤＮ ＡについてのサザンブロッティングまたはｍＲＮＡについてのノーザンブロッテ ィングによって測定し、対照細胞と比較する。このアッセイは、ＫＳに対して有 用かもしれない多数の化合物を速やかにスクリーニングすることができる。 さらに、本発明は、細胞質中または細胞核中の何れかにおいて、核酸分子また は蛋白質に結合可能な薬剤または他の分子を同定するために使用されるアッセイ 系を提供し、それによって転写活性を阻害または強化する。かかるアッセイは、 特定の細胞の活性に対して特異的である薬剤、または活性の時間またはレベルに おいてかかる活性を強化すると考えられる薬剤の開発に有用である。 本発明は、（ａ）細菌栄養要求体（栄養要求性突然変異体）におけるＫＳＨＶ ＤＨＦＲまたはＫＳＨＶ ＴＳを発現させ、（ｂ）該薬剤の存在または不在下に おいて、細菌の増殖速度を測定し、次いで（ｃ）かくして測定した速度を比較し てイン・ビボにおいてＫＳＨＶ ＤＨＦＲまたはＫＳＨＶ ＴＳを阻害する薬剤 を同定することを特徴とする、イン・ビボにおけるＫＳＨＶ選択的抗ウイルス剤 のスクリーニング方法を提供する。 当業者に周知の方法によって、適切な細菌栄養要求体のスクリーニングまたは 生産および細菌の増殖測定が可能になる。 抗葉酸化合物についての以下の総論は、当該技術の状態をさらに十分に記載す るために提供され、特にそれはデヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シン ターゼの阻害剤に関係する。（ａ）Unger,1996，現在の医療腫瘍学における治療 の理論：新規な抗癌剤、Journal of Cancer Research & Clinical Oncology 122 ,189-198、（ｂ）Jackson,1995,代謝経路モデリングからの毒性推定、Toxicolog y 102,197-205、（ｃ）Schultz,1995，癌治療におけるより新しい抗葉酸剤、Pro gress in Drug Research 44,129-157、（ｄ）van der WiltおよびPeters,1994， 固形腫瘍の治療におけるピリミジン抗代謝物質に対する新たな標的１：チミジル 酸シンターゼ、Pharm World Sci 16,167、（ｅ）Fleisher,1993，抗葉酸剤類縁 体：作用機構、分析の方法論、および臨床での効能、Therapeutic Drug Monitor ing 15,521-526、（ｆ）Eggottら,1993，慢性関節リウマチにおける抗葉酸剤： 仮定的な作用機構、Clinical & Experimental Rheumatology 11増補8,S101-S105 、（ｇ）Huennekensら，1992，葉酸剤化合物の膜輸送、Journal of Nutritional Science & Vitaminology臨時増刊No52-57、（ｈ）FlemingおよびSchilsky,1992 ，抗葉酸剤：次世代、Seminars in Oncology 19,707-719、および（ｉ）Bertino ら,1992，化学治療剤の標的としてのチミジル酸サイクルの酵素：抵抗性の機構 、Mount Sinai Journal of Medicine 59，391-395。 本発明は、（ａ）ｖＭＩＰ−Ｉ、ｖＭＩＰ−ＩＩまたはｖＭＩＰ−ＩＩＩの血 漿濃度を測定し、次いで（ｂ）該測定値を、測定値に対するＡＩＤＳの臨床経過 に関する標準曲線と比較して患者の健康状態を決定することを特徴とする、ＡＩ ＤＳ患者の健康状態の決定方法を提供する。 ＶＩＩＩ．ＨＩＶの治療 本発明は、ＨＩＶ複製の阻害方法であって、患者に核酸分子によってコードさ れる有効量のポリペプチドを投与するが、または該ポリペプチドで患者の細胞を 処理して、ＨＩＶの複製を阻害することを具備した方法を提供する。１つの態様 において、該ポリペプチドは、表１に与えられたリストから選んだものである。 以下、実験の詳細によって本発明をさらに詳しく説明する。これらは本発明の 理解を助けるためのものあって、後記の請求の範囲において示される発明を限定 するものではない。実験の詳細セクションＩ ＜カポシ肉腫関連ヘルペスウイルスのヌクレオチド配列＞ カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV又はHHV8）のゲノムをBC−１細胞系か らコスミド及びファージ遺伝子ライブラリーでマッビングした。そのヌクレオチ ド配列は、ゲノムの右端のクローニングし難い３ｋｂ領域を除いて決定された。 BC−１KSHVのゲノムは、複数のＧ＋Ｃに富む801bpの末端反復配列に隣接した140 .5ｋｂ長の特異的コード領域（LUR）からなる。明らかに親腫瘍において生じた ゲノムの複製が、この細胞培養物から派生した菌株中に存在していた。LURには 、少なくとも81のオープン・リーデイング・フレーム（ORFs）（その中にはヘル ペスウイルス・サイミリORFsと類似性を持つ66を含む）、及び５つの内部反復領 域が存在する。該ウイルスは、ウイルスの構造的、代謝的蛋白をコードするのみ ならず、相補的に結合する蛋白、３つのサイトカイン（二つのマクロファージ炎 症性蛋白及びインターロイキン６）、ジヒドロ葉酸・リダクターゼ、bcl−2、イ ンターフェロン調節因子、IL-8受容体、NCAM様アドヘーシン、Ｄ−型サイクリン と類似の遺伝子をコードしている。KS病巣由来ウイルスＤＮＡの末端反復を分析 することによって、KS腫瘍中にKSHVのモノクローナルの増殖があったことが示唆 される。完全なゲノム配列は、ジーンバンクの認識番号Ｕ75698（LUR）、Ｕ7569 9（TR）、Ｕ75700（ITR）に記載されている。 カポシ肉腫は、混合細胞組成の血管系腫瘍である（Tappcro et al.,1993,J.Am Acad.Dermatol.28,371-395）。組織学および重篤な免疫抑制のない人での比較 的良性なコースから、KS腫瘍細胞の増殖がサイトカイン誘導性であるという示唆 が導かれる（Ensoli et al.,1992,Immunol,Rev.127,147-155）。疫学的研究に よって、腫瘍は厳密なる免疫学的制御下にあり、HIV以外のセックスによって伝 染する感染性物質によって引き起こされるらしいことが示されている（Peterman et al.,1993,AIDS 7,605-611）。ＫＳ関連性ヘルペスウイルス（KSHV）は、表 象的相違分析（ＲＤＡ）によってAIDS−KS病巣で発見され、殆どすべてのAIDS-K S病巣に存在することがわかった（Chang et al.,1994,Scicnce 265,1865-1869） 。これらの知見は実証され、様々な疫学的クラスのＫＳを調査して得られた殆ど すべてのＫＳ病巣にまで拡大された（Boshoff et al.,1995,Lancet 345,1043-10 44; Dupin et al.,1995,Lancet 345,761-762;Moore and Chang，1995,New Eng.J.Med .332,1181-1185:Schalling et al.,1995,Nature Med.1,707-708;Chang et al.,1 996,Arch Int.Med.156,202-204）。KSHVは、今までに特定された内の第８番目の 推定ヒト・ヘルペスウイルス（HHV8）である。 該ウイルスは、二つのヘルペスウイルスＤＮＡ断片であるKS330am及びKS631Ba m（Chang et al.,1994,Science 265,1865-1869）から初めて特定された。続いて 、KS330Bamとハイブリダイズする21kb AIDS-KS遺伝子ライブラリー断片（KS5） をシーケンシングすることによって、KSHVはラデイノウイルス（Rhadinovirus） 属に属するヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＶＳ）関連のガンマ・ヘルペスウイ ルスであることが実証された（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558）。この 領域における遺伝子の同一線形的類似性、即ちシンテニー（syntcny）は、エプ スタイン・バーウイルス（EBV）とウマ・ヘルペスウイルス２（EHV2）間のみな らず、KSHVとHVS間でも維持されている。KS631Bam配列を含む12kb領域（L54及び SGL-1）には、ラデイノウイルスに特異的なサイクリンＤ遺伝子およびIL-8Ra遺 伝子が含まれる。 KSHVは、未感染細胞系に簡単には伝播しない（Moore et al.,1996,J.Virol.70 ,549-558）が、KSにしばしば関連して起こる微量Ｂ細胞の一次滲出（体腔起源） リンパ腫（PEL）中には存在している（Cesarman et al.,1995,New Eng.J.Med.33 2,1186-1191）。BC-1は、KSHVゲノムコピーを数多く含むPEL細胞系である（Cesa rman et al.,1995,Blood 86,2708-2714）。BC−１中及びその親腫瘍中のKSHVゲ ノム型は、270kbの直線マーカーと共に、バルスフィールドゲル電気泳動（PEGE ）上を共に移動する（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558）。しかしながら 、EBV陰性細胞系（Renne et al.,1996,Nature Med.2,342-346）由来の蛋白質膜 で包まれたＤＮＡゲノムに基づくゲノムサイズは、165kbと推定される(Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558)。KS病巣からの推定では、ゲノムサイズがEBVの ゲノムサイズ（172kb）よりも大きいことを示している（Decker et al.,1996,J. Exp.Med.184,283-288）。 KSHVのゲノム配列を決定し、また新規ウイルス遺伝子を特定するために、BC− 1ゲノムライブラリー由来の連続的にオーバーラップしているウイルスＤ ＮＡ挿入物をマッピングした。その右端の小さいクローン化不能な反復領域を除 き、高リダンダンシーでシーケンシングを行って、ウイルスのゲノム構造を規定 し且つKSHVに関連した病因として働く遺伝子の特定を可能にした。 ＜材料と方法＞ ライブラリーの形成およびスクリーニング：BC-1、HBL-6及びBCP-1細胞を、20 %の胎児子牛血清を加えたRPMI1640中で維持した（Moore et al.,1996,J.Virol.7 0,549-558;Cesarman et al.,1995,Blood 86,2708-2714;Gao et al.,1996,Nature Med.2,925-928）。BC-1細胞由来のDNAは、商業的に、ラムダFIXIIベクターまた はS-Cos1ベクター（Stratagene,La Jolla,CA）のいづれかにクローン化された(S ambrook et al.,1989,Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Har bor Press,Salem,Mass)。ファージ及びコスミド・ライブラリーは、標準法でス クリーンされた（Benton et al.,1977,Science 196,180-182;Hanahan and Mesel son,1983,Methods Enzymol.100,333-342）。 最初のライブラリー・スクリーニングは、KS330Bam及びKS631Bam RDA断片を使 用して行った(Chang et al.,1994,Science 265,1865-1869）。重複したクローン を、前もって特定したクローンの末端から合成したプローブを使用して、連続的 に特定した（図１）(Feinberg and Vogelstein,1983,Anal.Biochem.132,6;Melto n et al.,1984,Nucl.Acids,Res.12,7035-7056）。該マップは、コスミドZ2及びZ 6中において、多数の同型のTRユニットの存在によって円形に並べ変えられてい ると考えられた。各候補ファージ又はコスミドは、三次元スクリーニングによっ て確認された。 ショットガンシーケンシング及び配列の解明 ラムダＤＮＡ及びコスミドＤＮＡを、標準法によって精製した(Sambrook et a l.,1989,Molecular Closing:A laboratoy manual,Cold Spring Harbor Press,Sa lem,Mass.）。超音波破砕されたＤＮＡについて、ショットガン・シーケンシン グ（Deininger,1983,Anal.Biochem.129,216-223;Bankier et al.,1987,Meth.Enz ymol.155,51-93）を行なった。1-4kbの分画を、M13mp19（New England Biolabs, Inc.,Beverly MA）中にサブクローニングし、XL-1ブルー細胞(Stratagene,La Jo lla, CA）（Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Sp ring Harbor Prcss,Salem,Mass.）中で増殖させた。M13ファージは、ファージ又 はコスミド由来の挿入DNAを使用してポジティブにスクリーニンされ、ベクター ・アームDNA又は隣接するゲノムの挿入物を用いてネガティブにスクリーニング された。 自動ジデオキシサイクルシーケンシングを、M13（−21）CS+又はＦＳ染色プラ イマーキット（Perkin-Elmer Branchburg NJ）を用いて、ABI 373A又は377シー ケネータ（ABI Foster City,CA）上で実行した。各々10kbの挿入配列について 初期カバレッジを達成するためには、約300のM13配列が摸式的に必要であった。 任意の部位において、少なくとも４つの重複配列で二方向からカバーすることに より、最小限の配列（再現の）忠実性の規準が定義された。これらの規準に合致 しない配列ギャップ、不明瞭、又はフレームシフトを持つ領域については、汎用 プライマー（Perkin-Elmer）及び染色停止化合物（FS又は既製反応キット、Perk in-Elmer）を用いてプライマーウオーキングを行なった。Z2コスミド挿入物中の 右端TR配列に隣り合うシーケンシングされない3kb領域は、繰り返し努力したに も拘わらず、M13又はブルースクリプト中にクローニングすることはできなかっ た。 配列の組み立て及びオープン・リーデイングフレーム分析 配列データをファクチュラ（Factura）(ABI,Fostcr City CA)を使用して編集 し、電気泳動写真を使用して、オートアセンブラー（ABI、Foster City、CA） により一続きの配列に組み立て、アセンブリーライン（assemblyLIGN）(IBI-kod ak,Rochester NY)によって、更に大きく組み立てた。多数のシーケンシングを試 みても明瞭に解像されない塩基位置（全部で、10未満の塩基）に対して、多数派 塩基対(majority base pair)が割り当てられた。全配列（1-5kb断片）及びすべ ての予測オープン・リーデイングフレーム（ORFs）を、BLASTX、BLASTP、BLASTN （Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215,403-410）を使用して分析した。該配 列は、更にMOTIFS（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558）,REPEAT及びBESTF IT(GCG)及びMacVector（IBI,NewHaven,CT）を使用して分析された。 ORF の指定及び命名 HVSとの類似性を有する全てのORFsを特定した。これらと他の有望なORF（100 より多いアミノ酸を持つ）が、MacVectorを使用して発見された。他の既知の遺 伝子との類似性、至適開始コドンとの前後関係(Kozak、1987,Nucl.Acids Res.15 ,8125-8148）、サイズ及び位置を基にしたマップ（図１）には、HVS ORFsと類似 しないORFsも含まれていた。偽の割り当てを最小にするために、保存性選択（co nservative selection）をしたので、これによって真のリーデイングフレームの 数が少なく見積もられることになった。KSHV ORFの命名は、HVS類似性に基づい ている。即ち、HVS遺伝子と非類似のKSHV ORFsは、Kを前につけて順に番号づけ されている。配列はHVS ORFと類似しているが位置的類似性を持たないORFsは、H VS ORF番号（例えば、ORF2）が割り当てられる。新ORFsが特定された時は、こ れを小数点表記によって命名することが提唱される。KSHVゲノムの標準マッピン グ方向（図１）は、HVS（Albrecht et al.,1992,J.Virol.66,5047-5058）及びEH V2（Telford et al.,1995,J.Mol.Biol.249,520-528）の方向と同じであり、EBV 標準マップに対して逆方向である(Baer et al,1984,Nature 310,207-211)。 ＜結果＞ ゲノムマッピング及び配列の特徴 完全なゲノムマッピングが、７つのラムダ・クローン及び３つのコスミド・ク ローン（図１）を用いて完成された。BC-1 KSHVゲノムの構造は、TRユニットに 隣接したロングユニーク領域を持つ点においてHVSと類似している。〜140.5kbの LUR配列は、53.5％のG+C含有率を持ち、全て特定されたKSHV ORFsを含む。TR領 域は、有望なパッケージング部位及び開裂部位を備えた、84.5％のG+C含有率（ 図２Ａ）を持つ複数の801bpの直列反復ユニットからなる。反復ユニット間には 、わずかな配列の変異が見られる。基本型TRユニットと比較すると、左（Z6）TR ジャンクション（205bp）における最初のTRユニットはBC-1においては、欠損し かつ先端が切除されている。 シーケンシング・ベクター中にクローニングすることができないZ2コスミッド 挿入物中の3kb領域に起因して、右末端反復領域に隣接するゲノム配列は完成 されていない。プライマー・ウオーキングから得られた部分配列情報では、この 領域には、16bpのC+Tに富む不完全な直列反復の伸長物を少なくとも一つ有する 、16bpのA+Gに富んだ不完全な直列反復の複数の伸長物が点在している。これら は長い逆反復を形成し得るものであり、この領域は我々のサブクローニングに困 難を強いた。非クローン化領域を除いて少なくとも４回の重複読み取りによって 、全体のLURについて、完全な二方向性のカバレッジで12倍の以上の平均配列リ ダンダンシーが達成された。 その反復構造に起因して全領域のシーケンシングは不可能なので、BC-1TR領域 をサザン・ブロテイングによって調査した。TR内を一個所切断する酵素で消化さ れたとき、BC-1、BCP-1（EBV陰性、KSHVに感染した細胞系）及びKS病巣DNAsは、 単位長の反復配列と一致し且つTRプローブとハイブリダイズする〜800bpの強い シグナルを有する（図2B,2C）。TR内を切断しない酵素での消化により、BC-1菌 株は、7kb及び〜35kbTR配列に隣接し、TR中に埋められた特異的領域が含まれて いることが示される（図2C及び2D）。BC-1と同様の腫瘍から別個に派生した細胞 系、即ち、HBL-6中に、同一のパターンの発生が見られた。このことは、親腫瘍 中で、このような複製が存在していたことを示唆する（図2C及び2D）。NotIによ る制限パターン（NotIは、又TR内を一回だけ切断するがLUR内を殆ど切断しない ）によると、埋め込み領域は少なくとも33kbであることが示唆される。この領域 を部分的にシーケンシングすると、正確なゲノムの重複は、ORF K8に始まること が実証される。該LURは、右端のシーケンシングされていないギャップ（＜3kb） を含んだ140kbである。BC-1及びHBL-6(重複領域を含む)における推定のKSHVゲノ ムサイズは、約210kbである。 クローン性の研究（Raab-Traub and Flynn,1986,Cell 47,883-889）で使用さ れるEBV複製モデルに基づくと、多形BCP-1梯子パターンは、溶解性のウイルス複 製及びスーパー感染（図2C）を反映している可能性がある。EBV梯子パターンは 、溶解複製を行なっている間にTRユニットが欠損又は重複した時に発生し、各感 染細胞について、確率論的に起こるプロセスである（Raab-Traub and Flynn,198 6,Cell 47,883-889）。潜在的KSHV複製の緊密な制御下にあるBC-1につい ては、梯子は存在しない（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558）。KS病巣Ｄ ＮＡは又、単一のハイブリッド・バンドを示し、これは、KS腫瘍細胞中のウイル スがモノクローナル起源でありうることを示唆している。 KSHV LUR の特徴及びコード領域 KSHVゲノムは、他のヘルペスウイルス（Chee et al.,1990,Curr.Topics Micro biol.Immunol.154,125-169）の７ブロック(B)組織を共有しており、それに伴っ てサブファミリー特異的もしくはユニークなORFsが、ブロック間（ブロック間領 域(IB)a-h、図１）に存在する。ORF分析によって、シーケンシングされた137.5k b LURの79％のみが、81の同定可能なORFsをコードしていることが示され、これ はORF位置の保存的割り当てに起因していると思われる。全LUR CpGジヌクレオチ ドの観測／予測（O/E）比は0.75で、この比は、メチル化されたシトシンが適度 に失われていることと一致していたが、場所によって変異が著しい。最低のCpG O／E比（＜0.67）は、IBa（bp 1-3200）、B5(68,602-69,405）及びIBh（117,3 52-137,507）で生じている。最高のO／E比（＞0.88）は、B2からB3（30,701-47, 849）にわたってと、IBe(67,301-68600)及びB6(77,251-83,600)で生じている。K S5配列（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558）との比較では、これら二つの 菌株の間には高い配列保存性が見られ、比較された20.7kb領域(0.1％)にわたっ て21のポイント変異しが見られない。KS5ORF28と比較すると、BC-1ORF28（ポジ ション49,004）内のフレームシフトは、Ks5及びBC−１から増幅されたPCR産物を 繰り返しシーケンシングしたにも拘わらず、解像不可能であった。KS5配列と比 較して、非コード領域（bp 47,862,49,338）には別に二つのフレームシフトも存 在している。 LUR（図１）中には、幾つかの反復領域がある。ORF k11内のポジション92,678 -92,820及び92,852-92,994(waka/jwka)では143bp配列が、繰り返されている。ゲ ノムの他の領域には、複合反復が存在する。すなわち、24、285-24、902（ｆｒ ｎｋ）の領域には20-30bpの反復が、29、775と29、942（ｖｎｃｔ）塩基の間に は、13bpの反復、二つの別々の反復は、塩基118、123と118、697（zppa）間に伸 びており、15の異なる11−16ｂｐの反復が、124,527から 126,276(moi)の領域にわたって存在する。複合体Ａ−Ｇに富む反復領域(mdsk)は 、137,099に始まり、非シークエンス・ギャップ中に伸びている。 他のヘルペス・ウイルスに見られる類似遺伝子を持つ保存ORFsが表１に掲載さ れており、それに沿って、その極性、マップ位置、サイズ、HVS、EBV ORFsとの 関連性、及び推定機能が掲載されている。ウイルス構造蛋白及び酵素の保存され たORFsのコードには、ウイルスDNA複製（例えば、DNAポリメラーゼ（ORF9））、 ヌクレオチド合成（例えば、ジヒドロ葉酸・リダクターゼ(DHFR、ORF2)、チミジ ル酸シンターゼ(TS、ORF70)、遺伝子発現の調節因子（R、トランスアクチベータ (LCTP、ORF50)、５つの保存されたヘルペス・ウイルス構造キャプシドに関わる 遺伝子、及び５糖蛋白遺伝子が含まれている。 HVS ORFsと類似の幾つかの遺伝子はまた、ユニークな特徴を持つ。ORF45は、 核及び転写因子（チックヌクレオリン及び酵母SIR3）と類似の配列を持ち、また ORF45はトランスアクチベータ蛋白に典型的な伸長酸性ドメインを、アミノ酸90 と115間に持っている。ORF73は、moi反復によってコードされるグルタミンに富 む配列によって二つの領域に分けられた伸長酸性ドメインを持つ。最初の領域は 、もっぱら殆どアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の反復によって構成される 。これに対して、第二のグルタミン酸に富む領域は、レクチンジッパー構造を示 唆する、反復レクチン七価元素モチーフを持つ。ORF75、即ち、推定外皮蛋白は 、大腸菌のプリンのバイオ合成酵素及びD.メラノガスターのＮフォルミルグリシ ンアミド・リボタイド・アミドトランスフェラーゼ（FGARAT）と高レベルの類似 性を持っている。 ORFs K3及びK5は、HVS遺伝子と類似してはいないが、主な前初期（immediate early）ウシヘルペスウイルス・タイプ４(BHV4)遺伝子IE1（夫々、12及び13％類 似）と類似している(van Santen,1991,J.Virol.65,5211-5224)。これらの遺伝子 は、ヘルペス・シンプレックスウイルスＩ（HSV1）a0(BHV4 IEIと類似)とは有意 な類似性を持たないが、HSV1 ICP0蛋白と共通する蛋白をコードし、そのシステ インに富む領域は、ジンクフィンガーモチーフを形成し得る（van Santen，1991 ,J.Virol.65,5211-5224）。ORF k5によってコードされる蛋白は、BHV4蛋白の後 期型に存在する核の局在部位と類似する領域を持つ。ORF K8は、プリン結合モチーフ（GLLVTGKS）を、KSHV TK(ORF21)に存在するモチーフ と類似する該蛋白のＣ−末端に持つ（Moore et al.,1996,J.Virol.70,549-558） 。 HVC ORFs 1,3,5,12,13,14,15,51及び71と類似性を持つKSHV遺伝子はKSHV LUR 配列内では特定されなかった。HVC ORFIは、インビトロのHVSに誘導されるリン パ球の形質転換（Akarl et la.,1996,Virology 218,382-388）に関与する形質転 換蛋白をコードし、HVS菌株間の配列保存性は低い(Jung and Dcsrosiers,1991,J .Virol.65,6953-6960,Jung and Descrosicrs,1995,Molec.Cellular Biol.15,650 5-6512)．この遺伝子と類似の機能的KSHV遺伝子が存在する可能性があるが、配 列比較によっては特定できなかった。このように、EBV潜伏、形質転換に関与す る蛋白と類似のKSHV遺伝子（EBNA-1,EBNA-2,EBNA-LP,LMP-1,LMP-2、及びGP350/2 20）は、これらの遺伝子中に存在する反復配列が類似性しているにもかかわらず 、発見されなかった。KSHVはまた、BZLF1EBVトランスアクチベータ遺伝子と類似 した遺伝子も持っていない。 幾つかの配列は、発現された遺伝子の特徴をもっているけれども、所与のORF 分析の課題ではなかった。bp 90,173と90、643の間の配列は、多くのαヘルペス ・ウイルス（偽狂犬病EHV1）によってコードされる分泌される糖蛋白Ｘ（gX）の 前駆体と類似しており、ウイルス構造の一部を形成していない。FHV1における同 族遺伝子のように、KSHV型は、偽狂犬病遺伝子の高酸性カルボキシ末端を欠いて いる。 BCBL−l中で高コピー数で発現される二つのポリアデニレート転写物は、IBb中 ではポジション28,661-29,741(T1.1)で、IBh中では、ポジション118、130-117、 436(T0.7)に存在し、Ibhでは、118、130-117、436(T0.7)に存在する。T0.7は、6 0残基のポリペプチド(ORF K12、カボシンとも呼ばれる)をコードし、T1.1は、U RNA様転写物ではないかと推測されている。 細胞サイクル調節及び細胞シグナリング蛋白 KSHVに特異的であるが又は他のガンマヘルペスウイルスとだけ共通する多くの ORFは、腫瘍蛋白及び細胞シグナルリング蛋白と類似の遺伝子をコードしている 。ORF16は、EBV BHRF1及びHVS ORF16と同様に、Baxに媒介されるア ポトーシスを阻止できる機能的Bc1-2様蛋白をコードしている。ORF72は、HVSで も見られる（Nicholas et al.,1992,Nature 355,362-365）機能的サイクリンＤ 遺伝子をコードしており、これは網膜芽細胞腫瘍抑制蛋白をリン酸化する際にヒ トサイクリンＤを代替できることがわかった。 KSHVは、他のヒトヘルペス・ウイルスには見られない、機能的に活性なIL−6( ORF K2)及び二つのマクロファージ炎症性蛋白（MIPs）(ORFs K4及びK6)をコード している。vIL−６は、ヒトIL−６と62％のアミノ酸類似性を持ち、マウスの骨 髄腫細胞アポトーシスを防ぐ際に、ヒトIL−6を代替することが可能である。両M IP様蛋白は、βケモカインに特徴的なＣ−Ｃダイマーのサインを保存し、またそ のＮ−末端領域においてヒトMIP−１αに対してほぼ配列同一性を保存している 。vMIP−1(ORF K6)は、CCR−5依存性HIV−１複製を阻止可能である。ヌクレオチ ド数（ｂｐ）22、529−22、185（vMIP−III）にわたるオープン・リーデイング ・フレームは、MIP1β（BLASTX ポアソンp=0.0015）については低保存性である 、Ｃ−Ｃダイマー・モチーフを保持している。ORF K9(vIRF1)は、ヒト・インタ ーフェロン調節因子(IRF)（David,1995,Pharmac,Ther.65,149-161）のファミリ ーとの類似性を持つ449残基の蛋白をコードしている。ORF K9は、ヒト・インタ ーフェロン・コンセンサス配列結合蛋白及びＩＲＦ−ＤＮＡ結合ドメインの部分 的保存に対して13.4％のアミノ酸同一性を持つ。bp 88,910-88,410(vIRF2),bp 9 0541-89,600(vIRF3),及びbp 94,127-93,636(vIRF4)にある別の三つのオープン・ リーデイング・フレームは、IRF様蛋白との類似性は低い（p＞0.35）。保存され たインターフェロンのコンセンサス配列は、ゲノムのこの領域には見られなかっ た。 シグナル伝達ポリペプチドをコードしている他の遺伝子(他のヘルペス・ウイ ルス中にも見られるが)としては、補体結合蛋白（v-CBP,ORF4）、神経系細胞の 付着分子（NCAM様蛋白）（v-adh,ORF K14）、及びIL8レセプター(ORF 74)が挙げ られる。ORFs4及び74に類似の遺伝子は、他のラデイノ（rhadino）ウイルス中に 存在し、ORF4は、牛痘B19L及びD12L蛋白と類似する。ORF K14（v-adh）は、ラッ ト及びヒトOX−２膜抗原、種々のNCAMs及びポリオウイルス受容体関連蛋白PRRI と類似する。また、OX-2はヒト・ヘルペスウイルス６及び 7のORF U85と類似するが、KSHVとβヘルペスウイルスＯＸ−2／NCAM ORFsの間に は顕著な類似性はない。他のイムノグロブリン族付着蛋白のように、v-adhは、 Ｖ様、Ｃ様、膜内外及び細胞質ドメイン、及びフィブロネクチンRGD結合部位を 、残基268−270に持っている。vIL-8Rは、EBVに誘導されるEBI1蛋白（Birkenbac h et al.,1993,J.Virol.67,2209-2220）を含む、Ｇ蛋白と共役する化学誘因性受 容体に特徴的な７つの膜貫通ドメイン構造を持っている。 ＜考察＞ BC−１細胞におけるKSHVゲノムの完全長配列によって、KSHV関連病因の分子機 構を研究する機会が与えられる。該KSHVゲノムは、ゲノムを円形化していると推 定される部位である高Ｇ＋Ｃ末端反復領域に隣接した、単一の特異的コード領域 を含むラデイノウイルスゲノムの標準的特徴をもっている。ヘルペス・ウイルス の複製及び構造に関与する66の保存されたヘルペスウイルス遺伝子を持っている ことに加え、KSHVは、細胞サイクル調節及びシグナル蛋白を模した多くの蛋白を コードしている点で特異的である。 我々が推定したBC−１由来ゲノムのサイズ(重複部分を含む210kb)は、蛋白質 の膜で包まれたビリオンDNA（Zhong et al.,1996,Proc.Natl.Acd.Sci.USA 93,66 41-6646）を使用して発見されたものと一致している。ゲノムが再配置されるこ とは、培養されたヘルペス・ウイルス（Baer et al.,1984,Nature 310,207-211; Cha et al.,1996,J.Virol.70,78-83）では一般的なことである。しかしながら、 BC-1 KSHV中に存在しているゲノム複製は、組織培養を行なっている間には生じ なかったであろう。TRのハイブリダイゼーション研究によって、複製したLUR断 片のBC−１ TR中への挿入が、独立誘導されたHBL−6細胞系由来のKSHV中にも存 在していることを示している（Gaidano et al.,1996,Lcukemia 10,1237-40）。 このゲノムの再配置にも拘わらず、KSHVゲノムはコード領域内で良好に保存さ れている。BC−１とKS病巣から単離された21kb KS5断片の間には0.1％未満の塩 基対変異がある。もっと高いレベルの変異が、他の地域由来又は他の疾病条件由 来の菌株中に存在するかもしれない。LUR内においては、HVSに対するシ ンテニーがORFs2及び70では失われているが、HVSを保存している他のすべての領 域では一致が見られる。チミジンキナーゼ（TK）（Cesarman et al.,1995,Blood 86,2708-2714）TS及びDHFR（HVSに存在する、Albrecht et al.,1992,J.Virol.6 6,5047-5058参照）等の幾つかの保存された遺伝子は、現存の薬物にとって適切 な標的である蛋白をコードしている。 細胞サイクル調節及びシグナル蛋白のKSHVによる分子的模倣は、ウイルスの傑 出した特質である。KSHVゲノムは細胞の補体結合蛋白(ORF4)、サイトカイン(ORF sk2、K4及びK6)、bc1-2蛋白(ORF 16),サイトカイン伝達経路蛋白(K9)、IL−8R様 蛋白(OFR74)及びＤ−型サイクリン(ORF72)と類似の遺伝子を保持する。MIP及びI RF様蛋白との一定の類似性を持つ蛋白をコードしているその他の領域も又、KSHV ゲノムに存在する。細胞遺伝子と類似するKSHV遺伝子とEBV感染によって誘導さ れることが知られた細胞遺伝子の間には、顕著な類似性がある。細胞性サイクリ ンD、CD21／CR2、bc1-2,IL-8様蛋白（EBI1）、IL−6及び付着分子は、EBV感染に よってアップレギュレートされる（Birkenbach et al.,1993,J.Virol.67,2209-2 220;Palmero et al.，1993,Oncogene 8,1049-1054;Finkc et al.,1992,Blood 80 ,459-469;Finke et al.,1994,Leukemia & Lymphoma 12,413-419;Jones et al.,1 995,J.Exper.Med.182,1213-1221）。これによって、KSHVは、EBVが感染後に変更 するのと同じ信号及び調節経路を変更するが、それは、それ自身のゲノムから外 来遺伝子を導入することによってなされることが示唆される。 ウイルス感染に対する細胞防御には、通常細胞サイクルの停止、アポトーシス （概論として、Shen and Shenk,1995,Curr.Opin.Ggenet.Devel.5,105-111を参照 ）及び細胞を媒介とする免疫の構築が関与する。KSHVにコードされるv―bcl―2 、v-cyclin及びv-IL-6は、アポトーシス又は細胞サイクル停止のどちらかを防止 する活性がある（Chang et al.,1996,Nature 382,410）。β―ケモカインKSHV遺 伝子産物の少なくとも一つ、v-MIP-Iは、トランスフェクトされた細胞のCCR5に 媒介されるHIV感染を防止する。EBVの感染したＢ細胞は、通常の扁挑リンパ球よ りも高レベルのMIP−１αを発現するけれども（Harris et al.,1993,151,5975-5 983）、β−ケモカインが、細胞のEBV感染を成功させるために必要 であることは知られていない。EBV感染Ｂ細胞の自己分泌が、IL−6（Tosato et al.,1990,J.Virol.64,3033-3041）に加えて、小さくかつ特徴付けされていない 蛋白因子に対する依存性を持つことは、EBVのライフサイクル中でβケモカイン も重要な役割を果たしているのではないかとの見解を導く。 KSHVが、正式に形質転換ウイルスであることは示されておらず、また、HVS及 びEBVの主要形質転換遺伝子に類似した遺伝子は、BC−１菌株KSHV中には存在し ていない。にも拘わらず、特定された、KSHVをコードする原癌遺伝子及びサイト カインによって引き起こされる細胞増殖制御の調節異常は、ウイルス感染細胞の 腫瘍性増殖に寄与し得る。予備研究では、サブゲノムKSHV断片は、NIH3T3細胞を 形質転換する可能性があることが示唆されている。EBVの複製のように、KSHV複 製には、TRユニット(Raab-Traub and Flynn,1986,cell 47,883-889)の組み替え が関与しているとするなら、KS病巣に存在する単形性TRのハイブリダイゼーショ ン・パターンが、腫瘍中のクローン性ウイルス集団を示すことになる。これは、 KSHVが「乗客ウイルス」であるというよりも、むしろKSが単一に形質転換された KS感染細胞から生じる真の腫瘍性増殖物であることと一致する。現在の研究にお いて既知のオンコプロテイン及び細胞増殖因子に類似したKSHV遺伝子の同定は、 KSHVが形質転換ウイルスであるかもしれないという証拠を提供する。実験の詳細セクションＩＩ： ヒトサイトカイン及びサイトカイン反応経路遺伝子の、 KSHVによる分子的模倣 二つのヒトマクロファージ炎症性蛋白(MIP)ケモカインであるIL−6及びインタ ーフェロン調節因子(IRF又はICSBP)ポリペプチドと類似の蛋白をコードしている ４つのウイルス遺伝子が、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)のゲノム中に 存在している。これらの遺伝子の発現は、感染細胞系において、ホルボール・エ ステルで誘導可能である。vIL−６は、B9細胞増殖分析において機能的に活性で ある。vIL-6は、KS病巣よりも、むしろKS感染造血細胞において主に発現される 。vMIP−Iは、CCR5依存性HIV−１菌株の複製をインビトロで阻害 するが、このことは、vMIP−Iが機能的であり、且つこれら二つのウイルスの間 の相互作用に寄与することを示している。KSHVが細胞のシグナル蛋白を模倣する ことは、ホスト細胞の防御を阻止して、KSHV関連腫瘍の形成に寄与する。 カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）は、エプスタイン・バー・ウイルス (EBV)及びヘルペスウイルス・サイミリ(HVS)に関連したガンマ・ヘルペス・ウイ ルスである。KSHVは、さまざまなタイプのHIV関連KS及びHIV無関連KSを含む殆ど すべてのKS病巣に存在する（Chang et al.,1994,Science 265,1865-1869;Boscho ff et al.,1995,Lancet 345,1043-1044;Dupin et al.,1995.Lancet 345,761-762 ,Schalling et al.,1995,Nature Med.1,707-708）。ウイルス性DNAは、KS腫瘍に 優先的に局在しており(Boshoff、et al.1995、Nature Med.1、1274一1278)、血 清学的研究では、KSHVがKSと特異的に関連していることが示されている。原発性 浸出リンパ腫(PEL)、微量Ｂ細胞リンパ腫、キャストルマン疾病のある型等のKS 罹患患者で頻繁に発生する関連リンパ球増殖疾患もまた、KSHV感染と関連する（ Cesarman et al.,1995,New Eng.J.Med.332,1186-1191;Soulier et al.,1995,Blo od 86,1276-1280）。３つのKSHVをコードするサイトカイン様ポリペプチド及び インターフェロン調節因子遺伝子と類似のポリペプチドが、現在のところ特定さ れている。逆説的ではあるが、サイトカイン調節不全によってカポシ肉腫が引き 起こされることが提議されているのに対して（Ensoli et al.,1994,Nature 371, 674-680;Miles,1992 Cancer Treatment & Research 63,129-140），過去10年に わたるこれらの研究のために使用されたインビトロ紡錘細胞系は、一様にKSHVに は感染していない（Ambroziak et al.,Science 268,582-583;Lebbe et al.,1995 ,Lancet 345）。 KSHVゲノム中にある特異的な遺伝子を特定するために、BC−1、つまりKSHV及 びEBVの両者を安定的に感染させた非ホジキンリンパ球細胞系（Cesarma et al., 1995,Blood 86,2708-2714）由来のスーパーコス−1（Supercos-1）及びラムダFI XIIゲノム・ライブラリーを使用して、ゲノムのシーケンシングを行なった（方 法の項を参照）。KSHV DNA断片であるKS330Bam及びKS631Bam（Chang et al.,199 4,Science 265,1865-1869）を、マッピング及び二方向シーケンシングにおける ハイブリダイゼーションの開始点として使用した。 Z6コスミッド配列のオープン・リーデイング・フレーム(ORF)分析（方法参照） では、二つの別々のコード領域（ORFsK4及びK6）を、βケモカインと類似性を持 つ配列、及びヒト・インターロイキン-6（huIL-6）と類似の第三のコード領域(O RF K2)が特定され、第４のコード領域が、インターフェロン調節因子(IRF)ポリ ペプチド(図3A−3C)と類似の配列を持つZ8コスミドに挿入配列中に存在している ことを特定した。KSHV遺伝子はどれも他の既知のウイルス性遺伝子と類似してい ない。ちなみに、βケモカイン・モチーフのサインと類似の保存システイン・モ チーフを持つ蛋白が、軟属種伝染性ウイルス（ＭＣＶ）ゲノム中で最近報告され ている。vMIP-IもvMIP−IIもMCV蛋白との顕著な類似性はない。 これら４つのウイルス遺伝子に対する細胞対応物は、感染に対する細胞応答に 関わるポリペプチドをコードしている。例えば、8―10kDaのβ化学誘因性サイト カイン（ケモカイン）のMIP／RANTES(マクロファージ炎症性蛋白／活性化されて 調節され、通常のＴ細胞が発現され、分泌される）ファミリーは、ウイルス感染 によって起こる炎症に重要な役割を果たす（Cook et al.,1995;Scicece 269,158 3-1585）。β-ケモカインは、CCR5の天然のリガンドであり、非シンシチウム誘 導性(NSI)の一次リンパ球及びマクロファージ刺激HIV−１菌株のインビトロでの 侵入を、このHIV共レセプターと結合することによって阻止できる（Cocchi et a l.,1995,Science 270,1811-1815）。初めに記載したが、IL−6は、Ｂ細胞分化に 与えるその効果（Hirano et al.,1985,Proc Natl Acd Sci,USA 85,5490;Kishimo to etal.,1995,Blood 86,1243-1254）により、多種多様の細胞に影響を及ぼして 多面発現させ、多数の骨髄腫、多中心粒キャトルマン病（KSHV関連疾病）、AIDS −KS及びEBV関連移植後のリンパ球増殖疾患の病因となり得る（Klein et al.,19 95,Blood 85,863-872:Hilbert et al.,1995.,J.Exp Med 182,243-248;Brandt et al.,1990,Curr Topic Microbiol Immunol 166,37-41;Leger et al.,1991,Blood 78,2923-2930;Burger et a;.,1994,Annal Hematol 69,25-31;Tosato et al.,19 93,J Clin Invest 91,2806-2814）。IL6産生は、EBV又はCMV感染のどちらかによ って誘導され、ヌードマウス中でその腫瘍形成性を高めるEBV感染リンパ芽細胞 を自己分泌させる因子である（Tosato et al.,1990,J.Virol 64,3033-3041;Scal a et al.,1990.J.Exp med 172,61-68;Almcida et al.,1994,Blood 83,370-376） 。KS病巣か ら派生する細胞系は、KSHVに感染していなくても、IL−6を産生しかつ反応する( Miles et al.,1990.Proc Natl Acad Sci USA 87,4068-4072;Yang et al.,1994,J .Immunol 152,943-955)。MIP及びIL−6が分泌されたサイトカインであるのに対 して、IRFファミリーのポリペプチドは、γ又はα／βインターフェロンサイト カインと反応して、インターフェロン誘導可能なプロモータ領域内で特異的なイ ンターフェロン・コンセンサス配列と結合することにより、インターフェロン誘 導可能な遺伝子を調節する。インターフェロンに対する一連の広範な細胞反応は 、IRFポリペプチドのリプレッサー又はトランスアクチベータの作用により変調 され、また数種のメンバー(IRF-1及びIRF-2)は相反する抗腫瘍形成性及び腫瘍形 成活性を有する（Scharf et al.,1995,J.Biol Chem 270,13063-13069;Harada et al.,1993,Science 259,971-974;Weisz et al.,1994,Internat Immunol 6,1125- 1131;Weisz et al,1992,J.Biol Chem 267,25589-25596） 289bpのORF K6（ORF MIP1）遺伝子は、huMIP-1αに対して37.9％のアミノ酸同 一性（71％同等性）を有し、且つ別のβケモカイン（図３Ａ）との若干低い同等 性を有する10.5kDaのポリペプチド（vMIP-I;MIP1）をコードしている。ORF K4は 又、vMIP-Iに非常に近似し且つアミノ酸疎水性である推定10.5kDaのポリペプチ ド(vMIP-II;vMIP1α-II)コードしている。該二つのKSHVをコードするMIPβケモ カインは、KSHVゲノム上で、少なくとも40RFs（方法参照）を含む5.5kbの介在配 列によってお互いに分離されている。両ポリペプチドは、保存された、特徴的な Ｃ−Ｃジシスチン・ダイマー（図3A、残基36―37）を含むβケモカイン・モチー フ（図3A,残基17―55）を持ち、又残基56―84でヒトMIP−１αとほぼ配列同一性 を持つ。しかしながら、該二つのポリペプチドは、お互いに僅か49.0％アミノ酸 同一性を示し、ヌクレオチドレベルでは著しく多様である。このことは、この複 製はクローニングアーティクラフトではないことを示している。該二つのウイル ス性ポリペプチドは、huIMP-1α,huMIP-1αあるいはhuRANTESに対するよりも、 系統発生学的に相互にもっと綿密に関連している。これによって、それらペプチ ドはホストゲノムから非依存的に獲得されたものではなく、むしろ遺伝子の複製 によって生じたことが示唆される（方法の配 列整列参照）。ウイルスゲノムのこの二重遺伝子量(double gene dosage)の理由 はわからない。 KSHV ORF K2(図３)は、ヒトポリペプチドに対する24.8％のアミノ酸同一性及 び62.2％の類似性をもった、疎水性の19アミノ酸分泌シグナルリングペプチドを 有する204残基で、23.4kDaのIL-6様仮想ポリペプチドをコードしている。vIL-6 は又、IL-6様インターロイキン（ギャップポリペプチドのアミノ酸101−125）に 特徴的な保存配列を持ち、のみならずIL-6ポリペプチド（ギャップ配列残基、図 ３中、位置72、78、101及び111）に存在する保存された４つのシステインを持つ 。IL-6は糖化されたサイトカインであり、vIL-6配列中には、N-リンク被糖化部 位が、図3C中のギャップ位置96と107に存在する。ORF K9でコードされる449残基 のKSHV vIRFポリペプチドは、そのヒト細胞複製物との全アミノ酸同一性（約13 ％）がvMIPs又はvIL-6のいずれよりも低いが、しかしポリペプチドのIRFファミ リーから派生する保存領域を持つ（図3C,ギャップ残基88―121）。この領域は、 DNA結合に関与すると考えられている４つのトリプトファンのうち二つだけが位 置的に保存されているが、トリプトファンに富むIRF ICS DNA結合ドメインを含 んでいる。IRF同一性が明らかに低い87残基の親水性Ｎ末端がこの領域に先行し ている。IRFファミリーのトランスアクチベータ／レプレサー領域に対応するＣ 末端のアミノ酸同一性の程度は低い。 ４つのKSHV細胞シグナル経路遺伝子は、ウイルスが感染した細胞系において、 ノーザン・ブロテイングによる同様の発現パターンを示す(方法の項参照)。全RN Aが、BCP−１（KSHVのみが感染した細胞系）及びBC−1（EBV及びKSHVが共に感染 している；Cesarman et al.,1995,Blood 86,2708-2714参照）から、20ng/mlの12 -O-テトラデカノイル・ホルボール-13-アセテート(TRA,Sigma,St.Louis MO)で48 時間、前処理を伴って又は前処理を伴わずに抽出された。これらの遺伝子の構造 的発現は、該二つの細胞系の間で変化したが、４つの遺伝子の転写物すべての発 現は、TPA誘導の後のBCP-1細胞、BC-1細胞において増加した(図4A-4D)。このパ ターンは、溶解期のウイルスが複製している間に主に生じる発現と一致している 。BCP-1及びBC-1ウイルスの末端反復配列を調べると、TPA誘導無しで、BCP-1中 で低レベルのウイルスの溶解性複製が生じるが、BC-1中 では生じない（方法参照）こと、及びBC-1においてDNA複製の抑制があるにも拘 わらず、TRA処理によって両細胞系が誘導されて溶解フェーズ遺伝子を発現する ことが実証された。特にvIL-6（図4C）及びvIRF（図4D）については、低レベル の潜在発現も起こっているらしい。というのは、これらの転写物が、TPA誘導無 しでも厳密な潜在性規制下にあるBC-1中で検出可能であるからである。インビト ロのKS紡錘細胞培養物が、これらの遺伝子を含む欠損又は部分ウイルス配列を保 持しているかどうかを定めるために、DNAを４つのKS紡錘細胞系(KS-2、KS-10、K S-13、KS-22)から抽出し、vMIP-I、VMIP-II、vIL-6及びvIRF配列についてPCR増 幅をした（方法参照）。紡錘細胞DNAサンプルはどれも、該４つの遺伝子の何れ についても陽性ではなかった。 vIL-6が機能的に保存されているかどうかを定めるために、バイオアッセイ及 び抗体局在化研究を使用して、vIL-6を更に詳しく調査した。組み替えvIL-6（rv IL-6）は、huIL-6と交差反応しない抗ペプチド抗体によって特異的に認識される (図5A−5B)（方法参照）。vIL-6は、BCP-1細胞で構造的に産生され、ノーザン・ ハイブリダイゼーション実験と一致して、48時間TPA誘導後著しく増加している 。KSHV及びEBVの両者で共感染したBC-1細胞系は、TPA誘導後vIL-6ポリペプチド を発現する（図5A、レーン3―4）、また、コントロールのEBV感染したP3HR1細胞 は、ｖＩＬ−６発現に対して、陰性であった（図5A、レーン5―6)。TPA誘導（21 ―25kDa）後に現れた複数の高分子量のバンドは、ポリペプチドの前駆体型を示 しているのかもしれない。huIL-6とvIL-6の間の非相同性領域があるにも拘わら ず、Il-6依存性マウス形成細胞腫細胞系Ｂ９を使用した機能的バイオアッセイに おいては、ウイルス性インターロイキン６は生物活性を持つ（方法参照）。正方 向構築物(rvIL-6)からのCOS7上澄み液によって3Ｈチミジン取り込みで測定され るB9細胞増殖が支持され、これはvIL-6がB9アポトーシスを防ぐ際に細胞性IL-6 と代替可能であること(図6)を示すものである。図６に示される実験から、vIL-6 によって支持されるB9増殖は投与量依存性であり、非濃縮上澄み液はhuIL-6、1m lに付き約20pgに等しい生物活性を持つ。 非誘導BCP-1細胞(図7A)の43％が細胞内原形質vIL-6免疫染色(方法参照)された ことは、培養された感染細胞において構成ウイルスポリペプチド発現される ことを示唆するのに対して、未感染のコントロールP3HR1細胞中には非特異的免 疫反応染色は見られなかった（図７Ｂ）。vIL-6産生はKS組織中では殆ど検出さ れず、また、調査された８つのKS病巣のうち僅一つが、２％未満の細胞において 明瞭で特異的なvIL-6免疫染色を示した(図7C)。この低陽性率の特異性は、前も って免疫感作された血清及び過剰のvIL-6ペプチドによる中和を使用して確認さ れた。KS病巣における微量IL-6産生細胞は、CD34、即ち内皮細胞マーカー(図8A) 又はCD45即ちパン(pan)造血細胞マーカー(図8B)のいずれかについて陽性であっ た。このことは、KS病巣中の内皮細及び造血細胞の両者がvIL-6を産生すること を実証している。これらの微量vIL-6陽性細胞は、KSHV T1.1溶解フェーズRNAプ ローブを使用して起こることが示されている溶解フェーズ複製に突入することが 可能である。対照的に、HIV陰性PELからペレット化された腹水リンパ腫細胞の半 分（65％）を十分上回る細胞は、vIL-6(図7E)に対して強陽性であり、プラズマ 細胞マーカーEMAを発現している（Cesarman etal.,1995,Blood 86,2708-2714） 。これは、大半のPEL細胞がインビボでKSHVの溶解型を複製するか、又は潜在的 に感染したPEL細胞がvIL-6を高レベルで発現できるかのいずれかを示している。 特異的染色は、前もって免疫感作され又は後に免疫感作されたウサギの抗vIL-6 抗体を使用して調査した正常皮膚、扁挑腺組織、多形骨髄腫、又は血管肉腫を含 む何れのコントコール組織でも生じなかった(図7E及び7F)。 PELを発症しないAIDS-KS罹患患者からのリンパ節を調べることによって、非KS 組織に対するウイルス播種が発見された。多くのvIL-6染色造血細胞が、顕微鏡 的にKSフリーのリンパ節に存在していた(図8C)。vIL-6陽性リンパ節細胞は、比 較的Ｂ細胞に富む領域に存在し、あるものはCD20B細胞表面抗原(図8D)を発現す るが、（PEL細胞とは異なり）EMA表面抗原は発現しない（Cesarman etal.,1995, Blood 86,2708-2714）。マクロファージによるvIL-6免疫陽性細胞の食作用は頻 繁に観察されたが、Ｔ細胞表面抗原CD3又はマクロフェージ抗原CD68についてのv IL-6の同時陽性は検出されなかった。 vMIP-Iが、NSIHIV-1ウイルスの侵入を阻止できるがどうかを調査するために、 ヒトCD4＋ネコ腎臓細胞（CCC/CD4）に、ヒトCCR5及びvMIP-I又はその逆構 築物I-PIMvを発現するプラスミドを一時的にトランスフェクトした（方法中CCR5 及びvMIP-Iクローニング参照）。これらの細胞に、共通レセプターとしてCCR5を 使用することが知られるM23又はSF162一次NSI HIV-1の単離物（Clapham,et al., 1992,J.Virol 66,3531-3537）のいずれかを感染させ、或いはヒトCCR5無しでCD4 +CCC細胞を感染できるHIV-2変異物ROD/Bを感染させた。ウイルスの侵入及び複製 を、レトロウイルス抗原生産のための免疫染色によって分析した（図９）。vMIP -Iの同時トランスフェクションは、NSI HIV-1の病巣生成を、逆構成の陰性コン トロールの半分未満まで減少させたが、ROD／B HIV-2の複製に対しては何の効果 もなかった。 ホスト細胞遺伝子の分子的盗用は、あるDNAウイルス、特にヘルペスウイルス 及び水疱瘡ウイルスのあらたに認識された特質である（Murphy,1994,Infect Age nts Dis 3,137-154;Albrecht et al.,1992,J.Virol 66,5047-5058;Gao and Murp hy,1994,J.Biol Chem 269,28539-28542;Chee et al.,1990,Curr Top Microbiol Immunol 154,125-169;Massung et al.,1994,Virol 201 215-240）。KSHVが細胞 性遺伝子をそのゲノム中に取り込む程度は例外的に優れている。vMIP−IとvMIP −IIに加え、vIL−6とvIRF及びKSHVは、bc1―2(ORF16)、サイクリンD(ORF72)と 類似のポリペプチド、CD21／CR2(ORF4)と類似の補体結合性蛋白ポリペプチド、N CAM様付着蛋白（ORF K14）及びIL−8レセプター(ORF74)をコードしている。FBV はまた、これら同じ細胞性ポリペプチドをコードするが（BHRF1/bc1-2）、又は 誘導する（CR2；サイクリンD；IL−6；bc1-2;付着分子及びIL−様EBI1蛋白）（C leary et al.,1986,Cell 47,19-28;Tosato et al.,1990,J.Virol 64,3033-3041; Palmero et al.,1993,Oncogene 8,1049;Larcher et al.，1995,Eur J.Immunol 2 5,1713-1719;Birkenback et al.,1993,J.Virol 67,2209-2220）。こうして両ウ イルスは、類似のホスト細胞のシグナリング及び調節経路を変更することができ る。EBVは細胞性遺伝子の発現を通してこれらの変化を実行するように見えるの に対して、KSHVは該ポリペプチドを自身のゲノムから外因的に導入するようだ。 これらのウイルスにコードされる細胞性ポリペプチドを特定することは、細胞 の抗ウイルス反応に対する防御において、そのペプチドが果たす潜在的役割につ いても掘り下げて考えることになる。huIL-6は、骨髄腫細胞系において、γイン ターフェロンに誘導されたＢａｘに仲介されるアポトーシスを阻害し(Lichtenst ein et al.,1995,Cellular Immunology 162,248-255）、またvIL−6は、感染し たＢ細胞において同様の役割を果たしうる。KSHVをコードするvIRF,vbc1-2,v-サ イクリンもまた、ホスト細胞に仲介され、ウイルス感染によって誘導されるアポ トーシスを阻害し得るし、v-サイクリンは、感染した細胞のG1細胞サイクル阻止 を防御する。インターフェロンに誘導されるMHC抗原の表出及び細胞に仲介され る免疫反応（Holzinger et al.,1993,Immunol Let 35,109-117）もvIRFによって 阻害することが可能である。βケモカイン・ポリペプチドvMIP−I及びvMIP−II は、作動剤的又は拮抗剤的シグナル・伝達作用を持ち得る。それらの配列保存及 び重複遺伝子量が、KSHV複製及び生存において重要な作用を果たすことが示唆さ れる。 細胞シグナリング経路の調節障害から細胞成長が制御不可能になることは、こ のウイルス戦略の顕著で有望な副産物である。KS病巣でvIL−6を発現する細胞が 不足すると、vIL6がKS細胞の腫瘍形成に著しく寄与することは無いようだ。しか しながら、hu-IL6のKSHV誘導は、その後の血管形内皮細胞成長因子に媒介される 血管形成（Holzinger et al,1993,Immunol Let 35,109-117）の誘導と共に可能 である。vIL−6はまた、PELあるいはキャスルマン病の形質細胞変種等のKSHV関 連リンパ球増殖疾患の病因にも潜在的に関与し得る。腫瘍形成が細胞性サイクリ ン及びbc1―2の過剰発現をもたらすことは、十分に立証されている。これらのウ イルスをコードするポリペプチドもまた、KSHV関連腫瘍形成に関与する。 KSHV vMIPは、NSI HIV-1の複製をインビトロで阻害する(図９)。AIDSの流行初 期における研究では、AIDS-KS患者についての生存は他のAIDS患者についての生 存より長いことを示しており、また、３年より長く生存しているUS AIDS患者の9 3％がKSを保持していたのに比較して、３年以内に死亡すると診断されて生き残 ったAIDS患者では28％であることを示している（Hardy,1991,J.AIDS 4,386-391; Lemp et al.,1990,J.Am Med Assoc 263,402-406;Rothernberg et al.,1987,New Eng J Med 317,1297-1302,Jacobson et al.,1993,Am J Epidemiol 138,953-964; Lundgren et al.,1995,Am j Epidemiol 141,652-658）。このことは、比較的高 いＣ Ｄ４＋計測数でKSが発生するためと、別のAIDS規定症状での死亡率が高いことに よるのかもしれない。最近の調査データでは、AIDS−KSの疫学はAIDSの流行が進 行すると共に変化していると指摘されている(同上)。 ＜方法＞ ゲノムシーケンシング：ゲノム挿入物は、ランダムにせん断され、M13mp18に クローニングされ、完全に二方向からのシーケンシングによって平均12倍のリダ ンダンシーになるまでシーケンシングされた。KSHVポリペプチドの表現名称は、 ヘルペスウイルス・サイミリを誘導した命名システムに基づいている（Albrecht et al.,1992,J Virol 66,5047-5058）。 オープン・リーデイング・フレーム(ORF)分析：集められた配列連続体は、マ ックベクター（MacVector）(IBI-Kodak Rochester NY)を使用して、25アミノ酸 残基よりも大きいオープン・リーデイング・フレームの可能性について分析され 、またBLASTX BEAUTY-BLASTX(Altschul et al.,1990,J Molbiol 215,403-410;Wo rley et al.,1995 Genome Res 5,173-184;http://dot/imgcn.bcm.tmc.edu:9331/ scq-search/nucleic acid-search html)を使用して分析した。４つのKSHVポリペ プチド(イタリック体)に対して、類似蛋白を（名称（種、配列バンク承認番号、 最小ポアソン分布確率点））を並べた。すなわち（１）νMIP-I:LD78(MIP-1α)( ヒト、gi 127077,p=9,8Xe-22),MIP-1α(Rattus,gi 790633,p=3.3xe-20)、MIP-1 α(Mus,gi 127079,p=1.7xe-19),MIP-1β(Mus,gi 1346534,p=7.8xc-18);(2)nMIP- II:LD78(MIP-1a)(ヒト、gi 1207077,p=7.1xe-23)，MIP-1α(Mus,gi 127079,p=8. 9xe-21),MIP-1α(Rattus,gi 790633,p=1.2xe-20),MIP-1β(Mus,gi 1346534,p=3. 8xe-20);(3)vIL-6:26kDaポリペプチド(II-6)(ヒト、gi 23835,p=7.2xe-17),IL- 6(Macaca,gi 514386,p=1.6xe-16);及び(4)νIRF:ICSBP(Gallus,gi 662355,p=1.1 xe-11),ICSBP(Mus,sp p23611,p=1.0xe-10)，リンパ系特異的インターフェロン調 節因子(Mus,gi 972949,p=2.0xe-10)，ISGF3(Mus gi 1263310,p=8.1xe-10),IRF4( ヒトgi 1272477,p=1.0xe-9),ISGF3(ヒトspQ00978,3.9xe-9),ICSBP(ヒトspQ02556 ,p=2.3xe-8) 配列の整列比：アミノ酸配列をCLUSTAL W（Thompson et al.,1994,Nuc Acids Res22,4673-4680）を使用して整列させ,PAUP3.1.1を使用して比較した。累乗根 および非累乗根のブートストラップ（プログラム）による比較によって、ヒトポ リペプチドよりも多様化の程度の少ないウイルスポリペプチドによる100のブー トストラップ式複製物全てを持つ系統樹を作成した。 ノーザン・ブロッテイング：ノーザン・ブロッテイングを，標準条件を使用し て，メーカー（Teltest Inc,Friendswood TX）の指示に従ってRNAzolで抽出され た全細胞RNAについて、各レーンに全RNAを10μｇ充填して、下記プライマー：vM IP−I:5'AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3'(配列認識番号４),5'-GGT AGA TA A ATC CCC CCC CTT TG-3'(配列認識番号5);vMIP-II:5'-TGC ATC AGC TTC TTC AC C CAG-3'(配列認識番号6):5'-TGC TGT CTC GGT TAC CAG AAA AG-3'(配列認識番 号7),vIL-6'5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GTG-3'(配列認識番号8);5'-CGC C CT TCA GTG AGA CTT CGT AAC-3'(配列認識番号9);vIRF:5'-CTT GCG ATG AAC CAT CCA GG-3'(配列認識番号10),5'-ACA ACA CCC AAT TCC CCG TC-3'(配列認識番号 11)のセットについてのPCR産物からの無作為に標識したプローブで実施した（Ch ang et al.,1994,science 265,1865-1869）。BCP−1、BC−１及びp3HR1は、培養 条件下で保持し、TRAで前に記載したように誘導された(Gao et al.,1996,New En g J.Med 335,233-241)。れらのウイルス遺伝子についてのPCR増幅を、vMIP-I,vM IP-II,vIL-6及びvIRFプライマー・セットを使用して、35増幅サイクルで実施し 、陽性コントロールとして全BC−1DNAの希釈物と、前に記載したPCR条件（Moore and Chang,1995,New Eng J Med332,1181-1185）を使用して比較した。これらの 実験に使用されたKS紡錘細胞系DNAは、Dictor et al.,1996,Am J Pathol 148,20 09-2016に記載されていた。DNAサンプルの増幅可能性は、ヒトHLA−DQαとピル ビン酸脱水素酵素プライマーを使用して確認された。 vIL−６クローニング：vIL−6を695ｂｐポリメラーゼ・チェイン・リアクショ ン(PCR)産物から、下記プライマーセット：5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GT G-3'(配列認識番号12)及び5'-CGC CCT TCA GTG AGA CTT CGT AAC-3'(配列認識番 号13)，を使用してクローニングし、0.1μｇのBC−1DNAをテン プレートとして使用し、35サイクル増幅した。PCR産物は最初、pCR2.1（Invitro gen San Dicgo CA）中にクローニングされ、次にEcoRV挿入物をpMET7発現ベクタ ー(Takebe et al.,1988,Mol Cell Biol 8,466-472)にクローニングし、DEAE―デ キストランとクロロキニンを使用してCOS7細胞（CRL-1651,American Type Cultu re Collection,Rockville MD）中にトランスフェクトした。該配列もpMET7ベク ターに、SRaプロモーターに対して逆方向（6-Liv）に、陰性コントロールとして クローニングされ、両構築物の方向付け及び配列の忠実性が、ABI 377シークエ ネーター（Applied Biosystems Inc,Foster City CA）上で色素プライマー化学 を使用して、二方向性シーケンシングによって確認された。 15mlの無血清COS7上澄み液をの1.5ｍｌまでセントリプラス10フィルター付き （Amicon,Bevcrly MA）限外濾過により濃縮して、上澄み液濃縮物100μl又はrhu IL-6(R&D Systems,Minneapolis MN)をラエムリ（Laemmli）緩衝液中で各レーン に付き充填した。細胞溶解物のイムノブロッテングについて、TPA20ng/ml有無で 48時間で誘導した指数関数成長細胞をペレット化し、ラエムリ緩衝液に溶解され た全細胞蛋白100μｇを各レーンに充填し、15％のＳＤＳポリアクリルアミド・ ゲル上で電気泳動にかけ、イムノブロットし、標準条件（Gao et al.,1996、New Eng J Med 335、233−241）を使用して、ウサギ抗ペプチド抗体(1:100-1:1000 希釈)又は抗huIL-6(1μg/ml,R&D System,Minneapolis MN)と共に現像した。 細胞系B9：B9マウス形成細胞腫細胞系をアイスコーブ（Iscove）変性ダルベッ コ培地(IMDM)(Gibco,Gaithersburg,MD)、10％胎児子牛血清、１％ペニシリン／ ストレプトマイシン、1％グルタミン、５0μMβメルカプトエタノール及び10ng/ mlのrhuIL-6(R&D Systems,Minneapolis MN)中に保持した。3Ｈチミヂンの取り込 みを使用して、標準プリトコール（R&D System,Minneapolis MN)に従って、huIL -6又は組み替え上澄み液に反応して起こるB9の増殖を測定した。要するに、huIL -6又はCentriplus 10の濃縮組み替え上澄み液の１：３の連続希釈物を96ウエル プレートのウエル当たり２ｘ１０4細胞で、24時間３７℃でインキュベートし、 インキュベーションの最期の４時間は、各ウエルにチミジンストック溶液（1ml IMDM中に 1mCi/ml 3H-チミジンの50μl）10μlを加えた。細胞を収穫し、取り込まれた3 Ｈチミジンを液体シンチレーションカウンターを使用して測定した。各データ ポイントは、表示された標準偏差をもった６つの測定点の平均である。 vIL−６イムノブロテイング：組織のパラフィンを除去し、PBS中で0.03％H2O2 で30分クエンチした後、アビデインーバイオチン複合体（ＡＢＣ）法を使用して イムノブロッテングを実行した。10％の正常ヤギ血清、１％BSA、0.5％トウイー ン(Tween)20でブロックした後、一次抗体を1:1250希釈を作用させた。第二次ビ オチン化されたヤギ抗ウサギ抗体(PBS中１：200)を30分室温で作用させ、その後 PBS中での５分洗浄３回を行った。パーオキシダーゼを連結したABC（PBS中１：1 00）を30分作用させ、その後、PBS中で５分洗浄三回を行った。ダイアミノーベ ンジデイン(DAB)クロモゲン検出溶液（PBS中0.25％ＤＡＢ，0.01％H2O2）を５分 間作用させた。次にスライドを洗浄し、ヘマトキシリンでカウンター染色し、カ バーグラスをかけた。アミノエチルカルバゾール(AEC)又はベクター・レッド染 色を使用して、ある種の表面抗原についてのファストブルーによるカウンター染 色による二重標識された細胞の区別をより良好に行なえるようにした。CD68につ いては、vIL−6細胞質染色によって染色が不明瞭化されるかもしれないので、二 重標識免疫蛍光を使用した。マイクロ波による組織切断片を、PBS中２％ヒト血 清、１％ウシ血清アルブミン(BSA)によって30分でブロックし、一次抗体と共に 一晩インキュベートし、vIL−6局在についてはフルオレセイン抱合ヤギ抗ウサギ IgG（1：100 Sigma)で、またCD68局在については、ロダミン抱合ホース抗マウス IgG（1：100 Sigma）で、30分現像した。洗浄後、二次抗体インキュベーション を二回繰り返し、15分の洗浄各々施し、染色を増幅させた。残留膜抗原について は、スライドを最初はvIL−6について現像し、次に細胞抗原についてのみならず 逆局在（最初に細胞抗原抗体、次に抗vIL−6)について行い、両抗原の至適に視 覚化を成し遂げ区別を行なった。各々の場合、最初の抗体はAEC(Sigma)を使用し て現像し、前インキュベーション溶液（1％BSA,1-％正常ホース血清、0.5％トウ イーン20、30分）ブロックした。また現像はメーカーの指示に従った。二次抗体 は、ABCアルカリホスファターゼ技法を使用してファストブルークロマゲンで現 像した。マイクロ波及びトリプシン処理したも のは、結果として局在化は低く、vIL−6の免疫局在の特異性は低かった。膜抗原 の至適局在化にとってこれが必要な場合は、vIL−6AEC局在化の後、これらの技 法が適用される。至適に区別を行うためのAECに代替する染色として、ベクター ・レッド（Vector-Red）(Vector,Burlingame,CA)染色を使用し、ABCアルカィホ スファターゼ技法を使用して、メーカーのプロトコールに従って実行した。調査 された細胞抗原抗体には、メーカーの指示書に従って調節された組織上にあるCD 68(1：800、クローンKim6由来)、上皮膜抗原（EMA,1.500,Dako,Carpinteria,CA ）,CD3(1:200,Dako),CD20(1.200,Dako),OPD4(1:100,Dako),CD34(1:15,Dako),CD4 5(1:400，クローン9.4由来)、L26(1：100、Immunotech,Westbrook,ME)及びLeu22 (1:100,Bectdon-Dickinson,San Josc,CA)が挙げられる。特異的vIL−6のコロニ ーは、KS病巣においてCD34、CD45で、PELにおいてはEMAで、リンパ節組織におい てはCD20及びCD45で発見された。 免疫組織化学的vIL−6の局在化を、生理食塩水中１％のアガーに着床させた後 、48時間のTPAインキュベーションを伴って又は伴わずに、指数関数的生育中のB CP−1細胞について行った。陽性細胞のパーセントはスライド毎に３つの無作為 に選んだ高パワー顕微鏡視野の細胞数を計測して定めた。TPA処理（細胞溶解を もたらす可能性があり、TPAによる溶解ウイルス複製の誘導によって死亡する可 能性のある）後、vIL−6について陽性に染色されたBCP−１細胞のパーセントは 低かった。細胞及び組織の免疫染色は、抗血清の0.1μg/ml vIL-6合成ペプチド による４℃一晩インキュベートを使用した中和によって、また組織又は細胞調整 物についてのプレ免疫ウサギ抗血清、平行してポスト免疫血清を使用することに よって。特異的となることが実証された。特異的染色は、ペプチド中和あるいは プレ免疫血清使用後には、見られなかた。 CCR5及びvMIP-Iクローニング：CCR5をpRcMVベクター（Invitrogen）中にクロ ーニングし、PCR増幅後、下記プライマー対：5'-AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3'(配列認識番号14)、5'-GGT AGA TAA ACT CCC CCC CTT TG-3'(配列認識番 号15),を使用してvMIP−１遺伝子の正方向及び逆方向物をpMET７中にクローニン グした。CCR5単独及び正方向構築物(vMIP−I)を持つCCR5、逆方向構築物(I−PIM v)及び空のpMETベクターをCCC／CD4細胞（ヒ トCD4を安定的に発現するCCCキャット細胞、McKnight et al.,1994,Virol 201,8 -18参照）中に，リポフェクタミン（Gibco）を使用してトランスフェクトした。 48時間後、培地をトランスフェクトとされた細胞より取り除き、SF162,M23、又 はROD／Ｂウイルス培地ストック1000 TCID50を添加した。ウイルスインキュベー ションを４時間おこなった後、細胞を４回洗浄し、HIV-1 p24又はHIV-2gp105に 対する免疫染色の前に、上述のように５％FSC(子牛胎児血清)を添加したDMEM中 で72時間生育させた。各条件を平均3―4回繰り返し(図９)、標準偏差を表す中間 の誤差バーは、CCR5単独の病巣のパーセンテージを表す。実験の詳細、セクションＩＩＩ： 以下の特許は、ここに記載した発明をより完全に記述するための参照として、 本明細書に組み込まれる。 表１．ＫＳＨＶゲノムの、ＯＲＦおよび他のヘルペスウイルスの遺伝子に対する 類似性 ＜表１の注釈＞ 「名称」（例えばK1またはORF4）はKSHV ORFの表記を表している。 「Pol」はKSHVゲノム中のORFの極性（polarity）を意味する。「開始」は、開始 コドン中の最初のLURヌクレオチドの位置を表している。「停止」は、停止コド ン中の最後のLURヌクレオチドの位置を表している。「サイズ」は、KSHV ORFに よってコードされるアミノ酸残基の数を示している。 「HVS％Sim」は、ヘルペスウイルスサイミリの対応するORFに対する、表記のKSH V ORFのパーセント類似度を示している。「HVS%Id」は、ヘルペスウイルスサイ ミリの対応するORFに対する、表記のKSHV ORFのパーセント同一性を示している 。「EBV名」は、EBV ORFの表記を示している。「EBV%Sim」は、表示されている 名称のEBウイルスのORFに対する、表記のKSHV ORFのパーセント類似度を示して いる。「EBV%Id」は、表示されている名称のEBウイルスのORFに対する、表記のK SIIV ORFのパーセント同一性を示している。 KSHV名の欄のアスタリスクは、HVS ORF4a（*）およびHVSORF4b（**）に対するKS HV ORF4の比較を示している。注釈のない全ゲノム配列は、受付番号U75698(LUR) 、U75699(末端反復)、およびＵ75700(不完全末端反復)として、 れている。具体的には、LURの配列は、配列番号17〜20に5'-3'の方向で示されて いる。より具体的には、LURのヌクレオチド1〜35,100は、それぞれ配列番号17中 の1〜35,100の番号が付されたヌクレオチドに示されており、LURのヌクレオチド 35,101〜70,200は、それぞれ配列番号18中の1〜35,100の番号が付されたヌクレ オチドに示されており、LURのヌクレオチド70,201〜105,300は、それぞれ配列番 号19中の1〜35,100の番号が付されたヌクレオチドに示されており、LURのヌクレ オチド105,301〜137,507は、配列番号20中の1〜32,207の番号が付されたヌクレ オチドに各々示されている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION           Unique sequence of Kaposi's sarcoma-associated virus and its use   The invention disclosed herein is a joint research agreement CC from the Centers for Disease Control and Prevention. Under U210852 and CA67391 approved by the National Institutes of Health of the Ministry of Insurance and Social Welfare, National Cancer Institute It was made with government support. Accordingly, the U.S. Government has And have certain rights.   Throughout this application, various publications are referenced by Arabic numerals in parentheses. You. Full bibliographic citations for these publications are given at the end of the Detailed Description. It is listed. The disclosures of all publications cited herein are based on the technology to which the invention pertains. In order to more fully describe the situation, reference is made to part of this specification in its entirety. Incorporated herein.   [Background of the Invention]   Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) causes Kaposi's sarcoma (KS) It is a new human herpes virus (HHVS) that is thought to cause.   Kaposi's sarcoma is the most common occurring in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) Tumor. Approximately 15-20% of AIDS patients are rare for immunocompetent individuals. This tumor does not develop. Epidemiological evidence is available from AIDS-related KSs (AIDS -KS) has an infectious etiology. Gay and bisexual AI DS patients are almost 20 times more likely to develop KS than AIDS patients with hemophilia, and KS Is thought to be associated with specific sex habits among gay men with AIDS . KS is an adult AI infected by heterosexual or parenteral HIV infection. Among DS patients or among pediatric AIDS patients infected by vertical HIV infection Is rare. Pathogens that have been suspected of causing KS so far include hepatitis B Virus, human papilloma virus, Epstein-Barr virus (EBV) , Human herpes virus 6 type, human immunodeficiency virus (HIV) and mycop Razuma penetrans (Mycoplasma penetrans). In addition, nitrite absorption Non-infectious environmental substances, such as sequestrants, also play a role in KS tumorigenesis. It has been devised. However, for any of these pathogens, AIDS-KS No etiological association has been shown. (Summary of the Invention)   The present invention relates to a Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) polypeptide. Providing an isolated nucleic acid molecule to be administered. The present invention relates to an isolated polypeptide of KSHV. Provide a tide molecule. The present invention provides an antibody specific to the polypeptide. You. Antisense and triplex oligonucleotide molecules are also provided. It is. The present invention provides a vaccine against Kaposi's sarcoma (KS). The invention is based on K Methods of vaccination, prevention, diagnosis and treatment of patients with S and cell A method for detecting the expression of a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus. [Brief description of drawings]   Figure 1:   Unrecorded long specific regions (LUR) and terminal repeats (KS) in the KSHV genome TR). In the LUR, the direction of the identified ORFs is indicated by the direction of the arrow and is shown in dark blue PRFs similar to HVS shown and dissimilar ORFs shown in light blue Having. Preserved herpes wis with non-preserved interblock space (with text) Seven blocks (numbered) of the lus gene are shown below the kilobase marker However, the numbering scheme of this block is Chee (Chee et al., 1990, Cur r. Topics Microbiol. Tmmunol. 154, 125-169) You. Duplicate cosmids used to map the KSHV genome (Z Preff Ix) and λ (L prefix) clones were cloned from KS5 Compared to lambda phage clones and shown below. Features not specifically specified And the estimated coding region are shown above the ORF map. The repeating region is (Frnk, vnct, waka / jwka, zppa, moi) , Mdsk). Estimated coding regions and other features (see Chapter 1 of Experimental Details) ) Are not specified as ORFs, but are shown as solid lines.   2A-2D   (FIG. 2A): Sequence of terminal repeat unit (TR) showing high content of G + C (SEQ ID NO: 16). A sequence with high similarity to the conserved herpesvirus pac1 site Parts with low similarity to the specific pac1 and pac2 sequences displayed in tall font It is underlined along with the position. (FIG. 2B): Nde that cuts once in the TR sequence Digestion with II, followed by detection using a plasmid containing the TR sequence as a probe BC-1 (lane 1), BCP-1 (lane 2) and KS lesion (lane 3) Southern blot of the derived DNA. 0.8kb strong hybridization probe Shows multiple copies of a single unit TR digested with NdeII (FIG. 2C). . Schematic diagram of the genomic structure of KSHV in BCP-1 and BC-1 cell lines (Figure 2C) is consistent with the data shown in (FIG. 2B) and (FIG. 2D). Taql The (T) site is adjacent to the TR region, and the NdeII (N) site is in the TR. Below The tr of the source refers to the TR unit truncated at the right end of the specific region. DR Indicates an overlapping area of the LUR embedded in the TR. (Fig. 2D): Disconnection within TR BC-1 (lane 1), BCR-1 (lane 2) digested with Taq I TR of DNA derived from KS lesion (lane) and HBR-6 (lane 4) Southern blot hybridization with probe. BC-1 (lane 1) Taq-1 digested DNA from both HBR-6 and HBR-6 (lane 4) have similar The TR hybridization pattern is shown, indicating that the TR region Suggests that the insertion of the heterologous sequence is identical (this sequencing study proves that Is the replicated part of the LUR: see Experimental Details). BCP- 1TR hybridization (lane 2) resulted from this cell Shows laddering consistent with the viral population with variable TR region length in the strain . The absence of TR laddering in the KS lesion DNA (lane 3) indicates that Suggest that a population of infectious viruses is present in the tumor.   3A-3C:   KSHV encodes the corresponding human cell signaling pathway polypeptide sequence. CLUSTAL W alignment of polypeptide sequences to be loaded. Figure 3A: Two types of KSHVM IP-like polypeptides (vMIP-I and vMIP-II) were converted to human MIP-1 Compared with α, MIP-1β and RANTES. for vMIP-I Amino acid matches are indicated by shades of black reversal, versus vMIP-II alone Amino acid matches are indicated by shades of gray inversion, and the CC dimer motif Is displayed in italics. Both KSHV MIP genes are relatively conserved Encodes a 19-residue N-terminal hydrophobic secretory leader sequence (vMIP -I is also a hydrophobic library with no similarity to the chemokine dicysteine motif. With a second CC dimer in the base sequence). Possible O for vMIP-I The binding glycosylation sites (gap sites 22 and 23) are within vMIP-II Is absent, which indicates a possible putative selling glycosylation not found in vMIP-I It has only one site (position 51). FIG. 3B: KSHV against human IL-6 vIL-6 alignment comparison. Figures 3C-1 and 3C-2: ICSBP in italics And ISGF3, human I with putative ICS-bound tryptophan (W) Alignment comparison of KSHV vIRF polypeptide to CSBP and ISGF3 .   4A-4F   BCP- with or without 48 hours incubation with TPA RNA extracted from T.1 and BC-1 cells, and TPA incubation Northern hybridization of total RNA extracted from control P3HR1 cells after Option. All four genes (FIG. 4A, vMIP-I; FIG. 4B, vMIP-II; (FIG. 4C, v1L-6; FIG. 4D, vIRF) are TPA-inducible but constitutive , VIL-6 (FIG. 4C) and vIRF (FIG. 4D) are not induced. Also, vMIP-to-BCP-1 and BC-1 and to BCP-1 1 is also evident (FIG. 4A). Typical high with human β-actin probe Hybridization (FIGS. 4E-4F) shows comparable RNs for cell preparations. A load is shown.   FIG. 5A-5B:   FIG. 5A. BCP-1, BC-1, P3HR1 with or without TPA induction Cell lysate of cell line (lanes 1-6), 1 μg human rIL-6 (lane 7) And concentrated COS7 rvLI-6 and 6-LIV supernatants (lanes 8-9) In contrast, the amino acid sequence of vIL-6, that is, THYSPPKFDR (SEQ ID NO: 2) ) And rabbit anti-pepti made from PDVTPDVHDR (SEQ ID NO: 3) Do Immunoblot of antibodies. Anti-vIL-6 antibody was used in both recombinant supernatant and cell line. Specifically recognizes the viral IL-6 polypeptide but inhibits human IL-6 -6 is not recognized. BCP-1 cell line constitutively expresses low levels of vLI-6 In contrast, polypeptide expression is BC-1 (KSHV and EBV coinfection) And BCP-1 (KSHV alone infection) increased during TPA treatment. This indicates lysis phase expression. Pre-immunization from immunized rabbits Serum did not react with any of the preparations on immunoblotting. FIG. B: anti-huIL-6 monoclonal antibody is vIL-6 or a group bound to cells Does not cross react with the recombinant vIL-6 preparation.   Fig. 6   Serial dilutions of rhuIL-6 (solid squares) and rvIL-6 (solid circles) and r6-LIv (open square) COS7 supernatant or control LacZ (open circle) p IL-6 dependent B9 mouse plasma cells using MET7 transfection Tumor cellsThreeDose response curve for H-thymidine incorporation. This transfection Undiluted rvIL-6 supernatant from the lot was huIL-6> 0.02 ng / ml Show similar B9 proliferative activity to the reverse construct (r6-LIv) and La The cZ control does not show an increased ability to induce B9. At dilutions higher than 1: 1 The concentrated supernatant increases due to the concentration of the COS7 conditioning factor. Activity.   FIGS. 7A-7F:   Goat anti-rabbit immunoglobulin-per with hematoxylin counterstaining (blue) 100-fold localized rabbit anti-vI using oxidase conjugate (brown) L-6 peptide antibody activity was determined by vI in both KSHV infected cell lines and tissues. 4 shows the production of L-6. KSHV infected cell line BCP-1 (FIG. 7A) is prominent Shows localization of cytoplasmic vIL-6, but shows control EBV infected cell line P3HR1 (FIG. 7B). ) Does not show such localization. (FIG. 7C): Spinning from AIDS-KS lesion Cytoplasmic localization of vIL-6 in cone-forming cells. Of the 8 types of KS lesions Only one had vIL-6 staining of a subpopulation of cells that could be easily identified. In contrast, pelleted lymphoma cells derived from non-AIDS EBV negative PEL Had strong vIL-6 staining (FIG. 7D). Control hemangiosarcoma (FIG. 7) No immunostaining is seen in D) or multiple myeloma tissues (FIG. 7F).   8A-8D:   Dual antibody labeling of anti-vIL-6 and cell surface antibodies. CD34 using vIL-6 Examples of co-localization of both CD20 and CD20 were found in KS lesions. FIG. 8A: CD 34 (red) and vIL-6 localize to KS spindle cells (arrow) (blue) . The purple coloration is due to overlapping chromagen staining (100x). FIG. 8B : CD45 common leukocyte anti-vIL-6 (red) expressing Kaposi's sarcoma cells Body staining (blue, arrow) (100x). FIG. 8C: Lymph from a patient with KS In the section, a low magnification photograph (20 ×) showing many vIL-6 producing hematopoietic cells (red) ). Arrows indicate only the most prominently stained cells. Nuclei were counterstained with hematoxylin . FIG. 8D: CD20 with vIL-6 in lymph nodes of AIDS-KS patients (Brown, arrow) (100-fold).FIG.   Primary NSI SF162 strain in the presence or absence of vMIP-I CCC / CD by Robi ni M23 HIV-1 strain and HIV-2 strain ROD / B Quantitation of 4-cell infection. CCC / CD4 cells are CCR5 alone, CCR5 and VMIP in Petit pMET7 vector, CCR5 plus pMET7 vector -I, or CCR5 plus reverse orientation I-PIMv temporarily co-transfect Was turned on. After 72 hours incubation with each retrovirus, % Of foci forming units on cells transfected with CCR5 alone Displayed as a tage. The forward-oriented vMIP-I construct is NSI HIV-1 But did not inhibit the growth of HIV-2, whereas the opposite orientation of I- The PIMv construct had no effect on the growth of any retrovirus. [Detailed description of the invention]Definition   Throughout the specification, the following standard abbreviations have been used to indicate particular nucleotides. Use words:         C = cytosine A = adenosine         T = thymidine G = guanosine   As used herein, “nucleic acid” refers to complementary DNA (cDNA), genomic DNA DNA or RNA including NA and messenger RNA (mRNA) Or say. As used herein, "genomic" refers to the coding of an isolated nucleic acid molecule. Means both coding and non-coding regions. "Nucleic acid sequence" Deoxyribonucleotide bases or riboribonucleotides read from the 5 'end to the 3' end A single or double stranded polymer of nucleotide bases. It is a self-replication plus Infectious polymers of mid, DNA or RNA and non-functional DNA or RNA And both.   As used herein, a “polypeptide” is encoded by a nucleic acid The full-length gene product or a part thereof. Thus, "Polypepti “D” includes not only full-length proteins but also short peptides of less than 50 amino acid residues in length. Also included are partial length fragments that include   The term "SSC" refers to 0.15 M sodium chloride and 20 mM sodium citrate. Lithium citrate-saline solution. Solutions are often multiples of this concentration or Is represented as a fraction. For example, 6XSSC is 6 times the sodium chloride concentration And sodium citrate concentration, ie 0.9 M sodium chloride and 120 Refers to a solution with mM sodium citrate. 0.2XSSC is 0.2 times SS C concentration solution, ie 0.03 M sodium chloride and 4 mM sodium citrate Aum.   Of "selectively hybridize" and "specific hybridization" The phrase is used when the target sequence is present in a preparation of whole cellular DNA or RNA, Acid probe hybridizing to a specific target DNA or RNA sequence; Forming or binding a heavy helix. Selectively hybridize Under high stringency hybridization conditions, non-target The probe binds to the given target in a detectable manner, unlike the sequence Means   A "complementary" or "target" nucleic acid sequence is one that selectively binds to a nucleic acid probe. Refers to nucleic acid sequences that hybridize. Preferred annealing conditions include, for example, Depends on probe length, base composition, number and location of probe mismatches And is almost always determined empirically. Nucleic acid probe design and annealing For a discussion of conditions, see, for example, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Labo ratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Vols. 1-3 or , Ausubel, F. et al. (1987) Current Protocols in Nlolecular Biology, New York. Please refer to.   An "encoding nucleic acid molecule" is a nucleic acid molecule that directs the expression of a particular polypeptide. Say. The sequence of the nucleic acid molecule includes a DNA strand sequence transcribed into RNA, a complementary DN Includes the A chain and the RNA sequence translated into protein. The nucleic acid molecule contains Both long nucleic acid sequences as well as non-full length sequences are included. Further, the sequence may be Sequence or multiple sequence degenerate codons (which may (Which may be introduced to provide).   The fact that a nucleic acid probe is "specific" for the target microorganism in question means that When performed, the target microorganism is a heterogeneous population of proteins and other biological materials. In the presence of a nucleic acid sequence that is a determinant of the presence of the microorganism. Peculiar A target nucleic acid probe targets a part of the sequence that is a determinant of the microorganism. Hybridized with other sequences, especially those of the host in which the pathogen is to be detected. Will not.   "Expression cassette" refers to the expression of a structural gene in a host compatible with such sequences. Refers to nucleic acid sequences that can affect expression. Such cassettes are at least Also include a promoter and, optionally, a transcription termination signal. Also causes expression Additional factors required or assisting in expression are also described herein. May be used.   "Operably linked" as used herein refers to a promoter whose D Link a promoter upstream from the DNA sequence to mediate transcription of the NA sequence Means   "Vector" refers to a viral expression system and an autonomous self-complexing circular DN. A (plasmid), including both expression and non-expression plasmids . States that the recombinant microorganism or cell culture harbors an "expression vector" If so, this is extrachromosomal circular DNA and D integrated into the host chromosome. Includes both NA. If the vector is maintained by a host cell, the vector May be replicated stably by cells during mitosis as an autonomous structure; May be integrated into the genome of the host.   "Plasmid" refers to an autonomous circular DNA molecule that can replicate in cells, Includes both current and non-expressed forms. When a recombinant microorganism or recombinant cell culture If it is described as harboring a `` current plasmid, '' it is integrated into the host chromosome. Includes potential viral DNA. The plasmid is maintained by the host cell In some cases, the plasmid is stably maintained by the cell during mitosis as an autonomous structure. It may be replicated or integrated into the host genome.   "Recombinant protein" or "protein produced by recombination" refers to a non-natural cell Refers to a polypeptide produced using The cells are used for integration of the appropriate nucleic acid sequence. The protein is produced because it is more genetically modified.   The following terms are used to describe two or more nucleic acid molecule sequence relationships: Reference sequence "," Comparison window "," Sequence identity "," Percentage of sequence identity (%) " And "substantial identity." A “control sequence” is used as a basis for sequence comparisons. Control sequence is a subset of a larger sequence, e.g., a sequence. A segment of the full-length cDNA or gene sequence given in the column listing. Or may consist of a full-length cDNA or gene sequence. No.   Optimal alignment of sequences in the comparison window is described in Smith and Waterman (1981) Adv. Appl . Math. 2: 482, according to Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bi ol. 48: 443, by the method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. A cad. Sci. Search methods for similarity in 85.2444 or the use of these algorithms Computerized equipment (GAP, BESTFITPackage Release 8.0, Genetics Computer Gr oup, 575 Science Dr., Madison, WI).   As applied to polypeptides, "substantial identity" or "substantial sequence" "Identity of" means that two peptide sequences are GAPs using the default gap. Or at least 90% when optimally aligned, such as by BESTFIT Sequence identity, preferably at least 95% sequence identity, more preferably less It means sharing at least 99% sequence identity.   "Percentage of amino acid identity (%)" or "Percentage of amino acid sequence identity (% ) "Means approximately the indicated percentage (%) of identical amino acids when optimally aligned Refers to the similarity of the amino acids of two polypeptides with For example, "95% of The term "amino acid identity" refers to 95% amino acid identity when optimally aligned. Refers to the similarity of the amino acids of two polypeptides. Residue positions that are not identical It is desirable that these differ depending on the amino acid substituents. For example, for each charge or polarity Amino acid substitutions with similar chemical properties probably affect the properties of the protein. I would not be able to. Examples include glutamine for asparagine, or Glutamic acid to spartic acid.   "Substantially purified" or "isolated" refers to a herpesvirus polypeptide. When referring to peptides, a chemical composition that is substantially free of other intracellular components I do. It can be either dry or aqueous, but it must be homogeneous. Is preferred. Purity and homogeneity are typically determined by polyacrylamide gel electrophoresis. Using analytical chemistry techniques such as electrophoresis or high-performance liquid chromatography Can be The protein that is the predominant species present in the preparation has been substantially purified. one Generally, a substantially purified or isolated protein is present in the preparation. It will contain more than 80% of all macromolecular species. 95% or more of the protein It is more preferable to purify to the extent that other macromolecular species are not detected by a conventional method. Most preferably, it is purified to a qualitatively uniform state.   "Specifically binds to an antibody" or "specifically immunoreactive" When referring to tide, polypeptides and other proteins, including viruses other than KSHV, In the presence of a heterogeneous population of biologics, the KSHV polypeptide of the present invention is present. Refers to a binding reaction that determines that Thus, the designated immunoassay Under the conditions, the identified antibody binds to the KSHV antigen and binds to other antibodies present in the sample. Does not bind in significant amounts.   "Specific binding" to an antibody under such conditions includes specific binding to a specific antigen. Antibodies selected for gender will be required. For example, as described herein Selecting antibodies raised against the generated KSHV antigen, using a KSHV polypeptide Has specific immunoreactivity with other polypeptides and has no immunoreactivity with other polypeptides. You can get the body.   As used herein, a "biological sample" is a living or dead organism. Any sample derived from a dead organism. Examples of biological samples include body fluids And tissue specimens.   When referring to a particular sequence listing, such reference is substantially equivalent to that list. Sequence (eg, a small number of sequencing errors, single base changes, deletions, And the complement thereof, wherein such sequence changes are associated with the relevant sequence listing. Correspond to the nucleic acid sequence of the pathogenic microorganism or disease marker involved. Will be readily understood and this is the intention of this specification. I.KSHV-derived nucleic acid molecule   The present invention relates to Kaposi's sarcoma-associated hepes virus. rpesvirus (KSHV) provides an isolated nucleic acid molecule encoding a polypeptide You.   In one embodiment, an isolated nucleic acid molecule encoding a KSHV polypeptide Is shown in Genebank Accession Number U75698. The start codon and stop codon are shown in Table 1. In another embodiment, an isolated nucleic acid sequence encoding a KSHV polypeptide The child was determined by translation of the nucleic acid sequence set forth in Gene Bank Accession Number U75698. With defined amino acid sequences, the start and stop codons of which are shown in Table 1. You.   In one embodiment, the nucleic acid molecule isolated for the KSHV polypeptide comprises: Upstream of the ATG start codon, as indicated by Gene Bank Accession Number U75698 5 'untranslated sequence. In another embodiment, the KSHV polypeptide The isolated nucleic acid molecule is located downstream of the stop codon, Genebank accession number U7. It has a 3 'untranslated sequence as shown at 5698.   In one embodiment, the isolated nucleic acid molecule is genomic DNA. Another In embodiments, the isolated nucleic acid molecule is a cDNA. In another aspect The RNA is derived from the isolated nucleic acid molecule, or Has the ability to hybridize with offspring.   Further, the nucleic acid molecule may be, but is not limited to, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease. Lymphoma, lymphocytic leukemia, lymphosarcoma, splenomegaly, reticular sarcoma, Sezary syndrome, Mycosis fungoides, central nervous system lymphoma, AIDS-related central nervous system lymphoma, post-transplant Lymphatic proliferative disorders, including Burkitt's lymphoma It seems to be related. Lymphoid tissue proliferative disorder, lymph nodes, lymphoid Uncontrolled clonal or polyclonal lymphocyte content in tissues and other organs Characteristic growth.   A.Isolation and propagation of KSHV   KSHV can grow in vitro. For example, multiply the herpes virus Methods are described in the literature (Ablashi et al., In Virology 184, 545-552). Outline Briefly, umbilical cord blood cells, macrophages, and nerve cells stimulated by PHA Or glial cell lines, cerebrospinal fluid, plasma, peripheral blood leukocytes, or viral infection Culture with cells or tissue extracts including purified virus. Prior to infection The recipient cells were incubated at 37 ° C. for 2 hours using 5 μg / ml polybrene. To process. It shows morphological changes and becomes positive for viral antigens. Thus, infected cells are confirmed.   To isolate KSHV, the virus is recovered directly from cell culture by centrifugation. Or harvest the infected cells, homogenize or lyse, The virus is isolated from the cell debris and subjected to standard density isocratic sucrose gradient centrifugation. Purified by separation.   One of skill in the art can isolate and then propagate KSHV using the following protocol. Is also good. B lymphoid cell lines infected with KSHV (for example, RCC-1, HBL- 6 or BCBL-1) Long-term establishment uses cavity-based lymphoma and standard methods (Glick, 1980, Fundamentals of Human Lymphoid Culture, Marcel  Dekker, New York; Knowles et al., 1989, Blood 73, 792-798; Metcalf, 1984, Clon. al Culture of Hematopoetic Cells; Techniques and Applications, Elsevier, N ew York).   Filter fresh lymphoma tissue containing live infected cells to establish a single cell suspension You. Separate the cells by Ficoll-plaque centrifugation and then remove the lymphocyte layer. Start. The lymphocytes were then purified using RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum. Sometimes 1 × 10 to standard lymphocyte tissue culture mediumεTransfer at a density greater than cells / ml. Immortalized lymphocytes containing KSHV proliferate indefinitely in the medium, but are not immortalized Cells die during the prolonged culture process.   In addition, KSHV was able to detect 1 × 106cell/ Proliferation in new cell lines is achieved by removing the media supernatant, which contains You may let it. The medium is centrifuged at 2000 xg for 10 minutes, then The cells are removed by filtration through a filter. Medium is applied in a 1: 1 volume to remove cells 1 × 10 in 48 hours6Grow at a density greater than cells / ml. Wash cells and pellet Transfer to fresh media and test for KSHV 14 days later.   KSHV may be isolated from a cell line using the following method. Low penetration of infected cell lines Use standard methods such as pressure shock or Dounce homogenization Or lysate using repeated thawing and freezing cycles in small volumes (less than 3 ml). And then centrifuged at 2000 × g for 10 minutes to pellet. Take the supernatant And then centrifuged at 10,000 xg for 15 minutes to remove nuclei and organelles. Remove. Filter the resulting cell-free supernatant at low speed through a 0.45μ filter. And then centrifuged at 100,000 xg for 1 hour to pellet the virus. I do. The virus is then washed and pelleted again. Standard methods (for example, Phenol / chloroform) to extract DNA from the virus pellet, Then, using the specific probe described above, Southern blotting and / or P Test for the presence of KSHV by CR.   For all bound virions, the cell-free supernatant at low speed was 7% PEG- Adjust to include 8000. PEG-supernatant at 10,000 × g for 30 minutes Invert. The supernatant is drained off and the pellet is then collected and a small volume (1-2 ml) Virus buffer (VB, 0.1 M NaCl, 0.01 M Tris, pH 7.5) Resuspend in In a 10-15% sucrose density gradient made with VB, Virions are isolated by centrifugation at 25,000 rpm. Standard methods (for example, Using a fractionator) to obtain a gradient fraction, followed by specific hybridization. Test each fraction by dot blotting using a dilation probe And the gradient fraction containing the purified virus is determined (the preparation of this fraction depends on the presence of the virus). Is required, ie for standard DNA extraction).   The method of isolating the KSHV genome is described in Pellicer et al., 1978, Cell 14, 133-141. Gibson and Roizmann, 1972; Virol. Based on 10,1044-57.   The final method of isolating the KSHV genome is a clamped homogeneous electric field (CHEF) generator. Electrophoresis. Agarose plugs were used to reduce RSHV-infected cells to 1% LM. Resuspend in P agarose (Biorad) and 0.9% NaCl at 42 ° C. 2.5 × 10 concentration7Prepare by making cells / ml. Agaro solidified Sprags in lysis buffer (0.5 M EDTA pH 8.0, 1% sarkosyl, Transfer to a final concentration of 1 mg / ml with proteinase K, then incubate for 24 hours. To About 107Individual cells are loaded into each lane. CHEF Mapper XA pulse power On a field electrophoresis apparatus (Biorad), with a running time of 28 hours, a gradient of 6.0 V / cm. The gel is electrophoresed, and Southern blotting is performed. Hybridize with 0Bam and EBV terminal repeats.   To generate a new cell line infected with KSHV, cells already infected were Culture with Raji cell line isolated with 0.45μ filter. Then, about 1 -2x106Of already infected BCBL-1 cells and 2 × 106Raji fine Cells were cultured in medium supplemented with RPMI alone or at 20 ng / ml 12-O-. 2-20 days with tetradecanol phorbol-13-acetate (TPA) Culture for a while. After 2-20 days of co-culture, Raji cells are removed, washed, and Transfer to medium supplemented with PMI 1640. BCBL in 20 ng / ml TPA Raji cultures cultured for 2 days with -1 survived and were in continuous suspension for more than 10 weeks It is maintained in culture. This RCC-1 (Raji Co-Culture, No. 1) Cell line remains FCR positive for KSHV sequence after multiple passages . RCC-1 cells periodically undergo rapid cytolysis, suggestive of lytic growth of KSHV. Do. Thus, RCC-1 is a Raji cell line newly infected with KSHV .   In accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure, CC-1 and RCC-12F5On October 19, 1994, American Type C ulture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Marvland 20852 U.S.A. ATCC Accession No. CRL11734 in the Patent Culture Depository And deposited as CRL11735. International acceptance of deposit of microorganisms in patent proceedings HBL-6 (as BHL-6) in accordance with the Budapest Treaty on American Type and Culture Collection on November 18, 4th (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mar yland 20852 U.S.A. in the Patent Culture Depository) with ATCC accession number N o. Deposited as CRL11762.   B.KSHV hybridization probe   The present invention is designated by GenBank accession numbers U75698, U75699, U75700. Sometimes at least capable of specifically hybridizing with the isolated nucleic acid molecule A nucleic acid molecule having 14 nucleotides is provided.   In one embodiment, the nucleic acid molecule represented by GenBank accession number U75698 is , A long specific region (LUR) encoding a KSHV polypeptide. Another one In one embodiment, the nucleic acid molecule represented by GenBank Accession No. Contains rototype terminal repeats (TR). In another embodiment, GenBank The nucleic acid molecule represented by accession number U75700 contains an incomplete terminal repeat (ITR).   In one embodiment, the molecule is between 8 and 36 nucleotides. Another one In embodiments, the molecule is between 12 and 25 nucleotides. Another form In one embodiment, the molecule is 14 nucleotides.   In one embodiment, the molecule is DNA. In another embodiment, the component The offspring are RNA.   In one embodiment, the TR molecule is required for DNA replication and packaging. Contains essential cis-active elements. In another embodiment, the TR molecule is a gene clone. Included in the ning vector. In another embodiment, the TR molecule is a gene Contained in the therapeutic vector. In another embodiment, the gene therapy vector is a recombinant vector. It is expressed in non-competent cells. In another embodiment, the TR is a tumor clonality. And a molecular marker for determining In another embodiment, the marker is Crucial to the natural history of tumors in diagnostic analysis Provides features.   The present invention relates to a plasmid containing the 801 bp KSHV TR or a part thereof, Provides B-lymphotropic DNA vector containing other self-replicatable DNA molecules I do.   High stringency hybridization conditions are defined for ionic strength Melting point (Tm) About 5 ° C lower than I have. The TmMeans that 50% of the salt concentration is at least about 0.02 molar at pH 7 (by definition). Under ionic strength and pH) and at a temperature of at least about 60 ° C. . Others that can significantly affect the stringency of hybridization As factors, in particular, the base composition and the size of the complementary strand, the presence of an organic solvent, , Salt or formamide concentration, and the degree of base mismatch. The combination of these parameters is more important than the absolute value of any one. For example, hybridization at about 68 ° C. overnight in a 6 × SSC solution is performed. Wash with 6X SSC solution at then 68C in 0.6X SSC solution By doing so, high stringency can be achieved.   Hybridization at moderate stringency can be achieved, for example, by 1) Filter pre-hybridization, 3X SSC, 50% formamide Solution, 0.1 M Tris buffer (pH 7.5), 5X Denhardt's solution And 2) pre-hybridization at 37 ° C. for 4 hours. Done; 3) At 37 ° C., a total amount of labeling equal to 3,000,000 cpm Hybridization for 16 hours with the probe; 4) SSC and Wash with 0.1% SDS solution; 5) Wash 4 times for 1 minute at room temperature, Wash in 4X SSC for 30 minutes each; then 6) Dry and expose to film Can be achieved.   Nucleic acid probe technology is well known to those of skill in the art, and It can vary significantly, and is radioactive to facilitate detection of the probe. Easily understand that they can be labeled with a detectable label, such as an isotope or a fluorescent dye. Would be. The DNA probe molecule can be an isolated full-length or fragmented DNA virus. A DNA molecule containing a piece of nucleic acid molecule is converted to a plasmid or bacteriophage. Sometimes inserted into a suitable vector, then transformed into a suitable bacterial host cell, Replicated in a transformed bacterial host cell, using methods known in the art. It may be produced by collecting the DNA probe. Alternatively, DNA The probe may be produced chemically by a synthesizer.   The RNA probe is a bacteriophage protein such as T3, T7 or SP6. Insert the full length or fragment of the isolated nucleic acid molecule of the DNA virus downstream of the motor What is necessary is just to produce by inserting. Label the labeled nucleotides with the appropriate RNA A linearized version of the isolated nucleic acid molecule of a DNA virus in the presence of limerase. Or a fragment thereof (containing a promoter upstream). Alternatively, a large amount of RNA probe may be prepared.   As defined herein, a nucleic acid probe is a DNA or RNA fragment. Good. DNA fragments can be obtained, for example, by digesting plasmid DNA, May be prepared by the use of PCR or may be prepared in the literature (Beaudage and Carrut). hers, 1981, Tetrahedron Lett. 72, 1859-1862) Or according to the literature (Metteucci et al., 1981, Am. Chem. Soc. 103: 3185). It may be synthesized by any of the ester methods. Then, if desired, the appropriate By annealing with a chemically synthesized single strand under the conditions Synthesizing a complementary strand using a DNA polymerase having a sharp primer sequence May obtain a double-stranded fragment. When the specific sequence of the nucleic acid probe is given In that case, it is understood that the complementary strand fragment is also determined and included in the present invention. The complementary strand Will work equally well in situations where the target is a double-stranded nucleic acid. If a particular sequence is identified for use with a nucleic acid probe, it can be 25 salts in length. Subsequences of the sequences listed in the Sequence Listing that are more than base pairs (bp) are also referred to as probes. It will be understood that it is included with respect to the use of   Also, the nucleic acid molecules of the present invention may include the identification or localization of one or more amino acid residues. In view of the above, the polypeptide of an antigenic polypeptide different from the naturally occurring form De analogs, fragments or derivatives (residues less than all specified for the polypeptide) Deletion analogue containing a group, wherein one or more specified residues are replaced by another residue Substitution analogs and one or more amino acid residues at the terminal or middle of the polypeptide Addition analog), and of the nature in its naturally occurring form Also included are molecules that encode analogs that share some or all. these The molecule includes a set of "preferred" codons for expression by the selected non-mammalian host. Incorporation; Provision of a cleavage site by restriction endonuclease enzymes; and easy expression Additional DNA sequence at the start and additional end at the end to facilitate the construction of Includes providing additional DNA sequences or additional DNA sequences in the middle.   C.KSHV polypeptide and antibody thereto (Ab's)   The present invention relates to an isolated KSHV polypeptide, ie, as listed in Table 1 and below. A polypeptide is provided.   The present invention comprises a virus macrophage inflammatory protein III (vMIP-III). The isolated KSHV polypeptide is provided. In one embodiment, the vM IP-III constitutes an orphan cytokine. Another In embodiments, the vMIP-III is at nucleotides 22,529-22,185. Is coded. In another embodiment, vMIP-III comprises an anti-inflammatory drug You. In a preferred embodiment, the agents are useful for treating an autoimmune disorder. Most favorable In a preferred embodiment, the medicament is useful for treating rheumatoid arthritis.   The present invention relates to dihydrofolate reductase (DHF) encoded by ORF2. An isolated KSHV polypeptide comprising R) is provided. In one aspect Thus, DHFR is involved in KSHV nucleotide synthesis. In another aspect , DHFR is an enzyme essential for viral replication (ie, its inhibition causes virus production). Hinder). In another embodiment, the DHFR is a subunit vaccine. N Is configured. In another embodiment, DHFR is an antigen for immunological analysis. Constitute.   In another embodiment, DHFR has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 .   In another embodiment, KSHV DHFR inhibits bacterial DHFR Inhibited by known sulfa drugs. In a preferred embodiment, K SHV DHFR is a methotrex that is known to inhibit mammalian DHFR. Inhibited by xate or its derivatives. In another embodiment, Rufa, methotrexate or a derivative thereof is effective for inhibiting KSHV. It is selective for the herpes virus.   The present invention relates to thymidylate synthase (TS) encoded by ORF70. Provided, including an isolated KSHV polypeptide. In one aspect, the TS Is involved in KSHV nucleotide metabolism. In another aspect, the TS is Constructs an enzyme essential for viral replication (ie, its inhibition prevents virus production). To achieve. In another aspect, the TS comprises a subunit vaccine. Also In another embodiment, the TS comprises an antigen for immunological analysis.   The present invention relates to the isolation of the DNA polymerase encoded by ORF9. Provided KSHV polypeptides. In one embodiment, a DNA polymer Is an enzyme essential for viral replication (ie, its inhibition prevents virus production). ). In another embodiment, the DNA polymerase is a subunit Make up the vaccine. In another embodiment, the DNA polymerase is immunologically Make up the antigen for analysis.   The present invention comprises an alkaline exonuclease encoded by ORF37. The isolated KSHV polypeptide is provided. In one embodiment, al Calliexonuclease packages KSHV DNA into viral particles. To In another embodiment, the alkaline exonuclease is viral It constitutes an enzyme essential for replication (ie, its inhibition prevents virus production). Also In another embodiment, the alkaline exonuclease comprises a subunit vaccine. Constitute. In another embodiment, the alkaline exonuclease is immunologically separated. Make up the antigen for analysis.   The present invention relates to helicases encoded by ORFs 40, 41 and 44, respectively. -An isolated KSHV polymorph comprising primase, subunits 1, 2 and 3 Provide a peptide. In one embodiment, the helicase primase is a virus It has the enzymatic activity essential for DNA replication of DNA. In another embodiment, a helicopter Ze-primase is inhibited by nucleotide analogs. In another aspect In this case, helicase-primase is inhibited by known antiviral agents. In another embodiment, inhibition of helicase-primase prevents KSHV replication. I can.   The present invention relates to uracil DNA glycosylase encoded by ORF46 ( UTDG) is provided. One aspect In uracil DNA glycosylase, the DNA of KSHV during DNA replication A constitutes an enzyme essential for repair. In another embodiment, uracil DNA glycos Cosylase is inhibited by known antiviral agents. In another aspect , Uracil DNA glycosylase constitutes a subunit vaccine. Another one In an embodiment, uracil DNA glycosylase binds an antigen for immunological analysis. Constitute.   The present invention relates to a single-stranded DNA binding protein encoded by ORF06 (SS (BP) comprising the isolated KSHV polypeptide. In one aspect In addition, SSBP constitutes an enzyme essential for DNA replication of KSHV. Another In embodiments, SSBP is inhibited by known antiviral agents. Another In embodiments, SSBPs are used as in conventional PCR methods for DNA amplification. Increases the processivity of the remerase reaction.   The present invention provides a viral protein kinase encoded by ORF36. To provide an isolated KSHV polypeptide. In another embodiment, Irs protein kinase constitutes an antigen for immunological analysis. Another form In one embodiment, the viral protein kinase constitutes a subunit vaccine.   The present invention relates to a lysis cycle transactivator encoded by ORF50. The isolated KSHV polypeptide comprising the tertiary protein (LCTP) . In one embodiment, LCTP is used to activate a productive infection from a latent state. Must Is required. In another embodiment, LCTP is activated by a known antiviral agent. Be inhibited. In another embodiment, prevention of LCTP expression is due to the inability to replicate Keep the virus in a prone position.   The present invention relates to ribonucleotide reductase (ie, its small subunits and The two large subunits are encoded by ORF60 and ORF61, respectively. (Subunit enzyme). Also In another embodiment, the ribonucleotide reductase is capable of replicating DNA. To catalyze the conversion of ribonucleotides to deoxyribonucleotides. Already In one embodiment, the ribonucleotide reductase is a cellular ribonucleotide. In terminally differentiated cells that do not express dredactase, a known antiviral agent Inhibited by In another embodiment, a ribonucleotide reductase Constitutes an antigen for immunological analysis. In another embodiment, the ribonucleic acid Otide reductase constitutes a subunit vaccine. In another aspect Thus, ribonucleotide reductase is a trait for the establishment of immortalized cell lines. Make up the conversion agent.   The present invention relates to an isolated KSHV comprising a protein encoded by ORF K1. A polypeptide is provided.   The present invention provides a complement-binding protein (v-CBP; C-encoded by ORF4). CP) comprising the isolated KSHV polypeptide.   The present invention provides an isolated K protein comprising a transport protein encoded by ORF7. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated K protein comprising glycoprotein B encoded by ORF8. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF10. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF11. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to a viral interleukin 6 encoded by ORF K2. An isolated KSHV polypeptide comprising (vIL-6) is provided. One In embodiments, the antibody that selectively recognizes vIL-6 allows for differentiation between lymphomas To   The present invention constitutes BHV4-IE1 I encoded by ORF K3. The present invention provides an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to the isolation comprising the vMIP-II encoded by ORF K4 Provided KSHV polypeptides. In one embodiment, vMIP-II Constitute an anti-inflammatory drug. In a preferred embodiment, the medicament is for treating an autoimmune disorder. Useful. In a most preferred embodiment, the agent is useful for treating rheumatoid arthritis. It is for.   The present invention provides a BHV4-IE1 II encoded by ORF K5. To provide an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to an isolated vMIP-I encoded by ORF K6. KSHV polypeptides are provided. In one embodiment, vMIP-I is an anti- Contains inflammatory drugs. In a preferred embodiment, the agent is useful for treating an autoimmune disorder. You. In a most preferred embodiment, the agent is useful for treating rheumatoid arthritis .   The present invention relates to an isolated K comprising the protein encoded by ORF K7. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to the isolated Bcl-2 encoded by ORF16. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention constitutes capsid protein 1 encoded by ORF17 An isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF18. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated coat protein I which is encoded by ORF19. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF20. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolation comprising a thymidine kinase encoded by ORF21. Provided KSHV polypeptides.   The present invention provides an isolated form of glycoprotein H encoded by ORF22. A KSHV polypeptide is provided.   In one embodiment, the isolation comprising the protein encoded by ORF23 Provided KSHV polypeptides.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF24. An HV polypeptide is provided.   The present invention constitutes a major capsid protein encoded by ORF25. The present invention provides an isolated KSHV polypeptide.     The present invention provides a capsid protein II encoded by ORF26. To provide an isolated KSHV polypeptide.     The present invention provides an isolated K protein comprising the protein encoded by ORF27. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF28. An HV polypeptide is provided.   The present invention comprises a packaging protein II encoded by ORF29b. The isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF30. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF31. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF32. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF33. An HV polypeptide is provided.   The present invention provides a packaging protein I encoded by ORF29a. To provide an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF34. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF35. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF38. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated glycoprotein M encoded by ORF39. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF42. An HV polypeptide is provided.   The present invention provides a capsid protein III encoded by ORF43. To provide an isolated KSHV polypeptide.   The present invention provides a virion assembly protein encoded by ORF45. An isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to the isolated glycoprotein L encoded by ORF47. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF48. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF49. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated K comprising the protein encoded by ORF K8. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF52. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF53. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to isolated dUTPase encoded by ORF54. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF55. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to a DNA replication protein I encoded by ORF56. An isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an early protein II (LEP-II) encoded by ORF57. An isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to the preparation of viral interferons encoded by ORF K9. An isolated KSHV polypeptide that constitutes node factor 1 (vIRF1; ICSBP) Provide In one embodiment, vIRF1 is a transforming polypeptide. You.   The present invention relates to an isolated protein comprising the protein encoded by ORF K10. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated protein comprising the protein encoded by ORF K11. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated phosphoprotein that is encoded by ORF58. KSHV polypeptides are provided.   The present invention constitutes DNA replication protein II encoded by ORF59 An isolated KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an assembly / DNA mature protein encoded by ORF62. Provided is an isolated KSHV polypeptide comprising the substance.   The present invention relates to an isolated protein comprising coat protein II encoded by ORF63. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to the isolation of the coat protein III encoded by ORF64. Provided KSHV polypeptides.   The present invention provides a capsid protein IV encoded by ORF65. The present invention provides an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF66. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated protein comprising coat protein IV encoded by ORF67. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to an isolated K protein comprising the glycoprotein encoded by ORF68. An SHV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated KS comprising the protein encoded by ORF69. An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to an isolated capodin encoded by ORF K12. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to an isolated protein comprising the protein encoded by ORF K13. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to the isolated cyclin D encoded by ORF72. KSHV polypeptides are provided.   The present invention provides an immediate early protein (IEP) encoded by ORF73. The present invention provides an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to the isolated OX-2 encoded by ORF K14. KSHV polypeptides are provided.   The present invention relates to an isolated G-protein encoded by ORF74. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention provides a coat protein / FGARAT encoded by ORF75. To provide an isolated KSHV polypeptide.   The present invention relates to an isolated protein comprising the protein encoded by ORF K15. A KSHV polypeptide is provided.   The present invention relates to a mouse encoded by nucleotides 88,910-88,410. Isolated KS comprising illness interferon modulator 2 (vIRF2) An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to a mouse encoded by nucleotides 90,541-89,600. Isolated KS comprising illness interferon modulator 3 (vIRF3) An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to a mouse encoded by nucleotides 94,127-93,636. Isolated KS comprising illness interferon modulator 4 (vIRF4) An HV polypeptide is provided.   The present invention relates to the components encoded by nucleotides 90,173-90,643. An isolated KSHV polypeptide which constitutes a precursor of the secretory glycoprotein X (gX) I will provide a.   The present invention relates to a protein encoded by nucleotides 28,661-29,741. An isolated KSHV polypeptide comprising white matter T1.1 is provided.   Further, the isolated nucleic acid molecule can be linked to a second nucleic acid molecule and expressed in a suitable host. Allows the isolated polypeptide to be linked to and fused with a second polypeptide. Synthetic proteins may be formed. In one embodiment, the second nucleic acid molecule is β-galacto. Encodes tosidase. Other nucleic acid molecules used to form fusion proteins Is known to those skilled in the art.   The invention specifically binds to a polypeptide encoded by an isolated nucleic acid molecule An antibody is provided. In one embodiment, the antibody is a monoclonal antibody . In another embodiment, the antibody recognizes an epitope of a KSHV polypeptide I do. In another embodiment, the antibody comprises one or more epitopes of a KSHV polypeptide. Recognize the toup. In another embodiment, the antibody is an anti-idiotype antibody is there.   The antibody, polypeptide or isolated nucleic acid molecule can be, but is not limited to, , Radioactive, or colorimetric, luminescent, or fluorescent markers It may be labeled with a marker or a detectable marker such as gold. radiation Sex labels include, but are not limited to,ThreeH,14C,32P,33P,35S,Three 6 Cl,51Cr,57Co,59Co,59Fe,90Y,125I,135I and136Re is No. Fluorescent markers include, but are not limited to, fluorescein , Rhodamine and auramine. As a colorimetric marker, Although not specified, biotin and digoxigenin are mentioned. Polik Methods for producing nal or monoclonal antibodies are known to those of skill in the art. .   Further, the antibody, polypeptide or nucleic acid molecule may be alkaline phosphatase. Alternatively, use a secondary antibody conjugated to an enzyme such as horseradish peroxidase. May be detected. Other enzymes that may be used are well known to those skilled in the art.   The present invention provides for the production of polypeptides under appropriate conditions, and Growing the host vector system for recovering the produced polypeptide. A method for producing a polypeptide encoded by an isolated nucleic acid molecule. You. Suitable host cells include bacteria, yeast, molds, plants, insects and mammalian cells. Vesicles. For producing a polypeptide and then recovering the polypeptide Host vector systems are well known to those of skill in the art and include, but are not limited to, Lipof Ectin (Gibco-BRD) or calcium phosphate precipitation, or vector into cells -Transfer the mammalian expression vector by other methods to achieve E. coli and pMAL (New England Biolabs), Sf9 Insect cell baculovirus expression systems and mammalian expression vectors (eg, HeL a, COS, NIH 3T3 and HEK293). If you are a person skilled in the art Are familiar with the many expression systems available for the expression of KSHV polypeptides You.   The present invention relates to a polypeptide encoded by an isolated nucleic acid molecule of a DNA virus. A method for selecting a specific region on a butide to produce an antibody is provided. Amino acid sequence Are analyzed by methods well known to those skilled in the art, and they are formed by Determining whether to generate hydrophobic or hydrophilic regions in a polypeptide Good. In the case of cell membrane polypeptides, the hydrophobic region is inserted into the lipid bilayer of the cell membrane Whereas the hydrophilic region forms on the cell surface, i.e., water. Located in a sexual environment. Usually, hydrophilic regions are considered more immunogenic than hydrophobic regions Have been. Therefore, a hydrophilic amino acid sequence is selected to encode a DNA virus. Antibodies specific for the polypeptide encoded by the isolated nucleic acid molecule May be used to produce Selected antibodies were obtained using commercially available machines. May be prepared. Alternatively, the nucleic acid is cloned and expressed, and the resulting poly Peptide may be recovered and used as immunogen   Immunizing an animal with the selected KSHV polypeptide provides a Polyclonal antibodies to the polypeptide may be produced. Monoclonal anti The body is immunized using hybridoma technology and further described below. Antibody-producing B cells from the infected animal are fused with myeloma cells, and the resulting Prepared by selecting a hybridoma cell line that produces the desired antibody You. II.Immunoassay   Antibodies raised against the KSHV polypeptide antigen were ligated as described above. Detectable using conventional labeling techniques that are well known in the art. May be labeled.   Further, an enzyme may be used as a label. Suitable enzymes include alkaline Sphatase, β-galactosidase, glucose-6-phosphate dehydro Genases, maleate dehydrogenases and peroxidases. The two main types of enzyme immunoassays are enzyme-linked immunosorbent assays. (ELISA), and homogeneous enzyme immunoassays, which are also Known as an epidemiological assay (EMIT, Syva Corporation, Palo Alto, CA). E In a LISA system, separation is achieved, for example, by using an antibody bound to a solid phase. Can be done. The EMIT system relies on the inactivation of the enzyme in the tracer antibody complex, Thus, the activity is measured without the need for a separation step.   Further, a chemiluminescent compound may be used as a label. Typical chemiluminescent compounds Include luminol, isoluminol, aromatic acridinium ester, Dazole, acridinium salts, and oxalate esters. As well Alternatively, a bioluminescent compound may be used for labeling, Include luciferin, luciferase, and aequorin.   Radioimmunoassay (RIA) is described in the literature (Laboratory Techniques in  Biochemistry and Molecular Biology (1978) North Holland Publishing Comp any, New York). Chard's "Radio Immunoassay An Introduction to Radioimmune Assay and Related T echniques) ". Various types of common immunity A description of the quantification method is given in U.S. Pat.No. 4,376,110 (David et al.) Or Piasio).   A.Assay for KSHV polypeptide antigen   To detect a virus, its components, or antibodies to it, Essays can be used. For a general review of applicable technologies, see Harlow And Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pu There are blication and New York.   In one embodiment, using an antibody against a KSHV polypeptide antigen is used. it can. Conveniently, the target polypeptide is expressed to produce the antibody. To purify. The product is injected into a mammal capable of producing antibodies. The heredity Polyclonal or monoclonal antibodies specific to the progeny product (recombinant antibodies) ) Can be used in various immunoassays. Overcast Assay Examples include competitive immunoassay, radioimmunoassay, western blot, ELISA, indirect immunofluorescence, and the like. For competitive immunoassays See Harlow and Lane at pages 567-573 and 584-589. That.   Monoclonal or recombinant antibodies are well known to those of skill in the art. Can be obtained by Conveniently, from animals immunized with the desired antigen By fusing spleen cells or other lymphocytes, usually with myeloma cells, (Kohler and Milstain, 1976, Eur. J. Immunol. 6, 511-519). reference). Alternatives to immortalization include Epstein-Barr virus, oncogenes, or Or retcovirus, or a pond well known in the art. There is a method. Colony formation from single immortalized cells is desired for antigen Screening for the production of antibodies with specificity and affinity The yield of monoclonal antibody produced by the vesicle is injected into the peritoneal cavity of the vertebrate host. It may be increased by various techniques, including shooting. In addition, recombinant Newer technologies using large antibody expression systems have also created monoclonal antibodies. Can be used for For example, McCaffartv et al., (1990) Nature 348, 552; ogenboom et al., (1991) Nuc. Acids Res. 19, 4133; and Marks et al., (1991) J. Am. See Mol Biol, 222, 581-597.   Naturally occurring processin associated with MHC (major histocompatibility complex) I molecules A method for identifying the peptide that has undergone the tagging can be used. Falk et al., 1991, PCT Publication WO9 published on Nature 351,290 and November 26, 1992 See 2/21033. Typically, these methods involve appropriate details. By immunoprecipitation or affinity chromatography from cells or cell lines , MHC class I molecules. Another method is to classify B-type cells. Various HPLC fractions by known automated sequencing of peptides eluted from the molecule I Amino acid sequencing of even larger quantities of peptides (Jardetzkey et al., 1991) , Nature 353, 326), and human MHC class I molecules by mass spectrometry (ie, , HLA-A2.1 type) (Hunt et al., 1991, Eur. J. Immuno. l. 21, 2963-2970). Processing naturally in MHC Class I For a general review on the identification of received peptides, see Rotzschke and Falk, 199. 1, Tmmunol. See also Today 12, 447. Further, Marloes et al., 1991, Eu r. J. Immunol. 21, 2963-2970 describes possible viral immunity in vitro How Class I Binding Motifs Can Be Applied for Identification of Primitive Peptides It has been described.   Polypeptides described herein, produced by recombinant techniques, will be useful to those of skill in the art. It can be purified by well-known standard techniques. Wheat produced by recombination Rus polypeptides can be expressed directly or as fusion proteins. Can be expressed. The protein is then lysed (eg, by sonication) and And affinity chromatography. About the fusion product By digesting the fusion protein with the appropriate protease Release the desired peptide.   Selective precipitation with substances such as ammonium sulfate, column chromatography, Standard techniques well known in the art, including immunopurification and other methods Allows the polypeptide to be purified to substantially pure purity. For example, Scopes, 1982, Protein Purification: Principles and Practice, Spri See nger-Verlag, New York.   B.Assay for antibodies that specifically bind to KSHV polypeptide   Antibodies reactive with the polypeptide antigen of KSHV are described above for antigen determination. It can also be measured by various immunoassay methods similar to the method described above. Immunological and immunoassays applicable to the measurement of antibodies by immunoassay technology For a general review on B, see Basic and Clinical Immunology, 7th Edition, Stites and T err., and Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manural, See Cold Spring Harbor, New York.   Briefly, a method for measuring antibodies reactive with a KSHV polypeptide antigen is described. Muno assays may be either competitive or non-competitive binding assays. Competition In a combined assay, the sample analyte is a specific binding site on a capture agent bound to a solid surface. Compete with the labeled subject for Preferably, the scavenger is as described above. It is a purified recombinant human herpesvirus polypeptide produced by the above method. Also isolated Or partially purified, naturally occurring polypeptides, Other sources of human herpesvirus polypeptides may also be used.   Non-competitive assays typically involve two analyte-specific binding assays in a sample analyte. A sandwich assay that is bound between drugs. One of the binding reagents is a capture agent To bind to the solid surface. The second binding reagent may be labeled and visually or Is used to measure or detect the resulting complex by mechanical means You. Many combinations of capture agents and labeled binding reagents can be used You. A variety of different immunoassay formats, separation techniques and labels are also available from KSHV. It can be used as described above for the measurement of polypeptide antigen.   Hemagglutination inhibition (HI) and complement fixation (CF) Testing for the presence of antibodies to the antigens of human herpes There are two laboratory tests that can be used to detect infection with Rus.   Serological methods are also useful if you want to detect antibodies to specific virus variants Can be For example, a new formulation from a patient's serum You may want to see how successful the recipient has responded. IIA.Vectors, cell lines and transformed mammals   The invention relates to a replication comprising an isolated nucleic acid molecule encoding a KSHV polypeptide. Provide possible vectors. The vector is not limited, but Plasmid, cosmid, lambda phage or yeast artificial containing the isolated nucleic acid molecule Chromosomes (YAC).   In order to obtain the vector, for example, both the inserted DNA and the vector DNA Is exposed to restriction enzymes to create complementary ends on both molecules whose bases are paired with each other. Can be ligated together with DNA ligase. Alternatively, the linker can be Ligated to the inserted DNA corresponding to the restriction site in the vector DNA, and then Digest with restriction enzymes that cut with. Other methods are available and are well known to those skilled in the art.   The present invention provides a host cell containing the vector. Suitable host cells include: Without limitation, e.g. Escherichia coli (E. coli), yeast, filamentous fungi, Plant, insect and mammalian cells are included. Suitable animal cells are limited Vero cells, HeLa cells, Cos cells, CV1 cells and And various major mammalian cells.   The present invention relates to a form comprising the isolated nucleic acid molecule introduced into the mammal at the fetal stage. A transgenic non-human mammal is provided. The method for producing a transformed non-human mammal Known in the art. III.Diagnostic assays for KS   The present invention is directed to biological samples (eg, skin samples or other affected tissues). A diagnostic test kit for detecting the presence of KSHV in a KSHV polypeptide Containers containing specific nucleic acid sequences for peptides and uses for performing tests Includes a diagnostic reagent kit consisting of instructions. Which of these arrays is paired A container containing the nucleic acid primers is optionally included.   The present invention further provides for the use of biological samples (eg, serum or solid tissue samples). A diagnostic test kit for detecting the presence of KSHV, comprising: Consists of a container containing antibodies to the peptide and instructions for performing the test Diagnostic reagent kits. Alternatively, it may be derived from a herpes virus Inactivated virus particles or polypeptides are used in a diagnostic test kit to generate KS Antibodies specific for the HV polypeptide may be detected.   A.Nucleic acid assays   The present invention provides (a) obtaining nucleic acid molecules from a tumor lesion or an appropriate body fluid of a patient. And (b) under hybridizing conditions, the nucleic acid molecule is isolated from KSHV. At least 15 nucleotides capable of specifically hybridizing to a nucleic acid molecule Contacting with a labeled nucleic acid molecule of the present invention, and By determining the presence of a hybridized nucleic acid molecule that indicates Diagnosing Kaposi's sarcoma in a patient, comprising diagnosing Kaposi's sarcoma Provide the law.   In one embodiment, the nucleic acid molecule from the tumor lesion is amplified before step (b) Let it. In another embodiment, a polymerase chain reaction is used to amplify the nucleic acid molecule. The reaction (PCR) is used. Methods for amplifying nucleic acid molecules are known to those skilled in the art.   One of skill in the art will obtain an appropriate nucleic acid sample for diagnosing Kaposi's sarcoma in a patient. Will be able to The DNA sample obtained by the method described above is used for analysis. Previously, it may be cleaved with a restriction enzyme well known in the art.   In the method described above, the size fraction achieved by the polyacrylamide gel May be used. In one embodiment, the size fractionation is by agarose gel. Is achieved. In addition, prior to the hybridization step, a solid matrix The transcription of the nucleic acid fragment into the nucleic acid may be performed. One example of such a solid matrix is Nitrocellulose paper.   The present invention provides a cell-derived mRNA, and the mRNA is obtained under hybridizing conditions. Contact with a labeled nucleic acid molecule of KSHV and the presence of mRNA hybridized to the molecule And determining the expression of said KSHV gene thereby. And a method for detecting the expression of the KSHV gene in cells. In one aspect CDNA is prepared from mRNA obtained from the cells and used to detect KSHV expression. Used for exit.   Acceptable methods for performing hybridization assays are known. For a general review of the technology, see Nucleic Acid Hybridization: A Practical Appro ach (1985) Hamcs and Higgins, IRL Press: Hybridization of Nucleic Acids I mmobilized on Solid Supports, Meinkoth and Wahl; Analytical Biochemistry (1984) 238, 267-284 and Innis et al., PCR Protocols (1990) Academic Press, San Die. From the go review.   For KS nucleic acid hybridization diagnostic assays, target-specific probes May be used. The probe is specific or complementary to the target of interest . To distinguish the correct allele, the probe should be about 14 nucleotides long. And should preferably be about 20-30 nucleotides. For more universal detection of KSHV, the nucleic acid probe should be about 50-1000 Nucleotides, most preferably about 200-400 nucleotides.   Specific nucleic acid probes can be RNA, DNA, oligonucleotides, or May be analogs of The probe may be a single or double stranded nucleic acid molecule. The probes of the present invention can be enzymatically (eg, Nick translation, primer extension, reverse transcription, polymerase chain reaction, etc. ) Or chemically (eg, Beaucage and Carruthers or Matteucci et al., Supra) (By the method described above).   The probe forms a stable double helix with its target nucleic acid in the sample Must be of sufficient length, ie, at least 14 nucleotides. And may be even longer (eg, at least about 50 or 100 bases in length). Often the probes may be longer than about 100 bases in length. For example, Nick translation of DNA in the presence of labeled nucleotides When preparing probes, the average probe length can be about 100-600 bases .   For a discussion of nucleic acid probe design and annealing conditions, see, for example, Ausubel et al., Supra; Berger and Kimmel eds., Methods in Enzymology 152, (1 987) Academic Press, New York; or Hybridization with Nucleic Acid Probe s, pp. 495-524, (1993) Elsevier, Amsterdam.   Usually, at least a portion of the probe has significant sequence identity with the target nucleic acid. It is thought that it is. Degree of sequence identity required for specific hybridization Usually depends on the length of the probe and hybridization conditions, A probe has at least 70% identity to the target nucleic acid, and more usually at least Also have 80% identity, and even more usually have at least 90% identity, Most usually will have at least 95% or 100% identity.   The following stringent hybridization and wash conditions are specific Untargeted to specific probes (eg, fluorescently labeled nucleic acid probes) Will be sufficient to distinguish between: denatured probe, 50% formamide, 2X SS C in a solution containing 0.1% (w / v) dextran sulfate at 37 ° C. Time, incubate the probe with the sample, then 1X at 70 ° C. for 5 minutes.   2X SSC at 37 ° C. for 5 minutes in SSC, 0.2 × SS at room temperature for 5 minutes C, then H for 5 minutes at room temperatureTwoWash with O. Nucleic acid hybridization ( That is, in situ Southern or Northern) Cleaning agents (eg, sodium dodecyl sulfate), Rate agents (eg, EDTA) or other reagents (eg, buffer, Denhardt) Solution, dextran sulfate) is often advantageous. I know. To assess specificity, probes were placed on host cells containing KSHV. Can be compared to results obtained from cells containing non-KSHV virus. Wear.   To determine whether the probe is specific for a KSHV nucleic acid molecule Conventional methods use Southern blots (or dot blots) with DNA prepared from the virus. The use of lots) will be apparent to those skilled in the art. In short, the mark Isolate DNA from virus to identify target-specific probes . The test DNA (either viral or cellular) is solid (eg, charged) Nylon) Transfer to matrix. The probe is labeled by a standard method. The following changes Sex and / or prehybridization steps are known in the art. Immobilized DN under stringent conditions as defined above A is hybridized.   Furthermore, the present invention is useful for determining the specificity of a probe and for detecting KSHV. When using the method, a fixed amount of background signal is typical and One would easily be able to distinguish it from the specific signal. Twice the background Signals are acceptable.   A preferred method of detecting KSHV polypeptide is by PCR and / or docking. Is to use blot blot hybridization. Detection for KS Or test the presence or absence of KSHV for prognosis or risk assessment Other methods include Southern Transfer, Solution High, all of which are well known to those skilled in the art. Hybridization or non-radioactive detection systems. High with probe Perform hybridization. By visualizing the hybridized parts , The presence or absence of the causative reagent can be qualitatively determined.   Similarly, Northern transfer or reverse transcriptase PCR was performed using KSH in the sample. It may be used for the detection of V messenger RNA. These methods are also part of the art. It is well known in the field. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning. : A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Volume 1-3 Teru.   An alternative means for determining the presence of the human herpes virus is in situ And more recently, in situ polymerase chain It is a reaction. In situ PCR is described in Ncuvo et al. (1993) American Journal of Sur. ginal Pathology 17 (7), Intercellular location of PCR-amplified hepatitis C DNA in 683-690 Currently in Bagrasra et al., (1992) New England Journal of Medicine 326 (21), 1385-1391 Of HIV-1 provirus in mononuclear cells by in situ PCR And Heniford et al., (1993) Nuclcie Acids Research 21,3159-3166. Cellular EGF receptor mR demonstrated by u reverse transcriptase polymerase chain reaction Changes in NA expression are described. In situ hybridization Say is well known and is generally described in Methods Enzymol. 152, (1987) Berger and K. immel, Academic Press, New York. in situ hybrida In the incubation, cells are fixed to a solid support, typically a glass slide. It is. The cells are then contacted with the hybridization solution at a moderate temperature. Anneal the labeled target-specific probe. The probe is preferably Labeled with a radioisotope or a fluorescent reporter.   In addition, the above-mentioned probe is used for in situ hybridization. Or to locate tissues that express genes, or Other hybridization for the presence of a gene or its mRNA in tissue Useful for assays. In situ hybridization is performed on poly Sensitive positioning method independent of peptide antigen expression or natural or denaturing conditions is there.   Also, synthetic oligonucleotides prepared from KSHV phagemids or plasmids Otide (oligo) probes and riboprobes are also provided. Success with tissue sections Hybridization conditions can vary from one probe to another. Transfer easily. Commercially synthesized oligonucleotide probes have been identified It is prepared using the nucleotide sequence of the gene. These probes have a length ( 45-65mer), selected for high GC content (50-70%); Screened for specificity to other viral sequences in Bank You.   Oligos are 1x10Tento a specific activity in the range of dpm / μg. Using reotidyl transferase, [α-35S] dATP marks the 3 'end Is known. Unincorporated labeled nucleotides from the oligo probe By centrifugation through a Sephadex G-25 column or by Waters  Remove by elution from a Sep Pak C-18 column.   KS tissue embedded in OCT compound and frozen ice cooled on dry ice The frozen material in pentane is cut at 6 μm intervals and 3-aminopropyltriethoxy Thaw on run-treated slides and air dry. Then reload the slide Fix in the prepared 4% paraformaldehyde and wash in water. Also, Hol The KS tissue fixed in marine and embedded in paraffin is cut at 6 μm and slide Those baked on a lath can also be used. The flakes are then Deparaffinized in water and hydrated with gradually changing alcohol. At 37 ° C 30 mM 20 mM Tris pH 7.5, 0.02% Denhardt's solution, 10% Prehybridization in kisstran followed by 50% formal at 42 ° C. Muamide (v / v), 10% dextran sulfate (w / v), 20 mM sodium phosphate Lithium (pH 7.4), 3x SSC, 1x Denhardt's solution, 100 µg / ml Salmon sperm DNA, 125 μg / ml yeast tRNA and oligoprobe (106 (cpm / ml) overnight. Slide Wash twice with 3 × SSC at room temperature for 15 minutes each and 2 × with 1 × SSC, autoradio Visualize by chromatography. For convenience, the sections are treated with 0.3 M ammonium acetate. Dehydrate with gradually changed alcohol containing and air dry. Kodak N Immersed in TB2 emulsion, exposed for several days to several weeks, developed, Counterstain with phosphorus and eosin (H & E).   Alternative immunohistochemical protocols well known to those skilled in the art may be used.   B.Immunological assay   The present invention provides (a) obtaining an appropriate body fluid sample from a patient; The cut body fluid is applied to a support to which an antibody recognizing the KSHV polypeptide has already been bound. To bind said antibody to a specific KSHV polypeptide antigen (C) removing unbound body fluids from the support; Measuring the level of the antibody to which the antigen is bound, thereby diagnosing Kaposi's sarcoma. Diagnosing Kaposi's sarcoma in a patient.   The present invention provides (a) obtaining an appropriate body fluid sample from a patient; The cut body fluid is contacted with a support to which the KSHV polypeptide antigen has already been bound. Binding a specific Kaposi's sarcoma antibody to the antigen; Removing the unbound body fluid and then (d) binding the Kaposi's sarcoma antibody Measuring the level of said antigen, thereby diagnosing Kaposi's sarcoma. A method for diagnosing Kaposi's sarcoma in a patient, comprising:   A suitable body fluid sample is any body containing a Kaposi's sarcoma antibody, antigen or fragment thereof. It may be a liquid sample. Suitable body fluid samples include, but are not limited to, , Serum, plasma, cerebrospinal fluid, lymph, urine, leak, or exudate. In a preferred embodiment, a suitable body fluid sample is serum or plasma. further, The sample may be cells from bone marrow, or supernatant from cell culture. patient Methods for obtaining suitable bodily fluid samples are known to those skilled in the art. Antibody or antigen The method for measuring the level of is not limited, but includes ELISA, I FA, and Western blotting. Other methods are known to those skilled in the art. Is knowledge. In addition, patients infected with KSHV may be infected using the methods described above. Can be diagnosed.   The detection of KSHV and the detection of virus-associated KS are performed in essentially the same way. is there. The basic principle is that normal human cells or other Or using a specific ligand that binds to the virus rather than to the nucleic acid. It is to detect. The ligand is a nucleic acid molecule, polypeptide or antibody obtain. The ligand may be a naturally occurring or unnatural nucleotide base. Genetically or physically modified such as nucleic acid having, or antibody induction Body, ie, Fab or chimeric antibody. It is also present in the patient's serum. Serological tests for the detection of antibodies to different viruses are also described herein. As described above, it can be performed by using a KSHV polypeptide as an antigen. No.   Samples may be from patients with KS or from KS, such as AIDS patients. It can be taken from a patient. Typically, the sample is blood (cells, blood From serum and / or plasma) or from solid tissue samples such as skin lesions Is done. The most accurate diagnosis of KS is that an increase in the titer of the virus is This is done when it is detected in multiple lesions. In addition, antibodies against the virus are detected KS if performed and if there are other diagnostic factors for KS Can be pointed out.   Further description of the immunoreagents of the present invention for use in diagnostic assays for KS See the immunoassay for further details. IV.Treatment of KS induced by human herpes virus   The present invention relates to a method for treating a patient with Kaposi's sarcoma (KS). Administering a pharmaceutically effective amount of an antiviral agent contained in a pharmaceutically acceptable carrier. The antiviral agent is effective for treating KS patients. Provide the law.   Furthermore, the present invention relates to a method for preventing or treating Kaposi's sarcoma (KS), KSHV binding in a pharmaceutically acceptable carrier for patients at risk A method is provided by administering a sexual antibody.   The present invention relates to a method for treating a patient with Kaposi's sarcoma (KS), Under conditions such that the antisense molecule selectively enters the patient's KS tumor cells, An effective amount of an antisense component capable of hybridizing to an isolated DNA molecule of SHV. Providing a method comprising administering a child to treat the patient.   A.Nucleic acid therapeutic   The present invention is capable of hybridizing with an isolated nucleic acid molecule of KSHV Provide antisense molecules. In one embodiment, the antisense molecule is DN A. In another embodiment, the antisense molecule is an RNA. Already In one embodiment, the antisense molecule is a nucleic acid derivative (eg, a protein backbone). DNA or RNA).   The present invention provides for masking mRNA with an antisense nucleic acid, respectively, or Inhibits polypeptide expression, either by cleaving it with a ribozyme Of antisense nucleic acids and ribozymes that can be used to Expanded to preparation.   The present invention provides for affecting KS by binding to an isolated nucleic acid molecule of KSHV. Inhibitory nucleic acid therapy that can inhibit herpes virus activity in affected patients Provide the agent. Inhibitory nucleic acids can specifically bind to complementary nucleic acid sequences It may be a single-stranded nucleic acid. By binding to an appropriate target sequence, RNA- RNA, DNA-DNA, or RNA-DNA duplex or triple helix It is formed. These nucleic acids are usually added to the sense or coding strand of a gene. It is often referred to as “antisense” because it is complementary to Attempts have also been made to use nucleic acid. When used in the present invention, "inhibitory "Nucleic acid" refers to both "sense" and "antisense" nucleic acids.   By binding to the target nucleic acid, the inhibitory nucleic acid inhibits the function of the target nucleic acid Can be This can be achieved, for example, by DNA transcription, processing, or m. Inhibiting poly (A) addition to RNA, DNA replication, translation, or RNA modification It may be the result of inducing an inhibitory mechanism of the cell that induces growth. Therefore Inhibitory nucleic acid methods have made many different attempts to modify the expression of herpesvirus genes. Include. These different types of inhibitory nucleic acid technology include Helene and Toulme (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049, 99-125. The offering is called "Helene and Toulmeto."   Briefly, approaches to inhibitory nucleic acid therapy target DNA sequences, Targeting RNA sequences and triggering cleavage or chemical modification of target nucleic acids It can be roughly divided into what causes it.   Attempts to target DNA fall into several categories. Duplicate nucleic acids Designed to bind to the major groove of DNA, a triple helix structure, Ox "structures can be formed. Alternatively, during replication or transcription, The binding is performed so as to bind to a region of the single-stranded DNA resulting from the cleavage of the double-stranded DNA. Design inhibitory nucleic acids.   More commonly, an inhibitory nucleus is used to bind to mRNA or pre-mRNA. Design acid. Inhibitory nucleic acids are used to inhibit pre-mRNA maturation. RNA Pro Design inhibitory nucleic acids to inhibit processing, splicing or translation. You may.   The inhibitory nucleic acid can target mRNA. In this approach, Inhibitory nucleic acids are designed to specifically inhibit the translation of the encoded protein. Using this approach, the inhibitory nucleic acid can be used to encode a critical protein. Inhibition of mRNA translation can selectively suppress the function of specific cells. Wear. For example, an inhibitory nucleic acid having complementarity to a region of c-myc mRNA is HL60, a human promyelocytic leukemia cell line overexpressing the c-myc pre-oncogene Inhibits the expression of c-myc protein. Wickstrom et al. (1988) PNAS85, 1028-1032 and And Harel-Bellan et al. (1988) Exp. Med. 168, 2309-2318. Helene and Toulmeto As described, inhibitory nucleic acids targeting mRNA can be derived from several different mechanisms. Act by inhibiting the translation of the encoded protein .   Inhibitory nucleic acids introduced into cells are also as described in Helene and Toulmeto. Include the "sense" strand of the gene or mRNA and are involved in the translation of the mRNA Enzymes or binding proteins can be trapped or compete with it.   Finally, chemical inactivation of a target gene or mRNA using the inhibitory nucleic acid Alternatively, cleavage can be induced. Chemical inactivation involves inhibiting nucleic acids within the cell. It can be caused by inducing cross-linking with the target nucleic acid. Also, Target nucleic acid or other chemical modification induced by a specifically induced inhibitory nucleic acid It may be.   Cleavage, and hence inactivation, of the target nucleic acid is accomplished by activating and cleaving the inhibitory nucleic acid. Can be achieved by adding substituents that can induce a cleavage reaction . The substituent may affect either chemical or enzymatic cleavage. No. Alternatively, cleavage is induced by the use of ribozymes or catalytic RNA. You. In this approach, the inhibitory nucleic acid is a naturally occurring RNA (ribozyme). ) Or synthetic nucleic acids having catalytic activity.   By binding to targeting moieties that bind to receptors on the surface of these cells The targeting of inhibitory nucleic acids to specific cells of the immune system It can be used for any form of acid therapy. The present invention provides the above-mentioned, Includes all forms of inhibitory nucleic acid therapy as described by Helene and Toulmeto I do.   Examples of anti-herpesvirus inhibitory nucleic acids include ISIS with activity against CMV 2922 (ISIS Pharmaceuticals) (see Biotechnology News 14: 5).   A problem associated with inhibitory nucleic acid therapy is the effect of inhibitory nucleic acids on in vivo target cells. Delivery followed by uptake of the inhibitory nucleic acid by the cells. This is Binds harmful nucleic acids to target moieties and binds to specific receptors on the surface of target infected cells This can be achieved by forming a complex, which is incorporated after binding.   B.Antiviral agent   Combination of antivirals and continuous treatment is useful for the treatment of herpesvirus infections. It is also considered useful for the treatment of herpes virus-induced KS. An example For example, Snoeck et al. (1992) Eur.J.Clin.Micro.Infect.Dis.11,1144-1155 (E.g., zidovudine [3'-azido-3'-deoxythymidine) AZT] and HPMPC, ganciclovir, foscarnet or ansai Combination with Clover or HPPMPC with other antiviral agents ) And found additional or synergistic effects on CMV. Sight Megalo as well In the treatment of viral retinitis, induction with ganciclovir, Subsequent maintenance at the Focusnet maximizes efficiency, while maintaining individual processing. It has been shown as a way to minimize harmful side effects. Acyclovir and the analogy For example, 2-acetylpyridine-5-((2-pyridylamino) thiocarbonyl)- Anti-herpetic compositions comprising thiocarbonohydrazones are disclosed in US Pat. No. 5,175,16 5 (transferred to Burroughs Welcom Co.). T in antiherpetic drugs For combined use of S-inhibitors and viral TK-inhibitors, see Stiching.  No. 5,137,724 assigned to Rega VZW. H Synergistic inhibitory effect on EBV proliferation using specific combination ratio of PMPC and AZT Reported by Lin et al. (1991) Antimicrob Agents Chemother 35: 2440-3. Have been.   U.S. Patent Nos. 5,164,395 and 5,021,437 (Blumenkopf; Burroughs Wellcome) is developing acetylpyridine derivatives for use with acyclovir. Ribonucleotide reductase inhibitors for the treatment of herpes infections, including the use thereof It describes the use of bitter (acetylpyridine derivative). US Patent No. 5 137, 724 (Balzari et al. (1990) Mol. Pharm. 37, 402-7) Thymidylate synthase inhibitor used in combination with a compound having gin kinase inhibitory activity Bitter (e.g., 5-fluoro-uracil and 5-fluoro-2'-deoxy (Uridine).   Herpesvirus-related with the discovery of a newly identified etiologic agent for KS An effective therapeutic or prophylactic protocol to alleviate or prevent the symptoms of KS Has been established. Due to the viral properties of the disease, antiviral agents are referred to herein as Interferon, nucleic acid analogs, rivapirin, amantadine, and phosphonoacetic acid Pyrophosphate Analogue of Phoscarnet (Gorbach et al., 1992, Infectious Disea) se Ch. 35, 289, W.B.Saunders, Philadelphia, Pennsylvania). Have a business. Immunotherapy may also be triggered by the disease drugs described herein. May be effective in many cases to manage and alleviate symptoms that have occurred. Antivirus As an agent, it has no direct effect on virus growth or virus titer. Drugs that bind directly to viral products and inhibit disease progression, Comprises the composition. Does not directly affect viral titer as an antiviral agent It does not include immunomodulators that do not bind to the virus product. Antiviral drugs Inactivates the virus or otherwise inhibits its infectivity and growth Or if it alleviates the symptoms of KS.   Anti-herpes wis thought to be useful for treating virus-induced KS Luthic agents fall into a broad class based on their putative mode of action . These classes are based on (1) inhibition of viral DNA polymerase, (2) By targeting other viral enzymes and proteins, (3) By a miscellaneous or incompletely understood mechanism, or (4) a target nucleic acid Act (ie, the inhibitory nucleic acid therapy) to provide a synergistic effect. Or agents that achieve additional effects or other benefits.   It is convenient to classify antivirals by their confirmed mechanism of action However, Applicants believe that any particular mechanism of antiviral action is bound Not intended. In addition, those skilled in the art will recognize that the drug is May act on more than one target in a cell or via more than one mechanism You will understand that.     i)Inhibitors of DNA polymerase     Many anti-herpes virus agents for clinical use or development today are viral Via the inhibition of DNA replication, especially via the inhibition of the viral ONA polymerase It is a nucleic acid analog that is believed to work. These nucleic acid analogs are As an alternative substrate for DNA polymerase or as a DNA polymerase Acts as a competitive inhibitor of zeosubstrate. Usually these drugs are one if If present, it is preferentially phosphorylated by viral thymidine kinase (TK). And / or more viral DNA than to cellular DNA polymerase Perimerase has a higher affinity for it, resulting in selective antiviral activity Will occur. Nucleotide analogs are incorporated into the viral DNA Thus, viral activity or reproduction can be affected in various ways. For example, the analog Acts as a chain terminator and is unstable (eg, susceptible to cleavage) And / or as a template for transcription or replication of the displaced DNA Restore their ability to act (see, eg, Balzarini et al., Supra).   Many drugs and many reagents useful in the treatment of herpes virus infections Modified by metabolic enzymes in the primary cell, or virus-infected host cells (ie, Such "activation" will be known to those skilled in the art. For example, acyclo Billing is done by herpes virus thymidine kinase (if present) In the first phosphorylation, it is triphosphorylated to its active form. Another example is three-step Conversion of compound HOE602 to ganciclovir reported in the metabolic pathway (Winkler et al. , 1990, Antiviral Research 14, 61-74), and ganciclovir, such as CM Phosphorylation to its active form by V nucleotide kinase. Will That the specific metabolic capacity of virus affects its virus susceptibility to specific drugs Can be a factor in the selection of antiviral agents. Will be obvious. For information on the function and function of certain anti-herpes virus agents, see De Cle req (1993, Antimicrobial Chemotherapy 32, Suppl. A, 121-132), and And other references cited below.   Anti-herpesvirus drug therapy suitable for treating virus-induced KS Include, but are not limited to, acyclic phosphonic acid nucleoside analogs (eg, For example, phosphonyl-methoxyalkylpurines and -pyrimidines) and cyclic Nucleoside analogs, including nucleoside analogs. These include Vidarabine (9-β-arabinofuranosyladenine; adenine arabino, ara -A, Vira-A, Park-Davis; 1-β-D-arabinofura Nosyluracil (ara-U); 1-β-D-arabinofuranose-cytosine ( ara-C); HPMPC [(S) -1- [3-hydroxy-2- (phosphonylmec) Toxi) propyl] cytosine (eg, GS504, Gilead Science)] and its (S) -HPMPPDAP [(S) -9- (3-hydr) Roxy-2-phosphonylmethoxypropyl) -2,6-diaminopurine]; PM EDAP [9- (2-phosphonyl-methoxyethyl) -2,6-diaminopurine] HOE602 [2-amino-9- (1,3-bis (isopropoxy) -2-p]; Loxymethyl) purine]; PMEA [9- (2-histonylmethoxyethyl) Adenine]; bromovinyl-deoxyuridine (Burns and Standford, 1990, J. Inf. ect.Dis.162: 634-7); 1-β-D-arabinofuranosyl-E-5- (2-bromo Vinyl) -uridine or -2'-deoxyuridine; BVaraU (1-β- D-arabinofuranosyl-E-5- (2-bromovinyl) -uracil, Blobaba Bristol Myers Squibb, Yamasa Shoyu); BVDU [(E) -5- (2-bro Movinyl) -2'-deoxyuridine, brivudine, e.g. (Where the sugar moiety is replaced by a cyclopentane ring); IV DU [(E) -5- (2-bromovinyl) -2'-deoxyuridine] and its Carbocyclic analogs, C-IVDU (Balzarini et al., Supra); and 2'-deoxy 5-mercutthio analogs of lysine (Holliday and Williams, 1992, Antimicrob. ents Chemother. 36, 1935); ancyclobar [9-([2-hydroxyethoxy] me Chill) guanine; for example, Zovirax (Burroughs Wellcome)]; pen Cyclobar (9- [4-hydroxy-2- (hydroxymethyl) butyl] -guany Ganciclovir [(9- [1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl] -Guanine) e.g., Cymevene, Syntex, DHPG (Stals Et al., 1993, Antimicrobial Agents Chemother. 37, 218-223; Propyl ether derivatives (eg, Winkelmann et al., 1988, Drug Res. 38, 1545-1548) ); Cigarova; famciclovir [2-amino-9- (4-acetoxy-3- (Acetoxymethinole) but-1-yl) purine (Smithkline Beecham)]; Clover (Burroughs Wellcome); descyclobar [(2-amino-9- (2-eth Xymethyl) purine)] and 2-amino-9- (2-hydroxyethoxymethyl L) 9H-purine, a precursor of acyclovir]; CDG (carbocyclic 2'-deoxy Guanosine); and having a pentafuranosyl ring substituted with a cyclobutane ring Purine nucleosides (e.g., cyclobut A [(+-)-9- [1β, 2α, 3 β) -2,3-bis (hydroxymethyl) -1-cyclobutyl] adenine] Lobut-G [(+-)-9- [1β, 2α, 3β) -2,3-bis (hydroxymethyl Ru) -1-cyclobutyl] guanine], BHCG [(R)-(1α, 2β, 1α) -9- (2,3-bis (hydroxymethyl) cyclobutyl] guanine], and la Active isomer of semi-BHCG, sequence 34,514 [1R-1α, 2β, 3α)- 2-A Mino-9- [2,3-bis (hydroxymethyl) cyclobutyl] -6H-purine- 6-one] (Braitman et al., 1991, Antimicrob. Agents and Chemotherapy 35, 1464-1. 468)) and other nucleoside analogs. These anti-herpes For some ills, see Gorach et al., 1992, Infectious Disease Ch. 35,289. , W.B.Saunders, Philadelphia; Saunders et al., 1990, J.Acqulr.Immune Defic.Syndr. 3,571; Yamanaka et al., 1991, Mol. Pharmacol. 40, 446; and Greenspan et al., 1990, J. Acqu. ir.Immune Defic. Syndr. 3,571.   Triciribine and triciribine-phosphate are (Iekes et al., 1994, Antiviral Research 23, Scventh International Conf.on Antiviral Research, Abstract No.122, Supp.1.), HI V-1 and HIV-2 (Kucera et al., 1993, AIDS Res. Human Retroviruses 9,307-3 14) and nucleic acid analogs that can be used to treat KS. These drugs For example, once a week, about 0.35 mg / m 2Two(0 . 7 mg / kg), or intravenous injection every other week for at least 2 doses Preferably, more than four times every eight weeks.   Acyclovir and ganciclovir are one of those uses that are acceptable in a clinical setting. It is noted. Acyclovir, an acyclic analog of guanine, is a herpes Phosphorylated by subviral thymidine kinase and then further phosphorylated Chain termination by viral DNA polymerase during virus replication Incorporated as a It is a widespread herpes virus, herpes simplex type 1 and And type 2, herpes zoster, cytomegacovirus and Epstein-Barr virus Herpes encephalitis, neonatal herpes virus Infection, chickenpox in immunocompromised hosts, herpes zoster relapse, CMV retinitis, E Diseases such as BV infection, chronic fatigue syndrome, and vitiligo of AIDS patients Used for treatment. To illustrate intravenous or oral doses, 8 hours in 7 days 250 mg / kg / m of mushroomTwo2 times daily to control body surface area or recurrence Continuous administration of 200-400 mg intravenous injection or oral administration. Gangsik Rovir is more active against certain herpesviruses than acyclovir Has been shown. For example, Oren and Soble, 1991, Clinlcal Infectious Disease s 14, See 741-6. The treatment protocol for ganciclovir is 5 mg / kg daily 2 Intravenous injections, or 2.5 mg / kg three times daily for 10-14 days. Continuous throw The dosage is 5-6 mg / kg for 5-7 days.   Also note is HPMPC. HPPMC is used in various HSV-1 animal models. And prevention of HSV-2, TK-HSV, VZV or CMV infection Reported to be more active than either acyclovir or ganciclovir in (De Clereq, supra).   Nucleoside analogs such as BVaraU have been used in animal models of encephalitis. Potent HSV-1, EBV and VZV with higher activity than Clovir Is an inhibitor. FIAC (Fluroid arabinosylcytosine) and its related Fluoroethyl and iodine compounds (eg, FEAU, FIAU) It has potent and selective activity against virus and also has HPPMA ((S) -1- ([3-hydroxy-2-phosphorylmethoxy] propyl) adenine) More potent against HSV and CMV than iclover or ganciclovir It was shown that KS progressed, and it was outstanding. Cladribine (2-chlorodeoxyadenosine) is a highly specific anti-lymphocyte agent (ie, Another nucleoside analogue known as an immunosuppressant).   Other useful antiviral agents include 5-thien-2-yl-2'-deoxy. Lysine derivatives, for example, BTDU [5-5 (5-bromothien-2-yl) -2 '-Deoxyuridine] and CTDU [b- (5-chlorothien-2-yl)- 2'-deoxyuridine]; and OXT-A [9- (2-deoxy-2-hydro Xymethyl-β-D-erythro-oxetanosyl) adenine] and OXT-G [ 9- (2-deoxy-2-hydroxymethyl) -β-D-erythro-oxetano Syl) guanine]. OXT-G inhibits viral DNA synthesis Is believed to work by its own mechanism, but its mechanism of action has not yet been elucidated. No. These and other compounds are described in Andrei et al., 1992, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 143-51. Useful for treating herpesvirus infections Still further antiviral purine derivatives are described in US Pat. No. 5,108,994 (Be echam Group P.L.C.). 6-methoxypurine ala Vinoside (ara-M; Burroughs Wellcome) is the efficacy of herpes zoster virus It is a certain inhibitor and is thought to be useful in treating KS.   Certain major thymidine analogs [e.g., iodoxyuridine (5-iodo-2'-de) Oxyuridine) and trifluorothymidine] have antiviral activity However, due to its systemic toxicity, most are associated with stroma keratitis and It has been used for local herpesvirus infections, including metritis, and other options have been This is not a good thing here unless the solution is banned.   Other useful antiviral agents that have demonstrated antiherpesvirus activity include phos Canet sodium (trisodium phosphonoformate, PFA, foscarvir (Astra )) And phosphonoacetic acid (PAA). Hoskanet is a DNA polymer Act by competitively blocking the phosphate binding site of Loric acid analog. These substances are processed by viral thymidine kinase. Blocks DNA polymerase directly without any sessing. Hoskane The kit is reported to be less toxic than PAA.     ii)Other antivirals     Applicants do not intend to be bound by any particular antiviral mechanism of action, Confident that the antiviral agent acts through inhibition of viral DNA polymerase are doing. However, viral replication involves more than viral nucleic acid replication. Also, the production of viral proteins and other essential components is required. Therefore, the present invention Virus multiplication by targeting viral proteins other than DNA polymerase (Eg, inhibition of their synthesis or activation, or post-synthesis Attempts to treat KS (by disruption of viral proteins). For example, Viral serine protease (important for viral capsid development) Administration of an agent that inhibits KS may be useful in treating virus-induced KS.   Other viral enzyme targets that may be targeted include OMP decarboxylase inhibitors. (Eg, parazofurin target), CTP synthetase inhibitor (eg, For example, the target of cyclopentenyl cytosine), IMP dehydrogenase, ribonuclease Otide reductase (eg, as described in US Pat. No. 5,110,799 (Tolman et al., Merck) Target for carboxyl-containing N-alkyl dipeptides), thymidine quina (E.g., U.S. Patent Nos. 4,863,927 and 4,782,062 (Tolman et al., Merck)). 1- [2- (hydroxymethyl) cycloalkylmethyl] -5- as described Substituted -uracil and -guanine targets), and other enzymes. this Other identified viruses that may serve as targets for antiviral agents It is known to those of ordinary skill in the art that some proteins and viral proteins have not yet been discovered. Will be obvious.   Kutapressin is a 25 mg / ml injectable form of Washin Liver derivative available from Sehwarz Parma, Milwaukee, Ton. Hell The recommended dosage for the pesvirus is 150 lbs / day for an average adult 200 to 25 mg / ml.   Ampliken (from HEM Pharmaceuticals, Rockville, MD) Ampligcn), an acceptable antiviral agent, poly (I) poly (C12U) It is known to inhibit lupes virus and is suitable for treating KS. Another antiviral agent. Intravenous injection is a preferred route of administration. Average 150 About 100-600mg / m for Bond adultTwoDose of 2-3 per week Administered once. At least 200 mg / m per weekTwoBest to administer .   Active against herpes viruses (eg, herpes zoster and herpes simplex) Has been reported to be useful in the treatment of herpes virus-induced KS. As antiviral agents, mappicine keton (Smith Kline Be echam); compounds A, 79296 and A, 73209 (Abbott) against herpes zoster; and compounds 882C87 (Burroughs Wellcome) (May 17, 1993, Th e Pink Sheet 55 (20)).   Interferons are known to inhibit the replication of herpesviruses You. Oren and Soble see above. Interferon has known toxicity problems Second generation, retaining the antiviral properties of interferon and reducing side effects It is expected that interferon will be available shortly.   In addition, administration of a herpes virus reactivating agent induces reactivation of latent virus. May be able to treat herpesvirus-induced KS. It is. The reactivation may be used in combination with simultaneous or sequential administration of the anti-herpes virus agent. Preferably. Controlled reactivation over a short period of time, or antiviral agent Reactivation in the presence of DNA minimizes the adverse effects of certain herpesvirus infections (Eg, as described in PCT application WO 93/04683). Especially). Reactivating agents include estrogen, phorbol ester, and fors Choline and β-adrenergic inhibitors.   Useful for the treatment of herpes virus infections and the treatment of herpes virus-induced KS Useful agents are described in numerous US patents. For example, ganciclovir is used in rice Antiviral guanines of the type described in U.S. Patent Nos. 4,355,032 and 4,603,219 Examples of acyclic nucleotides.   Acyclovir, including 9- (2-hydroxyethylmethyl) adenine , U.S. Patent Nos. 4,287,188 and 4,199,574 It is an example of a body.   Brivudine is an antiviral deoxy of the type described in U.S. Pat.No. 4,424,211. It is an example of a cyuridine derivative.   Vidarabine is an antiviral purine of the type described in British Patent 1,159,290. It is an example of a nucleoside.   Blobber is of the type described in U.S. Pat.Nos. 4,542,210 and 4,386,076. Is an example of an antiviral deoxyuridine derivative.   BHCG is disclosed in U.S. Patent Nos. 5,153,352, 5,034,394 and 5,126,345. FIG. 6 is an example of an antiviral carbocyclic nucleoside analog of the type described.   HPPMC is an antiviral phospholipid of the type described in US Pat. No. 5,142,051. It is an example of a nylmethoxyalkyl derivative.   CDG (carbocyclic 2'-deoxyguanosine) is described in U.S. Patent No. 4,543,255; No. 4,855,466 and 4,894,458 antiviral carbocyclic nuclei of the type described. It is an example of a reoside analog.   Hoskanet is described in U.S. Pat. No. 4,339,445.   Trifluridine and its related ribonucleosides are disclosed in U.S. Pat.No. 3,201,387 It is described in.   U.S. Pat.No. 5,321,030 (Kaddurah-Daouk et al., Amira) is an anti-herpes virus agent Describes the use of creatine analogs as US Patent 5,306,722 No. (Kim et al., Bristol-Meyers Squibb) has been reported to treat HSV infection and Thymidine kinase inhibitors useful for inhibiting rupes thymidine kinase Is described. Other anti-herpes virus compositions are described in U.S. Pat. No. 9, No. 5, 098, 708 (Konishi et al., Bristol-Meyers Squibb) and No. 5,175,165 (Blumenkopf et al., Burroughs Wellcome). U.S. Pat.No. 4,880,820 (Ashton et al., Merk) proposed an anti-herpesvirus agent (S) -9- (2,3-dihydroxy). (1--1-propoxymethyl) guanine.   U.S. Pat. No. 4,708,935 (Suhadolnik et al., Research Corporation) discloses HSV and '-Deoxyadenosine compound effective for inhibiting EBV and EBV are doing. U.S. Pat.No. 4,386,076 (Machida et al., Yamasa Shoyu, Inc.) (E) -5- (2-Halogenovinyl) -arabinofura as Lupes virus agent Describes the use of nosyluracil. U.S. Pat.No. 4,340,599 (Lieb et al., B ayer Aktiengesellschaft) is a phosphonohydroxy vinegar useful as an antiherpes agent. acid Derivatives are described. U.S. Pat.Nos. 4,093,715 and 4,093,716 (Lin (Rescarch Corporation) are effective inhibitors of herpes simplex virus. To give 5'-amino-5'-deoxythymidine and 5-iodo-5'-amino- 2 ', 5'-dideoxycytidine is described. US Patent 4,069,382 No. (Baker et al., Parke, Davis & Company) describes 9- (5- O-acyl-beta-D-arabinofuranosyl) adenine compounds are described. ing. U.S. Pat. No. 3,927,216 (Witkowski et al.) Discloses a herpesvirus infection. 1,2,4-triazole-3-carboxamide and 1,2 for treating Describes the use of 2,4-triazole-3-thiocarboxamide. U.S. Pat. No. 5,179,093 (Afonso et al., Schering) teaches herpes simplex virus type 1 and And quinovirus against Cytomegalovirus and Epsinbar virus It describes a phosphorus-2,4-dione derivative activator.     iii)Administration method     The subject treated or tissue that can be used herein is a mammal, And, for example, humans, horses, pigs, rabbits, dogs, monkeys or rodents. Kind. In a preferred embodiment, the subject is a human.   The compositions are administered in a manner compatible with the dosage formulation, and in a pharmaceutically effective amount. Throw Precise amounts of active ingredient required to be administered depend on the judgment of the practitioner and may vary from patient to patient. It is.   Also, the appropriate therapeutic program for the initial and boost doses may vary. , Followed by an initial administration, followed by sequential injections or other administration methods at intervals of one hour or more. Repeated administration is typical.   As used herein, the administration method refers to a method of administering to a patient. Such person Methods are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, topical, parenteral, oral, Intravenous, intramuscular, subcutaneous, or aerosol administration. Administration of the drug Indicates that the drug in a patient is a patient with Kaposi's sarcoma Persistent or intermittent as effective in treating patients infected with Positive Sarcoma Can be done   An antiviral composition for treating herpes virus-induced KS is preferably Is administered to human patients via oral, intravenous or parenteral administration and other systemic dosage forms. Given. One skilled in the art will recognize the appropriate dosage protocol for the particular composition used by the physician. Will understand the rules.   The pharmaceutical formulation or composition of the present invention may be solid, semi-solid, or, for example, a suspension, It may be a liquid dosage form such as an aerosol. Preferably, the composition is The precise dosage is administered in a unit dosage form suitable for single administration. The composition also To formulate a pharmaceutical composition for animal or human administration, according to the desired formulation A pharmaceutically acceptable non-toxic carrier defined as commonly used excipients or Also contains diluent. The diluent should not affect the biological activity of the composition Selected. Examples of such diluents include distilled water, saline, Ringer's solution, Kisstran solution, and Hanks' solution. Further, the pharmaceutical composition or The pharmaceutical formulation may also contain other carriers, adjuvants; or non-toxic, non-therapeutic, non- Includes epidemiological stabilizers. An effective amount of such a diluent or carrier is determined by dissolving the ingredients. An effective amount to obtain a pharmaceutically acceptable formulation in terms of gender or biological activity That is. V.Immunological approach to treatment   As a new human herpes virus, the major etiological agent of KS in humans Can regulate immunological dysfunction resulting from the presence of virus-infected tissue Immunosuppressive therapy is provided. In particular, prevent immunological attack on the virus-infected cells Drugs that improve KS symptoms and / or reduce disease progression Can be Such therapies interfere with immune system targeting of virus-infected cells Antibodies. Such drugs include cytokines (immunizations that respond to viral infection). (Upregulates the epidemic system).   The antibody may be administered to the patient alone, or two or more antibodies, other therapeutic agents And compositions and the like (including, for example, immunosuppressants, enhancers, , But are not limited to). Special attention What is needed is an immunosuppressive agent that is useful for suppressing an allergic reaction in a host. Interest Deep Prednisone, prednisolone, decadron (DECADRON) (Merck, Sharp & Dohme, West Point, PA), cyclophosphamide, cyclosporin For 6-mercaptobrin, methotrexate, azathioprine and intravenous injection Gamma globulin or a combination thereof. Notable enhancers include Nensin, ammonium chloride and chloroquinine. These drugs Physician Desk Reference, 41st edition, (1987), published by Edward R, Barnha rt, a generally accepted dosage as disclosed in New Jersey Administer in the range.   Human-derived immunological groups previously infected with human herpes virus or related viruses Roblin can be obtained using standard techniques. The appropriate titer of antibodies is And is readily adapted for the treatment of KS. Immunoglobulin It can be administered by enteral injection or an intradural shunt. Briefly And immunoglobulin preparations are available for antibodies against KS-related human herpes virus. Can be obtained from individual donors screened by Of the plasma may be pooled. Alternatively, the plasma from the donor is pooled and then The high titer pool was tested for antibodies to Select for use with S patients.   Antibodies can be formulated in injectable formulations. Parenteral prescriptions are known Suitable for use in the present invention, intramuscular or intravenous administration is preferred. Treatment Formulations containing a therapeutically effective amount of antibody or immunotoxin may be used in sterile solutions, suspensions, Or lyophilized form, optionally containing stabilizers or excipients. Can be. The lyophilized composition provides about 0.01 mg / kg to 10 m of host body weight. g / kg at a suitable level, with a suitable diluent such as water for injection, saline, 0.3% It is reconstructed using glycine and the like. Typically, the antibody or immunotoxin A pharmaceutical composition comprising from about 0.01 mg / kg to about 5 mg / kg of the mammal to be treated. Will be administered at a therapeutically effective dose in the range Antibody or immunoto A therapeutically preferred effective amount of a pharmaceutical composition comprising a toxin will depend on the mammal to be treated. Range from about 0.01 mg / kg body weight to about 0.5 mg / kg body weight, Person 1 hour or more each day according to a treatment program that gradually increases the dose of It will be administered by intravenous infusion over several days to two weeks.   Antibodies can be administered systemically by intramuscular, subcutaneous or intraperitoneal injection. Alternatively, it may be injected directly into the KS lesion. The dose depends on the antibody used or The nature of the immunotoxin (eg, its activity and biological half-life), the antibody concentration in the formulation Degree, site and rate of administration, clinical tolerance of the patient involved, patient suffering These are within the skill of the physician, depending on the disease and the like.   The antibodies of the present invention can be administered as a solution. The pH of the solution is between pH 5 and 9.5. PH, preferably between pH 6.5 and 7.5. The antibody or Its derivatives include phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl and Or a solution with a suitable pharmaceutically acceptable buffer such as citrate or the like. Should be. The concentration of the buffer should be in the range 1-100 mM. Also The antibody solution is prepared by adding a salt such as sodium chloride or potassium chloride to M concentration. Also, albumin, globulin, gelatin, protami Or an effective amount of a stabilizer such as a protamine salt, which may be an antibody or a protamine salt. Or a solution containing immunotoxin or a composition for preparing the solution. You may.   Intravenous infusion may be acceptable for systemic administration of antibodies, but is generally daily intramuscular injection. Done by Also, administration may be by intranasal or other parenteral routes. It may be. Antibodies or immunotoxins are also found in certain tissues in blood. Via microspheres, liposomes or other particulate delivery systems May be administered.   In therapeutic applications, the dosage of the compound used in accordance with the present invention may vary depending on the compound And the condition to be treated. Recipient age, weight, and clinical Symptoms and the experience and judgment of the clinician or practitioner who administers the treatment Included in factors affecting dosage choice. For example, the dosage of immunoglobulin About 0.1 mg / kg body weight per day for polyclonal antibodies per day About 10 mg / kg body weight, about 5% of that amount for monoclonal antibodies. In the range of ~ 20%. In such a case, the immunoglobulin is administered intravenously. When And may be administered once daily. Preferably, until a therapeutic result is achieved or Dosing is repeated daily until action is warranted to discontinue treatment. one Generally, the dose will not affect the symptoms of KS without causing unacceptable toxicity to the patient. It should be sufficient to treat or ameliorate the condition or sign.   An effective amount of the compound is a subjective alleviation of the symptoms, or a clinician or other qualified person. Is an amount that provides any of the objectively determined improvements noticed by the observer . This dosage range will depend on the compound used, the route of administration and the potency of the particular compound. It can vary accordingly. VI.Vaccines and prevention for KS   The present invention relates to substances suitable for use as vaccines for the prevention of KS and their Methods of administration are provided. The vaccine is directed against KSHV, Also preferably, it comprises an antigen obtained from KSHV. In one embodiment, The vaccine contains attenuated KSHV. In another embodiment, the vaccine is Contains killed KSHV. In another embodiment, the vaccine is a KSHV vaccine. Contains a nucleic acid vector encoding a repeptide. In another embodiment, the The vaccine is a subunit vaccine containing a KSHV polypeptide.   The present invention also provides a gene encoding a KSHV polypeptide deleted from the genome. KSHV virus is provided. The recombinant virus is capable of transmitting KSHV infection. Useful as an attenuated vaccine for prevention.   The present invention is a method of vaccinating a patient for Kaposi's sarcoma, comprising the steps of: An effective amount of a peptide or polypeptide encoded by the DNA molecule; Specially acceptable carriers are administered to the patient, thereby vaccinating the patient. Provide a method of signing. In one embodiment, the naked DNA is associated with Kaposi's sarcoma. Administered to the patient in a vaccinationally effective amount.   The present invention immunizes patients against a disease caused by KSHV A method comprising: providing an effective immunizing amount of an isolated herpesvirus subunit vaccine. , Administering to a patient.   A.vaccine   Vaccines are produced as synthetic antigens as described above or recombinantly It can be prepared using the polypeptide obtained. Typically, vaccines are about Contains 1-50 micrograms of antigen. More preferably, the amount of polypeptide is About 15 to about 45 micrograms. Typically, the vaccine will have a dosage of about Formulated to contain 0.5 milliliter. The vaccine is available in the art. And may be administered by any known route. Preferably, the route is parenteral It is. More preferably, it is subcutaneous or intramuscular administration.   Many related to vaccine technology to enhance the effectiveness of antigens Strategies exist. For example, cyclization or circularization of a peptide is dependent on the antigenic potential of the peptide. Strength and immunogenic capacity can be increased. See U.S. Patent No. 5,001,049 I want to be illuminated. More generally, the antigen is linked to a suitable carrier, usually a protein molecule. Can be made. This method has several aspects. Thereby, pepti Multiple copies of an antigen, such as a ligand, can be conjugated to a single, larger carrier molecule. it can. Further, the carrier has the ability to promote transport, binding, absorption or translocation of the antigen. Can have quality.   Examples of suitable carriers for parenteral administration, such as subcutaneous injection, include tetanus ibis Soid, diphtheria toxoid, serum albumin, and lamprey, or Limpet, hemocyanin. Because they are This is because it gives only the minimum transmission limit. Complexes containing these universal carriers Activating T cell clones in individuals with very different gene sets Can act as a motor.   The conjugation between the peptide and the carrier may be made using one of the methods known in the art. Can be achieved. Illustratively, this binding may be achieved, for example, by Means and Feeney, A recent review of white matter modification technology ", detailed by Bioconjugate Chem. 1, 2-12 (1990). As described above, a bifunctional crosslinking agent can be used as a binder.   Vaccines against a number of herpes viruses have been successfully developed. Alive Vaccine against varicella-zoster virus using an attenuated strain of Oka Of varicella-zoster in children and immunocompromised and normal children Is effective in preventing chicken pox in both (Hardy, I. et al., 1990, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 4, 159; Hardy, I. et al., 1991, New Engl. J. Med. 325, 1545; Levin, M. J. 19 92, J. Inf. Dis. 166, 253; Gershon, A.A., 1992, J. Inf. Des. 166 (supplemented), 563). Also, Herpes simplex types 1 and 2 have been successfully marketed with some protection against major diseases. It is marketed, but in preventing the establishment of latent infections in sensory ganglia Not very successful (Roizman, B., 1991, Rev. Inf.Disease 13 (Supplement 11), S892; Ski nner, G.R. et al., 1992, Med. Microbiol. Immunol. 180, 305).   A vaccine against KSHV can be made from the KSHV envelope glycoprotein. these Can be purified and used for vaccination (Lasky, L.A., 1990, J. .Med.Virol.31,59). MHC-binding from cells infected with human herpes virus The peptide was purified by the method of Marloes et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21, 2963-2970. It can be identified as a candidate for Kuching.   KSHV antigen is combined with various solutions and other compounds known in the art. They may be combined or mixed. For example, including various adjuvants or immunodiluents. Administer it in the form of water, saline, or buffered vehicles with or without May be. Examples of such adjuvants or drugs include aluminum hydroxide , Aluminum phosphate, aluminum potassium sulfate (alum), beryllium sulfate , Silica, kaolin, carbon, water-in-oil nimulsion, oil-in-water emulsion, murami Rudipeptide, bacterial endotoxin, lipid X, corynebacterium pal Bum (Corynebacterium parvum) (Propionibacterium acnes (Propionib acterium acncs)), Bordetella pertussis, poly Ribonucleotides, sodium alginate, lanolin, lysolecithin, vitamins A, saponin, liposome, levamisole, DEAE-dextran, block Copolymers or other synthetic adjuvants are included. Such adjuvants are: Various sources, such as Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.) or Freund's incomplete and complete adjuvant (Difco Labo ratories, Detroit, Michlgan). Other suitable adjuvants Means Amphigen (oil-in-water), Alhydrogel (hydroxylated) Aluminum), or a mixture of amphigen and alhydrogel. A Only Luminium is approved for human use.   The proportions of antigen and adjuvant may vary over a wide range as long as both are present in effective amounts. May vary over the circumference. For example, aluminum hydroxide is about 0.5% (AlTwoOThree(Base) amount. On a per dose basis, The amount of the original may range from about 0.1 μg to about 100 μg of protein per patient. A preferred range is from about 1 μg to about 50 μg per dose. More preferred range The box is about 15 μg to about 45 μg. A suitable dose is about 0.5 ml. Thus, the dosage for intramuscular injection may be, for example, 0.5% aluminum hydroxide. 0.5 ml containing 45 μg of antigen in the mixture. After prescribing, The vaccine is placed in a sterile container, then sealed and stored at low temperature (eg, 4 ° C.) Or lyophilized. Lyophilization allows long-term storage in stabilized form Will be possible.   Administration of vaccines, including oral or parenteral (eg, subcutaneous or intramuscular) injection The vaccine may be administered by any conventional method. Intramuscular administration is preferred . Treatment consists of a single dose of the vaccine or multiple doses over a period of time. It is. The dose is preferably given to a human patient within the first eight months of its useful life. Good. The antigen of the invention may be an influenza antigen such as an influenza A antigen Can be used in combination with an appropriate dose of the compound containing. The antigen is administered orally. It can also be a component of a recombinant soctin that can be adapted for use.   The vaccine of the present invention may be combined with a vaccine for another disease to obtain a multivalent vaccine. May be produced. A pharmaceutically effective amount of the antigen is pharmaceutically acceptable, such as a protein. Carrier or diluents useful for vaccination of mammals, especially humans. Can be. Other vaccines may be prepared according to methods well known to those skilled in the art.   To provide effective immunoprotection, only exposing the mammal to the appropriate epitope Those skilled in the art can easily recognize the good points. The epitope is typically These are segments of amino acids that are a small part of white matter. When using genetic recombination Altering the primary structure of a natural protein to be identical or identical to a naturally occurring epitope Produces derivatives containing substantially similar (immunologically equivalent) epitopes Usually it is. Such derivatives include peptide fragments, amino acid substitutions, Of amino acid sequences of viral polypeptides from Mi It may include no acid addition. For example, certain amino acid residues can affect the biological activity of a protein. Amino acids of similar size and polarity without unduly affecting It is well known in the art of protein technology. The human herpes Rus polypeptides have an important tertiary structure and the epitope is usually Have Thus, the modification is generally in a conformation that results in a protective immune response. Should be kept.   B.Antibody prophylaxis   Therapeutic intravenous polyclonal or monoclonal antibodies are available for perinatal varicella and Used as a form of passive immunotherapy of herpes virus diseases, including CMV and CMV I have been. Previously infected with the human herpes virus, and Human-derived immunoglobulins having high titers of antibodies can be used as antiviral agents (eg, cancer Cyclovir) or in combination with currently approved KS treatments Other forms of immunotherapy (i.e., copolymer-1, Anti-idiotype monoclonal antibody, treatment with T cell "vaccine") Can be given together. Antibodies to human herpes virus are described herein. It can be administered to a patient as described herein. The human herpes Antibodies specific for epitopes expressed on cells infected with Rus are preferred, This can be obtained as described above.   A polypeptide, analog or active fragment thereof is neutralized with a pharmaceutically acceptable salt. It can be formulated in therapeutic compositions as a form. As pharmaceutically acceptable salts, Acid addition salts (formed at the free amino groups of a polypeptide or antibody molecule) These are, for example, inorganic acids such as hydrochloric acid or phosphoric acid, or acetic acid, oxalic acid, It is formed of organic acids such as tartaric acid and mandelic acid. Also, free carboki Salts formed from sil groups include, for example, sodium, potassium, ammonium, Inorganic bases such as calcium or ferric hydroxide, and isopropylamine, Limethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc. It can be derived from an organic base such as   C.Monitor therapeutic efficacy   The present invention relates to (a) a first sample from a patient suffering from Kaposi's sarcoma; Determining the presence of the isolated nucleic acid molecule, and (b) administering a therapeutic amount of the agent to the patient. Contacting the agent with cells in the sample, and (c) after an appropriate time, treating the treated patient. Measuring the amount of the isolated nucleic acid molecule in a second sample from the subject, and then ( d) determining the amount of the isolated nucleic acid molecule measured in the first sample and the second sample; Comparing the amount measured in the pull (the difference is indicative of the effect of the drug), thereby Kaposi meat characterized by monitoring therapeutic efficacy in the treatment of Kaposi's sarcoma Methods for monitoring therapeutic efficacy in the treatment of tumors. As defined herein, " “Amount” is the amount or copy number of the virus. Determine the amount or copy number of the virus. The method of determining is known to those skilled in the art. VII.Screening assays for drugs that alleviate the symptoms of KS   Since a substance involved in the cause or progression of KS has been identified and described, Enables assays directed at identifying drugs that may inhibit biological activity is there. In the present invention, the agent has activity against the viruses described herein. A KS drug screening assay to determine whether to do so is considered. Such assays identify compounds to be evaluated for use in the treatment of KS. Together with cells expressing a human herpesvirus polypeptide or peptide. Cubbing and the results show that the activity of these agents Measuring the effect of the compound. The virus is In vitro assays, which are maintained in cells, are preferred, but in vivo Object models are also effective.   Compounds of interest for the substance of interest or peptides derived from such substance , In vitro and in vivo assay systems. I In vitro assays include nucleotide analogs, chain terminators, Enrichment, including antisense oligonucleotides and random polypeptides In the presence of compounds that target virus replication with varying degrees of Infecting sensitive T cell lines such as leukocytes or MT-4 with the pathogen of interest (Asada et al., 1989, J. Clin. Microbiol, 27, 2204; Kikuta et al., 1989, Lancet Oct. 7,861). Infected cultures or their supernatants were purified by quantitative PCR. By using dot blot assays or by using immunological methods. Assay for the total amount of virus, including the presence of the viral genome be able to. For example, cultures of susceptible cells can be treated with K in the presence of various concentrations of the drug. SHV was infected, fixed on slides a few days later, and Testing viral antigens by indirect immunofluorescence using monoclonal antibodies (Kikuta et al., Supra). Alternatively, chemically bonded MT-4 Infectivity of cell monolayers using indirect immunofluorescent antibody staining to examine lesion shrinkage (Higashi et al., 1989, J. Clin. Micro. 27, 22). 04).   Can be isolated from host cells instead of whole cells in an in vitro assay, Or purified KSHV enzyme produced by recombinant technology for enzyme activity Can be used as a goal for rational drug design to measure the effects of potent drugs it can. KSHV enzymes following this attempt include dehydrofolate reductase. (DHFR), thymidylate synthase (TS), thymidine kinase or DN A polymerase, but is not limited thereto. Enzyme activity The measurement indicates the effect on the substance itself.   Drug screening using herpes virus products is known and described in EP051. 4830 (herpes protease) and WO 94/04920 (UL13 genetics (Protocol) as previously described.   The present invention provides assays for screening anti-KS chemotherapeutic agents. infection The cells are treated with chemical agents that may be chemotherapeutic against KS (eg, acyclic-guano). Gin). Then several days later, in the cells Virus levels for antigen, immunofluorescence assay for antigen, viral genome DN Southern blotting for A or Northern blotting for mRNA It is determined by aging and compared to control cells. This assay is useful for KS. Many compounds that may be useful can be quickly screened.   In addition, the present invention relates to nucleic acid molecules or Is an assay used to identify drugs or other molecules that can bind to proteins Provide a system, thereby inhibiting or enhancing transcriptional activity. Such an assay is An agent that is specific for the activity of a particular cell, or the time or level of activity In the development of drugs that are thought to enhance such activity.   The present invention relates to (a) KSHV in a bacterial auxotroph (auxotrophic mutant) Expressing DHFR or KSHV TS, and (b) in the presence or absence of the agent Measure the growth rate of the bacteria and then (c) compare the rates thus measured. Inhibiting KSHV DHFR or KSHV TS in vivo KSHV-selective antiviral agent in vivo, characterized by the identification of Is provided.   Screening or screening for appropriate bacterial auxotrophs by methods well known to those skilled in the art. Production and bacterial growth measurements are possible.   The following review of antifolate compounds more fully describes the state of the art. In particular, it comprises dehydrofolate reductase and thymidylate syn Relates to inhibitors of the enzyme. (A) Unger, 1996, current treatment in medical oncology. Theory: A New Anticancer Agent, Journal of Cancer Research & Clinical Oncology 122 189-198, (b) Jackson, 1995, Toxicity estimation from metabolic pathway modeling, Toxicolog y 102,197-205, (c) Schultz, 1995, Pro, a newer antifolate in cancer treatment. gress in Drug Research 44,129-157, (d) van der Wilt and Peters, 1994, A new target for pyrimidine antimetabolites in the treatment of solid tumors 1: thymidyl Acid synthase, Pharm World Sci 16,167, (e) Fleisher, 1993, analogs of antifolates Body: mechanism of action, analytical methodology, and clinical efficacy, Therapeutic Drug Monitor ing 15,521-526, (f) Eggott et al., 1993, antifolates in rheumatoid arthritis: Hypothetical mechanism of action, Clinical & Experimental Rheumatology 11 Aug 8, S101-S105 , (G) Huennekens et al., 1992, membrane transport of folate compounds, Journal of Nutritional  Science & Vitaminology extra edition No. 52-57, (h) Fleming and Schilsky, 1992 , Antifolates: next generation, Seminars in Oncology 19,707-719, and (i) Bertino Et al., 1992, Enzymes in the thymidylate cycle as targets for chemotherapeutic agents: mechanisms of resistance , Mount Sinai Journal of Medicine 59, 391-395.   The present invention relates to (a) vMIP-I, vMIP-II or vMIP-III blood. The plasma concentration was measured and then (b) the measured value was compared to the clinical course of AIDS for the measured value. Determining the patient's state of health by comparison with a standard curve for AI Provided is a method for determining a health condition of a DS patient. VIII.HIV treatment   The present invention is a method of inhibiting HIV replication, wherein the patient is encoded by a nucleic acid molecule. Administering an effective amount of the polypeptide to the cells, or Treating to inhibit the replication of HIV. One aspect Wherein the polypeptide is selected from the list given in Table 1.   Hereinafter, the present invention will be described in more detail by experimental details. These are the It is intended to aid understanding and is intended to limit the invention as set forth in the following claims. It does not do.Experimental Details Section I           <Nucleotide sequence of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus>   If the genome of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV or HHV8) is Were mapped with cosmid and phage gene libraries. That nucleochi The sequence was determined excluding the 3 kb region on the right end of the genome, which was difficult to clone. The genome of BC-1 KSHV contains 140 G flanked 801 bp terminal repeats enriched in G + C. It consists of a specific coding region (LUR) with a length of .5 kb. Apparently occurred in parent tumor Genomic replication was present in strains derived from this cell culture. LUR , At least 81 open reading frames (ORFs), including And 66 internal repeats similar to the PES virus simyli ORFs) Area exists. The virus only encodes structural and metabolic proteins of the virus Instead, proteins that bind complementarily, three cytokines (two macrophage Symptomatic protein and interleukin 6), dihydrofolate reductase, bcl-2, Interferon modulator, IL-8 receptor, NCAM-like adhesin, D-type cyclin And a similar gene. Analysis of terminal repeats of viral DNA from KS lesions Suggests that there was KSHV monoclonal growth in KS tumors Is done. The complete genomic sequence is available from Genebank under identification numbers U75698 (LUR), U7569. 9 (TR) and U75700 (ITR).   Kaposi's sarcoma is a mixed cell vascular tumor (Tappcro et al., 1993, J. Am  Acad. Dermatol. 28, 371-395). Histology and comparison in people without severe immunosuppression Benign course suggests that KS tumor cell growth is cytokine-induced (Ensoli et al., 1992, Immunol, Rev. 127, 147-155). For epidemiological research Therefore, tumors are under strict immunological control and are transmitted by non-HIV sex. It has been shown to be caused by infectious agents that stain (Peterman  et al., 1993, AIDS 7,605-611). KS-related herpesvirus (KSHV) Almost all AIDS-K detected in AIDS-KS lesions by symbolic difference analysis (RDA) It was found to be present in S lesions (Chang et al., 1994, Science 265, 1865-1869) . These findings have been substantiated, and most of the findings obtained by examining various epidemiological classes of KS Spread to all KS lesions (Boshoff et al., 1995, Lancet 345, 1043-10 44; Dupin et al., 1995, Lancet 345, 761-762; Moore and Chang, 1995, New Eng. J. Med. .332,1181-1185: Schalling et al., 1995, Nature Med. 1,707-708; Chang et al., 1 996, Arch Int. Med. 156, 202-204). KSHV is the eighth of the identified so far It is a putative human herpes virus (HHV8).   The virus has two herpesvirus DNA fragments, KS330am and KS631Ba. m (Chang et al., 1994, Science 265, 1865-1869). continue , A 21kb AIDS-KS gene library fragment that hybridizes with KS330Bam (KS5) By sequencing KSHV, Rhadinovirus Herpesvirus Simiri (HVS) -related gamma herpes virus belonging to the genus Genus (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558). this The co-linear similarity of the genes in the regions, or syntcny, is Everybody between Stein-Barr virus (EBV) and horse herpes virus 2 (EHV2) And is maintained between KSHV and HVS. A 12 kb region containing the KS631Bam sequence (L54 and SGL-1) contains the cyclin D gene specific for the Ladinovirus and the IL-8Ra gene. Contains genes.   KSHV does not easily propagate into uninfected cell lines (Moore et al., 1996, J. Virol. 70 , 549-558) but primary exudation of trace B cells, often associated with KS (coelomic origin) It is present in lymphomas (PEL) (Cesarman et al., 1995, New Eng. J. Med. 33 2,1186-1191). BC-1 is a PEL cell line that contains a large number of KSHV genome copies (Cesa rman et al., 1995, Blood 86, 2708-2714). KSHV gene in BC-1 and its parent tumor The nome form is obtained by using a 270 kb linear marker together with Barsfield gel electrophoresis (PEGE). ) Move together (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558). However , A protein membrane from an EBV-negative cell line (Renne et al., 1996, Nature Med. 2, 342-346) The genome size based on the DNA genome wrapped in is estimated to be 165 kb (Moore et al.  al., 1996, J. Virol. 70, 549-558). Estimates from KS lesions indicate that the genome size is Larger than the genome size (172 kb) (Decker et al., 1996, J. Exp.Med. 184,283-288).   To determine the genomic sequence of KSHV and to identify new viral genes, BC- Continuously overlapping virus D from one genomic library The NA insert was mapped. Exclude the small non-clonable repeat region at the right end. Sequence with high redundancy to define the genome structure of the virus And has enabled the identification of genes acting as etiologies associated with KSHV. <Materials and methods>   Library formation and screening: BC-1, HBL-6 and BCP-1 cells were % Fetal calf serum in RPMI 1640 (Moore et al., 1996, J. Virol. 0,549-558; Cesarman et al., 1995, Blood 86, 2708-2714; Gao et al., 1996, Nature  Med. 2,925-928). DNA from BC-1 cells is commercially available as lambda FIXII vectors or Was cloned into one of the S-Cos1 vectors (Stratagene, La Jolla, CA) (S ambrook et al., 1989, Molecular Cloning: Alaboratory manual, Cold Spring Har bor Press, Salem, Mass). Phage and cosmid libraries are prepared using standard methods. Cleaned (Benton et al., 1977, Science 196, 180-182; Hanahan and Mesel son, 1983, Methods Enzymol. 100, 333-342).   Initial library screening uses KS330Bam and KS631Bam RDA fragments. (Chang et al., 1994, Science 265, 1865-1869). Duplicate clone Using a probe synthesized from the end of a previously identified clone. (Fig. 1) (Feinberg and Vogelstein, 1983, Anal. Biochem. 132, 6; Melto n et al., 1984, Nucl. Acids, Res. 12, 7035-7056). The maps are cosmids Z2 and Z In Fig. 6, it is rearranged in a circle due to the presence of a large number of TR units of the same type. It was thought. Each candidate phage or cosmid is identified by three-dimensional screening. Was confirmed.   Shotgun sequencing and sequence elucidation   Lambda DNA and cosmid DNA were purified by standard methods (Sambrook et a l., 1989, Molecular Closing: A laboratoy manual, Cold Spring Harbor Press, Sa lem, Mass.). For sonicated DNA, use Shotgun Sequencing (Deininger, 1983, Anal. Biochem. 129, 216-223; Banker et al., 1987, Meth. Enz. ymol. 155, 51-93). The 1-4 kb fraction was transferred to M13mp19 (New England Biolabs, Inc., Beverly MA) and XL-1 blue cells (Stratagene, La Jo lla, CA) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Sp. ring Harbor Prcss, Salem, Mass.). M13 phage can be phage or Is positively screened using the insert DNA from the cosmid Negative screening with inserts of arm DNA or adjacent genome Was done.   Automated dideoxy cycle sequencing was performed on M13 (-21) CS + or FS stained plates. Using an Immer kit (Perkin-Elmer Branchburg NJ), ABI 373A or 377 Run on Keneta (ABI Foster City, CA). For each 10kb insertion sequence To achieve initial coverage, approximately 300 M13 sequences were typically required. At any site, at least four overlapping sequences to cover from two directions Thus, a minimum sequence (reproducibility) fidelity criterion was defined. Meet these criteria For regions with no sequence gaps, ambiguities, or frameshifts, Primer (Perkin-Elmer) and staining stop compound (FS or ready-made reaction kit, Perk In-Elmer) was used for primer walking. In the Z2 cosmid insert The unsequential 3kb region adjacent to the rightmost TR sequence was Nevertheless, it cannot be cloned into M13 or Bluescript Was.   Sequence assembly and open reading frame analysis   Edit sequence data using Factura (ABI, Fostcr City CA) Automated assembler (ABI, Foster City, CA) using electrophoresis photographs Into a continuous array by using the assembly line (assemblyLIGN) (IBI-kod ak, Rochester NY). Try lots of sequencing Base positions (less than 10 bases in total) that are not clearly resolved A majority base pair was assigned. All sequences (1-5 kb fragment) and all BLASTX, BLASTP, BLASTN (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410). The distribution Columns also show MOTIFS (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558), REPEAT and BESTF. Analyzed using IT (GCG) and MacVector (IBI, NewHaven, CT).   ORF Designation and naming   All ORFs with similarity to HVS were identified. These and other promising ORFs (100 (With more amino acids) was found using MacVector. Other known remains Similarity to the gene, context with the optimal start codon (Kozak, 1987, Nucl. Acids Res. 15 , 8125-8148), and a map based on size and position (Figure 1), similar to HVS ORFs Not ORFs were also included. To minimize spurious assignments, the preservation choice (co nservative selection), so that The number was underestimated. KSHV ORF naming is based on HVS similarity ing. That is, KSHV ORFs dissimilar to the HVS gene are numbered sequentially with a K prefix. Have been. ORFs whose sequences are similar to the HVS ORF but have no positional similarity A VS ORF number (eg, ORF2) is assigned. When new ORFs are identified, It is suggested that they be named in decimal notation. Standard mapping of KSHV genome Direction (FIG. 1) was determined by HVS (Albrecht et al., 1992, J. Virol. 66, 5047-5058) and EH V2 (Telford et al., 1995, J. Mol. Biol. 249, 520-528). The reverse direction is for the standard map (Baer et al, 1984, Nature 310, 207-211). <Result>   Genome mapping and sequence features   Complete genome mapping shows seven lambda clones and three cosmid clones Completed using a loan (Figure 1). BC-1 The structure of the KSHV genome is It is similar to HVS in having adjacent long unique areas. ~ 140.5kb The LUR sequence has a G + C content of 53.5% and contains all identified KSHV ORFs. TR area The region has a G + C content of 84.5% with promising packaging and cleavage sites ( It consists of a plurality of 801 bp serial repeat units with FIG. 2A). Between repeating units , Slight sequence variations are seen. Compared to the basic TR unit, the left (Z6) TR The first TR unit at the junction (205 bp) is missing in BC-1. And the tip is cut off.   Z2 cosmids that cannot be cloned into sequencing vectors Complete genomic sequence adjacent to right terminal repeat due to 3kb region in insert It has not been. In the partial sequence information obtained from primer walking, Region has at least one 16 bp C + T-rich incomplete tandem repeat extension , Dotted with multiple extensions of incomplete tandem repeats rich in 16 bp A + G. these Can form long inverted repeats, and this region is difficult for our subcloning. I struggled. By at least four duplicate reads, excluding the non-cloned regions 12x or more average array size with full bidirectional coverage for the entire LUR Dundancy has been achieved.   Because the entire region cannot be sequenced due to its repetitive structure, the BC-1TR region Were investigated by Southern blotting. Digested with an enzyme that cuts one part in TR When performed, BC-1, BCP-1 (EBV negative, KSHV infected cell line) and KS focal DNAs Strong ~ 800 bp matching unit length repeats and hybridizing to TR probe It has a signal (FIGS. 2B, 2C). Digestion with enzymes that do not cut TR The strain contains specific regions flanked by 7 kb and ~ 35 kb TR sequences and buried in the TR (FIGS. 2C and 2D). Cells separately derived from a tumor similar to BC-1 The same pattern was found to occur in the system, ie, HBL-6. This means that the parent tumor In suggest that such a replica was present (FIGS. 2C and 2D). NotI Restriction pattern (NotI also cuts only once in TR but hardly cuts in LUR ) Indicates that the buried region is at least 33 kb. This area Exact genome duplication may begin at ORF K8 when partially sequencing Is demonstrated. The LUR is the rightmost unsequential gap (<3 kb) 140 kb including Putative KSHV Geno in BC-1 and HBL-6 (including overlapping regions) The program size is about 210 kb.   Used in clonality studies (Raab-Traub and Flynn, 1986, Cell 47, 883-889). Based on the current EBV replication model, the polymorphic BCP-1 ladder pattern And may reflect a superinfection (Figure 2C). EBV ladder pattern This occurs when the TR unit is lost or duplicated during lytic replication. A process that occurs stochastically for stained cells (Raab-Traub and Flynn, 198 6, Cell 47,883-889). About BC-1 under tight control of potential KSHV replication Ladders do not exist (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558). KS lesion D NA also shows a single hybrid band, which indicates the virus in KS tumor cells. Suggest that the protein may be of monoclonal origin.   KSHV LUR Features and code areas   The KSHV genome is derived from other herpesviruses (Chee et al., 1990, Curr. Topics Micro biol.Immunol.154,125-169) with 7 blocks (B) Subfamily-specific or unique ORFs Region (IB) a-h, FIG. 1). 137.5k sequenced by ORF analysis b Only 79% of LURs were shown to encode 81 identifiable ORFs, indicating that May be due to a conservative assignment of ORF positions. All LUR CpG dinucleotides The observed / predicted (O / E) ratio is 0.75, which indicates that methylated cytosine is moderate. However, the mutation was remarkable in some places. Lowest CpG   The O / E ratio (<0.67) was determined for IBa (bp 1-3200), B5 (68,602-69,405) and IBh (117,3 52-137,507). The highest O / E ratio (> 0.88) is from B2 to B3 (30,701-47, 849) occurs in IBe (67,301-68600) and B6 (77,251-83,600). K Comparison with the S5 sequence (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558) shows that these two High sequence conservation was seen among the strains, spanning the compared 20.7 kb region (0.1%). 21 point mutation is not seen. Compared to KS5ORF28, BC-1ORF28 (positive 49,004), the PCR product amplified from Ks5 and BC-1 Despite repeated sequencing, resolution was not possible. KS5 sequence and ratio In comparison, the noncoding region (bp 47,862,49,338) also has two additional frame shifts. Are there.   There are several repeat regions in the LUR (FIG. 1). Position 92,678 in ORF k11 In -92,820 and 92,852-92,994 (waka / jwka), the 143 bp sequence is repeated. Get In other regions of nome there are multiple repeats. That is, 24, 285-24, 902 (fr The nk) region contains 20-30 bp repeats between 29,775 and 29,942 (vnct) bases. Is a 13 bp repeat, two separate repeats extend between bases 118, 123 and 118, 697 (zppa) And 15 different 11-16 bp repeats from 124,527 It exists over an area of 126,276 (moi). Complex AG-rich repeats (mdsk) , 137,099 and extends into the non-sequence gap.   Conserved ORFs with similar genes found in other herpes viruses are listed in Table 1. Along with its polarity, map location, size, HVS, EBV ORFs Relevance and estimation functions are listed. Preservation of viral structural proteins and enzymes ORFs code includes viral DNA replication (eg, DNA polymerase (ORF9)), Nucleotide synthesis (eg, dihydrofolate reductase (DHFR, ORF2), thymidi Lurate synthase (TS, ORF70), regulator of gene expression (R, transactivator (LCTP, ORF50), involved in five conserved herpesvirus structural capsids Gene and pentaglycoprotein gene.   Some genes similar to HVS ORFs also have unique features. ORF45 is It has sequences similar to nuclear and transcription factors (Tic nucleolin and yeast SIR3), and ORF45 contains an extended acidic domain typical of the transactivator protein at amino acid 90. And have between 115. ORF73 is rich in glutamine encoded by moi repeats It has an extended acidic domain divided into two regions depending on the sequence. The first area is Consists almost exclusively of repeating aspartic and glutamic acid residues . In contrast, the second glutamate-rich region shows a lectin zipper structure. It has a reminiscent lectin heptavalent element motif. ORF75, the putative coat protein, , Escherichia coli purine biosynthetic enzyme and D. melanogaster N-formylglycine High level similarity with amide ribotide amide transferase (FGARAT) Have sex.   ORFs K3 and K5 are not similar to the HVS gene but have a major immediate-early (immediate) early) bovine herpesvirus type 4 (BHV4) gene IE1 (12 and 13%, respectively) Similar) (van Santen, 1991, J. Virol. 65, 5211-5224). These genes Is significantly different from herpes simplex virus I (HSV1) a0 (similar to BHV4 IEI) Encodes a protein that has no similarities but shares common with the HSV1 ICP0 protein and In-rich regions can form zinc finger motifs (van Santen, 1991) , J. Virol. 65, 5211-5224). The protein encoded by ORF k5 follows the BHV4 protein It has a region similar to the nucleus localization site present in the stage. ORF K8 is a purine-binding motif (GLLVTGKS) that is present in KSHV TK (ORF21). Has a C-terminal similar to that of the protein (Moore et al., 1996, J. Virol. 70, 549-558). .   The KSHV genes with similarities to HVC ORFs 1,3,5,12,13,14,15,51 and 71 are KSHV LUR Not specified in the sequence. HVC ORFI is an in vitro HVS-induced phosphorus Transformation involved in papocyte transformation (Akarl et la., 1996, Virology 218, 382-388) Encodes a recombinant protein and has low sequence conservation between HVS strains (Jung and Dcsrosiers, 1991, J .Virol.65,6953-6960, Jung and Descrosicrs, 1995, Molec.Cellular Biol.15,650 5-6512). There may be a functional KSHV gene similar to this gene, Not identified by column comparison. Thus, it is involved in EBV latency and transformation KSHV genes (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-LP, LMP-1, LMP-2, and GP350 / 2 20) is that despite the similarity of the repetitive sequences present in these genes , Was not found. KSHV is also similar to the BZLF1EBV transactivator gene I don't even have the gene I did.   Although some sequences have the characteristics of the expressed gene, a given ORF It was not an analysis task. The sequence between bp 90,173 and 90,643 contains many alpha herpes The secretion of glycoprotein X (gX) encoded by the virus (pseudorabies EHV1) Similar to the precursor and does not form part of the viral structure. FHV1 Like family genes, the KSHV type lacks the highly acidic carboxy terminus of the pseudorabies gene I have.   Two polyadenylate transcripts expressed at high copy number in BCBL-1 In positions 28,661-29,741 (T1.1), during IBh, positions 118, 130-117, It exists at 436 (T0.7), and at Ibh, it exists at 118, 130-117, 436 (T0.7). T0.7 is 6 Encodes a 0 residue polypeptide (ORF K12, also called Cabosin), with T1.1 It is speculated that it may be an RNA-like transcript.   Cell cycle regulation and cell signaling proteins   Many that are specific to KSHV or common only to other gammaherpesviruses ORF encodes genes similar to oncoproteins and cell signaling proteins . ORF16 is similar to EBV BHRF1 and HVS ORF16 in that Bax-mediated It encodes a functional Bc1-2-like protein that can block potosis. ORF72 at HVS Is also found (Nicholas et al., 1992, Nature 355, 362-365) Functional cyclin D Gene, which is responsible for phosphorylating the retinoblastoma tumor suppressor protein. It was found that tocyclin D could be substituted.   KSHV is a functionally active IL-6 (not found in other human herpes viruses). ORF K2) and two macrophage inflammatory proteins (MIPs) (ORFs K4 and K6) are doing. vIL-6 has 62% amino acid similarity to human IL-6 and It is possible to replace human IL-6 in preventing myeloma cell apoptosis. Both M The IP-like protein preserves the signature of the CC dimer characteristic of β-chemokines, and Preserves nearly sequence identity to human MIP-1α in the N-terminal region of . vMIP-1 (ORF K6) is able to block CCR-5 dependent HIV-1 replication. Nucleoti Open readings over 22, 529-22, 185 (vMIP-III) The frame is low conservation for MIP1β (BLASTX Poisson p = 0.0015) , C-C dimer motif. ORF K9 (vIRF1) -Feron regulatory factor (IRF) (David, 1995, Pharmac, Ther.65,149-161) family Encodes a 449-residue protein with similarity to ORF K9 is a human interface -Feron consensus sequence binding protein and part of IRF-DNA binding domain Has 13.4% amino acid identity to the genetic conservation. bp 88,910-88,410 (vIRF2), bp 9 0541-89,600 (vIRF3) and another three open sites at bp 94,127-93,636 (vIRF4). The reading frame has low similarity to IRF-like proteins (p> 0.35). Saved Interferon consensus sequence is not found in this region of the genome Was.   Other genes encoding signaling polypeptides (other herpes As well as in complement) (complement binding protein (v-CBP, ORF4), Adhesion molecule (NCAM-like protein) (v-adh, ORF K14) and IL8 receptor (ORF 74) Can be Genes similar to ORFs4 and 74 are found in other rhadinoviruses. Present, ORF4 is similar to cowpox B19L and D12L proteins. ORF K14 (v-adh) And human OX-2 membrane antigen, various NCAMs and poliovirus receptor-related protein PRRI Similar to OX-2 is a human herpesvirus 6 and 7 ORFs similar to U85 but between KSHV and β herpesvirus OX-2 / NCAM ORFs Has no significant similarity. Like other immunoglobulin family attachment proteins, v-adh V-like, C-like, transmembrane and cytoplasmic domains, and fibronectin RGD binding site , Residues 268-270. vIL-8R is an EBV-induced EBI1 protein (Birkenbac h et al., 1993, J. Virol. 67, 2209-2220) and other chemoattractant receptors coupled to G proteins. It has seven transmembrane domain structures characteristic of the container. <Discussion>   The full-length sequence of the KSHV genome in BC-1 cells provides a molecular mechanism for KSHV-related pathogenesis. You will be given the opportunity to study the structure. The KSHV genome is believed to have rounded the genome. A single specific coding region adjacent to the high G + C terminal repeat region, which is the site defined And has the standard characteristics of the Ladinovirus genome. Herpes virus Has 66 conserved herpesvirus genes involved in the replication and structure of In addition, KSHV has many proteins that mimic cell cycle regulatory and signal proteins. It is specific in coding.   The size of the BC-1 derived genome we estimated (210 kb including the overlap) was the protein Virion DNA (Zhong et al., 1996, Proc. Natl. Accd. Sci. USA 93, 66) 41-6646). That the genome is rearranged Refers to a cultured herpes virus (Baer et al., 1984, Nature 310, 207-211; This is common in Cha et al., 1996, J. Virol. 70, 78-83). However, The genome replication present in BC-1 KSHV occurs during tissue culture. Would not have been. Duplicate LUR breaks from TR hybridization studies Insertion of the piece into BC-1 TR is also present in KSHV from an independently induced HBL-6 cell line. (Gaidano et al., 1996, Lcukemia 10, 1237-40).   Despite this genome rearrangement, the KSHV genome is well conserved within the coding region. Have been. Less than 0.1% salt between BC-1 and 21 kb KS5 fragment isolated from KS lesions There is a base pair mutation. Higher levels of mutations are from other regions or from other disease conditions. May be present in the next strain. Within the LUR, the system for HVS Are lost in ORFs 2 and 70, but all other regions conserving HVS There is agreement in the region. Thymidine kinase (TK) (Cesarman et al., 1995, Blood  86, 2708-2714) TS and DHFR (present in HVS, Albrecht et al., 1992, J. Virol. 6 Some conserved genes, such as 6,5047-5058), are appropriate for existing drugs. Encodes a protein that is an important target.   The molecular mimicry of cell cycle regulation and signal proteins by KSHV is a viral masterpiece. It is a characteristic that was issued. The KSHV genome contains complement binding proteins (ORF4), cytokines (ORF4) sk2, K4 and K6), bc1-2 protein (ORF 16), cytokine signaling pathway protein (K9), IL-8R-like Retains similar genes to protein (OFR74) and D-type cyclin (ORF72). MIP and I Other regions encoding proteins with certain similarities to RF-like proteins also include KSHV Present in the genome. KSHV gene similar to cellular gene and induced by EBV infection There are significant similarities between the cellular genes known to be involved. Cellular cycling D, CD21 / CR2, bc1-2, IL-8-like protein (EBI1), IL-6 and adhesion molecules are susceptible to EBV infection Therefore, it is up-regulated (Birkenbach et al., 1993, J. Virol. 67, 2209-2). 220; Palmero et al., 1993, Oncogene 8, 1049-1054; Finkc et al., 1992, Blood 80 , 459-469; Finke et al., 1994, Leukemia & Lymphoma 12, 413-419; Jones et al., 1 995, J.Exper.Med.182,1213-1221). This changed KSHV after EBV infection Alter the same signals and regulatory pathways as they do, but leave them out of their own genome. It is suggested that this is done by introducing a foreign gene.   Cell protection against viral infection usually involves cell cycle arrest, apoptosis (For an overview, see Shen and Shenk, 1995, Curr. Opin. Ggenet. Devel. 5, 105-111. ) And the construction of cell-mediated immunity. V-bcl-2 encoded in KSHV , V-cyclin and v-IL-6 prevent either apoptosis or cell cycle arrest (Chang et al., 1996, Nature 382, 410). Beta-chemokine KSHV At least one of the gene products, v-MIP-I, binds to CCR5 in transfected cells. Prevent mediated HIV transmission. B cells infected with EBV are more like normal tonsillar lymphocytes Although they express higher levels of MIP-1α (Harris et al., 1993, 151, 5975-5-5). 983), β-chemokines are required for successful EBV infection of cells Is not known to be. Autocrine secretion of EBV-infected B cells is triggered by IL-6 (Tosato et al., 1990, J. Virol. 64, 3033-3041) plus small and uncharacterized Dependence on protein factors indicates that beta chemokines Also play an important role.   KSHV has not been formally shown to be a transforming virus and And genes similar to the major transforming genes of EBV are present in BC-1 strain KSHV. Not. Nevertheless, identified proto-oncogenes and sites encoding KSHV Dysregulation of cell growth control caused by Cain May contribute to neoplastic growth. In preliminary studies, subgenomic KSHV fragments were used to transform NIH3T3 cells. It has been suggested that it may be transformed. Like EBV duplication, KSHV duplication The TR unit (Raab-Traub and Flynn, 1986, cell 47,883-889) Is involved, hybridization of monomorphic TR present in KS lesions Pattern will indicate the clonal virus population in the tumor. this is, Rather than KSHV being a "passenger virus", KS was single transformed Consistent with being a true neoplastic growth arising from KS infected cells. For current research Identification of KSHV genes similar to known oncoproteins and cell growth factors Provides evidence that KSHV may be a transforming virus.Experimental Details Section II:            Of human cytokines and cytokine response pathway genes,                           Molecular imitation by KSHV   Two human macrophage inflammatory protein (MIP) chemokines, IL-6 and -Encodes a protein similar to the feron regulatory factor (IRF or ICSBP) polypeptide Four viral genes are found in the genome of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) Existing. Expression of these genes has been demonstrated in infected cell lines in phorbol et Stealable. vIL-6 is functionally active in B9 cell proliferation assays is there. vIL-6 is predominantly expressed in KS-infected hematopoietic cells rather than KS lesions . vMIP-I inhibits replication of CCR5-dependent HIV-1 strain in vitro However, this indicates that vMIP-I is functional and that between these two viruses It contributes to the interaction of KSHV mimics cell signaling proteins This blocks host cell defenses and contributes to the formation of KSHV-related tumors.   Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is the Epstein-Barr virus (EBV) and gamma herpes virus associated with herpesvirus simyli (HVS) Ruth. KSHV consists of almost all types of HIV-related and non-HIV-related KSs. Present in all KS lesions (Chang et al., 1994, Science 265, 1865-1869; Boscho ff et al., 1995, Lancet 345, 1043-1044; Dupin et al., 1995. Lancet 345, 761-762 , Schalling et al., 1995, Nature Med. 1,707-708). Viral DNA can cause KS tumors Preferentially localized (Boshoff, et al. 1995, Nature Med. 1, 1274-1278); Cleavage studies have shown that KSHV is specifically associated with KS. Primary KS such as exudative lymphoma (PEL), trace B-cell lymphoma, and castleman disease Related lymphoproliferative disorders that occur frequently in affected patients are also associated with KSHV infection ( Cesarman et al., 1995, New Eng. J. Med. 332, 1186-1191; Soulier et al., 1995, Blo od 86,1276-1280). A cytokine-like polypeptide encoding three KSHVs; A polypeptide similar to the interferon regulator gene has been identified to date. Have been. Paradoxically, dysregulation of cytokines causes Kaposi's sarcoma It has been proposed that this be done (Ensoli et al., 1994, Nature 371, 674-680; Miles, 1992 Cancer Treatment & Research 63, 129-140) The in vitro spindle cell lines used for these studies throughout Is not infected (Ambroziak et al., Science 268, 582-583; Lebbe et al., 1995 , Lancet 345).   To identify specific genes in the KSHV genome, BC-1, or KSHV and Non-Hodgkin's lymphocyte cell lines that stably infected both EBV and EBV (Cesarma et al., 1995, Blood 86, 2708-2714) and Supercos-1 and Lambda FI Genomic sequencing was performed using the XII genomic library. See Law section). KSHV DNA fragments KS330Bam and KS631Bam (Chang et al., 199 4, Science 265,1865-1869) for mapping and bidirectional sequencing. Used as starting point for hybridization. Open reading frame (ORF) analysis of Z6 cosmid sequence (see method) Now, two separate coding regions (ORFs K4 and K6) share similarities with β-chemokines. Sequence and a third coding region similar to human interleukin-6 (huIL-6) (O RF K2) was identified and the fourth coding region was identified as interferon regulatory factor (IRF) Present in the inserted sequence in a Z8 cosmid with a similar sequence to the peptide (Figures 3A-3C) Identified that. All KSHV genes are similar to other known viral genes Absent. By the way, the conserved cysteine motif similar to the signature of Chief protein has recently been reported in the genus Molluscens Infectious Virus (MCV) genome ing. Neither vMIP-I nor vMIP-II has significant similarity to MCV protein.   Cell counterparts to these four viral genes are responsible for the cellular response to infection Encodes the polypeptide involved. For example, 8-10 kDa β chemoattractant site Cain (chemokine) MIP / RANTES (macrophage inflammatory protein / activated Regulated, normal T cells are expressed and secreted). Plays an important role in inflammation caused by (Cook et al., 1995; Scicece 269,158 3-1585). β-chemokines are natural ligands for CCR5 and are non-syncytium-induced Of inducible (NSI) primary lymphocyte and macrophage stimulated HIV-1 strains in vitro Entry can be blocked by binding to this HIV co-receptor (Cocchi et a l., 1995, Science 270, 1811-1815). As mentioned earlier, IL-6 is involved in B cell differentiation. Its effect (Hirano et al., 1985, Proc Natl Acd Sci, USA 85, 5490; Kishimo to etal., 1995, Blood 86, 1243-1254), affecting a wide variety of cells. Pleiotropically expressed, multiple myeloma, multicentral cattleman disease (KSHV-related disease), AIDS -Can be a cause of lymphoproliferative disorders following KS and EBV-related transplantation (Klein et al., 19 95, Blood 85, 863-872: Hilbert et al., 1995., J. Exp Med 182, 243-248; Brandt et  al., 1990, Curr Topic Microbiol Immunol 166, 37-41; Leger et al., 1991, Blood.  78, 2923-2930; Burger et a;., 1994, Annal Hematol 69, 25-31; Tosato et al., 19 93, J Clin Invest 91, 2806-2814). IL6 production is due to either EBV or CMV infection. -Induced EBV-infected lymphoblasts are induced in nude mice (Tosato et al., 1990, J. Virol 64, 3033-3041; Scal a et al., 1990.J. Exp med 172, 61-68; Almcida et al., 1994, Blood 83, 370-376) . KS foci Cell lines derived therefrom produce and respond to IL-6 even if they are not infected with KSHV ( Miles et al., 1990; Proc Natl Acad Sci USA 87, 4068-4072; Yang et al., 1994, J .Immunol 152,943-955). Whereas MIP and IL-6 are secreted cytokines Thus, a polypeptide of the IRF family may be a γ or α / β interferon site. Reacts with caine to generate a specific enzyme within the interferon-inducible promoter region. Interferon induction by binding to an interferon consensus sequence Regulate conductable genes. A series of extensive cellular responses to interferon Modulated by the action of a repressor or transactivator of an IRF polypeptide And several members (IRF-1 and IRF-2) have conflicting anti-tumorigenic and (Scharf et al., 1995, J. Biol Chem 270, 13063-13069; Harada et al.  al., 1993, Science 259, 971-974; Weisz et al., 1994, Internat Immunol 6,1125- 1131; Weisz et al, 1992, J. Biol Chem 267, 25589-25596)   The 289 bp ORF K6 (ORF MIP1) gene has 37.9% amino acid identity to huMIP-1α. Uniformity (71% equivalence) and slightly lower equivalence to another β-chemokine (FIG. 3A) It encodes a 10.5 kDa polypeptide (vMIP-I; MIP1) that has a property. ORF K4 Also, an estimated 10.5 kDa polypeptide that is very similar to vMIP-I and is amino acid hydrophobic. (VMIP-II; vMIP1α-II). MIPβ chemo encoding the two KSHVs Cain is a 5.5 kb intervening sequence containing at least 40 RFs (see Methods) on the KSHV genome. They are separated from each other by columns. Both polypeptides are conserved, characteristic Beta-chemokine mochi containing CC dicystin dimer (Figure 3A, residues 36-37) (Fig. 3A, residues 17-55), and almost identical to human MIP-1α at residues 56-84. have. However, the two polypeptides have only 49.0% amino acids Shows identity and is extremely diverse at the nucleotide level. This is Is not a cloning articraft. The two wills HuIMP-1α, huMIP-1α or huRANTES, Phylogenetically more closely related to each other. This makes them pepti Are not obtained independently from the host genome, but rather Suggest that this was caused by Column alignment). Reasons for this double gene dosage of the viral genome I don't know.   KSHV ORF K2 (FIG. 3) has 24.8% amino acid identity and And a hydrophobic 19 amino acid secretion signaling peptide with 62.2% similarity It has 204 residues and encodes a 23.4 kDa IL-6-like hypothetical polypeptide. vIL-6 Is also an IL-6-like interleukin (amino acids 101-125 of the gap polypeptide) It has a characteristic conserved sequence as well as IL-6 polypeptide (gap sequence residues, 3, with four conserved cysteines present at positions 72, 78, 101 and 111) . IL-6 is a glycated cytokine, and the vIL-6 sequence contains an N-linked glycosylation site. The positions are at gap positions 96 and 107 in FIG. 3C. 449 residues encoded by ORF K9 Of the KSHV vIRF polypeptide has full amino acid identity (approximately 13 %) Is lower than either vMIPs or vIL-6, but the polypeptide IRF family It has a conserved region derived from Lie (Fig. 3C, gap residues 88-121). This area is Of the four tryptophan that are thought to be involved in DNA binding, only two Conserved but contains a tryptophan-rich IRF ICS DNA binding domain. It is. A hydrophilic N-terminus of 87 residues with apparently lower IRF identity precedes this region. ing. C corresponding to the transactivator / repressor region of the IRF family The degree of terminal amino acid identity is low.   The four KSHV cell signaling genes are used in virus infected cell lines. A similar expression pattern by Northern blotting is shown (see Methods). All RN A is BCP-1 (cell line infected only with KSHV) and BC-1 (both EBV and KSHV are infected) Cesarman et al., 1995, Blood 86, 2708-2714). 48 with -O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TRA, Sigma, St. Louis MO) Time, extracted with or without pretreatment. Structure of these genes Expression varied between the two cell lines, but expression of all four gene transcripts Current increased in BCP-1 cells and BC-1 cells after TPA induction (FIGS. 4A-4D). This pa Turns are consistent with expression that occurs primarily during lytic phase virus replication . Examination of the terminal repeats of BCP-1 and BC-1 viruses revealed that BCP-1 Causes low levels of viral lytic replication in BC-1 Does not occur (see method), and there is suppression of DNA replication in BC-1 Nevertheless, both cell lines are induced by TRA treatment and express lytic phase genes This has been proven. In particular, low levels for vIL-6 (Figure 4C) and vIRF (Figure 4D) It seems that latent expression of is also occurring. Because these transcripts are not TPA-induced This is because it can be detected in BC-1 under strict potential regulation. Inbit KS spindle cell cultures retain defective or partial viral sequences containing these genes. In order to determine whether or not the DNA is present, the DNA was transferred to four KS spindle cell lines (KS-2, KS-10, K S-13, KS-22) and PCR amplified for vMIP-I, VMIP-II, vIL-6 and vIRF sequences. Width (see method). All spindle cell DNA samples were any of the four genes Was not positive.   To determine if vIL-6 is functionally preserved, use bioassays VIL-6 was further investigated using antibody and antibody localization studies. Recombination vIL-6 (rv IL-6) is specifically recognized by anti-peptide antibodies that do not cross-react with huIL-6 (FIGS. 5A-5B) (see method). vIL-6 is structurally produced in BCP-1 cells and Significantly increased after 48 h TPA induction, consistent with hybridization experiments . The BC-1 cell line co-infected with both KSHV and EBV shows vIL-6 polypeptide after TPA induction. (Figure 5A, lanes 3-4) and control EBV-infected P3HR1 cells Was negative for vIL-6 expression (FIG. 5A, lanes 5-6). TPA induction (21 -Multiple high molecular weight bands appearing after 25 kDa) indicate the precursor form of the polypeptide. Maybe you are. Despite the presence of a heterologous region between huIL-6 and vIL-6 And a functional bioassay using the Il-6-dependent murine cell tumor cell line B9 In this case, viral interleukin 6 has biological activity (see method). square By COS7 supernatant from the anti-construct (rvIL-6)ThreeMeasured by H-thymidine incorporation B9 cell growth is supported, and vIL-6 inhibits cellular IL-6 in preventing B9 apoptosis. FIG. 6 shows that it can be replaced with (FIG. 6). From the experiment shown in FIG. B9 growth supported by is dose-dependent, non-concentrated supernatant is huIL-6, 1m It has a biological activity equal to about 20 pg / l.   43% of uninduced BCP-1 cells (FIG. 7A) were immunostained intracellular plasma vIL-6 (see methods) Means that the constituent viral polypeptides are expressed in the cultured infected cells Non-specific immunization in uninfected control P3HR1 cells. No epidemiological reaction staining was seen (FIG. 7B). vIL-6 production is hardly detected in KS tissue And only one of the eight KS lesions studied had less than 2% cells Clear and specific vIL-6 immunostaining was shown (FIG. 7C). The specificity of this low positive rate Confirmed using immunized serum and neutralization with excess vIL-6 peptide. Was. Trace IL-6 producing cells in KS lesions are CD34, an endothelial cell marker (FIG. Or positive for either CD45, a pan hematopoietic cell marker (Figure 8B). Was. This means that both endothelial cells and hematopoietic cells in KS lesions produce vIL-6. Has been demonstrated. These trace vIL-6-positive cells are Using lobes to rush into lysis phase replication has been shown to occur It is possible. In contrast, half of ascites lymphoma cells pelleted from HIV-negative PEL Cells well above min (65%) are strongly positive for vIL-6 (Fig. Expresses the cell marker EMA (Cesarman et al., 1995, Blood 86, 2708-2714) . This indicates that most PEL cells replicate the soluble form of KSHV in vivo or Shows that PEL cells infected with A. can express high levels of vIL-6. Specific staining was performed with anti-vIL-6 from previously immunized or post-immunized rabbits. Includes normal skin, tonsil prostate tissue, myeloma multiforme, or hemangiosarcomas that were investigated using antibodies. This did not occur in any of the control tissues (FIGS. 7E and 7F).   By examining lymph nodes from AIDS-KS patients who do not develop PEL, Virus seeding on tissue was found. Many vIL-6 stained hematopoietic cells KS-free lymph nodes (Fig. 8C). vIL-6 positive lymph node cells Located in relatively B-cell rich regions, some express CD20B cell surface antigen (FIG. 8D) But does not express the EMA surface antigen (unlike PEL cells) (Cesarman et al., 1995, Blood 86,2708-2714). Phagocytosis of vIL-6 immunopositive cells by macrophages is frequent Although frequently observed, v for T cell surface antigen CD3 or macrophage antigen CD68 No co-positive IL-6 was detected.   To investigate whether vMIP-I can block the entry of the NSIHIV-1 virus, Human CD4 + feline kidney cells (CCC / CD4) have human CCR5 and vMIP-I or its inverse The plasmid expressing the construct I-PIMv was transiently transfected (CCR5 And vMIP-I cloning). In these cells, CCR5 is used as a common receptor. M23 or SF162 primary NSI HIV-1 isolates known to be used (Clapham, et al., 1992, J. Virol 66, 3531-3537) or CD4 without human CCR5 + HIV-2 mutant ROD / B capable of infecting CCC cells was infected. Virus penetration and replication Were analyzed by immunostaining for retroviral antigen production (FIG. 9). vMIP -I co-transfection can produce foci of NSI HIV-1 Reduced to less than half the trawl, but had no effect on ROD / B HIV-2 replication There was no.   Molecular plagiarism of host cell genes has been linked to certain DNA viruses, especially herpesviruses. And a newly recognized characteristic of chickenpox virus (Murphy, 1994, Infect Age nts Dis 3,137-154; Albrecht et al., 1992, J. Virol 66, 5047-5058; Gao and Murp hy, 1994, J. Biol Chem 269, 28538-28542; Chee et al., 1990, Curr Top Microbiol Immunol 154, 125-169; Massung et al., 1994, Virol 201 215-240). KSHV is a cell The extent to which sex genes are incorporated into their genomes is exceptionally good. vMIP-I and vMIP In addition to -II, vIL-6 and vIRF and KSHV are bc1-2 (ORF16) and cyclin D (ORF72). A similar polypeptide, a complement binding protein polypeptide similar to CD21 / CR2 (ORF4), N It encodes CAM-like adhesion protein (ORF K14) and IL-8 receptor (ORF74). FBV Also encodes these same cellular polypeptides (BHRF1 / bc1-2), or Induce (CR2; cyclin D; IL-6; bc1-2; adhesion molecule and IL-like EBI1 protein) (C leary et al., 1986, Cell 47, 19-28; Tosato et al., 1990, J. Virol 64, 3033-3041; Palmero et al., 1993, Oncogene 8, 1049; Larcher et al., 1995, Eur J. Immunol 2 5,1713-1719; Birkenback et al., 1993, J. Virol 67, 2209-2220). Thus both c Ils can alter signaling and regulatory pathways of similar host cells You. EBV appears to carry out these changes through the expression of cellular genes In contrast, KSHV appears to introduce the polypeptide exogenously from its genome.   Identifying the cellular polypeptides encoded by these viruses can The potential role of the peptide in the defense of humans against antiviral responses You will have to delve into it. huIL-6 has gamma-in in myeloma cell lines. Inhibits terferon-induced Bax-mediated apoptosis (Lichtenst ein et al., 1995, Cellular Immunology 162, 248-255) and vIL-6 May play a similar role in B cells. VIRF, vbc1-2, v-sa Iculin is also mediated by host cells and induces apoptosis induced by viral infection. V-cyclin can inhibit G1 cell cycle in infected cells Defend. Interferon-induced MHC antigen expression and cell-mediated Immune response (Holzinger et al., 1993, Immunol Let 35, 109-117) It is possible to inhibit. β chemokine polypeptides vMIP-I and vMIP-II Can have agonistic or antagonistic signaling and transduction effects. Preservation of their sequences and And duplicated gene levels play important roles in KSHV replication and survival It is.   This impairment of cell growth due to dysregulation of cell signaling pathways is Is a promising and promising by-product of the viral strategy. Cells expressing vIL-6 in KS lesions In short, vIL6 does not appear to significantly contribute to KS cell tumorigenesis. Only However, KSHV induction of hu-IL6 is mediated by subsequent angiogenic endothelial cell growth factor Possible with induction of angiogenesis (Holzinger et al, 1993, Immunol Let 35, 109-117) It is. vIL-6 may also be involved in KSHV-related, such as PEL or plasma cell variants of Castleman disease. It may also be potentially involved in the pathogenesis of a lymphoproliferative disorder. Tumor formation is cellular cycling It has been well documented to result in overexpression of bc1-2 and bc1-2. These c The polypeptide encoding irs is also involved in KSHV-associated tumorigenesis.   KSHV vMIP inhibits NSI HIV-1 replication in vitro (FIG. 9). The first AIDS trend In studies at the end of life, survival for AIDS-KS patients was US AIDS patients who have been living longer than 3 years Diagnosed to die within 3 years compared to 3% retaining KS and survived In 28% of patients with AIDS (Hardy, 1991, J. AIDS 4,386-391; Lemp et al., 1990, J. Am Med Assoc 263, 402-406; Rothernberg et al., 1987, New Eng J Med 317,1297-1302, Jacobson et al., 1993, Am J Epidemiol 138,953-964; Lundgren et al., 1995, Am j Epidemiol 141,652-658). This is relatively high C Due to the occurrence of KS in the D4 + measurement number and the high mortality rate due to another AIDS prescribed condition Maybe. Recent survey data suggests that the epidemiology of AIDS-KS is It has been pointed out that it has been changing as well (see id.). <Method>   Genome sequencing: Genomic inserts are randomly sheared into M13mp18 Averaged 12x reduction in cloned and fully bi-directional sequencing It was sequenced until it became danceable. The expression name of the KSHV polypeptide is Based on the naming system that derived the herpesvirus simyli (Albrecht  et al., 1992, J Virol 66, 5047-5058).   Open Reading Frame (ORF) analysis: The sequence continuum collected Using a vector (MacVector) (IBI-Kodak Rochester NY), 25 amino acids Analyzed for the possibility of an open reading frame larger than the residue And BLASTX BEAUTY-BLASTX (Altschul et al., 1990, J Molbiol 215,403-410; Wo rley et al., 1995 Genome Res 5,173-184; http: //dot/imgcn.bcm.tmc.edu: 9331 / Analysis was performed using scq-search / nucleic acid-search html). Four KSHV polypees Peptides (italics) can be identified with similar proteins (name (species, sequence bank approval number, Minimum Poisson distribution probability points)) were arranged. That is, (1) νMIP-I: LD78 (MIP-1α) ( Human, gi 127077, p = 9,8Xe-22), MIP-1α (Rattus, gi 790633, p = 3.3xe-20), MIP-1 α (Mus, gi 127079, p = 1.7xe-19), MIP-1β (Mus, gi 1346534, p = 7.8xc-18); (2) nMIP- II: LD78 (MIP-1a) (human, gi 1207077, p = 7.1xe-23), MIP-1α (Mus, gi 127079, p = 8. 9xe-21), MIP-1α (Rattus, gi 790633, p = 1.2xe-20), MIP-1β (Mus, gi 1346534, p = 3. 8xe-20); (3) vIL-6: 26 kDa polypeptide (II-6) (human, gi 23835, p = 7.2xe-17), IL- 6 (Macaca, gi 514386, p = 1.6xe-16); and (4) νIRF: ICSBP (Gallus, gi 662355, p = 1.1 xe-11), ICSBP (Mus, sp p23611, p = 1.0xe-10), lymphoid-specific interferon Nodal factor (Mus, gi 972949, p = 2.0xe-10), ISGF3 (Mus gi 1263310, p = 8.1xe-10), IRF4 ( Human gi 1272477, p = 1.0xe-9), ISGF3 (human spQ00978, 3.9xe-9), ICSBP (human spQ02556) , p = 2.3xe-8)   Sequence alignment ratio: Amino acid sequence is determined by CLUSTAL W (Thompson et al., 1994, Nuc Acids  Res22,4673-4680) and compared using PAUP3.1.1. Power root And non-power rootstrap (program) comparisons 100 boos with less diversified viral polypeptides than the polypeptide A phylogenetic tree with all tostrap-type replicas was created.   Northern blotting: Northern blotting was performed using standard conditions. Extracted with RNAzol according to the manufacturer's instructions (Teltest Inc, Friendswood TX). 10 μg of total RNA was loaded in each lane of the total cell RNA, and the following primers: IP-I: 5 'AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3' (sequence recognition number 4), 5'-GGT AGA TA A ATC CCC CCC CTT TG-3 '(SEQ ID NO: 5); vMIP-II: 5'-TGC ATC AGC TTC TTC AC C CAG-3 '(sequence recognition number 6): 5'-TGC TGT CTC GGT TAC CAG AAA AG-3' (sequence recognition number No. 7), vIL-6'5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GTG-3 '(sequence recognition number 8); 5'-CGCC CT TCA GTG AGA CTT CGT AAC-3 '(SEQ ID NO: 9); vIRF: 5'-CTT GCG ATG AAC CAT  CCA GG-3 '(sequence recognition number 10), 5'-ACA ACA CCC AAT TCC CCG TC-3' (sequence recognition number Performed with randomly labeled probes from the PCR products for the set of 11) (Ch ang et al., 1994, science 265, 1865-1869). BCP-1, BC-1 and p3HR1 were cultured Retained under conditions and induced with TRA as previously described (Gao et al., 1996, New En g J. Med 335,233-241). PCR amplification for these viral genes was performed using vMIP-I, vM Performed in 35 amplification cycles using IP-II, vIL-6 and vIRF primer sets. , A dilution of total BC-1 DNA as a positive control, and the PCR conditions (Moore  and Chang, 1995, New Eng J Med332, 1181-1185). these The KS spindle cell line DNA used in the experiment was Dictor et al., 1996, Am J Pathol 148,20. 09-2016. The amplification potential of the DNA sample depends on human HLA-DQα and pill Confirmed using a vinate dehydrogenase primer.   vIL-6 cloning: vIL-6 was cloned into a 695 bp polymerase chain reaction. The following primer set from the PCR product: 5'-TCA CGT CGC TCT TTA CTT ATC GT G-3 '(sequence recognition number 12) and 5'-CGC CCT TCA GTG AGA CTT CGT AAC-3' (sequence recognition number No. 13), and clone 0.1 μg of BC-1 DNA. Used as a plate and amplified for 35 cycles. The PCR product is initially pCR2.1 (Invitro gen San Dicgo CA) and then insert the EcoRV insert into the pMET7 expression vector (Takebe et al., 1988, Mol Cell Biol 8,466-472). COS7 cells using Cistran and chlorokinin (CRL-1651, American Type Cultu re Collection, Rockville MD). The sequence is also pMET7 vector As a negative control in the opposite direction (6-Liv) to the SRa promoter Cloned, the orientation and sequence fidelity of both constructs were verified by ABI 377 sequencing. Dye chemistry on a Noether (Applied Biosystems Inc, Foster City CA) Was confirmed by bidirectional sequencing.   15 ml of serum-free COS7 supernatant to 1.5 ml with Centriplus 10 filter (Amicon, Bevcrly MA) Concentrate by ultrafiltration and 100 μl of supernatant concentrate or rhu IL-6 (R & D Systems, Minneapolis MN) in Laemmli buffer in each lane And filled. Immunoblotting of cell lysate with and without TPA 20ng / ml Pellet exponentially growing cells induced at 48 hours and lysed in Laemmli buffer 100 μg of total cell protein was loaded in each lane, and 15% SDS polyacrylamide Electrophoresis on a gel, immunoblot and standard conditions (Gao et al., 1996, New  Eng J Med 335, 233-241) using rabbit anti-peptide antibody (1: 100-1: 1000). (Diluted) or with anti-huIL-6 (1 μg / ml, R & D System, Minneapolis MN).   Cell line B9: The B9 mouse forming cell tumor cell line was Medium (IMDM) (Gibco, Gaithersburg, MD), 10% fetal calf serum, 1% penicillin / Streptomycin, 1% glutamine, 50 μM β-mercaptoethanol and 10 ng / ml of rhuIL-6 (R & D Systems, Minneapolis MN).ThreeUptake of H thymidine HuIL according to the standard protocol (R & D System, Minneapolis MN) B9 proliferation in response to -6 or recombinant supernatant was measured. In short, huIL 96-well 1: 3 serial dilutions of -6 or Centriplus 10 concentrated recombinant supernatant 2x10 per well of plateFourIncubate with cells for 24 hours at 37 ° C. For the last 4 hours of incubation, add 1 ml of thymidine stock solution to each well. During IMDM   1mCi / mlThree10 μl of 50 μl of H-thymidine) was added. Cells harvested and taken upThree H-thymidine was measured using a liquid scintillation counter. Each data Points are the average of six measurement points with the indicated standard deviation.   vIL-6 immunoblotting: tissue paraffin is removed and 0.03% H in PBSTwoOTwo After quenching for 30 minutes using the avidein-biotin complex (ABC) method I performed Imuno Rotting. 10% normal goat serum, 1% BSA, 0.5% Tween After blocking with Tween 20, the primary antibody was subjected to a 1: 1250 dilution. Secondary bi Otinylated goat anti-rabbit antibody (1: 200 in PBS) was allowed to act for 30 minutes at room temperature, then Three 5 minute washes in PBS were performed. ABC conjugated with peroxidase (1: 1 in PBS) 00) was allowed to act for 30 minutes, followed by three washes in PBS for 5 minutes. Diaminobe Ndideine (DAB) chromogen detection solution (0.25% DAB, 0.01% H in PBS)TwoOTwo) For 5 minutes Allowed to act. The slides are then washed, counterstained with hematoxylin, I put on a bar glass. Aminoethylcarbazole (AEC) or Vector Red dye Using color to counterstain with Fast Blue for certain surface antigens Better discrimination of doubly labeled cells by color was achieved. About CD68 In some cases, vIL-6 cytoplasmic staining may obscure the staining, Double label immunofluorescence was used. Microwaves of tissue sections were removed from 2% human blood in PBS. Washed with 1% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes, with primary antibody Incubate overnight, fluorescein-conjugated goat anti-rabbit for vIL-6 localization For IgG (1: 100 Sigma) and for CD68 localization, rhodamine-conjugated horse anti-mouse Developed with IgG (1: 100 Sigma) for 30 minutes. After washing, secondary antibody incubation Was repeated twice, and each of them was washed for 15 minutes to amplify the staining. About residual membrane antigen Develops slides first for vIL-6 and then not only for cellular antigens Perform the reverse localization (first, cell antigen antibody, then anti-vIL-6) to optimally visualize both antigens. Awareness was achieved and a distinction was made. In each case, the first antibody used AEC (Sigma). Develop with pre-incubation solution (1% BSA, 1-% normal hose serum, 0.5% tow) Ein 20, 30 minutes) blocked. Development was in accordance with the manufacturer's instructions. Secondary antibody Developed in Fast Blue Chromagen using ABC alkaline phosphatase technology I imaged. Microwave and trypsinized As a result, the localization was low and the specificity of immunolocalization of vIL-6 was low. Membrane antigen If this is required for optimal localization of these techniques, these techniques may be used after vIL-6AEC localization. The law applies. As a staining alternative to AEC for optimal differentiation, vector -Using ABC (Vector-Red) (Vector, Burlingame, CA) staining Performed according to the manufacturer's protocol, using the phosphatase technique. Research Cell antigen-antibodies include CD on tissue regulated according to the manufacturer's instructions. 68 (1: 800, derived from clone Kim6), epithelial antigen (EMA, 1.500, Dako, Carpinteria, CA) ), CD3 (1: 200, Dako), CD20 (1.200, Dako), OPD4 (1: 100, Dako), CD34 (1: 15, Dako), CD4 5 (1: 400, from clone 9.4), L26 (1: 100, Immunotech, Westbrook, ME) and Leu22 (1: 100, Bectdon-Dickinson, San Josc, CA). Colony of specific vIL-6 -: CD34 and CD45 in KS lesions, EMA in PEL, lymph node tissue And CD20 and CD45.   Immunohistochemical localization of vIL-6 after implantation on 1% agar in saline Exponentially growing B with or without 48 h TPA incubation Performed on CP-1 cells. Percentage of positive cells is 3 random per slide The number of cells in the visual field of the high-power microscope selected in Example 2 was counted and determined. TPA treatment (cell lysis And may die from induction of lytic viral replication by TPA Later), the percentage of BCP-1 cells that stained positive for vIL-6 was It was low. Immunostaining of cells and tissues was performed using 0.1 μg / ml vIL-6 synthetic peptide of antiserum. By neutralization using 4 ° C. overnight incubation, and also by tissue or cell conditioning Pre-immune rabbit antiserum for the product, in parallel with the use of post-immune serum Therefore. It has been demonstrated to be specific. Specific staining is either peptide neutralization or After the use of the pre-immune serum, none was observed.   CCR5 and vMIP-I cloning: CCR5 was cloned into pRcMV vector (Invitrogen). After PCR amplification, the following primer pair: 5'-AGC ATA TAA GGA ACT CGG CGT TAC-3 '(sequence recognition number 14), 5'-GGT AGA TAA ACT CCC CCC CTT TG-3' (sequence recognition number No. 15), the forward and reverse orientation of the vMIP-1 gene was cloned into pMET7. I did it. CCR5 alone and CCR5 with forward construct (vMIP-I), reverse construct (I-PIM v) and empty pMET vector into CCC / CD4 cells (human CK cat cells stably expressing CD4, McKnight et al., 1994, Virol 201,8 -18) using lipofectamine (Gibco). After 48 hours, the medium was removed from the transfected cells, and SF162, M23 or Is ROD / B virus medium stock 1000 TCID50Was added. Virus Incubation After 4 hours of washing, the cells are washed four times and transferred to HIV-1 p24 or HIV-2gp105. Prior to immunostaining for DMEM in DMEM supplemented with 5% FSC (fetal calf serum) as described above. And grown for 72 hours. Each condition is repeated 3-4 times on average (Fig. 9), the intermediate value representing the standard deviation Error bars represent percentage of lesions with CCR5 alone.Experimental Details, Section III:   The following patents are, by way of reference, for a more complete description of the invention described herein. Incorporated herein. Table 1. KSHV genome to ORF and other herpesvirus genes Similarity <Notes in Table 1>   “Name” (for example, K1 or ORF4) indicates the notation of KSHV ORF. "Pol" means the polarity of the ORF in the KSHV genome. "Start" is start Represents the position of the first LUR nucleotide in the codon. "Stop" is the stop code Represents the position of the last LUR nucleotide in the sequence. "Size" for KSHV ORF Thus, the number of encoded amino acid residues is shown. "HVS% Sim" is the KSH notation for the corresponding ORF of herpesvirus simyli. The percentage similarity of V ORF is shown. “HVS% Id” is the herpes virus size Shows the percent identity of the indicated KSHV ORF to the corresponding ORF in millimeters . “EBV name” indicates the notation of the EBV ORF. "EBV% Sim" is displayed Show the percent similarity of the indicated KSHV ORF to the ORF of the named EB virus I have. "EBV% Id" is the notation K for the ORF of the EB virus with the displayed name The percent identity of the SIIV ORF is shown. The asterisk in the KSHV name column is HVS ORF4a (*) And HVSORF4b (**KS against) 3 shows a comparison of HV ORF4. The whole genome sequence without annotation is accession number U75698 (LUR) , U75699 (terminal repeat), and U75700 (incomplete terminal repeat) Have been. Specifically, the sequence of the LUR is shown in SEQ ID NOs: 17-20 in the 5'-3 'direction. I have. More specifically, nucleotides 1-35,100 of the LUR are each in SEQ ID NO: 17 1 to 35,100 numbered nucleotides are shown in the LUR nucleotides 35,101 to 70,200 are nucleotides numbered 1 to 35,100 in SEQ ID NO: 18, respectively. The nucleotides 70,201 to 105,300 of the LUR are shown in SEQ ID NOs. Nos. 1 to 35,100 in No. 19 are shown in nucleotides numbered 1 to 35,100, and Otides 105,301 to 137,507 are the nucleic acids numbered from 1 to 32,207 in SEQ ID NO: 20. Each is shown in the otide.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/03 Ｃ０７Ｋ 14/03 16/08 16/08 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:93） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） (31)優先権主張番号 ０８／６８６，３５０ (32)優先日 平成８年７月25日(1996．7．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６８７，２５３ (32)優先日 平成８年７月25日(1996．7．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／６８８，８１４ (32)優先日 平成８年７月25日(1996．7．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７０８，６７８ (32)優先日 平成８年９月５日(1996．9．5) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７２８，３２３ (32)優先日 平成８年10月10日(1996．10．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７４７，８８７ (32)優先日 平成８年11月13日(1996．11．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７４８，６４０ (32)優先日 平成８年11月13日(1996．11．13) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／７５７，６６９ (32)優先日 平成８年11月29日(1996．11．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 ボーエンツキー、ロイ・エー アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94040、マウンテン・ビュー、アパートメ ント 115、イースト・エル・カミーノ・ リアル 870 (72)発明者 ラッソ、ジェイムズ・ジェイ アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10032、 ニューヨーク、アパートメント 25イー、 ヘイブン・アベニュー 60 (72)発明者 エデルマン、イジドーア・エス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10027、 ニューヨーク、アパートメント 61、リバ ーサイド・ドライブ 464 (72)発明者 ムーア、パトリック・エス アメリカ合衆国、ニューヨーク州 10533、 アービングトン、クァーリ・レーン 20──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 35/00 C07K 14/03 C07K 14/03 16/08 16/08 19/00 19/00 C12N 1 / 15 C12N 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 C12P 21/08 C12P 21/08 G01N 33/569 J G01N 33/569 C12R 1:93) // (C12N 15/09 ZNA C12N 15 / (ZNAA C12R 1:93) (31) Priority claim number 08 / 686,350 (32) Priority date July 25, 1996 (July 25, 1996) (33) Priority claim country United States (US) ( 31) Priority claim number 08 / 687,253 (32) Priority date July 25, 1996 (July 25, 1996) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 688, 814 (32) Priority date July 25, 1996 (July 25, 1996) (33) (31) Priority claim number 08 / 708,678 (32) Priority date September 5, 1996 (September 9, 1996) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 728,323 (32) Priority date October 10, 1996 (Oct. 10, 1996) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 747,887 (32) Priority date November 13, 1996 (November 13, 1996) (33) Country of priority claim United States (US) (31) Priority claim number 08 / 748,640 (32) Priority Date November 13, 1996 (November 13, 1996) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 757,669 (32) Priority date November 29, 1996 (1996.11.29) (33) Priority country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP MX (72) Inventor Bowentsky, Roy A United States, California 94040, Mountain View, Apartment 115, East El Camino Real 870 (72) Inventor Lasso, James Jay United States of America, New York 10032, New York, Apartment 25E, Haven Avenue 60 (72) Inventor Edelman, Isidor S United States, New York 10027, New York, Apartment 61, Riverside Drive 464 (72) Inventor Moore, Patrick S. United States, New York 10533, Quarry Lane, Irvington 20

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）ポリペプチドをコードする単離 された核酸であって、前記ポリペプチドが、 a．チミジル酸シンターゼ b．ウイルスタンパク質キナーゼ c．アルカリエキソヌクレアーゼ（AE） d．ヘリカーゼ−プライマーゼ、サブユニット３、および e．ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG） からなる群から選択される核酸。 ２．請求項１に記載の合成DNA。 ３．請求項１に記載の単離されたゲノムDNA。 ４．請求項１に記載の単離されたcDNA。 ５．請求項１に記載の単離されたRNA。 ６．請求項１の単離された核酸分子を含有する複製可能なベクター。 ７．請求項６のベクターを含有する宿主細胞。 ８ 請求項７に記載の真核細胞。 ９ 請求項７に記載の細菌細胞。 １０．請求項１の単離された核酸分子を含有するプラスミド、コスミド、λフ ァージまたはYAC。 １１．請求項１の単離された核酸分子と特異的にハイブリダイズし得る、少な くとも14ヌクレオチドの核酸分子。 １２．請求項１１に記載の核酸であって、検出マーカーでラベルされた核酸。 １３．請求項１２に記載の核酸であって、前記マーカーが放射性ラベル、着色 ラベル、発光ラベルまたは蛍光ラベルである核酸。 １４．請求項１の核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する単離された ポリペプチド。 １５．請求項１４に記載のポリペプチドであって、第二のポリペプチドに結合 して融合蛋白質を形成しているポリペプチド。 １６．請求項１５に記載の融合タンパク質であって、前記第二のポリペプチド がβ−ガラクトシダーゼである融合タンパク質。 １７．請求項１４のポリペプチドと特異的に結合する抗体。 １８．前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１７に記載の抗体。 １９．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１７に記載の抗体。 ２０．請求項１４のポリペプチドを発現する宿主細胞。 ２１．有効免疫量の請求項１４のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体 を含有するワクチン。 ２２．請求項１の単離された核酸分子とハイブリダイズすることができるアン チセンス分子。 ２３．前記分子が核酸誘導体である請求項２２のアンチセンス分子。 ２４．請求項１の二本鎖核酸とハイブリダイズすることができるトリプレック スオリゴヌクレオチド。 ２５．胚の段階で哺乳動物に導入された請求項１の核酸を具備するトランスジ ェニック非ヒト哺乳動物。 ２６．対象におけるカポジ肉腫関連DNAウイルスを診断する方法であって、 （a）対象から核酸サンプルを得ることと、 （b）工程(a)で得られたサンプルを、高ストリンジェンシーのハイブリダイズ 条件下において、請求項１２の標識された核酸分子に接触させることと、 （c）工程(b)においてハイブリダイズした標識された核酸分子の存在を決定す ることと を具備し、該ハイブリダイズした核酸の存在はカポジ肉腫関連DNAウイルスのを 示し、これによって対象におけるカポジ肉腫関連DNAウイルスを診断する方法。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記サンプルが体液を含む方法。 ２８．請求項２７に記載の方法であって、前記体液は血清を含む方法。 ２９．請求項２６に記載の方法であって、前記サンプルは組織検体を含む方法 。 ３０．請求項２９に記載の方法であって、前記組織検体は腫瘍病巣を含む方法 。 ３１．請求項２６に記載の方法であって、工程(b)の前に、核酸分子を増幅す る方法。 ３２．対象においてカポジ肉腫関連DNAウイルスを診断する方法であって、 （a）患者からサンプルを得ることと、 （b）工程(a)で得たサンプルを、請求項１７のカポジ肉腫抗体が既に結 合された支持体に接触させて、該抗体を、前記サンプル中に存在す る特異的なカポジ肉腫抗原に結合せしめることと、 （c）前記支持体から未結合の物質を除去することと、 （d）工程(c)においてカポジ肉腫抗体に結合した特異的カポジ肉腫抗原 の存在を検出し、その存在がカポジ肉腫関連DNAウイルスを示し、 これによって対象におけるカポジ肉腫関連DNAウイルスを診断する ことと を具備する方法。 ３３．請求項３２に記載の方法であって、前記サンプルは適切な体液を含む方 法。 ３４．請求項３３に記載の方法であって、前記体液は血清を含む方法。 ３５．対象においてカポジ肉腫関連DNAウイルスを診断する方法であって、 （a）患者から適切な体液サンプルを得ることと、 （b）工程(a)で得られたサンプルを、請求項１の単離された核酸分子によ ってコードされるカポジ肉腫抗原が既に結合されている支持体に接触 させて、該カポジ肉腫抗原を、前記サンプル中に存在する特異的なカ ポジ肉腫抗体に結合せしめることと、 （c）前記支持体から未結合の物質を除去することと、 （d）工程(c)においてカポジ肉腫抗原によって結合された特異的化化ポジ 肉腫抗体の存在を検出し、その存在はカポジ肉腫関連ＤＮＡウイルス を示し、これによって対象におけるカポジ肉腫関連ＤＮＡウイルスを 診断することと を具備する方法。 ３６．請求項３５に記載の方法であって、前記サンプルは適切な体液を含む方 法。 ３７．請求項３６に記載の方法であって、前記体液は血清を含む方法。 ３８．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに感染した対象を治療する方法であっ て、対象に対して、有効量の請求項２２のアンチセンス分子を、該アンチセンス 分子が選択的に患者の感染細胞に入るような条件下で投与し、これによって患者 を治療することを具備する方法。 ３９．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに感染した対象を治療する方法であっ て、対象に対して、薬学的に許容される担体中の薬学的有効量の抗ウイルス剤を 投与することを具備し、該抗ウイルス剤は請求項１４のポリペプチドに特異的に 結合する方法。 ４０．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに感染した対象を治療または予防す方 法であって、対象に対して、薬学的に許容可能なキャリア中の請求項１７に記載 の抗体を投与することを具備した方法。 ４１．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに対して対象を予防接種する方法であ って、前記対象に対し、有効量の請求項１４のポリペプチドおよび適切な許容さ れる担体を患者に投与することにより、対象を予防接種することを具備する方法 。 ４２．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに対して対象を免疫化する方法であっ て、前記対象に対して、有効免疫投与量の請求項２１のワクチンおよび薬学的に 許容可能なキャリアを投与することを具備する方法。 ４３．請求項１８に記載の抗体であって、該抗体はウイルス性インターロイキ ン６の抗原性部位ヲコードするペプチドと特異的に免疫反応する抗体。 ４４．請求項４３に記載の抗体であって、前記ウイルス性インターロイキン６ の抗原性部位は、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する抗 体。 ４５．請求項４０に記載の方法であって、前記抗体はキメラ抗体である方法。 ４６．請求項４０に記載の方法であって、前記抗体はヒト化抗体である方法。 ４７．カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに対して対象を受動免疫する方法であ って、前記対象に対して、有効免疫量の請求項４３の抗体および薬学的に許容可 能なキャリアを投与することを具備した方法。[Claims]   1. Isolation encoding a Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) polypeptide Wherein the polypeptide is:         a. Thymidylate synthase         b. Viral protein kinase         c. Alkaline exonuclease (AE)         d. Helicase-primase, subunit 3, and         e. Uracil DNA Glycosylase (UDG) A nucleic acid selected from the group consisting of:   2. The synthetic DNA according to claim 1.   3. An isolated genomic DNA according to claim 1.   4. An isolated cDNA according to claim 1.   5. An isolated RNA according to claim 1.   6. A replicable vector containing the isolated nucleic acid molecule of claim 1.   7. A host cell containing the vector of claim 6.   8. The eukaryotic cell according to claim 7.   9. A bacterial cell according to claim 7.   10. A plasmid, cosmid, λ-family containing the isolated nucleic acid molecule of claim 1. Or YAC.   11. A small amount capable of specifically hybridizing with the isolated nucleic acid molecule of claim 1. A nucleic acid molecule of at least 14 nucleotides.   12. The nucleic acid according to claim 11, which is labeled with a detection marker.   13. 13. The nucleic acid according to claim 12, wherein the marker is a radioactive label, colored. Nucleic acids that are labels, luminescent labels or fluorescent labels.   14． An isolated having an amino acid sequence encoded by the nucleic acid of claim 1. Polypeptide.   15. 15. The polypeptide of claim 14, which binds to a second polypeptide. Polypeptide forming a fusion protein.   16. The fusion protein of claim 15, wherein the second polypeptide Is a β-galactosidase.   17． An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 14.   18. 18. The antibody according to claim 17, wherein said antibody is a polyclonal antibody.   19. 18. The antibody according to claim 17, wherein said antibody is a monoclonal antibody.   20. A host cell that expresses the polypeptide of claim 14.   21. An effective immunizing amount of the polypeptide of claim 14 and a pharmaceutically acceptable carrier. A vaccine containing.   22. An polymer capable of hybridizing with the isolated nucleic acid molecule of claim 1. Chisense molecule.   23. 23. The antisense molecule of claim 22, wherein said molecule is a nucleic acid derivative.   24. A triplex capable of hybridizing with the double-stranded nucleic acid according to claim 1. Small oligonucleotide.   25. A transgene comprising the nucleic acid of claim 1 introduced into a mammal at the embryo stage. Non-human mammals.   26. A method of diagnosing Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in a subject, comprising:   (A) obtaining a nucleic acid sample from the subject;   (B) The sample obtained in step (a) is hybridized with high stringency.       Contacting the labeled nucleic acid molecule of claim 12 under conditions;   (C) determining the presence of the labeled nucleic acid molecule hybridized in step (b)       Things Wherein the presence of the hybridized nucleic acid reduces the presence of Kaposi's sarcoma-associated DNA virus. A method for diagnosing a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in a subject.   27. 27. The method according to claim 26, wherein the sample comprises a bodily fluid.   28. 28. The method of claim 27, wherein the bodily fluid comprises serum.   29. 27. The method of claim 26, wherein the sample comprises a tissue specimen. .   30. 30. The method of claim 29, wherein the tissue specimen comprises a tumor lesion. .   31. The method according to claim 26, wherein the nucleic acid molecule is amplified before step (b). Way.   32. A method of diagnosing a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in a subject,         (A) obtaining a sample from the patient;         (B) the sample obtained in step (a) is already conjugated with the Kaposi's sarcoma antibody of claim 17;             The antibody is present in the sample by contacting the combined support.             Binding to a specific Kaposi's sarcoma antigen;         (C) removing unbound material from the support;         (D) specific Kaposi's sarcoma antigen bound to Kaposi's sarcoma antibody in step (c)             The presence of which indicates a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus,             This diagnoses Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in subjects             That A method comprising:   33. 33. The method of claim 32, wherein the sample comprises a suitable bodily fluid. Law.   34. 34. The method of claim 33, wherein the bodily fluid comprises serum.   35. A method of diagnosing a Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in a subject,       (A) obtaining an appropriate body fluid sample from the patient;       (B) subjecting the sample obtained in step (a) to the isolated nucleic acid molecule of claim 1;           Contacts a support that already has the Kaposi's sarcoma antigen encoded by           Then, the Kaposi's sarcoma antigen is replaced with the specific           Binding to a positive sarcoma antibody;       (C) removing unbound material from the support;       (D) the specificized positive bound by Kaposi's sarcoma antigen in step (c)           Detects the presence of sarcoma antibodies, and its presence is detected by Kaposi's sarcoma-associated DNA virus.           And thereby demonstrate Kaposi's sarcoma-associated DNA virus in the subject.           To diagnose A method comprising:   36. 36. The method of claim 35, wherein the sample comprises a suitable bodily fluid. Law.   37. 37. The method of claim 36, wherein the bodily fluid comprises serum.   38. A method to treat a subject infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus Administering to the subject an effective amount of the antisense molecule of claim 22. Administered under conditions such that the molecule selectively enters the patient's infected cells, thereby Treating.   39. A method to treat a subject infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus Subject to a pharmaceutically effective amount of an antiviral agent in a pharmaceutically acceptable carrier. Administering the antiviral agent specifically to the polypeptide of claim 14. How to combine.   40. How to treat or prevent a subject infected with Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus 18. The method of claim 17 in a pharmaceutically acceptable carrier for the subject. A method comprising administering the antibody of (1).   41. A method of vaccinating a subject against Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Thus, an effective amount of the polypeptide of claim 14 and appropriate tolerance for said subject. Vaccinating a subject by administering a carrier to the patient. .   42. A method to immunize a subject against Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus 22. The subject of claim 21, wherein the subject has an effective immunizing dose of an immunizing dose. A method comprising administering an acceptable carrier.   43. 19. The antibody of claim 18, wherein said antibody is a viral interleukin. An antibody that specifically immunoreacts with the peptide encoded by the antigenic site of peptide 6.   44. 44. The antibody of claim 43, wherein said viral interleukin-6 Has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. body.   45. 41. The method according to claim 40, wherein said antibody is a chimeric antibody.   46. 41. The method of claim 40, wherein said antibody is a humanized antibody.   47. Passive immunization of a subject against Kaposi's sarcoma-associated herpes virus Thus, an effective immunizing amount of the antibody of claim 43 and a pharmaceutically acceptable amount of said antibody against said subject. Administering an effective carrier.
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