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JP2002512640A - Local delivery of sustained therapeutics - Google Patents

Local delivery of sustained therapeutics

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JP2002512640A
JP2002512640A JP54845699A JP54845699A JP2002512640A JP 2002512640 A JP2002512640 A JP 2002512640A JP 54845699 A JP54845699 A JP 54845699A JP 54845699 A JP54845699 A JP 54845699A JP 2002512640 A JP2002512640 A JP 2002512640A
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JP
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Application number
JP54845699A
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Japanese (ja)
Inventor
エズリン，アラン，エム．
ミルナー，ピーター，ジー．
ブリドン，ドミニク，ピー．
ホームズ，ダレン，エル．
Original Assignee
コンジュケム，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コンジュケム，インコーポレーテッド filed Critical コンジュケム，インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 対象となる部位と共有結合を形成することができる治療薬を局所送達するための方法および組成物が開示される。本発明において有用な治療薬には、創傷治癒剤、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、抗感染剤および抗癌剤が含まれる。   (57) [Summary] Disclosed are methods and compositions for local delivery of a therapeutic agent capable of forming a covalent bond with a site of interest. Therapeutic agents useful in the present invention include wound healing agents, antibiotics, anti-inflammatory agents, anti-oxidants, anti-proliferative agents, immunosuppressants, anti-infectives and anti-cancer agents.

Description

【発明の詳細な説明】 持続性治療薬の局所送達 発明の利用分野 本発明は、医療分野の治療薬に関する。特に、本発明は、所定の薬物の組織保 持および治療効果の薬力学的持続を高めるために、in vivoで対象の部位に共有 結合することができる治療薬の局所送達の分野に関する。発明の背景 ドラッグデリバリーカテーテルまたはデバイスを用いた治療薬の局所送達の技 術は十分に確立されている。理想的な状況のもとでは、治療薬は効力増加のため に投与部位付近に残存するだろう。この技術は有用であるが、主な欠点は治療薬 が適用部位から消失する速度にある。例えば、Imanishiら(J Cardio，1996，27 ，267-271)によれば、加圧バルーンカテーテルから導入された残留アルガトロバ ン(argatroban)の濃度は、バルーンがしぼんだ後では最初の5分で3分の1に減少 する。この現象は他の治療薬の文献においても繰り返し報告されており、一般的 に、さまざまの治療エリアからの薬物は送達後数時間以内で十分な濃度を維持す ることができないため局所送達後の有効性が限られるという欠点をもたらす(Cir culation，1994，89(4)，1518-1524;Circulation，1997，96(1)，154-165)。そ の結果、薬物レベルの急激な低下および最高ではない性能つまり準有効な応答を 回避するために、局所投与した治療薬の反復投与が必要となる。これはコストを 増加させかつ患者を過剰量の治療薬に不必要に暴露する結果となる。 したがって、治療薬を所望の部位に長時間保持して作用持続時間を長期化する ように治療薬を局所投与する必要性が存在する。これらの治療薬は投与部位から それほど簡単になくならないので、治療薬の減少量を供給することができる。特 に、治療効果のために治療薬を有効に長時間存在させるように、局在化部位と共 有結合を形成することができる治療薬を提供する必要がある。発明の概要 これらの必要性を満たすために、本発明は、治療薬が増大した組織保持および 半減期を有するように、局在化部位と共有結合を形成することができる治療薬に 関する。 本発明の第一の態様は、薬物団(pharmacophore)受容体相互作用に関与しない 部位での薬物の修飾に関する。 本発明の第二の態様は、ホモおよびヘテロ二官能性架橋剤を用いる、共有結合 の非特異的形成に係わる新規な化学に関する。 さらに、本発明は、固定性の血液タンパク質および組織を、N-ヒドロキシ-ス クシンイミド(NHS)-薬物およびスルホ-NHS-薬物により非特異的に標識すること を含むが、血液のような水性媒質中で機能する他の反応性基も使用できる。いく つかの場合には、アミド、エステル、イミン、チオエーテル、ジスルフィド、置 換アミンなどを形成するために、アジド、ジアゾ、カルボジイミド、酸無水物、 ヒドラジン、ジアルデヒド、チオール基、アミンなどの特殊な試薬が利用される 。通常、形成された共有結合は血液成分の寿命の間ずっと、それが放出部位でな い限り、維持され得るだろう。この技術の主な利点は、全身投与と比べて、有効 な治療ウインドーを得るために必要な薬物の量が少なくてすむことである。この 利点の理由は、送達がターゲッティングされること、反応性成分と反応性官能基 との反応が高収率であること、そして反応後に形成された結合が不可逆的な性質 のものであることにより説明される。治療薬は治療標的の近傍に局在化されて、 他の遊離薬物のように血流中を循環することがない。この技術のもう一つの利点 は、上述した利点の結果としての副作用の低下である。いったん膜や組織に結合 されると、治療薬は肝臓代謝、腎臓濾過、排泄を受けにくくなり、さらに通常は 活性低下や排出促進へと至らせる（エンドペプチダーゼを含めて）プロテアーゼ 活性からさえも保護され得る。 本発明の別の態様は、固定性の血液タンパク質および組織上の利用可能な官能 基と反応して共有結合を形成することができる、放射性標識された分子の新規な 化学反応性誘導体に関し、これにより生成される共有結合コンジュゲートは放射 能の性質を有するものである。 遊離の放射性標識薬物と比較すると、コンジュゲート化された分子は血流中で 長期の寿命を有し、それゆえに、コンジュゲート化されていない親薬物と比べて 長期間にわたって放射能を維持することができ、しかも中枢性の副作用が少ない 活性をもたらす。 さらに、本発明は、固定性の血液タンパク質および組織を、NHS-放射性標識薬 物およびスルホ-NHS-放射性標識薬物により非特異的に標識することを含むが、 血液のような水性媒質中で機能する他の反応性基も使用できる。いくつかの場合 には、アミド、エステル、イミン、チオエーテル、ジスルフィド、置換アミンな どを形成するために、アジド、ジアゾ、カルボジイミド、酸無水物、ヒドラジン 、ジアルデヒド、チオール基、アミンなどの特殊な試薬が利用される。通常、形 成された共有結合は血液または組織成分の寿命の間ずっと、それが放出部位でな い限り、維持され得るだろう。 本発明はさらに、放射性標識誘導体と固定性血液成分および組織とのコンジュ ゲート、並びに哺乳動物宿主に新規な放射性標識誘導体を経皮的カテーテル法、 動脈血管内膜切除または直接組織インキュベーションの使用により投与すること からなる放射能のin vivo供給法を含む。 本発明の他の態様は、固定性の血液タンパク質および組織上の利用可能な官能 基と反応して共有結合を形成することができる、RGD含有ペプチドの新規な化学 反応性誘導体に関し、これにより得られる共有結合コンジュゲートはRGDペプチ ド活性を有する。 RGDペプチド薬物と比較すると、コンジュゲート化された分子は血流または組 織中で長期の寿命を有し、それゆえに、コンジュゲート化されていない親薬物と 比べて長期間にわたってRGDペプチド活性を維持することができる。かかる活性 は、局所送達の効率が高いこと、治療薬と膜タンパク質との共有結合が不可逆的 であること、本発明により用いられる治療用量が比較的低いことのために、中枢 性の副作用が少なくてすむ。 加えて、本発明は、固定性の血液タンパク質および組織を、NHS-RGDペプチド およびスルホ-NHS-ペプチドにより非特異的に標識することを含むが、血液のよ うな水性媒質中で機能する他の反応性基も使用できる。いくつかの場合には、ア ミド、エステル、イミン、チオエーテル、ジスルフィド、置換アミンなどを形 成するために、アジド、ジアゾ、カルボジイミド、酸無水物、ヒドラジン、ジア ルデヒド、チオール基、アミンなどの特殊な試薬が利用される。通常、形成され た共有結合は血液または組織成分の寿命の間ずっと、それが放出部位でない限り 、維持され得るだろう。 本発明はさらに、RGDペプチド誘導体と固定性の血液成分および組織とのコン ジュゲート、並びに哺乳動物宿主に新規なRGDペプチド誘導体を経皮的カテーテ ル法、動脈血管内膜切除、心膜、外膜、心臓内または直接組織インキュベーショ ンの使用により投与することからなるRGDペプチド活性のin vivo供給法を含む。 本発明はさらに、糖タンパク質IIb/IIIa受容体へのRGDペプチドの結合により 生じる血小板固定化を介して創傷治癒を行うためにRGDペプチドを供給するため の、RGD誘導体と、固定性血液成分および組織と、のコンジュゲートの使用方法 を含む。 本発明はさらに、既知のインテグリン受容体（αＶβIII、IIb/IIIa、α5βII Iなど）との直接相互作用を介して抗再狭窄性を生じさせて、血小板の刺激およ び炎症性応答（増殖、移動、細胞接着、組織改造の誘導を含む）をモジュレート するためにRGDペプチドを供給するための、RGD誘導体と、固定性血液成分および 組織と、のコンジュゲートの使用方法を含む。 本発明はさらに、細胞接着および細胞−細胞結合、並びに細胞の移入・移出と 関連したマトリックス分解を伴うインテグリン受容体相互作用により媒介される 接着および移動の変更により抗脈管形成性および抗転移性を生じさせるためにRG Dペプチドを供給するための、RGD誘導体と、固定性血液成分および組織と、のコ ンジュゲートの使用方法を含む。 本発明はさらに、式:X-Y-Zの化合物からなる局所送達剤を含み、式中Ｘは創傷 治癒剤、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、抗再狭窄剤、抗脈管形成剤 、免疫抑制剤、抗感染剤および抗癌剤の群から選択される。上記式中、Ｙは0〜3 0個の原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応 してそれと共有結合を形成することができる化学反応性成分である。 一つのフォーマットにおいては、ＺはN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロ キシスルホスクシンイミド、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレ イミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イ ソシアネート、チオールエステル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル 、カルボジイミド、酸無水物、および炭酸エステルから選択することができる。 別のフォーマットにおいて、Ｘはペプチド、有機分子および放射性分子から選 択することができる。他のフォーマットでは、Ｘは創傷治癒特性を有するRGD含 有ペプチドでありうる。RGDペプチドは配列Ac-RIARGDFPDDRK(EGS)-NH2を有し、 ここでEGSはエチレングリコール-ビス(スクシンイミジルスクシネート)である。 本発明はさらに、式:X-Y-Zの化合物を送達することによって、ある部位に局所 投与される治療薬の保持時間を増加させる方法を含む。ここで、Ｘは創傷治癒剤 、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、抗再狭窄剤、抗脈管形成剤、免疫 抑制剤、抗感染剤および抗癌剤の群から選択される。上記式中、Ｙは0〜30個の 原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそ れと共有結合を形成することができる化学反応性成分である。 本発明はさらに、式:X-Y-Zの化合物（ただし、Ｘは創傷治癒剤であり、Ｙは0 〜30個の原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反 応してそれと共有結合を形成することができる化学反応性成分である）を投与す ることからなる創傷部位の創傷治癒を促進する方法を含む。 本発明はさらに、式:X-Y-Zの化合物（ただし、Ｘは抗癌剤であり、Ｙは0〜30 個の原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応し てそれと共有結合を形成することができる化学反応性成分である）を投与するこ とからなる腫瘍の治療方法を含む。図面の簡単な説明 本発明は、図面を参照することによって一層理解しやすくなるだろう。 図１は、局所インキュベーション後の、損傷を受けたウサギ頸動脈と[3H]-NHS -プロピオネートとの結合効率を表す。 図２は、3分間インキュベーションした後の、損傷を受けたウサギ頸動脈にお ける[3H]-NHS-プロピオネートの保持効率を表す。 図３は、損傷を受けたウサギ頸動脈と3分間インキュベーションした後の、[3H ]-NHS-プロピオネートおよび[3H]-プロピオネートの3日間の保持効率を表す。発明の詳細な説明 定義 本発明の十分な理解を確実なものとするために、以下の定義が提供される： 局所送達剤：局所送達剤とは、関心のある局在部位に送達される薬剤のことで ある。このような薬剤には治療薬が含まれる。局所送達は治療処置を必要とする 内部および外部の両部位への局所適用を含む。 治療薬：治療薬とは治療効果を有する薬剤のことである。治療薬としては、創 傷治癒剤、抗生物質、抗感染剤、抗酸化剤、化学療法剤、抗癌剤、抗炎症剤およ び抗増殖剤が挙げられる。 固定性血液成分：固定性の血液成分は非移動性の血液成分であり、組織、膜受 容体、間質タンパク質、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞 、上皮細胞およびその結合膜および膜受容体、体細胞、骨格筋および平滑筋の細 胞、ニューロン成分、骨細胞および破骨細胞、並びに全ての身体組織、特に循環 系およびリンパ系と関連したもの、を含む。 移動性血液成分：移動性の血液成分とは長期にわたって（一般には5分を越え て、通常は1分を越えて）固定位置をもたない血液成分のことである。移動性血 液成分は免疫グロブリン、血清アルブミン、フェリチン、トランスフェリンなど の可溶性血液タンパク質を含む。 創傷治癒剤：創傷治癒剤は創傷治癒を促進する薬剤である。創傷治癒剤として は、インテグリン、ICAM、ECAM、ELAMなどの細胞接着分子、抗生物質、EGF、PDG F、IGF、bFGF、aFGF、KGFなどの増殖因子、フィブリン、トロンビン、RGDペプチ ドなどが挙げられる。 抗増殖剤：抗増殖剤には、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、メトトレキ セートのような葉酸アンタゴニスト、メルカプトプリン、アザチオプリンのよう なプリンアンタゴニスト、およびフルオロウラシル、シタラビンのようなピリ ミジンアンタゴニストが含まれる。 抗酸化剤：抗酸化剤は組織の酸化的損傷を防止する薬剤であり、アスパルテー ト、オロテート、トコフェロール誘導体（ビタミンＥ）、フリーラジカル捕捉剤 、例えばSOD、グルタチオンなどが含まれる。 哺乳動物細胞はスーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重 項酸素のような活性酸素種に絶えずさらされている。これらの活性酸素中間体は 好気的代謝作用、薬物や他の生体異物の異化作用、紫外線とＸ線、および侵入性 細菌（例えば、傷口から侵入するもの）を殺すための食細胞（例えば、白血球） のレスピラトリーバースト(respiratory burst)に応答して細胞がin vivoで生成 するものである。例えば、過酸化水素はほとんどの生物の呼吸中に、特にストレ スや損傷を受けた細胞によって産生される。 活性酸素種は細胞を傷つけることがある。こうした損傷の重要な例は不飽和脂 質の酸化的分解を伴う脂質の過酸化である。脂質の過酸化は膜の構造および機能 にとって非常に有害であり、多くの細胞病理学的作用を引き起こしうる。細胞は スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼといったラジカ ル捕捉剤を産生することによって脂質過酸化から防衛しているが、損傷を受けた 細胞はラジカル捕捉剤を産生する能力が低下している。過剰の過酸化水素がDNA と反応すると、バックボーンの分解が起こったり、突然変異が生じたり、塩基が 改変されたり遊離したりする。また、過酸化水素がピリミジンと反応すると、5, 6-二重結合が開いてしまい、この反応は相補的塩基と水素結合するピリミジンの 能力を阻害する(Hallaenderら(1971))。このような酸化的生化学的損傷は細胞膜 の完全性の低下、酵素活性の低下、輸送速度の変化、膜の脂質含量の変化、カリ ウムイオン、アミノ酸および他の細胞性物質の漏出をもたらすことがある。 抗酸化剤は活性酸素種と関連した損傷を防止することが見出された。例えば、 ピルビン酸や他のα-ケト酸は過酸化水素と迅速かつ化学量論的に反応して細胞 溶解作用から細胞を保護することが報告された(O'Donnell-Tormeyら，J．Exp.Me d.，165，pp.500-514(1987))。 抗感染剤：抗感染剤は感染を阻止する薬剤であり、抗ウイルス薬、抗真菌薬お よび抗生物質が含まれる。 抗ウイルス薬：抗ウイルス薬はウイルスを抑制する薬剤であり、ビダラビン、 アシクロビルおよびトリフルオロチミジンが含まれる。 抗真菌薬：抗真菌薬は真菌の増殖を抑制する薬剤である。抗真菌薬としては、 アンホテリシンＢ、ミコナゾール、ターコナゾール、エコナゾール、イソコナゾ ール、チオコナゾール、ビフォナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、 ブタコナゾール、イトラコナゾール、オキシコナゾール、フェンチコナゾール、 ニスタチン、ナフチフェン、ジノコナゾール、シクロピロキソールアミンおよび フルコナゾールが挙げられる。 抗生物質：抗生物質は各種の微生物、例えば細菌（バシラス属の種を含む）、 放線菌（ストレプトミセス属を含む）および真菌により産生される、他の微生物 の増殖を抑制したりまたは他の微生物を殺したりする、比較的低分子量の天然化 学物質である。構造および作用様式の類似した物質を化学的に合成することがで き、また、天然の化合物を修飾して半合成の抗生物質を製造することができる。 こうした生合成および半合成の誘導体も抗生物質として有効である。主なクラス の抗生物質は、(1)βラクタム、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、モノ バクタム：(2)アミノグリコシド、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、 ネチルマイシン、アミカシン；(3)テトラサイクリン：(4)スルホンアミドおよび トリメトプリム；(5)フルオロキノロン、例えば、シプロフロキサシン、ノルフ ロキサシン、オフロキサシン；(6)バンコマイシン；(7)マクロライド、例えば、 エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン；および(8)他の抗 生物質、例えば、ポリミキシン、クロラムフェニコール、リンコサミドである。 抗生物質はいくつかの作用メカニズムによりその抗菌作用を果たすものであり 、作用メカニズムは次のように類別される。すなわち、(1)細菌の細胞壁に作用 する薬剤、例えば、バシトラシン、セファロスポリン、シクロセリン、ホスホマ イシン、ペニシリン、リストセチン、バンコマイシン；(2)細胞膜に作用するか 洗浄作用を及ぼす薬剤、例えば、コリスチン、ノボビオシン、ポリミキシン：(3 )細胞の複製機構、情報伝達、およびリボソーム上でのその作用によるタンパク 質合成に影響を及ぼす薬剤、例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ク ロ ラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フシジン、リンコマ イシン、プロマイシン、リファンピシン、他のストレプトマイシン、およびエリ スロマイシンやオレアンドマイシンのようなマクロライド抗生物質；(4)核酸の 代謝に影響を及ぼす薬剤、例えば、フルオロキノロン、アクチノマイシン、エタ ンブトール、5-フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシン；および (5)中間代謝に影響を及ぼす薬剤、例えば、スルホンアミド、トリメトプリム、 および結核菌抑制剤であるイソニアジドおよびp-アミノサリチル酸に分類される 。一部の薬剤は、特に高濃度においては、２以上の主要な作用メカニズムを有す る。さらに、抗微生物薬の一次作用の後に、しばしば細菌細胞の構造または代謝 の二次的変化が起こる。 抗癌剤：抗癌剤は1種以上の癌に対して有効な天然または合成の分子である。 この定義は、その作用メカニズムによって細胞毒性である分子（抗癌化学療法剤 ）、免疫系を刺激する分子（免疫刺激剤）および脈管形成のモジュレーターを含 む。いずれの場合の結果も癌細胞の増殖を遅くすることである。 抗癌療法は一次性赤血球増加症や慢性白血病の治療に用いられる32Pのような 放射性同位元素を含む。放射性リンはヒトにおいて約8日の生物学的半減期を有 する。それは急速に増殖しつつある細胞に対して破壊作用を及ぼすβ線を発生す る。32Pは1日あたり約1mcの用量で5日間投与するのが普通である。投与経路は経 口であっても静脈内であってもよいが、その用量は大きく異ならない。放射性ヨ ウ素131I、放射性金198Auおよび他のアイソトープは32Pほど有効でない。それに もかかわらず、転移性の甲状腺癌においては131Iが用いられる場合がある。51Cr ，52Mn，52Mg，57Ni，65Coおよび56P，55Fe，103Pd，192Ir，64Cuおよび67Cuの ような他の放射性同位元素は放射性金属の錯体として、あるいは(BFCs)、6-[p-( ブロモアセトアミド)ベンジル]-1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8 ,11-テトラ酢酸(BAT)、6-[p-(イソチオシアナト)ベンジル]-1,4,8,11-テトラア ザシクロテトラデカン-1,4,8,11-テトラ酢酸(SCN-TETA)、4-[(1,4,8,11-テトラ アザシクロテトラデカ-1-イル)メチル]安息香酸(CPTA)、および1-[(1,4,7,10,13 -ペンタアザシクロペンタデカ-1-イル)メチル]安息香酸(PCBA)のような二官能性 キレート剤を用いた前記金属のキレートとして、我々の技術により使用す ることができる。 多数の薬物が新生物疾患の治療に有効な化学療法剤の範疇に入り、局所ドラッ グデリバリーおよび腫瘍部位における修飾薬物の保持のためのこの用途の実施形 態に従いやすい。この技術により誘導体化される薬剤として、代謝拮抗薬、例え ば、メトトレキセート（葉酸誘導体）、フルオロウラシル、シタラビン、メルカ プトプリン、チオグアニン、ペトスタチン（ピリミジンおよびプリン類似体また は阻害剤）；種々の天然産物、例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン（ ビンカアルカロイド）、エトポシドおよびテニポシド；種々の抗生物質、例えば 、マイトマイシン、プリカマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダノル ビシン、ダクトマイシン；種々の生物学的応答改変剤、例えば、インターフェロ ンα；種々の混成薬剤およびホルモン調節剤、例えば、シスプラチン、ヒドロキ シ尿素、ミトキサントロン(mitoxantorne)、プロカルボジン、アミノグルテチミ ド、プレドニゾン、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン（例：タモキ シフェン）、男性ホルモンステロイド、抗男性ホルモン剤（例：フルタミド）、 性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体（例：ロイプロリド）、マトリックスメタ ロプロテアーゼ阻害剤(MMPI)並びに抗癌剤、例えば、タキソール（パクリタキセ ル）およびタキソイド、タキシンまたはタキサンと集合的に呼ばれる関連分子が 挙げられる。 「タキソイド」の定義には、癌細胞増殖の抑制に有効であることがわかり、か つ当業者には公知の有機化学的方法により構築することができる基本的な環構造 （タキソイド核）の各種修飾体および結合体も含まれる。 化学療法剤にはポドフィロトキシン類とそれらの誘導体および類似体が含まれ る。本発明において有用な他の重要なクラスの化学療法剤はカンプトテシンであ る。 本発明において有用な他の好ましいクラスの化学療法剤はアンスラサイクリン 類（アドリアマイシンおよびダウノルビシン）である。 別の重要なクラスの化学療法剤は次のリストから引き出せる化合物である：タ キソテレ(Taxotere)、アモナフィド(Amonafide)、イルジンＳ(Illudin S)、6-ヒ ドロキシメチルアシルフルベン、ブリオスタチン1(Bryostatin 1)、26-スク シニルブリオスタチン1、パルミトイルリゾキシン(Palmitoyl Thizoxin)、DUP 9 41、マイトマイシンＢ、マイトマイシンＣ、ペンクロメジン(Penclomedine)、脈 管形成阻害剤化合物、シスプラチン疎水性錯体、例えば、塩化白金を含む2-ヒド ラジノ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾールおよび塩化白金を含む5-ヒドラジノ-3,4 −ジヒドロ-2H-ピロール、ビタミンＡ、ビタミンＥおよびその誘導体、特にトコ フェロールスクシネート。 本発明において有用な他の化合物には次のものが含まれる：1,3-ビス(2-クロ ロエチル)-1-ニトロソ尿素（「カルムスチン」(carmustine)または「BCNU」）、 5-フルオロウラシル、ドキソルビシン（「アドリアマイシン」）、エピルビシン 、アクラルビシン、ビスアントレン(ビス(2-イミダゾレン-2-イルヒドラゾン)-9 ,10-アントラセンジカルボキシアルデヒド、ミトキサントロン、メトトレキセー ト、エダトレキセート、ムラミルトリペプチド、ムラミルジペプチド、リポ多糖 類、ビダラビンおよびその2-フルオロ誘導体、レスベラトロール、レチノイン酸 およびレチノール、カロチノイド、およびタモキシフェン。 本発明の用途において有用な他の化学療法剤には次のものが含まれる：デカル バジン(Decarbazine)、ロニダミン(Lonidamine)、ピロキサントロン(Piroxantro ne)、アントラピラゾール類、エトポシド(Etoposide)、カンプトテシン(Camptot hecin)、9-アミノカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン、カンプトテシン-1 1（「イリノテカン」(Irinotecan)）、トポテカン(Topotecan)、ブレオマイシン 、ビンカ(Vinca)アルカロイド類およびそれらの類似体（ビンクリスチン(Vincri stine)、ビノレルビン(Vinorelbine)、ビンデシン(Vindesine)、ビントリポール (Vintripol)、ビンキサルチン(Vinxaltine)、アンシタビン(Ancitabine)）、6- アミノクリセン、およびナベルビン(Navelbine)。 本発明の用途において有用な他の化合物はタキソールのミメチック、エロイテ ロビン(eleutherobins)、サルコジクチン(sarcodictyins)、ジスコデルモリド(d iscodermolides)およびエポチオロン(epothiolones)である。 RGDペプチド：本発明に従って組織または固定性の内因性タンパク質に結合す るためのRGDペプチドは次の式： R1-Arg-Gly-Asp-R2 を有するアミノ酸（好ましくは、天然のL-アミノ酸とグリシン）の配列を含む。 上記式において、R1およびR2は1個のアミノ酸もしくは1個より多いアミノ酸の 配列、または1個以上の誘導体化されたもしくは化学修飾されたアミノ酸を表す 。 送達デバイス：送達デバイスは治療薬の局所送達に有用なデバイスである。送 達デバイスとしては、カテーテル、シリンジ、トロカール、内視鏡なとがある。 反応性成分：反応性成分とは、共有結合を形成することができる成分のことで ある。このような反応性物質が対象となる治療薬に連結または結合される。反応 性成分は一般に水性環境中で安定しており、通常は、カルボキシ、ホスホリル、 または（エステルもしくは酸無水物としての）便利なアシル基、またはイミデー トであり、それにより標的部位のアミノ基と共有結合を形成してアミドまたはア ミド誘導体を生成することができる。たいていは、エステルはフェノール系化合 物を含むか、チオールエステル、アルキルエステル、リン酸エステルなどである 。 反応性成分は通常標的部位のアミノ基と反応するように選択されるが、標的部 位の他の反応性官能基を利用することもできる。例えば、反応性成分は標的部位 の利用可能なヒドロキシル基との結合のために種々のホスフィニルまたはホスホ ニル誘導体を含んでいてもよく、また、チオール基との結合のためにイミン、チ オイミンまたはジスルフィドを含んでいてもよい。 反応性官能基：反応性基との共有結合の形成のために脈管タンパク質上の利用 可能な反応性官能基は一級アミノ、カルボキシルおよびチオール基である。反応 性成分の標的としてこれらの基のどれを使用してもよいが、たいていはアミノ基 との結合が用いられ、特にアミド結合が形成される。 アミド結合を形成するために、二官能性分子の反応性官能基として種々の活性 カルボキシル基を用いることができ、特にヒドロキシル基が必要とされるレベル で生理的に許容される場合はエステルが用いられる。いくつかの異なるヒドロキ シル基を用いることができ、最も便利なものはN-ヒドロキシスクシンイミドおよ びN-ヒドロキシスルホスクシンイミドであるが、脈管環境内で機能する他のアル コール類を使用してもよい。いくつかの場合には、反応をin vivoで行うのかin vitroで行うのか、標的、反応性成分の特異性などに応じて、アジド、ジア ゾ、カルボジイミド、酸無水物、ヒドラジンまたはチオール基などの特殊な試薬 を使用する。 IC50：酵素活性の50％が阻害される酵素阻害剤の濃度。 保護基：保護基は反応性成分がそれ自体と反応するのを防止するために利用さ れる化学的成分である。種々の保護基が米国特許第5,493,007号に記載されてお り、それを参照によりここに含めるものとする。かかる保護基として、アセチル 、フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)、t-ブチルオキシカルボニル(BOC )、ベンジルオキシカルボニル(CBZ)などがある。 連結基：連結基は反応性成分を治療薬に連結または結合する化学的成分である 。連結基は1以上のアルキレン、アルキレンオキシ、アルケニレン、アルキニレ ンまたはアルキル基で置換されたアミノ基；シクロアルキレン基、多環式基、ア リール基、ポリアリール基、置換アリール基、複素環式基、および置換複素環式 基を含みうる。連結基はその鎖中に2〜100個、通常は2〜18個、好ましくは6〜12 個の原子を有し、特に炭素、酸素、リンおよび窒素、中でも炭素と酸素を含むだ ろう。発明の詳細な説明 これらの定義を考慮に入れて、第1の態様では、本発明は治療薬の局所送達に 関する。該治療薬は共有結合反応するように反応性成分(reactive entity)で修 飾しておくことにより、in vivoにて固定性血液成分上の反応性官能基へ結合し 、治療薬の半減期を増大させる。 本発明の誘導体化治療薬は、通常以下の式 X-Y-Z （式中、Ｘは創傷治癒剤、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、免疫抑制 剤、抗感染剤および化学療法薬からなる群より選択される） を有するものである。 式中、Yは0〜30個、より一般的には2〜12個、好ましくは4〜12個の原子、特に 炭素、酸素、リンおよび窒素、より具体的には炭素および酸素からなる連結基で あり、酸素は好ましくはオキシエーテルとして存在し、Yはアルキレン、オキシ アルキレン、またはポリオキシアルキレン等であってもよく、オキシアルキレン 基は2〜3個の炭素原子を有する。XをZのできるだけ近くに配置したい場合には、 酸素原子からなる連結基が好ましい。 式中、Zはカルボキシ、カルボキシエステル（該エステル基は1〜8個、より一 般的には1〜6個の炭素原子からなる基である）等の反応性成分であり、特に、水 系におけるアミノ基との反応のため、カルボキシカルボニルを活性化する生理学 的に許容し得る脱離基であり、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N- ヒドロキシスルホスクシンイミド(sulfo-NHS)、マレイミド-ベンゾイル-スクシ ンイミド(MBS)、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS) およびマレイミドプロピオン酸(MPA)、N-ヒドロキシスクシンイミドイソシアネ ート、イソチオシアネート、チオールエステル、チオノカルボン酸エステル(thi onocarboxylic acid ester)、イミノエステル、混成無水物（例えば、カルボジ イミド無水物）、炭酸エステル等が挙げられる。 誘導体化治療薬の化学反応性成分との共有結合に利用できるタンパク質上の反 応性官能基は、主にアミノ基、カルボキシル基およびチオール基である。これら はいずれも治療薬上の化学反応性成分の標的として使用できるものの、多くの場 合、アミノ基への結合が利用され、特にアミド結合の形成を伴う。アミド結合を 形成するためには、化学的に反応性の基として広範な活性カルボキシル基（特に エステル）を用いることができ、ヒドロキシル部分は必要なレベルで生理学的に 許容し得るものである。多くの異なるヒドロキシル基を利用することができるが 、最も便利なのはN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)およびN-ヒドロキシスルホ スクシンイミド(sulfo-NHS)、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド(MBS)、γ -マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)およびマレイミドプ ロピオン酸(MPA)であり、血液等の水性媒体中で機能し得る他のアルコールを使 用してもよい。ある場合には、特定の試薬、例えばアジド、ジアゾ、カルボジイ ミド、無水物、ヒドラジン、ジアルデヒド、チオール基、またはアミンを使用し てアミド、エステル、イミン、チオエーテル、ジスルフィド、置換アミン等を形 成することができる。通常、形成される共有結合は、解離部位を意図したもので ない限り、血液または組織成分の寿命の間維持できるものでなければならない。 本発明の好適な実施形態では、このタンパク質上の官能基はチオール基であり、 化学的に反応性の基はGMBAまたはMPA等のマレイミド含有基である。GMBAはγ-マ レイミド-ブチリルアミドのことである。 本発明の誘導体化治療薬を製造する方法は、分子を構成する各種元素の性質に 応じて様々である。合成手順は、単純かつ高収率をもたらし、高純度の生成物が 得られるものを選択する。通常、化学的に反応性の基は、最終段階として例えば カルボキシル基を用いて構築し、活性エステルを形成するエステル交換を合成の 最終工程とする。本発明の誘導体化治療薬を製造する方法を実施例1〜6に記載す る。リンカーおよび反応性剤を用いて誘導体化を行うために選択した各治療薬を 、以下の基準に従って修飾する：元の分子上で薬理活性の保持に重要ではないカ ルボキシル基が利用でき、かつ他の反応性官能基が分子上に存在しない場合には 、リンカー-反応性成分修飾用の結合点としてカルボン酸を選ぶ。カルボン酸が 利用できない場合には、薬理活性の保持に重要ではない任意の他の官能基をリン カー-反応性成分修飾用の結合点として選択する。治療薬上で複数の官能基が利 用できる場合には、リンカー／反応性成分を添加し、かつ保護した官能基全てを 脱保護した後でも薬理活性が依然として保持されるような保護基の組み合わせを 用いる。治療薬上で反応性官能基が利用できない場合には、生物学的活性および 受容体特異性または標的特異性が保持されるような方法で、合成による元の親薬 剤の修飾を試みる。 化学反応性成分は、治療薬が固定性血液成分へ結合した際に、治療薬が親化合 物の抑制活性のかなりの割合を保持するような部位にある。 本発明の誘導体化治療薬は実質的にIC50値が低く、通常親分子のIC50である約 0.5〜0.01の範囲である。望ましくは、IC50は0.05以上、好ましくは約0.1以上で なければならない。IC50値が変われば、投与する誘導体化治療薬の量も変わる。 リンカーの性質および長さの決定は経験に基づいて最適化することにより行い 、生物学的活性の保持または喪失によって判断する。例えば、所定の阻害剤-酵 素相互作用を用いて、リンカーの性質および長さの改変と生物学的な酵素活性の 測定を繰り返すことが、最も有利なリンカーの長さと性質を決定するのに必要で ある。好ましくは、容易に合成される4〜12原子からなる短い親水性リンカーか ら反復プロセスを開始するのが有利である。 放射性標識治療薬の場合には、放射性同位元素の性質およびその浸透(penetra tion)に基づいて、標的から最短距離となるよう注意しなければならない。リン カーの長さおよび性質は、酵素-阻害剤の組合せの場合と比べてあまリ重要では ない。例えば、32Pのようなβ線を放射する放射性同位元素は、最大効率(99％) を有するには標的から5mm以内に位置しなければならないが、リンカーの性質お よび長さのわずかな変化による影響は限られているか、もしくは全くない。 反応性成分は、in vivoで適用されるため、反応性成分の大部分が反応性官能 基と最短時間で反応するように選ばなければならない。外科的な適用では、生物 学的な制約（例えば、動脈血流の中断）のため、最大インキュベーション時間が 3分である場合もある。ex vivoで行われる脈管移植のような他の外科的介入では 、移植片組織が適切な保存条件下で維持されていれば、かかる時間が数分または 数時間のものもある。従って、反応性成分は、反応性官能基との反応速度に応じ て適用の種類ごとに違っていてもよい。好ましくは、添加した分子の1〜30％が 標的反応性官能基へin vivoにて3分のインキュベーション時間内で結合する。よ り好ましくは、反応性成分の10〜90％が反応性官能基へin vivoにて3分以内で結 合する。最も好ましくは、反応を5分以内で終わらせる。ex vivo添加(loading) の場合には、分子の10％を反応性官能基へ3分以内に添加する。好ましくは、反 応性成分の10〜50％を反応性官能基へ3分以内に添加する。最も好ましくは、反 応を15分以内で終わらせる。 修飾した治療薬は、標準的なバルーンカテーテルによって、注入した薬剤物質 が効率的に分布するよう圧力もしくはイオン電気導入を利用して注入するか、ま たは薬剤が目的の部位へ局所送達されるよう標準的な注入、洗浄もしくは局所適 用技術によって導入する。薬剤を適切な連結基で修飾することにより、脈管壁に おいて露出タンパク質と結合した場合にも活性を維持する。非特異的NHSもしく は他の架橋剤を使用して、または特定のタンパク質に対する部位特異的共有結合 親和性プローブを使用してin vivo共有結合を達成する。一旦結合すれば、修飾 薬剤の生物活性は維持される。治療薬の共有結合によって、既存の方法または局 所薬剤送達よりも時間的に優れた長期にわたる効果が得られる。 本明細書に記載の技術から、以下のものを含む治療用途の広い範囲にわたる適 用が明らかである： １．RGD ペプチド A. 創傷治癒を改善するためのRGDペプチド Osteopontin等のRGD(Arg-Gly-Asp)を含有するペプチドおよびタンパク質は、 動物モデルにおいて創傷治癒を促進することが認められている。これらのペプチ ドが作用すると考えられるメカニズムは、繊維芽細胞の刺激と上皮細胞の遊走お よび創傷への接着を介したものである。RGD含有ペプチドは特定の受容体、即ち 、これらの細胞上にあるα(v)β3インテグリン受容体へ結合する。この受容体は 接着と遊走を刺激するものである。RGD含有ペプチドは、ヒトの臨床治験では創 傷治癒の改善、即ち、促進または強度増加に成功していない。これらのペプチド は、皮膚の潰瘍／創傷における滞留時間が短すぎたり、創傷の下層にある固定性 構造への結合が不十分だったりするため、作用を発揮できない可能性が大である 。 本発明に有用なRGD含有ペプチドの例は、以下の通りである： 本出願の主題であるペプチド等のRGD含有ペプチドは、反応性化学を使用して 創傷の下層に共有結合することができ、適切なスペーサー／リンカーと組み合わ せれば、従来慣用のRGD含有ペプチドよりも創傷治癒要素に長く正しく提示させ ることが可能である。α(v)β3受容体を介した繊維芽細胞および上皮細胞等の細 胞性創傷治癒要素への結合および接着は、本出願で使用する化学では変化しない 。 本明細書に記載の薬剤製品は、皮膚の創傷および切開（火傷、皮膚潰瘍、栄養 障害性潰瘍、糖尿病性潰瘍、外科的切開、皮膚移植片の採取部位および受容部位 、外科的皮弁修復、切除生検部位、フィステル、亀裂、並びに胃、十二指腸、結 腸または直腸の消化管潰瘍形成部位を含む）へ局所適用することができる。この 薬剤はまた、腸もしくは他の臓器の融着部位、または腹膜、胸膜もしくは粘膜の 表面へ適用して修復および治癒を刺激することもできる。この薬剤は、物理的に 潅注もしくは洗浄して、または酵素処理(enzymatic preparation)およびヒアル ロニダーゼ、パパイン等の薬剤で洗浄して適切な挫滅組織切除を行った後、生身 の露出した表面へ適用する。 薬剤は、洗浄を行ったわずかに水分を含む創傷表面へ、水溶液の状態で、DMSO 溶液の状態で、粉末、エーロゾル化ミスト、軟膏、ローション剤、乳剤として、 またはフィルムとして、または包帯もしくはラップの成分として適用することが できる。未反応の薬剤は、例えば5〜20分適用した後に除去することができる。 創傷は感染症を防いで清浄に維持しなければならず、適用後に湿乾包帯(wet tod ry dressing)を当てることが多い。 B. 抗脈管形成剤としてのRGDペプチド 腫瘍転移は、各種宿主細胞（内皮細胞、血小板、リンパ球）と細胞外マトリッ クス（例えば、コラーゲンIおよびIV、フィブロネクチン、ラミニン並びに硫酸 化グリコサミノグリカン）との相互作用を含む一連の工程を特徴とする。細胞と 細胞外マトリックス成分との相互作用は、インテグリンと呼ばれる細胞表面受容 体によって調節されている。細胞外マトリックスに含まれる接着分子由来の合成 ペプチドのうちいくつかは、腫瘍細胞の転移機能に係わるメカニズムをモジュレ ートすることが判明している。例えば、複数のインテグリンによって、正常細胞 および腫瘍細胞の細胞外マトリックス成分への接着を仲介するアミノ酸配列RGD が認識される。 脈管形成は、マトリックス分解、細胞の増殖および遊走並びに再コロニー化を を含む多段階プロセスであり、そのプロセス中、毛管内皮細胞は正常細胞の細胞 接着を制限し、細胞外マトリック ス中を遊走し、細胞間接着を再形成して新しい毛管を構築する。 C. 抗再狭窄剤としてのRGDペプチド 再狭窄は、脈管形成療法を受けた患者の大部分で起こる複雑な脈管創傷治癒に よって生じるものである。最近の研究から、内膜過形成をもたらす細胞増殖プロ セスと脈管のリモデリングが再狭窄現象（脈管形成術後の脈管の狭窄としても記 載される）の原因であることが示唆されている。Srivatsaら(Cardio Res 199736 :408-428)は、RGDペプチド疑似体によって、重篤なブタ冠状動脈損傷後の新生内 膜過形成(neointimal hyperplasia)と管腔狭窄が抑えられることを示している。 彼らはまた、最大の抗再狭窄効力を達成するためには、損傷後14日以上α(v)β( 3)の薬理学的遮断を持続させる必要があることも指摘している。Spelianら(Circ ulation 1998 97:1818-27)は、環状RGDペプチドを、バルーンによって損傷を受 けたラット頚動脈の外膜表面へ局所送達することにより、バルーンによる損傷後 14日で平滑筋細胞の遊走が有意に減少し、新生内膜の肥厚が減少することを示し ている。本出願の主題であるペプチド等のRGD含有ペプチドは、脈管形成術を行 った部位へ共有結合可能であり、α(v)β(3)受容体の薬理学的遮断を14日間以上 持続させて最大の抗再狭窄効力を可能にすべきものである。 本発明に従って組織または固定性の内在タンパク質へコンジュゲートさせるRG Dペプチドとしては、以下の式： R1-Arg-Gly-Asp-R2 を有するアミノ酸（好ましくは天然のL-アミノ酸およびグリシン）の配列が挙げ られる。 この式中、R1およびR2は、アミノ酸、または2個以上のアミノ酸からなる配列 、または誘導体化もしくは化学修飾アミノ酸、または2個以上の誘導体化もしく は化学修飾アミノ酸を表す。 特定の実施形態では、R1はXY(Z)n（式中、X、YおよびZは独立にアミノ酸を表 し、nは0または1を表す）を表し、R2はOHもしくはNH2、または任意のアミノ酸、 または2個以上のアミノ酸からなる配列、または誘導体化もしくは化学修飾アミ ノ酸を表す。特定の実施形態では、R2はセリン、トレオニンもしくはシステイン 以外のアミノ酸、またはこれらのアミド（アミノ酸がカルボキシアミドになって いる）を表す。別の特定の実施形態では、R2は2個以上のアミノ酸であり、その 配列中、アスパラギン酸に結合する第一アミノ酸はセリン、トレオニンもしくは システイン以外であるか、または任意の遊離カルボキシル基のアミドであり、こ の場合、R2は誘導体化もしくは化学修飾アミノ酸を含む。 好適な実施形態では、R2は、タンパク質上の反応性官能基へ共有結合する化学 反応性基を有する連結基を含み、R1は、R2の化学反応性基がR1と反応するのを防 ぐ保護基を含む。別の実施形態では、R1は、タンパク質上の反応性官能基へ共有 結合する化学反応性基を有する連結基を含み、R2は、R1の化学反応性基がR2と反 応するのを防ぐ保護基を含む。 さらに別の実施形態では、R1およびR2は両者とも、固定性タンパク質上の官能 基へ共有結合する化学反応性成分を有する連結基を含む。この実施形態では、連 結基は同一でも異なっていてもよい。 本発明のRGDペプチドでは、R1およびR2は任意のアミノ酸またはその配列を含 んでいてもよい。アミノ酸は、好ましくは天然のものである。最も一般的な天然 アミノ酸を表1に示す： しかしながら、本発明のRGDペプチドのR1およびR2は、20個の天然アミノ酸に 限定されない。他の実施形態では、R1およびR2は、D-アミノ酸、一般的ではない アミノ酸、または環状ペプチド、またはペプチド疑似体（化学的なペプチド類似 体）であってもよい。一般的ではないアミノ酸としては、限定するものではない が、通常のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、ヒドロキ シプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブ チルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、デ ザイナーアミノ酸(designer amino acid)(β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミ ノ酸、Nα-メチルアミノ酸等)、およびアミノ酸類似体一般が挙げられる。 さらに、RGD配列のArgおよび／またはAspは、D(右旋性)またはL(左旋性)アミ ノ酸のいずれであってもよい。 R1および／またはR2がアミノ酸の配列である場合、配列に含まれるアミノ酸の 数を限定する必要はない。従って、固定性血液タンパク質へコンジュゲートさせ るポリペプチドは任意のサイズであってよく、オリゴペプチドとも呼ばれるもの 、タンパク質、有機分子、またはポリエチレングリコール等のポリマーを包含す る。好ましくは、ポリペプチドは約1,000個以下のアミノ酸を有するものである 。 ポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法により調製することができる。例 えば、簡単に言うと、固相ペプチド合成は、C末端アミノ酸のカルボキシル基を 樹脂へカップリングさせ、続いてN-α保護アミノ酸を添加することからなる。保 護基は当該技術分野で公知の任意のものであってよい。新しいアミノ酸をそれぞ れ伸長中の鎖へ添加する前に、この鎖へ先に添加したアミノ酸の保護基を除去す る。適切な樹脂へのアミノ酸のカップリングは、Rivierらの米国特許第4,244,94 6号に記載されている。このような固相合成は、例えば、Merrifield，1964，J． Am．Chem．Soc．85:2149;Valeら，1981，Science 213:1394-1397;Markiら，1981 ，J．Am．Chem．Soc．103:3178並びに米国特許第4,305,872号および同第4,316,8 91号に記載されている。 タンパク質および他の固定性血液タンパク質とコンジュゲート可能なRGDペプ チドの誘導体およびその類似体は、当該技術分野で公知なように、タンパク質上 の反応性官能基に共有結合する化学反応性基を有する連結基を使用して調製する 。 ２．消化管潰瘍の治療 インテグリン、増殖因子および細胞接着分子は、本明細書に開示のNHS/リンカ ー技術を使用して修飾することができ、その結果、内視鏡によって病変部へ局所 適用すれば、食道潰瘍、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の基底(base)に共有結合する であろう。局所適用した増殖因子（GF、PDGF、IGF、bFGF、aFGFおよびKGFが挙げ られるが、これらに限定されない）並びに上述したようなインテグリンおよび細 胞接着分子が高レベルに維持されることで、再上皮化や潰瘍治癒が刺激されるで あろう。NSAIDS、ステロイドおよび他の抗炎症性薬剤も、本出願人らの技術で修 飾して潰瘍治癒剤とすることができる。 さらに、潰瘍部分におけるこれらの治療薬の局所濃度を高レベルに維持して治 癒を促進させるためには、Heliobacter pyloriiを死滅または不活化するように 設計された硫酸ビスマス等の抗菌剤または静菌剤を消化性潰瘍の基底に適用する ことができる。H．pyloriiは消化性潰瘍の病因因子として認められており、この 菌が潰瘍に長く留まると治癒の妨げとなることが判っている。 ３．癒着を防止するための術中投与 腹腔内および胸控内手術は癒着を併発することが多く、手術後数週間から数ヵ 月で症状が現れる。これらの癒着は気付かれることなく大事に至らないかもしれ ないが、多くの場合、手術後数ヵ月から数年で器官もしくは内臓（例えば、腸） の機能に関連した問題を引き起こすか、または再手術が必要なほど耐え難い痛み を引き起こす可能性がある。スペーサーを介してNHSへカップリングさせた細胞 接着分子およびマトリックス接着分子からなる抑制剤等の抗炎症性ペプチドおよ び抗炎症住薬剤を用いて、手術時に小腸吻合または大腸吻合の癒着傾向のある重 要な部位へ局所適用すれば、癒着を防止することができる。 ４．出血を防止するための術中投与 フィブリン、トロンビンまたは組織因子ペプチド、およびこれらの断片、並び に他の凝血促進性タンパク質および凝血促進性薬剤を、NHS/リンカー技術を使用 して身体の出血部位へ結合させ、止血を行って出血を防止することができる。こ れらの薬剤は、切開手術、腹腔鏡下手術、または他の侵襲性の低い手術（関節鏡 検査、胸腔鏡下手術(thorascopic surgery)、または骨盤腔鏡下手術(culdoscopi c surgery)および内視鏡下手術が挙げられるが、これらに限定されない）の際に 出血部位へ局所投与することができる。これらの薬剤を使用して、動脈切開術後 の出血を防止することができ、また、カテーテル（例えば、血管造影用カテーテ ル、血管形成用カテーテル、血液透析用カテーテルまたは血液灌流用カテーテル ）による動脈穿刺後の部位における局所出血を防止して穿刺後出血の危険性を軽 減することができ、また、分娩後の子宮内出血もしくは機能不全性不正子宮出血 を防止することができる。これらの薬剤はまた、心臓手術後の胸腔内大出血、脳 手術後の頭蓋内大出血、または動脈瘤修復後の頭蓋内、胸腔内もしくは腹腔内大 出血を防止するのに非常に有用である可能性もある。 ５．眼科手術 本発明の技術を用いて、抗増殖剤の体内貯留および局所作用を左右し、眼科手 術において癒着を防止および/または最小限にとどめることができる。とりわけ この技術は、緑内障の前房手術時に用いて小柱網または前房吸収器官の領域にお ける増殖性組織の術後増殖を防止することができる。さらに、NHSエステルで誘 導体化したプロテアーゼ阻害剤の局所使用は、細菌による強膜損傷を阻止し、網 膜に直接注射すれば脈管形成および黄斑変性を阻止することができる。 ６．泌尿器 泌尿器科領域では術後出血が一般的に認められ、上述の凝血促進剤をリンカー 技法によって反応性のNHSエステルとカップリングさせれば、膀胱鏡下でもしく は切開手術領域で、出血している可能性のある部位に局所適用することができる 。本発明の技術は、TURPを含むがそれに限定されない前立腺手術、または切開前 立腺切除術、ポリープ摘出、膀胱癌摘出もしくは部分的膀胱切除術の術後出血を 防止するために適用することもできる。本技術を使用して、静菌剤もしくは殺菌 剤を手術中に膀胱鏡を介して、またはMeyカテーテルおよび膀胱灌注によって手 術後に適用することにより、感染の治療を行うことができる。抗炎症剤も同様に 術後の尿道狭窄形成を防止するために適用することができる。 ７．内視鏡 食道手術後の、またはBarrett食道もしくは重症逆流性食道炎などの良性の原 因による食道狭窄形成の予防と治療に、同じ技術を用いることができる。メチル キサンチン(ペントキシフィリン、アミノフィリン、テオフィリン、および関連 誘導体)などのホスホジエステラーゼ阻害剤の内視鏡下適用並びに選択された抗 炎症剤の局所共有結合は、急性の喘息発作もしくは嚢胞性繊維症の患者の管理に 有用である可能性がある。 ８．胆嚢手術 NHS/リンカーをカップリングさせた抗炎症剤もしくは上述のような静菌/殺菌 剤を、開腹もしくは腹腔鏡下での胆嚢手術中に、癒着、狭窄、及び感染を防ぐ目 的で吻合/切除部位に局所適用することができる。 ９．結腸鏡下での使用 本技術を使用して、炎症性腸疾患(IBD)の管理下でステロイド、NSAIDS、およ びアスピリンなどの選ばれた小分子の抗炎症剤を適用し、かつ局所濃度を高く維 持することができる。クローン病もしくは潰瘍性大腸炎によって引き起こされた 結腸の炎症部位へ、治癒の促進、炎症の低減、および狭窄形成の防止のためにセ レクチンおよび細胞接着阻害剤および抗増殖剤を局所適用することができる。 10．脊髄および末梢神経 リンカーを介してNHSへカップリングさせたTRHまたはNGF、BNDF、CNTF、PTN、 MK、もしくはNT IIなどの神経栄養性増殖因子を、切断されたもしくは損傷した 脊髄または傷ついたもしくは切断された末梢神経の切開修復手術中に、本技術を 用いて局所適用し、神経再生を改善することができる。 11．肺 本技術を使用して、抗炎症剤および抗菌剤を気道の生検部位もしくは狭窄部位 （気管支内で確認および透視された場合）へ適用することができる。また同様に 、リンカーを介してNHSエステルへ結合させた凝血促進因子/ペプチドを生検後に 局所適用することにより、止血を行うことができるか、また止血を補助をするこ とができる。リンカーを介してNHSエステルへ結合させた選択されたトロンビン 阻害剤を局所適用することにより、肺小細胞癌の増殖阻害を補助することができ 、また外科的切除術の併用療法とすることができる。 12．歯科 出血及び感染防止のために抜歯後の歯槽へ凝血促進剤と抗菌剤を適用すること ができる。テトラサイクリンなどの選ばれた抗生物質を局所適用し、長期間その 薬剤をその部位に接着させておくことによって歯肉炎および歯肉の崩壊に伴って 出現するプロテアーゼを阻害することができる。 13．ENT 手術 同様の様式で、これらの凝血促進剤および抗菌剤をリンカーを介してNHSへカ ップリングさせたものを頭部および頸部へ、腫瘍切除などの手術中に出血及び感 染防止のために局所適用することができる。NHSへカップリングさせた凝血促進 剤は鼻出血、特に薬剤の到達と制御が困難な再発性の重篤な中隔後出血(posteri or septal bleed)に対して局所適用することができる。 14．腫瘍内適用 このNHS/リンカー技術を用いて、数日間から数週間にわたって持続的に腫瘍細 胞を殺滅するために腫瘍内に抗癌剤を緩徐にかつ持続的に放出させることが可能 である。このことは反応性のNHSエステルへリンカー技術を介して抗増殖剤をカ ップリングさせたものを腫瘍内に注射することによって可能となる。NHSへカッ プリングさせた薬剤は注射後、腫瘍の吻合部および細胞の構成要素と反応しこれ らの定着部位から腫瘍内へ結合部位を分解することによって徐々に放出させるこ とができる。 15．カテーテルを用いた放射線治療 放射性インプラントを置換するものとして、あるいは放射性液体の注射に替わ るものとして多くの用途が考えられている。192Irおよび32Pは、以前に再狭窄を 起こした患者において冠状動脈再狭窄を減少させることが知られている。冠状動 脈内放射線療法は再狭窄の一部である内膜過形成を減少させることが示されてい る。137Cs、89Srおよび90Sr、32P、ヨウ素125Iおよび131I、192Ir、90Y、90Y/Sr 、ビスマス、ラジウムが、口腔内、口唇、乳房、肛門、膣、甲状腺、骨髄、肺、 および前立腺などの各種の癌の体内治療に用いられる。多くの癌では術前および 術中の放射線治療は腫瘍の縮小もしくは腫瘍拡大の危険性を減少させることが示 されている。体内放射線治療は術後に残存している可能性のある微小量の癌を殺 滅させるためにも用いられる。 これらの同位元素はすべて腫瘍そのものもしくは腫瘍の周辺に共有結合でき、 待期療法、治療的処置、根治療法のいずれかに、または他の療法の補助薬として 用いることができるであろう。 例えば、32PはNHSホスホジエステルもしくはトリエステルを用いることによっ て、組織もしくは膜タンパク質へ共有結合させることができる。 その他の放射性同位元素も51Cr、52Mn、62Mg、57Ni、55Coおよび58P、55Feな どの放射性金属の錯体として、もしくはこれらの金属のキレートとして本出願人 の技術と併用することができる。好ましい放射性同位元素はβ線およびγ線放射 物である。 16．免疫抑制活性 免疫応答性および移植臓器拒絶を防ぐために移植前に臓器に局所適用するには 、シクロスポリンおよびその誘導体、コルチコステロイド、スルファサラジン、 サリドマイド、メトトレキセート、OKT3、ペプチド-T、またはＴ細胞の活性化も しくは接着を阻害する薬剤などの各種の免疫抑制剤が有用である。このような薬 剤は組織を摘出(例えば心臓、肺、肝臓の摘出)する際、もしくばレシピエントに おいて血流を再開させる直前に局所適用することができる。このような免疫抑制 剤は、ドナー組織由来の外来性抗原が認識されることを防ぐことによって、宿主 への短期間での受容を容易にし、また移植された臓器がより長期間生着すること を容易にする。 17．心臓内への送達 選択された薬剤を数日間から数週間の期間にわたって持続的に存在させる目的 で本発明のNHS/リンカー技術を用いれば、選択された薬剤を心臓内へ緩徐にかつ 持続的に存在させることが可能である。そのような薬剤は開胸手術もしくは開心 術を行っている間に、心膜送達用カテーテル、経皮送達カテーテルによって、も しくは心外膜、心筋、および心内膜へ直接注射することによって送達し得るであ ろう。このようなやり方で送達し得る薬剤としては、次のもののNHS誘導体が挙 げられる：心拍数および拍動障害を制御するためのジソピラミド、キニジン、ア ミオダロンなどの抗不整脈剤；心外膜炎を制御するために心外膜腔へ投与される 抗生物質もしくはコルチコステロイドなどの抗炎症剤；局所的な脈管再生を誘導 するためのVEGFもしくはFGFなどの増殖因子；機能不全に陥った心臓で収縮力お よび拍出率を改善するためのメチルキサンチン、ジギタリス、もしくはホスホジ エステラーゼ阻害剤などの強心剤。 18．骨髄内への送達 選択された薬剤を数日間から数週間の期間にわたって持続的に存在させる目的 で本技術を用いれば、選択された薬剤を脊髄内へ緩徐にかつ持続的に存在させる ことが可能である。白血病を治療するための化学療法を提供するか、もしくは前 駆血液細胞の産生を容易にする増殖因子を提供するために、そのような薬剤を長 骨の脈管腔へ送達することができる。そのような増殖因子としては顆粒球コロニ ー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/単球コロニー刺激因子(GM-CSF)、エリスロポエチン 、トロンボポエチン、インターロイキン-3が挙げられる。 19．脈管内への送達 選択された薬剤を数日間から数週間の期間にわたって持続的に存在させる目 的で本発明のNHS/リンカー技術を用いれば、選択された薬剤を心臓血管系構造体 (動脈/静脈)内へ洗浄もしくはカテーテル送達によって緩徐にかつ持続的に存在 させることが可能である。そのような目的に用いられる薬剤としては、抗血栓剤 、再狭窄を防ぐための抗増殖剤(メトトレキセート、コルヒチン、アンギオペプ チン、もしくはヘパリン誘導体など)、動脈瘤および再狭窄に伴う脈管の破綻を 防ぐためのプロテアーゼ阻害剤、増殖を抑えるための放射線療法もしくはDNA送 達、脈管の形成を抑えるためのエンドスタチンもしくはアンギオスタチンのNHS 誘導体またはオリゴヌクレオチド、cDNA、もしくは裸のDNAなどの脈管形成抑制 剤、脈管再生を促進する増殖因子VEGF、FGFが挙げられる。ニトロプルシドなど のニトロソ供与体もしくはその他の酸化窒素供与体などの薬剤が、損傷を受けた 組織での正常な脈管機能の回復に有益であろう。再開通、脈管形成術もしくはス テント配置(placement)などの損傷に応答して引き起こされる白血球細胞の接着 を阻害して脈管損傷および炎症を抑制する目的のために、オリゴ糖、シクロデキ ストラン、もしくはマンノース誘導体などのその他の薬剤を、脈管内腔の界面に NHS誘導体化を介して共有結合させることができる。そのような薬剤の組織での 保持および薬剤送達を改善するために、ある部位への配置および共有結合性の接 着を促進し、細胞へのローディングと取り込みを増強するには、反応性の官能基 と誘 導体化することが有利であろう。容器 本発明の治療用化合物は無菌の液状品として(好ましくは室温保存品として)バ イアル瓶入りとするか、もしくは再構成用バイアル瓶入りの凍結乾燥品として包 装される。溶液(凍結乾燥品の場合には希釈液)には、溶解性と安定性を確保する ために低濃度のある種の有機溶媒を含有させてもよい。液状品もしくは再構成後 の溶液には可能な限り高濃度の治療用化合物を含有させる。治療用化合物の各バ イアルには、その化合物の各適応症の治療に必要な、または疾病もしくは病状の 診断に必要な治療用物質の過剰量が含まれることとなる。送達法の選択 治療薬の局所送達にはいくつかの方法を選択しうる。 a）切開手術領域の洗浄： 切開手術の補助として治療用化合物の投与を必要とする、治療用化合物を局所 使用する適応症は多数ある。これらの場合には、治療用化合物を手術部位(もし くはその部位の一部)において縫合前の洗浄に用いるか、または治療用化合物を 限られた腔内(例えば動脈血管内膜切除法後の動脈の切断面の内部もしくは切除 の際の消化管の一部)で短時間インキュベートし、続いて過剰な液を取り除く。 b）組織移植片のインキュベーション： 自家および生体異物の静脈/動脈および弁の移植などの組織移植片および臓器 移植片は、それらを治療用溶液中でインキュベートするか、および/または治療 用溶液でそれらを還流することによって、共有結合を形成し得るように修飾した 治療用化合物で前処理することができる。 c）カテーテルによる送達： 臓器(例えば膀胱、消化管、膣/子宮)の内部への内視鏡手法の一部、もしくは バルーン脈管形成術などの心臓血管カテーテル手法に対する補助のいずれかとし て、カテーテルを治療用化合物の送達に使用する。標準的なカテーテル並びに新 規な薬剤送達用カテーテルおよびイオン電気導入用カテーテルが利用できる。 d）直接注射 関節内腔などの脈管部分の乏しい腔に対しては治療用化合物の直接注射によっ て表面組織とバイオコンジュゲートさせ、薬剤の効果を望みどおり持続させるこ とができる。その他の適用としては、骨髄内、腫瘍内、膣内、子宮内、腸内、耳 管内、クモ膜下、皮下、関節内、腹腔内、もしくは眼球内注射および気管支鏡経 由、経鼻胃管経由、および腎フィステル形成術(nophrostomy)経由などが挙げら れる。患者への投与量 本発明の化合物は哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。局所で 治療効果を発揮させる化合物の送達は全身的効果よりも局所的効果を得ようとす るものであるので、患者の体重もしくは体表面積の関数として投与量を定めるこ とは適切ではない。いくつかの治療用化合物では、過剰量を投与したとしてもそ の化合物による局所領域における安全性、もしくは毒性の作用に、著しい危険性 はない。そのような場合には治療用化合物の濃度を決めて製剤化することは、で きるだけ高い密度でコンジュゲートを形成するような結合を、標的となる局所領 域の内層を形成している細胞およびタンパク質に、局所化した薬剤の活性をその 部位に出来る限り長期間治療レベルに保持するために送達することができるよう に最適化される。しかし、いくつかの治療用化合物では最適投与レベルがあるか もしれない(通常、体表面積当たりのコンジュゲーション密度をもとに計算され る)。そのような場合には、体表面積当たりのコンジュゲーション密度はa)表面 部位の準備、b)反応時間および条件(例えば温度)、c)溶液の治療用化合物濃度、 およびd)溶液のpHおよびバッファーの関数として制御される。投与に関する問題点 治療薬の局所送達において重要なファクターは次のとおりである：a)標的組織 に対するコンジュゲーションの結合の密度を一定に保つこと；b)治療薬投与によ る局所組織刺激性もしくはその他の副作用を最小限とすること、およびc)局所投 与した治療用化合物のうち全身へ移行してしまう量を最小限とすること。これら の目標を達成するためには、投与部位から出来る限り多くの表面"デブリ"(例え ば血液細胞、遊離(loose)タンパク質その他など）をあらかじめ排除しておくこ とが重要である。このことによって、コンジュゲーション結合の密度を一様に確 保しつつ、バイオコンジュゲートされた化合物を可能な限り多量に、可能な限り 投与した局所に近接して残存させることができる。化合物溶液、pH、およびバッ フアーを最適化することによって投与部位表面に対するコンジュゲーション結合 のレベルが最大となる。切開手術領域から残存溶液を除去することにより全身に 移行する可能性のある治療用化合物の量を最小限とすることができる。 本発明は下記の実施例によって、それに限定されるものではないがより明確に 説明することができる。 実施例 実施例1 分子中に他の感受性官能基を含まないカルボン酸からのNHS誘導体の合成 カルボン酸を含有し、分子中に他の感受性官能基を含まない修飾すべき化合物 薬剤(１mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド(1.1mmol)の無水ジクロロメタン(xm L)溶液に、EDC(2.2mmol)を添加する。その溶液を室温で20時間もしくは溶解が完 了するまで攪拌する。次に反応物を水、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウム で乾燥し、濾過し、真空で濃縮する。残査を最小量の溶媒に溶解し、クロマトグ ラフィーで精製するかもしくは適切な溶媒系で再結晶させてNHS誘導体を得る。 実施例2 アミノ基および/またはチオール基ならびにカルボン酸を含有する分子からのNHS 誘導体の合成 遊離のアミノ基もしくはチオール基が分子中に存在する場合には、NHS誘導体 を付加させる前にこれらの官能基を保護しておくことが好ましい。例えば、その 分子が遊離のアミノ基を持っている場合には、実施例1に示す化学反応を行う前 にそのアミンをFmocもしくは好ましくはtBocで保護されたアミンに転換しておく ことが必要である。そのアミン官能基はNHS誘導体調製後に保護をはずされるこ とはない。従ってこの方法は、薬理学的な所望の効果を誘導するためにアミノ基 が遊離状態となることが必要でない化合物にのみ適用される。もしその分子の当 初の生物学的特性を保持するためにアミノ基を遊離させる必要がある場合には、 実施例3-6に記載の別のタイプの化学反応を行わねばならない。 実施例3 アミノ基もしくはチオール基を含みカルボン酸を含まない分子からのNHS誘導体 の合成 選択された分子がカルボン酸を含んでいない場合は、その分子を反応性のNHS 誘導体に転換させるために多数の二官能性リンカーを用いることができる。例え ば、エチレングリコール-ビス(スクシンイミジルコハク酸)(EGS)およびトリエチ ルアミンをDMF中に溶解させたものを、遊離アミノ基含有分子に添加すると(10:1 でEGSが多い比率で)、モノNHS誘導体を生ずる。チオール誘導体分子からNHS誘導 体を製するためには、N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステ ル(GMBS)およびトリエチルアミンをDMF中に含むものを用いることができる。マ レイミド基は遊離のチオールと反応し、NHS誘導体は反応混液からシリカ上での クロマトグラフィー、もしくはHPLCによって精製される。 実施例4 複数の化学官能基を含む分子からのNHS誘導体の合成 各場合を分析し異なる方法で解決しなければならない。しかし、市販されてい る保護基および二官能性リンカーが多数あるので、本発明は、好ましくは1ステ ップの化学反応で分子を誘導体化させるか(実施例1もしくは3に記載のように)、 または2ステップか(実施例2に記載のように感受性基の反応前の保護を含む)、ま たは3ステップ(保護、活性化、脱保護化)の化学反応を用いて、いかなる分子に 対しても適用可能である。例外的な状況下の場合のみ、ある分子を活性型のNHS もしくはマレイミド誘導体に転換させるために多数のステップ(4以上)の合成法 を用いることが必要となるであろう。 実施例5 遊離のアミノ基および/または遊離のカルボン酸を含有する分子からのマレイミ ド誘導体の合成 アミノ誘導体分子からマレイミド誘導体を製するためには、N-[γ-マレイミド ブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)およびトリエチルアミンをDMF中 に含むものを用いることができる。スクシンイミドエステル基は遊離のアミノ基 と反応し、マレイミド誘導体は反応混液から結晶化、シリカ上でのクロマトグラ フィー、またはHPLCによって精製される。 実施例6 複数のその他の官能基を含み遊離のカルボン酸を含まない分子からのマレイミド 誘導体の合成 選択された分子がカルボン酸を含んでいない場合は、その分子を反応性のNHS 誘導体に転換させるために多数の二官能性架橋剤を用いることができる。例えば 、DMF中でHBTU/HOBt/DIEA活性化を用いて遊離アミンとMPAのカルボン基とを反応 させることによってマレイミド誘導体を製するために、マレイミドプロピオン酸 (MPA)を遊離のアミンとカップリングさせることができる。 あるいは、その他の多数の市販ヘテロ二官能性架橋剤を必要があれば用いるこ とができる。 実施例7 ローダミンNHSエステルの調製 Rhodamine GreenTM-X、スクシンイミジルエステル、塩酸混合異性体がMolecul ar Probes(Eugene，米国オレゴン州)から市販されており、それは以下に示すと おりである。実施例8 NHS-ローダミンのin vivoでの添加 ニュージーランドウサギ(２kg)、雄または雌を用い、左頸動脈を外科的に露出 させる前にキシラジン(20mg/kg)、ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0 .75mg/kg)を筋肉内注射して麻酔した。双方の頸動脈を分離させ、それぞれの血 流を測定した。カテーテル(22G)を動脈切片に挿入し、その切片内で血液が肉眼 で見えなくなるまで0.9%塩化ナトリウムでカテーテルを介して洗った。 1cmのインキュベーションチャンバを切片領域に結紮糸を用いて作った。その インキュベーションチャンバを0.9%塩化ナトリウム1mLを用いて、3回洗った。10 0μlの500μM NHS-ローダミン溶液を調製し、そのインキュベーションチャンバ 内で3分間インキュベートした。過剰のローダミンを1mLシリンジで吸引して除去 した。インキュベーションチャンバを再度100mLの0.9%塩化ナトリウムで3回洗っ た。インキュベーションチャンバをウサギから除去し、3つの小片に分け、以後 の評価のために10％ホルマリンに浸漬した。NHS-ローダミンで処理された動脈は 非常に高いレベルの蛍光を示したのに対し、ローダミンのみで処理した動脈はバ ックグラウンドに比べて高い蛍光はほとんど見られなかった。これらの結果はロ ーダミンが局所送達部位に共有結合で結合されたことを示している。 実施例9 [3H]-NHS-プロピオン酸の調製 [3H]-NHS-プロピオン酸はAmersham Canada Ltd.(Oakville，カナダ国オンタリ オ州)から入手可能で、トリチウム標識プロピオン酸から当業界で知られている 濃縮法すなわちN-ヒドロスクシンイミドのDMF中もしくは塩化メチレン中でEDC存 在下で濃縮することによって調製することができる。 実施例10 [3H]-NHS-プロピオン酸のin vivoでの薬物動態学的研究 ニュージーランドウサギ(２kg)、雄または雌を用い、左頸動脈を外科的に露出 させる前にキシラジン(20mg/kg)、ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0 .75mg/kg)を筋肉内注射して麻酔した。頸動脈の10mmの切片を一時的に結紮して 取り出し、カニューレを通して0.9%塩化ナトリウムで血液成分が肉眼で見えなく なるまで洗った。 カテーテル(18G)を動脈切片に挿入し、血管形成術用バルーン(ワイヤーの上方 の直径2.5mm/Boston Scientific Inc.)をそのカテーテルを利用して導入した。 血管傷害(血管形成)は内膜細胞層を排除するために分離した切片で行った。血管 形成術用バルーンは異なる気圧(4，6，8，および10)で1分間、各膨張の間は45秒 間遅らせて順次膨らませた。4種の異なる気圧でバルーンによる拡張を5回行い、 血液循環中に1000U/kgのヘパリンを輸注した。 次いで血管形成術用バルーンを動脈から引き出し、カテーテルを再導入した。 動脈切片を生理食塩水で3回洗い、分離した動脈切片内で100μMの[3H]-NHS-プロ ピオン酸を30秒間、3分間、もしくは30分間のいずれかの時間インキュベートし た。インキュベーション終了時に過剰のインキュベーション液を動脈から抜き取 り、切片を生理食塩水で5回洗った。処理した動脈を直ちに回収し[3H]-標識化合 物の動脈内への取り込みをシンチレーションカウンターで調べた(図1参照)。30 秒間のインキュベーション後では2.55%の会合効率を記録した。3分間および30分 間では会合効率はそれぞれ5.5および6.5%であった。我々は効率的に動脈を処理 するためには3分間のインキュベーションで十分であると決定した。 保持レベルを調べる際には、100μMの[3H]-NHS-プロピオン酸もしくは[3H]-プ ロピオン酸を動脈と3分間インキュベートし、その後切片を生理食塩水で5回洗っ た。次いで、カテーテルを除去し動脈切除部位を微小縫合糸で縫合し、頸動脈内 の血流を再開通させた。最後に、頸部の傷を縫合糸で縫合し、動物を回復させた 。処置の3日後、動物をペントバルビタールナトリウムを過量投与することによ り屠殺し、頸動脈切片を摘出しシンチレーションカウンターで化合物の存在を調 べた。図2に示すとおり、3分間のインキュベーションの3日後に動脈における 残存放射活性に基づいて調べると、[3H]-NHS-プロピオン酸の保持は10.94%であ った。図3は、3分間インキュベーションした後の、共有結合で結合したプロピオ ン酸塩と非共有結合で結合したプロピオン酸塩との保持効率の差を示している。 非常に顕著な12倍もの保持の増強がNHS-プロピオン酸で記録された(インキュベ ートした総量の0.6%であったのに対し、非共有結合では0.046%であった)。この ことはある化合物の組織との会合はin vivoで共有結合で付着させることにより 劇的に増強されることを示している。それに引き続く血流の回復は、損傷72時間 後、[3H]-NHS-プロピオン酸の約10%が保持されたことを示している(図2)。この ことは、ここで具現した技術を用いての薬剤の組織での保持は、標準的な非共有 結合性薬剤についての文献(Circulation 1994 89(4)1518-1524)の中で例示され ているすべての局所薬剤送達技術よりもはるかに高いことを示している。 実施例11 [32P]NHS誘導体の合成 保護されたRおよびR'(RおよびR'の双方ともアルキル、フェニルもしくはアル コキシ基、およびXは酸素または硫黄のいずれか、アルコキシ、アルキル、およ びこれらの条件下で安定なその他のいかなる官能基であっても良い)を持つホス ホジエステル(0.1mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(0.2mmol)の溶液にジ イソプロピルエチルアミン(0.11mmol)を添加し、次いでHBTU(0.22mmol)を添加す る。反応混液を室温で36時間攪拌する。DMFを真空で蒸発させ残査をメタノール( 10mL)で溶解する。そのメタノール溶液をろ過して不溶物を除去し、ろ液を真空 で濃縮し、残査を最少量のメタノールで溶解する。次いで水を添加し沈殿を生成 させ、その沈殿物を真空で乾燥して所望の化合物を得る。 反応の収率はEDCをカップリング剤として下記に例示するとおり用いることに より通常は改善することができる。RおよびR'ホスホジエステル(0.054mmol)およ びN-ヒドロキシスクシンイミド(0.115mmol)を無水DMF(3mL)中に含む溶液に、EDC (31mg，0.162mmol)を添加する。溶液を室温で24時間攪拌する。DMFは真空蒸留さ せて除去し、残査を高真空度でさらに乾燥させる。次いで残査を最少量のメタノ ール(0.12mL)で溶解し、水(3.2mL)を添加して沈殿を生成させる。沈殿物を水(3 ×0.8mL)で洗い、真空で乾燥させて固形産物を得る。 保護されたホスホン酸誘導体のいかなるものでも同様の転換を行うことができ る。 実施例12 ニュージーランドウサギ(2kg)、雄または雌を用い、左頸動脈を外科的に露出 させる前にキシラジン(20mg/kg)、ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0 .75mg/kg)を筋肉内注射して麻酔した。頸動脈を外科的に切除し、約10mmの長さ の切片を分離した。血管にカニューレを通し、0.9%塩化ナトリウムで血液成分が 肉眼で見えなくなるまで洗った。 カテーテル(18G)を動脈切片に挿入し、血管形成術用バルーン(ワイヤーの上方 の直径2.5mm/Boston Scientific Inc.)をそのカテーテルを利用して導入した。 血管傷害(血管形成)は内膜細胞層を排除するために分離した切片で行った。血管 形成術用バルーンは異なる気圧(4，6，8，および10)で1分間、各膨張の間は45秒 間遅らせて順次膨らませた。4種の異なる気圧でバルーンによる拡張を5回行い、 血液循環中に1000U/kgのヘパリンを輸注した。 次いで血管形成術用バルーンを動脈から引き出し、カテーテルを再導入した。 動脈切片を生理食塩水で3回洗い、分離された動脈切片内で100μMの[32P]-NHS-[ リンカー]を3分間インキュベートした。インキュベーション終了時に過剰のイン キュベーション液を動脈から抜き取り、切片を生理食塩水で5回洗った。血管を 縫合糸で縫合し、血流を回復させて外科的創傷を修復させた。動物は4週間まで の期間動物飼養場へ戻された。[32P]-NHS-[リンカー]の組織での保持を、損傷後 の所定の時点で動物を全身X線撮影することにより調べた。この治療法に対する 組織応答は標準的な組織形態測定分析を用いて評価することができ、この分 析法は、組織の増殖および新生膜形成の程度を（治療した動物）対（対照動物） において定量し、これらの条件下で観察される血管創傷および過剰増殖成長に対 する反応をこの形態の近接照射療法が抑制することができるかを調べるためのも のである。 実施例13 [131I]-NHS誘導体の合成 保護されたアミノを有する[131I]−ヨードチロシン(0.1mmol)およびN-ヒドロ キシスクシンイミド(0.2mmol)の溶液にジイソプロピルエチルアミン(0.11mmol) を添加し、その後HBTU(0.22mmol)を添加する。反応混液を室温で12時間攪拌する 。DMFを真空蒸留で除去し、残査をメタノール(10mL)で溶解する。メタノール溶 液をろ過して不要物を除去し、ろ液を真空で濃縮し、残査を最少量のメタノール で溶解する。次いで水を添加して沈殿を生成させ、沈殿物を真空で乾燥させて所 望の化合物を得る。 この反応の収率はEDCをカップリング剤として下記に例示したように用いるこ とにより通常は改善することができる。[131I]-ヨードチロシン(0.054mmol)およ びN-ヒドロキシスクシンイミド(0.115mmol)を無水DMF(3mL)中に含む溶液にEDC(3 1mg，0.162mmol)を添加する。溶液を室温で24時間攪拌する。DMFを真空蒸留で除 去し、残査をさらに高真空度で乾燥させる。次いで残査を最少量のメタノール(0 .12mL)で溶解し、水(3.2mL)を添加して沈殿を生成させる。その沈殿物を水(3×0 .8mL)で洗い、真空で乾燥させて固体産物を得る。実施例14131 Ｉ誘導体のin vivo薬理学 オスまたはメスのニュージーランドウサギ(２Kg)を、キシラジン(20mg/kg)、 ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0.75mg/kg)で筋内麻酔し、左頸動脈 を外科的に露出した。頸動脈を外科的に切開し、約10mmの長さの切片を単離した 。血管にカニューレを挿入し、血液成分の形跡が見えなくなるまで0.9%塩化ナト リウムで濯いだ。 動脈切片にカテーテル(18G)を挿入し、血管形成用バルーン(ワイヤーの上方の 直径2.5mm、Boston Scientific Inc.)を導入した。単離した切片に対して血管傷 害(血管形成)を行い、内皮細胞の層を無くした。血管形成用バルーンを、異なる 気圧(４，６，８および10)において順に１分間膨張させた。膨張と膨張の間は、 45秒間の間隔をあけた。４気圧においてバルーンを５回収縮し、1000U/Kgのヘパ リンを血液循環系中に注入した。 次いで、血管形成用バルーンを動脈から回収し、カテーテルを再導入した。動 脈切片を生理食塩水で３回濯ぎ、100μMの[131I]-NHS-[リンカー]を、単離した 動脈切片内で３分間インキュベートした。最後に、インキュベーション液の過剰 分を動脈から除去し、切片を生理食塩水で５回濯いだ。血管を縫合して閉じ、血 流を復活させ、外科的創傷を治癒させた。動物を飼養場に４週間戻した。損傷後 の所定の時点において動物を全身Ｘ線撮影することにより、[131I]-NHS-[リンカ ー]の組織保持を評価した。この治療に対する組織応答は標準的な組織形態測定 分析を使用して評価でき、この分析法は、治療動物対対照動物における組織増殖 および新内膜形成(neoitimal)の程度を定量して、この形の近接照射療法(bracho therapy)がこれらの条件下で観察される脈管創傷および過剰増殖成長に対する応 答を制限できるかどうかを判定するものである。 実施例15 概論 以下の実施例で得られる生成物を、Varian(Rainin)分離用バイナリーHPLCシス テムを用いて分離用逆相HPLCで精製した。即ち、5〜60％ B(0.045% TFA含有 H2O(A)および0.045%TFA含有CH3CN(B))の勾配溶離で、9.5mL/分にて、Dynamax C1 8 、60Å、８μm、21mm×25cmカラム(Dynamax C18、60Å、８μmガードモジュー ルおよびUV検出器(Varian Dynamax UVD II)を装備)を使用して、λ214および254 nmにおいて検出した。分析用HPLCをVarian(Rainin)バイナリーHPLCシステムを用 いて行った。即ち、５〜60％ B(0.045% TFA含有H2O(A)および0.045% TFA含有CH3 CN(B))の勾配溶離で、0.5mL/分にて、Dynamax C18、60Å、８μm、4.6mm×25cm カラム(Dynamax C18、60Å、８μmガードモジュールおよびUV検出器(Varian Dya namax UVD II)を装備)を使用して、λ214および254nmにおいて検出した。PE Sci ex API IIIエレクトロスプレー・バイオモレキュラー・マス・アナライザで質量分 析を行った。 実施例16 Ac-RIARGDFPDDRK-NH2・4TFAの合成 ABI 433Aペプチド合成器で、0.49mmol/gのFmoc保護Rink Amide MBHA樹脂(Nova Biochem)510mg、４当量のFmoc保護アミノ酸、４当量の0.45MO-ベンゾトリアゾー ル-1-イル-N,N,N',N-テトラメチル-ウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBT U)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)のN,N-ジメチルホルムアミド溶 液、４当量の2M N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の1-メチル-2-ピロリジ ノン(NMP)溶液、Fmoc基のピペリジン脱保護を用いて、Ac-RIARGDFPDDRK-NH2ペプ チドの合成を行った。配列の完成後、樹脂を乾燥して990mgの淡褐色素に樹脂(91 ％)を得た。 609mgのAc-RIARGDFPDDRK-MBHA-樹脂を、２つの５mL切断カクテル(10mLのトリ フルオロ酢酸(TFA)：0.75ｇのフェノール；0.25ｇのチオアニソール；0.5mLのエ タンジチオール(EDT)；および0.5mLの水を含む)と２時間ずつ振とうして、樹脂 からペプチドを分離した。ろ液をそれぞれ回収し、５mLのTFAおよび５mLのCH2Cl2 で樹脂を洗浄して得たろ液と組み合わせた。ろ液を、約10mLまで濃縮し、40mL のドライアイス冷却Et2Oを加えて生成物を沈殿させた。得られた沈殿物を遠心分 離によって回収し、40mLのドライアイス冷却Et2O中に再度懸濁し、遠心分離し、 この工程を繰り返して163mgの白色固体の粗ペプチド(0.084mmol、60%)を 得た。分析用HPLCから、純度が約72%であることが示された。 実施例17 Ac-RIARGDFPDDRK(EGS)-NH2・3TFAの合成 15-mL遠心管において、46.2mgのエチレングリコール-ビス(スクシンイミジル スクシネート)(EGS)(0.071mmol)および8.50μLのトリエチルアミン(0.061mmol) を500μLのDMFに溶解した。このボルテックス混合溶液に、100μLのDMF中12.2mg のAc-RIARGDFPDDRK-NH2・4TFA(0.006mmol)の溶液(実施例２)を30秒間にわたって 滴下し、添加後、反応混合物を室温で1.5時間静置した。これに9.88μLのTFA(0. 122mmol)を加え、ボルテックス混合し、15-mLのドライアイス冷却Et2Oを加えて 生成物を沈殿させた。遠心分離により沈殿物を回収し、CH3CN中0.045%TFA１mLお よび水中0.045%TFA１mL中に固体を取り上げ、分離用HPLCに沈積させ、所望のフ ラクションを回収し、凍結乾燥させ、6.80mgの白色固体生成物(0.003mmol、50%) を得た。分析用HPLCは、生成物の純度が70％を超え、Rt=38.17分(生成物)および 37.21分(加水分解生成物)であり、C77H119N24O28(MH+)についてのESI-MS m/zが 計算値1827.9、実測値MH2+914.8であることを示した。加水分解生成物は、C73H1 16 N23O26(MH+)についてのESI-MS m/zが計算値1731.9、実測値MH2+866.2であった 。 実施例18 細胞培養物 ATCCから得たヒト謄静脈内皮細胞(HUVEC)を、熱で不活化した20%FBS、ECGS150 μg/mL、ペニシリン100Ui/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを加えた2.2mg/mL の炭酸水素ナトリウムを含有する培地199中でコンフルエントな状態まで増殖さ せる。75cm2フラスコ中で37℃にて5% CO2下で細胞を増殖させ、播種の初日およ びその後２日毎に培地を取り替えた。 ２〜４継代の間の細胞を使用した。通常の条件下およびコンフルエント培養物 を掻きとって傷をつけることにより機械的に損傷させたコンフルエント培養物に おいて、選択したRGD含有剤をこれらの細胞の成長および増殖を阻害する能力 について評価し、創傷を治癒する速度または溝を再構築する速度を測定した。 実施例19 in vitro細胞付着アッセイ 標準48-ウェル細胞培養プレート(Costar)を、PBS中100μLフィブロネクチン( ５および10μg/mL)、ビトロネクチン(５〜10μg/mL)またはHSA 1で一晩被覆し、 風乾した。内皮細胞および体細胞をトリプシン(0.25%、w/v)/EDTA(１mM)(5mL/25 cm2表面積)で処理して回収し、PBS中で２回洗浄し、10μg/mLのフルオレセイン イソチオシアネート(FITC)含有PBS中に5×105細胞/mLで37℃にて30分間懸濁した 。 標識細胞を洗浄し、インキュベーション培地M199に5×105細胞/mLで再懸濁し 、異なる濃度のHSA-RGDペプチドと37℃にて30分間インキュベートした。 対照および前処理した細胞を、ECMを被覆したプレートに5×104細胞/ウェルの 密度でアプライし、37℃にて90分間インキュベートして付着させた。PBSで２回 洗浄した後、非付着細胞を吸引により除去し、SpectroMaxを用いてプレートの蛍 光密度を定量した。トリプシンによる解離の後、付着細胞を血球計により再度数 え、ECMに付着している細胞のパーセンテージを計算した。このアッセイにおけ る細胞付着に対するHSA-RGDの直接的な効果は、創傷治癒における効果だけでは なく血小板および白血球の付着および付着後の漏出を抑制する効果を規定するた めのツールとなる。 実施例20 In vitro細胞移動アッセイ トリプシン／EDTA（5mL／25cm2表面積）処理により細胞を収穫し、PBSで２回 洗浄して、異なる濃度のHSA-RGDペプチドを含むPBS中に5×105細胞／mL濃度で再 び懸濁した。単離した細胞を37℃にて30分間インキュベートしたあと、ケモトラ クタント（chemotractant）としてI型コラーゲンを予めコーティングしておいた トランスウェル（Transwell）チャンバ（Costar 8.0μm）の上側チャンバに添加 した。37℃、5％CO2にて6〜18時間インキュベートしたあと、膜インサートを回 収し、細胞をQ-チップ綿棒で取り出して、1％クリスタルを含むメタノール（20 ％）と水（80％）の混合物中に入れた。細胞を20分間染色し、10％酢酸で抽出し てから、600nmにて吸光度を測定した。移動した細胞の数を標準曲線から計算す る。 実施例21 Matrigel誘導性毛管形成 内皮細胞は、天然ECM上に播種すると自然に毛管を形成する。基底膜マトリッ クス（Sigma）を冷たいPBSで4mg/mLに希釈し、24-ウェルプレート（Coster）に 全量200μLで各ウェルに加える。プレートを37℃にて30分間放置してゲル層を形 成させ、種々の濃度のペプチドを加えた20％FBSを含む培地中のHUVEC細胞2×105 を各ウェルに加え、37℃、5％CO2にて24時間インキュベートする。インキュベー ト後、細胞を洗浄して10分間2％グルタルアルデヒド中に固定させ、倒立位相差 顕微鏡検査にかける。毛管形成性の芽に及ぼすRGDペプチドの影響を目視測定し 、その毛管形成に対する効果を判定する。 実施例22 ニワトリCAM（漿尿膜）アッセイ ニワトリ胚におけるCAMは、血管形成に対する薬剤の影響を定量するための古 典的なin ovoアッセイである。10日齢のニワトリ胚を37℃、湿度60％にてインキ ュベートする。底にあるCAMが見えるように1cm2の窓を設ける。200μLのTNFα、 5ng/mLをCAMに注入することにより、血管形成を誘導する。24時間後、披検RGDペ プチド50μLを添加する。滅菌したセロハンテープで窓をカバーし、胚を37℃、 湿度60％にて更に48時間インキュベートする。インキュベーション後、CAM組織 の一部を切除して、血管形成を顕微鏡にて観察する。血管形成の阻害を半定量的 に評点して、血管形成の阻害におけるRGDペプチドの影響を評価する。 実施例23 角膜新血管新生のバイオアッセイ ラットに麻酔をし、血管形成を誘導する物質を挿入するための小さなポケット を角膜に作成する。血管形成因子（VEGF）および異なる濃度のRGDペプチドを含 む持続放出性ポリマー（Hydron）のペレットをこのポケットに移植する（D'Amat o法でのHydron中の混合物の調製方法参照；Angiogenesis，1996）。3〜5日後、 動物を殺して角膜の血管を撮影する。血管成長の密度を評点し、血管形成の阻害 程度を反映して被験RGDペプチドの活性を決定する。 実施例24 In vivo創傷治癒活性 ヌードマウスをペントバルビタールナトリウム（25mg/kg ip）で麻酔し、0.5m mの硝酸銀焼灼デバイスで皮膚に外傷を与える。この外傷は3〜5日で治癒した。 創傷の治癒を促進するRGDペプチドで治療した動物において、細胞浸潤速度およ び瘢痕形成の制限について評価する。高等動物モデルの場合、胃腸外科手術モデ ルにおいて外科的創傷治癒のためのRGDペプチドを評価する。外科麻酔したラッ トを開腹して十二指腸を完全に切断する。手術の際に、切断端部および隣接端部 をRGDペプチドで処置して再度縫合する。治癒までの時間を、外科損傷の24〜72 時間後のこれらの動物における木炭通過時間(charcoal transit time)によって 評価した胃腸機能の回復、および組織病理学的治癒速度に基づいて対照と比較し て評価する。RGDペプチドが胃腸管切断端部を治癒する能力を数週間にわたって 調べて、治癒過程の向上を評価する。 実施例25 in vivo新脈管形成および抗転移活性 このようなRGDペプチドの抗転移活性を、異なるヒト癌細胞系を接種したヌー ドマウスにおいて評価する。このアッセイでは、規定された成長および質量曲線 を使用して２cmを上回る規定質量にまで腫瘍を確立する。動物において、確立し たヒト腫瘍にNHS RGDペプチドを直接注射し、RGDペプチドの局所投与が腫瘍の大 きさおよび質量の増加に及ぼす影響を、ビヒクルで処置した動物と比較して判定 する。抗増殖活性および新脈管形成に対する影響を、治療後の腫瘍について、毛 細管形成、細胞数、腫瘍密度、および血流の直接的な定量により判定する。 実施例26 in vivo抗再狭窄活性 オスまたはメスのニュージーランドウサギ(２Kg)を、キシラジン(20mg/kg)、 ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0.75mg/kg)で筋内麻酔したあと、左 頸動脈を外科的に露出した。約10mmの頸動脈切片を、仮結紮により一時的に単離 し、血液成分の形跡が見えなくなるまで、カニューレを介して0.9%塩化ナトリウ ムで濯いだ。標準的バルーン血管形成術により頸動脈に損傷を与え、損傷の際に RGDを投与する。手術切開を修復し、損傷後最長１ヶ月までの間動物を飼養場に 戻す。 最終的な屠殺の際に、損傷した血管を単離し、灌流固定および回収により検査 する。損傷に対する応答を、断面のコンピュータ画像化を使用し、内膜対内側の 比(intimal to medial ratio)を計算し、BrDUを用いてこのin vivoアッセイにお ける細胞増殖の程度を評価することによって組織形態的に評価する。局所RGDペ プチドがこのモデルにおいて過剰増殖応答の防止に及ぼす効果は、損傷脈管の安 定化における薬剤相互作用を示している。 実施例27 Ex vivo血管移植 オスまたはメスのニュージーランドウサギ(２Kg)を、キシラジン(20mg/kg)、 ケタミン(50mg/kg)、およびアセプロマジン(0.75mg/kg)で筋内麻酔したあと、左 頸動脈を外科的に露出した。約20mmの頸動脈切片を、仮結紮により一時的に単離 し、血液成分の形跡が見えなくなるまで、カニューレを介して0.9%塩化ナトリウ ムで濯いだ。血管を取り出し、下行大動脈に移植した。手術の24時間後、動物を 再度麻酔にかけ、トランソニック流動プローブを使用して血流を測定し、血栓症 の発生の有無を調べた。血管移植に対するNHS RGDの適用は、前凝固薬または抗 凝固薬として作用することができる。RGDの局所的適用は、このモデルにおいて 、種々の時点で縫合部位における出血を予防し、また血小板堆積および動脈化 （血管新生）に対する影響を規定するために様々な使用法で測定できる。 本発明を十分に記載してきたが、当業者には、添付の請求の範囲の精神および 範囲から逸脱することなく、多くの改変および変更を行うことが可能であること が明らかであろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                         Local delivery of sustained therapeutics Field of application of the invention   The present invention relates to therapeutics in the medical field. In particular, the present invention provides a tissue protection for a given drug. In vivo sharing with target sites to increase pharmacodynamic persistence and therapeutic efficacy It relates to the field of local delivery of therapeutic agents that can be bound.Background of the Invention   Techniques for local delivery of therapeutic agents using drug delivery catheters or devices The technique is well established. Under ideal circumstances, therapeutics can increase potency Will remain near the site of administration. Although this technique is useful, the main drawback is the therapeutic agent At the rate of disappearing from the application site. For example, Imanishi et al. (J Cardio, 1996, 27 267-271), residual argatrova introduced from a pressurized balloon catheter. (Argatroban) concentration is reduced to one third in the first 5 minutes after balloon deflation I do. This phenomenon has been repeatedly reported in the literature of other therapeutic agents, In addition, drugs from various treatment areas maintain sufficient concentrations within hours after delivery. Lack of efficacy after local delivery (Cir culation, 1994, 89 (4), 1518-1524; Circulation, 1997, 96 (1), 154-165). So The result is a sharp drop in drug levels and sub-optimal performance, To avoid this, repeated administration of topically administered therapeutic agents is required. This costs Results in unnecessary exposure of patients to excessive amounts of therapeutic agent.   Therefore, the therapeutic agent is held at the desired site for a long time to extend the duration of action Thus, there is a need for local administration of a therapeutic agent. These drugs are administered from the site of administration Since it does not go so easily, a reduced amount of therapeutic agent can be supplied. Special In conjunction with the localization site, the therapeutic agent should be effectively present for a prolonged period of time for therapeutic effect. There is a need to provide therapeutic agents that can form covalent bonds.Summary of the Invention   To meet these needs, the present invention provides a therapeutic agent with increased tissue retention and A therapeutic agent that can form a covalent bond with a localization site so that it has a half-life Related.   The first aspect of the invention does not involve pharmacophore receptor interactions Regarding the modification of the drug at the site.   A second aspect of the present invention relates to covalent attachment using homo- and heterobifunctional crosslinkers. Novel chemistry related to non-specific formation of   In addition, the present invention provides for the use of N-hydroxy- Non-specific labeling with succinimide (NHS) -drug and sulfo-NHS-drug However, other reactive groups that function in aqueous media such as blood can also be used. Go In some cases, amides, esters, imines, thioethers, disulfides, Azides, diazos, carbodiimides, acid anhydrides, Special reagents such as hydrazine, dialdehyde, thiol group, and amine are used . Normally, the covalent bond formed is not the site of release throughout the life of the blood component. As long as it can be maintained. The main advantage of this technology is that it is more effective than systemic administration. That is, the amount of drug required to obtain a proper therapeutic window is small. this Reasons for the benefits include targeted delivery, reactive components and reactive functional groups Reaction in high yield and the bond formed after the reaction is irreversible Is explained. The therapeutic agent is localized near the therapeutic target, It does not circulate in the bloodstream like other free drugs. Another advantage of this technology Is a reduction in side effects as a result of the advantages described above. Once attached to a membrane or tissue Therapies are less susceptible to liver metabolism, kidney filtration, excretion, and Proteases (including endopeptidases) that lead to decreased activity and enhanced elimination It can be protected even from activity.   Another aspect of the present invention relates to immobilized blood proteins and available functionalities on tissues. A novel class of radiolabeled molecules that can react with groups to form covalent bonds With respect to chemically reactive derivatives, the covalent conjugates formed thereby are radioactive. It has the property of noh.   When compared to free radiolabeled drug, the conjugated molecule will Has a long lifespan and therefore, compared to the unconjugated parent drug Radioactivity can be maintained over a long period of time, with few central side effects Brings activity.   In addition, the present invention relates to the use of fixed blood proteins and Non-specifically with a compound and a sulfo-NHS-radiolabeled drug, Other reactive groups that function in an aqueous medium such as blood can also be used. In some cases Include amides, esters, imines, thioethers, disulfides, substituted amines Azide, diazo, carbodiimide, acid anhydride, hydrazine to form Special reagents such as aldehydes, dialdehydes, thiol groups, and amines are used. Usually the shape Once the covalent bond is formed, it remains at the site of release throughout the life of the blood or tissue component. As long as it can be maintained.   The present invention further provides conjugates of radiolabeled derivatives with fixed blood components and tissues. Gates, and percutaneous catheterization of a novel radiolabeled derivative to a mammalian host, Administered by using arterial endarterectomy or direct tissue incubation In vivo delivery of radioactivity.   Another aspect of the invention relates to the use of fixed blood proteins and available functionalities on tissue. Novel chemistry of RGD-containing peptides that can react with groups to form covalent bonds For reactive derivatives, the resulting covalent conjugate is an RGD peptide. Has activity.   When compared to RGD peptide drugs, the conjugated molecule Have a long lifespan in the fabric and, therefore, with unconjugated parent drug RGD peptide activity can be maintained over a longer period of time. Such activity Has high local delivery efficiency and irreversible covalent binding of therapeutic agents to membrane proteins Due to the relatively low therapeutic dose used by the present invention. Less sexual side effects.   In addition, the present invention relates to the use of NHS-RGD peptide And non-specific labeling with sulfo-NHS-peptide, but Other reactive groups that function in such aqueous media can also be used. In some cases, Form amides, esters, imines, thioethers, disulfides, substituted amines, etc. Azide, diazo, carbodiimide, acid anhydride, hydrazine, dia Special reagents such as aldehydes, thiol groups, and amines are used. Usually formed Covalent bonds throughout the life of the blood or tissue component, unless it is a release site Could be maintained.   The present invention further provides for the connection of RGD peptide derivatives with fixed blood components and tissues. Conjugates, and novel RGD peptide derivatives for transdermal catheterization in mammalian hosts Method, arterial endarterectomy, pericardium, adventitia, intracardiac or direct tissue incubation In vivo delivery of RGD peptide activity comprising administering by use of a protein.   The present invention further provides for the binding of RGD peptides to glycoprotein IIb / IIIa receptors. To supply RGD peptide for wound healing via resulting platelet immobilization Of conjugates of RGD derivatives with fixed blood components and tissues including.   The present invention further relates to known integrin receptors (αVβIII, IIb / IIIa, α5βII I)) to produce anti-restenosis through direct interaction with Modulates inflammatory and inflammatory responses, including induction of proliferation, migration, cell adhesion, and tissue remodeling To provide an RGD peptide, an RGD derivative, a fixed blood component and Includes how to use the conjugate with the tissue.   The invention further relates to cell adhesion and cell-cell binding, and cell import / export. Mediated by integrin receptor interactions with associated matrix degradation RG to generate anti-angiogenic and anti-metastatic properties by altering adhesion and migration Coupling RGD derivatives with fixed blood components and tissues to supply D-peptide Includes how to use the conjugate.   The invention further includes a topical delivery agent comprising a compound of the formula: X-Y-Z, wherein X is the wound Healing agents, antibiotics, anti-inflammatory agents, antioxidants, anti-proliferative agents, anti-restenotic agents, anti-angiogenic agents , Immunosuppressants, anti-infectives and anti-cancer agents. In the above formula, Y is 0-3 Z is a linking group consisting of 0 atoms, and Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component. Is a chemically reactive component that can form a covalent bond therewith.   In one format, Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydro Xisulfosuccinimide, maleimide-benzoyl-succinimide, γ-male Imide-butyryloxysuccinimide ester, maleimidopropionic acid, Socyanate, thiol ester, thionocarboxylic acid ester, imino ester , Carbodiimides, acid anhydrides, and carbonates.   In another format, X is selected from peptides, organic molecules and radioactive molecules. You can choose. In another format, X contains RGD with wound healing properties. It may be a peptide. RGD peptide has the sequence Ac-RIARGDFPDDRK (EGS) -NHTwoHas, Here, EGS is ethylene glycol-bis (succinimidyl succinate).   The present invention further provides delivery of a compound of the formula: Includes methods to increase the retention time of the administered therapeutic agent. Where X is a wound healing agent Antibiotics, Anti-inflammatory, Antioxidant, Antiproliferative, Antirestenotic, Antiangiogenic, Immune It is selected from the group of inhibitors, anti-infectives and anti-cancer agents. In the above formula, Y is from 0 to 30 Z is a linking group consisting of atoms, and Z reacts with a reactive functional group on the immobilized blood component. It is a chemically reactive component that can form a covalent bond with it.   The invention further provides compounds of the formula: X-Y-Z, wherein X is a wound healing agent and Y is 0 A linking group consisting of up to 30 atoms, and Z is opposite to a reactive functional group on the fixed blood component. Which is a chemically reactive component capable of forming a covalent bond with it) Promoting wound healing at the wound site.   The present invention further provides a compound of the formula: X-Y-Z, wherein X is an anticancer agent and Y is 0-30. Z is a reactive group on the immobilized blood component. Is a chemically reactive component capable of forming a covalent bond with it). And a method for treating a tumor comprising:BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The present invention may be better understood with reference to the drawings.   Figure 1 shows the damaged rabbit carotid artery after local incubation and [ThreeH] -NHS -Represents the binding efficiency with propionate.   FIG. 2 shows the inoculated rabbit carotid artery after 3 minutes incubation. [ThreeIt shows the retention efficiency of [H] -NHS-propionate.   FIG. 3 shows that after incubation with the damaged rabbit carotid artery for 3 minutes, [ThreeH ] -NHS-propionate and [Three3 shows the retention efficiency of [H] -propionate for 3 days.Detailed description of the invention Definition   To ensure a thorough understanding of the present invention, the following definitions are provided:   Local delivery agent: A local delivery agent is an agent delivered to a localized site of interest. is there. Such agents include therapeutic agents. Local delivery requires therapeutic treatment Includes topical application to both internal and external sites.   Therapeutic agent: A therapeutic agent is a drug that has a therapeutic effect. As a therapeutic drug, Wound healing agents, antibiotics, anti-infectives, anti-oxidants, chemotherapeutics, anti-cancer, anti-inflammatory and And antiproliferative agents.   Fixed blood component: A fixed blood component is a non-mobile blood component, Container, stromal protein, fibrin protein, collagen, platelets, endothelial cells Cells of epithelial cells and their associated membranes and membrane receptors, somatic cells, skeletal muscle and smooth muscle Vesicles, neuronal components, osteocytes and osteoclasts, and all body tissues, especially circulation And those associated with the lymphatic system.   Mobile blood components: Mobile blood components are long-term (typically more than 5 minutes) A blood component that does not have a fixed position (usually for more than a minute). Migrating blood Liquid components include immunoglobulin, serum albumin, ferritin, transferrin, etc. Of soluble blood proteins.   Wound healing agents: Wound healing agents are agents that promote wound healing. As a wound healing agent Are cell adhesion molecules such as integrin, ICAM, ECAM, ELAM, antibiotics, EGF, PDG Growth factors such as F, IGF, bFGF, aFGF, KGF, fibrin, thrombin, RGD pepti And the like.   Antiproliferatives: Antiproliferatives include antimetabolites, topoisomerase inhibitors, methotrex Folate antagonists like Sate, Mercaptopurine, Azathioprine Purine antagonists and pyriol such as fluorouracil and cytarabine Midine antagonists are included.   Antioxidants: Antioxidants are agents that prevent oxidative damage to tissues, G, orotate, tocopherol derivative (vitamin E), free radical scavenger For example, SOD, glutathione and the like are included.   Mammalian cells contain superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical, It is constantly exposed to reactive oxygen species such as oxygen. These active oxygen intermediates Aerobic metabolism, catabolism of drugs and other xenobiotics, UV and X-rays, and invasiveness Phagocytic cells (eg, leukocytes) to kill bacteria (eg, those that enter through wounds) Cells are generated in vivo in response to respiratory bursts Is what you do. For example, hydrogen peroxide can be found in most organisms during respiration, especially during storage. Produced by damaged or damaged cells.   Reactive oxygen species can damage cells. An important example of such damage is unsaturated fat Peroxidation of lipids with oxidative degradation of quality. Lipid peroxidation depends on membrane structure and function Can be very harmful to and cause many cytopathological effects. Cells Radiographs such as superoxide dismutase, catalase, and peroxidase Protects against lipid peroxidation by producing Cells have a reduced ability to produce radical scavengers. Excess hydrogen peroxide is DNA Reacts with to cause backbone degradation, mutations, Altered or released. Also, when hydrogen peroxide reacts with pyrimidine, 5, The 6-double bond is opened and the reaction is initiated by the formation of a pyrimidine that is hydrogen bonded to a complementary base. Inhibits ability (Hallaender et al. (1971)). Such oxidative biochemical damage is Loss of integrity, reduced enzyme activity, altered transport rate, altered lipid content of membranes, potassium May result in the escape of calcium ions, amino acids and other cellular substances.   Antioxidants have been found to prevent damage associated with reactive oxygen species. For example, Pyruvate and other α-keto acids react rapidly and stoichiometrically with hydrogen peroxide to produce cells. It has been reported to protect cells from lytic effects (O'Donnell-Tormey et al., J. Exp. Me. d., 165, pp. 500-514 (1987)).   Anti-infectives: Anti-infectives are drugs that stop infections, and include antivirals, antifungals, And antibiotics.   Antivirals: Antivirals are drugs that suppress the virus, such as vidarabine, Acyclovir and trifluorothymidine are included.   Antifungals: Antifungals are agents that inhibit fungal growth. As antifungals, Amphotericin B, miconazole, terconazole, econazole, isoconazo Thioconazole, bifonazole, clotrimazole, ketoconazole, Butaconazole, itraconazole, oxyconazole, fenticonazole, Nystatin, naftifen, dinoconazole, cyclopyroxylamine and Fluconazole.   Antibiotics: Antibiotics can be found in various microorganisms, such as bacteria (including Bacillus species), Actinomycetes (including Streptomyces) and other microorganisms produced by fungi Relatively low molecular weight naturalization that inhibits the growth of or kills other microorganisms Is a chemical substance. Chemical synthesis of substances with similar structure and mode of action In addition, natural compounds can be modified to produce semi-synthetic antibiotics. Such biosynthetic and semi-synthetic derivatives are also effective as antibiotics. Main class Antibiotics are (1) β-lactams such as penicillins, cephalosporins, Bactam: (2) aminoglycosides such as gentamicin, tobramycin, Netilmycin, amikacin; (3) tetracycline: (4) sulfonamide and Trimethoprim; (5) fluoroquinolones such as ciprofloxacin, norph Loxacin, ofloxacin; (6) vancomycin; (7) macrolide, such as Erythromycin, azithromycin, clarithromycin; and (8) other anti- Biomaterials such as polymyxin, chloramphenicol, lincosamide.   Antibiotics exert their antibacterial action through several mechanisms of action. The mechanism of action is categorized as follows. That is, (1) it acts on the cell wall of bacteria Drugs such as bacitracin, cephalosporin, cycloserine, phosphomers Isin, penicillin, ristocetin, vancomycin; (2) Does it act on cell membranes? Detergent agents such as colistin, novobiocin, polymyxin: (3 ) The cell's replication machinery, signaling, and its effects on ribosomes Agents that affect protein synthesis such as aminoglycosides, tetracyclines, B Ramphenicol, clindamycin, cycloheximide, fusidin, lincoma Isine, puromycin, rifampicin, other streptomycin, and Macrolide antibiotics such as sulomycin and oleandmycin; (4) nucleic acid Drugs that affect metabolism such as fluoroquinolones, actinomycins, eta Mbutol, 5-fluorocytosine, griseofulvin, rifamycin; and (5) drugs that affect intermediate metabolism, for example, sulfonamide, trimethoprim, And tuberculosis inhibitor isoniazid and p-aminosalicylic acid . Some drugs have more than one major mechanism of action, especially at high concentrations You. In addition, after the primary action of antimicrobial drugs, often the structure or metabolism of bacterial cells Secondary changes occur.   Anticancer agents: Anticancer agents are natural or synthetic molecules that are effective against one or more cancers. This definition refers to molecules that are cytotoxic by their mechanism of action (anticancer chemotherapeutic agents). ), Including molecules that stimulate the immune system (immunostimulants) and modulators of angiogenesis No. The result in each case is to slow the growth of the cancer cells.   Anticancer therapy is used to treat primary erythrocytosis and chronic leukemia32Like P Contains radioisotopes. Radioactive phosphorus has a biological half-life of about 8 days in humans I do. It produces beta rays that have a destructive effect on rapidly growing cells You.32P is usually administered at a dose of about 1 mc per day for 5 days. The route of administration is It can be oral or intravenous, but the dose does not vary significantly. Radioactive Udine131I, radioactive gold198Au and other isotopes32Not as effective as P. in addition Nevertheless, in metastatic thyroid cancer131I may be used.51Cr ,52Mn,52Mg,57Ni,65Co and56P,55Fe,103Pd,192Ir,64Cu and67Cu Other radioisotopes, such as radiometal complexes, or (BFCs), 6- [p- ( Bromoacetamido) benzyl] -1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8 , 11-Tetraacetic acid (BAT), 6- [p- (isothiocyanato) benzyl] -1,4,8,11-tetraa Zacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid (SCN-TETA), 4-[(1,4,8,11-tetraacetic acid Azacyclotetradec-1-yl) methyl] benzoic acid (CPTA), and 1-[(1,4,7,10,13 -Pentazacyclopentadec-1-yl) methyl] benzoic acid (PCBA) The chelate of the metal using a chelating agent may be used according to our technology. Can be   Numerous drugs fall into the category of chemotherapeutic agents that are effective in treating neoplastic disease, Embodiments of this use for g delivery and retention of modified drugs at tumor sites Easy to follow. Drugs derivatized by this technology include antimetabolites, such as For example, methotrexate (folate derivative), fluorouracil, cytarabine, merca Putpurin, thioguanine, petostatin (pyrimidine and purine analogs or Are inhibitors); various natural products such as vincristine and vinblastine ( Vinca alkaloids), etoposide and teniposide; various antibiotics such as , Mitomycin, plicamycin, bleomycin, doxorubicin, Danor Bicine, ductmycin; various biological response modifiers, such as interfero Α; various hybrid drugs and hormonal modulators such as cisplatin and hydroxy. Siurea, mitoxantorne, procarbodine, aminoglutethimi De, prednisone, progestin, estrogen, antiestrogen (eg, tamaki Sifen), androgenic steroids, antiandrogens (eg flutamide), Gonadotropin-releasing hormone analogues (eg leuprolide), matrix meta Protease inhibitors (MMPI) and anticancer agents such as taxol (paclitaxe) And taxoids, taxins or related molecules collectively called taxanes No.   The definition of "taxoid" was found to be effective in suppressing cancer cell growth, Basic ring structures that can be constructed by organic chemistry methods known to those skilled in the art Various modifications and conjugates of the (taxoid nucleus) are also included.   Chemotherapeutic agents include podophyllotoxins and their derivatives and analogs You. Another important class of chemotherapeutic agents useful in the present invention are camptothecins. You.   Another preferred class of chemotherapeutic agents useful in the present invention is anthracycline (Adriamycin and daunorubicin).   Another important class of chemotherapeutic agents are compounds that can be drawn from the following list: Taxotere, Amonafide, Illudin S, 6-H Droxymethylacylfulvene, bryostatin 1 (26-screen) Synylbryostatin 1, Palmitoyl Thizoxin, DUP 9 41, mitomycin B, mitomycin C, penclomedine, pulse Tube formation inhibitor compounds, cisplatin hydrophobic complexes, e.g., 2-hydrazines containing platinum chloride 5-hydrazino-3,4, including lazino-4,5-dihydro-1H-imidazole and platinum chloride -Dihydro-2H-pyrrole, vitamin A, vitamin E and its derivatives, especially toco Ferrol succinate.   Other compounds useful in the present invention include the following: 1,3-bis (2-chloro Roethyl) -1-nitrosourea ("carmustine" or "BCNU"), 5-fluorouracil, doxorubicin ("adriamycin"), epirubicin , Aclarubicin, bisanthrene (bis (2-imidazolen-2-ylhydrazone) -9 , 10-Anthracenedicarboxaldehyde, mitoxantrone, methotrexe G, edatrexate, muramyl tripeptide, muramyl dipeptide, lipopolysaccharide , Vidarabine and its 2-fluoro derivative, resveratrol, retinoic acid And retinol, carotenoids, and tamoxifen.   Other chemotherapeutic agents useful in the use of the present invention include the following: Virgin (Decarbazine), lonidamine (Lonidamine), pyroxantrone (Piroxantro ne), anthrapyrazoles, etoposide, camptothecin (Camptot hecin), 9-aminocamptothecin, 9-nitrocamptothecin, camptothecin-1 1 ("Irinotecan"), Topotecan, Bleomycin , Vinca alkaloids and their analogs (Vincristine stine), Vinorelbine, Vindesine, Bintripol (Vintripol), Vinxaltine, Ancitabine), 6- Aminochrysene, and Navelbine.   Other compounds useful in the applications of the present invention are taxol mimetics, eroites. Robin (eleutherobins), sarcodictin (sarcodictyins), discodermolide (d iscodermolides) and epothiolones.   RGD peptide: binds to tissue or fixed endogenous proteins according to the invention The RGD peptide for the following formula:             R1-Arg-Gly-Asp-RTwo (Preferably a natural L-amino acid and glycine).   In the above formula, R1And RTwoIs one amino acid or more than one amino acid Represents a sequence, or one or more derivatized or chemically modified amino acids .   Delivery device: A delivery device is a device useful for local delivery of a therapeutic agent. Sending Delivery devices include catheters, syringes, trocars, and endoscopes.   Reactive component: A reactive component is a component that can form a covalent bond. is there. Such a reactive substance is linked or conjugated to the therapeutic agent of interest. reaction Sexual ingredients are generally stable in an aqueous environment and usually include carboxy, phosphoryl, Or a convenient acyl group (as an ester or acid anhydride), or an imide To form a covalent bond with the amino group at the target site to form an amide or amino acid. Mido derivatives can be produced. In most cases, esters are phenolic compounds Or thiol esters, alkyl esters, phosphate esters, etc. .   The reactive component is usually selected to react with the amino group at the target site, Other reactive functionalities at the positions can also be utilized. For example, the reactive component is the target site Various phosphinyl or phospho groups for attachment to available hydroxyl groups of And a thiol group. It may contain oimine or disulfide.   Reactive functional groups: use on vascular proteins to form covalent bonds with reactive groups Possible reactive functional groups are primary amino, carboxyl and thiol groups. reaction Although any of these groups may be used as targets for the And an amide bond is particularly formed.   Various activities as reactive functional groups of bifunctional molecules to form amide bonds Carboxyl groups can be used, especially at levels where hydroxyl groups are required In the case where is physiologically acceptable, an ester is used. Some different hydroxy Sil groups can be used, the most convenient being N-hydroxysuccinimide and And other N-hydroxysulfosuccinimides that function in the vascular environment. Calls may be used. In some cases, do reactions occur in vivo? Depending on the target, the specificity of the reactive component, etc. Special reagents such as azo, carbodiimide, acid anhydride, hydrazine or thiol groups Use   IC50: concentration of enzyme inhibitor that inhibits 50% of the enzyme activity.   Protecting groups: Protecting groups are used to prevent a reactive component from reacting with itself. Chemical components. Various protecting groups are described in U.S. Pat.No. 5,493,007. And shall be incorporated herein by reference. As such a protecting group, acetyl , Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), t-butyloxycarbonyl (BOC ), Benzyloxycarbonyl (CBZ) and the like.   Linking group: A linking group is a chemical moiety that links or binds a reactive moiety to a therapeutic agent. . The linking group is one or more alkylene, alkyleneoxy, alkenylene, alkynylene An amino group substituted with an alkyl or alkyl group; a cycloalkylene group, a polycyclic group, Reel group, polyaryl group, substituted aryl group, heterocyclic group, and substituted heterocyclic group Groups. The linking group is 2 to 100, usually 2 to 18, preferably 6 to 12 in the chain. Atoms, especially including carbon, oxygen, phosphorus and nitrogen, especially carbon and oxygen. Would.Detailed description of the invention   Taking these definitions into account, in a first aspect, the invention relates to the local delivery of a therapeutic agent. Related. The therapeutic agent is modified with a reactive entity to react covalently. By decorating, it binds to reactive functional groups on fixed blood components in vivo. Increase the half-life of the therapeutic agent.   The derivatized therapeutic agent of the present invention generally has the formula                                   X-Y-Z (Where X is a wound healing agent, an antibiotic, an anti-inflammatory, an antioxidant, an antiproliferative, an immunosuppressant Drugs, anti-infectives and chemotherapeutics) It has.   Wherein Y is from 0 to 30, more usually 2 to 12, preferably 4 to 12 atoms, especially A linking group consisting of carbon, oxygen, phosphorus and nitrogen, more specifically carbon and oxygen And oxygen is preferably present as an oxyether, Y is alkylene, oxy Alkylene or polyoxyalkylene, etc. The groups have 2-3 carbon atoms. If you want X to be as close as possible to Z, A linking group consisting of an oxygen atom is preferred.   Wherein Z is carboxy, carboxyester (the ester group is 1 to 8, more (In general, a group consisting of 1 to 6 carbon atoms). Activates carboxycarbonyl for reaction with amino groups in the system A chemically acceptable leaving group, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS), N- Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), maleimido-benzoyl-succinimide Imide (MBS), γ-maleimide-butyryloxysuccinimide ester (GMBS) And maleimide propionic acid (MPA), N-hydroxysuccinimide isocyanate Salts, isothiocyanates, thiol esters, thionocarboxylic acid esters (thi onocarboxylic acid ester), imino ester, mixed anhydride (eg, carbodi Imide anhydride), carbonate and the like.   Antibodies on proteins available for covalent binding to chemically reactive components of derivatized therapeutics Responsive functional groups are mainly amino, carboxyl and thiol groups. these Can be used as targets for chemically reactive components on therapeutics, but In this case, a bond to an amino group is used, particularly with the formation of an amide bond. Amide bond To form, a wide range of active carboxyl groups (especially Esters) can be used and the hydroxyl moiety It is acceptable. Although many different hydroxyl groups are available The most convenient are N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-hydroxysulfo Succinimide (sulfo-NHS), maleimide-benzoyl-succinimide (MBS), γ -Maleimide-butyryloxysuccinimide ester (GMBS) and maleimide Use ropionic acid (MPA), another alcohol that can function in aqueous media such as blood. May be used. In some cases, certain reagents, such as azides, diazos, carbodii Use amides, anhydrides, hydrazines, dialdehydes, thiol groups, or amines Form amides, esters, imines, thioethers, disulfides, substituted amines, etc. Can be achieved. Usually, the covalent bond formed is intended for a dissociation site. Unless otherwise, they must be able to be maintained for the life of the blood or tissue components. In a preferred embodiment of the invention, the functional group on the protein is a thiol group, The chemically reactive group is a maleimide containing group such as GMBA or MPA. GMBA is γ-ma Reimido-butyrylamide.   The method for producing the derivatized therapeutic agent of the present invention depends on the properties of various elements constituting the molecule. It varies according to. The synthetic procedure provides simple and high yields, and high purity products Choose what you get. Typically, chemically reactive groups are used as a final step, for example Constructed using carboxyl groups and transesterified to form active esters This is the final step. The method for producing the derivatized therapeutic agent of the present invention is described in Examples 1 to 6. You. Each therapeutic selected for derivatization with a linker and a reactive agent , Modified according to the following criteria: not important for retention of pharmacological activity on the original molecule If a ruboxyl group is available and no other reactive functional groups are present on the molecule Choose carboxylic acid as the attachment point for linker-reactive component modification. Carboxylic acid If not available, phosphorylate any other functional groups that are not important for retention of pharmacological activity. Selected as the point of attachment for modification of the car-reactive component. Multiple functional groups are useful on the therapeutic agent If available, add linkers / reactive components and remove all protected functional groups. A combination of protecting groups that retains pharmacological activity even after deprotection Used. If reactive functional groups are not available on the therapeutic, biological activity and Synthetic parent drug in such a way that receptor or target specificity is retained Attempt to modify the agent.   The chemo-reactive component binds to the parent drug when the drug binds to the fixed blood component. At a site that retains a significant proportion of the inhibitory activity of the product.   The derivatized therapeutic agent of the present invention is substantially IC50Low value, usually IC of parent molecule50Is about It is in the range of 0.5 to 0.01. Preferably IC50Is at least 0.05, preferably at least about 0.1 There must be. I c50If the value changes, the amount of derivatized therapeutic agent administered will also change.   The nature and length of the linker are determined by empirical optimization. As determined by retention or loss of biological activity. For example, certain inhibitors-yeast Using elementary interactions, modification of the nature and length of the linker and Repeated measurements are necessary to determine the most favorable linker length and properties. is there. Preferably, a short hydrophilic linker consisting of 4 to 12 atoms that is easily synthesized It is advantageous to start the iterative process from there.   In the case of radiolabeled therapeutics, the nature of the radioisotope and its penetration (penetra Care must be taken to be the shortest distance from the target based on the option). Rin Kerr length and properties are less important than enzyme-inhibitor combinations. Absent. For example,32Radioisotopes that emit beta rays, such as P, have the highest efficiency (99%) Must be located within 5mm of the target to have The effect of small changes in length and length has limited or no effect.   Since reactive components are applied in vivo, most of the reactive components are reactive functional It must be chosen to react with the group in the shortest possible time. In surgical applications, biological Incubation time due to biological constraints (eg, interruption of arterial blood flow) Can be 3 minutes. Other surgical interventions such as ex vivo vascular transplantation If the graft tissue is maintained under proper storage conditions, this may take several minutes or Some last for hours. Therefore, the reactive component depends on the reaction rate with the reactive functional group. And may be different for each type of application. Preferably, 1 to 30% of the added molecules Binds to target reactive functional groups in vivo within a 3 minute incubation time. Yo More preferably, 10-90% of the reactive components bind to the reactive functional groups in vivo within 3 minutes. Combine. Most preferably, the reaction is completed within 5 minutes. ex vivo loading In this case, 10% of the molecules are added to the reactive functional group within 3 minutes. Preferably, anti Add 10-50% of the reactive component to the reactive functional group within 3 minutes. Most preferably, anti End the response within 15 minutes.   The modified therapeutic agent is injected via a standard balloon catheter. Injection using pressure or iontophoresis for efficient distribution, or Or standard injection, irrigation or topical delivery to deliver the drug or drug locally to the intended site. Introduced by technology. Modification of the drug with an appropriate linking group allows the Maintain its activity even when bound to the exposed protein. Non-specific NHS or Uses other cross-linking agents or site-specific covalent attachment to specific proteins Affinity probes are used to achieve in vivo covalent binding. Once bound, modify The biological activity of the drug is maintained. Existing methods or sites can be A long-lasting effect that is superior in terms of time over local drug delivery is obtained.   From the techniques described herein, the broad range of therapeutic applications, including: The use is obvious: 1.RGD peptide A. RGD peptides for improving wound healing   Peptides and proteins containing RGD (Arg-Gly-Asp) such as Osteopontin, It has been shown to promote wound healing in animal models. These pepti Possible mechanisms of action are stimulation of fibroblasts and migration of epithelial cells. And via adhesion to the wound. RGD-containing peptides are specific receptors, namely Binds to the α (v) β3 integrin receptor on these cells. This receptor It stimulates adhesion and migration. RGD-containing peptides have been discovered in human clinical trials. Failure to improve wound healing, ie, promote or increase strength. These peptides Indicates that the residence time in skin ulcers / wounds is too short or that the underlying Possibility that the effect cannot be exhibited due to insufficient bonding to the structure .   Examples of RGD-containing peptides useful in the present invention are as follows:   RGD-containing peptides, such as the peptides that are the subject of the present application, are prepared using reactive chemistry. Can be covalently attached to the underlying layer of the wound and combined with a suitable spacer / linker In this case, the wound healing element is presented longer and more correctly than the conventional RGD-containing peptide. It is possible to Cells such as fibroblasts and epithelial cells via α (v) β3 receptor Binding and adhesion to vesicular wound healing elements does not change with the chemistry used in this application .   The drug products described herein may be used to treat wounds and incisions on the skin (burns, skin ulcers, nutrition Obstructive ulcer, diabetic ulcer, surgical incision, skin graft sampling and receiving site Surgical flap repair, resection biopsy site, fistula, fissure, and stomach, duodenum, (Including sites of gastrointestinal ulceration of the intestine or rectum). this Drugs may also be applied to the site of fusion of the intestine or other organs, or to the peritoneum, pleura or mucosa. It can also be applied to surfaces to stimulate repair and healing. This drug physically Irrigation or washing, or enzymatic preparation and hyaluronan After washing with drugs such as lonidase and papain and performing appropriate crushed tissue resection, Apply to exposed surface.   The drug is applied in aqueous solution to the slightly hydrated wound surface, In the state of solution, as powder, aerosolized mist, ointment, lotion, emulsion, Or can be applied as a film or as a component of a bandage or wrap it can. Unreacted drug can be removed, for example, after 5-20 minutes of application. Wounds must be kept clean to prevent infection and after application wet to dry ry dressing). B. RGD peptides as anti-angiogenic agents   Tumor metastasis is based on various host cells (endothelial cells, platelets, lymphocytes) and extracellular matrices. Ginseng (eg, collagen I and IV, fibronectin, laminin and sulfate) (Interacting glycosaminoglycans). With cells Interactions with extracellular matrix components are performed by cell surface receptors called integrins. Regulated by the body. Synthesis from adhesion molecules contained in extracellular matrix Some peptides modulate the mechanisms involved in tumor cell metastasis. Has been found to be For example, multiple integrins allow normal cells Amino acid sequence RGD mediates adhesion of tumor and tumor cells to extracellular matrix components Is recognized.   Angiogenesis leads to matrix degradation, cell growth and migration, and recolonization. Is a multi-step process, during which capillary endothelial cells are cells of normal cells Extracellular matrix that limits adhesion Migrate through the cell and reform cell-cell adhesion to build new capillaries. C. RGD peptide as anti-restenosis agent   Restenosis is a complex vascular wound healing that occurs in most patients receiving angioplasty. This is what happens. Recent studies have shown that cell proliferation The remodeling of the vessel and vasculature is a phenomenon of restenosis (also described as vascular stenosis after angioplasty) It is suggested to be the cause. Srivatsa et al. (Cardio Res 199736 : 408-428) was demonstrated by the RGD peptide mimetic in neoplasms following severe porcine coronary artery injury. This shows that neointimal hyperplasia and luminal stenosis are suppressed. They also found that to achieve maximal anti-restenotic efficacy, α (v) β ( He points out that it is necessary to maintain the pharmacological blockade of 3). Spelian et al. (Circ ulation 1998 97: 1818-27) showed that cyclic RGD peptide was damaged by balloon. Following balloon injury by local delivery to the adventitia surface of girder rat carotid artery Significantly reduced smooth muscle cell migration at 14 days, indicating decreased neointimal hyperplasia ing. RGD-containing peptides, such as the peptides that are the subject of this application, perform angioplasty. Can be covalently bonded to the site, and has a pharmacological blockade of α (v) β (3) It should be sustained to allow maximum anti-restenotic efficacy.   RG conjugated to a tissue or fixed endogenous protein according to the invention For the D peptide, the following formula:                               R1-Arg-Gly-Asp-RTwo Amino acid sequences (preferably natural L-amino acids and glycine) Can be   Where R1And RTwoIs an amino acid or a sequence consisting of two or more amino acids Or a derivatized or chemically modified amino acid, or two or more derivatized or Represents a chemically modified amino acid.   In certain embodiments, R1Is XY (Z)n(Where X, Y and Z independently represent amino acids And n represents 0 or 1), and RTwoIs OH or NHTwoOr any amino acid, Or a sequence consisting of two or more amino acids, or a derivatized or chemically modified amino acid. It represents nonoic acid. In certain embodiments, RTwoIs serine, threonine or cysteine Other amino acids or their amides (where the amino acid is a carboxamide Represents). In another specific embodiment, RTwoIs two or more amino acids, the In the sequence, the first amino acid binding to aspartic acid is serine, threonine or An amide other than cysteine or any free carboxyl group, Then RTwoInclude derivatized or chemically modified amino acids.   In a preferred embodiment, RTwoIs a chemistry that covalently binds to reactive functional groups on proteins Including a linking group having a reactive group, R1Is RTwoIs a chemically reactive group of R1Prevent reacting with Including protecting groups. In another embodiment, R1Is shared with reactive functional groups on the protein Including a linking group having a chemically reactive group to bind, RTwoIs R1Is a chemically reactive group of RTwoAnd anti Includes protecting groups that prevent it from responding.   In yet another embodiment, R1And RTwoAre both functionalities on immobilized proteins Includes a linking group having a chemically reactive moiety that is covalently linked to the group. In this embodiment, The linking groups may be the same or different.   In the RGD peptide of the present invention, R1And RTwoContains any amino acid or its sequence You may go out. The amino acids are preferably naturally occurring. The most common natural The amino acids are shown in Table 1:   However, the RGD peptide of the present invention1And RTwoTurns into 20 natural amino acids Not limited. In other embodiments, R1And RTwoIs a D-amino acid, not common Amino acids, or cyclic peptides, or peptide mimetics (chemical peptide analogs) Body). Uncommon amino acids include, but are not limited to But the usual amino acid D-isomer, α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutyric acid, hydroxy Cyproline, sarcosine, citrulline, cysteic acid, t-butylglycine, t-butyl Tilalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine, β-alanine, Designer amino acid (β-methyl amino acid, Cα-methyl amino acid) And amino acid analogs), and amino acid analogs in general.   In addition, Arg and / or Asp of the RGD sequence may be D (dextrorotary) or L (levorotary) amino acids. It may be any of the acids.   R1And / or RTwoIs an amino acid sequence, the amino acid sequence There is no need to limit the number. Therefore, they can be conjugated to immobilized blood proteins. The polypeptide can be of any size and is also called an oligopeptide , Proteins, organic molecules, or polymers such as polyethylene glycol You. Preferably, the polypeptide has no more than about 1,000 amino acids .   Polypeptides can be prepared by methods known in the art. An example For example, to put it simply, solid-phase peptide synthesis involves carboxyl grouping of the C-terminal amino acid. Coupling to the resin followed by addition of the N-α protected amino acid. Security The protecting group can be any known in the art. Each new amino acid Before addition to the growing chain, the protecting group of the amino acid previously added to this chain is removed. You. Coupling of amino acids to a suitable resin is described in US Pat. It is described in No. 6. Such solid phase synthesis is described, for example, in Merrifield, 1964, J. Am. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Vale et al., 1981; Science 213: 1394-1397; Marki et al., 1981. , J. et al. Am. Chem. Soc. 103: 3178 and U.S. Pat.Nos. 4,305,872 and 4,316,8 No. 91.   RGD pep conjugated to proteins and other fixed blood proteins Derivatives of tide and analogs thereof are available on proteins, as is known in the art. Prepared using a linking group with a chemically reactive group that covalently binds to the reactive functional group of . 2.Gastrointestinal ulcer treatment   Integrins, growth factors and cell adhesion molecules can be obtained using the NHS / linker disclosed herein. Technique can be used to modify When applied, covalently binds to the base of esophageal, gastric, or duodenal ulcers Will. Topically applied growth factors (including GF, PDGF, IGF, bFGF, aFGF and KGF But not limited to) and integrins and cells as described above. High levels of vesicle adhesion molecules stimulate re-epithelialization and ulcer healing There will be. NSAIDS, steroids and other anti-inflammatory drugs are also trained in our technology. It can be decorated as an ulcer healing agent.   In addition, local concentrations of these drugs in the ulcer area are maintained at high levels to cure In order to promote healing, kill or inactivate Heliobacter pylorii Apply a designed antibacterial or bacteriostatic such as bismuth sulfate to the base of peptic ulcer be able to. H. pylorii is recognized as a causative agent of peptic ulcer, It has been found that long-lasting bacteria in the ulcer can hinder healing. 3.Intraoperative administration to prevent adhesions   Intraperitoneal and intrathoracic surgery is often associated with adhesions and can be weeks to weeks after surgery. Symptoms appear in the moon. These adhesions may not go unnoticed without being noticed Not, but often, organs or internal organs (eg, bowel) months to years after surgery Pain that causes problems related to the functioning of the body or is unbearable enough to require reoperation Can cause Cells coupled to NHS via spacer Anti-inflammatory peptides such as inhibitors consisting of adhesion molecules and matrix adhesion molecules; Intestinal anastomosis or colonic anastomosis during surgery, using anti-inflammatory drugs Adhesion can be prevented by topical application to important sites. 4.Intraoperative administration to prevent bleeding   Fibrin, thrombin or tissue factor peptides, and fragments thereof, Other procoagulant proteins and procoagulant drugs using NHS / linker technology To the bleeding site of the body to stop bleeding and prevent bleeding. This These drugs can be used for open surgery, laparoscopic surgery, or other less invasive surgery (arthroscopic surgery). Examination, thorascopic surgery, or peldoscopic surgery (culdoscopi c surgery) and endoscopic surgery, including, but not limited to) It can be administered locally to the site of bleeding. After using arteriotomy using these drugs Bleeding can be prevented, and catheters (eg, angiographic catheters) Catheter, angioplasty catheter, hemodialysis catheter or hemoperfusion catheter ) Prevents local bleeding at the site after arterial puncture and reduces the risk of post-puncture bleeding Reduced intrauterine bleeding or dysfunctional uterine bleeding after delivery Can be prevented. These drugs can also cause major intrathoracic bleeding after heart surgery, Intracranial major bleeding after surgery or intracranial, intrathoracic or intraperitoneal enlargement after aneurysm repair It can be very useful in preventing bleeding. 5.Ophthalmic surgery   The technique of the present invention is used to control the in vivo retention and local action of antiproliferative agents, Adhesions can be prevented and / or minimized during surgery. Above all This technique is used during anterior chamber surgery for glaucoma and is applied to the area of the trabecular meshwork or anterior chamber absorber. Post-operative growth of proliferative tissue can be prevented. In addition, with NHS ester Topical use of conductive protease inhibitors prevents bacterial scleral damage and Injection directly into the membrane can prevent angiogenesis and macular degeneration. 6.Urology   Postoperative bleeding is commonly observed in urology, and the above-mentioned procoagulant is Coupling with reactive NHS esters by techniques allows cystoscopy Can be applied locally to open bleeding areas in open surgery areas . The technique of the present invention may be used for prostate surgery, including but not limited to TURP, or before incision Postoperative bleeding after raptomy, polypectomy, removal of bladder cancer or partial cystectomy It can also be applied to prevent. Using this technology, bacteriostatic or sterilizing The drug is delivered intraoperatively via a cystoscope or by a Mey catheter and bladder irrigation. Post-operative application can treat infections. Anti-inflammatory drugs It can be applied to prevent postoperative urethral stricture formation. 7.Endoscope   Benign sources after esophageal surgery or such as Barrett's esophagus or severe reflux esophagitis The same techniques can be used to prevent and treat esophageal stricture formation due to esophagus. Methyl Xanthine (pentoxifylline, aminophylline, theophylline, and related Endoscopic application of phosphodiesterase inhibitors such as Local covalent attachment of inflammatory drugs can help manage patients with acute asthma attacks or cystic fibrosis Could be useful. 8.Gallbladder surgery   NHS / linker coupled anti-inflammatory or bacteriostatic / sterilizing as described above The drug may be used to prevent adhesions, stenosis, and infection during open or laparoscopic gallbladder surgery. And can be applied locally to the anastomosis / resection site. 9.Colonoscopy use   This technology can be used to control steroids, NSAIDS, and inflammatory bowel disease (IBD). Apply selected small molecule anti-inflammatory drugs such as You can have. Caused by Crohn's disease or ulcerative colitis Inflammation of the colon is used to promote healing, reduce inflammation, and prevent stenosis. Lectins and cell adhesion inhibitors and antiproliferatives can be applied topically. Ten.Spinal cord and peripheral nerves   TRH or NGF, BNDF, CNTF, PTN, coupled to NHS via a linker Truncated or damaged neurotrophic growth factors such as MK or NT II This technique can be used during open repair surgery of the spinal cord or injured or severed peripheral nerves. Can be used locally to improve nerve regeneration. 11．lung   Using this technique, anti-inflammatory and antimicrobial agents can be used to biopsy or constrict a site in the respiratory tract. (When confirmed and seen through the bronchi). Also in the same way After biopsy of procoagulant / peptide coupled to NHS ester via linker Whether topical application can stop or assist in stopping bleeding Can be. Selected thrombin linked to NHS ester via linker Topical application of inhibitors can help inhibit growth of small cell lung cancer Alternatively, it can be a combination therapy of surgical resection. 12．Dentistry   Apply anticoagulant and antibacterial agent to alveolar tooth after tooth extraction to prevent bleeding and infection Can be. Topical application of selected antibiotics such as tetracycline With gingivitis and gingival disintegration due to keeping the drug adhered to the site Appearing proteases can be inhibited. 13.ENT Surgery   In a similar manner, these procoagulants and antimicrobial agents are coupled to the NHS via a linker. Bleeding and feeling during the operation such as tumor resection Can be applied topically to prevent dyeing. Coagulation promotion coupled to NHS Drugs are used to treat epistaxis, especially severe recurrent postseptal hemorrhage (posteri or septal bleed). 14.Intratumoral application   With this NHS / linker technology, tumor cells can be sustained for days to weeks. Slow and sustained release of anticancer drug into tumor to kill vesicles It is. This encapsulates antiproliferative agents via reactive linker technology to reactive NHS esters. This is made possible by injecting the pulled one into the tumor. NHS The injected drug reacts with the tumor's anastomosis and cellular components after injection. From these colonization sites, the binding site is degraded into the tumor and released gradually. Can be. 15．Radiation therapy using a catheter   As a replacement for radioactive implants or as an alternative to injection of radioactive liquid Many uses are considered.192Ir and32P had previously had restenosis It is known to reduce coronary restenosis in affected patients. Coronal movement Intravenous radiation therapy has been shown to reduce intimal hyperplasia that is part of restenosis You.137Cs,89Sr and90Sr,32P, iodine125I and131I,192Ir,90Y,90Y / Sr , Bismuth, radium, in the mouth, lips, breast, anus, vagina, thyroid, bone marrow, lungs, And it is used for internal treatment of various cancers such as prostate. Preoperative and in many cancers Intraoperative radiation therapy has been shown to reduce the risk of tumor shrinkage or tumor expansion Have been. Internal radiotherapy kills small amounts of cancer that may remain after surgery Also used to destroy.   All of these isotopes can be covalently linked to the tumor itself or around the tumor, In palliative, curative, or curative therapy, or as an adjunct to other therapies Could be used.   For example,32P is determined by using NHS phosphodiester or triester. Can be covalently linked to tissue or membrane proteins.   Other radioisotopes51Cr,52Mn,62Mg,57Ni,55Co and58P,55Fe Applicants' complex as a complex of any radiometal or as a chelate of these metals Technology. Preferred radioisotopes are beta and gamma radiation Things. 16．Immunosuppressive activity   To apply topically to organs before transplantation to prevent immune responsiveness and organ rejection , Cyclosporine and its derivatives, corticosteroids, sulfasalazine, Also activates thalidomide, methotrexate, OKT3, peptide-T, or T cells Alternatively, various immunosuppressants such as drugs that inhibit adhesion are useful. Such drugs The drug can be used to remove tissue (e.g., to remove the heart, lungs, liver) or to the recipient. Can be applied locally just before resuming blood flow. Such immunosuppression The drug prevents host antigens from being recognized by Facilitates short-term receptivity of the transplanted organ and allows the transplanted organ to survive longer To facilitate. 17．Delivery into the heart   The purpose of making the selected drug persistent over a period of days to weeks With the NHS / linker technology of the present invention, the selected agent can be slowly and It is possible to make it exist continuously. Such drugs may be thoracotomy or open heart During surgery, pericardial and percutaneous delivery catheters Or by direct injection into the epicardium, myocardium, and endocardium. Would. Drugs that can be delivered in this manner include the following NHS derivatives: To control heart rate and dysrhythmia disopyramide, quinidine, Antiarrhythmic drugs such as myodarone; administered to epicardial space to control epicarditis Anti-inflammatory drugs such as antibiotics or corticosteroids; induce local revascularization Growth factors, such as VEGF or FGF, to increase contractility in a compromised heart Methylxanthine, digitalis, or phosphodies Cardiotonic agents such as esterase inhibitors. 18．Delivery into the bone marrow   The purpose of making the selected drug persistent over a period of days to weeks With this technology, the selected drug is slowly and continuously present in the spinal cord It is possible. Provide or prior to providing chemotherapy to treat leukemia To provide growth factors that facilitate the production of cardiovascular cells, such drugs should be lengthened. It can be delivered to the vascular lumen of the bone. Such growth factors include granulocyte colonies -Stimulating factor (G-CSF), Granulocyte / monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), Erythropoietin , Thrombopoietin and interleukin-3. 19.Intravascular delivery     The aim of making the selected drug persistently present over a period of days to weeks With the NHS / linker technology of the present invention, selected drugs can be (Artery / Vein) Slowly and persistently due to irrigation or catheter delivery It is possible to do. Drugs used for such purposes include antithrombotic agents , Antiproliferative agents to prevent restenosis (methotrexate, colchicine, angiopep Tin or heparin derivatives), vascular disruption associated with aneurysms and restenosis Protease inhibitors to prevent, radiation therapy or DNA delivery to suppress growth Endostatin or angiostatin NHS to reduce vascular formation Inhibition of angiogenesis such as derivatives or oligonucleotides, cDNA or naked DNA And growth factors VEGF and FGF which promote vascular regeneration. Nitroprusside, etc. Drugs such as nitroso or other nitric oxide donors are damaged It will be beneficial in restoring normal vascular function in the tissue. Recanalization, angioplasty or Leukocyte cell adhesion caused in response to damage such as tent placement Oligosaccharides and cyclodextrins for the purpose of inhibiting vascular injury and inflammation by inhibiting Strands or other drugs, such as mannose derivatives, are placed at the vascular lumen interface. Covalent attachment can be achieved through NHS derivatization. In the organization of such drugs Placement and covalent attachment at certain sites to improve retention and drug delivery Reactive functional groups are required to promote cell attachment and enhance cell loading and uptake. And invitation It may be advantageous to make it conductive.container   The therapeutic compound of the present invention is administered as a sterile liquid (preferably as a room temperature storage product). Enclosed in vials or lyophilized in vials for reconstitution Be mounted. Ensure solubility and stability of the solution (diluent if lyophilized) For this purpose, a low concentration of a certain organic solvent may be contained. Liquid or after reconstitution Contain the highest possible concentration of the therapeutic compound. Each batch of therapeutic compound Iars may be required to treat each indication for the compound, or to treat a disease or condition. Excessive amounts of therapeutic substances required for diagnosis will be included.Choice of delivery method   Several methods may be chosen for local delivery of the therapeutic agent. a)Cleaning the open surgery area:   Therapeutic compounds need to be administered locally to support open surgery. There are many indications to use. In these cases, the therapeutic compound is delivered to the surgical site (if Or a portion of the site) for irrigation before suturing, or use a therapeutic compound. Within a limited cavity (e.g., inside or after a section of an artery Briefly in the gastrointestinal tract) and then remove excess fluid. b)Incubation of tissue graft:   Tissue grafts and organs, such as autologous and xenobiotic vein / artery and valve transplants Grafts can be incubated in a therapeutic solution and / or treated Modified to form a covalent bond by refluxing them with a working solution. It can be pre-treated with a therapeutic compound. c)Delivery by catheter:   Part of endoscopic procedures inside organs (e.g. bladder, digestive tract, vagina / uterus), or As an aid to cardiovascular catheterization such as balloon angioplasty The catheter is then used to deliver a therapeutic compound. Standard catheters and new Regular drug delivery catheters and iontophoresis catheters are available. d)Direct injection   Intra-articular cavities, such as joint lumens, can be treated with direct injection of therapeutic compounds. Bioconjugate with surface tissue to maintain the effect of the drug as desired. Can be. Other applications include intramedullary, intratumoral, intravaginal, intrauterine, intestinal, and ear Intraductal, subarachnoid, subcutaneous, intraarticular, intraperitoneal, or intraocular injection and via bronchoscopy Via nasogastric tube, and via renal fistuloplasty It is.Dosage for patients   The compounds of the present invention can be administered to mammals, preferably humans. Locally Delivery of therapeutically active compounds seeks to obtain local rather than systemic effects Should be determined as a function of patient weight or body surface area. Is not appropriate. For some therapeutic compounds, even if an overdose Significant danger to the safety or toxic effects of topical compounds in local areas There is no. In such cases, it is not possible to formulate the drug at a fixed concentration of the therapeutic compound. The binding that forms the conjugate at the highest possible density is The activity of the localized drug on cells and proteins forming the inner lining of the region Be delivered to the site to maintain therapeutic levels for as long as possible Optimized for However, do some therapeutic compounds have optimal dosage levels? (Usually calculated based on the conjugation density per body surface area) ). In such cases, the conjugation density per body surface area is a) surface Site preparation, b) reaction time and conditions (e.g., temperature), c) therapeutic compound concentration in solution, And d) controlled as a function of solution pH and buffer.Administration issues   The key factors in local delivery of therapeutic agents are: a) Target tissue Keep the density of conjugation binding to the drug constant; b) Minimize local tissue irritation or other side effects; and Minimize the amount of a given therapeutic compound that can be transferred systemically. these In order to achieve the target, as many surface "debris" (e.g. Blood cells, loose protein, etc.). And is important. This ensures a uniform density of conjugation bonds. While keeping the amount of bioconjugated compound as large as possible and It can remain in close proximity to the administered area. Compound solution, pH, and buffer Conjugation binding to administration site surface by optimizing fur Level is maximized. Removal of residual solution from open surgical area The amount of therapeutic compound that can migrate is minimized.   The present invention is further, but not exclusively, limited by the following examples. Can be explained.                                   Example Example 1 Synthesis of NHS derivatives from carboxylic acids without other sensitive functional groups in the molecule   Compounds containing carboxylic acids to be modified that do not contain other sensitive functional groups in the molecule Drug (1 mmol) and N-hydroxysuccinimide (1.1 mmol) in anhydrous dichloromethane (xm L) To the solution is added EDC (2.2 mmol). Allow the solution to stand at room temperature for 20 hours or Stir until done. Next, the reaction product is washed with water and saturated saline, and then dried over anhydrous sodium sulfate. , Filter and concentrate in vacuo. Dissolve the residue in a minimal amount of solvent and Purify by laffy or recrystallize in a suitable solvent system to obtain the NHS derivative. Example 2 NHS from molecules containing amino and / or thiol groups and carboxylic acids Derivative synthesis   NHS derivatives when free amino or thiol groups are present in the molecule It is preferred that these functional groups are protected before adding. For example, If the molecule has a free amino group, before performing the chemical reaction shown in Example 1. Convert the amine to an amine protected with Fmoc or, preferably, tBoc It is necessary. The amine function can be unprotected after preparation of the NHS derivative. And not. Therefore, this method requires the amino group to induce the desired pharmacological effect. Applies only to compounds that do not need to be free. If the molecule If the amino group needs to be released to retain its initial biological properties, Another type of chemical reaction described in Examples 3-6 must be performed. Example 3 NHS derivatives from molecules containing amino or thiol groups and no carboxylic acid Synthesis of   If the selected molecule does not contain a carboxylic acid, the molecule is converted to reactive NHS A number of bifunctional linkers can be used to convert to derivatives. example For example, ethylene glycol-bis (succinimidyl succinate) (EGS) and triethyl Is added to a molecule containing a free amino group (10: 1 At high EGS ratios) to give mono NHS derivatives. NHS induction from thiol derivative molecules To produce the body, N- [γ-maleimidobutyryloxy] succinimide ester GMBS and triethylamine in DMF can be used. Ma The reimide group reacts with the free thiol and the NHS derivative reacts on the silica from the reaction mixture. Purified by chromatography or HPLC. Example 4 Synthesis of NHS derivatives from molecules containing multiple chemical functional groups   Each case must be analyzed and resolved in different ways. However, it is commercially available Because of the large number of protecting groups and bifunctional linkers, the present invention preferably Derivatizing the molecule with a chemical reaction of the tip (as described in Examples 1 or 3), Or two steps (including pre-reaction protection of sensitive groups as described in Example 2), or Or any three-step chemistry (protection, activation, deprotection) It is also applicable. Only under exceptional circumstances can a given molecule be activated by NHS Or a multi-step (4 or more) synthesis method to convert to a maleimide derivative Would need to be used. Example 5 Maleimi from molecules containing free amino groups and / or free carboxylic acids Of Derivatives   In order to produce a maleimide derivative from an amino derivative molecule, N- [γ-maleimide Butyryloxy] succinimide ester (GMBS) and triethylamine in DMF Can be used. Succinimide ester groups are free amino groups The maleimide derivative is crystallized from the reaction mixture and chromatographed on silica. Purified by feed or HPLC. Example 6 Maleimide from molecules containing multiple other functional groups and free carboxylic acids Derivative synthesis   If the selected molecule does not contain a carboxylic acid, the molecule is converted to reactive NHS A number of bifunctional crosslinkers can be used to convert to derivatives. For example Reacts free amines with carboxylic groups of MPA using HBTU / HOBt / DIEA activation in DMF To produce a maleimide derivative by reacting maleimide propionic acid (MPA) can be coupled with a free amine.   Alternatively, a number of other commercially available heterobifunctional crosslinkers can be used if necessary. Can be. Example 7 Preparation of rhodamine NHS ester   Rhodamine GreenTM-X, succinimidyl ester, hydrochloric acid mixed isomer is Molecul Commercially available from ar Probes (Eugene, Oregon, USA) which is shown below. It is a cage.Example 8 In vivo addition of NHS-rhodamine   Surgical exposure of left carotid artery using New Zealand rabbits (2 kg), male or female Xylazine (20 mg / kg), ketamine (50 mg / kg), and acepromazine (0 mg (.75 mg / kg) was injected intramuscularly and anesthetized. Separate both carotid arteries, The flow was measured. Insert a catheter (22G) into the arterial section where blood is Washed through catheter with 0.9% sodium chloride until no longer visible.   A 1 cm incubation chamber was created with a ligature in the section area. That The incubation chamber was washed three times with 1 mL of 0.9% sodium chloride. Ten Prepare 0 μl of a 500 μM NHS-rhodamine solution and place it in the incubation chamber. For 3 minutes. Remove excess rhodamine by aspirating with a 1 mL syringe did. Wash the incubation chamber again three times with 100 mL of 0.9% sodium chloride. Was. The incubation chamber was removed from the rabbit and divided into three pieces, It was immersed in 10% formalin for evaluation. Arteries treated with NHS-rhodamine Arteries treated with rhodamine alone showed very high levels of fluorescence, whereas High fluorescence was hardly observed as compared with the background. These results are 2 shows that -damine was covalently attached to the local delivery site. Example 9 [ThreePreparation of [H] -NHS-propionic acid   [ThreeH] -NHS-propionic acid was purchased from Amersham Canada Ltd. (Oakville, Ontario, Canada). O.) and is known in the art from tritium labeled propionic acid. Concentration method, i.e. EDC presence in DMF or methylene chloride of N-hydrosuccinimide It can be prepared by concentration in the presence. Example 10 [ThreeIn vivo pharmacokinetic study of [H] -NHS-propionic acid   Surgical exposure of left carotid artery using New Zealand rabbits (2 kg), male or female Xylazine (20 mg / kg), ketamine (50 mg / kg), and acepromazine (0 mg (.75 mg / kg) was injected intramuscularly and anesthetized. Temporarily ligate a 10 mm section of the carotid artery Take out and 0.9% sodium chloride through cannula to make blood components invisible Washed until it was.   Insert a catheter (18G) into the arterial section and place the angioplasty balloon (above the wire). 2.5 mm / Boston Scientific Inc.) was introduced using the catheter. Vascular injury (angiogenesis) was performed on dissected sections to exclude the intimal cell layer. Blood vessels Plastic balloons at different barometric pressures (4, 6, 8, and 10) for 1 minute, 45 seconds between each inflation It was delayed and inflated sequentially. Perform balloon dilation 5 times at 4 different atmospheric pressures, Heparin at 1000 U / kg was infused into the circulation.   The angioplasty balloon was then withdrawn from the artery and the catheter was reintroduced. The arterial section was washed three times with saline and 100 μM [ThreeH] -NHS-Pro Incubate pionic acid for 30 seconds, 3 minutes, or 30 minutes Was. At the end of the incubation period, remove excess incubation solution from the artery. And the sections were washed 5 times with saline. Immediately recover the treated artery [ThreeH] -labeled compound The uptake of the substance into the artery was examined using a scintillation counter (see FIG. 1). 30 After a second incubation, an association efficiency of 2.55% was recorded. 3 minutes and 30 minutes Between, the association efficiency was 5.5 and 6.5%, respectively. We handle arteries efficiently A 3 minute incubation was determined to be sufficient to perform the assay.   When examining retention levels, 100 μM [ThreeH] -NHS-propionic acid or [ThreeH] -P Incubate the ropionate with the artery for 3 minutes, and then wash the sections five times with saline. Was. Next, the catheter is removed, and the arterial resection site is sutured with a small suture, and the inside of the carotid artery is removed. Blood flow was resumed. Finally, the neck wound was sutured with sutures and the animal was allowed to recover . Three days after the treatment, the animals are overdosed with pentobarbital sodium. The carotid artery section was removed and the presence of the compound was determined using a scintillation counter. Solid. As shown in FIG. 2, in the artery 3 days after the 3 minute incubation. Based on the residual radioactivity,ThreeH] -NHS-propionic acid retention is 10.94%. Was. Figure 3 shows covalently bound propio after a 3 minute incubation. 2 shows the difference in retention efficiency between phosphate and non-covalently bound propionate. A very significant 12-fold retention enhancement was recorded with NHS-propionic acid (incubation 0.66% of the total amount, compared to 0.046% for non-covalent binding). this It is possible that the association of a compound with a tissue is achieved by covalent attachment in vivo. It shows that it is dramatically enhanced. Subsequent blood flow recovery is 72 hours injured rear,[ThreeIt shows that about 10% of [H] -NHS-propionic acid was retained (FIG. 2). this It is important to note that drug retention in tissues using the techniques embodied here is a standard non-shared Literature on binding drugs (Circulation 199489(4) 1518-1524) It is much higher than all topical drug delivery technologies. Example 11 [32Synthesis of [P] NHS derivatives   Protected R and R '(both R and R' are alkyl, phenyl or A oxy group, and X is either oxygen or sulfur, alkoxy, alkyl, and And any other functional groups that are stable under these conditions). A solution of the homodiester (0.1 mmol) and N-hydroxysuccinimide (0.2 mmol) Isopropylethylamine (0.11 mmol) is added, followed by HBTU (0.22 mmol). You. The reaction mixture is stirred at room temperature for 36 hours. DMF is evaporated in vacuo and the residue is methanol ( 10 mL). The methanol solution is filtered to remove insolubles, and the filtrate is evacuated. And dissolve the residue with a minimum amount of methanol. Then add water to form a precipitate And the precipitate is dried in vacuo to give the desired compound.   The yield of the reaction was determined using EDC as the coupling agent as illustrated below. More usually can be improved. R and R 'phosphodiester (0.054 mmol) and And N-hydroxysuccinimide (0.115 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was added to a solution containing EDC. (31 mg, 0.162 mmol) is added. The solution is stirred at room temperature for 24 hours. DMF is vacuum distilled And the residue is further dried at high vacuum. Then the residue is With water (0.12 mL) and water (3.2 mL) is added to form a precipitate. Precipitate with water (3 × 0.8 mL) and dried in vacuo to give a solid product.   Similar conversions can be made with any of the protected phosphonic acid derivatives. You. Example 12   Surgical exposure of left carotid artery using New Zealand rabbits (2 kg), male or female Xylazine (20 mg / kg), ketamine (50 mg / kg), and acepromazine (0 mg (.75 mg / kg) was injected intramuscularly and anesthetized. Surgical resection of the carotid artery, approximately 10 mm long Sections were separated. Cannulate the blood vessel, 0.9% sodium chloride to remove blood components Washed until invisible to the naked eye.   Insert a catheter (18G) into the arterial section and place the angioplasty balloon (above the wire). 2.5 mm / Boston Scientific Inc.) was introduced using the catheter. Vascular injury (angiogenesis) was performed on dissected sections to exclude the intimal cell layer. Blood vessels Plastic balloons at different barometric pressures (4, 6, 8, and 10) for 1 minute, 45 seconds between each inflation It was delayed and inflated sequentially. Perform balloon dilation 5 times at 4 different atmospheric pressures, Heparin at 1000 U / kg was infused into the circulation.   The angioplasty balloon was then withdrawn from the artery and the catheter was reintroduced. The arterial section was washed three times with saline and 100 μM [32P] -NHS- [ Linker] was incubated for 3 minutes. Excessive inflow at the end of the incubation The cubation fluid was withdrawn from the artery and the sections were washed five times with saline. Blood vessels Sutures were sutured to restore blood flow and repair the surgical wound. Animals up to 4 weeks Was returned to the animal farm during the period. [32Retains P] -NHS- [linker] in tissue after injury At predetermined time points, animals were examined by whole body radiography. For this treatment Tissue response can be assessed using standard histomorphometric analysis, The analysis method measures the degree of tissue growth and neoplasia (treated animals) versus (control animals). Vascular wounds and hyperproliferative growth observed under these conditions. To determine whether this form of brachytherapy can suppress It is. Example 13 [131Synthesis of I] -NHS derivatives   With protected amino [131I] -Iodotyrosine (0.1 mmol) and N-hydro Diisopropylethylamine (0.11 mmol) in a solution of xysuccinimide (0.2 mmol) Is added, followed by HBTU (0.22 mmol). Stir the reaction mixture at room temperature for 12 hours . DMF is removed by vacuum distillation and the residue is dissolved in methanol (10 mL). Methanol solution The solution is filtered to remove unwanted matter, the filtrate is concentrated in vacuo, and the residue is Dissolve with. Then, water is added to form a precipitate, and the precipitate is dried in a vacuum. The desired compound is obtained.   The yield of this reaction can be determined using EDC as the coupling agent as exemplified below. This can usually improve. [131I] -Iodotyrosine (0.054 mmol) and And N-hydroxysuccinimide (0.115 mmol) in anhydrous DMF (3 mL) was added to EDC (3 1 mg, 0.162 mmol) are added. The solution is stirred at room temperature for 24 hours. DMF is removed by vacuum distillation The residue is further dried at a high vacuum. The residue is then reduced to a minimum amount of methanol (0 .12 mL) and water (3.2 mL) is added to form a precipitate. The precipitate is washed with water (3 × 0 .8 mL) and dried in vacuo to give a solid product.Example 14131 In vivo pharmacology of I derivatives   Male or female New Zealand rabbits (2Kg) were ligated with xylazine (20mg / kg), Intramuscular anesthesia with ketamine (50 mg / kg) and acepromazine (0.75 mg / kg) Was surgically exposed. The carotid artery was surgically dissected and a section about 10 mm long was isolated . Insert a cannula into the vessel, 0.9% NaCl until no evidence of blood components is visible Rinse with lium.   Insert a catheter (18G) into the arterial section and place an angioplasty balloon (above the wire). 2.5 mm in diameter, Boston Scientific Inc.) was introduced. Vascular wounds on isolated sections Damage (angiogenesis) was performed and the endothelial cell layer was eliminated. Different angioplasty balloons Inflated sequentially for one minute at atmospheric pressure (4, 6, 8 and 10). Between inflation and inflation, There was a 45 second interval. The balloon is deflated 5 times at 4 atm, and the pressure of 1000U / Kg Phosphorus was injected into the blood circulation.   The angioplasty balloon was then withdrawn from the artery and the catheter was reintroduced. Movement The pulse slice was rinsed three times with saline and 100 μM [131I] -NHS- [linker] was isolated Incubated for 3 minutes in arterial sections. Finally, an excess of incubation solution The minute was removed from the artery and the section was rinsed five times with saline. Suture and close blood vessels, blood The flow was revived and the surgical wound healed. Animals were returned to the yard for 4 weeks. After damage By taking a whole body x-ray of the animal at a given point in time,131I] -NHS- [linker -] Was evaluated for tissue retention. Tissue response to this treatment is standard histomorphometry Assay, which is based on tissue growth in treated versus control animals. And the extent of neointima formation (neoitimal) response to vascular wounds and hyperproliferative growth observed under these conditions. This is to determine whether the answer can be restricted. Example 15 Introduction   The product obtained in the following example was purified using a binary HPLC system for Varian (Rainin) separation. Purified by preparative reverse phase HPLC using a system. That is, 5-60% B (0.045% TFA content HTwoO (A) and CH containing 0.045% TFAThreeCN (B)) at 9.5 mL / min with Dynamax C1 8 , 60Å, 8 μm, 21 mm x 25 cm column (Dynamax C18, 60mm, 8μm guard module Λ214 and 254 with a UV detector and a UV detector (equipped with Varian Dynamax UVD II). Detected in nm. Analytical HPLC using Varian (Rainin) binary HPLC system I went there. That is, 5-60% B (0.045% TFA containing HTwoO (A) and CH containing 0.045% TFAThree CN (B)) gradient elution at 0.5 mL / min with Dynamax C18, 60mm, 8μm, 4.6mm × 25cm Column (Dynamax C18, 60mm, 8μm guard module and UV detector (Varian Dya Namax UVD II)) at λ 214 and 254 nm. PE Sci ex API III electrospray biomolecular mass analyzer The analysis was performed. Example 16 Ac-RIARGDFPDDRK-NHTwo・ Synthesis of 4TFA   0.49 mmol / g Fmoc protected Rink Amide MBHA resin (Nova Biochem) 510 mg, 4 equivalents of Fmoc protected amino acid, 4 equivalents of 0.45 MO-benzotriazolate 1-yl-N, N, N ', N-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate (HBT U) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) in N, N-dimethylformamide Solution, 4 equivalents of 2M N, N-diisopropylethylamine (DIEA) in 1-methyl-2-pyrrolidine Non- (NMP) solution, using the piperidine deprotection of the Fmoc group, Ac-RIARGDFPDDRK-NHTwoPep Synthesis of tide was performed. After completion of the sequence, the resin was dried and dried in 990 mg %).   609 mg of Ac-RIARGDFPDDRK-MBHA-resin was added to two 5 mL cleavage cocktails (10 mL Fluoroacetic acid (TFA): 0.75 g phenol; 0.25 g thioanisole; Tandithiol (EDT) and 0.5 mL of water) and shake for 2 hours From the peptide. The filtrates were collected respectively, 5 mL of TFA and 5 mL of CHTwoClTwo Was combined with the filtrate obtained by washing the resin. Concentrate the filtrate to about 10 mL, 40 mL Dry Ice Cooling EtTwoO was added to precipitate the product. Centrifuge the obtained precipitate. Collect by separation, 40 mL dry ice cooled EtTwoResuspend in O, centrifuge, This step was repeated to give 163 mg of the crude peptide (0.084 mmol, 60%) as a white solid. Obtained. Analytical HPLC indicated a purity of about 72%. Example 17 Ac-RIARGDFPDDRK (EGS) -NHTwo・ Synthesis of 3TFA   In a 15-mL centrifuge tube, 46.2 mg of ethylene glycol-bis (succinimidyl Succinate) (EGS) (0.071 mmol) and 8.50 μL triethylamine (0.061 mmol) Was dissolved in 500 μL of DMF. To this vortex mixed solution, 12.2 mg in 100 μL DMF Ac-RIARGDFPDDRK-NHTwoA solution of 4TFA (0.006 mmol) (Example 2) over 30 seconds After dropwise addition, the reaction mixture was allowed to stand at room temperature for 1.5 hours. Add 9.88 μL of TFA (0. 122 mmol), vortex mixed, 15-mL dry ice cooled EtTwoAdd O The product precipitated. Collect the precipitate by centrifugation and remove CHThree1 mL of 0.045% TFA in CN The solid is taken up in 1 mL of 0.045% TFA in water and water, precipitated on a preparative HPLC, and The fractions were collected and lyophilized to give 6.80 mg of a white solid product (0.003 mmol, 50%) I got Analytical HPLC indicates that the purity of the product exceeds 70% and that Rt= 38.17 min (product) and 37.21 min (hydrolysis product), C77H119Ntwenty fourO28(MH+ESI-MS m / z for Calculated value 1827.9, measured value MH2+914.8. The hydrolysis product is C73H1 16 Ntwenty threeO26(MH+) Calculated for ESI-MS m / z 1731.9, found MH.2+866.2 . Example 18 Cell culture   Human isolated vein endothelial cells (HUVEC) obtained from ATCC, heat-inactivated 20% FBS, ECGS150 μg / mL, Penicillin 100 Ui / mL, Streptomycin 100 μg / mL plus 2.2 mg / mL Grown to confluence in medium 199 containing sodium hydrogen carbonate Let 75cmTwo5% CO at 37 ° C in a flaskTwoCells on the first day of seeding and The medium was changed every two days thereafter.   Cells between passages 2-4 were used. Under normal conditions and confluent cultures Confluent cultures mechanically damaged by scraping and scratching The ability of selected RGD-containing agents to inhibit the growth and proliferation of these cells And the rate at which the wound heals or rebuilds the sulcus was measured. Example 19 In vitro cell attachment assay   Standard 48-well cell culture plates (Costar) were prepared with 100 μL fibronectin (PBS) in PBS. 5 and 10 μg / mL), vitronectin (5-10 μg / mL) or HSA 1 overnight, Air dried. Endothelial cells and somatic cells were treated with trypsin (0.25%, w / v) / EDTA (1 mM) (5 mL / 25 cmTwoSurface area), wash twice in PBS, 10 μg / mL fluorescein 5x10 in PBS containing isothiocyanate (FITC)FiveSuspended at 37 ° C for 30 minutes at cells / mL .   Wash labeled cells and incubate 5x10 in incubation medium M199.FiveResuspend cells / mL And incubated with different concentrations of HSA-RGD peptide at 37 ° C. for 30 minutes.   Control and pretreated cells were plated on ECM coated plates at 5x10FourCells / well Apply at density and incubate at 37 ° C for 90 minutes to allow attachment. Twice with PBS After washing, non-adherent cells are removed by aspiration, and the plate Light density was quantified. After dissociation with trypsin, adherent cells were counted again with a hemocytometer. Then, the percentage of cells attached to the ECM was calculated. In this assay The direct effect of HSA-RGD on cell adhesion is not only its effect on wound healing Platelet and leukocyte adhesion and the effect of suppressing leakage after adhesion Tools. Example 20 In vitro cell migration assay   Trypsin / EDTA (5mL / 25cmTwoHarvest cells by surface area treatment and twice with PBS Wash and wash 5x10 in PBS with different concentrations of HSA-RGD peptide.FiveReconstitute at cell / mL concentration And suspended. After incubating the isolated cells at 37 ° C for 30 minutes, Pre-coated type I collagen as chemotractant Add to upper chamber of Transwell chamber (Costar 8.0μm) did. 37 ℃, 5% COTwoAfter incubating for 6 to 18 hours at Cells, remove cells with a Q-tip swab, and add methanol (20%) containing 1% crystal. %) And water (80%). Stain cells for 20 minutes, extract with 10% acetic acid Thereafter, the absorbance was measured at 600 nm. Calculate the number of cells migrated from the standard curve You. Example 21 Matrigel-induced capillary formation   Endothelial cells spontaneously form capillaries when seeded on native ECM. Basement membrane matrix Sigma (Sigma) diluted to 4 mg / mL with cold PBS and placed in a 24-well plate (Coster) Add a total volume of 200 μL to each well. Leave the plate at 37 ° C for 30 minutes to form a gel layer. HUVEC cells in medium containing 20% FBS supplemented with various concentrations of peptideFive Is added to each well, 37 ° C, 5% COTwoAnd incubated for 24 hours. Incubate After washing, wash the cells and fix them in 2% glutaraldehyde for 10 minutes. Subject to microscopic examination. Visual measurement of the effect of RGD peptide on capillary-forming buds , To determine its effect on capillary formation. Example 22 Chicken CAM (chorioallantoic membrane) assay   CAMs in chick embryos can be used to quantify the effects of drugs on angiogenesis. This is a typical in ovo assay. Incubate 10-day-old chicken embryos at 37 ° C and 60% humidity Lab. 1cm so that the CAM at the bottom can be seenTwoWindows are provided. 200 μL of TNFα, Angiogenesis is induced by injecting 5 ng / mL into CAM. 24 hours later, show RGD Add 50 μL of peptide. Cover the window with sterile cellophane tape and incubate the embryos at 37 ° C. Incubate for another 48 hours at 60% humidity. After incubation, CAM tissue Is cut off, and angiogenesis is observed under a microscope. Semi-quantitative inhibition of angiogenesis To assess the effect of the RGD peptide on inhibition of angiogenesis. Example 23 Bioassay for corneal neovascularization   Anesthetize rats and insert small pockets for inserting substances that induce angiogenesis Is made on the cornea. Contains angiogenic factor (VEGF) and different concentrations of RGD peptide Implant a pellet of a sustained release polymer (Hydron) into this pocket (D'Amat o See method for the preparation of a mixture in Hydron by the method; Angiogenesis, 1996). After 3-5 days, Animals are killed and corneal vessels photographed. Evaluate the density of vascular growth and inhibit angiogenesis The activity of the test RGD peptide is determined reflecting the extent. Example 24 In vivo wound healing activity   Anesthetize nude mice with sodium pentobarbital (25 mg / kg ip) Injure the skin with a silver nitrate cautery device. The trauma healed in 3-5 days. In animals treated with RGD peptides that promote wound healing, cell invasion rates and Evaluate for restriction of scarring and scar formation. For higher animal models, a gastrointestinal surgery model To assess RGD peptide for surgical wound healing. Surgically anesthetized rat Open the abdomen and completely cut the duodenum. During surgery, cut end and adjacent end Are treated with the RGD peptide and sutured again. Time to healing, 24-72 of surgical injury Time in these animals by charcoal transit time Restoration of gastrointestinal function assessed and comparison with controls based on histopathological healing rates To evaluate. The ability of RGD peptide to heal the cut end of the gastrointestinal tract over several weeks Examine and evaluate the improvement of the healing process. Example 25 In vivo angiogenesis and anti-metastatic activity   The anti-metastatic activity of such an RGD peptide can be measured in wild-type plants seeded with different human cancer cell lines. Evaluate in mouse. This assay uses defined growth and mass curves The tumor is established to a defined mass above 2 cm using Established in animals Injection of NHS RGD peptide directly into human tumors and local administration of RGD peptide Impact on increased size and mass compared to animals treated with vehicle I do. The effect on antiproliferative activity and angiogenesis was assessed for Determined by direct quantification of tubule formation, cell number, tumor density, and blood flow. Example 26 In vivo anti-restenotic activity   Male or female New Zealand rabbits (2 Kg) were treated with xylazine (20 mg / kg), After intramuscular anesthesia with ketamine (50 mg / kg) and acepromazine (0.75 mg / kg), The carotid artery was surgically exposed. Approximately 10 mm section of carotid artery is temporarily isolated by temporary ligation 0.9% sodium chloride via cannula until no evidence of blood components is visible Rinsed Damage the carotid artery with standard balloon angioplasty Administer RGD. Repair the surgical incision and return the animal to the yard for up to one month after injury. return.   At final sacrifice, isolated damaged vessels are examined by perfusion fixation and recovery I do. The response to the injury was evaluated using computer imaging of the cross section Calculate the intimal to medial ratio and use BrDU for this in vivo assay. Histomorphology is assessed by assessing the degree of cell proliferation in the cell. Local RGD The effect of the peptide on preventing the hyperproliferative response in this model has been shown to reduce the injury vasculature. Figure 2 shows drug interactions in stabilization. Example 27 Ex vivo vascular transplantation   Male or female New Zealand rabbits (2 Kg) were treated with xylazine (20 mg / kg), After intramuscular anesthesia with ketamine (50 mg / kg) and acepromazine (0.75 mg / kg), The carotid artery was surgically exposed. Approximately 20 mm carotid artery section is temporarily isolated by temporary ligation 0.9% sodium chloride via cannula until no evidence of blood components is visible Rinsed The blood vessels were removed and transplanted into the descending aorta. 24 hours after surgery Anesthetize again and measure blood flow using a transonic flow probe to determine thrombosis The presence or absence of the occurrence was examined. The application of NHS RGD for vascular transplantation is It can act as a coagulant. The local application of RGD is Prevent bleeding at the suture site at various times, and also platelet deposition and arterialization (Angiogenesis) can be measured in a variety of uses to define the effect.   Having fully described the invention, those skilled in the art will appreciate the spirit and scope of the appended claims. Many modifications and changes can be made without departing from the scope Will be obvious.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 51/00 Ａ６１Ｐ 9/08 Ａ６１Ｐ 9/00 9/10 9/08 17/02 9/10 31/18 17/02 35/00 31/18 Ａ６１Ｋ 37/02 35/00 43/00 (31)優先権主張番号 ６０／０８６，２０５ (32)優先日 平成10年５月21日(1998．5．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１０７，３９１ (32)優先日 平成10年11月６日(1998．11．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ブリドン，ドミニク，ピー. カナダ国 エイチ２ヴイ ２ビー２ ケベ ック，オートルモン，ステ―キャサリン, シュマン コト 243 (72)発明者 ホームズ，ダレン，エル. カナダ国 エイチ３ジー １ティー３ ケ ベック，モントリオール，ドラモンド ス トリート 3450──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 51/00 A61P 9/08 A61P 9/00 9/10 9/08 17/02 9/10 31/18 17/02 35/00 31/18 A61K 37/02 35/00 43/00 (31) Priority claim number 60 / 086,205 (32) Priority date May 21, 1998 (May 21, 1998) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 107,391 (32) Priority date November 6, 1998 (November 16, 1998) (33) Priority claim country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM) , AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW , MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, Z W (72) Inventor Bridon, Dominic, P. Canada H2V2B2Quebec, Ohio Torumon, stearyl -. Catherine, Chemin things 243 (72) inventor Holmes, Darren, El Canada H. 3 Gee 1 tea 3 Québec, Montreal, Drummond scan Treat 3450

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1. 式:X-Y-Z ［式中、Ｘは創傷治癒剤、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤、抗増殖剤、免疫抑 制剤、抗感染剤および抗癌剤よりなる群から選択され、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる局所送達剤。 2. 前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項1に記載の組成物。 3. 前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項1に記載の組成物。 4. ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物、および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項1に記載の組成物 。 5. ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項5に記載の組成物。 6. Ｘがペプチドである、請求項1に記載の組成物。 7. Ｘが有機分子である、請求項1に記載の組成物。 8. Ｘが放射性同位元素を含む、請求項1に記載の組成物。 9. 式:X-Y-Z ［式中、Ｘは創傷治癒剤、抗炎症剤、抗増殖剤および化学療法剤よりなる群か ら選択され、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる局所送達剤。 10．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項9に記載の組成物。 11．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項9に記載の組成物。 12．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項9に記載の組成物。 13．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項9に記載の組成物。 14．Ｘがペプチドである、請求項9に記載の組成物。 15．Ｘが有機分子である、請求項9に記載の組成物。 16．Ｘが放射性標識されたエレメントである、請求項9に記載の組成物。 17．式:X-Y-Z ［式中、Ｘは創傷治癒特性を有する治療薬であり、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる創傷治癒剤。 18．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項17に記載の組成物。 19．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項17に記載の組成物。 20．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項17に記載の組成物。 21．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項17に記載の組成物。 22．式:X-Y-Z ［式中、Ｘは創傷治癒特性を有するRGD含有ペプチドであり、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる創傷治癒剤。 23．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項22に記載の組成物。 24．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項22に記載の組成物。 25．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項22に記載の組成物。 26．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項22に記載の組成物。 27．RGD含有ペプチドが Ac-RIARGDFPDDRK(EGS)-NH2 であり、ここでEGSはエチレングリコール-ビス(スクシンイミジルスクシネー ト)である、請求項22に記載の組成物。 28．式:X-Y-Z ［式中、Ｘは抗再狭窄剤、抗増殖剤または抗脈管形成剤であり、ここで前記の 薬剤は放射性であり、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる局所送達剤。 29．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項28に記載の組成物。 30．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項28に記載の組成物。 31．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項28に記載の組成物。 32．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項28に記載の組成物。 33．式:X-Y-Z ［式中、Ｘは抗再狭窄剤、抗増殖剤または抗脈管形成剤であり、ここで前記の 薬剤はRGDペプチドを含み、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる局所送達剤。 34．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項33に記載の組成物。 35．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項33に記載の組成物。 36．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項33に記載の組成物。 37．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項33に記載の組成物。 38．RGDペプチドが Ac-RIARGDFPDDRK(EGS)-NH2 であり、ここでEGSはエチレングリコール-ビス(スクシンイミジルスクシネー ト)であり、Acはアセチル化された末端アミノ酸である、請求項33に記載の組 成物。 39．式:X-Y-Z ［式中、Ｘは抗再狭窄剤、抗増殖剤または抗脈管形成剤であり、ここで前記の 薬剤は放射性同位元素を含み、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成する ことができる化学反応性成分である］ で表される化合物からなる局所送達剤。 40．前記固定性血液成分がタンパク質である、請求項39に記載の組成物。 41．前記反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基またはチオール基よりなる群 から選択される、請求項39に記載の組成物。 42．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、マ レイミド-ベンゾイル-スクシンイミド、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシ ンイミドエステル、マレイミドプロピオン酸、イソシアネート、チオールエス テル、チオノカルボン酸エステル、イミノエステル、カルボジイミド、酸無水 物および炭酸エステルよりなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。 43．ＺがN-ヒドロキシスクシンイミドである、請求項39に記載の組成物。 44．放射性同位元素がβ線またはγ線放出物質である、請求項39に記載の組成 物。 45．ある部位に局所投与される治療薬の保持時間を増加させる方法であって、哺 乳動物の局在化部位に、式:X-Y-Z ［式中、Ｘは創傷治癒剤、抗生物質、抗炎症剤、抗酸化剤および化学療法剤よ りなる群から選択される治療薬であり、 Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、 Ｚは前記部位の反応性官能基と反応してそれと1以上の共有結合を形成する ことができる化学反応性基である］ で表される請求項3に記載の化合物を送達することを含んでなる、上記方法。 46．前記デバイスがカテーテル、シリンジ、トロカールおよび内視鏡よりなる群 から選択される、請求項32に記載の方法。 47．前記製剤が脈管内に送達される、請求項32に記載の方法。 48．前記製剤が局所的に送達される、請求項33に記載の方法。 49．前記製剤が動脈内に送達される、請求項33に記載の方法。 50．前記哺乳動物がヒトである、請求項45に記載の方法。 51．創傷部位の創傷治癒を促進する方法であって、式:X-Y-Z[式中、Ｘは創傷治 癒剤であり、Ｙは0〜30個の原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分 上の反応性官能基と反応してそれと共有結合を形成することができる化学反応 性成分である]で表される化合物を、前記部位またはその近傍に適用して、前 記部位またはその近傍の反応性官能基へ前記化合物を共有結合させることを含 んでなる、上記方法。 52．腫瘍を治療する方法であって、式:X-Y-Z[式中、Ｘは抗癌剤であり、Ｙは0 〜30個の原子からなる連結基であり、Ｚは固定性血液成分上の反応性官能基と 反応してそれと共有結合を形成することができる化学反応性成分である]で表 される化合物を、前記腫瘍またはその近傍に適用して、前記腫瘍またはその近 傍の反応性官能基へ前記化合物を共有結合させることを含んでなる、上記方法 。[Claims] 1. Formula: X-Y-Z   Wherein X is a wound healing agent, an antibiotic, an anti-inflammatory, an antioxidant, an antiproliferative, an immunosuppressant,   Selected from the group consisting of drug, anti-infective and anti-cancer agents,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A topical delivery agent comprising a compound represented by the formula: 2. The composition according to claim 1, wherein the fixed blood component is a protein. 3. The group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group   2. The composition according to claim 1, wherein the composition is selected from: 4. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   The composition of claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of:   . 5. The composition according to claim 5, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 6. The composition of claim 1, wherein X is a peptide. 7. The composition of claim 1, wherein X is an organic molecule. 8. The composition of claim 1, wherein X comprises a radioisotope. 9. Formula: X-Y-Z   Wherein X is a group consisting of a wound healing agent, an anti-inflammatory agent, an anti-proliferative agent and a chemotherapeutic agent.   Selected from     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A topical delivery agent comprising a compound represented by the formula: Ten. 10. The composition according to claim 9, wherein said fixed blood component is a protein. 11． A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   10. The composition according to claim 9, wherein the composition is selected from: 12． Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   10. The composition according to claim 9, wherein the composition is selected from the group consisting of a substance and a carbonate. 13. 10. The composition according to claim 9, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 14. 10. The composition according to claim 9, wherein X is a peptide. 15． 10. The composition according to claim 9, wherein X is an organic molecule. 16． 10. The composition according to claim 9, wherein X is a radiolabeled element. 17． Formula: X-Y-Z   Wherein X is a therapeutic agent having wound healing properties,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A wound healing agent comprising a compound represented by the formula: 18． 18. The composition according to claim 17, wherein said fixed blood component is a protein. 19. A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   18. The composition according to claim 17, wherein the composition is selected from: 20. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   18. The composition according to claim 17, wherein the composition is selected from the group consisting of a product and a carbonate. twenty one. 18. The composition according to claim 17, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. twenty two. Formula: X-Y-Z   Wherein X is an RGD-containing peptide having wound healing properties,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A wound healing agent comprising a compound represented by the formula: twenty three. 23. The composition according to claim 22, wherein said fixed blood component is a protein. twenty four. A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   23. The composition according to claim 22, wherein the composition is selected from: twenty five. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   23. The composition according to claim 22, wherein the composition is selected from the group consisting of a product and a carbonate. 26. 23. The composition according to claim 22, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 27. RGD-containing peptide               Ac-RIARGDFPDDRK (EGS) -NHTwo   Where EGS is ethylene glycol-bis (succinimidyl succinate)   23. The composition according to claim 22, which is g). 28. Formula: X-Y-Z   Wherein X is an anti-restenotic, anti-proliferative or anti-angiogenic agent, wherein   The drug is radioactive,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A topical delivery agent comprising a compound represented by the formula: 29. 29. The composition of claim 28, wherein said fixed blood component is a protein. 30. A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   29. The composition according to claim 28, wherein the composition is selected from: 31. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   29. The composition according to claim 28, wherein the composition is selected from the group consisting of a product and a carbonate. 32. 29. The composition according to claim 28, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 33. Formula: X-Y-Z   Wherein X is an anti-restenotic, anti-proliferative or anti-angiogenic agent, wherein   The drug comprises an RGD peptide,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A topical delivery agent comprising a compound represented by the formula: 34. 34. The composition of claim 33, wherein said fixed blood component is a protein. 35. A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   34. The composition of claim 33, wherein the composition is selected from: 36. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   34. The composition according to claim 33, wherein the composition is selected from the group consisting of a product and a carbonate. 37. 34. The composition of claim 33, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 38. RGD peptide             Ac-RIARGDFPDDRK (EGS) -NHTwo   Where EGS is ethylene glycol-bis (succinimidyl succinate)   34) the group of claim 33, wherein Ac is an acetylated terminal amino acid.   Adult. 39. Formula: X-Y-Z   Wherein X is an anti-restenotic, anti-proliferative or anti-angiogenic agent, wherein   The drug contains a radioisotope,     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with a reactive functional group on the fixed blood component to form a covalent bond with it   Is a chemically reactive component that can   A topical delivery agent comprising a compound represented by the formula: 40. 40. The composition of claim 39, wherein said fixed blood component is a protein. 41. A group in which the reactive functional group comprises an amino group, a carboxyl group, or a thiol group;   40. The composition of claim 39, wherein the composition is selected from: 42. Z is N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysulfosuccinimide,   Reimido-benzoyl-succinimide, γ-maleimide-butyryloxysuccinimide   Imide ester, maleimide propionic acid, isocyanate, thiols   Ter, thionocarboxylic acid ester, imino ester, carbodiimide, acid anhydride   40. The composition of claim 39, wherein the composition is selected from the group consisting of: 43. 40. The composition of claim 39, wherein Z is N-hydroxysuccinimide. 44. The composition of claim 39, wherein the radioisotope is a beta or gamma emitter.   object. 45. A method of increasing the retention time of a therapeutic agent administered locally at a site, comprising:   At the site of localization in the mammal, the formula: X-Y-Z   [Wherein X is a wound healing agent, an antibiotic, an anti-inflammatory, an antioxidant, and a chemotherapeutic.   A therapeutic agent selected from the group consisting of     Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms,     Z reacts with the reactive functional group at the site to form one or more covalent bonds therewith   Is a chemically reactive group that can   4. The method of claim 3, comprising delivering the compound of claim 3 represented by: 46. The device comprises a catheter, a syringe, a trocar, and an endoscope;   33. The method of claim 32, wherein the method is selected from: 47. 33. The method of claim 32, wherein the formulation is delivered intravascularly. 48. 34. The method of claim 33, wherein the formulation is delivered locally. 49. 34. The method of claim 33, wherein the formulation is delivered intra-arterially. 50. 46. The method of claim 45, wherein said mammal is a human. 51. A method of promoting wound healing at a wound site, comprising the formula: X-Y-Z [where X is the wound healing   A healing agent, Y is a linking group consisting of 0 to 30 atoms, and Z is a fixed blood component   A chemical reaction that can react with the above reactive functional group to form a covalent bond with it   A compound represented by the formula:   Including covalently bonding said compound to a reactive functional group at or near said site.   The above method. 52. A method of treating a tumor, comprising the formula: X-Y-Z, wherein X is an anticancer agent and Y is 0   A linking group consisting of up to 30 atoms, Z is a reactive functional group on the fixed blood component   Is a chemically reactive component that can react and form a covalent bond with it]   Is applied to the tumor or its vicinity, and the   A method as described above comprising covalently attaching said compound to a flanking reactive functional group   .
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