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JP2002512036A - キセノラブドゥス属のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからの新規殺昆虫性毒素およびそれをコードする核酸配列 - Google Patents

キセノラブドゥス属のＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからの新規殺昆虫性毒素およびそれをコードする核酸配列

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JP2002512036A
JP2002512036A JP2000544804A JP2000544804A JP2002512036A JP 2002512036 A JP2002512036 A JP 2002512036A JP 2000544804 A JP2000544804 A JP 2000544804A JP 2000544804 A JP2000544804 A JP 2000544804A JP 2002512036 A JP2002512036 A JP 2002512036A
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JP
Japan
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seq
nucleic acid
plant
expression
nucleotide sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2000544804A
Other languages
English (en)
Inventor
キャリー クレイマー，バンス
ケント モーガン，マイケル
ロバート アンダーソン，アーン
Original Assignee
ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト filed Critical ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Publication of JP2002512036A publication Critical patent/JP2002512036A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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Abstract

(57)【要約】 その発現が新規の殺昆虫毒素を生じるキセノラブドゥス属のXenorhabdus nematophilus、Xenorhabdus poinariiおよびフォトラブドゥス属のPhotorhabdus luminescensから単離される新規の核酸配列が、本明細書中で開示される。本発明は、昆虫を制御し得る殺昆虫毒素を含有する組成物および処方物も開示する。本発明はさらに、毒素の製造方法に、そして例えば有害昆虫を制御するために微生物中に、あるいは昆虫耐性を付与するためにトランスジェニック植物中にヌクレオチド配列を用いる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、キセノラブドゥス属のキセノラブドゥス・ネマトフィラス（Xenorh
abdus nematophilus）、キセノラブドゥス・ポイナリイ（Xenorhabdus poinarii
）およびフォトラブドゥス属のフォトラブドゥス・ルミネッセンス（Photorhabd
us luminescens）からの新規の毒素、その発現が前記の毒素を生じる核酸配列、
ならびに昆虫を制御するための毒素および対応する核酸配列の製造方法および使
用方法に関する。
【０００２】 有害昆虫（insect pests）は、作物損害の主因である。種々の属の昆虫の侵襲
により、米国だけで毎年約77億ドルが失われている。野外作物の損害の他に、有
害昆虫は野菜および果物栽培者に、そして観賞用花卉の生産者にとって重荷であ
り、そしてそれらは庭師および自家所有者にとって迷惑である。 有害昆虫は、昆虫成長の阻害、昆虫給餌または生殖の妨害、あるいは昆虫の死
を通じて作用する化学殺虫剤の集中的適用により主に制御され得る。良好な昆虫
制御はこのようにして達成され得るが、しかしこれらの化学物質は、時として他
の有益な昆虫にも影響を及ぼし得る。化学殺虫剤の広範な使用に起因する別の問
題は、耐性昆虫変種の出現である。これは種々の耐性管理戦略により一部は軽減
されてきたが、しかし代替的害虫制御剤の必要性が増大している。生物学的昆虫
制御剤、例えばδ−内毒素のような殺昆虫毒素を発現するバシラス属のバシラス
・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）株は、満足のいく結果を伴っ
て適用され、化学殺虫剤に対する代替物または補足物を提供してきた。近年、こ
れらのδ−内毒素のいくつかをコードする遺伝子が単離され、異種宿主中でのそ
れらの発現は、経済的に重要な有害昆虫の制御のためのもう一つの道具を提供す
ることが示されている。特に、トランスジェニック植物中での殺昆虫毒素、例え
ばバシラス属のBacillus thuringiensisのδ−内毒素の発現は、選定有害昆虫に
対する有効な防御を提供し、そしてこのような毒素を発現するトランスジェニッ
ク植物は商業化され、農業経営者が化学的昆虫制御剤を適用するのを低減させた
。さらに、この場合でも、耐性が発生する可能性は残り、２〜３の特定の有害昆
虫だけが制御可能である。その結果として、農業経営者に経済的利益を提供し、
そして環境的に許容可能な新規の且つ有効な昆虫制御剤を発見する必要性は、長
い間感得されてはいたが、しかし依然として実現していない。
【０００３】 本発明は、新規の昆虫制御剤の積年の必要性を記載する。特に必要なのは、経
済的に重要な有害昆虫を標的とし、そして既存の昆虫制御剤に耐性である昆虫系
統を有効に制御する制御剤である。さらに、その適用が環境に及ぼす負担を最小
限にする薬剤が望ましい。 新規の昆虫制御剤の探索において、ヘテロラブドゥス属Heterorhabdusおよび
ステイネルネマ属Steinernemaからのある種類の線虫類はそれらの殺昆虫特性の
ために、特に関心が持たれている。それらは昆虫の幼虫を殺害し、それらの子供
は死んだ幼虫中で育つ。実際、殺昆虫活性は、線虫体内に生息する共生細菌によ
る。これらの共生細菌は、ヘテロラブドゥス属Heterorhabdusの場合にはフォト
ラブドゥスPhotorhabdus、そしてステイネルネマ属Steinernemaの場合にはキセ
ノラブドゥスXenorhabdusである。
【０００４】 本発明は、その発現が、経済的に重要な有害昆虫、特に植物害昆虫に対して非
常に有毒である殺昆虫毒素を生じるキセノラブドゥス属のXenorhabdus nematoph
ilusから単離されるヌクレオチド配列、ならびにそれと実質的に同様のヌクレオ
チド配列に関する。本発明はさらに、ヌクレオチド配列の発現に起因する殺昆虫
毒素、ならびに生存、成長または生殖する有害昆虫の能力を阻害し、あるいは作
物植物における昆虫関連損害および損傷を制限し得る殺昆虫毒素を含有する組成
物および処方物に関する。本発明はさらに、例えば昆虫を制御するための微生物
中での、または昆虫耐性を付与するためのトランスジェニック植物中での毒素の
製造方法ならびにヌクレオチド配列の使用方法に、そして例えば、昆虫感受性領
域または植物を予防的に処置し、あるいは有害昆虫に対する防御または耐性を付
与するために昆虫侵食領域に毒素、組成物または処方物を適用する、毒素ならび
に毒素を包含する組成物および処方物の使用方法に関する。
【０００５】 新規の毒素は、経済的に重要な有害昆虫であるプルテラ・キシロステラ（Plut
ella xylostella）（コナガ）に対して高殺昆虫性である。毒素は多数の昆虫制
御戦略に用いられて、環境に及ぼす衝撃は最小で、最大効力を生じ得る。 一局面によれば、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド569-979、配列
番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列
番号１０、配列番号１２および配列番号１４から成る群から選択されるヌクレオ
チド配列と実質的に同様のヌクレオチド配列、あるいは（ｂ）（ａ）のヌクレオ
チド配列とアイソコーディングするヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子で
あって、その発現が昆虫に対して活性な少なくとも１つの毒素を生じる核酸分子
を提供する。この局面の一実施態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌ
クレオチド569-979、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番
号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４と実質的に
同様のヌクレオチド配列とアイソコーディングする。好ましくは、ヌクレオチド
配列は、配列番号１のヌクレオチド569-979、配列番号１のヌクレオチド1045-23
34、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または
配列番号１４と実質的に同様である。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は、
配列番号２、３、５、７、９、１１、１３および１５から成る群から選択される
アミノ酸配列をコードする。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１
のヌクレオチド569-979、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配
列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４を包含
する。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、pCIB9369（NRRL B-21883）に含
まれる約3.0 kbＤＮＡ断片を包含する。
【０００６】 本発明によれば、本発明の核酸分子の発現に起因する毒素は、コナガPlutella
xylostellaに対する活性を有する。 別の局面において、本発明は、配列番号１のヌクレオチド569-979、配列番号
１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号
１０、配列番号１２および配列番号１４から成る群から選択されるヌクレオチド
配列のそれぞれ連続した20、25、30、35、40、45または50（好ましくは20）塩基
対ヌクレオチド部分と配列が同一である20、25、30、35、40、45または50（好ま
しくは20）塩基対ヌクレオチド部分を包含する単離核酸分子であって、その発現
が昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる核酸分子を提供する。
【０００７】 本発明は、本発明の核酸分子と操作可能的に連結される異種プロモーター配列
を包含するキメラ遺伝子も提供する。さらに本発明は、このようなキメラ遺伝子
を包含する組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、このようなキメラ遺
伝子を包含する宿主細胞を提供する。本発明のこの局面の宿主細胞は、細菌細胞
、酵母菌細胞または植物細胞、好ましくは植物細胞であり得る。さらに本発明は
、このような植物細胞を包含する植物を提供する。好ましくは植物はトウモロコ
シ（maize）である。
【０００８】 さらに別の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ分子の発現により産生される
毒素を提供する。好ましい実施態様によれば、本発明の毒素はコナガPlutella x
ylostellaに対する活性を有する。 一実施態様では、毒素は、NRRL寄託番号B-21883と呼ばれる大腸菌株により産
生される。
【０００９】 別の実施態様では、本発明の毒素は、配列番号２、３、５、７、９、１１、１
３および１５から成る群から選択されるアミノ酸配列を包含する。 殺昆虫的有効量の本発明の毒素を包含する組成物も提供される。別の局面では
、本発明は、昆虫に対して活性である毒素の製造方法であって、（ａ）本発明の
核酸分子と操作可能的に連結される異種プロモーター配列をそれ自体が包含する
キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を得て、そして（ｂ）細胞中で核酸分子を発現
して、昆虫に対して活性である少なくとも１つの毒素を生じる工程を包含する方
法を提供する。
【００１０】 さらに別の局面では、本発明は、本発明の核酸分子を植物に導入することを包
含する昆虫耐性植物の産生方法であって、核酸分子が昆虫を制御するのに有効な
量で植物中で発現可能である方法を提供する。好ましい実施態様によれば、昆虫
は、コナガPlutella xylostellaである。 さらに別の局面では、本発明は、昆虫の制御方法であって、有効量の本発明の
毒素を昆虫に送達することを包含する方法を提供する。好ましい実施態様によれ
は、昆虫はコナガPlutella xylostellaである。好ましくは、毒素は経口的に昆
虫にデリバリーされる。
【００１１】 本発明のさらに別の局面は、所望のサイズの二本鎖無作為（random）断片の集
団に開裂された本発明の核酸分子を突然変異化するための方法であって、（ａ）
二本鎖無作為断片の集団に、各々が二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一構
造の領域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または二本鎖オリ
ゴヌクレオチドを付加し、（ｂ）その結果生じる二本鎖無作為断片およびオリゴ
ヌクレオチドの混合物を一本鎖断片に変性し、（ｃ）その結果生じる一本鎖断片
の集団を、対の一方の成員に関して他方の複製をプライムするのに十分な同一構
造の領域で一本鎖断片のアニーリングを生じてアニール化断片の対を生成し、そ
れにより突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する条件下でポリメラーゼと
ともにインキュベートし、そして（ｄ）第二および第三工程を少なくともさらに
２回反復するが、この場合、第二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が
前回の第三工程からの突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、さらにもう
１回実行すると突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドをさらに生じる工程を包含す
る方法の提供である。
【００１２】 本発明のその他の局面および利点は、本発明の以下の説明および非限定的実施
例から、当業者に明らかになる。 定義 本発明の毒素の「活性」とは、経口活性昆虫制御剤としての毒素機能が有毒作
用を有するか、または昆虫給餌を乱すかまたは妨げ、これが昆虫の死を引き起こ
すこともあるということを意味する。本発明の毒素が昆虫にデリバリーされると
、その結果は典型的には昆虫の死であるか、あるいは昆虫は、毒素を昆虫に利用
可能にする供給源を餌にしない。
【００１３】 「会合される／操作可能的に連結される」とは、物理的に、または機能的に関
連がある２つの核酸配列を指す。例えば、２つの配列が操作可能的に連結され、
あるいはレギュレーターＤＮＡ配列がコードまたは構造ＤＮＡ配列の発現レベル
に影響を及ぼし得るよう位置される場合、プロモーターまたは調節ＤＮＡ配列は
、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列と「会合される」といわれる
。
【００１４】 「キメラ遺伝子」とは、レギュレーター核酸配列が会合核酸配列の転写または
発現を調節しうるよう、プロモーターまたは調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコード
するかまたはタンパク質として発現される核酸配列と操作可能的に連結されるか
または会合される組換え核酸配列である。キメラ遺伝子のレギュレーター核酸配
列は、普通は、天然に見出されるような会合核酸配列に操作可能的に連結されな
い。
【００１５】 「コード配列」とは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲ
ＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに転写される核酸配列である。好
ましくは、ＲＮＡは次に、生物体中で翻訳されてタンパク質を産生する。 昆虫を「制御する（control）」とは、毒性作用により、生存、成長、給餌お
よび／または生殖する有害昆虫の能力を抑制し、あるいは作物植物における昆虫
関連損害または損傷を制限することを意味する。昆虫を「制御する」とは、昆虫
を殺害することを意味し得る場合もあるし、そうでない場合もあり得るが、しか
し好ましくは、昆虫を殺害することを意味する。
【００１６】 毒素を「デリバリーする（deliver）」とは、毒素が昆虫と接触するようにな
り、それが毒性作用を生じて、昆虫を制御することを意味する。毒素は、多数の
既知の経路で、例えば、昆虫が摂取することにより経口的に、またはトランスジ
ェニック植物発現、処方タンパク質組成物（単数または複数）、噴霧可能タンパ
ク質組成物（単数または複数）、毒餌マトリックス、あるいはあらゆるその他の
当業界で既知の毒素デリバリー・システムを介して、昆虫と接触させることによ
り送達され得る。
【００１７】 「発現カセット」とは、本明細書中で用いる場合には、適切な宿主細胞中での
特定のヌクレオチド配列の発現を指示し得る核酸配列であって、終止コドンと操
作可能的に連結される当該ヌクレオチド配列と操作可能的に連結されるプロモー
ターを包含する核酸配列を意味する。それは、典型的には、ヌクレオチド配列の
適正な翻訳に必要な配列も包含する。当該ヌクレオチド配列を包含する発現カセ
ットはキメラでもよく、これは、その構成成分の少なくとも１つがその他の構成
成分の少なくとも１つに関して異種構造であることを意味する。発現カセットは
、天然であるがしかし異種発現に有用な組換え形態で得られたものでもあり得る
。しかしながら、典型的には、発現カセットは宿主に関して異種であり、即ち、
発現カセットの特定の核酸配列は宿主中に天然では生じない、そして形質転換事
象により宿主細胞または宿主細胞の先祖中に導入されていなければならない。発
現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が何らかの特定の外的刺激
に曝された場合にのみ転写を開始する構成性プロモーターの、または誘導可能プ
ロモーターの制御下にあり得る。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーター
はさらに、特定の組織、器官または発生段階に特異的であり得る。
【００１８】 「遺伝子」とは、ゲノム内に位置し、前記のコード配列の他に、発現の制御に
関与する、言い換えればコード部分の転写および翻訳に関与するその他の、主と
して調節性の核酸配列を包含する限定領域である。遺伝子は、その他の５’およ
び３’非翻訳配列および終止配列も包含し得る。存在し得るさらなる要素は、例
えばイントロンである。
【００１９】 「着目の（当該）遺伝子」とは、植物に移入された場合に、所望の特徴、例え
ば抗生物質耐性、ウイルス耐性、昆虫耐性、疾患耐性またはその他の害虫に対す
る耐性、除草剤耐用性、栄養的価値の改良、産業工程での性能の改良、または生
殖能力の変化を植物に付与する任意の遺伝子を指す。「当該遺伝子」は、植物中
での商業的に有益な酵素または代謝物質の産生のために植物に移入されるもので
もあり得る。
【００２０】 「異種（heterologous）」核酸配列とは、それが導入される宿主細胞とは天然
では会合されない核酸配列であって、例えば、天然核酸配列の非天然複数コピー
である。 「同種（homologous）」核酸配列とは、それが導入される宿主細胞と天然で会
合される核酸配列である。
【００２１】 「同種組換え（Homologous recombination）」とは、同種核酸分子間の核酸断
片の相互的交換である。 「殺昆虫性（insecticidal）」とは、好ましくは昆虫を殺害することにより、
それらを制御し得る毒性生物学的活性と定義される。 核酸配列は、核酸配列が参照核酸配列によりコードされるポリペプチドと同一
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、参照核酸配列と「アイソ
コーディングする」。
【００２２】 「単離」核酸分子または単離酵素は、人の手により、その元の環境から離れて
存在し、したがって天然の産物ではない核酸分子または酵素である。単離核酸分
子または酵素は精製形態で存在し得るし、あるいは、非ネイティブ環境、例えば
組換え宿主細胞中に存在し得る。 「核酸分子」または「核酸配列」とは、あらゆる供給源から単離され得る一本
鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの線状セグメントである。本発明の情況では
、核酸分子は、好ましくはＤＮＡのセグメントである。
【００２３】 「ＯＲＦ」とは、開放読取枠を意味する。 「植物」とは、発生のあらゆる段階のあらゆる植物、特に種子植物である。 「植物細胞」とは、プロトプラストおよび細胞壁を包含する、植物の構造的お
よび生理学的単位である。植物細胞は、単離単一細胞または培養細胞の形態であ
り得るし、あるいはより高度な組織化単位、例えば植物組織、植物器官または全
植物体の一部として存在し得る。
【００２４】 「植物細胞培養」とは、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植
物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子および発生の種々の段階の
胚の培養を意味する。 「植物物質」とは、葉、茎、根、花または花部分、果実、花粉、卵細胞、接合
子、種子、切断物、細胞または組織培養、あるいは植物のその他のあらゆる部分
または生成物を指す。
【００２５】 「植物器官」とは、植物の異なる且つ視覚的に構造化および分化した部分、例
えば根、茎、葉、花蕾または胚である。 「植物組織」とは、本明細書中で用いる場合、構造および機能単位に組織化さ
れた植物細胞の一群を意味する。植物界（in planta）のまたは培養中（in cult
ure）の植物のあらゆる組織が含まれる。この用語は、全植物体、植物器官、植
物種子、組織培養および構造的および／または機能的単位に組織化されるあらゆ
る群の植物細胞を含むが、これらに限定されない。前記のような、またはそうで
なければこの定義に包含されるあらゆる特定の種類の植物組織とともに、または
それらの非存在下での、この用語の使用は、あらゆる他の種類の植物組織を排除
するものではない。
【００２６】 「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位を含有し、
ＤＮＡの転写を開始するコード領域の上流の非翻訳ＤＮＡ配列である。プロモー
ター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用する他の要素も含み得る。 「プロトプラスト」とは、細胞壁を有さない、または細胞壁の一部のみを有す
る単離植物細胞である。
【００２７】 「調節要素」とは、ヌクレオチド配列の発現を制御するのに関与する配列を指
す。調節要素は、当該ヌクレオチド配列および終止コドンと操作可能的に連結し
たプロモーターを包含する。それらは、典型的には、ヌクレオチド配列の適正な
翻訳に必要な配列を包含する。 その最も広義において、「実質的に同様の（substantially similar）」とい
う用語は、ヌクレオチド配列に関して本明細書中で用いる場合、参照ヌクレオチ
ド配列に対応するヌクレオチド配列を意味するが、この場合、対応する配列は、
参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一の構造お
よび機能を有するポリペプチドをコードし、例えば、ポリペプチド機能に影響を
及ぼさないアミノ酸変化だけが起こる。望ましくは、実質的に同様のヌクレオチ
ド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする
。実質的に同様のヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との間の同一性のパ
ーセンテージは、望ましくは少なくとも80％、さらに望ましくは少なくとも85％
、好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好まし
くは少なくとも99％である。参照ヌクレオチド配列と「実質的に同様の」ヌクレ
オチド配列は、2XSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄しながら、7％ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、0.5MのNaPO4、1mMのEDTA中で50℃で参照ヌクレオチド配列とハ
イブリダイズし、さらに望ましくは、1XSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄しながら
、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5MのNaPO4、1mMのEDTA中で50℃で、さ
らに望ましくは、0.5XSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄しながら、7％ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）、0.5MのNaPO4、1mMのEDTA中で50℃で、好ましくは、0.1XSSC
、0.1％SDS中で50℃で洗浄しながら、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M
のNaPO4、1mMのEDTA中で50℃で、さらに好ましくは、0.1XSSC、0.1％SDS中で65
℃で洗浄しながら、7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5MのNaPO4、1mMのED
TA中で50℃で参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【００２８】 「合成」とは、天然配列中には存在しない構造的特徴を包含するヌクレオチド
配列を指す。例えば、双子葉および／または単子葉遺伝子のＧ＋Ｃ含量および正
常コドン分布をより厳密に似せた人工配列は、合成であるといわれる。 「形質転換」とは、宿主細胞または生物体中に異種核酸を導入するための方法
である。特に、「形質転換」とは、当該生物体のゲノム中へのＤＮＡ分子の安定
組込みを意味する。
【００２９】 「形質転換化／トランスジェニック／組換え体」とは、異種核酸分子が導入さ
れた細菌または植物のような宿主生物体を指す。核酸分子は宿主のゲノム中に安
定に組み込まれ得るか、または核酸分子は染色体外分子としても存在し得る。こ
のような染色体外分子は、自己複製し得る。形質転換細胞、組織または植物は、
形質転換工程の最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫も包含する
と理解される。「非形質転換化」、「非トランスジェニック」または「非組換え
」宿主とは、野生型生物体、例えば異種核酸分子を含有しない細菌または植物を
指す。
【００３０】 ヌクレオチドは、以下の標準略語によりそれらの塩基で示される：アデニン（
Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）。アミノ酸は同様に
、以下の標準略語で示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；
Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイ
ン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、
グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；
Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；
Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｐ；Ｐ）、セリン（Ｓ
ｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロ
シン（Ｔｙｒ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。さらに、（Ｘａａ；Ｘ）はあ
らゆるアミノ酸を表す。
【００３１】 配列表中の配列の簡単な説明 配列番号１は、明示したヌクレオチド位置に以下のＯＲＦを含有するキセノラ
ブドゥスネマトフィルスXenorhabdus nematophilusクローンpCIB9369中に包含さ
れた約3.0 kbＤＮＡ断片の配列である。 名称 開始 終止 orf1 569 979 orf2 1045 2334 配列番号２は、クローンpCIB9369のorf1によりコードされた〜15 kDaのタンパ
ク質の配列である。
【００３２】 配列番号３は、クローンpCIB9369のorf2によりコードされた〜47.7 kDaの幼若
ホルモン・エステラーゼ様タンパク質の配列である。 配列番号４は、 キセノラブドゥスネマトフィルスXenorhabdus nematophilus
クローンpCIB9381のorf1のＤＮＡである。 配列番号５は、クローンpCIB9381のorf1によりコードされたタンパク質の配列
である。
【００３３】 配列番号６は、キセノラブドゥス・ネマトフィルス（Xenorhabdus nematophil
us）クローンpCIB9381のorf2によりコードされたＤＮＡ配列である。 配列番号７は、クローンpCIB9381のorf2によりコードされた幼若ホルモンエス
テラーゼ様タンパク質の配列である。 配列番号８は、キセノラブドゥス・ポイナリ（Xenorhabdus poinarii）クロー
ンpCIB9354のorf1のＤＮＡである。
【００３４】 配列番号９は、クローンpCIB9354のorf1によりコードされたタンパク質の配列
である。 配列番号１０は、キセノラブドゥス・ポイナリ（Xenorhabdus poinarii）クロ
ーンpCIB9354のorf2のＤＮＡ配列である。 配列番号１１は、クローンpCIB9354のorf2によりコードされた幼若ホルモンエ
ステラーゼ様タンパク質の配列である。 配列番号１２は、フォトラブドゥス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminesce
ns）クローンpCIB9383-21のorf1のＤＮＡ配列である。
【００３５】 配列番号１３は、クローンpCIB9383-21のorf1によりコードされたタンパク質
の配列である。 配列番号１４は、フォトラブドゥス・ルミネッセンス（Photorhabdus lumines
cens）クローンpCIB9383-21のorf2のＤＮＡ配列である。 配列番号１５は、クローンpCIB9383-21のorf2によりコードされた幼若ホルモ
ンエステラーゼ様タンパク質の配列である。
【００３６】 寄託 以下の物質は、International Recognition of the Deposit of Microorganis
ms for the Purposes of Patent Procedureに関するブダペスト条約の条件下で
、Agricultural Research Service, Patent Culture Collection（NRRL）, 1815
North University Street, Peoria, Illinois 61604に寄託されている。寄託物
質の利用可能性に関する制限はすべて、特許付与時に取り外されて、撤回できな
い。
【００３７】 クローン 寄託番号 寄託日時 pCIB9369 NRRL B-21883 1997年11月12日 pCIB9354 NRRL B-30109 1999年2月25日 pCIB9381 NRRL B-30110 1999年2月25日 pCIB9383-21 NRRL B-30111 1999年2月25日 その発現が殺昆虫毒素を生じる新規の核酸配列 本発明は、その発現が新規の毒素を生じる核酸配列、ならびに有害昆虫を制御
するための毒素の製造および使用に関する。核酸配列は、腸内細菌科の成員であ
るキセノラブドゥス属のXenorhabdus nematophilus、Xenorhabdus poinariiおよ
びフォトラブドゥス属のPhotorhabdus luminescensから単離される。キセノラブ
ドゥスはステイネルネマ属Steinernemaの線虫類の共生細菌である。フォトラブ
ドゥスは、ヘテロラブディティス属Heterorhabditisの線虫類の共生細菌である
。線虫類は昆虫幼虫をコロニー化し、それらを殺害して、それらの子孫は死んだ
幼虫を餌にする。殺昆虫活性は、共生キセノラブドゥスおよびフォトラブドゥス
細菌により実際に生成される。本発明人等は、本発明の核酸配列を単離した最初
の者である。本発明の核酸配列の発現は、鱗翅目昆虫、例えばコナガ属のPlutel
la xylostella（コナガ）を制御するために用いられ得る毒素を生じる。
【００３８】 クローンpCIB9369中の本発明のヌクレオチド配列は、寄託番号NRRL B-21883で
特許寄託に関するブダペスト条約に従って寄託された約3.0 kbのＤＮＡ断片を特
徴とする。このＤＮＡ断片の配列は、配列番号１で記載されている。２つの開放
読取枠（ＯＲＦ）が、配列番号１（ヌクレオチド569-979およびヌクレオチド104
5-2334）中に存在して、予測サイズ15 kDaおよび47.7 kDaのタンパク質（それぞ
れ、配列番号２および３）をコードする。２つのＯＲＦは、オペロン様構造で整
列される。UWGCG Blast and Gapプログラムを用いて各々個々のＯＲＦとの相同
を示す既知の配列に関する探索は、ＯＲＦ＃１に関するいかなる有意の適合も明
示せず、そしてＯＲＦ＃２とバシラス属のBacillus thuringensis cry3Aタンパ
ク質との間の21％の同一性を明示するが、このことは、当業界で有意であるとは
考えられない。BlastプログラムによるpCIB9369のＯＲＦ＃２によりコードされ
るタンパク質のGap分析は、幼若ホルモンエステラーゼ関連タンパク質との30.6
％AA同一性および44.1％AA類似性を同定する（GenBank寄託番号2921553; Heniko
ff et al., PNAS USA 89:10915-10919（1992））。本発明のヌクレオチド配列は
、殺昆虫毒素toxb4をコードする既知のキセノラブドゥスネマトフィルスXenorha
bdus nematophilus配列（WO95/00647）とも比較したが、有意の相同は見出され
ない。3.0 kbＤＮＡ断片は、WO98/08388で公告されたヌクレオチド配列とも比較
される。WO98/08388に記載された38.2 kbＤＮＡ断片からの60ヌクレオチド（60-
mers）の各々の22の配列を、UWGCG Gapプログラムを用いて本発明の3.0 kbＤＮ
Ａ断片と比較する。最初の60-merのヌクレオチド配列は38.2 kbＤＮＡ断片の塩
基１で始まり、他の60-mersは約2.0 kb間隔で位置する。22の配列の各々、なら
びにそれらの相補的配列を検査する。本発明の3.0 kbＤＮＡ断片とこれらの60-m
ersのうちの１つとの間の同一性の最高パーセントは53％であり、これは有意の
相同ではない。さらに、38.2 kb配列の５つの異なるＤＮＡ断片を、サザンブロ
ット分析により、本発明の3.0 kb断片とのハイブリダイゼーションに関して検査
する。それらはいずれも、正のハイブリダイゼーション信号を明示しない。
【００３９】 pCIB9381、pCIB9354およびpCIB9383-21のヌクレオチド配列も、これらのクロ
ーンの各々における２つの開放読み取り枠を明示する。 pCIB9381およびpCIB938
3-21の各々における２つのＯＲＦのヌクレオチド配列は、pCIB9369のものと高度
に相同である。それゆえ、pCIB9381およびpCIB9383-21のＯＲＦ＃２タンパク質
は、pCIB9369のＯＲＦ＃２タンパク質の場合と同様に、幼若ホルモンエステラー
ゼ関連タンパク質と本質的に同じ相同性を有する。 pCIB9354のＯＲＦ＃１のヌ
クレオチド配列はpCIB9369のＯＲＦ＃１のヌクレオチド配列と77％同一であり、
pCIB9354のＯＲＦ＃２のヌクレオチド配列はpCIB9369のＯＲＦ＃２のヌクレオチ
ド配列と79％同一である。pCIB9354のＯＲＦ＃２タンパク質も、幼若ホルモンエ
ステラーゼ関連タンパク質との相同性を有する（29.2％AA同一性および42.2％AA
類似性）。
【００４０】 好ましい実施態様では、本発明は、その発現が殺昆虫毒素を生じる配列番号１
のヌクレオチド569-979、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配
列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４を包含
する。本発明は、本発明の核酸配列を含有する組換えベクターも包含する。この
ようなベクターでは、核酸配列は、好ましくは、ヌクレオチド配列を発現し得る
宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現のための調節素子を包含する発現カセッ
ト中に含まれ得る。このような調節素子は、通常はプロモーターおよび終止コド
ンを包含し、好ましくは、本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドの
有効な翻訳を可能にする素子も含む。核酸配列を含むベクターは、好ましくは染
色体外分子として、特定の宿主細胞中での複製が通常は可能であり、したがって
、宿主細胞中で本発明の核酸配列を増幅するために用いられる。一実施態様では
、このようなベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば細菌、特に大腸菌で
ある。別の実施態様では、このような組換えベクターのための宿主細胞は、内部
寄生植物または着性植物である。このようなベクターのための好ましい宿主細胞
は、真核細胞、例えば酵母菌、植物細胞または昆虫細胞である。植物細胞、例え
ばトウモロコシ細胞は、最も好ましい宿主細胞である。別の好ましい実施態様で
は、このようなベクターはウイルスベクターであり、特定の宿主細胞、例えば昆
虫細胞または植物細胞中でのヌクレオチド配列の複製に用いられる。組換えベク
ターは、宿主細胞中への本発明のヌクレオチド配列の形質転換のためにも用いら
れ、それによりヌクレオチド配列はこのような宿主細胞のＤＮＡ中に安定的に組
み込まれる。一実施態様では、このような宿主細胞は原核細胞である。好ましい
実施態様では、このような宿主細胞は真核細胞、例えば酵母菌細胞、昆虫細胞ま
たは植物細胞である。最も好ましい実施態様では、宿主細胞は植物細胞、例えば
トウモロコシ細胞である。
【００４１】 本発明のヌクレオチド配列は、以下の実施例に記載した技法を用いて、または
ＰＣＲプライマーを構築するための基礎として列挙される配列に記載された配列
を用いたＰＣＲにより単離され得る。例えば、配列番号１のorf1のほぼ最初と最
後の20〜25連続ヌクレオチド（例えば、配列番号１のヌクレオチド569-588およ
び957-976）の配列を有するオリゴヌクレオチドは、供給源株（キセノラブドゥ
スネマトフィルスXenorhabdus nematophilus ATCC 19061株）から直接orf1コー
ド配列（配列番号１のヌクレオチド569-976）を増幅するためのＰＣＲプライマ
ーとして用いられ得る。本発明のその他の遺伝子配列は、ＰＣＲプライマーのた
めの基礎として列挙される配列に記載されたコード配列の末端を用いて、それぞ
れの供給源株からＰＣＲにより同様に増幅され得る。
【００４２】 別の好ましい実施態様では、殺昆虫毒素は、本発明のヌクレオチド配列により
コードされる少なくとも１つのポリペプチドを包含する。本発明の殺昆虫毒素の
分子量は、サイズ分別実験により確定されたように、6,000より大きい。プロテ
イナーゼＫによる処理後、殺昆虫活性の最小低減のみが昆虫バイオアッセイで観
察されるが、これは殺昆虫毒素がプロテイナーゼＫ処理に対して実質的に耐性で
あることを示す。殺昆虫毒素は、22℃または４℃で２週間保存された後、その殺
昆虫活性を保持する。それらは、凍結乾燥され、22℃で2週間保存された後にも
、その殺昆虫活性を保持する。殺昆虫毒素は60℃で５分間のインキュベーション
後も活性であるが、しかし100℃または80℃で５分間インキュベーション後には
、それらはその殺昆虫活性を失う。
【００４３】 さらに別の実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、in vitro組換えまた
はＤＮＡシャッフリングとして知られている技術における無作為突然変異の組み
入れにより修飾され得る。この技術は、Stemmer et al., Nature 370:389-391（
1994）および米国特許第5,605,793号（これらの記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）に記載されている。ヌクレオチド配列の多数の突然変異体コピ
ーが本発明の元のヌクレオチド配列を基礎にして生成され、そして特性の改良、
例えば殺昆虫活性の増大、安定性増強あるいは異なる特異性または標的有害昆虫
範囲を示す変異体が回収される。その方法は、本発明のヌクレオチド配列を包含
する、所望サイズの二本鎖無作為断片に開裂されている鋳型二本鎖ポリヌクレオ
チドから突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する工程を包含し、そしてそ
の結果生じる二本鎖無作為断片の集団に、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して
同一構造の領域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または二本
鎖オリゴヌクレオチドを付加し；その結果生じる二本鎖無作為断片とオリゴヌク
レオチドの混合物を一本鎖断片に変性し；その結果生じる一本鎖断片の集団を、
対の一員が他方の複製をプライムするのに十分である前記の同一構造領域で前記
の一本鎖断片のアニーリングを生じてアニール化断片の対を生成し、それにより
突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを生成する条件下でポリメラーゼとともにイ
ンキュベートし；そして第二および第三工程を少なくともさらに２回反復するが
、この場合、第二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が前回の第三工程
からの突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、さらにもう１回実行すると
突然変異化二本鎖ポリヌクレオチドがさらに生じる工程を包含する。好ましい実
施態様では、二本鎖無作為断片の集団中の単一種の二本鎖無作為断片の濃度は、
総ＤＮＡの１重量％未満である。さらに好ましい実施態様では、鋳型二本鎖ポリ
ヌクレオチドは、少なくとも約100種のポリヌクレオチドを包含する。さらに別
の好ましい実施態様では、二本鎖無作為断片のサイズは、約５bp〜５kbである。
さらに好ましい実施態様では、方法の第四工程は、第二および第三工程を少なく
とも10回反復することを包含する。
【００４４】 異種微生物宿主中でのヌクレオチド配列の発現 生物学的昆虫制御剤として、殺昆虫毒素は、ヌクレオチド配列を発現し得る異
種宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現により生成される。第一の実施態様で
は、その染色体位置に少なくとも１つの本発明のヌクレオチド配列の修飾を包含
するXenorhabdus nematophilus、Xenorhabdus poinariiまたはPhotorhabdus lum
inescens細胞が記載される。このような修飾は既存の調節素子の突然変異または
欠失を包含し、したがってヌクレオチド配列の発現の変更、またはヌクレオチド
配列の発現を制御する新規の調節素子の組入れをもたらす。別の実施態様では、
染色体中への挿入により、またはヌクレオチド配列を含有する染色体外複製分子
の導入により、１つ又はそれ以上のヌクレオチド配列の付加的コピーがXenorhab
dus nematophilus、Xenorhabdus poinariiまたはPhotorhabdus luminescens細胞
に付加される。
【００４５】 別の実施態様では、少なくとも１つの本発明のヌクレオチド配列が、プロモー
ターおよび終止コドンを包含する適切な発現カセット中に挿入される。ヌクレオ
チド配列の発現は構成的であり、あるいは転写を開始するための種々の種類の刺
激に応答する誘導可能プロモーターが用いられる。好ましい実施態様では、毒素
が発現される細胞は、微生物、例えばウイルス、細菌、真菌である。好ましい実
施態様では、ウイルス、例えばバキュウロウイルスは、そのゲノム中に本発明の
ヌクレオチド配列を含有し、そしてヌクレオチド配列のウイルス複製および発現
に適した適切な真核細胞の感染後に多量の対応する殺昆虫毒素を発現する。この
ようにして生成された殺昆虫毒素は、殺昆虫剤として用いられる。あるいは、ヌ
クレオチド配列を含有するよう工学処理されたバキュウロウイルスは、in vivo
で昆虫に感染し、殺昆虫毒素の発現により、またはウイルス感染と殺昆虫毒素の
発現との組合せにより、それらを殺害するために用いられる。
【００４６】 細菌細胞は、本発明のヌクレオチド配列の発現のための宿主でもある。好まし
い実施態様では、植物組織内で生存し、複製し得る非病原性共生細菌、いわゆる
内部寄生植物、または葉圏または根圏をコロニー化し得る非病原性共生細菌、い
わゆる着生植物が用いられる。このような細菌としては、アグロバクテリウム（
Agrobacterium）属、アルカリジーン（Alcaligenes）属、アゾスピリルム（Azos
pirillum）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、バシラス（Bacillus）属、
クラビバクター（Clavibacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エ
ルウィニア（Erwinia）属、フラボバクター（Flavobacter）属、クレブシエラ（
Klebsiella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、リゾビウム（Rhizobium）
属、セラチア（Serratia）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属およびキサ
ントモナス（Xanthomonas）属の細菌が挙げられる。共生真菌、例えばトリコデ
ルマ（Trichoderma）属およびグリオクラジウム（Gliocladium）属も、同じ目的
のための本発明のヌクレオチド配列の発現のための考え得る宿主である。
【００４７】 これらの遺伝子操作のための技術は、異なる利用可能な宿主に特異的であり、
当業界で既知である。例えば、発現ベクターpKK223-3およびpKK223-2は、tacま
たはtrcプロモーターの後ろに、転写または翻訳融合で、大腸菌中で異種遺伝子
を発現するために用いられ得る。多ＯＲＦをコードするオペロンの発現のために
は、最も簡単な手法は、転写融合で、ベクター、例えばpKK223-3中にオペロンを
挿入して、異種遺伝子のコグネイトリボソーム結合部位を使用可能にすることで
ある。グラム陽性種、例えばバシラス属における過剰発現のための技術も当業界
で知られており、本発明の情況で用いられ得る（Quax et al., In: Industrial
Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al.,
American Society for Microbiology, Washington（1993））。過剰発現のため
の代替的系は、例えば酵母菌ベクターによっており、ピキア属Pichia、サッカロ
ミセス属Saccharomycesおよびクルイベロミセス属Kluyveromycesの使用が挙げら
れる（Sreekrishna, In: Industrial microorganisms: basic and applied mole
cular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for M
icrobiology, Washington（1993）; Dequin & Barre, Biotechnology 12:173-17
7（1994）; van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139（1990））。
【００４８】 別の好ましい実施態様では、記載されたヌクレオチド配列のうちの少なくとも
１つが、生物制御特徴を有するシュードモナス属のPseudomonas fluorescens CG
A267356株（公開済み出願EU0472494、およびWO94/01561に記載されている）に移
入され、そこで発現される。別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド
配列は、これも生物制御特徴を有するPseudomonas aureofaciens 30-84株に移入
される。異種生物制御株中での発現は、選定宿主中での複製に適したベクターの
選択およびプロモーターの適切な選定を必要とする。グラム陰性およびグラム陽
性細菌および真菌中での発現のための技術は、当業界で周知である。
【００４９】 植物組織中でのヌクレオチド配列の発現 特に好ましい実施態様では、本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つが、高等生
物、例えば植物中で発現される。この場合、有効量の毒素を発現するトランスジ
ェニック植物は、有害昆虫からそれ自体を防御する。昆虫がこのようなトランス
ジェニック植物を食べ始めると、それは発現された毒素も摂食する。これは、昆
虫が植物組織をさらに噛むのを躊躇させ、あるいは昆虫を傷つけまたは殺害する
ことさえあり得る。本発明のヌクレオチド配列は、発現カセット中に挿入され、
次にこれは、好ましくは前記の植物のゲノム中に安定的に組み込まれる。別の好
ましい実施態様では、ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウイルス中に含入
される。本発明にしたがって形質転換される植物は、単子葉類または双子葉類で
あって、それらの例としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サ
ツマイモ、インゲン、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブ
ロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニ
ンニク、コショウ、セロリ、トウナス、カボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、
ナシ、カリン、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、イチ
ゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ
、マンゴー、バナナ、ダイズ、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、サトウダ
イコン、ヒマワリ、ナタネ、クローバー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファル
ファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、シロイヌナズナArabidopsisおよび
木本植物、例えば針葉樹および落葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】 所望のヌクレオチド配列が特定の植物種中で形質転換されれば、伝統的交配技
術を用いて、それはその種中で増殖され得るし、あるいは同一種のその他の変種
、例えば特に市販の変種中に移され得る。 本発明のヌクレオチド配列は、好ましくは、トランスジェニック植物中で発現
され、したがって、トランスジェニック植物中で対応する毒素の生合成を生じる
。この方法では、昆虫に対する耐性増強を示すトランスジェニック植物が生成さ
れる。トランスジェニック植物中でのそれらの発現のためには、本発明のヌクレ
オチド配列は、修飾および最適化を必要とし得る。多くの場合、微生物からの遺
伝子は修飾を伴わずに高レベルで植物中で発現され得るが、しかしトランスジェ
ニック植物中での低発現は、植物中では好ましくないコドンを有する微生物ヌク
レオチド配列に起因し得る。全生物が、コドン使用に関して特定の好みを有し、
本明細書中に記載したヌクレオチド配列のコドンは、それによりコードされるア
ミノ酸を保持しながら、植物の好みに合うよう変えられ得る、ということが当業
界で知られている。さらに、植物中での高発現は、少なくとも約35％のＧＣ含量
、好ましくは約45％より高い、さらに好ましくは約50％より高い、そして最も好
ましくは約60％より高いＧＣ含量を有するコード配列から最良に達成される。低
ＧＣ含量を有する微生物ヌクレオチド配列は、メッセージを不安定にし得るATTT
Aモチーフ、ならびに不適切なポリアデニル化を引き起こし得るAATAAAモチーフ
の存在のために、植物中で不十分に発現し得る。好ましい遺伝子配列は単子葉類
および双子葉類植物種の両方で適切に発現され得るが、しかし配列は、これらの
選択が異なることが示されている（Murray et al., Nucl. Acids Res. 17:477-4
98（1989））ように、単子葉類または双子葉類の特定のコドン選択およびＧＣ含
量選択を引き起こすように修飾され得る。さらに、ヌクレオチド配列は、メッセ
ージの先端切断を引き起こし得る非正統的スプライス部位の存在に関してスクリ
ーニングされる。前記のようなヌクレオチド内でなされる必要がある変化はすべ
て、公開済特許出願EP0385962（Monsanto）、EP0359472（Lubrizol）およびWO93
/07278（Ciba-Geigy）に記載された方法を用いた特定部位の突然変異誘発、ＰＣ
Ｒおよび合成遺伝子構築の周知の技術を用いて成される。
【００５１】 翻訳の有効な開始のためには、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を要する
。例えば、それらは、植物中で有効であることが知られている配列の含入により
修飾され得る。Joshiは、植物のための適切なコンセンサスを示唆し（NAR 15:66
43-6653（1987））、そしてClontechはさらに別のコンセンサス翻訳イニシエー
ターを示唆している（1993/1994カタログ、210ページ）。これらのコンセンサス
は、本発明のヌクレオチド配列に関する使用に適している。配列は、ＡＴＧを含
めてそこまで（しかし修飾されていない第二アミノ酸は残す）の、あるいはＡＴ
Ｇの後のＧＴＣを含めてそこまで（トランスジーンの第二アミノ酸を修飾する可
能性を有する）のヌクレオチド配列を包含する構築物中に組み入れられる。
【００５２】 トランスジェニック植物中でのヌクレオチド配列の発現は、植物中で機能性で
あることが示されたプロモーターにより駆動される。プロモーターの選定は、発
現のための時間的および空間的要件によって、そして標的種によっても変わる。
したがって、葉、穂、花序（例えば、穂状花序（spikes）、円錐花序（panicles
）、円塊花序（cobs）等）、根、および／または若木における本発明のヌクレオ
チド配列の発現が好ましい。しかしながら、多くの場合、１つより多い種類の有
害昆虫に対する防御が探索され、したがって、多組織中での発現が望ましい。双
子葉類からの多数のプロモーターは単子葉類で操作可能であり、その逆も言える
ことが示されているが、しかし理想的には、双子葉類プロモーターは双子葉類中
での発現のために選択され、そして単子葉類プロモーターは単子葉類中での発現
のために選択される。しかしながら、選択されるプロモーターの出所に対する制
限はない。所望の細胞中でのヌクレオチド配列の発現を駆動するに際して、それ
らが操作可能であることで十分である。
【００５３】 構成的に発現される好ましいプロモーターとしては、アクチンまたはユビキチ
ンをコードする遺伝子からのプロモーター、ならびにCaMV 35Sおよび19Sプロモ
ーターが挙げられる。本発明のヌクレオチド配列は、化学的に調節されるプロモ
ーターの調節下でも発現され得る。これは、作物植物が誘導化学物質で処理され
る場合のみ、殺昆虫毒素が合成されるのを可能にする。遺伝子発現の化学的誘導
のための好ましい技術は、公開済み出願EP0332104（Ciba-Geigy）および米国特
許第5,614,395号に詳述されている。化学的誘導のための好ましいプロモーター
は、タバコPR-1aプロモーターである。
【００５４】 好ましい範疇のプロモーターは、創傷誘導性であるものである。創傷部位で、
そして植物性病原性感染の部位でも発現される多数のプロモーターが記載されて
いる。理想的には、このようなプロモーターは感染の部位で局所的に活性である
だけであるべきで、この方法では、殺昆虫毒素は、侵襲有害昆虫を殺害するため
の殺昆虫毒素を合成する必要がある細胞中に蓄積するだけである。この種の好ま
しいプロモーターとしては、下記に記載されているものが挙げられる：Stanford
et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208（1989）; Xu et al., Plant Molec. B
iol. 22:573-588（1993）; Logemann et al., Plant Cell 1:151-158（1989）;R
ohmeler & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792（1993）; Firek et al. Pl
ant Molec. Biol. 22:129-142（1993）;およびWarner et al. Plant J. 3:191-2
01（1993）。
【００５５】 好ましい組織特異的発現パターンは、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的お
よび花特異的パターンを含む。緑色組織中での発現に適したプロモーターとして
は、光合成に関与する遺伝子を調節する多数のものが挙げられ、これらのうちの
多くは単子葉類および双子葉類の両方からクローン化されている。好ましいプロ
モーターは、ホスホエノールカルボキシレート遺伝子からのトウモロコシPEPCプ
ロモーターである（Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589（1989
））。根特異的発現のための好ましいプロモーターは、Framond（FEBS 290:103-
106（1991）;EP0452269（Ciba-Geigy））により記載されたものである。好まし
い茎特異的プロモーターは、米国特許第号（Ciba-Geigy）に記載されたものであ
り、これはトウモロコシtrpA遺伝子の発現を駆動する。
【００５６】 本発明の特に好ましい実施態様は、根選択または根特異的様式で本発明のヌク
レオチド配列の少なくとも１つを発現するトランスジェニック植物である。さら
に好ましい実施態様は、創傷誘導性または病原感染誘導性様式でヌクレオチド配
列を発現するトランスジェニック植物である。 適切なプロモーターの選択の他に、植物中での殺昆虫毒素の発現のための構築
物は、異種ヌクレオチド配列の下流に結合される適切な転写ターミネーターを必
要とする。いくつかのこのようなターミネーターが利用可能であり、当業界で既
知である（例えば、CaMVからのtm1、rbcSからのE9）。植物中で機能することが
知られているあらゆる利用可能なターミネーターが、本発明の状況下で用いられ
得る。
【００５７】 多数のその他の配列が、本発明に記載した発現カセット中に組み入れられ得る
。これらは、発現を増強することが示されている配列、例えばイントロン配列（
例えば、Adh1およびbronze1から）およびウイルスリーダー配列（例えば、TMV、
MCMVおよびAMVから）を含む。 植物中の異なる細胞局所限定を本発明のヌクレオチド配列の発現の目標にする
のが好ましい。ある場合には、サイトゾルにおける局所限定が好ましいし、一方
他の場合には、いくつかの亜細胞小器官中での局所限定が好ましい。トランスジ
ーンコード化酵素の亜細胞局所限定は、当業界で周知の技術を用いて実行される
。典型的には、既知の細胞小器官標的化遺伝子生成物からの標的ペプチドをコー
ドするＤＮＡが操作され、ヌクレオチド配列の上流に融合される。多数のこのよ
うな標的配列は葉緑体に関して知られており、それらの異種構築物中での機能が
示されている。本発明のヌクレオチド配列の発現は、小胞体に対して、または宿
主細胞の液胞に対しても標的化される。これを達成するための技術は、当業界で
周知である。
【００５８】 植物形質転換に適したベクターは、本明細書中の別の箇所に記載されている。
アグロバクテリウム媒介性形質転換に関しては、バイナリーベクターまたは少な
くとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を保有するベクターが適しているが、一方
、直接遺伝子移入に関しては、あらゆるベクターが適しており、当該構築物のみ
を含有する線状ＤＮＡが好ましい。直接遺伝子移入の場合、単一ＤＮＡ種による
形質転換または同時形質転換が用いられ得る（Schocher et al., Biotechnology
4:1093-1096（1986））。直接遺伝子移入およびアグロバクテリウム媒介性移入
の両方に関して、形質転換は、通常は（しかし必ずしもというわけではなく）、
抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）または除
草剤（バスタbasta）に対する耐性を提供し得る選択可能マーカーを用いて試み
られる。このようなマーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼ
、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、２，２−ジクロロプロピオ
ン酸デハロゲナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、５−エノルピルビル−シ
キメート−ホスフェートシンターゼ、ハロアリールニトリラーゼ、プロトポリリ
ノゲンオキシダーゼ、アセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ、ジヒドロプテロエ
ートシンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびβ−
グルクロニダーゼである。しかしながら、植物形質転換のための選択可能または
スクリーニング可能マーカーの選定は、本発明に取って重要ではない。
【００５９】 前記の組換えＤＮＡは、多数の当業界で既知の方法により、植物細胞中に導入
され得る。当業者は、方法の選択が形質転換のために標的化される植物の種類に
より得る、と理解する。植物細胞を形質転換する適切な方法としては、マイクロ
インジェクション（Crossway et al., Bio Techniques 4:320-334（1986））、
電気穿孔（electroporation）（Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83
:5602-5606（1986））、アグロバクテリウム媒介性形質転換（Hinchee et al.,
Biotechnology 6:915-921（1988）; トウモロコシ形質転換に関してはIshida et
al., Nature Biotechnology 14:745-750（June 1996）も参照）、直接遺伝子移
入（Paszkowski et al.,EMBO J. 3:2717-2722（1984）; Hayashimoto et al., P
lant Physiol. 93:857-863（1990）（イネ））ならびにAgracetus, Inc., Madis
on, Wisconsinおよび Dupont, Inc., Wilmington, Delawareから入手可能な装置
を用いた弾道粒子加速（例えば、Sanford et al., 米国特許第4,945,050号；お
よびMcCabe et al., Biotechnology 6:923-926（1988）参照。Weissinger et al
., Annual Rev. Genet. 22:421-477（1988）; Sanford et al., Particulate Sc
ience and Technology 5:27-37（1987）（タマネギ）；Svab et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 87:8526-8530（1990）（タバコ葉緑体）;Christou et al.,
Plant Physiol. 87:671-674（1988）（ダイズ）;McCabe et al., Bio/Technolog
y 6:923-926（1988）（ダイズ）; Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:4305-4309（1988）（トウモロコシ）; Klein et al., Bio/Technology 6:559
-563（1988）（トウモロコシ）; Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444（1
988）（トウモロコシ）; Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839（1990）;お
よびGordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618（1990）（トウモロコシ）;Koz
iel et al., Biotechnology 11:194-200（1993）（トウモロコシ）; Shimamoto
et al., Nature 338:274-277（1989）（イネ）; Christou et al., Biotechnolo
gy 9:957-962（1991）（イネ）; Datta et al., Bio/Technology 8:736-740（19
90）（イネ）; 欧州特許出願第0 332 581号（カモガヤおよびその他のPooideae
）;Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558（1993）（コムギ）；Weeks et
al., Plant Physiol. 102:1077-1084（1993）（コムギ）; Wan et al., Plant P
hysiol. 104:37-48（1994）（オオムギ）;Jahne et al., Theor. Appl. Genet.
89:525-533（1994）（オオムギ）; Umbeck et al., Bio/Technology 5:263-266
（1987）（ワタ）; Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-112
16（Dec. 1993）（サトウモロコシ）; Somers et al., Bio/Technology 10:1589
-1594（Dec. 1992）（カラスムギ）; Torbert et al., Plant Cell Reports 14:
635-640（1995）（カラスムギ）;Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084
（1993）（コムギ）; Chang et al., WO94/13822（コムギ）、ならびにNehra et
al., The Plant Journal 5:285-297（1994）（コムギ）も参照） が挙げられる
。マイクロインジェクション衝撃によりトウモロコシに組換えＤＮＡ分子を導入
するための特に好ましい組の実施態様は、Koziel et al., Biotechnology 11:19
4-200（1993）、Hill et al., Euphytica 85:119-123（1995）およびKoziel et
al., Annals of the New York Academy of Sciences 792:164-171（1996）に見
出し得る。さらに好ましい実施態様は、欧州特許第0 292 435号に開示されてい
るようなトウモロコシに関するプロトプラスト形質転換法である。植物の形質転
換は、単一ＤＮＡ種または多ＤＮＡ種（即ち同時形質転換）を用いて試みられ、
そしてこれらの両技法は、ペルオキシダーゼコード配列に関する使用に適してい
る。
【００６０】 別の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチドゲノム
中に直接形質転換される。プラスチド形質転換の主な利点は、プラスチドが一般
に、実質的修飾を伴わずに細菌遺伝子を発現し得ること、そしてプラスチドが単
一プロモーターの制御下で多数の開放読取枠を発現し得ることである。プラスチ
ド形質転換技術は、下記において広範に記載されている：米国特許第5,451,513
号、第5,545,817号および第5,545,818号、ならびにＰＣＴ出願WO95/16783、なら
びにMcBride et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305。葉緑
体形質転換のための基本技術は、例えば、biolisticsまたはプロトプラスト形質
転換（例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ媒介性形質転換）を用いて、選択可
能マーカーと側面を接するクローン化プラスチドＤＮＡの領域を当該遺伝子と一
緒に適切な標的組織中に導入することを包含する。ターゲッティング領域と呼ば
れる１〜1.5 kbのフランキング領域は、プラスチドゲノムとの相同的組換えを促
し、したがってプラストームの特定の領域の置換または修飾を可能にする。最初
に、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する耐性を付与
する葉緑体16SｒＲＮＡおよびrps12遺伝子における点突然変異は、形質転換のた
めの選択可能マーカーとして利用される（Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Ma
liga, P.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M.,
and Maliga, P. （1992）Plant Cell 4, 39-45）。これは、標的葉の約１／100
衝撃の頻度で、安定ホモプラスミー性形質転換を生じた。これらのマーカー間の
クローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲッティ
ングベクターの作製を可能にした（Staub, J.M., and Maliga, P.（1993）EMBO
J.12, 601-606）。形質転換頻度の実質的増大は、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−タン
パク質抗生物質耐性遺伝子の、優性選択可能マーカー、即ちスペクチノマイシン
−解毒酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする
細菌aadA遺伝子との置換により得られる（Svab, Z., and Maliga, P.（1993）Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917）。従来、このマーカーは緑藻類クラミ
ドモナス属Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチドゲノムの高頻度形質転換の
ためにうまく用いられてきた（Goldschmidt-Clermont, M.（1991）Nucl. Acids
Res. 19:4083-4089）。プラスチド形質転換に有用なその他の選択可能マーカー
は当業界で知られており、本発明の範囲内に含まれる。典型的には、ホモプラス
チド状態に達するには、形質転換後、約15〜20細胞分裂周期が必要である。相同
的組換えにより各植物細胞中に存在する環状プラスチドゲノムの数千のコピーの
すべてに遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、可溶性植物タンパク質全体の10
％を容易に越え得る発現レベルを可能にするために、核発現遺伝子を上回る利点
である厖大なコピー数を利用する。好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチ
ド配列は、プラスチドターゲッティングベクター中に挿入され、所望の植物宿主
のプラスチドゲノム中で形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含有する
プラスチドゲノムと成因的相同の植物が得られ、ヌクレオチド配列の高発現を選
択的に可能にする。
【００６１】 殺昆虫組成物の配合 本発明は、本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つを含有する組成物も含む。有
害昆虫を有効に制御するために、このような組成物は、好ましくは、十分量の毒
素を含有する。このような量は、防御される作物によって、標的化される特定の
害虫によって、そして環境条件、例えば湿度、温度または土壌の種類によって変
わる。好ましい実施態様では、殺昆虫毒素を含有する組成物は、さらに精製せず
に毒素を発現する宿主細胞を包含する。別の好ましい実施態様では、殺昆虫毒素
を発現する細胞は、殺昆虫剤としてのそれらの使用前に凍結乾燥される。別の実
施態様では、殺昆虫毒素は、宿主細胞から分泌されるように工学処理される。そ
れらが発現される宿主細胞からの毒素の精製が望ましい場合、殺昆虫毒素の種々
の程度の精製が達成される。
【００６２】 本発明はさらに、本明細書中に記載した１つ又はそれ以上の化合物または化合
物群と均質に混合される本発明の殺昆虫毒素の少なくとも１つを含有する組成物
の調製を包含する。本発明は、殺昆虫毒素または殺昆虫毒素を含有する組成物の
植物への適用を包含する植物の処理方法にも関する。殺昆虫毒素は、組成物の形
態で作物領域に、または処理される植物に、さらに別の化合物と同時にまたは逐
次、適用される。これらの化合物は、肥料または微量栄養素供給体または植物成
長に影響を及ぼすその他の調製物であり得る。それらは、選択的除草剤、殺昆虫
剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはこれらの製剤のいくつ
かの混合物でもあり得るし、所望により、処方業界で普通に常用されるさらに別
の担体、界面活性剤または適用促進アジュバントと一緒に用いられ得る。適切な
担体およびアジュバントは、固体または液体であり得るし、処方技術に常用され
る物質、例えば天然または再生無機物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、
結合剤または肥料に対応し得る。
【００６３】 本発明の殺昆虫毒素を適用する好ましい方法は、土壌、水または植物の群葉と
いった、有害昆虫を宿している環境に噴霧することによる。適用回数および適用
率は、有害昆虫による侵食の種類および程度による。殺昆虫毒素は、液体組成物
を植物の場所に含浸させる（全身作用）ことにより、あるいは土壌に固体形態で
、例えば粒状形態で化合物を適用する（土壌適用）ことにより、土壌を介して根
を通って植物に浸透し得る。殺昆虫毒素は、殺昆虫毒素を含有する液体処方物を
種子に含浸させることにより、または固体処方物をそれらにコーティングするこ
とにより、種子に適用され得る（コーティング）。特別な場合、さらに別の種類
の適用、例えば植物の茎または蕾の選択的処理も考え得る。殺昆虫毒素は、地面
の上または下に位置する毒餌としても提供され得る。
【００６４】 殺昆虫毒素は、好ましくは、処方業界で慣用的に用いられるアジュバントと一
緒に、非修飾化形態で用いられ、したがって、既知の方法で乳化濃縮物、被覆可
能ペースト、直接噴霧可能または稀釈可能溶液、稀釈乳濁液、湿潤性粉末、可溶
性粉末、ダスト、顆粒に処方され、そして例えばポリマー物質中に封入される。
組成物の性質と同様に、適用方法、例えば噴霧、霧吹き、散粉、散布または注入
は、意図される目的物および一般的環境にしたがって選択される。
【００６５】 殺昆虫毒素、そして適切な場合には固体または液体のアジュバントを含有する
処方物、組成物または製剤は、既知の方法で、例えば殺昆虫毒素を増量剤、例え
ば溶媒、固体担体と、そして適切な場合には界面活性化合物（界面活性剤）と、
均質に混合および／または粉砕することにより、調製される。 適切な溶媒としては、芳香族炭化水素、好ましくは炭素数が８〜12の分画、例
えばキシレン混合物または置換ナフタレン、フタレート、例えばジブチルフタレ
ートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えばシクロヘキサンまた
はパラフィン、アルコールおよびグリコール、ならびにそれらのエーテルおよび
エステル、例えばエタノール、エチレングリコール、モノメチルまたはモノエチ
ルエーテル、ケトン、例えばシクロヘキサノン、強極性溶媒、例えばＮ−メチル
−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド、ならび
にエポキシド化植物油、例えばエポキシド化ヤシ油またはダイズ油、あるいは水
が挙げられる。
【００６６】 例えば、ダストおよび分散性粉末に用いられる固体担体は、普通は天然無機充
填剤、例えば方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャ
イトである。物理的特性を改良するために、高分散化ケイ酸または高分散化吸収
剤ポリマーを付加することもできる。適切な粒状化吸着性担体は、多孔質型、例
えば軽石、粉砕煉瓦、海泡石またはベントナイトであり、適切な非収着性担体は
、例えば方解石または砂のような物質である。さらに、莫大な数の無機または有
機性の予備粒状化物質、例えばドロマイトまたは粉砕植物残渣が用いられ得る。
【００６７】 適切な界面活性化合物は、良好な乳化、分散および湿潤特性を有する非イオン
性、陽イオン性および／または陰イオン性界面活性剤である。「界面活性剤」と
いう用語は、界面活性剤の混合物を包含するとも理解される。適切な陽イオン性
界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶性合成界面活性化合物の両方であり得る。 適切な石鹸は、高級脂肪酸（炭素数10〜22の鎖）のアルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩、あるいは非置換または置換アンモニウム塩、例えばオレイン酸また
はステアリン酸の、あるいは、例えばヤシ油または獣油から得られる天然脂肪酸
混合物のナトリウムまたはカリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩も用いら
れ得る。
【００６８】 しかしながら、さらにしばしば、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪スルホネ
ート、脂肪スルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル
アリールスルホネートが用いられる。 脂肪スルホネートまたはスルフェートは、通常は、アルカリ金属塩、アルカリ
土類金属塩、あるいは非置換または置換アンモニウム塩の形態であり、アルキル
基のアルキル部分も含めた炭素数8〜22のアルキル基を有し、その例としては、
例えばリグノンスルホン酸の、ドデシルスルホネートの、または天然脂肪酸から
得られる脂肪アルコールスルフェートのナトリウムまたはカルシウム塩がある。
これらの化合物は、脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物の硫酸エステルお
よびスルホン酸の塩も包含する。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ま
しくは、２個のスルホン酸基と炭素数８〜22の１個の脂肪酸基を含有する。アル
キルアリールスルホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフ
タレンスルホン酸、または成る他レンスルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物
のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアミン塩である。対応するホス
フェート、例えば４〜14モルのエチレンオキシドを有するｐ−ノニルフェノール
の付加物のリン酸エステルの塩も適している。
【００６９】 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、脂肪族または脂環式アルコールの、あ
るいは飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエー
テル誘導体であって、前記の誘導体は３〜30個のグリコールエーテル基および８
〜20個の炭素原子を（脂肪族）炭化水素部分に、そして６〜18個の炭素原子をア
ルキルフェノールのアルキル部分に含有する。
【００７０】 さらに適切な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコール、エチレンジ
アミンプロピレングリコールおよびアルキル鎖に１〜10個の炭素原子を含有する
アルキルポリプロピレングリコールを伴うポリエチレンオキシドの水溶性付加物
であって、付加物は、20〜250個のエチレングリコールエーテル基と10〜100個の
プロピレングリコールエーテル基を含有する。これらの化合物は、通常は、１〜
５個のエチレングリコール単位／プロピレングリコール単位を含有する。
【００７１】 非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール
、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付
加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール
およびオクチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソル
ビタンおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレエートの脂肪酸エステルも
適切な非イオン性界面活性剤である。
【００７２】 陽イオン性界面活性剤は、好ましくは、Ｎ置換基として少なくとも１つのＣ8
〜Ｃ22のアルキル基と、さらに別の置換基として低級非置換またはハロゲン化ア
ルキル、ベンジルまたは低級ヒドロキシアルキル基を有する第四級アンモニウム
塩である。塩は、好ましくは、ハロゲン化物、メチルスルホネートまたはエチル
スルフェートの形態であり、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロリド
またはベンジルジ（２−クロロエチル）エチルアンモニウムブロミドである。
【００７３】 当処方業界で常用される界面活性剤は、例えば、“McCutcheon's Detergents
and Emulsifiers Annual,” MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979
、ならびにSisely and Wood,“Encyclopedia of Surface Active Agents,”Chem
ical Publishing Co., Inc. New York, 1980に記載されている。 実施例 以下の詳細な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。これらの実施
例は、説明のためにのみ提供されたものであり、別記しない限り、本発明を限定
するよう意図されていない。ここで用いられる標準組換えＤＮＡおよび分子クロ
ーニング技術は当業界で周知であり、下記の文献に記載されている：Ausubel（e
d.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.
（1994）; T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY（1989）; およびT.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experimen
ts with Gene Fusions, Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY（1984）。
【００７４】 Ａ．その発現が鱗翅目昆虫に対して活性な毒素を生じるヌクレオチド配列の単 離 実施例１：キセノラブドゥス属およびフォトラブドゥス株の増殖 昆虫バイオアッセイのために、ATCC推奨の培地中で25℃で３日間栄養ブロス中
で、以下の株を増殖させる。ＤＮＡ単離のために、培養を同一条件下で24時間増
殖させる。
【００７５】 Xenorhabdus nematophilus ATCC19061株 Xenorhabdus nematophilus Ps1株、USDA単離物 Xenorhabdus poinarii ATCC49122株 Photorhabdus luminescens Ps5株、USDA単離物 実施例２：昆虫バイオアッセイ 固体人工コナガ飼料上での各大腸菌培養の50μlのアリコート化により、コナガP
lutella xylostella（Px）バイオアッセイを実施する（Biever and Boldt, Anna
ls of Entomological Society of America, 1971; Shelton et al., J. Ent. Sc
i. 26:17）。4 mlの飼料を１ozの透明プラスチックカップ（Bioserve product #
9051）中に注ぎ入れる。飼料適合実験室コロニーからの５匹のコナガ新生幼虫を
各飼料含入カップに入れた後、白色紙製蓋（Bioserve product #9049）で覆う。
10匹の幼虫を濃度当たりで検定する。カップのトレーを、72#Ｆで3日間、14:10
（時間）明：暗周期で、インキュベーター中に入れる。次に、各カップ中の生存
幼虫の数を記録する。
【００７６】 実施例３：バイオアッセイの結果 Xenorhabdus nematophilus ATCC19061株のブロスは、実施例２の昆虫バイオア
ッセイにおいて、コナガPlutella xylostella（Ｐｘ）に対して100％死亡率を示
す。Xenorhabdus nematophilus Ps1株、Xenorhabdus poinarii ATCC49122株およ
びPhotorhabdus luminescens Ps5株の各々のブロスは、同様に、実施例２の昆虫
バイオアッセイにおいて、コナガPlutella xylostella（Ｐｘ）に対して100％死
亡率を示す。
【００７７】 実施例４：コスミドライブラリーの構築 100mMのトリスｐＨ８、10 mMのEDTA中に再懸濁した新鮮な増殖化細胞を、2mg/m
lのリゾチームで、37℃で30分間処理することにより、全ＤＮＡを単離する。プ
ロテイナーゼＫを付加して最終濃度を0.5％SDS中100μg/mlとし、45℃でインキ
ュベートする。溶液は透明且つ粘着性になる。SDS濃度を１％に上げて、300mMの
ＮａＣｌおよび等容積のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールを付
加する。標本を5分間静かに混合し、3Kで遠心分離する。これを２回反復する。
次に水性相を0.7容積のイソプロパノールと混合し、遠心分離する。ＤＮＡペレ
ットを70％エタノールで３回洗浄し、0.5XＴＥ中に静かに再懸濁する。6μgのＤ
ＮＡを、100μlの容積中で0.3単位のSau3A／ＤＮＡ１μgで、37℃で3.5分間処理
する。次に標本を65℃で30分間加熱して酵素を不活性化し、次に２単位の仔ウシ
小腸アルカリ性ホスファターゼとともに、37℃で30分間インキュベートする。標
本を等容積のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールと混合し、遠心
分離する。水性相を取り出し、0.7容積のイソプロパノールと混合して、遠心分
離する。ペレットを100 ng/mlの濃度で0.5XＴＥ中に再懸濁させる。
【００７８】 BamHIクローニング部位を利用して、供給元の説明通りに、スーパーコスSuper
Cosコスミドベクター（Stratagene, La Jolla, CA）を調製する。100 ng/mlで調
製されたスーパーコスを、６℃で一夜、５μl容積中で２：１の比で、Sau3Aで予
め消化したX. nematophilusＤＮＡと結紮する。供給元の説明通りに、Gigapack
XL III（Stratagene）を用いて、結紮混合物をパッケージングする。パッケージ
されたファージを、供給元の説明通りにXL-1MR大腸菌細胞（Stratagene）に感染
させる。50μg/mlのカナマイシンを含有するＬ−寒天上にコスミドライブラリー
をプレート化して、37℃で16時間インキュベートする。500コロニーを、新鮮な
Ｌ−kanプレート上に、50コロニー／プレートの密度で寄せ集める。細胞をＬブ
ロスで洗い落として、20％グリセロールと混合し、−80℃で凍結させる。
【００７９】 X. nematophilusの4.2 Mb大型ゲノムの場合には、40 Kbの平均サイズを有する
450クローンはゲノムの４倍適用範囲に対応する。したがって、450クローンのス
クリーニングは、99％の確率であらゆる遺伝子を見出すはずである。 Xenorhabdus nematophilus Ps1株、Xenorhabdus poinarii ATCC49122株および
Photorhabdus luminescens Ps5株からのコスミドライブラリーは、同様の方法で
構築される。
【００８０】 実施例５：殺昆虫活性を有するクローンのコスミドバイオアッセイおよび同定
の結果 コナガPlutella xylostellaに対する活性を有するクローンを生じる昆虫バイ
オアッセイにより、各コスミドライブラリーからの400の大腸菌クローンをスク
リーニングする。 Xenorhabdus nematophilus ATCC 19061株からの殺昆虫コスミ
ドクローンは、pCIB9362として同定される。Xenorhabdus nematophilus Ps1株か
らの42 kb殺昆虫コスミドクローンは、pCIB9379として同定される。Xenorhabdus
poinarii ATCC49122株からの42 kb殺昆虫コスミドクローンは、pCIB9354として
同定される。Photorhabdus luminescens Ps5株からの7 kb殺昆虫コスミドクロー
ンは、pCIB9383-21として同定される。
【００８１】 実施例６：殺昆虫活性を有するサブクローンの単離 クローンpCIB9362をSacIIで消化して、9 kbＤＮＡ断片を単離する。この断片
をSacIIで切断されたBluescriptに結紮する。結紮混合物を、Molecular Cloning
（第二版、Sambrook等）に記載されているようなDH5α大腸菌細胞中で形質転換
させる。形質転換混合物をＬ寒天＋100μg/mlアンピシリン上に載せ、37℃で一
夜インキュベートする。単離コロニーを、100μg/mlアンピシリンおよびMolecul
ar Cloning第二版に記載されているようなアルカリ性ミニプレップにより単離さ
れたプラスミドＤＮＡを含有するＬブロス中で増殖させる。9 kb SacIIクローン
はpCIB9362-3と同定され、コナガに対するバイオアッセイにおいて100％死亡率
を示す。3μgのpCIB9362-3を単離し、0.3単位のSau3A／ＤＮＡ１μgを用いて37
℃で４、６および８分間消化して、75℃で15分間加熱する。標本をプールし、Ba
mHIで予め消化されたpUC19に結紮して、仔ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼで
処理する。結紮物をDH5α大腸菌細胞中で形質転換し、Molecular Cloning第二版
に記載されているようなXgal/Ampを含有するＬ寒天上に載せて、37℃で一夜増殖
させる。白色コロニーを採取して、100μg/mlのアンピシリンおよびプラスミド
ＤＮＡを含有するＬブロス中で増殖させ、前記と同様に単離する。ＤＮＡをEcoR
I/HindIIIで消化し、新規の制限パターンをシーケンシングする。シーケンシン
グプライマーは、Genosys Biotechnologies（Woodlands, TX）から注文する。チ
ェインターミネーター法を用いてシーケンシングを実施し、Applied Biosystems
Inc.377型自動ＤＮＡシーケンサー（Foster City, CA）を用いて、シーケンシ
ングを完了する。Gene Codes Corporation（Ann Arbor, Michgan）からのシーケ
ンサー3.0を用いて、配列を組み立てる。
【００８２】 制限部位の、そして考え得るＯＲＦの同定後、pCIB9362-3をClaIで消化し、3.
0 kb断片を単離し、Bluescript中でクローン化し、DH5α大腸菌細胞中で形質転
換させる。単離コロニーを前記と同様に増殖させて、プラスミドＤＮＡをアルカ
リ法により単離する。サブクローンはpCIB9369と同定され、バイオアッセイにお
いて、コナガに対して100％死亡率を示す。pCIB9369は、USDA ARS特許培養コレ
クションに1997年11月12日に寄託され、NRRL B-21883号として同定される。
【００８３】 CIB9381として同定される20 kb断片は、NotI消化を用いてコスミドpCIB9379か
らサブクローニングされる。 実施例７：バイオアッセイ結果 種々の昆虫に対するpCIB9369に関して、昆虫バイオアッセイを実施する。
【００８４】
【表１】
【００８５】 これらの結果は、pCIB9369における3.0 kbヌクレオチド配列の発現に起因する
殺昆虫毒素がコナガPlutella xylostellaに対して高活性である、ということを
示す。 pCIB9381、pCIB9354およびpCIB9383-21に関するバイオアッセイも、コナガに
対して高殺昆虫活性を示す。
【００８６】 実施例８：殺昆虫活性のサイズ分別 Xenorhabdus nematophilusコスミドクローンpCIB9369および大腸菌宿主DH5中のS
tratagene's Blue Scriptベクターを、50％Terrificブロスおよび50％ルリアブ
ロスを含有し、50μg/mlのアンピシリンを補充した培地中で増殖させる。振盪フ
ラスコ培養（1000 mlバフルドフラスコ中に300 ml）を250 RPMで37℃で一夜増殖
させる。各株の培養を4℃でSorvall GS-3 ローター中で7,000RPMで遠心分離する
。ペレット化細胞を、30 mlの50 mMＮａＣｌ、25 mMトリス塩基、ｐＨ7.0中に再
懸濁する。Branson Model 450音波処理機を用いて、周期間に氷上で冷却しなが
ら約10秒間を８回、音波処理することにより、濃縮細胞を粉砕する。音波処理物
をSorvall SS34ローター中で6,000 RPMで4℃で10分間、遠心分離する。その結果
生じる上清を0.2μのフィルターを通して濾過する。遠心分離化音波処理物から
のペレットを、30 mlの50 mMＮａＣｌ、25 mMトリス塩基、ｐＨ7.0中に再懸濁す
る。
【００８７】 濾液の3ml分画を、10mlの50mMのＮａＣｌ、25mMのトリス塩基、ｐＨ7.0で予め
平衡させておいたBio-Rad Econo-Pac 10DGカラムに適用する。標本投入中に収集
されたフロースルーを廃棄する。ＮａＣｌ−トリス平衡緩衝液各4mlをその後２
回付加しながら、標本を分別する。最初の３つの分画は検査用に取っておく。第
一分画は、約6,000重量ｍｏｌより大きいすべての物質を含有すべきである。そ
の後の分画は、6,000重量ｍｏｌより小さい物質を含有すべきである。
【００８８】 音波処理濾液および音波処理後の再懸濁化ペレットの標本を、10DGカラムから
の３つの分画とともに、表面汚染検定において、コナガ新生幼虫に及ぼす活性に
関して検査する。9369標本からの音波処理物および第一カラム分画の濾過上清は
、コナガに関して高活性である。9369からの第二および第三カラム分画は、活性
でない。Blue Scriptプラスミド培養を用いたDH5aからの標本はいずれも、いか
なる活性も有さない。これらの結果は、 Xenorhabdus nematophilusクローンpCI
B9369、ならびにpCIB9381、pCIB9354およびpCIB9383-21からの相同体に関してコ
ードされる殺昆虫活性が、6,000より大きい分子量であることを示唆する。
【００８９】 実施例９：殺昆虫活性の安定性 100μg/mlのアンピシリンを補足した300mlのルリアブロスを、 pCIB9369に接
種し、37℃で一夜増殖させる。標本を滅菌15mlねじ蓋付管に入れ、22℃および4
℃で保存する。一標本を遠心分離し、上清を除去して、凍結乾燥し、22℃で保存
する。これらの標本をこれらの条件下で２週間保存した後、コナガに対してバイ
オアッセイを実行する。凍結乾燥物質を、標本を凍結乾燥する前と同一容積中に
再懸濁する。全標本を攪拌しながら再懸濁する。別の標本を100℃で５分間処理
する。処理 結果 22℃（２週間） ＋＋ 4℃（２週間） ＋＋ 凍結乾燥（２週間） ＋＋ 100℃で5分間 na na=非活性 実施例１０：殺昆虫活性の熱不活性化 毒素の熱安定性を確定する。大腸菌pCIB9369株（大腸菌宿主DH5a、Xenorhabdu
s nematophilusの3.0 kbＤＮＡを保有）の一夜培養を、ルリアブロスとTerrific
ブロスの50:50混合物中で増殖させる。培養は、試験管ローラー上の培養管中で3
7℃で増殖させる。各培養の1ml標本を1.5mlエッペンドルフ管中に入れ、60℃、8
0℃で放置する。５分後に標本を取り出して、室温に冷却させる。この標本を培
養の未処理部分と一緒に、コナガに関して検定する。50μlの標本を飼料上に散
布して乾燥させ、コナガの新生幼虫を表面に適用する。検定物を室温で５日間イ
ンキュベートする。
【００９０】 未処理標本および60℃で処理した標本は、100％の死亡率を生じる。80℃で処
理した標本および飼料単独対照は、観察可能な死亡率を何も生じない。 実施例１１：殺昆虫活性のプロテアーゼ処理 Xenorhabdus nematophilusコスミドクローンpCIB9369および大腸菌宿主DH5中のS
tratagene's Blue Scriptベクターを、50％Terrificブロスおよび50％ルリアブ
ロスを含有し、50μg/mlのアンピシリンを補充した培地中で増殖させる。振盪フ
ラスコ培養（1000 mlバフルドフラスコ中に300 ml）を250 RPMで37℃で一夜増殖
させる。各株の培養を4℃でSorvall GS-3 ローター中で7,000RPMで遠心分離する
。ペレット化細胞を、30 mlの50 mMＮａＣｌ、25 mMトリス塩基、ｐＨ7.0中に再
懸濁する。Branson Model 450音波処理機を用いて、周期間に氷上で冷却しなが
ら約10秒間を８回、音波処理することにより、濃縮細胞を粉砕する。音波処理物
をSorvall SS34ローター中で6,000 RPMで4℃で10分間、遠心分離する。その結果
生じる上清を0.2μのフィルターを通して濾過する。状勢の1 ml標本をＣａＣｌ2 の付加により5 mMＣａ++に調整する。プロテアーゼＫ（Gibco BRL; Gaithersbur
g, MD）を付加して、500μg/mlとする。標本を37℃で2および24時間インキュベ
ートする。対照標本を調製し、Ｃａ++を付加し、プロテアーゼは含有せずにイン
キュベートする。
【００９１】 遠心分離化音波処理物からのペレットを、30 mlの50 mMＮａＣｌ、25 mMトリ
ス塩基、ｐＨ7.0中に再懸濁する。 pCIB9369からの音波処理濾液および5 mMＣａ++の存在下でインキュベートしたpC
IB9369標本は、コナガPlutella xylostella新生幼虫に関して100％死亡率を生じ
る。Ｃａ++の他にプロテアーゼＫとともにインキュベートされたpCIB9369標本は
、コナガに関してわずかに低い約90％の死亡率を示す。
【００９２】 実施例１２：cry3Aのタンパク質配列および幼若ホルモンエステラーゼのタン
パク質配列を用いた配列比較 pCIB9369のヌクレオチド配列（配列番号１）は、ヌクレオチド569-979および104
5-2334に2つの開放読み取り枠（ＯＲＦ）を明示する。ＯＲＦ＃１は、UWGCG Bla
st and Gapプログラムを用いた探索後、Genbank中のいかなる配列との相同も有
さない。 BlastプログラムによるpCIB9369のＯＲＦ＃２によりコードされるタン
パク質のGap分析は、バシラス属のBacillus thuringensis cry3Aタンパク質との
間の多少非有意の相同（21％の同一性）を同定する。しかしながら、Blastプロ
グラムによるpCIB9369のＯＲＦ＃２によりコードされるタンパク質（配列番号３
）のGap分析は、幼若ホルモンエステラーゼ関連タンパク質との相同（30.6％AA
同一性および44.1％AA類似性）を同定する（GenBank寄託番号2921553; Henikoff
et al., PNAS USA 89:10915-10919（1992））。
【００９３】 pCIB9381、pCIB9354およびpCIB9383-21のヌクレオチド配列も、これらのクロ
ーンの各々における２つの開放読み取り枠を明示する。 pCIB9381およびpCIB938
3-21の各々における２つのＯＲＦのヌクレオチド配列は、pCIB9369のものと全部
で90％以上同一である。それゆえ、pCIB9381およびpCIB9383-21のＯＲＦ＃２タ
ンパク質は、pCIB9369のＯＲＦ＃２タンパク質の場合と同様に、幼若ホルモンエ
ステラーゼ関連タンパク質と本質的に同じ相同性を有する。 pCIB9354のＯＲＦ
＃１のヌクレオチド配列はpCIB9369のＯＲＦ＃１のヌクレオチド配列と77％同一
であり、pCIB9354のＯＲＦ＃２のヌクレオチド配列はpCIB9369のＯＲＦ＃２のヌ
クレオチド配列と79％同一である。pCIB9354のＯＲＦ＃２タンパク質も、幼若ホ
ルモンエステラーゼ関連タンパク質との相同性を有する（29.2％AA同一性および
42.2％AA類似性）。
【００９４】 実施例１３：pCIB9369およびWO98/08388からの配列の配列比較 そのヌクレオチド配列がWO98/08388に記載された38.2 kbＤＮＡ断片から、各々6
0ヌクレオチド（60-mers）の22の配列を得て、pCIB9369を包含するCIB9362-3の
ヌクレオチド配列と比較する。最初の60-merは38.2 kbＤＮＡ断片の塩基１で始
まり、他の60-mersは約2.0 kb間隔でＤＮＡ断片上に位置する。38.2 kbＤＮＡ断
片上のそれらの位置を以下に示す： 1-60; 2,041-2,100; 4,021-4,080; 6,001-6,060; 8,041-8,100; 10,021-10,08
0; 12,001-12,060; 14,041-14,100; 16,021-16,080; 18,001-18,060; 20,041-20
,100; 22,021-22,080; 24,001-24,060; 26,041-26,100; 28,021-28,080; 30,001
-30,060; 32,041-32,100; 34,021-34,080; 36,001-36,060; 38,041-38,100; 38,
161-38,220. UWGCG Gapプログラムを用いて配列を比較し、22の60-mer配列の各々、ならび
にそれらの相補的配列を検査する。これらのアラインメントの結果は、同一性の
最高パーセントが53％であることを示したが、これは当業界では有意の相同では
ない。
【００９５】 実施例１４：WO98/08388配列から得られるプローブを用いたサザンブロット分
析 オリゴヌクレオチドの対を、WO98/08388で公開された38.2 kbＤＮＡ断片のＤ
ＮＡ断片を増幅するよう設計する。オリゴヌクレオチドは、Genosys Biotechnol
ogies（The Woodlands, Texas）から注文する。38.2 kbＤＮＡ断片中のそれらの
位置を、以下に示す。それらの、そして増幅化ＰＣＲ断片のサイズも列挙する： VK1046: 位置20-40 VK1047: 位置2,078-2,100 VK1046およびVK1047を用いて増幅されるＰＣＲ断片のサイズ： 2,080 bp VK1048: 位置11,221-11,241 VK1049: 位置13,360-13,380 VK1048およびVK1049を用いて増幅されるＰＣＲ断片のサイズ： 2,120 bp VK1050: 位置26,581-26,601 VK1051: 位置28,537-28,560 VK1050およびVK1051を用いて増幅されるＰＣＲ断片のサイズ： 1,979 bp VK1052: 位置18,901-18,921 VK1053: 位置20,321-20,340 VK1052およびVK1053を用いて増幅されるＰＣＲ断片のサイズ： 1,439 bp VK1054: 位置34,261-34,281 VK1055: 位置35,320-35,340 VK1054およびVK1055を用いて増幅されるＰＣＲ断片のサイズ： 1,079 bp Perkin-Elmer 9600サーモサイクラーを用いて、以下の条件でＰＣＲ反応を完
了する：94℃、2分；次に94℃で30秒を30回；54℃で30秒；72℃で4分。標本は、
最終容積100μl中に800 ngのXenorhabdus nematophilusＤＮＡ、0.1〜0.5μMの
オリゴヌクレオチドの各対、250μMのｄＮＴＰ、5UのTaqポリメラーゼおよび1X
緩衝液（Perkin-Elmer）を含有する。完了反応物をエタノール中に沈澱させて、
ＴＥ中に再懸濁し、1％SeaPlaque（FMC, Rockland, Maine）ＴＢＥゲル上に載せ
る。電気泳動処理後、エチジウムブロミド染色およびＵＶ光下での可視化後、断
片をゲルから切り出す。ゲル薄片を65℃で融解し、10μlアリコートを10μl蒸留
水と混合し、５分間沸騰させ、氷上に載せる。次に、15μlのRandom Priming標
識緩衝液（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）、6μlのｄＮＴＰミックス（ｄＣＴ
Ｐは含有せず）、80μCiのα−ｄＣＴ32Ｐおよび1μlのクレノウを混合する。標
識反応を、室温で60分で実行する。供給元の忠告にしたがって、Nickカラム（Ph
armacia Biotech）上で標本を浄化する。プローブを５分間沸騰させ、氷上に置
く。
【００９６】 Xenorhabdus nematophilusの全ＤＮＡ、コスミドpCIB9362およびpCIB9363（こ
れらのコスミドは、25 kbに亘って重複し、ともにCIB9369のＤＮＡ断片を含有す
る；pCIB9362はサブクローニングのために用いられた）由来のＤＮＡ、 ClaI、S
acIIまたはHindIIIで消化されたサブクローンpCIB9362-3（9 kb ScaII断片）お
よびpCIB9369（2.96 kb ClaI断片）由来のＤＮＡを消化することにより、サザン
ブロットを実施する。消化反応物を0.75％アガロースＴＢＥゲル上に載せて、一
夜走行させる。写真を撮って、Zeta-Probeハイブリダイゼーション膜にブロッテ
ィングするためにBio-Radが記載したのと同様に、ゲルを処理する。ブロッティ
ング後、膜を80℃で30分間焼き乾かす。次に膜を7％ＳＤＳ、250 mMのリン酸ナ
トリウム、ｐＨ7.2中に入れて、67℃で30分間インキュベートする。新鮮な溶液
を付加し、67℃に平衡させた後、前記の放射性プローブを付加して、一夜ハイブ
リダイズさせる。膜を2 XＳＳＣ、0.5％ＳＤＳ中で67℃で30分間、次に0.5 XＳ
ＳＣ、0.5％ＳＤＳ中で67℃で30分間洗浄する。膜をフィルムに１時間および3時
間露出させる。フィルムを現像する。結果は、WO98/08388配列からのＰＣＲプロ
ーブが本発明に記載したコスミドのＤＮＡまたはサブクローンのＤＮＡとハイブ
リダイズしないことを示す。しかしながら、X. nematophilusを用いて、強ハイ
ブリダイゼーション信号が観察される。
【００９７】 これらの結果は配列比較の結果を確証し、クローンpCIB9369がWO98/08388に記
載されたヌクレオチド配列とは異なることを示す。 Ｂ．異種微生物宿主中での本発明の核酸配列の発現 本発明のヌクレオチド配列の異種発現に適した微生物は、植物または根圏をコ
ロニー化し得るすべての微生物である。そういうものとして、それらは有害昆虫
と接触するようし向けられる。これらの例としては、グラム陰性微生物、例えば
シュードモナス属、エンテロバクター属およびセラチア属、グラム陽性微生物、
例えばバシラス属、ならびに真菌類のトリコデルマ属、グリオクラジウム属およ
びビール酵母菌Saccharomyces cerevisiaeが挙げられる。特に好ましい異種宿主
は、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas cepacia、Ps
eudomonas aureofaciens、Pseudomonas aurantiaca、Enterobacter cloacae、霊
菌Serratia marscesens、枯草菌Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Trichod
erma viride、Trichoderma harianum、Gliocladium virensおよびビール酵母菌S
accharomyces cerevisiaeである。
【００９８】 実施例１９：大腸菌およびその他のグラム陰性細菌中でのヌクレオチド配列の
発現 多数の遺伝子が、異種的方法でグラム陰性細菌中で発現されてきた。発現ベク
ターpKK223-3（Pharmaciaカタログ＃27-4935-01）は、大腸菌中での発現を可能
にする。このベクターは、lacリプレッサーにより調節され、IPTGにより誘導さ
れる強力なtacプロモーターを有する（Brosius, J. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81）。大腸菌中での使用のために、多数のその他の発現系が開発され
てきた。熱誘導性発現ベクターpPL（Pharmacea #27-4946-01）は、タンパク質の
高レベルの発現を可能にする、厳密に調節されたバクテリオファージλを使用す
る。lacプロモーターは発現の別の手段を提供するが、しかしそのプロモーター
はtacプロモーターと同様の高レベルでは発現されない。これらの発現系ベクタ
ーのいくつかに広範な宿主範囲レプリコンを付加すると、密接に関連したグラム
陰性細菌、例えばシュードモナス、エンテロバクター、セラチアおよびエルウィ
ニア属の細菌中でのヌクレオチド配列の発現が可能である。例えば、pLRKD211（
Kaiser & Kroos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5816-5820（1984））は、多
数のグラム陰性細菌中での複製を可能にする広範な宿主範囲レプリコンori Tを
含有する。
【００９９】 大腸菌中では、IPTGによる誘導は、tac（即ちtrp-lac）プロモーターの発現の
ために必要である。この同一プロモーター（例えば、広宿主範囲プラスミドpLRK
D211上の）がシュードモナス中に導入された場合、それはIPTGによる誘導を伴わ
ずに、構成的に活性である。このtrp-lacプロモーターは、このような遺伝子の
構成性発現のためのシュードモナスまたはあらゆるその他の密接に関連した細菌
中での発現のために、当該するあらゆる遺伝子またはオペロンの前方に置かれ得
る。したがって、その発現が殺昆虫毒素を生じるヌクレオチド配列は、強力な構
成性プロモーターの後ろに置かれ、植物または根圏コロニー化特性を有する細菌
に移入されて、この生物体を殺昆虫剤にする。その他の考え得るプロモーターは
、グラム陰性細菌中でのヌクレオチド配列の構成性発現のために用いられ得る。
これらの例としては、例えばシュードモナス調節遺伝子gafAおよびlemA（WO94/0
1561）からのプロモーター、ならびにPseudomonas savastanoi IAAオペロンプロ
モーター（Gaffney et al., J. Bacteriol. 172:5593-5601（1990））が挙げら
れる。
【０１００】 実施例２０：グラム陽性細菌中でのヌクレオチド配列の発現 グラム陽性細菌中でのヌクレオチド配列の異種発現は、殺昆虫毒素のもう一つ
の産生手段である。バシラス属およびストレプトミセス属に関する発現系は、も
っともよく特性化されている。肺炎連鎖球菌Streptococcus pneumoniaeからのエ
リスロマイシン耐性遺伝子（ermR）のためのプロモーターは、グラム陽性好気性
菌および嫌気性菌中で、ならびに大腸菌中でも活性であることが示されている（
Trieu-Cuot et al., Nucl. Acids Res. 18:3660（1990））。チオストレプトン
遺伝子からのさらに別の抗生物質耐性プロモーターは、ストレプトミセスクロー
ニングベクター中で用いられている（Bibb, Mol. Gen. Genet. 199:26-36（1985
））。シャトルベクターpHT3101も、バシラス属中での発現に適している（Lerec
lus, FEMS Microbiol Lett 60:211-218（1989））。このアプローチの有意の利
点は、多数のグラム陽性細菌が、より長い保存寿命を有する殺昆虫剤を生成する
処方物中に用いられ得る花粉を生じることである。バシラス属およびストレプト
ミセス属は、土壌の活動的移住種である。
【０１０１】 実施例２１：真菌類におけるヌクレオチド配列の発現 Trichoderma harianumおよびGliocladium virensは、野外での種々のレベルの
生物制御を提供することが示されている（米国特許第5,165,928号および米国特
許第4,996,157号（ともにCornell Research Foundation））。その発現が殺昆虫
毒素を生じるヌクレオチド配列は、このような真菌類中で発現され得る。これは
、当業界で周知の多数の方法により成し遂げられ得る。１つは、ＰＥＧまたは電
気穿孔媒介技法による真菌のプロトプラスト媒介性形質転換である。あるいは、
粒子衝撃を用いて、再生成熟構造に発達する能力を有するプロトプラストまたは
その他の真菌細胞を形質転換し得る。元々、アスペルギルス属の形質転換のため
に開発され、目下、真菌類の形質転換のために広範に用いられているベクターpA
N7-1（Curragh et al., Mycol. Res. 97（3）:313-317（1992）; Tooley et al.
, Curr. Genet. 21:55-60（1992）; Punt et al., Gene 56:117-124（1987））
は、ヌクレオチド配列を含有するよう工学処理される。このプラスミドは、Aspe
rgillus nidulans gpdプロモーターおよびtrpCターミネーターと側面を接する大
腸菌ヒグロマイシンＢ耐性遺伝子を含有する（Punt et al., Gene 56:117-124（
1987））。
【０１０２】 好ましい実施態様では、本発明の核酸は酵母菌のビール酵母菌Saccharomyces
cerevisiae中で発現される。例えば、pCIB9369、 pCIB9381、pCIB9354またはpCI
B9383からの２つのＯＲＦの各々は、GAL1誘導性プロモーターおよびCYC1ターミ
ネーターを有する個々のベクター中でクローン化される。各ベクターは、アンピ
シリン耐性および２μのレプリコンを有する。ベクターは、なるべく並びにそれ
らの酵母菌増殖マーカーが異なる。構築物は、別個におよび一緒に、ビール酵母
菌中で形質転換させる。ＯＲＦは一緒に発現され、タンパク質発現および殺昆虫
活性に関して検査される。
【０１０３】 Ｃ．殺昆虫毒素の処方物 単離毒素を、あるいはそれを産生し、そして前記の実施例に記載されている細
胞の懸濁液または濃縮物を包含する活性成分を用いて、殺昆虫処方物を製造する
。例えば、殺昆虫毒素を発現する大腸菌細胞を用いて、有害昆虫を制御し得る。
処方物は、液体または固体形態で製造される。それを以下で説明する。
【０１０４】 実施例１８．：殺昆虫組成物の液体処方物 以下の実施例では、組成物のパーセンテージは、重量で示される。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】 水で稀釈することにより、あらゆる必要濃度のエマルションがこのような濃縮
物から製造され得る。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】 これらの溶液は、微小滴の形態での適用に適している。
【０１０９】
【表４】
【０１１０】 活性成分は、塩化メチレン中に溶解され、溶液は担体上に噴霧され、そして溶
媒は実質的に真空で蒸発される。
【０１１１】
【表５】
【０１１２】 易使用性ダストは、担体を活性成分と密接して混合することにより得られる。 実施例１９：殺昆虫組成物の固体処方物 以下の実施例では、組成物のパーセンテージは、重量で示される。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】 活性成分をアジュバントと十分に混合し、混合物を適切なミルで十分に粉砕し
て、水で稀釈されて所望の濃度の懸濁液を生じ得る湿潤性粉末を生成する。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】 水での稀釈により、この濃縮物からあらゆる必要濃度のエマルションが得られ
る。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】 易使用性ダストは、活性成分を担体と混合し、混合物を適切なミルで粉砕する
ことにより得られる。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】 活性成分をアジュバントと十分に混合し、粉砕して、その後混合物を水で湿ら
せる。混合物を押し出した後、空気流中で乾燥させる。
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】 微粉活性成分をミキサー中で、ポリエチレングリコールで湿らせたカオリンに
均一に適用する。このようにして非粉末状被覆顆粒を得る。
【０１２３】
【表１１】
【０１２４】 微粉活性成分をアジュバントと十分に混合し、水で稀釈してあらゆる所望濃度
の懸濁液を生じ得る懸濁濃縮物を生成する。 Ｄ．トランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列の発現 本出願に記載した核酸配列を、慣用的組換えＤＮＡ技術を用いて、植物細胞中
に組み入れ得る。一般に、これは、当業界で既知の標準クローニング法を用いて
、コード配列が異種である（即ち普通では存在しない）発現系中に本発明のコー
ド配列を挿入することを包含する。ベクターは、挿入タンパク質コード配列の転
写および翻訳に必要な素子を含有する。当業界で既知の多数のベクター系、例え
ばプラスミド、バクテリオファージウイルスおよびその他の修飾ウイルスが用い
られ得る。適切なベクターとしては、ウイルスベクター、例えばλベクター系、
λgtI1，λgtI0およびシャロン４；プラスミドベクター、例えばpBI121、pBR322
、pACYC177、pACYC184、pARシリーズ、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p
LG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；およびその他の同様の系が挙げられ
るが、これらに限定されない。発現系の構成成分を、発現を増大するために修飾
し得る。例えば、切頭配列、ヌクレオチド置換またはその他の修飾を用い得る。
本明細書中に記載した発現系を用いて、適切な条件下で事実上あらゆる作物植物
細胞を形質転換し得る。形質転換細胞は、本発明のヌクレオチド配列がトランス
ジェニック植物に昆虫耐性を付与するように、全植物体中で再生され得る。
【０１２５】 実施例２２：コード配列および隣接配列の修飾 本出願中に記載したヌクレオチド配列を、トランスジェニック植物宿主中での
発現のために修飾し得る。ヌクレオチド配列を発現し、その細胞中に殺昆虫毒素
を産生する宿主植物は、昆虫侵襲に対する耐性増強を示し、したがってこのよう
な侵襲に伴う作物損失に耐えるような良好な備えを有する。
【０１２６】 微生物供給源から得られる遺伝子の植物中でのトランスジェニック発現は、植
物中でのそれらの発現を達成し且つ最適化するためにそれらの遺伝子の修飾を必
要とする。特に、別々の酵素をコードするが、しかし元の微生物中の同一転写物
によりコードされる細菌ＯＲＦは、別個の転写物に関して植物中で最良に発現さ
れる。これを成し遂げるために、各微生物ＯＲＦを別々に単離し、ＯＲＦの５’
末端に植物プロモーター配列を、そしてＯＲＦの３’末端に植物転写ターミネー
ターを提供するカセット内でクローン化する。単離ＯＲＦ配列は、好ましくは、
開始ＡＴＧコドンおよび終止ＳＴＯＰコドンを含むが、しかし開始ＡＴＧおよび
終止ＳＴＯＰコドンの向こうに付加的配列を含み得る。さらに、ＯＲＦは、切頭
化されるが、しかし依然として必要な活性を保持する。特に長ＯＲＦに関しては
、活性を保持する切頭化バージョンが、トランスジェニック生物中での発現のた
めには好ましい。「植物プロモーター」および「植物転写ターミネーター」とは
、植物細胞内で作動するプロモーターおよび転写ターミネーターを意味するもの
とする。これは、非植物供給源、例えばウイルス（一例は、カリフラワーモザイ
クウイルスである）から得られるプロモーターおよび転写ターミネーターを含む
。
【０１２７】 いくつかの場合には、ＯＲＦコード配列および隣接配列に対する修飾は必要な
い。当該ＯＲＦを含有する断片を単離し、そしてそれを植物プロモーターの下流
にそれを挿入することで十分である。例えば、Gaffney等（Science 261:754-756
（1993））は、コード配列の修飾を伴わずに、そして、依然としてnahGＯＲＦに
結合されたままのＡＴＧの上流のｘbpのシュードモナス遺伝子およびＳＴＯＰコ
ドンの下流のｙbpを伴って、CaMV 35SプロモーターおよびCaMV tmIターミネータ
ーの制御下で、トランスジェニック植物中でシュードモナスnahG遺伝子を首尾よ
く発現させた。好ましくは、小隣接微生物配列は、ＡＴＧの上流およびＳＴＯＰ
コドンの下流に結合されたままであるべきである。実際、このような構築は、制
限部位の利用可能性により得る。
【０１２８】 他の場合には、微生物供給源から得られる遺伝子の発現は、発現における問題
を提供し得る。これらの問題は当業界で十分特性化されており、バシラス属のよ
うなある種の供給源から得られる遺伝子に関して特に一般的である。これらの問
題は、本発明のヌクレオチド配列にも当てはまり、これらの遺伝子の修飾は、当
業界で周知の技術を用いて成され得る。以下の問題が発生し得る： １．コドン使用法 植物における好ましいコドン使用法は、ある種の微生物における好ましいコド
ン使用法とは異なる。クローン化微生物ＯＲＦ内でのコドンの使用と植物遺伝子
（そして特に、標的植物からの遺伝子）におけるコドンの使用との比較は、好ま
しくは変更さるべきＯＲＦ内のコドンの確認を可能にする。典型的には、植物進
化は、単子葉類の第三塩基位置における強いヌクレオチドＣおよびＧ選択傾向を
有するが、一方、双子葉類はしばしば、この位置にヌクレオチドＡまたはＴを使
用する。特定の標的トランスジェニック種のための好ましいコドン使用を組み入
れるために遺伝子を修飾することにより、ＧＣ／ＡＴ含量および非正統的スプラ
イシングに関して後述する問題の多くが克服される。
【０１２９】 ２．ＧＣ／ＡＴ含量 植物遺伝子は、典型的には、35％より多いＧＣ含量を有する。ＡおよびＴヌク
レオチドが豊富なＯＲＦ配列は、植物におけるいくつかの問題を引き起こし得る
。第一に、ATTTAのモチーフは、メッセージの不安定化を生じると考えられ、多
数の短命ｍＲＮＡの３’末端に見出される。第二に、メッセージ内の不適切な位
置でのポリアデニル化信号、例えばAATAAAの発生は、転写の早期切頭化を引き起
こすと考えられる。さらに、単子葉類は、スプライス部位として富ＡＴ配列を認
識し得る（下記参照）。
【０１３０】 ３．開始メチオニンに隣接する配列 植物は、それらのメッセージが限定されたリボソーム結合部位を保有しないと
いう点で微生物と異なる。むしろ、リボソームはメッセージの５’末端に結合し
、翻訳を開始するための最初の利用可能なＡＴＧに関して精査する、と考えられ
る。それにもかかわらず、ＡＴＧに隣接するある種のヌクレオチドに対する選択
が存在し、微生物遺伝子の発現は、ＡＴＧでの真核生物コンセンサス翻訳イニシ
エーターの含入により増強され得る、と考えられる。Clontech（1993/1994カタ
ログ、210ページ）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、
植物中での大腸菌uidA遺伝子の発現のためのコンセンサス翻訳イニシエーターと
しての一配列を示唆している。さらに、Joshi（NAR 15:6643-6653（1987））（
この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、ＡＴＧに隣接する多数
の植物配列を比較して、別のコンセンサス配列を示唆している。植物中での微生
物ＯＲＦの発現に際して困難に遭遇する状況では、開始ＡＴＧでのこれらの配列
の１つの含入は、翻訳を改良し得る。このような場合、コンセンサス配列の最後
の３つのヌクレオチドは、第二ＡＡ残基のそれらの修飾のために、修飾配列中の
含入には適切でない。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、異なる植物種
間で異なり得る。GenBankデータベースに位置する14のトウモロコシ遺伝子の探
索は、以下の結果を提供した：
【０１３１】
【表１２】
【０１３２】 この分析は、ヌクレオチド配列が組み入れられている所望の植物種、ならびに
好ましいヌクレオチドを組み入れるために修飾されるＡＴＧに隣接する配列に関
して成され得る。 ４．非正統的スプライス部位の除去 非植物供給源からクローン化され、植物中での発現のために最適化されていな
い遺伝子は、５’または３’スプライス部位として植物中で認識され、開裂され
て、したがって切頭化または欠失化メッセージを生成し得るモチーフも含有し得
る。これらの部位は、当業界で周知の技術を用いて除去し得る。
【０１３３】 コード配列および隣接配列の修飾のための技術は、当業界で周知である。微生
物ＯＲＦの初期発現が低く、そして前記のような配列に変更させるのが適切であ
るとみなされる場合には、当業界で周知の方法により、合成遺伝子の構築が達成
され得る。これらは、例えば、公開済み特許開示EP0385962（Monsanto）、EP035
9472（Lubrizol）およびWO93/07278（Ciba-Geigy）（これらの記載内容は、参照
により本明細書中に含まれる）に記載されている。ほとんどの場合、トランスジ
ェニック植物へのそれらの移入の前に、短期検定プロトコール（当業界で周知）
を用いて遺伝子構築物の発現を検定するのが好ましい。
【０１３４】 実施例２３：植物発現カセットの構築 トランスジェニック植物中での発現を意図されたコード配列は、植物中で発現
可能な適切なプロモーターの後の発現カセット中に先ず組み立てられる。発現カ
セットは、トランスジーンの発現に必要な、またはそのために選択される任意の
さらにべつの配列も包含し得る。このような配列としては、転写ターミネーター
、発現を増強するための外来配列、例えばイントロン、生命維持配列、ならびに
特定の細胞小器官および細胞区画に対する遺伝子生成物の標的化を意図された配
列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの発現カセットは、次に、下
記の植物形質転換ベクターに容易に移入し得る。以下は、典型的発現カセットの
種々の構成成分の説明である。
【０１３５】 １．プロモーター 発現カセット中に用いられるプロモーターの選択は、トランスジェニック植物
中でのトランスジーンの空間的および時間的発現パターンを確定する。選択プロ
モーターは、特定の種類の細胞（例えば、葉表皮細胞、葉肉細胞、根の皮質細胞
）中で、または特定の組織または器官（例えば、根、葉または花）中でトランス
ジーンを発現し、そしてその選択は、遺伝子生成物の蓄積の望ましい位置を反映
する。あるいは、選択プロモーターは、種々の誘導条件下での遺伝子の発現を駆
動し得る。プロモーターは、それらの強度が、即ち転写を促す能力が異なる。利
用される宿主細胞系によって、遺伝子のネイティブプロモーターを含めた多数の
適切なプロモーターのいずれかを用い得る。以下は、発現カセット中に用いられ
得るプロモーターの例であるが、これらに限定されない。
【０１３６】 ａ．構成性発現、ユビキチンプロモーター： ユビキチンは、多数の種類の細胞中に蓄積することが知られている遺伝子生成
物であり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物中に用いるためにいく
つかの種からクローン化されてきた（例えば、ヒマワリ−Binet et al., Plant
Science 79:87-94（1991）;トウモロコシ−Christensen et al., Plant Molec.
Biol. 12:619-632（1989）;およびシロイヌナズナ−Norris et al., Plant Mol.
Biol. 21:895-906（1993））。トウモロコシユビキチンプロモーターはトラン
スジェニック単子葉類系で開発され、単子葉類形質転換のために構築されたその
配列およびベクターは、特許公告EP0342926（Lubrizol）（この記載内容は、参
照により本明細書中に含まれる）に開示されている。Taylor等（Plant Cell Rep
. 12:491-495（1993））は、トウモロコシユビキチンプロモーターおよび最初の
イントロンを包含するベクター（pAHC25）、ならびに微小射出衝撃により導入さ
れる場合の多数の単子葉類の細胞懸濁液中のその高活性を記載する。シロイヌナ
ズナユビキチンプロモーターは、本発明のヌクレオチド配列とともに使用するの
に理想的である。ユビキチンプロモーターは、単子葉類および双子葉類の両方の
トランスジェニック植物中での遺伝子発現に適している。適切なベクターは、pA
HC25の誘導体、あるいは、適切なユビキチンプロモーターおよび／またはイント
ロン配列の導入により修飾される、本出願に記載した形質転換プロモーターのい
ずれかである。
【０１３７】 ｂ．構成性発現、CaMV 35Sプロモーター： プラスミドpCGN1761の構築は、公開済特許出願EP0392225（実施例２３）（こ
の記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されている。pCGN1761
は、プロモーターとターミネーターとの間に独特のEcoRI部位を有する「二重」C
aMV 35Sプロモーターおよびtml転写ターミネーターを含有し、pUC型主鎖を有す
る。 既存のEcoRI部位の他に、NotIおよびXhoI部位を含む修飾化ポリリンカーを
有するpCGN1761の誘導体が構築される。この誘導体は、pCGN1761ENXと呼ばれる
。pCGN1761ENXは、トランスジェニック植物中での35Sプロモーター制御下でのそ
れらの発現のためにそのポリリンカー内でのｃＤＮＡ配列またはコード配列（微
生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。このような構築物の全35
Sプロモーターコード配列−tmlターミネーターカセットは、例えば下記のような
形質転換ベクターへの移入のために、プロモーターに対して５’のHindIII、Sph
I、SaIIおよびXbaI部位、ならびにターミネーターに対して３’のXbaI、BamHIお
よびBgII部位により切り出され得る。さらに、二重35Sプロモーター断片は、別
のプロモーターによる置換のための、 HindIII、SphI、SaII、XbaIまたはPstIに
よる５’切り出し、ならびにポリリンカー制限部位（EcoRI、NotIまたはXhoI）
のいずれかによる３’切り出しにより除去され得る。所望により、クローニング
部位周囲の修飾は、翻訳を増強し得る配列の導入によりなされ得る。これは、過
剰発現が望ましい場合に、特に有用である。例えば、pCGN1761ENXは、米国特許
第5,639,949号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）の実施例
３７に記載されたような翻訳開始部位の最適化により修飾され得る。
【０１３８】 ｃ．構成性発現、アクチンプロモーター： アクチンのいくつかのアイソフォームは、ほとんどの種類の細胞中で発現され
ることが知られており、したがって、アクチンプロモーターは構成性プロモータ
ーのための良好な選択である。特に、イネActI遺伝子からのプロモーターがクロ
ーン化され、特性化されている（McElroy et al., Plant Cell2:163-171（1990
））。プロモーターの1.3kb断片は、イネプロトプラスト中での発現に必要なす
べての調節素子を含有することが判明した。さらに、ActIプロモーターを基礎に
した多数の発現ベクターが、単子葉類における使用のために特に構築されている
（ McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150-160（1991））。これらは、Act
I-イントロン１、AdhI 5'フランキング配列およびAdhI-イントロン１（トウモロ
コシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）、ならびにCaMV 35Sプロモーター
を組み入れる。最高発現を示すベクターは、35SおよびActI-イントロンまたはAd
hI 5'フランキング配列およびAdhI-イントロンの融合体である。開始ＡＴＧ（GU
Sレポーター遺伝子の）周囲の配列の最適化も、発現を増強した。McElroy等（ M
ol. Gen. Genet. 231:150-160（1991））により記載されたプロモーター発現カ
セットは、遺伝子発現のために容易に修飾され得るし、単子葉類宿主中で用いる
のに特に適している。例えば、プロモーター含有断片は、McElroy構築物から除
去され、pCGN1761ENX中の二重35Sプロモーターを置換するために用いられ、次に
これは、特定の遺伝子配列の挿入に利用可能である。このようにして構築される
融合遺伝子は、次に、適切な形質転換ベクターに移入され得る。別の報告では、
イネActIプロモーターは、その第一イントロンとともに、培養オオムギ細胞中で
の高発現を指図することが判明している（Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12:
506-509（1993））。
【０１３９】 ｄ．誘導性発現、PR-1プロモーター： pCGN1761ENX中の二重35Sプロモーターは、適切に高発現レベルを生じる選り抜
きの任意の他のプロモーターで置換され得る。例として、米国特許第5,614,395
号に記載された化学的に調節可能なプロモーターの１つは、二重35Sプロモータ
ーを置換し得る。選り抜きのプロモーターは、好ましくは制限酵素によりその供
給源から切り離されるが、しかしあるいは、適切な末端制限部位を保有するプラ
イマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。ＰＣＲ増幅はなされるべきであり、その場
合、プロモーターは、標的ベクター中での増幅プロモーターのクローニング後に
、増幅エラーに関して点検するために再シーケンシングされるべきである。化学
的／病原体調節可能タバコPR-1aプロモーターは、プラスミドpCIB1004（構築に
関しては、EP0332104の実施例２１参照（この記載内容は、参照により本明細書
中に含まれる））から切断され、プラスミドpCGN1761ENXに移入される（Uknes e
t al., 1992）。pCIB1004はNcoIにより開裂され、その結果生じる線状化断片の
３’オーバーハングはT4ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって平滑にされる。
断片は次に、HindIIIにより開裂され、その結果生じるPR-1aプロモーター含有断
片はゲル精製されて、二重35Sプロモーターが除去されたpCGN1761ENX中にクロー
ン化される。これは、XhoIによる開裂およびT4ポリメラーゼによる平滑化と、そ
の後のHindIIIによる開裂およびpCIB1004プロモーター断片がクローン化される
断片を含有する大型ベクターターミネーターの単離によりなされる。これは、PR
-1aプロモーターおよびtmIターミネーター、ならびに独特のEcoRIおよびNotI部
位を伴う介在ポリリンカーを有するpCGN1761ENX誘導体を生じる。選択コード配
列はこのベクターに挿入され、そして融合生成物（即ち、プロモーター−遺伝子
−ターミネーター）はその後任意の選択形質転換ベクター、例えば下記のものに
移入され得る。種々の化学的調節剤、例えば、米国特許第5,523,311号および第5
,614,395号に開示されたベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸およびサリチル
酸化合物を用いて、本発明により形質転換された植物中の選択コード配列の発現
を誘導し得る。
【０１４０】 ｅ．誘導性発現、エタノール誘導性プロモーター： ある種のアルコールまたはケトン、例えばエタノールにより誘導可能なプロモ
ーターも、本発明のコード配列の誘導性発現を付与するために用いられ得る。こ
のようなプロモーターは、例えば、アスペルギルス属のAspergillus nidulansか
らのalcA遺伝子プロモーターである（Caddick et al.（1998）Nat. Biotechnol.
16:177-180）。A. nidulansにおいては、alcA遺伝子はアルコールデヒドロゲナ
ーゼＩをコードし、その発現は、化学的誘導物質の存在下でAlcR転写因子により
調節される。本発明の目的のために、最小35Sプロモーターに融合されたalcA遺
伝子プロモーター配列を包含するプラスミドpalcA:CAT中のCATコード配列（Cadd
ick et al.（1998）Nat. Biotechnol. 16:177-180）が本発明のコード配列によ
り置換されて、alcA遺伝子プロモーターの制御下でコード配列を有する発現カセ
ットを生成する。これは、当業界で周知の方法を用いて実行される。
【０１４１】 ｆ．誘導性発現、グルココルチコイド−誘導性プロモーター： ステロイドホルモンを基礎にした系を用いた本発明の核酸配列の発現の誘導も
意図される。例えば、グルココルチコイド媒介性誘導系が用いられ（Aoyama and
Chua（1997）The Plant Journal 11:605-612）、グルココルチコイド、例えば
合成グルココルチコイド、好ましくはデキサメタソンの、好ましくは0.1mM〜1mM
、さらに好ましくは10mM〜100mMの範囲の濃度での適用により、遺伝子発現が誘
導される。本発明の目的のために、ルシフェラーゼ遺伝子配列が本発明の核酸配
列により置換されて、35S最小プロモーターに融合されたGAL4上流活性化配列の
６つのコピーの制御下で本発明の核酸配列を有する発現カセットを生成する。こ
れは、当業界で周知の方法を用いて実行される。トランス作用因子は、ラットグ
ルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン（Picard et al., （1988））
に融合されたヘルペスウイルスタンパク質VP16のトランス活性化ドメイン（Trie
zenberg et al.（1988）Genes Devel. 2:718-729）に融合されたGAL4ＤＮＡ結合
ドメイン（Keegan et al.（1986））を包含する。融合タンパク質の発現は、当
業界で既知の、または本明細書に記載した植物中での発現に適した任意のプロモ
ーターにより制御される。この発現カセットは、6XGAL4/最小プロモーターに融
合される本発明の核酸配列を包含する植物中にも含まれる。したがって、融合タ
ンパク質の組織または器官特異性が達成され、殺昆虫毒素の誘導性組織または器
官特異性がもたらされる。
【０１４２】 ｇ．根特異的発現： 遺伝子発現の別のパターンは、根発現である。適切な根プロモーターは、de F
ramond（FEBS 290:103-106（1991））により、そして公開済特許出願EP0452269
（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）にも記載されている。こ
のプロモーターは、選択遺伝子の挿入とその後の当該形質転換ベクターへの全プ
ロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットの移入のために、適切なベクター
、例えばpCGN1761ENXに移入される。
【０１４３】 ｈ．創傷誘導性プロモーター： 創傷誘導性プロモーターは、遺伝子発現に適している。多数のこのようなプロ
モーターが記載されており（例えば、Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-58
8（1993）; Logemann et al. Plant Cell 1:151-158（1989）; Rohrmeier & Leh
le, Plant Molec. Biol. 22:783-792（1993）; Firek et al. Plant Molec. Bio
l. 22:129-142（1993）; Warner et al. Plant J. 3:191-201（1993））、そし
てすべてが本発明に関する使用に適している。Logemann等は、双子葉類ジャガイ
モwunI遺伝子の５‘上流配列を記載する。Xu等は、双子葉類ジャガイモ（pin2）
からの創傷誘発性プロモーターが単子葉類のイネにおいて活性であることを示す
。さらに、Rohrmeier & Lehleは、創傷誘導性で、標準技法を用いてコグネイト
プロモーターを単離するために用いられ得るトウモロコシWipIｃＤＮＡのクロー
ニングを記載する。同様に、Firek等およびWarner等は、局所創傷および病原体
侵襲部位で発現される単子葉類のAsparagus officinalisからの創傷誘導性遺伝
子を記載している。当業界で周知のクローニング技術を用いて、これらのプロモ
ーターは適切なベクターに移入され、本発明に属する遺伝子に融合され、そして
植物創傷部位でこれらの遺伝子を発現するために用いられ得る。
【０１４４】 ｉ．髄−優先発現： 特許出願WO93/07278（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は
、髄細胞中で選択的に発現されるトウモロコシtrpA遺伝子の単離を記載する。転
写起始から〜1726bpまで延びる遺伝子配列およびプロモーターが示されている。
標準分子生物学的技法を用いて、このプロモーターまたはその一部は、それが35
Sプロモーターを置換し得るベクター、例えばpCGN1761に移入され、髄優先方式
で外来遺伝子の発現を駆動するために用いられ得る。実際、髄優先プロモーター
またはその一部を含有する断片は任意のベクターに移入され、トランスジェニッ
ク植物中での利用のために修飾され得る。
【０１４５】 ｊ．葉特異的発現： ホスホエノールカルボキシラーゼ（PEPC）をコードするトウモロコシ遺伝子は
、Hudspeth & Grula（Plant Molec. Biol. 12:579-589（1989））により記載さ
れている。標準分子生物学的技法を用いて、この遺伝子のためのプロモーターは
、トランスジェニック植物中での葉特異的方式での任意の遺伝子の発現を駆動す
るために用いられ得る。
【０１４６】 ｋ．花粉特異的発現： WO93/07278は、花粉細胞中で発現されるトウモロコシカルシウム依存性プロテ
インキナーゼ（CDPK）遺伝子の単離を記載する。遺伝子配列およびプロモーター
は、転写の起始から1400bpまで延びる。標準分子生物学的技法を用いて、このプ
ロモーターまたはその一部は、それが35Sプロモーターを置換し得るベクター、
例えばpCGN1761に移入され、花粉特異的方式で本発明の核酸配列の発現を駆動す
るために用いられ得る。
【０１４７】 ２．転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターは、発現カセット中で用いるために利用可能である
。これらは、トランスジーンを越えた転写の終止およびその正しいポリアデニル
化に関与する。適切な転写ターミネーターは、植物中で機能することが知られて
いるものであり、その例としては、CaMV 35Sターミネーター、tmIターミネータ
ー、ノパリンシンターゼターミネーターおよびエンドウ豆rbcS E9ターミネータ
ーが挙げられる。これらは、単子葉類および双子葉類の両方で用いられ得る。さ
らに、遺伝子のネイティブ転写ターミネーターが用いられ得る。
【０１４８】 ３．発現の増強または調節のための配列 多数の配列が、転写単位内から遺伝子発現を増強することが判明しており、こ
れらの配列は、トランスジェニック植物中でのそれらの発現を増大するために本
発明の遺伝子と一緒に用いられ得る。 種々のイントロン配列が、特に単子葉細胞において、発現を増強することが示
されている。例えば、トウモロコシAdhI遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細
胞に導入された場合、そのコグネイトプロモーター下で野生型遺伝子の発現を有
意に増強することが判明している。イントロン１は特に有効であることが判明し
ており、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築
物中での発現を増強した（Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200（1987
））。同一実験系において、トウモロコシbronze1遺伝子からのイントロンは、
発現増強に際して同様の作用を示した。イントロン配列は、植物形質転換ベクタ
ー中に、典型的には非翻訳リーダー内に、ルーチンに組み入れられている。
【０１４９】 ウイルスから得られる多数の非翻訳リーダー配列も発現を増強することが知ら
れており、これらは、単子葉細胞で特に有効である。特に、タバコモザイクウイ
ルス（TMV、「Ｗ配列」）、トウモロコシ萎黄病斑点ウイルス（MCMV）およびア
ルファルファモザイクウイルス（AMV）からのリーダー配列は、発現増強に有効
であることが示されている（例えば、Gallie et al. Nucl Acids Res. 15:8693-
8711（1987）; Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15:65-79（1990））。
【０１５０】 ４．細胞内の遺伝子生成物の標的化 遺伝子生成物をターゲッティングするための種々のメカニズムは、植物中に存
在することが知られており、これらのメカニズムの機能を制御する配列は多少詳
細に特性化されている。例えば、葉緑体に対する遺伝子生成物のターゲッティン
グは、成熟タンパク質を産生するために葉緑体移入中に開裂される種々のタンパ
ク質のアミノ末端に見出されるシグナル配列により制御される（例えば、Comai
et al. J. Biol. Chem. 263:15104-15109（1988））。これらのシグナル配列は
、葉緑体中への異種生成物の移入を実行するために異種遺伝子生成物と融合され
得る（van den Broeck, et al. Nature 313:358-363（1985））。適切なシグナ
ル配列をコードするＤＮＡは、RUBISCOタンパク質、CABタンパク質、EPSPシンタ
ーゼ酵素、GS2タンパク質、および局在化葉緑体であることが知られているその
他の多数のタンパク質をコードするｃＤＮＡの５’末端から単離され得る（米国
特許第5,639,949号の実施例３７の「葉緑体ターゲッティングによる発現」の項
も参照）。
【０１５１】 その他の遺伝子生成物は、他の細胞小器官、例えばミトコンドリアおよびペル
オキシソームに局在化される（例えば、Unger et al. Plant Molec. Biol. 13:4
11-418（1989））。これらの生成物をコードするｃＤＮＡも、これらの細胞小器
官に対する異種遺伝子生成物のターゲッティングを実行するために操作され得る
。このような配列の例は、核−コード化ＡＴＰアーゼおよびミトコンドリアに特
異的なアスパルテートアミノトランスフェラーゼアイソフォームである。ターゲ
ッティング細胞タンパク質体は、Rogers等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:65
12-6516（1985））により記載されている。
【０１５２】 さらに、他の細胞区画に対する遺伝子生成物のターゲッティングを引き起こす
配列が特性化されている。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラスト、およびアリ
ューロン細胞からの細胞外分泌に対するターゲッティングに関与する（Koehler
& Ho, Plant Cell 2:769-783（1990））。さらに、アミノ末端配列は、カルボキ
シ末端配列と一緒に、遺伝子生成物に対する液胞型ターゲッティングに関与する
（Shinshi et al. Plant Molec. Biol.14:357-368（1990））。
【０１５３】 前記の適切なターゲッティング配列と当該トランスジーン配列との融合によ
り、トランスジーン生成物を任意の細胞小器官または細胞区画に向けることがで
きる。例えば、葉緑体ターゲッティングに関しては、RUBISCO遺伝子、CAB遺伝子
、EPSPシンターゼ遺伝子またはGS2遺伝子からの葉緑体シグナル配列が、枠内で
、トランスジーンのアミノ末端ＡＴＧに融合される。選択されるシグナル配列は
既知の開裂部位を含むべきであり、そして構築された融合物は、開列に必要な開
裂部位後のあらゆるアミノ酸を考慮すべきである。いくつかの場合には、この要
件は、開裂部位とトランスジーンＡＴＧとの間の少数のアミノ酸の付加により、
あるいは、トランスジーン配列内のいくつかのアミノ酸の置換により満たされ得
る。葉緑体移入のために構築された融合物は、in vitro転写構築物のin vitro翻
訳による葉緑体取込みとその後の、Bartlett等（Edelmann et al.（Eds.）Metho
ds in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091（1982））およ
びWasmann等（Mol. Gen. Genet. 205:446-453（1986））により記載された技術
を用いるin vitro葉緑体取込みの効力に関して検査され得る。これらの構築技術
は当業界で周知であり、ミトコンドリアおよびペルオキシソームに等しく適用可
能である。
【０１５４】 細胞ターゲッティングに関する前記のメカニズムは、それらのコグネイトプロ
モーターと一緒にだけでなく、異種プロモーターとも一緒に、ターゲッティング
シグナルが誘導するプロモーターの場合とは異なる発現パターンを有するプロモ
ーターの転写調節下で特異的細胞ターゲッティング目標を実行するために、利用
され得る。
【０１５５】 実施例２４：植物形質転換ベクターの構築 植物形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターが植物形質転換業界の当業
者に知られており、本発明に属する遺伝子は、あらゆるこのようなベクターと一
緒に用いられ得る。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術および形質転換の
ための標的種によっている。ある種の標的種に関しては、異なる抗生物質または
除草剤選択マーカーが選択され得る。形質転換にルーチンに用いられる選択マー
カーとしては、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するnptII
遺伝子（Messing & Vierra, Gene 19:259-268（1982）; Bevan et al., Nature
304:184-187（1983））、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するbar
遺伝子（White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062（1990）; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79:625-631（1990））、抗生物質ハイグロマイシンに対す
る耐性を付与するhph遺伝子（Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4:29
29-2931）、およびメタトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子（Bouro
uis et al., EMBO J. 2（7）:1099-1104（1983））、ならびにグリフォセートに
対する耐性を付与するEPSPS遺伝子（米国特許第4,940,935号および第5,188,642
号）が挙げられる。
【０１５６】 １．アグロバクテリウム形質転換に適したベクター 多数のベクターが、アグロバクテリウムのAgrobacterium tumefaciensを用い
た形質転換に利用可能である。これらは、典型的には、少なくとも１つのＴ−Ｄ
ＮＡボーダー配列を保有し、その例としては、例えばpBIN19（Bevan, Nucl. Aci
ds Res.（1984））およびpXYZのようなベクターが挙げられる。以下に、アグロ
バクテリウム形質転換に適した２つの典型的ベクターの構築を記載する。
【０１５７】 ａ．pCIB200およびpCIB2001： バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001は、アグロバクテリウムに関して
用いるための組換えベクターの構築に用いられ、以下の方式で構築される。pTJS
75kanは、pTJS75のNarI消化により作成され（Schmidhauser & Helinski, J. Bac
teriol. 164:446-455 （1985））、テトラサイクリン耐性遺伝子の切り出しと、
その後の、NPTIIを保有するpUC4KからのAccI断片の挿入を可能にする（ Messing
& Vierra, Gene 19:259-268（1982）; Bevan et al., Nature 304:184-187（19
83）；McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276（1990））。XhoI
リンカーは、左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー、植物選択性nos/nptIIキメラ遺伝
子およびpUCポリリンカーを含有するPCIB7のEcoRV断片に結紮され（Rothstein e
t al., Gene 53:153-161（1987））、そしてXhoI消化断片は、SaII消化pTJS75ka
n中にクローン化されて、pCIB200を作成する（EP0332104の実施例１９も参照）
。 pCIB200は、以下の独自のポリリンカー制限部位を含有する：EcoRI、SstI、K
pnI、BglII、XbaIおよびSaII。pCIB2001は、付加的制限部位のポリリンカー中へ
の挿入により作成されるpCIB200の誘導体である。pCIB2001のポリリンカー中の
独自の制限部位は、 EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SaII、MluI、BclI、Avr
II、ApaI、HpaIおよびStuIである。これらの独自の制限部位の他に、 pCIB2001
は、植物および細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム媒介性形質転換のた
めの左および右Ｔ−ＤＮＡボーダー、大腸菌と他の宿主との間の可動性のための
RK2-由来trfA機能、ならびにRK2からのOriTおよびOriV機能を有する。pCIB2001
ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含有する植物発現カセットのクロー
ニングに適している。
【０１５８】 ｂ．pCIB10およびそのヒグロマイシン選択誘導体 バイナリーベクターpCIB10は、植物中での選択のためのカナマイシン耐性をコ
ードする遺伝子、ならびにＴ−ＤＮＡ右および左ボーダー配列を含有し、そして
大腸菌とアグロバクテリウムの両方でそれを複製させる広範宿主範囲プラスミド
pRK252からの配列を組み入れる。その構築は、Rothstein等（Gene 53:153-161（
1987））により記載されている。Gritz等（Gene 25:179-188（1983））により記
載されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼに関する遺伝子を組み入
れる種々の誘導体が構築される。これらの誘導体は、ハイグロマイシンのみ（pC
IB743）またはヒグロマイシンとカナマイシン（pCIB715、 pCIB717）に関するト
ランスジェニック植物細胞の選択を可能にする。
【０１５９】 ２．非アグロバクテリウム形質転換に適したベクター Agrobacterium tumefaciensを用いない形質転換は、選択される形質転換ベク
ター中のＴ−ＤＮＡ配列に関する要件を回避し、したがって、これらの配列を欠
くベクターが、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する前記のようなベクターに加えて、利用
され得る。アグロバクテリウムに頼らない形質転換技術としては、粒子衝撃によ
る形質転換、プロトプラスト取込み（例えば、ＰＥＧおよび電気穿孔）ならびに
マイクロインジェクションが挙げられる。ベクターの選択は、形質転換されてい
る種に対する好ましい選択に大いに拠っている。以下に、非アグロバクテリウム
形質転換に適した典型的ベクターの構築を記載する。
【０１６０】 ａ．pCIB3064： pCIB3064は、除草剤バスタ（またはホスフィノトリシン）による選択と組合せ
た直接遺伝子移入技術に適したpUC由来ベクターである。プラスミドpCIB246は、
大腸菌GUS遺伝子とCaMV 35S転写ターミネーターとの操作可能的融合でCaMV 35S
プロモーターを包含し、ＰＣＴ公開済出願WO93/07278に記載されている。このベ
クターの35Sプロモーターは、開始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含有する。こ
れらの部位は、ＡＴＧを除去し、制限部位SspIおよびPvuIIを生成するような方
法で、標準ＰＣＲ技術を用いて突然変異化される。新規の制限部位は、独自のSa
lI部位から96および37bp離れ、実際の開始部位から101および42bp離れている。
その結果生じるpCIB246の誘導体は、pCIB3025と呼ばれる。次に、SalIおよびSac
Iによる消化によってpCIB3025からGUS遺伝子が切り出され、末端が平滑にされ、
再結紮されてプラスミドpCIB3060を生じる。プラスミドpJIT82は、John Innes C
entre, Norwichから得られ、ストレプトミセス属のStreptomyces viridochromog
enesからのbar遺伝子を含有する400bpの小断片が切り出され、pCIB3060のHpaI部
位に挿入される（Thompson et al., EMBO J. 6:2519-2523（1987））。これは、
除草剤選択のためのCaMV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下のbar
遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子（大腸菌中での選択のため）、ならび
に独自の部位SphI、PstI、HindIIIおよびBamHIを有するポリリンカーを包含する
pCIB3064を生じる。このベクターは、それら自体の調節シグナルを含有する植物
発現カセットのクローニングに適している。
【０１６１】 ｂ．pSOG19およびpSOG35： pSOG35は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択可能マーカーとして
大腸菌遺伝子ジヒドロフォレエートレダクターゼ（ＤＦＲ）を利用する形質転換
ベクターである。ＰＣＲは、35Sプロモーター（〜800bp）、トウモロコシAdh1遺
伝子からのイントロン６（〜550bp）およびpSOG10からの18bpのGUS非翻訳リーダ
ー配列を増幅するために用いられる。大腸菌ジヒドロフォレートレダクターゼII
型遺伝子をコードする250bp断片もＰＣＲにより増幅され、これら２つのＰＣＲ
断片は、pUC19ベクター主鎖およびノパリンシンターゼターミネーターを包含す
るpB1221（Clontech）からのSacI-PstI断片とともにアッセンブルされる。これ
らの断片のアッセンブリーは、イントロン６配列、GUSリーダー、DHFR遺伝子お
よびノパリンシンターゼターミネーターと融合して35Sプロモーターを含有するp
SOG19を生成する。トウモロコシ萎黄病斑点ウイルス（MCMV）からのリーダー配
列によるpSOG19中のGUSリーダーの置換は、ベクターpSOG35を生じる。pSOG19お
よびpSOG35は、アンピシリン耐性に関するpUC遺伝子を保有し、外来物質のクロ
ーニングに利用可能なHindIII、SphI、PstIおよびEcoRI部位を有する。
【０１６２】 ３．葉緑体形質転換に適したベクター 植物プラスチド中の本発明のヌクレオチド配列の発現に関しては、プラスチド
形質転換ベクターpPH143（WO97/32011、実施例３６）が用いられる。ヌクレオチ
ド配列をpPH143に挿入し、それによりPROTOXコード配列を置換する。次にこのベ
クターを、プラスチド形質転換およびスペクチノマイシン耐性に関する形質転換
体の選択に用いる。あるいは、ヌクレオチドを、それがaadH遺伝子を置換するよ
う、pPH143に挿入する。この場合、形質転換体は、PROTOX阻害剤に対する耐性に
関して選択される。
【０１６３】 実施例２５：形質転換 本発明の核酸配列が発現系中にクローン化されると、それは植物細胞中に形質
転換される。植物の形質転換および再生のための方法は、当業界で周知である。
例えば、Tiプラスミドベクターは、外来ＤＮＡのデリバリー、ならびに直接ＤＮ
Ａ取込み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクションおよびマイクロプ
ロジェクションに利用されている。さらに、アグロバクテリウム属からの細菌は
、植物細胞を形質転換するために利用され得る。以下は、双子葉類および単子葉
類植物の両方を形質転換するための代表的技術の説明である。
【０１６４】 １．双子葉類の形質転換 双子葉類のための形質転換技術は当業界で周知であり、その例としては、アグ
ロバクテリウムベースの技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術が挙
げられる。非アグロバクテリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による直接
的な外生的遺伝物質の取込みを包含する。これは、ＰＥＧまたは電気穿孔媒介性
取込み、粒子衝撃媒介性デリバリー、またはマイクロインジェクションにより達
成され得る。これらの技法の例は、以下の文献に記載されている：Paszkowski e
t al., EMBO J. 3:2717-2722（1984）; Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 19
9:169-177（1985）; Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004（1986）および
Klein et al., Nature 327:70-73（1987）。各々の場合、形質転換細胞は、当業
界で既知の標準技法を用いて、全植物体に再生される。
【０１６５】 アグロバクテリウム媒介性形質転換は、その高形質転換効力および多数の異な
る種を用いたその広範な効用のために、双子葉類の形質転換に好ましい技術であ
る。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、同時在住Tiプラスミドに関す
るまたは染色体的な、宿主アグロバクテリウム株により保有されるvir遺伝子の
補体により得る適切なアグロバクテリウム株（例えばpCIB200またはpCIB2001に
関してはCIB542株（Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993））への、当該
外来ＤＮＡを保有するバイナリーベクター（例えば、pCIB200またはpCIB2001）
の移入を包含する。組換えバイナリーベクターを保有する大腸菌、pRK2013のよ
うなプラスミドを保有し、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム
株に可動化し得るヘルパー大腸菌株を用いる三親交配法により、アグロバクテリ
ウムへの組換えバイナリーベクターの移入は成し遂げられる。あるいは、組換え
バイナリーベクターは、ＤＮＡ形質転換によりアグロバクテリウムに移入され得
る（Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877（1988））。
【０１６６】 組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常は、植物から
の外植片とのアグロバクテリウムの同時培養を包含し、当業界で周知のプロトコ
ールに従う。形質転換組織は、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダー間に存
在する抗生物質または除草剤耐性マーカーを保有する選択可能培地上で再生され
る。
【０１６７】 遺伝子を用いて植物細胞を形質転換する別のアプローチは、植物組織および細
胞に、不活性または生物学的活性粒子を推進させることを包含する。この技法は
、米国特許第4,945,050号、第5,036,006号および第5,100,792号（すべてSanford
等）に開示されている。一般に、この手法は、細胞の外表面を貫通し、その内部
に組み入れをもたらすのに有効な条件下で、細胞に不活性または生物学的活性粒
子を推進させることを包含する。不活性粒子を用いる場合、ベクターは、所望の
遺伝子を含有するベクターで粒子を被覆することにより細胞中に導入され得る。
あるいは、標的細胞は、粒子の航跡により細胞中にベクターが運ばれるように、
ベクターに取り囲まれ得る。生物学的活性粒子（例えば、各々導入されると思わ
れるＤＮＡを含有する乾燥酵母菌細胞、乾燥細菌またはバクテリオファージ）も
、植物細胞組織中に推進され得る。
【０１６８】 ２．単子葉類の形質転換 ほとんどの単子葉類の形質転換も、目下、ルーチンになってきた。好ましい技
法としては、ＰＥＧまたは電気穿孔技法を用いたプロトプラストへの直接遺伝子
移入、ならびにカルス組織への粒子衝撃が挙げられる。形質転換は、単一ＤＮＡ
種または多ＤＮＡ種（即ち同時形質転換）を用いて成され得るが、これらの技法
はともに、本発明に関する使用に適している。同時形質転換は、完全ベクター構
築を回避し、そして当該遺伝子に関する非連鎖遺伝子座および選択可能マーカー
を有し、望ましいとみなされるべきその後の世代における選択可能マーカーの除
去を可能にするトランスジェニック植物を再生するという利点を有し得る。しか
しながら、同時形質転換の使用の欠点は、別個のＤＮＡ種がゲノムに統合される
頻度が100％未満であることである（Schocher et al. Biotechnology 4:1093-10
96（1986））。
【０１６９】 特許出願EP0292435、EP0392225およびWO93/07278は、トウモロコシの近親交配
系統からのカルスおよびプロトプラストの調製、ＰＥＧまたは電気穿孔を用いる
プロトプラストの形質転換、ならびに形質転換プロトプラストからのトウモロコ
シ植物体の再生のための技術を記載する。Gordon-Kamm等（Plant Cell 2:603-61
8（1990））ならびにFromm等（Biotechnology 8:833-839（1990））は、粒子衝
撃を用いたA188由来トウモロコシ系統の形質転換のための技法を発表した。さら
に、WO93/07278およびKoziel等（Biotechnology 11:194-200（1993））は、粒子
衝撃によるトウモロコシの精選近親交配系統の形質転換のための技法を記載する
。この技法は、受粉後14〜15日目のトウモロコシの穂から切り出した長さ1.5〜2
.5mmの未熟トウモロコシ胚と、衝撃のためのPDS-1000He Biolistics装置を利用
する。
【０１７０】 イネの形質転換も、プロトプラストを利用する直接遺伝子移入技法または粒子
衝撃によりなされ得る。プロトプラスト媒介性形質転換は、ジャポニカ型および
インディカ型に関して記載されている（Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379-
384（1988）; Shimamoto et al., Nature 338:274-277（1989）; Datta et al.,
Biotechnology 8:736-740（1990））。両型とも、粒子衝撃を用いてルーチンに
形質転換可能である（Christou et al., Biotechnology 9: 957-962（1991））
。さらに、WO93/21335は、電気穿孔によるイネの形質転換のための技法を記載す
る。
【０１７１】 特許出願EP0332581は、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換および再生
のための技法を記載する。これらの技法は、Dactylisおよびコムギの形質転換を
可能にする。さらに、コムギ形質転換は、Ｃ型長期再生可能カルスの細胞への粒
子衝撃を用いて、Vasil等（Biotechnology 10:667-674（1992））により、そし
て未熟胚および未熟胚由来カルスを用いて、 Vasil等（Biotechnology 11:1553-
1558（1993））およびWeeks等（Plant Physiol. 102:1077-1084（1993））によ
り記載されている。しかしながら、コムギ形質転換のための好ましい技法は、未
熟胚の粒子衝撃によるコムギの形質転換を包含し、遺伝子送達前の高スクロース
または高マルトース工程を含む。衝撃前に、任意数の胚（長さ0.75〜1mm）を、
体性胚の誘導のために3％スクロース（Murashiga & Skoog, Physiologia Planta
rum 15:473-497（1962））および3mg/lの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地上でプ
レート化し、これは暗所で進行される。衝撃の選定日に、胚を誘導培地から取り
出し、オスモチクム（即ち所望の濃度で、典型的には15％で付加されるスクロー
スまたはマルトースを含有する導入培地）上でプレート化する。胚を2〜3時間原
形質分離させた後、衝撃処理する。標的プレート当たり20個の胚が典型的である
が、しかしこれは重要ではない。適切な遺伝子保有プラスミド（例えばpCIB3064
またはpSG35）を、標準手法を用いてμmサイズの金粒子上に沈澱させる。標準80
メッシュスクリーンを用いて、〜1000 psiの破裂圧を用いて、胚の各プレート
をDuPont BiolisticsRヘリウム装置で撃つ。衝撃後、胚を暗所に戻して、約24時
間回復させる（依然としてオスモチクム上で）。24時間後、胚をオスモチクムか
ら取り出して、誘導培地に戻すが、そこにそれらは約１ヶ月間留まった後、再生
する。約１ヶ月後、発生中の胚形成性カルスとともに、胚外植片を、再生培地（
MS+1mg/l NAA, 5mg/l GA）に移し、さらに適切な選択作用物質（pCIB3064の場合
は10mg/lバスタ、pSOG35の場合は2mg/l メトキシレート）を含入する。約１ヶ月
後、半強度MS, 2％スクロースならびに同一濃度の選択作用物質を含入する「GA7
」として知られている大型滅菌容器に発生した新芽を移す。
【０１７２】 アグロバクテリウムを用いた単子葉類の形質転換も記載されている（WO94/009
77および米国特許第5,591,616号参照）（これらの記載内容はともに、参照によ
り本明細書中に含まれる）。 ３．プラスチドの形質転換 Ｔ寒天培地上に１インチ環状列で７／プレートで、タバコNicotiana tabacum
c.v.‘Xanthi nc'の種子を発芽させ、本質的には前記（Svab, Z. and Maliga, P
.（1993）PNAS 90, 913-917）と同様に、プラスミドpPH143およびpPH145からの
ＤＮＡで被覆した1μmタングステン粒子（M10, Biorad, Hercules, CA）を用い
て播種後12〜14日目に衝撃を与える。衝撃化苗木をＴ培地上で２日間インキュベ
ートし、その後、葉を切り取って、500μg/mlのスペクチノマイシンジヒドロク
ロリド（Stigma, St. Louis, MO）を含有するRMOP培地（Svab, Z., Hajdukiewic
z, P. and Maliga, P.（1990）PNAS 87, 8526-8530）のプレート上の明光（350
〜500μmol photons/m2/s）中に背軸側を上にして置く。衝撃後3〜8週目に漂白
化葉の真下に出現する耐性新芽を同一選択培地上でサブクローニングして、カル
スを形成させて、二次新芽を単離し、サブクローニングする。個々のサブクロー
ン中の形質転換プラスチドゲノムコピーの完全分離（ホモプラスミー性（homopl
asmicity））を、サザンブロッティングの標準技法により査定する（Sambrook e
t al.,（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor）。BamHI/EcoRI−消化全細胞ＤＮＡ（Mettle
r, I. J.（1987）Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349）を1％トリス−ホウ酸
塩（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜（Amersham）に移して、rp
s7/12プラスチド標的配列の一部を含有するpC8からの0.7 kb BamHI/HindIIIＤＮ
Ａ断片に対応する32Ｐ標識化無作為プライム化ＤＮＡ配列を用いて精査する。ホ
モプラスミー性新芽を、スペクチノマイシン含有MS/IBA培地（McBride, K.E. et
al.（1994）PNAS 91, 7301-7305）上で無菌的に根付かせて、温室に移す。
【０１７３】 Ｅ．交配および種子産生 実施例２６：交配 本発明の核酸配列を用いた形質転換により得られた植物は、広範な植物種、例
えば単子葉類および双子葉類のいずれかであり得るが、しかしながら、本発明の
方法に用いられる植物は、好ましくは、前記の農業経営学的に重要な標的作物の
一覧から選択される。本発明生産および品質に関して重要なその他の特徴と組合
せた本発明の遺伝子の発現は、交配により植物系統に組み入れられる。交配アプ
ローチおよび技法は、当業界で知られている（例えば、Welsh J.R., Fundamenta
ls of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & Sons, NY（1981）; Crop B
reeding, Wood D.R.（Ed.）American Society of Agronomy Madison, Wisconsin
（1983）; Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarend
on Press, Oxford （1987）; Singh, D.P., Breeding for Resistance to Disea
ses and Insect Pests, Springer-Verlag, NY（1986）;およびWricke and Weber
, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter
and Co., Berlin（1986）参照）。
【０１７４】 前記のトランスジェニック種子および植物中で工学処理された遺伝特性は、生
殖または植物性成長により移行され、したがって、子孫植物中に保持され、増殖
され得る。一般に、前記の保持および増殖は、耕作、播種または収穫といった特
定の目的に合わせて開発された既知の農業的方法を用いる。水耕法または温室法
といった特殊方法も適用され得る。成長中の作物は昆虫または感染により引き起
こされる襲撃または損害に対してならびに雑草植物による競合に対して傷つきや
すいので、収量を改良するために雑草、植物病、昆虫、線虫およびその他の悪影
響を及ぼす条件の制御がなされる。これらは、機械的測定、例えば土壌の耕作作
業、または雑草および感染植物の除去、ならびに農業化学物質、例えば除草剤（
herbicides）、殺真菌剤（fungicides）、殺配偶子剤（gametocides）、殺線虫
剤（nematicides）、成長調節剤（growth regulants）、成熟剤（ripening agen
ts）、および殺昆虫剤（insecticides）の適用を含む。
【０１７５】 本発明のトランスジェニック植物および種子の有益な遺伝特性の使用はさらに
、害虫、除草剤またはストレスの耐容性といった促成の改良、栄養値の改良、収
量増大、あるいは倒壊または落果による損失を低下させる構造改良を示す植物の
開発を目指す植物交配において成され得る。種々の交配工程は、十分限定された
ヒトの介入、例えば交雑される系統の選択、親系統の受粉の指図、または適切な
子孫植物の選択により特性化される。所望の特性によって、異なる交配測定が採
用される。関連技術は当業界で周知であり、その例としては、ハイブリダイゼー
ション、近親交配、戻し交配、多系統交配、変種融合、種間ハイブリダイゼーシ
ョン、異数体技法等が挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼー
ション技法はさらに、機械的、化学的または生化学的手段により雌または雄の不
稔性植物を産生するための植物の不稔化を含む。異なる系統の花粉を用いた雄不
稔性植物交差受粉は、雄不稔性で、しかし雌稔性の植物のゲノムが両方の親の系
統の特性を均質に得るのを保証する。したがって、本発明のトランスジェニック
種子および植物は、例えば、除草剤または殺虫剤処理といった慣用的方法の有効
性を増大し、またはそれらの修飾遺伝子特性のために前記の方法を用いて分配さ
せる改良植物系統の交配のために用いられ得る。あるいは、その最適化遺伝的「
装置」のために、ストレス耐性の改良を示す新規の作物が得られ、それらは、匹
敵する悪発生条件を耐容し得ない生成物よりも良好な品質の収穫生成物を産生す
る。
【０１７６】 実施例２７：種子産生 種子産生において、種子の発芽の質および均一性は不可欠な生成物特性である
が、一方、農業経営者が収穫し、販売する種子の発芽の質および均一性は、重要
ではない。他の作物および雑草の種子が混じらないよう作物を保持するのは困難
であるので、種子保有疾患を制御し、そして良好な発芽を示す種子を産生するた
めに、純正種子の成長、条件調節および販売の業界で経験を積んだ種子産生者に
より、かなり広範な、且つ十分限定された種子産生手段が開発されてきた。した
がって、彼自身の作物からの種子を用いる代わりに、特定の品質基準を満たす保
証付種子を農業経営者が購入することは一般的におこなわれることである。種子
として用いられる繁殖用物質は、通常は、除草剤、殺昆虫剤、殺真菌剤、殺細菌
剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤またはそれらの混合物を包含する予防保護剤コーテ
ィングにより処理される。常習的に用いられる予防保護剤コーティングは、カプ
タン、カルボキシン、チラム（TMTD（商標））、メタラキシル（アプロン（商標
））およびピリミフォス−メチル（アクテリック（商標））といった化合物を包
含する。所望により、これらの化合物は、さらに処方業界で常用される担体、界
面活性剤または適用促進アジュバントと一緒に処方されて、細菌、真菌または動
物害虫により引き起こされる損害に対する防御を提供する。予防保護剤コーティ
ングは、液体処方物を繁殖物質に含浸させることにより、または併合湿潤または
乾燥処方物で被覆することにより、適用され得る。蕾または果実に向けられる処
理といったその他の適用方法も可能である。
【０１７７】 前記で例示したような、本発明のトランスジェニック植物、トランスジェニッ
ク植物物質またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする、新規の農法を提
供することは、本発明のさらに別の局面である。 種子は、適切なパッケージ物質から成る袋、入れ物または容器中で提供され、
袋または入れ物は、種子を含有するために密閉され得る。袋、入れ物または容器
は、種子の短期または長期保存のために、あるいはその両方のために設計され得
る。適切なパッケージ物質の例としては、紙、例えばクラフト紙、剛性または可
撓性プラスチックまたはその他の高分子物質、ガラスあるいは金属が挙げられる
。望ましくは、袋、入れ物または容器は、同一または異なる型の、パッケージ物
質の複数の層から成る。一実施態様では、袋、入れ物または容器は、水または湿
気が種子と接触するのを排除するかまたは制限するように提供される。一実施例
では、袋、入れ物または容器は密封され、例えば溶封されて、水または湿気が侵
入するのを防止する。別の実施態様では、水吸収物質がパッケージ物質層の間に
、または隣接して配置される。さらに別の実施態様では、袋、入れ物または容器
、あるいは含有されるパッケージ物質は、疾患、汚染または種子の保存または運
搬のその他の悪影響を制限し、抑制し、または防止するよう処理される。このよ
うな処理の一例は、例えば、化学的手段による、または放射線への曝露による滅
菌である。野生型植物より高レベルで前記の形質転換植物中で発現される本発明
の遺伝子を包含するトランスジェニック植物の種子を、適切な担体と一緒に、植
物に広範囲の疾患耐性を付与するためのそれらの使用に関する説明を記したラベ
ルとともに含有する市販の袋は、本発明に含まれる。
【０１７８】 前記の開示実施態様は、説明に役立つ。本発明のこの開示は、本発明が多数の
変更を有することを当業者に認めさせる。このような明白且つ予測可能な変更は
すべて、添付の特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 アンダーソン，アーン ロバート アメリカ合衆国，ノースカロライナ 27597，ゼブロン，グリーン−ペイス ロ ード 1005 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA07 AA08 BA80 CA05 DA01 DA05 DA11 DA12 EA04 EA06 GA11 GA17 GA19 HA12 4B064 AG01 AG30 CA02 CA05 CA06 CA11 CA19 CC24 DA12 4B065 AA01Y AA26X AA79X AA88X AB01 AC14 BA02 CA24 CA48 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA72 CA11 DA83 EA06 FA74

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の： （ａ）配列番号１のヌクレオチド569-979、配列番号１のヌクレオチド1045-
    2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２およ
    び配列番号１４から成る群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に同様のヌ
    クレオチド配列；あるいは （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列とアイソコーディングするヌクレオチド配
    列 を包含する単離核酸分子であって、その発現が昆虫に対して活性である少なくと
    も１つの毒素を生じる単離核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド569-979
    、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８
    、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４と実質的に同様のヌクレオチ
    ド配列とアイソコーディングする請求項１の単離核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド569-979
    、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８
    、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４と実質的に同様である請求項
    １の単離核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、３、５、７、９、１
    １、１３および１５から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする請求項
    １の単離核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド569-97
    9、配列番号１のヌクレオチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８
    、配列番号１０、配列番号１２または配列番号１４を包含する請求項１の単離核
    酸分子。
  6. 【請求項６】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド569-97
    9、配列番号４、配列番号８または配列番号１２と実質的に同様である請求項１
    の単離核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記ヌクレオチド配列が配列番号２、配列番号５、配列番号
    ９または配列番号１３で記載されるアミノ酸配列をコードする請求項１の単離核
    酸分子。
  8. 【請求項８】 前記ヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド1045-233
    4、配列番号６、配列番号１０または配列番号１４と実質的に同様である請求項
    １の単離核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記ヌクレオチド配列が配列番号３、配列番号７、配列番号
    １１または配列番号１５で記載されるアミノ酸配列をコードする請求項１の単離
    核酸分子。
  10. 【請求項１０】 前記ヌクレオチド配列がpCIB9369（NRRL B-21883）に含ま
    れる約3.0 kbＤＮＡ断片を包含する請求項１の単離核酸分子。
  11. 【請求項１１】 毒素がコナガ（Plutella xylostella）に対して活性であ
    る請求項１の単離核酸分子。
  12. 【請求項１２】 配列番号１のヌクレオチド569-979、配列番号１のヌクレ
    オチド1045-2334、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列
    番号１２および配列番号１４から成る群から選択されるヌクレオチド配列の連続
    20塩基対ヌクレオチド部分と配列が同一である20塩基対ヌクレオチド部分を包含
    する単離核酸分子であって、その発現が昆虫に対して活性である少なくとも１つ
    の毒素を生じる単離核酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１または請求項１２の核酸分子と操作可能的に連結
    される異種プロモーター配列を包含するキメラ遺伝子。
  14. 【請求項１４】 請求項１３のキメラ遺伝子を包含する組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１３のキメラ遺伝子を包含する宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 細菌細胞である請求項１５の宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 酵母菌細胞である請求項１５の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 植物細胞である請求項１５の宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 請求項１８の植物細胞を包含する植物。
  20. 【請求項２０】 トウモロコシ（maize）である請求項１９の植物。
  21. 【請求項２１】 請求項１または請求項１２のＤＮＡ分子の発現により生成
    される毒素。
  22. 【請求項２２】 コナガ（Plutella xylostella）に対して活性である請求
    項２１の毒素。
  23. 【請求項２３】 NRRL寄託番号B-21883と呼ばれる大腸菌株により産生され
    る請求項２１の毒素。
  24. 【請求項２４】 配列番号２、３、５、７、９、１１、１３および１５から
    成る群から選択されるアミノ酸配列を包含する請求項２１の毒素。
  25. 【請求項２５】 配列番号２、５、９および１３から成る群から選択される
    アミノ酸配列を包含する請求項２４の毒素。
  26. 【請求項２６】 配列番号３、７、１１および１５から成る群から選択され
    るアミノ酸配列を包含する請求項２４の毒素。
  27. 【請求項２７】 殺昆虫的有効量の請求項２１の毒素を包含する組成物。
  28. 【請求項２８】 昆虫に対して活性である毒素の製造方法であって、以下の
    ： （ａ）請求項１５の宿主細胞を得て、そして （ｂ）前記細胞中で核酸分子を発現し、これが昆虫に対して活性である少な
    くとも１つの毒素を生じる 工程を包含する方法。
  29. 【請求項２９】 前記植物中に請求項１または請求項１２の核酸分子を導入
    することを包含する昆虫耐性植物の産生方法であって、前記核酸分子が昆虫を制
    御するのに有効な量で前記植物中に発現可能である方法。
  30. 【請求項３０】 昆虫がコナガ（Plutella xylostella）である請求項２９
    の方法。
  31. 【請求項３１】 有効量の請求項２１の毒素を昆虫にデリバリーすることを
    包含する昆虫の制御方法。
  32. 【請求項３２】 昆虫がコナガ（Plutella xylostella）である請求項３１
    の方法。
  33. 【請求項３３】 毒素が経口的に昆虫にデリバリーされる請求項３２の方法
    。
  34. 【請求項３４】 所望のサイズの二本鎖無作為断片の集団に開裂された請求
    項１または請求項１２の核酸分子の突然変異化方法であって、以下の： （ａ）二本鎖無作為断片の集団に、各々が二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対
    して同一構造の領域と異種構造の領域を包含する１つ又はそれ以上の一本または
    二本鎖オリゴヌクレオチドを付加し、 （ｂ）その結果生じる二本鎖無作為断片およびオリゴヌクレオチドの混合物
    を一本鎖断片に変性し、 （ｃ）その結果生じる一本鎖断片の集団を、対の一方の成員に関して他方の
    複製をプライムするのに十分な同一構造の領域で前記一本鎖断片のアニーリング
    を生じてアニール化断片の対を生成し、それにより突然変異化二本鎖ポリヌクレ
    オチドを生成する条件下でポリメラーゼとともにインキュベートし、そして （ｄ）第二および第三工程を少なくともさらに２回反復するが、この場合、
    第二工程をさらに１回実施した結果生じる混合物が前回の第三工程からの突然変
    異化二本鎖ポリヌクレオチドを含有し、さらにもう１回実行すると突然変異化二
    本鎖ポリヌクレオチドがさらに生じる、 工程を包含する方法。
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