JP2002512001A

JP2002512001A - 微生物の溶解方法

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Publication number: JP2002512001A
Application number: JP2000512915A
Authority: JP
Inventors: リセ・サントロ; ソフィー・ロペス; ブリュノ・コラン; コリンヌ・ジェイ; セシル・パリス; キャスリーン・アン・クラーク・ディケイ
Original assignee: ベーイーオー・メリュー; ジーイーエヌ−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2002-04-23
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: CA2304846A1; CA2304846C; ATE238411T1; FR2768743A1; JP2009131274A; DE69813848T2; JP4391017B2; EP1017784A1; US6660472B1; ES2195383T3; DE69813848D1; WO1999015621A1; FR2768743B1; AU728694B2; EP1017784B1; JP4422782B2; AU9091298A

Abstract

(57)【要約】本発明は：液体媒体中の生物学的試料を容器中に用意すること；相対的に硬く、核酸材料に関して実質上不活性である少なくとも１の粒状材料を上記容器中に用意すること；該生物学的試料と粒状材料混合物に運動を受けさせることを含む、微生物に属する興味ある核材料を放出するための、細菌型の少なくとも１の微生物を含む生物学的試料の溶解方法に関する。本発明は、選択した運動が渦動型であり、且つ以下の条件を満たす；粒子材料が９０と１５μｍの間の直径を持つビーズからなり；ビーズの見かけ容積（Ｖｂ）と液体試料の容積（Ｖｅ）が関係Ｖｅ＝α．Ｖｂであり、容器が管状のときαは１．４と１０の間の範囲を持ち、容器がディスク状のとき、αは２．１までである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、微生物を溶解する方法であって、一般に微生物、特には一以上の細
胞の膜を破壊して、少なくとも一の興味ある核材料、例えばデオキシリボ核酸（
ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）等の処理、特には分析するためのものを放出す
ることを可能にする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

資料ＵＳ−Ｃ−５，６４３，７６７は、液体中で溶解して細胞のＤＮＡ又はＲ
ＮＡを分離する方法を開示している。この目的のために容器を使用するが、これ
にはＲＮＡ又はＤＮＡを抽出するための溶媒、及び直径が０．１乃至１ｍｍの複
数の粒子、更に直径が３乃至５ｍｍの少なくとも一のより大型の粒子が含まれて
いる。このようにして充填されている容器に運動、即ち振動を与える。この資料
においては、この運動は、ミキサー又は別のホモジナイザーで作り出される回転
運動であることが好ましいことが明確に記載されているが、これは回転運動によ
れば、細胞は単純に同じ方向に回転して、それぞれが互いに衝突せず、ビーズと
一緒にすればそれらの間で押しつぶされるからである。

【０００３】資料ＵＳ−Ｃ−４，２９５，６１３は、細菌を破壊する装置を開示しているが
、これによれば、細胞を含んだ試料をチューブ内に微小なビーズと接触させて置
く。このビーズは、７０乃至１１０μｍのオーダーの直径を有するが、これを、
処理する試料及び必要な緩衝溶液とともにチューブ内に導入し、次いで振動運動
を当該容器又はチューブに対して水平軸に沿って適用し、これによって、溶液状
の亜細胞性構成物、例えば酵素、蛋白質、炭水化物等を得る。

【０００４】資料ＦＲ−Ａ−１，５７６，２９９は、植物及び動物の細胞を破壊する方法を
開示しているが、これによれば粒子サイズが直径において０．０５乃至１ｍｍの
粒子材料を使用しており、これは鋼製又は別の同様な物質製の粒子とすることが
できる。

【０００５】資料ＥＰ−Ａ−０，３１７，８０３は、水性媒体をカプセル化している多層状
リポソームを作製する方法を開示している。この方法は、脂質と、カプセル化す
る水性媒体とを混合し、この混合物を容器内で直径が３ｍｍ未満、好ましくは５
０乃至１００μｍの粒子の存在下で撹拌して直径が約１５０乃至３０００ナノメ
ートルのリポソームを得ることからなるものである。

【０００６】資料ＥＰ−Ａ−０，７９６，９１７は、粒子を生物学的試料（細胞を含む）中
に放出する装置を開示している。試料を撹拌又は超音波処理する場合に、この装
置は当該粒子を十分な期間保持し、次いでそれを放出して細胞を破壊するための
パーティションを具備しているが、これにより核酸をアクセス可能にする。この
パーティションにより保持される粒子はガラス製、プラスチック、又はジルコニ
ウム等の金属製であるが、これは異なる形状を有することができ、また約０．１
乃至０．１５ｍｍの直径を有することができる。一の粒子が当該パーティション
を破壊するために割り当てられていて、これは約１乃至４ｍｍ、好ましくは３ｍ
ｍの直径を有している。この交互の運動にかける装置は、Ｂｉｏｓｐｅｃの商標
の撹拌機である。

【０００７】資料ＥＰ−Ａ−０，２８８，６１８は、細胞（微生物を含む）を溶解し、亜細
胞性構成物（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を溶液中に放出させるための方法を開示
している。生物学的試料を、異なるサイズの粒子が入った容器内に入れる。次い
でこの容器を細胞がその構成物を放出するまで超音波処理にかける。超音波によ
り粒子が試料中において振動し、これによって剪断による細胞の破壊が起きる。
粒子は０．０５乃至１ｍｍの直径のガラス製ビーズである。超音波の時間は室温
で１０分間である。

【０００８】資料ＵＳ−Ｃ−５，４６４，７７３は、亜細胞性の構成物を破壊することなく
、細胞を溶解して、特にハイブリダイズさせるためのＲＮＡ及びＤＮＡを放出さ
せる装置を開示している。使用する容器は、二つのサイズのビーズであって、ジ
ルコニウム、ガラス、又はプラスチック製等のものを含んでいる。好ましい態様
においては、この容器にはサイズと重量が異なる二つのジルコニウム粒子、例え
ば０．７ｇで直径が０．１ｍｍのものと、０．６５ｇで直径が０．５ｍｍのもの
が４００μｌ含まれている。この容器に適用する運動は、振動（vibrating）タ
イプのもの、特には揺動（oscillatory）タイプの運動である。

【０００９】資料ＵＳ−Ｃ−４，６６６，８５０は、血液試料を遠心中に溶解する装置及び
方法を開示している。血液試料を入れる容器には、プラスチック製又はガラス製
の粒子又はビーズが含まれているが、これは細菌が遠心中にチューブの底に沈殿
するのを防止しないサイズでなくてはならない。

【００１０】資料ＥＰ−Ａ−０，３４１，２１５は、遺伝的に形質転換した酵母に由来する
異種蛋白質を産生する方法を開示している。蛋白質の量を評価するためには、細
胞を溶解し、当該酵母をガラス製ビーズとともに含んだ生物学的試料を震盪して
機械的剪断力を適用するとだけ記載されている。

【００１１】資料ＥＰ−Ａ−０，２８４，０４４は、酵母中の蛋白質の産生を増大させる方
法を開示している。これには、蛋白質の量を分析する細胞（酵母）を、ガラス製
のビーズであって直径が４５０乃至５００μｍのものとともに、好ましくは渦動
タイプの運動を最大スピードで１分間、連続して三回、当該生物学的試料に適用
して溶解すると記載されている。

【００１２】資料ＵＳ−Ｃ−４，７７５，６２２は、酵母培養物に由来する蛋白質の発現及
び回収方法を開示している。この方法は、少なくとも一の微生物を具備する生物学的試料を溶解するために
一般に使用されているが、特に少なくとも一の興味ある核酸を放出するために使
用されていて、これは以下の従来技術によるものを必須としている： −液体媒体中の生物学的試料であって、溶解する微生物を具備したものを容器中
に配置する； −少なくとも一の粒子材料で相対的に硬く、核材料に対して実質的に不活性であ
るものを前記容器内に配置する； −生物学的試料、及び粒子材料の混合物を、運動を引き起こすのに選択した技術
又は装置に応じて、種々の強度、及び／又は規則性運動の場合には種々の周波数
での交互運動に必ずかける。

【００１３】使用されるこれらの方法は、いくらかの不利益を有している。これらは十分に
効果的ではなく、特に細胞溶解は核材料の放出のために量及び質において不適切
であることが証明されている。更にこれらは溶解に抵抗性のあるとされている細胞を必ずしも溶解するわけで
はなく、特にグラム陽性細菌、例えばマイコバクテリアなどの場合はそうである
。同様に、これらの方法を使用すると、例えば酵素及び／又は界面活性剤等の添
加剤を添加することがしばしば必要になる。

【００１４】本発明によれば、米国特許第５，６４３，７６７号に開示された教示に反し、
渦動タイプの回転運動が、微生物を溶解して、興味ある核材料を直接的に放出さ
せるのに特に適することが判明したが、これは特に容器との関係における、この
運動のある種の変数を選択する必要がある。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】

従って本発明の主題は、少なくとも一の微生物を具備する生物学的試料を完全
に、効率良く、しかも単純に溶解する方法であって、方法の使用中に如何なる試
薬も如何なる付加的操作工程をも不要とする方法である。

【００１６】

【課題を解決するための手段】

従って本発明の第一の主題は、少なくとも一の細菌タイプの微生物を含む生物
学的試料を溶解して、当該微生物に属する少なくとも一の興味ある核材料を放出
させる方法であって、これによれば： −液体媒体中の当該生物学的試料を容器内に配置し； −少なくとも一の粒子材料であって相対的に硬く、核材料に対して実施的に不活
性であるものを当該容器内に配置し； −生物学的試料と粒子材料の混合物を運動にかける方法であり：組み合わせにおいて、選択する前記の運動が渦動タイプのものであり、以下の条件： −粒子材料は９０乃至１５０μｍの直径を有するビーズからなり、 −当該ビーズの見掛け容量であるＶｂ、及び液体試料の容量であるＶｅは、Ｖｅ
＝α．Ｖｂの関係にある（但し容器が管形である場合にはαは１．４乃至１０の
間であり、容器がディスク形である場合にはαは２．１以下である）に相当するものであることを特徴とし、これによって、試薬及び／又は付加的操作工程を更に要することなく、核材料を
直接的に天然型で、且つ如何なる試薬もがアクセスできる状態で液体媒体中に放
出される上記の方法である。

【００１７】本発明の第二の主題は、少なくとも一の酵母タイプの微生物を具備する生物学
的試料を溶解して、少なくとも一の興味ある核材料であって当該微生物に属する
ものを放出させる方法であるが、これによれば： −液体媒体中の当該生物学的試料を容器内に配置し、 −少なくとも一の粒子材料であって相対的に硬く、核材料に対して実質的に不活
性であるものを当該容器内に配置し、 −生物学的試料と粒子材料との混合物を運動にかける方法であって、組み合わせにおいて、選択する前記の運動が渦動タイプのものであり、以下の条件： −粒子材料は約５００μｍの直径を有するビーズからなり、 −当該ビーズの見掛け容量であるＶｂ、及び液体試料の容量であるＶｅは、Ｖｅ
＝α．Ｖｂの関係にある（但し容器が管形である場合にはαは１．４乃至１０の
間であり、容器がディスク形である場合にはαは２．１以下である）に相当するものであることを特徴とし、これによって、試薬及び／又は付加的操作工程を更に要することなく、核材料を
直接的に天然型で、且つ如何なる試薬もがアクセスできる状態で液体媒体中に放
出される上記の方法である。

【００１８】本発明の方法を使用すると、核材料が天然の状態で得られるが、このことはそ
れが全く分解されていない、例えば変性していないこと、又はそれが抽出された
細胞又は生物の中で有していた全ての性質又は特徴を保存していることを意味す
る。

【００１９】更に、本発明の方法は、単一の微生物を十分効果的に溶解するものであり、こ
れは数多くの生物学的分析、特に核プローブのハイブリダイゼーションによる増
幅又は分析の技術にとって特に重要である。

【００２０】核材料に関しては、本発明は、それに関して引き続いて行う如何なるプロトコ
ル、例えば一以上の増幅プライマー、一以上のハイブリダイゼーションプローブ
等に対してもアクセス可能な直接的方法でもって当該物質を放出する決定的な利
点を提供するするものである。

【００２１】従って本発明によれば、得られた溶解済生物学的試料は、直接的に処置するこ
とができ、即ち、放出された興味ある核材料についての如何なる操作工程におい
ても、例えば適切な核試薬等を使用して行う増幅や分析等の中間的な操作工程は
一切不要であり、また付加的試薬も一切不要である。

【００２２】本発明の第一の主題の好ましい態様によれば、細菌タイプの微生物の場合、粒
子材料は、約１００μｍの直径を有するビーズからなる。

【００２３】本発明の第一又は第二の主題の別の態様によれば、渦動タイプの運動は、更に
以下の関係を満たしている：Ｖｂ＜Ｖｅ＜Ｖｃ、但しＶｃ＝β．Ｖｅであり、βは２．５以上であり、Ｖｃは容器の有効容量である。

【００２４】本発明において使用が可能な容器は、異なる構造のものであってもよく、例え
ば管形又はディスク形とすることができる。容器は管形であることが好ましく、更にＵ字形底を有するものが好ましい。こ
の好ましい態様においては、βは２．５と３０の間の数である。

【００２５】本発明の更に別の態様においては、容器はＵ字形底を有するか（例えばファル
コン（商標）タイプ）、又は円錐形の底を有する（例えばエッペンドルフ（商標
）タイプ）管形及びディスク形のものである。容器がディスク形の場合、αは２．１以下の数であり、好ましくは１．４以下
であり、βは９．３以上の数である。容器はエッペンドルフチューブ等の円錐型の底を有し、αは１．４乃至１０の
間、好ましくは１．４と３．３の間であることが好ましく、βは２．５と３０の
間、好ましくは２．５と１５の間、更に好ましくは３．７５と１５の間であるこ
とが好ましい。容器はまた、ファルコンチューブ等のＵ字形底を有するチューブであることが
好ましく、αは１．４と１０の間、好ましくは１．４と３．３の間、更に好まし
くは３．３であることが好ましく、βは３と３０の間、好ましくは１２と３０の
間、更に好ましくは２０であることが好ましい。

【００２６】本発明の更に別の態様においては、粒子材料は、前記ビーズのものよりも大き
い直径を有する他のビーズを具備する。好ましくは容器は最大で１６、好ましく
は１０の他のビーズを有する。更に好ましくはこれらの他のビーズは、約２乃至
３ｍｍの直径を有する。

【００２７】本発明の方法のこの付加的特徴により、同等の効率でもって生物学的試料の溶
解に必要な時間を低減又は制限することが特に可能になる。この付加的特徴は又、例えば生組織等の複雑な生物学的試料を、実際の溶解前
に破壊することをも可能にする。

【００２８】本発明の更に別の態様においては、消泡剤物質を当該生物学的試料中に添加し
て最終濃度を液体試料の容量Ｖｅの０．０１乃至１重量％、好ましくは０．５乃
至１重量％とすることができる。

【００２９】別の態様によれば、アニオン性タイプの界面活性剤を生物学的試料中に、最終
濃度で液体試料の容量Ｖｅの２．５重量％まで添加することも可能である。

【００３０】本発明の第一の主題における好ましい態様においては、渦動タイプの運動にか
ける時間は、少なくとも１０秒間、好ましくは２０秒間、有益には１乃至５分間
の間である。渦動にかける時間は、溶解率が少なくとも２０％以上になるように調節する。使用する溶解プロトコルの特異性によれば、より大きな直径のビーズを添加す
る場合には特に、渦動タイプの運動にかける時間は約２分であることが好ましい
。

【００３１】本発明の第二の主題の好ましい態様においては、渦動タイプの運動にかける時
間は８分と２０分との間である。

【００３２】得られる溶解物により、興味ある核材料を直接的に検出、及び／又は定量、及
び／又は増幅することが可能になるので、本発明は又、興味ある核材料を具備す
る一の微生物を具備する生物学的試料を処理する方法であって、ａ）以下を備えた溶解工程： −液体媒体中の生物学的試料を容器内に配置する； −少なくとも一の粒子材料であって相対的に硬く、核材料に対して実質的に不活
性であるものを当該容器内に配置する；そして −生物学的試料と粒子材料との混合物を渦動タイプの運動にかける：但しこれは
組み合わせにおいて以下の通りである： −細菌タイプの微生物の場合には９０と１５０μｍの間の直径を有するビーズ
であり、及び酵母タイプの微生物の場合には約５００μｍのものである； −当該ビーズの見掛け容量であるＶｂと、液体試料の容量であるＶｅとの間に
は、Ｖｅ＝α．Ｖｂの関係がある（但し容器が管形である場合にはαは１．４と
１０の間であり、容器がディスク形である場合にはαは２．１以下である）；ｂ）溶解した生物学的試料を、溶解用の粒子材料とともに又はそれなしで、興味
ある核材料に特に関連した操作プロトコルに直接かけて、例えば核酸の増幅及び
／又は検出及び／又は定量する工程を具備する方法である。従って、例えば増幅後には、少なくとも１×１０²細胞／ｍｌを検出すること
ができる。

【００３３】本発明の第三の主題は、単一使用用の容器であって、上記した方法を実施する
ためのものであって、あらかじめ決定しておいた生物学的試料の容量に応じた、
上記した方法の実施に直接的に使用するのに適当な粒子材料を搭載することを特
徴とするものである。

【００３４】「生物学的試料」とは、単純又は複雑な生物学的物質の如何なる試料、検体、
又は画分をも意味し、例えば生組織又は体の流動物又は体液などである。この生
物学的試料には、微生物を構成する構造物につていの前処理、例えば組織の構成
の破壊とともに、又はそれなしで溶解する少なくとも一の微生物が含まれている
。

【００３５】「微生物」とは、閉じた膜又はエンベロ−プ、当該膜又はエンベロ−プの内部
に閉じられている一以上の興味ある亜細胞性の生物学的構成物、即ち核構成物（
ＤＮＡ又はＲＮＡ）を天然に具備した如何なる生物学的物質をも意味するものと
理解される。例えば、細菌や古細菌などの原核性生物、植物や動物の細動、酵母
や菌類等の真核生物、又、種々の生組織や更にウイルス粒子までももちろん挙げ
ることができる。

【００３６】「溶解」という用語は、上記した膜又はエンベロ−プを破壊して興味ある核材
料を完全な又は不完全な形態でもって放出するための如何なるプロセスをも意味
するものと理解される。

【００３７】以下の図及び実施例により、本発明の主題を例示することが可能になるが、こ
れらはその範囲を限定するものでは決してない。

【００３８】

【発明の実施の形態】

本発明の溶解方法の効率を決定するために、得られる溶解物の溶解率を測定す
ることにより分析する一般的な試験プロトコルを開発した。この一般的なプロトコルを以下に記載する。ＢＨＢ（脳−心臓ブロス）液体培地中で培養した、グラム陽性壁の細菌である
スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ参照ＡＰＩ番号 8149310）を、毎
分２５００回転で１０分間、２５°Ｃで遠心し、次にＢＨＢ培地又は溶解緩衝液
中に、５×１０⁹細胞／３００μｌの濃度で再懸濁する。溶解緩衝液の組成は、
以下の通りである：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．２。この懸濁液の３００μｌを、一定量のガラス製ビーズ
をあらかじめ含めておいた管へ添加する。管を閉じて、渦動タイプの運動に２分
間、最大出力で装置（Ｒｅａｘ２０００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）にかける。この
ように処理した細菌懸濁液は、分析にかけるまで氷上に保存する。溶解率は、５５０ｎｍでの光学密度を測定して、試料回収後すぐに決定する。
溶解率は、渦動前の５５０ｎｍにおけるＯＤ値に対する、渦動後の細菌溶液の５
５０ｎｍにおけるＯＤ値の比率に等しい。

【００３９】渦動工程で放出された核酸の量は、０．８％アガロースゲル上で確認する。溶
解物の１０μｌを各ウェルに置き、泳動は定常電圧（１５０Ｖ）で行い、ゲルは
紫外線輻射下での観察前に臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色する。渦動工程で放出される核酸の量は、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（フランス）のＶｉ
ｄａｓ（商標）装置を使用して、いわゆるサンドウイッチハイブリダイゼーショ
ン技術により決定する。Ｓ．エピデルミディスの核酸に特異的な捕捉用及び検出
用のオリゴヌクレオチドプローブ（特許ＥＰ０，６３２，２６９を参照）を選
択した。この捕捉用及び検出用オリゴヌクレオチドは、 5’-GACCACCTGTCACTCTGTCCC-3’（配列ＩＤ番号：１）及び 5’-GGAAGGGGAAAACTCTATCTC-3’（配列ＩＤ番号：２）をそれぞれ有する。検出
用プローブは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にカップリングさせて標識させ
る。溶解物中に放出された核酸へのこれらのプローブの特異的ハイブリダイゼー
ションは、存在する核酸の量のみならず、使用するプローブのアクセスしやすさ
にも依存する。Ｓ．エピデルミディスのＤＮＡ及びＲＮＡ分子に特異的な以下の二つの増幅プ
ロトコルは、回収した溶解物でもって開始したが、これは渦動により放出された
核酸が増幅されるか否かを確認するためである：ＤＮＡの増幅用のＰＣＲプロト
コル、及び１６ＳｒＲＮＡの増幅用のＮＡＳＢＡプロトコル。

【００４０】ＰＣＲプロトコル：ＰＣＲ法は、ＧｏｏｄｍａｎがＰＣＲｓｔｒａｔｅｇｉ
ｅｓ、編：Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆｏｒｄ，ａｎｄＳｎｉｓｋｙ、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９９５ｐｐ１７−３１に記載されるものである。二
つの増幅プライマーを使用したが、これらは以下の配列を有している：プライマー１：5’-ATCTTGACATCCTCTGACC-3’（配列ＩＤ番号：３）プライマー２：5’-TCGACGGCTAGCTCCAAAT-3’（配列ＩＤ番号：４）。以下の温度サイクルを使用した：一回３分間９４°Ｃ２分間６５°Ｃ３５回１分間７２°Ｃ１分間９４°Ｃ２分間６５°Ｃ一回５分間７２°Ｃ

【００４１】ＮＡＳＢＡプロトコル：ＮＡＢＳＡ法は、ＶａｎｄｅｒＶｌｉｅｔｅｔ
ａｌ．，J．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３，１３９：２４２３に記
載されているものである。二つの増幅プライマーを使用したが、これらは以下の
配列を有している：プライマー１：5’-GGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGA-3’ プライマー２：5’-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA-3’。溶解物の１０μｌ又は５μｌをそれぞれＰＣＲ及びＮＡＢＳＡアッセイに使用
する。ＰＣＲによる増幅物は、上述のようにして０．８％アガロースゲルで観察
し、Ｖｉｄａｓ装置で定量する。ＮＡＢＳＡ後に産生される増幅物は、P．Ｃｒ
ｏｓｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ１９９２，２４０：８７０に記載される
方法により、Ｓ．エピデルミディスに特異的な捕捉プローブ及び検出プローブで
ハイブリダイゼーションして、マイクロプレート上で検出及び定量する。検出プ
ローブは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にカップリングして
いる。この二つのプローブは、以下の配列を有する：捕捉プローブ：5’-GATAGAGTTTTCCCCTTC-3’（配列ＩＤ番号：７）検出プローブ：5’-GACATCCTCTGACCCCTC-3’（配列ＩＤ番号：８）。

【００４２】

【実施例】

実施例１：ビーズの直径の及び渦溶解の有効性に関する係数の影響ａ−ビーズの直径の影響該溶解プロトコルは、実験毎に２分間、異なる直径で特徴付けたビーズの異な
る混合物の９０μｌの存在中でスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphy
lococcus epidermidis）（５ｘ１０⁹細胞／３００μｌ）の最初の懸濁によって
開始する上述した通りに実行した。試験した直径は、１と５００μｍの間とした
；試験した混合物は以下の通りである：Ａ：１と５００μｍの間の直径を有するガラスミクロビーズ、Ｂ：５０と１００μｍの間の直径を有するガラスミクロビーズ、Ｃ：９０と１５０μｍの間の直径を有するガラスミクロビーズ、Ｄ：直径１００μｍのビーズの均一な混合物、Ｅ：直径１００μｍのジルコニウムビーズの均一な混合物Ｆ：直径５００μｍのジルコニウムビーズの均一な混合物Ｇ：直径１００と５００μｍのジルコニウムビーズの混合物（５０／５０v/
v）。

【００４３】図１中に示した通り、得られた細胞溶解は、９０と１５０μｍの間の、好まし
くは１００μｍに等しい直径を有するビーズの存在中で最も有効であった。これ
らの条件下で２分間渦動後に採取した試料の５５０ｎｍでの光学濃度の測定は、
Ｓ．エピデルミディスの溶解パーセンテージがこのビーズ直径で６０と７０％の
間であることを示す。溶解パーセンテージにおける無視して良い誤差のみが、同
じ直径のビーズ（ガラス又はジルコニア）の本質に従って観測される。一方、直
径１から５０μｍ、５０から１００μｍ、１００から５００μｍ、又は直径５０
０μｍのビーズの均一な混合物のような、９０から１５０μｍまでよりも小さい
又は大きい直径を有するビーズの使用は、溶解パーセンテージにおける減少をも
たらす。図２中に提示した、溶解物に放出した核酸の０．８％アガロースゲルで
の分析は、ＤＮＡとｒＲＮＡ分子が、０．８％アガロースゲル上でのそれらの移
動プロフィールが精製した且つ商業上利用可能な細菌ＤＮＡとｒＲＮＡの分子の
それと同じであることから、十分に保存される。放出される核酸はまた、その細
胞溶解のために用いたビーズの直径にかかわらず、同じ移動プロフィールを有す
る。該放出される核酸はまた、そのプロトコルが上述されるＶｉｄａｓ分析によ
っても検出することができる。更に図２に従って、Ｖｉｄａｓ分析によって測定
した、溶解物中に放出される核酸の量は、得られた溶解パーセンテージを反映す
る。並びにそれは、それぞれの溶解物のＤＮＡ又は１６ＳｒＲＮＡが、先の一般
的な試験プロトコルのセクションで記載される、ＰＣＲ又はＳ．エピデルミディ
スに特有のＮＡＳＢＡによって増幅することができる。

【００４４】ｂ−係数αの影響 −エッペンドルフ(Eppendorf)管該溶解プロトコルは、２分間、１００μｍの直径を有するビーズの存在中で実
行した。同一のエッペンドルフ管を全ての実験で用いた。細菌懸濁液の容積は、
それぞれの実験について３００μｌ／管でセットし、且つビーズの容積を１と３
００μｌの間で変えた。Ｖｂ、ビーズの見かけ容積、及びＶｅ、Ｖｅ＝α．Ｖｂ
（αは０と異なる正の実数である）と共にＶｂ＜Ｖｅとなるような液体試料の容
積である。係数αは、１から３００まで変化した。渦動工程の後、採取した該試
料は、５５０ｎｍで光学濃度を測定することによって分析され、溶解物に放出さ
れる核酸は、０．８％アガロースゲル上で検査され且つＶｉｄａｓ分析により定
量される。

【００４５】図３は、Ｓ．エピデルミディスの溶解が１．４と１０の間のα係数値について
有効であることを示す：その溶解パーセンテージは３０と７０％の間である。α
＜１．４の値について、ビーズの溶液が余りに多すぎて、細胞の懸濁液の不活性
容積が、細胞の懸濁液の最初の溶液を回収することが不可能となる程度にまで増
加する。α＞１０の容積については、ビーズの容積が低くなり、会合の及びビー
ズと細胞との間の機械的衝撃の可能性が減じられる。好ましくは、該細胞溶解は
、１．４と３．３の間のα値についてより有効である：その溶解パーセンテージ
は４０と７０％の間になっている。該溶解物の０．８％アガロースゲルでの分析
は、放出される核酸の移動プロフィールが、αの値にかかわらず、変更されない
ことを示す。Ｖｉｄａｓ分析によって測定した核酸の量は、溶解パーセンテージ
と直接的な相関関係になる。

【００４６】 −ファルコン(Falcon)管同じ試験を、エッペンドルフ管を、ポリプロピレンで作られたファルコン管（
Ｖｃ＝６ｍｌ）に変えて実行した。図４は、Ｓ．エピデルミディスの溶解が１．
４と１０の間のα係数値で有効であることを示す：その溶解パーセンテージは、
２０％よりも大きい。好ましくは、該細胞溶解は、１．４と３．３の間のα値で
より有効である：その溶解パーセンテージは６５と８５％の間である。

【００４７】 −ディスク形ｌ＝Ｌ＝８．５ｃｍとｈ＝０．４ｃｍの寸法を有するカードを用いた。ウェル
として定義される１以上の孔が、該カードの高さ（それは０．４ｃｍである）と
常に等しい高さを有し且つ一定の直径を有して作製される。これらのウェルは、
何れかの側がフィルムで覆われ、且つそれぞれのウェルは、１００μｌの直径、
見かけ容積Ｖｂを有するビーズ、２ｍｍの直径を有する１０の鉄ビーズの及び容
積Ｖｅの細胞懸濁液の混合物により充填される。かくして定義した該カードは、
渦動上に維持される。

【００４８】その溶解プロトコルは、２分間実行した。３０ｃｍの直径を持つ（Ｖｃ＝２．
８ｍｌ／ウェル）上述した通りのカードを、それぞれの実験に使用した。細菌懸
濁液の容積は、７００μｌ／ウェルにセットし、ビーズの容積は９０から５１０
μｌ／ウェルまで変えた。係数αは、１．４から７．８まで変えた。渦動工程の
後、採取した試料の溶解パーセンテージは、５５０ｎｍで光学濃度を測定するこ
とによって分析し、放出される核酸は、アガロースゲル上で調査し、且つＶｉｄ
ａｓ分析によって定量した。

【００４９】図５は、係数αの関数として得られた溶解パーセンテージを示す。Ｓ．エピデ
ルミディスの溶解は、２．１以下の係数値による「カード」フォーマットを有す
る容器で有効である：αが１．４と２．１の間である場合、溶解パーセンテージ
は４５％と７５％の間である。好ましくは、その係数の最適値は、１．４に近づ
くα値では溶解パーセンテージがプラトーに達しないために、１．４より少なく
すべきである。その溶解物の０．８％アガロースゲルでの分析は、放出される核
酸移動プロフィールが、αの値にかかわらず変化しないことを示す。Ｖｉｄａｓ
分析によって測定した核酸の量は、溶解パーセンテージと直接的に相関関係とな
る。

【００５０】実施例２：渦動溶解の能率についての係数βの影響 −エッペンドルフ(Eppendorf)管該溶解プロトコルは、２分間、ビーズの見かけ容積と液体試料の容積との間の
一定割合（α＝Ｖｅ／Ｖｂ＝３．３）の存在中で実行した。細菌懸濁液の容積は
、１００μｌと１ｍｌの間で変化させた。即ちＶｅ、液体試料の容積及びＶｃ、
容器の有用な又は利用可能な容積で、Ｖｅ＜Ｖｃ及びＶｃ＝β．Ｖｅ（βは０以
外の正の実数である）となるようにし、該係数βは１．５から１５まで変化させ
た。その実験は、エッペンドルフ管はＶｃ＝１．５ｍｌである。渦動工程の後、
採取した該試料は、５５０ｎｍで光学濃度を測定することによって分析され、溶
解物に放出される核酸は、０．８％アガロースゲル上で検査され且つＶｉｄａｓ
分析により定量される。

【００５１】係数βの関数として得られた溶解パーセンテージが、図６中に示される。Ｓ．
エピデルミディスの溶解は、２．５と１５の間のβ係数値について有効である：
その溶解パーセンテージは、３０％より大きい。２．５より小さいβの値につい
て、ビーズと液体試料の容積が余りに多すぎる；それは試料中のビーズの移動が
制限され且つ試料の不活性容積が増加する。１５より大きなβの値については、
試料の容積が、α＝３．３における細胞懸濁液の開始容積の完全な回収を与える
ためにあまりにも低すぎる。好ましくは、細胞溶解の能率は、３．７５と１５の
間のβ値についてより良好である：溶解パーセンテージは、３５と６０％の間で
ある；７．５と１５の間の値（４０から６０％溶解）が好適である。溶解物の０
．８％アガロースゲルでの分析は、放出される核酸の移動プロフィールがβの値
にかかわらず同じであることを示す。Ｖｉｄａｓ分析によって測定される核酸の
量は、得られた溶解パーセントと直接相関関係になった。

【００５２】 −ファルコン(Falcon)管同じ試験を、エッペンドルフ管を、ポリプロピレンで作られたファルコン管（
Ｖｃ＝６ｍｌ）に変えて実行した。係数αの同じ値をセットした（α＝３．３）
。細菌懸濁液の容積は、２００μｌと２ｍｌの間で変化させた。βは、３から３
０までで変化させた。図７は、係数βの関数として得られた溶解パーセンテージ
を説明する。Ｓ．エピデルミディスの溶解は、６と３０の間のβ値でより有効で
ある：その溶解パーセンテージは、５０％よりも大きい。β＞３０の値について
は、試料の容積が、α＝３．３において細胞懸濁液の最初の容積の完全な回収を
与えるには余りにも少なすぎる。好ましくは、細胞溶解の能率は、１２と３０の
間のβ値でより良好となる：溶解パーセンテージは６０％より大きい。

【００５３】 −ディスク形溶解プロトコルは、２分間で、係数αの値（α＝３．３）と共に、実施例１で
用いたと同じ容器（ウェルの直径３０ｍｍ、Ｖｃ＝２．８ｍｌ）で実行した。細
菌懸濁液の容積は、３００から７００μｌ／ウェルまで変化させた。係数βは、
４から９．３まで変化させた。渦動工程の後、回収した試料の溶解パーセンテー
ジは、５５０ｎｍで光学濃度を測定することによって分析した。放出される核酸
は、アガロースゲル上で調査し、且つＶｉｄａｓ分析によって定量した。

【００５４】係数βを関数として得られた溶解パーセンテージは、図８中に示される。Ｓ．
エピデルミディスの溶解は、９．３以上のβ値のための「カードフォーマット」
を有する容器で有効である。βが、非最適値のα（α＝３．３）と共に９．３に
等しい場合、細胞の６０％が溶解される。溶解物の０．８％アガロースゲルでの
分析は、放出される核酸の移動プロフィールがβの値にかかわらず変化しないこ
と及びその管フォーマットについて記載したそれらと類似していることを示す。
Ｖｉｄａｓ分析によって測定した核酸の量は、それぞれの実験のための溶解パー
センテージと相関関係にある。

【００５５】実施例３：渦動溶解の能率に関して管の幾何の影響溶解プロトコルは、２分間、細胞溶解液の３００μｌと１００μｍの直径を有
するビーズの９０μｌの存在中で、異なる幾何及び異なる容積（Ｖｃ）を持った
容器で実行した（α＝３．３及びβは可変である）。

【００５６】Ａ：Ｖ字形底を持つポリプロピレンのエッペンドルフ管、Ｖｃ＝１．５ｍｌＢ：平底のポリプロピレン分光器キュベット、Ｖｃ＝５ｍｌＣ：平底管、Ｖｃ＝３０ｍｌＤ：平底管、Ｖｃ＝６０ｍｌＥ＝平底ガラスボトル、Ｖｃ＝８ｍｌＦ＝平底ガラスボトル、Ｖｃ＝２５ｍｌＧ＝Ｕ字形底を持ったポリスチレン管、Ｖｃ＝６ｍｌＨ＝Ｕ字形底を持ったポリスチレン管、Ｖｃ＝１４ｍｌＩ＝Ｕ字形底を持ったポリスチレン管、Ｖｃ＝２２ｍｌＪ＝Ｕ字形底を持ったポリプロピレン管、Ｖｃ＝６ｍｌＫ＝Ｕ字形底を持ったポリプロピレン管、Ｖｃ＝１４ｍｌＬ＝Ｕ字形底を持ったポリプロピレン管、Ｖｃ＝２２ｍｌＭ＝Ｕ字形底を持ったポリプロピレン管、Ｖｃ＝４ｍｌ。

【００５７】図９は、使用した容器の幾何の関数として得られた溶解パーセンテージを示す
。その溶解パーセンテージは、平底を持つ及びＶ字形底を持つ管については６０
と７５％の間の平均に基づき、一方、同じ渦動時間と同じαの値でのＵ字形底を
持った管については７０と８０％の間の平均に基づく。放出した核酸の量の、Ｖ
ｉｄａｓ分析による測定は、この影響を確認する。

【００５８】実施例４：渦動溶解の能率に関するより大きな直径を持ったビーズの添加の影
響溶解プロトコルは、２分間、細胞溶解液の３００μｌと１００μｍの直径を有
するビーズの９０μｌ（即ちα＝３．３及びβ＝５）の存在中で、エッペンドル
フ管中で実行した。各種のビーズを組合せて媒体に加えた：２ｍｍの直径を有す
る鉄ビーズ、３ｍｍの直径を有するガラスビーズ。

【００５９】図１０は、加えたビーズの各種組合せの関数としてＳ.エピデルミディスの溶
解パーセンテージを示す。鉄ビーズの又はガラスビーズの添加は、溶解パーセン
テージの増加をもたらす。このパーセンテージは、１０ビーズ／管までの存在に
おいて実質上、より良好である。これら１０ビーズの存在は、１００μｍの直径
を有するビーズの移動を妨げることはない；一方、この値より上では、その移動
は妨げられる。得られた溶解パーセンテージは、実験毎に、鉄ビーズと同じ数の
ガラスビーズの存在においてより高かった。図１１に従い、鉄とガラスビーズの
組合せの添加は、試験したそれぞれの組合せの均一な混合物の添加の存在と同程
度に高い溶解パーセンテージを得ることを可能にする；その溶解パーセンテージ
は、８０％より大きい。放出される核酸についての０．８％アガロースゲルでの
分析は、そのＤＮＡとｒＲＮＡ分子が、使用したビーズの組合せにかかわらず、
溶解後同じ移動プロフィールを有することを示す。鉄とガラスビーズの添加は、
放出される核酸材料の構造に逆の影響を及ぼさない。更に、それは、該溶解物中
のそれらの存在が、ＰＣＲとＮＡＳＢＡ増幅反応に干渉しないことを証明する。

【００６０】実施例５：渦動溶解の能率に関する渦動時間の影響３つの溶解プロトコルを並行して実行した： −プロトコルＩ：エッペンドルフ管Ｖｃ＝１．５ｍｌ、直径１００μｍのビー
ズの９０μｌ及び細胞懸濁液の３００μｌ、α＝３．３及びβ＝５）。 −プロトコルＩＩ：プロトコルＩＩに加えて直径３ｍｍのガラスビーズと直径
２ｍｍの鉄ビーズ。 −プロトコルＩＩＩ：プロトコルＩＩにおいてエッペンドルフ管に代えてファ
ルコン管（Ｖｃ＝６ｍｌ）。

【００６１】図１２は、プロトコルＩとＩＩにおいて、渦動時間の関数として得られた溶解
パーセンテージを示す。プロトコルＩのための実験条件は最適ではない。それは
、渦動２分後でＳ.エピデルミディス細菌の６０％のみが溶解されることから確
認される。一方、渦動時間の増加によってこれらの非最適条件にもかかわらず該
プロトコルの能率が改善される可能性がある：８分を越える渦動、８５％の細菌
が溶解される。プロトコルＩＩのための実験条件は、３ｍｍの直径を有するビー
ズの付加のために、プロトコルＩのそれよりもより至適である：これらの条件下
で、Ｓ.エピデルミディス細菌の８５％が、４分を越える渦動で溶解される。

【００６２】図１３は、プロトコルＩＩとＩＩＩのための渦動時間の関数として得られた溶
解パーセンテージを表す。プロトコルＩＩＩのための実験条件は、プロトコルＩ
Ｉのそれらよりもより至適である：プロトコルＩＩ又はＩのそれぞれについて２
分後の細菌の８０％又は６０％のみであったのに対し、８８％のＳ.エピデルミ
ディス細菌が、渦動のわずか２分後に溶解される。放出される核酸の、Ｖｉｄａ
ｓ分析による測定は、これらの主要な観測を確証する。

【００６３】かくして、渦動時間の増加は、最初の実験条件が至適ではない場合に、高い溶
解パーセンテージを得ることを可能にする。同じく、これらの条件が至適である
場合、渦動時間は短縮して良い（２分間）。

【００６４】実施例６：本発明に従う溶解プロトコルの普遍性本発明に従う溶解法は、他の細胞種に適用し得る。そのために、該プロトコル
は、１×１０⁹細胞／ｍｌの濃度を有する細胞懸濁液の３００μｌ、１００μｍ
の直径を有するビーズの９０μｌの存在でエッペンドルフ管内で８分に等しい渦
動時間によって実行した。各種の細胞をそれぞれ使用した（マイコバクテリウム
・ゴルドナエ(Mycobacterium gordonae)、大腸菌(Escherichia coli)、リステリ
ア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus
pneumoniae)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophil
us)、ミクロコッカス種(Micrococcus sp.)、アクチノマイセス・ビスコサス(Act
inomyces viscosus)、ネスルンド放線菌(Actinomyces naeslundii)、ストマトコ
ッカス・ムシラギノサス(Stomatococcus mucilaginosus)、ノカルディア・アス
テロイデス(Nocardia asteroides)、ロドコッカス種(Rhodococcus sp.)）。得ら
れた結果は、これらの分析のそれぞれの溶解パーセンテージが、８０と９０％の
間であることを示す。それぞれの溶解物において放出された核酸の０．８％アガ
ロースゲルでの移動プロフィールは、試験したそれぞれの細菌株について類似し
、精製した及び商業上利用可能な大腸菌１６ＳのｒＲＮＡとＤＮＡのそれに類似
する。

【００６５】実施例７：酵母の溶解試験した種：カンディダアルビカンス(Candida albicans) 容器：Ｖｃ＝６ｍｌのポリプロピレン製ファルコン管。０．５ McFarlandに調製した試料、それは３．１０６酵母／ｍｌである。試料容積：Ｖｅ＝６００μｌビーズの見かけ容積：Ｖｂ（μｌ、可変）：６０、９０及び１８０μｌ。試験したガラスビーズの直径（μ）：１００、５００及び１５００μｍ。溶解能率は、溶解パーセンテージに基づいて測定される：溶解％＝ＯＤ５５０（溶解前）−ＯＤ５５０（溶解後）／ＯＤ５５０（溶解前
）渦動の継続：２から２０分間

【００６６】結果

【表１】１００μｍの直径が不十分であることが示される。

【００６７】

【表２】１５００μｍのビーズ直径に関して、約３０％の溶解パーセンテージが、６０
と１８０μｌの間のＶｂと８と２０分の間の渦動継続によって得られることが示
される。

【００６８】

【表３】５００μの直径が、６０と１８０μｌの間のＶｂと８と２０分の間の渦動継続
によって、５０％より高い溶解パーセンテージを得ることを可能にすることが示
される。

【００６９】結論：８と２０分の間の渦動継続によって、直径で５００μｍのビーズが、酵母溶解
のための渦動型運動との組合せにおけるパラメーターとして必須である。

【００７０】実施例８：本発明に従う溶解プロトコルの感受性本発明の方法に従う溶解によって放出されるＤＮＡと１６ＳｒＲＮＡ核酸は
増幅を受けさせた。溶解条件は実施例６中に示したそれと同じである。用いた細
菌株は、Ｓ.エピデルミディスである。Ｓ.エピデルミディス核酸に特異的な２つ
の増幅プロトコルは、一般的な試験プロトコル中に上述した通り、ＤＮＡの増幅
のためのＰＣＲプロトコル、又は１６ＳｒＲＮＡの増幅のためのＮＡＳＢＡプ
ロトコルのいずれか一方で、採取した溶解物により開始するよう実施した。

【００７１】１）−放出されるＤＮＡのＰＣＲ増幅１×１０⁹から１×１０²細胞／ｍｌの開始濃度を用いた。溶解物の１０μｌを
それぞれのＰＣＲアッセイ用に用いた。生産されるアンプリコンは、一般的な試
験プロトコル中に記載した通り、Ｖｉｄａｓ装置での特異的サンドウイッチハイ
ブリダイゼーション後に検出及び定量した。生産されるアンプリコンは、少なく
とも１×１０²細胞／ｍｌより大きいか又は等しい、即ち３０細胞／３００μｌ
の開始細菌濃度で測定することができる。かくして、渦動によって最適化した溶
解プロトコルは、少なくとも３００細胞／３００μｌで溶解するために及び生産
されるアプリコンの量が検出可能であるようにＰＣＲによって増幅することがで
きるＤＮＡ分子を放出するために有効である。

【００７２】２）− １６ＳｒＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅２×１０⁹から２×１０²細胞／ｍｌの開始濃度を用いた。溶解物の５μｌをそ
れぞれのＮＡＳＢＡアッセイ用に用いた。生産されるアンプリコンは、一般的な
試験プロトコル中に記載した通り、Ｓ.エピデルミディスに特異的なオリゴヌク
レオチドプローブによるサンドウイッチハイブリダイゼーションによってミクロ
プレート上で検出及び定量した。生産されるアンプリコンは、少なくとも２×１
０²細胞／ｍｌより大きいか又は等しい、即ち６０細胞／３００μｌの開始細菌
濃度で検出及び測定することができた。測定したアプリコンの量は、６０細胞／
３００μｌより低い開始濃度を有する細菌の溶解後に、生産されるアプリコンが
検出可能で且つ測定可能であろうと思われることを示す、この開始濃度について
は高い。

【００７３】実施例９：試料中のビーズの揺動で生じる泡の形成の解消自動化の目的のために、ピペッティングを経て移行する工程に邪魔になる又は
妨害する、液体中の泡の形成を解消及び防止することが必須である。「消泡」剤
で、このタイプの現象を制限するその能力に関して研究した。これをなすために
、流動的にされている且つ"ＮａＬｃ"プロトコルに従って不活性化されている呼
吸器用の試料（痰(sputum)、痰(expectorations)、気管支肺胞の洗浄物）を用い
たプロトコルを確証した。概略的には、２ｍｌの試料が防腐溶液（４％水酸化ナ
トリウムの１５０ｍｌ中にＮ−アセチル−Ｌ−システインの０．７５ｇを溶かす
ことによって得た）の２ｍｌに加えられる。その混合物は渦動され、２０分間室
温で撹拌を維持し、４１ｍｌのリン酸緩衝液で中性化される（ｐＨ６．８）。そ
の全体の媒体は、５０秒間渦動され、次いで４℃、４０００ｇで２５分間遠心分
離される。そのペレットは、上清を排除した後の残りの２ｍｌ中で再懸濁される
（渦動、１５秒）。

【００７４】次いで各種の試料が、該試験のための均質且つ不変の媒体を得るために混合さ
れる。該実験は、以下の手法で実施される：２６０μｌの試料を、１００μｍの
直径を有するガラスビーズの９０μｌ、２ｍｍの直径を有する３のガラスビーズ
、２ｍｍの直径を有する５の鉄ビーズと共に、１２×７５ｍｍのポリプロピレン
管に加える。４０μｌのアニオン性洗浄剤を、２．５％の最終濃度が得られるよ
うに加える。その洗浄剤の存在は、核酸が溶解プロセスの間安定化され且つ保護
されるという事実によって証明される。

【００７５】その媒体全体を、１２分間最大パワーで、Reax 2000 vortex(Heidolph)中で撹
拌する（時間は標準プロトコルと比較して特に長いが、妥当である場合に泡の形
成の可能性が促進されるであろう）。その管中の液体の高さが最初と撹拌後に測
定され、得られた泡のパーセンテージが、最初の高さに対する泡の高さの割合を
算出することによって以下の結果で表される。

【表４】

【００７６】消泡剤、特にFoam Ban MS-575 (Ultra Inc., Charlotte, USA)が、０．０１か
ら１％の最終濃度が得られるように、取るに足らない量で加えられる（表４）。

【００７７】その結果（表４参照）は、消泡剤の存在が、特に沈渣のような臨床試料からの
泡の形成の解消を与えることを示す。０．５から１％の濃度でのその使用は、ビ
ーズの存在する液体試料の撹拌で生じる泡の形成を完全に解決することを可能に
する。

【００７８】該消泡剤の有効性はまた、上述したプロトコルに従い、０．６％の最終濃度で
、個別の試料（混合しない）を用いても確認された。

【００７９】その結果（表５参照）は、泡の形成が生物学的試料に従い可変であるが、溶解
プロトコルにおける消泡剤の存在は、各種の呼吸器系試料からの泡の形成を解決
し且つ防止することを示す。

【表５】

【００８０】実施例１０：消泡剤の存在中で微生物を溶解するためのプロトコルの感受性特に消泡剤の存在中で、全体の溶解プロトコルの能率を、非常に低い濃度の細
菌を含む試料で評価した。細菌マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧを、このマイ
コバクテリウムが溶解するのが困難であることが知られ、且つ呼吸器系試料にお
いて特に試験されるため、用いた。

【００８１】デンシトメトリー測定によって決定した濃度（５５０ｎｍでの光学密度）の細
菌の均質な最初の懸濁液で開始される連続希釈を、陰性（各種の流動化し且つ脱
不純物した陰性沈渣を混合することによって再構築した）且つ不活性化した沈渣
（９５℃で１５分間加熱する）である沈渣の取るに足らない容積画分に接種する
ために作製した。かくして再構築した該試料を、以下のプロトコルにかけた：・それぞれ２．５％と１％の採集濃度をえるためにアニオン性洗浄剤とFoam
Ban MS-575消泡剤を含む緩衝液中での希釈。・９５℃で１５分間加熱すること（細菌の不活性化）。・６００μｌの容量が、１００μｍのガラスビーズの１８０μｌ、６のガラ
スビーズ（直径２ｍｍ）、１０の鉄ビーズ（直径２ｍｍ）を含む１２ｘ７５ｍｍ
のセル（ポリプロピレン）に加えられ、その全媒体は、最大パワーで２分間、可
動を促進するために揺動される。

【００８２】同時に、コントロール実験が実施される：これらは、渦動によってビーズを揺
動する工程を除いて、上述したと同じプロトコルを受けさせる。

【００８３】かくして潜在的に放出される核酸は、以下のプロトコルに従い、Ｍ．ツベルク
ロシスＢＣＧ１６ＳＲＮＡ配列に相補である捕捉オリゴヌクレオチドから得ら
れたマグネチックビーズ(Seradyne)での特異的捕捉工程により精製される：・得られた溶解物の２５０μｌが、マグネチックビーズに結合したオリゴヌ
クレオチドプローブ（５０μｌ／アッセイ）を含む捕捉緩衝液と混合される。そ
の全体の媒体は、６０℃で２０分間、次いで室温で１０分間インキュベーション
され、次いでその上清が磁力付与によって管の壁に該ビーズを固定化した後に除
去される。・該ビーズは、洗浄緩衝液の１ｍｌの２画分で洗浄される（再懸濁及び磁力
付与）。・緩衝液の除去後、該ビーズは、５０μｌの水と、McDonoughら（Nucleic A
cids Amplification Technologies, 1997, Ed. Lee, Morse & Olsvik, Eaton Pu
blishing, Natik, USA, pp. 113-123）同じくKacianとFulz（Nucleic Acid Sequ
ences Amplification Methods, 1995, 米国特許第５３９９４９１号）によって
記載された"Transcription-Mediated Amplification" (TMA)に基づいたＭ．ツベ
ルクロシス同定キット（"Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct", Gen
-Probe ref. 1001）のオリゴヌクレオチドプライマーとデオキシリボヌクレオチ
ドを含む増幅混合物の２５μｌで再懸濁される。・その全体の媒体は、６０℃１５分間加熱され、４２℃で５分間冷やされ、
該キットの酵素溶液（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素を含む）の２５μ
ｌが加えられる。・その反応物は、４２℃で１時間インキュベーションされ、Arnoldら（Clin
. Chem., 1989, Vol. 35, pp. 1588-1594）によって記載される「ハイブリダイ
ゼーション保護アッセイ」（ＨＰＡ）に従い、キットの検出試薬を用いて分析さ
れる。・その反応物は、４５０イルミノメーター(Gen-Probe)で読まれ、相対光単
位（ＲＬＵ）におけるデータをもたらし、アッセイの陽性の限界は、３００００
ＲＬＵｓである。

【００８４】得られたデータは、表６中に示され、試験した条件毎の３つの実験アッセイに
相当する。

【表６】

【００８５】その結果（表６参照）は、消泡剤の存在中でガラスビーズを用いた溶解プロト
コルの実施は、１０^-3細菌／アッセイに当量、即ち感受性手法においてリボソー
ムの１から１０コピーに当量の生物学的試料中で検出することを可能にする。比
較すると、溶解の不在（試料の不活性化のための洗浄剤の存在中で最初に加熱す
ることを除く）は、アッセイ当たり１０から１０００細菌の当量、即ち用いた溶
解法によるよりも１００００倍でのみ検出できる。

【００８６】これらの結果は、ビーズの存在中（渦動などの助力と共に）で機械的衝撃によ
って細菌の溶解に関するプロトコルの有効性が、消泡剤の使用と結び付くことを
示す。ビーズの揺動による溶解の方法の組み合わせは、それ故に、申し分なく適
当である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、溶解率（ｙ軸）を、ビーズの直径（ｘ軸）と混合物の組
成（ビーズの性質と割合）の関数として表したものである。「ＳＩ」とは、初期溶液を意味し、溶解されていない対照を表す。Ａ：１乃至５０μｍのガラス製ビーズＢ：５０乃至１００μｍのガラス製ビーズＣ：９０乃至１５０μｍのガラス製ビーズＤ：１００μｍのガラス製ビーズＥ：１００μｍのジルコニウム製ビーズＦ：５００μｍのジルコニウム製ビーズＧ：１００及び５００μｍのジルコニウム製ビーズの５０／５０混合物

【図２】図２は、検出されたＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの核酸（ｙ軸）
を、ビーズの直径（ｘ軸）の関数で表したものである。「ＳＩ」とは、「初期溶液」を意味し、溶解しなかった対照を表す。Ａ：１乃至５０μｍのガラス製ビーズＢ：５０乃至１００μｍのガラス製ビーズＣ：９０乃至１５０μｍのガラス製ビーズＤ：１００μｍのガラス製ビーズＥ：１００μｍのジルコニウム製ビーズＦ：５００μｍのジルコニウム製ビーズＧ：１００及び５００μｍのジルコニウム製ビーズの５０／５０混合物

【図３】図３は、エッペンドルフチューブ内での溶解率（ｙ軸）を、係数
ａ（ｘ軸）の関数で表したものである。

【図４】図４は、ファルコンチューブ内での溶解率（ｙ軸）を、係数ａ（
ｘ軸）の関数で表したものである。

【図５】図５は、ディスク形の容器内での溶解率（ｙ軸）を、係数ａ（ｘ
軸）の関数で表したものである。

【図６】図６は、エッペンドルフチューブ内での溶解率（ｙ軸）を、係数
ｂ（ｘ軸）の関数で表したものである。

【図７】図７は、ファルコンチューブ内での溶解率（ｙ軸）を、係数ｂ（
ｘ軸）の関数で表したものである。

【図８】図８は、ディスク形の容器内での溶解率（ｙ軸）を、係数ｂ（ｘ
軸）の関数で表したものである。

【図９】図９は、溶解率（ｙ軸）を、容器の形状（ｘ軸）の関数で表した
ものである。Ａ：Ｖ字型底を有するエッペンドルフチューブＶｃ＝１．５ｍｌＢ：平底の分光器用キュベットＶｃ＝５ｍｌＣ：平底のチューブＶｃ＝３０ｍｌＤ：平底のチューブＶｃ＝６０ｍｌＥ：平底のガラス製ボトルＶｃ＝８ｍｌＦ：平底のガラス製ボトルＶｃ＝２５ｍｌＧ：Ｕ字形底を有するポリスチレンチューブＶｃ＝６ｍｌＨ：Ｕ字形底を有するポリスチレンチューブＶｃ＝１４ｍｌＩ：Ｕ字形底を有するポリスチレンチューブＶｃ＝２２ｍｌＪ：Ｕ字形底を有するポリプロピレンチューブＶｃ＝６ｍｌＫ：Ｕ字形底を有するポリプロピレンチューブＶｃ＝１４ｍｌＬ：Ｕ字形底を有するポリプロピレンチューブＶｃ＝２２ｍｌＭ：Ｕ字形底を有するポリプロピレンチューブＶｃ＝４ｍｌ

【図１０】図１０は、溶解率（ｙ軸）を、添加した異なるビーズの組み合
わせ（ｘ軸）の関数として表したものである。

【図１１】図１１は、溶解率（ｙ軸）を、添加した異なるビーズの組み合
わせの（ｘ軸）関数として表したものである。Ａ：直径が２ｍｍの１０個のステンレススチール製ビーズＢ：直径が３ｍｍの１０個のガラス製ビーズＣ：それぞれ直径が２、３ｍｍの５個のステンレススチール製ビーズ及び５個
のガラス製ビーズＤ：それぞれ直径が２、３ｍｍの４個のステンレススチール製ビーズ及び４個
のガラス製ビーズＥ：それぞれ直径が２、３ｍｍの５個のステンレススチール製ビーズ及び３個
のガラス製ビーズＦ：それぞれ直径が２、３ｍｍの３個のステンレススチール製ビーズ及び５個
のガラス製ビーズ。

【図１２】図１２は、溶解率（ｙ軸）を、実施例５のプロトコルＩ及びＩ
Ｉで渦動タイプの運動にかけた時間（ｘ軸）の関数で表したものである。

【図１３】図１３は、溶解率（ｙ軸）を、実施例５のプロトコルＩＩ及び
ＩＩＩで渦動タイプの運動にかけた時間（ｘ軸）の関数で表したものである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月１３日（１９９９．１２．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ソフィー・ロペスフランス・Ｆ−69380・シャゼイ・ダゼルギュ・リュ・デュ・シュヴァリエ・ベイヤード・３ (72)発明者ブリュノ・コランフランス・Ｆ−69280・マルスィ・レトワール・シュマン・デ・ギャレンヌ・23 (72)発明者コリンヌ・ジェイフランス・Ｆ−69100・ヴィリュバンヌ・アヴニュ・ピアトン・２ (72)発明者セシル・パリスフランス・Ｆ−69280・マルスィ・レトワール・リュ・デュ・コテュー・27 (72)発明者キャスリーン・アン・クラーク・ディケイアメリカ合衆国・カリフォルニア・ 91007・カーディフ・ブルーシアラ・コート・2046 Ｆターム(参考） 4B029 AA15 BB02 BB07 4B065 AA01X AA72X BD01 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 − 液体媒体中の生物学的試料が容器内に配され、 − 相対的に硬く且つ核酸材料に関して実質上不活性である少なくとも１の粒
子材料が容器内に配され、 − 該生物学的試料と粒子材料の混合物が運動を受けさせられる、ことに従って、微生物に属する興味ある少なくとも１の核酸材料を放出するため
の、細菌タイプの少なくとも１の微生物を含む生物学的試料の溶解方法であって
、組合せにおいて：選択される運動が渦動タイプであり、以下の条件： − 粒子材料は９０と１５０μｍの間の直径を有するビーズからなり、及び − 該ビーズの見掛け容積であるＶｂ、及び液体試料の容積であるＶｅは、Ｖ
ｅ＝α．Ｖｂの関係にある（但し容器が管状である場合にはαは１．４と１０の
間であり、容器がディスク形である場合にはαは２．１以下である）に相当するものであり、これによって、試薬及び／又は付加的操作工程を更に要することなく、核材料
を天然状態で、且つ続く処理のための如何なる試薬もアクセス可能な状態で液体
媒体中に直接的に放出することを特徴とする生物学的試料の溶解方法。
【請求項２】 − 液体媒体中の生物学的試料が容器内に配され、 − 相対的に硬く且つ核酸材料に関して実質上不活性である少なくとも１の粒
子材料が容器内に配され、 − 該生物学的試料と粒子材料の混合物が運動を受けさせられる、ことに従って、微生物に属する興味ある少なくとも１の核酸材料を放出するため
の、酵母タイプの少なくとも１の微生物を含む生物学的試料の溶解方法であって
、組合せにおいて：選択される運動が渦動タイプであり、以下の条件： − 粒子材料は約５００μｍの直径を有するビーズからなり、及び − 該ビーズの見掛け容積であるＶｂ、及び液体試料の容積であるＶｅは、Ｖ
ｅ＝α．Ｖｂの関係にある（但し容器が管状である場合にはαは１．４と１０の
間であり、容器がディスク形である場合にはαは２．１以下である）に相当するものであり、これによって、試薬及び／又は付加的操作工程を更に要することなく、核材料
を天然状態で、且つ続く処理のための如何なる試薬もアクセス可能な状態で液体
媒体中に放出することを特徴とする生物学的試料の溶解方法。
【請求項３】粒状材料が約１００μｍの直径を有するビーズからなること
を特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】渦動タイプの運動が、更に以下の関係を満たしている：Ｖｂ＜Ｖｅ＜Ｖｃ、但しＶｃ＝β．Ｖｅであり、βは２．５以上であり、Ｖｃは容器の有効容積であるこ
とを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】容器が管状、好ましくはＵ字形底を持つものであることを特
徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】 βが２．５と３０の間の数であることを特徴とする請求項４
記載の方法。
【請求項７】容器が、フルストコニカル底を持つ管であり、且つαが１．
４と３．３の間の数であり、且つβが２．５と１５の間、好ましくは３．７５と
１５の間の数であることを特徴とする請求項１，２，４又は５のいずれか１項記
載の方法。
【請求項８】容器がＵ字形底を持つ管であり、且つαが１．４と３．３の
間の数、好ましくは３．３に等しく、且つβが３と３０の間、好ましくは１２と
３０の間、例えば２０に等しい数であることを特徴とする請求項１，２，４又は
５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】容器がディスク形であり、且つαが１．４以下であり、且つ
βが９．３以上であることを特徴とする請求項１，２又は４のいずれか１項記載
の方法。
【請求項１０】粒子材料が、ビーズよりもより大きい直径を有する他のビ
ーズを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項１１】容器が、１６までの他のビーズ、好ましくは約２から３ｍ
ｍに等しい直径を有する、１０までの他のビーズを含むことを特徴とする請求項
１０記載の方法。
【請求項１２】消泡剤が、液体試料の容積、Ｖｅの０．０１から１％、好
ましくは０．５から１％の最終濃度で加えられることを特徴とする請求項１又は
２記載の方法。
【請求項１３】アニオンタイプの洗浄剤が、液体試料の容積、Ｖｅの２．
５％の最終濃度に更に加えられることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】渦動タイプ運動を実行するための時間が、少なくとも１０
秒に等しい、好ましくは少なくとも２０秒に等しい、例えば１と５分の間である
ことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】渦動タイプ運動を実行するための時間が、約２分間である
ことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】渦動タイプ運動を実行するための時間が、８と２０分の間
であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１７】細菌又は酵母タイプの少なくとも１の微生物を含む生物学
的試料の処理方法であって： − 上記試料が請求項１から１６のいずれか１項記載の方法に従い溶解される
、 − 溶解のために使える粒子材料と共に又は無しで、溶解した生物学的試料が
、興味ある核材料に特に関係する操作プロトコル、例えば核検出又は増幅を直接
受けさせることを特徴とする生物学的試料の処理方法。
【請求項１８】請求項１から１６のいずれか１項記載の方法を実行するた
めの、単一使用のための容器であり、請求項１から１５のいずれか１項記載の方
法を直接実行するため、生物学的試料の予め決定した容積に基づいて、適した粒
子材料の装填を含むことを特徴とする容器。