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JP2002511241A - ペプチド - Google Patents

ペプチド

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Publication number
JP2002511241A
JP2002511241A JP2000543495A JP2000543495A JP2002511241A JP 2002511241 A JP2002511241 A JP 2002511241A JP 2000543495 A JP2000543495 A JP 2000543495A JP 2000543495 A JP2000543495 A JP 2000543495A JP 2002511241 A JP2002511241 A JP 2002511241A
Authority
JP
Japan
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sequence
protein
polypeptide
amino acids
app
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000543495A
Other languages
English (en)
Inventor
ヘンリク ブヨルク、ラルス
− マリア フリック、インガ
Original Assignee
アクティノバ リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アクティノバ リミテッド filed Critical アクティノバ リミテッド
Publication of JP2002511241A publication Critical patent/JP2002511241A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1275—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Streptococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
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Abstract

(57)【要約】 連鎖球菌感染症に対するワクチンとして用いるのに適合した長さがアミノ酸50個までのポリペプチドが記載されている。ポリペプチドは（ａ）配列QKQQQLETEKQISEASRKSを有する化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）のタンパク質Ｈの１５０−１６８番アミノ酸；（ｂ）配列（ａ）に対応する連鎖球菌株の外層膜タンパク質に対するアミノ酸配列；（ｃ）６個またはそれ以上のアミノ酸を有する配列（ａ）または（ｂ）の断片；（ｄ）削除、挿入、置換、再配置によって変性された配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を構成する配列で構成されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の属する技術分野） 本発明はペプチド並びに連鎖球菌感染に対するワクチンへの当該ペプチドの用
法に関するものである。
【０００２】 （発明の背景） ヒト並びにその他の動物に疾患状態を起こさせる原因となる連鎖球菌種が多数
存在している。
【０００３】 連鎖球菌に起因する疾患は咽頭炎や皮膚感染のような複雑ではない化膿性疾患
から敗血症や中毒ショック症候群のような重大な疾患まで多岐にわたっている。
リューマチ熱や腎炎は化膿性連鎖球菌の急性感染に起因する非化膿性の後遺症で
ある。連鎖球菌に起因するその他の疾患には猩紅熱、とびひ、丹毒、筋肉炎、壊
死性腺維束収縮、敗血症性関節炎、フレグモーネ、心臓弁の集落化と破壊（心内
膜炎）、新生児感染症、結膜炎、静脈洞炎、飛節症、臍炎、髄膜炎、剥離と絨毛
腺炎、分娩後敗血症、ヒトの上部呼吸気道疾患、肺炎、中耳炎、傷口感染症、膿
瘍、蓄膿症、乳腺炎、尿路感染症、骨髄炎、ウマの伝染性熱病、ヒトの歯科病原
体、ヒトの腎臓感染症などがある。
【０００４】 急性咽頭炎などの多くの細菌感染症は抗生物質によって処置が可能である。し
かしながら世界のある種の地域では抗生物質、特にエリスロマイシンに対する抵
抗性が極めて一般的となっている。以前連鎖球菌性咽頭症に随伴した急性リュー
マチ熱の発症率が急増したことがあった。急性リューマチ熱は少なくとも6種類
の異ったＭ−型化膿性連鎖球菌に関係している。その上重大な連鎖球菌感染症の
症例数は増加しつつあって、菌血症と敗血症、壊死性腺維束収縮と筋肉炎、産褥
性敗血症、連鎖球菌中毒ショック症候群（ＳＴＳＳ）などに至る例が多くなって
いる。
【０００５】 重大な連鎖球菌感染症に対しては迅速で且つ積極的な処置が有効である。現在
かかる治療法には手術による創傷面切除、抗生物質処置、静脈内輸液、酸素と換
気による呼吸支援、透析、血圧を上昇させるための血管収縮、ステロイドと抗血
栓薬などが包含されている。重大な連鎖球菌感染症は死亡に至る場合もある。
【０００６】 化膿性連鎖球菌に対する現在のワクチン戦略は外層膜のM-タンパク質を対象と
している。このタンパク質は細菌に対する食菌作用への抵抗性を与えている可能
性があるとの観点から菌毒力因子のキーであると考えられている。更にまた、こ
のタンパク質はその超抗原特性を通じて有害な宿主免疫応答を刺激してヒトに交
差反応性抗体応答を生起させる可能性を引き出している。しかし、Ｍ−タンパク
質の種類と数、およびそれが交差反応性抗体応答を引き出す可能性とが化膿性連
鎖球菌の各種血清型に対する有効なワクチンを調製する上の障害となっている。
【０００７】 重大な連鎖球菌感染症に対する追加的な処置戦略を開発して、単に化膿性連鎖
球菌感染症ばかりではなくて他の連鎖球菌種に起因する感染症の克服にも利用可
能な新しいワクチン処方を創出する必要性は今も継続している。
【０００８】 （発明の要約） 本発明者達は化膿性連鎖球菌の毒力および化膿性連鎖球菌が凝集する能力と臨
床的感染症との間の関係を確立した。凝集する能力は化膿性連鎖球菌のH-タンパ
ク質の免疫原性領域と関係している。この領域のアミノ酸配列と一致するアミノ
酸配列は単に広範囲の化膿性連鎖球菌ばかりではなくて他の連鎖球菌株の外層膜
タンパク中にも認められている。
【０００９】 したがって、本発明は下記のような構成の連鎖球菌感染症に対するワクチンと
して用いるのに適切な長さがアミノ酸50個までのポリペプチドを提供するもので
ある： （ａ） QKQQQLETEKQISEASRKSの配列を有する化膿性連鎖球菌のタンパク質Ｈ
の１５０〜１６８番アミノ酸； （ｂ） 配列（ａ）に対応した連鎖球菌株の外層膜タンパクのアミノ酸配列； （ｃ） ６個またはそれ以上のアミノ酸からなる配列（ａ）または（ｂ）の断
片；または （ｄ） 削除、挿入、置換、または再配列によって変性を行った配列（ａ）、
（ｂ）または（ｃ）からなる配列。
【００１０】 本発明は第一ポリペプチドが上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の配列で
あって第二のポリペプチドが自然界では第一にポリペプチドと隣接していないも
のであるキメラタンパク質をも併せて提供するものである。
【００１１】 更に観点を広げると、本発明のポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを
も本発明は提供するものである。
【００１２】 本発明のポリヌクレオチドを構成すると共に、ポリヌクレオチドによってコー
ドされたポリペプチドの発現型である当該ポリヌクレオチドと当該発現ベクター
によって形質転換された宿主細胞に結合可能な調節配列にも本発明は併せて関連
している。
【００１３】 本発明のポリペプチドと医薬的に許容された担体とで構成された医薬配合品、
および本発明のポリペプチド、医薬的に許容された担体中のアジュバントまたは
本発明のポリヌクレオチドと医薬的に許容されたポリヌクレオチドの担体とで構
成されたワクチン組成物をも本発明は併せて提供している。
【００１４】 本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体にも関係したものである。
【００１５】 更に観点を広げると、本発明は下記の構成よりなるアミノ酸が５０個までの長
さのポリペプチドを提供するものである： （ａ）QKQQQLETEKQISEASRKSの配列を有する化膿性連鎖球菌のタンパク質Ｈの
１５０〜１６８番アミノ酸； （ｂ） 配列（ａ）に対応した連鎖球菌株の外層膜タンパク質のアミノ酸配列
であって、当該配列が当該連鎖球菌株の凝集または付着を阻害する機能を有する
アミノ酸配列； （ｃ） ６個またはそれ以上のアミノ酸からなる配列（ａ）または（ｂ）の断
片であって、連鎖球菌の凝集または付着を阻害する機能を有する断片；および （ｄ） 削除、挿入、置換、または再配列によって変性を行った配列（ａ）、
（ｂ）または（ｃ）からなる配列であって、連鎖球菌の凝集または付着を阻害す
る機能を有する配列。
【００１６】 （発明の詳細な説明） 本発明のポリペプチドは連鎖球菌感染症に対するワクチンとして使用するのに
適合した長さが５０アミノ酸までのものである。ポリペプチドは（ａ）配列QKQQ
QLETEKQISEASRKSを有する化膿性連鎖球菌のタンパク質Ｈの１５０〜１６８番ア
ミノ酸で実質的に構成されている。本発明のポリペプチドはまた、（ｂ）配列（
ａ）に対応した連鎖球菌株の外層膜タンパク質のアミノ酸配列、（ｃ）配列（ａ
）または（ｂ）の何れかの長さが6またはそれ以上のアミノ酸断片、（ｄ）削除
、挿入、置換、再配列によって変性された配列（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を構
成する配列の何れかであっても良い。
【００１７】 連鎖球菌はランスフィールド（Lancefield）分類によって幾つかのグループに
分類することが出来る。この分類は細胞壁多糖類中に存在するグループに固有の
抗体に基づいたものである。ランスフィールド分類のキーとなっているのは化膿
性連鎖球菌（Streptococcus Pyogenes）で構成されるＡグループ、アガラクタエ
連鎖球菌（Streptococcus agalactiae）で構成されるＢグループ、エクイ連鎖球
菌（Streptococcus equi）とエクイシミリス連鎖球菌（Streptococcus equisimi
lis ）を含むＣグループ、糞便腸球菌（Enterococcus faecalis）を含むＤグル
ープ、ムタンス連鎖球菌とサングイス連鎖球菌を含むビリディアン（Viridian）
グループである。グループに属していない菌株はニューモニアエ連鎖球菌（Stre
ptococcus pneumoniae）である。
【００１８】 各グループ内で細菌はその血清型によって更に分類される。Ａグループの連鎖
球菌の場合は血清型分類は付加的な表面抗体、Ｍタンパク質によって行われる。
このタンパク質はＡグループの連鎖球菌を８０以上の血清型に分けている。Ｍ血
清型の幾つかは強い毒性と病原性によって集められている。特に、Ｍ１、２、３
、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２２、２
４、４９、５５、５７および６０の各血清型はヒトの重篤な感染症に関連してい
る。
【００１９】 化膿性連鎖球菌は免疫グロブリン結合タンパク質を含む他の外層膜タンパク質
を発現する場合がある。タンパク質Ｈは化膿性連鎖球菌のＭ１血清型によって発
現される外層膜タンパク質の一例である。タンパク質Ｈは、化膿性連鎖球菌によ
って発現される他のＩｇＧタンパク質と共に、ＩｇＧと結合可能なＭタンパク質
と構造的に関係があるので、同じ族の一部であると現在では考えられている。ニ
ールソン（Nielson）らは化膿性連鎖球菌のＡＰ１株のタンパク質ＨとＭ１タン
パク質の構造を記載し（Biochemistry; 1995 Vol.34 No.41 13688-13698）この
タンパク質の全配列とドメイン構造を開示している。
【００２０】 連鎖球菌の幾つかの菌株は凝集塊を作ることが知られているが、凝集塊を作り
やすい場合はその細菌の毒性が強いこととの関連が大きい。下に掲げた例はタン
パク質Ｈがタンパク質Ｈ−タンパク質Ｈ間相互作用によってタンパク質Ｈが凝集
塊になる役割を示したものである。この凝集性はタンパク質Ｈの１５０〜１６８
番残基を構成している上記の配列（ａ）にマッピングされていてＡＰＰと名付け
られている。ＡＰＰが細菌の毒性を伴う凝集性に役割を果たしているという観点
から、このものは連鎖球菌に対するワクチンとして利用するのに適切なものであ
ると考えられる。同様の観点から配列（ａ）に隣接したタンパク質Ｈの１４５〜
１７７番残基、すなわち配列YQEQLQKQQQLETEKQISEASRKSLSRDLEASRも関心が持た
れるが、これは３３量体である。
【００２１】 化膿性連鎖球菌の広範囲の血清型の外層膜タンパク質の比較試験を行った結果
化膿性連鎖球菌の多くの他の菌種にも類似の配列が存在していることが明らかに
なった。同一の配列はＡグループに属さない連鎖球菌にも認められた。従って本
発明は連鎖球菌株の外層膜タンパク質に対応した配列を構成する配列（ｂ）に関
係したものである。このことはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇの各グループおよびビリディ
アン（Viridian）連鎖球菌の表面に発現されているこれらのタンパク質を含んで
いる。本発明の或る好ましい実施例においては、配列（ｂ）はＡグループの連鎖
球菌、化膿性連鎖球菌の外層膜タンパク質から導かれている。本発明の今一つの
或る実施例ではアミノ酸配列は化膿性連鎖球菌のもっと毒性の強い血清型、例え
ばＭ１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８、
１９、２２、２４、４９、５５、５７および６０から導かれている。外層膜タン
パク質は例えばＡグループの連鎖球菌のＭタンパク質の一つを構成していること
もある。他のタンパク質の例には血清タンパク質の結合と関係が深いある種の連
鎖球菌株によって発現されるタンパク質Ａｒｐとタンパク質Ｓｉｒ２２も含まれ
ている。関連する外層膜タンパク質と配列はＡＰＰまたは３３量体を用いて明確
にされて、連鎖球菌の外層膜タンパク質の配列に注目した場合の最も適正な配置
を確立することが出来るのである。
【００２２】 かかる配列の例は図７と図１１に掲げられている。かかる配列の例を以下に示
す：
【００２３】 図７に掲げた例から解るように、先に掲げた毒性が強い連鎖球菌の菌種の中に
は配列がワクチンとして適切であることを力説した配列（ａ）に相当する配列を
有しているものがある。その他のこのような配列にはタンパク質ＨのＣ２および
Ｃ３繰り返しドメイン中の配列が含まれていて、ＡＰＰと高度の類似性を有して
いる。
【００２４】 本発明の配列（ｂ）または（ｄ）のポリペプチドはその全長に対して少なくと
も４０％が配列（ａ）または前記の３３量体とアミノ酸に関して相同であること
が望ましい。本発明の配列（ｂ）または（ｄ）が少なくとも５０％が配列（ａ）
と相同であれば更に望ましく、少なくとも６０％、７０％、８０％が相同であれ
ば更に一層望ましい。配列（ｂ）または（ｄ）が、その少なくとも９０％が、更
に望ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％が配列（ａ）または上記３３量
体と相同である配列で構成されていることが更に望ましい。
【００２５】 今一つの方法としては、図１０に示したヌクレオチド配列を用いて交雑によっ
て対応する配列を得ることも出来るが、これについては後述する。
【００２６】 本発明はまた配列（ａ）または（ｂ）のアミノ酸の長さが６個以上、好ましく
はアミノ酸の長さが８個以上、更に好ましくは１０個以上の断片にも関するもの
である。かかる断片はアミノ酸の長さが１０個までであることも出来るが、アミ
ノ酸の長さが１２、１６、または１８までであるのが望ましい。
【００２７】 アミノ酸の置換、削除または再配置による変性を（ａ）、（ｂ）、または（ｃ
）の配列の、例えば配列（ａ）の１、２、３、４、５から９までの位置の、望ま
しくは１、２、または３の位置のアミノ酸に施すことが可能である。例えば下表
に示したように在来的な方法で置換を行うことが出来る。二番目の列にある同じ
ブロック、望ましくは三番目の列の同じ行にあるものが相互に置換可能である。
【００２８】 その他の望ましい置換は例えば上に述べた配列と比較して実施することが出来
る。上に述べた配列の一つ以上で置換が行われるのが望ましい。
【００２９】 特に断定した場合を除いて、此処に述べるポリペプチドの配列は在来の一文字
コードで表され、Ｎ−端末からＣ−端末への結合配置である。本発明のアミノ酸
ポリペプチドは自然界には存在しないアミノ酸を含ませたり生体内で安定性が増
すような変性も可能である。化合物が合成的方法で作られる場合は、かかるアミ
ノ酸は製造過程で導入される。合成的または再結合的手法によって変性を行うこ
とも可能である。
【００３０】 本発明のポリペプチドはＤ−アミノ酸を用いて合成的に作ることも出来る。こ
の場合にはアミノ酸はＣからＮの逆は位置で結合している。この方法はこのよう
なペプチドを作るための常法である。
【００３１】 アミノ酸に対して側鎖変性を行う方法も公知であって本発明のポリペプチドを
用いて側鎖変性を行うことも出来る。かかる変性法には例えば、アルデヒドと反
応させてからＮａＢＨ4で還元する還元アルキル化法、無水酢酸でアシル化する
ためのアミジン化などがある。カルボキシ末端やカルボキシ側鎖はエステル基、
例えばＣ1-6のアルキルエステルの形でブロックすることが出来る。
【００３２】 上に掲げたアミノ酸の変性例は網羅的なものではない。技術に習熟した当業者
は既知の化学的方法を利用して所望の位置にあるアミノ酸側鎖の変性を行うこと
が出来る。
【００３３】 本発明のポリペプチドは配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で実質的に
構成されることが可能である。
【００３４】 一般的に、本発明のポリペプチドはワクチン組成物としての安定性を保持する
ように選定され変性される。当業者には容易に理解されるように、本発明の場合
はワクチン組成物として用いるのに適合したポリペプチドとは連鎖球菌感染症に
対して防御的な免疫応答を示すことが出来るポリペプチドである。本発明のポリ
ペプチドは細菌の凝集または上皮面への付着を阻害する機能によって主として選
定される。集塊の形成と付着の面からいうと、配列は抗凝集剤として使用されて
いる。対応する配列（ｂ）はその配列が導かれた連鎖球菌株の凝集を阻害するの
に利用される。言葉を換えていうと、配列は連鎖球菌の凝集および／または上皮
細胞への細菌の付着を一般的に阻害することが出来る。この面では、細菌の凝集
とは例１に掲げたような連鎖球菌の凝集であって吸収試験で測定可能なものを意
味している。ペプチドは凝集を３０％以上低減させるものが望ましく、少なくと
も５０％低減すれば更に望ましい。更に追加乃至は言い換えると、ポリペプチド
は例４に示したように上皮細胞への細菌の付着を阻害することも出来る。
【００３５】 配列（ａ）および（ｂ）の断片は細菌の凝集または付着を阻害する機能を基準
にして選ぶことが出来る。すでに略述した変性、置換、削除、再配置はポリペプ
チドの細菌の凝集を阻害する機能を維持するように選ぶことも出来る。
【００３６】 かくて、本発明の観点を変えると、我々が提供するアミノ酸が５０までのポリ
ペプチドは下記のような構成である： （ａ）化膿性連鎖球菌のタンパクHの配列QKQQQLETEKQISEASRKSを有する１５０
〜１６８番アミノ酸； （ｂ）連鎖球菌株の外層膜タンパクの配列（ａ）に相当する配列であって、当
該配列は当該連鎖球菌株の凝集または付着を阻害する機能を有している； （ｃ）配列（ａ）または（ｂ）のアミノ酸６個以上からなる断片であって、連
鎖球菌の凝集または付着を阻害する機能を有している；および （ｄ）削除、挿入、置換、再配列によって変性された配列（ａ）、（ｂ）また
は（ｃ）からなる配列であって、かかる配列は連鎖球菌の凝集または付着を阻害
する機能を有している。
【００３７】 かかる応用をされたポリペプチドは細菌の凝集や上皮細胞への付着を阻害する
ために用いることを提案されたものであるから細菌の毒性を低減させるのに用い
ることも可能である。
【００３８】 本発明のポリペプチドは出来るだけ単離された形にするのが望ましい。ポリペ
プチドはポリペプチドの利用目的を阻害しない担体または希釈剤と一緒に用いら
れる場合もあるが、その場合でも単離された形が望ましいと考えられている。本
発明のポリペプチドは出来る限り精製された形にされるが、この場合ポリペプチ
ドは分離と精製の工程を経て調製された製剤の中のポリペプチドの重量分率が９
０％を占めているのが一般的であるが、９５％以上、時には９９重量％以上を占
める場合もある。
【００３９】 本発明のポリペプチドは当業者には広く公知となっている技術を用いて合成的
にまたは再結合で作り出すことが可能である。合成的製造方法は一般的に所望の
配列のポリペプチドが作られている反応容器中で個々のアミノ酸残基を逐次的に
付加させる工程を含んでいる。再結合技術の例を以下に記述する。
【００４０】 本発明のポリペプチドは長さがアミノ酸５０個までのものである。更に望まし
くは長さが４０から４５個のアミノ酸を越えないポリペプチドであって、最も望
ましいのは長さが３０，２０，または１５個までのアミノ酸である。
【００４１】 本発明は、本発明の第一のポリペプチドと、自然界ではかかる第一のポリペプ
チドと隣接していることがない第二のポリペプチドとで構成されるキメラ・タン
パクとも関係している。このような場合、本発明のポリペプチドは配列（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の繰り返しまたはそれらの組み合わせであることも
可能である。ポリペプチドは環状である場合もある。ポリペプチドが例えばポリ
リジン・ブリッジのようなリンカー配列を通じてリンクした繰り返し単位で構成
されている場合もある。ペプチドは、特に鍵穴リンペット・ヘマシアニン（limp
et hemacyanin）、ジフテリア・トキソイド（diptheria toxoid）、破傷風トキ
ソイド（tetanus toxoid）のような担体と一緒にワクチンとして使用される場合
には、担体との溶融タンパクとして配合することも可能である。
【００４２】 本発明のポリペプチドは医薬組成物に処方することが出来る。組成物はポリペ
プチドと医薬的に許容される担体または希釈剤とで構成される。医薬的に許容さ
れる担体または希釈剤には経口、局所、非経口（例えば筋肉内、静脈内）投与に
適合した配合に用いられるものが含まれる。配合品は通常単位投与に用いる形に
調製され医薬業界で公知の方法で調薬される。
【００４３】 例えば、非経口投与に適合した調合には目的とした投与位置の血液と等張力の
調合にするための抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質を含んだ水系および非水系の
滅菌注射液、懸濁剤と濃化剤を含んだ水系および非水系の滅菌懸濁液、ポリペプ
チドを体内に送り届けるためにデザインされたリポソームまたはその他の微粒子
系が含まれている。
【００４４】 本発明のポリペプチドは連鎖球菌による後感染を防ぐための免疫応答を生起さ
せるためにも使用することが出来る。
【００４５】 ペプチドの免疫原を発現させる手段には以下のようなものが含まれるがこれに
限定されるものではない：鍵穴リンペット・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン
、卵白アルブミン、破傷風毒素やジフテリア毒素のような非活性化細菌毒素、細
菌性または哺乳動物性熱ショックタンパク質などの適切な担体タンパク質と共役
したペプチドの形；選ばれたペプチドとＴ−またはＢ−細胞エピトープ（抗原決
定基）を含む一つまたはそれ以上のペプチドまたはタンパク質とで構成された組
換え細菌またはウイルス、またはリンパ球表面に存在する分子に対する相対的結
合ドメインによって発現された溶融またはキメラタンパク質の形；生きた細菌ま
たはウイルスのベクターによって表面に発現するか隠れた状態のペプチドまたは
溶融タンパク質の形の遊離ペプチド。
【００４６】 ペプチドはリンパ球の内部に捕捉させるかまたはその表面に発現させるか；(
Ｄ，Ｌ)乳酸-グリコール酸共重合体またはその他のポリマーから調製された生分
解性のマイクロビーズ中に組み込むか、希釈剤として適切なクイルＡ(Quil A）
のようなサポニン類、コレステロール、燐脂質などから調製したミセルの表面に
発現させることが出来る。
【００４７】 免疫応答を高めるために、例えばペプチド・ワクチン原のコピーを２乃至２０
および／または付加Ｔ−またはＢ−細胞エピトープのコピーを一つまたは複数個
含む合成ポリペプチドのような、ペプチドの多重コピーを投与することが出来る
。一方、ペプチド・ワクチン原のコピーを２乃至２０および／または付加Ｔ−ま
たはＢ−細胞エピトープのコピーを一つまたは複数個は、リジンまたは他のアミ
ノ酸の中心マトリックスの周りに形成された化学的に合成された分岐したオリゴ
マーの形で発現する。
【００４８】 ワクチンに使用されるタンパク質はタンパク質担体への供役を促進し及び／又
は免疫原性を増強するために化学的に変性することが出来る。適切な変性には各
端末に二硫化物結合の生成を経由した重合を可能にするシステイン残基を付加さ
せることが含まれるが、これに限定されるものではない。ペプチドはＮ−端末に
α-アミノヘキサデカン酸のような脂質を共役させることによって免疫原性を増
強させる変性を行うことも出来る。
【００４９】 免疫原ポリペプチドを活性成分として含有するワクチンの調製は当業者には公
知である。例えば、かかるワクチンは溶液または懸濁液の形で注射可能な調剤に
、溶液または懸濁液にするのに適合した固体状の調剤に、注射する前に調剤する
液体に調剤される。調剤品は乳化状である場合もあればリポソームに包摂されて
いる場合もある。活性免疫原成分は医薬的に許容され活性成分と混和性のある添
加物と混合される場合が屡々ある。適切な添加物には、例えば、水、生理食塩水
、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはこれらを組み合わせたも
のなどがある。
【００５０】 更にまた、必要な場合には少量の湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／または
ワクチンの効果を高めるアジュバントのような各種成分をワクチンに含ませるこ
とも可能である。有効なアジュバントには明礬またはその他のアルミニウム塩類
、カルシウム塩類、鉱物油を含んだ油中水型エマルジョン、スクアレンまたはス
クアラン、スクアレンの油中水型エマルジョン、ツウィーン（Tween）８５また
はスパン（Span）８５などの界面活性剤と組み合わせたスクアレンまたは油など
があるが、これらに限定されるものではない。かかるエマルジョンはＮ−アセチ
ル-ムラミル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミン（ＭＤＰ）、合成スルフォリポ多
糖類、非イオン性ブロック共重合体、クイルＡおよび／またはモノフォスフォリ
ル脂質Ａ（ＭＰＬ）のようなサポニン類を含む成分、マンナンまたはβ−１−３
−グルコースのような炭水化物ポリマー、コレラ毒素や大腸菌不安定毒素のよう
な天然または組換え細菌毒素、ヒト・インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ
−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５のような天然または組換えサイトカイン類（cytokine
s）などの成分を含ませることも出来る。アジュバントの有効性は各種のアジュ
バントで構成されたワクチンの投与から得られた免疫原ペプチドを指向した抗体
の量を測ることによって求めることが可能である。
【００５１】 ワクチンは、例えば皮下または筋肉内に、注射するなどの通常の非経口経路で
投与される。その他の投与形態には坐薬を含む投与方法に適した形、経口投与、
場合によっては鼻、直腸、膣粘膜への局所投与、液体または粉末調剤品の吸入、
などの方法がある。坐薬の場合には例えばポリアルキレングリコール・トリグリ
セリドのような伝統的な結合剤乃至は担体が添加される。経口用の調剤は通常使
用される賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン
酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム塩、セルロース、炭酸マグネシウムな
どを含んでいる。かかる調剤品は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放
性製剤、粉剤などに調製される。ワクチン組成物が凍結乾燥されている場合は凍
結乾燥品は投与に先立って液状化、例えば懸濁液にする。
【００５２】 患者に経口投与されるカプセル剤、錠剤、丸剤はエウドラギット（Eudragit）
”Ｓ”、エウデラギット”Ｌ”、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチル・セルロースなどで溶腸コーティングされる場合もある
。
【００５３】 本発明のポリペプチドは遊離の形または塩の形でワクチンに調剤される。医薬
的に許容される塩には酸が付加した塩（ペプチドの遊離アミノ基との間で形成さ
れる）が含まれるが、この場合は塩酸、燐酸のような無機酸、酢酸、蓚酸、酒石
酸、マレイン酸などの有機酸が用いられる。遊離のカルボキシル基が塩を形成し
た形は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄のような
無機塩基、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノ・エタノ
ール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から導かれる。
【００５４】 ペプチド・ワクチン原は一回投与または反復投与が行われるが、一回の投与量
は２から５００マイクログラムであって、１０から１０００マイクログラムのペ
プチド量を投与するのが望ましい。望ましくは２回またはそれ以上の繰り返し投
与が行われる。
【００５５】 ワクチン組成物の調剤に際しては連鎖球菌タンパク質から得られるそれ以外の
抗原物質も併用することが出来る。例えば、連鎖球菌の細胞外システインプロテ
イナーゼ（ＳＣＰ）またはその抗原性断片もワクチン調剤に併用される。ＳＣＰ
は化膿性連鎖球菌の毒性に重要な役割を果たしていると考えられている。活性Ｓ
ＣＰの生産力が不足した化膿性連鎖球菌は実質的に毒性を有しないことが知られ
ている。ＳＣＰの中で維持された免疫度の高いエピトープ特性を示している例え
ばＷＯ９６／０８５６９２開示されているような合成ペプチドは適切なワクチン
組成物に共用することが出来る。
【００５６】 ワクチンの調剤に有用な今一つの連鎖球菌タンパク質は補体誘導溶菌現象の連
鎖球菌インヒビターであって、ＳＩＣと名付けられている。このタンパク質も連
鎖球菌の病原性と毒性に役割を果たしていて、ＷＯ９７／１３７８６２に開示さ
れている。
【００５７】 上記に略記したように、本発明のペプチドは組換え技術によって作られる場合
もある。本発明は核酸をコードした本発明のポリペプチドをも併せて提供するも
のである。特に望ましいものは３３量体の配列が図１０に示されているポリヌク
レオチドまたは１９量体ＡＰＰ配列（ａ）をコードしたその断片できる。
【００５８】 本発明のポリヌクレオチドは配列（ａ）のコーディング配列、例えば３３量体
に対して図１０に示された配列または１９量体ＡＰＰ配列（ａ）をコードしたそ
の断片と、またはコーディング配列に相補性である配列に選択的にハイブリダイ
ズすることが出来る。本発明のポリヌクレオチドは、ＡＰＰまたは３３量体のア
ミノ酸配列をコードした図１０記載の配列の変異体、本発明の配列（ｂ）、（ｃ
）または（ｄ）を有するポリペプチドをコード化した配列の変異体を含んでいる
。概略的にいうと、本発明のポリヌクレオチドは図１０に掲げた３３量体または
１９量体のポリヌクレオチド配列またはかかる配列の相補体に選択的にハイブリ
ダイズすることが出来るヌクレオチドの隣接配列である。
【００５９】 １９量体ＡＰＰの配列（ａ）をコード化した図１０の配列のハイブリダイズし
た本発明のポリヌクレオチドはバックグラウンドよりも高いレベルでハイブリダ
イズすることが出来る。バックグラウンドハイブリダイゼーションは例えばＤＮ
Ａライブラリーに存在する他のＤＮＡが原因で起こる場合がある。本発明のポリ
ヌクレオチドと１９量体の配列（ａ）をコードした図１０のポリヌクレオチドの
配列との間の相互作用によって誘発される信号のレベルは、他のヌクレオチドと
配列（ａ）をコードした図１０のポリヌクレオチド配列との間の相互作用よりも
一般的に言って少なくとも１０倍、望ましくは少なくとも１００倍ある。相互作
用の強度は、例えば32Ｐのようなプローブで放射化標識することによって測定す
ることが出来る。選択的ハイブリダイゼーションは高緊縮度の媒体、例えば０．
０３Ｍの塩化ナトリウムと０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム中で約５０℃から約
６０℃という条件を使うことによって達成できる。
【００６０】 配列（ａ）のＤＮＡコーディング配列またはそのコーディング配列に相補性で
ある配列に選択的にハイブリダイズできるヌクレオチドの配列は、一般的に少な
くとも５０％、望ましくは少なくとも７０または８０％が、更に望ましくは少な
くとも９０または９５％が図１０のポリヌクレオチドに、または３３量体に対し
て図１０に掲げたポリヌクレオチド配列の全体長さにわたって少なくとも３０，
望ましくは少なくとも４０，例えば６０、８０、９０の隣接したヌクレオチドの
領域での相補体に相同である。ポリヌクレオチドの相同性の測定方法は公知であ
る。ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供しているＵＷＧＣＧパッケージが、例えば
そのデフォルトの設定で、相同性の計算に使用できる（Deveraux et al, Nucl.
Acids. Res. 12.387-395, 1984）。
【００６１】 上に掲げた相同性と最小サイズとの如何なる組み合わせであっても、もっと厳
格な組み合わせ、すなわちもっと長い範囲に亘って高度の相同性が成立している
ものと同様に、本発明のポリヌクレオチドを定義するのに用いることが出来る。
【００６２】 本発明のポリヌクレオチドは組換え複製ベクターに参加可能である。ベクター
は適合性のある宿主細胞中で核酸を複製するのに使用される。更に他の例では、
本発明は複製可能なベクターに本発明のポリヌクレオチドを導入する方法で、適
合性のある宿主細胞にベクターを導入する方法で、およびベクターの複製を引き
起こす条件下で宿主細胞を成長させる方法で本発明のポリヌクレオチドを作る方
法を提供している。ベクターは宿主細胞から回収される。適切な宿主細胞には大
腸菌のような細菌、酵母、哺乳動物細胞系、その他の真核細胞系、例えば昆虫Ｓ
Ｆ９細胞が含まれる。
【００６３】 ベクター中にある本発明のポリヌクレオチドは宿主細胞のコーディング配列の
表現を与えることが出来る正規配列に対して操作可能な結合をするのが望ましい
。操作可能な結合という用語の意味は問題としている成分が望んだ形で機能を発
揮することが出来る関係にあるということと並列である。コーディング配列と操
作可能な結合ができる正規システムは対照配列と適合性のある条件下で達成され
る。
【００６４】 このようなベクターは本発明のポリペプチドの発現を提供するために上に述べ
たような適切な宿主細胞に形質転換（transformation）またはトランスフェクシ
ョン（transfection）することが出来る。この過程は上に述べた発現ベクターで
形質転換した宿主細胞をポリペプチドをコードしたコーディング配列のベクター
による発現を提供する条件下で培養した後に発現化されたポリペプチドを回収す
ることで構成される。
【００６５】 ベクターは例えば複製の原型を提供するプラスミドまたはウイルスであること
もあるが、当該ポリヌクレオチドの発現に対するプロモーターであるのが望まし
く、プロモーターのレギュレーターであるのが望ましい。ベクターは一つまたは
それ以上の選択性マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン
耐性遺伝子、哺乳動物ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子を含んでいる場
合がある。ベクターは生体外で、例えばＲＮＡの作成に使用されるか宿主細胞を
トランスフェクトまたは形質転換するのに使用される。
【００６６】 プロモーター／エンハンサーおよびその他の発現規制信号は発現ベクターがデ
ザインされる宿主細胞に適合するように選択される。例えば、酵母プロモーター
は酵母（S.serevisiae）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーターを含んでいる。ウイ
ルスのプロモーターはＳＶ４０大型Ｔ抗原プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ
プロモーター、アデノウイルス・プロモーターを含んでいる。これらのプロモー
ターは当業者が容易に入手することが出来る。
【００６７】 本発明のヌクレオチド配列および発現ベクターも上に略述したようにワクチン
の調製に用いることが出来る。ワクチンは裸のヌクレオチド配列またはカチオン
性脂質、ポリマー、標的システムとの組み合わせで構成される。
【００６８】 上述したようにして調製された免疫ポリペプチドは多クローン性抗体、単クロ
ーン性抗体、双方の抗体の生産に使用される。多クローン性抗体が必要な場合は
選び出した哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、など）を本発明の免
疫性ポリペプチドで免疫する。免疫した動物からの得た血清を集めて既知の方法
で処理する。ポリペプチドの対する多クローン性抗体を含む血清が他の抗原に対
する抗体を含んでいる場合は免疫親和性クロマトグラフィーで精製することが出
来る。多クローン性抗体血清を生産し加工する方法は当業者に公知である。
【００６９】 本発明のポリペプチド中の連鎖球菌エピトープに対する単クローン性抗体も当
業者には公知の方法で生産することが出来る。雑種細胞（hybridoma）で単クロ
ーン性抗体を生産する一般的な方法は公知である。不死化抗体産出細胞系列は細
胞融合によって作られるか、腫瘍ＤＮＡによるＢリンパ球の直接的形質転換、エ
ピスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルスによる形質変換などの方法で作ら
れる。本発明のポリペプチドに対して生産された単クローン性抗体のパネルはイ
ソタイプやエピトープの親和性などの性質を利用して選別される。
【００７０】 本発明のポリペプチドを対象とした単クローン性並びに多クローン性抗体は診
断に際して特に有効であって、中和した抗体は受動的免疫療法に有用である。特
に単クローン性抗体は抗イディオタイプ抗体を立ち上げるのに利用できる。抗イ
ディオタイプ抗体は防御が必要な感染源に対する抗原の「内部像」をもたらす免
疫グロブリンである。
【００７１】 抗イディオタイプ抗体を立ち上げる方法は当業者には公知である。かかる抗イ
ディオタイプ抗体は連鎖球菌の処理に、また本発明のポリペプチドの免疫領域の
解明に有用である。
【００７２】 上述の抗体の断片、例えばＦａｂ断片の使用も可能である。
【００７３】 （実施例） 例１ ＡＰ１細菌の凝集を促進する表層タンパク質 ＷＨＯ連鎖球菌情報調査共同研究センター（Collaborating Center for Refer
ence and Research on Streptococci, Prague, Czech Republic）から入手した
連鎖球菌のＡＰ１株（４０／５８）はトッド・ホウイット・ブイヨン（Todd Hew
itt broth）（TH）（Difco, Detroit, MI）中で３７℃で一夜成長させると凝集
体を作ることが明らかとなった。この目で見える凝集体は試験管の底へ急速に沈
降する。６２０ｎｍでの光学密度を時間を追って測定すると凝集度が計測できる
。ヒト血漿（１０％溶液）またはヒトＩｇＧ（１．４ｍｇ／ｍｌ）（Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO）では成長中に凝集が認められず培養物の沈降も遙か
に遅い（図１）。培養物を顕微鏡で調べると血漿またはＩｇＧを含むもの以外で
は細菌の巨大な凝集体が認められるが、血漿またはＩｇＧの場合は連鎖も短く凝
集体は認められなかった（図示せず）。
【００７４】 細菌の表層ではタンパクＨとＭ１タンパクがＩｇＧ結合に応答するので、凝集
体の精製に対してのこれらの分子の役割が解明される。
【００７５】 化膿性連鎖球菌から産出されるパパインおよびシステインの分解酵素はＡＰ１
菌の表層からタンパクＨとＭ１タンパクを除去する機能がある。ＡＰ１菌を０．
０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で１％（ｖ／ｖ）に懸濁させた（２ｘ
１０9細胞／ｍｌ）。細菌をパパイン（Sigma）とＬ−システイン溶液（細胞溶液
１ｍｌ中に１００μgのパパインと１Ｍ Ｌ−システイン溶液２８μLを含む）中
で３７℃で１時間培養した。３０００ｘｇで遠心分離にかけて細菌を集め、ＰＢ
Ｓで２回洗浄し沈降分析にかけた。125Ｉで標識したＩｇＧの細胞への結合も実
施した。連鎖球菌をシステイン分解酵素で消化させるために、ＡＰ１菌０．５ｍ
ｌ（２ｘ１０10細胞／ｍＬ ＰＢＳ）を活性化酵素５μｇと一緒に３７℃で3時
間培養した。ヨード酢酸を６ｍＭになるまで加えて酵素を無力化し、細胞をＰＢ
Ｓで２回洗浄してから沈降と125Ｉで標識したＩｇＧの結合を測定した。
【００７６】 この酵素または臭化シアン（ＣＮＢｒ）で処理した後ゆっくりと沈降させた細
菌懸濁物はもはやＩｇＧとの結合活性を示さない（図２Ａ、Ｂ）。ＣＮＢｒで可
溶化したペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し５４、４９、４４ｋＤａの見かけ
の分子量でそれぞれバンドを形成させた。図２CのＩ、ＩＩ、ＩＩＩと名付けた
これらのバンドをＮＨ2−端末アミノ酸配列に割り当てた。バンドＩとＩＩの配
列はAsn-Gly-Asp-Gly-AsnとGlu-Val-Ala-Gly-Argと同定され、配列はＭ１タンパ
ク質の４２と８２の位置でそれぞれ始まっているが、バンドＩＩＩのＮＨ2−端
末配列（Glu-Gly-Ala-Lys-Ile）は４２位置で始まるタンパク質Ｈの断片に相当
する。ＣＮＢｒで生成する断片の大きさはＭ１タンパク質とタンパク質Ｈの配列
中のメチオニン残基の位置と良く一致している。ＩｇＧ結合と凝集体形成との観
察から得られるデータは、タンパク質Ｈおよび／またはＭ１が細菌の巨大凝集体
の形成によって起こる細胞間相互作用に寄与していることを示している。
【００７７】 例２ それ自体に結合するタンパク質Ｈ ボルトン・ハンター試薬（Bolton and Hunter reagent）（Amersham, UK）を
用いて125Ｉで放射化標識したタンパク質ＨまたはＭ１タンパク質をＡＰ１細菌
と一緒に従来同様にＴＨ中で培養した。タンパク質Ｈが細菌細胞と結合している
のが認められた（図３Ａ）。Ｍ６血清型のＡＰ６株はタンパク質Ｈを発現しない
菌株であってタンパク質ＨもＭ１タンパク質もこの菌とは親和性を示さない。正
の対照試料として図３Ａに掲げたものは125Ｉで標識したＩｇＧで得られた結合
曲線である。タンパク質ＨのＡＰ１細菌への結合はタンパク質Ｈによって有効に
阻害される（下記参照、図４Ｂ）。タンパク質ＨとＭ１タンパク質はＰＶＤＣ膜
の切り口から適用され125Ｉで標識したタンパク質ＨとＭ１タンパク質をプロー
ブとした。相互作用はタンパク質Ｈ分子間で認められたが、Ｍ１タンパク質はタ
ンパク質Ｈともそれ自体とも結合しなかった（図３Ｂ）。更にまた、セファロー
スで不動態化したタンパク質Ｈは125Ｉで標識したタンパク質Ｈと特異的に相互
作用を起こすことが認められた（下記参照）。この観察結果はタンパク質Ｈは同
性間相互作用によってＡＰ１の凝集に寄与していることを示唆している。
【００７８】 例３ タンパク質Ｈの自己相互作用領域の同定 タンパク質Ｈの色々な断片を用いてタンパク質Ｈ分子のＩｇＧ、アルブミン、
ＦＮＩＩＩドメインに対する結合位置を測定した。ＩｇＧとＦＮＩＩＩに対する
結合位置はＮＨ2−端末ＡＢとＡ領域にそれぞれ位置しているが、アルブミン残
基に対する結合はタンパク質ＨのＣ繰り返しで起こっている。図４Ｃはタンパク
質Ｈを図解したものであるが、以下に記述する実験で使用した断片についても記
載されている。
【００７９】 放射能標識したタンパク質Ｈと断片Ａを除く断片ＡＢはＡＰ１細菌と親和性を
示す（図４Ａ）。放射能標識したタンパク質ＨのＡＰ１細菌への結合も断片ＡＢ
でブロックされるが断片Ａではブロックされず、このことは結合がＢ領域に位置
していることを示唆している（図４Ｂ）。それにも拘わらず、タンパク質Ｈと比
較するとＡＢの大部分が阻害に必要である。従って、５０％阻害を得るためには
ＡＢ断片の３００倍以上が必要である。更にまた、フィブロネクチンとアルブミ
ンはタンパク質ＨのＡＰ１への結合をブロックできないが（データは示されてい
ない）、Ｂは自己凝集領域を示すことを示唆している。
【００８０】 タンパク質ＨへのＩｇＧ結合はＢのＮＨ2−端末部分とＡのＣＯＯＨ−端末部
分とを覆う領域に位置づけられている。ＩｇＧが細菌の凝集を阻害するという事
実は自己凝集領域がＩｇＧ結合位置と重なり合っている可能性があることを示し
ている。しかしながら、放射能標識したタンパク質Ｈをタンパク質Ｈ−セファロ
ース・カラムに適用すると、結合された放射能は過剰の未標識ＩｇＧでは溶出す
ることが出来ない（図５）。これに対して、放射能は３Ｍ ＫＳＣＮでは簡単に
溶出する。タンパク質Ｈの断片のタンパク質Ｈ−セファロースに対する結合を再
度テストしたが、ＡＢ断片のみが親和性を有していた（図示はされていない）。
この断片はＣ１繰り返しからのＮＨ2−端末アミノ酸残基を含んでいるが（図４
Ｃ参照）、この配列および／またはＢのＣＯＯＨ−端末部分が自己凝集領域を示
す可能性を起こさせている。この領域をカバーするペプチドが合成され（図４Ｃ
）ＡＰＰ：凝集性タンパク質Ｈペプチド（aggregative protein H peptide 150-
168）と名付けられている。
【００８１】 細菌の表面でタンパク質ＨとＭタンパク質族の他のメンバーとはα-螺旋コイ
ル状のダイマーを形成している。Ｍｅ2ＳＯ4中のピアス（Pierce）からの均質二
官能性架橋剤ジスクシンイミジル基質（ＤＳＳ）を最終濃度が１ｍＭになるよう
にタンパク質のＰＢＳ溶液に４℃で３０分かけて添加した。１ＭのＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ７．５と１Ｍ Ｎａｃｌを加えて反応を集結させた。ＤＳＳがタンパ
ク質Ｈを二量化させているのが認められた（図６、着色、レーン１と２）。ＡＰ
Ｐがダイマーと相互作用を起こしているか否かを調べるために125Ｉで標識した
ＡＰＰと一緒２１０００倍過剰の未標識ＡＰＰがない状態とある状態とでタンパ
ク質Ｈを培養し、次いでＤＳＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥと架橋結合させた。ゲル
の一方は染色し（図６、着色）一方は乾燥状態でオートラジオグラフにかけた（
図６、オートダイアグラム）。125Ｉで標識したＡＰＰが優先的にタンパク質Ｈ
のダイマーと結合し（図６、オートラジオグラム、レーン３）結合は未標識のＡ
ＰＰによって阻害されている（図６、オートラジオグラム、レーン４）。過剰の
ＡＰＰの存在によるタンパク質Ｈの不完全な二量化（図６、着色、レーン４）は
ペプチドがタンパク質Ｈのモノマーと結合したためと考えられ、その結果二量化
とそれに続く共有結合の形成が阻害されている。ＡＰＰを使った実験がタンパク
質Ｈとの間に物理的相互作用が存在することを示しているが、無関係のペプチド
はタンパク質Ｈと架橋結合しない（図６、オートラジオグラフ、レーン５）。こ
のペプチドは種類の違った細菌表層タンパクであるタンパク質ＬのＩｇ軽鎖−結
合ドメインの一つに対応している。この結果はＡＰＰ配列はタンパク質Ｈの自己
凝集領域に一部であってＡＰＰタンパクはこの領域で相互作用を起こすことを示
している。
【００８２】 例４ ＡＰＰ配列は細菌の凝集、付着、食作用に対する抵抗に関係している ＡＰＰ配列も細菌の凝集に影響を及ぼすか否かを調べるためにＡＰＰペプチド
をＡＰ１倍地に加えた。ＡＰＰ、タンパク質ＨとＭ１は沈降速度を低下させたが
（次表）、タンパク質ＨのＣＯＯＨ−端末部分から得られたペプチドとタンパク
質Ｌに導かれるペプチドは影響を及ぼさなかった。 表１ ＡＰ１の凝集の阻害（１時間後のＯＤ低下の％）1 タンパク質／ペプチド nmol／ｍL 阻害％ タンパク質Ｈ 1.7 99.5 Ｍ１タンパク質 1.3 98.6 ＡＰＰ 82.5 51.5 タンパク質Ｈ ペプチド351-376 64.6 0 タンパク質Ｌ、Ｂ１−Ｂ４ 5.0 0 タンパク質Ｌ ペプチド１ 150.8 0 タンパク質Ｌ ペプチド２ 82.4 0 1ＡＰ１はＴＨ中で色々なタンパク質／ペプチドの共存下で一夜成長させた
。 沈降を測定して１時間後の光学密度の減少（ＯＤ低下）を計算し、ＴＨ単体中で
のＡＰ１の沈降と比較した。少なくとも２回の実験からの平均値を採用した。
【００８３】 Ｍ１タンパク質を含めた色々なＭおよびＭ−類似タンパク質中でのＡＰＰ−関
連配列を同定した（図７）。ＡＰＰ−関連配列が同定されたＭ血清型の中で、Ｍ
血清型の３つの菌株４、１２、４９を試験したところ凝集することが見出された
が、この凝集体はタンパク質Ｈとはブロックを作らなかった（データは示されて
いない）。多くのＭ並びにＭ−類似のタンパク質が配列未解明で残っているが、
図７に掲げたＡＰＰ−関連配列を有するタンパクは最も普遍的で重要な連鎖球菌
株、特に化膿性連鎖球菌株の幾つかに見出されている。図７に示したものに関連
した血清型は１９８０−１９９０年の間に連合王国内で臨床的に単離された化膿
性連鎖球菌の４６％を占めている（Colman et al, J. Med Microbiol 1993 Vol.
39 165-178）。ＡＰＰ−関連配列が臨床的に単離されたものに普遍的であるとい
う事実は凝集が化膿性連鎖球菌やその他の連鎖球菌類の病原性に影響を及ぼして
いることを説明している。
【００８４】 粘膜面への付着は化膿性連鎖球菌感染症の重要な初期段階である。我々はＡＰ
１菌株とタンパク質Ｈが欠損しているＭ６タンパク質−発現菌株ＪＲＳ４を用い
て凝集と付着に及ぶ連鎖球菌表面のＡＰＰ−関連配列の重要性を解析した。
【００８５】 デトロイト（Detroit）５６２ヒト（ガン）咽頭上皮細胞（ATCC CCL 138）を
ＩＣＮから入手したアールの塩（Earle’s salt）を含む最小必要培地（ＭＥＭ
）にグルタミン（ＩＣＮ）０．１ｍＭ、Life Technologies社から入手したウシ
胎児血清（ＦＣＳ）１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０００単位／
ｍＬ；５０００μｇ／ｍＬ、ＰＥＳＴ；ＩＣＮ）を追加したもの中で３７℃、５
％ＣＯ2雰囲気中で培養した。付着性を評価する細胞は２４ウェルの組織培養プ
レートでほぼ集密化するまで培養した。細胞は使用に先立って抗生物質を含まな
い培地で３回洗浄した。細菌はＴＨ上で一夜培養して遠心分離で集め、ＰＢＳ中
で１回洗浄してから１０ＦＣＳを追加したＨＥＭ中に再懸濁させた。２ｘ１０7
個の細菌をウェルに加えてプレートを２時間３７℃で培養した。ウェルをＰＢＳ
で３回洗浄して未付着の細菌を除去し、上皮細胞を溶解させるためにトリプシン
（ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬとトリトンX−１００（ＰＢＳ中０．
０２５％）０．５ｍＬを各ウェルに加えた。生きている細菌数を測定するために
ＴＨプレート上で各ウェルが３倍になるように必要な希釈を行った。
【００８６】 図８に示したように野生型の両菌株は凝集性が強く上皮細胞にも良く付着する
。ＢＭ２７．６はＡＰ１の変種であってタンパク質Ｈを発現しないが、ＢＪＭ７
１はタンパク質ＨとＭ１タンパク質の双方を欠損している。図８のデータは細菌
の表面からタンパク質Ｈが欠損すると細菌の凝集性と付着性は著しく低下し、Ｍ
１タンパク質も除くと凝集性が更に低下することを示している。Ｍ６タンパク質
−欠損変種ＪＲＳ１４５での結果も表面でのＡＰＰ−関連配列の存在が凝集と付
着を促していることを示唆している。
【００８７】 化膿性連鎖球菌のＭタンパク質発現株である本研究の対象としたAP1株はヒト
全血中で生存し増殖する。このことは非凝集性ＢＭＪ７１株が速やかに死滅する
のと対照的である。上に述べたように、可溶性のタンパク質ＨとＡＰＰは何れも
ＡＰ１の凝集を阻害する。凝集が抗食菌効果に寄与しているならばこのペプチド
はＡＰ１細菌の人血中での成長を阻害するはずである。
【００８８】 細菌は早い半対数形状で成長し（ＯＤ620＝０．１５）ＴＨ中で強く希釈され
る。細菌溶液１００μＬをタンパク質またはペプチドと共に３０分間氷上で培養
し、異なったドナーから採取したヘパリン処理した血液１ｍＬと混合し、３７℃
で連続反転させた。試料１００μＬを時間ごとに採取し、０．５％の寒天を含む
ＴＨを加え、ＴＨ−寒天プレート上に展開して３７℃で一夜培養した。
【００８９】 下記の表２に示したように、ＨまたはＡＰＰを添加したが関連のないペプチド
は添加していない場合はヒト全血中でのＡＰ１細菌の増殖は阻害されており、こ
のことはＡＰＰを介した凝集が化膿性連鎖球菌を食菌から保護していることを示
唆している。 表２ 人血中でのＡＰ１の生存 培養時間（時間） Ｏ 5 CFU/mL血液1 阻害％ AP1＋PBS 88±67 126476±90500 AP1＋タンパク質H 72±86 52632±60627 57.4±29.4 （1.25 nmol） AP1＋APP 88±82 43938±39205 65.9±25.1 （1000 nmol） AP1＋タンパク質L 173±118 256333±102372 0 （1.67 nmol） 1数値は異なるドナーから採取した血液を用いた５回の実験値の平均値±ＳＤ
【００９０】 例６ 免疫試験 次に、ワクチン候補としての能力を示す抗体の生成に対するAPPの可能性を調
べるための試験を実施した。
【００９１】 Ａ．KLH（Pierce）と共役した１９量体ＡＰＰペプチドをウサギの免疫性を上
昇させるために使用した。１９量体ＡＰＰペプチド０．４ｍｇとＫＬＨ０．１ｍ
ｇを０．５ｍＬの体積にしてＦｒｅｕｎｄ補助剤（Sigma, St. Louis, MO）０．
５ｍＬ（完全1部と不完全２部）と混合し、１０ｘ０．１ｍＬをウサギの背中の
皮下に注射した。免疫処置は第１日目に実施し、同量のタンパクによる免疫増強
剤を３０日目と６０日目に同様の方法で注射した。
【００９２】 タンパク質Ｈ、ＡＰＰ−ペプチド、タンパク質Ｌ−ペプチド（Actigen, Cambr
idge, UK）の各タンパク質を結合緩衝液（Na2CO3 0.016 M、NaHCO3 0.035 M、pH
9.6）で希釈した1μg／ｍＬの溶液２００μＬを９６ウェルのプレート（Nunc,
Maxisoap）の各ウェルに塗布して一夜放置した。ＰＢＳで洗浄後、各ウェルを予
備免疫血清または抗血清２００μＬと一緒に３７℃で１時間培養した。この血清
をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０．２％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）で1:1000；1:2000；1:4000；1:8000；1:16000；1:32000；1:64000；1
:128000に希釈した。
【００９３】 二次抗体、ヤギ抗ウサギＨＲＰ−標識（BioRad、Hercules、CA）をＰＢＳ＋０
．０５％Tween（登録商標）−２０．２％ＢＳＡで１：３０００に希釈したもの
を活性検出のために加えた。ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ-ジ（３−エチルベン
ゾチアゾリンスルフォネート(ＮＨ4)2-塩）２００ｍｇを１０の水に溶かした。
基質緩衝液（クエン酸０．１Ｍ、Ｎａ2ＨＰＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ ０．１Ｍ、ｐＨ４．５
）４０ｍＬ、ＡＢＴＳ溶液２ｍＬ、３０％Ｈ2Ｏ2 ０．８ｍＬで構成された着色
試薬混合物を調製した。
【００９４】 各ウェルに着色試薬混合物200μLを加えて展開し、３７℃で３０分間培養した
。プレートをＥＬＩＳＡリーダーを使って４０５ｎｍで解読した。
【００９５】 図９に示したように、ＡＰＰは抗体と結合していて抗ＡＰＰ抗原が出来ている
ことが立証された。
【００９６】 Ｂ．ヒツジにＳｐｙ−ｐＨ ＹＱＥ３３を吸餌した 鍵穴リンペット・ヘマシアニン（ＫＬＨ）に共役した（YQWQLQKQQQLETEKQISEA
SRKSLSRDLEASRC-COOH）をフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバントに溶か
したものを６箇所に皮下投与した。第一次の免疫付与から２８、５６、８２日目
にSpy-PH YQE33-KLH共役体３５０μｇをフロイント完全アジュバントに溶かした
ものを６カ所に投与して免疫増強を行った。最後の免疫増強から１４日後に動物
から採血し、抗-Spy-PH-YQE33抗体をＥＬＩＳＡで測定するための血清を調製し
た。
【００９７】 微量力価測定プレート（９６ウェル）に、０．０５Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９
．６）にペプチドを５μｇ／ｍＬで溶かした溶液を加えることによってSpy-PH-Y
QE33ペプチドを塗布して培養した（６０分、３７℃）。ＰＢＳに０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０を加えたもの（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）にウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を１％溶かしたものでプレートをブロックしてバックグラウンドの結合を最
小化した。上記のようにして調製したヒツジ免疫血清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１
：１００００に希釈して、Spy-PH-QKQ19(QKQQQLETEKQLSEASRKSC-COOH)関連ペプ
チド100Μg／ｍＬまたはSpy-LP-KEY17(CKEY TDKLDKLDKESKDK-COOH)非関連ペプチ
ド１００μｇ／Ｍｌと一緒に予備培養した（６０分、３７℃）。対照血清はペプ
チドのない状態で培養した。予備培養した血清をプレートに加えて３７℃で６０
分培養した。ワサビダイコン・パーオキシターゼに共役したロバ抗ヒツジＩｇＧ
（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：１０００希釈）をプレートに加え（６０分、３７℃
）、更にｐＨ５．０の燐酸クエン酸緩衝液中に3,3’,5,5’-テトラメチル−ベン
チジンを含有する酵素基質溶液を加えた（１０分、ＲＴ）。２ Ｍ ＨＣｌを加
えて比色反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。プレートはＥＬＩ
ＳＡの各工程の中間で少なくとも３回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。
【００９８】 結果を図１２に示した。
【００９９】 Ｃ．組換えタンパク質ＨはＢｅｒｇｅらの方法（Berge et al., (1997) J. Bi
ol. Chem. 272, 20774-20781）で大腸菌の発現から得た。タンパク質ＨはヒトＩ
ｇＧ−セファロース・カラムを使用して単親和性クロマトグラフィーで大腸菌の
溶菌物から精製した。結合したタンパク質Ｈは３ Ｍ ＫＳＣＮで溶出させＰＢ
Ｓを透析で除去した。
【０１００】 リゾチームと免疫リジンを使用して細胞壁を部分消化させることによってタン
パク質抽出物を化膿性連鎖球菌から調製した。ＯＤ600nmが約１．０になるまで
成長させた細胞約２ｍＬを低速遠心分離器でペレット化し、新たに加えたリゾチ
ーム（Sigma）５ｍｇ／ｍＬと免疫リジン（Sigma）１００Ｕ／ｍＬを含む１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ １００μＬに再分散させた。３７℃で１０分間培養した後
遠心分離にかけて細胞を回収し１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍ
Ｌで２回洗浄し、５０ｍＭ ＤＤＴを含むＮｕＰａｇｅ試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ
）１５０μＬを加えて溶菌させた。
【０１０１】 タンパク質は電気泳動で分離したが、分子量が３９から６０ｋＤａの範囲で最
適の分離が出来るように１０％NuPage Bis-Tris-HCl緩衝アクリルアミド・ゲル
とＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ走行緩衝液を使用した。NuPage電気泳動システ
ムの詳細はNovex Electrophoresis GmbH（Brueningstrasse 50, Building C584,
D-65929 Frankfurt/M）から入手することが出来る。Novex XCell II 滴下装置
とそのメーカーに推奨されている方法を使ってタンパクをPVDF薄膜フィルターに
移した。PVDFフィルターに移した後０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０（PBST
）を含むUHF脱脂乳と燐酸で緩衝した生理食塩水の１:１混合物を用いて室温で３
０分間ブロックした。フィルターはブロッキング緩衝液（脱脂乳１部とＰＢＳＴ
３部）中で一次抗体血清（１：１０００）と一緒に室温で１時間培養し、ブロッ
キング緩衝液で３回、各５分間洗浄した。フィルターは１：５０００に希釈した
抗ウシＩｇＧアルカリ燐酸塩共役体と一緒に室温で３０分間培養した。フィルタ
ーはアルカリ燐酸塩の着色基質であるブロモ−クロロ−インドリル燐酸エステル
／ニトロ-青テトラゾリウム（ＢＣＩ／ＭＢＴ基質キット、Sigma）を加える前に
ＰＢＳＴで１０分間２回と１０ｍＭ Tris-HCl(ｐＨ８．０)、１５０ｍＭ Ｎａ
ｃｌで５分間２回の最終洗浄を行った。
【０１０２】 組換えタンパク質Ｈ（８００ｎｇ）と化膿性連鎖球菌のＭ６型（タンパク質Ｈ
非表現型）とＡＰ１(Ｍ１型タンパク質Ｈ表現型)からのタンパク質抽出物を使っ
て免疫着色を実施した。主バンドは精製した組換えタンパク質Ｈを着けたトラッ
クで検出され軽度の高分子量バンドがＡＰ１を着けたトラックで検出されたが、
このことはＡＰ１株の細胞壁から少量のタンパク質Ｈが酵素的に放出されている
ことを示している。
【０１０３】 この結果は、キャリヤー・タナパクＫＬＨにとも役したＡＰＰペプチドによる
免疫は精製した組換えタンパク質Ｈと化膿性連鎖球菌からの野生型タンパク質Ｈ
に結合したＩｇＧ血清抗体を誘発することを示している。精製した組換えタンパ
ク質Ｈと化膿性連鎖球菌からの野生型タンパク質Ｈの分子量差は組換えタンパク
質Ｈの方が３０アミノ酸分長さが短いという事実から求められる。
【０１０４】 例７ 殺菌性解析 化膿性連鎖球菌Ａグループ（ＡＰ１）の細菌はTodd Hewittブイヨン（ＴＨ）
（Difco Laboratories, Detroit,MN）中、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で早期半
対数形状で成長する（ＯＤ620＝０．１５）。細菌液０．４ｍＬにＴＨ−ブイヨ
ン４．６ｍＬを加える方法でＴＨブイヨンで５段階の逐次希釈を行った。４番目
または５番目の希釈液１００μＬを、未希釈の前免疫血清（pre-APP）１００μ
Ｌまたは未希釈の抗体血清（anti-APP）１００μＬ、１ｍｇ／ｍＬの前免疫血清
（pre-IgG）または抗血清（anti-IgG）１００μＬと一緒に氷上で３０分間培養
した。ヘパリン処理した人血１ｍＬを混合物２００μＬに加えて３７℃で連続転
倒回転させた。
【０１０５】 各時間ごとに試料１００μＬを抜き取り、０．５％の寒天を含むＴＨ２．５ｍ
Ｌを加え、ＴＨ−寒天プレート上に展開して３７℃で一夜培養した。生成したコ
ロニーの数を数えた。前免疫血清と抗血清からのＩｇＧフラクションはそれぞれ
タンパク質ＬＧ−セファロース上で精製した。
【０１０６】 結果を以下の表３に示したが、抗ＡＰＰ血清がＡＰ１の人血中での生存を阻害
していることが解る。ＡＰＰはそれ自体が阻害活性を有していて、ＡＰＰの活力
を概観すると単にワクチンの候補であるばかりではなくで凝集阻害剤でもあるこ
とが解る。 表３ 人血中でのＡＰ１の生存の阻害 阻害剤 阻害％ 前-APP血清1 30.9±24.8 抗-APP血清1 35.5±15.9 前-APP血清から精製したIgG2類似体 50.3±28.9 抗-APP血清から精製したIgG2類似体 80.2±11.8 1異なる３ドナーからの血液を使用した5回の実験からの平均値 2異なる２ドナーからの血液を使用した3回の実験からの平均値
【０１０７】 例８ ＡＰＰペプチドと化膿性連鎖球菌の攻撃（challenge)実験 抗凝集性によって生存が増える場合のＡＰＰの有効性を調べた。
【０１０８】 Ｍ１血清型の化膿性連鎖球菌ＡＰ１株をTodd Hewitt培地中で３７℃で５％Ｃ
Ｏ2雰囲気中で一夜成長させた。３，８００ｘｇで１０分間遠心分離にかけて菌
体を集めた。得られた細菌ペレットを2回洗浄してから1ｘ燐酸塩緩衝食塩水、Ｐ
ＢＳに再懸濁させた。１９量体ＡＰＰ−ペプチド２ｍｇをＰＢＳに溶かし、ＡＰ
１菌の１０6のコロニーを形成する単位を混合して全体を０．２ｍＬとした。こ
の混合物を所謂空気吸飲モデルを使用してマウスに皮下注射した。この方法では
空気０．８ｍＬと細菌／ペプチド混合物０．２ｍＬとを注射器に満たして混合す
る。これが所謂空気吸飲モデルである。マウスを飼育カゴ中に放置して生存数を
時間を追って勘定する。その結果を表４に示した。 表４ 細菌（cfu/mL） 細菌＋APP-ペプチド 生存数 106 − 全数死亡 106 2 mg 全数生存
【０１０９】 細菌のみを受け入れたマウスは２４時間以内に全数死亡したが、一方細菌＋Ａ
ＰＰ−ペプチドを投与されたマウスは４週間後も全数生存していた。
【図の簡単な説明】
【図１】 ＡＰ１細菌の沈降分析 ＡＰ１細菌はＴＨ（○）、１０％のヒト血清を含むＴＨ（●）、１．４ｍｇ/
ｍＬのヒトＩｇＧを含むＴＨ（△）中で３７℃で一夜成長させた。細菌は再分散
させてから室温で放置して沈降させた。沈降速度は６２０ｎｍにおける光学密度
を時間に対してプロットすることによって求めた。
【図２】 ＡＰ１表層タンパク質の溶解 （Ａ）ＡＰ１細菌はＰＢＳ（○）、パパイン（●）、連鎖球菌システイン・プ
ロテイナーゼ（△）またはＣＮＢｒ（▲）と一緒に培養した。細菌を消化させた
後遠心分離にかけ、洗浄、再分散の後沈降分析を行った。 （Ｂ）濃度が２ｘ１０9細菌／ｍＬの上記（Ａ）は逐次希釈を行った後125Ｉで
標識したＩｇＧとの結合試験を行った。 （Ｃ）ＡＰ１細菌からのＣＮＢｒ−可溶化材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 ＣＮＢｒによって生成した断片はＨタンパク質とＭ１タンパク質の図的表現に
よって表される。ＮＨ2−端末信号シーケンス（Ｓｓ）が表示され、タンパク質
はＣＯＯＨ−端末Ｄドメインによって細菌細胞と結合している。Ｓｓ、Ｃ、Ｄド
メインの配列は高度の相同性を示している。ＩｇＧＦｃ−結合はＨタンパク質の
Ａ−ＢドメインとＭ１タンパク質のＳドメインとに位置している。図中の数字は
アミノ酸残基の位置を示したものである。此処で使用したＨタンパク質は細菌の
細胞壁と結合する２７番ＣＯＯＨ−端末アミノ酸残基を欠いた先端の切れた形（
４２−３４９）であるが、一方Ｍ１タンパク質は４２−４８４番残基をカバーし
たものである。
【図３】 ＡＰ１細菌と精製タンパク質Ｈに結合したタンパク質Ｈ （Ａ）２ｘ１０9細胞／ｍＬのＡＰ１とＡＰ６細菌は逐次希釈した後125Ｉで標
識したタンパク質Ｈ（●）またはＭ１タンパク質(△)との結合試験を行った。12 5 Ｉで標識したＩｇＧ（○）は正の対照試料として使用した。 （Ｂ）色々な量のタンパク質ＨとＭ１タンパク質をＰＶＤＦフィルターに適用
した。フィルターは125Ｉで標識したタンパク質ＨまたはＭ１タンパク質（２ｘ
１０5ｃｐｍ/ｍｌ）と一緒に３時間培養した後３日間オートラジオグラフにかけ
た。
【図４】 タンパク質Ｈの自己会合領域のマッピング （Ａ）125Ｉで標識したタンパク質Ｈ（○）、タンパク質Ｈの断片ＡＢ(△)ま
たは断片ＡＢ（□）の４ＡＰ１細菌への結合。 （Ｂ）125Ｉで標識したタンパク質ＨのＡＰ１細菌（２ｘ１０9細胞／ｍＬ）へ
の結合は色々な量の標識していないタンパク質Ｈ（○）またはタンパク質Ｈの断
片ＡＢ(△)およびＡ（□）によって阻害される。 （Ｃ）タンパク質Ｈの図解。タンパク質Ｈの色々な断片は凝集性のタンパク質
Ｈのペプチド（ＡＰＰ）の配列と一緒に図の下に示されている。数字はアミノ酸
残基に対するものである。
【図５】 放射性標識したタンパク質Ｈはタンパク質Ｈ−セファロースと親和性を持って
いる。 タンパク質Ｈ−セファロース・カラムに125Ｉで標識したタンパク質Ｈ（１０6 ｃｐｍ）を適用した。カラムをＰＢＳＡＴで十分に洗浄してからヒトＩｇＧ（５
ｍｇ／ｍＬ）で溶出させ、ＰＢＳＡＴで二度目の洗浄を行ってから３ＭのＫＳＣ
Ｎで最終的に溶出させた。フラクションの放射能を溶出容積に対してプロットし
た。
【図６】 ＡＰＰはタンパク質Ｈに架橋結合している。 125Ｉで標識したＡＰＰ（約４５０ｐｍｏｌ）の存在下でタンパク質Ｈ（３０
０ｐｍｏｌ）をＤＳＳと架橋結合させた。ゲルの一方は染着させ他方は乾いた状
態でオートラジオグラフにかけて試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。レーン１
：架橋剤なしのタンパク質Ｈ；レーン２：架橋剤ありのタンパク質Ｈ；レーン３
：125Ｉ−ＡＰＰの存在下で架橋させたタンパク質Ｈ；レーン４：125Ｉ−ＡＰＰ
の存在下で架橋させたタンパク質Ｈと過剰量の標識していないＡＰＰ（４５０ｎ
ｍｏｌ）；レーン５：タンパク質Ｌの125Ｉで標識したＢ１ドメインの存在下で
架橋させたタンパク質Ｈ。
【図７】 ＡＰＰ−関連の配列は幾つかのＭまたはＭ−類似タンパク質で認められる。 ＡＰＰに関連した配列の並びはデータベースで見出すことが出来る。アミノ酸
とヌクレオチドのレベルでのＡＰＰとの同一性はタンパク質が由来しているＭ血
清型でも得られている。各種のタンパク質Ｍ４９、Ｓｉｒ２２、ＭＬ２．１、Ｍ
１、Ｍ５、Ｍ１２、Ａｒｐ４およびＭ６でもＡＰＰ−関連の配列の位置で認めら
れている。
【図８】 化膿性連鎖球菌の沈降分析と付着 （Ａ）野生型ＡＰ１、タンパク質Ｈ欠損変異株（ＢＭ２７．６）、タンパク質
ＨとＭ１タンパク質の両方が欠損した変異株（ＢＭＪ７１）、野生型Ｍ６株（Ｊ
ＲＳ４）（タンパク質Ｈを示さない）、Ｍ６タンパク質欠損変異株（ＪＲＳ１４
５）の凝集試験を行った。沈降は１時間後の６２０ｎｍにおける光学密度の減少
から求めた。平均値±ＳＤが求められる。 （Ｂ）野生株と変異株はヒト上皮細胞への付着性を調べた。百パーセント付着
は１．４９ｘ１０6±０．５ＡＰ1細菌／上皮細胞層 または０．２７ｘ１０6±０
．０４ｘ１０6ＪＲＳ４細菌／上皮細胞層 に相当する。ＡＰ１変異株はＡＰ１と
比較し、ＪＲＳ１４５変異株はＪＲＳ４と比較した。数値は 平均値±ＳＤであ
る。
【図９】 ＫＬＨにとも約したＡＰＰをアジュバントと一緒にウサギに注射して調製した
抗血清を使用したＥＬＩＳＡの結果。
【図１０】 ＡＰＰ−ペプチド（３３量体）と他のＭタンパク質相同体のヌクレオチド配列
。
【図１１】 ＡＰＰ-ペプチド（３３量体）を使用したＡＰＰ−関連配列の配置。
【図１２】 Spy-PH-YQE33によって誘導された抗体の検出へのペプチドの予備吸着の影響。
ヒツジに初回抗原刺激を与えてからＫＬＨ担体タンパク質に共約したタンパク質
Ｈ−誘導ペプチドSpy-PH-YQE33で追加抗原刺激を与えた。免疫後の血清（１：１
００００希釈）を無関係なペプチド（Spn-LP-KEY17）１００μｇ／ＭＬまたは関
係のあるペプチド（Spy-PH-QKQ19）１００μｇ／ｍＬと一緒に培養した（６０分
、３７℃）。対照試料はペプチドのない状態で培養した。Spy-PH-YQE33エピトー
プに対する抗体はこのようにしてＥＬＩＳＡによって測定された。結果は４５０
ｎｍで測定した光学密度で表されている（平均値、ｎ＝４ウェル）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/12 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA07 BA01 BA17 BA18 BA19 CA04 MA52 MA66 NA14 ZB351 ZB352 4C085 AA03 BA14 BB11 CC07 CC32 DD62 GG03 GG04 GG08 GG10 4H045 AA10 AA11 AA30 BA17 BA18 CA11 DA76 DA86 EA29 FA72 FA74 GA26

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 連鎖球菌性感染に対するワクチンとして用いるのに適合した
    、アミノ酸が５０個までの長さのポリペプチドであって （ａ） QKQQQLETEKQISEASRKSの配列を有する化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）
    のタンパクＨの１５０〜１６８番アミノ酸； （ｂ） 配列（ａ）に対応した連鎖球菌株の外層膜タンパク質のアミノ酸配列
    ； （ｃ） ６個またはそれ以上のアミノ酸からなる配列（ａ）または（ｂ）の断
    片；または （ｄ） 削除、挿入、置換、または再配列によって変性を行った配列（ａ）、
    （ｂ）または（ｃ）からなる配列 からなる上記ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列（ａ）が配列YQEQLQKQQQLETEKQISEASRKSLSRDLEASRであ
    る請求項１記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列（ｂ）が化膿性連鎖球菌の外層膜タンパク質のアミノ酸
    配列からなる請求項１または２記載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】 配列（ｂ）が化膿性連鎖球菌のＭまたはＭ類似タンパク質の
    アミノ酸配列からなる請求項３記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 ポリペプチドの長さがアミノ酸４０個まで、望ましくは長さ
    がアミノ酸３０個までである請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド
    。
  6. 【請求項６】 配列（ａ）または（ｂ）の断片の長さがアミノ酸１０個また
    はそれ以上、望ましくは長さがアミノ酸１８個である請求項１〜５のいずれか一
    項に記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】 配列（ａ）が実質的に配列QKQQQLETEKQISEASRKSまたは配列Y
    QEQLQKQQQLETEKQISEASRKSLSRDLEASRである請求項１記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の第一のポリペプチドお
    よび第一のポリペプチドと天然界では隣接することがない第二のポリペプチドか
    らなるキメラタンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドをコードした
    ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載のポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオ
    チドによってコードされたポリペプチドの発現のための当該ポリヌクレオチドに
    操作して結合可能な調節配列からなる発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドと医薬
    として許容されている担体からなる医薬組成物。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜８に記載のポリペプチド、アジュバントおよび
    医薬として許容されている担体からなるワクチン組成物。
  14. 【請求項１４】 請求項９のポリヌクレオチドおよび医薬として許容されて
    いる、当該ポリヌクレオチドのための担体からなるワクチン組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
  16. 【請求項１６】 アミノ酸が５０個までの長さのポリペプチドであって （ａ）QKQQQLETEKQISEASRKSの配列を有する化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）の
    タンパク質Ｈの１５０〜１６８番アミノ酸； （ｂ） 配列（ａ）に対応した連鎖球菌株の外層膜タンパク質のアミノ酸配列
    であって、当該配列が当該連鎖球菌株の凝集または付着を阻害する機能を有する
    アミノ酸配列； （ｃ） ６個またはそれ以上のアミノ酸からなる配列（ａ）または（ｂ）の断
    片であって、連鎖球菌の凝集または付着を阻害する機能を有する断片；および （ｄ） 削除、挿入、置換、または再配列によって変性を行った配列（ａ）、
    （ｂ）または（ｃ）からなる配列であって、連鎖球菌の凝集または付着を阻害す
    る機能を有する配列 からなる上記ポリペプチド。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ES2338637T3 (es) 2001-02-21 2010-05-11 Id Biomedical Corporation Polipeptidos de streptococcus pyogenes y fragmentos de adn correspondiente.
US7255867B2 (en) * 2002-11-15 2007-08-14 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4454121A (en) * 1982-07-27 1984-06-12 The University Of Tennessee Research Corporation Synthetic peptides corresponding to antigenic determinants of the M protein of Streptococcus pyogenes
US4521334A (en) * 1982-07-27 1985-06-04 The University Of Tennesse Research Corporation Synthetic polypeptide fragments
US4784948A (en) * 1983-08-10 1988-11-15 The Rockefeller University Production of streptococcal m protein immunogens and molecular probes
JP2871709B2 (ja) * 1988-11-21 1999-03-17 住友製薬株式会社 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法
SE9002212D0 (sv) * 1990-06-21 1990-06-21 Hightech Receptor Ab Igg binding protein

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