JP2002508664A

JP2002508664A - 複数の単一ヌクレオチド多型を単一の反応で検出する方法

Info

Publication number: JP2002508664A
Application number: JP50498299A
Authority: JP
Inventors: マッキントッシュ，ティナ; ヘッド，スティーブン; ゴーレット，フィリップ; ボイス−ジャチノ，マイケル・ティ
Original assignee: オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2002-03-19
Also published as: WO1998059066A1; EP0994960A1; CA2294053A1; AU8162498A

Abstract

(57)【要約】植物または動物のゲノム中の複数の多型部位を同定するのに適した分子および方法。そのような部位の同定は、同一性、祖先、遺伝病への素因、所望の特質の存在または不存在などを決定するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称複数の単一ヌクレオチド多型を単一の反応で検出する方法発明の技術分野本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野におけるものである。さらに詳しくは、本発明は、植物、動物または微生物のゲノムにおいて１またはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を単一の反応にて同定し、かかる部位を同一性、祖先または遺伝的特質（traits）を分析するために用いるのに適した分子および方法に関する。関連出願の相互参照本願は、米国特許出願第０８／２１６,５３８号（１９９４年３月２３日出願）（該出願は、米国特許出願第０８／１４５,１４５号（１９９３年１１月３日出願）の一部継続出願である）の一部継続出願である。発明の背景動物、植物または微生物の遺伝子型を決定しうることは、法科学、医学および疫学および公衆衛生において、および動物の育種および出品（exhibition）において基本的に重要な事柄である。そのような決定しうることは、たとえば、感染性疾患の病因を同定するため、２人の個体が血縁であるか否かを決定するため、または生物のゲノム内に遺伝子をマッピングするために必要である。疾患を診断しうることとともに同一性および親であることの分析はまた、ヒト、動物および植物の遺伝的研究、とりわけ法的なまたは実父確定（paternity）評価において、および個体が遺伝病に罹るリスクを評価するうえで中心的な関心事でもある。そのような目標は、一人の個体のＤＮＡを他の個体のＤＮＡとは異なったものとするＤＮＡ配列の変異を分析することによって追跡されている。もしも、そのような変異が制限エンドヌクレアーゼ開裂により生成する断片の長さを変えるなら、そのような変異は制限断片長多型（「ＲＦＬＰ」）と称される。ＲＦＬＰはヒトおよび動物の遺伝子分析に広く用いられている（Grassberg ，J.、英国特許出願第２１３５７７４号；Skolnick，M.H.ら、Cytogen ．Cell Ge net ．32:58〜67(1982)；Bostein，D.ら、Ann ．J．Hum．Genet．32:314〜331（19 80）；Fischer，S．G.ら（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１３６６８号）；Uhlen， M.、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１１３６９号）。遺伝性の特質を特定のＲＦＬＰと関連付けることができれば、標的動物での該ＲＦＬＰの存在は該動物もまた該特質を示すであろう可能性の高いことを予測するのに用いることができる。複数のアレルに依存する複合的な特質をマッピングできるように、ＲＦＬＰの多遺伝子座（multilocus）分析を可能とする統計的方法が開発されている(Lander，S.ら、P roc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A) 83:7353〜7357(1986)；Lander，S.ら、Proc ．N atl．Acad．Sci.(U.S.A) 84:2363〜2367(1987);Donis-Keller，H.ら、Cell 51:3 19〜337(1987)；Lander，S.ら、Genetics 121:185〜199(1989)、すべて参照のため本明細書中に引用する）。そのような方法は、遺伝子地図を開発するため、並びに一層望ましい特質を有する植物または動物を開発するために用いることができる（Donis-Keller，H.ら、Cell 51:319〜337(1987);Lander，S.ら、Genetics 121 :185〜199(1989)）。ある場合には、ＤＮＡ配列の変異は、ヌクレオチドのタンデムなジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド繰り返しモチーフを含む短タンデムリピート（shortt andem repeats;「ＳＴＲ」）を特徴とする領域に存在する。これらタンデムリピートはまた、「可変数タンデムリピート（variable number tandem repeat）（「ＶＮＴＲ」）とも称される。ＶＮＴＲは同定および実父確定分析に用いられてきており (Weber，J.L.、米国特許第５,０７５,２１７号；Armour，J.A.L.ら、FEBS Lett ．307:113〜115(1992)；Jones，L.ら、Eur ．J．Haematol．39:144〜14 7(1987)；Horn，G.T.ら、ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１４００３号；Jeffreys，A.J. 、ヨーロッパ特許出願３７０,７１９号；Jeffreys，A.J.、米国特許第５,１７５ ,０８２号；Jeffreys，A.J.ら、Amer ．J．Hum．Genet．39:11〜24(1986)；Jeffr eys，A.J.ら、Nature 316:76〜79(1985)；Grey，I.C.ら、Proc ．R．Acad．Soc． Lond ．243:241〜253(1991)；Moore，S.S.ら、Genomics 10:654〜660(1991)；Jef freys，A.J.ら、Anim ．Genet．18:1〜15(1987)；Hillel，J.ら、Anim ．Genet．2 0 :145〜155(1989)；Hillel，J.ら、Genet．124:783〜789(1990))、現在では数多くの遺伝子マッピングの研究に用いられている。第三のクラスのＤＮＡ配列変異は、同じ種の個体間に存在する単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）の結果生じるものである。そのような多型は、ＳＴＲやＶＮＴＲに比べてはるかに頻繁に起こる。幾つかの場合において、そのような多型は、遺伝病において決定的な特性である変異を含んでいる。実際、そのような変異は、疾患（すなわち、血友病、鎌形赤血球貧血など）を現実に引き起こすに充分な仕方でタンパク質コード遺伝子中の単一のヌクレオチドに影響を及ぼす。多くの場合、これらＳＮＰはゲノムの非コード領域に起こる。そのような多型の現代遺伝学における中心的な重要性にもかかわらず、個体からの１またはそれ以上の遺伝子座の分析を単一の反応フォーマットで可能とする実際的方法は開発されていない。本発明は、そのような改良法を提供するものである。実際、本発明は、複数の単一ヌクレオチド多型の変異を識別することにより同定および実父確定の遺伝子分析および疾患の診断を可能とする方法および遺伝子配列を提供する。発明の要約本発明は、あらゆる生命形態に存在する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む分子に関する。本発明は、（i）１またはそれ以上の新規な単一ヌクレオチド多型を同定する方法、（ii）これらＳＮＰを異なる試料で繰返し分析および試験する方法および（iii）そのような部位の存在を動物、植物および微生物の遺伝子分析に活用する方法に関する。そのような部位の分析（遺伝子型決定）は、同一性、祖先、遺伝病への素因、所望の特質の存在または不在等の決定に有用である。詳細には、本発明は、いずれかの生物のゲノムＤＮＡセグメントの１またはそれ以上のヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有する１またはそれ以上のインテロゲーション（interrogation）核酸（または核酸アナログ）プライマー分子を提供するものであり、その際、該ゲノムセグメントは、哺乳動物の単一ヌクレオチド多型アレルの単一ヌクレオチド多型部位Ｘの直ぐ３'遠位に位置し、単一ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）による核酸（または核酸アナログ）プライマー分子の鋳型依存性の伸長は、該プライマー分子を単一ヌクレオチド（またはアナログ）により伸長させ、該単一ヌクレオチド（またはアナログ）は該単一ヌクレオチド多型アレルのヌクレオチドＸに相補的である。本発明は、プライマーの鋳型依存性の伸長を、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰ（または他の鎖停止塩基アナログ）よりなる群から選ばれた１またはそれ以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸誘導体（またはアナログ）の存在下だが、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの不在下で行う態様に関する。本発明はさらに、１またはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を単一の反応において同定する方法であって、工程：（Ａ）１またはそれ以上の識別可能なインテロゲーションオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドアナログ）プライマーを１またはそれ以上の標的核酸分子にハイブリダイズさせ、その際、各オリゴヌクレオチドプライマーは、各プライマーの３'末端が興味のもたれる特定かつ独特の標的ヌクレオチドの直ぐ近位に位置するように、各標的核酸分子の特定かつ独特の領域に相補的であり；（Ｂ）各インテロゲーションオリゴヌクレオチド（またはアナログ）を鋳型依存性のポリメラーゼで伸長させ、その際、該伸長は、１またはそれ以上の非伸長性のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の存在下で起こり；（Ｃ）使用した各インテロゲーションプライマーについて、そのようなプライマー中に導入された非伸長性のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の同一性を決定することにより興味のもたれる各ヌクレオチド（またはアナログ）を同定し、その際、同定された該非伸長性のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）は該プライマーの標的ヌクレオチドに相補的である；ついで（Ｄ）適当なマトリックス上、または物理的または化学的分離の他の標準法または同定法により、該伸長したプライマーを分離するを含む。図面の簡単な説明図１は、ランダムゲノム断片をクローニングするための好ましい方法を示す。ゲノムＤＮＡをサイズ分画し、ついでランダムクローンを得るためにプラスミドベクター中に導入する。挿入されたゲノム配列の配列を決定するためにＰＣＲプライマーをデザインし、使用する。図２は、ランダムゲノム断片のサイクルシークエンシング（cycle sequencing ）である、新規な多型配列を同定するための好ましい方法により得られたデータを示す。図３は、多型配列のためのランダムクローンのスクリーニングのためのＲＦＬＰ法を示す。図４は、遺伝子マーカーの所定のパネルで２人の個体が同一の遺伝子型を有するであろう確率のグラフを示す。図５は、２０の遺伝子マーカーの所定のパネルが、母親が問題となっていない実父確定訴訟においてランダムな真偽の疑わしい父親を排除するであろう確率のグラフを示す。図６は、ＳＮＰの遺伝子型決定のための好ましい方法を示す。７つの工程は、生物学的試料から出発してＧＢＡを行う仕方を示している。好ましい態様の説明Ｉ．本発明の単一ヌクレオチド多型および遺伝子分析におけるその使用の利点Ａ．多型の属性本発明にとって興味のもたれる特定の遺伝子配列は、「単一ヌクレオチド多型」を含む。「多型」とは、ある種における幾つかの成員のＤＮＡ配列の変異である。動物および植物のゲノムは、その持続的な進化の過程で自然の突然変異を蒙る（Gusella，J.F.、Ann ．Rev．Biochem．55:831〜854(1986)）。そのような突然変異の大部分は多型を生み出す。変異した配列および元の配列は、その種の集団において共に存在する。幾つかの場合には、そのような共存は安定なまたは準安定な平衡にある。他の場合には、そのような変異はその種が生き残る上でまたは進化にとっての有利さをもたらすため、ついには（すなわち、進化的な時間において）、それがその種の全成員のゲノム中に組み込まれることになる。それゆえ、多型は、多型の存在のためにある種の幾つかの成員は変異していない配列（すなわち、元の「アレル」）を有する一方で他の成員は変異した配列（すなわち、変異した「アレル」）を有するという点で「アレリック（allelic）」と呼ばれる。最も単純な場合では、ただ一つの変異した配列が存在し、この多型はジアレリック（diallelic）と呼ばれる。別の変異が起こるとトリアレリック（triallelic）をもたらす、等。アレルは、該変異を含むヌクレオチドにより表される。本発明は、特定のクラスのアレル多型、および植物、動物、または微生物の遺伝子型を決定するためのその使用に関する。そのようなアレル多型は、本明細書において「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」と称する。「単一ヌクレオチド多型」は以下の属性により定義される。そのような多型の中心的な属性は、アレル配列間での変異の部位である多型部位「Ｘ」を含むことである。ＳＮＰの第二の特性は、その多型部位「Ｘ」がしばしばアレルの「非変異」配列に先行され後続されていることである。それゆえ、ＳＮＰの多型部位は、「５'近位」非変異配列の「直ぐ」３'側に位置し、「３'遠位」非変異配列の「直ぐ」５'側に位置するとされる。そのような配列は多型部位をフランキングしている。単一ヌクレオチド多型の「単一」なる語は、多型のヌクレオチドの数（すなわち、１つのヌクレオチド）をいう；これは標的ＤＮＡ中に存在する多型の数（１つから多数にわたる）とは関係ない。本明細書において、ある配列がその種の集団内で変化しないならばアレルの「非変異」配列といわれ、マッピングしている場合にはその種の集団の各成員のゲノム内の同じアレルの「対応」配列にマッピングされる。２またはそれ以上のＳＮＰが互いに極めて近接して位置してよいことに注意すべきである。２つの配列は、それらが互いに異なる採取源から得られたアナログである場合に「対応」配列といわれる。２人のヒトにおいてヘモグロビンをコードする遺伝子配列が「対応」アレル配列の例示である。本明細書における「対応アレル」の定義は、この語の意味を明確にするためであって、当業者に理解されている語の意味を変えることを意図するものではない。表１の各列は、「対応」ウマアレルの多型部位のヌクレオチドの同定並びに非変異５'近位配列および３'遠位配列（これらも該ＳＮＰの属性である）を示す。ヒトアレルに関する「対応アレル」は表２に示してある。表２の各列は、「対応」ヒトアレルの多型部位のヌクレオチドの同定並びに非変異５'近位配列および３'遠位配列（これらも該ＳＮＰの属性である）を示す。ゲノムＤＮＡは二本鎖であるから、各ＳＮＰはプラス鎖かまたはマイナス鎖のいずれかで定義できる。それゆえ、各ＳＮＰについて、一方の鎖は直ぐ５'の近位非変異配列を含み、他方の鎖は直ぐ３'の遠位非変異配列を含むであろう。各ＳＮＰ多型部位「Ｘ」が単一のヌクレオチドである好ましい態様において、ＳＮＰの二本鎖ＤＮＡの各鎖は直ぐ５'の近位非変異配列および直ぐ３'の遠位非変異配列の両者を含むであろう。本発明の好ましいＳＮＰはＳＮＰ多型での１つのヌクレオチドの他のヌクレオチドによる置換に関するものであるが、ＳＮＰはまたさらに複雑なものであってもよく、２つの対応配列の１つからのヌクレオチドの欠失または２つの対応配列の１つへの挿入を含んでいてよい。たとえば、ある動物において特定の遺伝子配列が特定の多型部位中にＡを含んでいるのに対して、他の動物では該部位に単一または複数の塩基置換が存在してよい。本発明の好ましいＳＮＰは非変異近位配列および非変異遠位配列の両者を有するが、ＳＮＰは非変異近位配列のみまたは非変異遠位配列のみを有していてもよい。ＳＮＰの直ぐ３'の遠位非変異配列に相補的な配列を有する核酸分子は、「鋳型依存的な」仕方で伸長された場合には、ＳＮＰの多型部位を含む伸長生成物を形成しうる。そのような核酸分子の好ましい例は、ＳＮＰの５'の近位非変異配列と同じ配列を有する核酸分子である。「鋳型依存的な」伸長とは、伸長された配列が核酸鋳型の配列に相補的となるようにポリメラーゼがプライマーの伸長を媒介しうることをいう。「プライマー」とは、「鋳型依存的な」伸長反応でのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の共有結合付加により伸長されうる、一本鎖オリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドアナログ）または一本鎖ポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドアナログ）をいう。そのような能力を有するためには、プライマーは３'ヒドロキシル（またはポリメラーゼ媒介伸長に適した他の化学基）末端を有していなければならず、第二の核酸分子（すなわち、「鋳型」）にハイブリダイズされなければならない。プライマーは、（１）該プライマーの３'末端が目的とする標的ヌクレオチドの直ぐ近位となるように、標的分子の特定の領域に相補的な８塩基またはそれ以上の長さの独特の配列、および（２）特定かつ独特の長さ、物理的または化学的特性の中性成分からなる５'テール、からなる。最も好ましくはプライマーの相補的な領域は約２０塩基であるが、一層短いまたは一層長いプライマーでもよい。典型的には、プライマーの相補的な領域は約１２塩基から約２０塩基である。５'テールの中性成分は、ポリＴ、非塩基性残基等の、あらゆる非特異的でハイブリダイズしないポリマーまたは化学的基である。「ポリメラーゼ」とは、ある核酸分子が適当な鋳型核酸分子にハイブリダイズした場合に、ヌクレオシド三リン酸（または適当なアナログ）を導入することによって該核酸分子の３'ヒドロキシル基を伸長しうる酵素である。ポリメラーゼ酵素は、Watson，J.D.，In:Molecular Biology o f the Gene 、第３版、ベンジャミン、メンロ・パーク、カリフォルニア（１９７７）（参照のため本明細書中に引用する）および同様の出典において論じられている。他のポリメラーゼ、たとえば、「クレノウ」ポリメラーゼとして一般に知られる大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大きなタンパク質加水分解断片、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼなどもまた、本明細書に記載した方法を行うのに用いることができる。ＳＮＰの直ぐ３'の遠位非変異配列と同じ配列を有する核酸は、直ぐ５'の近位配列と同じ配列を有し鋳型依存的な仕方で１のヌクレオチドを伸長したプライマーに鋳型依存的な仕方でライゲートすることができる。Ｂ．遺伝子分析にＳＮＰを用いることの利点本発明の単一ヌクレオチド多型部位は、植物、動物、または微生物のＤＮＡを分析するのに用いることができる。そのような部位は、ヒトを含む哺乳動物、非哺乳動物、家畜（イヌ、ネコなど）、農場動物（ウシ、ヒツジなど）および他の経済的に重要な動物のゲノムを分析するのに適している。しかしながら、本発明の単一ヌクレオチド多型部位は他の種類の動物、植物、および微生物に関して用いることができる。ＳＮＰはＳＴＲやＶＮＴＲに比べて遺伝子分析において幾つかの際立った利点を有する。第一に、ＳＮＰはＳＴＲやＶＮＴＲに比べて一層高い頻度で（約１０〜１００倍高い）かつ一層均一に生じる。ＳＮＰの頻度が一層高いことは、ＳＮＰが他のクラスの多型に比べて一層容易に同定できることを意味する。その分布が一層均一であることは、目的とする特定の特質に「一層近くで」ＳＮＰを同定することを可能にする。これら２つの属性の組み合わせはＳＮＰを極めて価値あるものにする。たとえば、ある特定の特質（たとえば、癌への素因）がある特定の遺伝子座での変異を反映しているならば、該遺伝子座と関連したすべての多型を用いて、ある個人が該特質を示すようになる確率を予測することができる。そのような予測の価値は、一部は、多型と遺伝子座との間の拒理によって決定される。それゆえ、もしも遺伝子座がいかなる繰返しタンデムヌクレオチド配列モチーフからも離れているならば、ＶＮＴＲ分析はごく限られた価値しか有しないであろう。同様に、もしも遺伝子座がいかなる検出可能なＲＦＬＰからも離れているならば、ＲＦＬＰ分析は正確ではなくなるであろう。しかしながら、本発明のＳＮＰは哺乳動物ゲノム中の約３００塩基毎に存在し、しかも分布の均一性を示すので、ＳＮＰは統計的には、ある特定の遺伝子障害または変異の１５０塩基内に認められうる。実際、特定の変異は、それ自体、ＳＮＰであってよい。それゆえ、そのような遺伝子座の配列が決定されている場合には、該遺伝子座のヌクレオチドにおける変異は、問題となっている特質を決定するものとなる。第二に、ＳＮＰは他のクラスの多型に比べて一層安定である。その自然突然変異率は約１０^-9であり、ＶＮＴＲよりも約１,０００倍頻度が低い。確かに、ＶＮＴＲ型の多型は高変異率を特徴とする。第三に、ＳＮＰはさらに、そのアレル頻度を比較的少数の代表的な例についての研究から推論できるという利点を有する。これらのＳＮＰの属性は、ＲＦＬＰかまたはＶＮＴＲ多型のいずれかで可能なものに比べて、同一性、実父確定排除（paternity exclusion）、および特定の遺伝的特質に対する動物の素因の分析のはるかに高度な遺伝的解析を可能にする。第四に、ＳＮＰは、遺伝情報（ヌクレオチド位置および塩基の同定）の最も可能性の高い描写（definition）を反映している。そのように高度の描写を与えるにもかかわらず、ＳＮＰはＲＦＬＰまたはＶＮＴＲに比べて一層容易に、しかも一層高い柔軟性にて検出することができる。実際、ＤＮＡは二本鎖であるので、アレルの相補鎖を分析してＳＮＰの存在および同一性を確認することができる。同定したＳＮＰを特徴付ける際の柔軟性はＳＮＰの際立った特徴である。たとえば、ＶＮＴＲ型の多型は、多数の繰返し中の変異を識別しうるサイズ分画法により容易に検出できる。ＲＦＬＰは、サイズ分画についで制限消化することにより最も容易に検出できる。対照的に、ＳＮＰは様々な方法のいずれを用いても特徴付けることができる。そのような方法としては、該部位の直接または間接シークエンシング、該部位の各アレルが制限部位を生成または破壊する場合の制限酵素の使用、アレル特異的なハイブリダイゼーションプローブの使用、多型の異なるアレルによりコードされるタンパク質に特異的な抗体の使用、または他の生化学的解釈が挙げられる。 Goelet，P.らにより記載され（ＷＯ９２／１５７１２号、参照のため本明細書中に引用する）以下において論じる「ジェネティックビット分析（Genetic Bit Analysis）」（「ＧＢＡ」）法は、単一ヌクレオチド多型部位に存在するヌクレオチドを同定するための方法である。ＧＢＡは、標的ＤＮＡ配列中の変異の部位の周辺のヌクレオチド配列情報を用いて該標的ＤＮＡ中の可変ヌクレオチドに直ぐ隣接するが該ヌクレオチドを含まない領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーをデザインする、多型部位解明の方法である。標的ＤＮＡ鋳型を生物学的試料から選択し、インテロゲーションプライマーにハイブリダイズさせる。このプライマーを、１またはそれ以上の鎖停止ヌクレオシド三リン酸前駆体（または適当なアナログ）の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて単一の標識ジデオキシヌクレオチド（またはアナログ）により伸長させる。 Cohen，D.ら（ＰＣＴ出願ＷＯ９１／０２０８７号）は、遺伝子型決定のための他の関連法を記載しており、該方法によれば、所望の遺伝子座で配列を決定するためにジデオキシヌクレオチドを用いて単一のヌクレオチドにより単一のプライマーを伸長させる。Daleら（ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０９４５５）は、プライマーを単一のジデオキシヌクレオチド種とともに用いて「可変部位」の配列を決定するための方法を開示している。Daleらの方法はさらに、複数のプライマーの使用および分離要素の使用を開示している。Ritterband，M．ら（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１７６７６号）は、そのような標的分子を液体試料中で分離、濃縮および検出するための装置を記載している。Cheeseman，P.（米国特許第５,３０２,５０９号）は、一本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定する関連法を記載している。 Cheesemanの方法は、蛍光標識した３’保護ヌクレオチド三リン酸（各塩基は異なる蛍光標識を有する）を用いる。 Wallaceら（ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０４１４）は、アレル特異的なプライマーを用いることにより標的の複数の領域を同時に複製するのに用いることのできる複数のＰＣＲ法を記載している。アレル特異的なプライマーを用いることにより、特定のアレルが試料中に存在する場合にのみ増幅が起こる。ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための幾つかのプライマー先導ヌクレオチド導入法が記載されている（Komher，J.S．ら、Nucl ．Acids Res． 17:7779〜77 84(1989);Sokolov，B.P.、Nucl ．Acids Res． 18：3671(1990);Syvanen，A.-C. ら、Genomics 8:684〜692(1990);Kuppuswamy，M.N.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci ．(USA) 88:1143〜1147(1991);Prezant，T.R.ら、Hum ．Mutat． 1:159〜164(199 2);Ugozzoli，L.ら、GATA 9:107〜112(1992);Nyren，P.ら、Anal ．Biochem． 20 8 ：171〜175(1993)）。これら方法はすべて、多型部位の塩基を識別するために標識デオキシヌクレオチドを導入することに拠っている点でＧＢＡとは異なる。かかるフォーマットにおいて、シグナルは導入されたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドのラン（runs）で生じる多型はランの長さに比例するシグナルという結果となりうる（Syvanen，A.-C.ら、Amer ．J．Hum．Ge net． 52:46〜59(1993)）。かかる所定範囲の遺伝子座特異的シグナルは、とりわけヘテロ接合体の場合、ＧＢＡ法によって生成される単純な３成分（２：０、１：１または０：２）クラスのシグナルに比べて解釈が一層困難でありうる。さらに、ある種の遺伝子座においては、正しいジデオキシヌクレオチドの存在下でさえも正しくないデオキシヌクレオチドの導入が起こりうる（Komher，J.S.ら、Nucl ．Acids Res． 17:7779〜7784(1989)）。かかるデオキシヌクレオチドの誤導入は、幾つかの配列の状況ではミスペアしたデオキシ−基質に対するＤＮＡポリメラーゼのＫｍが、正しく塩基対形成したジデオキシ−基質の比較的小さなＫｍに匹敵することによる（Kornberg，A.ら、In:DNA Replication、第２版(1992) 、フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨーク；Tabor，S.ら、Proc ．Natl ．Acad．Sci．(USA) 86：4076〜4080(1989)）。この効果は、多型部位の解明においてバックグラウンドノイズに貢献する。そのような方法すべてとは対照的に、本発明の方法は、複数のＳＮＰに存在するヌクレオチドの決定を可能とするかまたは極めて容易にする。 II．新規な多型部位を発見する方法多型部位を発見するための好ましい方法は、多数の半数体ゲノムからのゲノムＤＮＡ断片の比較的な配列決定を含む。好ましい態様において、図１に示すように、そのような配列決定は、ある種の１つの成員からのＤＮＡの０．５〜３Ｋｂ断片を含むランダムゲノムライブラリーを調製することにより行う。ついで、これら組換え体の配列を用いて、該種のランダムに選択した多数の個体の同じゲノム遺伝子座でのＰＣＲ配列決定を容易にする。そのようなゲノムライブラリー（典型的に約５０,０００クローン）から数百（２００〜５００）の個々のクローンを精製し、その挿入物の末端の配列を決定する。クローニングした領域のＰＣＲ増幅を可能とするには、ごく少量の末端配列情報（１００〜２００塩基）が得られればよい。この配列決定の目的は、該種の他の成員のゲノムＤＮＡ試料からの同等の断片の増幅を媒介するのに適したプライマーの合成を可能とするのに充分な配列情報を得ることである。好ましくは、そのような配列決定は、サイクルシークエンシング法を用いて行う。これらプライマーを用いて標的種のランダムに選択した成員のパネルからのＤＮＡを増幅させる。パネル中の成員数は、単離すべき多型の最低の頻度を決定する。それゆえ、もしも６の成員を評価するならば、たとえば０．０１の頻度で存在する多型は同定されないかもしれない。例示的だが単純化しすぎた数学的扱いにおいて、６の成員のサンプリングでは約０.０８（すなわち、１.０の全頻度割る６成員割るゲノム当たり２アレル）を超える頻度で起こる多型のみが同定されることが予測される。それゆえ、一層低い頻度の多型の同定を望むなら、より多数のパネル成員を評価しなければならない。サイクル配列分析（Mullis，K.ら、Cold Spring Harbor Symp ．Quant．Biol． 51 :263〜273(1986)；Erlich H.ら、ヨーロッパ特許出願第50,424号；ヨーロッパ特許出願第84,796号、ヨーロッパ特許出願第258,017号、ヨーロッパ特許出願第2 37,362号；Mullis，K.、ヨーロッパ特許出願第201,184号；Mullis，K.ら、米国特許第4,683,202号；Erlich，H.、米国特許第4,582,788号；Saiki，R.ら、米国特許第4,683,194号）は、自動ＤＮＡシークエンシング装置およびソフトウエア（Applied Biosystems，Inc.）を用いることにより容易になる。そのようにして、コンピュータースクリーン上のクロマトグラムの関連部分を調べることにより、異なる動物の配列間の差異を同定し、確認することができる。差異は、両鎖にtuいてデータが得られ、試験した動物の集団の中で１を超える半数体例で存在する場合にのみ、ＤＮＡ多型を反映していると解釈される。図２は、ランダムゲノム断片のサイクルシークエンシングである、新規な多型配列を同定するための好ましい方法を示す。動物からのＰＣＲ断片をアクリルアミドゲルから電気溶出し、ｄＮＴＰおよび蛍光標識または化学的に標識したｄｄＮＴＰの混合物の存在下での熱安定ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの繰返しサイクルを用いて配列決定する。ついで、生成物を分離し、Applied Biosystems，Inc.の自動ＤＮＡシークエンシング装置を用いて分析する。得られたデータをＡＢＩソフトウエアを用いて分析する。異なる動物の配列間の差異は、該ソフトウエアにより同定され、コンピュータースクリーン上のクロマトグラムの関連部分を調べることにより確認される。差異は、両鎖についてデータが得られ、試験した５匹のウマで１を超える半数体例に存在する場合にのみ、「ＤＮＡ多型」として表される。最上段のパネルは「Ａ」ホモ接合体を示し、中段のパネルは「ＡＴ」ヘテロ接合体を示し、最下段のパネルは「Ｔ」ホモ接合体を示す。別のやり方として、多型部位の発見は図３に示す戦略を用いて行うことができる。この態様では、ＤＮＡ配列多型は、関連のない成員のゲノム鋳型からのｐＣＲ反応の生成物に対して幾つかの制限酵素のパネルを作用させて得られた制限エンドヌクレアーゼ開裂プロフィールを比較することにより同定する。最も好ましくは、使用する各制限エンドヌクレアーゼは４塩基認識配列を有しており、それゆえ、増幅生成物中で所望の数の切断が可能となるであろう。ゲノムＤＮＡから得られた制限消化パターンを、対応プラスミド鋳型を用いて得られたＰＣＲ生成物から得られたパターンと直接比較する。そのような比較は、ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡからの増幅配列が同等の遺伝子座からのものであることを示す内部対照を提供する。この対照はまた、繰返し配列またはマルチコピー遺伝子座を偶然に増幅させたプライマーの同定を可能にする。なぜなら、これらはプラスミド鋳型からよりもゲノムＤＮＡ鋳型からの方がより多くの断片を生成するであろうからである。 III．本発明の単一ヌクレオチド多型の遺伝子型を決定する方法本発明の単一ヌクレオチド多型の多型部位「Ｘ」を同定するために、様々な方法のいずれをも用いることができる。そのような同定の好ましい方法は、分析した各多型について多型の配列を直接確認することを含む。それゆえ、このアプローチは、多型の特定の配列よりもむしろバンドのパターンを分析するＲＦＬＰ法とは著しく異なる。Ａ．増幅ベースの分析ＤＮＡ試料中の多型部位の検出は、ＤＮＡ増幅法を用いることにより容易になる。そのような方法は、多型部位にまたがる配列、または多型部位と該部位の遠位かまたは近位に位置する配列とを含む配列の濃度を特異的に増加させる。そのようにして増幅した分子は、ゲル電気泳動その他の手段により容易に検出できる。そのような増幅を達成するための最も好ましい方法では、その二本鎖形態において多型を定める近位配列にハイブリダイズしうるプライマーペアを用いたＰＣＲを採用する。ＰＣＲの代わりに「リガーゼ連鎖反応」（「ＬＣＲ」）などの別法を用いることができる（Barany，F. Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 88:189〜193(1991) ）。ＬＣＲでは、２対のオリゴヌクレオチドプローブを用いて特定の標的を指数関数的に増幅させる。各オリゴヌクレオチドペアの配列は、該ペアが標的の同鎖上の隣接する配列にハイブリダイズできるように選択する。そのようなハイブリダイゼーションは、鋳型依存性のリガーゼの基質を形成する。ＰＣＲと同様に、かくして得られた生成物はその後のサイクルの鋳型として働き、所望の配列の指数関数的な増幅が得られる。本発明に従って、ＬＣＲは多型部位の同鎖上の近位配列および遠位配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。一つの態様において、いずれかのオリゴヌクレオチドが多型の実際の多型部位を含むようにデザインされるであろう。そのような態様において、反応条件は、標的分子が該オリゴヌクレオチド上に存在する多型部位に相補的な特定のヌクレオチドを含むかあるいは欠失している場合にのみオリゴヌクレオチドが一緒にライゲートしうるように選択する。別の態様において、オリゴヌクレオチドは多型部位を含まず、それらが標的分子にハイブリダイズしたときには「ギャップ」が生成されるであろう（Segev，D .ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０１０６９参照）。ついで、このギャップは、相補的なｄＮＴＰにより（ＤＮＡポリメラーゼにより媒介される）、または別のオリゴヌクレオチドペアにより充填される。それゆえ、各サイクルの終わりには各一本鎖は次のサイクルにおいて標的として働きうる相補鎖を有し、所望の配列の指数関数的な増幅が得られる。「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（「ＯＬＡ」）」（Landegren ，U.ら、Science 241:1077〜1080(1988)）はＬＣＲとある種の類似点を有し、多型分析に使用すべく適合させることができる。ＯＬＡプロトコールでは、標的一本鎖の隣接配列にハイブリダイズしうるようにデザインした２つのオリゴヌクレオチドを用いる。ＬＣＲと同様にＯＬＡは点変異の検出に特に適している。しかしながら、ＬＣＲとは異なり、ＯＬＡでは標的配列の指数関数的な増幅ではなく「直線的な」増幅が得られる。 Nickerson，D.A.らは、ＰＣＲとＯＬＡとの属性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載している（Nickerson，D.A.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A)87: 8923〜8927(1990)）。この方法では、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成するためにＰＣＲを用い、ついで該標的ＤＮＡをＯＬＡを用いて検出する。複数かつ別々の処理工程が必要であることに加えて、このような組み合わせに付随する一つの問題は、それがＰＣＲおよびＯＬＡに付随する全ての問題を継承していることである。２つの（またはそれ以上の）オリゴヌクレオチドをその結果得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下でライゲーションさせ、それによって該ジオリゴヌクレオチドを増幅させる方式もまた知られており(Wu，D.Y.ら、Genomics 4:560(1989))、本発明の目的のために容易に適合させることができる。他の知られた核酸増幅法、たとえば、転写ベースの増幅系（Malek，L.T.ら、米国特許第5,130,238号；Davey，C.ら、ヨーロッパ特許出願第329,822号； Schusterら、米国特許第5,169,766号；Miller，H.I.ら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００；Kwoh，D.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 86:1173(1989)；G ingeras，T.R.ら、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５）または等温増幅法（Walke r，G.T.ら、Proc ．Natl．Acad．Sic．(U.S.A.) 89:392〜396(1992)）もまた用いることができる。Ｂ．一本鎖ＤＮＡの調製本発明におけるＳＮＰの配列の直接分析は、「サンガー法」としても知られる「ジデオキシ媒介鎖停止法」（Sanger，F.ら、J ．Molec．Biol． 94：441(1975) ）かまたは「マクサム−ギルバート法」としても知られる「化学分解法」（Maxa m，A.M.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 74:560(1977)）（両文献を参照のため本明細書中に引用する）のいずれかを用いて行うことができる。ジデオキシ媒介法かまたはマクサム−ギルバート法のいずれかを用いてＤＮＡの配列を決定する方法は当業者には広く知られている。そのような方法は、たとえば、Samb rook，J.ら、Molecular Cloning ，A Laboratory Manual、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）およびZyskind，J.W.ら、Recombinant DNA Laboratory Manual、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８８）（両文献を参照のため本明細書中に引用する）に開示されている。核酸試料が二本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含む場合、または二本鎖核酸増幅プロトコール（ＰＣＲなど）を用いる場合には、二本鎖のうちの一方の鎖に富む、好ましくは優先的に一方の鎖のみを含む調製物が得られるように二本鎖分子を処理した後にそのような配列分析を行うのが一般に望ましい。しかしながら、熱安定性のポリメラーゼを使用し、反応液を１回かまたはそれ以上加熱および冷却するならば、本発明では一本鎖ＤＮＡ鋳型を生成する必要はない。この処理により、二本鎖の鋳型がその相補鎖から分離され、その後の冷却工程でインテロゲーションプライマーとアニールさせることができる。他の鋳型鎖によるハイブリダイゼーションへの競合は、融解−冷却条件の繰返しサイクルにより補償できる。二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ分子を生成するための最も簡単な方法は、熱かまたはアルカリ処理のいずれかを用いた変性である。一本鎖ＤＮＡ分子はまた、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３を用いて生成することができる（Messin g，J.ら、Meth ．Enzymol． 101:20(1983);Sambrook，J.らのMolecular Cloning ．A Laboratory Manual 、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）をも参照）。一本鎖ＤＮＡ分子を生成するために幾つかの別法を用いることができる。 Gyllensten，U.ら(Proc ．Natl．Acad．Sci．(USA) 85：7652〜7656(1988))およびMihovilovic，M.ら(BioTechniques 7(1)：14(1989)）は、「非対称ＰＣＲ」と称する方法を記載しており、この方法では異なるモル濃度で存在するプライマーを用いて標準「ＰＣＲ」法を行う。Higuchi，R.G.ら（Nucl ．Acids Res．17:586 5(1985)）は、一本鎖増幅生成物を生成するための別の方法を例示している。この方法は、二本鎖増幅生成物の一方の鎖の５'末端をリン酸化し、ついで５'→３ 'エキソヌクレアーゼ（Ｔ７エキソヌクレアーゼなど）にリン酸化鎖を優先的に分解させることを内容とする。他の方法はまた、一本鎖ＤＮＡ分子を生成させるためにホスホロチオエート誘導体のヌクレアーゼ耐性特性を利用している（Benkovicら、米国特許第4,521,50 9号;Sayers，J.R.ら、Nucl ．Acids Res． 16:791〜802(1988);Eckstein，F.ら、Biochemistry 15:1685〜1691(1976);Ott，J.ら、Biochemistry 26:8237〜8241(1 987)）。そのような一本鎖分子を生成する方法の相対的な利点および不利な点に関する議論は、Nikiforov，T.（米国特許出願第08/005,061号（出願は１９９４年６月２４日に放棄）、参照のため本明細書中に引用する）により記載されている。最も好ましい態様では、ホスホロチオエート誘導体をプライマーに含ませる。ヌクレオチド誘導体はプライマーのいずれの位置にも導入することができるが、好ましくはプライマーの５'末端に、最も好ましくは互いに隣接して導入されるであろう。好ましくは、プライマー分子は長さが約２５ヌクレオチドの相補的領域を有し、（全残基と比較して）約４％〜約１００％、さらに好ましくは約４％〜約４０％、最も好ましくは約１６％のホスホロチオエート残基を含むであろう。これらヌクレオチドはプライマーのいずれの位置に導入してもよく、互いに隣接していてよく、またはプライマーの全体または一部に散在していてよい。一つの態様において、本発明は増幅プロトコール、たとえばＰＣＲとともに用いることができる。この態様では、非修飾プライマーの場合に確立されているＰＣＲプロトコールを変えることなく上記プライマーを用いることができるように、プライマーのホスホロチオエート結合の数は約１０（プライマーの長さの約半分）に制限するのが好ましい。プライマーがそれ以上のホスホロチオエート結合を含む場合には、反応条件を最適化するためにＰＣＲ条件はとりわけアニーリング温度に関して調整する必要がある。そのようなヌクレオチド誘導体のＤＮＡまたはＲＮＡ中への導入は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に行うことができる（Vosberg，H.P.ら、Biochemistr y 16:3633〜3640(1977)；Burgers，P.M.J.ら、Ｊ．Biol．Chem．254:6889〜6893 (1979)；Kunkel，T.A.ら、In:Nucleic Acids and Molecular Biology Vol．2,12 4〜135(Eckstein，F.ら編)、シュプリンガー−フェアラーク、ベルリン(1988)； Olsen，D.B.ら、Proc ．Natl．Acad．Sic．(U.S.A.) 87:，1451〜1455(1990)；Gr iep，M.A.ら、Biochemistry 29:9006〜9014(1990)；Sayers，J.R.ら、Nucl ．Aci ds Res． 16：791〜802(1988)）。別法として、ホスホロチオエートヌクレオチド誘導体は合成によりオリゴヌクレオチド中に導入することができる（Zon，G．Anti-Canc ．Drug Des． 6:539〜568(1991)）。プライマー分子は相補的な標的核酸分子にハイブリダイズし、ついで好ましくはポリメラーゼにより伸長して伸長生成物を形成することができる。プライマー中のホスホロチオエートヌクレオチドの存在は、伸長生成物をヌクレアーゼ攻撃に対して耐性にする。指摘されるように、ホスホロチオエートまたは他の適当なヌクレオチド誘導体を含む増幅生成物はＴ７エキソヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼなどの「５'→３'」エキソヌクレアーゼによる「排除」（すなわち、分解）に対して実質的に耐性であり、それゆえ、５'→３'エキソヌクレアーゼがホスホロチオエート残基のところへきたときには該エキソヌクレアーゼは核酸分子をそれ以上、実質的に分解することができないであろう。標的分子はヌクレアーゼ耐性残基を欠くので、伸長生成物およびその鋳型（標的）を５'→３'エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートすると鋳型鎖の破壊という結果となり、それにより所望の一本鎖の優先的な生成が達成される。Ｃ．溶液中でのＤＮＡのハイブリダイゼーション多型の多型部位の同一性を決定するための好ましい方法は核酸ハイブリダイゼーションを含む。そのようなハイブリダイゼーションは固相上でも行うことができるが（Saiki，R.K.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．(U.S.A.) 86:6230〜6234(198 9)；Gilhamら、J ．Amer．Chem．Soc． 86:4982(1964)およびKrembskyら、Nucl ． Acids Res． 15:3131〜3139(1987)）、溶液中でハイブリダイズさせるのが好ましい（Berk，A.J.ら、Cell 12:721〜732(1977)；Hood，L.E.ら、In:Molecular B iology of Eukaryotic Cells:A Problems Approach 、メンロ・パーク、カリフォルニア：ベンジャミン−カミングス(1975)；Wetmer，J.G．Hybridization and R enaturation Kinetics of Nucleic Acids ． Ann ．Rev．Biophys．Bioeng． 5:33 7〜361(1976)；Itakura，K.ら、Ann ．Rev．Biochem．53:323〜356(1984)）。高容量試験に応用するには、非放射性の検出法を用いるのが望ましい。それゆえ、蛍光標識したまたはハプテン化した（haptenated）ジデオキシヌクレオチドを使用するのが好ましい。ビオチン化ｄｄＮＴＰの使用は、４つの各（３−アミノプロピン−１−イル）ヌクレオシド三リン酸をスルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートと反応させることにより調製するのが好ましい。その際、（３−アミノプロピン−１−イル）ヌクレオシド５'−三リン酸は、H obbs，F.W.により（J ．Org．Chem． 54:3420〜3422(1989)）およびHobbs，F.W．らにより（米国特許第5,047,519号）記載されたようにして調製する。Ｄ．多型部位の分析１．ポリメラーゼ媒介分析本発明の多型部位のヌクレオチドの同一性は、たとえば、Goelet，P.らにより開示された核酸配列変異のオリゴヌクレオチドベース診断アッセイの変法（ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５７１２、参照のため本明細書中に引用する）を用いて決定できる。とりわけ、本発明は、複数のＳＮＰの同時または同時に近い分析を可能または容易にするという点で米国特許出願第０８／２１６,５３８号（参照のため本明細書中に引用する）に記載されたＳＮＰの分析法に対して改良をもたらすものである。そのような進歩を達成するため、本発明は好ましくは、標的分子に溶液中でハイブリダイズしうる所定の配列を有する１またはそれ以上の精製したインテロゲーションオリゴヌクレオチドを用いる。「インテロゲーションオリゴヌクレオチド」とは、一般に、１またはそれ以上の単一ヌクレオチド多型の直ぐ近位または遠位の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをいう。好ましい態様において、標的分子の特定の領域に相補的な配列を有する１またはそれ以上のインテロゲーションオリゴヌクレオチドプライマーを上記方法を用いて調製する。好ましくは、プライマーは標的分子の特定の領域に相補的な約１２〜２０塩基を有する。これらオリゴヌクレオチドプライマーは、各プライマーの３'末端が目的とする標的ヌクレオチド（ＳＮＰなど）の直ぐ近位となるように標的分子にハイブリダイズする。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、中性成分（たとえば、ポリＡ、非塩基性残基、または他の非特異的でハイブリダイズしないポリマーまたは化学標識）からなる５'テールを含む。最も好ましい態様において、中性成分は特定の独特の長さが割り当てられる。プライマーは、プライマー特異的な標識を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。しかしながら、最も好しい態様においてはオリゴヌクレオチドプライマーはプライマー特異的な標識を含む。ついで、インテロゲーションプライマーを、１またはそれ以上の単一ヌクレオチド多型を有する標的ＤＮＡ分子（好ましくはゲノムＤＮＡ分子）（各ＳＮＰについてその直ぐ３'の遠位配列はインテロゲーションプライマーと相補的である）、ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖停止ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）三リン酸誘導体の存在下でインキュベートする。好ましくは、そのようなインキュベーションは、ｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の完全な不在下だが１またはそれ以上の鎖停止ヌクレオチド三リン酸誘導体（またはアナログ）（たとえば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰなど）のみの存在下、該プライマーの３'末端への該誘導体の単一塩基導入が可能な条件下にて行う。反応液中に未導入のヌクレオチド三リン酸が存在することは反応にとって重要ではないが、そのような未導入のヌクレオチドは幾つかの手段により分離することができる。導入したヌクレオチドの同一性は、多型の多型部位のヌクレオチドにより決定され、該ヌクレオチドに相補的である。本発明において非伸長性のヌクレオチドは、好ましくは³²Ｐまたは蛍光分子で標識してよい。本発明に適した他の標識としては、これらに限られるものではないが、ビオチン、イミノビオチン、ハプテン、抗原、補因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子密度の高い（el ectron dense）分子、不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素が挙げられる。本発明に適した蛍光分子としては、これらに限られないが、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ４１およびＢＯＤＩＰＹが挙げられる。本発明に適した電子密度指示薬（electron dense indic ator）分子としては、これらに限られるものではないが、フェリチン、ヘモシアニンおよびコロイド状金が挙げられる。検出可能なポリペプチドは、検出可能なポリペプチドを、指示薬分子に共有結合した第二のポリペプチドと特異的に複合体を形成させることにより間接的に検出可能であってよい。そのような態様において、検出可能なポリペプチドはアビジンおよびストレプトアビジンよりなる群から選ばれるのが好ましく、第二のポリペプチドはビオチンおよびイミノビオチンよりなる群から選ばれるのが好ましい。好ましい態様において、得られた伸長したプライマーを適当なマトリックス上で分析するために分離する。伸長したプライマーを分析のために分離するために、多くの方法のいずれをも用いることができる。そのような方法としては、これらに限られるものではないが、マススペクトロメトリー、（オリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーション）フローサイトメトリー、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる。好ましくは、伸長したプライマーは変性条件下で分離される；しかしながら、変性条件は有効な分離のためには必要とされない。非伸長性のヌクレオチドとは、鋳型依存的な仕方で導入されうる、合成または天然に存在するヌクレオチドアナログをいう。本発明において使用するのに適した合成または天然に存在するヌクレオチドアナログとしては、これらに限られるものではないが、非環状リボースヌクレオチドアナログ、置換リボースヌクレオチドアナログ、および修飾リボースヌクレオチドアナログが挙げられる。合成ヌクレオチドアナログは、好ましくは、フルクトースベースのヌクレオチドアナログ、天然のヌクレオチドと特異的に塩基対形成する能力を保持した化学的修飾プリン、天然のヌクレオチドと特異的に塩基対形成する能力を保持した化学的修飾ピリミジン、および天然のヌクレオチドと特異的に塩基対形成する能力を保持したあらゆる化合物よりなる群から選ばれる。最も好ましい態様において、伸長したプライマーの分離は、適当なアクリルアミド濃度を有する標準シークエンシングゲルなどの変性サイズ分離マトリックス上で行う。この態様では、特定の独特の長さの５'テールを含むインテロゲーションプライマーを用いる。伸長したプライマーは、特定の独特の長さの５'テールに基づいて識別分離される。好ましい態様では標識した鎖停止ヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）を用いるが、本態様はまた識別標識したインテロゲーションプライマーをも指向するものである。一つの亜態様では識別標識した鎖停止ヌクレオチド（すなわち、ジデオキシヌクレオチド）を用いる。別の亜態様では、単一の鎖停止ヌクレオチドのみを標識した、１またはそれ以上の鎖停止ヌクレオチドを用いる。他の好ましい態様では、固相上に配置した相補的な配列にハイブリダイズしうる独特かつ特定の配列を含むインテロゲーションプライマーを用いる。この態様では、インテロゲーションプライマーを配置された捕捉プライマーに暴露し、固相捕捉プライマーアレイ上での位置に基づいて標識塩基を検出することにより各単一ヌクレオチド多型を同定することで分離される。別の態様においては、得られた伸長したプライマーは適当なアフィニティー分離法を用いて分離される。そのようなアフィニティー分離法は、一般に、レセプター−リガンド法（たとえば、アビジン−ストレプトアビジンなど）、モノクローナル抗体法などと関係する。この態様では、各プライマーの５'末端を、対応の独特のレセプターが存在する独特のリガンドに結合させる。この態様では、レ七プターを固相表面（すなわち、ビーズ、カラム、ディップスティック、マイクロタイタープレートなど）に固定化するのが好ましい。リガンド標識したプライマーは、反応混合物を対応レセプターに暴露することにより分離される。ついで、上記方法を用いて各単一ヌクレオチド多型の同一性を決定することができる。他の態様では、独特のサイズの残基（たとえば、ＢＳＡ、リゾチーム、卵アルブミンなど）に（共有結合かまたは他の仕方で）結合させたプライマーを用いる。この態様では、独特のサイズのプライマーは、適当なサイズ排除クロマトグラフィーカラムに該プライマーを通し、上記方法を用いて各単一ヌクレオチド多型の同一性を決定することにより分離される。また、本発明において上記方法を組み合わせて用いることにより単一の反応で同定できるＳＮＰの数を増加させることもできる。本発明において使用するのに適した標識としては、これらに限られるものではないが、酵素（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、放射性同位体（すなわち、³²Ｐ、¹³Ｃ、³Ｈなど）、蛍光残基（すなわち、フルオレセイン、ローダミンなど）、色原体が挙げられる。プライマーは直接標識することもできるし、または標識されているかまたは標識されていない別個のリガンドに結合させることもできる。リガンド分子はオリゴヌクレオチドプライマーに、共有結合、イオン性相互作用、非特異的吸着、または特異的だが非共有結合性のリガンド− レセプター相互作用により結合させることができる。リガンドとは、一般に、対応の別個のレセプターが存在する所定のタンパク質または化学物質をいう。本発明に使用するのに適したリガンドとしては、これらに限られるものではないが、ハプテン、抗原、補因子、ビオチン、イミノビオチン、ジニトロフェノール、リボ酸、オレフィン化合物、オリゴヌクレオチド、相補的なオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインしたタンパク質核酸（「ＰＮＡ」）配列、およびレセプターとして機能するＰＮＡ配列が挙げられる。本発明に使用するのに適した他のリガンドとしては、これらに限られるものではないが、抗体、酵素、ポリペプチド、ストレプトアビジンおよびアビジンが挙げられる。一つの態様において、リガンドは検出可能に標識したポリペプチドと結合することにより複合体を形成することができる。本発明に使用するのに適した検出可能な標識としては、これらに限られるものではないが、抗体、不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素、ストレプトアビジンおよびアビジンが挙げられる。好ましくは、検出可能に標識したポリペプチドは、ランダムに生成したポリペプチドライブラリーから選択する。レセプターとは、一般に、対応のリガンドが存在する所定のタンパク質または化学物質をいう。本発明に使用するのに適したレセプターとしては、これらに限られるものではないが、抗原、補因子、ビオチン、イミノビオチン、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、オリゴヌクレオチド、相補的なオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインしたＰＮＡ配列、およびリガンドとして機能するＰＮＡ配列が挙げられる。一つの態様において、レセプターは検出可能に標識したポリペプチドと結合することにより複合体を形成することができる。本発明に使用するのに適した検出可能な標識としては、これらに限られるものではないが、抗体、不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素、ストレプトアビジンおよびアビジンが挙げられる。好ましくは、検出可能に標識したポリペプチドは、ランダムに生成したポリペプチドライブラリーから選択する。レセプターはマトリックスに結合させてよい。レセプターをマトリックスに結合させる適当な方法としては、これらに限られるものではないが、共有結合、イオン性相互作用、非特異的吸着、または特異的だが非共有結合性のリガンド−レセプター相互作用が挙げられる。本発明に使用するのに適したリガンド−レセプタ一としては、これらに限られるものではないが、相補的なハイブリダイズする核酸、相補的なハイブリダイズするＰＮＡ、および他の相補的な合成核酸アナログが挙げられる。好ましい態様では検出に先立って伸長したプライマーを分離するが、本発明はまたプライマーを分離することなくＳＮＰを同定するために用いることができる。この態様では、（オリゴヌクレオチドの標識によるか、またはオリゴヌクレオチドが標識されないことにより）ヌクレオチドのインテロゲーションプライマーへの付加を検出できるように、少なくとも一つの鎖停止ヌクレオチド三リン酸誘導体を独特に標識する。それゆえ、たとえば、３つの異なるＳＮＰを解明するために３つのプライマーを標識ｄｄＡＴＰの存在下で用いた場合には、そのような標識の導入はＳＮＰの１つがＴであることを示すものである。プライマー特異的標識および導入したヌクレオチドによるプライマーの同定は、標的分子の遺伝子型決定を可能にする。それゆえ、多型部位のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドのセットのうちのいずれがプライマー依存性ポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドの３'末端に導入されたかをアッセイすることにより決定される。非伸長性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、多くの物理的または化学的方法のいずれによっても同定できる。しかしながら、好ましい物理的または化学的手段は、偏光分光分析、質量分光分析、赤外分光分析、紫外分光分析、可視光分光分析またはＮＭＲ分光分析よりなる群から選ばれる。本発明は複数のＳＮＰを単一の反応にて同定する方法を指向するものであるが、本発明はまた、複数のＳＮＰの同定を単一の反応にて確認することもできる。この態様では、標的核酸のプラス鎖およびマイナス鎖の両方について各ＳＮＰの同一性を上記のようにして決定する。その配列は、分析した各ＳＮＰについてプラス鎖およびマイナス鎖が相補的である場合に確認される。２．ポリメラーゼ／リガーゼ媒介分析別の態様において、多型部位のヌクレオチドはポリメラーゼ／リガーゼ媒介法を用いて同定される。上記態様と同様に、複数のＳＮＰを同じ反応にて検出するために複数のオリゴヌクレオチドプライマーを同時に用いる。上記態様と同様に、ＳＮＰの直ぐ３'の遠位非変異配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。分析すべき多型の５'近位配列に相補的だが該オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズできない第二のオリゴヌクレオチドを用いる。これらオリゴヌクレオチドを、分析すべき単一ヌクレオチド多型を含むＤＮＡ、および少なくとも１つの２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でインキュベートする。このインキュベーション反応液はさらにＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む。それゆえ、両オリゴヌクレオチドは、分析すべき単一ヌクレオチド多型の同じ鎖にハイブリダイズすることができる。配列の考慮により、これら２つのオリゴヌクレオチドは、多型の多型部位（Ｘ）をフランキングしているＳＮＰの近位および遠位配列にハイブリダイズするようになる；それゆえ、これらハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、多型部位の正確な位置で単一ヌクレオチドの「ギャップ」により隔てられている。ポリメラーゼおよび（Ｘ）に相補的な２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸の存在により、該相補的な２'，５'−デオキシヌクレオチド三リン酸で伸長したプライマーと遠位配列に相補的なハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとのライゲーションが可能となり、多型のヌクレオチドに相補的な２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸はライゲートしうる基質を生成させる。ついで、「ギャップ」の向かい側にある多型部位の同一性は、幾つかの手段のいずれによっても決定することができる。好ましい態様では、反応の２',５'− デオキシヌクレオチド三リン酸を標識しておき、その検出により多型部位の相補的ヌクレオチドを同定する。幾つかの異なる２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸が存在していてよく、それぞれ異なって標識する。別法として、別々の反応を行い、各反応で異なる２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸を用いる。別の亜態様において、２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸は標識せず、第二の可溶性のオリゴヌクレオチドを標識する。別々の反応を行い、各反応で異なる２',５'−デオキシヌクレオチド三リン酸を用いる。上記態様は単一の多型部位の検出のためのポリメラーゼ／リガーゼ媒介法を詳述するものであるが、この方法は複数の多型部位の検出のための複数の独特のオリゴヌクレオチドプライマーの同時使用を採用できることが一般的に理解されるであろう。Ｅ．シグナル増幅核酸ハイブリダイゼーション検出アッセイの感度は、検出を観察者に報告ないしシグナル伝達する仕方を変えることにより高めることができる。それゆえ、たとえば、アッセイ感度は検出可能に標識した試薬を使用することにより高めることができる。この目的のため、広範囲のそのようなシグナル増幅法がデザインされている。Kourilskyら（米国特許第4,581,333号）は、酵素標識を用いて検出アッセイの感度を高めることを記載している。蛍光標識（Albarellaら、ＥＰ14491 4号）、化学標識(Sheldon IIIら、米国特許第4,582,789号；Albarellaら、米国特許第4,563,417号）、修飾塩基（Miyoshiら、ＥＰ119448号）なども、ハイブリダイゼーションを観察する効率を改良する努力の中で用いられている。導入されたヌクレオチドの同一性を適当な検出装置を用いて自動または半自動の仕方で決定しうるように、蛍光または色原体（とりわけ、酵素）標識を用いるのが好ましい。ＩＶ．遺伝子分析の方法におけるＳＮＰ遺伝子型決定の使用Ａ．遺伝子分析に単一ヌクレオチド多型を用いるに際しての一般的考察本発明の多型部位の有用性は、そのような部位が、２つの個体が所定の多型に対して同じアレルを有するであろう統計的な確率を予測するのに用いることができることに基づく。ＳＮＰの統計的分析は、様々な目的のいずれに対しても用いることができる。ある特定の個体が以前に試験されている場合には、そのような試験は「フィンガープリント」として用いることができ、これはある特定の個体の同一性を決定するのに用いることができる。ある特定の個体の推定の親あるいは両方の親を試験した場合には、本発明の方法は、ある特定の動物がそのような親あるいは両方の親の子孫であるかないかの見込みを決定するのに用いることができる。それゆえ、ＳＮＰの検出および分析は、ある特定の個体に対してあるオスの父性（paternity）（ある特定の子供の父親の実父確定など）を排除したり、またはある特定の個体がある選ばれたメス（ある特定の子供とある選ばれた母親など）の子孫である確率を評価するのに用いることができる。以下に示すように、本発明は標的種の遺伝子地図の構築を可能にする。それゆえ、そのような遺伝病、状態、または特質へのある特定の動物（または植物）の素因を予測するため、本発明の方法により同定した多型の特定のアレイを特定の特質と関連付けることができる。本明細書において「特質」とは、「遺伝病」、「状態」、または「特性」を包含することを意図するものである。「遺伝病」とは、検出しうるか否かまたは無症候性であるか否かにかかわらず、変異によって引き起こされる病理学的状態をいう。「状態」とは、特性（喘息、弱い骨、盲目、潰瘍、癌、心臓または心血管系の疾患、骨格−筋の欠陥など）への素因をいう。「特性」は、植物または動物に経済的価値を付与する属性である。特性の例としては、寿命、スピード、耐久性、加齢の速度、生殖能力などが挙げられる。Ｂ．同定および親であることの確認同定および父性試験システムの効力を決定する最も有用な測定値は、（i）「同一性の確率（probability of identity）（ｐ(ＩＤ)）」および（ii）「排除の確率（probability of exclusion）（ｐ(ｅｘｃ)）」である。ｐ(ＩＤ)は、２つのランダムな個体が所定の多型マーカーに関して同じ遺伝子型を有するであろう見込みを計算するものである。ｐ(ｅｘｃ)は、所定の多型マーカーに関して、ランダムなオスが母親の同一性が問題でない平均的な実父確定ケースにおいて父親であることと両立しない遺伝子型を有するであろう見込みを計算するものである。単一の遺伝子座（主要組織適合領域などの多数のアレルを有する遺伝子座を含む）が実父確定試験について適切な統計的信頼性のある試験を提供することは稀であるので、所望の試験は好ましくは複数の連関していない遺伝子座を平行して測定するであろう。同一性または非同一性の累積確率、および父性排除の累積確率は、各遺伝子座により与えられる確率を掛けることにより、これら複数遺伝子座試験について決定される。最も興味のもたれる統計的測定値は、（i）非同一性の累積確率（cump(nonID) ）、および（ii）父性排除の累積確率（cump(exc)）である。これらの確率の値を計算するのに用いる式は下記に示す。簡単のため、これらはまず２アレル遺伝子座に対して与えられ、一つのアレルはＡ型と称し、他方はＢ型と称する。そのようなモデルでは４つの遺伝子型が可能である：ＡＡ、ＡＢ、ＢＡおよびＢＢ（ＡＢ型およびＢＡ型は生化学的には区別することができない）。アレルの頻度は、半数体ゲノム中に見出されるＡの回数（f(A)、Ａの頻度は「ｐ」で表される）またはＢの回数（f(B)、Ｂの頻度は「ｑ」（ここで、ｑ＝１ −ｐである）で表される）によって与えられる。所定の遺伝子型座における所定の遺伝子型の確率は下記のように示される：ホモ接合体：p(AA)＝p² 単一のヘテロ接合体：p(AB)＝p(BA)＝pq＝p(1-p) 両方のヘテロ接合体：p(AB+BA)＝2pq＝2p(1-p) ホモ接合体：p(BB)＝q²＝(1-p)² ある遺伝子座における同一性の確率（すなわち、ある集団からランダムに取り出した２つの個体が所定の遺伝子座で同一の遺伝子型を有するであろう確率）は、等式： p(ID)＝(p²)²＋(2pq)²＋(q²)² で与えられる。それゆえ、ｎ個の遺伝子座に対する同一性の累積確率は、等式：で与えられる。ｎ個の遺伝子座に対する非同一性の累積確率（すなわち、ある集団からランダムに取り出した２つの個体が１またはそれ以上の遺伝子座で異なるであろう確率）は、等式： cum p(nonID)＝１−cum p(ID) で与えられる。父性排除の確率（ランダムなオスが所定の遺伝子座に関して母親の同一性が問題でない平均的な実父確定ケースにおいてオス親であることと両立しない遺伝子型を有するであろう確率を示す）は、等式： p(exc)＝pq(1−pq) で与えられる。非排除の確率（所定の遺伝子座でランダムなオスが平均的な実父確定ケースにおいてオス親として生化学的に排除されないであろう確率を表す）は、等式： p(non-exc)＝１−p(exc) で与えられる。それゆえ、非排除の累積確率（ｎ個の遺伝子座を用いたときに得られる値を表す）は、である。排除の累積確率（ｎ個の遺伝子座のパネルを用い、ランダムなオスが母親が問題とならない平均的な実父確定ケースにおいてオス親として生化学的に排除されるであろう確率を表す）は、等式： cum p(exc)＝１−cump(non-exc) で与えられる。これらの計算は、所定の遺伝子座においていかなる数のアレルに対しても拡張できる。たとえば、アレルがそれぞれ集団中の頻度ｐ、ｑおよびｒを有する３アレル系についての同一性の確率ｐ(ＩＤ)は、遺伝子型頻度の二乗の合計に等しい： p(ID)＝p⁴＋(2pq)²＋(2qr)²＋(2pr)²＋r⁴＋q⁴ 同様に、３アレル系についての排除の確率は、 p(exc)＝pq(1−pq)＋qr(1−qr)＋pr(1−pr)＋3pqr(1−pqr) によって与えられる。ｎ個のアレルの遺伝子座においては、適当な二項式的拡張を用いてｐ(ＩＤ)およびｐ(ｅｘｃ)を計算する。図３および図４は、使用した遺伝子座の数および型の両者にともなってcum p( nonID)およびcum p(exc)がどのようにして増大するかを示す。３アレル系を用いた場合には一層優れた識別力が一層少ないマーカーで達成されることがわかる。図３および図４において、三角は２つのアレルを有する遺伝子座の数が増加するにつれて増大する確率値を追ったものであり、共通のアレルはｐ＝０.７９の頻度で存在する。図３および図４における×は、ｐ＝０.５、ｑ＝０.３４およびｒ＝０.１５の３アレル遺伝子座の数の増加についての同様の分析を示す。しかしながら、２、３またはそれ以上のアレルを有する遺伝子座のいずれを選択するかは、上記生化学的な考慮により大きく影響される。多型分析試験は、所定の遺伝子座においていずれの数のアレルに対しても評点すべくデザインできる。アレルの評点をゲル電気泳動を用いて行うのであれば、各アレルはゲル電気泳動により容易に解析しうるものでなければならない。複数のアレルファミリーでの長さの変異はしばしば小さいので、複数のアレルファミリーを用いたヒトＤＮＡ試験にはアレルの誤同定のための統計的な補正が含まれる。さらに、複数のアレル系からの稀なアレルの出現は情報として非常に有益ではあるが、これらアレルが稀であることは集団中でのその頻度の正確な測定を極めて困難なものにしている。稀なアレルを用いた場合にこれら頻度評価における誤りを補正するために、このデータの統計分析は、これら頻度評価における不確実性の累積効果の測定を含んでいなければならない。これら複数のアレル系の使用はまた、大きな集団のスクリーニングの際に該集団中の新規なまたは稀なアレルが発見されるであろう見込みを増大させる。これまでに集めた遺伝子データの完全さは、新規なアレルの発見を反映して経験的に改定されるであろう。これらの点を考慮に入れて、多数のアレルを有する遺伝子座を用いることは潜在的に幾つかの短期的な利点をもたらしうるけれども（より少ない遺伝子座しかスクリーニングする必要がないので）、（i）一層頻繁に表され、および（ii）明白に測定するのが一層容易であるような一層少ないアレルを有する遺伝子座を用いて多型分析を行うのが好ましい。このタイプの試験では、より多型性の高い遺伝子座に基づく試験と同じ識別力を達成できるが、ただし、同じ全数のアレルを一連の連関していない遺伝子座から回収しなければならない。Ｇ．ＳＮＰを用いた遺伝子マッピングおよび遺伝特質分析同じ種（ヒト、ウマなど）かまたは密接に関連した種の個体のセットで検出された多型は、ある特定の多型の存在または不存在が特定の特質と相関関係があるか否かについて決定するために分析することができる。そのような多型分析を行うため、多型のセット（すなわち、「多型アレイ」）の存在または不存在を個体のセットについて決定する。これら個体のうちの幾つかは特定の特質を示し、また別の幾つかは相互に排他的な特質（たとえば、ウマに関しては、脆い骨と脆くない骨；成熟期に開始する盲目と盲目でないこと；喘息、心血管系疾患などの素因とそのような素因のないこと）を示す。ついで、このセットの各多型のアレルを調べて、ある特定のアレルの存在または不存在が興味のもたれる特定の特質と関係しているか否かを決定する。そのような相関関係は、個々の種の遺伝子地図を定める。特質に関してランダムには分離しないアレルは、ある特定の動物がその特性を発現するであろう確率を予測するのに用いることができる。たとえば、ある特定の多型アレルが心血管状態を呈する種の成員の２０％にしか存在しないときは、そのアレルを含むその種のある特定の成員は、そのような心血管状態を示す確率を２０％有することであろう。指摘するように、この分析の予測力は、ある特定の多型アレルとある特定の特性との間の連関の程度により増大する。同様に、この分析の予測力は、ある特定の特質の複数の多型遺伝子座のアレルを同時に分析することによって増大させることができる。上記例において、第二の多型アレルもまた心血管状態を呈する成員の２０％に存在することがわかれば、そのような心血管状態を呈する評価した全成員がこれら第一および第二の多型のアレルの特定の組み合わせを有し、それゆえ、そのようなアレルを両者ともに含む特定の成員は心血管状態を呈する非常に高い確率を有するであろう。複数の多型部位の検出は、そのような部位が集団中で独立に分離する頻度を定めることを可能にする。たとえば、２つの多型部位がランダムに分離するならば、それらは別々の染色体上に存在するかまたは同じ染色体上で互いに離れて存在する。逆に、有意の頻度で同時に遺伝される２つの多型部位は、同じ染色体上で互いに連関している。このようにして、分離の頻度の分析は、マーカーの遺伝子地図の確立を可能にする。それゆえ、本発明は植物および動物のゲノムをマッピングする手段を提供するものである。遺伝子地図の解像度は、それが含むマーカーの数に比例する。本発明の方法は多数の多型部位を単離するのに用いることができるので、あらゆる所望の程度の解像度を有する地図を作成するのに用いることができる。多型部位の配列決定は、遺伝子マッピングにおけるその有用性を大いに高める。そのような配列は染色体を「歩き」、それによって新たなマーカー部位を同定するのに用いることのできるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブをデザインするのに用いることができる（Bender，W.ら、J ．Supra．Molec．Struc． 10(補遺) ：32(1979);Chinault，A.C.ら、Gene 5:111〜126(1979)；Clarke L．ら、Nature 287:504〜509(1980)）。地図の解像度は、多型分析を、そのゲノムをマッピングしようとする植物または動物の他の属性の表現型に関するデータと組み合わせることによりさらに高めることができる。それゆえ、ある特定の多型が褐色の髪の毛の色とともに分離すれば、その多型は髪の毛の色の遺伝子または遺伝子群の近くの遺伝子座にマッピングされる。同様に、生化学的データを用いて遺伝子地図の解像度を高めることができる。この態様では、生化学的な決定（血清型、イソ型など）は、それがいずれかの多型部位と一緒に分離するか否かを決定するために調べられる。そのような地図は、たとえば、新たな遺伝子配列を同定したり、疾患の原因となる変異を同定するのに用いることができる。実際、本発明のＳＮＰの同定は、該ＳＮＰのいずれかの側に位置する新規な遺伝子配列を単離あるいは配列決定するために、相補的なオリゴヌクレオチドをＰＣＲまたは他の反応においてプライマーとして用いることを可能にする。本発明は、そのような新規な遺伝子配列を含む。そのようなプライマーを用いることによってクローン的に単離できるゲノム配列は、ＲＮＡに転写され、ついでタンパク質として翻訳することができる。本発明はまた、そのようなタンパク質、並びにそのようなタンパク質に結合しうる抗体その他の結合分子をも含む。本発明を以下において、その態様の２つ、すなわち、ウマおよびヒトに関して説明する。しかしながら、遺伝学の基本的な教義は種にかかわりなく適用できるので、そのような説明は他のいずれの種に対しても同様に適用しうるものである。それゆえ、当業者は、上記本発明の方法を直接用いて他のいずれかの種においてＳＮＰを単離し、それによって本発明の遺伝子分析を行うだけでよいであろう。上記で指摘したように、ＬＯＤ評点法は、遺伝的特質の遺伝を追跡するためと、種の遺伝子地図を構築するためとの両方のためにＲＦＬＰを使用するのを可能とすべく開発された（Lander，S.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci.(U.S.A) 83:7353 〜7357(1986);Lander，S.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci.(U.S.A) 84:2363〜2367(1 987);Donis-Keller，H.ら、Cell 51:319〜337(1987);Lander，S.ら、Genetics 1 21 ：185〜199(1989)）。そのような方法は、本発明の多型に使用すべく容易に適合させることができる。実際、そのような多型は、この点でＲＦＬＰおよびＳＴＲよりも優れている。ＳＮＰの頻度のため、濃密な遺伝子地図を容易に作成することができる。さらに、上記で指摘したように、本発明の多型は典型的なＶＮＴＲ型の多型に比べて一層安定である。本発明の多型は直接的なゲノム配列情報を含むため、多くの方法によりタイプ分けできる。ＲＦＬＰまたはＳＴＲ依存性の地図では分析はゲルベースでなければならず、標的動物のＤＮＡの電気泳動プロフィルを得ることを必然的に伴う。ゲルベースの方法に加え、多型（ＳＮＰ）の分析は分光分析法を用いても行うことができ、多数の標的動物の分析を容易にするために容易に自動化することができる。以上、本発明を一般的に記載したので、ウマ多型の単離および分析である下記実施例を参照することにより本発明をより一層理解できるであろう。これら実施例は説明のためであって、本発明を限定することを意図するものではない。実施例１ポリアクリルアミドゲル電気泳動による複数のＳＮＰの分析複数の単一ヌクレオチド多型の検出のための本実施例では、一本鎖ＤＮＡ鋳型を３つのインテロゲーションプライマーでプローブした（probed）。プライマー＃１は５塩基Ｔ−テールを有し、プライマー＃２は１０塩基Ｔ−テールを有し、プライマー＃３は１５塩基Ｔ−テールを有する。一本鎖鋳型を得るため、２つの方法のうちのいずれかを用いた。第一に、Niki forov，T．（米国特許出願第08/005,061号（出願は１９９６年６月２４日に放棄）により教示されるように、４ホスホロチオエート−ヌクレオチド誘導体を含むプライマーを用いて増幅を媒介する。別法として、第二ラウンドのＰＣＲを「非対称」プライマー濃度を用いて行うことができる。第一の反応の生成物を第二の反応では１／１０００に希釈する。第二ラウンドのプライマーの一方は２Ｍの標準濃度で用い、他方は０.０８Ｍの濃度で用いる。これら条件下で一本鎖分子を反応の間に合成する。プライマー混合物を一本鎖標的鋳型にハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの修飾した非伸長性のヌクレオチドを用いた単一塩基伸長反応を起こさせる。各４つの反応管について１のみの修飾した非伸長性のヌクレオチドを好ましくは³²Ｐまたは蛍光分子で標識する。ついで、得られた伸長したプライマーを標準１２％シークエンシングゲル上での分析のため分離する。このようにして、各プライマーの電気泳動移動度および標識した非伸長性のヌクレオチドの同定に基づいて各プライマーに対応するＳＮＰの同一性を決定することが可能になる。実施例２サイズ排除クロマトグラフィーによる複数のＳＮＰの分析プライマー１、２、３および４をそれぞれＢＳＡ、卵アルブミン、リゾチームおよびＣＩＰに共有結合させる。一本鎖ＤＮＡ鋳型を４つのインテロゲーションプライマーでプローブし、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの修飾した非伸長性のヌクレオチドを用いた単一塩基伸長反応を起こさせる。好ましくは各非伸長性のヌクレオチドは、独特かつ別個に標識する。引き続き、得られた伸長したプライマーを適当なサイズ排除カラム（たとえば、セファデックス、セファロースなど）上で分離し、溶出液を（たとえば、シンチレーションカウンターにより）分析して導入されたヌクレオチドの同一性を決定する。実施例３アフィニティー法を用いた複数のＳＮＰの分析本実施例では、たとえば、Chuらにより開示された方法（Nucleic Acids Res ． 16 :3671〜3691(1988)、参照のため本明細書中に引用する）を用い、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーリガンドをインテロゲーションオリゴヌクレオチドに共有結合させる。ついで、アフィニティーリガンド−インテロゲーションプライマー複合体を標的核酸分子にハイブリダイズさせ、上記単一塩基伸長を４っの異なって標識したジデオキシヌクレオチド種（ｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＣおよびｄｄＧ）の存在下で起こさせる。所望の場合は、より少ない種のジデオキシヌクレオチドを用いてもよい。上記ペプチドまたはタンパク質に対する対応モノクローナル抗体をマイクロタイタープレート（Nunc）に固定化する。各モノクローナル抗体を室温にて緩衝液中でマイクロタイタープレートに固定化する。ついで、プレートをＴＮＴｗ溶液で３回洗浄して過剰の未結合タンパク質を除去する。ついで、伸長したプライマーの溶液を各ウエルに約３０分間かけて加える。未結合プライマーをＴＮＴｗ溶液で充分に洗浄して除去する。表３はそのような実験から予測される結果を示す。実施例４オリゴヌクレオチドを分離しない複数のＳＮＰの分析オリゴヌクレオチドプローブを分離することなく複数の単一ヌクレオチド多型を同定することも可能である。そのような実験では、各ジデオキシヌクレオチド三リン酸を独特に標識するのが好ましい。それゆえ、たとえば、ｄｄＡＴＰは³²Ｐで標識し、ｄｄＧＴＰは³Ｈで標識し、ｄｄＣＴＰは³⁵Ｓで標識し、ｄｄＴＴＰは¹²⁵Ｉで標識することができる。表３は、興味のもたれる核酸を含む調製液に６つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて得られる仮定上の結果、および単一の塩基伸長反応の結果を示す。そのような実験において、導入されなかったｄｄＮＴＰは種々の手段（たとえば、適当なスピンカラム（すなわち、CentriSepスピンカラム）など）のいずれかを用いて伸長したプローブから分離できる。導入された標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸は、その後、シンチレーションカウンターを用いて検出する。各同位体は別個の発光スペクトルを有するので、シンチレーションカウンターは精製手順を必要とすることなく複数の単一ヌクレオチド多型の同一性を決定することができる。表４に示すように、単一ヌクレオチド多型に相補的な導入されたジデオキシヌクレオチドの同定は、プライマー１〜６に関してそれぞれＴ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇであることが明らかである。曖昧さは、プライマーの組み合わせを変えることによって決定できる。実施例５オリゴヌクレオチドアレイ分離による複数のＳＮＰの分析プライマー１、２、３および４は、鋳型ＤＮＡに相補的な配列に加えて固相表面上の捕捉オリゴヌクレオチドにその後にハイブリダイズさせるための独特の配列を含む。一本鎖ＤＮＡ鋳型を４つのインテロゲーションプライマーでプローブし、ＤＮＡポリメラーゼおよび４つの修飾した非伸長性のヌクレオチドを用いた単一塩基伸長反応を起こさせる。好ましくは各非伸長性のヌクレオチドは、独特かつ別個に標識する。得られた伸長したプライマーを、その後、オリゴヌクレオチドアレイの表面に適用する。このアレイは４つの別々かつ空間的に隔てられた別個の捕捉オリゴヌクレオチドからなり、各オリゴヌクレオチドはインテロゲーションプライマーの一つの上の独特の配列に相補的である。各インテロゲーションプライマーは、その対応表面に結合した捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションにより有効に分離される。ついで、標識ヌクレオチドの同一性を適当な方法により決定する。本発明をその特定の態様に関連して記載したが、さらに修飾することが可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従って、および本発明が関与する技術分野内では公知で慣例的な実施であるとして、あるいは上記や添付の請求の範囲内の本質的特徴に適用しうるものとして、本発明の開示から逸脱するものを包含して、本発明の変更、使用、または適応を包含することを意図するものであることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヘッド，スティーブンアメリカ合衆国21074メリーランド州ハンプステッド、サウス・メイン・ストリート 808番 (72)発明者ゴーレット，フィリップアメリカ合衆国21136メリーランド州リースタータウン、ミレンダー・ミル・ロード 4000番 (72)発明者ボイス−ジャチノ，マイケル・ティアメリカ合衆国21048メリーランド州フィンクスバーグ、ナイナー・ロード3811番

Claims

【特許請求の範囲】１．１またはそれ以上の単一多型を単一の反応において同定する方法であって、工程：（Ａ）１またはそれ以上の識別可能なインテロゲーションオリゴヌクレオチドプライマーを１またはそれ以上の標的核酸分子にハイブリダイズさせ、その際、各オリゴヌクレオチドプライマーは、各プライマーの３'末端が興味のもたれる特定かつ独特の標的ヌクレオチドの直ぐ近位に位置するように、各標的核酸分子の特定かつ独特の領域に相補的であり; （Ｂ）各インテロゲーションオリゴヌクレオチドを鋳型依存性のポリメラーゼで伸長させ、その際、該伸長は、１またはそれ以上の非伸長性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ種の存在下で起こり；ついで（Ｃ）使用した各インテロゲーションプライマーについて、そのようなプライマー中に導入された非伸長性のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の同一性を決定することにより興味のもたれる各ヌクレオチドの同一性を決定し、その際、同定された該非伸長性のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは該プライマーの標的ヌクレオチドに相補的であるを含む方法。２．各インテロゲーションオリゴヌクレオチドプライマーが５'テールを含み、該５'テールは、特定かつ独特の長さまたは各インテロゲーションプライマーを同定または分離するのに使用する他の特性を有する中性の成分からなる、請求項１に記載の方法。３．該ハイブリダイゼーション工程が溶液中で起こる、請求項１に記載の方法。４．該非伸長性のヌクレオチドを物理的方法または化学的方法により同定する、請求項１に記載の方法。５．該物理的方法または化学的方法が、偏光分光分析、質量分光分析、赤外分光分析、紫外分光分析、可視光分光分析またはＮＭＲ分光分析よりなる群から選ばれたものである、請求項４に記載の方法。６．さらに工程：（Ｄ）適当なマトリックス上で該伸長したプライマーを分離するを含む、請求項１に記載の方法。７．該マトリックスがサイズ分離マトリックスである、請求項６に記載の方法。８．該サイズ分離マトリックスがシークエンシングゲルである、請求項７に記載の方法。９．該シークエンシングゲルが約４％〜約２０％のポリアクリルアミドを含む、請求項８に記載の方法。１０．該サイズ分離マトリックスがサイズ排除カラムである、請求項７に記載の方法。１１．適当な該レセプター分子が該マトリックスに結合され、該レセプター分子に対応する適当な該リガンド分子が該オリゴヌクレオチドプライマーに結合されている、請求項６に記載の方法。１２．該マトリックスが、ビーズ、カラム、ディップスティック、マイクロタイタープレートおよびガラススライドよりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。１３．該非伸長性のヌクレオチドがｄｄＮＴＰである、請求項１に記載の方法。１４．該ｄｄＮＴＰが蛍光によりまたは化学的に標識されている、請求項１３に記載の方法。１５．該ｄｄＮＴＰがビオチン化されている、請求項１３に記載の方法。１６．該標的分子が核酸分子である、請求項１に記載の方法。１７．該核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１６に記載の方法。１８．該ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。１９．該ＤＮＡ分子が二本鎖ＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。２０．該ＤＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。２１．該核酸分子がＲＮＡ分子である、請求項１６に記載の方法。２２．標的ＤＮＡを特徴付ける方法であって、工程：（Ａ）１またはそれ以上の識別可能なインテロゲーションオリゴヌクレオチドプライマーを１またはそれ以上の標的核酸分子にハイブリダイズさせ、その際、各オリゴヌクレオチドプライマーは、各プライマーの３'末端が興味のもたれる特定かつ独特の標的ヌクレオチドの直ぐ近位に位置するように、各標的核酸分子の特定かつ独特の領域に相補的であり；（Ｂ）各インテロゲーションオリゴヌクレオチドを鋳型依存性のポリメラーゼで伸長させ、その際、該伸長は、１を超える非伸長性のヌクレオチド種の存在下で起こり；（Ｃ）該伸長したプライマーを適当なマトリックス上で分離し；（Ｄ）使用した各インテロゲーションプライマーについて、そのようなプライマー中に導入された非伸長性のヌクレオチドの同一性を決定することにより興味のもたれる各ヌクレオチドを調べ、その際、同定された該非伸長性のヌクレオチドは該プライマーの標的ヌクレオチドに相補的であり；ついで（Ｅ）調べた該興味のもたれるヌクレオチドを、参照核酸分子の興味のもたれる対応ヌクレオチドと比較し、興味のもたれる該ヌクレオチドがそれぞれの部位で同じ単一のヌクレオチドを含むか否かを決定することを含む方法。２３．該特徴付けが該標的ＤＮＡ分子の特質を同定するものである、請求項２２に記載の方法。２４．該特質が遺伝病である、請求項２３に記載の方法。２５．該特質が遺伝的状態である、請求項２３に記載の方法。２６．該サイズ分離マトリックスが、セファロースおよびセファデックスよりなる群から選ばれたものである、請求項７に記載の方法。２７．該リガンドが、ハプテン、抗原、補因子、ビオチンおよびイミノビオチンよりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。２８．該リガンドが、ジニトロフェノール、リポ酸およびオレフィン化合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。２９．該リガンドが、相補的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインした独特かつ特定のオリゴヌクレオチド、相補的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインしたＰＮＡ配列およびレセプターとして機能するＰＮＡ配列よりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。３０．該リガンドが抗体、酵素、ポリペプチド、ストレプトアビジンおよびアビジンよりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。３１．該リガンドが、検出可能なポリペプチドと結合することによって複合体を形成しうる、請求項１１に記載の方法。３２．該検出可能なポリペプチドが、抗体、不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素、ストレプトアビジンおよびアビジンよりなる群から選ばれたものである、請求項３０に記載の方法。３３．該検出可能なポリペプチドが、ランダムに生成したポリペプチドライブラリーから選ばれたものである、請求項３０に記載の方法。３４．該レセプターが、ハプテン、抗原、補因子、ビオチンおよびイミノビオチンよりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。３５．該レセプターが、ジニトロフェノール、リポ酸およびオレフィン化合物よりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。３６．該レセプターが、相補的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインした独特かつ特定のオリゴヌクレオチド、相補的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにデザインしたＰＮＡ配列およびレセプターとして機能するＰＮＡ配列よりなる群から選ばれたものである、請求項１１に記載の方法。３７．該レセプターが、検出可能なポリペプチドと結合することによって複合体を形成しうる、請求項１１に記載の方法。３８．該検出可能なポリペプチドが、抗体、不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素、ストレプトアビジンおよびアビジンよりなる群から選ばれたものである、請求項３７に記載の方法。３９．該検出可能なポリペプチドが、ランダムに生成したポリペプチドライブラリーから選ばれたものである、請求項３７に記載の方法。４０．該レセプター分子が該マトリックスに、共有結合、イオン性相互作用、非特異的吸着、および特異的だが非共有結合性のリガンド−レセプター相互作用よりなる群から選ばれた方法により結合される、請求項１１に記載の方法。４１．該リガンド−レセプターが相補的なハイブリダイズする核酸から選ばれる、請求項４０に記載の方法。４２．該リガンド−レセプターが相補的なハイブリダイズするＰＮＡおよび他の合成核酸アナログよりなる群から選ばれたものである、請求項４０に記載の方法。４３．該リガンド分子が該オリゴヌクレオチドプライマーに、共有結合、イオン性相互作用、非特異的吸着、および特異的だが非共有結合性のリガンド−レセプター相互作用よりなる群から選ばれた方法により結合される、請求項１１に記載の方法。４４．該リガンド−レセプターが相補的なハイブリダイズする核酸から選ばれる、請求項４３に記載の方法。４５．該リガンド−レセプターが相補的なハイブリダイズするＰＮＡおよび他の合成核酸アナログよりなる群から選ばれたものである、請求項４３に記載の方法。４６．該非伸長性のヌクレオチドが、鋳型依存性のポリメラーゼにより導入されうる合成のまたは天然に存在するヌクレオチドアナログである、請求項１に記載の方法。４７．該合成のまたは天然に存在するヌクレオチドアナログが、非環状リボース、置換ヌクレオチドアナログ、および修飾リボースヌクレオチドアナログよりなる群から選ばれたものである、請求項４６に記載の方法。４８．該合成ヌクレオチドアナログが、フルクトースベースのヌクレオチドアナログよりなる群から選ばれたものである、請求項４６に記載の方法。４９．該合成ヌクレオチドアナログが、天然に存在するヌクレオチドと特異的に塩基対形成する能力を保持した化学的に修飾したプリンまたはピリミジンよりなる群から選ばれたものである、請求項４６に記載の方法。５０．該合成ヌクレオチドアナログが、天然に存在するヌクレオチドと特異的に塩基対形成する能力を保持した化合物よりなる群から選ばれたものである、請求項４６に記載の方法。５１．該非伸長性のヌクレオチドが蛍光標識されているかまたは化学的に標識されている、請求項１に記載の方法。５２．該非伸長性のヌクレオチドがビオチンまたはイミノビオチンにより標識されている、請求項１に記載の方法。５３．該非伸長性のヌクレオチドがハプテン、抗原または補因子により標識されている、請求項１に記載の方法。５４．該非伸長性のヌクレオチドがジニトロフェノール、リポ酸またはオレフィン化合物により標識されている、請求項１に記載の方法。５５．該非伸長性のヌクレオチドが検出可能なポリペプチドにより標識されている、請求項１に記載の方法。５６．該非伸長性のヌクレオチドが電子密度の高い分子または不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素により標識されている、請求項１に記載の方法。５７．該非伸長性のヌクレオチドが電子密度の高い分子または不溶性の反応生成物を沈積しうる酵素により標識されている、請求項１に記載の方法。５８．該蛍光指示薬分子が、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ４１およびＢＯＤＩＰＹよりなる群から選ばれたものである、請求項４８に記載の方法。５９．該電子密度の高い指示薬分子が、フェリチン、ヘモシアニン、およびコロイド金よりなる群から選ばれたものである、請求項５７に記載の方法。６０．該検出可能なポリペプチドが、該検出可能なポリペプチドを、指示薬分子に共有結合した第二のポリペプチドと特異的に複合体を形成させることによって間接的に検出可能なものである、請求項５５に記載の方法。６１．該検出可能なポリペプチドがアビジンおよびストレプトアビジンよりなる群から選ばれたものであり、該第二のポリペプチドがビオチンおよびイミノビオチンよりなる群から選ばれたものである、請求項６０に記載の方法。６２．該核酸分子が植物からのものである、請求項１６に記載の方法。６３．該核酸分子が微生物からのものである、請求項１６に記載の方法。６４．該微生物が、細菌、真菌、酵母、ウイルス、ウイロイドおよび他の遺伝可能な遺伝的存在よりなる群から選ばれたものである、請求項６３に記載の方法。