JP2002508168A

JP2002508168A - ヒト腫瘍壊死因子ｒ２様タンパク質

Info

Publication number: JP2002508168A
Application number: JP2000539051A
Authority: JP
Inventors: バンドマン、オルガ; ヒルマン、ジェニファー・エル; オウ−ヤング、ジャニス; タング、トム・ワイ; カイザー、マシュー・アール
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2002-03-19
Also published as: WO1999031128A3; WO1999031128A2; CA2314884A1; AU1541699A; EP1037908A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質（TR2P）並びにTR2Pを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はTR2Pの発現に関わる疾患の治療または予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質(human tumor necrosis factor-R
2-like proteins)の核酸配列およびアミノ酸配列、並びに骨形成、発生、生殖、
免疫、及び潰瘍性の疾患の診断・予防・治療におけるこれらの配列の利用法に係
るものである。

【０００２】発明の背景多くの真核生物の細胞膜には、構造的支持を担い、細胞および組織の同一性を
供し、更に自己分泌、パラ分泌および周囲環境における細胞に対する隣接細胞分
泌(juxtacrine)特性を有するタンパク質が含まれる（McGowan,S.E.(1992) FASEB
J. 6:2895-2904）。膜タンパク質（MP）の多様な生化学的特徴として、個別の各分子に起因する多くの（しばしば重複する）役割が示されている（Grant, D.S
.及びKleiranan, H.K. (1997) EXS 79:317-333）。多数のMPが単離されてきたが
、大半のMPが、互いに或いは細胞膜の中に存在する他の分子とどのように相互作
用するかは依然として不確かなままである。多くのMPは、組織の成長、細胞増殖
、組織・細胞の分化、及び細胞死に関係している（Taipale, J.及び Keski-Oja,
J. (1997) FASEB J.011:51-59；Eleftheriou, C.S. ら (1991) Mutat. Res. 25
6:127-138）。

【０００３】例えば、胎生の骨形成のプロセスには、組織の成熟の過程において石灰化する
細胞外基質の生成が含まれる。個々の基質は、その寿命までの間に、（石灰化さ
れた骨を形成する）骨芽細胞および（骨を再吸収する）破骨細胞の総合作用によ
って絶えず再構築（リモデリング）される。先天的疾患、後成的疾患、または感
染症の結果として生じる生化学的な変化は、MPの成分バランスや生じる骨の構造
を混乱させる原因となることがある（Francomano,C.A.ら(1996)Curr.Opin.Genet
. Dev. 6:301-308）。

【０００４】また、MPは炎症反応の重要な媒介物や制御因子として作用する。血管外遊出の
際に、白血球は配位子−受容体結合による炎症性媒介物およびサイトカインの生
成のために初回抗原刺激を受ける（Pakianathan, D.R. (1995) J. Leukoc. Biol
. 57:699-702）。腫瘍壊死因子（TNF）は、免疫の調節および炎症反応を媒介する多面性サイトカインである。TNFが誘因となる細胞の応答は、2つの異なる細胞
表面受容体（TNF-R1 (55kDa) 及び TNF-R2 (75kDa)）との相互作用によって開始
される（Tartaglia, L.A.及びGoeddel, D.V. (1992) Immunol. Today 13:151-15
3）。両TNF受容体は、より大きなTNF受容体（TNFR）スーパーファミリーの一部であり、その構成要素にはFas抗原、CD27、CD30、及びCD40が含まれ、細胞外ドメインにおいてシステインリッチの偽性反復(cysteine-rich pseudorepeats)を共有し、またTNFR/NGFRファミリーのシステインリッチ領域のサイン(signature)
を共有する（Smith, C.A.ら (1994) Cell 76:959-962）。TNFに関連するサイトカインは、受容体モノマーの凝集を引き起こすことによって、分化、増殖、NF-k
B活性化、及び細胞死を含む部分的に重複する細胞応答を発生させる（Smithら；
前出）。両方のTNF受容体タイプはほとんどの細胞のタイプで発現されるが、TNF
-R1は大部分のTNF活性の主因である（Tartaglia及びGoeddel；前出）。TNF-R2の
寄与は、TNF-R2が隣接するTNF-R1分子（後者はシグナルを伝達している）に対し
てTNFを提供する配位子通過モデル(ligand passing model)によって部分的に説明可能である（Tartaglia及びGoeddel；前出）。直接のTNF-R2のシグナル伝達は
、主にリンパ球に作用する（例えば、T細胞ハイブリドーマによる顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子分泌の誘発およびCT6 T細胞株の増殖）（Tartaglia
, L.A. ら (1993) Cell 74:845-853）。更に、TNF-R2の場合の独立したシグナル
伝達の役割は、幾つかの特異的な株化細胞におけるTNF媒介(TNF-mediated)の細胞毒性作用において実証されている（Vandenabeele, P.ら(1995) Trends Cell B
iol. 5:392-399）。 TNF-R1とTNF-R2の細胞質内ドメインは配列相同性を欠いており、そのことはそれ
らが異なる活性化シグナルを発生することを示唆している。Beyaert, R.ら（199
5; J. Biol.Chem. 270:23292-23299）は、TNF-Rキナーゼをカゼインキナーゼ1（
CK-1）として同定し、TNF誘発のアポトーシスに対するTNF-R2媒介のシグナル伝達は、CK-1によるリン酸化によって負の調節を受けることを観察した。不適正な
TNFの発現は、敗血症性ショックや自己免疫異常のような疾患の発生と関連している（Beyaert,R.ら；前出）。オステオプロテゲリン(osteoprotegerin)は、最近になって骨吸収を調節するTNF-R2ファミリーの一員として確認された。オステ
オプロテゲリンは、ラットにおいて破骨細胞への前駆細胞の分化を防ぎ、また卵
巣切除関連の骨損失を防ぐ（Simonet, W.S.ら(1997) Cell 89:309-319）。

【０００５】ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質およびこれらのヒト腫瘍壊死因子R2様タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドの開示は、骨形成、発生、生殖、免疫、及び
潰瘍性の疾患の診断・予防・治療に役立つ新たな組成物を提供して従来技術にお
ける要求を満たすものである。

【０００６】発明の概要本発明は、実質的に精製されたポリペプチド、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク
質（まとめて「TR2P」、個別には「TR2P-1」及び「TR2P-2」と称する）を特徴とするも
のである。一態様において、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸を含む実質的に精製されたポリペプチド、TR2Pを提供する。

【０００７】また、本発明は、SEQ ID NO:1若しくはSEQ ID NO:3、又はこれらの配列の断片
のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製されたTR2Pの変異体を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO
:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレ
オチド配列を提供する。更に、本発明には、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID
NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90
%以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチド配列の変異配列が含まれる。

【０００８】更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、SE
Q ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からな
る一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに対して相補的な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく
、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片か
らなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズする単離および精製されたポ
リヌクレオチド配列を提供する。

【０００９】また、本発明は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ
ID NO:4の断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離お
よび精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群か
ら選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して相補的
な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく、SEQ ID NO:2、SEQ I
D NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチド
配列の変異配列を提供する。

【００１０】更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを提供す
る。別の態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。

【００１１】また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法を提供し、その方
法には、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、TR2Pをコードするポ
リヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養
する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含
まれる。

【００１２】また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたTR2Pを適切な製薬用
担体と共に含む医薬品成分を提供する。

【００１３】更に、本発明には、前記ポリペプチドに対する精製されたアゴニストおよび精
製されたアンタゴニストだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体が含まれる。

【００１４】また、本発明は、所定の骨形成疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法
には、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医
薬品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。

【００１５】また、本発明は、所定の発生障害の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医薬
品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。

【００１６】また、本発明は、所定の生殖疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対して実質的に精製されたTR2Pを含む医薬
品組成物を有効な量投与する過程が含まれる。

【００１７】また、本発明は、所定の免疫疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量投
与する過程が含まれる。

【００１８】また、本発明は、所定の腫瘍性疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法
には、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量
投与する過程が含まれる。

【００１９】更に、本発明は、所定の免疫応答の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してTR2Pのアンタゴニストを有効な量投
与する過程が含まれる。

【００２０】また、本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードするポリ
ヌクレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の相補配列と生物学的サンプルの核酸の少なく
とも一部をハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過
程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、生物学的サンプルに
おけるTR2Pをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、前記ハイブ
リダイゼーション複合体を検出する過程とが含まれる。一態様では、ハイブリダ
イゼーション過程の前に、ポリメラーゼ連鎖反応法により生物学的サンプルの核
酸を増幅する。

【００２１】発明を実施するための形態本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また
、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたもので
あり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図した
ものではないことも理解されたい。

【００２２】請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。

【００２３】特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法や材
料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な
方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告され
た本発明に関して用いられ得る株化細胞、ベクター、及び方法論を説明・開示す
るために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発
明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない
。

【００２４】定義ここで用いる「TR2P」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウ
マ、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天
然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製された
TR2Pのアミノ酸配列を指す。

【００２５】ここで用いる用語「アゴニスト」は、TR2Pと結合した場合にTR2Pの効果を高めた
り、その効果の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、TR2Pに結合して
その作用を調節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得
る。

【００２６】ここで用いる「アレル」または「アレルの配列」は、TR2Pをコードする遺伝子の対
立形である。アレルは、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し
、変異したmRNA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化す
る場合と変化しない場合がある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型
の遺伝子には、アレル形がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するも
のがある。一般にアレルが生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付
加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独または
他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で生じ
得る。

【００２７】ここで用いるTR2Pをコードする「変異した（altered）」核酸配列には、結果として同一のTR2PまたはTR2Pの機能的特徴の少なくとも1つをともなうポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、
または置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、TR2Pをコードす
るポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可
能な、或いは検出困難な多型と、またTR2Pをコードするポリヌクレオチド配列の
正常の染色体の位置とは別の所定の位置を有する、アレルに対する不適切な或い
は予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク質
もまた「変異した」ものであり得て、サイレント変化（silent change）を生ずるアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価TR2Pとな
るものである。意図的なアミノ酸置換は、TR2Pの生物学的または免疫学的活性が
保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および
／または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に
荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電し
たアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電
荷の極性頭基(polar head groups)を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレ
オニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。

【００２８】ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり
、自然発生又は合成の分子を指す。TR2Pの断片は、好ましくは約5〜約15個のアミノ酸の長さを有し、TR2Pの生物的活性又は免疫学的活性を保持しているもので
ある。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」は
、好ましくは約5〜15のアミノ酸の長さであってTR2Pの生物学的活性または免疫学的活性を保持するTR2Pの断片を指す。ここで「アミノ酸配列」は、自然発生タ
ンパク質分子のアミノ酸配列を指すものとして挙げているが、「アミノ酸配列」
や類似の用語は、列挙されたタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ
酸配列にアミノ酸配列を限定する意味で用いられるわけではない。

【００２９】ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される（Die
ffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual,p
p.1-5, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY参照）。

【００３０】ここで用いる用語「アンタゴニスト」は、TR2Pに結合した場合にTR2Pの生物学
的又は免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分
子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはTR2Pの作用を
低下させる任意の他の分子が含まれ得る。

【００３１】ここで用いる用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa
、F(ab')₂、及びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。TR2Pポリペプチド
に結合する抗体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原とし
て関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物
（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得られ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する
通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。

【００３２】ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち
、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動
物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質
の所定の領域または三次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。
抗原決定基は抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために
用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３３】ここで用いる用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補
的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の
方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げる。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（
＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。

【００３４】ここで用いる用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節
機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」
は、天然の、組換え体の、又は合成のTR2P、若しくはその任意のオリゴペプチド
の能力を指し、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体
に結合する。

【００３５】ここで用いる用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩類(permissive
salt)及び温度条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合である。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A」に結合する。2つの1本鎖分
子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、
或いは1本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さ
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅
反応や、ペプチド核酸（PNA）分子の設計及び使用において特に重要である。

【００３６】ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤、水溶液、
または無菌の組成物が含まれ得る。TR2PまたはTR2Pの断片をコードするポリヌク
レオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用でき
る。このプローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定
化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプロー
ブは、塩（例えば、NaCl）、界面活性剤（例えば、SDS）及び他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液に分散させることができる。

【００３７】ここで用いる用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分
離された核酸配列か、XL-PCR^TM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて5’方向及
び／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメントの組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment A
ssembly system, GCG, Madison WI）を用いて2種以上のインサイト社クローンの
重複した配列から組み合わせて作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長
され、かつ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。

【００３８】ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン解析によるTR2Pをコードする核酸配列と同一か又は関連する核酸の存在の検出
が、サンプル内のTR2Pをコードする核酸の存在を示しており、従ってTR2Pをコー
ドするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、というこ
とを表している。

【００３９】ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。

【００４０】ここで用いる用語「誘導体」は、TR2P、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配
列、またはTR2Pをコードするポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド
配列を化学修飾したものを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば
、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌク
レオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持している
ポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(pegylation)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的
機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。

【００４１】ここで用いる用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な相同
性と、完全な相同性の場合がある。用語「相同性」の代わりに「同一性」を用いるこ
とができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分
的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同な」ことを指す。完全に
相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性
のもとで、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液
ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に相同な配列また
はハイブリダイゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に相同な配列
との結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな
厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味
するわけではなく、緩やかな厳密性の条件では2つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないこ
とを、部分的な程度の相補性（即ち約30%未満の同一性）さえも有していない第2
の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が存在しな
い場合、概ね相同な配列またはプローブは第2の非相補的な標的配列とハイブリダイズしない。

【００４２】「ヒト人工染色体」（HACs）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である(Harrington, J.J.ら (1997) Nat Genet. 15:345-355)。

【００４３】ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持し
ながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列
を置換した抗体分子を指す。

【００４４】ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介し
て相補鎖と結合する任意の過程を指す。

【００４５】ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の
水素結合形成の効力によって、2つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析
）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メン
ブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその
核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成さ
れ得る。

【００４６】ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌ
クレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００４７】「マイクロアレイ」とは、例えば紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン
、フィルタ、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体のよう
な基板上に配列された個々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを配列し
たものを指す。

【００４８】ここで用いる用語「調節(modulate)」は、TR2Pの活性の変化を指す。例えば、
調節によって、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はTR2Pの生物
学的、機能的、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。

【００４９】ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、1本鎖または2本鎖の、センス鎖又
はアンチセンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のDNA、RNAや、ヌクレオチド
、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその任意の断片や、ペプチ
ド核酸（PNA）や、任意のDNA様もしくはRNA様材料を指す。「フラグメント（断片）」は、長さが60ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最も好ましくは、長さ
が100ヌクレオチド以上、又は1000ヌクレオチド以上、更には10,000ヌクレオチド以上の断片を指す。

【００５０】ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリダイゼーションアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長
さが少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド程度のもので、好適には1
5〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用
語「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と
概ね同義である。

【００５１】ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端のリジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに優先
的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。（Nielsen, P.E.ら(1993) Ant
icancer Drug Des. 8:53-63）。

【００５２】ここで用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。TR2Pをコ
ードする核酸、若しくはその断片、またTR2P自体を含む疑いのある生物学的サン
プルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽
出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA
、またはcDNAや、組織や、組織プリントその他を含み得る。

【００５３】ここで用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体ならび
にタンパク質もしくはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。こ
の相互作用は、結合する分子が認識するタンパク質の特定の構造（即ち、抗原決
定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗
体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離した「A」及び
その抗体を含む反応において、エピトープA（つまり遊離し、標識されていないA
）を含むポリヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識されたA の量が低下する。

【００５４】ここで用いる用語「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と要求されたポリ
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件を指す。適切な厳密
な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションにおける塩類またはホルムアミ
ドの濃度、ハイブリダイゼーション溶液、ハイブリダイゼーション温度によって
定義することが可能であり、これらの条件は当技術分野で周知である。特に、塩
類の濃度を低下させることや、ホルムアミドの濃度を上昇させることや、ハイブ
リダイゼーション温度を上昇させることによって厳密性が増す。

【００５５】例えば、高い厳密性の条件の下でのハイブリダイゼーションは、約37℃〜42℃
の約50%のホルムアミド中において起こり得る。またハイブリダイゼーションは、約30℃〜35℃の約35%〜25%のホルムアミド中の緩やかな厳密性の条件下で起こ
り得る。特に、ハイブリダイゼーションは、42℃の50%のホルムアミド中、5X SS
PE、0.3%SDS、および200μg/mlの切断され変性したサケの精液DNA、という高い厳密性の条件下で起こり得る。また、ハイブリダイゼーションは、温度を35℃に
低下させた35%のホルムアミド中において、前述のような緩やかな厳密性の条件下で起こり得る。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、対象物の核酸の
ピリミジンに対するプリンの割合を算出して、温度を調節することによってさら
に狭めることができる。上述の温度範囲および条件の変更例は、当業者には周知
である。

【００５６】ここで用いる用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列
又はアミノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から
単離又は分離されて、その構成要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好まし
くは90%以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。

【００５７】ここで用いる「置換」は、それぞれ1個または2個以上のヌクレオチド或いはア
ミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸に各々置換することを指す。

【００５８】ここで用いる「形質転換」の定義は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を
用いた天然または人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞ま
たは真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質
転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定
はされないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーショ
ン）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「
形質転換された」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとして、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞
が含まれ、またそれは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に発現する細
胞を指す。

【００５９】ここで用いるTR2Pの「変異体」は、1又は2以上のアミノ酸が変異したアミノ酸
配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この場合、例え
ばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるアミノ酸が類似な構
造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシンがトリプトファ
ンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合もある。類似した
小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方が含まれる。例え
ばDNASTARソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用いて、何れのアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除
去可能であるということを決定するガイダンスを提供することができる。

【００６０】発明本発明は、ヒト腫瘍壊死因子R2様タンパク質（TR2P）、TR2Pをコードするポリ
ヌクレオチド、並びに骨形成、発生、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患の診断、予
防、又は治療のためのこれらの物質の使用法の発見に基づくものである。

【００６１】本発明のTR2P-1をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、脾臓cDNAライブラリー(SPLNNOT04)からのインサイト社クローン1533650に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:2は、
次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン1533650 及び1559031(SPLNNOT04)、3219886 (COLNNON03) 、1339238 (COLNTUT03) 、1542
861 (PROSTUT04) 、3257322 (OVARTUN01)並びに2613221(SINIUCT01)から導出された。

【００６２】一実施例において、本発明はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。TR2P-1は、245のアミノ酸の長さであり、またN-173の潜在的Nグルコシル化部位と、残基S-66の潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸化部位と、
残基S₁₆₃及びS₁₈₇の2つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、残基S₂₀₂ 及びS₂₂₅の2つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、残基Y₃₆の1つの潜
在的チロシンキナーゼリン酸化部位と、残基C₇₇及びC₁₁₃の間の1つのTNFR/NGFR ファミリーのシステインリッチ(cysteine-rich)領域のサインと、残基C₁₂₆及びC ₁₃₂ 並びにC₁₆₈及びC₁₇₄の間の2つのホスホリパーゼA₂活性部位サインとを有する。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃに示すように、TR2P-1は、ヒトオステオプロテ
グリン（GI 2072185, SEQ ID NO:5）及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6
）と化学的および構造的相同性を有する。詳細にはTR2P-1は、ヒトオステオプロ
テグリンと31%、ヒトTNF-R2と27%の同一性を有する。また、TR2P-1とヒトオステ
オプロテグリンは、1つの潜在的Nグルコシル化部位と、1つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、1つのTNFR/NGFRファミリーのシステインリッチ領域のサインと、2つのホスホリパーゼA₂活性部位のサインとを共有する。更に、TR2
P-1とヒトTNF-R2は、1つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、1つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、1つのTNFR/NGFRファミリーのシステインリッチ領域のサインと、1つのホスホリパーゼA₂活性部位のサインとを共有し、また同様な等電点6.6及び5.9をそれぞれ有する。ノーザン分析は、種々のラ
イブラリーにおけるこの配列の発現を示し、これらのライブラリーの少なくとも
58%が不死化したもの、即ち癌性であり、少なくとも41%が免疫応答に関係するも
のである。特に注目すべきは、胃腸、生殖、造血、心血管、結合、及び胎性組織
にけるTR2P-1の発現である。

【００６３】本発明のTR2P-2をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、腎臓cDNAライブラリー(KIDNTUT13)からのインサイト社クローン2581223に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:4は、
次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、インサイト社クローン2581223(
KIDNTUT13)、260827 (HNT2RAT01) 、2482038 (SMCANOT01)、及び2623152(KERANO
T02)から導出された。一実施例において、本発明はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。TR2P-2は、393のアミノ酸の長さであり、また残基N₂₄、N₁₃₅、N₁₄₀、
N₁₆₁、N₁₇₂、及びN₃₂₂の6つの潜在的Nグルコシル化部位と、残基T₄₄及びS₂₅₇の2
つの潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸化部位と、残基T₁₀、T₄₄、T₅₈、S₁₅ ₂ 、T₁₅₇、T₂₀₂、S₃₂₄、及びT₃₈₅の8つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位
と、残基T₁₀、S₁₄₄、S₁₆₄、S₂₅₂、S₂₅₆、T₂₅₉、S₃₂₄、T₃₅₀、及びT₃₈₉の9つの潜
在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、残基C₂₇及びC₃₃の間の1つのホスホリ
パーゼA₂活性部位のサインとを有する。図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示すよう
に、TR2P-2は、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V₈₃〜S₄₆₁：GI 1469541, SEQ
ID NO:6）、及びヒトオステオプロテグリン（切り詰められた配列、L₉₀〜L₄₀₁ ：GI 2072185, SEQ ID NO:5）と化学的および構造的相同性を有する。詳細にはT
R2P-2は、ヒトTNF-R2と17%、ヒトオステオプロテグリンと18%の同一性を有する。また、TR2P-2とヒトTNF-R2は、2つの潜在的プロテインキナーゼA又はGリン酸化部位と、4つの潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位と、2つの潜在的プロテ
インキナーゼCリン酸化部位とを共有する。更に、TR2P-2とヒトオステオプロテグリンは、2つの潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位と、1つのホスホリパーゼA₂活性部位のサインとを共有し、また同様な等電点8.8及び9.2をそれぞれ有
する。ノーザン分析は、種々のライブラリーにおけるこの配列の発現を示し、こ
れらのライブラリーの少なくとも93%が不死化したもの、即ち癌性であり、少なくとも29%が免疫応答に関係するものである。特に注目すべきは、皮膚、胃腸、造血、生殖、神経、泌尿器、及び心血管組織にけるTR2P-2の発現である。

【００６４】また本発明はTR2Pの変異体を含む。TR2P変異体は、TR2P アミノ酸配列に対して好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少
なくとも95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またTR2Pの機能的もしくは構造的特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列である。

【００６５】また本発明は、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを含む。図１Ａ、図１Ｂ、
及び図１Ｃに示すように、特定の実施例において、本発明はTR2PをコードするSE
Q ID NO:2の配列を含むポリヌクレオチドを包含する。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、及び図２Ｄに示すように、更なる実施例において、本発明はTR2Pをコードする
SEQ ID NO:4の配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００６６】また本発明は、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。特
に、ポリヌクレオチド配列のそのような変異配列は、TR2Pをコードするポリヌク
レオチド配列に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも9
0%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の態様においては、SEQ ID NO:2に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有するSEQ ID NO:2の変異配列を包含する。更に、本発明は、SEQ ID NO:4に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましく
は少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の
同一性を有するSEQ ID NO:4のポリヌクレオチド変異配列を包含する。上述の何れのポリヌクレオチド変異配列も、TR2Pの機能的または構造的特徴の少なくとも
１つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。

【００６７】遺伝暗号の縮重の結果、既知のの遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオ
チド配列に対する最小の相同性を有する幾つかのものを含め、多数のTR2Pをコー
ドするポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであ
ろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出
され得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組
合せは自然発生のTR2Pのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプ
レット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はこ
こに明確に開示されると考えられたい。

【００６８】 TR2Pをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳
密性の条件下に於いて、好ましくは自然発生のTR2Pのヌクレオチド配列に対しハ
イブリダイズ可能であり、それは実質的に異なるコドンの用法を有するTR2P又は
その誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。特定のコ
ドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又は原核生物の宿主に於いて
ペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを選択することができる。コ
ードされるアミノ酸配列を変化させることなしにTR2P及びその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作り出
された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するRNA転写物を作り出すためである。

【００６９】また本発明は、TR2P及びその誘導体をコードするDNA配列、またはその断片を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によ
って周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入
することが可能である。更に、合成化学を利用してTR2Pをコードする配列又はそ
れらの任意のフラグメントに突然変異を導入しうる。

【００７０】また本発明は、Wahl, G.M.及びS.L. Berger（1987; Methods Enzymol. 152:39
9-407）及びKimmel, A.R.（1987; Methods Enzymol. 152:507-511）によって教示された種々の厳密な条件の下で、請求されるヌクレオチド配列、特にSEQ ID N
O:2、若しくはSEQ ID NO:2の断片、並びにSEQ ID NO:4、若しくはSEQ ID NO:4の
断片に示されたものに対してハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含
む。

【００７１】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、一般に先行技術に於いても利用され、本発明の任意の実施例においても利用されうる。その方法は、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Sequenase ^ョ（US Biochemical Corp, Clevelan d, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐熱性T7ポリメラーゼ（Amersham
, Chicago, IL）、或いはGibco/BRL（Gaithersburg, MD）によって市販されるEL
ONGASE増幅システムに於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。そのプロセスは、
Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（P
TC200; MJ Research, Watertown, MA）及びABI Catalyst及び373及び377 DNA se
quencers（Perkin Elmer）のような装置によって自動化することが好ましい。

【００７２】 TR2Pをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に
於いて周知の種々の方法で伸長し、プロモータ及び調節エレメントのような上流
の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法の１つである制限部位
PCR法は、一般的なプライマーを使用し、既知の位置に隣接する未知の配列を検索する（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特にゲノムDNA
は、リンカーシークエンスに対するプライマー及び既知の領域に対して特異的な
プライマーの存在下に於いてまず増幅される。次に増幅された配列は、同様なリ
ンカープライマー及び最初のものの内に含まれる別の特異的プライマのを用いて
、2ラウンドのPCRを受ける。各ラウンドのPCRの生成物は、適切なRNAポリメラー
ゼを用いて転写され、逆転写酵素を用い配列決定される。

【００７３】また逆PCR法（inverse PCR）を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを
用いた配列の増幅、または伸長を行なうこともできる。（Triglia, T.ら（1988 ）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、市販のOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウエア（National Biosciences Inc.,Plymouth MN）や他の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチドで、50%以上のGC含量を有し、約6
8〜72℃の温度で標的配列をアニーリングするように設計する。その方法により、いくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域における適当な断片を作り出す
。そこで、この断片を分子内連結反応により環状にし、PCR用の鋳型として使用する。

【００７４】使用できる別の方法には捕獲PCR法(capture PCR)があり、この方法には、ヒト
及び酵母菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれる（Lagerstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。またこの方法
では、PCRの前に、複数の制限酵素による消化及びライゲーションを用いて、DNA
分子の未知の断片に操作された2本鎖配列を配置することもできる。未知の配列を引き出すために用いることができる別の方法として、Parker, J.D.らの方法（
1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）がある。更に、PCR、入れ子状態のプ
ライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムDNA歩行を行うことができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーのスクリ
ーニングが不要で、イントロン／エクソン接合部の発見に有用である。

【００７５】完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。またランダムに準備刺激された(ran
dom primed)ライブラリーは、遺伝子の5’領域を含む配列をより多く含むという
点で好適である。ランダムに準備刺激されたライブラリーは、オリゴd(T)ライブ
ラリーで完全長cDNAが得られない場合には特に好適である。またゲノムライブラ
リーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。

【００７６】配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラ
リーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザーで
活性化される4つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して1つ）、放射された
波長の検出を行うCCDカメラを使用する。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えば、Perkin Elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子デー
タ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、
特定のサンプル内に限られた量だけ存在するDNAの小片の配列決定に特に好適である。

【００７７】本発明の別の実施例では、TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、TR2P、その断片またはその機能的等価物の適切な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によ
って、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が作り出され、これらの配列はTR2Pのクローニングや発現のために用いること
ができる。

【００７８】当業者に理解されるように、非自然発生コドンを有するTR2Pコーディング(enc
oding)ヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原核
生物或いは真核生物の宿主において選好されるコドンを選択することにより、タ
ンパク質の発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物よ
りも長い半減期であるような望ましい特性を有するRNA転写物を作製することが可能である。

【００７９】限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、TR2Pをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再構
成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、特異的部位の突然変異誘
発により、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の
変化、スプライシングバリアントの生成、及び突然変異の導入等をもたらすこと
ができる。

【００８０】本発明の別の実施例では、TR2Pをコードする自然な、改変された、或いは組換
え型の核酸配列を、融合タンパク質をコードするために、非相同的な配列に結合
させうる。例えば、TR2P活性のインヒビターに対してペプチドライブラリーをス
クリーニングするために、市販の抗体により認識されるキメラTR2Pタンパク質を
コードすることが有用である。また、融合タンパク質はTR2Pコーディング配列と
非相同的なタンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように操作可能であ
り、これによってTR2Pを切断して非相同的な部分から分けて精製することが可能
となる。

【００８１】本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法（Caruthers. M.H.ら（1
980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T.ら（1980）Nucl. Acids
Res. Symp. Ser.225-232参照）を用いて、TR2Pをコードする配列の全体、或いは
その一部を合成することができる。或いは、化学的手法を用いてタンパク質自体
を作り出し、TR2Pのアミノ酸配列又はその一部を合成することができる。例えば
、種々の固相技術（Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204）を用いてペプチド合成を行うことができ、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）
を用いて合成の自動化を行なうことができる。

【００８２】この新たに合成されたペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより
実質的に精製することができる（Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Meth
ods Enzymol. 182:392-421.）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（the Edman degradation pr
ocedure described in Creighton, T. (1983) Proteins. Structures avd Molec ular Properties , WH Freeman and Co., New York, NY.）。更に、TR2Pのアミノ
酸配列もしくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、並
びに／又は他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と結合させる
ことにより、変異体ポリペプチドを生成可能である。

【００８３】生物学的に活性なTR2Pを発現させるために、TR2Pまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列またはその機能的等価物を、適切な発現ベクター（即ち、挿
入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿
入する。

【００８４】 TR2Pをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる。この
ような技術は、Sambrook, J.らの文献（1989；Molecular Cloning, A Laborator y Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview,NY）及びAusubel, F.M.らの文献（1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biol ogy , ch. 9. 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY）に開示されている。

【００８５】 TR2Pをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主
系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター
（例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTM
V）或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用される宿主
細胞によって限定されるものではない。

【００８６】これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（即ち、
エンハンサー、プロモーター並びに5′及び3′非翻訳領域）である。このような
エレメントの強さ及び特異性は様々である。利用されるベクター及び宿主に応じ
て、構成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメ
ントを用いることができる。例えば、細菌系にクローニングする場合、Bluescri
ptョファージミド（Stratagene, LaJolla,CA）またはpSport1^TMプラスミド（Gib co BRL）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性のプロモーターを用
いることができる。昆虫細胞においてバキュロウイルスポリヘドリンプロモータ
ーを用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエン
ハンサ（例えば、熱ショック, RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば、ウイルス性プ
ロモータまたはリーダー配列）をベクターにクローンニングできる。哺乳類細胞
系においては、哺乳類の遺伝子或いは哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ま
しい。TR2Pをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を作る必要がある場合、
SV40或いはEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いることができる。

【００８７】細菌系では、TR2Pの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる
。例えば、抗体の誘発のために大量のTR2Pが必要な場合は、容易に精製される融
合タンパク質を高レベルで発現するベクターを用いることができる。そのような
ベクターには、以下に限定しないが、TR2Pをコードする配列を、アミノ末端メチ
オニン及び後続のβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列を備えたフレーム内におい
てベクターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できるBluescriptョ（Strat agene）のような、多機能の大腸菌クローニング、発現ベクターや、pINベクター
（Van Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等
が含まれる。またpGEXベクター（Promega、Madison WI）も、グルタチオンS-トランスファーゼ（GST）を伴う融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するため用いることができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後に遊離グルタチオンの存在下
で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製できる。そのような系
において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン又はXA因子プロテアー
ゼ切断部位を含み、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随意に放出させることができるように設計できる。

【００８８】酵母菌、Saccharomyces cerevisiaeでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーターを含む多数のベクターを用いることができる。レビューには、Ausubelら（前出）及びGrantらの文献（1987；Me
thods Enzymol.153:516-544）を参照されたい。

【００８９】植物発現ベクターを用いる場合には、TR2Pをコードする配列の発現は、多数の
プロモータの何れかで行なわれ得る。例えばCaMVの35S及び19Sプロモーターのよ
うなウイルスのプロモーターを単独で用いるか、或いはTMV（Takamatsu,N.ら（1
987）EMBO J.6:307-311）由来のオメガリーダー配列と併用することができる。或いは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターのような植物プロモーターを用いてもよい（Coruzzi, G.ら（1984）EMBO J.3:1671-1680）; B
roglie, R. ら（1984）Science 224:838-843; 及びWinter, J. ら（1991）Resul
ts Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換または病原体が媒介した形質移入により植物細胞内に導入できる。このような技
術は一般に入手可能な多くの文献に記載されている（例えば、Hobbs, S.又はMur
ry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw
Hill New York,NY; pp.191-196を参照）。

【００９０】昆虫系もTR2Pの発現に用いることができる。例えば、そのような系の一つにお
いては、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼生において外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica多核角体病ウイ
ルス（AcNPV）を用いる。TR2Pをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須な領域にクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御
下に置くことができる。TR2Pコーディング配列の挿入の成功により、ポリヘドリ
ン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した組換え型のウイルスが
生成される。そこで、この組換え型のウイルスを用いて、例えばS.frugiperda細
胞またはTrichoplusiaの幼生へ感染させ、その中でTR2Pを発現させることができ
る（Engelhard, E.K.ら（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。

【００９１】哺乳類の宿主細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用すること
ができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、TR2Pをコード
する配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス
転写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域
における挿入により、感染した宿主細胞においてTR2Pを発現可能である生存可能
なウイルスが得られる（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sc
i. 81:3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような
転写エンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いること
ができる。

【００９２】また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる。

【００９３】また、特定の開始シグナルを用いて、TR2Pをコードする配列のより効率的な翻
訳を行なうことができる。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含まれる。TR2Pをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切
な発現ベクター内に挿入された場合、追加の転写または翻訳の制御シグナルは不
要である。しかし、コーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、
ATG開始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、全てのインサートの転写を確実にするために、開始コドンは正しい読み枠に
存在しなければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び
合成の両方の種々の起源に由来するものであり得る。文献（Scharf,D.ら（1994 ）Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載のように、用いられる特定
の細胞系に適切なエンハンサーを含めることで、発現の効率を高めることができ
る。

【００９４】さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力や、発現したタン
パク質を望ましい形にプロセシングする能力によって選択可能である。このよう
なポリペプチドの修飾には、以下に限定しないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、リピド化(lipidation)及びアシル化が含まれる。ま
たタンパク質の「プレプロ」形を切り離す翻訳後のプロセシングを用いて、正し
い挿入、折り畳み、及び／又は機能することを促進できる。翻訳後の活性のため
の特定の細胞器械及び特徴的な機構を有している種々の宿主細胞（例えば、CHO 、HeLa、MDCK293、WI38）は、American Type Culture Collection（ATCC; Bethe
sda, MD）より入手可能であり、これらを外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確実に行なうために選択してもよい。

【００９５】組換え型タンパク質の高収率の産生を長期間にわたり確保するためには安定し
た発現が好ましい。例えば、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性発現エレ
メント並びに選択可能なマーカー遺伝子を同一のベクター上、又は別々のベクタ
ー上に含む発現ベクターを用いて、TR2Pを安定的に発現可能な株化細胞を形質転
換することができる。ベクターの導入の後、選択培地に切り替える前に濃縮培地
内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択可能なマーカーの目的は、選択のための耐
性を与えることであり、またその存在によって導入された配列をうまく発現する
細胞の増殖および回収が可能とすることである。安定的に形質転換された細胞の
耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することがで
きる。

【００９６】形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
遺伝子（Wigler, M.ら（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I. ら（1980）Cell 22:817-23）が含まれ、それぞれは、tk^-及びapr^-細胞において用いられる。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトト
レキセートに対する耐性を与え（Wigler, M.ら(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:35
67-70）、nptはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（C
olberre-Garapin, F. ら（1981）J.Mol.Biol.150:1-14）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（Murry, 前出）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、細胞がトリプトファンの代わり
にインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチ
ノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記載されている（Hart
man, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。最近では、例えば、アントシアニン、β-グルクロニダーゼ及びその基質GUS、及
びルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカーと共に可視マーカ
ーがよく利用されるようになった。これらのマーカーは形質転換体を同定するだ
けでなく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量
を定量するために広く用いられる（Rhodes, C.A. ら（1995）Methods Mol. Biol
. 55:121-131）。

【００９７】マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばTR2Pをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、TR2Pをコードする配列
を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同
定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、マーカー遺伝子をTR2P
をコードする配列と直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識
遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。

【００９８】或いは、当業者に周知の様々な方法により、TR2Pをコードする核酸配列を含み
TR2Pを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション並びに、核酸とタンパク質
配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若しくはチッ
プを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。

【００９９】 TR2Pをコードするポリヌクレオチドの断片またはプローブ若しくは断片を用い
るDNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション又は増幅により、TR2Pをコード
するポリヌクレオチド配列の存在を検出できる。TR2PをコードするDNA或いはRNA
を含む形質転換体を検出するために、核酸増幅に基づくアッセイは、TR2Pをコー
ドする核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーの使用を含む。

【０１００】 TR2Pの発現を検出・測定するための種々のプロトコルは、このタンパク質に特
異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用い、また当業
者に周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。T
R2P上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclon
al-based immunoassay）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これら
アッセイおよび他のアッセイは、例えばHampton, R.らの文献（1990; Serologic al Methods, a Laboratory Manual , Section IV, APS Press, St Paul ,MN）及びMaddox, D.E.らの文献（（1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）に詳細に記載
されている。

【０１０１】多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。TR2Pをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識（oligolabeling）、
ニックトランスレーション法、末端標識（end-labeling）、或いは標識ヌクレオ
チドを用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、TR2Pをコードする配列、又はその任意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例え
ばT7、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを
加えることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, MI）；Promega
（Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp.,Cleveland, OH提供）を用いて実
施することができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即
ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質
、コファクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。

【０１０２】細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、TR2Pを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／ま
たはベクターに応じて分泌される、つまり細胞内に含まれるようにすることがで
きる。当業者に理解されるように、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを含む発
現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してTR2P分泌を指向するシグナ
ル配列を含むように設計することができる。また他の作製物を用いることにより
、TR2Pをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドド
メインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。そのような精製
を容易にするドメインには、以下に限定しないが、固定化金属上での精製を可能
にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド類
、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、及びFLA
GS延長／アフィニティー精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex Co
rp., Seattle WA）が含まれる。精製ドメインとTR2Pコーディング配列の間におけるXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）に対して特異
的な配列のような切断可能なリンカー配列の包含により、精製が容易になる。こ
のような発現ベクターの１つは、TR2Pおよびチオレドキシン及びエンテロキナー
ゼ切断部位に先行する6個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質を発現する。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラ
フィー（IMAC；Porath, Jら (1992) Prot. Exp. Purif. 3:263-281に記載）での
精製を促進する一方、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質からのTR2Pの
精製のための手段を与える。融合タンパク質を含むベクターについての解説は、
Kroll, D.J.ら（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に記載されている。

【０１０３】組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
TR2Pの断片を作り出すことができる（Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc.
85:2149-2154参照）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができる。自動化された合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。TR2Pの種々の断片を個別に合成
して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。

【０１０４】治療 TR2P-1と、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185）及びヒトTNF-R2（GI 146
9541）との間に化学的および構造的相同性が存在する。更にTR2P-1は、腫瘍、免
疫、胃腸、生殖、造血、心血管、結合、及び胎生組織において発現される。従っ
てTR2P-1は、骨形成、発生、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患において所定の役割
を担っていると考えられる。

【０１０５】 TR2P-2と、ヒトTNF-R2（GI 1469541）及びヒトオステオプロテグリン（GI 207
2185）との間に化学的及び構造的相同性が存在する。更にTR2P-2は、腫瘍、免疫
、皮膚、胃腸、造血、生殖、神経、泌尿器、及び心血管の組織において発現され
る。従ってTR2P-2は、生殖、免疫、及び潰瘍性の疾患において所定の役割を担っ
ていると考えられる。

【０１０６】従って、一実施例においては、骨形成疾患の治療または予防のためにTR2P又は
フラグメント又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような腫瘍性
疾患には、以下に限定はしないが、軟骨形成不全、キャフィー病、頭蓋骨幹端異
形成不全症、大理石骨病、骨粗鬆症-偽性神経膠腫症候群、骨ページェット病、易捻挫性小人症(parastremmatic dwarfism)、及び多骨性溶骨性異形成症が含まれる。

【０１０７】別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治療ま
たは予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクター
を被験者に投与することがある。

【０１０８】また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治
療または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験
者に投与することがある。

【０１０９】更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む骨形成疾患の治
療または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与するこ
とがある。

【０１１０】一実施例においては、発生障害の治療または予防のためにTR2P又はフラグメン
ト又はその誘導体を被験者に投与することがある。ここで用語「発生障害」は、被
験者の組織、器官、又は系（例えば、脳、副腎、腎臓、骨格または生殖系等）の
発育および機能と関係する任意の疾患を指す。そのような疾患には、以下に限定
はしないが、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全小
人症、デュシェンヌ及びベッカー筋ジストロフィー、てんかん、生殖腺発育異常
、WAGR症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シ
ャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症のような遺伝性神経障害、甲状腺
機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病および脳性麻痺のような発作障害、二分脊
椎、及び先天性緑内障、白内障、又は感音性聴力損失が含まれる。

【０１１１】別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療また
は予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクターを
被験者に投与することがある。

【０１１２】また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療
または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験者
に投与することがある。

【０１１３】更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む発生障害の治療
または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与すること
がある。

【０１１４】一実施例においては、生殖障害の治療または予防のためにTR2P又はフラグメン
ト又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような疾患には、以下に
限定はしないが、プロラクチン産生異常、卵管異常・排卵異常・子宮内膜症を含
む不妊症、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激
症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生、乳
房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳、精子形成の混乱、異常性精子生理、精巣の
癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、及び前立腺炎、男性の乳房や女性化乳房
の癌が含まれる。

【０１１５】別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療また
は予防のために、TR2P又はフラグメント又はその誘導体を発現可能なベクターを
被験者に投与することがある。

【０１１６】また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療
または予防のために、適切な医薬用担体と共にTR2Pを含む医薬品組成物を被験者
に投与することがある。

【０１１７】更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療
または予防のために、TR2Pの活性を調節するアゴニストを被験者に投与すること
がある。

【０１１８】更なる実施例においては、免疫疾患の治療または予防のためにTR2P又はフラグ
メント又はその誘導体を被験者に投与することがある。そのような疾患には、以
下に限定はしないが、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレルギー、貧
血、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大
腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎
、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過剰好酸球増加症、被刺激性の腸シンドロ
ーム、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心臓周囲の
炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェー
グレーン症候群、ウェルナー症候群、自己免疫性の甲状腺炎、癌・血液透析・体
外循環の合併症、潰瘍性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫様の感染症
、及び心的外傷が含まれる。一態様では、TR2Pと特異的に結合する抗体をアンタ
ゴニストとして直接用いるか、或いはTR2Pを発現する細胞や組織に薬剤をもたら
す送達機構またはターゲティングとして間接的に用いることができる。

【０１１９】別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む免疫疾患の治療また
は予防のために、TR2Pをコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチドの相補
配列を発現するベクターを被験者に対して投与することがある。

【０１２０】更なる実施例においては、腫瘍性疾患の治療または予防のためにTR2Pのアンタ
ゴニストを被験者に投与することがある。そのような疾患には、以下に限定はし
ないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに特
に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓
、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓
、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一態様では、TR2Pと特異的に
結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いるか、或いはTR2Pを発現する細胞
や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲティングとして間接的に用いるこ
とができる。

【０１２１】別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む腫瘍性疾患の治療ま
たは予防のために、TR2Pをコードするポリヌクレオチドのポリヌクレオチドの相
補配列を発現するベクターを被験者に対して投与することがある。

【０１２２】他の実施例においては、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、
アゴニスト、相補的配列またはベクターを、他の適切な治療薬と組合せて投与す
ることもできる。従来の製薬の原理に基づき、当業者は併用療法で使用するため
の適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与える相乗作用をしうる。この方
法を用いることにより、各薬剤の少ない投与量で治療効果を上げることができ、
従って副作用の可能性を低下させることができる。

【０１２３】 TR2Pのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたTR2Pを用いて、抗体を作り出し、或いはTR2Pに特異的に
結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングすること
ができる。TR2Pに対する抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生するこ
とができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現
ライブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体
形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。

【０１２４】抗体を産生するために、TR2Pか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫学
的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのような
アジュバントには、以下に限定しないが、フロイントのアジュバント、アルミニ
ウムの水酸化物ようなミネラルゲルアジュバント、リゾレシチンのような界面活
性剤アジュバント、プルロニックポリオール(pluronic polyols)アジュバント、
ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、オイルエマルジョンアジュ
バント、KLHアジュバント及びジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ヒトで使用するアジュバントのなかで、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。

【０１２５】 TR2Pに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド類、
またはその断片は、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプ
チド、ペプチド、または断片は、自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で
、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。TR2Pア
ミノ酸の短い伸展部が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１２６】 TR2Pのモノクローナル抗体は、培養における連続的な株化細胞によって抗体分
子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限
定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハイブリドーマ技術（Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D. ら(1
985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）が含ま
れる。

【０１２７】さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を備えた分子を得るために、「キメ
ラ抗体」の産生、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのため
に開発された技術が用いられる（Morrison,S.L.ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci
. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nature 312:604-608;Takeda, S. ら(
1985)Nature 314:452-454）。或いは、当業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、TR2P-特異的単鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有し、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み
合わせの免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合(chain shuffling)によって産生することができる（Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-
3）。

【０１２８】また文献（Orlandi, R.ら(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Wi
nter, G.ら(1991) Nature 349:293-299）に開示されているように、抗体は、免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニ
ングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより産生することができる。

【０１２９】またTR2Pに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えば、このような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプ
シン消化により生成することができるF(ab’)₂フラグメントや、F(ab’)₂フラグ
メントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に識別可能なように、Fab発現ライブラリーを構成しうる（H
use, W.D.ら(1989)Science 254:1275-1281）。

【０１３０】種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を識別するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合アッセイ或いは免疫
放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイム
ノアッセイには、一般にTR2Pとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が
含まれる。2つの非干渉TR2Pエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（two sites monocl
onal based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられうる
（Maddox , 前出）。

【０１３１】本発明の別の実施例では、TR2Pをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、TR2Pをコードするポリヌクレ
オチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、TR2Pをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、TR
2Pの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子また
は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片が、TR2Pをコードする配
列のコード領域や調節領域に従う様々な位置から設計可能である。

【０１３２】レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、TR2Pをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核
酸配列を発現するベクターを産生することができる。これらの技術は、例えばSa
mbrook（前出）及びAusubel（前出）に記載されている。

【０１３３】 TR2Pをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、TR2Pをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続けうる。一過性の発現は、非複製ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合にはさらに長い期間持続し得る。

【０１３４】前述のように、TR2Pをコードする遺伝子の制御、5’、即ち調節領域に対する相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによって、遺伝子発現の修飾を行なうことができる。転写開始点、例えば開始部位か
ら+10〜-10の位置に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重ら
せん体」塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラー
ゼ、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける
能力を阻害するので、三重らせん対合は有用である。三重のDNAを用いた最近の治療の進歩については、文献（Gee, J.E.ら(1994)In: Huber, B.E.及びB.I. Car
r, Molecular and Immunologic Approaches, pp.163-177, Futura Publishing C
o., Mt.Kisco,NY）に記載されている。転写物のリボソームへの結合を阻止することによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセンス分子を
設計し得る。

【０１３５】リボザイム、酵素RNA分子はRNAの特異的切断を触媒することができる。リボザ
イム作用機構では、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後ヌクレオチド鎖切断が行なわれる。例えば、操
作されたハンマーヘッド(hammerhead)モチーフリボザイム分子は、TR2Pをコード
する配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。

【０１３６】任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続する配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌクレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価することができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用い
、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接触性(acc
essibility)の検査により評価することができる。

【０１３７】本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、TR2PをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことができる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。

【０１３８】細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾することができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及び／又は3′末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子にに拡張
可能である。

【０１３９】細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466）。

【０１４０】前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及
び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用する
ことができる。

【０１４１】本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、TR2P、TR2Pの
抗体、TR2Pの擬態(mimetics)、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビター
からなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような
1以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖
或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホ
ルモンと結合した形で患者に投与されうる。

【０１４２】本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれうる。

【０１４３】活性成分に加えて、これらの医薬成分は、活性化合物を医薬上使用できる製剤
にするための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認
められる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Reming ton's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton,PA）の最新版
に記載されている。

【０１４４】経口投与のための医薬成分は、当技術分野でよく知られる医薬上認められる担
体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により、医
薬成分を、患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体剤、
ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に処方できる。

【０１４５】経口投与に用いるための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを配合すること
によって得られるが、必要に応じて適切な補助剤を添加した後に、また（所望に
より、得られた混合物を粉砕した後に）顆粒の混合物を処理し、錠剤或いは糖衣
丸コア(dragee core)を作ることができる。必要ならば、適切な添加物が加えられる。適切な医薬品添加物には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤、トウモロコシ、
コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのよう
なセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴム、並びにゼラ
チン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、クロスリン
クしたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸
、又はその塩のような、崩壊剤(disintegrating agents)或いは可溶化剤が加えられる。

【０１４６】糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切なコーティングと結合するが、溶液には
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物を含みうる。錠剤の識別のため、或いは活性化
合物の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。

【０１４７】経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる柔らかくシールされたカプセル及びグリセロール或いは
ソルビトールのようなコーティングが含まれる。プッシュフィットカプセルは、
ラクトース或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリ
ン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された活性成分
を含みうる。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、安定剤とともに或いは
安定剤なしに、脂肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような
適切な液体に溶解或いは懸濁される。

【０１４８】非経口投与用の製剤は、水溶液中、好適にはハンク溶液(Hanks's solution)、
リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中
で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物
質を含みうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製
される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪性の油や、オ
レイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステル
を含む。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。
所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可
能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。

【０１４９】局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。

【０１５０】本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。

【０１５１】この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態であるよりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースにおいて、好
適な製剤としては、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたpH4.5〜5.5の範囲にある2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは
全てを含む凍結乾燥粉末でもよい。

【０１５２】医薬組成物は、調製された後に適切な容器内に入れられて、示された状態の治
療のためにラベル付けされうる。TR2Pの投与の場合では、このようなラベルには
、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。

【０１５３】本発明において使用するのに適切な医薬組成物は、所望の目的を達成するため
に、活性成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。

【０１５４】任意の化合物の場合、治療に有効な量は、例えば最初は腫瘍性細胞の細胞培養
のアッセイにおいて見積もられ、或いは一般にマウス、ウサギ、イヌ、ブタのよ
うな動物モデルにおいて見積もられる。そこで、このような情報を利用して、ヒ
トにおける有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１５５】治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるTR2Pまたはその断片
、TR2Pの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの活性成分の量
である。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な
製薬方法により、例えばED50(母集団の50%における治療的な有効投与量）または
LD50(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによって決定することができる。毒性と治療的な有効性との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。医薬組成物は大きな治療指数を示すことが好ましい
。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための
投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分の用量は、毒
性少ないか或いは全く毒性がなく、ED50を含む循環する濃度の範囲内にあること
が好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じて、投与量はこ
の範囲内で変化する。

【０１５６】正確な用量は、治療が必要な被験者に関連する要因の観点から医師が決定する
。投与及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与える、即ち所定の効果を維持
するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、被験者の
通常の健康、年齢、体重、性別、食餌、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反
応感受性、および治療への耐性／反応が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は
３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の製剤のクリアランス速度に
応じて２週間に１度投与してもよい。

【０１５７】通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。

【０１５８】診断別の実施例においては、TR2Pに特異的に結合する抗体を、TR2Pの発現によって
特徴づけられる状態や疾病の診断や、TR2P又はTR2Pのアゴニスト、アンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対し有用な抗体は、前述の治療のためのものと同
様の方法で作製することができる。TR2Pの診断のアッセイには、ヒトの体液、細
胞或いは組織の抽出物においてTR2Pを検出するために抗体および標識を用いる方
法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有結
合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識するこ
とができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、その幾つかにつ
いては前述の通りである。

【０１５９】 ELISA、RIA及びFACSを含む、TR2Pを測定するための種々のプロトコルが当技術分野では周知であり、またこれによりTR2P発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。TR2Pの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物とTR2Pに対する抗体を結合させることによって確立できる。標準の複
合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光の手段を用いて定量化できる。被験
者の生検組織からの調節及び疾病サンプルにおいて発現されたTR2Pの量を、標準
値と比較する。標準値と被験者の値との偏差から、疾病診断のためのパラメータ
が確立される。

【０１６０】本発明の別の実施例において、TR2Pをコードするポリヌクレオチドを、診断目
的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチ
ド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドは、TR2Pの発現が疾病と関連するような生検組織における遺伝子発現を検出および
定量するために用いられる。診断アッセイは、TR2Pが存在、非存在、過剰発現の
いずれの状態かを識別したり、治療の処置の際にTR2Pレベルの調節をモニタリン
グするために用いることができる。

【０１６１】一態様では、TR2Pまたは近い関連の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、TR2Pをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性
、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5′調節領域）に由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、特に3′コーディング領域）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増
幅（最大の、高い、中程度の或いは低い）の厳密性によって、そのプローブがTR
2Pをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列
も同定するかということが決定される。

【０１６２】プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はTR2Pをコードする任意の配列からのヌクレオチドを少なくとも50%含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAやRNAか、またSEQ ID N
O:2、SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列に由来するものか、或いは自然発生TR2Pの
イントロン、エンハンサーエレメント、及びプロモータを含むゲノムの配列に由
来するものでもよい。

【０１６３】 TR2PをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製するための手段には、mRNAプローブを作り出すために、TR2P又はTR2P誘導体を
コードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。
このようなベクターは当業者に周知であり、また市販されており、適切なRNAポリメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroで
RNAプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、この標識には、³²P や³⁵Sのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等が含まれる
。

【０１６４】 TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列を、TR2Pの発現に関係する疾患の診断
のために用いることができる。そのような疾患の例には、以下に限定はしないが
、軟骨形成不全、キャフィー病、頭蓋骨幹端異形成不全症、大理石骨病、骨粗鬆
症-偽性神経膠腫症候群、骨ページェット病、易捻挫性小人症、及び多骨性溶骨性異形成症等のような骨形成疾患や、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング
症候群、軟骨形成不全小人症、デュシェンヌ及びベッカー筋ジストロフィー、て
んかん、生殖腺発育異常、WAGR症候群、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異
形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症のような
遺伝性神経障害、甲状腺機能低下症、水頭症、シドナム舞踏病および脳性麻痺の
ような発作障害、二分脊椎、及び先天性緑内障、白内障、又は感音性聴力損失等
のような発生障害や、プロラクチン産生異常、卵管異常・排卵異常・子宮内膜症
を含む不妊症、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過
刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生
、乳房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳、精子形成の混乱、異常性精子生理、精
巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、及び前立腺炎、男性の乳房や女性化
乳房の癌等のような生殖障害や、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレ
ルギー、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病
、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、
萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過剰好酸球増加症、被刺激性の
腸シンドローム、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または
心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮
症、シェーグレーン症候群、ウェルナー症候群、自己免疫性の甲状腺炎、癌・血
液透析・体外循環の合併症、潰瘍性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫
様の感染症、及び心的外傷等のような免疫疾患や、腺癌、白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房
、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲
状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌
等のような腫瘍性疾患が含まれる。TR2Pをコードするポリヌクレオチド配列を、
患者の生検組織や体液を利用するサザンブロットまたはノーザン分析、ドットブ
ロット法或いは他の膜ベース(membrane-based)技術や、PCR技術や、ディップスティック試験法(dipstick)、ピン、ELISAアッセイまたはマイクロアレイにおいて用いて、TR2P発現の変化を検出することができる。このような定性的または定
量的試験法は当業者に周知のものである。

【０１６５】特定の態様では、特に上述のような関連する疾患の存在を検出するアッセイに
おいて、TR2Pをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。TR2Pをコードす
るヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識され、またハイブリダイゼーション
複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることが
できる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルは洗浄され、シグナ
ルが定量されて標準値と比較される。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、
比較できる対照サンプルから有意に変化している場合、そのヌクレオチド配列は
サンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、またサンプルのなかの
TR2Pをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化するということは、関連する
疾患の存在を示している。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床
試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法
の有効性を評価することもできる。

【０１６６】 TR2Pの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な被験者から採取された
体液或いは細胞抽出物を、TR2Pをコードする配列又はその断片と結合させること
により達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得られ
る値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られる値とを比較することにより定量しうる。正常なサンプルから得られた標
準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較することができ
る。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。

【０１６７】一旦疾患の存在が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者にお
いて観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。連続的な
アッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示す
ことができる。

【０１６８】癌に関しては、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在が、疾
病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するた
めの手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予
防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に
癌の発生や更なる進行を予防することができる。

【０１６９】 TR2Pをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの付加的な診断のた
めの使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成され、酵素を用いて作製され、またはin vitroで作製されてもよい。オリゴマー
は、好ましくはTR2Pをコードするポリヌクレオチドの断片、またはTR2Pをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子
或いは状態を識別するための最適化された条件の下で用いられる。また深く関わ
るDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密
性の条件で用いることができる。

【０１７０】またTR2P発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（Melby, P.C.ら(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Biochem. 229-2
36）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に
存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELISA形式においてアッセイを実施することによって加速することができる。

【０１７１】別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺伝子の変異配列、変異及び
多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的
基礎の理解、疾病の診断、並びに治療薬の開発およびその活性のモニタリングに
おいて有用である。

【０１７２】一実施例においては、PCT出願WO95/11995（Cheeら）、Lockhart, D. J. ら（
1996; Nat.Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M.ら（1996; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 93: 10614-10619）に記載のような当業者に周知の方法に従いマイクロ
アレイを準備して利用する。これらの文献はここで言及することにより本明細書
の一部とする。

【０１７３】マイクロアレイは、固形支持体に固定された、一般に合成アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドまたはcDNAの断片の何れかの、数多くの独特の1本鎖の核酸配列から好ましくは構成される。そのオリゴヌクレオチドは、好ましくは約6〜60個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは約15〜30個のヌクレオチドの長さ、最も好
ましくは約20〜25個のヌクレオチドの長さをなす。マイクロアレイの一定のタイ
プに対しては、約7〜10個のヌクレオチドの長さしかないオリゴヌクレオチドを用いるのが好ましいことがあり得る。マイクロアレイは、既知の5’又は3’配列
をカバーするオリゴヌクレオチドや、完全長配列をカバーする連続的なオリゴヌ
クレオチドや、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選択された独特のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイで用いられるポリヌクレオチドは、
少なくとも配列の断片が既知である目的の遺伝子又は遺伝子群に特異的なオリゴ
ヌクレオチドか、特定の細胞または組織のタイプ、または正常、発生的若しくは
疾患状態に対して共通な１またはそれ以上の未同定のcDNAに特異的なオリゴヌク
レオチドであり得る。所定の状況においては、マイクロアレイにおいて対をなす
オリゴヌクレオチドを用いることが適当である。その対は、配列の中央に好まし
くは位置する1つのヌクレオチドを除けば、同一のものである。その対における第2のオリゴヌクレオチド（１つのヌクレオチドは一致していない）は、調節に役立つ。対をなすオリゴヌクレオチドの数は、約2〜1,000,000の範囲である。

【０１７４】マイクロアレイのための既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを作製するた
めに、コンピュータアルゴリズムを用いて、ヌクレオチド配列の5’またはより好ましくは3’末端から始めて、目的の遺伝子を調査する。このアルゴリズムにより、その遺伝子に独特な、ハイブリダイゼーションに適した範囲のGC含量を有
する、ハイブリダイゼーションを妨げうる予想された二次構造のない、限定され
た長さのオリゴマーを同定する。ある局面においては、オリゴマーは、光照射(l
ight-directed)化学プロセスを用いて、基板上の指定された領域において合成さ
れる。その基板は、紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン、フィルタ、チ
ップ、スライドガラス、又は他の適切な任意の固形支持体であり得る。

【０１７５】別の局面では、オリゴヌクレオチドを基板表面上で、PCT出願WO95/251116 （B
aldeschweilerら）に記載のような化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて合成することができる。前記PCT出願はここで言及することにより本明細書の一部とする。また別の局面では、ドットブロット又はスロットブロット
（HYBRIDOT^ョ apparatus, IBCO/BRL）に類似のグリッドアレイを用い、真空システム、熱、UV、機械的又は化学的結合プロシージャを利用してcDNA断片又はオリ
ゴヌクレオチドを基板の表面に対して配置及び結合することができる。更に別の
態様では、アレイは、手作業或いは市販の装置で、材料、及び機械（Brinkmann^ョマルチチャネルピペッターまたはロボット装置を含む）を用いることにより製
作することができ、また市販の器具を効果的に使用できる8、24、96、384、1536、又は6144個のオリゴヌクレオチド、或いは2個から100万個の範囲の任意の数のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。

【０１７６】マイクロアレイを用いてサンプル解析を実施するために、ポリヌクレオチドが
生物学的サンプルから抽出される。生物学的サンプルは、任意の体液（血液、尿
、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、または他の組織標本から得られ
る。プローブを作製するために、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、
マイクロアレイ上の核酸と相補的な核酸配列を作るのに用いられる。マイクロア
レイがcDNAからなる場合、アンチセンスRNA（aRNA）がプローブに適している。従って、ある局面においては、mRNAを用いてcDNAを生成し、次に蛍光性ヌクレオ
チドの存在下において、cDNA用いてフラグメントまたはオリゴヌクレオチドaRNA
プローブを作製する。これらの蛍光性に標識されたプローブをマイクロアレイと
共にインキュベートし、プローブ配列がマイクロアレイのcDNAオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズすようにする。別の態様では、プローブとして用いられる核
酸配列には、ハイブリダイズ技術として当業者に周知の制限酵素、PCR技術およびオリゴラべリング(Oligolabeling)またはTransProbe kits (Pharmacia & Upjo
hn)を用いて作り出されたポリヌクレオチド、断片、および相補的配列もしくはアンチセンス配列が含まれる。

【０１７７】インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的一致を
伴い起こるか、或いはより低い相補性の種々のレベルで起こるように調節される
。ハイブリダイズしていないプローブを取り除いた後、スキャナーを用いて、蛍
光のレベル及びパターンを決定する。マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド
配列の相補性の程度及び相対的な量を決定するために、スキャンされたイメージ
を調べる。検出システムを用いて、全ての個別の配列に対して同時にハイブリダ
イゼーションの非存在、存在、及び量を測定することができる。このデータは、
サンプル中の配列、突然変異、変異体、又は多形体におけるラージスケールの相
関性の研究、または機能分析のために用いることができる（Heller. R.A.ら (19
97) Proc.Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155.）。

【０１７８】本発明の別の実施例においては、TR2Pをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又
は人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、
Price, C.M. の文献（1993；Blood Rev. 7:127-134）及びTrask, B.J. の文献（1991；Trends Genet. 7:149-154）に記載のように、ヒト人工染色体（HACs）、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体（BACs）、細菌性P1作製物又は1 本鎖染色体cDNAライブラリーがある。

【０１７９】蛍光性インサイチューハイブリダイゼーション（FISH. 、Heinz-Ulrichら (19
95) in Meyers, R.A. (ed.) Molecular Biology and Biotechnology, pp. 965-9
68, VCH Publishers New York, NY.に記載）は、他の物理的な染色体マッピング
技術及び遺伝地図データと関連し得る。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、
またはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）部位に見られる。物理的な染色体地図上のTR2Pをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定
の疾病の素因との関連性の助けにより、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定めることができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、即ち
発症した個体との遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１８０】遺伝地図を広げるために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的なマッピング技術
を用いることができる。場合によっては、特定のヒト染色体の数やアームが未知
であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連す
るマーカーが明らかになる。物理的なマッピングによって、新たな配列を染色体
のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニ
ングまたは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値あ
る情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えば
AT to 11q22-23（Gatti, R.A.ら（1988）Nature 336:577-580）への遺伝連鎖によって不完全な局所化がなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は
、さらなる研究のための関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る。また、本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャリア、即ち発
症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違いを検出するこ
ともできる。

【０１８１】本発明の別の実施例においては、TR2Pや、その触媒作用性または免疫原性断片
、即ちそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のでありうる。TR2Pと検定する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。

【０１８２】用いることのできる別の薬物スクリーニング技術として、公開されたPCT出願W
O84/03564（Geysenら）に記載のような、目的のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される。この方法
において、多くの異なる小形の試験化合物が、プラスチックピン或いは別の表面
のような固体基質において合成される。試験化合物をTR2P又はその断片と反応さ
せ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合TR2Pを検出する。ま
た、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製されたTR2Pを
プレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用い
て、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。

【０１８３】別の実施例においては、TR2P結合のためにTR2Pと結合可能な中和抗体が試験化
合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができ
る。この方法において、抗体を用いて、1またはそれ以上の抗原決定基をTR2Pと共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１８４】さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレッ
ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含む特性の現在周知のヌ
クレオチド配列の特性に基づくものであれば、TR2Pをコードするヌクレオチド配
列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。

【０１８５】以下に示す実施例は本発明の例示であって、本発明を限定しようとするもので
はない。

【０１８６】

【実施例】

１ SPLNNOT04 cDNAライブラリーの作製 SPLNNOT04 SPLNNOT04 cDNAライブラリーは、脳無酸素症で死亡した2歳のスペイン人の男児から得られた正常な脾臓の微視的組織から作製された（specimen #RU95-09-06
64; International Institute for the Advancement of Medicine,Exton,PA）。
患者の血清学および過去の病歴には注目すべきものはなかった。

【０１８７】グアニジニウムイソチオシアネート溶液中で凍結組織をBrinkmann Homogenize
r Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments,Westbury,NJ）を用いて均質化および溶解した。溶解産物は、Beckman L8-70M超遠心機のBeckman SW28ローター（
Beckman Instruments）を用いて、室温において25,000rpmで18時間、5.7MのCsCl
クッションで遠心分離した。RNAを酸性フェノール（pH4.7）で抽出し、0.3Mの酢
酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノールを用いて沈殿させ、RNAseフリーの水に再
懸濁させ、37℃においてDNaseで処理した。前述のようにRNAを抽出し、沈殿させ
た。mRNAをQiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）を用いて単離し
てSPLNNOT04 cDNAライブラリーの作製に使用した。

【０１８８】 KIDNTUT13 KIDNTUT13 cDNAライブラリーは、腎尿管切除の際に51歳の白人女性から得られ
た左の腎臓の上側の極の組織から作製された。左の腎臓の病理報告は、グレード
3の腎臓明細胞癌が、莢膜(capsule)に対して付着性である出血性および嚢胞性の
上側の極の塊(upper pole mass)を形成していることを示している。腎静脈には腫瘍がなかった。非腫瘍性腎臓の実質組織および副腎には注目すべきものはなか
った。尿管の縁は腫瘍に対して陰性であった。患者は背部痛を呈していた。患者
の病歴には、抑うつ障害、パニックを伴う広場恐怖、低血糖、機能性下痢、嚥下
障害、複数の関節における関節痛、子宮内膜症、正常分娩、成人虐待症候群が含
まれていた。既往手術には、全体の腹式子宮切除およびアデノイド口蓋扁桃摘出
が含まれていた。患者の投薬には、トリアムテレン、プロプラノロールハイドロクロライド、Prilosec^ョ（オメプラゾール; Astra/Merck Group,Wayne,PA）、ビタミンE、C及びβカロチン、Questran^ョ Light（Cholestyramine for Oral Sus pension; Bristol-Myers Squibb Company,Princeton,NJ）、Trazadone Hydrochl
oride、プロテインサプリメントが含まれる。家族歴には、祖父（母）のタイプI
I糖尿病、悪性の結腸腫瘍、良性の高血圧症、父親の不安状態および開胸冠動脈血管形成、並びに母親、父親、同胞の腎臓結石が含まれる。

【０１８９】凍結組織をBrinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instrument
s）を用いて均質化し、Trizol試薬（1g tissue/10ml Trizol;Cat.#10296-028;Gm
co-BRL,Gaithersburg,MD）、フェノール及びグアニジニウムイソチオシアネート
のモノプラスチック(monoplastic)溶液中に溶解した。氷上での短いインキュベーションの後に、クロロフォルム（1:5 v/v）を添加して溶解産物を遠心分離した。上側のクロロフォルム層を未使用のチューブに移し、RNAをイソプロパノールで抽出し、DEPC処置水に再懸濁させ、37℃で25分間Dnaseで処理した。前述のようにRNAを抽出し、沈殿させた。mRNAをQiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc. ）を用いて単離してKIDNTUT13 cDNAライブラリーの作製に使用した。

【０１９０】両方のライブラリーからのRNAは、SuperScript Plasmid Systemの推奨プロトコル(Catalog #18248-013.GIBCO-BRL)に従って取扱った。cDNA合成は、NotI-oli
go d(T)プライマーで開始した。2本鎖cDNAを平滑末端化し、EcoRIアダプタと結合させ、NotIで消化し、セファロースCL4Bカラム(Cat. #275105-01;Pharmacia) において分別し、400bpを超えるこれらのcDNAをpINCYベクター（インサイト社）
のNotI 及びEcoRI 部位と結びつけた。続いて両方のライブラリーに対するプラスミドpINCYをDH5α^TMコンピテント細胞（Cat.#18258-012,GIBCO-BRL）に形質転
換した。

【０１９１】２ cDNAクローンの単離および配列決定両方のライブリーの場合において、プラスミドDNAを細胞から遊離し、REAL Pr
ep 96 Plasmid (Catalog #26173,QIAGEN,Inc.)を用いて精製した。推奨プロトコ
ルを用いたが、以下の点を変更した。１）細菌は、25mg/Lのカルベニシリン及び
0.4%のグリセロールと共に1mlの滅菌Terrific Broth(Catalog #22711,GIBCO-BRL
)において培養した。２）接種の後、培養株を19時間インキュベートし、インキュベーションの終了時に細胞を0.3mlの溶解バッファーで溶解した。３）イソプロパノール沈殿の後に、プラスミドDNAペレッを0.1mlの蒸留水中に再懸濁した。
プロトコルの最終ステップの終了後に、サンプルを96穴ブロックに移して4℃で保管した。

【０１９２】 Peltier Thermal Cyclers （PTC200 from MJ Research, Watertown,MA）並びにApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems及びHamilton Micro Lab 22
00 （Hamilton,Reno,NV）を組み合わせて用いて、Sangerら（1975,J.Mol.Biol.9
4:441f）の方法によってこのcDNAの配列決定を行ない、読み枠を画定した。

【０１９３】３ cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 GenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIデータベースにおいて、配列表のヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いた。
これらのデータベースには既に同定された注釈付きの配列が含まれており、BLAS
T(Basic Local Alignment Search Tool)を用いて相同性を有する領域をこのデー
タベースの中から検索した（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；及び
Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403-10）。

【０１９４】 BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、配列類似性を判定する。そのアライメントの局部的性質のため、BLASTは厳密な一致を判定する、即ち原核生物（細菌）又は真核生物（動物、真菌、植物）起源のホ
モログを同定する際に特に有効である。他のアルゴリズム、例えばSmith,Tら(19
92, Protein Engineering 5:35-51)に記載のアルゴリズムを、一次配列パターン
及び二次的な構造ギャップペナルティを取り扱う際に用いることができる。本明
細書に開示された配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不要な塩基
は12%未満である（ここでは、A、C、G、TではなくNが記録される）。

【０１９５】 BLASTアプローチは、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する。また、BLASTは、発見されたあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性のしきい値を満たすそれらの一致のみを報告する。本出
願でのしきい値は、ヌクレオチドで10^-25、ペプチドで10^-14に設定した。

【０１９６】インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、そして同じクローンか
ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索
した。

【０１９７】４ノーザン分析ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrookら、前出,
ch.7並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16.）。

【０１９８】 BLAST（Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul,S.F.ら(1990)
J.Mol.Evol. 215:403-410）を使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenB
ank或いはLIFESEQ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデー
タベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブ
リダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更
して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類され
るかを決定することができる。検索の基準は、以下で定義される積スコア（prod
uct score）である。（%配列同一性×%最大BLASTスコア）／100 積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れる。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積ス
コア70の場合は正確な一致となる。相同性分子は通常、15〜40間の積スコアを示す
分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子
が同定される場合もある。

【０１９９】ノーザン分析の結果は、TR2Pをコードする転写物が発生するライブラリのリス
トとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定の転
写物がcDNAライブラリ内に現れる回数を正に表すものであり、存在率は、存在量
をcDNAライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０２００】５ TR2Pをコードするポリヌクレオチドの伸長インサイト社クローン1533650、2581223の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチ
ド配列を完全長まで伸長するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
各核酸配列に対して、一方のプライマーを合成してアンチセンスポリヌクレオチ
ドの伸長を開始し、他方のプライマーを合成してセンスポリヌクレオチドの配列
を伸長を開始した。プライマーを用いることにより、対象の領域に対する新たな
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列
の伸長を容易にした。初期のプライマーを、OLIGO4.06 (National Biosciences)
或いは他の適切なプログラムを用いて、約22〜30ヌクレオチドからなる長さで、
50%以上のGC含有物を有し、且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにcDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸展も避けた。

【０２０１】選択されたヒトcDNAライブラリ(Gibco/BRL)を用いて配列を伸長した。２つ以上の伸長が必要である、もしくは望まれる場合には、さらに別のプライマの組を
設計して既知領域をさらに伸長させる。

【０２０２】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。PCRはPeltier Thermal
Cycler (PTC200; M.J.Research, Watertown,MA)を用いて実施され、以下のパラ
メータで、40pmolの各プライマおよびキットの他の全ての成分を推奨された濃度
で開始した。ステップ1 94℃で1分間(初期変性）ステップ2 65℃で1分間ステップ3 68℃で6分間ステップ4 94℃で15秒間ステップ5 65℃で1分間ステップ6 68℃で7分間ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル繰返すステップ8 94℃で15秒間ステップ9 65℃で1分間ステップ10 68℃で7分15秒間ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル繰返すステップ12 72℃で8分間ステップ13 4℃（保持する）反応混合物の5〜10μlのアリコットを低濃度（約0.6〜0.8%）アガロースミニゲル上で電気泳動法により分析し、どの反応物が配列の伸長に成功したかを判定
した。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドをゲルから切出し、QIA Quic
k^TM （QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA）を用いて精製し、クレノウ酵素を用いてオーバーハングを切除して、再連結及びクローニングを容易にした。

【０２０３】エタノール沈殿の後、その生成物を13μlの連結緩衝液中に再溶解し、1μlT4-
DNAリガーゼ（15単位)及び1μlT4ポリヌクレオチドキナーゼが加えて、その混合
物を2〜3時間室温で、或いは16℃で一晩インキュベートした。コンピテントE.col i 細胞(40μlの適切な培養液中の）を3μlの連結混合物を用いて形質転換し、80μ
lのSOC培養液で培養した（Sambrook、前出,Appendix A, p.2）。37℃で1時間インキュベートした後、E.coli混合物を、2x Carbを含むLuria Bertani (LB)-agar
(Sambrook、前出,Appendix A, p.1)上で培養した（plated）。翌日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択して、適切な市販の滅菌96穴マイクロ
タイタープレートの個々のウエル内に置かれた150μlの液体LB/2xCarb培地で培養した。その翌日、終夜培養した各5μlの培養物を非滅菌の96穴プレートに移し
、水で1:10に希釈した後、各サンプルから5μlをのPCRアレイに移した。

【０２０４】 PCR増幅の場合、4単位のrTthDNAポリメラーゼ、ベクタプライマー、及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマーを含む18μl の濃縮PCR反応混合物(3.3x)が各ウエルに加えられた。増幅は、以下の条件で実施した。ステップ1 94℃で60秒間ステップ2 94℃で20秒間ステップ3 55℃で30秒間ステップ4 72℃で90秒間ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル繰返すステップ6 72℃で180秒間ステップ7 4℃（保持する） PCR反応物のアリコットを、分子量マーカと共にアガロースゲル上で移動させた。PCR生成物の大きさを元の部分cDNAと比較し、適切なクローンを選択し、プラスミドに結合させて、配列決定した。

【０２０５】同様に、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を用いて、上記手
順、5´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いる5´調節配列を得る。

【０２０６】６個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4に由来するハイブリダイゼーションプローブを
用いて、cDNA、ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化について特に記載するが、より大きなヌクレオ
チドフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO 4.
06 (National Biosciences)のような現状の技術分野のソフトウエアを用いて設計し、50pmolの各オリゴマーと250μCiの[γ-³²P]アデノシン三リン酸 (Amersha
m)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN^ョ, Boston MA)とを組み合わせることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム(Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの
標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼ（Ase I, Bgl II,
Eco RI, Pst I, Xba 1.或いは Pvu II(DuPont NEN^ョ)）の1つで消化されたヒト
ゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。

【０２０７】各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜(Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイゼーションは40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増
す条件下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT AR^TM フィルム (Kod
ak, Rochester,NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics, Syn
nyvale,CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンを視
覚的に比較する。

【０２０８】７マイクロアレイマイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作り出すために、本発明のヌクレオ
チド配列を、そのヌクレオチド配列の3´末端から開始して、所定のコンピュータアルゴリズムを用いて調べる。そのアルゴリズムによって、その遺伝子に固有
で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のGC含有物を有し、ハイブリダイゼ
ーションに妨げとなるような予測された二次的構造がない特定の長さのオリゴマ
を同定する。そのアルゴリズムは、長さが約20ヌクレオチドからなる（20量体)2
0個の特異な配列のオリゴヌクレオチドを同定する。各配列の中央の1つのヌクレ
オチドが変化していることを除いて一致したオリゴヌクレオチドの組を形成する
。このプロセスはマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰返され、20個の20量体
からなる組の2つが、光配向（light-directed）化学処理（Chee (前出)に記載）
を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。

【０２０９】別法として、化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることに
より、基板の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler,前出）。さらに別の方法では、ドットブロット又はスロットブロット法に類似のグリッドアレイを
用いて、真空システムまたは熱、紫外線（UV）、機械的或いは化学的結合プロシ
ージャを利用して、基板の表面にcDNAフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを
配列及び結合させる。一般にアレイは手動で或いは市販の道具及び装置を用いて
、8ドット、24ドット、96ドット、384ドット、1536ドット或いは6144ドットのグ
リッドを含むように製造できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを
洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し、スキャナーを用いて蛍光
のレベル及びパターンを判定する。スキャナーで読取られた画像が検査して、マ
イクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量
／発現レベルを判定する。

【０２１０】８相補的ポリヌクレオチド TR2Pをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部を用いて、自然発
生TR2Pの発現を検出して低下させ、即ち抑制する。約15〜約30塩基対を含むオリ
ゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列
フラグメントの場合でも概ね同じ方法が用いられる。Oligo4.06ソフトウエア及びT R2Pコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特の5´配列から設計し、プロモーターのコーディング配列への結合を防止するために用いる。翻訳を抑制する
ために、相補的なオリゴヌクレオチドを、リボソームのTR2Pをコードする転写物
への結合を防ぐように設計する。

【０２１１】９ TR2Pの発現 TR2Pの発現は、cDNAを適切なベクタにサブクローニングし、ベクターを宿主細
胞に形質転換することにより行われる。この場合には、クローニングベクターを
用いて、E.coliにおいてTR2Pを発現させる。クローニング部位の上流では、この
ベクターはβ-ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それにアミノ末端M
et及びそれに後続するβ-ガラクトシダーゼの7残基を含む配列が続く。直後のこ
れら8残基は、転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及び多くの特有の制限部位を含むリンカーである。

【０２１２】単離され、標準的な方法を用いてIPTG (isopropyil beta-D-thiogalactopyran
oside)と転換された菌種の誘発により、β-ガラクトシダーゼの最初の8残基、リ
ンカーの約5〜15残基及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成する。このシグナル残基により細菌増殖培地へのTR2Pの分泌が促され、この培地を後
述の活性のためのアッセイにおいて直接用いることができる。

【０２１３】１０ TR2P活性の実証ヒトの胎児腎臓293株化細胞を全ての形質移入実験に用いる。ウエスタンブロット法、免疫共沈降実験、及びルシフェラーゼレポーターアッセイのための一過
性の形質移入は、先行技術（Hsu,H.ら(1995)Cell 81:495-504）に記載のCaPO₄法
によって実施する。また、ルシフェラーゼレポーターアッセイは前述の文献（Hs
u,H.ら；前出）に記載のように実施する。形質移入の24時間後、100mmプレート当たり約2×10⁶ の293細胞を5mMのEDTAを含むpH7.4の氷冷のリン酸緩衝食塩水（
PBS）中で一度洗浄する。タンパク質は、氷上において30分間、0.5mlの溶解バッ
ファー-250（50mMのTris, pH7.4, 250mMのNaC1, 0.1%ノニデットP-40, 10%グリセロール, 50mMのNaF, 1mMのsodium orthovanadate, 1mMのジチオスレイトール,
1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,10μg/mlのアプロチニン, 10μg/mlのロイペプチン, 及び10μg/mlのペプスタチンA）中の各プレートから抽出される。細胞の残留物は遠心分離で除去する。上澄みには10μMのZnCl₂が補充され、10μ
lのプロテインA-セファロース（Pharmacia）に移され、2%のウシ血清アルブミン
（Boehringer Mannheim）で遮断され、またanti-FLAG（1μl）又は anti-TR2P細
胞外ドメイン（1μl）に事前結合(prebound)され、4℃で3時間インキュベートされる。ビーズを溶解バッファー-250中で5回洗浄し、結合したタンパク質を10%
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロース上にブロッティングする（Schleicher & Schuell）。ウエスタン分析の場合、ブロットされ
たニトロセルロース膜を、0.05% Tween 20含有PBS（PBS containing 0.05% Twee
n 20；PBST）の5%脱脂乳中で室温で1時間のインキュベーションによって遮断し、またanti-HA（1%ゼラチンPBSTで2000倍希釈）、anti-FLAG（300倍希釈）、又はanti-TR2P（700倍希釈）で1時間インキュベートする。ブロットをPBST中で3度
洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した3000倍希釈のプロテインAにおいてインキュベートし、次にECL化学発光検出システム（Amersham Corp.）で可視化する。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad）によって決定する。

【０２１４】１１ TR2P特異的抗体の産生 PAGE電気泳動法（Harrington,M.G.(1990)Methods Enzymol.182:488-495）、或
いは他の精製技術を用いて実質的に精製されたTR2Pを用いて、ウサギを免疫化し
、標準的なプロトコルを使用して抗体を生成する。アミノ酸配列を、DNASTAR so
ftware （DNASTAR Inc）を用いて分析して、免疫原性の高い領域を判定し、対応
するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗
体を作り出す。C-末端付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエ
ピトープの選択については、Ausubel F.M.らの文献（1995,定期的に増補；Curre
nt Protocols in Molecular Biology,ch. 11, John Wiley & Sons, New York,
NY）などに記載される。

【０２１５】通常、オリゴペプチドは15残基の長さであり、fmoc法の化学作用を利用するApp
lied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成し、MBS（M-mal
eimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester : Ausubelら、前出）を用いた反応
によりKLH(Sigma, St.Louis, MO)に結合させる。ウサギは、完全なフロイントの
アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化する。その結果生じる
抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウ
サギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２１６】１２特異的抗体を用いる自然発生TR2Pの精製 TR2Pに対して特異な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィによ
り、自然発生或いは組換えTR2Pを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、TR2P抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結
合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。

【０２１７】 TR2Pを含む培養液を免疫親和性カラムに通し、そのカラムをTR2Pを優先的に吸
着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファ
ー）で洗浄する。抗体／TR2P結合を分裂させる条件下（例えば、pH2〜3のバッフ
ァー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ(c
haotrope)）でカラムを溶出させ、TR2Pを回収する。

【０２１８】１３ TR2Pと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(Boltonら(1973) Biochem.J.133:529)を用いて、TR2P
或いはその生物学的に活性な断片を標識する。マルチウエルプレートのウエル内
に予め配列した候補分子を、標識されたTR2Pでインキュベートし、洗浄し、標識
されたTR2P複合体を有する任意のウエルを検定する。種々のTR2P濃度で得られた
データを用いて、数、親和性及びTR2Pと候補分子との会合についての値を計算す
る。

【０２１９】上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に
記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を
特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実
施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本
発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業
者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である（図１Ａ乃至図１Ｃの配列アライメントの作成にはMacDNASIS PROTMソフトウエア(Hitach Software Engineering Co.Ltd.,San Bruno,CA)を使用した）
。

【図１Ｂ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図１Ｃ】 TR2P-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図２Ａ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である（図２Ａ乃至図２Ｄの配列アライメントの作成にはMacDNASIS PROTM so
ftware (Hitach Software Engineering Co.Ltd.,San Bruno,CA)を使用した）。

【図２Ｂ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図２Ｃ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図２Ｄ】 TR2P-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図３Ａ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン(human osteopr
otegrin)（GI 2072185, SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID
NO:6）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である（図３Ａ乃至図３Ｃの配
列アライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシー
ケンスアライメントプログラムを用いて作成）。

【図３Ｂ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185,
SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6）の間のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。

【図３Ｃ】 TR2P-1（1542861; SEQ ID NO:1）、ヒトオステオプロテグリン（GI 2072185,
SEQ ID NO:5）、及びヒトTNF-R2（GI 1469541, SEQ ID NO:6）の間のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。

【図４Ａ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である（図４Ａ乃至図４Ｃの配列アライメントはDNASTAR^TM
software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラ
ムを用いて作成）。

【図４Ｂ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。

【図４Ｃ】 TR2P-2（2581223; SEQ ID NO:3）、ヒトTNF-R2（切り詰められた配列、V-83〜
S-461：GI 1469541, SEQ ID NO:6）、およびヒトオステオプロテグリン（切り詰
められた配列、L-90〜L-401：GI 2072185, SEQ ID NO:5）の間のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 ４Ｈ０４５ 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/525 43/00 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/525 16/24 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヒルマン、ジェニファー・エルアメリカ合衆国カリフォルニア州94040・マウンテンビュー・＃12・モンロードライブ 230 (72)発明者オウ−ヤング、ジャニスアメリカ合衆国カリフォルニア州94702・バークレイ・カインズアベニュー 1419 (72)発明者タング、トム・ワイアメリカ合衆国カリフォルニア州95118・サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者カイザー、マシュー・アールアメリカ合衆国カリフォルニア州94546− 1017・カストロバレー・ユーイングロード 4793 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA28 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG07 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA06 AA07 AA27 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA25 NA14 ZA812 ZA962 ZB022 ZB262 ZC422 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA22 EA22 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびS
EQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む、ヒト腫瘍壊
死因子R2様タンパク質（TR2P）。
【請求項２】請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製されたABBRの変異体。
【請求項３】請求項１のTR2Pをコードする単離され精製されたポリヌク
レオチド配列。
【請求項４】請求項３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの
変異配列。
【請求項５】請求項３のポリヌクレオチド配列を含む所定の組成物。
【請求項６】厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７】請求項３のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単離
され精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項８】 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびS
EQ ID NO:4の断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む、単
離され精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項９】請求項８のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの
変異配列。
【請求項１０】請求項８のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単
離され精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】請求項３のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含
む発現ベクター。
【請求項１２】請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１２の宿主細胞を
培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
を特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】適切な医薬用担体と共に請求項１のTR2Pを含む医薬品組
成物。
【請求項１５】請求項１のTR2Pに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１６】請求項１のTR2Pの精製されたアゴニスト。
【請求項１７】請求項１のTR2Pの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１８】骨形成疾患の治療方法または予防方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。
【請求項１９】発生障害の治療方法または予防方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。
【請求項２０】生殖疾患の治療方法または予防方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１４の医薬品組成物
を投与する過程を含む方法。
【請求項２１】免疫疾患の治療方法または予防方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
トを投与する過程を含む方法。
【請求項２２】腫瘍性疾患の治療方法または予防方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
トを投与する過程を含む方法。
【請求項２３】核酸を含む生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードする
ポリヌクレオチドの検出方法であって、（ａ）請求項７のポリヌクレオチドを生物学的サンプルの少なくとも１つの核
酸材料とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該複合体
の存在が、前記生物学的サンプルにおけるTR2Pをコードするポリヌクレオチドの
存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とするTR2Pの検出方法。
【請求項２４】ハイブリダイゼーションの前に、前記生物学的サンプル
の核酸をポリメラーゼ連鎖反応法によって増幅することを特徴とする請求項２３
に記載の方法。